JP5658695B2 - 免疫応答に関与する新規ポリペプチド - Google Patents

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Description

発明の分野
本発明は、Ｔリンパ球の活性化に関与するポリペプチドに関する。特に、本発明は、Ｔリンパ球共刺激ポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸、該ポリペプチドを産生するための発現ベクターと宿主細胞、ならびに免疫抑制および免疫活性化に関連する疾患の治療用組成物および方法に関する。
発明の背景
適切なＴリンパ球（Ｔ細胞）の免疫応答を得るためには、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって２種類のシグナルがＴ細胞に送られる必要がある。第１に、特異性を決定する場合に、抗原は主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）によってＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に提示される必要がある。第２に、抗原依存性の共刺激シグナルは、ＡＰＣ上のＢ７ファミリーに属する要素がＴ細胞上のＣＤ２８タンパク質と連結することによって送り出される必要がある。増殖性の免疫応答は、増殖、分化、クローン性増殖、および作用または機能につながる。第２の共刺激シグナルがない場合は、Ｔ細胞はアネルギーと称される持続性抗原特異的不応答性の状態になる。
Ｔ細胞は、免疫応答を開始し、抗原特異的エフェクター機能を媒介し、サイトカインの分泌によって他の白血球の活性を制限する。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、Ｔ細胞を他のリンパ球と区別するものであり、ＡＰＣのＭＨＣによって抗原が提示された場合にのみその抗原と結合可能である。特定のＴ細胞の機能は、ＣＤ４やＣＤ８などの膜抗原の発現と関連づけることができる。例えば、一般にＣＤ４＋Ｔ細胞はヘルパーＴ細胞（ＴＨ）として機能しＭＨＣクラスＩＩに限定され、一般にＣＤ８＋細胞は細胞障害性Ｔ細胞（ＴＣ）として機能しＭＨＣクラスＩに限定される。
従来同定された有効なＴ細胞共刺激ポリペプチドとしては、Ｂ７．１と称されるポリペプチド（フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）らＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４３，２７１４−２７２２（１９８９）、フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）らＪｏｕｒ．Ｅｘｐｔ．Ｍｅｄ．１７４，６２５−３１（１９９１））、およびＢ７．２と称される（フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）らＳｃｉｅｎｃｅ ２６２，９０９−９１１（１９９３）、およびフリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）らＪｏｕｒ．Ｅｘｐｔ．Ｍｅｄ．１７８，２１８５−２１９２（１９９３））（あるいはそれぞれＣＤ８０およびＣＤ８６と称される）が挙げられる。これらのポリペプチドは、種々のＡＰＣ上において誘発的または恒常的のいずれかで発現され、それぞれＴ細胞上のＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４に対する膜結合リガンドである。ＣＤ２８（アルフォ（Ａｒｕｆｆｏ）およびシード（Ｓｅｅｄ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４，８５７３−８５７７（１９８７）、およびグロス（Ｇｒｏｓｓ）らＪ．Ｉｍｍｕｎ．１４４，３２０１−３２１０（１９９０））は、休止Ｔ細胞上で発現され、陽性共刺激シグナルを媒介する。ＣＴＬＡ−４（ブルネット（Ｂｒｕｎｅｔ）らＮａｔｕｒｅ ３２８，２６７−２７０（１９８７）、およびダリアバク（Ｄａｒｉａｖａｃｈ）らＥｕｒ．Ｊｏｕｒ．Ｉｍｍｕｎ．１８，１９０１−１９０５（１９８８））の発現は、Ｔ細胞の活性化によって誘発され、Ｂ７．１およびＢ７．２に対する結合親和性がより高いために、ＣＤ２８シグナルを負の方向に制御する。ＣＴＬＡ−４遺伝子をもたないマウスはＣＴＬＡ−４がない状態では増殖シグナルのスイッチオフ機構が損なわれているため、Ｔ細胞量が非常に多く見られる。この表現型は、Ｔ細胞の増殖に対してＣＴＬＡ−４共刺激タンパク質が有する主要な阻害作用を明確に示している。ＣＤ２８またはＢ７．１またはＢ７．２の欠如したマウスでは、これほど過度な表現型は見られないが、これはＴ細胞共刺激に関する別の経路が存在しうることを示している。
Ｔ細胞の活性化および増殖を調節する手段としてＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４経路について大きな関心が示されてきている。ヒトＦｃと融合したＣＴＬＡ−４の細胞外部分を含有するキメラタンパク質は強力な免疫抑制効果を有し、種々の臨床状況において研究が行われてきた。Ｂ７．１タンパク質とＢ７．２タンパク質に対する抗体についても、免疫抑制の分野で同様の徴候について評価されている。抗ＣＴＬＡ−４抗体は、Ｔ細胞活性化の促進に有用であることが示されている。さらに、Ｂ７．１およびＢ７．２の遺伝子治療が、癌免疫療法の分野で非常に有用であることが示されている。
