ES2536653T3

ES2536653T3 - Polipéptidos implicados en la respuesta inmunitaria

Info

Publication number: ES2536653T3
Application number: ES08171572.4T
Authority: ES
Inventors: Arda Shahinian; Anna Tafuri Bladt; Giorgio Senaldi; Tak Wah Mak; Steven Kiyoshi Yoshinaga
Original assignee: Amgen Canada Inc; Amgen Inc
Current assignee: Amgen Canada Inc; Amgen Inc
Priority date: 2000-11-28
Filing date: 2001-11-28
Publication date: 2015-05-27
Anticipated expiration: 2021-11-28
Also published as: AU1796902A; MXPA03004578A; WO2002044364A3; JP4236925B2; EP1337634A2; EP2042596B1; JP2004520819A; CA2429599A1; AU2002217969B2; WO2002044364A2; EP2351840A1; EP2042596A1

Abstract

Un antagonista de B7RP1 para su uso en la disminución de la producción de IgE en un paciente que padece una respuesta alérgica que comprende administrar el antagonista en una cantidad eficaz para disminuir la producción de IgE, en donde el antagonista es un anticuerpo que se une B7RP1 e inhibe parcialmente o completamente la producción de IgE.

Description

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DESCRIPCIÓN

Polipéptidos implicados en la respuestainmunitaria

5 Campo de la invención

La presente invención se refiere a polipéptidos que están implicados en la activación de linfocitos T. Específicamente, la invención se refiere a polipéptidos coestimuladores de linfocitos T, a los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos, a los vectores de expresión y células anfitrionas para la producción de los polipéptidos, y a

10 las composiciones y métodos para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la inmunosupresión y la activacióninmunitaria.

Antecedentes de la invención

15 Para la generación de una respuesta inmunitaria de linfocitos T (células T) apropiada, se deben proporcionar dos señales a las células T por medio de las células presentadoras de antígenos (APC). En primer lugar, el antígeno debe ser presentado al receptor de células T (TCR) a travésde un complejomayor de histocompatibilidad (MHC), en un evento que determina la especificidad. En segundo lugar, se debe liberar una señal coestimuladora independiente del antígeno mediante la interacción de los miembros de la familia B7 sobre la APC con la proteína

20 CD28 sobre las células T. Una respuesta inmunitaria productiva conduce a la proliferación, la diferenciación, la expansión clonal, y el efecto o función. En ausencia de lo segundo, la señal coestimuladora, las células T experimentan un estado falta de respuesta específica del antígeno de larga duración, denominada anergia.

Las células T inician la respuesta inmunitaria, median las funciones efectoras específicas de antígeno, y regulan la

25 actividad de otros leucocitos mediante la secreción de citoquinas. El receptor de células T (TCR) distingue la célula T de los otros linfocitos y se puede unir al antígeno solo cuando éste es presentado por la APC en el contexto de un MHC. La actividad funcional de una célula T en particular se puede correlacionar con la expresión de los antígenos de membrana, tales como CD4 y CD8. Por ejemplo, las células T CD4+ generalmente funcionan como células T coadyuvantes (TH) y están restringidas para el MHC de clase II, mientras que las células CD8+ en general funcionan

30 comocélulasTcitotóxicas(TC)yestánrestringidasparaelMHCdeclaseI.

Los polipéptidos coestimuladoras de las células T potentes que ha sido previamente identificados incluyen polipéptidos denominados B7.1 (Freeman et al. J. Immunology 143, 2714-2722 (1989), Freeman et al. Jour. Exp. Med. 174, 625-31 (1991)) y B7.2 (Freeman et al. Science 262, 909-911 (1993), y Freeman et al. Jour. Exp. Med. 35 178, 2185-2192 (1993)), (o CD80 y CD86, respectivamente). Estos polipéptidos son expresados o bien induciblemente o bien constitutivamente sobre diferentes CPA y son ligandos unidos a la membrana para CD28 y CTLA-4, respectivamente, sobre las células T. CD28 (Aruffo y Seed, Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 8573-8577 (1987) y Gross et al. J. Immun. 144, 3201-3210 (1990)) es expresado en células T en reposo y media una señal coestimuladora positiva. La expresión de CTLA-4 (Brunet et al. Nature 328, 267-270 (1987) y Dariavach et al. Eur. 40 Jour. Immun. 18, 1901-1905 (1988)) es inducida después de la activación de las células T y regula negativamente la señal de CD28, debido a su mayor afinidad de unión para B7.1 y B7.2. Los ratones sin el gen CTLA-4 muestran niveles drásticamente altos de células T, ya que el mecanismo de desconexión para la señal de proliferación se deteriora en ausencia de CTLA-4. Este fenotipo demuestra claramente el importante efecto inhibidor que tiene la proteína coestimuladora CTLA-4 sobre la proliferación de células T. Los ratones que carecen de CD28 o B7.1 o B7.2

45 tienen un fenotipo menos grave, indican que pueden existir rutas alternativas para la coestimulación de células T.

Ha habido un considerable interés en la ruta de CD28/CTLA-4 como medio para la regulación de la activación y la proliferación de las células T. Una proteína quimérica que contiene la porción extracelular de CTLA-4 fusionada a un Fc humano tiene fuertes efectos inmunosupresores y ha sido estudiada en una variedad de entornos clínicos.

50 También se han evaluado anticuerpos para las proteínas B7.1 y B7.2 para indicaciones similares en el área de la inmunosupresión. Los anticuerpos anti-CTLA-4 han demostrado utilidad en la promoción de la activación de las células T. Además, la terapia génica con B7.1 y B7.2 ha demostrado una gran promesa en el área de la inmunoterapia contra el cáncer.

55 Hasta el momento, CD28, CTLA-4, B7.1 y B7.2 están implicados en una sola vía coestimuladora de células T. Dada la capacidad de modular una respuesta inmunitaria mediante la regulación de la coestimulación de las células T, sería deseable identificar otros miembros de la misma o ruta coestimuladora de células T o una ruta separada que puedan tener propiedades ventajosas en la regulación de la función de las células T y la respuesta inmunitaria del anfitrión.

60 En consecuencia, un objeto de la invención es proporcionar nuevos polipéptidos para la estimulación de la actividad y/o la proliferación de las células T. Un objeto adicional de la invención es el uso de los nuevos polipéptidos para la prevención y el tratamiento de lostrastornos inmunitarios mediados por células T.

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Compendio de la invención

Sorprendentemente, se han identificado dos nuevos polipéptidos de una ruta coestimuladora de células T. Los polipéptidos representan un par ligando-receptor en una ruta coestimuladora única que parece ser distinta de la ruta 5 que consiste en las proteínas CD28, CTLA-4, B7.1, y B7.2 descritas anteriormente. Los polipéptidos son referidos como proteína-1 relacionada con CD28, o CRP1, y proteína-1 relacionada con B7, o B7RP1.

La presente invención proporciona por las siguientes realizaciones definidas en los puntos 1-4:

10 1. Un antagonista de B7RP1 para su uso en la disminución de la producción de IgE en un paciente que padece una respuesta alérgica que comprende administrar el antagonista en una cantidad eficaz para disminuir la producción de IgE, en donde el antagonista es un anticuerpo que se une B7RP1 e inhibe parcialmente o completamentela producción de IgE.

2. El antagonista de punto 1 para su uso de acuerdo con el punto 1, en donde el método comprende

15 adicionalmente la administración de un antagonista de IgE, en donde el antagonista de IgE es un anticuerpo anti-IgE o fragmento del mismo, un receptor FCεRI soluble o un fragmento del mismo, un anticuerpo anti-FCεRI o un fragmento del mismo, variantes de IgE o fragmentos de las mismas, péptidos de unión a IgE, péptidos de unión a FCεRI, o moléculas pequeñas capaces de unirse a IgE o competir con IgE por la unión al receptor FCεRI.

20 3. Uso de un antagonista de B7RP1 para la preparación de un medicamento para disminuir la producción de IgE en un paciente que padece una respuesta alérgica, que comprende administrar el antagonista en una cantidad eficaz para disminuir la producción de IgE, en donde el antagonista es un anticuerpo que se une B7RP1 e inhibe parcialmente o completamentela producción de IgE.

4. El uso del punto 3, que comprende adicionalmente la administración de un antagonista de IgE, en donde

25 el antagonista de IgE es un anticuerpo anti-IgE o un fragmento del mismo, un receptor FCεRI soluble o un fragmento del mismo, un anticuerpo anti-FCεRI o un fragmento del mismo, variantes de IgE o fragmentos de las mismas, péptidos de unión a IgE, péptidos de unión a FCεRI, o moléculas pequeñas capaces de unirse a IgE o competir con IgE por la unión al receptor FCεRI.

30 Se describen en la presente memoria moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos CRP1 y B7RP1 y polipéptidos relacionados. La molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

a) la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1A (SEQ ID NO: 1); b) la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido a partir de los residuos 1-200 o a partir de los

35 residuos21-200mostradaenlaFigura1A(SEQIDNO:1); c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que es idéntico en al menos aproximadamente 70 por ciento al polipéptido mostrado en la Figura 1A(SEQ ID NO: 1); d) una variante alélica de origen natural o una variante de empalme alternativa de cualquiera de (a), (b) o (c);

40 e) una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de (a), (b) o (c); f) una secuencia de nucleótidos de (b), (c) o (d) que codifica un fragmento polipeptídico de al menos aproximadamente 25, 50, 75, 100, o más de 100 residuos deaminoácido; g) una secuencia de nucleótidos de (a), (b) o (c) que comprende un fragmento de al menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, omás de 100 nucleótidos; y

45 h) una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas con cualquiera de (a) -(g).

Adicionalmente se describe en la presente memoria una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: a) la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 2A (SEQ ID NO: 6) o la Figura 3A (SEQ ID NO: 11) o

50 la Figura 12A (SEQ ID NO: 16); b) la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido mostrado en la Figura 2A (SEQ ID NO: 6) a partir de los residuos 1 a 322 o a partir de los residuos 47 a 322 o mostrada en la Figura 3A (SEQ ID NO: 11) a partir de residuos de 1-288 o a partir de los residuos 19-288, 20-288, 21-288, 22-288, 24-288, o 28-288; o mostrada en la Figura 12A a partir de residuos 1-302 o a partir de los residuos 19-302, 20-302, 21-302, 22

55 302, 24-302 o 28-302; c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que es idéntico en al menos aproximadamente 70 por ciento a los polipéptidos mostrados en la Figura 2A (SEQ ID NO: 6) o la Figura 3A (SEQ ID NO: 11)

o la Figura 12A (SEQ ID NO: 16); d) una variante alélica de origen natural o una variante de empalme alternativa de cualquiera de (a), (b) o

60 (c); e) una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de (a), (b) o (c); f) una secuencia de nucleótidos de (b), (c) o (d) que codifica un fragmento polipeptídico de al menos aproximadamente 25, 50, 75, 100, o más de 100 residuos deaminoácido; g) una secuencia de nucleótidos de (a), (b) o (c) que comprende un fragmento de al menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, omás de 100 nucleótidos; y h) una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas con cualquiera de (a) -(g).

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5 Adicionalmente se describen en la presente memoria polipéptidos CRP1 y B7RP1 y polipéptidos relacionados, p. ej.,

un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: a) la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1A (SEQ ID NO: 2); b) la secuencia de aminoácidos madura mostrada en la Figura 1A (SEQ ID NO: 2) que comprende un amino maduro en el residuo 21;

10 c) un fragmento de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1A (SEQ ID NO: 2) que comprende al menos aproximadamente 25, 50, 75, 100, omás de 100 residuos de aminoácido; d) un ortólogo de(a), (b) o (c); y e) una variante alélica o variante de empalmealternativa de (a), (b) o (d).

15 Además se describe en la presente memoria un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos

seleccionada del grupo que consiste en: a) la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 2A (SEQ ID NO: 7) o la Figura 3A (SEQ ID NO: 12) o la Figura 12A (SEQ ID NO: 17); b) la secuencia de aminoácidos madura mostrada en la Figura 2A (SEQ ID NO: 7) que comprende un

20 amino maduro en los residuos 47 o la Figura 3A (SEQ ID NO: 12) que comprende un amino maduro en cualquiera de los residuos 19, 20 , 21, 22, 24 o 28 o la Figura 12A (SEQ ID NO: 17) que comprende un amino maduro en cualquiera de los residuos 19, 20, 21, 22, 24, o 28; c) un fragmento de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 2A (SEQ ID NO: 7) o la Figura 3A (SEQ ID NO: 12) o la Figura 12A (SEQ ID NO: 17) que comprende al menos aproximadamente 25, 50, 75,

25 100,omásde100residuosdeaminoácido; d) un ortólogo de(a), (b) o (c); y e) una variante alélica o una variante de empalmealternativa de (a), (b), (c) o (d).

Adicionalmente se describen en la presente memoria vectores de expresión y células anfitrionas para la producción

30 de los polipéptidos, anticuerpos que se unen a los polipéptidos CRP1 y B7RP1 y a polipéptidos relacionados, y análisis para detectar la unión de B7RP1 y polipéptidos relacionados con B7RP1 a CRP1 y polipéptidos relacionados con CRP1. Las composiciones farmacéuticas que comprenden CRP1 o polipéptidos relacionados con CRP1 y B7RP1 o polipéptidos relacionados con B7RP1 también están abarcadas por la invención. También se proporcionan métodos para la identificación de compuestos que interactúan con CRP1 o B7RP1 como los análisis para determinar

35 sitalescompuestossonagonistasoantagonistasdelaactividadCRP1yB7RP1.

Los polipéptidos CRP1 y B7RP1 están implicados en la coestimulación y la proliferación de células T. Los polipéptidos CRP1 y B7RP1, los agentes de unión selectiva de los mismos, y los agonistas y antagonistas de los mismos, pueden ser útiles para el diagnóstico, la prevención y el tratamiento de enfermedades relacionadas con el

40 controldelasrespuestasdecélulasT.

Los polipéptidos CRP1 y B7RP1, los agentes de unión selectiva de losmismos, y los agonistas y antagonistas de los mismos, pueden ser útiles para el diagnóstico, la prevención y el tratamiento de trastornos inmunitarios, ya sea para estimular una respuesta inmunitaria insuficiente o para reducir o inhibir una respuesta inmunitaria exagerada o

45 inapropiada. EltrastornoinmunitariopuedeestarmediadodirectamenteoindirectamenteporlascélulasT.

La invención proporciona un polipéptido CRP1 o B7RP1 para su uso en el tratamiento, prevención, o mejora de un trastorno mediado por células T. Adicionalmente se describe en la presente memoria un método para diagnosticar un trastorno mediado por células T o una susceptibilidad a un trastorno mediado por células T en un animal que 50 comprende determinar la presencia o cantidad de expresión de un polipéptido CRP1 o B7RP1; y diagnosticar un trastorno mediado por células T o una susceptibilidad a un trastorno mediado por células T basándose en la presencia o cantidad de expresión del polipéptido. Típicamente, un trastorno mediado por células T es un trastorno inmunitario que puede estar mediado directamente o indirectamente por células T. El animal es preferiblemente un mamífero y más preferiblemente un ser humano. También se describe en la presente memoria un método para

55 identificar una molécula de ensayo que se une a un polipéptido CRP1 o B7RP1 que comprende poner en contacto el polipéptido con un compuesto de ensayo y determinar el grado de unión del polipéptido al compuesto de ensayo. El método se puede utilizar para identificar agonistas y antagonistas del polipéptido CRP1 y/o B7RP1.

Los antagonistas de los polipéptidos CRP1 y/o B7RP1 se pueden utilizar como agentes inmunosupresores para

60 muchas indicaciones, incluyendo trastornos autoinmunitarios (tales como artritis reumatoide, psoriasis, esclerosis múltiple, diabetes y lupus eritematoso generalizado), síndrome de choque tóxico, trasplante de médula ósea y órganos, enfermedad inflamatoria intestinal, alosensibilización debida a transfusiones de sangre, y tratamiento de la enfermedad de injerto contra anfitrión. Además, se pueden utilizar antagonistas como agentes inhibidores para las indicaciones mediadas por células B dependientes de células T incluyendo el asma y la alergia, y la autoinmunidad mediada por anticuerpos. Los agonistas de los polipéptidos CRP1 y/o B7RP1 pueden ser útiles en, pero no están restringidos a, la activación de células T para la vigilancia yla eliminación del tumor.

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Un antagonista incluye un anticuerpo, o un fragmento del mismo, que es reactivo con o se une a B7RP1 o a un

5 dominio extracelular de B7RP1 en donde el anticuerpo reduce o elimina la unión de B7RP1 a CRP1. En una realización, el anticuerpo se une selectivamente a B7RP1 humana o a un dominio extracelular de la misma. El anticuerpo o fragmento del mismo que es un antagonista inhibe parcialmente o completamente la actividad coestimuladora inmunitaria de B7RP1. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal y puede ser murino, humano, quimérico o humanizado.

10 Adicionalmente se describe en la presente memoria un método para regular la interacción de B7RP1 con CRP1 que comprende administrar a un animal un agente de unión selectiva de CRP1 o un agente de unión selectiva de B7RP1

o ambos. En una realización, el agente de unión selectiva es un anticuerpo que se une a B7RP1 y reduce o elimina la unión de B7RP1 a CRP1. Adicionalmente se describe en la presente memoria un método de regulación de la

15 coestimulación inmunitaria mediada por B7RP1 que comprende administrar a un animal un agente de unión selectiva de B7RP1. El agente de unión selectiva es preferiblemente un anticuerpo que se une a B7RP1 e inhibe parcialmente o completamentela coestimulacióninmunitariamediada por B7RP1.

Adicionalmente se describe en la presente memoria unmétodo para regular la activación o la proliferación de células

20 T en un animal que comprende administrar al animal una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido B7RP1 o CRP1. Por ejemplo, se puede utilizar una moléculade ácido nucleico que codifica un polipéptido B7RP1 en la terapia génica paramejorar la activación de células T en respuesta a diversostumores.

Adicionalmente se describe en la presente memoria un mamífero no humano transgénico que comprende una

25 molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido CRP1 o B7RP1. Los ácidos nucleicos de CRP1 o B7RP1 se introducen en el mamífero de una manera que permite la expresión y el aumento de los niveles en circulación de los polipéptidos CRP1 o B7RP1. El mamífero transgénico no humano es preferiblemente un roedor, y más preferiblemente un ratón o una rata.

30 También se proporciona un método para estimular o potenciar una respuesta inmunitaria que comprende administrar B7RP1 o CRP1, o un agonista de B7RP1 o un agonista de CRP1. Opcionalmente, se puede estimular o potenciar una respuesta inmunitaria mediante la administración adicional de uno o más moléculas inmunoestimuladoras diferentes, tales como un agonista de CD28, un antagonista de CTLA4, omoléculas tales como B7.1 y/o B7.2.

35 Adicionalmente se describe en la presente memoria un método para la regulación de la producción de IgE que comprende la administración de B7RP1 o CRP1, o una combinación de las mismas, un agonista de B7RP1 o un agonista de CRP1, o una combinación de los mismos, o un antagonista de B7RP1 o un antagonista de CRP1, o una combinación de los mismos. Por ejemplo, la administración de B7RP1 o una combinación de B7RP1 y un agonista de CRP1 aumentaría la producción de IgE y sería útil para estimular una respuesta inmunitaria mediada por IgE

40 insuficiente. La administración de un antagonista de B7RP1 o un antagonista de CRP1, o una combinación de los mismos, disminuiría la producción de IgE y sería útil para inhibir una respuesta inmunitaria mediada por IgE exagerada o inapropiada. En una realización, la producción de IgE es parcialmente o completamente inhibida mediante la administración de un antagonista de B7RP1, o un antagonista de CRP1, o una combinación de los mismos. Se describe en la presente memoria un método para prevenir y/o tratar un trastorno mediado por IgE que

45 comprende administrar un antagonista de B7RP1, o un antagonista de CRP1, o una combinación de los mismos. Los trastornos mediados por IgE incluyen aquellos caracterizados por una producción excesiva de IgE, tales como asma, trastornos alérgicos, hipersensibilidad e inflamación sinusal.

Descripción de las Figuras

50 Figura 1. A) secuencia de ADN y de aminoácidos de CRP1 murina (mCRP1). La secuencia de señal pronosticada de CRP1 está subrayada en el extremo amino terminal y el sitio de escisión del pro-péptido determinado experimentalmente se indica mediante un asterisco. La secuencia transmembrana pronosticada está subrayado hacia el extremo carboxilo terminal. B) alineamiento de aminoácidos de la

55 secuenciadelaproteínasCRP1murina(mCRP1)conCD28murino(mCD28). Figura 2. A) secuencia de ADN y de aminoácidos de B7RP1 murina (mB7RP1). La secuencia señal pronosticada de B7RP1 está subrayada en el extremo amino terminal y el sitio de escisión del pro-péptido determinado experimentalmente se indica mediante un asterisco. La secuencia transmembrana pronosticada está subrayada hacia el extremo carboxilo terminal. B) alineamiento de aminoácidos de

60 secuencia de la proteína B7RP1 (mB7RP1) con CD80 murino (mCD80). Figura 3. A) Estructura y secuencia de la región codificante de la proteína de la supuesta B7RP1 humana (hB7RP1). La secuencia señal pronosticada de hB7RP1 está subrayada en el extremo amino terminal. Los sitios de escisión del péptido señal pronosticado están marcados mediante asteriscos. La secuencia transmembrana pronosticada está subrayada hacia el extremo carboxilo terminal. B) alineamiento de aminoácidos dela supuesta proteína hB7RP1madura con laproteína B7RP1murinamadura (mB7RP1). Figura 4. A) Expresión de la proteína de fusión CRP1-Fc soluble de las células 293T transfectadas con pcDNA3/CRP1-Fc. Se cargaron volúmenes normalizados de producto lisado celular o medio acondicionado

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5 y se separaron sobre un gel PAGE al 10% según se indica. Análisis Western del producto lisado celular y sobrenadante de medio celular para la expresión de proteínas de fusión Fc asociadas a la célula (producto lisado celular) y secretadas (medio). El anticuerpo primario fue anticuerpo de cabra anti-Fc humano (Pierce Chemical Company, Rockford, IL.). B) Expresión de proteína de fusión B7RP1-Fc soluble a partir de células 293T transfectadas con pcDNA3/B7RP1-Fc. Se cargaron 20 µl de producto lisado celular normalizado o

10 sobrenadante de medio y se separaron en un gel PAGE al 10%. El análisis de Western se realizó como en (A). La Figura 5. Interacción de proteínas de fusión CRP1-Fc y B7RP1-Fc con proteínas unidas a membrana expresadas en células COS-7. Se transfectaron transitoriamente células COS-7 con pcDNA3/CRP1, pcDNA3/B7RP1, o vector pcDNA3 solo. Se transfectaron células CHO D con psDRα/HCD28 y expresaron

15 de manera estable CD28 humano (hCD28). Las células que expresan CRP1, B7RP1, o HCD28 unidas a membrana se representan en filas, como se indica en el lado izquierdo del panel. Las proteínas de fusión con de Fc se incubaron con las células unida a la placa en columnas como se indica en la parte superior del panel. Después de la incubación, las células se lavaron, y las proteínas de fusión de Fc unidas se detectaron utilizando un anticuerpo anti-Fc humano y análisis ACAS (por "Adherent Cell Analys and Sorting"

20 Análisis de Clasificación de Células Adherentes; ACAS Ultima, Meridian Instruments, Inc., Okemos, MI). La Figura 6. Análisis FACS (por "Fluorescence-Activated Cell Sorter" Clasificador de Células Activadas por Fluorescencia) de la expresión del receptor para B7RP1 (supuestamente, CRP1) sobre células T CD4+ y CD8+ activadas. Se activaron esplenocitos de ratón con PMA e ionomicina durante 12 horas. La proteína de fusión B7RP1-Fc, la proteína Fc de control(Fc Simulado), o PBS (sin tinción), se incubaron con las

25 células, se lavaron y posteriormente se incubaron con anticuerpo de cabra anti-Fc humano conjugado con FITC (GaHuFc-FITC) como se indica en la parte inferior de cada panel. Los anticuerpos para marcadores celulares (para los marcadores de células T CD4 y CD8 conjugados con PE), o anticuerpo de control de isotipo (isotipo de rata) conjugado con PE, o PBS (sin tinción), se añadieron como se indica en el lado izquierdo de cada panel individual.

30 Figura 7. Análisis FACS (Clasificador de Células Activadas por Fluorescencia) de la expresión de B7RP1 sobre células B. Análisis fluorocitométrico de la expresión del ligando para CRP1 (presumiblemente, B7RP1) sobre esplenocitos de ratón. La proteína de fusión CRP1-Fc, la proteína Fc de control (Fc simulado), o PBS (sin tinción), se incubaron con las células, se lavaron y posteriormente se incubaron con anticuerpo de cabra anti-Fc humano conjugado con FITC (GaHuFc-FITC) como seindica en la parte inferior

35 de cada panel. El anticuerpo para el marcador celular conjugado con PE para CD45R (CD45R es un marcador de células B) o el anticuerpo de control de isotipo (isotipo de rata), o PBS (sin tinción), se añadieron como se indica en el lado izquierdo de cada panel individual. Figura 8. Análisis FACS de la expresión del ligando mCRP1 sobre macrófagos peritoneales. Las células peritoneales se distinguieron primero en subgrupos sobre la base de sus propiedades de dispersión de luz

40 (panel A). Los macrófagos se identificaron en la región 5 (R5) debido a su capacidad para dispersar fuertemente la luz hacia adelante (FSC) y hacia los lados (SSC) y debido a su tinción positiva para el antígeno F4/80, un marcador de macrófagos (panel B). Los macrófagos en la región 6 (R6) fueron destacados basándose en su tinción menos intensa para el antígeno F4/80 y se encontró que eran teñidos por la proteína de fusión CRP1-Fc (presumiblemente debido a su expresión de B7RP1).

45 Figura 9. Inhibición de la proliferación de células T utilizando una proteína de fusión B7RP1-Fc. Las células T de esplenocitos de ratón se activaron aumentando las concentraciones de concanavalina A (Con A) como se indica en la parte inferior del gráfico. Se añadieron proteínas de fusión mCRP1-Fc, mB7RP1, y mB7.2-Fc a células T enriquecidas de los esplenocitos en ausencia (sin adicionales) o presencia de Con A. Se utilizaron 200.000 en el análisis de proliferación de células T en una placa de 96 pocillos. Las células se

50 incubaron con medio (sin adiciones) o proteínas de fusión de Fc como se indica en la leyenda del gráfico. Después de 42 horas, las células se pulsaron con H-timidinadurante 6 horas, a continuación se cosecharon y se determinó la radiactividad incorporada. Se representan las CPM medias y la desviación típica de las muestras por triplicado. Figura 10. A) Ganglio linfático mesentérico normal del Ratón Núm. 10 de control que muestra el córtex, el

55 paracórtex y la médula del ganglio. Tinción con hematoxilina-eosina (H y E), 40x. B) ganglio linfático mesentérico notablemente agrandado de Ratón Núm. 40 WX11 con prominente hiperplasia folicular (FH), expansión del paracórtex e hiperplasia medular espinal (MH). H y E, 40x. C) Primer plano de los cordones medulares (MC) y senos (MS) del ganglio linfático mesentérico del Ratón Núm. 10 de control. Obsérvense los pequeños cordones medulares compuestos principalmente por linfocitos pequeños adyacentes a los

60 senos medulares con macrófagos carnosos. H y E, 400x. D. Primer plano de cordones medulares (MC) y senos (MS) del ganglio linfático mesentérico del Ratón Núm. 40 WX11. Obsérvense los cordones medulares marcadamente engrosados compuestos por un gran número de células plasmáticas con cuerpos de Russell ocasionales (flecha). H y E, 400x. E) Bazo normal del Ratón Núm. 10 de control, que muestra zonas de pulpa roja y pulpa blanca con vainas periarteriolares linfoides (PALS), 100x. Recuadro: primer plano de la zona marginal que rodea la pulpa blanca con pequeños linfocitos, macrófagos y células plasmáticas ocasionales, 400x. F) Bazo de Ratón Núm. 6 WX11 con zonas de pulpa blanca agrandadas, incluyendo PALS y folículos (flecha), 100x. Recuadro: primer plano de la zona marginal con numerosascélulas plasmáticas y cuerpos de Russell ocasionales, 400x. G) Íleon con placa de Peyer del Ratón Núm.

