HU228108B1 - Graft rejection suppressing agents - Google Patents

Description

Beültetett am vagy szövet (“graft”) kilökődését szsppresszáló hatóanyagok

A taláhnásry tárgyát képezik olyan gyógyászati készítmények, amelyek “akováció által indukálható limfocita immuntnodulátór-moltfoib” (“AIIJM”, melyeket indukálható kostimuiátorként, ÍCOS-kéat is ismerünk), különösen az Á.1L1M áltat közvetített jelátviteli folyamatok biológiai aktivitását moduláló aktivitással rendelkező anyagot tartalmaznak,

Előnyösen, a találmány tárgyát képezik olyan gyógyászati készítmények, amelyek .AILIM-et expresszáló sejtek proliferáiácíóját moduláló (pl. gátló), vagy AHJM-et oxpresssáló sejtek cltokinierroeléséí (pl. ymterferon-termeléséí vagy ínierieukin-4-termeiését) moduláló (pl. gátló) aktivitással rendelkező anyagot tartalmaznak.

Még speeiíiknsabfes® a találmány tárgyát képezik 1) szerv, szerv része vagy szövet átültetésével együtt járó szöveti kilökődést reakció (“grafekíiökődés”, immunológiái kilökődés) gátlását, kezelését vagy megelőzését szolgáló gyógyászati készítméityek; és 2) szer/, szerv része vagy szövet átültetésével együtt járó szöveti kilökődésl reakció (“grsfikilőkődás”, immtmológlal kilökődés) ímmunszöppresszív hatóanyagai gátló, terápiás vagy megelőző hatása megnövelésére szolgáló gyógyászati készítmények,

A2al^btakbgnísamr^űka.tajáimfey hátterét.

A szervátültetést szsbálysze törvények legutóbbi felülvizsgálata következtében végrehajtottak néhány szervátültetést Japánban agyhaloít betegek szerveit télhasznáiva,. Az egyik esetben egv donortól hét beteg kapott szerveket. Ezek után a szervátültetések száma várhatóan növekszik majd.

Másrészről az. olyas japán betegek száma, akik súlyos kardiovaszkuláris betegségben szesvedsek, mint például inájheíegségekben (akut májelégtelenség, tnájuirrózis stb.), szívbetegségekben (súlyos szivelégtelenség, kardíouiiopáiia, szivnagyobbodás), stb.), vesebeíegségekben (veseelégíeienség, krónikás glemereíone&itisz, diabetikus neíropátia, ptelonefekisz, stb.), tüdőbetegségekben (mindkét tüdő működésképtelensége stb.) és a hasnyálmirigy betegségeiben (diabeteszes betegek kezelése), akik szántára a terápiás szervátültetés életmentő (kb.), becslések szerint évente körülbelül őOO-zal emelkedik a szívbetegek, körülbelül 300ö-rei a rnáibetegek és körülbelül 500-zal a tüdőbetegek esetében. Míg a jogi helyzet fejlődött, az átültethető saervek hiánya pillanatnyilag reális, létező probléma. Hasonló módon a szervek hiánya komoly probléma az Egyesült. Államokban, amely a szervátültetés szempontjából Fejlett állam. Az Egyesült Államokban (1999-ben) megközelítőleg 4300an várnak szívátültetésre, és (1999-ben) megközelítőleg 43000-en veseátültetésre. Ténylegesen megközelítőleg 8ö0-an illetve megközelítőleg 231)Ö-an halnak meg minden évben, meri sem jutnak szív- és veseátültetéshez.

Szövet (mint pl. bőr, szamhártya és csont) vagy szerv (mint pl. máj, szív, vese, tüdő és hasnyálmirigy) átültetése magában foglal: 1) auto-transzpianíáriőt (antológ transzplantációt), 2) izo-Snmszplantádőt 3) ahotranszplantációt és 4) xeno-'trajrsxplaníáeiőt.

Az auto-transzplantáció kifejezésen étijük azt,, ha egy személy esetében a test egy részét máshova átültetjük, példaként említjük azt, ha égés kezelésekor a saját, normál bőrt az érintett területre átültetjük.

As izo-iwtszphmtáeióí homogén állatok között hajtják végre. Emberek esetében ilyen átültetést hajtanak végre egypetéjű ikrek között (pl. vesék vagy májszövetek átültetése).

Allo-transzpolsrháeíőt hajtanak végre két különböző személy esetében, akik genetikai háttere különböző; ilyen átültetést hajtanak végre kétpeíéju ikrek között vagy egymással nem rokon egyének között,

Xemo-iranszplnmáeiői hajtattak végre, különböző állatfajokhoz tartozó egyebek között. Példaként emiít1Ő849Ö-8Ó61/SG φφφ jak 82t az esetet, «tuskor csimpánz vagy sertés szövetét vagy szervét emberbe ültetik.

Amint fent említettük, az agybaloít betegekből történó ailo-imnssplastáeiő (száma) várhatóan növekedni fog a szervátültetéssel kapcsolatos törvényhozás fejlődése következtében. Az átültethető szervek abszolút hiányának megoldása céljából különböző kutatásokat végeznek, amelyek a ?teno-íi'an?zplantáció, specrükusabban a nem humán emlős, mint például a. sertés szövetei vagy szervei emberbe történő transzplantációja gyakorlati alkalmazásait célozzák meg.

Az átültethető szövetek és szervek hiánya várhatóan megoldható az agyhalálra és üanszplsíttácíóra vonatkozó- törvények fejlődésével és a xexm-teasszplaatáeiós technikák j-avnlásával, azonban egy másik, szélsőségesen nagy akadály az allo-transzplanfációvai és xeno-transzpkmláoiőval kapcsolatos betegségek .kezelése. Még speciíikusabbaa az akadály a recipiensben, a donortól származó szervek vagy szövetek transzplantációja után fellépő súlyos immunológiai kilökődés (graftkilökődés),

A graftkilökődés alatt azokat a különböző immunválaszokat érijük, amellyel a donortól beülteted: szövet, gretfí (élő test része, amelyet átültetünk, sejt, szövet vagy szerv) kilökésére és megsemmisítésére törekszik, álról a donor genetikai háttere a reetpsssétől eltérő (azaz allo-traeszplaníáció vagy xenotransjgílanláctó esetében), mivel a racieas a gvuZf-ot Idegen anyagként Ismeri fel. Áz átültetést kísérő Immunválaszok & következőképpen osztályozhatók: 1) híperakut kilökődés, amely a transzplantációt kővetően azonnal fellépő erős kilökődés! reakció, 2) akut. kilökődés, amely a transzplantáció után néhány hónappal figyelhető meg, és 3) krónikus transplsmfáeió. amely a transzplantáció után jő néhány hónappal lép fel. Ráadásul a fő válaszreakciót a sejtes immunitás adja, noha a sejtes immunitást a T-sejtek által képviselt immunkompetens sejtek adják, es a immorális imrmmitást bonyolultan koordinált antitestek adjak.

A graftkilökődés eredményeképp a graft végső soron sekrotiknssá válik és leesik. Ráadásul a recipiess nemcsak súlyos főseteket mutat, mist például a láz. leukoertózis és kimerültség, leniem a transzplantáció helyén duzzadást és érzékenységet is. Ráadásul súlyos komplikációk, mint. például fertőzések is felléphetnek.

Közelebbről xenogén graft, mint például sertésből származó graft átültetésekor súlyos probléma, a hiperakuf kilökődés lép fel, amikor a gsft pereekes he® kilökődik.

Korlátozott számú, as immuskompetens sejtek működését elnyomó immunszuppresszív hatóanyagot alkalmaznak az ilyen franszpiantációkkal járó iunnunológial kilökődés (graftkilökődés) elnyomására, mivel az allo-trsnszplantáeió által okozott immunológiai kilökődést inképp a celluláris immunitás okozza, ilyen immunszuppresszív hatóanyag f őbbek között a eikiosporin (CsA), a takrolimus (FK-5ÖÓ), az aaatioprin (AZ), -a mikoíenelái-moístil (MMF), a mizoribin (MZ), s ieflusomid (LE.F), az adrenokortikáhs szferoidok (más néven adrenokortikálb hormonok, kortikoszteroidok, korhkoidok), mint például a prednizoion és meíil-prednizolon, sirolimus (más néven rapamieirt), dezoxi-SfKtgaalio (DSö) és FIY72Ö (kémiai neve: 2-atnino-2-[2-(4ökfilíemljetíl}-1,3-propándioi-hidroklorid).

A €TI,A4-et és CD2h-at, amelyek a T-sejtek aktiválásához szükséges kostimulátor-szignál jelátviteléért felelős molekulák (kostimuláíoríel-áfvheli molekulák), és különösen a CTLÁ-haíósnyagöknt, amelyek & CTLA4 oldható régióját és az azt kódoló gént alkalmazzák, szintén kifejlesztették klimkailag immunszuppresszív hatóanyagokként

Másrészt az «többi időben a CTLA4-hez és a CD23-hoz hasonlóan, amelyek kostimulátor-szignsi jelátviteli molekulák, egy aktiválással imi-ukálhatö iímfooíta immtmmoduiáiores molekulának nevezett molekulát (AlLIM; humán, egér- és patkáayeredaíő) [Int, hmnusöl,, 1.2(1), 51-55 (20őöjj, amelyet neveznek munkálható

4>

kostinjuláloruak is {fCOS; humán eredetű) iNatare, 397(67lő): 263-266 (1999); J. temunol, 16.6(1): I (2QöÖ); J. taaaaagl. 165(9): 5035 <2ÖÖÖ); Biochem.. Biophys. Rés. Commun., 276(1): 335 (200Ö); ímmumly, 13(1): 95 (2ÖÖ6); 1. Εχρ. Med., 1((2(1): 53 (26(8)); Eur. í. tataasol, 30(4): 1040 (2000)-.]» a harmadik, olyan kostímulátoros jelátmtoli molekulaként azon.ositotíák, amely a iimfociták (tant pl. a T-sejtek) aktiváláséhoz szükséges második jeles, (kosttauiáiorjel) továbbítja, és a jellel kapcsoltan szabályozza az aktivált ihníociták (mák pl .a T-seitek) működését.

Áz AILíM-öJoleknlával kapcsolatos legutóbbi vizsgálatok megállapításai alapján az AILIM-molehuláról valószinüsitik, hogy szerepet játszhat különböző betegségekben (például autoimmun betegségekben, allergiákban és gyulladásokban), amelyeket imnrnnkcmpeíens sejtek, mint pk a T-sejtek (különösen a T-sejíek) aktiválódása okoz. Nincs közlemény tszoaban az AtUM-molekula és a szövet- vagy szmvátübetést kísérő graftkilöködés (immunológia! kilökődés) közötti hánniíyen ösze&ggésról, valamint olyan kísérlet sem ismert, amely során az ilyen, szövet- vagy szervátültetést kísérő kllökődési reakciókat az AHdM-moiekula aktiviíásánsk: modulálásával nyomták el, kezelték vagy előzték meg.

Ráadásul nemrég azcmushotíak egy áj molekulát, amelyet BTfe-ösk, B7R£M~nek, GL5ő-aek vagy LICOS-nak nevezlek el, és amelyről feltételezik, hogy a kostímulátorjel-átoíteh molekulával, az A1LIMmolekulával kölcsönhatásba lépő ligandum [Natúré, 402(6763: 82.7-832 (1999); Natúré Médíeine, 5(12): 13651369 (1999); 1. ímmunoígv, 164: 1653-1657 (2000); Catrr. Bioi, j0(6): 33-336 (2000)1

E kétféle új molekula, név szerint az ÁILM (ÍCOS) és a B7KJM (B7h, GI..50, LICOS) azonosítása bizonyított, hogy a CD28 és C3Q8O (B7-1} f CD86 (S7-2) között és a CTLA4 és CDSÖ <S7-1): CD86 (B7-2) között az ismert első és a második jelátviteli reakciőutakon kívül van egy új, harmadik kostinmiátor jelátviteli reakeíóút, amely alapvető a limfociíák, mint a T-sejtek fent ismertetett aktiválásához és az aktivált T-sejtek olyan működése kontrolljához, amely sz AILIM (1COS) és a B7RP-1 (B7h, G.L50, LICOS) közötti kölcsönhatáson át fejtik ki hatásukat.

Alapos vizsgálatok vannak folyamaiba® a fenti öj molekulák biológiai szerepeivel, a Iimfociták, mint a T-sejtek működésének a. harmadik koslirnalátor jelátvitel állal való szabályozásával, valamint az új jelátvitel és a betegségek Összefüggésével kapcsolatban.

Közelebbről, a találmány célja eljárások és gyógyászati hatóanyagok biztosítása a szövet vagy szerv átültetését (allotrauszpiantácíőt vagy xeeofoanszpíaaíáciői) kísérő immunológiai kilökődés (grafikilökődés) elnyomása, kezelése vagy megelőzése céljából, orvosi és gyógyászati technikák (pl. gyógyászati hatóanyagok, mint például alacsony molekuíatőmegő vegyületek és antitestek) alkalmazásával, egy új molekula, az AILIM biológiai möködése modulálására, amely tudásunk szerint limfociták, mint például. T-sejíek aktiválásához szükséges második jel (kostirmilátor-szigrAl) átviteléért felelős, és a jelhez kapcsolódóan modulálja az aktivált ismlbeiták, mim például az akílválff-sejtek működéséi.

A találmány szerinti megoldás egy másik célja eljárás biztosítása a létező hmuunszuppresszív hatóanyagok (eiklosporin, azsíiopiridin, adrettokortíkáhs szteroidok FR-506, stb.) graftkilSködésre gyakorolt szuppressziv hatásának növelésére az olyan gyógyászati hatóanyagok alkalmazásával, amelyek modulálják az AILIM’ biológiai működését (például gyógyászata hatóanyagok, mint az alacsony mole.kulatömegű vegyületek és antitestek).