今までのところ、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７．１、およびＢ７．２は、１つのＴ細胞共刺激経路と関連している。Ｔ細胞共刺激を調節することによって免疫応答を変化できるのであれば、宿主Ｔ細胞の機能および免疫応答の調節に関して好都合な性質を有する可能性のある同一または別のＴ細胞共刺激経路の他の要素を同定することが望ましい。
したがって本発明の目的の１つは、Ｔ細胞活性および／または増殖を刺激する新規ポリペプチドを提供することである。本発明のさらなる目的は、Ｔ細胞媒介免疫疾患の予防および治療のために該新規ポリペプチドを使用することである。
フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）らＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４３，２７１４−２７２２（１９８９） フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）らＪｏｕｒ．Ｅｘｐｔ．Ｍｅｄ．１７４，６２５−３１（１９９１） フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）らＳｃｉｅｎｃｅ ２６２，９０９−９１１（１９９３） フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）らＪｏｕｒ．Ｅｘｐｔ．Ｍｅｄ．１７８，２１８５−２１９２（１９９３） アルフォ（Ａｒｕｆｆｏ）およびシード（Ｓｅｅｄ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４，８５７３−８５７７（１９８７） グロス（Ｇｒｏｓｓ）らＪ．Ｉｍｍｕｎ．１４４，３２０１−３２１０（１９９０） ブルネット（Ｂｒｕｎｅｔ）らＮａｔｕｒｅ ３２８，２６７−２７０（１９８７） ダリアバク（Ｄａｒｉａｖａｃｈ）らＥｕｒ．Ｊｏｕｒ．Ｉｍｍｕｎ．１８，１９０１−１９０５（１９８８）
発明の要約
驚くべきことに、Ｔ細胞共刺激経路の２種類の新規ポリペプチドがこれまでに同定されている。これらのポリペプチドは、前述のタンパク質ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７．１、およびＢ７．２からなる経路とは異なるものと思われるただ１つの共刺激経路におけるリガンド−受容体対を表している。これらのポリペプチドは、ＣＤ２８関連タンパク質−１またはＣＲＰ１、およびＢ７関連タンパク質−１またはＢ７ＲＰ１と称される。
本発明は、ＣＲＰ１およびＢ７ＲＰ１ポリペプチド、ならびに関連ポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。本発明の単離核酸分子は、
ａ）図１Ａ（配列番号１）に記載のヌクレオチド配列；
ｂ）図１Ａ（配列番号１）に記載の残基１〜２００または残基２１〜２００のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｃ）図１Ａ（配列番号１）に記載のポリペプチドと少なくとも約７０％が同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のいずれかの天然の対立遺伝子変異体または選択的スプライス変異体；
ｅ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のいずれかと相補的なヌクレオチド配列；
ｆ）少なくとも約２５個、５０個、７５個、１００個、または１００個を超えるアミノ酸残基のポリペプチド断片をコードする（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）のヌクレオチド配列；
ｇ）少なくとも約１０、１５、２０、２５個、５０個、７５個、１００個、または１００個を超えるヌクレオチドの断片を含む（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のヌクレオチド配列；および
ｈ）ストリンジェンシー条件下で（ａ）〜（ｇ）のいずれかとハイブリッド形成するヌクレオチド配列；
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
さらに、本発明は、
ａ）図２Ａ（配列番号６）または図３Ａ（配列番号１１）または図１２Ａ（配列番号１６）に記載されるヌクレオチド配列；
ｂ）図２Ａ（配列番号６）に記載の残基１〜３２２または残基４７〜３２２のポリペプチド、または図３Ａ（配列番号１１）に記載の残基１〜２８８、あるいは残基１９〜２８８、２０〜２８８、２１〜２８８、２２〜２８８、２４〜２８８、または２８〜２８８のポリペプチド、または図１２Ａに記載の残基１〜３０２、あるいは残基１９〜３０２、２０〜３０２、２１〜３０２、２２〜３０２、２４〜３０２、または２８〜３０２のポリペプチド、をコードするヌクレオチド配列；
ｃ）図２Ａ（配列番号６）または図３Ａ（配列番号１１）または図１２Ａ（配列番号１６）に記載のポリペプチドと少なくとも約７０％が同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のいずれかの天然の対立遺伝子変異体または選択的スプライス変異体；
ｅ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のいずれかと相補的なヌクレオチド配列；
ｆ）少なくとも約２５個、５０個、７５個、１００個、または１００個を超えるアミノ酸残基のポリペプチド断片をコードする（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）のヌクレオチド配列；