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5 25 de control con la zona interfolicular (flecha) flanqueada por dos folículos secundarios, 40x. H) Íleon con placa de Peyer de Ratón Núm. 32 WX11 con folículos marcadamente agrandados con centros germinales prominentes y tejidointerfolicular (flecha), 40x. Figura 11. A) Ganglio linfático mesentérico normal del Ratón Núm. 5 de control que muestra el córtex, el paracórtex y la médula del ganglio. Tinción con hematoxilina-eosina (H y E), aumento 40x. B) Ganglio

10 linfático mesentérico notablemente agrandado del Ratón Núm. 33 WX11 con prominente hiperplasia folicular (parte superior: filas de folículos secundarios en el córtex externo), expansión del paracórtex (centro) e hiperplasiamedular espinal (parte inferior). H y E, 40x. C) Tinción inmunohistoquímica del ganglio linfático mesentérico del Ratón Núm. 10 de control con el anticuerpo anti-B220 (marcador de células B). Obsérvese la zona cortical (color pardo) y los cordones medulares delgados intensamente teñidos.

15 Inmunotinción realizada utilizando el método de inmunoperoxidasa con complejo de avidina-biotina (ABC) (cromógeno DAB, tinción de contraste con hematoxilina), 40x. D) Tinción inmunohistoquímica del ganglio linfático mesentérico del Ratón Núm. 33 WX11 con el anticuerpo anti-B220. Obsérvense los folículos corticales y los cordones medulares intensamente teñidos (aunque las células plasmáticas maduras en los cordones son negativas para B220), 40x. E) Tinción inmunohistoquímica de los ganglios linfáticos del Ratón

20 Núm. 10 de control con el anticuerpo anti-CD3 (marcador de células T). Obsérvese la inmunotinción de la zona paracortical del ganglio, 40x. F) Tinción inmunohistoquímica del ganglio linfático del Ratón Núm. 33 WX11 con el anticuerpo anti-CD3. Obsérvense las zonas paracorticales intensamente teñidas agrandadas del ganglio, 40x. Figura 12. A) Estructura y secuencia de la región codificante de la proteína B7RP1 humana (hB7RP1). La

25 secuencia señal pronosticada de hB7RP1 está subrayada en el extremo amino terminal. Los sitios de escisión del péptido señal pronosticado están marcados con asteriscos. La secuencia transmembrana pronosticada está subrayada hacia el extremo carboxilo terminal. B) Alineamiento de aminoácidos de la supuesta proteína madura hB7RP1 conla proteína madura B7RP1 murina (mB7RP1). Figura 13. A) Estructura y secuencia de la región codificante de la proteína de CRP1 humana (hCRP1). La

30 secuencia señal pronosticada de hCRP1 está subrayada en el extremo amino terminal. Los sitios de escisión del péptido señal pronosticado están marcados con asteriscos. La secuencia transmembrana pronosticada está subrayada hacia el extremo carboxilo terminal. B) Alineamiento de aminoácidos de la proteína hCRP1 conla proteína CRP1 murina (mB7RP1). Figura 14. CRP1 se encuentra en las células T de memoria en reposo. Los esplenocitos en reposo de

35 ratones de 6-7 meses de edad fueron sometidos a tinción doble utilizando B7RP1-Fc marcada con un anticuerpo anti-Fc humano conjugado con FITC y un anticuerpo conjugado con PE contra cualquiera de CD44 (Fig. 14A), CD45RB (Fig. 14B), o CD69 (Fig. 14C). Figura 15. Co-estimulación de células T mediante proteína de fusión B7RP1-Fc. A) Proliferación de células T inducida por diferentes cantidades de B7RP1-Fc (cuadrados cerrados), B7.2-Fc (círculos cerrados), o

40 control de proteína de fusión OPG-Fc (cuadrados abiertos), junto con el anticuerpo anti-CD3. Las proteínas de fusión se utilizaron a diversas concentraciones para recubrir placas de 96 pocillos pre-recubiertas con FAb2 anti-Fc humano (12,5 µg/ml) y anticuerpo anti-CD3 (0,9 µg/ml). B7RP1-Fc y B7.2-Fc co-estimulan las células T de una manera dependiente de la dosis hasta 0,3 µg/ml, a la que se consigue el efecto máximo. B) Proliferación de células T inducida por B7RP1-Fc (cuadrados cerrados), B7.2-Fc (círculos cerrados), Fc

45 no fusionado (cuadrados abiertos), o sin Fc (círculos abiertos) junto con un anticuerpo anti-CD3 (0,85 µg/ml) y en presencia de diversas concentraciones de un anticuerpo policlonal de conejo anti-B7RP1-Fc. Las proteínas de fusión de Fc se utilizaron a una concentración de 0,3 µg/ml y se unieron a las placas como antes. El anticuerpo anti-B7RP1-Fc se obtuvo contra B7RP1-Fc purificada mediante inyecciones subcutáneas de antígeno emulsionado en coadyuvante, y a continuación se purificó por afinidad. Los

50 anticuerpos se incubaron durante 30 min con las proteínas de fusión de Fc antes de la adición de las células. El anticuerpo anti-B7RP1-Fc inhibe específicamente la proliferación de células T inducida por B7RP1-Fc de unamanera dependiente de la dosis. Figura 16. Efecto de las proteínas CRP1-Fc y B7RP1-Fc sobre la incidencia (A) y la gravedad (B) de la artritis inducida por colágeno en ratones. Los ratones B10.RIII susceptibles a la artritis inducida por

55 colágeno se inmunizaron en la base de la cola con 10 µg de colágeno porcino de tipo II en CFA. Los ratones recibieron 100 µg de proteína de fusión dos veces por semana. Las proteínas de fusión de Fc y el tratamiento con PBS de control se indican en la leyenda de la figura. Figura 17. Colon proximal en ratones transgénicos para B7RP1-Fc. (A) Colon proximal normal del Ratón Núm. 53F de control (hembra) que muestra la pared intestinal con la mucosa, submucosa, muscular y

60 serosa. Tinción con hematoxilina-eosina (H y E), aumento 40x. (B) Colon proximal difusamente engrosado de Ratón Núm. 111F transgénico para B7RP1-Fc con prominente hipertrofia glandular, ulceración fisurante e inflamación transmural. H y E, 40x. (C) Vista a menos aumentos del colon proximal (como en el panel B) del Ratón Núm. 111F transgénico para B7RP1-Fc con ulceración fisurante multifocal e inflamación transmural. H y E, 20x. (D) Primer plano de la úlcera fisurante y de las glándulas colónicas hipertróficas del Ratón Núm. 111F transgénico para B7RP1-Fc (mostradas en los paneles B y C más arriba). Obsérvese el lumen con exudado mucopurulento. H y E, 100x. (E) Primer plano de la inflamación granulomatosa en la submucosa del Ratón Núm. 112F transgénico para B7RP1-Fc con una célula gigante multinucleada rodeada de macrófagos, linfocitos y un menor número de neutrófilos. H y E, 400x. (F) Primer plano de la

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5 inflamacióngranulomatosaenlamucosadelRatónNúm. 112FtransgénicoparaB7RP1-Fcconmacrófagos epitelioides mezclados con linfocitos, células plasmáticas y un menor número de neutrófilos subyacentes a las glándulasmucosales . H y E, 400x. Figura 18. Colon distal en ratones transgénicos para B7RP1-Fc. (A) Colon distal normal del Ratón Núm. 53F de control (hembra) que muestra las capas de la pared intestinal con mucosa, submucosa, muscular y

10 serosa. Tinción con de hematoxilina-eosina (H y E), aumento 40x. (B) Colon distal difusamente engrosado de ratón Núm. 111F transgénico para B7RP1-Fc (hembra) con prominente hipertrofia e hiperplasia glandular y abscesos dispersos en las criptas. H y E, 40x. (C) Colon distal difusamente engrosado de Ratón Núm. 55M transgénico para B7RP1-Fc (macho) con prominente hipertrofia e hiperplasia glandular. H y E, 40x. (D) Colon distal difusamente engrosado de Ratón Núm. 112F transgénico para B7RP1-Fc (hembra)

15 con glándulas del colon hipertróficas, agregados linfoides focales y muchos abscesos en las criptas. H y E, 40x. (E) Tinción inmunohistoquímica del colon distal de Ratón Núm. 112F transgénico para B7RP1-Fc con anticuerpo anti-CD3 (marcador de células T). Obsérvese la inmunotinción de la mucosa superficial y la placa linfoide del colon. H y E, 40x. (F) Primer plano de la mucosa colónica de Ratón Núm. 112F transgénico para B7RP1-Fc con un absceso en la cripta (flecha) y el agregado linfoide compuesto de

20 células B220 + B (recuadro). H y E, 100x. Figura 19. Intestino delgado en ratones transgénicos para B7RP1-Fc. (A) Duodeno normal del Ratón Núm. 53F de control (hembra) que muestra el lumen, las vellosidades y las criptas de la mucosa y la submucosa, la muscular y la serosa subyacentes. Tinción con Hematoxilina-eosina (H y E), aumento 40x. (B) Duodeno difusamente engrosado de Ratón Núm. 51F transgénico para B7RP1-Fc (hembra) con prominente

25 hipertrofia e hiperplasia de las criptas e infiltrado linfoplasmacítico leve en la lámina propia. H y E, 40x. (C) Yeyuno normal del Ratón Núm. 53F de control (hembra) quemuestra la longitud normal de las vellosidades y las criptas de la mucosa yeyunal. H y E, aumento 40x. (D) Mucosa yeyunal notablemente engrosada de Ratón Núm. 51F transgénico para B7RP1-Fc (hembra) con hipertrofia e hiperplasia de las criptaslocalmente extensa. H y E, 40x. (E) Íleon normal del Ratón Núm. 53F de control (hembra) que muestra la

30 longitud normal de las vellosidades y las criptas de la mucosa ileal. H y E, aumento 40x. (F) Atrofia leve de la mucosa ileal de Ratón Núm. 231M transgénico para B7RP1-Fc (macho) con pérdida focal y acortamiento de las vellosidades. H y E, 40x. Figura 20. La proteína de fusión B7RP1-Fc inhibe el crecimiento tumoral en ratones. Se implantaron por vía intradérmica células de sarcoma Meth A en el abdomen de ratones Balb/C. Los días 7, 10, 14 y 17,

35 después de la implantación, los ratones fueron tratados con vehículo (diamantes oscuros) o B7RP1-Fc murina (triángulos grises, Ejemplo 7). El volumen del tumor se midió, como se describe en el Ejemplo 20, los días indicados después de la implantación. El crecimiento del tumor se controló hasta el día 28. Cada grupo tenía ocho ratones. Figura 21. Co-estimulación de células T mediante B7RP1-Fc humana. Se utilizaron anti-CD3 y B7RP1 Fc

40 humana para revestir placas de 96 pocillos, y se cultivaron 1 x 105 células T/pocillo (> 98% CD3+) y se recogieron como se describe en el Ejemplo 21. A) Co-estimulación inducida por anti-CD3 solo (círculos cerrados), B7RP1 Fc de 0,5 µg/ml (triángulos cerrados), OPG-Fc de 0,5 µg/ml (círculos abiertos), y anti-CD28 de 5 µg/ml (triángulos abiertos) a diferentes concentraciones de estimulación primaria con anti-CD3. Los datos muestran que B7RP1-Fc co-estimuló las células T cebadas con anti-CD3 a niveles similares a la

45 co-estimulación utilizando anticuerpos anti-CD28. Los datos mostrados son la [3H]TdR media incorporada +/-DT de pocillos triplicados de un experimento representativo de varios experimentos generados con células T aisladas de tres donantes normales. B) Inhibición dependiente de la dosis de la co-estimulación con B7RP1-Fc por CRP1-Fc. Las células T se cultivaron en pocillos recubiertos con anti-CD3 a 0,3 µg/ml y con B7RP1-Fc a 0,5 µg/ml. Se preincubaron concentraciones diluidas seriadamente de CRP1-Fc (círculos

50 cerrados) u OPG-Fc (círculos abiertos) con B7RP1-Fc durante 30 min antes de la adición de células T. Los datos muestran que CRP1-Fc inhibe la co-estimulación inducida por B7RP1 de una manera dependiente de la dosis. El porcentaje de inhibición se traza frente a la concentración de proteína CRP1-Fc u OPG-Fc. Los datos mostrados son la [3H]TdR media incorporada +/-DT de tres experimentos realizados en pocillos por triplicado y son representativos de experimentos generados con dos donantes normales. C) Co

55 estimulación por células CHO B7RP1 humanas. Las células T se purificaron a partir de sangre periférica y se cultivaron con diversas concentraciones de anti-CD3 en presencia de anti-CD3 solo (círculos cerrados), 1 x 104 células de control de vector CHO (círculos abiertos) o 1 x 104 células CHO B7RP1 (triángulos cerrados), como se describe en el Ejemplo 22. Los datos muestran que B7RP1 unida a la membrana coestimuló el crecimiento de las células T a un nivel similar al observado utilizando proteínas de fusión

60 B7RP1-Fc. Los datos mostrados son la media +/-DT de cultivos por triplicado y son representativos de los resultados obtenidos con dos donantes normales. D) Producción de citoquinas. Las células T se cultivaron como se describe en la (Figura 21A) y los sobrenadantes se recogieron a las 48 (barras de color negro) y 72 (barra de color gris) hrs. Los datos muestran que la cantidad de IL-2 producida por las células coestimuladas con B7RP1-Fc (gráfico superior) fue similar a la producida por las células estimuladas por anti

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CD3 y Fc de control, pero significativamente menor que la producida por las células co-estimuladas con anti-CD28. Los datos también muestran que la co-estimulación con B7RP1-Fc potenció la producción de IL10 (gráfico intermedio) eIFN-gamma (gráfico inferior). La Figura 22muestra los niveles de IgE en ratones transgénicos de control y B7RP1.

5 La Figura 23 muestra los efectos combinados de B7RP1-Fc y B7.2-Fc sobre la hipersensibilidad crónica. Los ratones fueron sensibilizados con oxazolona como se describe en el Ejemplo 24. Se administraron B7RP1-Fc, B7.2-Fc, B7RP1-Fc + B7.2-Fc, y Fc a dosis alta (2 o 1 + 1 mg/Kg, A) y baja (0,4 o 0,2 + 0,2 mg/Kg, B) aproximadamente en el momento de la sensibilización. A, En comparación con Fc, B7RP1-Fc B7.2-Fc, y B7RP1-Fc + B7.2-Fc aumentaron ΔET desde el día 3 (p <0,001). B7RP1-Fc y B7RP1-Fc + B7.2

10 Fc aumentaron ΔET más que B7.2-Fc desde el día 4 (p <0,001). B7RP1-Fc + B7.2-Fc aumentó ΔET más que B7RP1-Fc desde el día 4 (p <0,001). B, En comparación con Fc, B7RP1-Fc y B7RP1-Fc + B7.2-Fc aumentaron ΔET desde el día 4 (p <0,001). B7RP1-Fc y B7RP1-Fc + B7.2-Fc aumentaron ΔET más que B7.2-Fc (p <0,001).

15 Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona las siguientes realizaciones definidas en los puntos 1-4:

1. Un antagonista de B7RP1 para su uso en la disminución de la producción de IgE en un paciente que

20 padece una respuesta alérgica que comprende administrar el antagonista en una cantidad eficaz para disminuir la producción de IgE, en donde el antagonista es un anticuerpo que se une a B7RP1 e inhibe parcialmente o completamentela producción de IgE.

2. El antagonista del punto 1 para su uso de acuerdo con el punto 1, en donde el método comprende adicionalmente la administración de un antagonista de IgE, en donde el antagonista de IgE es un

25 anticuerpo anti-IgE o fragmento del mismo, un receptor FCεRI soluble o un fragmento del mismo, un anticuerpo anti-FCεRI o un fragmento del mismo, variantes de IgE o fragmentos de las mismas, péptidos de unión a IgE, péptidos de unión a FCεRI, o moléculas pequeñas capaces de unirse a IgE o competir con IgE por la unión al receptor FCεRI.

3. El uso de un antagonista de B7RP1 para la preparación de un medicamento para disminuir la producción

30 de IgE en un paciente que padece una respuesta alérgica, que comprende administrar el antagonista en una cantidad eficaz para disminuir la producción de IgE, en donde el antagonista es un anticuerpo que se une a B7RP1 e inhibe parcialmente o completamente la producción deIgE.

4. El uso del punto 3, que comprende adicionalmente la administración de un antagonista de IgE, en donde el antagonista de IgE es un anticuerpo anti-IgE o fragmento del mismo, un receptor FCεRI soluble o un

35 fragmento del mismo, un anticuerpo anti-FCεRI o un fragmento del mismo, variantes de IgE o fragmentos de las mismas, péptidos de unión a IgE, péptidos de unión a FCεRI, o moléculas pequeñas capaces de unirse a IgE o competir con IgE por la unión al receptor FCεRI.

También se describen en la presente memoria polipéptidos denominados en la presente memoria CRP1 y B7RP1,

40 que comprenden un par receptor-ligando que está implicado en la activación de las células T. Los ADNc que codifican los polipéptidos se identificaron a partir de una biblioteca preparada a partir de células intraepiteliales intestinales de ratón y se seleccionaron basándose en la homología con los polipéptidos CD28 y CTLA-4 (para CRP1) o los polipéptidos B7.1 y B7.2 (para B7RP1).

45 Se pronostica que la proteína-1 relacionada con CD28, o CRP1, sea una proteína transmembrana de tipo I con una secuencia señal y un dominio extracelular en el amino-terminal, un dominio transmembrana, y un dominio intracelular extremo carboxilo terminal (Figura 1). La proteína CRP1 completa tiene 180 aminoácidos en su forma madura. La secuencia líder pronosticada abarca aproximadamente los residuos de aminoácido 1-20 (con respecto a la metionina de inicio) y el dominio extracelular de la proteína madura incluye aproximadamente los residuos 21 a

50 145 (Ejemplo 1). El dominio transmembrana pronosticado abarca aproximadamente los residuos 146 a 163 y el dominio intracelular incluye aproximadamente los residuos 164-200. El dominio extracelular extremo amino terminal es similar a un bucle de Ig con supuestas cisteínas de unión intra-e inter-moleculares conservadas. Por otra parte, también está parcialmente conservado un motivo "MYPPPY", que se sabía previamente que era importante para la unión de B7.1 y B7.2 a CD28 y CTLA-4.

55 CD28 y CTLA-4 son débilmente homólogos como se ilustra por la identidad de aminoácidos de 26% entre CD28 y CTLA-4 murinos. Existe una identidad de aminoácidos de 19% de CRP1 con CD28 murino y una identidad de 14% de CRP1 con CTLA-4 murino. Sin embargo, los residuos de cisteína críticos están conservados entre CD28, CTLA-4 y CRP1 murinos en los residuos 42, 63, 83, 109, y 137 (con respecto a la metionina de inicio en la proteína CRP1,

60 Véase la Figura 1A). Las longitudes y localizaciones aproximadas de la proteína madura de la región transmembrana con respecto al extremo carboxiloterminal también son similares en CRP1, CD28 y CTLA-4.

La CRP1 humana es una proteína transmembrana que tiene la secuencia de nucleótidos y aminoácidos mostrada en la Figura 13A. La secuencia líder pronosticada abarca aproximadamente los residuos 1-19 o aproximadamente los

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5 aproximadamente los residuos 162-199. La proteína CRP1 humana tiene una identidad de 69% con la proteína murina y las correspondientes secuencias de nucleótidos son idénticas en 77%. La secuencia de CRP1 humana fue referida por Hutloff et al. en Nature 397, 263-266 (1999).

Se pronostica que la proteína-1 relacionada con B7, o B7RP1, es una proteína transmembrana de tipo I con una

10 secuencia señal y un dominio extracelular en el extremo amino terminal, un dominio transmembrana, y un dominio intracelular carboxilo terminal (Figura 2A). La proteína B7RP1 completa tiene 276 aminoácidos en su forma madura. La secuencia líder pronosticada abarca aproximadamente los residuos de aminoácido 1-46 (con respecto a la metionina de inicio) y el dominio extracelular de la proteína madura incluye los residuos 47 a 279 (Ejemplo 3). El dominio transmembrana pronosticado abarca los residuos 280 a 298 y el dominio intracelular incluye los residuos

15 299-322. De un modo similar a B7.1 y B7.2, el dominio extracelular de B7RP1 comprende dos bucles de Ig.

B7.1 y B7.2 son débilmente homólogas como lo demuestra la identidad de aminoácidos de 24% entre B7.1 y B7.2 murinas. Existe una identidad de aminoácidos de 20% de B7RP1 con B7.1 murina y una identidad de 19% de B7RP1 con B7.2 murina. Sin embargo, los residuos de cisteína críticos están conservados entre B7.1, B7.2 y B7RP1

20 murinas en los residuos 62, 138, 185, y 242 (con respecto a la metionina de inicio en la proteína B7RP1, Figura 2A). La longitud y la localización aproximadas de la región transmembrana de la proteína madura con respecto al extremo carboxi terminal también son similares en mB7RP1, B7.1, y B7.2.

La B7RP1 humana es también una proteína transmembrana con residuos de cisteína conservados en el dominio

25 extracelular que son necesarios para las estructuras de bucle de Ig. La secuencia líder pronosticada incluye aproximadamente los residuos 1-18, 1-19, 1-20, 1-21, 1-23 o 1-27 como se muestra en la Figura 3A. El extremo amino terminal maduro pronosticado puede estar en cualquiera de los residuos 19, 20, 21, 22, 24 o 28. Preferiblemente, el extremo amino terminal está en la posición 19. El dominio extracelular incluye desde cualquiera de los extremos amino terminales maduros hasta aproximadamente el residuo de aminoácido 259. El dominio

30 transmembrana pronosticado abarca aproximadamente los residuos 259-274. El dominio intracelular incluye los residuos 275-302. La secuencia de nucleótidos y de aminoácidos de B7RP1 humana completa se muestra en la Figura 12A. La B7RP1 humana es idéntica en aproximadamente 43% a la proteína murina.

CRP1 y B7RP1 se unen cada uno entre sí, pero CRP1 no se une de forma detectable a la proteína B7.2 relacionada

35 con B7RP1; y B7RP1 no presenta unión detectable a CD28 o CTLA-4 relacionados con CRP1 (Ejemplo 8). Se demostró que B7RP1 regula la proliferación de células T, presumiblemente a través de la interacción de B7RP1 con los receptores de CRP1 (Ejemplo 11). Por lo tanto, CRP1 y B7RP1 representan una ruta novedosa para la regulación de la proliferación yla activación de células T.

40 La interacción de B7RP1 con CRP1 se puede regular de tal manera que se puedan aumentar o disminuir la coestimulación inmunitaria y la proliferación y la activación de células T. A modo de ejemplo, anticuerpos monoclonales y policlonales anti-B7RP1 originados contra B7RP1 murina bloquearon la interacción B7RP1/CRP1 y también bloquearon la proliferación de células T inducida por una proteína de fusión B7RP1-Fc (véase el Ejemplo 17). Una proteína de fusión CRP1-Fc humana bloqueó la proliferación de células T humanas inducida por B7RP1-Fc

45 humana (Ejemplo 21). Además, la adición de una proteína de fusión CRP1-Fc retrasó la aparición de los síntomas artríticos en un modelo de ratón de artritis reumatoide (véase el Ejemplo 18). La co-estimulación con B7RP1/CRP1 también se puede aumentar mediante la adición de una proteína de fusión B7RP1-Fc u otros activadores de esta ruta (Ejemplo 20).

50 Moléculas de ácido nucleico

El término "molécula de ácido nucleico aislada" se refiere a una molécula de ácido nucleico que está libre de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que está asociada naturalmente, y preferiblemente sustancialmente libre de otras moléculas de ácido nucleico de mamíferos contaminantes cualesquiera.

55 El término "variante alélica" se refiere a una de varias formas alternativas posibles de origen natural de un gen que ocupa un locus dado en un cromosoma de un organismo.

El término "variante de empalme" se refiere a una molécula de ácido nucleico, normalmente ARN, que se genera por 60 procesamientoalternativodesecuenciasdeintronesenuntranscritodeARN.

El término "condiciones de alta rigurosidad" se refiere a aquellas condiciones que: (1) emplean baja fuerza iónica y alta temperatura para el lavado, por ejemplo, 0,1 X SSC (NaCl 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M) NaDodSO4 (SDS) al 0,1% a 50°C, o (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante tal como formamida, por ejemplo,

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formamida al 50% (vol/vol) con albúmina de suero bovino al 0,1%/Ficoll al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con 5 X SSC (NaCl 750 mM, citrato de sodio 75 mM) a 42°C. Otro ejemplo de condiciones de alta rigurosidad es formamida al 50%, 5 x SSC, fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sodio al 0,1%, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sometido a sonicación (50 µg/ml), SDS al 0,1%, y sulfato de dextrano al 10% a 42°C, conlavados a 42°C en 0,2 x SSC y SDS al 0,1%.

El término "condiciones de rigurosidad moderada" se refiere a aquellas condiciones que incluyen el uso de una disolución de lavado y condiciones de hibridación (p. ej., temperatura y fuerza iónica) menos rigurosas que las que se han descrito anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas son condiciones tales como la incubación durante la noche a 37°C en una disolución que comprende: formamida al 20%, 5 x SSC, fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10%, y ADN de esperma de salmón sometido a cizalla desnaturalizado de 20 µl/ml, seguido de lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50°C. El experto en la técnica reconocerá cómo ajustar la temperatura, la fuerza iónica y otros parámetros según sea necesario para acomodar factores tales comolongitud dela sonda y similares.

Los métodos de tecnología de ADN recombinante se exponen en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989)) y/o Ausubel et al., Eds., (Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. yWiley and Sons, NY (1994)).

Adicionalmente se describen en la presente memoria moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican los polipéptidos CRP1 y B7RP1. También se proporcionan moléculas de ácido nucleico que son fragmentos, variantes alélicas, variantes de empalme, o tienen secuencias complementarias a las de las moléculas que codifican los polipéptidos CRP1 y B7RP1. También están incluidas moléculas de ácido nucleico que son al menos aproximadamente 70% idénticas a lasmoléculas que codifican CRP1 o B7RP1 o que hibridan con lasmoléculas que codifican CRP1 o B7RP1 en condiciones de rigurosidad moderada o alta. Las moléculas de ácido nucleico pueden ser ADNc, ADN genómico, ARN o una molécula de ácido nucleico parcialmente o totalmente sintética. En realizaciones preferidas, las moléculas de ácido nucleico son idénticas en al menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90% o 95% a las moléculas de ácido nucleico que codifican CRP1 o B7RP1.

Un gen o un ADNc que codifica un polipéptido CRP1 o B7RP1 o un fragmento del mismo se pueden obtener, por ejemplo, mediante el escrutinio de hibridación o amplificación por PCR de una biblioteca genómica o de ADNc. Las sondas o cebadores útiles para el escrutinio de la biblioteca se pueden generar basándose en la información de la secuencia para otros genes o fragmentos de genes conocidos de la misma familia de genes o de una familia relacionada, por ejemplo, motivos conservados encontrados en polipéptidos relacionados con CRP1 o B7RP1 tales como una matriz conservada de residuos de cisteína. Además, cuando un gen que codifica un polipéptido CRP1 o B7RP1 ha sido identificado a partir de una especie, todo o una porción de ese gen pueden ser utilizados como sonda para identificar genes homólogos de otras especies. Las sondas o los cebadores se pueden utilizar para escrutar bibliotecas de ADNc de diversasfuentes de tejidos que se cree que expresan el gen de CRP1 o B7RP1.

Cuando se utilizan sondas oligonucleotídicas para escrutar bibliotecas de ADNc o genómicas, se puede utilizar una de las siguientes dos disoluciones de alta rigurosidad. La primera de estas es 6 X SSC con pirofosfato de sodio al 0,05% a 35°C-62°C, dependiendo la temperatura de la longitud de la sonda oligonucleotídica. Por ejemplo, las sondas de 14 pares de bases se lavan a 35-40°C, las sondas de 17 pares de bases se lavan a 45-50°C, las sondas de 20 pares de bases se lavan a 52-57°C y las sondas de 23 pares de bases se lavan a 57-63°C. La temperatura se puede aumentar 2-3°C, cuando la unión no específica del fondo parece elevada. Una segunda disolución de alta rigurosidad utiliza cloruro de tetrametilamonio (TMAC) para lavar las sondas oligonucleotídicas. Una disolución de lavado rigurosa es TMAC 3 M, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, y SDS al 0,2%. La temperatura de lavado utilizando esta disolución es una función de la longitud de la sonda. Por ejemplo, una sonda de 17 pares de bases se lava a aproximadamente 45-50°C.

