JP2003277293A - 移植片拒絶反応抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 組織や臓器の移植（同種移植または異種移
植）における免疫拒絶反応（移植片拒絶反応）を抑制、
治療または予防する方法及び薬剤を提供する医薬組成物
を提供する。 【解決手段】 AILIM（ICOS及び8F4とも呼ぶ）に対する
抗体及びAILIM-Igが、種々臓器（肝臓、心臓、肺、腎
臓、膵臓など）の不全症の治療のために施される組織や
臓器の移植（同種移植または異種移植）において深刻な
問題となっている移植片拒絶反応に抑制または予防に対
して有意な治療効果を有することを見出した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、AILIM（activatio
n inducible lymphocyte immunomodulatory molecule；
別名を「ICOS（inducible co-stimulator）」とい
う。）の生物活性、特にAILIMを介するシグナル伝達を
制御する活性を有する物質を含んでなる医薬組成物に関
する。具体的には、本発明は、AILIM発現細胞の増殖を
制御（例えば抑制）するか、またはAILIM発現細胞によ
るサイトカイン（例えば、インターフェロンγまたはイ
ンターロイキン４など）の産生を制御（例えば抑制）す
る活性を有する物質を含んでなる医薬組成物に関する。
さらに具体的には、本発明は、（1）臓器若しくはその
一部または組織の移植に伴う移植片拒絶反応（免疫拒絶
反応）を抑制、治療または予防するための医薬組成物、
並びに（2）免疫抑制剤による臓器若しくはその一部ま
たは組織の移植に伴う移植片拒絶反応（免疫拒絶反応）
の抑制、治療または予防の効果を増大するための医薬組
成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】昨今の臓器移植法の改正により、我が国
においても数例の脳死患者からの臓器移植が行われてい
る。その内の１例では、１人のドナーから、７名の患者
がその恩恵を受けた。今後は我が国おいても臓器移植が
増大が期待される。一方、我が国においては、重篤な循
環器系の疾患、例えば、肝臓疾患（急性肝不全、肝硬変
など）、心臓疾患（重症心不全、心筋症、心臓肥大症な
ど）、腎臓疾患（腎不全、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎
症、腎盂腎炎など）、肺疾患（両肺機能不全など）、及
び膵臓疾患（糖尿病患者の治療）などに罹患しその治療
のために臓器の移植を必要とする患者が、毎年、心臓で
約600人、肝臓で約3,000人、また肺で約500人ずつ増加
していると推定されている。上述した法的側面での整備
が整う一方で、移植され得る臓器の不足も現実的な問題
として存在する。移植先進国である米国においても同様
に臓器の不足が深刻な問題となっており、米国では心臓
移植で約4,300人（1999年）また腎臓移植で約43,000人
（1999年）が移植を待ち続けており、それぞれ毎年約80
0人及び約2,300人が移植を受けられないままこの世を去
っているのが実状である。

【０００３】組織（皮膚、角膜及び骨などの組織）また
は臓器（肝臓、心臓、腎臓、肺、膵臓など）の移植に
は、（1）自家移植（自己移植）、（2）同系移植、
（3）同種移植、及び（4）異種移植がある。自家移植
（自己移植；autotransplantation）は、１つの個体の
一部を同じ個体の他の部分に移植するものであり、例え
ば、火傷の治療のための自身の正常な皮膚を損傷部位に
移植する場合がそれにあたる。同系移植（isotransplan
tation）は、同じ均一系の動物の間で行われる移植であ
り、ヒトにおいては、一卵性双生児の間で行われる移植
（例えば、腎臓の片方や肝臓組織などの移植）である。
同種移植（allotransplantation）は、遺伝原組成が異
なる２つの個体間で行われる移植であり、ヒトにおいて
は、二卵性双生児の間での移植や、全く血縁関係のない
個体間での移植がこれにあたる。異種移植（xenotransp
lantation）は、互いに異なる動物種である個体間での
移植であり、例えば、チンパンジーやブタの組織や臓器
をヒトに移植する場合がこれにあたる。

【０００４】臓器移植に関する法整備により脳死患者か
らの同種移植の増大が見込まれることは上述したとおり
であるが、移植臓器の絶対的な不足を解消すべく最近で
は異種動物、即ちブタなどの非ヒト哺乳動物からヒトへ
の組織や臓器の移植の実用化に向けた様々な検討が活発
になってきている移植され得る組織や臓器の不足の問題
が上述のような脳死移植法の整備並びに異種移植技術の
発達で解消されることが期待される一方で、同種移植及
び異種移植による疾患治療においてはもう一つの極めて
大きなハードルが存在する。即ち、ドナーからの移植組
織や臓器をレシピエントに移植した後に起こるレシピエ
ント患者における重篤な免疫拒絶反応（移植片拒絶反応
（graft rejection））である。

【０００５】移植片拒絶反応は、移植片（移植される生
体の一部であり、細胞、組織または臓器）のドナーのレ
シピエントの遺伝的背景が異なる場合（即ち、同種移植
または異種移植）、移植片がレシピエントによって異物
と認識されることによりレシピエントの免疫系がその移
植片を拒絶し排除しようとする様々な免疫反応である。
この移植に伴うこの免疫反応は、（1）移植直後に起こ
る強い拒絶反応である超急性拒絶反応（hyper-acute re
jection reaction）、（2）移植後数ヶ月以内に見られ
る急性拒絶反応（acute rejection reaction）、（3）
移植後数ヶ月以降に見られる慢性拒絶反応（chronic re
jection reaction）に分けられる。また、Ｔ細胞に代表
される免疫担当細胞による細胞性免疫と抗体による液性
免疫が複雑に連携した形で起こるが、主としては細胞性
免疫である。

【０００６】この移植片拒絶反応により、移植片は最終
的には壊死脱落する。また、レシピエントには、発熱、
白血球増多、倦怠感などの重篤な全身症状だけでなく、
移植局所の腫脹や圧痛が起こる。さらには、感染症など
の重篤な合併症を引き起こすこととなる。とりわけ、ブ
タなどの異種の移植片をヒトに移植する場合には、超急
性拒絶反応が起こり移植片が分単位で拒絶されてしまう
という大きな問題が存在する。このような移植に伴う免
疫拒絶反応（移植片拒絶反応）を抑制するためには、同
種移植により惹起される免疫拒絶反応が主として細胞性
免疫によるものであることから、免疫担当細胞の機能を
抑制する限られたいくつかの免疫抑制剤が用いられてい
る。例えば、サイクロスポリン（cyclosporin; CsA）、
タクロリムス（tacrolimus; FK-506）、アザチオプリン
（azathioprine; AZ）、ミコフェノール酸モフェティル
（mycophenolate mofetil; MMF）、ミゾリビン（mizori
bine; MZ）、レフルノマイド（leflunomide; LEF）、プ
レドニゾロン（predonisolon）やメチルプレドニゾロン
（methylpredonisolon）などの副腎皮質ステロイド（別
称：副腎皮質ホルモン；コルチコステロイド(corticost
eroid)；コルチコイド(corticoid)）、シロリムス（sir
olimus）（別称：ラパマイシン(rapamycin)）、デオキ
シスパーガリン（deoxyspergualin; DSG）及びFTY720
（化学名称：2-amino-2-[2-(4-octylphenyl)ethyl]-1,3
-propanediol hydrochloride）などである。また、T細
胞の活性化に必要なコスティミュレイトリーシグナルの
伝達を担う分子（副刺激伝達分子）であるCTLA4やCD2
8、特にCTLA4の可溶性領域やそれをコードする遺伝子を
用いるCTLA4医薬も免疫抑制剤として臨床開発中であ
る。

【０００７】一方、最近になって、コスティミュレイト
リーシグナル伝達分子であるCTLA4やCD28と同様に、当
該Ｔ細胞等のリンパ球の活性化に必須な第２のシグナル
（コスティミュレイトリーシグナル）の伝達、並びに該
シグナルに連動して活性化Ｔ細胞等の活性化リンパ球の
機能制御を行う第３の副刺激伝達分子としてAILIM（act
ivation inducible lymphocyte immunomodulatory mole
cule；ヒト、マウス及びラット；Int. Immunol., Vol.1
2, No.1, p.51-55, 2000；別称をICOSという（Inducibl
e co-stimulator；ヒト；Nature, Vol.397, No.6716,
p.263-266, 1999）； J. Immunol., 166(1), p.1, 200
1; J. Immunol., 165(9), p.5035, 2000;Biochem. Biop
hys. Res. Commun., 276(1), p.335, 2000; Immunity,
13(1), p.95, 2000; J. Exp. Med., 192(1), p.53, 200
0; Eur. J. Immunol., 30(4), p.1040, 2000）と呼ばれ
る分子が同定された。この分子に関する最近の研究に基
づく知見から、このAILIM分子は、T細胞などの免疫担当
細胞（特にT細胞）の活性化を通じて引き起こされる種
々の疾患（例えば、自己免疫疾患、アレルギー、炎症な
ど）に関与する可能性が予測されているが、このAILIM
分子の機能の制御と組織や臓器の移植に伴う移植片拒絶
反応（免疫拒絶反応）との関係、並びに当該AILIM分子
の活性を制御することによるそのような組織や臓器の移
植に伴う拒絶反応の抑制、治療または予防の試みについ
ては何ら報告されていない。

【０００８】また、極最近になって、この副刺激伝達分
子AILIMと相互作用するリガンドと考えられるB7h、B7RP
-1、GL50あるいはLICOSと称される新規分子も同定され
ている（Nature, Vol.402, No.6763, p.827-832, 1999;
Nature Medicine, Vol.5, No.12, p.1365-1369, 199
9；J. Immunology, Vol.164, p.1653-1657, 2000; Cur
r. Biol., Vol.10, No.6, p.333-336, 2000）。

【０００９】これら2種類の新規な分子、即ち、AILIM
（ICOS）とB7RP-1（B7h, GL50, LICOS）の同定により、
上述したＴ細胞等のリンパ球の活性化及び活性化Ｔ細胞
の機能制御に必須であるコスティミュレイトリーシグナ
ルの伝達経路には、これまで知られていたCD28とCD80(B
7-1)／CD86(B7-2)との間のシグナル伝達経路、及びCTLA
4とCD80(B7-1)／CD86(B7-2)との間のシグナル伝達経路
である第一及び第二の経路の他にAILIM（ICOS）とB7RP-
1（B7h, GL50, LICOS）との相互作用による新しい第三
の経路があることが判明することとなった。この新しい
２つの分子の各々の生物学的機能、該分子による第三の
コスティミュレイトリーシグナル伝達によるＴ細胞等の
リンパ球の機能制御、並びに該新規なシグナル伝達と疾
患との関連性については、目下精力的に研究が進めれら
ているところである。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】即ち、本発明は、Ｔ細
胞等のリンパ球の活性化に必須な第２のシグナル（コス
ティミュレイトリーシグナル）の伝達、並びに該シグナ
ルに連動して活性化Ｔ細胞等の活性化リンパ球の機能制
御を行う分子であると考えられる新規分子AILIMの生物
学的機能を、医学及び薬学的手法（例えば、低分子化合
物及び抗体等の薬剤）により制御することにより、組織
や臓器の移植（同種移植または異種移植）における免疫
拒絶反応（移植片拒絶反応）を抑制、治療または予防す
る方法及び薬剤を提供することを目的とする。さらに
は、そのようなAILIMの生物学的機能を制御する薬剤
（例えば、低分子化合物及び抗体等の薬剤）を用いて、
既存の免疫抑制剤（サイクロスポリン、アザチオプリ
ン、副腎皮質ステロイド、FK-506など）による移植片拒
絶反応の抑制効果を増大させる方法を提供することを目
的とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、哺乳動物
のAILIMの生物学的機能、並びに移植片（細胞、組織、
臓器）の移植（同種移植または異種移植）に伴う深刻な
問題である免疫拒絶反応（移植片拒絶反応）を抑制する
方法に関して鋭意研究を重ねた結果、（1）AILIMの機能
を制御する薬剤が組織や臓器の移植に伴う免疫拒絶反応
（移植片拒絶反応）を有意に抑制すること、並びに
（2）既存の免疫抑制剤による移植片拒絶反応の抑制の
効果が、AILIMの機能を制御する薬剤を用いることによ
り増大されることを見出し本発明を完成するに到った。

