SK288048B6

SK288048B6 - Use of a substance effective in modulating signal transduction mediated by AILIM for suppressing, treating or preventing graft rejection and pharmaceutical composition comprising the substance for use in suppressing, treating or preventing graft rejection

Info

Publication number: SK288048B6
Application number: SK1214-2003A
Authority: SK
Inventors: Seiichi Suzuki (Zomrel); Mitsuaki Isobe
Original assignee: Japan Tobacco, Inc.
Priority date: 2001-03-01
Filing date: 2002-02-05
Publication date: 2013-03-01
Also published as: RU2263512C2; IL156845A0; DK1769807T3; HU228108B1; KR100609444B1; DE60217839D1; HK1061531A1; US20040253229A1; CZ20032406A3; CN1518458A; HK1102293A1; AU2002228435B2; SI1769807T1; RU2003129166A; MXPA03006736A; KR20030078946A; HUP0303332A2; CY1110143T1; CA2439858C; DE60217839T2

Abstract

Use of a substance having an activity to modulate signal transduction mediated by AILIM for suppressing, treating or preventing graft rejection accompanying the transplantation of liver, heart, or a portion thereof and for enhancing the effect of one or more immunosuppressive agents, such as tacrolimus, on the suppression, treatment, or prevention of graft rejection accompanying the transplantation of liver, heart, or a portion thereof. Disclosed is also a pharmaceutical composition for aforementioned use, which comprises the substance having an activity to modulate signal transduction mediated by AILIM.

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka farmaceutických prípravkov zahŕňajúcich látku, ktorá je účinná pri modulácii biologickej aktivity „aktivačnej indukovateľnej lymfocytovej imunomodulačnej molekuly (AILIM) (známej tiež ako „indukovateľný kostimulátor“ (1COS)), najmä prenosu signálu sprostredkovaného AILIM.

Vynález sa týka najmä farmaceutických prípravkov zahŕňajúcich látku, ktorá je účinná pri modulácii (napríklad inhibícii) proliferácie buniek exprimujúcich AILIM alebo modulácii (napríklad inhibícii) produkcie cytokínu (napríklad interferónu-γ alebo interleukínu-4) bunkami exprimujúcimi AILIM.

Konkrétne sa vynález týka (1) farmaceutických prípravkov na inhibíciu, liečbu alebo prevenciu odvrhnutia transplantátu (imunologická rejekcia), sprevádzajúceho transplantáciu orgánov alebo jeho časti alebo tkaniva, a (2) farmaceutických prípravkov na podporu inhibičného, terapeutického alebo preventívneho účinku imunosupresív na odvrhnutie transplantátu (imunologická rejekcia), sprevádzajúce transplantáciu orgánov, jeho časti alebo tkaniva.

Doterajší stav techniky

Vďaka nedávnej revízii zákonov o transplantáciách orgánov bolo v Japonsku uskutočnených niekoľko transplantácií orgánov od pacientov po klinickej smrti. V jednom prípade bol tento benefit poskytnutý siedmim pacientom od jedného darcu. Do budúcnosti sa očakáva, že počet transplantácií orgánov stúpne.

Na druhej strane sa odhaduje, že počet japonských pacientov postihnutých vážnymi kardiovaskulárnymi ochoreniami, ako sú ochorenia pečene (akútne zlyhanie pečene, cirhóza pečene a pod.), ochorenia srdca (ťažké zlyhanie srdca, kardiomyopatia, srdcová hypertrofia a pod.), ochorenia obličiek (zlyhanie obličiek, chronická glomerulonefritída, diabetická nefropatia, pyelonefritída a pod.), pľúcne ochorenia (pulmonálna dysfunkcia oboch pľúc a pod.) a pankreatické ochorenia (liečba diabetických pacientov), pre ktorých je transplantácia orgánov na liečbu nevyhnutná, sa každý rok zvyšuje asi o 600 kardiakov, asi 3000 pacientov s ochorením pečene a asi 500 pacientov s ochorením pľúc. Zatiaľ čo zákonný rámec je v štádiu vývoja, nedostatok orgánov na transplantáciu je taktiež reálnym problémom, ktorý v súčasnosti existuje. Podobne je nedostatok orgánov vážnym problémom taktiež v Spojených štátoch, ktoré sú v transplantáciách poprednou krajinou. V Spojených štátoch čaká približne 4300 ľudí (1999) na transplantáciu srdca a približne 43 000 ľudí (1999) na transplantáciu obličky. V skutočnosti každoročne zomiera približne 800, resp. 2300 ľudí, pretože nemôžu podstúpiť transplantáciu srdca, resp. obličky.

Transplantácia tkaniva (ako je koža, rohovka a kosť) alebo orgánu (ako sú pečeň, srdce, oblička, pľúca a pankreas) zahŕňa: (1) autotransplantáciu (autológnu transplantáciu), (2) izotranplantáciu, (3) alotransplantáciu a (4) xenotransplantáciu.

Autotransplantácia sa týka transplantácie časti jedinca do inej časti toho istého jedinca a príkladom je liečba popáleniny naočkovaním vlastnej kože pacienta na postihnutú oblasť.

Izotransplantácia sa uskutočňuje medzi homogénnymi živočíchmi. U ľudí sa takáto transplantácia uskutočňuje medzi jednovaječnými dvojčatami (napríklad transplantácia jednej obličky alebo pečeňového tkaniva).

Alotransplantácia sa uskutočňuje medzi dvoma rôznymi jedincami, ktorí majú rozdielne genetické pozadie a u ľudí sa takéto transplantácie uskutočňujú medzi dvojvaječnými dvojčatami alebo medzi jedincami, ktorí nemajú absolútne žiaden vzájomný pokrvný vzťah.

Xenotransplantácia sa uskutočňuje medzi jedincami rôzneho živočíšneho pôvodu. Príkladom je prípad, keď sa tkanivo šimpanza alebo prasaťa transplantuje človekovi.

Ako je uvedené, očakáva sa, že počet alotransplantácií od klinicky mŕtvych pacientov sa bude zvyšovať v dôsledku vývoja legislatívy týkajúcej sa transplantácií orgánov. S cieľom riešiť absolútny nedostatok transplantovateľných orgánov sa však v súčasnosti aktívne uskutočňujú rôzne výskumy zamerané na praktické aplikácie xenotransplantácie, najmä transplantácie tkanív alebo orgánov zo zvierat, ako sú prasatá, na ľudí.

Zatiaľ čo otázka nedostatku transplantovateľných tkanív a orgánov bude pravdepodobne vyriešená vývojom zákonov o klinickej smrti a transplantáciách a vylepšením techník xenotransplantácie, zostáva v liečbe ochorení alotransplantáciami a xenotransplantáciami ďalšia extrémne veľká prekážka. Touto prekážkou je konkrétne silná imunologická reakcia (odvrhnutie štepu) príjemcu, ktorá nastáva po transplantácii tkanív a orgánov od darcu.

Odvrhnutie štepu sa týka rôznych imunitných reakcií, ktoré sa snažia vypudiť a zničiť transplantát (štep, časť živého organizmu, ktorá je transplantovaná, bunku, tkanivo alebo orgán) od darcu, ktorého genetické pozadie je odlišné od príjemcu (t. j. alotransplantácia alebo xenotransplantácia), pretože príjemca rozpoznáva transplantát ako cudzorodú substanciu. Imunitné reakcie, ktoré túto transplantáciu sprevádzajú, je možné klasifikovať na: (1) hyperakútne odvrhnutie, čo je silná reakcia, objavujúca sa bezprostredne po transplantácii, (2) akútne odvrhnutie, ktoré sa pozoruje do niekoľkých mesiacov po transplantácii, a (3) chronické odvrhnu2

SK 288048 Β6 tie, pozorované niekoľko mesiacov po transplantácii. Navyše, aj keď bunková imunita na základe imunokompetentných buniek predstavovaná T bunkami a humorálna imunita na základe protilátok fungujú zložito koordinovaným spôsobom, hlavnú odpoveď tvorí bunková imunita.

Ako dôsledok odvrhnutia transplantát nakoniec nekrotizuje a odpadne. Okrem toho sa u príjemcu vyvinú nielen vážne systémové príznaky, ako je horúčka, leukocytóza a únava, ale taktiež opuch a citlivosť v mieste transplantácie. Okrem toho môže dochádzať k vážnym komplikáciám, ako sú infekcie.

Najmä pokiaľ sa transplantuje xenogénny štep, napríklad z prasaťa, vzniká vážny problém hyperakútnej rejekcie, keď je štep odvrhnutý počas niekoľkých minút.

Na potlačenie imunologickej rejekcie (odvrhnutie štepu), sprevádzajúcej tieto transplantácie, sa používa obmedzený počet imunosupresív, ktoré potlačujú fúnkciu imunokompetentných buniek, pretože imunologická rejekcia vyvolaná alotransplantáciou je hlavne dôsledkom bunkovej imunity. Medzi takéto imunosupresíva patrí cyklosporín (CsA), takrolimus (FK-506), azatioprín (AZ), mykofenolát mofetil (MMF), mizoribín (MZ), leflunomid (LEF), adrenokortikálne steroidy (známe taktiež ako adrenokortikálne hormóny, kortikosteroidy, kortikoidy), ako je prednizolón a metylprednizolón, ďalej sirolimus, (známy taktiež ako rapamycín), deoxyspergualín (DSG) a FTY720 (chemický názov 2-amino-2-[2-(4-oktylfenyl)etyl]-l,3-propándiolhydrochlorid).

Ako imunosupresíva sú taktiež predmetom klinického vývoja CTLA4 a CD28, čo sú molekuly, zodpovedné za transdukciu kostimulačných signálov, potrebných na aktiváciu T buniek (transdukčné molekuly kostimulačných signálov), a najmä liečivá obsahujúce CTLA4, ktoré používajú rozpustnú oblasť CTLA4 a gén, ktorý ju kóduje.

Na druhej strane, podobne ako CTLA4 a CD28, čo sú transdukčné molekuly kostimulačného signálu, bola nedávno identifikovaná molekula nazvaná aktivačná indukovateľná lymfocytová imunomodulačná molekula (activation inducible lymphocyte immunomodulatory molecule, AILIM; ľudská, myšacia a krysia; Int. Immunol., 12 (1), str. 51 - 55, 2000, nazývaná tiež indukovateľný kostimulátor (ICOS; ľudský; Náture, 397 (6716), str. 263 - 266, 1999), J. Immunol., 166 (1), str. 1, 2001, J. Immunol., 165 (9), str. 5035, 2000, Biochem. Biophys. Res. Commun., 276 (1), str. 335, 2000, Immunity, 13(1), str. 95, 2000, J. Exp. Med., 192 (1), str. 53, 2000, Eur. J. Immunol., 30 (4), str. 1040, 2000) ako tretia transdukčná molekula kostimulačného signálu, ktorá prenáša druhý signál (kostimulačný signál), potrebný na aktiváciu lymfocytov, ako sú T bunky, a v spojení so signálom reguluje fúnkciu aktivovaných lymfocytov, ako sú aktivované T bunky.

Na základe zistení z nedávnych štúdií týkajúcich sa tejto molekuly sa predpovedá, že molekula AILIM sa pravdepodobne podieľa na rôznych ochoreniach (napríklad autoimunitných ochoreniach, alergiách a zápaloch), vyvolávaných aktiváciou imunokompetentných buniek, ako sú T bunky (najmä T buniek). Nie sú však doteraz známe akékoľvek údaje o vzťahu medzi funkčnou moduláciou molekuly AILIM a odvrhnutím štepu (imunologickou reakciou), sprevádzajúcim transplantácie tkanív alebo orgánov, ani pokusy o potlačenie, liečbu alebo prevenciu takýchto odmietavých reakcií, sprevádzajúcich transplantácie orgánov, moduláciou aktivity molekuly AILIM.

Okrem toho bola veľmi nedávno identifikovaná nová molekula nazvaná B7h, GL50 alebo LICOS, ktorá sa považuje za ligand interagujúci s transdukčnou molekulou kostimulačného signálu AILIM (Náture, zv. 402, č. 6763, str. 827 - 832, 1999; Náture Medicíne, zv. 5, č. 12, str. 1365 - 1369, 1999; J. Immunology, zv. 164, str. 1653 - 1657, 2000; Curr. Biol., zv. 10, č. 6, str. 333 - 336,2000).

Identifikácia týchto dvoch druhov nových molekúl, totiž AILIM (ICIS) a B7RP-1 (B7h, GL50, LICOS), odhalila, že okrem prvej a druhej signálnej transdukčnej dráhy medzi CD28 a CD80 (B7-1)/CD86 (B7-2) a medzi CTLA4 a CD80 (B7-1)/CD86 (B7-2) existuje nová tretia transdukčná dráha kostimulačného signálu, ktorá je nevyhnutná pre uvedenú aktiváciu lymfocytov, ako sú T bunky, a kontrolu fúnkcie aktivovaných T buniek, ktorá pôsobí prostredníctvom interakcie medzi AILIM (ICIS) a B7RP-1 (B7h, GL50, LICOS).

Prebiehajú rozsiahle štúdie biologických funkcií týchto nových molekúl, regulácia fúnkcií lymfocytov, ako sú T bunky prostredníctvom tretej transdukcie kostimulačného signálu molekulami a vzťahu medzi novou transdukciou signálu a chorobami.

Podstata vynálezu

Konkrétne je cieľom vynálezu nájsť postupy a farmaceutické prostriedky, ktoré tlmia, liečia alebo preventívne ovplyvňujú imunologickú rejekciu (odvrhnutie štepu), sprevádzajúcu transplantáciu tkaniva alebo orgánu (alotransplantáciu alebo xenotransplantáciu) použitím liečebných a farmaceutických metód (napríklad farmaceutickými prostriedkami, ako sú nízkomolekulové zlúčeniny a protilátky) na moduláciu biologickej funkcie novej molekuly, AILIM, o ktorej sa uvažuje, že prenáša druhý signál (kostimulačný signál) nutný na aktiváciu lymfocytov, ako sú T bunky, a v spojení s týmto signálom moduluje fúnkciu aktivovaných lymfocytov, ako sú aktivované T bunky.

Ďalším cieľom je nájsť spôsoby zvýšenia supresívneho účinku existujúcich imunosupresív (cyklosporínu,

SK 288048 Β6 azatioprínu, adrenokortikosteroidov, FK-506 atď.) na odvrhnutie štepu s použitím farmaceutických prostriedkov, ktoré modulujú biologickú funkciu AILIM (napríklad farmaceutických prostriedkov, ako sú nízkomolekulové zlúčeniny a protilátky).