Az emiöseredetű AILIM biológiai funkciójára, és az immunológiai kilökődésre (grallkílö.kődés, amely

- 4 » * graft, azaz sejt, szövet vagy szerv h-aKSzpiuníáeiésát, az altötranszpianíácíóí vagy xescáranszptantácíét kísérti súlyos probléma) vonatkozó alapos kutatások eredményeképpen azt találtuk, hogy 1). az ΑΠ..ΪΜ működésének modulálása jelentős mértékben elnyomja a szövet (szövetek) vagy szerv (szervek) transzplantációját kísérő immunológiai kilökődést (graiikiíökőáós), és 2) a létező írumusszuppressziv hatóanyagok grshkilSkódésre gyakorolt elnyomó Itatását megnöveli az: olyan gyógyászati hatóanyagok alkalmazása, amelyek az: AÍIJM működéséi modulálják, Ezen felismerések alapján megalkottok a találmányt.

A találmány tárgyát képező gyógyászati készítmény alkalmazható gyógyszerként az olyan, különböző reakciók in vivő modulálására, amelyekben szerepet játszik a kostimuláltorjel AII3M-expresszáló sejtekbe, A1L1M által történő átvitele (például AltlM-expresszáló sejtek prolíferáciőja, ?klLlM-expresszáló sejtek cítokintenneiése, ÁILíM-expresszálő sejtek ínurarn-riiobzise vagy apoptózlsa, és AlLöd-expresszáló sejtekkel szenjberd. aníiíest-feggő ceíluíúris cítotoxicitás índukálására irányuló aktivitás), és/vagy az olyan, különböző betegségek fellépése és/vagy kifejlődése megelőzésére szolgáló gyógyszer, amely betegségben az AÍLIM általi jelátvitel szerepet játszik, és a betegségek kezelésére vsgy megelőzésére szolgáló gyógyszer,

Előnyösen, a taíáfejány tárgyát: képező gyógyászati készítmény modulálhatja (elnyomhatja, vagy elősegítheti) az; AtLtM-expressxáló sejtek proiííeráciőjái, vagy modulálhatja (gátolhatja, vagy elősegítheti) az ÁILlM-expresszaló sejtek citokintermetését (például y-interferou vagy mterleukm-4), és megelőzheti az olyan, különböző, fiziológiai jelenségek által okozott hetegseg-áílapoiekaí, amelyekben az AÍLIM által közvetíteti jelátvitel szerepet játszik, és lehetővé teszi a külSnbSzö betegségek kezelését vagy megelőzését,

A találmány tárgyút képező gyógyászati készítmény alkalmazása lehetővé teszi az immunológiai kilökődés (grídíkiiókődés) elnyomását, megelőzését és/vagy kezelését, amely jelenség súlyos probléma az olyan terápiákban, ahol donortól származó szervet (májat, szivet, fedőt, vesét, hasnyálmirigyet, stb.) vagy annak egy részét, vagy szövetet (mint például bőrt, szaruhártyái és csontot) talteíst-ek át (aiíotranszplantáciő vagy xenoíranszplantáció által) súlyos, kardiovaszknlám betegségben szenvedő reeípjensbe.

Ráadásul a találmány tárgyát képező gyógyászati készítmény lehetővé teszi az ilyen transzplantációs terápiákban az immunológiai kilökődés élriyeraása céljából beadóit, létező istmunszuppresziv hatóanyagok graftkiiőködésre gyakorolt elnyomó hatásának megnöveléséi.

Előnyösebben, a találmány tárgyát képezik:

1. Gyógyászati késxiimény szerv, szerv része vagy szövet: transzplantációját kísérő grafikílökődés elnyomására, kezelésére vagy megelőzésére, amely tartalmaz AÍLIM. által közvetített jelátvitelt moduláló ativitással rendelkező anyagot és gyógyászatiig elfogadott hordozót,

2. Gyógyászati készítmény egy vagy több immunsznppresszfe hatóanyag szerv, szerv része vagy .szövet transzplantációját kísérő grafikiiőköáés elnyomására, kezelésére vagy megelőzésére gyakorolt hatása növelésére, amely gyógyászati készítmény tartalmaz AÍLIM által közvetített jelátvitelt moduláló ativitással rendelkező anyagot és gyógyászatilag elfogadott hordozót.

3. A 2) gyógyászati készítmény, ahol az Immunszappressxí.v hatóanyag lehet azatíoprin, adreaokortikális .«zéróid, eikiosporiu, rajzodéin és takrolsmusz (FK-506), mikofenoiát-mofeíl, íeSuuomid, szirolímusz, dezoxispergulamin, TTY729, és CTLA4 hatóanyag..

4. Az 1 -3, pontok bármelyike alatti gyógyászati készítmény, ahol a trajjszplaníáció allotranszplantáció,

5. Az 1-3. pontok bármelyike alatti gyógyászati készítmény, ahol a transzplantáció xenotranszpianúiciő. ő. Az 1-S. pontok bármelyike alatti gyógyászati készítmény, ahol & szerv a máj, a szív, a vese, a fedő

- 5 « »♦ 0 * * * * « « »*« χ «-*♦ * * X ** * ♦« vagy a 'feasnyáteátigy.

7. Az 1 -5, pontok bármelyike alatti gyógyászati készítmény, ahal a szövet bor. szarnhártya vagy csontszövet.

8. Az I -7, pontok bármelyike alatti gyógyászati készítmény, ahol az anyag febérietermészetS anyag.

9. A 8. pont szerinti gyógyászati készítmény, ahol .«· fehérjetermészetű anyag lehet

a) AILIM-hez kötődő antitest, vagy az antitest része;

b) AÍLÍM exftaceíiuiám régióját vagy annak részót iaxtahnazö polipeptid;

c> AÍLÍM exttsceliniárls régióját, vagy annak részéi, és immunglcbuim-nehéziáncoí vagy annak részét tartalmazó tázíós polipepíid; és· di az AILíM-hez kötődő polipeptid,

10. Az 1-7. pontok bármelyike szerinti gyógyászati készítmény, ahol az anyag nem fehérjetermészetű anyag.

11. A 18. pont szerinti, ahol a nem fehérjetermészetű anyag DNS, RNS vagy kémiailag szmíetizáli vegyület.

Az alábbiakban a találmány részletes leírását adjak: meg a kifejezések és a találmányban alkalmazott anyagok előállítására szolgáló eljárások meghatározásával.

Az „emlős” kifejezésen ériünk embert, szarvasmarhát, kecskét, nyalat, egeret, patkányt, hörcsögöt és aranyhorcsögöí; előnyösen embert, szarvasmarhát, patkányt, egeret vagy aranyhörcsőgöt, és különösen előnyösen embert.

Az „AíLIM” kifejezésen az „aktiválással indukálható limíbctta ímnmrnnodulátor-molekula” rövidítését értjük, és olyan, emlöseredetű sejtfelszíni molekulát jelöl, amely szerkezetét és iunkeiöját korábbi közleményekben leírták ií. Immunok, 166(1); 1 (2981); 3. Immunoi,, 165(9): 5035 (2080); Biocbem, Bíophys, Rés, Commun., 276(1): 335 (2890); Imammiíy, 13(1): 95 (2000); X. Exp. Med., 192(1); 53 (2Ö00); Eur. í, tanúsok, 30(4): 3040· (2000); Int Immunok, 12(1): 51 (2081)); Natúré, 397(67 ló): 263 (1999); GenBankszám:BAAS2129 (humán eredetű); BAA82Í28 (patkány eredetű); BAA8212? (egy patkányeredetü változat); BAA82126 (egéreredetd)].

Különösen előnyösen a kifejezés humán eredetű AILIM~et jelöl [példánk lateraatroaai immnnoiogy, 12(1): 51-55 (2080)).

Az AlLIM-et nevezik ICOS-nsk is [Natasa, 397(6716): 263-266 (1999)], vagy .ITT-Ι/ΠΤ-2-sntigémdc [(JP-A) Her 11-29599. sz. nem vizsgált,. közzétett japán szabadalmi bejelentés, WO98/38216. sz, nemzetközi szabadalmi bejelentés], és ezeket a molekníákat említve kölcsönösen ugyanazt a molekulát értjük.

Ráadásai az „AH..IM” kifejezésen értünk többek között olyas polipeptidet, amely amiaosav-szekvenciája mindegyik emlős esetében a kotábban idézett irodalomban leírt az AHJM-ssekvaxsÍa.. és különösen előnyösen a humán eredetű AILtM-ateí azonos amiuosav-szekveneiájú polipeptidet. Ráadásul az ,,ΆΙΙΙΙΜΓ kifejezésen értünk többek között a korábban azonosított, paíkásysredstü (GenBstík-szám: BAA82327} AILIM-változatokhoz hasonló, humán eredetű ΛILlM-váhozatokat.

Az „alapvetően azonos aminosav-szekvenciájd” kifejezésen azt értjük, hogy a találmány szerinti „AÍLÍM” tartalmaz olyas polipeptidet, amely aminosav-szekvencíájábau több aminosav, előnyösen 1-19 aminosav, különösen előnyösen 1-5 ammosav szubxzűtnálva, dcletálva és/vagy módosítva, és tartalmaz olyan polipeptidet,. amely amfeosav-szekvamiáíákoz több annnosav, előnyösen 1-18 aminosav, különösen előnyösen

* φ

1-5 aminosav van hozzáadva, feltéve, hogy a pollpeptidsk alapvetően a korábbi közleményekben bemutatott ammosav-szekvmnát tartalmazó polipeptidekkel azonos biológiai tulajdonságokkal rendelkeznek.

Az amínosavak ilyen szubsztitúciói, delócíóí vagy beillesztései végrehajtotok a szokásos eljárások alkalmazásával (Experimeatal Medicine: kiég. kőiéi, „Flandbook of Geaetíc Engineering” (1992), stb.].

A szintetikus oligonnkleotld alkalmazásával végrehajtott hely-specifikus mutagenezísre („gapped duplex” eljárás) példaként emlíötejiük a pönt-rntúagenezásí, amely során pontmutációt viszünk be véletlenszemen nitrátéi vagy szulfáttal való kezeléssel, amely eljárással delécíós mutánst állítunk elő $oí3/-eszimtnei és igy tovább, a kazetta-muíagestezíst, a „iinker scnenótg eljárást, a „hibás beépülés” eljárást, a „hibás’' láacMfó eljárást, a DNS-szegmeBS-sztstíézls eljárási, stb.

A. szintetikus öiigohukleoííddaí végrehajtott. helyspeeíírkus tnutagenezis („gapped” duplex eljárás) végrehajtható például a kővetkezők szerint. A mutagsm'záim szándékozott régiót „stnber” mutációt tartalmazó MB-rágvektorba klónozzuk egyláncú fág-DNS előállítása céljából. Áz „amber” mutációt áem tartalmazó RF-liM.13-fág DNS-ét restrikciós ensmmnel történd kezeléssel Ilaearizáljuic, majd a DNS-t összekeverjük a fenti, egyláncú fág-DNS-sel, dénaíutaljuk és anselálásnak vetjük alá, „gapped duplex” DNS-t kialakítva. Előállítunk „gapped duplex” DNS-sel szintetikus oiigonukleotidot, amelybe mutációkat viszünk be, valamint. zárt, cirkuláris, keftSsIáneő DNS-t a DNS-polimerázzal és DNS-ligázsal való kezeléssel. „Mi,«matek repaír” aktivitásában derictejts mmT? g. cörásejteket ezzel a DNS-sel tmnszfekciőnak vetünk' alá. Szuprcsszor-aktivitússal nem rendelkező £ cö/i-seíteket fertőzünk a félszaporitotí fásokkal, és csak az „antber” mutációval nem rendelkező fágökra szkrinelüak,

A ponönntotók sitriítel történő bevitelekor például az alábbi. elvet alkalmazzuk. A DNS-t nítrittel kezelve a nukíeofidok dezamdsálódnak, és az adenin hipoxanünná, a citozín nme illa és a guanói xantísná alakul át Ha dezamínált DNS-t juttatunk a sejtbe, az, ,,á:T” és „G:C” „G:C”-vcl és „Á:T”-vei helyeítesitődik, mivel a hipoxasítin, az uracil és a xsstía citozínnaí, aoeninnei és timámel lép bázispárba a DNS-replikáció során. Valójában a. nitrátéi kezelt, egyláncú DNS-fragmensek „gapped duplex”-DNS-sel hibridizálnak, és ezután a mutáns törzseket elválasztják, ugyanolyan kezeléssel, mint a szintetikus olígonukieotiddal végrehajtóik heiyspeeiSkus mutagenezís („gapped duplex” eljárás) esetében.

A „eitokin” kifejezésen, mint az ,pkILIM-expresszál.ő sejtek citokistermeiése” esetében is, ΑΙΠΜexpresszáló sejtek (különösen a T-sejtek) által termelt, öxtóayeseu. kiválasztott citokínt értünk.

A T-sejtekre példaként említhetjük a Thl- és Trők-ííposú 'T-sejteket, és a eitokin. kifejezésen előnyösen Thl-típusú és/vagy Th2~típö.sú T-sejtek által termelt, önkényesen kiválasztott eltekint értünk.

A Tirí -típusú T-sejtek által termelt ci.toki.nek többek között az iFN-γ, az 1.1.-2, a TNF, az IL-3, és a Th2tlnusú T-sejtek által termelt cítokinek többek: közölt az II.-3, az IL-4, az H.-5, az II,-10 és a TNF [Cell, .29(9): 343-34Ő (1998)].

Az „anyag” kifejezésen, előnyösen az „ΑΙΙ,ΙΜ-ábal közvetített jelátvitelt moduláló aktivitással: retidelkezö anyag”, és specifikusábban az „AILÍbá-espresszáló sejtek proliferáeióját gátló aktivitással,. vagy az AIITMexpresszáió sejtek eitokintennelését gátló aktivitással rendelkező anyag” kifejezésen olyas anyagot értünk, amely természetes körülmények között előforduló anyag vagy mesterségesen előállított önkényesen kiválasztott anyag.