ｇ）少なくとも約１０個、１５個、２０個、２５個、５０個、７５個、１００個、または１００個を超えるヌクレオチドの断片を含む（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のヌクレオチド配列；および
ｈ）ストリンジェンシー条件下で（ａ）〜（ｇ）のいずれかとハイブリット形成するヌクレオチド配列；
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を提供する。
さらに本発明の主題は、ＣＲＰ１ポリペプチドおよびＢ７ＲＰ１ポリペプチド、ならびに関連ポリペプチドにも関する。本発明は、
ａ）図１Ａ（配列番号２）に記載のアミノ酸配列；
ｂ）残基２１に成熟アミノ末端を含む図１Ａ（配列番号２）に記載の成熟アミノ酸配列；
ｃ）少なくとも約２５個、５０個、７５個、１００個、または１００個を超えるアミノ酸残基を含む図１Ａ（配列番号２）に記載のアミノ酸配列断片；
ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のオルソログ；および
ｅ）（ａ）、（ｂ）、または（ｄ）の対立遺伝子変異体または選択的スプライス変異体；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを提供する。
さらに、本発明は、
ａ）図２Ａ（配列番号７）または図３Ａ（配列番号１２）または図１２Ａ（配列番号１７）に記載のアミノ酸配列；
ｂ）残基４７に成熟アミノ末端を含む図２Ａ（配列番号７）に記載の成熟アミノ酸配列、あるいは残基１９、２０、２１、２２、２４、または２８のいずれかに成熟アミノ末端を含む図３Ａ（配列番号１２）に記載の成熟アミノ酸配列、あるいは残基１９、２０、２１、２２、２４、または２８のいずれかに成熟アミノ末端を含む図１２Ａ（配列番号１７）に記載の成熟アミノ酸配列；
ｃ）少なくとも約２５個、５０個、７５個、１００個、または１００個を超えるアミノ酸残基を含む図２Ａ（配列番号７）または図３Ａ（配列番号１２）または図１２Ａ（配列番号１７）に記載のアミノ酸配列断片；
ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のオルソログ；および
ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）の対立遺伝子変異体または選択的スプライス変異体；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを提供する。
また、本発明のポリペプチドを産生する発現ベクターおよび宿主細胞、ＣＲＰ１ポリペプチドおよびＢ７ＲＰ１ポリペプチドならびに関連ポリペプチドと結合する抗体、ならびにＢ７ＲＰ１ポリペプチドおよびＢ７ＲＰ１関連ポリペプチドと、ＣＲＰ１ポリペプチドおよびＣＲＰ１関連ポリペプチドとの結合を検出するアッセイも本発明に包含される。ＣＲＰ１ポリペプチドまたはＣＲＰ１関連ポリペプチドと、Ｂ７ＲＰ１ポリペプチドまたはＢ７ＲＰ１関連ポリペプチドとを含む医薬組成物も本発明に包含される。ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１と相互作用する化合物の同定方法も、これらの化合物がＣＲＰ１とＢ７ＲＰ１の活性に対するアゴニストとアンタゴニストのいずれとなるかを決定するためのアッセイとして提供される。
ＣＲＰ１ポリペプチドとＢ７ＲＰ１ポリペプチドは、Ｔ細胞の共刺激および増殖に関与する。ＣＲＰ１ポリペプチドとＢ７ＲＰ１ポリペプチド、それらの選択的結合剤、ならびにそれらのアゴニストおよびアンタゴニストは、Ｔ細胞応答の調節に関連する疾患の診断、予防、および治療に有用となりうる。
ＣＲＰ１ポリペプチドとＢ７ＲＰ１ポリペプチド、それらの選択的結合剤、ならびにそれらのアゴニストおよびアンタゴニストは、不充分な免疫応答の刺激、あるいは異常に大きいまたは不適当な免疫応答の軽減または抑制のいずれかによる免疫疾患の診断、予防、および治療に有用となりうる。免疫疾患は、Ｔ細胞が直接的または間接的に媒介しうる。
本発明は、動物にＣＲＰ１ポリペプチドまたはＢ７ＲＰ１ポリペプチドを投与することを含むＴ細胞媒介疾患の治療、予防、または回復のために提供される。本発明は、ＣＲＰ１ポリペプチドまたはＢ７ＲＰ１ポリペプチドの存在または発現量を決定することを含む動物のＴ細胞媒介疾患またはＴ細胞媒介疾患に対する感受性の診断方法；ならびに該ポリペプチドの存在または発現量に基づくＴ細胞媒介疾患またはＴ細胞媒介疾患に対する感受性の診断方法も提供する。通常、Ｔ細胞媒介疾患は、Ｔ細胞が直接的または間接的に媒介しうる免疫疾患である。動物は哺乳動物が好ましく、ヒトがより好ましい。本発明は、ＣＲＰ１ポリペプチドまたはＢ７ＲＰ１ポリペプチドと結合する試験分子の同定方法であって、該ポリペプチドを試験化合物と接触させ、ポリペプチドと試験化合物の結合程度を求めることを含む同定方法も提供する。この方法は、ＣＲＰ１ポリペプチドおよび／またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストの同定に使用可能である。