Ako výsledok rozsiahleho výskumu týkajúceho sa biologickej funkcie cicavčej AILIM a spôsobu potlačovania imunologickej rejekcie (odvrhnutie štepu), ktorá je vážnym problémom sprevádzajúcim transplantácie (alotransplantácie alebo xenotransplantácie) štepov (buniek, tkaniva alebo orgánu), pôvodcovia tohto vynálezu zistili, že (1) farmaceutické prostriedky, ktoré modulujú funkciu AILIM, významne tlmia imunologickú rejekciu (odvrhnutie štepu) sprevádzajúcu transplantáciu tkaniva (tkanív) alebo orgánu (orgánov) a že (2) supresívny účinok doterajších imunosupresív na odvrhnutie štepu sa zvýši použitím farmaceutických prostriedkov, ktoré modulujú funkciu AILIM, a tak vytvorili tento vynález.

Farmaceutická kompozícia podľa vynálezu je použiteľná ako liečivo na in vivo moduláciu rôznych reakcií, ktorých sa zúčastní transdukcia kostimulačného signálu do buniek exprimujúcich AILIM, sprostredkovaná AILIM (napríklad proliferácia buniek exprimujúcich AILIM, produkcia cytokínu(ov) bunkami exprimujúcimi AILIM, imunitná cytolýza alebo apoptóza buniek exprimujúcich AILIM a aktivita pri indukcii protilátkovej závislej bunkovej cytotoxicity proti bunkám exprimujúcim AILIM) a/alebo ako liečivo na prevenciu nástupu a/alebo postupu rôznych ochorení, ktorých sa zúčastňuje transdukcia signálu sprostredkovaná AILIM, a na liečbu a profylaxiu týchto ochorení.

Konkrétne môže farmaceutická kompozícia podľa vynálezu modulovať (potlačovať alebo podporovať) proliferáciu buniek exprimujúcich AILIM alebo modulovať (inhibovať alebo podporovať produkciu cytokínov (napríklad interferónu γ alebo interleukínu 4) bunkami exprimujúcimi AILIM, a môže predchádzať rôznym chorobným stavom spúšťaným rôznymi fyziologickými javmi, ktorých sa zúčastňuje transdukcia signálu sprostredkovaná AILIM, a umožňuje tak liečbu a prevenciu rôznych ochorení.

Použitie farmaceutickej kompozície podľa vynálezu umožňuje supresiu, prevenciu a/alebo liečbu imunologickej rejekcie (odvrhnutie štepu), ktorá je vážnym problémom v terapii, pri ktorej sa orgán (pečeň, srdce, pľúca, oblička, pankreas atď.), jeho časť alebo tkanivo (ako je koža, rohovka a kosť) od darcu transplantuje (alotransplantuje alebo xenotransplantuje) príjemcovi, postihnutému vážnym kardiovaskulárnym ochorením.

Použitie farmaceutickej kompozície podľa vynálezu ďalej umožňuje zvýšenie supresívneho účinku na odvrhnutie štepu pri doterajších imunosupresívach, podávaných na potlačenie imunologickej rejekcie pri takýchto transplantačných terapiách.

Konkrétne je predmetom vynálezu:

(1) Použitie látky, ktorá je účinná pri modulácii transdukcie signálu sprostredkovanej molekulou AILIM, na prípravu liečiva na potláčanie, liečbu alebo prevenciu odvrhnutia štepu, sprevádzajúceho transplantáciu pečene, srdca alebo ich časti, pričom táto látka je vybraná z ktorejkoľvek látky (a) až (e) uvedenej neskôr;

(a) protilátka, ktorá sa viaže na AILIM alebo časť tejto protilátky;

(b) polypeptid obsahujúci celú extracelulámu oblasť AILIM alebo jej časť;

(c) fúzny polypeptid obsahujúci celú extracelulámu oblasť AILIM alebo jej časť a celú konštantnú oblasť ťažkého reťazca imunoglobulínu alebo jej časť;

(d) polypeptid, ktorý sa viaže na AILIM; a (e) antisense DNA alebo antisense RNA proti AILIM.

(2) Použitie látky, ktorá je účinná pri modulácii transdukcie signálu sprostredkovanej molekulou AILIM, na prípravu liečiva na zvýšenie účinku jedného alebo viacerých imunosupresív na potláčanie, liečbu alebo prevenciu odvrhnutia štepu, sprevádzajúceho transplantáciu pečene, srdca alebo ich časti, pričom látka je vybraná z ktorejkoľvek látky (a) až (e) uvedenej neskôr;

(a) protilátka, ktorá sa viaže na AILIM alebo časť tejto protilátky;

(b) polypeptid obsahujúci celú extracelulámu oblasť AILIM alebo jej časť;

(3) Použitie uvedené v odseku 2, kde imunosupresívom je jeden alebo viac terapeutických prostriedkov vybraných zo skupiny pozostávajúcej z liečiv azatioprín, adrenokortikálny steroid, cyklosporín, mizoribín a takrolimus (FK-506), mykofenolát mofetil, leflunomid, sirolimus, deoxyspergualín, FTY720 a CTLA4.

(4) Použitie uvedené v odsekoch 1 až 3, na použitie v kombinácii s takrolimom (FK-506) a/alebo liečivom CTLA4.

(5) Použitie uvedené v odsekoch 1 až 4, kde transplantáciou je alotransplantácia.

(6) Použitie uvedené v odsekoch 1 až 4, kde transplantáciou je xenotransplantácia.

(7) Použitie uvedené v odsekoch 1 až 6, kde uvedenou látkou je protilátka, ktorá sa viaže na AILIM alebo časť tejto protilátky.

(8) Farmaceutická kompozícia na použitie na potláčanie, liečbu alebo prevenciu odvrhnutia štepu, sprevádzajúceho transplantáciu pečene, srdca alebo ich časti, ktorá obsahuje látku účinnú pri modulácii transdukcie

SK 288048 Β6 signálu, sprostredkovanej molekulou AILIM vybranú z ktorejkoľvek látky (a) až (e) uvedenej neskôr a farmaceutický prijateľný nosič;

a) protilátka, ktorá sa viaže na AILIM alebo časť tejto protilátky;

b) polypeptid obsahujúci celú extracelulámu oblasť AILIM alebo jej časť;

c) fuzny polypeptid obsahujúci celú extracelulámu oblasť AILIM alebo jej časť a celú konštantnú oblasť ťažkého reťazca imunoglobulínu alebo jej časť;

d) polypeptid, ktorý sa viaže na AILIM; a

e) antisense DNA alebo antisense RNA proti AILIM.

(9) Farmaceutická kompozícia na použitie na zvýšenie účinku jedného alebo viacerých imunosupresív na potláčanie, liečbu alebo prevenciu odvrhnutia štepu, sprevádzajúceho transplantáciu pečene, srdca alebo ich časti, ktorá obsahuje látku účinnú pri modulácii transdukcie signálu, sprostredkovanej molekulou AILIM vybranú z ktorejkoľvek látky (a) až (e) uvedenej neskôr a farmaceutický prijateľný nosič;

a) protilátka, ktorá sa viaže na AILIM alebo časť tejto protilátky;

b) polypeptid obsahujúci celú extracelulámu oblasť AILIM alebo jej časť;

d) polypeptid, ktorý sa viaže na AILIM; a

e) antisense DNA alebo antisense RNA proti AILIM.

(10) Farmaceutická kompozícia uvedená v odseku 9, kde imunosupresívom je jeden alebo viac terapeutických prostriedkov vybraných zo skupiny pozostávajúcej z liečiv azatioprín, adrenokortikálny steroid, cyklosporín, mizoribín a takrolimus (FK.-506), mykofenolát mofetil, leflunomid, sirolimus, deoxyspergualín, FTY720 a CTLA4.

(11) Farmaceutická uvedená v odsekoch 8 alebo 9, kde imunosupresívom je jeden alebo viac terapeutických prostriedkov vybraných zo skupiny pozostávajúcej z liečiv takrolimus (FK-506) a CTLA4.

(12) Farmaceutická kompozícia uvedená v odsekoch 8 až 11, kde transplantáciou je alotransplantácia.

(13) Farmaceutická kompozícia uvedená v odsekoch 8 až 11, kde transplantáciou je xenotransplantácia.

(14) Farmaceutická kompozícia uvedená v odsekoch 8 až 13, kde uvedenou látkou je protilátka, ktorá sa viaže na AILIM, alebo časť tejto protilátky.

Vynález je ďalej podrobnejšie opísaný pomocou definícií termínov a metód na výrobu látok používaných podľa vynálezu.

Termín „cicavec“ znamená človeka, kravu, kozu, králika, myš, krysu, škrečka a morča, výhodne človeka, kravu, krysu, myš alebo škrečka a zvlášť výhodne človeka.

„AILIM“ je podľa vynálezu skratka pre aktivačnú indukovateľnú lymfocytovú imunomodulačnú molekulu (activation inducible lymphocyte immunomodulatory molecule) a označuje molekulu na povrchu bunky cicavca, ktorá má štruktúru a funkciu opísanú v predchádzajúcich správach (J. Immunol., 166 (1), str. 1, 2001; J. Immunol., 165 (9), str. 5035, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun., 276 (1), str. 335, 2000; Immunity, 13(1), str. 95, 2000; J. Exp. Med., 192 (1), str. 53, 2000; Eur. J. Immunol., 30 (4), str. 040, 2000; Int. Immunol., 12 (1), str. 51, 2000; Náture, 397 (6716), str. 263, 1999; prístupové číslo GenBank: BAA82129 (ľudská); BAA82128 (krysia); BAA82127 (krysí variant); BAA82126 (myšia)).

Obzvlášť výhodne tento termín označuje AILIM odvodenú od človeka (napríklad International Immunology, zv. 12, č. 1, str. 51 -55,2000).

Táto AILIM sa označuje taktiež ako ICOS (Náture, zv. 397, č. 6716, str. 263 - 266, 1999) alebo JTT-1 antigén/JTT-2 antigén (zverejnená japonská patentová prihláška pred prieskumom č. (JP-A) Hei 11-29599, medzinárodná patentová prihláška č. WO 98/38216) a tieto označenia sa vzájomne vzťahujú na tú istú molekulu.

Okrem toho „AILIM“, ako sa na ňu odkazuje v tomto vynáleze, zahŕňa polypeptid, ktorý má aminokyselinové sekvencie AILIM z každého cicavca opísané v už uvedenej literatúre, a zvlášť výhodne taktiež polypeptid, ktorý má v podstate tú istú aminokyselinovú sekvenciu ako ľudská AILIM. V „AILIM podľa tohto vynálezu sú ďalej zahrnuté taktiež varianty ľudskej AILIM, podobné skôr identifikovanému variantu AILIM odvodenej od krysy (prístupové číslo GenBank: BAA82127).

Výraz „ktorá má v podstate tú istú aminokyselinovú sekvenciu“ tu znamená, že „AILIM“ podľa vynálezu zahŕňa polypeptid, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu, v ktorej niekoľko aminokyselín, výhodne 1 až 10 aminokyselín, zvlášť výhodne 1 až 5 aminokyselín, je nahradených, vypustených a/alebo modifikovaných, a polypeptidy, ktoré majú aminokyselinové sekvencie, v ktorých je niekoľko aminokyselín, výhodne 1 až 10 aminokyselín, zvlášť výhodne 1 až 5 aminokyselín, pridaných, pokiaľ tieto polypeptidy majú v podstate tie isté biologické vlastnosti ako polypeptid zahŕňajúci aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v predchádzajúcich správach.

Takéto substitúcie, delécie alebo inzercie aminokyselín, je možné uskutočniť obvyklými metódami (Experimental Medicíne: SUPPLEMENT, “Handbook of Genetic Engineering” (1992), atď.).

Príkladmi sú miestne riadená mutagenéza syntetického oligonukleotidu (metóda gapped duplex), bodová mutagenéza, ktorou sa náhodne zavádza bodová mutagenéza pôsobením nitritov alebo sulfitov, metóda, kto5 rou sa pripravuje delečný mutant s enzýmom Bal31 atd’., kazetová mutagenéza, metóda skenovania linkerov, metóda chybne párovaných primérov, metóda syntézy segmentov DNA atď.

Miestne riadená mutagenéza syntetického oligonukieotidu (metóda gapped duplex) môže byť uskutočnená napríklad nasledovne: Oblasť, ktorú si želáme mutagenizovať, sa klonuje do fágového vektora M13, ktorý má mutáciu typu amber za vzniku j ednovláknovej fágovej DNA. Potom, ako sa RF I DNA vektora M13 bez mutácie typu amber linearizuje pôsobením reštrikčného enzýmu, zmieša sa táto DNA s uvedenou jednovláknovou fágovou DNA, denaturuje a spojí za vzniku DNA „gapped duplex“. Syntetický oligonukleotid, do ktorého sa mutácie zavedú, sa hybridizuje s gapped duplex DNA a pripraví sa kruhová dvojvláknová DNA reakciou s DNA polymerázou a DNA ligázou.

Touto DNA sa transfektujú bunky E. coli mutS, deficitné na opravnú aktivitu chybného párovania. Vypestovanými fágami sa infikujú bunky E. coli bez supresorovej aktivity a vyhľadávajú sa len fágy, ktoré nemajú žiadne mutácie typu amber.

Metóda, ktorou sa zavádza bodová mutácia pomocou nitritu, využíva napríklad ďalej uvedený princíp. Ak sa pôsobí na DNA nitritom, nukleotidy sa deaminujú, pričom sa adenín mení na hypoxantín, cytozín na uracil a guanín na xantín. Pokiaľ sa deaminovaná DNA zavedie do buniek, „A : T“ sa nahradí s G : C a „G : C“ sa nahradí s „A : T“, pretože hypoxantín, uracil a xantín sa pri replikách DNA bázové párujú s cytozínom, resp. adenínom a. tymínom, v tomto poradí. Teraz dochádza k hybridizácii fragmentov j ednovlákno vej DNA ošetrenej nitritom s „gapped duplex DNA“ a potom sa mutantné kmene oddelia manipuláciou rovnakým spôsobom ako pri miestne riadenej mutagenéze syntetického oligonukieotidu (metóda gapped duplex).