Az: _>yAILIM által közvetített jelátvitel kifejezésen az AILIM által közvetített jelátvitelt ériünk, amely a fenti, vagy a Példákban leüt, AIL.1M-expresszáiö bármely fenotlpasa változásához. vezet (változás a sejtprcliíérácsöban, sejíaktivácíöban, apoptézishan és/vagy AJLIM-expresszáló sejtek önkényesen kiválasztott κ* ** * 9 » 0 4 »9* » fcöc * » 4

9« 4 0« citokia termelésére való képességében).

Az „anyag” Síképp „íshétjeterntészetfe’ és „nem fehérjetermészetű' anyagok” kategóriákba sorolható.

Á „fehérjetermészetű anyagokra” példaként említhetjük a poilpeptidefcet, az antitesteket (polikionális antitestek, snonoktonétis antitestek vagy asooohJonátis antitestek részei).

Ha az anyag antitest, az előnyösen monoklonális antitest. Ha az anyag monoklonális antitest, az nemcsak nem hantát? emlős eredetű ntosokktnáiis antitest lehet, hanem lehet rekombináns, .monoklonális kíméraantitest, rekoínbináns, humanizált monoklonális antitest és haxnáo eredetű monoklonális antitest.

Ha az anyag polipeptid, az lehet többek között polipeptid, polipeptid-tiagmeas (oiigopepöd), fúziós polipeptid és kémiailag módosított polipeptid. Az eligopepfidekre példaként említhetjük az 5-30, előnyösen az 5-20 aminosavat t&rtaltnazó peptideket. Kémiai uíődositás tervezhető a köiSttbözö céloktól függően, például az /« rivo beadás «setében a vérben mérhető íéiéletiÖS növelése vagy a degradáeíöval szembeni tolerancia növelése céljából, vagy orális beadás esetében az emésztőrendszerben az abszorpció növelése céljából.

A polipeptidekre példaként ernliíhetjük a kővetkezőket:

1) AILIM extraeellulárís régióját vagy annak részét tartalmazó polipeptid;

2) .AILIM extracelluláris régióját vagy annak részét, és imsmmgíobulin-riehézlánc konstans régióját vagy annak részét tartalmazó fúziós polipeptid; vagy .3) AILÍM-hez kötödő polipeptid.

A ,mem fehérjetermészetű” anyagra példaként említfeetjtík a DNS-t, RNS-t és kémiailag szintetizált vegyűieteket.

A „DNS” alatt „antiszenz DNS-árogkónt alkalmazható, a fenti AIEIM-et (előnyösen humán eredetű AILIM) .kódoló DNS részleges nnklontidszekveneiáját tartalmazó DNS-t értünk, vagy kémiailag módosított DNS-t, amely tervezhető az AILíM-et kódoló DNS-t (cDNS-t vagy genonti DNS-t) alapul, véve”. Előnyösen, az andszenz DNS gátolhatja az AILSd-et kódoló DNS mRNS-sé való hanszkEÍpciójái, vagy az mRNS tehésjévé való transzlációját azáltal, hogy az AlLÍM-ei kódoló DNS-sei vagy RNS-sel híbrídizát,

A „részleges smklsotidszekveneís” kifejezésen, önkényesen kiválasztott régió önkényesen kiválasstoíí számú nnkieotidját tnrtídmazé részleges nnkleotídszekveaelát értünk, Részleges nukieotidszekvencia tartalmaz 5-löö, előnyösen 5-70, előnyösebben 5-5Ö, és a legelőnyösebben 5-3Ö egymást követő nukieotidoti

Ha DNS-t aikítltnKznnk antiszenx DNS-drogként, a DNS-szekveneiáí. részlegesen módosíthatjuk abból a célból, hogy meghosszabbítsak a vérben mérhető féléletidejét (stabilitását) a DNS orálisan történő beadása esetében, a DNS iníra-chopfetzmatikns membránott való permeabllitásának növelése céljából, vagy orális beadás esetében az. eirsésztőrendszerben a degradáejőval szembeni rezisztesrcia vagy sz abszorpció növelése céljából. Kémiai módosítások többek közöd az öhgoaökleotid-DNS szerkezetében például a foszfátkötés, ribóz, nukleotid, szésihidrát-ntoiekularész és a 3-vég és/vagy az 5'-vég tnődosíhlsa,

A foszíátkőtés módosításai többek kozott például egy vagy több feszfediészter-kötés (D-oIigo), a ibszfoditio-auiiífát-kötések (S-oligo), a ínenl-feszcfonáí-kőtések (MP-oligo), a feszfo-amidát-kötések, a· nem foszfát-kötések vagy metii-goszfono-tioláf-kótésck konverziója, vagy ezek kombinációja.

A rsbóz módosítása többek között: például ü'-tiuororfbőz vagy 2'-O-aietiInfeózzá való konverzió. A nukleotid módosítása többek között például az 5-propionil-nracll vagy 2-asáöc-adema konverziója.

Az „RNS” kifejezésen az „antiazenz RNS-ként alkalmazható, a festi AlLIM-eí (előnyösen humán eredetű AfEíM-et) kódoló részleges nukkxdidszekvencíát, vagy kémiailag módosítóit RNS-t tartalmazó RNS-t értönk, amely tervezető- az Áll JM-et kódoló RNS-t alapul véve, Az antíszesz RNS gátolhatja az AlLM-et kódoló DNS mRNS-sé való transzkripcióját vagy as taRNS fehérjévé történő transzlációját azáltal, hogy az AII1Met kódoló DNS-sel vagy RNS-seí Inbrldisál.

A ,/észleges nukleotidsxekveircia kifejezésen: önkényesen kiválasztott régsó önkényesen kiválasztott számú nuldeotidját tartalmazó részleges nukisöiidszekveueíát értőnk. Részleges uuldeotidszekv'encia tartalmaz 5-1QÖ·, előnyösen 5-7Ö, előnyösebben 5-50, és a legelőnyösebben 5-30 egymást követő onltíeotidot

Az andszenz RNS-szekvcncíát kötnmlag módosíthatjuk abból a célból, hogy meghosszabbítsuk a vérben mérhető télélctidelét (stabilitását) & DNS orálisai! történő beadása esetében, a DNS mtra-citoplazmatikus membránon való penneabiliíásának növelése céljából, vagy orális beadás esetében as emésztőrendszerben a degradációvai szembe® rezisztencia vagy az abszorpció növelése céljából. Kémiai módosítások többek kőzett, azok a módosítások, amelyeket a fenti, aodszeas DNS esetében, alkalmazunk.

„Kémiailag szintetizált vegyidet” alatt tetszőleges vegyületeket, kizárva a fenti DNS-t, RNS-t és fehérjetermészetű anyagokat, és amelyek molekulatömege lÖö-IÖOQ vagy kisebb, előnyösen olyan vegyidet, amely mokdmhtpmege 108-W, és előnyösebben löö-Söíl.

A fenti „anyag” kifejezésen a „polipeptid” AifJM-eí (előnyösen humán eredetű AÍLÍM-et) alkotó pollpeptidláncot vagy részét (rragmensét), előnyösen sz AlLlM-®t alkotó polipeptid extracelluláris régióját vagy részét értjük (a régió N-íermsrális és/vagy C-termiaális részéhez adott esetben 1-5 aminosavat hozzáadhatunk),

A találmány szériái AHJM a sejtmembránba hatoló transzmembrán molekula, amely 1 vagy 2 polipepddláucot tartalmaz.

A „trsnsxmembrán fehérje kifejezésen olyan fehérjéi értünk, amely a membrán bpid-kettősrétegén egyszer vagy néhányszor áthaladó hidrofób peptidrégiön át kapcsolódik a. sejtmembráohoz, és amelynek szerkezete teljes egészében három fö régióból áll, azaz extracelluláris régióból, transzmembrán régiából és eitoplazmatikus régióból, amint azt sok receptorban vagy sejtfelszíni molekulában láthatjuk. Ilyen traaszmembrán fehérje alkot miaden receptort vagy sejtfelszíni molekulát monomerként vagy homodiraerként, heterodimerként vagy oligomerként, azonos vagy különböző sminosav-szekvenciájú lánccal kapcsolva.

Áz „extracelluláris régió” kifejezésen a fenti transzmembrárí fehérje egészét vagy részét érjük,, ahol a részleges szerkezet a membrános kívül helyezkedik el, Másképp ez azt jelenti, hogy a transzmembrán fehérje régiója vagy része, kivéve a membránba beépült régiót (transzmembrát! régiót) és a íranszmembrás régiét követő, cköplszmáhan található régiót (ciíoplazrttatikus régiót).

A fenti „fehérjetennészctú anyag· kifejezésben. a „fúziós polipeptid” alatt siziós polipeptidet értünk, amely ÁILIM-eí (előnyösen barnán eredetű AILlM-et) alkotó polipeptid extracelluláris régióját vagy részét, és „hmsungiobutm-nehézlönc (?g, előnyösen hantán eredetű: lg) konstans régióját vagy részét tartalmaz. Előnyösen a fúziós polipeptid az AÍLIM extracelluláris régióját és hantán eredetű Igö-sehézlánc konstans régiója részét tartalmazó fúziós polipeptid, és különösen előnyösen az AlLTM extracelluláris régióját és a kapocsrégíót, a CH2-domént és CÍD-domént tartalmazó humán eredetű IgG-oehézláoc régióját (Fc) tartalmazó fúziós polipeptiá. IgG-kőnt előnyös az IgGl, és AlLIM-ként előnyős a humán eredetű, az egércredstú vagy patkányeredeíü AiUM (előnyöset! humán eredetű).

Az „iimnuogfobtdis-nehéziásc (Ig-nchézlánc) konstans régiója vagy annak része” kifejezésen humán eredetű Immunglobulm-neházlánc (H) konstans régióját vagy Fe-régsóját vagy annak részét értjük. Az·: immunglobulin lehet bármely osztályba és bármely alosztályba tartozó immunglobulin. Előnyösen, az Immunglobulin lehel. IgG {IgGl, Ígö2, lgG3 és ígG4), igM, IgA (IgAl és fgA2), ígD és IgE. Előnyösen az immunglobulin igG (IgGl, igG2, IgG3 és ígG4) vagy ígM, A találmány sz.eriut megoldásban a különösen előnyős intmnnglobulmokra példaként említhetjük a humán eredetű IgG-ket (IgGl, IgG2, lgG3 és IgG4).

Az immunglobutm egy Y-aiakú szerkezeti egységgé· bk, amelyben négy lánc alkot két homológ kősnyüláacot (L-láncök) és két homológ nehézlánccí (H-Iáneok), és amelyek disznlSdhidakkai (S-S-kötések) kapcsolódnak. A könnyőiáneok a könnyalánc-variáhilisrégii^ról (VJ és a kőnnyöbmc-konstansrégióból (CL) állnak. A nebézláncot a nehéziá.nc-vadá.bilisrágió (VJ és a nebé.zlánc-konsttm.srég:ó (C_H) alkotja.

A nehéziánc-korsstansrégióí olyan doraének alkotják, amelyek mnínosav-szekvenciája egyedi minden osztályban <íg<S» ígM, IgA, IgD és ígE) és .minden alosztályban (IgGl, ígG2, igG3 és IgG4, IgAl έ» IgA2>„

Az IgG-nehézlánc (IgGl, IgG2, IgG3 és Ígö4) V_:,rdoménból, C_M1 -doméríből, kapocsrégióből, Cm2doménból és C_s J-dontem>ól áll, ebben a sorrendben, az N-íemsiaális irányból felsorolva.

Hasonlóan az IgG;-nehézláne V_M-doménből, Gy;I-doménból, kapoesrégióhől, Cy^-dornénhöl, CyJdoménból ált, ebben & sorrendben, sz N-temhnáhs irányból felsorolva. Az IgG2-nehézláne V_B-döménből, Cyrtdornéhból, kapoesráglófeól, CyJ-áoménből, Cy J-doménfeól áll, ebben a sorrendben, az N-terminális irányból felsorolva. Az IgGS-aehézláac V_K~doménhó.l, €y_;4-dornénból, kspocsregióból, Cy^-doménbóf GyJ-doménból áll, ebben a sorrendben, az: N-terminális irányból felsorolva. Az IgG4-nehézláne V^-doménbói, Cy₄1 -do.ménbói, kapoesrégiőból, Cy^k-doménból, Gyap-döménhöl áll,, ebben a sorrendben, az N-terminális irányból felsorolva.

Az IgA-nehézdáne Vj-rdoménbói, Col-domésból, kspocsrégióból, CbS-doméafeől, CcG-dosnénból áll, ebben a sorrendben, aa '.N “terminális irányból felsorolva.

Hasonlóan, az ígGAl-nehézláne Vfj-doméhbói, Csj1-dom.énből, kapocsreglóbói, GnJ-doménból, C<r_s3doménbóí: áll, ebben a sorrendben, az M-íermináüs irányból felsorolva. Az lgA2-nehézlaoc Vg-dom&íból, dosnénbók kapocsrégióból, Cro2-domésból, Ca^S-doménfeöl áll, ebben a sorrendben, az N-terminális Irányból felsorolva.

Az ígD-sehézláne V_tí-áoméabók Cöl-doméaból, kapoesrégiőból, Có2~domenbót CóS-dornénbol áll, ebben a sorrendben, az N-terminális Irányból felsorolva.

Az IgM-»e.hézláne Vfráomésból, Cul-dosnénbóL C)G-donténból, Cu3-dornénbói és CtG-doménbóI áll, ebben & sorrendben, az N-termínális irányból felsorolva, és: hiányzik az JgG-bea, as IgA-bao és az IgD-ben található kapocsrégió.