【００１２】本発明の医薬組成物は、AILIMを発現する
細胞へのAILIMを介するコスティミュレイトリーシグナ
ル（副刺激シグナル）の伝達が関与する種々の生体反応
（例えば、AILIMを発現する細胞の細胞増殖、AILIMを発
現する細胞によるサイトカインの産生、AILIMを発現す
る細胞の免疫細胞溶解（immune cytolysis）若しくは細
胞死（apoptosis）、及びAILIMを発現する細胞に対する
抗体依存性細胞障害を誘導する活性など）を制御するた
めの医薬品として、及び／または該AILIMを介するシグ
ナル伝達が関与する種々の疾患の発症及び／または進行
を抑制、阻止し、該疾患を治療または予防するための医
薬品として有用である。

【００１３】具体的には、本発明の医薬組成物は、AILI
M発現細胞の増殖の制御（抑制または促進）またはAILIM
発現細胞によるサイトカイン（例えば、インターフェロ
ンγまたはインターロイキン４など）の産生を制御（抑
制または促進）することが可能であり、AILIMを介する
シグナル伝達が関与する様々な生理現象により惹起され
る種々の病的状態の抑制、及び種々の疾患の治療または
予防を可能にする。本発明の医薬組成物を用いることに
より、重篤な循環器系疾患に罹患しているレシピエント
のドナーの臓器（肝臓、心臓、肺、腎臓、膵臓など）若
しくはその一部または組織（皮膚、角膜、骨などの組
織）を移植（同種移植または異種移植）による治療にお
ける深刻な問題である免疫拒絶反応（移植片拒絶反応）
を抑制、予防及び／または治療することが可能である。
さらには、本発明の医薬組成物を用いることにより、そ
のような移植治療での免疫拒絶反応の抑制のために施さ
れている既存の免疫抑制剤による移植片拒絶反応の抑制
の効果を増大させることが可能である。

【００１４】即ち、本発明は、下記(1)乃至(11)に記載
されるとおりの発明である。 （1） AILIMを介するシグナル伝達を制御する活性を有
する物質及び薬学的に許容され得る担体を含んでなり、
臓器若しくはその一部または組織の移植に伴う移植片拒
絶反応を抑制、治療または予防するための医薬組成物。 （2） AILIMを介するシグナル伝達を制御する活性を有
する物質及び薬学的に許容され得る担体を含んでなり、
１または複数の免疫抑制剤による臓器若しくはその一部
または組織の移植に伴う移植片拒絶反応の抑制、治療ま
たは予防の効果を増大するための医薬組成物。 （3） 該免疫抑制剤が、アザチオプリン、副腎皮質ス
テロイド、サイクロスポリン、ミゾリビン及びタクロリ
ムス（FK-506）、ミコフェノール酸モフェティル、レフ
ルノマイド、シロリムス、デオキシスパーガリン、FTY7
20及びCTLA4医薬から選ばれる１または複数の薬剤であ
ることを特徴とする前記（2）に記載の医薬組成物。 （4） 該移植が、同種移植であることを特徴とする前
記（1）乃至前記（3）のいずれかに記載の医薬組成物。 （5） 該移植が、異種移植であることを特徴とする前
記（1）乃至前記（3）のいずれかに記載の医薬組成物。 （6） 該臓器が、肝臓、心臓、腎臓、肺または膵臓で
あることを特徴とする前記（1）乃至前記（5）のいずれ
かに記載の医薬組成物。 （7） 該組織が、皮膚、角膜または骨の組織であるこ
とを特徴とする前記（1）乃至前記（5）のいずれかに記
載の医薬組成物。 （8） 該物質が、蛋白性物質であることを特徴とする
前記（1）乃至前記（7）のいずれかに記載の医薬組成
物。 （9） 該蛋白性物質が、下記群から選ばれるいずれか
であることを特徴とする前記（8）に記載の医薬組成
物： ａ）AILIMに結合する抗体またはその一部； ｂ）AILIMの細胞外領域の全部または一部を含むポリペ
プチド； ｃ）AILIMの細胞外領域の全部または一部と免疫グロブ
リンの重鎖の定常領域の全部または一部とからなる融合
ポリペプチド；及び ｄ）AILIMに結合するポリペプチド。 （10） 該物質が、非蛋白性物質であることを特徴とす
る前記（1）乃至前記（7）のいずれかに記載の医薬組成
物。 （11） 該非蛋白性物質が、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは化学
的に合成された化合物であることを特徴とする前記（1
0）に記載の医薬組成物。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下、本発明で用いられる語句の
意味、並びに物質の製造方法を明らかにすることによ
り、本発明を詳細に説明する。本発明における「哺乳動
物」とは、ヒト、ウシ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラッ
ト、ハムスター、及びモルモット等を意味し、好ましく
は、ヒト、ウシ、ラット、マウスまたはハムスターであ
り、特に好ましくは、ヒトである。

【００１６】本発明でいう「AILIM」とは、Activation
inducible lymphocyte immunomodulatory moleculeの略
称であり前述に記載したとおりの既報に報告される構造
及び機能を有する哺乳動物の細胞表面分子を意味する
（J. Immunol., 166(1), p.1,2001; J. Immunol., 165
(9), p.5035, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun.,
276(1), p.335, 2000; Immunity, 13(1), p.95, 2000;
J. Exp. Med., 192(1),p.53, 2000; Eur. J. Immunol.,
30(4), p.1040, 2000; Int. Immunol., 12(1), p.51,
2000; Nature, 397(6716), p.263, 1999； GenBank Ac
cession Number: BAA82129（ヒト）；BAA82128（ラッ
ト）；BAA82127（ラット変異体）；BAA82126（マウ
ス））。特に好ましくはヒト由来のAILIMを意味する
（例えば、International Immunology, Vol.12, No.1,
p.51-55, 2000； GenBank Accession Number: BAA8212
9（ヒト））。なお、このAILIMは、ICOS（Nature, Vol.
397, No.6716, p.263-266, 1999）またはJTT-1抗原／JT
T-2抗原（日本国特許出願公開平11-29599号公報； 国
際特許出願公開WO98/38216号公報）とも別称されるが、
それらの分子は互いに同一の分子を意味する。また、本
発明で言う「AILIM」には、該既報の文献中に記載され
た各々の哺乳動物のAILIMのアミノ酸配列、特に好まし
くはヒトAILIMのアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ
酸配列を有するポリペプチドも包含される。さらにま
た、既に同定されているラット由来のAILIM変異体（Gen
Bank Accession Number: BAA82127）と同様のヒトAILIM
変異体も本発明における「AILIM」に包含される。

【００１７】ここで「実質的に同一のアミノ酸配列を有
する」とは、該既報のアミノ酸配列を含むポリペプチド
と実質的に同等の生物学的性質を有する限り、該アミノ
酸配列中の複数個のアミノ酸、好ましくは１乃至１０個
のアミノ酸、特に好ましくは１乃至５個のアミノ酸が置
換、欠失及び／または修飾されているアミノ酸配列を有
するポリペプチド、並びに該アミノ酸配列に、複数個の
アミノ酸、好ましくは１乃至１０個のアミノ酸、特に好
ましくは１乃至５個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配
列を有するポリペプチドも本願発明の「AILIM」の範囲
に包含されることを意味する。そのようなアミノ酸の置
換、欠失、または挿入は常法に従って行うことができる
（実験医学別冊・「遺伝子工学ハンドブック」(1992)な
ど）。

【００１８】例えば、合成オリゴヌクレオチド指定突然
変異導入法（gapped duplex）法、亜硝酸あるいは亜硫
酸処理によってランダムに点突然変異を導入する方法、
Ba131酵素等により欠失変異体を作製する方法、カセッ
ト変異法、リンカースキャニング法、ミスインコーポレ
ーション法、ミスマッチプライマー法、DNAセグメント
合成法などを挙げることができる。

【００１９】合成オリゴヌクレオチド指定突然変異導入
（gapped duplex）法は、例えば下記のように行うこと
ができる。アンバー変異をもつM13ファージベクターに
変異誘起を希望する領域をクローニングし、一本鎖ファ
ージDNAを調製する。アンバー変異をもたないM13ベクタ
ーのRFIDNAを制限酵素処理により線状とし、上記の一本
鎖ファージDNAと混合して変性後、アニールさせ、「gap
ped duplex DNA」を形成させる。これに変異を導入した
合成オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、DNAポ
リメラーゼとDNAリガーゼの反応により閉環状2本鎖DNA
とする。このDNAをミスマッチ修飾能が欠損している大
腸菌mutS株にトランスフェクションし、増殖したファー
ジをサプレッサー機能のない大腸菌に感染させ、アンバ
ー変異を持たないファージだけを選択する。

【００２０】また、亜硝酸による点突然変異を導入する
方法は、例えば下記のような原理を利用する。DNAを亜
硝酸処理すると塩基が脱アミノ化されて、アデニンはヒ
ポキサンチンに、シトシンはウラシルに、グアニンはキ
サンチンになる。脱アミノ化されたDNAを細胞に導入す
ると、DNA複製時にヒポキサンチンはシトシンと、ウラ
シルはアデニンとキサンチンはチミンと塩基対を形成す
るため、「A:T」が「G:C」へ、「G:C」が「A:T」へと置
換する。実際には亜硝酸処理した一本鎖DNA断片を「gap
ped duplex DNA」にハイブリダイズさせ、以下、合成オ
リゴヌクレオチド指定突然変異導入（gapped duplex）
法と同様に操作して変異株を分離すればよい。

【００２１】本発明を構成する「AILIM発現細胞による
サイトカインの産生」における「サイトカイン」とは、
AILIMを発現する細胞（特に、Ｔ細胞）が産生する任意
のサイトカインを意味する。該Ｔ細胞は、Th1タイプの
Ｔ細胞及びTh2タイプのＴ細胞が挙げられ、本発明にお
ける該サイトカインは、特にそれらTh1タイプのＴ細胞
が産生するサイトカイン及び／またはTh2タイプのＴ細
胞が産生する任意のサイトカインを意味する。Th1タイ
プのＴ細胞が産生するサイトカインとしては、IFN-γ、
IL-2、TNF、IL-3などが挙げられ、またTh2タイプのＴ細
胞が産生するサイトカインとしては、Il-3、IL-4、IL-
5、IL-10、TNFなどが挙げられる（細胞、Vol.30, No.9,
p.343-346, 1998）。

【００２２】本発明を構成する「物質」、具体的には
「AILIMを介するシグナル伝達を制御する活性を有する
物質」、さらに具体的には「AILIM発現細胞の増殖を抑
制するか、またはAILIM発現細胞によるサイトカインの
産生を抑制する活性を有する物質」には、自然界に存在
する天然の物質あるいは人工的に調製される任意の物質
を意味する。ここで、「AILIMを介するシグナル伝達」
とは、上述または後述する実施例で詳述するようなAILI
Mを発現する細胞に任意の表現型の変化（細胞増殖、細
胞の活性化、細胞の不活性化、細胞死、及び／またはAI
LIM発現細胞からの任意のサイトカインの産生能の変
化）をもたらすようなAILIMを通じたシグナル伝達を意
味する。