Termín „cytokín“, napríklad v „produkcii cytokínu bunkami exprimujúcimi AILIM“ podľa vynálezu znamená ľubovoľný cytokín produkovaný bunkami exprimujúcimi AILIM (najmä T bunkami).

Príkladmi T buniek sú T bunky typu Thl a Th2 a cytokín podľa vynálezu konkrétne znamená cytokín produkovaný T bunkami typu Thl a/alebo ľubovoľný cytokín produkovaný bunkami typu Th2.

Cytokíny produkované T bunkami typu Thl zahŕňajú IFN-γ, IL-2, TNF, IL-3 a cytokíny produkované T bunkami typu Th2 zahŕňajú IL-3, IL-4, IL-5, IL-10 a TNF (Celí, zv. 30, č. 9, str. 343 - 346, 1998).

Termín „látka“, používaný podľa vynálezu, konkrétne „látka účinná pri modulácii transdukcie signálu, sprostredkovanej molekulou AILIM“ a obzvlášť „látka účinná pri inhibícii proliferácie buniek exprimujúcich AILIM alebo inhibícii produkcie cytokínu bunkami exprimujúcimi AILIM“ znamená prirodzene sa vyskytujúcu látku alebo ľubovoľnú umelo pripravenú látku.

Výraz „transdukcia signálu sprostredkovaná molekulou AILIM“, znamená transdukciu signálu prostredníctvom AILIM, vedúcu k zmene akéhokoľvek fenotypu vo vyššie uvedených bunkách exprimujúcich AILIM alebo v ďalej uvedených príkladoch (zmena proliferácie buniek, aktivácie buniek, inaktivácie buniek, apoptóza a/alebo schopnosť produkovať ľubovoľný cytokín z buniek exprimujúcich AILIM).

„Látku“ možno v zásade klasifikovať ako „bielkovinovú látku“ a „nebielkovinovú látku“.

Príkladmi „bielkovinových látok“ sú ďalej uvedené polypeptidy, protilátky (polyklonové protilátky, monoklonové protilátky alebo časti monoklonových protilátok.

Pokiaľ je látkou protilátka, ide výhodne o monoklonovú protilátku. Pokiaľ je látkou monoklonová protilátka, zahŕňa nielen iné než ľudské monoklonové protilátky cicavčieho pôvodu, ale i ďalej uvedené rekombinantné chimérové monoklonové protilátky, rekombinantné humanizovaná monoklonové protilátky a ľudské monoklonové protilátky.

Pokiaľ je látkou polypeptid, zahŕňa ďalej uvedené polypeptidy, polypeptidické (oligopeptidické) fragmenty, fúzne polypeptidy a chemicky modifikované polypeptidy. Príkladmi oligopeptidov sú peptidy s 5 až 30 aminokyselinami, výhodne 5 až 20 aminokyselinami. Chemická modifikácia sa môže uskutočniť v závislosti od rôzneho cieľa, napríklad na zvýšenie polčasu rozpadu v krvi v prípade podávania in vivo, alebo na zvýšenie tolerancie proti degradácii, alebo zvýšenie absorpcie v zažívacom trakte pri perorálnom podávaní.

Príkladmi polypeptidov sú:

(1) Polypeptid zahŕňajúci celú extracelulámu oblasť AILIM alebo jej časť;

(2) Fúzny polypeptid zahŕňajúci celú extracelulámu oblasť AILIM alebo jej časť a celú konštantnú oblasť ťažkého reťazca imunoglobulínu alebo jej časť; alebo (3) Polypeptid, ktorý sa viaže na AILIM.

Príkladmi „nebielkovinových látok“ sú DNA, RNA a chemicky syntetizované zlúčeniny.

„DNA“ tu znamená „DNA použiteľnú ako protismemé („antisense“) DNA liečivo zahŕňajúce čiastočnú nukleotidovú sekvenciu DNA kódujúcu uvedenú AILIM (výhodne ľudskú AILIM) alebo jej chemicky modifikovanú DNA, ktorá môže byť vytvorená na základe DNA (cDNA alebo genómovej DNA) kódujúcej AILIM“. Konkrétne môže protismemá DNA inhibovať transkripciu DNA kódujúcej AILIM do mRNA alebo transláciu mRNA do proteínu hybridizáciou s DNA alebo s RNA kódujúcou AILIM.

Výraz „čiastočná nukleotidová sekvencia“ sa tu vzťahuje na čiastočnú nukleotidovú sekvenciu zahrnujúcu ľubovoľný počet nukleotidov v ľubovoľnej oblasti. Čiastočná nukleotidová sekvencia zahŕňa 5 až 100 po sebe idúcich nukleotidov, výhodne 5 až 70 po sebe idúcich nukleotidov, výhodne 5 až 50 po sebe idúcich nukleotidov a najmä 5 až 30 po sebe idúcich nukleotidov.

SK 288048 Β6

Pokiaľ sa ako protismemé DNA liečivo používa DNA, môže byť sekvencia DNA čiastočne chemicky modifikovaná, aby sa predĺžila životnosť (stabilita) v krvi pri podávaní pacientom, zvýšila intracytoplazmatická membránová permeabilita DNA alebo zvýšila odolnosť proti degradácii alebo absorpcia perorálne podávanej DNA v zažívacích orgánoch. Chemické modifikácie zahŕňajú napríklad modifikáciu fosfátovej väzby, ribózy, nukleotidu, cukomej jednotky a 3‘ konca a/alebo 5‘ konca v štruktúre oligonukleotidovej DNA.

Modifikácie fosfátovej väzby zahŕňajú napríklad premenu jednej alebo viacerých väzieb na fosfodiesterové väzby, fosforotioátové väzby, fosforoditioátové väzby (S-oligo), metylfosfonátové (MP-oligo) väzby, fosforoamidátové väzby, nefosfátové väzby alebo metylfosfónotioátové väzby alebo ich kombinácie. Modifikácia ribózy zahŕňa napríklad premenu na 2‘-fluórribózu alebo 2‘-O-metylribózu. Modifikácia nukleotidu zahŕňa napríklad premenu na 5-propinyluracil alebo 2-aminoadenín.

„RNA“ tu znamená „RNA použiteľnú ako protismerné RNA liečivo zahŕňajúce čiastočnú nukleotidovú sekvenciu RNA kódujúcu uvedenú AILIM (výhodne ľudskú AILIM) alebo jej chemicky modifikovanú RNA, ktorá môže byť vytvorená na základe RNA kódujúcej AILIM“. Protismerná RNA môže inhibovať transkripciu DNA kódujúcej AILIM do mRNA alebo transláciu mRNA do proteínu hybridizáciou s DNA alebo RNA kódujúcou AILIM.

Výraz „čiastočná nukleotidová sekvencia“ sa tu vzťahuje na čiastočnú nukleotidovú sekvenciu zahrnujúcu ľubovoľný počet nukleotidov v ľubovoľnej oblasti. Čiastočná nukleotidová sekvencia zahŕňa 5 až 100 po sebe idúcich nukleotidov, výhodne 5 až 70 po sebe idúcich nukleotidov, výhodnejšie 5 až 50 po sebe idúcich nukleotidov a ešte výhodnejšie 5 až 30 po sebe idúcich nukleotidov.

Sekvencia protismernej RNA môže byť čiastočne chemicky modifikovaná, aby sa predĺžila životnosť (stabilita) v krvi pri podávaní RNA pacientom, zvýšila intracytoplazmatická membránová permeabilita RNA alebo zvýšila odolnosť proti degradácii alebo absorpcia perorálne podávanej RNA v zažívacích orgánoch. Chemické modifikácie zahŕňajú také modifikácie, aké sa používajú pre uvedenú protismemú DNA.

Príkladom „chemicky syntetizovanej zlúčeniny“ je ľubovoľná zlúčenina okrem uvedenej DNA, RNA a bielkovinových látok, ktorá má molekulovú hmotnosť asi 100 až asi 1000 alebo menej, výhodne zlúčenina, ktorá má molekulovú hmotnosť asi 100 až asi 800 a výhodnejšie zlúčenina, ktorá má molekulovú hmotnosť asi 100 až asi 600.

Výraz „polypeptid“, zahrnutý v definícii uvedenej „látky“ znamená časť (fragment) polypeptidického reťazca tvoriaceho AILIM (výhodne ľudskú AILIM), výhodne celú extracelulámu oblasť polypeptidu tvoriaceho AILIM alebo jej časť (na N-konci a/alebo C-konci oblasti sa môže prípadne pridať 1 až 5 aminokyselín).

AILIM podľa tohto vynálezu je transmembránová molekula, penetrujuca cez bunkovú membránu, zahŕňajúca 1 alebo 2 polypeptidicke reťazce.

Výraz „transmembránový proteín“ tu znamená proteín, ktorý je napojený na bunkovú membránu prostredníctvom hydrofóbnej peptidovej oblasti, ktorá jedenkrát alebo niekoľkokrát preniká lipidovou dvojvrstvou membrány, a ktorého štruktúra je ako celok tvorená tromi hlavnými oblasťami, tzn. extracelulámou oblasťou, transmembránovou oblasťou a cytoplazmatickou oblasťou, ako je pozorované na mnohých receptoroch alebo molekulách na povrchu buniek. Takýto transmembránový proteín tvorí každý receptor alebo molekula na povrchu bunky ako monomér, alebo ako homodimér, heterodimér alebo oligomér spojený s jedným alebo niekoľkými reťazcami, ktoré majú rovnaké alebo rozdielne aminokyselinové sekvencie.

„Extraceluláma oblasť“ tu znamená celok alebo časť čiastočnej štruktúry (čiastočnej oblasti) celej štruktúry uvedeného transmembránového proteínu, kde čiastočná štruktúra existuje vnútri membrány. Inými slovami, znamená celok alebo časť oblasti transmembránového proteínu okrem oblasti zabudovanej do membrány (transmembránovej oblasti) a oblasti existujúcej v cytoplazme za transmembránovou oblasťou (cytoplazmatickej oblasti).

„Fúzny polypeptid“, zahrnutý vo uvedenej „bielkovinovej látke“ znamená fúzny polypeptid zahŕňajúci celok alebo časť extracelulámej oblasti polypeptidu tvoriaceho AILIM (výhodne ľudskú AILIM) a „celok alebo časť konštantnej oblasti ťažkého reťazca imunoglobulínu (Ig, výhodne ľudského Igj“. Výhodne je fuznym polypeptidom fúzny polypeptid, ktorá má extracelulámu oblasť AILIM a časť konštantnej oblasti ťažkého reťazca ľudského IgG, a zvlášť výhodne fúzny polypeptid extracelulámej oblasti AILIM a oblasti (Fc) ťažkého reťazca ľudského IgG, zahŕňajúcej pántovú oblasť, doménu C_H2 a doménu C_H3. Ako Ig sa dáva prednosť IgGl a ako AILIM je výhodná ľudská, myšia alebo krysia AILIM (najmä ľudská).

Výraz „celok alebo časť konštantnej oblasti ťažkého reťazca imunoglobulínu (Ig)“ tu znamená konštantnú oblasť alebo Fc oblasť ťažkého reťazca imunoglobulínu ľudského pôvodu (H reťazca) alebo jej časť. Imunoglobulínom môže byť ktorýkoľvek imunoglobulín patriaci do akejkoľvek skupiny a akejkoľvek podtriedy. Konkrétne imunoglobulín zahŕňa IgG (IgGl, IgG2, lgG3 a IgG4), IgM, IgA (IgAl a IgA2), IgD a IgE. Výhodne je imunoglobulínom IgG (IgGl, IgG2, IgG3 alebo lgG4) alebo IgM. Príkladmi zvlášť výhodných imunoglobulínov podľa vynálezu sú imunoglobulíny patriace medzi IgG (IgGl, IgG2, IgG3 alebo IgG4) ľudského pôvodu.

Imunoglobulín má štruktúrnu jednotku tvaru Y, v ktorej sú štyri reťazce tvorené dvoma homológnymi

SK 288048 Β6 ľahkými reťazcami (reťazcami L) a dvoma homológnymi ťažkými reťazcami (reťazcami H) spojenými disulfidickými väzbami (väzbami S-S). Ľahký reťazec je tvorený variabilnou oblasťou (V_L) ľahkého reťazca a konštantnou oblasťou (C_L) ľahkého reťazca. Ťažký reťazec je tvorený variabilnou oblasťou (V_H) ťažkého reťazca a konštantnou oblasťou (C_H) ťažkého reťazca.

Konštantná oblasť ťažkého reťazca je tvorená niekoľkými doménami, ktoré majú aminokyselinové sekvencie jedinečné pre každú triedu (IgG, IgM, IgA, IgD a IgE) a každú podtriedu (IgGl, IgG2, IgG3 a IgG4, IgAl a IgA2).

Ťažký reťazec imunoglobulínov IgG (IgGl, IgG2, IgG3 a IgG4) je tvorený V_H, doménou C_H1, pántovou oblasťou, doménou C_H2 a doménou C_H3 v tomto poradí od N-konca.

Podobne ťažký reťazec IgGl je tvorený V_H, doménou CyJ, pántovou oblasťou, doménou Cyi2 a doménou Cyi3 v tomto poradí od N-konca. Ťažký reťazec IgG2 je tvorený V_H, doménou Cy₂l, pántovou oblasťou, doménou Cy₂2 a doménou Cy₂3 v tomto poradí od N-konca. Ťažký reťazec IgG3 je tvorený V_H, doménou Cy₃l, pántovou oblasťou, doménou Cy₃2 a doménou Cy₃3 v tomto poradí od N-konca. Ťažký reťazec IgG4 je tvorený V_H, doménou Cy₄l, pántovou oblasťou, doménou Cy₄2 a doménou Cy₄3 v tomto poradí od N-konca.

Ťažký reťazec IgA je tvorený V_H, doménou Cal, pántovou oblasťou, doménou Ca2 a doménou Ca3 v tomto poradí od N-konca.

Podobne ťažký reťazec IgAl je tvorený V_H, doménou Ca,l, pántovou oblasťou, doménou Cai2 a doménou C<Xi3 v tomto poradí od N-konca. Ťažký reťazec IgA2 je tvorený V_H, doménou Ca₂l, pántovou oblasťou, doménou Ca₂2 a doménou Ca₂3 v tomto poradí od N-konca.

Ťažký reťazec IgD je tvorený V_H, doménou CS1, pántovou oblasťou, doménou Có2 a doménou Có3 v tomto poradí od N-konca.