Az IgE-nehézláae V_K-doménból:, Csl-doménbol, Cs2-do ménből, Cs3-dornénbói és Cs4-doménből áll, ebben a sorrendben, az N-terminális irányból felsorolva, és hiányzik az IgG-hen, az IgA-ban és az IgD-ben található kapoesrégió.

Ha például IgG-t papaitmal kezelünk, az IgG az N-toaátális közelében, a dlszulűdhidakon tűi, a kapocsrégióban hasad, ahol a dísznlbdhidak összekapcsolják a két nebézláncot két homológ Fab-t kialakítva, amelyben Vh-bói és CHl-böl álló nehezláne-fragmess kapcsolódik egy kösnyölánccal disznliidhidah, valamint egy hóból, amelyben kapoesrégiőból, C)J-doménbói ss C_K3-doménből álló két homológ nehézláne-fragmens kapcsolódik diszulfidkőtésekkei (lásd Nankodo. fmmunoíogy Ifetrated, ereded 2. kiad., 65-75 (1992); és Nankodo, Focns of Newesí Medical Seimusü, Reeognhion Meehamsm öf Immuné System, 4-7 (1991); és így tovább],

A fenti, „imnömglobnhn-nehézláne konstansrégiéjs része” kifejezésen konkrétan im-ntíngiobnhnnehézláne konstans régióját értjük, amely a fenti szerkezeti jellegzetességekkel rendelkezik, és előnyösen Cldomént vagy Fc-régiőt nem tartalmazó konstans régiót. Előnyösen, ezekre példaként emikhetjlik az IgG, igA és

- 10 IgD mindegyike esetében a kapocsrógjóből, C2-áoménból és C3-domé»b«í, vagy IgM és IgE esetében. C'2domériból, C3-dojiténbél és C4káoroé®hól álló régiói Különösen előnyős példaként említhetjük a humán eredetű eredetű IgG 1-et.

A fenti, fúziós polipeptiánek megvan az az előnye, hogy tisztítása szélsőségesen könnyű affinitást kromatográfia alkalmazásával a protefo-A kötési telajdoságsií alkalmazva, amely előnyösen az Immunglobu&nftagmemfeez kötődik, mivel a találmány szerinti fúziós polipeptid tartalmaz ímmuh^obufiti, matt például IgG konstans régiója részét (pl. Fc-t) feiós partnerként. Ráadásul, mivel a különböző- imnmngiobuimok Fc-tégiója elleni antitestek hozzáférhetőek, a feiós pofipeptidekre immunológiai mérési eljárás könnyen végrehajtható az Fé elleni antitestekkel.

Az „AH.IM-hez kötődé polipeptid” fogalma beletartozik a „polipeptid” fogalomba, és azt pedig magában foglalja az „anyag” definíciója.

Az AILIM-hez kötődő polipeptid” -specifikus példájaként említhetjük a B7h, S7RP-1, GL5Ő vagy LICOS néven ismert molekulákat tartalmazó polipeptidet vagy azok egy részét, amely az AILIM-mel kölcsönhatásba lépő ligandum (Mafore, 402(63031; 827-832 (1999); Natúré Mediciae 5(12): 1365-1369 (1999); J, ímmnnolögy ÍM: 1653-lőS? (2000); Cmr. Biok, l@(ő): 333-336 (2000)],

Előnyösen a polipeptid a fenti ligandumok (S7h, B7RP-1, GLS0, LiCOS) exttacellolárís régióját vagy részét tartalmazó polipeptid, vagy ímmungiöbuliumöhézláBc (előnyösen humán eredetű Immunglobulin) konstans régióját vagy részét tartalmazza, Irt az „extraeelteláris régió” és ,3mm.unglobnim-aebéslá»c‘’ kifejezések a fentiekkel azonos értelmitek.

A fenti polipeptidék, palipeptidrészek (fr&grnensek) és fúziós polipeptidek elöállhh&tó&k nemcsak az alábbi rekombínáns DNS-technológlával, hanem a technikában ismert eljárással, mint például kémiai szintetikus eljárással vagy sejttenvésztési eljárással, vagy ezek módosításával

A találmány szerinti „antitest” lehet a fent definiált, emiőseredetii AÍLIM ellent (különösen előnyöse® humán eredetű AíLíM) elleni políkionális antitest (szérum) vagy tnónoklónális antitest, és előnyöse® monoklonális antitest.

Előnyösen, az antitest AÍLlM-espresszáló sejtek probfeációjái az AiLIM-hez való kötődéssel gátié aktivitással rendelkező antitest, vagy .AlLíM-sxpresszálö sejtek mtétferon-γ- vagy íntérleukimA-termolését AILIM-hez való kötődéssel gátló aktivitással rendelkező antitest.

A találmány szerinti antitestek lehetnek; emlősök, mint például egerek, patkányok, hörcsögök, granyhőrcsögök és nyulak antigénnel, való immunizálásával, mint például a találmány szerinti AlLIM-et expresszáló sejtekkel (természetes sejtek, sejtvonalak, ternorsejiek stb.), rokombináns DNS-teelnmiógiávsl az AÍLIM sejtíhlszüteti való túlexpresszálása céljából előállítod, teanszfermánsökfc&L AILlM-et iartskuszó poíipeptidekkei vagy a fenti, AlLIM-et íaríahnazó fúziós poiipeptidekkol, vagy az AKIM exímeelktiáris régiójával történő immunizálással kapott természetes antitestek. A találmány szerinti antitestek lehetnek kiméraaotitestek és humanizált antitestek („CDR-grafted antitestek), amelyek siéáíb'thatőak rekombínáns DNS-technológsával, és olyan, hantén eredeti! antitestek, amelyek eiősilithstóak humán. eredetű antitesteket termelő transzgsnikas állaMonokloriátis antitestek többek között &z. IgG, IgM, IgA, IgD vagy IgE ízotípusok bármelyikébe sorolhatóak. Előnyős az IgG vagy IgM.

Políkionális .antitest (antiszértmt) vagy ratmokkmális antitest előállítható ismert síjárások alkalmazásával.

Konkrétan, emlősállatot, előnyösen egerei, patkányt, hörcsögöt, aranyhörcsőgöt, nyalat, macskát, kutyát, sertést, kecskéi, lovai: -vagy borjút, előnyösebben egeret, patkányt, hörcsögöt, aranyhörcsögöt vagy nyalat immunizálunk például a fenti anligénnelTömoKÍ-feie aájuvásssal, ha szükséges,

Poíiklon&lís antitest állítható elő aa Így immunizált állatok szérumából. Ráadásul monoklonális antitesteket a következők szerint állítunk elő. íísbridőmákat állítunk elő az igy immunizált állatokból nyert antitesttermelő sejtekből, és autoanriiestek termelésére képtelen míeiőmasejtskből. A hibriáómák&t klónozzuk, es az emlősállat Immunizálásában alkalmazott antigénnél szembeni specifikus affinitást mutató mosoklouáhs autltesteket termelő klőnokra szkriseiünk.

Előnyösen, monoklonális antitest állítható elő a követezők szerint, immunizálást hajtunk végre úgy, hogy a fenő: antigént immunogéukéní egyszer vagy többször injektálva vagy beültetve, ha szükséges, .Fre.vnriféle adjuvánssal, szubkután, mtramuszkulárisau, intravénásán, ujjhegybe vagy istraperifooeálisan nem humán emlősbe, előnyösen, egérbe, patkányba, hörcsögbe, aranyhőrosögbe vagy nyálba, előnyösen egérbe, patkányba vagy arenyhörcsögbe (többek között iranszgemkus állatba, amelyet így állítunk elő más állatból származó antitestek elöállitáss céljából, mint például as alábbiakban leírt, bumás eredetű antitesteket termelő transzgenikus egér), Áz immunizálásokat rendszerint az 1-14, napos 1-4 alkalommal hajtjuk végre. Az Igy srmrunizáh emlősállattól antitest-termelő sejteket nyerünk az utolsó immunizálás után 1-5 nappal. Az immunizálás gyakorisága és időtartama elrendezhető alkalmas módon például az alkalmazott immunogén jellegétől függően.

Möfioklonáhs antitestet szefaetáló hibridómák elöáliíthatőak Köhter és Milsíein [Natúré, 256:495-497 (1975)1 eljárásával, vagy arm&fc módosításával. Konkrétan hlbrídó-mákaí állítunk elő a fentiek szerint immunizált, nem humán emlősállat iépébeu, nyirokcsomójában, csontvelőjében vagy mandulájában, előnyösen lépőben található, antltesttermelö sejtek és emlősből, előnyösen egérből, patkányból, aranyhöresögböl, hörcsögből, nyúlból vagy emberből származó, előnyösen, egérből, patkányból vagy emberből származó, autoántitesttermelésre képtelen mlelömák ferionáltalásávál.

Például egéreredetü,. P3/X63-AO6S3 (íiS3), F3/NSl/l-Ag4-l (NS-i), P3ZW-AGKU1 (P3VI), SP2/0Agl4 (Sp2/ö, Sp2), FAI, bö, NSO vagy :8W5I47 mielőma, vagy paíkányeredetö 21O1?.CY3-Ág,2.3„ mieióma, vagy bufnán eredetű U-26ŐÁRI, GM1500-6TG-AI-2, W729-6, CEM-AGR, DIRI 1 vagy CEM-T15 mieióma alkalmazható rmelómaként sejtfúzió céljára..

I-ííbridomákat termelő monökionáüs antitestek szkrmeiheíők hibridómák tenyésztésével, például rnikrotiter-lemezeken, és az üregekben a teuyészíélülúszót vizsgáljak & feni: ismertetett mmmnizálásm alkalmazott immusogéimei szembeni reaktivitásra, például enzimes immunológiai mérési eljárásban, mint például RÍAban vagy ELISA-fean,

Monokionális antitestek állíthatöak elő bibridómákbái úgy, hogy a. hibriddmákai 1« váró vagy 1« vreo tenyésztjük, például egér, psíkány, arsnyhörcsőg, hörcsög vagy nyúl, előnyösen, egér vagy patkány, előnyösebben egér zmeüss-iblyadékábas, és as antitesteket izoláljuk az eredményül kapott felülószóböl vagy az emlősállat osciies-folyadékáböl,

A hibridómák Is ráro tenyésztése végrehajtható például a tenyésztendő sejtek tulajdonságaitól, a vizsgálat céljától és a tenyésztési eljárás különböző körülményeitől függően, ismert tápközegek alkalmazásával vagy az Ismert, alaptápközegből származó, a hibridómák szaporítására, fenntartására és tárolására szolgáló bármely tápkőseg alkalmazásával, a monoklonális antitestek tenyészfeiülúszéhan történő előállítása céljából.

Alaptápfcőzegre példaként említhetjük az alacsony fcaleiumtartalmú tápkőzsgeket, mint például a Efemféle Fi 2-tápkőzeg, az MCDB'i 53-üipküzeg, vagy a magas kalciumtsrtaímó tápközegek, aaut például az MCDSlŐ4-fepközeg, a MEM-íápkozeg, az. IüAHíő4ő~tápközeg, az ASPiOő-íápközeg vagy az RD-tápközeg, Áz nlapíápközeg tartalmazhat példád szérumokat, hormonokat, citokineketés/vagy különböző, szerveden vagy szerves anyagokat, a -céltól Bggően..

Monoldonábs antitestek Izolálhatod; és tisztíthatóak a lenti teayészfelSlúszóből vagy «setefolyadékból telített ammőmtirn-szulfáíos kscsapással, englobuhn-kicsapási eljárással, kapronsavas kicsapási eljárással, kaprílsavas kiosupásí eljárással, ioncserélő kfomatográlsával (DEÁE vagy DE52), vagy affinitási kromatográfiávai, itmmmgiobulin-elleKí oszlop vagy proteta-A-oszíop alkalmazásával,

A „rekombináns kíméra monoklonális anütesT genetikai műveletekkel előállított monoklonális antitest, és előnyösen, ki.mértumfilestet jelent, mint például: egér/humáo kunéra monoklonális antitestei, amely variábilis régiója nem homárt emlősből (egérből, patkányból, hörcsögből stb,), és konstans régiója danán eredetű immunglobulinból származik,

Hotnán ünmtmglolmkuMl származó konstans: regtő aminosav-szekvenciája egyedi minden izotipus esetében, mint példád az IgG-nfei (IgGl, ígö2, IgG3, lgG4), az IgM, az }gÁ, az IgD és az IgE esetében. A rekombináns, kintéra monoklonális aníifesí konstans régiója lehet bármely izoíípusba tartozó, humán eredetű hmmmgiobulim Előnyöseit ez barnán ereded IgG konstans: régiója.

Kimér?,, monoklonális antitest előállítható például a kővetkezők szerint. Szükségtelen említenünk, hogy az előállítási eljárás nem korlátozódik erre.

Egér/hirmén kíméra twíoklonális antitest előállítható a következők alapján: Experimental Medicine: kiegészítő kötet, 1.6. (10) (19RS); és a (1P-B) Hei 3-7328Ő. számú, vizsgáit, közzétett japán szabadalmi: bejelentés. Konkrétan, az antitestek előállítható ágy, hogy a hantán ereded imtmmglobuhnt kódoló DNS-ből nyers CBgérrt (a í-I-iánc konstans régióját kódoló C-gén) működőképesen beillesztjük egéreredetú, nmnoklönáiis antitestet termelő hiferidómákböl izolált DNS-ből nyert aktiv VB-géaekiól (átrendezett VDJ-gén, amely ft-íáae variábilis régióját kódolja) S'-S'-traayfcaa („dowstream”), és a humán eredetű immunglobulint kódoló DNS-ből rsyert CL-gém (sz L-láne konstans régióját kódoló C-gén) helyezzük működőképesen: mbridótnáhól izolált, egéreredetú monoklonális DNS-ből nyert VL-gének (az L-lánc variábilis régióját kódoló, átrendezett VJ-gén) hatása alá, azonos vektorba vagy különböző vektorba expresszálfeatő módon, majd gaadasejíeket transzformálunk az expressziós vektorral és a tnmszfermánsokal tenyésztjük.