Otro medio para preparar un gen que codifica un polipéptido CRP1 o B7RP1 o un fragmento del mismo consiste emplear la síntesis química utilizando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica tales comolos descritos por Engels et al. (Agnew. Chem. Intl. Ed., 28: 716-734 (1989)). Estos métodos incluyen, entre otros, los métodos del fosfotriéster, la fosforamidita, y de H-fosfonato para la síntesis de ácido nucleico. Un método preferido para dicha síntesis química es la síntesis soportada en polímero utilizando la química convencional de la fosforamidita. Típicamente, el ADN que codifica un polipéptido CRP1 o B7RP1 tendrá varios cientos de nucleótidos de longitud. Los ácidos nucleicos de más de aproximadamente 100 nucleótidos se pueden sintetizar en forma de varios fragmentos utilizando estos métodos. Los fragmentos se pueden ligar a continuación entre sí para formar un polipéptido CRP1 o B7RP1 completo. Por lo general, el fragmento de ADN que codifica el extremo amino terminal del polipéptido tendrá un ATG, que codifica un residuo demetionina. Esta metionina puede estar presente o no en la forma madura de un polipéptido CRP1 o B7RP1, dependiendo de si el polipéptido producido en la célula anfitriona está diseñado para ser secretado desde esa célula.

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Las moléculas, fragmentos y/o derivados de ácido nucleico de CRP1 o B7RP1 que no codifican por sí mismos polipéptidos que son biológicamente activos puede no obstante ser útiles como sondas de hibridación en análisis de diagnóstico para someter a ensayo, ya sea cualitativa o cuantitativamente, la presencia de ADN o ARN correspondiente de CRP1 o B7RP1 en muestras de tejidos ode líquido corporal demamífero.

5 En algunos casos, puede ser deseable preparar ácido nucleico y/o variantes de aminoácidos de polipéptidos o de CRP1 o B7RP1 de origen natural. Las variantes de ácido nucleico se pueden producir utilizando mutagénesis dirigida al sitio, amplificación por PCR, u otros métodos apropiados, donde el cebador o los cebadores tienen las mutaciones puntuales deseadas (véanse Sambrook et al., más arriba, y Ausubel et al., más arriba, para las

10 descripciones de las técnicas de mutagénesis). La síntesis química utilizando los métodos descritos por Engels et al., más arriba, también se pueden utilizar para preparar tales variantes. También se pueden utilizar otros métodos conocidos por el experto en la técnica.

Las variantes de ácido nucleico preferidas incluyen aquellas que contienen codones que han sido alterados para la

15 expresión óptima de los polipéptidos CRP1 y B7RP1 en una célula anfitriona dada. Las alteraciones de codones concretas dependerán de la selección de la proteína y la célula anfitriona. Tal "optimización de codones" puede en un caso, llevarse a cabo mediante la selección de codones que se utilizan preferentemente en genes altamente expresados en una célula anfitriona dada. Se pueden utilizar algoritmos informáticos que incorporan tablas de frecuencia de codones tales como "Ecohigh. Cod" para la preferencia de codones de genes bacterianos altamente

20 expresados y son proporcionados por University of Wisconsin Package versión 9.0, Genetics Computer Group, Madison, WI. Otras tablas de frecuencia de codones útiles incluyen "Celegans_high.cod", "Celegans_low.cod", "Drosophila_high.cod", "Human_high.cod", "Maize_high.cod", y "Yeast_high.cod". Otras variantes preferidas son aquellas que codifican cambios conservativos de aminoácidos como se describe a continuación (p. ej., en donde la carga o polaridad de la cadena lateral de aminoácido de origen natural no resulta alterada sustancialmente por la

25 sustitución por un aminoácido diferente) en comparación con el tipo salvaje, y/o aquellas diseñadas para generar uno o varios sitios de glicosilación y/o fosforilación novedosos, o aquellas diseñadas para eliminar uno o varios sitios de glicosilación y/o fosforilación existente.

El gen, ADNc, o el fragmento del mismo que codifican un polipéptido CRP1 o B7RP1 se pueden insertar en un

30 vector de expresión o amplificación apropiado utilizando técnicas de ligación convencionales. El vector se selecciona típicamente para que sea funcional en la célula anfitriona concreta empleada (es decir, el vector es compatible con la maquinaria de la célula anfitriona de tal manera que se puede producir la amplificación del gen y/o la expresión del gen). El gen, ADNc o fragmento del mismo que codifican el polipéptido CRP1 o B7RP1 se pueden amplificar/expresar en células anfitrionas procariotas, de levadura, de insecto (sistemas de baculovirus) y/o

35 eucariotas. La selección de la célula anfitriona dependerá en parte de si el polipéptido CRP1 o B7RP1 o fragmento del mismo se van a glicosilar y/o fosforilar. Si es así, se prefieren células anfitrionas de levadura, insecto, o mamífero.

Típicamente, los vectores de expresión utilizados en cualquiera de las células anfitrionas contendrán secuencias

40 para el mantenimiento del plásmido y la clonación y la expresión de las secuencias de nucleótidos insertadas. Dichas secuencias, que son referidas colectivamente como "secuencias flanqueantes", incluirán un promotor y otros elementos reguladores tales como uno o varios potenciadores, un origen del elemento de replicación, un elemento de terminación transcripcional, una secuencia intrónica completa que contiene un sitio donador y aceptor de empalme, una secuencia de péptido señal, un elemento del sitio de unión al ribosoma, una secuencia de

45 poliadenilación, una región poliligadora para insertar el ácido nucleico que codifica el polipéptido que se va a expresar, y un elemento marcador seleccionable. Cada uno de estos elementos se comenta a continuación. Opcionalmente, el vector puede contener una secuencia "etiqueta", es decir, una molécula de oligonucleótido localizada en el extremo 5' o 3' de una secuencia codificante del polipéptido CRP1 o B7RP1; la molécula de oligonucleótido codifica poliHis (tal como hexaHis), u otra "etiqueta", tal como FLAG, HA (hemaglutinina del virus

50 Influenza) o myc para las que existen anticuerpos disponibles en el mercado. Esta etiqueta se fusiona típicamente al polipéptido tras la expresión del polipéptido, y puede servir como medio para la purificación por afinidad de un polipéptido CRP1 o B7RP1 de la célula anfitriona. La purificación por afinidad puede lograrse, por ejemplo, mediante cromatografía en columna utilizando anticuerpos contra la etiqueta como una matriz de afinidad. Opcionalmente, la etiqueta se puede eliminar con posterioridad de un polipéptido CRP1 o B7RP1 purificada mediante diversos medios

55 tales como el uso de ciertas peptidasas.

La bisagra y la región Fc de inmunoglobulina humana pueden ser fusionadas en el extremo N-terminal o C-terminal de un polipéptido CRP1 o B7RP1 por un experto en la técnica. La subsiguiente proteína de fusión de Fc se puede purificar mediante el uso de una columna de afinidad de Proteína A. Se sabe que una región Fc de inmunoglobulina

60 muestra una vida media farmacocinética prolongada in vivo y se ha encontrado que las proteínas fusionadas a una región Fc muestran una vida media in vivo sustancialmente mayor en comparación con la contraparte no fusionada. Asimismo, la fusión a la región Fc permite la dimerización y/o multimerización de la molécula que puede ser útil para la bioactividad de algunas moléculas.

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La secuencia flanqueante puede ser homóloga (es decir, de la misma especie y/o cepa que la célula anfitriona), heteróloga (es decir, de una especie distinta de la especie o cepa de la célula anfitriona), híbrida (es decir, una combinación de secuencias flanqueantes de más de una fuente), sintética, o puede ser la secuencia flanqueante de ácido nucleico de CRP1 o B7RP1 nativa. Como tal, la fuente de la secuencia flanqueante puede ser cualquier

5 organismo procariótico o eucariótico unicelular, cualquier organismo vertebrado o invertebrado, o cualquier planta, siempre que la secuencia flanqueante sea funcional en, y pueda ser activada por, la maquinaria de la célula anfitriona.

Las secuencias flanqueantes útiles en los vectores se pueden obtener mediante cualquiera de varios métodos bien

10 conocidos en la técnica. Típicamente, las secuencias flanqueantes útiles en la presente memoria distintas de la secuencia flanqueante de ácido nucleico de CRP1 o B7RP1se habrán identificado previamentemediantemapeo y/o mediante digestión con endonucleasas de restricción y por lo tanto pueden ser aisladas de la fuente tisular apropiada utilizando las endonucleasas de restricción apropiadas. En algunos casos, la secuencia de nucleótidos completa de la secuencia flanqueante puede ser conocida. Aquí, la secuencia flanqueante se puede sintetizar

15 utilizandolosmétodosdescritosanteriormenteparalasíntesisolaclonacióndeácidonucleico.

Cuando toda o solo una porción de la secuencia flanqueante es conocida, ésta se puede obtener utilizando PCR y/o mediante el escrutinio de una biblioteca genómica con el oligonucleótido adecuado y/o fragmentos de secuencia flanqueantes de la misma u otra especie.

20 Cuando la secuencia flanqueante no es conocida, se puede aislar un fragmento de ADN que contiene una secuencia flanqueante de un pedazo más grande de ADN que puede contener, por ejemplo, una secuencia codificante o incluso otro gen o genes. El aislamiento puede llevarse a cabo mediante digestión con endonucleasas de restricción utilizando una o más enzimas seleccionadas cuidadosamente para aislar el fragmento de ADN apropiado. Después

25 de la digestión, se puede aislar el fragmento deseado mediante purificación en gel de agarosa, columna Qiagen® u otros métodos conocidos por el experto en la técnica. La selección de enzimas adecuadas para lograr este propósito será fácilmente evidente para un experto normal en la técnica.

El origen del elemento de replicación es típicamente una parte de los vectores de expresión procarióticos adquiridos

30 comercialmente, y ayuda a la amplificación del vector en una célula anfitriona. La amplificación del vector hasta un cierto número de copias puede, en algunos casos, ser importante para la expresión óptima del polipéptido CRP1 o B7RP1. Si el vector de elección no contiene un origen del sitio de replicación, se puede sintetizar químicamente basándose en una secuencia conocida, y ligar en el vector.

35 El elemento de terminación de la transcripción se localiza típicamente 3' con respecto al extremo de una secuencia codificante del polipéptido CRP1 o B7RP1 y sirve para terminar la transcripción de un polipéptido B7RP1 o CRP1. Por lo general, el elemento de terminación de la transcripción en células procarióticas es un fragmento rico en G-C seguido por una secuencia poli T. Si bien el elemento se clona fácilmente a partir de una biblioteca o incluso se adquiere comercialmente como parte de un vector, también se puede sintetizar fácilmente utilizando métodos para la

40 síntesis de ácido nucleico tales como los descritos anteriormente.

Un elemento del gen marcador seleccionable codifica una proteína necesaria para la supervivencia y el crecimiento de una célula anfitriona cultivada en un medio de cultivo selectivo. Los genes marcadores de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, p. ej., ampicilina, tetraciclina, o

45 kanamicina para células anfitrionas procarióticas, (b) complementan deficiencias auxotróficas de la célula; o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles en medios complejos. Los marcadores seleccionables preferidos son el gen de resistencia ala kanamicina, el gen deresistencia a laampicilina, y el gen de resistencia a la tetraciclina.

El elemento de unión al ribosoma, comúnmente denominado secuencia de Shine-Dalgarno (procariotas) o secuencia

50 Kozak (eucariotas), normalmente es necesario para la iniciación de la traducción de ARNm. El elemento se localiza típicamente 3' con respecto al promotor y 5' con respecto a la secuencia codificante del polipéptido CRP1 o B7RP1 que va a ser sintetizado. La secuencia de Shine-Dalgarno es variada pero es típicamente una polipurina (es decir, tiene un alto contenido en A-G). Se han identificado muchas secuencias de Shine-Dalgarno, cada una de las cuales puede sintetizarse fácilmente utilizando métodos expuestos anteriormente y utilizada en un vector procariótico.

55 En aquellos casos en los que es deseable que un polipéptido CRP1 o B7RP1 sea secretado desde la célula anfitriona, se puede utilizar una secuencia señal para la exportación directa del polipéptido desde la célula anfitriona. Un dominio transmembrana CRP1 o B7RP1 también es inactivado por mutación o deleción para impedir el anclaje a la membrana del anfitrión. Típicamente, la secuencia señal está posicionada en la región codificante de un gen o

60 ADNc de CRP1 o B7RP1, o directamente en el extremo 5' de una región codificante del gen de CRP1 o B7RP1. Se han identificado muchas secuencias señal, y cualquiera de ellas que sea funcional en la célula anfitriona seleccionada se puede utilizar junto con un gen o ADNc de CRP1 o B7RP1. Por lo tanto, la secuencia señal puede ser homóloga o heteróloga para un gen o ADNc de CRP1 B7RP1, y puede ser homóloga o heteróloga para un gen o ADNc de los polipéptidos CRP1 o B7RP1. Adicionalmente, la secuencia señal puede ser sintetizada químicamente utilizando losmétodos expuestos anteriormente.

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En la mayoría de los casos, la secreción del polipéptido a partir de la célula anfitriona a través de la presencia de un 5 péptidoseñaldarácomoresultadolaeliminacióndelametioninaaminoterminaldelpolipéptido.

En muchos casos, la transcripción de un gen o ADNc de CRP1 o B7RP1 se incrementa por la presencia de uno o más intrones en el vector; esto se verifica particularmente cuando un polipéptido CRP1 o B7RP1 se produce en células anfitrionas eucarióticas, especialmente células anfitrionas demamífero. Los intrones utilizados pueden ser de 10 origen natural dentro de un gen de CRP1 o B7RP1, especialmente cuando el gen utilizado es una secuencia genómica completa o un fragmento de la misma. Cuando el intrón no es de origen natural dentro del gen (como para la mayoría de los ADNc), el intrón o los intrones se pueden obtener de otra fuente. La posición del intrón con respecto a la secuencia flanqueante 5' y un gen de CRP1 o B7RP1 es generalmente importante, ya que el intrón debe ser transcrito para que sea eficaz. Como tal, cuando un gen de CRP1 o B7RP1 insertado en el vector de 15 expresión es una molécula de ADNc, la posición preferida para el intrón es 3' con respecto al sitio de inicio de la transcripción, y 5' con respecto a la secuencia de terminación de la transcripción poliA. Preferiblemente, el intrón o los intrones se localizarán en un lado o el otro (es decir, 5' o 3') del ADNc de tal manera que no interrumpan la secuencia codificante. Cualquier intrón de cualquier fuente, incluyendo cualquier organismo viral, procariota y eucariota (planta o animal), se puede utilizar para poner en práctica esta invención, siempre que sea compatible con

20 la célula o células anfitrionas en las cuales es insertado. También se incluyen en la presente memoria los intrones sintéticos. Opcionalmente, se puede utilizar más de unintrónen el vector.

Cuando uno o más de los elementos expuestos anteriormente no están ya presentes en el vector que se va a utilizar, se pueden obtener individualmente y ligar en el vector. Los métodos utilizados para la obtención de cada uno

25 de los elementos son bien conocidos por el experto en la técnica.

Los vectores preferidos son aquellos que son compatibles con células anfitrionas bacterianas, de insecto, y de mamífero. Tales vectores incluyen, entre otros, pCRII, pCR3, y pcDNA3.1 (Invitrogen Company, San Diego, CA), pBSII (Stratagene Company, La Jolla, CA), pET15b (Novagen, Madison, WI), pGEX (Pharmacia Biotech,

30 Piscataway, NJ), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, CA), pETL (BlueBacII; Invitrogen), y pFastBacDual (Gibco/BRL, Grand Island, NY).

Después de que el vector ha sido construido y se ha insertado una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido CRP1 o B7RP1 completo o truncado en el sitio apropiado del vector, el vector completado se puede

35 insertarenunacélulaanfitrionaadecuadaparalaamplificacióny/oexpresióndelpolipéptido.

Las células anfitrionas pueden ser células anfitrionas procarióticas (tales como E. Coli) o células anfitrionas eucarióticas (tales como una célula de levadura, una célula de insecto, o una célula de vertebrado). La célula anfitriona, cuando se cultiva en condiciones apropiadas, puede sintetizar un polipéptido CRP1 o B7RP1 que puede

40 recogerse posteriormente del medio de cultivo (si la célula anfitriona lo secreta al medio) o directamente desde la célula anfitriona que lo produce (si no es secretado). Después de la recogida, se puede purificar un polipéptido CRP1 o B7RP1 utilizando métodos tales como cromatografía de tamices moleculares, cromatografía de afinidad, y similares.

45 La selección de la célula anfitriona apropiada para la producción del polipéptido CRP1 o B7RP1 dependerá de diversos factores, tales como los niveles de expresión deseados, las modificaciones de los polipéptidos que son necesarios para la actividad, tales como glicosilación o fosforilación, o la facilidad de plegamiento en una molécula biológicamente activa.

50 Las células o líneas celulares adecuadas pueden ser células de mamífero, tales como células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñón embrionario humano (HEK) 293 o 293T, o células 3T3. La selección de las células anfitrionas demamífero adecuadas y los métodos de transformación, cultivo, amplificación, escrutinio y producción y purificación del producto son conocidos en la técnica. Otras líneas celulares de mamífero adecuadas, son las líneas celulares COS-1 y COS-7 de mono, y la línea celular CV-1. Otras células anfitrionas de mamífero ilustrativas

55 incluyen líneas celulares de primate y líneas celulares de roedor, incluyendo líneas celulares transformadas. También son adecuadas células diploides normales, cepas celulares derivadas de cultivo in vitro de tejido primario, así como explantes primarios. Las células candidato pueden ser genotípicamente deficientes en el gen de selección,

o pueden contener un gen de selección que actúa de manera dominantemente. Otras líneas celulares de mamífero adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células N2A de neuroblastoma de ratón, HeLa, células L-929 de ratón,

60 líneas 3T3 derivadas de ratones Swiss, Balb-c o NIH, o líneas celulares de hámster BHK o HaK. Del mismo modo son útiles como células anfitrionas las células bacterianas. Por ejemplo, las diversas cepas de E. Coli (p. ej., HB101, DH5α, DH10, y MC1061) son bien conocidas como células anfitrionas en el campo de la biotecnología. También se pueden emplear en este método diversas cepas de B. subtilis, Pseudomonas spp., otros Bacillus spp., Streptomyces spp., y similares.

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Muchas cepas de células de levadura conocidas por los expertos en la técnica también están disponibles como células anfitrionas parala expresión de los polipéptidos descritos en la presentememoria.

Adicionalmente, cuando se desee, se pueden utilizar sistemas de células de insectos en los métodos descritos en la

5 presente memoria. Tales sistemas son descritos por ejemplo por Kitts et al. (Biotechniques, 14: 810-817 (1993)), Lucklow (Curr. Opin. Biotechnol., 4: 564-572 (1993)) y Lucklow et al. (J. Virol, 67: 4566-4579 (1993)). Las células de insecto preferidas son Sf-9 y Hi5 (Invitrogen, Carlsbad, CA).

La "transformación" o "transfección" de un vector de expresión en la célula anfitriona seleccionada se pueden

10 completar utilizando métodos tales como cloruro de calcio, electroporación, microinyección, lipofección o el método DEAE-dextrano. El método seleccionado será en parte una función del tipo de célula anfitriona que se vaya a utilizar. Estos métodos y otros métodos adecuados son bien conocidos por el experto en la técnica, y se exponen, por ejemplo, en Sambrook et al., más arriba.

15 Las células anfitrionas transformadas o transfectadas con un vector de expresión pueden ser cultivadas utilizando medios convencionales bien conocidos por el experto en la técnica. Los medios normalmente contendrán todos los nutrientes necesarios para el crecimiento y la supervivencia de las células. Los medios adecuados para el cultivo de células de E. Coli son, por ejemplo, Caldo Luria (LB) y/o Caldo Formidable "Terrific Broth" (TB). Los medios adecuados para cultivar las células eucariotas son RPMI 1640, MEM, DMEM, todos los cuales pueden tener un

20 suplemento de suero y/o factores de crecimiento según requiera la línea celular concreta que se esté cultivando. Un medio adecuado para los cultivos de insecto es el medio de Grace con un suplemento de Yeastolate, producto hidrolizado delactoalbúmina, y/o suero deternera fetal según sea necesario.

Típicamente, se añade un antibiótico u otro compuesto útil para el crecimiento selectivo de las células transformadas

25 solamente como suplemento para el medio. El compuesto que se vaya a utilizar estará dictado por el elemento marcador seleccionable presente en el plásmido con el cual se transformó la célula anfitriona. Por ejemplo, cuando el elemento marcador seleccionable es la resistencia a la kanamicina, el compuesto añadido al medio de cultivo será kanamicina.

30 La cantidad de polipéptido CRP1 o B7RP1 producido en la célula anfitriona puede ser evaluada utilizando métodos convencionales conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen, sin limitación, análisis de transferencia Western, electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS, electroforesis en gel no desnaturalizante, separación por HPLC, inmunoprecipitación, y/o análisis de actividad tales como análisis de desplazamiento de unión a ADN en gel.

35 Si un polipéptido CRP1 o B7RP1 ha sido diseñado para ser secretado desde las células anfitrionas, la mayor parte del polipéptido se puede encontrar en el medio de cultivo celular. Los polipéptidos preparados de esta forma típicamente no poseerán una metionina amino terminal, ya que ésta es eliminada durante la secreción desde la célula. Si, no obstante, un polipéptido CRP1 o B7RP1 no es secretado desde las células anfitrionas, estará presente en el citoplasma y/o el núcleo (para las células anfitrionas eucarióticas) o en el citosol (para las células anfitrionas

40 bacterianas gram negativas) y puede tener una metionina amino terminal.

La purificación de un polipéptido CRP1 o B7RP1 de la disolución se puede lograr utilizando una variedad de técnicas. Si el polipéptido ha sido sintetizado de manera que contenga una etiqueta tal como Hexahistidina (CRP1 o B7RP1/hexaHis) u otro péptido pequeño tal como FLAG (Eastman Kodak Co., New Haven, CT) o mic (Invitrogen, 45 Carlsbad, CA) ya sea en su extremo carboxilo o amino terminal, éste se puede purificar esencialmente en un procedimiento de una etapa haciendo pasar el polipéptido etiquetado a través de una columna de afinidad donde la matriz de la columna tiene una alta afinidad por la etiqueta o por el polipéptido directamente (es decir, un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente un polipéptido CRP1 o B7RP1). Por ejemplo, la polihistidina se une con gran afinidad y especificidad al níquel, por tanto, se puede utilizar una columna de afinidad de níquel (tal como las

50 columnas de níquel de Qiagen®) para la purificación de CRP1 o B7RP1/poliHis. (Véase, por ejemplo, Ausubel et al., Eds., Current Protocolsin Molecular Biology, Sección 10.11.8, John Wiley & Sons, Nueva York (1993)).

Cuando se prepara un polipéptido CRP1 o B7RP1 sin una etiqueta anclada, y no hay anticuerpos disponibles, se pueden utilizar otros procedimientos bien conocidos para la purificación. Tales procedimientos incluyen, sin

55 limitación, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de tamices moleculares, HPLC, electroforesis en gel nativo combinada con elución en gel, e isoelectroenfoque preparativo (máquina/técnica "Isoprime", Hoefer Scientific). En algunos casos, se pueden combinar dos omás de estas técnicas paralograr el aumento de pureza.

Si se prevé que un polipéptido CRP1 o B7RP1 se encontrará principalmente intracelularmente, el material

60 intracelular (incluyendo cuerpos de inclusión para las bacterias gram-negativas) puede ser extraído de la célula anfitriona utilizando cualquier mecanismo convencional conocido por el experto en la técnica. Por ejemplo, las células anfitrionas pueden ser lisadas para liberar el contenido del periplasma/citoplasma por medio de una prensa de French, homogeneización, y/o sonicación seguido de centrifugación.

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Si un polipéptido CRP1 o B7RP1 ha formado cuerpos de inclusión en el citosol, los cuerpos de inclusión pueden a menudo unirse a las membranas celulares internas y/o externas y de ese modo se encontrarán principalmente en el material del sedimento después de la centrifugación. El material del sedimento se puede tratar a continuación a pH extremos o con un agente caotrópico tal como un detergente, guanidina, derivados de guanidina, urea, o derivados de urea en presencia de un agente reductor tal como ditiotreitol a pH alcalino o tris-carboxietil fosfina a pH ácido para liberar, separar, y solubilizar los cuerpos de inclusión. El polipéptido en su forma ahora soluble puede ser analizado a continuación utilizando electroforesis en gel, inmunoprecipitación o similar. Si se desea aislar un polipéptido CRP1 o B7RP1, el aislamiento se puede realizar utilizando métodos convencionales tales como los expuestos a continuación y por Marston et al. en (Meth. Enz., 182:264-275 (1990)). En algunos casos, un polipéptido CRP1 o B7RP1 puede no ser biológicamente activo después del aislamiento. Se pueden utilizar diferentes métodos para "replegar" o convertir el polipéptido a su estructura terciaria y generar enlaces disulfuro para restaurar la actividad biológica. Tales métodos incluyen poner en contacto el polipéptido solubilizado con una disolución que tiene un pH normalmente por encima de 7 y en presencia de una concentración concreta de un caotropo apropiado. En la mayoría de los casos la disolución de replegamiento/oxidación también contendrá un agente reductor o el agente reductor y la forma oxidada correspondiente en una proporción específica para generar un potencial redox concreto, que permite que se produzca la reorganización de los enlaces disulfuro en la formación de los puentes de cisteína de la proteína. Algunos de los pares redox comúnmente utilizados incluyen cisteína/cistamina, glutatión (GSH)/ditiobis GSH, cloruro cúprico, ditiotreitol (DTT)/ditiano DTT, 2-mercaptoetanol (bME)/ditio-b(ME). En muchos casos es necesario un codisolvente para aumentar la eficacia del replegamiento y los reactivos más comunes utilizados para este propósitoincluyen glicerol, polietilenglicol de diversos pesos moleculares, y arginina.

Los polipéptidos CRP1 o B7RP1, fragmentos, y/o derivados de los mismos también se pueden preparar por medio demétodos desíntesis química (tales como síntesis depéptidos en fasesólida) utilizandomecanismos conocidos en la técnica tales como los expuestos por Merrifield et al., (J. Am. Chem. Soc., 85:2149 (1963)), Houghten et al. (Proc Natl Acad. Sci. USA, 82:5132 (1985)), y Stewart y Young (Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984)). Tales polipéptidos se pueden sintetizar con o sin una metionina en el extremo amino terminal. Los polipéptidos CRP1 o B7RP1 o los fragmentos sintetizados químicamente se pueden oxidar utilizando los métodos expuestos en estas referencias para formar puentes disulfuro. Se espera que los polipéptidos o fragmentos de CRP1 o B7RP1 tengan una actividad biológica comparable a la de los polipéptidos CRP1 o B7RP1 producidos de forma recombinante o purificados a partir de fuentes naturales, y por lo tanto se pueden utilizar indistintamente con polipéptido CRP1 o B7RP1 recombinantes o naturales.

Polipéptidos

El término "polipéptido CRP1 o B7RP1" se refiere a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la Figura 1A (SEQ ID NO: 2), la Figura 2A (SEQ ID NO: 7) o la Figura 3A (SEQ ID NO: 12) y todos los polipéptidos relacionados descritos en la presente memoria. Los polipéptidos relacionados incluyen variantes alélicas, variantes de empalme, fragmentos, derivados, variantes por sustitución, deleción, e inserción, polipéptidos de fusión, y ortólogos. Tales polipéptidos relacionados pueden ser polipéptidos maduros, es decir, polipéptidos que carecen de un péptido señal. Un polipéptido CRP1 o B7RP1 puede tener o no una metionina amino terminal, dependiendo de la manera en que ha sido preparado.

El término "fragmento de polipéptido CRP1 o B7RP1" se refiere a un péptido o polipéptido que es menor que la secuencia de aminoácidos completa de un polipéptido CRP1 o B7RP1 mostrado en la Figura 1A (SEQ ID NO: 2), la Figura 2A (SEQ ID NO: 7) o la Figura 3A (SEQ ID NO: 12). Tal fragmento puede ser resultado del truncamiento en el extremo amino terminal, el truncamiento en el extremo carboxi terminal , y/o una deleción interna de la secuencia de polipéptido. Tales fragmentos de polipéptidos CRP1 o B7RP1 se pueden preparar con o sin una metionina amino terminal. Además, los fragmentos de polipéptidos CRP1 o B7RP1 pueden ser variantes de empalme de origen natural, otras variantes de empalme, y fragmentos resultantes de la actividad de proteasas in vivo de origen natural. Los fragmentos de polipéptido CRP1 o B7RP1 preferidos incluyen formas solubles de CRP1 o B7RP1 que carecen de un dominio transmembrana funcional y comprenden parte o la totalidad del dominio extracelular de cualquiera de CRP1 o B7RP1.