【００２３】該「物質」は、「蛋白性物質」と「非蛋白
性物質」に大別することができる。該「蛋白性物質」と
しては、後述するポリペプチド、抗体（ポリクローナル
抗体、モノクローナル抗体または該モノクローナル抗体
の一部）が挙げられる。該物質が抗体である場合には、
好ましくはモノクローナル抗体である。該物質がモノク
ローナル抗体である場合には、非ヒト哺乳動物由来のモ
ノクローナル抗体だけでなく、後述する組換えキメラモ
ノクローナル抗体、組換えヒト型モノクローナル抗体及
びヒトモノクローナル抗体が包含される。

【００２４】該物質が、ポリペプチドである場合には、
後述するポリペプチド、該ポリペプチドの断片（オリゴ
ペプチド）、融合ポリペプチド、及びそれらいずれかの
化学修飾体が包含される。オリゴペプチドとしては、５
乃至３０個のアミノ酸、好ましくは５乃至２０個のアミ
ノ酸からなるペプチドを挙げることができる。該化学修
飾は、生体に投与された場合の血中半減期の増大あるい
は経口投与時における消化管での分解に対する耐性若し
くは吸収性の増大の目的等の種々の目的に応じて設計す
ることができる。該ポリペプチドの具体例としては、後
述する下記が挙げられる。 (1)AILIMの細胞外領域の全部または一部を含むポリペプ
チド； (2)AILIMの細胞外領域の全部またはは一部と免疫グロブ
リンの重鎖の定常領域の全部または一部とからなる融合
ポリペプチド；または、 (3)AILIMに結合するポリペプチド。

【００２５】該「非蛋白性物質」としては、ＤＮＡ、Ｒ
ＮＡ及び化学的に合成された化合物が挙げられる。ここ
で、「ＤＮＡ」とは、前述のAILIM（好ましくはヒトAIL
IM）をコードするＤＮＡ（cDNA及びゲノミックＤＮＡを
含む）の塩基配列を基に設計されるアンチセンスＤＮＡ
医薬として有用な「該ＤＮＡの部分塩基配列を含むＤＮ
Ａあるいはそれらを化学修飾した化学修飾ＤＮＡ」を意
味する。即ち、該アンチセンスＤＮＡは、AILIMをコー
ドするＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズすることに
より、該AILIMをコードするＤＮＡのｍＲＮＡへの転写
あるいは該ｍＲＮＡの蛋白への翻訳を阻害することがで
きる。

【００２６】ここで、「部分塩基配列」とは、任意の部
位における任意の数の塩基からなる部分塩基配列を意味
する。該部分塩基配列としては、連続した５乃至１００
塩基の部分塩基配列が挙げられ、好ましくは、連続した
５乃至７０塩基の部分塩基配列、さらに好ましくは連続
した５乃至５０塩基の部分塩基配列、より好ましくは連
続した５乃至３０塩基の部分塩基配列が挙げられる。

【００２７】また、該ＤＮＡをアンチセンス医薬として
用いる場合には、該ＤＮＡが患者の体内に投与された場
合の血中半減期の増大（安定性）、細胞内膜の透過性の
増大、あるいは経口投与の場合の消化器官での分解耐性
の増大若しくは吸収の増大などの目的のために、該ＤＮ
Ａの塩基配列の一部に化学修飾を施すことが可能であ
る。化学修飾としては、例えば、オリゴヌクレオチドの
構造中のリン酸結合、リボース、核酸塩基、糖部位、
3’及び／または5’末端等の化学修飾が挙げられる。リ
ン酸結合の修飾としては、１以上の該結合を、ホスホジ
エステル結合（D-オリゴ）、ホスホロチオエート結合、
ホスホロジチオエート結合（S-オリゴ）、メチルホスホ
ネート結合（MP-オリゴ）、ホスホロアミデート結合、
非リン酸結合及びメチルホスホノチオエート結合のいず
れかまたはそれらの組み合わせへの変更を挙げることが
できる。リボースの修飾としては、2'-フルオロリボー
スあるいは2'-O-メチルリボースへなどへの変更を挙げ
ることができる。核酸塩基の修飾としては、5-プロピニ
ルウラシルまたは2-アミノアデニンなどへの変更が挙げ
られる。

【００２８】ここで、「ＲＮＡ」とは、前述のAILIM
（好ましくはヒトAILIM）をコードするＲＮＡの塩基配
列を基に設計されるアンチセンスＲＮＡ医薬として有用
な「該ＲＮＡの部分塩基配列を含むＲＮＡあるいはそれ
らを化学修飾した化学修飾ＲＮＡ」を意味する。該アン
チセンスＲＮＡは、AILIMをコードするＤＮＡにハイブ
リダイズすることにより、該AILIMをコードするＤＮＡ
またはＲＮＡにハイブリダイズすることにより、該AILI
MをコードするＤＮＡのｍＲＮＡへの転写あるいは該ｍ
ＲＮＡの蛋白への翻訳を阻害することができる。

【００２９】ここで、「部分塩基配列」とは、任意の部
位における任意の数の塩基からなる部分塩基配列を意味
する。該部分塩基配列としては、連続した５乃至１００
塩基の部分塩基配列が挙げられ、好ましくは、連続した
５乃至７０塩基の部分塩基配列、さらに好ましくは連続
した５乃至５０塩基の部分塩基配列、より好ましくは連
続した５乃至３０塩基の部分塩基配列が挙げられる。該
アンチセンスＲＮＡは、該ＲＮＡが患者の体内に投与さ
れた場合の血中半減期の増大、細胞内膜の透過性の増
大、あるいは経口投与の場合の消化器官での分解耐性の
増大若しくは吸収の増大などの目的のために、該ＲＮＡ
の塩基配列の一部に化学修飾を施すことが可能である。
化学修飾としては、例えば、前述のアンチセンスＤＮＡ
に適用されるような化学修飾を挙げることができる。

【００３０】「化学的に合成された化合物」とは、上述
のＤＮＡ、ＲＮＡ及び蛋白性物質を除く任意の化合物で
あって、分子量約100乃至約1000以下の化合物、好まし
くは分子量約100乃至約800の化合物であり、より好まし
くは分子量約100乃至約600の化合物を挙げることができ
る。

【００３１】前記「物質」の定義に包含される「ポリペ
プチド」とは、AILIM（好ましくはヒトのAILIM）を構成
するポリペプチド鎖の一部（断片）を意味し、好ましく
はAILIMを構成するポリペプチドの細胞外領域の全部ま
たはその一部を意味する（該領域は所望に応じそのＮ末
端及び／またはＣ末端に１乃至５のアミノ酸が付加され
ていてもよい。）。本発明に係るAILIMは、１または２
のポリペプチド鎖により構成される細胞膜を貫通する細
胞膜貫通分子である。

【００３２】ここで「細胞膜貫通蛋白」とは、多くの受
容体あるいは細胞膜表面分子に見られるように、膜の脂
質二重層を１回または数回貫通する疎水性ペプチド領域
により膜と連結し、全体として細胞外領域(extracellul
ar region)、膜貫通領域(transmembrane region)及び細
胞質領域(cytoplasmic region)の３つの主領域から構成
される構造をとる蛋白を指す。さらにそのような膜貫通
性蛋白は、モノマ−(monomer）として、または、同一の
アミノ酸配列を有するもう１本の鎖あるいは異なるアミ
ノ酸配列を有する鎖とともにそれぞれホモダイマ−(hom
odimer) 、ヘテロダイマ−(heterodimer)あるいはオリ
ゴマ−(origomer)を形成して存在することにより、各々
の受容体や細胞表面分子を構成する。

【００３３】ここで「細胞外領域」とは、前述のような
細胞膜膜貫通蛋白の全体構造のうち、該膜蛋白が連結し
ている膜の外界側に存在する部分構造（部分領域）の全
部または一部を意味し、換言すれば、膜内に取り込まれ
ている領域（膜貫通領域）及び該膜内の領域に引き続い
て細胞質内に存在する領域（細胞内領域）以外の領域の
全部または一部を意味する。

【００３４】前述の「蛋白性物質」に包含される「融合
ポリペプチド」とは、AILIM（好ましくはヒトのAILIM）
を構成するポリペプチドの細胞外領域の全部または一部
と「免疫グロブリン（Ig、好ましくはヒトのIg）の重鎖
の定常領域の全部または一部」とからなる融合ポリペプ
チドである。好ましくはAILIMの細胞外領域とヒトIgGの
重鎖の定常領域の一部との融合ポリペプチドであり、特
に好ましくはAILIMの細胞外領域とヒトIgGの重鎖のヒン
ジ領域、Ｃ_H2ドメイン及びＣ_H3ドメインからなる領域
（Ｆｃ）との融合ポリペプチドである。なお、IgGとし
ては、IgG1が好ましい。また、AILIMとしては、ヒト、
マウスまたはラット（好ましくはヒト）のAILIMが好ま
しい。

【００３５】ここで「免疫グロブリン（Ig）の重鎖の定
常領域の全部または一部」とは、好ましくはヒト由来の
免疫グロブリンの重鎖（Heavy Chain，Ｈ鎖）の定常領
域（Constant region）、Ｆｃ領域またはそれらの一部
を意味する。該免疫グロブリンは、どのようなクラス及
びサブクラスに属する免疫グロブリンであってもよく、
具体的には、IgG（IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4）、IgM、
IgA（IgA1及びIgA2）、IgD及びIgEを挙げることができ
る。好ましくは、IgG（IgG1、IgG2、IgG3若しくはIgG
4）、またはIgMである。本発明における特に好ましい例
としては、ヒト由来のIgG（IgG1、IgG2、IgG3若しくはI
gG4）に属する免疫グロブリンである。

【００３６】免疫グロブリンは、２つの相同な軽鎖（Li
ght Chain，Ｌ鎖）と２つの相同な重鎖（Heavy Chain，
Ｈ鎖）の４つの鎖が、ジスルフィド結合（S-S結合）で
結合したＹ字形の構造単位を有する。軽鎖は、軽鎖可変
領域（Ｖ_L）及び軽鎖定常領域（Ｃ_L）から構成される。
重鎖は、重鎖可変領域（Ｖ_H）と重鎖定常領域（Ｃ_H）か
ら構成される。

【００３７】重鎖定常領域は、クラス（IgG、IgM、Ig
A、IgD及びIgE）並びにサブクラス（IgG1、IgG2、IgG
3、IgG4、IgA1及びIgA2）毎に各々固有のアミノ酸配列
を有するいくつかのドメインから構成される。

【００３８】IgG（IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4）の重鎖
は、Ｎ末端から順に、Ｖ_H、Ｃ_H1ドメイン、ヒンジ領
域、Ｃ_H2ドメイン及びＣ_H3ドメインから構成される。

【００３９】同様にIgG1の重鎖は、Ｎ末端から順に、Ｖ
_H、Ｃγ_１1ドメイン、ヒンジ領域、Ｃγ_１2ドメイン及
びＣγ_１3ドメインから構成される。IgG2の重鎖は、Ｎ
末端から順に、Ｖ_H、Ｃγ_２1ドメイン、ヒンジ領域、Ｃ
γ_２2ドメイン及びＣγ_２3ドメインから構成される。Ig
G3の重鎖は、Ｎ末端から順に、Ｖ_H、Ｃγ_３1ドメイン、
ヒンジ領域、Ｃγ_３2ドメイン及びＣγ_３3ドメインから
構成され る。IgG4の重鎖は、Ｎ末端から順に、Ｖ_H、Ｃ
γ_４1ドメイン、ヒンジ領域、Ｃγ_４2ドメイン及びＣγ
_４3ドメインから構成される。