Előnyösen, a DNS-t először egéreredetű antitestet termelő hibridómákból a szokásos eljárással exímháljuk, alkalmas restrikciós enzimekkel emésztjük (például: EooAAgyel és FfmdíS-mal), elektoforézisnek vetjük alá (például ő.7%-os agarőzgélt alkalmazva) és 5őífíát???í-hk’rtal vizsgáljuk. Az elektroforéziímek kitért gélt festjük például ctídíum-btomíddal és lefényképezzük, s gélen a markerpoziciókat megjelöljük, a gélt kétszer mossuk és Ő.25 M HCl-ben áztatjuk 15 percig, Ezután a gélt 0.4 N NaOH-oldatban áztatjuklö percig, és fásomén rázatjuk:. A DNS-t filterre visszük 4 órán át, a szokásos eljárás alkalmazásával:. A Eltért kiemeljük, és kétszer mossuk 2xSS€~pufferbcn. Ha a. Eltér eléggé kiszáradt, 75°C-on: 3 órán át hőkezelésnek vetjük alá. A hőkezelés után a filtert ö.ix$S€70.1% SDS-ben ő5C-on 30 percen át kezeltük. Ezután 3,xSSC/ő.l%· SDS-bea áztattuk. A kapott filtert prehtbrtdízációs oldattal kezeltük: műanyag zsákban 65^rtC-on, 3ö percig.

Ezután ^JÍR-tni jelölt próba-DNS-t és hibridizációs oldatot teszünk a zsákba, és 6$®€-on 12 órán át teeltök. A hibridizáció után a filtert megfelelő sókoncrenrtáció, reakciós hőmérséklet és reakcióidő mellett mostuk (például 2xSSC/8.l% SDS, szobahőmérséklet, 10 perc).,A. filtert műanyag zsákba kis térfogatú 2xSSC-ben, és a zsák lezárása atóa antoradiegráfíának letíűk ki.

Egéreredetü monokioftális antitest H-láacát és L-láacát kódoló, átrendeződöd VW-géai és VJ-géni a fenti Settfta-e-btaölásx eljárással azonosítunk. Az azonosított DNS-fragmeast tartalmazó régiót cnkorsöröséggradiens-oentrifogáhíssal frakcíosáljuk, és íhgvektorba (pl. Cta-ota^. Cka?o?i28, ÁEMSL3 és &E&Í8L4). E. colí-i (pl. LE392 és ΛίΜ539) úaaszíormáliunk a fágve-ktorral genorokőayvtár létrehozása céljából. Á genomkönyvíárt plskkhlhód-báeiiSs technikával, mint például ^önton-AíVK^-eljásással [Science, .1.96; 18ö-182 (157?)] sxknneiiük, alkalmas próbák alkalmazásával (H-lánc í-gén, t-tac (κ) J-gén, sih.) az átrendeződött VD,i-gént vagy Vl-géat tartalmazó klönok előállítása céljából. Restrikciós térkép készl-esével és a kapott klönok nukleotidszekvenciája meghatározásával igazoljuk, hogy a gének «.kívánt, átrendeződött VH-géaeket (VDJgénekeí) vagy VE~géneksl. ÍVJ-gésekst) tartalmazó géneket kaptuk meg.

A kiméraképzéshez alkalmazott CH-gáneket és humán eredetű CL-géaefcet külön-külön izolálóik. Például ha a kiméra-antitestet humán eredetű Igö l-gyei állítjuk elő, Cvl-géneket izolálnak CH-génként, és Ckgénekeí CL-génként Ezeket a géneket tanán eredetű genomi könyvtárból izolálhatjuk egéreredetű Cyl-gén es egéreredeM Ck-gén próbaként való alkalmazásával, amely gének a tanán GyI-génnek és Cx-génnek felel meg, kihasználva az egéreredetü és a harsán eredetű irmmmglobtihngén közötti homologián

Előnyösen, a tanán Cx-géat és egy imáauoer-régiót tartalmazó DNS-írugmenst ízoláhiak humán Cőaro«44 YoeSAtaíAgosomi könyvtárból [Ceü, 15: Π57-1174 (1987)], például az Ígl46-klón 3 kb. hosszúságú .foí«í//Zí-ó!f?f«A7-hugmeí5se [Eme. Natl. Acad. Sci. USA., 75: 4705-4713 (1978)] ós & áóEP/Ö-klón Ó.S kb. hosszúságú EcoRZ-ffagmense {Eroe. Natl. Acad- Sci. USA, 78: 474-478 (1981)] próbaként való alkalmazásával. Ráadásul például humán eredélű magzati hepaioeíta-DNS-t /tadöArnal emésztünk, agarózgél-elektroforézissel frakcionáljttk, majd egy 5,9 kb. hosszúságú tagmenst illesztőnk λ 788-ba, majd tanán Cyi-géut izolálunk a fent- próbákkal.

Az igy kapott egéreredetű VH~gén, egéreredetü VL-gém humán eredetű CTI-gén és humán, eredetű CLgéa alkalmazásává, és a pmmóter-régiót és ««hmtcet-régíói figyelembe véve, humán. CH-gént illesztettünk egéreredetü VH-géotől 3 '-5 '-irányban (áwöwX és humán CL-gént iiieszteltörjk egéreredetü YL-géntoi 3“5‘'-irányban (dcwítaeew) expressziós vektorba, mint példáiul a póTUgpí vagy pStYneo alkalmas restrikciós enzimekkel és DNS-lígázzal, a szokásos eljárás alkalmazásával. Ebben sz esetben egéreredetü Víi-gén/tanáa eredetű CH-gén, valamint egéreredetü VH-géa/tanán eredetű CL-géa kiméra géujeií illesztjük azonos -vagy különböző expressziós vektorba.

Az Így előállítóit, kiméragértí tartalmazó expresziós vektort (vektorokat) antitestet nem termelő mielötnákba, például P5M3*4?8*Ó51rs^tekbe vagy óYU/Ö-sejtekbe visszük be protoplnszt-iűziós eljárással, DEAE-dexíta-eljátással, tacto>£os?j&t-eljátáml vagy elektroporálási eljárással. A transzlbrtsáusokaí az expressziós vektorban található drogrezisztaciának megfelelő drogot tartalmazó tápközeggel szkrineijűk, és ezután a kívánt,, monokionális khnéra-aatiíesteket termelő sejteket kinyerjük.

A kívánt, monoklonálís kimera-anthesteket az így szkrínelt, aotitest-tanelÓ sejtek felülüszójáfeól kinyerjük.

A ..hsmarúzált moaoktaálís antitest (€DR-gn#fed antitest)” kifejezésem olyan tnosoklotais antitestet értünk, amelyet genetikai műveletekkel áilítansk elő, és előnyösen, olyan, humanizált, monoklonálís: antitestet értünk, ahol a .hipervariáhilis régió kempletnemaritásí. meghatározó régiéi részben vagy egészen nem hunta emlőseredetö (egér, patkány, hörcsög, stb.) monokionális antitest hipervariáhilis régió kemplementantást meghatározó régióiból, a variábilis régió vázszerkezet-régiói humán inmumgiobuhn variábilis régióiból származnak.

* ♦ * és a konstans régsó humán eredetű hnmanglobulm konstans régiójából származik. A hipervariáhiHs régió kompísjnmtadiásí meghatározó régió· antitest variábilis régiójában, a variábilis régióban van, és három régiót jelent, amelyek közvetlenül és komplementer mádon kötődnek antigénhez (komplementaritást meghatározó aminosavak. CDR1, GDR2 és CDR3). Á variábilis régió vázszerkezete négy, viszonylag, konzervált régió, amelyek s három komplementaritást meghatározó régióhoz viszonyítva Hpsíream, dow/ismeam irányban vegy azok között helyezkedik el {vázszerkezet-régió, 1¾ FS2, FR3 és FR4)^:.

Más szavakkal, humanizált monokioöáiis antitest alatt olyan antitestet értünk, amelyben nem humán eredetű monoklonális antitest minden régióját, kivéve s komplementeritást meghatározó régiók: részét vagy egészét a ötegfeleió, humán· eredetű immunglobulinból származó régiókkal helyettesítjük.

Humán, eredetű, immunglobulinból származó konstans régióatninosav-szdtvenciéja minden izodpns, mint például az IgG (igöl, IgG2, ígG3, lgG4), IgM, IgA, ígD és IgE esetében egyedi. A találmány szerinti mosklonális, humanizált antitest konstans régiója származhat bármely izotipusba tartozó humán immunglobulinból. Előnyösen ez humán IgG konstans régiója. A humán immungolobalinből származó vázszerkezet-régiók nem különöse» koriátitzohak.

Humanizált, monoklonális antitest előállítható például a következőképpen. Szükségtelen említenünk,, hogy az előállítási eljárás nem korlátozódik ezekre..

Például egéreredeíű, monoklonális antitestből szánnagó rekombináns, humanizált, monoklonális antitest genetikai műveletekkel (Hei 4-506458. sz. és JP-A Sho 62-296890. sz nemzetközi közzététel közzétett, japán fordítása];. Konkrétan, legalább egy egéreredehi H-láso-CDR-gént és legalább egy, egéreredetü L-láno-€DRgént, amely az egéreredetü H-iánc-CDR-génuek felel meg, izolálunk egéreredetü monoklonális antitestet termelő hibridőínákból, és a humán eredetű H-lásc-gén (kivéve a fenti, egéreredetü H-íá»c-CDR-«ek megfelelő, humán, H-láuo-CDR-t) teljes régióját kódoló gént, valamim a humán eredetű L-lánc-gén (kivéve a humán. L-láncCDR-í, amely a lenti, egéreredetű H-lánc-CDR-nek felei meg) teljes régióját kódoló gém izoláljuk humán immonglobulm-génekből.

Az így izolált, egéreredetü H-iáno-CDR-gént (géneket) és a .barnán eredetű H-iánc-géut (géneket) működőképesen beillesztjük alkalmas vektorba ügy, hogy ezek expresszíűhatóak legyenek. Hasonló módon, az egéreredetű L-lánc-CDR-géní (géneket) és a humán eredetű L-iáno-gént (géneket) működőképesen beillesztjük egy másik, alkalmas vektorba ügy, hogy ezek expmsszálhaiőak legyenek, ékltemaíív módon az egéreredetü H-láncCDR-géní (géneket)7 humán eredetű H-lánc-géni (gémeket) és egéreredetü L-lánc-CDR-gént (géneket) / humán eredetű L-iane-gént (géneket) működőképesen beilleszthetjük azonos expresszíós vektorban, expresszálható módon. Gazdasejteket íranszfesmáiunk az igy előállított expresszíós vektorral humanizáló monokfonáíis antitest elöállitásá céljából, A tratszforuiánstók tenyésztésével a kiváró, humanizált, mosofelosális antitestet a tenyésztelühíszóböi kinyerjük.

A „humán eredetű monokkmálls antitest” kifejezésen olyan immunglobulint ériünk, amelyben as immunglobulint alkotó H-íánc variábilis és konstans régióit tartalmazó teljes régiókat, és az L-Iánc variábilis és konstans régiói humán immunglobulint kódoló génekből származnak.

A humán eredetű antitest (előnyösen humán eredetű monoklonális antitest) előállítható jól ismert eljárósokkal, például ugyanúgy, mint fest, a poliklonális vagy monoklonális antitestek esetében, transzgenikus állat olyan antigénnel törtésó immunizálásával, amelyben humán eredetű immunglobniingém integrálunk nem hatná» emlős, mint például egér génlokaszáha legalább egy humán inmumgobulin-gém.

'15 -

Például Itomáo antitesteket termelő tmnsageaikM egér előállítható a kővetkező közlemények szerint: [Natúré Genetics, 7; 13-21 (1994); Natee Genetics, 13: 146-156 (1997); a-JP-WÁ Hei 4-504365. sz, nemzetközi közzététel japán. fordítása; a JP-WA Bei 7-50913-7,. sz,. nemzetközi közzététel japán fordítása; Nikkel Science, §: 4Ö-5Ö (1995); a WO94/255S5. sz. nemzetközi közzétételi irat Natúré, 368: 856-859 (1994); a JPAVAHei 6500233. sz. nemzetközi közzététel j apán íordliása].

Ráadásul afelmttzhalé a fewtán eredeté fehérje transzgenlkus: tehénben vagy sertésben történő előállítására szolgáló technika ('.Nikkel Science, 78-34 (1997. április)]:.

Az „antitest, része” kifejezésen a fenti monoklonális antitest a fenti monoklonális antitest régiórészleter értjük. Előnyösen jelem F(ab'b-k Fab'-t, Pab-t, Pv-t, (antitest variábilisftagmense), sFv-t, dsFv-t (dissalfiádsl stabilizált Fv), vagy dAb-r t egyderaénes antitest) (Exp, Opin, Ther. Fateste, 6(5): 441-456 (1996)].