Ťažký reťazec IgM je tvorený V_H, doménou Cgl, doménou Cp2, doménou Cp3 a doménou Cg4 v tomto poradí od N-konca a nemá pántovú oblasť, ktorá sa vyskytuje u IgG, IgA a IgD.

Ťažký reťazec IgE je tvorený V_H, doménou Cel, doménou Ce2, doménou Ce3 a doménou Ce4 v tomto poradí od N-konca a nemá pántovú oblasť, ktorá sa vyskytuje u IgG, IgA a IgD.

Pokiaľ sa napríklad na IgG pôsobí papaínom, dôjde k štiepeniu na mierne N-koncovej strane za disulfídickými väzbami existujúcimi v pántovej oblasti, kde disulfidické väzby spájajú oba ťažké reťazce, za vzniku dvoch homológnych Fab, v ktorých je fragment ťažkého reťazca, tvorený V_H a C_H1, spojený disuifidickou väzbou s jedným ľahkým reťazcom, a jedného Fc, v ktorom sú dva homológne fragmenty ťažkého reťazca, tvorené pántovou oblasťou, doménou Ch2 a doménou C_H3, spojené disulfidickými väzbami (pozri „Immunology Illustrated“, pôv. 1. vyd., Nankodo, str. 65 - 75 (1992), a „Focus of Newest Medical Science ,Recognition Mechanism of Immune System“'¹, Nankodo, str. 4-7 (1991), a pod.).

Uvedená „časť konštantnej oblasti ťažkého reťazca imunoglobulínu“ teda znamená časť konštantnej oblasti ťažkého reťazca imunoglobulínu, ktorá má uvedenú štruktúrnu charakteristiku, a výhodne ide o konštantnú oblasť bez oblasti C1 alebo oblasť Fc. Príkladom je konkrétne oblasť tvorená vždy pántovou oblasťou, doménou C2 a doménou C3 z IgG, IgA alebo IgD, alebo oblasť tvorená vždy doménou C2, doménou C3 a doménou C4 z IgM alebo IgE. Zvlášť výhodným príkladom je oblasť Fc z IgGl ľudského pôvodu.

Uvedený lúzny polypeptid má výhodu v tom, že sa extrémne ľahko čistí pomocou afinitnej stĺpcovej chromatografie s využitím vlastnosti proteínu A, ktorý sa špecificky viaže na fragment imunoglobulínu, pretože fuzny polypeptid podľa vynálezu má časť konštantnej oblasti (napríklad Fc) imunoglobulínu, ako je uvedený IgG, ako fúzneho partnera. Okrem toho, pretože sú k dispozícii rôzne protilátky proti Fc rôznych imunoglobulínov, možno s protilátkami proti Fc ľahko uskutočňovať imunotest na fúzne polypeptidy. „Polypeptid, ktorý sa viaže na AILIM“ je zahrnutý v „polypeptide, ktorý patrí do definície uvedenej látky“.

Konkrétnym príkladom „polypeptidu, ktorý sa viaže na AILIM“, je celok alebo časť polypeptidu zahŕňajúceho známu molekulu nazývanú B7h, B7RP-1, GL50 alebo LICOS, čo je ligand, ktorý interaguje s AILIM (Náture, zv. 402, č. 6763, str. 527 - 832, 1999, Náture Medicíne, zv. 5, č. 12, str. 1365 - 1369, 1999, J. Immunology, zv. 164, str. 1653 - 1657, 2000, Curr. Biol., zv. 10, č. 6, str. 333 - 336, 2000).

Polypeptidom je výhodne polypeptid zahŕňajúci celok alebo časť extracelulámej oblasti uvedených ligandov (B7h, B7RP-1, GL50, LICOS) alebo fúzny polypeptid zahŕňajúci tento polypeptid a celok alebo časť konštantnej oblasti ťažkého reťazca imunoglobulínu (výhodne ľudského imunoglobulínu). Výrazy „extraceluláma oblasť“ a „konštantná oblasť ťažkého reťazca imunoglobulínu“ tu majú rovnaký význam, aký je uvedený skôr.

Uvedené polypeptidy, časti polypeptidov (fragmenty) a fúzne polypeptidy môžu byť získavané nielen ďalej uvedenou technológiou rekombinácie DNA, ale taktiež metódou známou v odbore ako metóda chemickej syntézy alebo metóda kultivácie buniek, alebo modifikáciou týchto metód.

„Protilátka“ podľa vynálezu môže byť polyklonová protilátka (antisérum) alebo definovaná monoklonová protilátka proti cicavčej AILIM (zvlášť výhodne ľudské AILIM) a výhodne monoklonová protilátka.

Konkrétne je protilátkou protilátka, ktorá má schopnosť inhibovať proliferáciu buniek exprimujúcich AILIM väzbou na AILIM, alebo inhibovať produkciu interferónu-γ alebo interleukínu-4 bunkami exprimujúcimi AILIM väzbou na AILIM.

SK 288048 Β6

Protilátky podľa vynálezu môžu byť prírodné protilátky, získané imunizáciou cicavcov, ako sú myši, krysy, škrečky, morčatá a králiky, antigénom, ako sú bunky (prirodzené bunky, bunkové línie, nádorové bunky a pod.), exprimujúce AILIM podľa vynálezu, transformanty pripravené s použitím technológie rekombinantnej DNA tak, aby hyperexprimovali AILIM na svojom povrchu, polypeptidy tvoriace AILIM alebo uvedené fúzne polypeptidy zahŕňajúce polypeptid AILIM alebo extracelulámu oblasť AILIM. Protilátky podľa vynálezu zahŕňajú taktiež chimérové protilátky a humanizovane protilátky (CDR-očkované protilátky), ktoré môžu byť získané rekombinantnou technológiou DNA, a ľudské protilátky, ktoré môžu byť získané s použitím transgénových zvierat produkujúcich ľudské protilátky.

Monoklonové protilátky zahŕňajú protilátky obsahujúce akýkoľvek izotyp IgG, IgM, IgA alebo IgE. Výhodné je IgG alebo IgM.

Polyklonová protilátka (antisérum) alebo monoklonová protilátka môže byť získaná známymi postupmi. Cicavec, výhodne myš, krysa, škrečok, morča, králik, mačka, pes, prasa, koza, kôň alebo krava, sa imunizuje, napríklad uvedeným antigénom s Freundovým adjuvans, ak je to nutné.

Polyklonová protilátka môže byť získaná zo séra získaného z takto imunizovaného zvieraťa. Monoklonové protilátky sa potom získavajú takto: Pripravia sa hybridómy z buniek takto imunizovaného zvieraťa, produkujúcich protilátku, a myelómových buniek, ktoré nie sú schopné produkovať autoprotilátky. Hybridómy sa klonujú a uskutočňuje sa skríning na klony produkujúce monoklonové protilátky vykazujúce špecifickú afinitu k antigénu použitému na imunizáciu.

Konkrétne je možné monoklonovú protilátku pripraviť takto: Uskutoční sa imunizácia jednorazovým alebo niekoľkonásobným vstreknutím alebo implantáciou uvedeného antigénu ako imunogénu, v prípade potreby s Freundovým adjuvans, subkutánne, intramuskuláme, intravenózne, do tlapky, alebo intraperitoneálne do cicavca iného než človeka, konkrétne myši, krysy alebo škrečka (vrátane transgénových zvierat vytvorených tak, aby produkovali protilátky pochádzajúce z iného zvieraťa, napríklad ďalej uvedené transgénové myši, produkujúce ľudské protilátky). Imunizácie sa obvykle uskutočňujú jeden až štyrikrát každých 1 až 14 dní po prvej imunizácii. Bunky produkujúce protilátky sa získavajú z takto imunizovaného cicavca asi 1 až 5 dní po poslednej imunizácii. Frekvencia a interval imunizácii môžu byť príslušne upravené napríklad v závislosti od vlastností použitého imunogénu.

Hybridómy, ktoré vylučujú monoklonovú protilátku, môžu byť pripravené metódou Kôhlera a Milsteina (Náture, zv. 256, str. 495 - 497 (1975)) alebo jej modifikáciou. Hybridómy sa tak pripravia fúzovaním buniek produkujúcich protilátky, obsiahnutých v slezine, lymfatických uzlinách, kostnej dreni alebo mandliach, získaných od cicavca iného než človeka, imunizovaného uvedeným spôsobom, výhodne v slezine, s myelómami bez schopnosti produkovať autoprotilátky, ktoré pochádzajú výhodne od cicavca, ako je myš, krysa, morča, králik alebo človek, výhodne myš, krysa alebo človek.

Ako myelómy na fúziu buniek môžu byť použité napríklad myelómy P3/X63-AG8.653 (653), P3/NSI/1Ag4-1 (NS-1), P3/X63-Ag8.Ul (P3U1), SP2/0-Agl4 (Sp2/0, Sp2), PA1, F0, NSO alebo BW5147 myšacieho pôvodu, myelómy 210RCY3-Ag.2.3. pochádzajúce z krýs alebo myelómy U-266AR1, GM1500-6TG-A1-2, UC729-6, CEM-AGR, D1R11 alebo CEM-T15 ľudského pôvodu.

Hybridómy produkujúce monoklonové protilátky môžu byť podrobené skríningu kultiváciou hybridómov, napríklad na mikrotitračných platniach, a meraním reaktivity supematantu kultúr v jamkách, v ktorých sa pozoruje rast hybridómov, na imunogén použitému na uvedenú imunizáciu, napríklad pomocou enzýmovej imunoanalýzy, ako je RIA a ELISA.

Monoklonové protilátky sa môžu získať z hybridómov kultiváciou hybridómov in vitro alebo in vivo, napríklad v ascitickej tekutine myši, krysy, morčaťa, škrečka alebo králika, výhodne myši alebo krysy, výhodnejšie myši, a izolovaním protilátok zo vzniknutého supematantu kultúry alebo z ascitickej tekutiny cicavca.

Kultivácia hybridómov in vitro sa môže uskutočniť v závislosti napríklad od charakteru kultivovaných buniek, predmetu Štúdie a rôznych podmienok kultivačnej metódy, s použitím známych živných médií alebo akéhokoľvek živného média odvodeného od známych bazálnych médií na rast, udržiavanie a uchovávanie hybridómov na produkciu monoklonových protilátok v supematante kultúry.

Príkladmi bazálnych médií sú médiá s nízkou koncentráciou vápnika, ako je médium Ham'F12, médium MCDB153 alebo médium s nízkou koncentráciou vápnika MEM, a média s vysokou koncentráciou vápnika, ako je médium MCDB104, médium MEM, médium D-MEM, médium RPMI1640, médium ASF104 alebo médium RD. Bazálne médiá môžu obsahovať napríklad séra, hormóny, cytokíny a/alebo rôzne anorganické alebo organické látky v závislosti od účelu použitia.

Monoklonové protilátky môžu byť z uvedeného supematantu kultúry alebo ascitické tekutiny izolované a čistené zrážaním nasýteným síranom amónnym, metódou zrážania euglobulínom, metódou kyseliny kaprónovej, metódou kyseliny kaprylovej, ionomeničovou chromatografiou (DEAE alebo DE52) a afinitnou chromatografiou s použitím stĺpca anti-imunoglobulínu alebo stĺpca proteínu A.

„Rekombinantná chimérová monoklonová protilátka“ je monoklonová protilátka pripravená genetickým inžinierstvom, a konkrétne znamená chimérovú protilátku, ako je myšacia/ľudská chimérová monoklonová protilátka, ktorej variabilné oblasti sú odvodené od imunoglobulínu cicavca iného než človeka (myši, krysy, škrečka a pod.) a ktorej konštantné oblasti sú odvodené z ľudského imunoglobulínu.

Konštantná oblasť odvodená od ľudského imunoglobulínu má aminokyselinovú sekvenciu typickú pre každý izotyp, ako je IgG (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD a IgE. Konštantná oblasť rekombinantnej chimérovej monoklonovej protilátky môže byť oblasť ľudského imunoglobulínu prislúchajúceho k akémukoľvek izotypu. Výhodne ide o konštantnú oblasť ľudského IgG.

Chimérová monoklonová protilátka sa môže získať napríklad nasledujúcim spôsobom. Nie je treba zdôrazňovať, že výrobný postup nie je obmedzený na opísaný spôsob.

Myšaciu/ľudskú chimérovú monoklonovú protilátku je možné pripraviť s odkazom na Experimental Medicíne: Supplement, zv. 1.6, č. 10 (1988) a na zverejnenú japonskú patentovú prihlášku po prieskume č. (JP-B) Hei 3-73280. Konkrétne je ju možné pripraviť operatívnym vložením génu CH (C gén kódujúci konštantnú oblasť reťazca H), získaného z DNA kódujúcej ľudský imunoglobulín za aktívne V_H gény (reorganizovaný VDJ gén kódujúci variabilnú oblasť reťazca H) získané z DNA kódujúcej myšaciu monoklonovú protilátku izolovanú z hybridómu produkujúceho myšaciu monoklonovú protilátku, a génu C_L (C gén kódujúci konštantnú oblasť reťazca L), získaného z DNA kódujúcej ľudský imunoglobulín za aktívne V_L gény (reorganizovaný VJ gén kódujúci variabilnú oblasť reťazca L) získané z DNA kódujúcej myšaciu monoklonovú protilátku izolovanú z hybridómu, exprimovateľným spôsobom do rovnakého vektora alebo rozdielneho vektora, potom sa expresným vektorom transformujú hostiteľské bunky a potom sa transformanty kultivujú.

Konkrétne sa najprv z myších hybridómov, produkujúcich monoklonové protilátky, obvyklou metódou získajú DNA, štiepia sa príslušnými reštrikčnými enzýmami (napríklad EcoRI a Hindlll), podrobia sa elektroforéze (napríklad s použitím 0,7 % agarózového gélu) a analyzujú Southemovým blottingom. Po elektroforéze sa gél zafarbí, napríklad etídiumbromidom, a fotografuje, potom sa mu pridelia markerové pozície, premyje sa dvakrát vodou a na 15 min. sa ponorí do 0,25M HC1. Potom sa gél ponorí na 10 min. za mierneho miešania do roztoku 0,4N NaOH. DNA sa obvyklou metódou prenesú na 4 h na filter. Filter sa regeneruje, premyje dvakrát 2 x SSC. Potom, čo sa filter dostatočne vysuší, vypaľuje sa 3 h pri 75 °C. Po vypálení sa filter na 30 min. podrobí pôsobeniu 0,1 x SSC/0,1 % SDS pri 65 °C. Potom sa ponorí do 3 x SSC/0,1 % SDS. Získaný filter sa ošetruje 3 až 4 h pri 65 °C prehybridizačným roztokom v plastovom vrecku.