El término "variantes de polipéptidos CRP1 o B7RP1" se refiere a polipéptidos CRP1 o B7RP1 cuyas secuencias de aminoácidos contienen una o más sustituciones, deleciones, y/o adiciones en la secuencia de aminoácidos en comparación con las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos CRP1 o B7RP1 mostradas en la Figura 1A (SEQ ID NO: 2), la Figura 2A (SEQ ID NO: 7) o la Figura 3A(SEQ ID NO: 12). Tales variantes de polipéptidos CRP1

o B7RP1 se pueden preparar a partir de las correspondientes variantes de las moléculas de ácido nucleico de los polipéptidos CRP1 y B7RP1, que tienen una secuencia de ADN que varía consiguientemente de las secuencias de ADN paralos polipéptidos CRP1 o B7RP1.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "derivados de polipéptidos CRP1 o B7RP1" se refiere a polipéptidos CRP1 o B7RP1, variantes, o fragmentos de los mismos, que han sido modificados químicamente, como por ejemplo, mediante la adición de uno o más polímeros solubles en agua, carbohidratos unido a N o unidos a O, azúcares, fosfatos, y/u otras moléculas semejantes, donde la molécula o las moléculas no están ancladas naturalmente a polipéptidos CRP1 o B7RP1 de tipo salvaje. Los derivados incluyen adicionalmente deleción de uno

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o más grupos químicos anclados naturalmente al polipéptidoCRP1 o B7RP1.

5 Según se utiliza en la presente memoria, los términos "polipéptidos CRP1 o B7RP1 biológicamente activos", "fragmentos de polipéptidos CRP1 o B7RP1 biológicamente activos", "variantes de polipéptidos CRP1 o B7RP1 biológicamente activos", y "derivados de polipéptidos CRP1 o B7RP1 biológicamente activos" se refieren a polipéptidos CRP1 o B7RP1 que tienen al menos una de las actividades características de CRP1 o B7RP1. Una de las actividades es la unión de B7RP1 a CRP1. Otra actividad es la capacidad de CRP1 o B7RP1 para estimular la

10 proliferación y/o activación de células T.

El término "ortólogo" se refiere a un polipéptido que corresponde a un polipéptido identificado a partir de una especie. Por ejemplo, los polipéptidos B7RP1 de ratón y humanos son considerados ortólogos.

15 El término "secuencia de aminoácidos madura" se refiere a un polipéptido que carece de una secuencia líder.

El término "polipéptido aislado" se refiere a un polipéptido que está libre de al menos un polipéptido contaminante que se encuentra en su entorno natural, y preferiblemente sustancialmente libre de cualquier otro polipéptido de mamífero contaminante.

20 El término "identidad", como se conoce en la técnica, es una relación entre las secuencias de dos o más moléculas de ácido nucleico o dos o más polipéptidos, según se determina mediante la comparación de las secuencias. En la técnica, "identidad" también significa el grado de relación de la secuencia entre las secuencias del polipéptido o la molécula de ácido nucleico, según sea el caso, determinado por la coincidencia entre cadenas de secuencias de

25 nucleótidos o de aminoácidos. "Identidad" mide el porcentaje de coincidencias idénticas entre dos o más secuencias con alineamientos de espacios dirigidos por programas informáticos concretos (es decir, "algoritmos").

El término "similitud" se refiere a un concepto relacionado, pero a diferencia de la "identidad", una medida de la similitud incluye tanto las coincidencias idénticas como las coincidencias de sustituciones conservativas. Puesto que 30 las sustituciones conservativas se aplican a polipéptidos y no a moléculas de ácidos nucleicos, la similitud corresponde solamente a las comparaciones de secuencias de polipéptidos. Si dos secuencias de polipéptidos tienen, por ejemplo, 10/20 aminoácidos idénticos, y el resto son todas sustituciones no conservativas, en ese caso el porcentaje de identidad y similitud serían ambos de 50%. Si en el mismo ejemplo, hay 5 posiciones más en las que hay sustituciones conservativas, en ese caso el porcentaje de identidad sigue siendo de 50%, pero el porcentaje de 35 similitud sería de 75% (15/20). Por lo tanto, en los casos en los que hay sustituciones conservativas, el grado de similitud entre dos secuencias de polipéptidos será mayor que el porcentaje de identidad entre esas dos secuencias. Las sustituciones de aminoácidos "conservativas" se describen en la presente memoria a continuación en referencia a la Tabla I. Basándose en la Tabla I, las sustituciones de aminoácidos conservativas son aminoácidos alternos seleccionados del mismo agrupamiento, p. ej., alcalinos, ácidos, polares no cargados, y no polares. Por ejemplo, las

40 sustituciones de aminoácidos conservativas para la arginina serían lisina e histidina.

La identidad y la similitud se pueden calcular fácilmente mediante métodos conocidos, incluyendo pero no limitados a los descritos en Computacional Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed, Academic Press, Nueva York, 1993; Computer

45 Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M. Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988).

50 Losmétodospreferidosparadeterminarlaidentidady/osimilitudsediseñanparaproporcionarlamayorcoincidencia entre las secuencias sometidas a ensayo. Los métodos para determinar la identidad y similitud están codificados en programas informáticos disponibles públicamente. Los métodos de los programas informáticos preferidos para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete de programas GCG, incluyendo GAP (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1):387 (1984); Genetics Computer Group,

55 UniversidaddeWisconsin,Madison,WI),BLASTP,BLASTN,yFASTA(Atschul,S. F. etal.,J.Molec. Biol. 215:403410 (1990). El programa BLAST X está disponible públicamente del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI) y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., et al. NCB NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). El algoritmo de Smith Waterman bien conocido también se puede utilizar para determinar laidentidad.

60 A modo de ejemplo, utilizando el algoritmo informático GAP (Genetics Computer Group, Universidad de Wisconsin, Madison, WI), dos polipéptidos para los cuales se va a determinar el porcentaje de identidad de secuencia se alinean para una coincidencia óptima de sus respectivos aminoácidos (el "tramo coincidente", determinado por el algoritmo). Se utilizan una penalización por apertura del espacio (que se calcula como 3 X la diagonal media; el "diagonal media" es la media de la diagonal de la matriz de comparación que se está utilizando; la "diagonal" es la puntuación o el número asignado a cada coincidencia de aminoácido perfecta por la matriz de comparación concreta) y una penalización por extensión del espacio (quees normalmente 1/10 veces la penalización por apertura del espacio), así como una matriz de comparación tal como PAM 250 o BLOSUM 62 junto con el algoritmo. El

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5 algoritmo también utiliza una matriz de comparación convencional (véase Dayhoff et al., en: Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, sup. 3 (1978) para la matriz de comparación PAM250; véase Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA., 89: 10915-10919 (1992) para lamatrizde comparación BLOSUM 62).

Los parámetros preferidos para la comparación de secuencias de polipéptidos incluyen los siguientes:

10 Algoritmo:NeedlemanyWunsch,J. Mol. Biol. 48:443-453(1970) Matriz de comparación: BLOSUM 62 de Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919 (1992) Penalización por espacio: 12 Penalización por longitud del espacio: 4

15 Umbral de similitud: 0

El programa GAP es útil con los parámetros anteriores. Los parámetros anteriormente mencionados son los parámetros por defecto para las comparaciones de polipéptidos (junto con ninguna penalización para los espacios finales) utilizando el algoritmo GAP.

20 Los parámetros preferidos para la comparación de secuencias de ácido nucleicomolécula incluyen los siguientes: Algoritmo: Needleman yWunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970) Matriz de comparación: coincidencias = +10, emparejamientos erróneos = 0 Penalización por espacio: 50

25 Penalización por Longitud del espacio: 3

El programa GAP también es útil con los parámetros anteriores. Los parámetros anteriormentemencionados son los parámetros por defecto para comparaciones moléculas de ácido nucleico.

30 Otros algoritmos ilustrativos, penalizaciones por apertura de espacio, penalizaciones por extensión del espacio, matrices de comparación, umbrales de similitud, etc. pueden ser utilizados por los expertos en la técnica, incluyendo los establecidos en el Program Manual, Wisconsin Package, Versión 9, Septiembre de 1997. Las elecciones particulares que se vayan a realizar dependerán de la comparación específica que se vaya a realizar, tal como ADN con ADN, proteína con proteína, proteína con ADN; y adicionalmente, la comparación entre pares de secuencias (en

35 cuyo caso se prefieren generalmente GAP o BestFit) o entre una secuencia y una gran base de datos de secuencias (en cuyo caso se prefieren FASTA o BLASTA).

Los polipéptidos que son al menos aproximadamente idénticos en 70 por ciento tendrán típicamente una o más sustituciones, deleciones, y/o adiciones de aminoácidos en comparación con un polipéptido CRP1 o B7RP1 de tipo

40 salvaje. En una realización preferida, los polipéptidos tendrán aproximadamente una identidad de aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90% o 95% con los polipéptidos CRP1 o B7RP1. Por lo general, las sustituciones del residuo nativo serán o bien alanina, o bien un aminoácido conservativo de manera que tenga poco o ningún efecto sobre la carga global neta, la polaridad, o el carácter hidrófobo del polipéptido. Las sustituciones conservativas se exponen en la Tabla I a continuación.

45 Tabla I

Sustituciones conservativas de aminoácidos

Alcalinos:: arginina

imagen16: lisina

imagen17: histidina

Ácidos:: ácido glutámico

imagen18: ácido aspártico

Polares sin carga:: glutamina

imagen19: asparragina

imagen20: serina

imagen21: treonina

imagen22: tirosina

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Sustituciones conservativas de aminoácidos

No polares:: fenilalanina

imagen24: triptófano

imagen25: cisteína

imagen26: glicina

imagen27: alanina

imagen28: valina

imagen29: prolina

imagen30: metionina

imagen31: leucina

imagen32: norleucina

imagen33: isoleucina

Los derivados de polipéptidos CRP1 o B7RP1 se describen en la presente memoria. Las composiciones de polipéptidos CRP1 o B7RP1 modificados químicamente en las que los polipéptidos CRP1 o B7RP1 están unidos a un polímero también se describen en la presente memoria. El polímero seleccionado es típicamente soluble en agua 5 de modo que la proteína a la que está anclado no precipita en un entorno acuoso, tal como un entorno fisiológico. El polímero seleccionado está normalmente modificado para tener un único grupo reactivo, tal como un éster activo para la acilación o un aldehído para la alquilación, demodo que el grado de polimerización se puede controlar como se indica en los presentes métodos. El polímero puede tener cualquier peso molecular, y puede ser ramificado o no ramificado. En la presente memoria se describe una mezcla de polímeros. Preferiblemente, para uso terapéutico de

10 la preparación del producto final, el polímero será farmacéuticamente aceptable.

El polímero soluble en agua o sus mezclas pueden ser seleccionados del grupo que consiste en, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), monometoxi-polietilenglicol, dextrano, celulosa u otros polímeros basados en carbohidratos, poli-(N-vinilpirrolidona) polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, un co-polímero de óxido de

15 polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (p. ej., glicerol) y poli(alcohol vinílico).

Para las reacciones de acilación, el polímero o los polímeros seleccionados deben tener un único grupo éster reactivo. Para la alquilación reductiva, el polímero o los polímeros seleccionados deben tener un único grupo aldehído reactivo. Un aldehído reactivo preferido es el propionaldehído de polietilenglicol, que es estable en agua, o

20 derivadosmonoalcoxioariloxiC1-C10delosmismos(véaselaPatentedelosEstadosUnidosNúm. 5.252.714).

La PEGilación de polipéptidos CRP1 o B7RP1 puede llevarse a cabo mediante cualquiera de las reacciones de pegilación conocidas en la técnica, como se describe por ejemplo en las siguientes referencias: Focus on Growth Factors 3: 4-10 (1992); documento EP 0 154 316; y documento EP 0 401 384. Preferiblemente, la pegilación se lleva

25 a cabo a través de una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de polietilenglicol reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo análogo) como se describe a continuación.

Un polímero soluble en agua particularmente preferido para uso en la presente memoria es el polietilenglicol, abreviado como PEG. Según se utiliza en la presente memoria, el polietilenglicol está destinado a abarcar cualquiera

30 de las formas de PEG que han sido utilizadas para derivatizar otras proteínas, tales como mono-alcoxi o ariloxi-(C1C10)polietilenglicol.

En general, la derivatización química se puede realizar bajo condiciones adecuadas cualesquiera utilizadas para hacer reaccionar una sustancia biológicamente activa con una molécula de polímero activado. Los métodos para 35 preparar polipéptidos CRP1 y B7RP1 pegilados comprenderán generalmente las etapas de (a) hacer reaccionar el polipéptido con polietilenglicol (tal como un éster o derivado aldehído reactivo de PEG) bajo condiciones mediante las cuales el polipéptido CRP1 o B7RP1 se ancla a uno o más grupos de PEG y (b) obtener el producto o los productos de reacción. En general, las condiciones de reacción óptimas para las reacciones de acilación serán determinadas basándose en parámetros conocidos y el resultado deseado. Por ejemplo, cuanto mayor sea la

40 proporción de PEG:proteína, mayor será el porcentaje de producto poli-pegilado.

Generalmente, las afecciones que pueden ser aliviadas o moduladas por la administración de productos conjugados poliméricos de CRP1 o B7RP1 incluyen las descritas en la presente memoria para los polipéptidos CRP1 o B7RP1 no conjugados. Sin embargo, los productos conjugados descritos en la presente memoria pueden tener actividades adicionales, una actividad biológica mejorada o reducida, u otras características, tales como aumento o disminución de la vidamedia, en comparación conlasmoléculas no derivatizadas.

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Los polipéptidos, fragmentos, variantes y derivados de CRP1 o B7RP1, se pueden emplear solos, juntos, o

5 combinadosconotrascomposicionesfarmacéuticas. Lospolipéptidos,fragmentos,variantes,yderivadosdeCRP1o B7RP1, pueden ser utilizados combinados con citoquinas, factores de crecimiento, antibióticos, antiinflamatorios, y/o agentes quimioterapéuticos según sea apropiado parala indicación que se estétratando.

Se describen en la presente memoria agentes de unión selectiva de CRP1 o B7RP1. Un agente de unión selectiva

10 se refiere a una molécula que tiene especificidad para CRP1 o B7RP1 y puede incluir una proteína, un péptido, un ácido nucleico, un carbohidrato, un lípido o un compuesto depequeño peso molecular. Un agente de unión selectiva interactúa con CRP1 o B7RP1 y a su vez regula la unión de CRP1 a B7RP1. En una realización, un agente de unión selectiva bloquea parcial o completamente la unión de CRP1 a B7RP1 e inhibe parcialmente o completamente al menos una actividad biológica de CRP1 o B7RP1, tal como la actividad coestimuladora inmunitaria. En otra

15 realización, el agente de unión selectiva es un anticuerpo. El anticuerpo puede ser inmunorreactivo con CRP1 o B7RP1 y es preferiblemente inmunorreactivo con B7RP1. Un anticuerpo reactivo con B7RP1 se une a un epítopo en B7RP1 de tal manera que la unión a CRP1 sea parcial o totalmente bloqueada y al menos una actividad biológica de B7RP1, tal como la actividad coestimuladora inmunitaria, pueda ser parcialmente o completamente inhibida. El término parcialmente inhibida significa que se ha producido al menos un nivel detectable de inhibición. El término

20 completamenteinhibidasignificaquenosehaproducidounnuevoaumentodeinhibición.

Los polipéptidos fragmentos, variantes, y/o derivados de CRP1 o B7RP1, se pueden utilizar para preparar anticuerpos utilizando métodos conocidos en la técnica. Por lo tanto, los anticuerpos que reaccionan con los polipéptidos CRP1 o B7RP1, así como los fragmentos reactivos de tales anticuerpos, también se describen la 25 presente memoria. Los anticuerpos pueden ser policlonales, monoclonales, recombinantes, quimérica de cadena sencilla y/o biespecíficos. Típicamente, el anticuerpo o fragmento del mismo será o bien de origen humano, o bien será "humanizado", es decir, preparado con el fin de prevenir o minimizar una reacción inmunitaria al anticuerpo cuando se administra a un paciente. El fragmento de anticuerpo puede ser cualquier fragmento que sea reactivo con los polipéptidos CRP1 o B7RP1, descritos en la presente memoria, tales como, Fab, Fab', etc. También se describen 30 en la presente memoria los hibridomas generados mediante la presentación de cualquier polipéptido CRP1 o B7RP1

o fragmentos del mismo como antígeno a un mamífero seleccionado, seguido de la fusión de las células (p. ej., células de bazo) del mamífero con ciertas células cancerosas para crear líneas celulares inmortalizadas mediante técnicas conocidas. Losmétodos empleados para generar tales líneas celulares y anticuerpos dirigidos contra todo o porciones de un polipéptido CRP1 o B7RP1 humano también se describen en la presente memoria.

35 Los anticuerpos monoclonales incluyen anticuerpos "quiméricos" en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase concreta de anticuerpo, mientras que el resto de las cadenas son idénticas u homólogas a las correspondientes secuencias de anticuerpos derivados de otras especies o

40 pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de tales anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada (Patente de los Estados Unidos Núm. 4.816.567; Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 6851-6855(1985)).

En una realización preferida, el anticuerpo anti-CRP1 o B7RP1 quimérico es un anticuerpo "humanizado". Los

45 métodos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido introducidos en el mismo de una fuente que no es humana. La humanización se puede realizar siguiendo métodos conocidos en la técnica (Jones, et al., Nature 321, 522-525 1986); Riechmann, et al., (Nature, 332, 323-327 1988); Verhoeyen, et al., (Science 239, 1534-1536 1988)), sustituyendo las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de roedor por las regiones correspondientes

50 de un anticuerpo humano.

También se describen en la presente memoria anticuerpos anti-CRP1 o anti-B7RP1 completamente humanos. Tales anticuerpos pueden ser producidos por inmunización con un antígeno B7RP1 o CRP1 de animales transgénicos (p. ej., ratones) que son capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de producción de

55 inmunoglobulina endógena. Véanse, por ejemplo, Jakobovits, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90, 2551-2555 (1993); Jakobovits, et al., (Nature 362, 255-258 1993). Los anticuerpos humanos también se pueden producir en bibliotecas de presentación en fagos (Hoogenboom, et al., J. Mol. Biol. 227, 381 (1991); Marks, et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991).

60 Los agentes de unión selectiva se pueden utilizar para regular la unión de CRP1 a B7RP1 y regular al menos una actividad biológicamediada por CRP1 y B7RP1 tal como la co-estimulación inmunitaria. Un ejemplo de tales agentes de unión selectiva son anticuerpos inmunorreactivos con cualquiera de CRP1 o B7RP1. Los anticuerpos se pueden utilizar terapéuticamente, por ejemplo para inhibir la unión del polipéptido CRP1 y B7RP1 a su compañero de unión.

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Los anticuerpos se pueden utilizar adicionalmente para fines diagnósticos in vivo e in vitro, por ejemplo en forma marcada para detectar la presencia de polipéptido CRP1 y B7RP1 en un fluido corporal o muestra celular.

Composiciones farmacéuticas y administración

5 Las composiciones farmacéuticas de los polipéptidos CRP1 o B7RP1 también se describen en la presente memoria. Tales composiciones pueden comprender una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido o fragmentos, variantes, o derivados mezclados con un portador farmacéuticamente aceptable. En realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas comprenden los polipéptidos CRP1 o B7RP1 como formas solubles que comprenden

10 parte o todo el dominio extracelular de CRP1 o B7RP1. Típicamente, un compuesto terapéutico de polipéptido CRP1 y B7RP1 se administrará en forma de una composición que comprende polipéptido, fragmento, variante, o derivado purificados junto con uno o más portadores, excipientes o diluyentes fisiológicamente aceptables. El material portador puede ser agua para inyectables, preferiblemente con un suplemento de otros materiales comunes en disoluciones para su administración a mamíferos. La solución salina tamponada neutra o la solución salina mezclada

15 con albúmina de suero son portadores apropiados ilustrativos. Preferiblemente, el producto se formula en forma de un producto liofilizado utilizando excipientes apropiados (p. ej., sacarosa). Se pueden incluir, según se desee otros portadores, diluyentes, y excipientes convencionales. Otras composiciones ilustrativas comprenden tampón Tris con un pH de aproximadamente 7,0-8,5, o tampón acetato con un pH de aproximadamente 4,0-5,5, que pueden incluir adicionalmente sorbitol o un sustituto adecuado del mismo.

20 Las composiciones farmacéuticas de CRP1 o B7RP1 se pueden administrar por vía parenteral. Alternativamente, las composiciones se pueden administrar por vía intravenosa o subcutánea. Cuando se administran sistémicamente, las composiciones terapéuticas para su uso en esta invención pueden estar en forma de una disolución acuosa libre de pirógenos, parenteralmente aceptable. La preparación de tales disoluciones de proteína farmacéuticamente

25 aceptables, con la debida consideración al pH, isotonicidad, estabilidad y similares, está dentro del conocimiento práctico dela técnica.

Las formulaciones terapéuticas de composiciones de polipéptidos CRP1 y B7RP1 útiles para la práctica de la presente invención se pueden preparar para su almacenamiento mezclando la composición seleccionada que tiene

30 el grado deseado de pureza con portadores, excipientes, o estabilizadores opcionales fisiológicamente aceptables (Remington Pharmaceutical Sciences, 18ª Edición, AR Gennaro, ed, Mack Publishing Company (1990)) en forma de una torta liofilizada o una disolución acuosa. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores y son preferiblemente inertes a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, u otros ácidos orgánicos; antioxidantes tales como ácido ascórbico;

35 polipéptidos de bajo peso molecular; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparragina, arginina

o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcares tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicostales como Tween, Pluronics o polietilenglicol (PEG).

40 La cantidad eficaz de una o varias composiciones de polipéptido CRP1 o B7RP1 que se va a emplear terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos tales como la indicación para la que se utiliza el polipéptido CRP1 y B7RP1, la ruta de administración, y el estado del paciente. En consecuencia, será necesario para el terapeuta titular la dosificación y modificar la ruta de administración según se requiera para

45 obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosis diaria típica puede oscilar de aproximadamente 0,1 µg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Típicamente, un médico clínico administrará la composición hasta que se alcance una dosificación que consiga el efecto deseado. Por tanto, la composición puede administrarse como una dosis única, o como dos o más dosis (que pueden o no contener la misma cantidad de un polipéptido CRP1 o B7RP1) con el tiempo, o como una infusión continua a través de un dispositivo de

50 implantación o catéter.

A medida que se lleven a cabo más estudios, surgirá información con respecto a los niveles de dosificación apropiados para el tratamiento de diversas afecciones en diversos pacientes, y el trabajador experto normal, considerando el contexto terapéutico, el tipo de trastorno en tratamiento, la edad y la salud general del receptor, será

55 capaz de determinar la dosificación apropiada. La composición de polipéptido CRP1 o B7RP1 que se va a utilizar para la administración in vivo debe ser estéril. Esto se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. Cuando se liofiliza la composición, se puede llevar a cabo la esterilización utilizando estos métodos ya sea antes, o después de la liofilización y la reconstitución. La composición para administración parenteral normalmente se almacenará en forma

60 liofilizada o en disolución.

Las composiciones terapéuticas generalmente se colocan en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de disolución intravenosa o vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.

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La ruta de administración de la composición está de acuerdo con métodos conocidos, p. ej., oral, inyección o infusión por vía intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimatosa), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial, o intralesional, o mediante sistemas de liberación sostenida o dispositivo de implantación que pueden implicar opcionalmente el uso de un catéter. Cuando se desee, las composiciones pueden

5 seradministradascontinuamentemedianteinfusión,inyeccióndeboloomediantedispositivodeimplantación.

Alternativamente o adicionalmente, la composición puede ser administrada localmente a través dela implantación en el área afectada de una membrana, esponja, u otro material apropiado sobre el cual el polipéptido CRP1 y B7RP1 ha sido absorbido.

10 Cuando se utiliza un dispositivo de implantación, el dispositivo puede ser implantado en cualquier tejido u órgano adecuado, y la liberación de un polipéptido CRP1 o B7RP1 puede ser directamente a través del dispositivo por medio de bolo, o mediante administración continua, o mediante catéter utilizando infusión continua. Un polipéptido CRP1 o B7RP1 se puede administrar en una formulación o preparación de liberación sostenida. Los ejemplos

15 adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices poliméricas semipermeables en forma de artículos conformados, p. ej. películas o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles, polilactidas (documento U.S. 3.773.919, documento EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y Lglutamato de gamma-etilo (Sidman et al, Biopolymers, 22: 547-556 (1983)), poli(2-hidroxietil-metacrilato) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981)] y Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)), etileno vinilacetato

20 (Langer et al., supra) o ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico (documento EP 133.988). Las composiciones de liberación sostenida también pueden incluir liposomas, que se pueden preparar mediante cualquiera de diversos métodos conocidos en la técnica (p. ej., Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 82: 3688-3692 (1985); documento EP 36.676; documento EP 88.046; documento EP 143.949).

25 En algunos casos, puede ser deseable utilizar composiciones de polipéptidos CRP1 o B7RP1 de una manera ex vivo. Aquí, las células, tejidos, u órganos que han sido retirados del paciente son expuestos a composiciones de polipéptidos CRP1 o B7RP1 después de lo cual las células, tejidos y/u órganos se implantan con posterioridad de nuevo en el paciente.

30 En otros casos, un polipéptido CRP1 o B7RP1 puede ser liberado a través de implantación en los pacientes de ciertas células que se han modificado genéticamente, utilizando métodos como los descritos en la presente memoria, para expresar y secretar los polipéptidos, fragmentos, variantes, o derivados. Tales células pueden ser células animales o humanas, y pueden derivar de tejidos del propio paciente o de otra fuente, ya sea humana o no humana. Opcionalmente, las células pueden ser inmortalizadas. Sin embargo, con el fin de disminuir la probabilidad

35 de una respuesta inmunológica, se prefiere que las células estén encapsular para evitar la infiltración de los tejidos circundantes. Los materiales de encapsulación son típicamente recintos o membranas poliméricos biocompatibles, semipermeables que permiten la liberación del producto o los productos proteicos pero impiden la destrucción de las células por el sistemainmunitario del paciente o por otrosfactores perjudiciales de lostejidos circundantes.

40 Los métodos utilizados para la encapsulación de membrana de las células son familiares para el experto en la técnica, y la preparación de células encapsuladas y su implantación en pacientes se pueden realizar sin experimentación indebida. Véase, p. ej. las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.892.538; 5.011.472; y

5.106.627. Un sistema para encapsular células vivas se describe en el documento PCT WO 91/10425 (Aebischer et al.). Los mecanismos para formular una variedad de otros medios de liberación sostenida o controlada, tales como

45 portadores de liposomas, partículas o cuentas bioerosionables, también son conocidas por los expertos en la técnica, y se describen, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.653.975. Las células, con o sin encapsulación, pueden ser implantadas en tejidos u órganoscorporales adecuados del paciente.

Como se ha comentado anteriormente, puede ser deseable tratar las preparaciones de células con uno o más

50 polipéptidos, variantes, derivados y/o fragmentos de CRP1 o B7RP1. Esto se puede lograr mediante la exposición de, por ejemplo, las células que comprenden células T, tales como células de médula ósea, al polipéptido, variante, derivado o fragmento directamente, cuando éste está en una forma que es permeable a la membrana celular. Por ejemplo, las células que comprenden células T se pueden exponer a un polipéptido B7RP1 con el fin de activar la función de células T ylas células tratadas de ese modo son implantadas en el paciente.

55 Alternativamente, se puede emplear la terapia génica. Una manera en la que la terapia génica puede ser aplicada consiste en el uso de un gen de CRP1 o B7RP1 (ya sea ADN genómico, ADNc, y/o ADN sintético que codifica un polipéptido CRP1 o B7RP1, o un fragmento, variante, o derivado del mismo) que puede estar conectado operablemente a un promotor constitutivo o inducible para formar un "constructo de ADN para terapia génica". El promotor puede ser homólogo o heterólogo al gen CRP1 o B7RP1 endógeno, siempre que sea activo en el tipo de

60 célula o tejido en el que se insertará el constructo. Otros componentes del constructo de ADN para terapia génica pueden incluir opcionalmente, según se requiera, moléculas de ADN diseñadas para la integración específica de sitio (p. ej., secuencias flanqueantes endógenas útiles para la recombinación homóloga), promotor específico de tejido, potenciadores o silenciadores, moléculas de ADN capaces de proporcionar una ventaja selectiva sobre la célula parental, moléculas de ADN útiles como marcas para identificar células transformadas, sistemas de selección negativa, agentes de unión específica a células (como, por ejemplo, para el direccionamiento celular), factores de internalización específicos de células, y factores de transcripción para potenciar la expresión por un vector así como factores para permitir la fabricación del vector.