„P(ab')G és „Fab”’ -eíöáffitható immunglobulint (monoklonális antitest) proteázzal, mint példáid pepsrinsei és papainnal kezelve, és jeleni olyan antitest-thsgrnenst, amelyet úgy állítunk elő, hogy immnaglobuíia: emésztünk a két B-lánc közötti kaprwsrégióban, a diszníírdkötések mellett. Például a papain az IgG-t a két kiláss közötti kapocsfogiőfcas a dissüiftsíhidtól N~törtninális irányban (aprircom) hasd, kél homológ antitestfmgmenst képezve;, amelyekben VL-ből (L-lánc variábilis- régió) és CL-böl (I,-lánc konsíuns régió) allé L-lánc, és VB-ból (B-láac variábilis régió) és CByl (yl-régió a H-látac konstans régiójában.) álló L-lánc, amelyek Cteímináiis régióiknál diszulíidbíddaí kapcsolódnak. Két ilyen homológ aoíitesi-tragmenst Fab'-nek nevezünk. A pepszin az IgG-t szánén hasítja, a két H-lánc közötti kapocsrégióban, a diszrdfidhiátél G-termmálís lítOtessNeam) Irányban olyan aníltest-ffagmensi képezve, amely kissé nagyobb, mis) kettő, fenti Fab'~t a feapocsréglóban összekapcsoló feagmess, Est az mtitcsí-fe&gmensf F(ab'):;-nek nevezzük.

A „graftkilöködés” kifejezésen különböző Immunválaszokat értünk, amelyek a reeipienstöl különböző genetikai hátterű donorból származó graft (élő testrész, amelyet transzpíaniáilak; sejt, szövet vagy szerv) (azaz ailofomszplamáeió vagy xenotrasszplanláosó) kilökésére és eliminálására irányulnak, mivel a recípíens a graitot idegen anyagként ismert fel. A transzplantációt kísérő innaun válaszok a következők szerint osmályoshatöak: 1) hiperakat kilökődés, amely közvetlenül a transzplantációt követő erős kilőkődésl reakció, 2) akut kilökődés, amelyet a transzplantáció alán néhány hónappal figyelőnk meg, 3) krónikus kilökődés, amelyet transzplantáció után több hónappal figyelünk meg, Ráaadásni a fö válaszreakciót a celltüáris Inmmnitás adja, noha a eeiluláris immunitás a T-sejtek által képviselt Inurampkompetens sejteknek köszönhető- és az aatitesiekrsek tulajdonítható humorális immunitás bonyolultan Összehangolt módom lép fel.

A grailktlőködés etedmenyeképpest a graft végső soron nekrotikussá vélik és leesik. Ráadásul, a beteg nemcsak súlyos szisztémás tüneteket mutat, mint a láz, leukoeltózis és kimerültség, hanem a transzplantáció helyén duzzadást és érzékettységel is. Ráadásul felléphetnek súlyos komplikációk, mini: a fertőzések.

Közelebbről xenogén grafitul, mist például sertésből szármázd grafital. végrehajtott transzplantáció során a híperakut kilökődés súlyos problémája lép fel, mikor a graft perceken belül kilökődik,

A „grafl” kifejezésen emlőseredetü donortól emiőseredetü reeipiensbe átülteted „szervet vagy asmnk részét”, vagy .„szövetet” értünk,

A „szerv vagy arnutk része” kifejezésen a trasszpiaafecióra vonatkozóan önkényesen .kiválasztott szervei vagy annak részét értjük, melyet emlősállat vagy ember (előnyösen ember vagy sertés, és különösen előnyösen ember) élő teste tartalmaz. Előnyős példaként említhetjük a májat, szivet, tüdői, hasnyálmirigyet, vesét, vastagbelet, vékonybelet vagy ezek részéi. Különösen előnyös a máj: vagy annak része.

A „szövet” .kifejezése» a transzplantációra vonatkozóan emlősállat vagy ember előnyöse» ember vagy sertés, és kölönosso előnyösen ember) élő testóból származik. Szövetre előnyős példaként említhetjük a bőrt, a szamhártyáí, csontot, vagy szívbillentyűt, azonban nem korlátozódik ezekre.

Az ,dí»mamzttppressziv hatóanyag” kifejezésen értitek bármely, létező immunszapptesszáv hatóanyagot, amelyet graft trauszpianíációja által, sejtek, szövetek vagy szervek klinikai transzplantációja- -során íecípiensnek okozott immtmolőgiui kilökődés (grsdkílökődős) elnyomására alkalmaznak,.és amely gyártását és gyógyászati hatóanyagként való értékesítését állami szervezet hagyta jóvá; vagy bármely más immunszappresszív hatóanyag, amelye t jelenleg klinikai vagy prekhsiktü kísérletekben .alkalmaznak, vagy a klinikai kísérletekben alkalmazni fognak a jövőben, amely gyártását és gyógyászati hatóanyagként való értékesítését állami szervezet jóváhagyhatja a kísérleteket kővetően.

Az ilyen ínmmnszuppressziv hatóanyagokat nemcsak önmagukban alkalmazzák, hanem 2, 3 vagy több hatóanyaggal kombinálva. Ezáltal az „immmisxuppresszív hatóanyag” kifejezés magában foglalja gyógyászati hatóanyag önmagában történő alkalmazását, vagy több gyógyászati hatóanyag kombinált alkalmazását (előnyösen 2 vagy 3 hatóanyag kombinált alkalmazását).

Előnyösen az ímmunszappresssiv hatóanyag például egy vagy több a kővetkezőkben felsoroltak közül: ciklosporin (CsA), takrelimos (FK-SÖó), szatioprín (AZ), mikofenolát-mofetíl (MMF), mizoribin (MZ), lefíunomid (LEP), az aárenokortikátis szteroidok (más néven, adresokortíkális hormonok, kotiskoszterotdok, koriikeióok), mint például a predrdzoloa és metil-pmdaízolon,. srrolimas (más néven rapnmiem), dezoxispergtiíilm (DSG) és FTY728- (kémia) neve: 2-antiíK5-2-[2-(4-okiiifersil)etiF-i,3~p!’Opándioi-mdroidoHd, és az alábbiakban leírásra kerülő „CTLA-drog”, .Különösen előnyösek a takndimus (FK,-5öó) és a eiklesporia közül az: egyik vagy mímdkettő.

A „CTkA-drog*’ kifejezésen olvaa gyógyszert értünk, amely aktív hatóanyagként tartalmaz 1) Iramán eredetű -CTLA4 (ertotoxikus T-lmtiőeíiávsl asszociált 4-es antigén.) exíracelinláris régióját vagy annak részéi antinos&v-szekvencía: GeoBank-ssám:; NP 6ÜS2Q5; eDNS: GenBauk-szám; NM ÖÖ52I4); 2) humán eredetű extraeeílulárss régióját vagy részét, , és más fehérjét (különösen előnyösen humán eredetű smnnmglobuíúinelfezlánc konstans régiója) vagy részét tartalmazó fúziós polipepudet (ezeket -CTLA4-IgFc-késrt vagy CTLA4Ig-ként jelöljük):; vagy 3) DNS, amely az 1. polipeptid vagy 2. fúziós polipeptid emlősnek .(különöseit előnyösen embernek) való bejuttetására. alkalmas, vagy a DNS-t tartalmazó vektor (különösen előnyösen génterápiában általában alkalmazott plazmid, vagy vfessból. (retrovíxmból, adenovimból, adeno-asszoeíáit vírusból származó) virális vektor, vagy ehhez hasonlóak.

Áz „exixacelluláris régió”, & „rész”, az. „intmunglobuiin-nehézlánc’’, a .„fózlós polipeptid” és a „gyakorlatilag ugyanaz” kifejezéseket a fent meghatározón értelemben alkalmazzuk.

A fest említett -CTIA4-.íg jelentős xunnunszt^presszlv hatásáról számos közlemény jelent meg. Például a BAmd-Afyons SpdkWeptignu által kifejleszteti Y lööF (a 100, pozícióban a tirozlni feailal&mma cseréljük) nagy ütummszuppresszív hatását számos állatkísérlet megerősítette, és ez a termés, az egyik €TLA4-drogként szintén a találmány tárgyát képezi (ígakuno Ayutni, 194(14):1195-1200 (2000); I, Ciin. Invest,. Iö3; 1223-1225 (1999); N. Bjgl, 1 Meri., 335: 1369-1377 (1996): 1. Fxp. Med. Π& 130I-1S06 (1993); Blood, 94: 2523-2529 (1999):: NatureMed., 6. 464-469 (2000); Blood, 83: 3815-3523 (1995); 3. Clio. lövést., 2: 473-482 (1998): Blood, 85: 2607-2012 (1995); J. Ciin. favest, 2: 473-452 (1995): Blood, 85: 2697-2612 (1995); N. Bogi. 3. Med. 335: 1369-1377 (1996); 3. Clio, hívest., jö3:1243-1252 (1999)].

A „gyógyászatliag elfogadott hordozó· kifejezés: magában foglal excipiensl, hígítói, töltőanyagot oldószert, snfoíllxálöszep, tartósítószert, paffért, einnigeáíót. aromaíizáfot,. hatóanyagot, színezékei, édeshőt, viszkozitást növelő hatóanyagot, Ízesítőt, oldhatóságot növelő hatóanyagot vagy más adalékot. Egy vagy több ilyen hordozó alkalmazásával gyógyászati készítmény fommiázhaíő tablettákban, pirulákban, pofókban, granulátumokban, injekcióban, oldatban, kapszulákban, pasztillákban, e&írekben, azuszpenziókban, emulziókban, szirupokban stb.

A gyógyászati készítmény beadható orálisan vagy parenteráhsan. A parenterális beadás más formát főbbek között a külső alkalmazásra szolgáló oldat, kúp rektális beadásra és egy vagy főbb aktív hatóanyagot tartalmazó pesszárhon (hüvelykúp), a szokásos előírással .A dózis függhet az életkortól & nemtől, súlytól és a beteg tüneteitől a kezelés időtartamától, a gyógyászati készfonérty által tartalmazott aktív hatóanyag fajtájától (a fenti, találmány tárgyát képező „anyag). A gyógyászati készítmény felnőttnek beadható 18-1801) ug (vagy 10-590 pg) dózisban alkalmanként. A különböző körülményektől függően a fenti dózisnál kisebb dózis lehet elegendő bizonyos esetekben, vagy nagyobb dózis szükséges lehet más esetekben.

Injekció esetében ez: előáliiihatő úgy, írsgy antitestet sem toxikus, gyógyászatifog elfogadott hordozóban, mint például fiziológiai sóoldatban vagy kereskedelmi forgalomban hozzáférhető desztillált vízben feloldjuk vagy szuszpendáljuk injekció céljára úgy, hogy ö,l pg _ lő mg arttsíesi/ml hordozó koseenttációt állítunk be. Az igy előállítóit iajetóó beadható humán betegnek szükséges kezelés esetében, I gg - 180 mg/kg, előnyösen 50 gg - 56 mg/kg testtömeg dózistarioníányöan, naponta egy vagy több alkalommal. A beadás módjára példaként említhetjük az intravénás injekciót, szabkutáu injekciót, míradmoátis injekciói, mftamuszkuiáns injekciót, mtraperittmeáiis infekciót és ehhez hasonlókat, előnyős az intravénás injekció.

Az injekciót előállíthatjuk sem vizes hígítóban (például propiíén-gltkoiban, növényi olajban, muri például olívaolajban és alkoholban, mint például etanolban), szaszpenzióban vagy emulzióban.

Az: injekció sterilizálható bakíériumszthőn szűrve, baktérimnölöszerrel keverve vagy besugárzással, Áz injekció előállítható az alkalmazás időpontjában. Konkrétan, fogyasztva szárításnak tesszük ki steril, szilárd készítményt előállítva, amely steril desztillált vízben, vagy más oldószerben feloldható injekció céljára alkalmazás előtt

A találmány szerinti gyógyászati készítmény extrém módon .alkalmas az immunológiai kilökődés (gmftkilöködés) elnyomására, megelőzésére és/va.gy kezelésére; amely itnintmológtai kilökődés (grsítkilőködás) súlyos probléma olyan terápiákban, ahol donortól származó szervet (májai, szivet, tüdőt, vesét, hasnyálmirigyet, stb.) vagy részét, vagy szövetet (mint például bőrt, szarahártyát és csontot) franszpiantálnak (aheíranszplantácíőval vagy xeoett;mszplantáeióval) súlyos, kardiovasziknláris betegségben szenvedő reclpiensaek.

Ráadásul a találmány szerimi gyógyászati készítmény megnövelheti β gmftkiiökődés (immunológiai kilökődés) olyan, létező immuítszuppressztv hatóanyagokkal történő elnyomását, amely hatóanyagokat az ilyen ttanszplnnfáciős terápiák során adnak be, ha a gyógyászati készítményt as Immunssuppresszáv hatóanyagokkal

Az I. ábra AILIM-ellem antitest -és/vagy Ímmunszuppressziv hatóanyag szerv transzplantációját kísérő írrmnmoiógiai kilökődés (grafikilükodés): elnyomására gyakorolt hatását mutatja be, indexként a grafoüíéíés olyan recipiensben való meghosszabbodását alkalmazzuk, amelybe donortól származó májat ültettek.

A 2. ábra szerv transzplantációját kísérő immunológia! kilökődés (gratikilökődés) ARJM-eÜeni antitesttel és/vagy Ímmunszuppressziv hatóanyaggal való elnyomásának hatását mutatja be, indexként a grafhülélés

XX Φ φ φφ * * φ olyan 'rectpiensfcm való meghosszabbodását. (napokban kifejezve) alkalmazzuk, amelybe donortól származó májat ülíeitek.

A 3. ábra szerv transzplantációjátkísérő immunológia? kilökődés (graiikliökódés) AíLIM-eüeal antitesttel (másképp nevezve íCOB-elleni antitest) való elnyomásának hatását mutatja be, indexként a grafítólélés olyan reeipiensben való meghosszabbodását (napokban, kifejezve)· alkalmazzak, amelybe donortól származó szivet ültettek.

A 4. ábra AKIM-expresszáló sejtek öws^laatált szívbe való infiítrálódásának fokát bemutató fénykép.

.Az 5. ábra szerv tmnszplantáeióját kísérő immunológiai kilökődés (graükilöködés) AíLÍM-ellem antitesttel és/vagy A.dCTLA4-lg-vel való elnyomásának, hatását mutatja be, indexként a gtaftíúlélés olyan reeípjerssben való meghosszabbodását (napokban kifejezve) alkalmazzuk, amelybe donortól származó szivet ültettek.