Potom sa do vrecka pridá ³²P-značená sonda DNA a hybridizačný roztok a nechá sa asi 12 h reagovať. Po hybridizácii sa filter premyje pri vhodnej koncentrácii soli, reakčnej teplote a čase (napríklad 2 x SSC/0,1 % SDS, teplota miestnosti, 10 min.). Filter sa umiestni do plastového vrecka s malým objemom 2 x SSC a po zatavení vrecka sa podrobí autorádiografii.

Reorganizované gény VDJ a VJ, kódujúce reťazec H a L myšacej monoklonovej protilátky, sa identifikujú uvedeným Southemovým blottingom. Oblasť zahŕňajúca identifikovaný fragment DNA sa frakcionuje odstreďovaním s gradientom hustoty sacharózy a vloží sa do fágového vektora (napríklad Charon 4A, Charon 28, XEMBL3 a XEMBL4). Fágovým vektorom sa transformuje E. coli (napríklad LE392 a NM539) na vytvorenie genómovej knižnice. Genómová knižnica sa podrobí skríningu metódou hybridizácie plakov, ako je metóda Benton-Davisa (Science, zv. 196, str. 180 - 182 (1977)), s použitím príslušných sond (J gén reťazca H, (k) J gén reťazca L atď.) na získanie pozitívnych klonov zahŕňajúcich reorganizovaný VDJ gén alebo VJ gén. Vytvorením reštrikčnej mapy a stanovením nukleotidovej sekvencie získaných klonov sa potvrdí, či sa získali gény zahŕňajúce požadovaný reorganizovaný gén V_H (VDJ) alebo V_L (VJ).

Zvlášť sa izolujú ľudské gény C_H a C_L, použité na chimerizáciu. Napríklad pokiaľ sa získava chimérová protilátka s ľudským IgGl, izoluje sa ako C_H gén, gén Cyl a ako C_L gén sa izoluje gén Ck. Tieto gény môžu byť izolované z ľudskej genómovej knižnice s myšacími génmi Cyl a Ck, ktoré zodpovedajú ľudskému génu Cyl, resp. Ck, ako sondami, s využitím výhody vysokej homológie medzi nukleotidovými sekvenciami myšacieho imunoglobulínového génu a ľudského imunoglobulínového génu.

Konkrétne sa fragmenty DNA, zahŕňajúcej ľudský gén Ck a oblasť zosilňovača transkripcie, izolujú napríklad z genómovej knižnice ľudského XCharon 4A HaelII-Alut (Celí, zv. 15, str. 1157 - 1174 (1978)) s použitím 3 kb fragmentu HindlII-BamHI klonu Igl46 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, zv. 75, str. 4709 - 4713 (1978)) a 6,8 kb fragmentu EcoRI klonu MEP10 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, zv. 78, str. 474 - 478 (1981)) ako sond. Okrem toho napríklad potom, čo sa ľudská fetálna hepatocytová DNA digeruje s Hindlll a frakcionuje elektroforézou na agarózovom géli, vloží sa do λ788 5,9 kb fragment a potom sa pomocou uvedených sond izoluje ľudský Cyl gén.

S použitím takto získaného myšacieho génu V_H, myšacieho génu V_L, ľudského génu C_H a ľudského génu C_L a so zahrnutím oblasti promótora a oblasti zosilňovača transkripcie sa do expresného vektora, ako je pSV2gpt alebo pSV2neo, obvyklou metódou vloží ľudský gén C_H za myšací gén V_H a ľudský gén C_L sa vloží za myšací V_L gén, s príslušnými reštrikčnými enzýmami a DNA ligázou. V tomto prípade môžu byť chimérové gény myšací gén V_H/ľudský gén C_H, resp. myšací gén V_L/ľudský gén C_L vložené do rovnakého expresného vektora alebo do rôznych expresných vektorov.

Takto získaný expresný vektor(y) s vloženým chimérovým génom sa zavádza do myelómov, ktoré neprodukujú protilátky, napríklad buniek P3X63 Ag8-653 alebo buniek SP 120, metódou fúzie protoplastov, DEAE- dextránovou metódou, kalciumfosfátovou metódou alebo elektroporáciou.

Transformanty sa podrobujú skríningu kultiváciou v prostredí obsahujúcom liečivo zodpovedajúce génu rezistencie na liečivo vloženému do expresného vektora a potom sa získajú bunky produkujúce požadované chimérové monoklonové protilátky.

Požadované chimérové monoklonové protilátky sa získavajú zo supematantu kultúry takto získaných buniek produkujúcich protilátky.

„Humanizovaná monoklonová protilátka“ (CDR-očkovaná protilátka) podľa vynálezu je monoklonová protilátka, pripravená genetickým inžinierstvom a konkrétne znamená humanizovanú monoklonovú protilátku, kde časť alebo všetky oblasti určujúce komplementaritu hypervariabilnej oblasti sú odvodené od komplementaritu určujúcich oblastí hypervariabilnej oblasti z monoklonovej protilátky cicavca iného než človeka (myši, krysy, škrečka a pod.), úseky základnej štruktúry variabilnej oblasti sú odvodené od úsekov základnej štruktúry ľudského imunoglobulínu a konštantná oblasť je odvodená od konštantnej oblasti z imunoglobulínu ľudského pôvodu.

Komplementaritu určujúce oblasti hypervariabilnej oblasti existujú v hypervariabilnej oblasti variabilnej oblasti protilátky a znamenajú tri oblasti, ktoré sa priamo a komplementárne viažu na antigén (komplementaritu určujúce zvyšky - complementarity determining regions - CDR1, CDR2 a CDR3). Úseky základnej štruktúry znamenajú štyri porovnateľne konzervované oblasti ležiace pred, za alebo medzi týmito troma oblasťami určujúcimi komplementaritu (úseky základnej štruktúry - framework regions - FR1, FR2, FR3 a FR4).

Inak povedané, humanizovaná monoklonová protilátka znamená protilátku, pri ktorej boli všetky oblasti monoklonovej protilátky odvodené od iného cicavca než človeka, s výnimkou celých alebo častí komplementaritu určujúcich oblastí v hypervariabilnej oblasti, nahradené zodpovedajúcimi oblasťami, odvodenými od ľudského imunoglobulínu.

Konštantná oblasť odvodená od ľudského imunoglobulínu má aminokyselinovú sekvenciu jedinečnú pre každý izotyp, ako je IgG (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD a IgE. Konštantná oblasť humanizovanej monoklonovej protilátky podľa vynálezu môže byť z ľudského imunoglobulínu prislúchajúceho ku ktorémukoľvek izotypu. Úseky základnej štruktúry konštantnej oblasti odvodené od ľudského imunoglobulínu nie sú zvlášť obmedzené.

Humanizovanú monoklonovú protilátku je možne pripraviť napríklad nasledujúcim postupom. Nie je treba zdôrazňovať, že tento postup nie je nijako obmedzujúci.

Napríklad je možné genetickým inžinierstvom pripraviť rekombinantnú humanizovanú monoklonovú protilátku odvodenú od myšacej monoklonovej protilátky, s odkazom na zverejnený japonský preklad medzinárodnej zverejnenej prihlášky (JP-WA) č. Hei 4-506458 a JP-A Sho 62-296890. Konkrétne sa z hybridómov produkujúcich myšaciu monoklonovú protilátku izoluje aspoň jeden CDR gén myšacieho H reťazca a aspoň jeden CDR gén myšacieho L reťazca zodpovedajúci CDR génu myšacieho H reťazca a z génov ľudského imunoglobulínu sa izoluje ľudský gén H reťazca kódujúci celé oblasti okrem CDR ľudského H reťazca zodpovedajúceho uvedenému CDR myšacieho H reťazca a ľudský gén L reťazca kódujúci celú oblasť okrem CDR ľudského L reťazca zodpovedajúceho uvedenému CDR myšacieho L reťazca.

Takto izolované CDR gén(y) myšacieho H reťazca a gén(y) ľudského H reťazca sa operatívne vložia do vhodného vektora, aby mohli byť exprimované. Podobne sa CDR gén(y) myšacieho L reťazca a gén(y) ľudského L reťazca operatívne vložia do vhodného vektora, aby mohli byť exprimované. Alternatívne môžu byť CDR gén(y) myšacieho H reťazca/gén(y) ľudského H a gén(y) myšacieho L reťazca/gén(y) ľudského L reťazca vložené exprimovateľným spôsobom do toho istého expresného vektora. Takto pripraveným vektorom sa transformujú hostiteľské bunky, čím sa získajú transformanty produkujúce humanizovanú monoklonovú protilátku. Kultiváciou transformantov sa zo supematantu kultúry získa požadovaná humanizovaná monoklonová protilátka.

„Ľudská monoklonová protilátka“ je imunoglobulín, v ktorom sú celé oblasti, zahŕňajúce variabilnú a konštantnú oblasť H reťazca a variabilnú a konštantnú oblasť L reťazca tvoriace imunoglobulín, odvodené od génov kódujúcich ľudský imunoglobulín.

Ľudská protilátka (výhodne ľudská monoklonová protilátka) sa môže získať známymi metódami, napríklad rovnakým spôsobom ako v opísanej produkčnej metóde polyklonových alebo monoklonových protilátok tak, že sa antigénom imunizuje transgénové zviera, pripravené integráciou aspoň jedného génu ľudského imunoglobulínu do génového miesta cicavca iného než človeka, ako je myš.

Transgénová myš produkujúca ľudské protilátky sa pripraví napríklad metódami opísanými v Náture Genetics, zv. 7, str. 13 - 21 (1194), Náture Genetics, zv. 15, str. 146 - 156 (1977), JP-WA Hei 4-504365, JP-WA Hei 7-509137, Nikkei Science, č. 6, str. 40 - 50 (1995), WO 94/25585, Náture, zv. 368, str. 856 - 859 (1994) a JP-WA č. Hei 6-500233.

Okrem toho je možné aplikovať taktiež nedávno vyvinutú metódu produkcie proteínov ľudského pôvodu z mlieka transgénových kráv alebo prasiat (Nikkei Science, str. 78 - 84 (apríl 1997)).

Výraz „časť protilátky“, používaný v tomto texte, znamená čiastočnú oblasť uvedenej monoklonovej protilátky. Konkrétne znamená fragment F(ab‘)₂, Fab‘, Fab, Fv (variabilný fragment protilátky), sFv, dsFv (di11

SK 288048 Β6 sulfidicky stabilizovaný Fv) alebo dAb (jednodoménová protilátka) (Exp. Opin. Ther. Patents, zv. 6, č. 5, str. 441 -456(1996)).

„F(ab‘)2“ a „Fab“‘ sa môžu získať pôsobením proteázy, ako je pepsín a papaín, na imunoglobulín (monoklonovú protilátku) proteázou, a znamenajú fragment protilátky, vzniknutý štiepením imunoglobulínu v blízkosti disulfidických väzieb v pántových oblastiach existujúcich medzi každým z oboch H reťazcov. Napríklad papaín štiepi IgG pred disulfidickými väzbami v pántových oblastiach existujúcich medzi oboma H reťazcami za vzniku dvoch homológnych fragmentov, v ktorých je v C-terminálnych oblastiach disulfidickou väzbou napojený L reťazec zložený z V_L (variabilná oblasť L reťazca) a C_L (konštantná oblasť L reťazca) a fragment H reťazca zložený z V_H (variabilná oblasť H reťazca) a (3_Ηγ1 (γΐ oblasť konštantnej oblasti H reťazca). Každý z takýchto homológnych fragmentov protilátky sa nazýva Fab‘. Pepsín štiepi IgG taktiež za disulfidickými väzbami v pántových oblastiach existujúcich medzi oboma H reťazcami za vzniku fragmentu protilátky mierne väčšieho, než je fragment, v ktorom sú oba uvedené Fab‘ spojené v pántovej oblasti. Tento fragment protilátky sa nazýva F(ab‘)₂·

Výraz „odvrhnutie štepu“ podľa vynálezu sa vzťahuje na rôzne imunitné odpovede, ktoré sa snažia odvrhnúť a zničiť štep (časť živého tela, ktorá je transplantovaná; bunka, tkanivo alebo orgán) od darcu, ktorého genetické pozadie je odlišné od genetického pozadia príjemcu (t. j. alotransplantácia alebo xenotransplantácia), pretože príjemca štep rozpoznáva ako cudzorodú látku. Imunitné odpovede, ktoré sprevádzajú túto transplantáciu, môžu byť klasifikované ako (1) hyperakútne odvrhnutie, čo je silná odmietavá reakcia, ku ktorej dochádza bezprostredne po transplantácii, (2) akútne odvrhnutie, ktoré je pozorované v priebehu niekoľkých mesiacov po transplantácii, a (3) chronické odvrhnutie, pozorované po niekoľkých mesiacoch po transplantácii. Okrem toho, aj keď bunková imunita v dôsledku imunokompetentných buniek predstavovaných T bunkami i humorálna imunita v dôsledku protilátok prebiehajú zložito koordinovaným spôsobom, k hlavnej reakcii dochádza bunkovou imunitou.

Ako dôsledok odvrhnutia štepu transplantát nakoniec nekrotizuje a odpadne. U pacienta sa okrem toho vyvinú nielen vážne systémové symptómy, ako je horúčka, leukocytóza a únava, ale taktiež opuch a bolestivosť v mieste transplantácie. Okrem toho môže dôjsť k vážnym komplikáciám, ako sú infekcie.

Napríklad pokiaľ sa transplantuje xenogénny štep, ako je štep z prasaťa, vyskytuje sa vážny problém hyperakútneho odmietnutia, pričom je štep odvrhnutý v priebehu minút.

Výraz „štep“ podľa vynálezu sa vzťahuje na „orgán alebo jeho časť“ alebo „tkanivo“, ktoré je transplantované cicavčiemu príjemcovi od cicavčieho darcu.

Výraz „orgán alebo jeho časť“, vzťahujúci sa na transplantáciu podľa vynálezu, sa týka ľubovoľného orgánu či jeho časti, ktoré tvoria živé telo cicavca (výhodne človeka alebo prasaťa, zvlášť výhodne človeka). Výhodnými príkladmi sú pečeň, srdce, pľúca, pankreas, ľadvina, hrubé črevo, tenké črevo alebo ich časti. Zvlášť výhodné sú pečeň alebo jej časť.