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5 Este constructo de ADN para terapia génica puede ser introducido a continuación en las células del paciente (ya sea ex vivo o in vivo). Un medio para introducir el constructo de ADN para terapia génica es a través de vectores virales. Los vectores virales adecuados utilizados típicamente en la terapia génica para la liberación de constructos de ADN para terapia génica incluyen, sin limitación, vectores de adenovirus, virus adeno-asociados, virus herpes simplex, lentivirus, virus del papiloma, y retrovirus. Algunos de estos vectores, tales como los vectores retrovirales, liberarán

10 el constructo de ADN para terapia génica en el ADN cromosómico de las células del paciente, y el constructo de ADN para terapia génica se puede integrar en el ADN cromosómico; otros vectores funcionarán como episomas y el constructo de ADN para terapia génica permanecerá en el citoplasma. El uso de vectores de terapia génica se describe, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.672.344, 5.399.346.

15 Los medios alternativos para liberar constructos de ADN para terapia génica a las células de un paciente sin el uso de vectores virales incluyen, sin limitación, transferencia mediada por liposomas, inyección directa de ADN desnudo, transferencia mediada por receptor (complejo ADN-ligando), electroporación, precipitación con fosfato de calcio, y bombardeo de micropartículas (por ejemplo, "Pistola de genes"). Véanse las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.970.154, el documentoWO 96/40958, 5.679.559, 5.676.954, y 5.593.875.

20 Otromedio para aumentar la expresión del polipéptido CRP1 o B7RP1 endógeno en una célula a través de la terapia génica es insertar uno o más elementos potenciadores en el promotor del polipéptido CRP1 o B7RP1, donde el elemento o los elementos potenciadores pueden servir para aumentar la actividad transcripcional de un gen del polipéptido CRP1 o B7RP1. El elemento o los elementos potenciadores utilizados se seleccionan basándose en el

25 tejido en el que se desean activar el gen o los genes; se seleccionarán los elementos potenciadores conocidos por conferir la activación del promotor en ese tejido. Por ejemplo, si un polipéptido CRP1 o B7RP1 va a ser "activado" en las células T, se puede utilizar el elemento potenciador del promotor lck. Aquí, la porción funcional del elemento transcripcional que va a ser añadido puede ser insertado en un fragmento de ADN que contiene un promotor de polipéptido CRP1 o B7RP1 (y opcionalmente, vector, la secuencia flanqueante 5' y/o 3', etc.) utilizando técnicas de

30 clonación normalizadas. Este constructo, conocido como "constructo de recombinación homóloga" puede ser introducido a continuación en las células deseadas ya sea ex vivo o in vivo.

La terapia génica se puede utilizar para disminuir expresión del polipéptido CRP1 o B7RP1 mediante la modificación de la secuencia de nucleótidos del promotor o los promotores endógenos. Dicha modificación se realiza típicamente 35 a través de métodos de recombinación homóloga. Por ejemplo, se puede modificar genéticamente una molécula de ADN que contiene todo o una porción del promotor de uno o varios genes de CRP1 o B7RP1 seleccionado para la inactivación para eliminar y/o sustituir las piezas del promotor queregula la transcripción. Aquí, sepueden suprimir la caja TATA y/o el sitio de unión de un activador de la transcripción del promotor utilizando técnicas de biología molecular convencionales; tal supresión puede inhibir la actividad promotora reprimiendo de ese modo la 40 transcripción del gen CRP1 o B7RP1 correspondiente. La deleción de la caja TATA o del sitio de unión del activador de la transcripción en el promotor puede llevarse a cabo mediante la generación de un constructo de ADN que comprende la totalidad o la parte relevante de un promotor o los promotores del polipéptido CRP1 o B7RP1 (de la misma o de una especie relacionada como uno o varios genes de CRP1 o B7RP1 que van a ser regulados) en el que uno o más de la caja TATA y/o los nucleótidos del sitio de unión del activador de la transcripción están mutados 45 mediante sustitución, deleción y/o inserción de uno o más nucleótidos de tal manera que la caja TATA y/o el sitio de unión del activador tienen una actividad reducida o se han vuelto completamente inactivos. Este constructo, que también contendrá típicamente al menos aproximadamente 500 bases de ADN que corresponden a las regiones flanqueantes 5' y 3' (endógenas) nativas del segmento promotor que ha sido modificado, puede introducirse en las células apropiadas (ya sea ex vivo o in vivo) directamente o a través de un vector viral como se ha descrito

50 anteriormente. Típicamente, la integración del constructo en el ADN genómico de las células será mediante recombinación homóloga, en la que las secuencias de ADN flanqueantes 5' y 3' en el constructo del promotor pueden servir para ayudar a integrar la región promotora modificada a través de hibridación con el ADN cromosómico endógeno.

55 Otros métodos de terapia génica también pueden emplearse cuando sea deseable para inhibir uno o más polipéptidos CRP1 o B7RP1. Por ejemplo, se pueden introducir en la célula moléculas de ADN o ARN antisentido, que tienen una secuencia que es complementaria a al menos una porción de uno o varios genes de los polipéptidos CRP1 o B7RP1 seleccionados. Típicamente, cada una de tales molécula antisentido será complementaria al sitio de inicio (extremo 5') de cada gen CRP1 o B7RP1 seleccionado. Cuando la molécula antisentido hibrida a continuación

60 conelARNmdelpolipéptidoCRP1oB7RP1correspondiente,seevitalatraduccióndeesteARNm.

Alternativamente, la terapia génica puede ser empleada para crear un inhibidor dominante negativo de uno o más polipéptidos CRP1 o B7RP1. En esta situación, se puede preparar e introducir el ADN que codifica un polipéptido completo o truncado mutante de cada polipéptido CRP1 o B7RP1 seleccionado en las células de un paciente utilizando métodos virales o no virales como se describió anteriormente. Cada uno de tales mutantes está diseñado típicamente para competir con polipéptido endógeno en su papel biológico.

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Agonistas y Antagonistas

5 Se describen adicionalmente en la presente memoria agonistas y antagonistas de CRP1 o B7RP1 que regulan la actividad de una o ambas moléculas. Un agonista de CRP1 o B7RP1 estimulará o potenciará al menos una actividad de CRP1 o B7RP1. Un antagonista de CRP1 o B7RP1 inhibe parcial o completamente al menos una actividad de CRP1 o B7RP1. Los agonistas y antagonistas pueden ser identificados a partir de moléculas de ensayo que alteran

10 la unión de B7RP1 a CRP1.

El término "molécula o moléculas de ensayo" se refiere a la molécula o las moléculas que es/son objeto de evaluación de la capacidad para unirse a un polipéptido CRP1 o B7RP1 y por lo tanto alterar la unión de B7RP1 a CRP1. Preferiblemente, la molécula de ensayo se unirá con una constante de afinidad de al menos

15 aproximadamente 106M.

Se puede utilizar una variedad de análisis para medir la unión de B7RP1 a CRP1. Estos análisis se pueden utilizar para detectar moléculas de ensayo por su capacidad para aumentar o disminuir la tasa o el grado de unión de B7RP1 a CRP1. En un tipo de análisis, un polipéptido CRP1, preferiblemente una forma soluble de CRP1 tal como 20 un dominio extracelular, se inmoviliza mediante anclaje a la parte inferior de los pocillos de una placa de microtitulación. A continuación, se pueden añadir B7RP1 radiomarcado y la molécula o las moléculas de ensayo ya sea de una en una (en cualquier orden) o simultáneamente a los pocillos. Después de la incubación, los pocillos se pueden lavar y contar utilizando un contador de centelleo para determinar la radiactividad para determinar el grado de unión a la proteína CRP1 de B7RP1. Típicamente, las moléculas se someterán a ensayo a lo largo de un 25 intervalo de concentraciones, y se puede utilizar una serie de pocillos de control que carecen de uno o más elementos de los análisis de ensayo para determinar la exactitud en la evaluación de los resultados. Una alternativa a este método implica la reversión de las "posiciones" de las proteínas, es decir, la inmovilización de B7RP1 en los pocillos de las placas de microtitulación, la incubación con la molécula de ensayo y CRP1 radiomarcado, y la determinación de la extensión de la unión de CRP1 (véase, por ejemplo, el capítulo 18 de Current Protocols in

30 MolecularBiology,Ausubeletal.,eds.,JohnWiley&Sons,NuevaYork,NY).

Como una alternativa al radiomarcaje, CRP1 o B7RP1 pueden conjugarse con biotina y a continuación se puede detectar la presencia de la proteína biotinilada utilizando estreptavidina ligada a una enzima, tal como peroxidasa de rábano picante [HRP] o fosfatasa alcalina [AP], que se puede detectar colorimétricamente, o mediante etiquetado

35 fluorescente de estreptavidina. También se puede utilizar un anticuerpo dirigido a CRP1 o B7RP1 que está conjugado con biotina y se puede detectar después de la incubación con estreptavidina ligada a la enzima ligada a AP o HRP

CRP1 y B7RP1 también pueden inmovilizarse por medio de la unión a cuentas de agarosa, cuentas acrílicas u otros

40 tipos de dichos sustratos inertes. El complejo de sustrato-proteína puede ser colocado en una disolución que contiene la proteína complementaria y el compuesto de ensayo; después de la incubación, las cuentas se pueden precipitar mediante centrifugación, y se puede evaluar la cantidad de unión entre CRP1 y B7RP1 utilizando los métodos descritos anteriormente. Alternativamente, el complejo de sustrato-proteína puede ser inmovilizado en una columna y se pueden hacer pasar por la columna la molécula de ensayo y la proteína complementaria. La formación

45 de un complejo entre CRP1 y B7RP1 se puede evaluar a continuación utilizando cualquiera de las técnicas mostradas anteriormente, es decir, marcaje radiactivo, unióna anticuerpo, o similares.

Otro tipo de análisis in vitro que es útil para identificar una molécula de ensayo que aumenta o disminuye la formación de un complejo de CRP1/B7RP1 es un sistema detector de resonancia de plasmón superficial tal como el 50 sistema de ensayo Biacore (Pharmacia, Piscataway, NJ). El sistema Biacore puede llevarse a cabo utilizando el protocolo del fabricante. Este análisis implica esencialmente la unión de cualquiera de CRP1 o B7RP1 a un chip sensor recubierto con dextrano que está localizado en un detector covalente. El compuesto de ensayo y la otra proteína complementaria pueden ser inyectados a continuación en la cámara que contiene el chip sensor simultáneamente o secuencialmente y se puede evaluar la cantidad de proteína complementaria que se une

55 basándose en el cambio en la masa molecular que se asocia físicamente con el lado recubierto de dextrano del chip sensor; el cambio en lamasamolecular puede ser medido por el sistema detector.

En algunos casos, puede ser deseable evaluar dos o más compuestos de ensayo juntos para su uso en el aumento

o la disminución de la formación de un complejo de CRP1/B7RP1. En estos casos, los análisis expuestos

60 anteriormente se pueden modificar fácilmente mediante la adición de tales compuestos de ensayo adicionales, ya sea simultáneamente al, o después del, primer compuesto de ensayo. El resto de etapas en el análisis son las expuestas anteriormente.

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Se pueden utilizar ventajosamente análisis in vitro tales como los descritos anteriormente para escrutar rápidamente un gran número decompuestos para determinar los efectos sobrela formación del complejo por CRP1 y B7RP1. Los análisis se pueden automatizar para escrutar compuestos generados en bibliotecas de presentación en fagos, de péptidos sintéticos y de síntesis química.

5 Los compuestos que aumentan o disminuyen la formación del complejo de CRP1 y B7RP1 también se pueden escrutar en cultivo celular utilizando células y líneas celulares que expresen cualquier polipéptido. Las células y las líneas celulares se pueden obtener de cualquier mamífero, pero preferiblemente serán de fuentes humanas o de otro primate, caninas, o de roedor. La unión de B7RP1 a las células que expresan CRP1 en la superficie se evalúa en

10 presencia o ausencia de moléculas de ensayo y el grado de unión puede determinarse mediante, por ejemplo, citometría de flujo utilizando un anticuerpo biotinilado para B7RP1. Los análisis de cultivo celular se pueden utilizar ventajosamente para evaluar adicionalmente compuestos que presentan puntuación positiva en los análisis de unión de proteínas descritos anteriormente.

15 Usos Terapéuticos

Los polipéptidos descritos en la presente memoria, y los agonistas y antagonistas de los mismos, pueden ser utilizados para regular la función de las células T. Los agonistas y antagonistas incluyen aquellas moléculas que regulan la actividad de CRP1 y/o B7RP1 y, o bien aumentar o disminuyen al menos una actividad de una proteína 20 CRP1 o B7RP1 tal como una actividad asociada con funciones de las células T, por ejemplo, la activación de células

T. Los agonistas o antagonistas pueden ser co-factores, tales como una proteína, péptido, carbohidrato, lípido, o molécula de pequeño peso molecular, que interactúan con cualquiera de CRP1 o B7RP1 y con ello regulan su actividad. Los agonistas o antagonistas de polipéptidos potenciales incluyen anticuerpos que reaccionan con cualquiera de las formas solubles o unidas a la membrana de CRP1 o B7RP1 que comprenden parte o la totalidad

25 de los dominios extracelulares de dichas proteínas. Las moléculas que regulan la expresión de CRP1 o B7RP1 incluyen típicamente ácidos nucleicos que codifican proteína CRP1 o B7RP1 que pueden actuar como reguladores antisentido dela expresión.

Los polipéptidos CRP1 o B7RP1, y los agonistas y antagonistas de los mismos, se pueden utilizar en el tratamiento

30 de enfermedades autoinmunitarias, la supervivencia de injertos, la activación de células inmunitarias para inhibir el crecimiento de células tumorales, las enfermedades mediadas por células B dependiente de células T, y la inmunoterapia génica del cáncer. Los antagonistas o inhibidores de la función de CRP1 y/o B7RP1 pueden ser beneficiosos para aliviar los síntomas en enfermedades con disfunción crónica de células inmunitarias. Las enfermedades autoinmunitarias, tales como el lupus eritematoso generalizado, la artritis reumatoide, la púrpura

35 trombocitopénica inmunológica (PTI), y la psoriasis, pueden ser tratadas con antagonistas o inhibidores de CRP1/B7RP1. Además, las enfermedades inflamatorias crónicas, como las enfermedades inflamatorias intestinales (enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), la enfermedad de Graves, la tiroiditis de Hashimoto, y la diabetes mellitus, pueden también ser tratadas con inhibidores de CRP1/B7RP1. Según se ha descrito en el Ejemplo 18, CRP1-Fc inhibe y B7RP1-Fc potencia, la aparición de la enfermedad en un modelo de enfermedad de la artritis reumatoide de

40 roedor. Estos efectos opuestos en este modelo apoyan un papel agonístico para la proteína B7RP1-Fc y un papel antagónico para la proteína CRP1-Fc. Los resultados también ilustran cómo las respuestas de células T pueden ser reguladas por medio de la manipulación de esta ruta y el significado de esta ruta en la progresión de la artritis reumatoide. Además, como se describe en el Ejemplo 19, la expresión de B7RP1-Fc in vivo estimula un fenotipo de enfermedad inflamatoria intestinal (EII) en ratones transgénicos. Este ejemplo apoya el papel de B7RP1/CRP1 en el

45 desarrollo de la inflamación en el intestino. Por lo tanto, los antagonistas de la ruta B7RP1/CRP1 se pueden utilizar para tratar la EII humana.

Los antagonistas de CRP1 o B7RP1 se pueden utilizar como agentes inmunosupresores para la médula ósea y el trasplante de órganos y se pueden utilizar para prolongar la supervivencia del injerto. Tales antagonistas pueden 50 proporcionar ventajas significativas sobre tratamiento existente. La terapia de trasplante de médula ósea y de órganos deben enfrentarse al rechazo mediado por células T de las células o tejido foráneos por el anfitrión. Los regímenes terapéuticos actuales para la inhibición del rechazo mediado por células T implican el tratamiento con los fármacos ciclosporina o FK506. Si bien los medicamentos son eficaces, los pacientes sufren efectos secundarios graves, incluyendo hepatotoxicidad, nefrotoxicidad y neurotoxicidad. La diana de la clase de agentes terapéuticos de

55 ciclosporina/FK506 es la calcineurina, una fosfatasa con expresión ubicua. Puesto que la expresión de CRP1 está restringida a las células T, los inhibidores de CRP1 o B7RP1 pueden carecer de los efectos secundarios graves observados con el uso de los presentes agentes inmunoterapéuticos.

Los antagonistas de CRP1 o B7RP1 se pueden utilizar como agentes inmunosupresores para los trastornos

60 autoinmunitarios, tales como la artritis reumatoide, la psoriasis, la esclerosis múltiple, la diabetes y el lupus eritematoso generalizado.

Los antagonistas de la ruta coestimuladora mediada por CRP1/B7RP1 también se pueden utilizar para aliviar el síndrome de choque tóxico, las enfermedades inflamatorias intestinales, la alosensibilización debida a transfusiones de sangre, las enfermedades mediadas por células B dependientes de células T, y el tratamiento de la enfermedad de injerto contra anfitrión.

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Los anticuerpos, las proteínas solubles que comprenden, por ejemplo, dominios extracelulares, y otros reguladores

5 deCRP1oB7RP1quedancomoresultadolaactivacióndecélulasTprolongadaomejoradasepuedenutilizarpara el aumento de la respuesta inmunitaria a los tumores. El Ejemplo 20 muestra que B7RP1-Fc puede inhibir el crecimiento de células tumorales en ratones. Del mismo modo, B7RP1-Fc humano, u otros activadores de la ruta B7RP1/CRP1, pueden utilizarse para mejorar las respuestas inmunitarias contra tumores humanos. Se considera que la actividad antitumoral en general tienen un fuerte componente citolítico de linfocitos T. De hecho, los efectos

10 anti-tumorales de proteínas de fusión de B7-Fc (Sturmhoefel et al., Cancer Res. 59: 4964-4972, 1999) fueron mediados por células T citolíticas CD8+. Puesto que CRP1 se expresa también en células T CD8+ citolíticas (Ejemplo 9), es probable que los efectos antitumorales demostrados en el Ejemplo 20 se debieran a la acción de B7RP1-Fc sobre las células CD8+. La ruta B7RP1/CRP1 también puede ser manipulada para regular la respuesta de CTL en varios otros entornos clínicos, incluyendo el trasplante de aloinjerto, la enfermedad injerto contra anfitrión,

15 y las enfermedades autoinmunitarias.

La terapia génica que utiliza genes de B7RP1 se puede utilizar en la inmunoterapia del cáncer. Los genes de B7RP1 introducidos en las células cancerosas pueden transformarlas en células presentadoras de antígenos que pueden ser reconocidos por las células T del sistema inmunitario cuando se introducen de nuevo en un animal. El 20 reconocimiento de las células tumorales transfectadas por las células T da como resultado la erradicación tanto de las células tumorales que expresan, como de las que no expresan, el gen B7RP1. Este enfoque de la inmunoterapia puede ser utilizado para diversas leucemias, sarcomas, melanomas, adenocarcinomas, carcinomas de mama, tumores de próstata, carcinomas de pulmón, carcinomas de colon y otros tumores. Esta invención abarca la utilización del gen B7RP1 de una manera similar para potenciar la activación de las células T en respuesta a una

25 variedad de tumores.

Como se ha descrito en el Ejemplo 14, el fenotipo de los ratones transgénicos que expresan B7RP1 indica que B7RP1 es importante en el control de la producción de anticuerpos. Los agonistas y antagonistas de la actividad de la proteína B7RP1 pueden ser útiles en indicaciones terapéuticas que requieren la inhibición o potenciación de la

30 producción de anticuerpos.

Por ejemplo, muchas vacunas actúan provocando una respuesta eficaz y específica de anticuerpos. Algunas vacunas, especialmente aquellas contra microorganismos intestinales (p. ej., virus de la hepatitis A, y Salmonellas), provocan una respuesta de anticuerpos de corta duración. Es deseable potenciar y prolongar esta respuesta con el

35 fin de aumentar la eficacia de la vacuna. Por lo tanto, la B7RP1 soluble o los anticuerpos activadores contra CRP1 pueden servir como un coadyuvante de vacuna.

Las respuestas anti-virales también pueden ser potenciadas por activadores o agonistas de la ruta B7RP1/CRP1. Los datos del Ejemplo 20 indican que la inmunidad celular es potenciada por B7RP1-Fc. La potenciación de las

40 funciones inmunitarias celulares por B7RP1-Fc, u otros activadores de la ruta B7RP1/CRP1, también puede ser beneficiosa en la eliminación de células infectadas por virus. De una forma complementaria, B7RP1-Fc tiene efectos sobre las funciones inmunitarias humorales que pueden mejorar las respuestas mediadas por anticuerpos como se observa en el Ejemplo 13 que pueden funcionar para ayudar a aclarar virus libres del organismo.

45 La potenciación de las funciones inmunitarias celulares, sería deseable en el tratamiento de cáncer o las infecciones virales. La respuesta inmunitaria puede ser mejorada por la activación de la ruta de B7RP1/CRP1 opcionalmente junto con la activación de una ruta estimuladora inmunitaria separada. Un efecto sinérgico de B7RP1 y B7.2 en un modelo de hipersensibilidad crónica de ratón se muestra en el Ejemplo 24. Por lo tanto, B7RP1 o un agonista de CRP1 se pueden administrar con B7.1 o B7.2 para estimular las funciones inmunitarias. La B7RP1 o un agonista de

50 CRP1 se pueden administrar con un agonista de CD28 o un antagonista de CTLA4 para estimular las funciones inmunitarias. También se contempla que se pueda utilizar B7RP1 o un agonista de CRP1 con otras moléculas estimuladoras inmunitarias, tales como moléculas estimuladoras de células T, con el fin de mejorar las funciones inmunitarias celulares. Un agonista CRP1 es un anticuerpo que se une CRP1 y estimula o aumenta la actividad de CRP1.

55 Por el contrario, hay una serie de afecciones clínicas que mejorarían por la inhibición de la producción de anticuerpos. La hipersensibilidad es una respuesta inmunitaria normalmente beneficiosa que es exagerada o inapropiada, y conduce a reacciones inflamatorias y daño tisular. Las reacciones de hipersensibilidad, que están mediadas por anticuerpos pueden ser particularmente susceptibles al antagonismo por inhibidores de la actividad de B7RP1. Las alergias, la fiebre del heno, el asma y el edema agudo causan reacciones de hipersensibilidad de tipo I,

60 y estas reacciones pueden ser suprimidas por proteínas, anticuerpos o inhibidores de molécula pequeña de la actividad de B7RP1.

Las enfermedades que causan reacciones de hipersensibilidad mediadas por anticuerpos, incluyendo lupus eritematoso generalizado, artritis (artritis reumatoide, artritis reactiva, artritis psoriásica), nefropatías (glomerulonefritis, membranosa, mesangiocapilar, segmentaria focal, necrotizante focal, semilunar, proliferativa -tubulopatías), trastornos cutáneos (pénfigo y penfigoide, eritema nudoso), endocrinopatías (tiroiditis -de Graves, de Hashimoto diabetes mellitus insulinodependiente), diversas neumopatías (alveolitis especialmente extrínseca), diversas vasculopatías, enfermedad celíaca, con producción aberrante de IgA, muchas anemias y trombocitopenias,

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5 SíndromedeGuillain-Barre,ylamiasteniagravis,puedensertratadasconantagonistasB7RP1.

Además, trastornos linfoproliferativos, tales como el mieloma múltiple, la macroglobulinemia de Waldenstrom, y las crioglobulinemias, pueden ser inhibidos por la proteína, el anticuerpo, o los antagonistas de molécula pequeña de B7RP1.

10 Por último, enfermedad injerto contra anfitrión, un trastorno inmunológico "artificial", se puede beneficiar de la inhibición dela producción de anticuerpos por antagonistas de B7RP1.

La ruta de B7RP1/CRP1 está implicada en la regulación de la producción de IgE. IgE es un isotipo de

15 inmunoglobulina implicado específicamente en la mediación de las respuestas alérgicas, tales como el asma, las alergias alimentarias, la fiebre del heno, hipersensibilidad de tipo 1 y la inflamación en los senos. Tras la exposición a un alérgeno, un proceso que implica la colaboración de células T y células B da como resultado la producción en la células B de IgE específica para el alérgeno. La IgE específica de alérgeno liberada en la circulación por las células B se une a los mastocitos y los basófilos a través del receptor de IgE de alta afinidad (FcεRI). Los mastocitos y los

20 basófilos a los que se une la IgE se sensibilizan y la posterior exposición al alérgenos da como resultado el entrecruzamiento de los receptores de la superficie y la liberación de histaminas.

El Ejemplo 22 muestra que los ratones transgénicos que expresan una proteína de fusión B7RP1 tienen un aumento de los niveles de IgE en comparación con los ratones normales. Además, los ratones con el gen de CRP1

25 desactivado muestran la inhibición completa del cambio de clase para IgE (véase el Ejemplo 23). Estos resultados indican que la activación dela ruta de B7RP1/CRP1 conduce a la producción de IgE.

La invención proporciona el uso de moduladores de B7RP1 o CRP1 para regular la producción de IgE y para prevenir o tratar trastornos mediados por IgE. En una realización, los antagonistas de B7RP1 o CRP1 se utilizan

30 para inhibir parcial o totalmente la producción de IgE. Los antagonistas pueden ser utilizados por separado, o combinados, en un régimen de tratamiento para la disminución de los niveles de IgE. Los ejemplos de antagonistas de B7RP1 y CRP1 incluyen ácidos nucleicos, polipéptidos, péptidos, anticuerpos, carbohidratos, lípidos y moléculas pequeñas. En una realización, el antagonista es un anticuerpo que se une a B7RP1 e inhibe parcialmente o totalmente la producción de IgE. En otra realización, el antagonista es un anticuerpo que se une a CRP1 e inhibe

35 parcialmente o totalmente la actividad de CRP1. En otra realización, se puede utilizar una combinación de un antagonista de B7RP1 y un antagonista CRP1, por ejemplo, el anticuerpo antagonista de B7RP1 y un anticuerpo antagonista de CRP1. Los antagonistas de B7RP1 y CRP1 se administran en cantidades eficaces para disminuir la producción deIgE.

40 Los antagonistas de la invención se pueden utilizar para prevenir y/o tratar trastornos caracterizados por la producción excesiva o inapropiada IgE. A modo de ejemplo, dichos trastornos incluyen reacciones alérgicas, tales como el asma, las alergias alimentarias, la fiebre del heno, la hipersensibilidad y la inflamación en los senos.

La invención también proporciona un antagonista de B7RP1 o un antagonista de CRP1 combinados con un

45 antagonista de IgE para su uso para inhibir parcial o totalmente la producción de IgE y para prevenir y/o tratar trastornos caracterizados por la producción excesiva o inapropiada IgE. Según se utiliza en la presente memoria, el término "antagonista de IgE" se refiere a un compuesto capaz de interrumpir o bloquear la interacción de la IgE con su receptor de alta afinidad FcεRI en las células de tal manera que la respuesta al estímulo del alérgeno es atenuada

o eliminada. Los antagonistas incluyen un anticuerpo anti-IgE y fragmentos del mismo, receptor FcεRI soluble y

50 fragmentos del mismo, anticuerpo anti-FcεRI y fragmentos del mismo, variantes de IgE y fragmentos de las mismas, péptidos de unión de IgE, péptidos de unión al receptor FcεRI, y moléculas pequeñas capaces de unirse a IgE o competir con IgE por la unión al receptor FcεRI. Los antagonistas de B7RP1 también se pueden utilizar con combinados con antihistamínicos, desensibilización de alérgeno, reducción en la exposición al alérgeno y similares para el tratamiento de trastornos alérgicos.

55 En algunos casos, puede ser útil aumentar la producción de IgE, por ejemplo para prevenir y/o tratar trastornos relacionados con el sistema inmunitario en un anfitrión inmunológicamente comprometido. En tales casos, B7RP1 solo o junto con un agonista de CRP1 se puede administrar en cantidades suficientes para aumentar la producción de IgE.