ＣＲＰ１ポリペプチドおよび／またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドのアンタゴニストは、自己免疫疾患（リウマチ様関節炎、乾癬、多発性硬化病、糖尿病、および全身性エリテマトーデスなど）、トキシックショック症候群、骨髄または臓器移植、炎症性腸疾患、輸血による異種感作、および移植片対宿主疾患の治療を含む多くの徴候の免疫抑制剤として使用することができる。さらに、アンタゴニストは、喘息およびアレルギーなどのＴ細胞依存性Ｂ細胞の媒介する徴候、および抗体媒介自己免疫疾患の抑制剤として使用することができる。ＣＲＰ１ポリペプチドおよび／またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドのアゴニストは、腫瘍のサーベイランスおよび除去のためのＴ細胞活性化に有用となりうるが、これに限定されるものではない。
本発明のアンタゴニストは、Ｂ７ＲＰ１またはＢ７ＲＰ１の細胞外ドメインと反応性であるかそれらと結合する抗体またはその断片を含み、この抗体はＢ７ＲＰ１とＣＲＰ１の結合を減少させるか結合しなくする。実施態様の１つでは、この抗体は、ヒトＢ７ＲＰ１またはその細胞外ドメインと選択的に結合する。アンタゴニストであるこの抗体またはその断片は、Ｂ７ＲＰ１の免疫共刺激活性を部分的または完全に阻害する。好ましい実施態様では、この抗体はモノクローナル抗体であり、マウス抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体であってよい。
本発明は、ＣＲＰ１の選択的結合剤またはＢ７ＲＰ１の選択的結合剤またはその療法を動物に投与することを含む、Ｂ７ＲＰ１とＣＲＰ１の相互作用を調節する方法もさらに提供する。実施態様の１つでは、この選択的結合剤は、Ｂ７ＲＰ１と結合して、Ｂ７ＲＰ１のＣＲＰ１に対する結合を減少させたりなくしたりする抗体である。本発明は、Ｂ７ＲＰ１の選択的結合剤を動物に投与することを含む、Ｂ７ＲＰ１が媒介する免疫共刺激を調節する方法も提供する。この選択的結合剤は、Ｂ７ＲＰ１と結合して、Ｂ７ＲＰ１が媒介する免疫共刺激を部分的または完全に抑制する抗体であることが好ましい。
本発明は、ＣＲＰ１ポリペプチドまたはＢ７ＲＰ１ポリペプチドをコードする核酸分子を動物に投与することを含む、動物のＴ細胞の活性化または増殖を調節する方法も提供する。例えば、Ｂ７ＲＰ１ポリペプチドをコードする核酸分子を、種々の腫瘍に対するＴ細胞の活性化を促進する遺伝子治療に使用することができる。
また、ＣＲＰ１ポリペプチドまたはＢ７ＲＰ１ポリペプチドを含む非ヒトのトランスジェニック哺乳動物も本発明に包含される。ＣＲＰ１ポリペプチドまたはＢ７ＲＰ１ポリペプチドを発現してその循環量を増大させる方法で、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１核酸が哺乳動物に導入される。非ヒトのトランスジェニック哺乳動物は、囓歯類が好ましく、マウスまたはラットがより好ましい。
マウスＣＲＰ１（ｍＣＲＰ１）のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列。ＣＲＰ１の予測シグナル配列にはアミノ末端で下線が引かれており、実験的に求めたプロペプチド開裂部位はアスタリスクで示され、予測膜貫通配列はカルボキシ末端に向かって下線が引かれている。 マウスＣＲＰ１タンパク質配列（ｍＣＲＰ１）とマウスＣＤ２８（ｍＣＤ２８）のアミノ酸配列。 マウスＢ７ＲＰ１（ｍＢ７ＲＰ１）のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列。Ｂ７ＲＰ１の予測シグナル配列にはアミノ末端で下線が引かれており、実験的に求めたプロペプチド開裂部位はアスタリスクで示される。予測膜貫通配列はカルボキシ末端に向かって下線が引かれている。 マウスＢ７ＲＰ１（ｍＢ７ＲＰ１）のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列。Ｂ７ＲＰ１の予測シグナル配列にはアミノ末端で下線が引かれており、実験的に求めたプロペプチド開裂部位はアスタリスクで示される。予測膜貫通配列はカルボキシ末端に向かって下線が引かれている。 Ｂ７ＲＰ１タンパク質配列（ｍＢ７ＲＰ１）とマウスＣＤ８０（ｍＣＤ８０）のアミノ酸配列。 推定ヒトＢ７ＲＰ１（ｈＢ７ＲＰ１）のタンパク質コード領域の構造および配列。ｈＢ７ＲＰ１の予測シグナル配列にはアミノ末端で下線が引かれている。予測シグナルペプチド開裂部位にはアスタリスクが付けられている。予測膜貫通配列にはカルボキシ末端に向かって下線が引かれている。 推定ヒトＢ７ＲＰ１（ｈＢ７ＲＰ１）のタンパク質コード領域の構造および配列。ｈＢ７ＲＰ１の予測シグナル配列にはアミノ末端で下線が引かれている。予測シグナルペプチド開裂部位にはアスタリスクが付けられている。予測膜貫通配列にはカルボキシ末端に向かって下線が引かれている。 推定成熟ｈＢ７ＲＰ１タンパク質と成熟マウスＢ７ＲＰ１（ｍＢ７Ｒｐ１）タンパク質のアミノ酸配列。 ｐｃＤＮＡ３／ＣＲＰ１−Ｆｃをトランスフェクションした２９３Ｔ細胞の可溶性ＣＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質の発現。図に示すように規格化体積の細胞溶解物または馴化培地を１０％ＰＡＧＥゲルに加えて分離させる。細胞関連（細胞溶解物）および分泌された（培地）のＦｃ融合タンパク質の発現についての、細胞溶解物および細胞培地上清のウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）分析。１次抗体はヤギ抗ヒトＦｃ抗体（ピアス・ケミカルカンパニー（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ），ＩＬ）であった。 ｐｃＤＮＡ３／Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃをトランスフェクションした２９３Ｔ細胞の可溶性Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質の発現。