【００４０】IgAの重鎖は、Ｎ末端から順に、Ｖ_H、Ｃα
1ドメイン、ヒンジ領域、Ｃα2ドメイン及びＣα3ドメ
インから構成される。

【００４１】同様にIgA1の重鎖は、Ｎ末端から順に、Ｖ
_H、Ｃα₁1ドメイン、ヒンジ領域、Ｃα_１2ドメイン及び
Ｃα_１3ドメインから構成される。IgA2の重鎖は、Ｎ末
端から順に、Ｖ_H、Ｃα_２1ドメイン、ヒンジ領域、Ｃα
_２2ドメイン及びＣα_２3ドメインから構成される。

【００４２】IgDの重鎖は、Ｎ末端から順に、Ｖ_H、Ｃδ
1ドメイン、ヒンジ領域、Ｃδ2ドメイン及びＣδ3ドメ
インから構成される。

【００４３】IgMの重鎖は、Ｎ末端から順に、Ｖ_H、Ｃμ
1ドメイン、Ｃμ2ドメイン、 Ｃμ3ドメイン及びＣμ4
ドメインから構成され、IgG、IgA及びIgDに見られるよ
うなヒンジ領域を有しない。

【００４４】IgEの重鎖は、Ｎ末端から順に、Ｖ_H、Ｃε
1ドメイン、Ｃε2ドメイン、Ｃε3ドメイン及びＣε4ド
メインから構成され、IgG、IgA及びIgDに見られるよう
なヒンジ領域を有しない。

【００４５】さらに、IgGを例に挙げるならば、IgGをパ
パインで処理すると、２つの重鎖を連結させているヒン
ジ領域中に存在するジスルフィド結合のややＮ末端側で
切断されて、Ｖ_H及びＣ_H1からなる重鎖断片と１つの軽
鎖がジスルフィド結合で連結した２つの相同なFab、並
びにヒンジ領域、Ｃ_H2ドメイン及びＣ_H3ドメインからな
る２つの相同な重鎖断片がジスルフィド結合で連結した
１つのＦｃを生ずる（以上、「免疫学イラストレイテッ
ド」、原書第２版、第65〜75頁、1992年、南江堂発行、
及び「最新医科学の焦点「免疫系の認識機構」」、第4
〜7頁、1991年、南江堂発行など参照）。

【００４６】即ち、上述の「免疫グロブリンの重鎖の定
常領域の一部」とは、上述のような構造的特徴を有する
免疫グロブリンの重鎖の定常領域一部を意味し、好まし
くは、Ｃ1ドメインを欠く定常領域またはFc領域であ
る。具体的には、IgG、IgAまたはIgDの場合には、各々
のヒンジ領域、Ｃ2ドメイン及びＣ3ドメインからなる領
域が挙げられ、IgMまたはIgEの場合には、各々のＣ2ド
メイン、Ｃ3ドメイン及びＣ4ドメインからなる領域が挙
げられる。とりわけ好ましい例としては、ヒト由来のIg
G1のFc領域を挙げることができる。

【００４７】上述の融合ポリペプチドは、前述のような
IgG等の免疫グロリンの定常領域の一部（例えば、Fc）
を融合パートナーとして有することから、該免疫グロブ
リン断片に特異的に結合するというプロテインＡの性質
を用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用
いることにより該融合ポリペプチドを極めて容易に精製
することが可能であるという点で利点を有する。さら
に、種々の免疫グロブリンのFcに対する種々の抗体が提
供されていることから、該Fcに対する抗体を用いて、該
融合ポリペプチドのイムノアッセイを簡便に行うことが
できる。

【００４８】前記「物質」の定義に包含される「ポリペ
プチド」には、また「AILIMに結合するポリペプチド」
が包含される。「AILIMに結合するポリペプチド」とし
ては、具体的には、AILIMと相互作用するリガンドであ
る既知のB7h、B7RP-1、GL50あるいはLICOSと称される分
子（Nature, Vol.402, No.6763, p.827-832, 1999; Nat
ure Medicine, Vol.5, No.12, p.1365-1369, 1999；J.
Immunology, Vol.164, p.1653-1657, 2000; Curr. Bio
l.,Vol.10, No.6, p.333-336, 2000）を構成するポリペ
プチドの全部または一部を含むポリペプチドが挙げられ
る。好ましくは、上記リガンド（B7h、B7RP-1、GL50、L
ICOS）の細胞外領域の全部または一部を含むポリペプチ
ド、または該ポリペプチドと免疫グロブリン（好ましく
はヒト免疫グロブリン）の重鎖の定常領域の全部または
一部とからなる融合ポリペプチドである。ここで、「細
胞外領域」及び「免疫グロブリンの重鎖の定常領域」な
る用語については、上述と同様の意味を有する。

【００４９】上述したポリペプチド、該ポリペプチドの
一部（断片）及び融合ポリペプチドは、後述するような
遺伝子組換え技術のほか、化学的合成法、細胞培養方法
等のような当該技術的分野において知られる公知の方法
あるいはその修飾方法を適宜用いることにより製造する
ことができる。本発明における「抗体」とは、前記で定
義した哺乳動物のAILIM（特に好ましくはヒトAILIM）に
対するポリクローナル抗体（抗血清）あるいはモノクロ
ーナル抗体を意味し、好ましくはモノクローナル抗体で
ある。具体的には、AILIMに結合しAILIM発現細胞の増殖
を抑制するか、またはAILIMに結合しAILIM発現細胞によ
るインターフェロンγ若しくはインターロイキン４の産
生を抑制する活性を有する抗体である。

【００５０】本発明の「抗体」は、本発明のAILIMを発
現する細胞（天然の細胞、株化細胞、腫瘍細胞など）、
AILIMをその細胞表面に高発現するように遺伝子組換技
術を用いて作製された形質転換体、AILIMを構成するポ
リペプチド、該AILIMポリペプチド、またはAILIMの細胞
外領域を含む前述の融合ポリペプチドを抗原として用
い、該抗原をマウス、ラット、ハムスター、モルモット
あるいはウサギ等の哺乳動物に免疫して得られる天然型
抗体、遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラ抗体
及びヒト型抗体（CDR-grafted抗体）、並びにヒト抗体
産生トランスジェニッ ク動物等を用いて製造され得る
ヒト抗体も包含する。

【００５１】モノクローナル抗体には、IgG、IgM、Ig
A、IgDあるいはIgE等のいずれのアイソタイプを有する
モノクローナル抗体もが包含される。好ましくは、IgG
またはIgMである。

【００５２】ポリクローナル抗体（抗血清）あるいはモ
ノクローナル抗体は、既存の一般的な製造方法によって
製造することができる。即ち、例えば、前述のような抗
原を、必要に応じてフロイントアジュバント（Freund's
Adjuvant）と ともに、哺乳動物、好ましくは、マウ
ス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、
イヌ、ブタ、ヤギ、ウマあるいはウシ、より好ましくは
マウス、ラット、ハムスター、モルモットまたはウサギ
に免疫する。

【００５３】ポリクローナル抗体は、該免疫感作動物か
ら得た血清から取得することができる。またモノクロー
ナル抗体は、該免疫感作動物から得た該抗体産生細胞と
自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）
からハイブリドーマを調製し、該ハイブリドーマをクロ
ーン化し、哺乳動物の免疫に用いた抗原に対して特異的
親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを
選択することによって製造される。

【００５４】モノクローナル抗体は、具体的には下記の
ようにして製造することができる。即ち、前述のような
抗原を免疫原とし、該免疫原を、必要に応じてフロイン
トアジュバント（Freund's Adjuvant）とともに、非ヒ
ト哺乳動物、具体的には、マウス、ラット、ハムスタ
ー、モルモ ットあるいはウサギ、好ましくは マウス、
ラットあるいはハムスター（後述するヒト抗体産生トラ
ンスジェニックマウスのような他の動物由来の抗体を産
生するように作出されたトランスジェニック動物を含
む）の皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内あるい
は腹腔内に１乃至数回注射するかあるいは移植すること
により免疫感作を施す。通常、初回免疫から約１乃至１
４日毎に１乃至４回免疫を行って、最終免疫より約１乃
至５日後に免疫感作された該哺乳動物から抗体産生細胞
が取得される。免疫を施す回数及び時間的インターバル
は、使用する免疫原の性質などにより、適宜変更するこ
とができる。

【００５５】モノクローナル抗体を分泌するハイブリド
ーマの調製は、ケーラー及びミルシュタインらの方法
（ネイチャー(Nature)、第２５６巻、第４９５〜第４９
７頁、１９７５年）及びそれに準じる修飾方法に従って
行うことができる。即ち、前述の如く免疫感作された非
ヒト哺乳動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄ある
いは扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞
と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスタ
ー、ウサギまたはヒト等の哺乳動物、より好ましくはマ
ウス、ラットまたはヒト由来の自己抗体産生能のないミ
エローマ細胞との細胞融合させることにより調製され
る。

【００５６】細胞融合に用いられるミエローマ細胞とし
ては、例えばマウス由来ミエローマP3/X63-AG8.653（65
3）、P3/NSI/1-Ag4-1（NS-1）、P3/X63-Ag8.U1（P3U
1）、SP2/0-Ag14（Sp2/O、Sp2）、PAI、F0、NS0あるい
はBW5147、ラット由来ミエローマ210RCY3-Ag.2.3.、ヒ
ト由来ミエローマU-266AR1、GM1500-6TG-A1-2、UC729-
6、CEM-AGR、D1R11あるいはCEM-T15を使用することがで
きる。

【００５７】モノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマクローンのスクリーニングは、ハイブリドーマを、
例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見
られたウェルの培養上清の前述の免疫感作で用いた免疫
抗原に対する反応性を、例えばＲＩＡやＥＬＩＳＡ等の
酵素免疫測定法によって測定することにより行なうこと
ができる。

【００５８】ハイブリドーマからのモノクローナル抗体
の製造は、ハイブリドーマをインビトロ、またはマウ
ス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等、
好ましくはマウスまたはラット、より好ましくはマウス
の腹水中等でのインビボで行い、得られた培養上清、ま
たは哺乳動物の腹水から単離することにより行うことが
できる。

【００５９】インビトロで培養する場合には、培養する
細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々条
件に合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存さ
せ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるため
に用いられるような既知栄養培地あるいは既知の基本培
地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施す
ることが可能である。

【００６０】基本培地としては、例えば、Ham'F12培
地、MCDB153培地あるいは低カルシウムMEM培地等の低カ
ルシウム培地及びMCDB104培地、MEM培地、D-MEM培地、R
PMI1640培地、ASF104培地あるいはRD培地等の高カルシ
ウム培地等が挙げられ、該基本培地は、目的に応じて、
例えば血清、ホルモン、サイトカイン及び／または種々
無機あるいは有機物質等を含有することができる。

【００６１】モノクローナル抗体の単離、精製は、上述
の培養上清あるいは腹水を、飽和硫酸アンモニウム、ユ
ーグロブリン沈澱法、カプロイン酸法、カプリル酸法、
イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたはＤＥ５
２等）、抗イムノグロブリンカラムあるいはプロテイン
Ａカラム等のアフィニティカラムクロマトグラフィーに
供すること等により行うことができる。

【００６２】「組換えキメラモノクローナル抗体」は、
遺伝子工学的に作製されるモノクローナル抗体であっ
て、具体的には、その可変領域が、非ヒト哺乳動物（マ
ウス、ラット、ハムスターなど）のイムノグロブリン由
来の可変領域であり、かつその定常領域がヒトイムノグ
ロブリン由来の定常領域であることを特徴とするマウス
／ヒトキメラモノクローナル抗体等のキメラモノクロー
ナル抗体を意味する。