60 La invención también proporciona un antagonista de B7RP1 o un antagonista de CRP1 solo o combinado con uno o más agentes para su uso en la prevención y/o el tratamiento del asma. Los ejemplos de tales agentes incluyen broncodilatadores (agentes anti-colinérgicos, agonistas de receptores adrenérgicos ß2, antagonistas de leucotrieno D4, antagonistas de neuroquinina, abridores de canales de potasio, antagonistas de la sustancia P, antagonistas de tromboxano A2, y xantinas), antiinflamatorios (inhibidores de 5-lipoxigenasa, inhibidores de la proteína activadora de 5-lipoxigenasa, inhibidores de la fosfodiesterasa IV, antagonistas del factor activador de plaquetas, AINE respiratorios, esteroides, e inhibidores de la tirosina quinasa), inhibidores de citoquinas (inhibidores de CD4, IL-4 e IL-5) y antagonistas deIgE como se expuso anteriormente.

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5 Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar más completamente la invención, pero no se deben interpretar como limitantes del alcance dela misma.

Ejemplo 1

10 ADNc y secuencia de aminoácidos de CRP1

Se sacrificaron ratones C57/Black 6, y se extirparon los intestinos delgados, y se retiraron las placas de Peyer. El tejido del intestino delgado se cortó abierto y se lavó para eliminar el mucus y otros desechos. La capa epitelial, que 15 contenía las células intraepiteliales intestinales (iIEL), fue liberada mediante agitación suave en RPMI-1640 con un suplemento de ditiotreitol 1 mM (DTT), durante 20 minutos a 37°C. Las células disociadas se hicieron pasar a través de un filtro de 100 μ, se lavaron en 50 ml de RPMI-1640, se mezclaron para romper adicionalmente las masas de células, y a continuación se hicieron pasan a través de un colador de 40 μ para obtener poblaciones de células individuales. Estas células selavaron a continuación de nuevo en un volumen de 50 ml de RPMI-1640 para asegurar 20 la eliminación del DTT residual. A continuación el tejido se agitó y se lavó como antes para reunir las iIEL restantes. Las iIEL se separaron de las células adiposas y de la mayoría de las células epiteliales en un gradiente de Percol de 3 etapas, con las iIEL formando bandas en la interfaz de 40% a 80%. Estas células se lavaron dos veces con RPMI1640 para eliminar las trazas de Percol, seinmunotiñeron con anticuerpos CD103 (integrina alfa IEL), y se separaron en un clasificador de células FACs Star. Estas células clasificadas se utilizaron para preparar el ARN total utilizando

25 directamente Trizol (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), o se activaron durante la noche sobre anticuerpos activadores unidos a placa, que entrecruzan los TCR gamma/delta, los TCR alfa/beta, o CD3. El ARN se preparó como antes y se agrupó para su uso en la construcción de bibliotecas de ADNc de EST.

Un clon de ADNc, designado smil2-00082-a1, contenía la secuencia de nucleótidos de homología con CD28 (Figura

30 1B). La traducción de la secuencia y la posterior comparación con proteínas conocidas en una base de datos pública reveló 19% de identidad de aminoácidos con CD28 murino (Figura 1B). Esta baja homología fue significativa porque las acciones murino CD28 única identidad de aminoácidos del 26% con CTLA-4 murino. Todas las cisteínas putativos se cree que son críticos para intra e inter-molecular unión cisteína en la familia CD28/CTLA-4 se encontraron para ser conservadas (residuos de aminoácido 83, 109, y 137; con relación ala metionina de iniciación).

35 Además, la longitud total del marco de lectura abierto putativo, y la posición relativa del dominio transmembrana, fueron similares a los de ambos CD28 y CTLA-4. Nombramos el CRP1 gen, por CD28-relacionados Protein-1.

Ejemplo 2

40 Clonación de ADNc de CRP1 humana

La secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína CRP1 humana se identifica mediante los siguientes procedimientos. Se preparó una biblioteca de ADNc humano a partir de linfocitos enriquecidos de sangre periférica humana de voluntarios humanos normales. Los linfocitos se purificaron y los glóbulos rojos se eliminaron mediante 45 Lymphocyte Separation Media (ICN Pharmaceuticals, Inc., Costa Mesa, CA). Las células se activaron después durante la noche en medio que contenía 10 ng/ml de PMA, 500 ng/ml de ionomicina, y anticuerpos activadores contra para CD3 unidos a placa. El ARN total se preparó a partir de las células activadas por medio del método de Trizol (Gibco/BRL) y el RNA poli A se aisló mediante purificación en cuentas Dynal. El ADNc se preparó a partir del ARN poli A aislado y el se seleccionó por tamaño para determinar los fragmentos de ADNc más grandes. El ADNc 50 seleccionado por tamaño se ligó a continuación en el plásmido pSPORT (Gibco/BRL). El ADN que codifica la proteína CRP1 humana se obtiene escrutando la biblioteca de ADNc de linfocitos activados mediante protocolos de placas de bacteriófagos recombinantes, o hibridación de colonias de bacterias transformadas (Sambrook et al. Supra). La biblioteca de ADNc de fagos o plásmidos se escruta utilizando sondas marcadas radiactivamente derivadas del clon de genes de CRP1 murino como se describe en el Ejemplo 1 y la Figura 1. Las sondas se utilizan 55 para escrutar filtros de nailon transferidos de la biblioteca cultivada en placa. Estos filtros se hibridan previamente durante 4 horas a 42°C en formamida al 50%, 5X SSPE, 2X disolución de Denhardt, SDS al 0,5%, y ADN de esperma de salmón de 100 µg/ml y a continuación se hibridan durante 24 horas a 42°C en formamida al 50%, 5X SSPE, 2X disolución de Denhardt, SDS al 0,5%, ADN de esperma de salmón de 100 µg/ml, y sonda de mB7RP1 de 5 ng/ml de. Las transferencias se lavan en 2X SSC, SDS al 0,1% durante 10 min a RT, 1X SSC, SDS al 0,1%

60 durante 10 min a 50°C, 0,2X SSC, SDS al 0,1% durante 10 min a 50°C, a continuación, 0,2X SSC durante 10 minutos a 50°C de nuevo. Los insertos obtenidos a partir de cualquiera de los clones de CRP1 humana son secuenciados y analizados como se describe en el Ejemplo 1.

Ejemplo 3

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ADN y secuencia de aminoácidos de B7RP1

Un clon de ADNc, denominado smill-00003-g5, contenía homología de la secuencia de nucleótidos de B7.1 (CD80) y B7.2 (CD86). La traducción de la secuencia (Figura 2A) y la posterior comparación con proteínas conocidas en una 5 base de datos pública reveló 20% de identidad de aminoácidos con B7.1 murino (Figura 2B). Esta baja homología fue significativa puesto que B7.1 murina comparte única identidad de aminoácidos de 24% con B7.2 murina. A pesar de esta baja homología, los residuos de cisteína críticos están conservados entre el marco de lectura abierto de este clon y B7.1 y B7.2 murinas en los residuos 62, 138, 185, y 242 (con respecto a la metionina deiniciación, Figura 2B). La longitud aproximada de la proteína madura y la localización de la región transmembrana con respecto al extremo

10 carboxi también son similares en el supuesto ORF de este clon, en comparación con B7.1 y B7.2. Los autores de la presente invención denominaron al gen B7RP1, por Proteína-1 Relacionada con B7.

Ejemplo 4

15 Clonación de ADNc humano de B7RP1

Una búsqueda de homología BLAST GenBank (GCG, Universidad de Wisconsin) utilizando la secuencia de B7RP1 murina (véase la Figura 2) recuperó un clon (AB014553) que contiene una secuencia de 4358 pb con 1679 pb del ORF. Los cebadores de clonación de PCR fueron diseñados de acuerdo con esta secuencia. Se obtuvo un

20 fragmento de ADN de 1313 pb mediante RACE 5' y 3' utilizando ADNc Human Lymph Node Marathon-Ready™ (Clontech, Palo Alto, CA) de acuerdo conlos procedimientosrecomendados por el fabricante. Cebadores utilizados para B7RP1 humana completa:

2083-75 ACC ATG CGG CTG GGC AGT CCTGGA (SEQ ID NO: 25)

25 2083-76 TGG TGA CCT ACC ACA TCC CAC AG (SEQ ID NO: 26) 2083-77 TCC GATGTC ATT TCC TGT CTG GC (SEQ ID NO: 27) 2083-78GCT CTG TCT CCG GAC TCA CAG CCC

30 (SEQ ID NO: 28) 2113-29GTG GCAGCA AAC TTC AGC GTG CCC GTCG (SEQ ID NO: 29) 2113-30 CCC AACGTG TAC TGG ATC AAT AAG ACG G (SEQ ID NO: 30)

35 2113-31GCGTGCTGAGGATCGCACGGACCCCCAG

(SEQ ID NO: 31) Los cebadores 2083-75 y 2083-76 se utilizaron para amplificar el extremo 5' del gen utilizando protocolos RACE. Los cebadores 2083-77, 2083-78, 2113-29, 2113-30, y 2113-31, se utilizaron para amplificar el extremo 3' del gen utilizando protocolos RACE.

40 La secuencia de nucleótidos resultante contenía un ORF de 288 residuos de aminoácido a partir de la metionina. A continuación, se comparó la secuencia de aminoácidos B7RP1 humana madura pronosticada con la secuencia de aminoácidos de B7RP1 de ratón madura (Figura 3B) y se encontró que compartía una identidad de aminoácidos de 48%. Esta homología es significativo porque la homología entre especies es baja con el gen CD80 (B7.1), de hecho,

45 CD80 de ratón y humano comparten una identidad de aminoácidos de solo 41%. Es importante destacar que la proteína B7RP1 humana conserva residuos de cisteína críticos necesarios para estructuras de bucle de Ig (residuos de aminoácido 16, 92, 138, 194, y 195, con respecto a la proteína madura, Figura 3B). Además, la longitud total y la posición del dominio transmembrana son congruentes con un homólogo de B7RP1 humana.

50 Ejemplo 5

Expresión del ARN de B7RP1

Hibridación in situ de ARN utilizando sondas de ARN para el gen de B7RP1. Se fijaron tejidos de ratón adulto en

55 paraformaldehído al 4%, se embebieron en parafina, y se seccionaron a 5 µm. Antes de la hibridación in situ, los tejidos se permeabilizaron con HCl 0,2 M, seguido por la digestión con proteinasa K, y acetilación con trietanolamina y anhídrido acético. Las secciones se hibridaron durante la noche a 55°C con una ribosonda marcada con 33P de 969 bases correspondiente a los nucleótidos 1 a 969 de la secuencia de B7RP1 de ratón. El exceso de sonda se eliminó mediante digestión con ARNasa, seguido por una serie de lavados en tampón con concentraciones de sal

60 decrecientes, y a continuación un lavado de alta rigurosidad en 0,1X SSC a 55°C. Los portas se sumergieron en emulsión Kodak NTB2, se expusieron a 4°C durante 2-3 semanas, se revelaron y se contratiñeron con hematoxilina y eosina. Las secciones se examinaron con campo oscuro e iluminación de luz transmitida para permitir la evaluación simultánea de lamorfología delos tejidos yla señal de hibridación.

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El análisis del ARN de B7RP1 mediante hibridación in situ mostró que el ARN de B7RP1 fue altamente expresado en áreas de maduración linfoide y activación de linfocitos. El ARN de B7RP1 se expresa en los tejidos linfoides del timo, las placas de Peyer del intestino, el bazo y los ganglios linfáticos. Expresión dentro de estos tejidos linfoides demostró que el ARN de B7RP1 es expresado generalmente en las zonas de células B y otra implicación de APC.

5 Estas regiones incluyen al zona de la médula del timo, los folículos primarios de los ganglios linfáticos, y las regiones foliculares y la cúpula de las placas de Peyer. La expresión del ARN de B7RP1 es altamente específica para las regiones de la participación de APC en lostejidos linfoides.

El análisis de varios tejidos no linfoides también reveló expresión de B7RP1 en las regiones de participación de

10 APC. En el pulmón, se encontró expresión de B7RP1 en las regiones submucosas, coherente con una función en el procesamiento de antígenos. En el intestino delgado, se encontró ARN de B7RP1 en la lámina propia. En particular, los autores de la presente invención han encontrado una sección del hígado dañado, que mostró la infiltración de linfocitos que se solapa con la expresión del ARN de B7RP1. Esta coincidencia de expresión de B7RP1 con la acumulación de linfocitos en respuesta a daño tisular indica fuertemente que B7RP1 está implicada en la activación

15 de linfocitos.

Ejemplo 6

Expresión del ARN de CRP1

20 Hibridación in situ ARN utilizando sondas de ARN con el gen CRP1. Se prepararon tejidos de ratón como en el Ejemplo 5. La permeabilización del tejido, la hibridación de la sonda, el tratamiento de los portas, y la tinción de tejidos fueron las descritas en el Ejemplo 5. Las secciones se hibridaron durantela nochea 55°C con una Ribosonda marcada con 33P de 603 bases correspondiente a los nucleótidos 1 a 603 de la secuencia de CRP1 de ratón. Las

25 secciones se examinaron con campo oscuro e iluminación de luz transmitida para permitir la evaluación simultánea de la morfología de los tejidos y la señal de hibridación.

Se seccionaron los ganglios linfáticos de los ratones normales o un ratón tratado con oxazolona y se analizaron para determinar la expresión del ARN de CRP1. El ganglio linfático del ratón sensibilizado mostró unamayor expresión de

30 ARN de CRP1 que el ganglio linfático normal de ratón. La expresión de CRP1 se encontró en la paracorteza, una región de la actividad de células T. Por lo tanto, la expresión del ARN de CRP1 es coherente con la expresión de los linfocitos T y es regulada al alza tras la activación de las células T.

Ejemplo 7

35 Expresión y purificación de las proteínas de fusión CRP1-Fc y B7RP1-Fc

Para construir el vector de expresión de ADN para la proteína de fusión Fc-CRP1, se fusionó la secuencia codificante de los primeros 147 aminoácidos amino terminales de la CRP1, en marco, a la secuencia codificante de

40 235 aminoácidos carboxi terminales del gen de Fc humano (isotipo IgG1) y se ligó dentro de la secuencia poliligadora de pADNc3 (pADNc3/CRP1-Fc). Para construir el vector de expresión de ADN para la proteína de fusión B7RP1-Fc, se fusionó la secuencia codificante de para los primeros 269 aminoácidos amino terminales de B7RP1, en marco, a la secuencia codificante de 235 aminoácidos carboxi terminales del gen Fc humano (isotipo IgG1) y se ligó dentro de la secuencia poliligadora de pADNc3 (pADNc3/B7RP1-Fc). Las secuencias codificantes de CRP1 y de

45 B7RP1 contenían secuencias del extremo N-terminal de cada proteína hasta, pero sin incluir, la supuesta región transmembrana de cada proteína. Se transfectaron células 293T ya sea con pADNc3/CRP1-Fc o pADNc3/B7RP1-Fc utilizando el reactivo de transfección FuGene 6 (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN). Después de cuatro días, se recogieron los medios acondicionados y las proteínas de fusión de Fc se purificaron mediante cromatografía por lotes utilizando Proteína A Sepharose (Pharmacia). Las proteínas de fusión Fc unidas a la columna se eluyeron

50 con tres volúmenes de la columna de tampón de elución Immunopure Gentle (Pierce), y a continuación se dializaron frente a 150 volúmenes de HEPES 20 mM, NaCl 100 mM, pH 7,5. La proteína dializada se concentró utilizando productos concentrados con centrífugas Macrosep, MWCO 30 kD (Pall Filtron), y las concentraciones de proteína se calcularon utilizando coeficientes de extinción derivados de la secuencia de aminoácidos de cada proteína. La expresión de la proteína de fusión CRP1-Fc semuestra en la Figura 4A, la expresión de proteína de fusión B7CPR1

55 FcsemuestraenlaFigura4B.

Ejemplo 8

Identificación de CRP1 y B7RP1 como par receptor-ligando

60 Con el fin de determinar si las nuevas proteínas eran parte de la misma ruta coestimuladora como la que contiene CD28, CTLA-4, B7.1, y B7.2, se utilizó un análisis de presentación en la superficie celular. Este análisis utiliza análisis ACAS (Análisis y Clasificación de Células Adherentes en sus siglas inglesas) para analizar si las proteínas unidas a la membrana expresadas en las células interactúan con varias proteínas de fusión de Fc. Las células que expresan las proteínas unidas a membrana, indicadas en el lado izquierdo de la Figura 5, se incubaron con proteínas defusión de Fc, indicadas en la parte superior de la figura.

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Las células Cos-7, cultivadas en medio DMEM con FBS al 10%, se sembraron a 500.000 células/pocillo en una

5 placa de 24 pocillos. Las células fueron transfectadas utilizando el reactivo FuGene 6 (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN). Para cada transfección, se añadieron 3 µl de reactivo FuGene 6 a 47 µl de medio DMEM sin suero. Después de una incubación de 10 min a temperatura ambiente, se añadieron a la mezcla 0,25 µg de plásmido gota a gota y a continuación se incubó durante15 minutos. A continuación, la mezcla anterior se añadió a las células con 0,5 ml de DMEM con FBS al 10%. Las células se incubaron a 37°C en una atmósfera de CO2 al

10 5%. Como control, también se cultivaron en placa células CHO D, transfectadas de forma estable con un plásmido de expresión que contenía el ADNc de CD28 humano, a 500.000 células/pocillo en una placa de 24 pocillos.

Después de 48 h, el medio con el reactivo de transfección se retiró y las células se lavaron dos veces con RPMI más FBS al 5%. Se añadieron a las células de 10 a 20 ng de proteínas de fusión de Fc purificadas en 1 ml demedio, que

15 se incubaron durante 30 min en hielo. Las células se lavaron tres veces con RPMI más FBS al 5% y a continuación se incubaron con 2 µl de anticuerpo anti-Fc humano conjugado con FITC (1 mg/ml) durante otros 30 min en hielo. Después de tres lavados sucesivos con RPMI, las células se cubrieron con 250 µl demedio RPMI sin rojo fenol para el análisis ACAS.

20 El análisis ACAS de las células que se unían a las diversas proteínas de fusión de Fc demostró que la proteína B7RP1 se unía a CRP1, pero no a las proteínas en la ruta coestimuladora conocida, CD28 o CTLA-4. A la inversa, CRP1 interactuó con B7RP1, pero no con B7.2, un componente en la ruta conocida. (Véase la Figura 5). Estos resultados indican fuertemente que CRP1 y B7RP1 representan un par receptor-ligando novedoso, análogo a CD28 y B7.2. Sin embargo, puesto que CRP1 y B7RP1 no interactúan con B7.2, CTLA-4, o CD28, éstas están separadas y

25 son independientes de la ruta coestimuladora conocida.

Ejemplo 9

Identificación de células que expresan receptores B7RP1

30 La proteína de fusión B7RP1-Fc se utilizó para detectar las células que expresaban los receptores para B7RP1, presumiblemente incluyendo la proteína CRP1 (véase el Ejemplo 6), mediante análisis FACS. Se extrajeron los bazos de ratones C57/Black 6 hembra, se trituraron en filtros de malla de 100 micras para liberar los linfocitos, se hicieron pasar a través de filtros de 70 micras, y después se lavaron en 50 ml de RPMI-1640. Sedimentaron a 1500

35 rpm, se resuspendieron en RPMI fresco, se mezclaron para romper las células que formaban de grumos, y se hicieron pasar a través de un filtro de 40 micras. Las células T que iban a ser activadas fueron sembradas en placas de 6 pocillos en medio RPMI-1640, FBS al 5%, 1XPSG, PMA, ionomicina, y se incubaron a 37°C, CO2 al 5% durante la noche. La activación de células T se comprobómediante la confirmación visual después de 12 hr.

40 Las células de bazo activadas para la inmunotinción se lavaron en PBS, BSA al 0,5% (Path-ocyte 4, ICN Pharmaceuticals) tampón de lavado, se resuspendieron, y a continuación se dividieron en alícuotas en volúmenes de 100 microlitros. Se añadieron 15 µg/ml de o bien la proteína de fusión Fc-CRP1 o la proteína de fusión Fc-B7RP1 (1,5 µg/muestra) según fuera apropiado, y después las mezclas se incubaron en hielo durante 30 min mezclando ocasionalmente. Las células se lavaron dos veces en 5,0 ml de tampón de lavado. La unión de las proteínas de

45 fusión se visualizó con 2 µg de anticuerpo secundario cabra anti-(GaHuFc-FITC) humano conjugado en un volumen de 100 µl para la tinción celular. Se añadieron anticuerpos marcadores de células conjugados con PE con GaHUFc-FITC, así como controles de anticuerpos conjugados con PE de isotipo de control (isotipo de rata) cuando se indique. Las muestras se incubaron en hielo y se lavaron como antes. La visualización se realizó mediante análisis FACScan con acotamiento de poblaciones de linfocitos. La doble tinción con anticuerpos CD4+ y la proteína de

50 fusión B7RP1-Fc indicó que las células expresaban tanto el marcador CD4 como el receptor de B7RP1, presumiblemente CRP1 (Figura 6). Del mismo modo, la tinción doble con anticuerpos CD8+ y la proteína de fusión B7RP1-Fc demostró que las células expresan tanto los receptores CD8 como B7RP1 (Figura 6). Los autores de la presente invención no han podido detectar de forma fiable estas células con doble tinción en las preparaciones de esplenocitos inactivados. Puesto que CD4 y CD8 son marcadores de linfocitos T, los autores de la presente

55 invención pueden postular que CRP1 se expresa en las células T CD4+ y CD8+ activadas. Estos datos son coherentes con el aumento de la expresión de ARN de CRP1 en las regiones de células T de ganglios linfáticos de ratones sensibilizados en comparación con los ratones normales (Ejemplo 6).

Ejemplo 10

60 Identificación de células que expresan ligandos CRP1

La proteína de fusión CRP1-Fc se utilizó para detectar las células que expresaban ligandos a CRP1, presumiblemente incluyendo la proteína B7RP1 (véase el Ejemplo 8), mediante análisis FACS (Figura 7). Los esplenocitos se prepararon como en el Ejemplo 8, excepto que se omitió la etapa de activación de células T de 12 hr y las células se analizaron directamente. Los esplenocitos se sometieron a tinción doble con anticuerpos marcadores CD45R (B220) y la proteína de fusión CRP1-Fc. Se detectaron las células que expresaban tanto el marcador de células B CD45R y los supuestos ligandos para CRP1, presumiblemente incluyendo B7RP1 (Ejemplo 8). Por lo

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5 tanto, se concluye que B7RP1 se expresa sobre células B, un tipo de célula presentadora de antígeno. Estos datos son coherentes con la expresión del ARN de B7RP1 en regiones de células B de diversos tejidos linfoides (Ejemplo 5).

Análisis FACS de la expresión de B7RP1 en los macrófagos peritoneales (Figura 8). Las células peritoneales se

10 recolectaron mediante lavado local a partir de un ratón normal y se lavaron antes de ser incubadas con la proteína de fusión CRP1-Fc o la proteína Fc como control o con el anticuerpo monoclonal F4/80 (que detecta un antígeno específico paramacrófagos) o un anticuerpo monoclonal de control de isotipo coincidente, irrelevante. Las células se lavaron de nuevo y se incubaron con anticuerpo de cabra anti-Fc humano conjugado con FITC. Tras un nuevo lavado, las células fueron evaluadas en un analizador FACS por sus propiedades de dispersión de luz y tinción de

15 fluorescencia. Las células peritoneales se distinguieron primero en subgrupos basándose en sus propiedades de dispersión de luz (Figura 8A). Los macrófagos se identificaron en la región 5 (R5) debido a su capacidad para dispersar fuertemente la luz frontal (FSC) y lateral (SSC) y debido a su tinción positiva para el antígeno F4/80, un marcador de macrófagos (Figura 8B). Los macrófagos de la región 6 (R6) fueron señalados basándose en su tinción menosintensa para el antígeno F4/80 y se encontró que eran teñidos por la proteína de fusión CRP1-Fc (Figura 8C).

20 Estos datos indican que los ligandos para CRP1, posiblemente incluyendo B7RP1, se expresan en los macrófagos, una célula presentadora de antígeno profesional. Esto es coherente con la función de CRP1 y B7RP1 en la activación de los linfocitos T.

Ejemplo 11

25 Actividad inhibidora in vitro de la proteína de fusión B7RP1-Fc en linfocitos T estimulados con ConA

Se prepararon esplenocitos de ratón como en el Ejemplo 8 y se enriquecieron en linfocitos T mediante selección negativa (R y D Systems, Inc., Minneapolis, MN)). Se utilizaron 200.000 esplenocitos en análisis de proliferación de 30 células T en una placa de fondo redondo de 96 pocillos. Las células se incubaron durante 1 hora con medios (sin adiciones), CRP1-Fc, B7RP1-Fc, o B7.2-Fc, proteínas de fusión como se indica la figura 9. Se añadieron medios (sin adiciones), o Con A a diversas concentraciones como se indica en la parte inferior de la Figura 9. Las células se incubaron a continuación a 37°C y CO2 al 5%. Al cabo de 42 horas, las células se pulsaron con 3H-timidina durante 6 horas, se cosecharon y se determinó la radiactividad incorporada. Las CPM medias y la desviación típica de las

35 muestras por triplicado se representan en la Figura 9.

Las proteínas de fusión Fc no demostraron actividad estimuladora o inhibidora de células T significativa por sí mismas, sin embargo, en la presencia de 1 µg/ml y 3 µg/ml de Con A, las proteínas fusión B7RP1-Fc y B7.2-Fc conocida mostraron una actividad inhibidora significativa (Figura 9). A altas concentraciones (10 µg/ml), la

40 estimulaciónconConAdacomoresultadolamuertecelular,presumiblementeatravésdeactivaciónexcesivadelas células T. La adición de cualquiera de B7RP1-Fc o B7.2-Fc, protegió de manera significativa las células de los efectos perjudiciales de las altas concentraciones de Con A. En ambas funciones inhibidoras y de protección, el efecto por la proteína B7RP1-Fc fue mayor que el proteína B7.2-Fc sobre las células estimuladas con Con A. Estos datosindican que las funciones de la proteína B7RP1 regulan la proliferación de células T.

45 Ejemplo 12

Administración sistémica dela proteína defusión B7RP1-Fc en ratones transgénicos

50 La proteína de fusión B7RP1-Fc descrita en el Ejemplo 7 se subclonó en un vector de expresión específico de hígado ApoE (Simonet et al. J. Clin. Invest. 94, 1310-1319 (1994) y Solicitud PCT Núm. US94/11675). La región codificante se escindió de pCEP4/B7RP1-Fc utilizando las enzimas de restricción, Spe I y Not I, y el fragmento se subclonó en los mismos sitios en el vector de expresión específico de hígado ApoE anteriormente mencionado. El plásmido resultante, HE-B7RP1-Fc, se secuenció a través de su región codificante de proteínas, y las secuencias

55 queflanqueanlaregióncodificante,paraasegurarsedequeestabalibredemutaciones.

El plásmido se amplificó y se purificó a través de dos rondas de centrifugación en gradiente de densidad de CsCl. El ADN plasmídico purificado se digirió con las enzimas de restricción, Cla I y Ase I, y el inserto del transgén de 1,5 kb se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa. El fragmento purificado se diluyó a una disolución inyectables

60 departidade1µg/mlenTris5mM,pH7,4,yEDTA0,2mM. EmbrionesunicelularesderatonescriadosconBDF1X BDF1 fueron inyectados esencialmente como se ha descrito (Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4338 (1985)), excepto que las agujas de los inyectables se biselaron y se siliconizaron antes de su uso. Los embriones se cultivaron durante una noche en un incubador de CO2 y de 15 a 20 embriones de 2 células se transfirieron a los oviductos deratones hembra CD1 pseudopreñada.

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Después de la gestación a término, se obtuvieron 56 crías a partir de la implantación de los embriones microinyectados. Las crías se seleccionaron mediante amplificación por PCR del transgén integrado en muestras de ADN genómico. La región diana para la amplificación era una región de 369 pb del intrón Apo E humano que estaba incluido en el vector de expresión. Los oligos utilizados para la amplificaciónmediante PCR fueron:

5 5'-GCC TCT AGA AAG AGC TGG GAC-3' (SEQ ID NO: 32) 5'-CGC CGT GTT CCA TTT ATG AGC-3' (SEQ ID NO: 33)

Las condiciones para la PCR fueron: 94°C durante 2 min, 1 ciclo; 94°C durante 1 min, 63°C durante 20 seg, y 72°C durante 30 seg, 30 ciclos. De las 56 crías originales, 7 fueron identificadas como ratones fundadores transgénicos

10 positivos para PCR.