１０％ＰＡＧＥゲルに２０μｌの規格化細胞溶解物または培地上清を加えて分離させた。（ａ）と同様にウエスタン分析を行った。 ＣＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質およびＢ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質と、ＣＯＳ−７細胞の発現した膜結合タンパク質の相互作用。ＣＯＳ−７細胞には一時的にｐｃＤＮＡ３／ＣＲＰ１、ｐｃＤＮＡ３／Ｂ７ＲＰ１、またはｐｃＤＮＡ３ベクター単独をトランスフェクションした。ＣＨＯのＤ細胞にｐｓＤＲα／ｈＣＤ２８をトランスフェクションすると、ヒトＣＤ２８（ｈＣＤ２８）を安定に発現した。細胞の発現する膜結合ＣＲＰ１、Ｂ７ＲＰ１、またはｈＣＤ２８は、パネルの左側の列に示される。Ｆｃ融合タンパク質は、パネル上部の列に示されるプレート結合細胞とともにインキュベートした。インキュベート後、細胞を洗い流し、結合したＦｃ融合タンパク質を、抗ヒトＦｃ抗体とＡＣＡＳ（付着細胞分析および選別（Ａｄｈｅｒｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｓｏｒｔｉｎｇ）；ＡＣＡＳアルティマ（ＡＣＡＳ Ｕｌｔｉｍａ），メリディアン・インストルメンツ（Ｍｅｒｉｄｉａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．），オケモス（Ｏｋｅｍｏｓ），ＭＩ）分析を使用して検出した。 活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞上のＢ７ＲＰ１受容体（ＣＲＰ１と推定される）の発現のＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別器（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ））分析。マウス脾細胞はＰＭＡとイオノマイシンで１２時間活性化させた。各パネル底部に示されるように、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質、対照Ｆｃタンパク質（Ｍｏｃｋ−Ｆｃ）、またはＰＢＳ（染色なし）に細胞を加えてインキュベートし、洗浄し、次にヤギ抗ヒトＦｃ−ＦＩＴＣ複合抗体（ＧａＨｕＦｃ−ＦＩＴＣ）を加えてインキュベートした。各パネルの左側に示されるように、細胞マーカー抗体（Ｔ細胞マーカーＣＤ４およびＣＤ８の）ＰＥ複合体、またはアイソタイプ対照抗体（ラットアイソタイプ）ＰＥ複合体、またはＰＢＳ（染色なし）を加えた。 Ｂ細胞のＢ７ＲＰ１発現のＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別器）分析。マウス脾細胞のＣＲＰ１に対するリガンド（Ｂ７ＲＰ１と推定される）の発現の蛍光細胞数分析。各パネル底部に示されるように、ＣＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質、対照Ｆｃタンパク質（Ｍｏｃｋ−Ｆｃ）、またはＰＢＳ（染色なし）を、細胞を加えてインキュベートし、洗浄し、次にヤギ抗ヒトＦｃ−ＦＩＴＣ複合抗体（ＧａＨｕＦｃ−ＦＩＴＣ）を加えてインキュベートした。各パネルの左側に示されるように、ＰＥを複合化したＣＤ４５Ｒに対する細胞マーカー抗体（ＣＤ４５ＲはＢ細胞マーカーである）またはアイソタイプ対照抗体（ラットアイソタイプ）、またはＰＢＳ（染色なし）を加えた。 腹腔マクロファージのｍＣＲＰ１リガンドの発現のＦＡＣＳ分析。最初に腹腔細胞は、光散乱特性によってサブセットに分類した（パネルＡ）。前方（ＦＳＣ）および側方（ＳＳＣ）に強く光を散乱することができ、マクロファージのマーカーであるＦ４／８０抗原に対して陽性染色されるため、領域５（Ｒ５）にマクロファージを識別した（パネルＢ）。領域６（Ｒ６）のマクロファージは、Ｆ４／８０抗原による染色強度が低いことに基づいて選択したものであり、ＣＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質によって染色されることが分かった（Ｂ７ＲＰ１を発現するためと推定される）。 Ｂ７ＲＰ１−ＦＣ融合タンパク質を使用したＴ細胞増殖の抑制。マウス脾細胞からのＴ細胞を、グラフ底部に示されるようにコンカナバリン（Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ）Ａ（Ｃｏｎ Ａ）濃度を増加させることによって活性化させた。ＣｏｎＡの非存在下（添加せず）または存在下で脾細胞のＴ細胞を増加させるために、ｍＣＲＰ１−Ｆｃ、ｍＢ７ＲＰ１、およびｍＢ７．２−Ｆｃ融合タンパク質を加えた。９６ウェルプレートでのＴ細胞増殖アッセイに２００，０００細胞を使用した。グラフ凡例に示されるように、細胞を培地（添加物なし）またはＦｃ融合タンパク質でインキュベートした。４２時間後、細胞にＨ−チミジンを６時間加え、続いて回収し、放射活性を測定した。三重反復試料の平均ＣＰＭおよび標準偏差を示している。 Ａ）リンパ節皮質、傍皮質、および髄質を示している対照マウス＃１０の正常腸間膜リンパ節。ヘマトキシリン−エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色、４０倍。Ｂ）顕著な濾胞過形成（ＦＨ）、傍皮質の膨張、および髄索過形成（ＭＨ）を示すＷＸ１１マウス＃４０の顕著に肥大した腸間膜リンパ節。Ｈ＆Ｅ、４０倍。Ｃ）対照マウス＃１０の腸間膜リンパ節の髄索（ＭＣ）および髄洞（ＭＳ）の拡大図。