A 6, ábra. AILIM-dtó antitest és AdC?LA4-lg kombinációja szerv transzplantációját kísérő immunológiai kilökődésre (graftkilökődes) gyakorolt elnyomó hatását mutatja be, indexként az átültetett szív (elsődleges szívátültetés és másodlagos szívátültetés) reeipiensben való grafttúlélése vagy annak hiányát alkalmazva.

Az alábbiakban a Példákra hivatkozva iilasztráljufc a találmányt, azonban ezáltal nem kívánjuk korlátozni annak oltalmi korét.

L példa

GratikilőkŐdés elnyomása AlLl'M-moáuláió anyaggal májátültetés esetében.

1, Anyagok es módszerek

1.1. Állatok

Felnőtt ómoA-patkányokat (hintek, .210-251) g) és £>A-paíkányökai (hűnek, 210-250 g) alkalmaztunk recípíensként és donorként.

1.2. Patkártyeredetü AlLlM-ellens antitest

A korábban közölt, ,,JTT-1 efoevszésti, egéreredetü patkány-AítiM-ellem nmnoklonális antitestet alkalmaztunk, (egéreredetü, patkány-JTT-l-antigén-ellent mortokíottáíis antitest), amelyet híbridóata (melyet Budapesti Szerződés szerint letétbe helyeztek 1996. október 11-én a ,Voóó«űí /uxr/ívre cy Áfoxc.fonce .esd //«?ít<m-reeh«í?fogy- Áfotísőy ofFoosorny, JAnfo <w ómmuöy-uál, amely a Budapest-s.zerzóáés által igazolt nemzetközi letéti ügynökség, letéti szám: EBRM BP-57Ö?) ifi v.úA> és íh vivő tenyésztésével nyert tenyészfelülússéjából vagy asettes-folyadékhol t isztifuttak. Ezt az: antitestet egyszerűen „.ÁlLIM-ellest antitestnek nevezzük,

1.3. Májrtans^iantáciő

Kamada és munkatársai korábbat!: közölt eljárását követve a donor DÁ-patitottvok mását recípiens .Őeudspatkányokba traaszplantáltuk [Suzgsry, 92: 64 (1979)).

Előnyösen, a íBA-patkányokhöl kapod májakat sterilizált, bőséges desztillált vízzel mostuk a bemeneti vénán át. Ezután a májak recípiens óev-üs-patkányokba történő sranszplaíttációját a máj feletti ve?;« covu elvarrásával kezdtük. Ezótán a _:,znandzs&tta’’-teeimíka alkalmazásával a bemeneti vénát és a máj alatti swat covo-t összevarrtuk [Trtmsplaní, Proc., 19: 1158 (19S7); TKmspla.nta.tion, 43: 745 (1957)].

Ha a recípiens patkányok a transzplantáció befejezését: követő 3 napon beiül elpusztultak, ezt a transzplantációban bekövetkezett technikai hibásak határoztuk meg. Ennek, eredményeként a sikeres operációk aránya 95% volt.

- 19 «φ-φφ φφ * Φ * * »»» φ »χ»

1.4. AÍLlM-eltet snittest és/vagy immunssuppresszív-hatóanyagbeadása

A transzplantáció befejezése után as AíLíM-eileai antitestet és/vagy az FK-5Ö6 immuosznppresszív hatóanyagot adtuk be mindegyik .öeukr-píttfcásysak (minden csoport 5-9 állatot tartalmazott) a feta ismertetett dómokban és ütemezés szerint. A transzplantáció befejezésének napjátszámítóitok a. ö. napnak (0),

Kontroliként azt a. csoportot, alkalmaztuk, amelynél az AlLlM-ellem antitestet és az FK-SÖő immmsszuppressziy hatóanyagot n adtuk be.

.1. AlLIM-eikmi antitest (1 mg/kg: intravénás injekció;: 0, nap)

2. ÍLíM-elíeni antitest (1 mg/kg; intravénás injekció; ö. és 6. nap)

3. AlLlM-ellen-i antitest (1 mg/kg; intravénás injekció; 0., 3. és 6. nap)

4. AlLIM-elleni antitest (1 mg/kg; intravénás injekció; 0., 3., ó. és 9. nap)

5. AlLlM-ellení antitest (ö.,3 mg/kg; intravénás injekció; Ö., 3., n, és 9. nap)

6. í-K-506 (1 mg/kg: imramaszkuláris injekció; t), nap)

7. AlLIM-elleni antitest (1 mg/kg; intravénás injekció; Ö. nap) és PK--S06 (í mg/kg; iníramuszkuláris; 0, nap).

A transzpltmíáil máj reeipiensfeett való töléiéséoek időtartamát meghatároztuk a Κφ/er-AfemMeszÉ alkalmazásával.

2. Eredmények .Az eredményeket az l. és a 2. ábrán mutatjuk be. A. 2. ábrás az adatok egy része az i. ábra adaton friss.tti.

Eredményként azt a következtetést vonhatjuk le, hogy abban a csoportban, -ahol AILlM'-eUení antitestet adtunk be (l mg/kg) 3-szor vagy 5-szőr, a transzplantációt kővetően egy adott idóperioduson át, a transzplantáit máj gratttóléiésének jelentés mértékű meghosszabbodását figyeltük meg a kontrolllioz viszonyítva.

Ráadásul abban a csoportban, ahol alacsony dózisé AÍLlM-ellem antitestei: adtunk be 5-ször transzplantációt követőéit egy adott idépedöduson át, a tnmszplaniáií máj graftttilélésének hasonló, jelentős mértékű meghosszabbodását figyelték meg.

Ráadásul, meglepő módon, az AlLIM-elleni antitestet akár csak egyszer, FK-506-tal (klinikaiiag többféle céte alkalmazott, inmmnszo.ppre.ssziv hatóanyaggal) kon-bmációban beadva a transspianiált máj grafiíúiélése nagymértékben meghosszabbodik; a túlélési: idő jelentős mértékben hosszabb volt, mint amikor csak az FK-SÖő-oí. alkalmaztuk, egy -alkalommal

Az eredmények alapján a következőket áiiífbatjuk:

1) Az AlLIM-elleni antitest jelentős mértékben elnyomja a graífkliökődést (Immunológiai kilökődést), amely graft, például szerv txansKplaetációját kíséri..

2) A grad, például szerv trattszplantációját kísérő graftkllöködés még jobbas elnyomható- AlLÍMellesi antitest ímmuttszuppresszív hatóanyaggal történő beadásával, ahhoz viszonyítva, ha csak az egyiket alkalmazzuk,

2, példa immunológiai kilökődés elnyomása AiUM-rnodtdál.ó anyaggal szivtrasszplastáció során 0. rész)

1, Reagensek, állatok-és mérési elj árások

1,1, Állatok

Felnőtt, CT/őí/é-egereket (hímek, 6 hetesek) és R-iáéffe-egereket (hintek, ő hetesek) alkalmaztunk >0 recipienskéní és donorként.

1.2. Egér AILlM-elleni monoklonálisantitest előállítása

Az előállhast a következőképpen hajtottuk végre::

A korábban közök (int. Immunok, 12(1): 51-55 (2(W)| egéreredetü Á1LIM teljes hosszúságú aminosav-szekveuciáját kódoló cDNS-t alkshuazva egéreredetü AiLÍM-ot expresszié tzsnszfetftnit sejteket állítottunk elő standard eljárásokkal, genetikai rekombiaáeiös technológia alkalmazásával,

A manszibrmáh sejteket homogenizáltuk és uittacerttriiugálásoak. vetettük alá (löö ÖÖü x g), és a sejtmembránftakeiőt tartalmazó, eesirifogáit maradékot összegyűjtöttük, és PBS-ben szuszpe-ndáhuk. A kapott sej tmetabránfrakelól komplett FmtW-fóIe adjuvánssal együtt Wtar-padcásiyok upbegyelte injektáltuk kezdeti immunizálásként (0. nap). Ráadásul a sejtmembrás&akeiót antigénként az ujjbegybe beadtuk (adott) időközönként, a 14. és 2S. napon. A végső immunizálás utas két nappal nyirokcsomói sejteket gyűjtöttünk össze,

A nyirokcsomói sejteket és iRdf-mielómasej leket (JC'R sz. BŐI 13.; Rés. Díselosure, 217; 155 (1982)1 5:1 arányban összekevertünk, és monokktnális antitestet termelő hibridómákat állítottunk eló sejtfúzióval 40Öö-es poli-etiléngljkol (jfeeámger Ahmak&m) luziós hatóanyagként történő alkalmazásával. A híbriáőmaszelekeiót /Eé7-ot, 10% magzati berjúszérumot és aminopterint tartalmazó X.57AW-tápközegben (Ajinomoto) való tenyésztéssel haj tottak végre.

A sejtek fiuoreszceuci&mtenziíúsát mértük :(a sejteket úgy festettük, hogy mindegyik kihrídómát reagáltatiuuk a fenti, rekombínáns, AlLíM-expresszálö, transzíéktáit sejtekkel, mjd.HTC-jsSélt, paikáayelleni IgG-vei (Cdppe/}, ARéGR-EE/TS'/íovv cimméter alkalmazásával a mindegyik hibridóma. esetében a teuyészfelGlúszóban elöáiittoít, monoklonális antitestek egéreredetü AUJM-elleaí reaktivitásának megerősítésére. Ennek eredményeként kaptunk néhány hibrídömát, amely egéreredetü AILlM-elleni reaktivitással rendelkező monoklonális antitestet termelt.

Az; egyik ilyen hibridómáí „BlS,5”~nek neveztük: el. Ezt a hibridómáí (10- l ö' sejtiö.5 rnl egér) injektáltuk ioíraperitoseálisan ZCS .««/«s egérbe (nőstény, 7-8 hetes). 10-20 nap elteltével laparatómiát hajtottunk végre az, egéren altatásban, és a kapott «sczíavdbiyadékból nagy léptékű, egér AlLIM-ellerü, patkányeredetű monoklonális antitest (Igö2a) előállítást hajtottunk végre standard eljárásoknak megfelelően. Ezt az antitestet ezután „AILIM-elIesi antitestnek” nevezzük.

1.3. Szívátültetés

A korábban közölt eljárást követve BAASké-donörcgemk szivét recipiens CAWfe-egerek hasüregébe ültettük. A titaíszplaötált szív dobogásának megszűnését vettük a graftkilöködés lezajlásának.

2. 1. Kísérlet (AlLIM-dlani antitest beadása)

Mindegyik, tiasszplantsción átesett, CJB-He-egémek (10 egér) az ÁltlM-eiieai antitestet (10 mg/kg) közvetlenül a transzplantáció után beadtok (0. nap, 200 pg), a 2. napot! (200 pg), a 4. napon (200 pg), a 7, napon (200 pg) és a 10. napon (I öö pg). Kontroliként olyan csoportot alkalmaztunk (25 egér), amelyeknek nem adtunk be AIUM-eílesl antitestet

Az átültetett szivek transzplaníáelót követő graíltólélését a rectjnensben megbecsültük és &ataMefer-teszt alkalmazásával meghatároztuk.

Az átültetett szivei; íranszjílanúlciót követő, a reeipiensben. xneghatárosott graittüléiésének átlagos időtartama a kővetkező:;

- 21 AlLIM-ellení antitestet kapod csoport: a grafttúlélés időtartama: 9 stap 1 egérben, 10 nap 3 egérben, 13 nap-4 egérben, 16 nap 2 egérben.

Kontrollcsoport: a grafttáléíes Időtartama,: δ nap 2' egérben, 7 nap 9 egérben, 8 nap 7 egérben, 9 nap 3 egérben, 10 nap 4 egérben.

A kontrollcsoportban, ahol AfláM-eltern antitestet nem adtunk be, a graft-túíésés időtartama 7.9 nap volt, ezzel szentben az AXLÍM-eöeai antitesttel kezdi csoport esetében ez 12,3 nap volt, és a transzplantálí szív grafttüiélése jelentős mértékő íneghosszabbodását tíemonstrákuk az ÁXLÍM-eHera antitesttel kezelt csoportban.

3. 2. Kísérlet í AlLIM-elieni autitestbeadásíí)

Ugyanazokat az állatokat (donorok és reeipiensek) és AXLXM-dfaü antitestet alkalmaztuk, taínt a fentiekben.

A szívátültetést az 1. kisérleíbeu leírtakhoz hasonló módon: hajtottuk végre·.

Mindegyik, transzplantáción átesett, GS&Zfe-egémek intraperítoneálísao beadtak az AILlM-eileni antitestet (tOG ug/nap) közvetlenül a transzplantációt követően (Ö. nap), a 2>, 4,, 7. és íö. napon. Kontrollként olyan csoportot alkalmaztunk, amelynél AfLIM-eileni antitestet nsra adtunk be.

Az átültetett szivek transzplantációt kővető, a recipíensben meghatározod graíbúiéíéséoek átlagos időtartama megközelítőleg 7.7 nap volt a kontrollcsoportban, míg az AlLIM-elieni antitesttel kezelt csoport esetében ez megközelítőleg 4Ö.9 nap volt (intermedier érték: 29 nap, maximumérték: 120 nap), (3. ábra). Konkretat! az AILíM-elleni antitesttel kezelt csoport. esetén a íranszplantált szív graföálélésének jelentős mértékű meghosszabbodását demonstráltuk.

Ráadásul, hemaíoxilinteozin-festéssel standard eljárások alkalmazásával) vizsgáltuk az ΑΠ.ΙΜexpresszáló (ICOS-expresszáió) sejtek íranszplantált szívbe történő mfiltrálódásának mértékét minden kontroliegér esetében (a transzplantáció után terápiás kezdési, nem alkalmaztunk) és a transzplantáció után. ÁILIM-elleni antitesttel kezelt egér esetében.