A las 12 semanas de edad, nueve fundadores transgénicos (Ratón Núm. 1, 2, 4, 6, 8, 30, 32, 33, 40) y cinco controles (Ratón Núm. 5, 9, 10, 25, 28) fueron sacrificados para la necropsia y el análisis patológico. El ARN celular total se aisló de los hígados de los animales fundadores y de los compañeros de camada de control negativo como 15 se ha descrito (McDonald et al. Meth. Enzymol. 152, 219 (1987)). El análisis de transferencia Northern se realizó en estas muestras para evaluar el nivel de expresión de los transgenes. Aproximadamente 10 µg del ARN total de cada animal se resolvió mediante electroforesis en geles de agarosa desnaturalizantes (Ogden et al. Meth. Enzymol. 152, 61 (1987)), a continuación se transfirieron a una membrana de nylon Hybond-N (Amersham), y se sondearon con ADNdeinsertomB7RP1-FcmarcadocondCTP 32P.Lahibridaciónserealizódurante1horaa63°Cendisolución

20 ExpressHyb (Clonetech) y 2-4 X 106 CPM de sonda marcada/ml de tampón de hibridación. Después de la hibridación, las transferencias se lavaron dos veces en 2X SSC, SDS al 0,1% a temperatura ambiente durante 5 min cada uno, y a continuación dos veces en 0,1X SSC, SDS al 0,1% a 55°C durante 15-20 min cada uno. La expresión del transgén en los compañeros de camadafundadores y decontrol se determinó siguiendo la autorradiografía.

25 Los análisis de transferencia de Northern indicó que siete de los fundadores transgénicos expresaban niveles detectables de ARN del transgén (ratón núm. 1, 2, 6, 8, 32, 33, y 40). Los ratones de control negativo y tres fundadores (núms. 4, 30, y 31) no expresaron niveles detectables de ARN. Dado que se determinó que la proteína de fusión B7RP1-Fc era secretada a partir de células demamífero en cultivo (Figura 4B y el Ejemplo 7), la expresión del ARNm del transgén debe ser indicativo del nivel de producto génico sistémicamente liberado.

30 Ejemplo 13

Actividad biológica dela proteína defusión Fc-B7RP1

35 Siete de los ratones transgénicos (ratón Núm. 1, 2, 6, 8, 32, 33, y 40) y cinco compañeros de camada de control (núm. 5, 9, 10, 25, y 28) fueron sacrificados para la necropsia y el análisis patológico mediante lo siguientes procedimientos: Antes de la eutanasia, todos los animales tenían sus números de identificación verificados, a continuación se pesaron, se anestesiaron y se les extrajo sangre. La sangre se guardó como suero y sangre completa para un panel de química y hematología de suero completo. La radiografía se llevó a cabo inmediatamente

40 despuésdelaanestesiaterminalmedianteinhalaciónletaldeCO2,yantesdeladisecciónenbruto. Acontinuación, los tejidos se retiraron y se fijaron en Zn-formalina tamponada al 10% para el examen histológico. Los tejidos recogidosincluyeron el hígado, el bazo, el páncreas, el estómago, el duodeno, el íleon, las placas de Peyer, el colon, el riñón, los órganos reproductores, la piel, las glándulas mamarias, el hueso, el cerebro, el corazón, el pulmón, el timo, la tráquea, el esófago, la glándula tiroidea/paratiroidea, el yeyuno, el ciego, el recto, las glándulas

45 suprarrenales, la grasa blanca y parda, el nervio ciático, la médula ósea, la vejiga urinaria, y el músculo esquelético. Antes de la fijación, los pesos de los órganos completos se determinaron para el hígado, corazón, estómago, riñón, las glándulas suprarrenales, el bazo y el timo. Después de la fijación, los tejidos se procesaron en bloques de parafina, y se obtuvieron secciones de 3 µm.

50 Se llevó a cabo la inmunohistoquímica para el marcador de linfocitos B, B220, y el marcador de linfocitos T, CD3. Para detectar la expresión de B220 o CD3, se desparafinaron secciones de 4 µm fijadas con formalina, embebidas en parafina, y se hidrataron con agua desionizada. Las secciones se sofocaron con peróxido de hidrógeno al 3%, se bloquearon con Protein Block (Lipshaw, Pittsburgh, PA), y se incubaron en anticuerpo monoclonal de rata para B220 (Pharmingen, San Diego, CA) o anticuerpo policlonal de conejo para CD3 (Dako, Carpinteria, CA ). Los anticuerpos

55 se detectaron mediante inmunoglobulinas anti-rata de conejo o anti-conejo de cabra biotiniladas, estreptavidina conjugada con peroxidasa, (BioGenex, San Ramon, CA) con DAB como cromógeno (Biotek, Santa Barbara, CA). Las secciones se contratiñeron con hematoxilina.

En este estudio, se registraron los signos clínicos normales durante la fase de vida del estudio. Las radiografías del

60 cuerpo entero de los ratones transgénicos fueron comparables a las de los ratones de control. Los parámetros hematológicos generales de los ratones transgénicos fueron comparables a los del grupo control negativo, aunque estuvieron presentes cambios esporádicos en los ratones individuales: el transgénico Núm. 8 y el Núm. 40 tenían un aumento de los niveles de globulina en suero (hiperglobulinemia) y el Núm. 32 y el Núm. 33 tenían niveles de globulina en el intervalo normal alto acompañado de niveles de albúmina en el intervalo normal bajo, que es un patrón comúnmente observado con la estimulación antigénica crónica del sistema inmunitario. Los pesos de los órganos delos otros ratones transgénicos no fueron significativamente diferentes de los del grupo de control.

imagen48

En los ratones transgénicos estuvieron presentes los siguientes cambios histopatológicos: Los ganglios linfáticos

5 mesentéricos de los ratones B7RP1-Fc transgénicos fueron moderadamente a notablemente agrandados en comparación con los ratones de control (Fig. 10A-10D; Fig. 11A-11E). El córtex tuvo destacada hiperplasia folicular observada en forma de folículos secundarios agrandados (Fig. 10B-11B) con grandes centros germinales que contienen principalmente células B220 + B (Fig. 11D) y unas pocas células T CD3+ dispersas (Fig. 11F). La zona paracortical (células T CD3+) también fue moderadamente agrandada (Fig. 11B-11F) y los senos medulares habían

10 aumentado ligeramente el número de macrófagos carnosas (histiocitosis sinusal). El cambio más notable en los ganglios estuvo presente en los cordones medulares, que estaban de ligeramente a notablemente expandidos por un gran número de células plasmáticas bien diferenciadas en los ratones transgénicos B7RP1-Fc (Fig. 10D). En los ratones transgénicos Núm. 40, también se encontraron pequeñas cantidades de cuerpos de Russell dispersos (es decir, las células plasmáticas con vesículas intracitoplasmáticas prominentes, grandes, redondas, que contienen

15 inmunoglobulinas) en los cordones medulares (Fig. 10D). Curiosamente, los otros ganglios linfáticos internos y periféricos (por ejemplo, cervical, inguinal) tenían características morfológicas similares de la hiperplasia linfoide reactiva que sugería una respuesta sistémica. Estos hallazgos son coherentes con una estimulación inmunitaria crónica, continua con potenciación de la reacción inmunitaria humoral, que conduce a la proliferación de células B y la diferenciación terminal a células plasmáticas.

20 El bazo de los ratones transgénicos B7RP1-Fc había agrandado de forma variable las áreas de pulpa blanca con hiperplasia linfoide reactiva moderada que implicaba particularmente los folículos secundarios de las células B con centros germinales prominentes y vainas periarteriolares de células T en comparación con los ratones de control (Fig. 10E-10F). Otro hallazgo visible en los ratones transgénicos B7RP1-Fc fue una plasmocitosis de mínima a leve

25 en la zona marginal que rodea las áreas de pulpa blanca y en la pulpa roja adyacente. El ratón transgénico Núm. 6 tenía unos pocos cuerpos de Russell dispersos (Fig. 10F, recuadro). La pulpa roja tenía hematopoyesis extramedular de leve a moderada, que era comparable a la observada en los ratones de control (Fig. 10E).

Las placas de Peyer intestinales pequeñas se agrandaron de ligeramente a notablemente en los ratones

30 transgénicos B7RP1-Fc en comparación con las de los ratones de control (Fig. 10G) y tenían folículos muy grandes con destacados centros germinales, en particular en el ratón transgénico Núm. 40 y Núm. 32 (Fig. 10H). Además, hubo un aumento de mínimo (en el Núm. 32) a leve (en el Núm. 8 y Núm. 33) del número de linfocitos y células plasmáticas (mezcladas con un leve producto infiltrado de eosinófilos en el íleon de Ratón Núm. 32) en capa de la lámina propria engrosada de la mucosa, que estaba presente en el intestino delgado, pero más prominente en el

35 colon de los ratones transgénicos. Los agregados linfoides intestinales grandes (GALT) también fueron ligeramente más prominente en algunos ratones transgénicos B7RP1-Fc (particularmente el Ratón Núm. 8 y Núm. 2) que en el grupo control.

Generalmente, los otros tejidos examinados, incluyendo el timo, la médula ósea, el hígado, el pulmón, el corazón, el

40 páncreas, loe riñones, la glándula adrenal, la tiroides, la paratiroides, la tráquea, los órganos reproductores, la vejiga urinaria, la glándula mamaria, la piel, el músculo esquelético, el nervio periférico, el cerebro, el esófago, el estómago, el intestino delgado y grueso, el hueso (fémur/tibia), la articulación femoro-tibiarotuliana, la grasa blanco y parda parecían normales y comparables a los cambios defondo detectados en los ratones de control.

45 Los datos de este estudio demuestran que la expresión en exceso de la quimera de Fc con la proteína relacionada con B7 (B7RP1-Fc) en ratones transgénicos induce un fenotipo caracterizado por la prominente hiperplasia linfoide reactiva detectada en el bazo, los ganglios linfáticos periféricos e internos, y el tejido linfoide asociado al intestino, como hiperplasia folicular, expansión de las zonas de células T y plasmocitosis conspicua acompañada de hiperglobulinemia en algunos animales. La plasmocitosis está acompañada por niveles más altos de IgG circulante

50 (media ± DT = 597 ± 298 mg/ml en ratones transgénicos frente a 209 ± 80 mg/ml en compañeros de camada de control, n = 7, P <0,05, prueba t), en particular IgG2a (217 ± 100 mg/ml vs. 75 ± 29 mg/ml, n = 7, P <0,01, prueba t). La inducción de IgG2a se asocia normalmente con un citoquinas Th1, tales como IFN-g. De este modo, B7RP1 induce la proliferación de células B y T y estimula la diferenciación de las células B a células plasmáticas y la producción deinmunoglobulina.

55 Estos cambios son coherentes con una respuesta inmunitaria sistémica persistente con hiperestimulación del brazo humoral del sistema inmunitario que da como resultado la estimulación de las células B, la proliferación y la diferenciación de células plasmáticas productoras de anticuerpos a través delos órganoslinfoides examinados.

60 Los autores de la presente invención llegaron a la conclusión a partir de la marcada hiperplasia linfoide demostrada en los ratones transgénicos B7RP1-Fc que la proteína B7RP1 tiene actividad biológica significativa in vivo, relacionada conla estimulación del sistema inmunitario.

Ejemplo 14

imagen49

Clonación de B7RP1 humana

Se separaron linfocitos periféricos circulantes humanos normales de los glóbulos rojos utilizando Lymphocyte Separation Medium (ICN Pharmaceuticals). Las células T se activaron a continuación con 10 µg/ml de anticuerpo 5 anti-CD3 unido a placa (Immunotech, Westbrook, ME), 10 ng/ml de PMA y 500 ng/ml ionomicina durante la noche (16 horas) a 37°C y CO2 al 5%. A continuación, el ARN total se preparó a partir de las células utilizando el reactivo TRIzol (Gibco BRL). Las células se sedimentaron mediante centrifugación y el sedimento celular se resuspendió en 1 ml de reactivo TRIzol para cada 5 X 106 células y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 min. A continuación se añadieron 0,2 ml de cloroformo por 1 ml de reactivo TRIzol original. Los tubos se agitaron 10 vigorosamente a mano durante 15 segundos y se incubaron durante 3 minutos a RT y se centrifugaron a 13.000 rpm durante 15 min a 4°C. Después de la centrifugación, se recogió la fase acuosa superior clara que contenía el ARN y la muestra de ARN se precipitó mediante adición de alcohol isopropílico. La disolución se incubó a continuación a RT durante 10 min, el ARN se sedimentó, se lavó con etanol al 75%, y después se centrifugó a 15.000 rpm durante 5 min a 4°C. El sedimento se secó al aire, se resuspendió en agua libre de ARNasa, a continuación se dividió en

15 alícuotasysealmacenóa -80°Chastasuusoposterior.

La biblioteca se construyó utilizando el sistema de plásmido Superscript para la síntesis de ADNc y Plasmid Cloning (Gibco BRL). En resumen, se ligaron insertos de ADNc con un tamaño medio de 2 kb en el vector pSport en el sitio de clonación Sall/Not1. Los plásmidos ligados se sometieron a electroporación E. coli competentes para 20 transformación Electromax (Gibco BRL), se titularon y se sembraron a quince mil colonias por placa LB (100 µg/ml de ampicilina). Se transfirieron 300.000 colonias sobre membranas de transferencia de hibridación para el escrutinio de colonias/placas (NEN Life Sciences), se desnaturalizaron en NaOH 0,5 N, NaCl 1,5 M durante 5 minutos, después se neutralizaron sucesivamente durante 5 minutos cada una en los siguientes tampones, Tris HCl 1 M de pH 8,0, Tris HCl 0,5 M de pH 8,0 y M NaCl 1,5 y 2X SSC. Los filtros se entrecruzaron a continuación mediante

25 irradiación ultravioleta y se cocieron durante 30 min a 80°C en un horno de vacío. Los filtros se pre-lavaron exhaustivamente en 2X SSC a 42°C para eliminar los desechos, a continuación se prehibridaron a 42°C en formamida al 50%, 5X SSPE, 5X solución de Denhardt, SDS al 0,5%, ADN de esperma de salmón de 100 µg/ml, durante 2 horas.

30 La biblioteca de ADNc de linfocitos humanos se escrutó con un fragmento de ADN de 895 pb que tenía los nucleótidos 1-711 como se muestra en la Figura 3A, 167 pb inmediatamente 5' con respecto al codón iniciador de metionina en la Figura 3A y 17 pb inmediatamente 3' con respecto a la posición 711 en la Figura 3A. Esta secuencia 5' aguas arriba de 167 pares de bases se obtuvo mediante 5' RACE del ADNc HuB7RP1 (Ejemplo 4) y fue liberado de un vector TOPO TA (Invitrogen, Carlsbad, CA) en el sitio de escisión de la enzima de restricción Eco RI. Este

35 inserto se purificó dos veces en un gel de de agarosa al 0,8% con TAE. Se utilizó un de purificación en gel de ADN (Qiagen) para aislar el inserto de ADN dela agarosa.

Se marcaron 125 ng del fragmento de ADN con 32P dCTP (Amersham) siguiendo el protocolo del sistema de marcaje con cebadores aleatorios Redi-Prime 2 (Amersham). A continuación se dejó que los filtros de transferencia 40 de colonias hibridaran con la sonda a 42°C en el siguiente tampón durante la noche a 42°C; formamida al 50%, 5X SSPE, 2X solución de Denhardt, SDS al 5%, ADNss de 100 mg/ml. La actividad específica de la sonda fue de 2,38 X 109 cpm/µg de ADN, en aproximadamente 2 ng de sonda marcada por ml de tampón de hibridación. La sonda se retiró y se guardó para la siguiente ronda de escrutinio. Los filtros se lavaron a continuación en 2X SSC, SDS al 0,1% a RT durante15 min, seguido de1X SSC, SDS al 0,1%a 55°C durante15 min, y 1X SSC, SDS al 0,1% a 60°C 45 durante 10 min. Los filtros se envolvieron en plástico y se expusieron a película de autorradiografía durante la noche a -80°C con 2 pantallas intensificadoras. Se identificaron tres clones positivos independientes. Las exposiciones se alinearon con las placas bacterianas y los clones positivos se rasparon, se diluyeron y se volvieron a sembrar en placas LB con 100 μg/ml de ampicilina, se cultivaron durante la noche como antes y las colonias se transfirieron, se prepararon, y se sondearon como se ha descrito previamente. Se aislaron tres colonias de clones independientes,

50 se aisló el ADN, y el ADN se secuenció para cada clon por triplicado. La longitud completa de la proteína B7RP1 humana es de 302 aminoácidos. La longitud y la posición relativa en el polipéptido del dominio transmembrana, es coherente con otros miembros de la familia B7. El gen B7RP1 humano tiene 43% de identidad de aminoácidos con el clon de ratón. Este grado de homología es significativo ya que las proteínas CD80 de ratón y humanas son solo idénticas en 41%. Notablemente conservadas entre los genes de ratón

55 yhumanossonlosresiduosdecisteínaenlasposicionesdeaminoácido37,113,158,215,y216.

Ejemplo 15

Clonación de CRP1 humana

60 Una búsqueda de homología BLAST GenBank (GCG, Universidad de Wisconsin) utilizando la secuencia B7RP1 murina (véase la Figura 2) recuperó un clon genómico (Núm. de Acceso Gen Bank AQ022676) que contenía una secuencia de 104 pb que mostró una alta homología con el gen CRP1 murino. Los cebadores de clonación de PCR se diseñaron para solapar esta secuencia.

imagen50

5'-GCA TAT TTA TGA ATC CCA-3' (SEQ ID NO: 34) 5'-ACT ATT AGG GTC ATG CAC-3' (SEQ ID NO: 35)

Utilizando los cebadores anteriores, se amplificó mediante PCR un fragmento de ADN de 151 pb de la CRP1 murina

5 utilizando el plásmido CRP1 murino descrito en la Figura 1 y en el Ejemplo 1 como molde. Se marcaron 125 ng del ADN con 32P dCTP (Amersham) siguiendo el protocolo del sistema demarcajecon cebadores aleatorios Redi-Prime 2 (Amersham). A continuación se dejó que los filtros de transferencia de colonias de las bibliotecas de sangre periférica humana descritas en el Ejemplo 15 hibridaran con la sonda en el siguiente tampón de hibridación durante la noche (15 h) a 41°C, formamida al 50%, 5X SSPE, 2X solución de Denhardt, SDS al 0,5%, ADNss de 100 µg/ml.

10 La actividad específica de la sonda fue de 3,52 X 109 cpm/µg de ADN, 1,5 ng de sonda marcada/ml de tampón de hibridación. La sonda se retiró y se guardó para la siguiente ronda de selección. Los filtros se lavaron a continuación en 2X SSC, SDS al 0,1% a temperatura ambiente durante 10 min, seguido de 1X SSC, SDS al 0,1% a 37°C durante 7 minutos, 40°C durante 7 minutos, 44°C durante 7 minutos, a continuación 50°C durante 7 minutos, controlando continuamente la velocidad a la que los filtros liberaban la sonda marcada. Los filtros se envolvieron en plástico y se

15 exponen a película durante la noche a -80°C con 2 pantallas intensificadoras. Este método reveló 9 posibles clones positivos independientes. Las exposiciones se alinearon con las placas bacterianas y los clones positivos se rasparon, se depositaron en 200 µl de SOC, se realizaron 2 diluciones seriadas de 1:10 y se volvieron a cultivar en placas 70 µl de la segunda dilución en placas LB que contenían ampicilina a 100 µg/ml y se cultivaron durante la noche como antes. Las colonias fueron transferidas, se prepararon y se sondearon como antes. Se aislaron ocho

20 clonesindependientesyADNsepreparómedianteelmétododeminiprepdeQiagen.

Se obtuvo un clon de ADNc que contenía unmarco de lectura abierto de 199 aminoácidos (Figura 13A). Este clon de ADNc contenía homologías de nucleótidos y aminoácidos con el clon CRP1 murino descrito en el Ejemplo 1 y en la Figura 1. Los nucleótidos correspondientes al marco de lectura abierto de este clon humano fue idéntico en 77% al 25 gen de CRP1 murino. La traducción de la secuencia humana y la posterior comparación con la proteína CRP1 murina reveló una identidad de aminoácidos de 69% con la proteína murina (Figura 13B). Además, el motivo entre los aminoácidos 114 a 119, "FDPPPF", se conservó entre los genes de CRP1 murinos y humanos. Este motivo corresponde al motivo "MYPPPY" en CD28 murino y humano que es esencial para la interacción con la proteína B7. Además, también se conservan las cisteínas de las posiciones de aminoácido 42, 109, y 141. Estas cisteínas que

30 corresponden a las cisteínas de CD28 y CTLA-4 están implicadas en la formación del bucle de Ig y la dimerización por disulfuro intermolecular. La estrecha similitud con CRP1 murina, y las similitudes estructurales con la familia de homología con CD28, indican que éste es el homólogo de CRP1 humano.

Ejemplo 16

35 CRP1 se expresa linfocitos T dememoria en reposo

Con el fin de estudiar la expresión de CRP1 en células T dememoria, se recogieron células T del bazo de ratones 67 meses de edad. Estas células se sometieron a tinción doble utilizando B7RP1-Fc marcado con un anticuerpo anti40 Fc humano conjugado con FITC y un anticuerpo conjugado con PE para cualquiera de CD44, CD45RB, o CD69. La tinción con la proteína de fusión B7RP1-Fc detecta la expresión de la proteína CRP1 en estas células T. Los ratones de más edad muestran más células T CRP1+ esplénicas que los ratones más jóvenes. Curiosamente, un número notable de estas células son CD44 alto (Figura 14a) y CD45RB bajo (Figura 14b), un perfil típico de células T de memoria. Estas células T de memoria CRP1+ se encuentran en un estado de reposo, ya que no expresan el

45 marcador de activación CD69 (Fig. 14c). La expresión de CRP1 en células T de memoria indica que CRP1 tiene funciones estimuladoras delas células T dememoria.

Ejemplo 17

50 Coestimulación de células T in vitro inhibida por anticuerpos contra B7RP1. Para determinar si la proteína B7RP1 tiene relevancia funcional para las células T, los autores de la presente invención incubaron células T CD3+ con la proteína de fusión B7RP1-Fc y un anticuerpo anti-CD3 en un análisis de proliferación in vitro. A continuación se utilizaron anticuerpos policlonales de conejo anti-B7RP1 de ratón o anticuerpos monoclonales de rata anti-B7RP1 de ratón para inhibir específicamente proliferación coestimulada por

55 B7RP1-Fc in vitro.

Preparación de antisuero policlonal de conejo B7RP1

Se inyectó IM con la proteína murina B7RP1 a tres conejos blancos New Zealand (2,27-3,63 kg de peso inicial).

60 Cada conejo se inmunizó el día 1 con 150 µg de proteína B7RP1 murina emulsionada en un volumen igual de coadyuvante completo Hunters Titer Max. Se realizaron refuerzos adicionales (días 14 y 28) mediante el mismo procedimiento. Los títulos de anticuerpos se controlaron mediante EIA. Después del segundo refuerzo, los antisueros revelaron títulos de anticuerpo moderados. A continuación, se obtuvo de cada animal una producción de extracción de sangre de 30 ml. Esto se repitió cada semana durante 6 semanas. Los anticuerpos policlonales se purificaron mediante cromatografía de proteína A-agarosa, seguido de cromatografía de afinidad de proteína Fc de selección negativa y selección positivamediante cromatografía de afinidad de B7RP1-Fc.

imagen51

Preparación de anticuerpomonoclonal de rata anti-B7RP1 murina

5 Se generaron anticuerpos monoclonales de rata anti-B7RP1 murina como se describe en Practical Immunology, segunda edición (1980; L. Hudson y F.C. Hay; Blackwell Scientific Publications, St. Louis, MO). En resumen, se inyectó intraperitonealmente proteína de fusión Fc-muB7RP1 emulsionada en adyuvante de Freund a ratas Lou (Harlan; Indianápolis, IN) a intervalos de 4 semanas. Tres días antes de la fusión, las ratas se reforzaron por vía

10 intravenosa con muB7RP1 soluble. En el día de la fusión, el animal se sacrificado con dióxido de carbono y el bazo se retiró asépticamente. La suspensión de células individuales se generó utilizando un homogeneizador de tejidos Stomacher. Los esplenocitos y las células demieloma Y3-Ag1.2.3 (American Type Culture Collection; Rockville, MD) se lavaron en medio libre de suero y a continuación se fusionaron mediante la adición de polietilenglicol (PEG 1500; Boehringer Mannheim Biochemicals; Indianapolis, IN). Las células se lavaron una vez, se resuspendieron en medios

15 que contenían suero, y se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos. De diez a 12 días más tarde, los medios de cada pocillo se sometieron a ensayo para determinar el anticuerpo específico para B7RP1 a través de un Análisis Inmunoabsorción ligado a Enzimas (EIA) directo. Las células de los pocillos que indicaban el potencial de unión se hicieron crecer hasta cultivos de 10 ml y se congelaron en nitrógeno líquido. Los medios de cada cultivo se sometieron a ensayo adicionalmente mediante citometría de flujo y en un análisis de proliferación de células T

20 funcional. Aquellas que se determinó que eran de interés por estos métodos se cultivaron en placa hasta colonias individuales de células, se seleccionaron de nuevo mediante EIA, y las líneas celulares finales se mantuvieron para la generación de anticuerpos. Los anticuerpos se purificaron a partir de los medios celulares mediante cromatografía de proteína A agarosa.

25 Preparación de células T y análisis de proliferación de células T

Las células T de los bazos de ratones C57B1/6 (hembras de 8-12 semanas de edad, Charles River Laboratories) se purificaron mediante selección negativa a través de una columna de enriquecimiento de células T murinas (R & D Systems). Las células T se utilizaron directamente o se purificaron adicionalmente por medio de anticuerpo y lisis por 30 complemento como sigue. Las células se volvieron a suspender (2,5 X 106 células/ml) en medio RPMI que contenía anticuerpos (todos a 10 µg/ml y de Pharmingen) contra CD11b murino (Clon M1/70), NK-1.1 (Clon PK136), CD8a (Clon 53-6.7), IAb (Clon M5/114.15.2), CD11c (Clon HL3), y el antígeno B220 (Clon RA3-6B2). Las células se incubaron después en hielo durante 30 min, se sedimentaron a 1200 rpm, se resuspendieron en RPMI:complemento de conejo 4:1 vol/vol (Sigma, Núm. S-7764), y se incubaron durante 30 min adicionales a 37°C. Las células se 35 sedimentaron de nuevo, y se repitió el tratamiento con complemento. Antes del cultivo en placas, las células se lavaron con RPMI que contenía FCS al 10%. Placas de 96 pocillos con fondo en U se recubrieron con un anticuerpo anti-CD3 (Clon 145-2C11, Pharmingen) a concentraciones que oscilaban entre 0 y 1,2 µg/ml), y Fab2 anti-IgG humana (Sigma, 12,5 g/ml) durantela noche a 4°C, seguido de una incubación de 6-9 horas a 37°C. Las células T (1 x 105/pocillo) se cultivaron en ausencia o presencia de varias proteínas de fusión de Fc durante 48 horas y se

40 pulsaron durante las últimas 18 horas con 1 µCi de 3H-timidina. Las proteínas de Fc de control incluían una proteína de fusión de OPG y un Fc y un fragmento de proteína de Fc no fusionado. Las células se cosecharon a continuación y se contó la radiactividad incorporada. B7RP1-Fc co-estimula las células T para que proliferen de una manera dependiente de la dosis (Fig. 15a), y un anticuerpo anti-B7RP1-Fc inhibe específicamente esta co-estimulación de una manera dependiente de la dosis (Fig. 15b).

45 Ejemplo 18

Inhibidores dela ruta CRP1/B7RP1 disminuyen la aparición de la artritis reumatoide inducida por colágeno.