新しいマクロファージを有する髄洞の近傍に大部分が小リンパ球で構成される小さな軸索が注目される。Ｈ＆Ｅ、４００倍。Ｄ）ＷＸ１１マウス＃４０の腸間膜リンパ節の髄索（ＭＣ）および髄洞（ＭＳ）の拡大図。点在するラッセル小体細胞（矢印）を有する多数の形質細胞で構成される顕著に太い髄索が注目される。Ｈ＆Ｅ、４００倍。Ｅ）動脈周囲リンパ鞘（ＰＡＬＳ）を有する赤脾髄領域および白脾髄領域を示している対照マウス＃１０の正常脾臓、１００倍。挿入図：小リンパ球、マクロファージ、および時々の形質細胞を有する白脾髄の周縁領域の拡大図、４００倍。Ｆ）ＰＡＬＳおよび濾胞（矢印）を含む肥大した白脾髄領域を有するＭＸ１１マウス＃６の脾臓、１００倍。挿入図：多数の形質細胞および時々のラッセル小体を有する周縁領域の拡大図、４００倍。Ｇ）２つの２次濾胞が隣接する濾胞間領域（矢印）を有する対照マウス＃２５のパイエル板を有する回腸、４０倍。Ｈ）顕著な胚中心と濾胞間組織（矢印）を有する顕著に肥大した濾胞を有するＷＸ１１マウス＃３２のパイエル板を有する回腸、４０倍。 Ａ）リンパ節皮質、傍皮質、および髄質を示している対照マウス＃５の正常腸間膜リンパ節。ヘマトキシリン−エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色、４０倍。Ｂ）顕著な濾胞過形成（上部：外部皮質の第２濾胞の列）、膨張した傍皮質（中央）および髄索過形成（下部）が見られるＷＸ１１マウス＃３３の顕著に肥大した腸間膜リンパ節。Ｈ＆Ｅ、４０倍。Ｃ）抗Ｂ２２０抗体（Ｂ細胞マーカー）による対照マウス＃１０の腸間膜リンパ節の免疫組織化学的染色。強く（褐色）染色された軸索領域と薄い髄索に注目されたい。アビジン−ビオチン複合体（ＡＢＣ）免疫ペルオキシダーゼ法（ＤＡＢ色原体、ヘマトキシリン中心染色）を使用して免疫染色を行った。４０倍。Ｄ）抗Ｂ２２０抗体によるＷＸ１１マウス＃３３の腸間膜リンパ節の免疫組織化学的染色。強く染色された皮質濾胞および髄索（索の成熟形質細胞はＢ２２０に対して陰性である）に注目されたい。４０倍。Ｅ）抗ＣＤ３抗体（Ｔ細胞マーカー）による対照マウス＃１０のリンパ節の免疫組織化学的染色。リンパ節の傍皮質領域の免疫染色に注目されたい。４０倍。Ｆ）抗ＣＤ３抗体によるＷＸ１１マウス＃３３のリンパ節の免疫組織化学的染色。リンパ節の肥大し強く染色された傍皮質領域に注目されたい。４０倍。 ヒトＢ７ＲＰ１（ｈＢ７ＲＰ１）のタンパク質コード領域の構造および配列。ｈＢ７ＲＰ１の予測シグナル配列にはアミノ末端で下線が引かれている。予測シグナルペプチド開裂部位にはアスタリスクが付けられている。予測膜貫通配列にはカルボキシ末端に向かって下線が引かれている。 ヒトＢ７ＲＰ１（ｈＢ７ＲＰ１）のタンパク質コード領域の構造および配列。ｈＢ７ＲＰ１の予測シグナル配列にはアミノ末端で下線が引かれている。予測シグナルペプチド開裂部位にはアスタリスクが付けられている。予測膜貫通配列にはカルボキシ末端に向かって下線が引かれている。 推定成ｈＢ７ＲＰ１タンパク質と成熟マウスＢ７ＲＰ１（ｍＢ７ＲＰ１）タンパク質のアミノ酸配列。 ヒトＣＲＰ１（ｈＣＲＰ１）のタンパク質コード領域の構造および配列。ｈＣＲＰ１の予測シグナル配列にはアミノ末端で下線が引かれている。予測シグナルペプチド開裂部位はアスタリスクが付けられている。予測膜貫通配列にはカルボキシ末端に向かって下線が引かれている。 ヒトＣＲＰ１（ｈＣＲＰ１）のタンパク質コード領域の構造および配列。ｈＣＲＰ１の予測シグナル配列にはアミノ末端で下線が引かれている。予測シグナルペプチド開裂部位はアスタリスクが付けられている。予測膜貫通配列にはカルボキシ末端に向かって下線が引かれている。 ｈＣＲＰ１タンパク質とマウスＣＲＰ１（ｍＢ７ＲＰ１）タンパク質のアミノ酸配列。 ＣＲＰ−１は休止記憶Ｔ細胞上にある。６〜７月齢のマウスの休止脾細胞は、ＦＩＴＣ複合化抗ヒトＦｃ抗体と、ＣＤ４４（図１４Ａ）、ＣＤ４５ＲＢ（図１４Ｂ）、またはＣＤ６９（図１４Ｃ）のいずれかに対する抗体とＰＥの複合体によるＢ７ＲＰ−１−Ｆｃ標識を使用して二重染色した。 Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質によるＴ細胞の共刺激。Ａ）異なる量のＢ７ＲＰ−１−Ｆｃ（黒四角）、Ｂ７．２−Ｆｃ（黒丸）、またはＯＰＧ−Ｆｃ融合タンパク質対照試料（白四角）を抗ＣＤ３抗体と併用してＴ細胞の増殖を誘発させた。種々の濃度の融合タンパク質を使用して、抗ヒトＦｃＦＡｂ２（１２．５μｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ３抗体（０．９μｇ／ｍｌ）で予備コーティングした９６ウェルプレートにコーティングした。Ｂ７ＲＰ−１−ＦｃおよびＢ７．２−Ｆｃは、最大効果がえられる０．３μｇ／ｍｌを最大量として用量依存的にＴ細胞を共刺激する。Ｂ）Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃ（黒四角）、Ｂ７．２−Ｆｃ（黒丸）、非融合Ｆｃ（白四角）、またはＦｃなし（白丸）を、抗ＣＤ３抗体（０．８５μｇ／ｍｌ）および種々の濃度のウサギ抗Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃポリクローナル抗体と併用してＴ細胞の増殖を誘発させた。Ｆｃ融合タンパク質は濃度０．３μｇ／ｍｌで使用し、上記プレートに結合させた。アジュバントに乳化させた抗原の精製Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃを皮下注射して抗Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃ抗体を産生させ、次にアフィニティ精製した。