Výraz „tkanivo“, vzťahujúci sa na transplantáciu podľa vynálezu, sa týka ľubovoľného tkaniva pochádzajúceho zo živého tela cicavca (výhodne človeka alebo prasaťa, zvlášť výhodne človeka). Výhodným príkladom je tkanivo, ako je koža, rohovka, kosť alebo srdcová chlopňa; ale nie je na ne tento výraz obmedzený.

Výraz „imunosupresívum“ podľa vynálezu sa týka akéhokoľvek jedného alebo viacerých existujúcich imunosupresív, používaných na supresiu imunologickej rejekcie (odvrhnutie štepu) u príjemcu, vyvolanej transplantáciou štepu pri klinickej transplantácii buniek, tkanív alebo orgánov, ktorých výroba a predaj ako liečiva boli schválené vládnou organizáciou, alebo akéhokoľvek jedného alebo viacerých imunosupresív, ktoré sa v súčasnosti používajú v klinických alebo preklinických skúškach alebo budú použité v klinických testoch v budúcnosti, ktorých výroba a predaj ako liečiva môže byť po testoch schválená vládnou organizáciou.

Takéto imunosupresíva sa používajú nielen samostatne, ale taktiež v kombinácii s 2, 3 alebo viacerými prostriedkami. Výraz „imunosupresívum“ podľa vynálezu preto zahŕňa použitie jediného typu liečiva alebo kombinované použitie viacerých farmaceutických prostriedkov (výhodne používaných v kombinácii s 2 alebo 3 prostriedkami).

Imunosupresívum je výhodne napríklad jedno alebo viac liečiv vybraných zo skupiny zahŕňajúcej cyklosporín (CsA). takrolimus (FK-506), azatioprín (AZ), mykofenolát mofetil (MMF), mizoribín (MZ), leflunomid (LEF), adrenokortikosteroidy (inak nazývané adrenokortikálne hormóny, kortikosteroidy, kortikoidy), ako je prednizolón a metylprednizolón, sirolimus (inak nazývaný rapamycín), deoxyspergualín (DSO), FTY720 (chemický názov: 2-amino-2-[2-(4-oktylfenyl)etyl]-l,3-propándiol hydrochlorid) a „liečivo CTLA4“, opísané ďalej. Zvlášť výhodný je takrolimus (FK-506) a cyklosporín, tak jednotlivo, ako aj súčasne.

Výraz „liečivo CTLA4“ podľa vynálezu sa vzťahuje na liečivo, ktoré obsahuje ako účinnú zložku (1) poiypeptid zahŕňajúci celú dĺžku (vrátane molekúl, ktoré majú prakticky rovnakú aminokyselinovú sekvenciu) alebo celok alebo časť extracelulámej oblasti ľudského CTLA4 (cytotoxický antigén asociovaný s T lymfocytami; <aminokyselinová sekvencia> GenBank prístupové číslo NP 005205, <cDNA> GenBank prístupové číslo NM 005214, (2) fúzny polypeptid zahŕňajúci alebo celok alebo časť extracelulámej oblasti ľudského CTLA4 a celok alebo časť ďalšieho proteínu (zvlášť výhodne celok alebo časť konštantnej oblasti ťažkého reťazca ľudského imunoglobulínu) (ďalej skracovaný ako CTLA4-IgFc alebo CTLA4-Ig) alebo (3) DNA, ktorá môže cicavcovi (zvlášť výhodne človekovi) poskytnúť polypeptid (1) alebo fúzny polypeptid (2), alebo vektor zahŕňajúci túto DNA (zvlášť výhodný je plazmid obvykle používaný v génovej terapii alebo virálny vektor odvodený od vírusu (retrovírusu, adenovírusu, adeno-asociovaného vírusu atď.) a pod.

Každý z tu používaných výrazov ako „extraceluláma oblasť“, „časť“, „konštantná oblasť ťažkého reťazca imunoglobulínu“, „fúzny polypeptid a „prakticky rovnaký“ má rovnaký význam, aký je uvedený skôr.

Existuje značný počet údajov o významnom imunosupresívnom účinku uvedeného CTLA4-Ig. Napríklad vysoký imunosupresívny účinok Y100F (tyrozín v polohe 100 je nahradený fenylalanínom), vyvinutého v Bristol-Myers Squibb/Repligen, bol potvrdený rôznymi testami na zvieratách, a tento produkt je taktiež zahrnutý ako jedno z CTLA4 liečiv podľa vynálezu (Igaku no Ayumi, zv. 194, č. 14, str. 1195 - 1200, 2000, J. Clin. Invest., zv. 103, str. 1223 - 1225, 1999, N. Engl. J. Med., zv. 335, str. 1369 - 1377, 1996, J. Exp. Med., zv. 178, str. 1801 - 1806, 1993, Blood, zv. 94, str. 2523 - 2529, 1999, Náture Med., zv. 6, str. 464 - 469, 2000, Blood, zv. 83, str. 3815 - 3823, 1995, J. Clin. Invest., zv. 2, str. 473 - 482, 1998, Blood, zv. 85, str. 2607 - 2612, 1995, N. Engl. J. Med., zv. 340, str. 1704 - 1714, 1999, N. Encl. J. Med., zv. 335, str. 1369 1377, 1996, J. Clin. Invest., zv. 102, str. 1243 - 1252, 1999).

Výraz „farmaceutický prijateľný nosič“ podľa vynálezu zahŕňa pomocnú látku, riedidlo, plnivo, dekompozičné činidlo, stabilizátor, konzervačné činidlo, pufer, emulgátor, aromatické činidlo, farbivo, sladidlo, činidlo zvyšujúce viskozitu, príchuť, činidlo zvyšujúce rozpustnosť alebo nejakú ďalšiu prísadu. S použitím jedného alebo viacerých takýchto nosičov môže byť farmaceutická kompozícia formulovaná do tabliet, piluliek, práškov, granúl, injekcií, roztokov, kapsúl, pastiliek, elixírov, suspenzií, emulzií, sirupov atď.

Farmaceutická kompozícia môže byť podávaná perorálne alebo parenterálne. Ďalšie formy parenterálnej aplikácie zahŕňajú roztok na vonkajšie použitie, čapíky na rektálnu aplikáciu a pesary, používané bežnou metódou, ktoré zahŕňajú jednu alebo viac účinných zložiek.

Dávkovanie sa môže líšiť v závislosti od veku, pohlavia, hmotnosti a symptómov pacienta, účinku liečby, spôsobu podávania, času liečby, druhu účinnej zložky („látka“ podľa vynálezu, uvedená skôr) obsiahnutej vo farmaceutickej kompozícii atď. Obvykle môže byť farmaceutická kompozícia podávaná dospelým v dávke 10 pg až 1000 mg (alebo 10 pg až 500 mg) na jedno podanie. V závislosti od rôznych podmienok môže v niektorých prípadoch postačovať dávka nižšia než skôr uvedená a v iných prípadoch môže byť nutná dávka vyššia než skôr uvedená.

V prípade injekcie je ju možné pripravovať rozpustením alebo suspendovaním protilátky v netoxickom farmaceutický prijateľnom nosiči, ako je fyziologický roztok alebo komerčne dostupná voda pre injekcie, úpravou koncentrácie v rozmedzí 0,1 pg protilátky/ml nosiča až 10 mg protilátky/ml nosiča. Takto pripravené injekcie môžu byť podávané ľudskému pacientovi, vyžadujúcemu liečbu, v rozmedzí dávok 1 pg až 100 mg/kg telesnej hmotnosti, výhodne 50 pg až 50 mg/kg telesnej hmotnosti, jeden alebo viackrát derme. Príkladmi spôsobu podávania sú medicínsky vhodné cesty, ako je intravenózna injekcia, subkutánna injekcia, intradermálna injekcia, intramuskuláma injekcia, intraperitoneálna injekcia a pod., výhodne intravenózna injekcia.

Injekcie je možné pripravovať taktiež v nevodnom riedidle (napríklad propylénglykole, polyetylénglykole, rastlinnom oleji, ako je olivový olej a alkohole, ako je etanol), suspenzii alebo emulzii.

Injekcie môžu byť sterilizované filtráciou cez bakteriálny filter, zmiešaním s baktericídom alebo ožarovaním. Injekcie sa môžu vyrábať takým spôsobom, že sa pripravujú v čase použitia. Najmä sú lyofilizované na sterilné pevné kompozície, ktoré môžu byť pred použitím rozpustené v sterilnej destilovanej vode pre injekcie alebo inom rozpúšťadle.

Farmaceutická kompozícia podľa vynálezu je veľmi vhodná na supresiu, prevenciu a/alebo liečbu imunologickej rejekcie (odvrhnutie štepu), ktorá je vážnym problémom pri terapiách, kde je od darcu transplantovaný (alotransplantovaný alebo xenotransplantovaný) orgán (pečeň, srdce, pľúca, oblička, pankreas atď.) alebo jeho časť, alebo tkanivo (ako je koža, rohovka a kosť) príjemcovi, trpiacemu vážnym kardiovaskulárnym ochorením.

Farmaceutická kompozícia podľa vynálezu môže ďalej zvýšiť účinok imunosupresie odvrhnutia štepu (imunologickej rejekcie) existujúcimi imunosupresívami, podávanými na potlačenie odvrhnutia štepu počas takýchto transplantačných terapií, kde sa farmaceutická kompozícia používa spolu s imunosupresívami.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 ukazuje efekt potlačenia imunologickej rejekcie (odvrhnutie štepu) sprevádzajúce transplantáciu orgánu protilátkou proti AILIM (nazývanou inak anti-lCOS protilátka), kde ako index sú použité dni predĺženia prežitia štepu v prípade transplantovaného srdca od darcu u príjemcu.

Obr. 2 predstavuje fotografiu znázorňujúcu stupeň infiltrácie buniek exprimujúcich AILIM do transplantovaného srdca.

SK 288048 Β6

Príklady uskutočnenia vynálezu

Ďalej je vynález konkrétne osvetlený s poukázaním na príklady, ale nie je možné si to vysvetľovať tak, že by bol obmedzený na uskutočnenia, opísané v príkladoch.

Príklad 1

Supresia odvrhnutia štepu látkou modulujúcou AILIM pri transplantácii pečene <1> Materiály a metódy <1-1> Zvieratá

Ako príjemcovia, resp. darcovia, boli použité dospelé krysy Lewis (samci, 210 až 250 g), resp. krysy DA (samčí, 210 až 250 g) <l-2> Anti-krysia AILIM monoklonová protilátka

Bola použitá monoklonová protilátka, vyčistená z ascitickej tekutiny supematantu kultúry získanej in vitro alebo in vivo kultiváciou skôr opísaného hybridómu s názvom „JTT-1“ (tento hybridom bol medzinárodne uložený 11.10.1996 v National Inštitúte of Bioscience and Human Technology, Advanced Science and Technology, Ministry of Economy, Trade and Industry, čo je medzinárodné úschovné miesto certifikované podľa Budapeštianskej zmluvy. Medzinárodné prístupové číslo: FERM BP-5707), ktorý produkuje myšaciu antikrysiu AILIM monoklonová protilátku (monoklonová protilátka myšacieho anti-krysieho JTT-1 antigénu) (JP-A Hei 11-29599 (príklady 1 a 2) a WO 98/38216 (príklady 1 a 2). Ďalej sa táto protilátka jednoducho označuje ako „anti-AILIM protilátka“.

<l-3> Transplantácia pečene

Postupom podľa metódy, ktorú skôr opísal Kamada a spol., bola pečeň darcovských krýs DA transplantovaná príjemcovským krysám Lewis (Surgery, 93, str. 64, 1983, transplantation, 30, str. 43, 1980, Transplantation, 28, str. 47, 1979).

Konkrétne bola pečeň odobratá krysám DA prepláchnutá ľadom chladenou sterilizovanou destilovanou vodou od portálnej žily. Potom bola začatá transplantácia pečene príjemcovi zašitím suprahepatálnej vena cava. Potom bola s použitím manžetovej techniky zašitá portálna žila a infrahepatálna vena cava (Transplant. Proc., 19, str. 1158, 1987, Transplantation, 43, str. 745, 1987).

Pokiaľ príjemcovia uhynuli do 3 dní po dokončení transplantácie, bolo to stanovené ako technické zlyhanie transplantácie. Dosiahnutá úspešnosť transplantácie bola 95 %.

<l-4> Podávanie anti-AILIM protilátky a/alebo imunosupresíva

Po dokončení transplantácie bola každej z krýs Lewis (každá skupina obsahovala 5 až 9 zvierat) podávaná anti-AILIM protilátka a/alebo imunosupresívny prostriedok FK-506 v dávkach a časoch uvedených ďalej. Deň, v ktorom bola dokončená transplantácia, bol počítaný ako deň nula (0).

Skupina, ktorej nebola podávaná ani anti-AILIM protilátka ani imunosupresívum FK-506, bola použitá ako kontrola.

1. Anti-AILIM protilátka (1 mg/kg, intravenózna injekcia, deň 0)

2. Anti-AILIM protilátka (1 mg/kg, intravenózna injekcia, deň 0 a 6)

3. Anti-AILIM protilátka (1 mg/kg, intravenózna injekcia, deň 0, 3 a 6)

4. Anti-AILIM protilátka (1 mg/kg, intravenózna injekcia, deň 0, 3, 6, 9 a 12)

5. Anti-AILIM protilátka (0,3 mg/kg, intravenózna injekcia, deň 0, 3, 6, 9 a 12)

6. FK-506 (1 mg/kg, intramuskuláma injekcia, deň 0)

7. Anti-AILIM protilátka (1 mg/kg, intravenózna injekcia, deft 0) a FK-506 (1 mg/kg, intramuskuláma injekcia, deň 0)

Dĺžka prežitia štepu transplantovanej pečene u príjemcu bola hodnotená a stanovená Kaplan-Meierovým testom.

<2> Výsledky

Výsledky sú znázornené v tabuľke 1 a 2. Časť údajov v tabuľke 2 je aktualizáciou údajov z tabuľky 1.