【００６３】ヒトイムノグロブリン由来の定常領域は、
IgG（IgG1, IgG2, IgG3, IgG4）、IgM、IgA、IgD及びIg
E等のアイソタイプにより各々固有のアミノ酸配列を有
するが、組換えキメラモノクローナル抗体の定常領域は
いずれのアイソタイプに属するヒトイムノグログリンの
定常領域であってもよい。好ましくは、ヒトIgGの定常
領域である。

【００６４】組換えキメラモノクローナル抗体は、例え
ば以下のようにして製造することができる。しかしなが
ら、そのような製造方法に限定されるものでないことは
言うまでもない。

【００６５】例えば、マウス／ヒトキメラモノクローナ
ル抗体は、実験医学（臨時増刊号）、第1.6巻、第10
号、1988年及び特公平3-73280号公報等を参照しながら
作製することができる。即ち、マウスモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマから単離した該マウスモノ
クローナル抗体をコードするＤＮＡから取得した活性な
Ｖ _H遺伝子（Ｈ鎖可変領域をコードする再配列されたＶ
ＤＪ遺伝子）の下流に、ヒトイムノグロムリンをコード
するＤＮＡから取得したＣH遺伝子（Ｈ鎖定常領域をコ
ードするＣ遺伝子）を、また該ハイブリドーマから単離
したマウスモノクローナル抗体をコードするＤＮＡから
取得した活性なＶ_L遺伝子 （Ｌ鎖可変領域をコードする
再配列されたＶＪ遺伝子）の下流にヒトイムノグロムリ
ンをコードするＤＮＡから取得したＣ_L遺伝子（Ｌ鎖定
常領域をコードするＣ遺伝子）を、各々発現可能なよう
に配列して１つ又は別々の発現ベクターに挿入し、該発
現ベクターで宿主細胞を形質転換し、該形質転換細胞を
培養することにより作製することができる。

【００６６】具体的には、まず、マウスモノクローナル
抗体産生ハイブリドーマから常法によりＤＮＡを抽出
後、該ＤＮＡを適切な制限酵素（例えばEcoRI、Hind II
I等）を用いて消化し、電気泳動に付して（例えば0.7％
アガロースゲル使用）サザンブロット法を行う。泳動し
たゲルを例えばエチジウムブロマイド等で染色し、写真
撮影後、マーカーの位置を付し、ゲルを２回水洗し、0.
25MのHCl溶液に１５分間浸す。次いで、0.4NのNaOH溶液
に１０分間浸し、その間緩やかに振盪する。常法によ
り、フィルターに移し、４時間後フィルターを回収して
2×SSCで２回洗浄する。フィルターを十分乾燥した後、
ベイキング（７５℃、３時間）を行う。ベイキング終了
後に、該フィルターを0.1×SSC／0.1％SDS溶液に入れ、
６５℃で３０分間処理する。次いで、3×SSC／0.1％SDS
溶液に浸す。得られたフィルターをプレハイブリダイゼ
ーション液と共にビニール袋に入れ、６５℃で３〜４時
間処理する。

【００６７】次に、この中に^３２Ｐ標識したプローブＤ
ＮＡ及びハイブリダイゼーション液を入れ、６５℃で１
２時間程度反応させる。ハイブリダイゼーション終了
後、適切な塩濃度、反応温度および時間（例えば、2×S
SC/0.1%SDS溶液、室温、１０分間）のもとで、フィルタ
ーを洗う。該フィルターをビニール袋に入れ、2×SSCを
少量加え、密封し、オートラジオグラフィーを行う。

【００６８】上記サザンブロット法により、マウスモノ
クローナル抗体のＨ鎖及びＬ鎖を各々コードする再配列
されたＶＤＪ遺伝子及びＶＪ遺伝子を同定する。同定し
たＤＮＡ断片を含む領域をショ糖密度勾配遠心にて分画
し、ファージベクター（例えば、Charon 4A、Charon 2
8、λEMBL3、λEMBL4等）に組み込み、該ファージベク
ターで大腸菌（例えば、LE392、 NM539等) を形質転換
し、ゲノム ライブラリーを作製する。そのゲノムライ
ブラリーを適当なプローブ（Ｈ鎖Ｊ遺伝子、Ｌ鎖（κ）
Ｊ遺伝子等）を用いて、例えばベントンデイビス法（Sc
ience、第196巻、第180〜第182頁、1977年）に従って、
プ ラークハイブリダイゼーションを行い、再配列され
たＶＤＪ遺伝子あるいはＶＪ遺伝子を各々含むポジティ
ブクローンを得る。得られたクローンの制限酵素地図を
作製し、塩基配列を決定し、目的とする再配列されたＶ
_H(VDJ)遺伝子あるいはＶ_L(VJ)遺伝子を含む遺伝子が得
られていることを確認する。

【００６９】一方、キメラ化に用いるヒトＣ_H遺伝子及
びヒトＣ_L遺伝子を別に単離する。例えば、ヒトIgG1と
のキメラ抗体を作製する場合には、Ｃ_H遺伝子であるＣ
γ1遺伝子とＣ_L遺伝子であるＣκ遺伝子を単離する。こ
れらの遺伝子はマウス免疫 グロブリン遺伝子とヒト免
疫グロブリン遺伝子の塩基配列の高い相同性を利用して
ヒトＣγ1遺伝子及びヒトＣκ遺伝子に相当するマウス
Ｃγ1遺伝子及びマウスＣκ遺伝子をプローブとして用
い、ヒトゲノムライブラリーから単離することによって
得ることができる。

【００７０】具体的には、例えば、クローンIg146（Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA、第75巻、第4709〜第4713
頁、1978年）からの3kbのHind III−BamHI断片と クロ
ーンMEP10（Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第78巻、第4
74〜第478頁、1981年）からの6.8kbのEcoRI断片をプロ
ーブとして用い、ヒトのラムダCharon 4A のHae III−A
luIゲノムライブラリー（Cell、第15巻、第1157〜第117
4頁、1978年）中から、ヒトＣκ遺伝子を含み、エンハ
ンサー領域を保持しているＤＮＡ断片を単離する。ま
た、ヒトＣγ1遺伝子は、例えばヒト胎児肝細胞ＤＮＡ
をHind IIIで切断し、アガロースゲル電気泳動 で分画
した後、5.9kbのバンドをλ788に挿入し、前記のプロー
ブを用いて単離する。

【００７１】このようにして単離されたマウスＶ_H遺伝
子とマウスＶ_L遺伝子、及びヒトＣ_H遺伝子とヒトＣ_L遺
伝子を用いて、プロモーター領域及びエンハンサー領域
などを考慮しながらマウスＶH遺伝子の下流にヒトＣ_H遺
伝子を、またマウスＶ_L遺伝子の下流にヒトＣ_L遺伝子
を、適切な制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いて、例え
ばｐSV2gptあるいはｐSV2neo等の発現ベクターに常法に
従って組み込む。この際、マウスＶ_H遺伝子／ヒトＣ_H遺
伝子とマウスＶ_L遺伝子／ヒトＣ_L遺伝子のキメラ遺伝子
は、一つの発現ベクターに同時に配置されてもよいし、
各々別個の発現ベクターに配置することもできる。

【００７２】このようにして作製したキメラ遺伝子挿入
発現ベクターを、例えばP3X63・Ag8・653細胞あるいは SP
210細胞といった、自らは抗体を産生していない骨髄腫
細胞にプロトプラスト融合法、DEAE−デキストラン法、
リン酸カルシウム法あるいは電気穿孔法等により導入す
る。形質転換細胞は、発現ベクターに導入された薬物耐
性遺伝子に対応する薬物含有培地中での培養により選別
し、目的とするキメラモノクローナル抗体産生細胞を取
得する。このようにして選別された抗体産生細胞の培養
上清中から目的のキメラモノクローナル抗体を取得す
る。

【００７３】「ヒト型モノクローナル抗体（CDR-grafte
d抗体）」は、遺伝子工学的に作製されるモノクローナ
ル抗体であって、具体的には、その超可変領域の相補性
決定領域の一部または全部が非ヒト哺乳動物（マウス、
ラット、ハムスターなど）のモノクローナル抗体に由来
する超可変領域の相補性決定領域であり、その可変領域
の枠組領域がヒトイムノグロブリン由来の可変領域の枠
組領域であり、かつその定常領域がヒトイムノグロブリ
ン由来の定常領域であることを特徴とするヒト型モノク
ローナル抗体を意味する。

【００７４】ここで、超可変領域の相補性決定領域と
は、抗体の可変領域中の超可変領域に存在し、抗原と相
補的に直接結合する部位である３つの領域（Complement
arity-determining residue；CDR1、CDR2、CDR3）を指
し、また可変領域 の枠組領域とは、該３つ相補性決定
領域の前後に介在する比較的保存された４つの領域（Fr
amework region；FR1、FR2、FR3、FR4）を指す。換言す
れば、非ヒト哺乳動物由来のモノクローナル抗体の超可
変領域の相補性決定領域の一部または全部以外の全ての
領域が、ヒトイムノグロブリンの対応領域と置き代わっ
たモノクローナル抗体を意味する。

【００７５】ヒトイムノグロブリン由来の定常領域は、
IgG（IgG1, IgG2, IgG3, IgG4）、IgM、IgA、IgD及びIg
E等のアイソタイプにより各々固有のアミノ酸配列を有
するが、本発明においては、該ヒト型モノクローナル抗
体の定常領域はいずれのアイソタイプに属するヒトイム
ノグログリンの定常領域であってもよい。好ましくは、
ヒトIgGの定常領域である。また、ヒトイムノグロブリ
ン由来の可変領域の枠組領域についても限定されるもの
ではない。

【００７６】ヒト型モノクローナル抗体は、例えば以下
のようにして製造することができる。しかしながら、そ
のような製造方法に限定されるものでないことは言うま
でもない。例えば、マウスモノクローナル抗体に由来す
る組換ヒト型モノクローナル抗体は、特表平4-506458号
公報及び特開昭62-296890号公報等を参照して、遺伝子
工学的に作製することができる。即ち、マウスモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマから、少なくとも
１つのマウスＨ鎖CDR遺伝子と該マウスＨ鎖CDR遺伝子に
対応する少なくとも１つのマウスＬ鎖CDR遺伝子を単離
し、またヒトイムノグロブリン遺伝子から前記マウスＨ
鎖CDRに対応するヒトＨ鎖CDR以外の全領域をコードする
ヒトＨ鎖遺伝子と、前マウスＬ鎖CDRに対応するヒトＬ
鎖CDR以外の全領域をコードするヒトＬ鎖遺伝子を単離
する。

【００７７】単離した該マウスＨ鎖CDR遺伝子と該ヒト
Ｈ鎖遺伝子を発現可能なように適当な発現ベクターに導
入し、同様に該マウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子と該ヒトＬ鎖遺
伝子を発現可能なように適当なもう１つの発現ベクター
に導入する。または、該マウスＨ鎖CDR遺伝子／ヒトＨ
鎖遺伝子とマウスＬ鎖CDR遺伝子／ヒトＬ鎖遺伝子を同
一の発現ベクターに発現可能なように導入することもで
きる。このようにして作製された発現ベクターで宿主細
胞を形質転換することによりヒト型モノクローナル抗体
産生形質転換細胞を得、該形質転換細胞を培養すること
により培養上清中から目的のヒト型モノクローナル抗体
を得る。

【００７８】「ヒトモノクローナル抗体」とは、イムノ
グロブリンを構成するＨ鎖の可変領域及びＨ鎖の定常領
域並びにＬ鎖の可変領域及びＬ鎖の定常領域を含む全て
の領域がヒトイムノグロブリンをコードする遺伝子に由
来するイムノグロブリンである。ヒト抗体（好ましくは
ヒトモノクローナル抗体）は、常法に従って、例えば、
少なくともヒトイムノグロブリン遺伝子をマウス等のヒ
ト以外の哺乳動物の遺伝子座中に組込むことにより作製
されたトランスジェニック動物を、抗原で免疫感作する
ことにより、前述したポリクローナル抗体あるいはモノ
クローナル抗体の作製法と同様にして製造することがで
きる。