この抗体にＦｃ融合タンパク質を加えて３０分間インキュベートした後に細胞に加えた。抗Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃ抗体は用量依存的に、Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃにより誘発されるＴ細胞増殖を特異的に阻害する。 マウスのコラーゲン誘発関節炎の（Ａ）発生率および（Ｂ）重度に対するＣＲＰ−１−Ｆｃタンパク質およびＢ７ＲＰ−１−Ｆｃタンパク質の効果。コラーゲン誘発関節炎感受性のＢ１０．ＲＩＩＩマウスの尾の基部にＣＦＡ中の１０μｇのブタコラーゲンＩＩ型を免疫した。１００μｇの融合タンパク質をマウスに１週間当り２回与えた。Ｆｃ融合タンパク質および対照ＰＢＳによる処理は図の凡例に示している。 Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃトランスジェニックマウスの近位結腸。（Ａ）粘膜、粘膜下組織、筋層、および漿膜を有する腸壁を示す対照マウス＃５３Ｆ（メス）の正常近位結腸。ヘマトキシリン−エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色、倍率４０倍。（ｂ）顕著な腺肥大、裂傷潰瘍形成、および経壁炎症を有するＢ７ＲＰ−１−Ｆｃトランスジェニックマウス＃１１１Ｆのびまん性肥厚化近位結腸。Ｈ＆Ｅ、４０倍。（Ｃ）多病巣性裂傷潰瘍形成および経壁炎症を有するＢ７ＲＰ−１−Ｆｃトランスジェニックマウス＃１１１Ｆの近位結腸（パネルＢと同じ）のより低倍率での図。Ｈ＆Ｅ、２０倍。（Ｄ）Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃトランスジェニックマウス＃１１１Ｆ裂傷潰瘍および肥大性直腸腺（上述のパネルＢおよびＣに示される）の拡大図。粘液化膿性滲出物を有する内腔に注意されたい。Ｈ＆Ｅ、１００倍。（Ｅ）マクロファージ、リンパ球、およびより少数の好中球に囲まれる多核巨細胞が見られるＢ７ＲＰ−１−Ｆｃトランスジェニックマウス＃１１２Ｆの粘膜下組織の肉芽腫性炎の拡大図。Ｈ＆Ｅ、４００倍。（Ｆ）粘膜腺の直下のリンパ球、形質細胞、およびより少数の好中球と混合された類上皮マクロファージが見られるＢ７ＲＰ−１−Ｆｃトランスジェニックマウス＃１１２Ｆの粘膜の肉芽腫性炎の拡大図。Ｈ＆Ｅ、４００倍。 Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃトランスジェニックマウスの遠位結腸。（Ａ）粘膜、粘膜下組織、筋層、および漿膜を有する腸壁の層が示される対照マウス＃５３Ｆ（メス）の正常遠位結腸。ヘマトキシリン−エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色、倍率４０倍。（ｂ）顕著な腺肥大および過形成、ならびに散在する腺窩膿瘍が見られるＢ７ＲＰ−１−Ｆｃトランスジェニックマウス＃１１１Ｆ（メス）のびまん性肥厚化遠位結腸。Ｈ＆Ｅ、４０倍。（Ｃ）顕著な腺肥大および過形成の見られるＢ７ＲＰ−１−Ｆｃトランスジェニックマウス＃５５Ｍ（オス）のびまん性肥厚化遠位結腸。Ｈ＆Ｅ、４０倍。（Ｄ）肥大性結腸腺、限局性リンパ様凝集体、および多くの腺窩膿瘍が見られるＢ７ＲＰ−１−Ｆｃトランスジェニックマウス＃１１２Ｆ（メス）のびまん性肥厚化遠位結腸。Ｈ＆Ｅ、４０倍。（Ｅ）抗ＣＤ３抗体（Ｔ細胞マーカー）によるＢ７ＲＰ−１−Ｆｃトランスジェニックマウス＃１１２Ｆの遠位結腸の免疫組織化学的染色。表在粘膜および結腸リンパ様斑の免疫染色に注目されたい。Ｈ＆Ｅ、４０倍。（Ｆ）腺窩膿瘍（矢印）とＢ２２０＋Ｂ細胞で構成されるリンパ様凝集体（差し込み）とが見られるＢ７ＲＰ−１−Ｆｃトランスジェニックマウス＃１１２Ｆの結腸粘膜の拡大図。Ｈ＆Ｅ、１００倍。 Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃトランスジェニックマウスの小腸。（ａ）粘膜の内腔、絨毛、および腺窩が見られ、粘膜下組織、筋層、および漿膜がその下にある対照マウス＃５３Ｆ（メス）の正常十二指腸。ヘマトキシリン−エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色、倍率４０倍。（ｂ）顕著な腺窩肥大および過形成、ならびに粘膜固有層の軽度のリンパ形質細胞性浸潤が見られるＢ７ＲＰ−１−Ｆｃトランスジェニックマウス＃５１Ｆ（メス）のびまん性肥厚化十二指腸。Ｈ＆Ｅ、４０倍。（ｃ）空腸粘膜に正常な長さの絨毛および腺窩が見られる対照マウス＃５３Ｆ（メス）の正常空腸。Ｈ＆Ｅ、倍率４０倍。（ｄ）局所的に高度の腺窩肥大および過形成が見られるＢ７ＲＰ−１−Ｆｃトランスジェニックマウス＃５１Ｆ（メス）の顕著に 肥厚化した空腸粘膜。Ｈ＆Ｅ、４０倍。（Ｅ）回腸粘膜で正常な長さの絨毛および腺窩が見られる対照マウス＃５３Ｆ（メス）の正常回腸。Ｈ＆Ｅ、倍率４０倍。（Ｆ）絨毛が局所的に失われ平滑化したＢ７ＲＰ−１−Ｆｃトランスジェニックマウス＃２３１Ｍ（オス）の軽度に萎縮した回腸粘膜。Ｈ＆Ｅ、４０倍。 Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質はマウスの腫瘍増殖を抑制する。Ｍｅｔｈ Ａ肉腫細胞をＢａｌｂ／Ｃマウスの腹部の皮内に移植した。移植の７日後、１０日後、１４日後、および１７日後に、マウスを媒体（黒ひし形）またはマウスＢ７ＲＰ−１−Ｆｃ（灰色三角、実施例７）で処理した。移植後の指定の日に、実施例２０に記載のように腫瘍体積を測定した。