Tabuľka 1 ukazuje efekt protilátky proti AILIM a/alebo imunosupresívneho prostriedku na potlačenie imunologickej rejekcie (odvrhnutie štepu) sprevádzajúcej transplantáciu orgánu, kde ako index je použité predĺženie prežitia štepu u príjemcu, ktorému bola transplantovaná pečeň od darcu.

Tabuľka. 2 ukazuje efekt potlačenia imunologickej rejekcie (odvrhnutie štepu) sprevádzajúcej transplantáciu orgánu protilátkou proti AILIM a/alebo imunosupresívnym prostriedkom, kde ako index sú použité dni predĺženia prežitia štepu v prípade transplantovanej pečene od darcu u príjemcu.

SK 288048 Β6

Tabuľka 1

ošetrenie	počet zvierat	dĺžka prežitia štepu transplantovanej pečene (dni)	priemer (dni)	hodnota testu (P“)
kontrola	6	10, 11,11,11, 12, 12	11,1
anti-AILIM protilátka (1 mg/kg, IV injekcia, deft 0)	5	10, 10, 11, 12, 13	11,2
anti-AILIM protilátka (1 mg/kg, IV injekcia, deň 0 a 6)	5	10, 11, 11, 12, 14	11,6
anti-AILIM protilátka (1 mg/kg, IV injekcia, deň 0, 3 a 6)	7	10, 14, 16, 25, 28, 30, 30	>21,9	<0,001
anti-AILIM protilátka (1 mg/kg, IV injekcia, deň 0, 3, 6, 9 a 12)	9	13, 16, 19, 19, 23,25,29,31, 32	23	<0,001
anti-AILIM protilátka (0,3 mg/kg, IV injekcia, deň 0, 3, 6, 9, a 12)	6	12, 12, 14, 17, 25,27	17,8	<0,001
FK-506 (1 mg/kg, IM injekcia, deň 0)	8	22,24, 26,30, 30, 30, 19, 19	15,5
anti-AILIM protilátka (1 mg/kg, IV injekcia, deň 0) a FK-506 (1 mg/kg, IM injekcia, deň 0)	8	17,41,47, 56, 19, 19, 64, 129	>49,0	<0,001

a - v porovnaní s kontrolnou skupinou * - doteraz prežívajúci štep

Tabuľka 2

ošetrenie	počet zvierat	dĺžka prežitia štepu transplantovanej pečene (dni)	medzihodnota (dni)	hodnota testu (P^a)
kontrola (neošetrená)	6	10, 11, 11, 11, 12, 12	11
anti-AILIM protilátka (1 mg/kg, IV injekcia, deň 0, 3, 6, 9 a 12)	9	13, 16, 19, 19, 23,25,29, 31,32	23	<0,001
FK-506 (1 mg/kg, IM injekcia, deň 0)	8	19, 22, 24, 26, 30,42, 45, 91	28	<0,001
anti-AILIM protilátka (1 mg/kg, IV injekcia, deň 0) a FK-506 (1 mg/kg, IM injekcia, deň 0)	9	17,35,38,41,47, 56,58, >100, >100	>44	<0,001
anti-AILIM protilátka (1 mg/kg, IV injekcia, deň 0, 3 a 6) a FK-506 (1 mg/kg, IM injekcia, deň 0)	2	45, 69	57

Výsledkom je, že v skupine, ktorej bola v období po transplantácii anti-AILIM protilátka (1 mg/kg) podávaná trikrát alebo päťkrát, bolo pozorované významné predĺženie prežitia štepu transplantovanej pečene v porovnaní s kontrolou.

Ďalej bolo v skupine, ktorej bola v období po transplantácii päťkrát podaná nízka dávka anti-AILIM protilátky (0,3 mg/kg), pozorované podobne významné predĺženie prežitia štepu transplantovanej pečene.

Okrem toho, pokiaľ bola anti-AILIM protilátka podaná aj len jedenkrát v kombinácii s FK-506, čo je imunosupresívny prostriedok používaný na rôzne účely, značne sa predĺžilo prežitie štepu transplantovanej pečene, ktoré bolo výrazne dlhšie, než pokiaľ bol jedenkrát podaný iba FK-506 (1 mg/kg).

Z týchto výsledkov vyplývajú nasledujúce skutočnosti:

1) Anti-AILIM protilátka významne potlačuje odvrhnutie štepu (imunologickú rejekciu), ktoré sprevádza transplantáciu štepu, napríklad orgánu.

2) Odvrhnutie štepu, ktoré sprevádza transplantáciu štepu, napríklad orgánu, môže byť ďalej potlačené použitím anti-AILIM protilátky v kombinácii s imunosupresívom, na rozdiel od toho, keď je použitá iba jedna z týchto látok.

Príklad 2

Supresia imunologickej rejekcie látkou modulujúcu AILIM pri transplantácii srdca (časť 1) <1> Reagenty, zvieratá a skúšobná metóda <1-1> Zvieratá

Ako príjemcovia, resp. darcovia, boli použité dospelé myši C3H/He (samčí, vek 6 týždňov), resp. myši BALB/c (samčí, vek 6 týždňov).

<l-2> Príprava anti-myšacej AILIM monoklonovej protilátky

Príprava bola uskutočnená nasledujúcim spôsobom.

S použitím cDNA kódujúcej celú dĺžku aminokyselinovej sekvencie skôr opísanej myšacej AILIM (Int. Immunol., zv. 12, č. 1, str. 51 - 55, 2000) boli štandardnými metódami pomocou technológie genetickej rekombinácie pripravené transformované bunky exprimujúcej myšaciu AILIM.

Transformované bunky boli homogenizované a ultracentrifugované (100 000 x g) a odstredený zvyšok obsahujúci frakciu bunkových membrán bol odobraný a suspendovaný v PBS. Na počiatočnú imunizáciu bola získaná frakcia bunkových membrán injekčné vnesená spolu s kompletným Freundovým adjuvans do tlapky krysy Wistar (deň 0). Potom bola frakcia bunkových membrán podávaná do tlapky ako antigén v intervaloch, v deň 7, deň 14 a deň 28. Dva dni po konečnej imunizácii boli odobrané bunky lymfatických uzlín.

Bunky lymfatických uzlín a myšacie myelómové bunky PAI (JCR č. B0113, Res. Disclosure, zv. 217, str. 155, 1982) boli zmiešané v pomere 5:1a fuzovaním buniek pomocou polyetyléglykolu 4000 (Boehringer Mannheim) ako fuzneho činidla bol pripravený hybridom produkujúci monoklonovú protilátku. Selekcia hybridómu bola uskutočnená kultiváciou v médiu ASF104 s obsahom HAT (Ajinomoto), obsahujúcim 10 % fetálneho bovinného séra a aminopterín.

S použitím prietokového cytometra EPICS-EL1TE boli merané fluorescenčné intenzity buniek sfarbených reakciou supematantov kultúr každého hybridómu s uvedenými transfektovanými rekombinantnými bunkami exprimujúcimi myšací AILIM a následnou reakciou s FITC-značeným anti-krysím IgG (Cappel) na potvrdenie reaktivity monoklonových protilátok produkovaných v supematantoch kultúr každého hybridómu proti myšacej AILIM. Ako výsledok bolo získaných niekoľko hybridómov, ktoré produkujú monoklonové protilátky s reaktivitou proti myšacej AILIM.

Jeden z týchto hybridómov bol nazvaný „B10.5“. Tento hybridom (vždy 10⁶ až 10⁷ buniek/0,5 ml/myš) bol intraperitoneálnou injekciou vnesený do myši ICR nunu (samica, vek 7 až 8 týždňov), po 10 až 20 dňoch bola u myši v anestézii uskutočnená laparotómia a z ascitu získaného štandardnými postupmi bola uskutočnená veľkoobjemová príprava krysej anti-myšacej AILIM monoklonovej protilátky (Ig2a). Ďalej sa táto protilátka jednoducho označuje ako „anti-ALIM protilátka“.

<l-3> Transplantácia srdca

Podľa skôr opísanej metódy bolo srdce darcovských myší BALB/c transplantované do brušnej dutiny príjemcovských myší C3H/He. Zmiznutie pulzácie transplantovaného srdca bolo posúdené ako dokončenie odvrhnutia štepu.

<2>Experiment 1 (podávanie anti-AILIM protilátky)

Každej myši C3H/He (10 myší), u ktorej prebehla transplantácia, bola podaná anti-AILIM protilátka (10 mg/kg) bezprostredne po transplantácii (deň 0, 200 gg), v deň 2 (200 gg), deň 4 (200 gg), deň 7 (200 gg) a deň 10 (100 gg). Skupina, ktorej nebola anti-AILIM protilátka podaná (25 myší), bola použitá ako kontrola.

Dĺžka prežitia štepu transplantovaného srdca u príjemcu po transplantácii bola hodnotená a stanovená pomocou Kaplan-Meierového testu.

Priemerná dĺžka prežitia štepu transplantovaného srdca u príjemcov bola nasledujúca:

(skupina s podávaním anti-AILIM protilátky) čas prežitia štepu: 9 dní u 1 myši, 10 dní u 3 myší, 13 dní u 4 myší, 16 dní u 2 myší (kontrolná skupina) čas prežitia štepu: 2 dni u 2 myší, 7 dní u 9 myší, 8 dní u 7 myší, 9 dní u 3 myší, 10 dní u 4 myší

Dĺžka prežitia štepu v kontrolnej skupine, ktorej nebola podávaná anti-AILIM protilátka, bola 7,9 dní, ale oproti tomu v skupine, ktorej bola podávaná anti-AILIM protilátka, bola 12,3 dní, a v skupine, ktorej bola podávaná anti-AILIM protilátka, sa prejavilo výrazné predĺženie prežitia štepu transplantovaného srdca.

<3>Experiment 2 (podávanie anti-AILIM protilátky)

Boli použité rovnaké zvieratá (darcovia i príjemcovia) a rovnaká anti-AILIM protilátka, ako je uvedené.

Transplantácia srdca bola uskutočnená podobným spôsobom ako v experimente 1.

Každej myši C3H/He, u ktorej prebehla transplantácia, bola intraperitoneálne podaná anti-AILIM protilátka (100 gg/deň) bezprostredne po transplantácii (deň 0, 200 gg), v deň 2, deň 4, deň 7 a deň 10. Skupina, ktorej nebola podaná anti-AILIM protilátka, bola použitá ako kontrola.

Priemerná dĺžka prežitia štepu transplantovaného srdca u príjemcov myší bola približne 7,7 dní v kontrolnej skupine, zatiaľ čo v skupine, ktorej bola deň 7 a deň 10. Skupina, ktorej nebola podaná anti-AILIM protilátka, bola použitá ako kontrola.

Priemerná dĺžka prežitia štepu transplantovaného srdca u príjemcov myší bola približne 7,7 dní v kontrolnej skupine, zatiaľ čo v skupine, ktorej bola podávaná anti-AILIM protilátka, bola približne 40,9 dní (medzihodnota: 29 dní/maximálna hodnota: 120 dní) (obr. 1). V skupine s podaním anti-AILIM protilátky sa teda prejavilo významné predĺženie prežitia štepu transplantovaného srdca.

Ďalej bol farbením hematoxylínom/eozínom (HE farbenie) podľa štandardných metód u každej kontrolnej myši (bez liečby po transplantácii srdca) a u myší, ktorým bola po transplantácii podávaná anti-AILIM protilátka, analyzovaný stupeň infiltrácie buniek exprimujúcich AILIM (ICOS) do transplantovaného srdca.

Výsledkom bolo, že v neošetrenej skupine bola pozorovaná významná infiltrácia buniek exprimujúcich AILIM (ICOS), rovnako ako nekróza srdcového svalu (sfarbená časť). Naproti tomu u transplantovaného srdca myši, ktorej bola podávaná anti-AILIM protilátka, nebolo možné pozorovať nekrózu srdcového svalu a bol potvrdený významný pokles infiltrácie buniek exprimujúcich AILIM (ICOS) (obr. 2).

Príklad 3

Supresia imunologických reakcií látkami modulujúcimi AILIM pri transplantácii srdca a kože <1> Reagenty, zvieratá a testovacia metóda <1-1> Adenovírusový vektor

Rekombinantný adenovírus obsahujúci expresnú kazetu buď cDNA kódujúcu hCTLA4-Ig (fiizny proteín zahŕňajúci extracelulámu oblasť ľudského CTLA4 a ľudský Fc) alebo β-galaktozidázového génu E. coli bol získaný homológnou rekombináciou medzi expresnou kozmidovou kazetou pAdex/CAhCTLA4-Ig (Transplantation, zv. 68, č. 6, str. 758, 1999) a genómom rodičovského kmeňa adenovírusu (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, zv. 90, c. 24, str. 11498 - 11502, 1993).

Rekombinantný vírus bol potom množený v bunkovej línii 293, odvodenej z ľudskej ľadviny. Vírusový vektor, pripravený týmto spôsobom, bol odobraný a uchovávaný zmrazením na -80 °C. Rekombinantný adenovírus obsahujúci cDNA pre hCTLA4-Ig a adenovírus obsahujúci LacZ boli nazvané AdCTLA4-lg, resp. AdLacZ.

<l-2> Zvieratá a protilátka

Ako príjemcovia boli použité dospelé samce krýs Lewis (RT1¹) (210 až 250 g) a ako darcovia dospelé samce (210 až 250 g) krýs DA (RTl^a) alebo krýs BN (RTlⁿ).

Bola použitá myšacia anti-krysia AILIM monoklonová protilátka, pripravená v príklade 1.

<l-3> Transplantácia srdca a kože a testovacia metóda

Podľa skôr opísanej metódy (J. Thorac. Cardiovasc. Surg., zv. 57, č. 2, str. 225 - 229, 1969) boli srdcia odobrané krysám DA transplantované do brušnej dutiny krýs Lewis. Bezprostredne po transplantácii bola príjemcovským krysám intravenózne podaná v jednej dávke anti-krysia AILIM protilátka (1 mg/kg) a/alebo AdCTLA4-Ig (10⁹ jednotiek tvoriacich plaky, pfu).

Skupina transplantovaných zvierat, ktorým nebola podaná ani anti-krysia AILIM protilátka ani AdCTLA4-Ig, a skupina transplantovaných zvierat, ktorým bol miesto toho podaný AdLacZ, boli použité ako kontroly. Ošetrenie zvierat prebiehalo ďalej opísaným spôsobom.

Skupina 1: Alotransplantácia (Lewis/DA) bez imunosupresívnej liečby.

Skupina 2: Izotransplantácia (Lewis/Lewis) bez imunosupresívnej liečby.