【００７９】例えば、ヒト抗体を産生するトランスジェ
ニックマウスは、Nature Genetics,Vol.7, p.13-21, 19
94；Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997；特
表平4-504365号公報；特表平7-509137号公報；日経サイ
エンス、６月号、第40〜第50頁、1995年；国際出願公開
WO94/25585号公報；Nature, Vol.368, p.856-859, 199
4；及び特表平6-500233号公報などに記載の方法に従っ
て作製することができる。また、昨今開発された技術で
あるトランスジェニックなウシやブタのミルク中からヒ
ト由来タンパクを製造方法を適用することも可能である
（日系サイエンス、1997年４月号、第78頁乃至84頁）。

【００８０】本発明における「抗体の一部」とは、前述
のようなモノクローナル抗体の一部分の領域を意味し、
具体的にはF(ab')_２、Fab'、Fab、Fv（variable fragme
nt of antibody）、sFv、dsFv（disulphide stabilised
Fv）あるいはdAb（single domain antibody）などを意
味する（Exp. Opin. Ther. Patents，第６巻，第５号，
第441〜456頁，1996年）。ここで、「F(ab')_２」及び
「Fab'」とは、イムノグロブリン（モノクローナル抗
体）を、蛋白分解酵素であるペプシンあるいはパパイン
等で処理することにより製造され、ヒンジ領域中の２本
のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の前後で消化され
て生成される抗体フラグメントを意味する。例えば、Ig
Gをパパインで処理すると、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖
間に存在するジスルフィド結合の上流で切断されてＶ_L
（Ｌ鎖可変領域）とＣ_L（Ｌ鎖定常領域）からなるＬ
鎖、及びＶ_H（Ｈ鎖可変領域）とＣ_Hγ1（Ｈ鎖定常領域
中のγ1領域）とからなるＨ鎖フラグメントがＣ末端領
域でジスルフィド結合により結合した相同な２つの抗体
フラグメントを製造することができる。これら２つの相
同な抗体フラグメントを各々Fab'という。またIgGをペ
プシンで処理すると、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存
在するジスルフィド結合の下流で切断されて前記２つの
Fab'がヒンジ領域でつながったものよりやや大きい抗体
フラグメントを製造することができる。この抗体フラグ
メントをF(ab')_２という。

【００８１】本発明における「移植片拒絶反応（graft
rejection）」とは、移植片（移植される生体の一部で
あり、細胞、組織または臓器）のドナーのレシピエント
の遺伝的背景が異なる場合（即ち、同種移植または異種
移植）、移植片がレシピエントによって異物と認識され
ることによりレシピエントの免疫系がその移植片を拒絶
し排除しようとする様々な免疫反応である。この移植に
伴うこの免疫反応は、（1）移植直後に起こる強い拒絶
反応である超急性拒絶反応（hyper-acute rejection re
action）、（2）移植後数ヶ月以内に見られる急性拒絶
反応（acute rejection reaction）、（3）移植後数ヶ
月以降に見られる慢性拒絶反応（chronic rejection re
action）に分けられる。また、Ｔ細胞に代表される免疫
担当細胞による細胞性免疫と抗体による液性免疫が複雑
に連携した形で起こるが、主としては細胞性免疫であ
る。この移植片拒絶反応により、移植片は最終的には壊
死脱落する。また、レシピエントには、発熱、白血球増
多、倦怠感などの重篤な全身症状だけでなく、移植局所
の腫脹や圧痛が起こる。さらには、感染症などの重篤な
合併症を引き起こすこととなる。とりわけ、ブタなどの
異種の移植片をヒトに移植する場合には、超急性拒絶反
応が起こり移植片が分単位で拒絶されてしまうという大
きな問題が存在する。

【００８２】本発明における「移植片」とは、ドナー哺
乳動物からレシピエント哺乳動物に移植される「臓器ま
たはその一部」または「組織」を意味する。本発明にお
ける当該移植に係る「臓器またはその一部」とは、哺乳
動物（好ましくはヒトまたはブタであり、特に好ましく
はヒトである。）の生体を構成する任意の臓器またはそ
の一部を意味する。好ましくは、肝臓、心臓、肺、膵
臓、腎臓、大腸若しくは小腸、またはその一部を挙げる
ことができる。特に好ましくは、肝臓またはその一部で
ある。本発明における移植に係る「組織」とは、哺乳動
物（好ましくはヒトまたはブタであり、特に好ましくは
ヒトである。）の生体に由来する任意の組織を意味す
る。好ましくは、皮膚、角膜若しくは骨などの組織、ま
たは心臓弁などが挙げられるがこの限りではない。

【００８３】本発明における「免疫抑制剤」とは、臨床
現場において行われている細胞、組織あるいは臓器の移
植において、移植片の移植により惹起されるレシピエン
トにおける免疫拒絶反応（移植片拒絶反応）を抑制する
ために用いられている政府機関から医薬品としての製造
販売承認された既存の１または複数の任意の免疫抑制
剤、または現在臨床試験若しくは前臨床試験中であるか
または将来臨床試験において使用され、当該試験の後に
将来政府機関から医薬品としての製造販売承認がされる
であろう１または複数の任意の免疫抑制剤を意味する。
それらの免疫抑制剤は、単独で用いられるだけでなく、
2剤、3剤またはそれ以上を併用して用いられている。従
って、本発明に係る「免疫抑制剤」とは、1種の薬剤の
使用、または複数の薬剤の併用（好ましくは2剤若しく
は3剤の併用）も含む。

【００８４】当該免疫抑制剤としては、好ましくは、サ
イクロスポリン（cyclosporin; CsA）； タクロリムス
（tacrolimus; FK-506）； アザチオプリン（azathiop
rine; AZ）； ミコフェノール酸モフェティル（mycoph
enolate mofetil; MMF）；ミゾリビン（mizoribine; M
Z）； レフルノマイド（leflunomide; LEF）； プレ
ドニゾロン（predonisolon）やメチルプレドニゾロン
（methylpredonisolon）などの副腎皮質ステロイド（別
称：副腎皮質ホルモン；コルチコステロイド(corticost
eroid)；コルチコイド(corticoid)）； シロリムス（s
irolimus）（別称：ラパマイシン(rapamycin)）； デ
オキシスパーガリン（deoxyspergualin; DSG）； FTY7
20（化学名称：2-amino-2-[2-(4-octylphenyl)ethyl]-
1,3-propanediol hydrochloride）及び後述する「CTLA4
医薬」から選ばれる１または複数の薬剤を挙げることが
できる。特に好ましくはタクロリムス（FK-506）及びサ
イクロスポリンのいずれかまたは両方である。

【００８５】本発明における「CTLA4医薬」とは、
（１）ヒトのCTLA4（cytotoxic T lymphocyte-assoscia
ted antigen 4; 〈アミノ酸配列〉GenBank Accession N
o.NP 005205；〈cDNA〉GenBank Accession No.NM 00521
4）の全長（実質的に同一なアミノ酸配列を有する分子
を含む。）または細胞外領域の全部若しくはその一部か
らなるポリペプチド、（２）ヒトCTLA4の細胞外領域の
全部若しくは一部と他の蛋白質の全部若しくは一部（特
に好ましくは、ヒト免疫グロブリン重鎖の定常領域の全
部または一部）とからなる融合ポリペプチド（以下、CT
LA4-IgFcまたはCTLA4-Igと省略する。）、または（３）
前記(1)のポリペプチドまたは前記(2)の融合ポリペプチ
ドを哺乳動物（特に好ましくはヒト）の体内に供給し得
るDNAまたは該DNAからなるベクター（特に好ましくは遺
伝子治療で汎用されるプラスミドあるいはウイルス（レ
トロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスな
ど）に由来するウイルスベクターなど）を活性成分とし
て含む医薬を意味する。ここで「細胞外領域」、「一
部」、「免疫グロブリン重鎖の定常領域」、「融合ポリ
ペプチド」、「実質的に同一」等の各用語は、前述の定
義と同様の意味を有する。

【００８６】前述のCTLA4-Igの有意な免疫抑制効果につ
いては多数の報告があり、例えば、Bristol-Myers Squi
bb社／Repligen社の開発品であるY100F（100番目のチロ
シンがアラニンに変換されている）の高い免疫抑制効果
が種々の動物試験で確認されており、この製品も本発明
におけるCTLA4医薬の一つとして包含される（医学のあ
ゆみ, Vol.194, No.14, p.1195-1200, 2000; J. Clin.
Invest., Vol.103, p.1223-1225, 1999; N. Engl. J. M
ed., Vol.335, p.1369-1377, 1996; J. Exp. Med., Vo
l.178, p.1801-1806, 1993; Blood, Vol.94, p.2523-25
29, 1999; Nature Med., Vol.6, p.464-469, 2000; Blo
od, Vol.83, p.3815-3823, 1995; J. Clin. Invest., V
ol.2, p.473-482, 1998; Blood, Vol.85, p.2607-2612,
1995; N.Engl. J. Med., Vol.340, p.1704-1714, 199
9; N. Engl. J. Med., Vol.335, p.1369-1377, 1996;
J. Clin. Invest., Vol.103, p.1243-1252, 1999）。

【００８７】本発明において「薬学的に許容され得る担
体」とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、
保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘
稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が
挙げられる。そのような担体の一つ以上を用いることに
より、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、注射剤、液剤、カプ
セル剤、トローチ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤ある
いはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することが
できる。これらの医薬組成物は、経口あるいは非経口的
に投与することができる。非経口投与のためのその他の
形態としては、一つまたはそれ以上の活性物質を含み、
常法により処方される外用液剤、腸溶内投与のための坐
剤およびペッサリーなどが含まれる。

【００８８】投与量は、患者の年齢、性別、体重及び症
状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬組
成物に含有される活性成分（前記の本発明に係る「物
質」など）の種類などにより異なるが、通常成人一人当
たり、一回につき10μgから1000mg（あるいは10μgから
500mg）の範囲で投与することができる。しかしなが
ら、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与
量より少ない量で十分な場合もあり、また上記の範囲を
越える投与量が必要な場合もある。

【００８９】とりわけ注射剤の場合には、例えば生理食
塩水あるいは市販の注射用蒸留水等の非毒性の薬学的に
許容され得る担体中に0.1μｇ抗体／ml担体〜10mg抗体
／ml担体の濃度となるように溶解または懸濁することに
より製造することができる。このようにして製造された
注射剤は、処置を必要とするヒト患者に対し、１回の投
与において１kg体重あたり、１μｇ〜100mgの割合で、
好ましくは50μｇ〜50mgの割合で、１日あたり１回〜数
回投与することができる。投与の形態としては、静脈内
注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内
注射のような医療上適当な投与形態が例示できる。好ま
しくは静脈内注射である。

【００９０】また、注射剤は、場合により、非水性の希
釈剤（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール、オリーブ油のような植物油、エタノールのよう
なアルコール類など）、懸濁剤あるいは乳濁剤として調
製することもできる。そのような注射剤の無菌化は、バ
クテリア保留フィルターを通す濾過滅菌、殺菌剤の配合
または照射により行うことができる。注射剤は、用時調
製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥
法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の
注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することが
できる。