50 La artritis inducida por colágeno (AIC) es un modelo animal de poliartritis autoinmunitaria en roedores y primates que tiene muchas similitudes con la artritis reumatoide en seres humanos. La inmunización con especies heterólogas de colágeno de tipo II (CII) induce una respuesta autoinmunitaria a CII que conduce al desarrollo de la AIC en cepas de ratones susceptibles. Las cepas congénicas de ratones con H-2r y H-2q son altamente susceptibles a la AIC. La AIC está mediada por los efectos sinérgicos tanto de las células T reactivas contra CII como de los anticuerpos. Se

55 disolvió CII porcino (Nabozny et al., Autoimmunity 20, 51-58 (1995)) en ácido acético 0,01 N a una concentración de 2 mg/ml y a continuación se emulsionó en una razón 1:1 con CFA (Difco). Se inmunizaron ratones B10.RIII (H-2r) susceptibles a artritis (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) con 100 µl de emulsión por vía intradérmica en la base de la cola. Los ratones se controlaron 2-3 veces por semana para verificar el desarrollo de artritis. La gravedad de la artritis se determinó utilizando un sistema de clasificación para cada pata de la siguiente manera: 0: sin artritis; 1:

60 enrojecimiento o hinchazón en 1-3 dedos del pie; 2: inflamación severa de la pata; 3: anquilosamiento de la articulación. La puntuación de cada extremidad se sumó para proporcionar un intervalo de gravedad de 0 a 12 para cada animal.

imagen52

Se inyectaron a los ratones 100 µg (en 200 µl) de proteína por vía intraperitoneal dos veces por semana. El tratamiento se inició 1 día después de la inmunización con CII porcina y se detuvo en el día 52 después de la inmunización. El experimento se llevó a cabo en grupos de tratamiento de 10 ratones, y los animales con puntuaciones de 1 o superior se anotaron como positivos. Los resultados se muestran en la Figura 16 y en la Tabla

5 1.

TABLA 1

Efecto de las proteínas de fusión de CRP1, B7RP1, CTLA-4, y B7.2 con Fc en la aparición de la artritis

Grupos de tratamiento: Media +/-D.T. día de inicio

CTLA4-Fc: 60,0 ± 0,0

CRP1-Fc: 48,9 ± 13,2

imagen53: imagen54

B7.2-Fc: 28,4 ± 14,1

B7RP1-Fc: 33,9 ± 16,6

PBS: 37,7 ± 17,1

En los ratones tratados con la proteína de fusión CRP1-Fc, la aparición de los síntomas artríticos se retrasó 10 aproximadamente 10 días en comparación con los ratones tratados con PBS. Esto demuestra que la inhibición de la ruta de CRP1/B7RP1 puede aliviar los síntomas dela enfermedad en estemodelo de ratón de la artritis reumatoide.

Los ratones tratados con B7RP1-Fc o B7.2-Fc mostraron un inicio más temprano dela enfermedad (Tabla 1 y Figura 16a) con un incremento en la gravedad de la artritis (Figura 16b) en comparación con los controles tratados con 15 PBS. Esto indica que la proteína de fusión B7RP1-Fc potencia la respuesta inmunitaria de células T. Tal actividad puede ser útil en la generación de inmunidad anti-tumoral in vivo.

Los efectos opuestos por CRP1-Fc y B7RP1-Fc en este modelo de ratón de artritis reumatoide indican que la ruta puede ser manipulada para mejorar o inhibir la progresión de la enfermedad. El direccionamiento de la proteína 20 CRP1 con B7RP1-Fc soluble potencia la enfermedad, mientras que la interacción de CRP1-Fc soluble con B7RP1 inhibe los síntomas de la enfermedad.

Ejemplo 19

25 B7RP1-Fcinduceunfenotipodeenfermedadinflamatoriaintestinalenratonestransgénicos.

La expresión en exceso persistente de la proteína relacionada con B7 (B7RP1-Fc) en ratones transgénicos de 22 a 25 semanas de edad (Ejemplo 12) induce un fenotipo sorprendente de enfermedad inflamatoria intestinal (EII) con engrosamiento marcado e inflamación crónica de los intestinos delgado y grueso (enterocolitis) y pérdida de peso en 30 algunos animales. Histológicamente, los cambios inflamatorios más severos se encontraron en el colon proximal y distal, con cambios más suaves en el intestino delgado. El colon proximal fue notablemente engrosado con ulceración fisurante, inflamación transmural, e hipertrofia de la mucosa colónica, mientras que el colon distal tuvo hipertrofia difusa de la mucosa (o erosión focal y atrofia glandular) sin ulceración. El intestino delgado proximal tuvo hipertrofia de la mucosa de leve a marcada con cambios inflamatorios más leves, mientras que el intestino delgado

35 distal (íleon) tuvo hipertrofia de la mucosa leve en algunos animales y atrofia en otros ratones. Los cambios intestinales fueron los más graves y se encontraron sistemáticamente en los ratones transgénicos B7RP1 hembra, pero también se observaron en varios delos ratones transgénicosmacho en este estudio. Resulta interesante observar que las características histológicas encontradas en el colon proximal, incluyendo la ulceración fisurante y la inflamación granulomatosa crónica transmural con células gigantes multinucleadas, se

40 asemejan más a las observadas en la enfermedad de Crohn que en la colitis ulcerosa en seres humanos. Morfológicamente, esta colitis también imita la EII descrita en ratones deficientes en interleuquina-10, que desarrollan emaciación, anemia y enterocolitis que afectan a la totalidad de su tracto intestinal (Kuhn et al. 1993; Sartor 1995; Leach et al. 1999). Como en los ratones con el gen de IL-10 desactivado, los cambios iniciales en los ratones transgénicos para B7RP1-Fc consisten de productos infiltrados focales, leves de las células inflamatorias en

45 la lámina propia sin hiperplasia epitelial colónica (Ejemplo 13). En los ratones más viejos, los segmentos colónicos afectados se engrosan debido a hipertrofia/hiperplasia glandular e inflamación crónica. Los cólones proximales y distales de los ratones B7RP1-Fc tenían colitis de moderada a severa con características histológicas de enfermedad inflamatoria intestinal (EII). Los segmentos afectados de colon proximal (Figura 17B-17D) se engrosaron difusamente, debido a la prominente hipertrofia e hiperplasia glandular epitelial con elongación y dilatación de las

50 glándulas mucosas (Fig. 17B), que tenían un mayor número de figuras mitóticas y abscesos raros de las criptas, pero conservaban células caliciformes con mucina (Fig. 17D). La mucosa tenía inflamación crónica difusa en la

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lámina propia, que en algunos animales se extendía transmuralmente involucrando las capas subyacentes de la pared del intestino, incluyendo la submucosa, muscular, serosa, y el tejido de grasa mesentérica adyacente (Fig. 17B-17C). Los productos infiltrados inflamatorios consistieron en linfocitos (predominantemente células T CD3+, CD44+), células plasmáticas y macrófagos epitelioides (Fig. 17F) mezclados con algunos neutrófilos y células 5 gigantes multinucleadas ocasionales (Fig. 17E), características de la inflamación granulomatosa crónica. Los productos agregados linfoides (en su mayoría células B220 + mezcladas con un pequeño número de células CD3+) también estuvieron presentes en la mucosa y alrededor de los vasos sanguíneos más pequeños en la submucosa y las capas más profundas, incluyendo grasa mesentérica (Fig. 17C). El lumen contenía exudado mucopurulento o mucoso (Fig. 17D). Se encontró evidencia severa de colitis, con ulceración fisurante multifocal de la mucosa e

10 inflamacióntransmural(Fig. 17B-17C),enestosratonestransgénicosparaB7RP1-Fc.

El colon distal de los ratones transgénicos para B7RP1-Fc también presentaba engrosamiento difuso e hiperplasia con elongación, basofilia, y dilatación de las glándulas colónicas (Fig. 18B-18G), algunas de las cuales contenían abscesos en las criptas (Fig. 18D y 18F) y mucus. La lámina propia tenía un producto infiltrado inflamatorio difuso 15 leve de linfocitos (predominantemente células CD3+, CD44+, en particular en la mucosa superficial; Fig. 18E), así como células plasmáticas y productos agregados focales de macrófagos epitelioides mezclados con algunos neutrófilos. También se dispersaban a través de la mucosa productos agregados linfoides (predominantemente de células B220+; Fig. 18D y 18F). El intestino delgado de los ratones transgénicos para B7RP1-Fc tenía cambios más variables, incluyendo hipertrofia e hiperplasia focalmente de la mucosa y de las criptas de leve a focalmente 20 marcada (Fig. 19B y 19D con razones de cripta/vellosidades que oscilaban de 1:4 a 1,5:1, en comparación con 1:10 en los ratones de control) acompañadas de un producto infiltrado predominantemente linfoplasmacítico en la lámina propia. La hiperplasia de la mucosa fue más prominente en el intestino delgado proximal, incluyendo el duodeno (Fig. 19B) y en particular el yeyuno (Fig. 19D). La arquitectura de las criptas fue focalmente perturbada y displásica en los ratones más gravemente afectados (Fig. 19D). En contraste, los intestinos delgados distales (íleon) de

25 algunos ratones, tenían leve atrofia de las vellosidades, a parches de la mucosa ileal (Fig. 19F) con acortamiento, engrosamiento o pérdida focal de las vellosidades (con una razón cripta:vellosidad de 1:1 o menos, en lugar de la razón 1:2 normal), mientras que otros ratones tenían hipertrofia de lamucosaileal leve.

La proteína de fusión B7RP1-Fc actúa activando las células que son responsables de provocar un fenotipo muy

30 similar al de la enfermedad de Crohn humana. Esto indica que las células que pueden ser responsables de la inflamación en la enfermedad de Crohn son activadas por la proteína de fusión B7RP1-Fc. La proteína soluble, el anticuerpo o losinhibidores demolécula pequeña de B7RP1 pueden por lo tanto ser útiles en la inhibición de la EII.

Ejemplo 20

35 La proteína de fusión B7RP1-Fcinhibe el crecimiento tumoral en ratones

Para examinar el efecto de B7RP1 y CRP1 sobre el crecimiento del sarcoma Meth A murino inmunogénico, los autores de la presente invención investigaron si la B7RP1-Fc soluble afecta al crecimiento de un sarcoma Meth A

40 establecido en ratones Balb/c.

Se implantaron células de sarcoma Meth A que crecían exponencialmente por medio de inyección intradérmica de 0,5 millones de células en el abdomen de ratones Balb/c el día 0. El día 7, cuando los tumores alcanzaron ~100 mm3, los ratones fueron tratados con vehículo (PBS) o B7RP1-Fc (8 mg/kg), por vía subcutánea en el cuello los días

45 7,10,14y17.Losdiámetrosbidimensionalesdelostumoressemidieronmediantecalibresyseesteimóelvolumen del tumor (en mm3) utilizando la fórmula: volumen del tumor = [{(ancho)2xlargo}/2]. El crecimiento del tumor se controló hasta el día 28. Cada grupotenía ocho ratones.

El patrón de crecimiento del sarcoma Meth A del tumor de control era bi-fásico: una fase inicial lenta estaba seguida

50 por una fase exponencial relativamente rápida. En los ratones tratados con B7RP1-Fc, el crecimiento del tumor fue significativamente más lento en la fase exponencial rápida. El día 28, los volúmenes medios de los ratones de control y tratados con B7RP1-Fc fueron 1.410 mm3 y 580 mm3, respectivamente (Figura 20). Por lo tanto, el tratamiento con B7RP1-Fc inhibió significativamente el crecimiento tumoral en este modelo. Los datos sugieren fuertemente la utilidad terapéutica beneficiosa de la proteína B7RP1-Fc soluble, y otros activadores de la ruta

55 B7RP1/CRP1,eneltratamientodetumoresinmunogénicos.

La actividad anti-tumoral inmunológica está estrechamente asociado con la función citolítica delos linfocitos T (CTL). En consonancia, la proteína B7RP1-Fc se expresa en células T CD8+ citolíticas (Ejemplo 9, Figura 6). Estos datos apoyan firmemente las funciones de B7RP1 en las células T CD8+ citolíticas. B7RP1-Fc, u otros estimuladores de la

60 ruta B7RP1/CRP1, se pueden utilizar por lo tanto para potenciar las células T citolíticas y las funciones inmunitarias celulares para numerosas indicaciones no relacionadas con el cáncer.

Ejemplo 21

imagen56

Inhibición dela actividad B7RP1 humanain vitro

Para determinar si B7RP1 humana tiene propiedades coestimuladoras positivas, los autores de la presente invención sometieron a ensayo las células que expresaban B7RP1 humana y la proteína de fusión B7RP1-Fc 5 humana en análisis de proliferación de células T. La proteína de fusión B7RP1-Fc humana se construyó fusionando secuencias de genes que correspondían a los aminoácidos 1 a 247 a una secuencia de gen de IgG1 humana parcial (Ejemplo 14). La proteína de fusión CRP1-Fc humana se construyó fusionando secuencias génicas que correspondían a los aminoácidos 1 a 146 a una secuencia de gen de IgG1 humana parcial (Ejemplo 2). Se llevaron a cabo los métodos de construcción, expresión y purificación de ambas proteínas de fusión como se ha descrito en el

10 Ejemplo 7. B7RP1-Fc demostró actividades co-estimuladoras que eran dependientes de la estimulación anti-CD3 (Figura 21a). Además, esta actividad puede ser inhibida específicamente por la proteína CRP1-Fc soluble (Figura 21b). Se obtuvieron efectos co-estimuladores similares utilizando células CHO que expresaban B7RP1 humana unida amembrana, que contenía todala secuencia codificante (Figura 21c).

15 Se determinó la producción de citoquinas por las células T humanas en las condiciones de proliferación in vitro anteriores. Se analizaron los sobrenadantes de los cultivos de células T estimulados durante 48 y 72 horas para determinar IL-2, IL-10, e IFN-gamma por medio de ELISA de acuerdo con las especificaciones del fabricante (Biosource International). Los niveles de IFN-gamma e IL-10 se incrementaron demanera significativa; sin embargo, a diferencia del caso de co-estimulación con CD28, la IL-2 no fue notablemente inducida (Figura 21d). El aumento

20 de los niveles de IFN-gamma, una citoquina Th1, se correlacionan con las funciones de B7RP1 para aumentar IgG2a, como se describe en el Ejemplo 13.

Se llevaron a cabo análisis de co-estimulación de células T in vitro de la siguiente manera. Se aislaron células T humanas altamente purificadas (>98% CD3+) mediante selección negativa de PBMC de escasa adherencia, frescas 25 o descongeladas, utilizando cuentas magnéticas marcadas mAb (Miltenyi Biotec). Las células T (1 x 105 células/pocillo) se cultivaron en pocillos por triplicado en placas de 96 pocillos a 200 µl/pocillo de RPMI + FCS al 10%. Para evaluar la co-estimulación con B7RP1-Fc, se recubrieron previamente placas de fondo en U con diversas concentraciones de anti-CD3 (Pharmingen) y Fc anti-IgG humana de 10 µg/ml (Sigma) en 100 µl de 1X PBS mediante incubación a 4°C durante la noche. El anti-CD3 y el Fc anti-IgG humana no unidos se eliminaron, y las 30 células se cultivaron en presencia o ausencia de diversas concentraciones de B7RP1-Fc, control de OPG-Fc o anti-CD28 (Pharmingen). Para la inhibición por CRP1-Fc de la co-estimulación con B7RP1-Fc, se cultivaron células T en pocillos previamente recubiertos con anti-CD3 de 0,33 µg/ml y Fc anti-IgG humana de 10 µg/ml con B7RP1-Fc de 0,5 µg/ml en presencia de CRP1-Fc u OPG-Fc diluidos seriadamente, empezando a 10 µg/ml. Para evaluar la coestimulación por células CHO que expresaban B7RP1, las células T se cultivaron en placas de fondo plano con 35 diferentes concentraciones de anti-CD3 soluble en presencia o ausencia de diversas cantidades de células CHO B7RP1 o células vectoras CHO tratadas mitomicina-C. Para someter a ensayo la proliferación de células T, los cultivos se pulsaron con 1 µCi/pocillo de [3H]TdR durante las últimas 18 horas de un cultivo de 72 h. Proliferación de células T se determinó mediante la incorporación [3H]TdR. Los resultados de un experimento representativo de tres donantes al azar se expresan como las CPM medias incorporadas +/-DT. Para los análisis de la producción de

40 citoquinas, las células se cultivaron durante 48 y 72 horas y los sobrenadantes se recogieron para el ELISA.

Estos experimentos demuestran que la porción extracelular de B7RP1 humana, como se describe en el Ejemplo 14, cuando se fusiona a un fragmento Fc humano, puede co-estimular las células T in vitro. Esta co-estimulación es inhibida por CRP1-Fc y por lo tanto demuestra cómo puede funcionar un inhibidor soluble de B7RP1 humana. Se

45 pudieron utilizar análisis in vitro, tales como los descritos aquí utilizando B7RP1 y CRP1 humanas, para escrutar anticuerpos, proteínas solubles, pepticuerpos, o inhibidores de molécula pequeña de la actividad B7RP1/CRP1.

Ejemplo 22

50 LosratonestransgénicosparaB7RP1presentanaumentodelosnivelesdeIgE

Los ratones transgénicos descritos en el Ejemplo 12 se analizaron para determinar los anticuerpos de IgE en suero. Se analizaron sueros orbitales de ratones transgénicos para B7RP1-Fc y controles de camada para determinar la IgE mediante un protocolo de ELISA. Se recubrieron placas de EIA de poliestireno de 96 pocillos (Coster, 55 Cambridge, MA) con 50 µl de una disolución de 5 µg/ml de anticuerpo de rata anti-IgE de ratón (BD Pharmingen, San Diego, CA) en tampón Na2CO3/NaHCO3 50 mM (pH 9,6 a temperatura ambiente durante 2 horas, después a 4°C durante la noche. Los procedimientos posteriores se realizaron a temperatura ambiente. Tras el bloqueo con diluyente de análisis (BSA al 1%, suero normal de cabra al 1%, y Tween-20 al 0,2% en PBS) durante 30 min, se añadieron a los pocillos muestras de suero y patrones de IgE de ratón (BD Pharmingen), y las placas se incubaron 60 durante 2 h. Los pocillos se lavaron 3 veces con tampón de lavado KPL (KPL, Gaithersburg, MD). Se añadió anticuerpo de cabra anti-rata conjugado con biotina (BD Pharmingen) y se incubó durante 1 hr. Después de lavar 3 veces con tampón de lavado KPL, se añadió estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante (BD Pharmingen) a los pocillos, y las placas se incubaron durante 30 min. Después de lavar los pocillos 5 veces con tampón de lavado KPL, se añadió disolución sustrato de TMB-peróxido de hidrógeno (KPL), y las placas se

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incubaron durante 10min. La reacción se detuvomediante la adición de ácido fosfórico 1 M, y la absorbancia se leyó a una longitud de onda de 450 nm. Los niveles de IgE en los sueros de los ratones transgénicos para B7RP1-Fc fueron aproximadamente tres veces superiores que los de los controles de camadas (Figura 22). Este aumento en los niveles en suero deIgE indica que B7RP1 regula la expresión de IgE.

5 Ejemplo 23

Respuesta mediada por IgE de ratones con CRP1 desactivado

10 El gen CRP1 en ratones se interrumpió suprimiendo un fragmento genómico correspondiente a los nucleótidos 318591 de la secuencia de ADNc de CRP1 murina (véase SEQ ID NO: _). El gen de CRP1 murino se aisló de una biblioteca 129J utilizando la sonda de ADNc completa (800 pb) (Yoshinaga et al. Nature 402, 827-832 (1999). El vector de direccionamiento, que remplazó un fragmento genómico 2,8kb por un casete de resistencia a neomicina (neo) en orientación efectora con respecto a la transcripción de CRP1, se sometió a electroporación en células

15 madre embrionarias (ES) E14 (129/Ola, disponible de la Colección de Cultivos Tipo Americana, Manassas, Va con el Núm. de Acceso CRL-1821). Después de la selección con G418, se identificaron los recombinantes homólogos mediante PCR utilizando el par de cebadores GAG ACT CAT GCT GTG GTT TCA GG (SEQ ID NO: _) y TTC GCC AAT GAC AAG ACG CTG G (SEQ ID NO: _) y se verificaron mediante transferencia Southern. Los ratones quiméricos generados a partir de los clones de ES CRP1+/-se cruzaron con hembras C57BL6 para producir ratones

20 CRP1+/-. La transmisión de la línea germinal de la mutación CRP1 se evaluó mediante PCR y análisis de transferencia Southern de ADN de la cola. Los ratones CRP1-/-generados por el entrecruzamiento de la descendencia heterocigota nacieron a la frecuencia mendeliana esperada y fueron viables, fértiles y de tamaño normal. Para verificar quela mutación CRP1 había anulado la expresión deCRP1, seanalizaronmediantecitometría de flujo las células T activadas de los ratones CRP1-/-y de las camadas de control. Tras la activación de las células

25 T in vitro, se expresó CRP1 sobre la superficie de células T de tipo salvaje tanto CD4+ como CD8+, pero no fue detectable en células T CRP1-/-.

Para investigar el papel de CRP1 en la producción de anticuerpos de células B mediada por células T y el cambio de clase de isotipo, se inmunizaron ratones CRP1-/-y controles de camada con 200 µg de ovoalbúmina conjugada con

30 nitrofenol (NP-OVA; Biosearch Technologies, Inc.) adsorbida a alúmina por vía intraperitoneal. Se recogió sangre de las colas de los ratones cada semana después de la inmunización y se evaluaron los niveles de IgM e IgG1 específicas de nitrofenol (NP) así los niveles de IgE específica de OVA en el suero.

Los títulos de los anticuerpos IgG1 e IgM específicos de NP se evaluaron mediante ELISA de tipo sándwich

35 (Southern Biotechnology Associates) en el que las placas de ELISA se recubrieron con NP(23)-albúmina de suero bovino a 50 µg/ml en PBS o tampón carbonato pH 9,2 (Sigma). Los valores arbitrarios obtenidos mediante el uso del programa de análisis de ELISA SoftmaxPro (Molecular Devices) se basaron en la curva de titulación del patrón de isotipo utilizado en cada placa. Los niveles de IgE específica de ovoalbúmina se detectaron utilizando un método ELISA de captura de antígeno (ovoalbúmina biotinilada) como se ha descrito previamente (Stampfli et al. Am J

40 Respir. Cell Mol. Biol. 21, 317-326 (1999)). El ELISA se normalizó utilizando suero obtenido de ratones sensibilizados a la ovoalbúmina de acuerdo con un modelo de sensibilización intraperitoneal convencional (Ohkawara et al. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 16, 510 (1997)).

Los niveles de IgM específica NP fueron normales (día 7); sin embargo, una reducción significativa en los niveles de

45 IgG1 específica de NP los días 14 y 21 después de la inmunización, indicaba que la producción de anticuerpo dependiente de células T se vio gravemente afectada en los ratones CRP1-/-. Además, los autores de la presente invención observaron que la IgE específica OVA era completamente indetectable en el suero de ratones ICOS-/-los días 21 y 28 después de la inmunización, mientras que el cambio de isotipo se produjo en ratones de control tanto heterocigotos como de tipo salvajes, como se demuestra por la presencia de IgE en el suero de estos animales

50 (Véase Tabla 3). Estos hallazgos indican que ICOS desempeña un papel de importancia primordial en el control de la colaboración de células T-B y el cambio delas clases deisotipo IgG1 e IgE.

Tabla 3

Cambio de isotipo IgE en ratones CRP1-/-

Días después de la inmunización: CRP1+/+ CRP1 +/- CRP1-/-

Día 21: 4/8 5/9 0/7

Día 28: 4/6 8/9 0/8

55 Ejemplo 24 Efectos de B7RP1 y B7.2 en un modelo de hipersensibilidadpor contacto 41

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Con el fin de inducir hipersensibilidad por contacto, se sensibilizaron primero ratones Balb/c hembra (de 9 a 14 semanas de edad; Charles River Laboratories, Wilmington, MA) mediante la aplicación de una disolución al 1% de oxazolona (Sigma, St. Louis, MO) en acetona y aceite de oliva sobre la piel afeitada del abdomen. Siete días después de la sensibilización, los ratones fueron estimulados (día 0) mediante la aplicación de la disolución de

5 oxazolona en la oreja derecha. Se aplicaron la acetona y el aceite de oliva disolventes al mismo tiempo en la oreja izquierda como control. El espesor de las orejas se midió diariamente con un micrómetro (Mitutoyo, Kawasaki, Japón) comenzando inmediatamente antes de la estimulación. Se utilizó la diferencia en el grosor de la oreja (ΔET) entre la oreja derecha e izquierda de expresar los resultados(McHale et al. J. Immunol 162, 1648 (1999)).

10 Se ha observado previamente que la administración de una proteína de fusión B7RP1-Fc en este modelo exacerba hipersensibilidad por contacto tanto en el momento de la sensibilización (inducción de la respuesta inmunitaria primaria) como en el momento de la estimulación (inducción de la respuesta inmunitaria secundaria), aunque la efectos son más pronunciados cuando la administración se produce en el momento de la estimulación (Yoshinaga et al. Nature 402, 827-832 (1999)).

15 Con el fin de estudiar los efectos combinados de B7RP1-Fc y B7.2-Fc sobre la hipersensibilidad por contacto, se administraron B7RP1-Fc y B7.2-Fc a dos dosis diferentes, solas o combinadas más o menos en el momento de la estimulación. A una dosis elevada (2 mg/Kg de B7RP1-Fc sola, 2 mg/Kg de B7.2-Fc sola, y 1 mg/kg de cada una combinadas), B7RP1-Fc, B7.2-Fc, y B7RP1-Fc + B7.2-Fc aumentaron ΔET en comparación con Fc (2 mg/Kg) a

20 partir del día 3 (Fig. 23A). A esta dosis B7RP1-Fc y B7RP1-Fc + B7.2-Fc aumentaron ΔET más que B7.2-Fc a partir del día 4 (Fig. 23A). B7RP1-Fc + B7.2-Fc también aumentaron ΔET más que B7RP1-Fc a partir del día 4 (Fig. 23A). A una dosis baja (0,4 mg/Kg de B7RP1-Fc sola, 0,4 mg/Kg de B7.2-Fc sola, y 0,2 mg/kg de cada una combinadas), B7RP1-Fc y B7RP1-Fc + B7.2-Fc aumentaron ΔET en comparación con Fc (0,4 mg/Kg) a partir del día 4, mientras que B7.2-Fc no cambió significativamente ΔET (Fig. 23B). También a esta dosis B7RP1-Fc y B7RP1-Fc + B7.2-Fc

25 aumentaron ΔET más que B7.2-Fc, y B7RP1-Fc + B7.2-Fc más que B7RP1-Fc (Fig. 23B). Por lo tanto, la mitad de las dosis completas de B7RP1-Fc combinada con la mitad de dosis completas de B7.2-Fc aumentó ΔET los días 4 a 7 más que las dosis completas de B7RP1-Fc sola o de B7.2 sola, lo que indica que B7RP1-Fc y B7.2-Fc interaccionaban sinérgicamente.

30 Aunque la presente invención ha sido descrita en términos de las realizaciones preferidas, se entiende que a los expertos en latécnica se les ocurrirán variaciones ymodificaciones.

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Un antagonista de B7RP1 para su uso en la disminución de la producción de IgE en un paciente que padece una respuesta alérgica que comprende administrar el antagonista en una cantidad eficaz para disminuir la producción de

5 IgE, en donde el antagonista es un anticuerpo que se une B7RP1 e inhibe parcialmente o completamente la producción deIgE.
2. El antagonista de la reivindicación 1 para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el método comprende adicionalmente administrar un antagonista de IgE, en donde el antagonista de IgE es un anticuerpo anti

10 IgE o fragmento del mismo, un receptor soluble o un fragmento del mismo, un anticuerpo anti-FCεRI o un fragmento del mismo, variantes de IgE o fragmentos de las mismas, péptidos de unión a IgE, péptidos de unión a FCεRI, o moléculas pequeñas capaces de unirse a IgE o competir conIgE por la unión al receptor FCεRI.
3. El uso de un antagonista de B7RP1 para la preparación de un medicamento para disminuir la producción de IgE

15 en un paciente que padece una respuesta alérgica, que comprende administrar el antagonista en una cantidad eficaz para disminuir la producción de IgE, en donde el antagonista es un anticuerpo que se une B7RP1 e parcialmente o completamentela producción de IgE.
4. El uso de la reivindicación 3, que comprende adicionalmente administrar un antagonista de IgE, en donde el

20 antagonista de IgE es un anticuerpo anti-IgE o un fragmento del mismo, un receptor FCεRL soluble o un fragmento del mismo, un anticuerpo anti-FCεRI o un fragmento del mismo, variantes de IgE o fragmentos de las mismas, péptidos de unión a IgE, péptidos de unión a FCεRI, o moléculas pequeñas capaces de unirse a IgE o competir con IgE por la unión al receptor FCεRI.

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