Skupina 3: Alotransplantácia (Lewis/DA) s podávaním AdLacZ.

Skupina 4: Alotransplantácia (Lewis/DA) s podávaním AdCTLA4-Ig.

Skupina 5: Alotransplantácia (Lewis/DA) s podávaním anti-AILIM protilátky.

Skupina 6: Alotransplantácia (Lewis/DA) s podávaním AdCTLA4-Ig a anti-AILIM protilátky.

Vymiznutie pulzácie transplantovaného srdca bolo posúdené ako dokončenie odvrhnutia štepu. Odvrhnutie štepu bolo potvrdené histologickou analýzou mononukleámych buniek, ktoré sa infiltrovali do tkaniva transponovaného srdca, a nekrózy svalových buniek HE farbením štandardnými metódami.

Ďalej bol na laterálnu torakálnu stenu príjemcovských krýs skupiny 4 a skupiny 6, u ktorých transplantované srdce prežilo po dlhý čas, v deň 140 od transplantácie srdca transplantovaný dostatočne silný kožný štep z darcovskej krysy DA. Po transplantácii kože nebola uskutočnená imunosupresívna liečba anti-AILIM protilátkou, AdCTLA4-Ig alebo podobne. Koniec trvania prežitia štepu pri kožnom transplantáte bol stanovený, keď sa stupeň vizuálne pozorovateľného kožného štepu znížil na 10 % alebo menej pôvodného stavu.

Potom bolo, v deň 200 od pôvodnej transplantácie srdca krýs DA, s použitím manžetovej techniky (Acta Pathol. Microbiol. Scand. [A], zv. 79, č. 4, str. 366 - 372, 1971) znovu transplantované srdce darcovskej krysy DA do cervikálnej oblasti 3 príjemcovských krýs skupiny 6, ktoré vykázali odvrhnutie štepu po prijatí kožného transplantátu od darcu.

Okrem toho bolo zvyšným príjemcovským krysám zo skupiny 6, u ktorých transplantované srdce prežívalo počas dlhého času, v deň 150 od pôvodnej transplantácie srdca z krýs DA transplantované srdce z krýs BN.

Štatistické hodnotenie stupňa prežitia štepu u príjemcu bolo uskutočnené Kaplan-Meierovým testom.

SK 288048 Β6 <2>Výsledky testov

Tabuľka 3 ukazuje efekt potlačenia imunologickej rejekcie (odvrhnutie štepu) sprevádzajúce transplantáciu orgánu protilátkou proti AILIM a/alebo AdCTLA4-Ig, kde ako index sú použité dni predĺženia prežitia štepu v prípade transplantovaného srdca od darcu u príjemcu.

Tabuľka 3

Ošetrenie	počet zvierat	dĺžka prežitia štepu transplantovanej pečene (dni)	medzihodnota (dni)	hodnota testu (P)
kontrola (neošetrená	10	5, 5, 5, 6, 6, 6, 6, 6, 6, 6	6
izotransplantácia /neošetrená	4	>250, >250, >250, >250	>250
alotransplantácia/AdLacZ	7	6, 6, 6, 6, 7, 7, 7	6
alotransplantácia/AdCTLA4-Ig	10	40,42, 58, 62, 64, 65, 68, 109, 140^a, 140^a	64	<0,001
alotransplantácia/anti-AILIM protilátka	7	5, 5, 6, 6, 6, 6, 6	6
alotransplantácia/AdCTLA4-Ig + antiAILIM protilátka	5	>250^b, >250^b, >250^b, >250^a, >250^a,	>250	<0,001

a - primárna transplantácia kože b - sekundárna transplantácia kože

Ako je uvedené v tabuľke 3, významné predĺženie prežitia štepu u transplantovaného srdca u príjemcov v porovnaní so skupinou neošetrených zvierat, u ktorých bola uskutočnená xenotransplantácia (skupina 1), nebolo pozorované v skupine zvierat s podávaním AdLacZ (skupina 3) a v skupine zvierat, ktorým bola podaná jedna dávka anti-AILIM protilátky (skupina 5).

Naproti tomu v skupine s podávaním AdCTLA4-Ig (skupina 4) bolo prežitie štepu u transplantovaného srdca (pôvodne transplantované srdce krýs DA) významne predĺžené (priemer: približne 64 dní). Ďalej bolo u 3 krýs zo skupiny 4 (10 krýs) pozorované prežitie štepu u transplantovaného srdca počas dlhšieho času 100 dní alebo viac (tabuľka 3).

Ďalej bolo v skupine zvierat, u ktorých boli AdCTLA4-Ig a anti-AILIM protilátka použité v kombinácii (skupina 6), prežitie štepu transplantovaného srdca u všetkých príjemcov neobmedzene predĺžené (300 dní alebo viac) (tabuľka 4).

U príjemcovských krýs v skupine 4 bolo transplantované srdce (pôvodne transplantované srdce darcovských krýs DA) odvrhnuté spolu s odvrhnutím transplantovanej kože, zatiaľ čo u príjemcovských krýs v skupine 6 nebolo odvrhnutie transplantovaného srdca pozorované.

Tabuľka 4 ukazuje efekt protilátky proti AILIM použitej v kombinácii s AdCTLA4-Ig na potlačenie imunologickej rejekcie (odvrhnutie štepu) sprevádzajúcej transplantáciu orgánu, kde ako index je použitá prítomnosť alebo neprítomnosť prežitia štepu v prípade transplantácie srdca (primárna transplantácia srdca a sekundárna transplantácia srdca) a transplantácie kože (primárna transplantácia kože) u príjemcu.

Tabuľka 4

Ošetrenie	počet zvierat	transplantácia kože (primárna)	transplantácia srdca (primárna)	transplantácia srdca (sekundárna)
odvrhnutie	prežitie	odvrhnutie	prežitie	odvrhnutie	prežitie
alotransplantácia/AdCTLA4-Ig	2	2/2	0/2			2/2	0/2
alotransplantácia/AdCTLA4-Ig + anti-AILIM protilátka	5	2/2	0/2	0/3	3/3	0/5	5/5

Ako je znázornené v tabuľke 4, u všetkých príjemcovských krýs v skupine 4 a skupine 6, ktorým bola transplantovaná koža z darcu, bola transplantovaná koža odvrhnutá. Ale oproti skupine 4 a kontrolnej skupine, v ktorej bolo odvrhnutie kože dokončené za 12 dní alebo menej od transplantácie kože, bolo v skupine 6 dokončenie odvrhnutia trochu oneskorené a bolo pozorované počas 16 dní alebo menej. Tento výsledok ukazuje, že kombinované použitie AdCTLA4-Ig a anti-AILIM protilátky môže zdržať odvrhnutie transplantovanej kože v porovnaní s prípadom, keď sa použije AdCTLA4-Ig samotný.

Je zaujímavé, že u príjemcovských krýs skupiny 6, u ktorých bolo potvrdené dlhodobé prežitie štepu transplantovaného srdca (pôvodné srdce krysy DA), bola transplantovaná koža úplne odvrhnutá, ako bolo uvedené, ale u druhého transplantovaného srdca (po druhýkrát transplantované srdce od darcu DA) bolo pozorované prežitie štepu po neobmedzený čas. Okrem toho u týchto príjemcovských krýs pôvodne transplantované srdce prežilo počas pokusu.

U príjemcov v skupine 6, ktorým bolo transplantované srdce darcov BN, pôvodne transplantované srdce od darcov DA stále pulzovalo a prežívalo počas pokusu, ale srdce od darcov BN, transplantované ako druhé, bolo odvrhnuté v čase, podobnom výsledkom zvierat zo skupiny 1.

SK 288048 Β6

Priemyselná využiteľnosť

Farmaceutické kompozície podľa vynálezu sú zvlášť použiteľné pri supresii, prevencii a/alebo liečbe imunologickej rejekcie (odvrhnutie štepu), ktorá je vážnym problémom sprevádzajúcim liečbu transplantáciami (alotransplantáciami alebo xenotransplantáciami) orgánov (pečene, srdca, pľúc, obličiek, pankreasu atd’.), ich častí alebo tkanív (kože, rohovky, kosti atď.) od darcu príjemcovi trpiacemu vážnym kardiovaskulárnym ochorením.

Farmaceutické kompozície podľa vynálezu môžu taktiež silnejšie potlačovať odvrhnutie štepu, pokiaľ sa použijú v kombinácii s existujúcimi imunosupresívami, ktoré sa podávajú na potlačenie odvrhnutia štepu (imunologické reakcie) pri takýchto transplantačných terapiách.

Navyše je farmaceutická kompozícia, zahŕňajúca ľudskú protilátku proti AILIM, zahrnutú vo farmaceutických kompozíciách podľa vynálezu, veľmi výhodným liečivom, pretože nevyvoláva žiadne vedľajšie účinky, ako je alergia, pokiaľ sa protilátka odvodená od myši podáva človekovi.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použitie látky, ktorá je účinná pri modulácii transdukcie signálu sprostredkovanej molekulou AILIM, na prípravu liečiva na potláčanie, liečbu alebo prevenciu odvrhnutia štepu, sprevádzajúceho transplantáciu pečene, srdca alebo ich časti, pričom táto látka je vybraná z ktorejkoľvek látky (a) až (e) uvedenej nižšie;

(a) protilátka, ktorá sa viaže na AILIM alebo časť tejto protilátky;

(b) polypeptid obsahujúci celú extracelulámu oblasť AILIM alebo jej časť;

(c) fuzny polypeptid obsahujúci celú extracelulámu oblasť AILIM alebo jej časť a celú konštantnú oblasť ťažkého reťazca imunoglobulínu alebo jej časť;

(d) polypeptid, ktorý sa viaže na AILIM; a (e) antisense DNA alebo antisense RNA proti AILIM.
2. Použitie látky, ktorá je účinná pri modulácii transdukcie signálu sprostredkovanej molekulou AILIM, na prípravu liečiva na zvýšenie účinku jedného alebo viacerých imunosupresív na potláčanie, liečbu alebo prevenciu odvrhnutia štepu, sprevádzajúceho transplantáciu pečene, srdca alebo ich časti, pričom látka je vybraná z ktorejkoľvek látky (a) až (e) uvedenej nižšie;

(a) protilátka, ktorá sa viaže na AILIM alebo časť tejto protilátky;

(b) polypeptid obsahujúci celú extracelulámu oblasť AILIM alebo jej časť;

(c) fuzny polypeptid obsahujúci celú extracelulámu oblasť AILIM alebo jej časť a celú konštantnú oblasť ťažkého reťazca imunoglobulínu alebo jej časť;

(d) polypeptid, ktorý sa viaže na AILIM; a (e) antisense DNA alebo antisense RNA proti AILIM.
3. Použitie podľa nároku 2, kde imunosupresívom je jeden alebo viac terapeutických prostriedkov vybraných zo skupiny pozostávajúcej z liečiv azatioprín, adrenokortikálny steroid, cyklosporín, mizoribín a takrolimus (FK.-506), mykofenolát mofetil, leflunomid, sirolimus, deoxyspergualín, FTY720 a CTLA4.
4. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, na použitie v kombinácii s takrolimom (FK-506) a/alebo liečivom CTLA4.
5. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, kde transplantáciou je alotransplantácia.
6. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, kde transplantáciou je xenotransplantácia.
7. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, kde uvedenou látkou je protilátka, ktorá sa viaže na AILIM alebo časť tejto protilátky.
8. Farmaceutická kompozícia na použitie na potláčanie, liečbu alebo prevenciu odvrhnutia štepu, sprevádzajúceho transplantáciu pečene, srdca alebo ich časti, vyznačujúca sa tým, že obsahuje látku účinnú pri modulácii transdukcie signálu, sprostredkovanej molekulou AILIM vybranú z ktorejkoľvek látky (a) až (e) uvedenej nižšie a farmaceutický prijateľný nosič;

(a) protilátka, ktorá sa viaže na AILIM alebo časť tejto protilátky;

(b) polypeptid obsahujúci celú extracelulámu oblasť AILIM alebo jej časť;

(c) fuzny polypeptid obsahujúci celú extracelulámu oblasť AILIM alebo jej časť a celú konštantnú oblasť ťažkého reťazca imunoglobulínu alebo jej časť;

(d) polypeptid, ktorý sa viaže na AILIM; a (e) antisense DNA alebo antisense RNA proti AILIM.
9. Farmaceutická kompozícia na použitie na zvýšenie účinku jedného alebo viacerých imunosupresív na potláčanie, liečbu alebo prevenciu odvrhnutia štepu, sprevádzajúceho transplantáciu pečene, srdca alebo ich časti, vyznačujúca sa tým, že obsahuje látku účinnú pri modulácii transdukcie signálu, sprostredkovanej molekulou AILIM vybranú z ktorejkoľvek látky (a) až (e) uvedenej nižšie a farmaceutický prijateľný nosič;

SK 288048 Β6 (a) protilátka, ktorá sa viaže na AILIM alebo časť tejto protilátky;

(b) polypeptid obsahujúci celú extracelulámu oblasť AILIM alebo jej časť;

(c) fúzny polypeptid obsahujúci celú extracelulámu oblasť AILIM alebo jej časť a celú konštantnú oblasť ťažkého reťazca imunoglobulínu alebo jej časť;

5 (d) polypeptid, ktorý sa viaže na AILIM; a (e) antisense DNA alebo antisense RNA proti AILIM.
10. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 9, vyznačujúca sa tým, že imunosupresívom je jeden alebo viac terapeutických prostriedkov vybraných zo skupiny pozostávajúcej z liečiv azatioprín, adrenokortikálny steroid, cyklosporín, mizoribín a takrolimus (FK.-506), mykofenolát mofetil, leflunomid, si10 rolimus, deoxyspergualín, FTY720 a CTLA4.
11. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 8 alebo 9, vyznačujúca sa tým, že imunosupresívom je jeden alebo viac terapeutických prostriedkov vybraných zo skupiny pozostávajúcej z liečiv takrolimus (FK.-506) a CTLA4.
12. Farmaceutická kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 11, vyznačujúca sa 15 tým, že transplantáciou je alotransplantácia.
13. Farmaceutická kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 11, vyznačujúca sa tým, že transplantáciou je xenotransplantácia.
14. Farmaceutická kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 13, vyznačujúca sa tým, že uvedenou látkou je protilátka, ktorá sa viaže na AILIM, alebo časť tejto protilátky.