【００９１】本発明の医薬組成物は、重篤な循環器系疾
患に罹患しているレシピエントのドナーの臓器（肝臓、
心臓、肺、腎臓、膵臓など）若しくはその一部または組
織（皮膚、角膜、骨などの組織）を移植（同種移植また
は異種移植）による治療における深刻な問題である免疫
拒絶反応（移植片拒絶反応）を抑制、予防及び／または
治療のために極めて有用である。本発明の医薬組成物は
また、そのような移植治療での移植片拒絶反応の抑制の
ために施されている既存の免疫抑制剤による移植片拒絶
反応の抑制において併用することにより、移植片拒絶反
応（免疫拒絶反応）の抑制の効果を増大させることが可
能である。

【００９２】以下、実施例を以て本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明が該実施例に記載される態様のみに
限定されるものではないことは言うまでもない。 実施例１ 肝臓移植での移植片拒絶反応のAILIM制御物
質による抑制効果 <1>試薬及び試験方法 <1-1> 動物 成体Lewisラット（雄、210-250g）及びDAラット（雄、2
10-250g）を、各々レシピエント及びドナーとして用い
た。 <1-2> 抗ラットAILIMモノクローナル抗体 既報のマウス抗ラットAILIMモノクローナル抗体（マウ
ス抗ラットJTT-1抗原モノクローナル抗体）を産生する
「JTT-1」と命名したハイブリドーマ（当該ハイブリド
ーマは1996年10月11日付でブダペスト条約の下で認定さ
れた国際寄託機関である日本国通産省工業技術院生命工
学工業技術研究所に国際寄託されている。国際寄番号：
FERM BP-5707）をin vitroまたはin vivoで培養して得
られる培養上清または腹水から精製したモノクローナル
抗体を用いた（日本国特許出願公開11-29599号公報（実
施例１及び２）、及び国際特許出願公開WO98/38216号
（実施例１及び２））。以下、この抗体を単に抗AILIM
抗体と呼ぶ。

【００９３】<1-3> 肝臓の移植 既報の鎌田らの方法に従って、ドナーとしてのDAラット
の肝臓をレシピエントとしてのLewisラットに移植した
（Surgery, 93, p.64, 1983; Transplantation,30, p.4
3, 1980; Transplantation, 28, p.47, 1979）。即ち、
DAラットから採取した肝臓を門脈血管（portal vein）
から氷冷滅菌蒸留水を流すことにより洗浄した。次い
で、肝上の大静脈（supra-hepatic vena cava）を縫合
することにより、当該肝臓のレシピエントであるLewis
ラットへの移植を開始した。その後に、カフ（cuff）技
術を用いて、門脈血管（portal vein）と肝臓下の大静
脈（infra-hepatic vena cava）を縫合した（Transplan
t. Proc., 19, p.1158, 1987; Transplantation, 43,
p.745, 1987）。レシピエントであるラットが、移植の
完了後3日以内に死んだ場合を移植の技術的な失敗と判
断した。その結果、移植の成功率は95%であった。

【００９４】<1-4> 抗AILIM抗体及び／または免疫抑制
剤の投与 移植完了後のLewisラット（各群5-9匹）の各々に、抗AI
LIM抗体及び／または免疫抑制剤FK-506を下記の用量及
びタイミングで投与した。なお、移植完了直後をゼロ
（０）日目とした。なお、抗AILIM抗体及び免疫抑制剤F
K-506のいずれをも投与しない群を対照とした。 １．抗AILIM抗体（1mg/kg；静注；０日目） ２．抗AILIM抗体（1mg/kg；静注；０及び６日目） ３．抗AILIM抗体（1mg/kg；静注；０、３及び６日目） ４．抗AILIM抗体（1mg/kg；静注；０、３、６、９及び1
2日目） ５．抗AILIM抗体（0.3mg/kg；静注；０、３、６、９及
び12日目） ６．FK-506（1mg/kg；筋注；０日目） ７．抗AILIM抗体（1mg/kg；静注；０日目）とFK-506（1
mg/kg；筋注；０日目） 移植肝の生存日数（移植肝のレシピエント内での生着の
日数）を、Kaplan-Meierテストに従って評価して求め
た。

【００９５】<2> 結果 結果を図１及び図２に示す。図２のデータの一部は、図
１に示すデータを更新したものである。この結果、対照
に比べ、抗AILIM抗体（1mg/kg）を、移植後経時的に3回
または5回投与した群において、移植肝の生存日数（移
植肝の生着日数）の有意な改善が見られた。また、さら
に低用量の抗AILIM抗体（0.3mg/kg）を、移植後経時的
に5回投与した群においても同様に生存日数（移植肝の
生着日数）の有意な延長が観察された。さらに、驚くべ
きことに、臨床現場において汎用されている免疫抑制剤
であるFK-506と抗AILIM抗体を併用した場合には、抗AIL
IM抗体の投与が1回であるにも関わらず、移植肝の生存
日数（移植肝の生着日数）は大幅に延長され、FK-506
（1mg/kg）を単独で1回投与した場合の生存日数（移植
肝の生着日数）をはるかに上回るものであった。

【００９６】この結果から、下記が明らかになった。 １）抗AILIM抗体は、臓器等の移植片の移植に伴い起こ
る移植片拒絶反応（免疫拒絶反応）を有意に抑制する。 ２）抗AILIM抗体と免疫抑制剤を併用することにより、
いずれか一方を用いた場合よりも、臓器等の移植片の移
植に伴い起こる移植片拒絶反応をさらに強く抑制するこ
とができる。

【００９７】実施例２ 心臓移植での免疫拒絶反応のAI
LIM制御物質による抑制効果（その１） <1>試薬、動物及び試験方法 <1-1> 動物 成体C3H/Heマウス（雄、6週齢）及びBALB/cマウス
（雄、6週齢）を、各々レシピエント及びドナーとして
用いた。 <1-2> 抗マウスAILIMモノクローナル抗体の調製 以下のようにして調製した。既報のマウスAILIM（Int.
Immunol., Vol.12, No.1, p.51-55, 2000）の全長アミ
ノ酸配列をコードするcDNAを用いて、遺伝子組換え技術
を用いて常法に従ってマウスAILIMを発現する形質転換
細胞を調製した。該形質転換細胞をホモジナイズし、超
遠心分離（100,000×ｇ）して、細胞膜画分を含む遠心
残さを回収し、PBSに懸濁させた。得られた細胞膜画分
を、完全フロインドアジュバントとともにWistarラット
のフッドパッド内に注射することにより初回免疫（０
日）した。さらに該細胞膜画分抗原を7日目、14日目お
よび28日目という間隔でフットパッド内に投与した。最
後の免疫から２日後にリンパ節細胞を採取した。

【００９８】該リンパ節細胞とマウスミエローマ細胞PA
I（JCR No.B0113; Res. Disclosure, Vol.217, p.155,
1982）とを５：１で混合し、融合剤としてポリエチレン
グリコール4000（Boehringer Mannheim製）を用いて細
胞融合させることによりモノクローナル抗体産生ハイブ
リドーマを作製した。ハイブリドーマの選択は、10％ウ
シ胎児血清とアミノプテリンを含有するHAT含有ASF104
培地（味の素製）中で培養することにより行った。各々
のハイブリドーマの培養上清中に生成されたモノクロー
ナル抗体のマウスAILIMに対する反応性を、各々の培養
上清を、前記組換えマウスAILIM発現形質転換細胞に反
応させた後、FITC標識抗ラットIgG（Cappel製）と反応
させることにより染色された細胞の蛍光強度をEPICS-EL
ITEフローサトメーターで測定することにより確認し
た。この結果、マウスAILIMに反応性を有するモノクロ
ーナル抗体を産生する複数のハイブリドーマを得た。そ
れらのハイブリドーマの内の１つを「B10.5」と命名し
た。このハイブリドーマ（各々10⁶乃至10⁷個／0.5ml／
マウス）を、ICR nu/nuマウス（雌、７乃至８週齢）の
腹腔内に注射した。１０乃至２０日後、マウスを麻酔下
で開腹し、常法に従って採取した腹水からラット抗マウ
スAILIMモノクローナル抗体（IgG2a)を大量調製した。
以下、この抗体を単に抗AILIM抗体と呼ぶ。

【００９９】<1-3> 心臓の移植 既報の方法に従って、ドナーとしてのBALB/cマウスの心
臓をレシピエントとしてのC3H/Heマウスの腹部に移植し
た。なお、移植心の拍動の消失を以って移植拒絶の完結
と判断した。

【０１００】<2> 試験１（抗AILIM抗体の投与による） 移植完了後のC3H/Heマウス（10匹）の各々に、抗AILIM
抗体（10mg/kg）を移植直後（０日；200μg）、２日目
（200μg）、４日目（200μg）、７日目（200μg）及び
10日目（100μg）に投与した。抗AILIM抗体を投与しな
い群（25匹）を対照とした。移植後の移植心の生存日数
（移植心のレシピエント内での生着の日数）を、Kaplan
-Meierテストに従って評価して求めた。移植心のレシピ
エント内での生着日数の平均値は、下記のとおりであっ
た。 （抗AILIM抗体投与群） 生着日数： 9日が1匹、10日が3匹、13日が4匹、16日が
2匹 （対照群） 生着日数： 6日が2匹、7日が9匹、8日が7匹、9日が3
匹、10日が4匹 抗AILIM抗体を投与しない対照群では7.9日であったのに
対し、抗AILIM抗体投与群では12.3日であり、抗AILIM抗
体投与群では移植心の生着日数の有意な延長が確認され
た。

【０１０１】<3> 試験２（抗AILIM抗体またはAILIM-Ig
の投与による） 動物（ドナー及びレシピエント）及び抗AILIM抗体は前
記と同一のものを用いた。一方、本試験で用いるAILIM-
Igは、既報と同様にして調製したマウスAILIMの細胞外
領域とIgG-Fcとの融合蛋白を用いた（国際出願公開公報
WO98/38216；欧州特許出願公開EP0984023）。また、心
臓の移植は、試験１と同様にして行った。移植完了後の
C3H/Heマウスの各々に、抗AILIM抗体（100μg/day）ま
たはAILIM-Ig（100μg/day）を移植直後（０日）、２日
目、４日目、７日目及び10日目に腹腔内投与した。抗AI
LIM抗体及びAILIM-Igのいずれをも投与しない動物群を
対照とした。

【０１０２】移植心のレシピエントマウス内での生着日
数の平均値は、対照群では約7.7日であったのに対し、
抗AILIM抗体投与群では約40.9日（中間値：29日／最
長：120日）であり、またAILIM-Ig投与群では30日以上
（中間値：20日／最長：64日）であった（図３及び図
４）。即ち、抗AILIM抗体投与群及びAILIM-Ig投与群の
いずれにおいても、移植心の生着期間の有意な延長が確
認された。また、常法に従ってHE染色（hematoxylin/eo
sin-staining）により、AILIM（ICOS）発現細胞の移植
心への浸潤の程度を、対照マウス（心移植後の治療的処
置なし）及び移植後に抗AILIM抗体が投与されたマウス
の各々について解析した。その結果、無治療群では、AI
LIM(ICOS)発現細胞の強い浸潤に加え、心筋の壊死が認
められた（強染部分）。一方、抗AILIM抗体の投与を受
けたマウスの移植心においては、心筋壊死は認められ
ず、AILIM（ICOS）発現細胞の浸潤の有意な減少が認め
られた（図５）。

【０１０３】実施例３ 心臓及び皮膚の移植での免疫拒
絶反応のAILIM制御物質による抑制効果 <1>試薬、動物及び試験方法 <1-1> アデノウイルスベクター 発現コスミドカセットpAdex/CAhCTLA4-Ig（Transplatat
ion, Vol.68, No.6, p.758, 1999）及び親株でのあるア
デノウイルスのゲノム（Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,
Vol.90, No.24, p.11498-11502, 1993）との間の相同
組換えにより、hCTLA4-Ig（ヒトCTLA4の細胞外領域とヒ
トのFcとからなる融合蛋白）をコードするcDNAまたは大
腸菌のβガラクトシダーゼ遺伝子（LacZ）の発現カセッ
トを含む組換えアデノウイルスを作製した。次いで、該
組換えウイルスをヒト腎臓由来の293細胞株中で増殖さ
せた。そうして調製されたウイルスベクターを回収し、
−80℃で凍結保存した。hCTLA4-IgのcDNAを含む組換え
アデノウイルス及びLacZを含むアデノウイルスを各々、
AdCTLA4-Ig及びAdLacZと命名した。