Ennek eredményeképpen, Al'LlM-expres&záló (ICÖS-expresszálő) sejtek jelentős mértékű mfiiirálődását, valamint a szivizcnn nekrözrsáí figyeltük meg (festődéit rész). Másrészt az AlLIM-elieni antitesttel kezelt egére esetében a manszplantált szívben a szívizom nekrózisáí nem figyelhettük meg, az MiJM-expressxálö (ICOS-expresszáló) sejtek isflhráledásának jelentős mértékű csökkenését megerősítettük (4, ábra).

3, példa

Az immunológiai kilökődés elnyomása szív- és bőrátültetés esetében /klllM-moduláló anyagokkal

1, Reagensek, állatok: es mérési eljárások

1,1. Adenovirus vektor h€TLÁ9-Ig-t (humáti eredeíűCTLA4 cxtraeeíluláris régióját és iramán eredetű Fc-t tartalmazó fúziós fehérje) kódoló cDNS vagy akár az £ coA β-galaktozidáz-géniét (lacZ) kódoló cDNS expressziős kazettáját tartalmazó adenovifust álilioihmk elő a pdrta.7&íáC7L/14-/g expressziós kezmidkazetta [Transpianíatíos, 6S(ó): 758 (1999)1: és a szülői törzs adenovirus genomja [Proc, Kaik Acad. Sct USA., 99(24): 11498-11502 (1993)] homológ rekombinációjával.

Ezután a rekombináns vírust humán veséből származó ákj-sejtvonalbati prolíí'mácíónak vetettük alá. Az ilyen módon előállított vínssvektort összegyűjtöttük. és -8ö^cC-on fagyasztva fároítuk, A hCTLA-íg < # cDNS-ét tartalmazó rekombináns adenovírust és LacZ-t tartalmazó adesov&ust AdCTlA-lg-«ek és AdLaeZ-nek neveztük el.

1.2. Állatok és antitestek

Felnőtt, birs (2ÍÖ-250g).dmrir (RTF) patkányokat alkalmaztunk recipiensként, ős felnőtt, tóm (21 ö25Ög) fád (RT1^S) vagy ÖN (RTF) patkányokat alkalmaztunk donorként.

Az 1. példa szerint elöálljtott, egétetedetii, patkány AILIM-elleni monoklonális antitestet alkalmaztak.

1.3 , Szív- és bőrátültetés és mérési eljárások

Korábban közölt eljárását követve (.5. Thorsc. Cardiovase, Surg,, 57(2); 225-229 (1969)) IMpatkányokíól nyert, sziveket dmvri-paikányok hasüregébe ültettük. A szfvPanszplantációt követben azonnal patkány AILIM-dlesi antitestet (1 mg/kg) és/vagy Ad€TLA44g-t (lö⁵ „píakképző” egység, pfuj adtunk be intravénásán, egyetlen dózisban a rceípíens patkányoknak.

Kontrollként olyan csoportot alkalmaztunk, amelynél a transzphmtált állatoknak AllX-eUeni antitestet és AdCTLAddg-í sem adtunk be, és olyat, melynél AdL&cY-í adtunk be. A kezdési eljárást mmdes állatcsoportnál az alábbiakban mutatjuk be,

1. csoport: Alloíranszplajstáció (detwis/öd) mnunnpszuppresszív kezelés nélkül.

2. csoport; ízotranszplantádö (Lmws/Lwás)· immunpszuppresszív kezelés nélkül.

3. csoport: Alleteuszpianíácíó (deadriöd) AdEacZ beadásával.

4. csoport; Allcdrasszplantáció (deado73d) Ad€TLÁ4~íg beadásával.

5. csoport: Allé transzplantáció (deatix/öd) AKJM-dlení antitest beadásával.

6. csoport: Alleiraaszplantáeié (.tiewAid) AdCTLA4~Ig és AILIM-elleni antitest beadásával.

A. tnmszplantáli szív dobogásának megszűnését vettük a gradkÜöködés lezajlásának. A. grafikilökődést a tianszplantáli szív szövetébe ínfiltrálódoií sejtek hisztolőgiai vizsgálatával és az izomsejiek sekrózisának (standard eljárásokat követő) SRdésíéxével történő vizsgálatával erősítettük meg.

Ezután & 4, és 6. csoportban {ahol & szivek bosszú ideig túlélést mutattak) a redpiess patkányok laterális mellöregfalába a díd-donorpatkányok megfelelően vastag hörgraílját íranszplantáltuk. A bőrtranszpluruáció után AILIM-elleni antitesttel, AdCTLA4-lg-veI vagy ilyenekkel immunszuppresszív kezelést nem haj totóink végre, A hörgraíbíálélés időtartamának végét vizuális megfigyeléssel, a graft líl%-ra vagy kisebbre csökkenésével, határoztuk meg,

Ezrstán a kezdeti, Dd-patkányok. szívtmnszpiantácíója után 200 nappal a .£).d-donorpaíkásy szívét mandzsetta-technika [Acta Patkot, bíicrohiol. Scand. (A), 79(4): 366-372 (1971)1 újra átültettük a 6. csoportba (amely & dottorbör-ttimszplgttíáció során graftkílöködést mutatott) tartozó, 3 recipisns patkány eervikális régiójába trans^iantái.tnk.

Ráadásul a kezdeti, .0,-:1--áosorpatkányok szlvtranxzpkratáeiöja után 150 nappal ZdáMonorpaikányak szivét transzpiantáltisk a 6, -csoportba (ahol a hsuszpianiálí szív hosszú időn keresztül túlélést mutatott) tartozó, feiHunaradt recipiens-patkáuyokba.

A graltiúlélős rtídpiensben tapasztalt mértékének statisztikai kiértékelését AirtduK-Áíerer-teszi szerint hajtotóik végre.

2. Vizsgálati eredmények

Amint az .5. ábrás bemutattuk, a tr&uszplantálí szivek reejpiensben való túlélésének a w kezelt,

- Οϊ *φ «<*«φ φφ * ♦ ΦΦΧ *«« φ Φϊφφ φ φ φ φφ ♦ φφ xenobmíszplantáctón átesett állatok csoportjához <1, csoport) viszonyított, jelentős mértékű meghosszabbodását figyeltük meg, illetve nem figyeltük meg. az ÁdLasZrVsl kezelt állatok esopo.rtjáb;m O. csoport) és egyszeri dózisban AlElM-eHeul antitesttel kezelt: állatok csoportjában (5, csoport).

Másrészt as AdCTLAti-íg-el kezek: állatok csoportjában (4.. csoport) a tmuszpiantált szív grafttólélése (kezdetben átültetett .ÖA-gatkánysziv) jelentős mértékben meghosszabbodott (átlag: megközelítőleg 64 nap), Ráadásul a 4, csoportba (1(1 patkány) tartozó 3 patkány esetében a transspiauiált szív grafltúiélése esetében bosszú, 3 Öl) napos, vngy hosszabb időszakot figyeltünk meg (5. ábra).

Ráadásul abban a csoportban, ahol Ad€TLA4-lg-í és AlLIM-ellem antitestet kombinációban alkalmaztunk (6, csoport), a transzplantáit szív gratitúléiéss (kezdeti, .ÖA-patkánysziv) koriátianui (3ÖS nap vagy több) meghosszabbodott mindegyik reeiplens esetében (5. ábra.)

A 4. csoport reelplensében a trsnszplautált szív grafitúlélése (kezdeti, ÖA-patkányszív) kilökődött a transzplaníák bőméi együtt, míg a 6. csoport a traöszplantúlt szív kilökődését nem figyeltük meg.

Amint azt a 6. ábrán bemutatjuk, a 4. és 6, csoportba tartozó mindegyik patkány esetében, amelyik donortól trtmszplatdálf bőrt kapott a trasszpteíált bőr kilökődött. Azostóan a 4. csoporttal és a kontrollcsoporttal ellentétben,, ahol a Iranszplaniált bőr kilökődése 12 napon belül lezajlód, a 6, csoportban a kilökődés kissé később zajlott le, 16 napon belül vagy hamarabb. Ez az eredmény azt tnotatja, hogy az AdCTLÁ4-Ig és AlLIM-elleni antitest kombinált alkalmazása késleltethet: a bőrgraft kilökődését az AdCTLA44g önmagában történő alkalmazásához viszonyítva.

Érdekes módon a ó. paíkánycsoport recipiens állatai esetében, ahol a íranszplaníáh szív (kezdeti, .DA-paíkánysziv) hosszá idejű gratiiulélését Igazoltak, a fcr&nszplantáU bőr teljes mértékben kilökődött a fentiek: szerint, azonban a második transzplantáit szív esetében (a másodszor temszplaníúlt ZMpatkánydcnerszi'v) korlátlan idegi grailtúíá lését láttuk. Ráadásul a rccipiens patkányok esetében a kezdetben transzpianíáit donorsziv túlélést mutatott a vizsgálat során.

A 6. csoport esetében, uoudyekbe ikV-patkánydonorszívet transzplantáltunk, a kezdetben trasszplantált D/i-patkányszivek tovább dobogtak, és túlélést mutattak a vizsgálat során, azonban a másodszorra transzplantáit RV-patkánydonorszivek rövid időn beül kilökődtek az 1. csoport állatainál megfigyelt eredményekhez hasonlóan.

A találmány szerinti gyógyászati készítmények extrém utódon alkalmazhatóak a szerv (máj, szív, tüdő, vese, hasnyálmirigy stb.), annak része vagy szövet: (bőr, szaroháríya, csont, stb.)., súlyos, ^diovaszkuláris betegségekben. szenvedő reetplensbe, donortól történő transzplantációjával (alloíranszplantáctóval vagy xeitotráítszplaníácíóval) járó terápiákat kísérő súlyos probléma, az: immunológiai kilökődés (gratikííökődes) elnyomására, megelőzésére és/vagy kezelésére,

A találmány szerinti gyógyászati készítmények ezen kívül erősen elnyomják a graftkiiskődésí létező, gratikíiöködés (Immunológiai kilökődés) elnyomására as ilyen transzplantációs terápiában alkalmazott, imrnrmszuppresssiv hatóanyagokkal kömhmúcíóbso alkalmazva,

Ráadásul a találmány szerinti, ÁlLiM-elleni, humán eredetű antitestei tartalmazó gyógyászati készítmény kitünően alkalmazható gyógyszer, mivel sem okoz semmilyen mellékhatást, mint például allergiát, amely az egéreredetű antitest embernek történő beadásakor fellép.

Claims (9)

1. AILIM .által közvetített jelátvitelt moduláló aktivitással bíró anyag egy vagy több munsioszuppressziv hatóanyagnak szerv, annak része vagy szövet transzplantációját kísérő grallkilökődés elnyomására, kezdésére vagy megelőzésére gyakorolt hatásának növelésére szolgáló gyógyszer előállítására,, amely anyag az alábbi, (ajtói (ej anyagok kozni választott:

táj AlLlM-boz kötőrlő antitest vagy az antitest része;

(b) AUM extmcelialárís régiója egészét vagy részét tartalmazó polipeptid;

(ej AILIM extracelhiláris régiója egészét vagy részét és immonglobulin-nehézláno konstans régiójának egészét vagy részét tartalmazó fúziós polipeptid;

(d) AÍOM-hö?, kötődő polipeptid; és (ej AÍOM elleni aníiszensz DNS vagy astiszensz RNS.

2. Az 1. igénypont szerinti anyag, ahol az inwnmsznppresszív hatóanyag egy vagy több, terápiás hatóanyag. a kővetkezőkben felsoroltak közül; azaíloprín, adtenokcrtikáíís szterotdok, .«kiospöria, mszonbia ős íakrolimusz (FK-506), mskoienolái-mofétil, íefhmosmd, sírolimus, uezoxi-spergnaíin, FTY72Ö és CTLA4haíóanyag.

3. Az 1. vagy 2. igéoypeanok szériád anyag iakroíimasszal (FK-506) és/vagy CT.LM-hat6snyaggal kombinációban történő alkalmazásra.

4. Az 1-3, igénypontok bármelyike szerinti anyag, ahol a transzplantáció aliotranszplaníáció.

5. Az 1-3. igénypontok bármelyike szeriad anyag, ahol a transzplantáció xenolranszplantácíó.

ó.

Áz 1-5. igénypontok bármelyike szerinti anyag, ahol az anyag Ali ,ΙΜ-hez kötődő antitest vagy az. antitest része.

7, AILIM által közvetített jelátviteli moduláló akiíviíásssi bíró anyag és egy vagy több immoBszuppresszív hatóanyag gyógyászati kombinációja,, ahol az anyag az alábbi, (&)-tól (ej anyagok közöl választóit:

(a) AlLIM-hoz kötődő antitest vagy az antitest egy része;

(bj AILIM exlraceiluláris régiója egészét vagy részét tartalmazó polipeptid;

(c) AILIM. estraeeliuláris régiója egészét vagy részét és immnnglobulin-nehéziánc konstans régiójának egészét vagy részéi tartalmazó fezios polipeptid;

(d) AILIM-hoz kötődő polipeptid;: és (ej AILIM elinni anbszetisz DNS vagy antiszensz RNS,

8, A 7. jgéaypoát szerinti gyógyászati kombináció, ahol az irmnunszoppresssiv hatóanyag egy vagy több terápiás hatóanyag a következőkben felsoroltak közük azatioprín, adreaokorttkáiis ssteroidok, dklosporin, mizoribm és tafcrolímusz (FK-506), mikofenolát-mofeth, britmomid, sirolimas, dezoxi-spergualis,.FTY'720 és CTLAő-haróanyag.

9, A 7. vagy 8. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati kombináció, ahol az anyag AILIM-hez kötődő antitest vagy annak része,