【０１０４】<1-2> 動物及び抗体 成体雄（210-250g）のLewis（RT1^l）ラットをレシピエ
ントとして、また成体雄（210-250g）のDA（RT1^a）ラッ
ト若しくはBN（RT1ⁿ）ラットをドナーとして用いた。実
施例１で調製したマウス抗ラットAILIMモノクローナル
抗体を用いた。

【０１０５】<1-3> 心臓及び皮膚の移植及び試験方法 既報の方法（J. Thorac. Cardiovasc. Surg., Vol.57,
No.2, p.225-229, 1969）に従い、DAラットから取得し
た心臓をLewisラットの腹腔に移植した。心移植の直後
に、該レシピエントラットに、抗ラットAILIM抗体（1mg
/kg）及び／またはAdCTLA4-Ig（10⁹ plague-forming un
it; pfu）を単回静脈内投与した。抗ラットAILIM抗体及
びAdCTLA4-Igのいずれをも投与しない移植動物群、及び
それらの代わりにAdLacZを投与した移植動物群を対照と
した。各動物群の処置方法は下記のとおり。 グループ１： 同種移植（Lewis／DA）で、免疫抑制処
置なし。 グループ２： 同系移植（Lewis／Lewis）で、免疫抑制
処置なし。 グループ３： 同種移植（Lewis／DA）で、AdLacZを投
与。 グループ４： 同種移植（Lewis／DA）で、AdCTLA4-Ig
を投与。 グループ５： 同種移植（Lewis／DA）で、抗AILIM抗体
を投与。 グループ６： 同種移植（Lewis／DA）で、AdCTLA4-Ig
及び抗AILIM抗体を投与。なお、移植拒絶の完結は、移
植心の拍動の消失を以って判断した。該移植拒絶は、常
法に従ってHE染色（hematoxylin/eosin-staining）によ
り、移植心組織に浸潤した単核細胞及び筋細胞壊死を組
織学的に解析した確認した。

【０１０６】次に、移植心が長期に亘り生着したグルー
プ４及びグループ６のレシピエントラットの側胸壁に、
心移植から140日目に、DAドナーラットの十分な厚さの
皮膚片を移植した。該皮膚移植後においては、抗AILIM
抗体やAdCTLA4-Ig等による免疫抑制処置は施さなかっ
た。該皮膚片の生着期間の最終は、該移植皮膚片の黙視
可能な程度が当初の10％以下に減少した時をその時とし
た。

【０１０７】次に、ドナー型皮膚の移植を受け移植拒絶
反応を呈したグループ６のレシピエントの３匹の頚部
に、DAラットの心臓の最初の移植から200日目に、カフ
（cuff）技術（Acta. Pathol. Microbiol. Scand. [A],
Vol.79, No.4, p.366-372, 1971）を用いてドナーDAラ
ットの心臓を再度移植した。さらに、移植心が長期に亘
り生着したグループ６のレシピエントラットの残りに、
最初のDAドナーラットの心臓の移植から150日目に、BN
ドナーラットの心臓を移植した。移植片のレシピエント
内での生着の程度の統計的評価は、Kaplan-Meierのテス
トに従って行った。

【０１０８】<2> 試験結果 図６に示すとおり、異種移植を施した未処置動物群（グ
ループ１）に比べ、AdLacZを投与した動物群（グループ
３）及び単一用量の抗AILIM抗体を投与した動物群（グ
ループ５）では、移植心のレシピエント内での生着の有
意な延長は認められなかった。一方、AdCTLA4-Igを投与
した動物群（グループ４）では、移植心（最初に移植さ
れたDAラットの心臓）の生着期間が有意に延長された
（平均値：約64日）。また、該グループ４（10匹）の3
匹では、100日以上という長期間の移植心の生着が認め
られた（図６）。さらに、AdCTLA4-Igと抗AILIM抗体を
併用した動物群（グループ６）においては、全てのレシ
ピエントにおいて移植心（最初のDAラットの心臓）の生
着が無期限に（300日以上）延長された（図６）。

【０１０９】グループ４の該レシピエントラットにおい
ては、該移植皮膚の拒絶に伴い移植心（最初に移植され
たDAドナーラットの心臓）もまた拒絶されたのに対し、
グループ６の該レシピエントラットでは該移植心の拒絶
は見られなかった。図７に示すとおり、グループ４及び
グループ６においてドナーの皮膚移植を受けたレシピエ
ントラットのいずれにおいても、該移植皮膚が拒絶され
たものの、グループ４及び対照群における該移植皮膚の
拒絶は皮膚移植から12日以内に完結したのに対し、グル
ープ６においてはやや遅れ約16日以内であった。この結
果は、AdCTLA4-Igを単独で用いる場合に比べ、AdCTLA4-
Igとともに抗AILIM抗体を併用することで移植皮膚の拒
絶を遅らせることができることを示すものである。また
興味深いことに、グループ６において移植心（最初のDA
ラットの心臓）の長期の生着が認められたレシピエント
ラットでは、前述したとおり該移植皮膚は完全に拒絶さ
れたものの、2度目の移植心（2度目に移植されたDAドナ
ーラットの心臓）は無期限の生着が認められた。また、
当該レシピエントラットにおいては、最初に移植された
ドナー心臓が本試験の間中生着していた。

【０１１０】BNドナーラットの心臓の移植を受けたグル
ープ６のレシピエントにおいては、最初に移植されたDA
ラットの心臓は本試験の間中拍動を続け生着していた
が、2度目に移植された該BNドナーラットの心臓は、前
記グループ１の動物群での結果と同様の時間内で拒絶さ
れた。

【０１１１】

【発明の効果】本発明の医薬組成物は、重篤な循環器系
疾患に罹患しているレシピエントの、ドナーの臓器（肝
臓、心臓、肺、腎臓、膵臓など）若しくはその一部また
は組織（皮膚、角膜、骨などの組織）の移植（同種移植
または異種移植）による治療における深刻な問題である
免疫拒絶反応（移植片拒絶反応）の抑制、予防及び／ま
たは治療において極めて有用である。本発明の医薬組成
物はまた、そのような移植治療での移植片拒絶反応（免
疫拒絶反応）の抑制のために施されている既存の免疫抑
制剤と併用することにより移植片拒絶反応をより強く抑
制することが可能である。また、本発明の医薬組成物に
含まれるAILIMに対するヒト抗体を含んでなる医薬組成
物は、マウス由来の抗体をヒトに投与する際のアレルギ
ー等の副作用を全く惹起しないことから医薬品として極
めて有用である。

【０１１２】

【図面の簡単な説明】

【図１】移植したドナーの肝臓のレシピエント内での生
着日数の延長を指標とする、臓器移植に伴い起こる免疫
拒絶反応（移植片拒絶反応）の抗AILIM抗体及び／また
は免疫抑制剤による抑制効果を示す図。

【図２】移植したドナーの肝臓のレシピエント内での生
着日数の延長を指標とする、臓器移植に伴い起こる免疫
拒絶反応（移植片拒絶反応）の抗AILIM抗体及び／また
は免疫抑制剤による抑制効果を示す図。

【図３】移植したドナーの心臓のレシピエント内での生
着日数の延長を指標とする、臓器移植に伴い起こる免疫
拒絶反応（移植片拒絶反応）の抗AILIM抗体（抗ICOS抗
体と別称）による抑制効果を示す図。

【図４】移植したドナーの心臓のレシピエント内での生
着日数の延長を指標とする、臓器移植に伴い起こる免疫
拒絶反応（移植片拒絶反応）のAILIM-Ig（ICOS-Igと別
称）による抑制効果を示す図。

【図５】移植したドナーの心臓へ浸潤したAILIM発現細
胞の程度を示す図。

【図６】移植したドナーの心臓のレシピエント内での生
着日数の延長を指標とする、臓器移植に伴い起こる免疫
拒絶反応（移植片拒絶反応）の抗AILIM抗体及び／また
はAdCTLA4-Igによる抑制効果を示す図。

【図７】移植したドナーの心臓（一次心移植及び二次心
移植）及び皮膚（一次皮膚移植）のレシピエント内での
生着の有無を指標とする、臓器移植に伴い起こる免疫拒
絶反応（移植片拒絶反応）の抗AILIM抗体とAdCTLA4-Ig
との併用による抑制効果を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｐ 37/06 Ａ６１Ｐ 37/06 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA17 BA44 CA36 CA53 DA01 NA14 ZB082 4C085 AA13 AA14 BB17 CC05 DD22 DD23 DD33 DD34 DD43 GG08 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 MA52 MA55 MA56 NA14 ZB08

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 AILIMを介するシグナル伝達を制御する
   活性を有する物質及び薬学的に許容され得る担体を含ん
   でなり、臓器若しくはその一部または組織の移植に伴う
   移植片拒絶反応を抑制、治療または予防するための医薬
   組成物。
2. 【請求項２】 AILIMを介するシグナル伝達を制御する
   活性を有する物質及び薬学的に許容され得る担体を含ん
   でなり、１または複数の免疫抑制剤による臓器若しくは
   その一部または組織の移植に伴う移植片拒絶反応の抑
   制、治療または予防の効果を増大するための医薬組成
   物。
3. 【請求項３】 該免疫抑制剤が、アザチオプリン、副腎
   皮質ステロイド、サイクロスポリン、ミゾリビン及びタ
   クロリムス（FK-506）、ミコフェノール酸モフェティ
   ル、レフルノマイド、シロリムス、デオキシスパーガリ
   ン、FTY720及びCTLA4医薬から選ばれる１または複数の
   薬剤であることを特徴とする請求項２に記載の医薬組成
   物。
4. 【請求項４】 該移植が、同種移植であることを特徴と
   する請求項１乃至請求項３のいずれかに記載の医薬組成
   物。
5. 【請求項５】 該移植が、異種移植であることを特徴と
   する請求項１乃至請求項３のいずれかに記載の医薬組成
   物。
6. 【請求項６】 該臓器が、肝臓、心臓、腎臓、肺または
   膵臓であることを特徴とする請求項１乃至請求項５のい
   ずれかに記載の医薬組成物。
7. 【請求項７】 該組織が、皮膚、角膜または骨の組織で
   あることを特徴とする請求項１乃至請求項５のいずれか
   に記載の医薬組成物。
8. 【請求項８】 該物質が、蛋白性物質であることを特徴
   とする請求項１乃至請求項７のいずれかに記載の医薬組
   成物。
9. 【請求項９】 該蛋白性物質が、下記群から選ばれるい
   ずれかであることを特徴とする請求項８に記載の医薬組
   成物： ａ）AILIMに結合する抗体またはその一部； ｂ）AILIMの細胞外領域の全部または一部を含むポリペ
   プチド； ｃ）AILIMの細胞外領域の全部または一部と免疫グロブ
   リンの重鎖の定常領域の全部または一部とからなる融合
   ポリペプチド；及び ｄ）AILIMに結合するポリペプチド。
10. 【請求項１０】 該物質が、非蛋白性物質であることを
    特徴とする請求項１乃至請求項７のいずれかに記載の医
    薬組成物。
11. 【請求項１１】 該非蛋白性物質が、ＤＮＡ、ＲＮＡま
    たは化学的に合成された化合物であることを特徴とする
    請求項１０に記載の医薬組成物。