腫瘍増殖を最長２８日まで観察した。各群は８匹のマウスで構成された。 ヒトＢ７ＲＰ−１−ＦｃによるＴ細胞共刺激。実施例２１に記載のように、抗ＣＤ３およびヒトＢ７ＲＰ−１ Ｆｃを使用して９６ウェルプレートをコーティングし、１×１０５Ｔ細胞／ウェル（＞９８％ＣＤ３＋）を培養して回収した。Ａ）異なる濃度の抗ＣＤ３の１次刺激における、抗ＣＤ３のみ（黒丸）、０．５μｇ／ｍｌのＢ７ＲＰ−１ Ｆｃ（黒三角）、０．５μｇ／ｍｌのＯＰＧ−Ｆｃ（白丸）、および５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（白三角）による共刺激。データは、抗ＣＤ３で１次刺激したＴ細胞のＢ７ＲＰ−１−Ｆｃによる共刺激が、抗ＣＤ２８抗体を使用した共刺激と同程度であることを示している。示されるデータは、３つの正常ドナーから単離したＴ細胞で行った数回の実験の代表的な１つについての三重反復ウェルの平均［３Ｈ］ＴｄＲ±ＳＤが含まれている。 ヒトＢ７ＲＰ−１−ＦｃによるＴ細胞共刺激。実施例２１に記載のように、抗ＣＤ３およびヒトＢ７ＲＰ−１ Ｆｃを使用して９６ウェルプレートをコーティングし、１×１０５Ｔ細胞／ウェル（＞９８％ＣＤ３＋）を培養して回収した。Ｂ）ＣＲＰ−１−ＦｃによるＢ７ＲＰ−１−ＦＣ共刺激の用量依存性阻害。０．３μｇ／ｍｌおよび０．５μｇ／ｍｌのＢ７ＲＰ−１−Ｆｃの両方で抗ＣＤ３をコーティングしたウェルでＴ細胞を培養した。連続的に希釈した濃度のＣＲＰ−１−Ｆｃ（黒丸）またはＯＰＧ−Ｆｃ（白丸）に、Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃを加えて３０分間予備インキュベートした後に、Ｔ細胞を加えた。データは、ＣＲＰ−１−ＦｃがＢ７ＲＰ−１誘発共刺激を用量依存的に抑制することを示している。％阻害をＣＲＰ−１−ＦｃまたはＯＰＧ−Ｆｃタンパク質濃度に対してプロットする。示されるデータは、三重反復ウェルで行った３回の実験の平均［３Ｈ］ＴｄＲ±ＳＤであり、２つの正常ドナーで行った実験を代表している。 ヒトＢ７ＲＰ−１−ＦｃによるＴ細胞共刺激。実施例２１に記載のように、抗ＣＤ３およびヒトＢ７ＲＰ−１ Ｆｃを使用して９６ウェルプレートをコーティングし、１×１０５Ｔ細胞／ウェル（＞９８％ＣＤ３＋）を培養して回収した。Ｃ）ＣＨＯヒトＢ７ＲＰ−１細胞による共刺激。実施例２２に記載されるように、Ｔ細胞を末梢血から精製し、抗ＣＤ３単独（黒丸）、１×１０４ＣＨＯベクター対照細胞（白丸）、または１×１０４ＣＨＯ Ｂ７ＲＰ−１細胞（黒三角）の存在下で種々の濃度の抗ＣＤ３を加えて培養した。データは、膜結合Ｂ７ＲＰ−１によるＴ細胞増殖の共刺激が、Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質を使用した場合に観察される共刺激都道程度であることを示している。示されるデータは三重反復培養の平均±ＳＤであり、２つの正常ドナーで得られる結果を代表している。 ヒトＢ７ＲＰ−１−ＦｃによるＴ細胞共刺激。実施例２１に記載のように、抗ＣＤ３およびヒトＢ７ＲＰ−１ Ｆｃを使用して９６ウェルプレートをコーティングし、１×１０５Ｔ細胞／ウェル（＞９８％ＣＤ３＋）を培養して回収した。Ｄ）サイトカイン産生。（図２１Ａ）に記載のようにＴ細胞を培養し、４８時間（黒棒）および７２時間（灰色棒）で上清を回収した。データは、Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃ共刺激細胞によって産生されるＩＬ−２量（一番上のグラフ）は、抗ＣＤ３および対照Ｆｃによって刺激された細胞の産生する量と同様であるが、抗ＣＤ２８共刺激細胞の産生する量よりは有意に少ないことを示している。またデータは、Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃ共刺激が、ＩＬ−１０（中央のグラフ）およびＩＦＮ−γ（一番下のグラフ）産生を向上させることも示している。
発明の詳細な説明
本発明は、本明細書においてＣＲＰ１およびＢ７ＲＰ１と称される新規ポリペプチドを提供し、これらはＴ細胞活性化に関与する受容体−リガンド対を構成している。本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、マウス腸上皮内細胞から作製したライブラリーから同定され、ＣＤ２８ポリペプチドおよびＣＴＬＡ−４ポリペプチド（ＣＲＰ１の場合）、またはＢ７．１ポリペプチドおよびＢ７．２ポリペプチド（Ｂ７ＲＰ１の場合）との相同性を基準にしてスクリーニングを行った。
ＣＤ２８関連タンパク質−１、すなわちＣＲＰ１は、アミノ末端のシグナル配列と細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、カルボキシ末端細胞内ドメインを有するＩ型膜貫通タンパク質であると予測される（図１）。ＣＲＰ１タンパク質の全長は、成熟形態で１８０アミノ酸である。予測リーダー配列はアミノ酸残基で１〜２０付近（開始メチオニンに対して）に及び、成熟タンパク質の細胞外ドメインは残基２１〜１４５付近を含む（実施例１）。予測膜貫通ドメインは残基１４６〜１６３付近にわたり、細胞内ドメインは残基１６４〜２００付近を含む。アミノ末端細胞外ドメインはＩｇループと同様に、推定細胞内および細胞間結合システインが保存される。さらに、Ｂ７．１およびＢ７．２がＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４と結合するために重要であると従来知られていた「ＭＹＰＰＰＹ」モチーフも部分的に保存される。
マウスＣＤ２８とＣＴＬＡ−４の間でアミノ酸同一性が２６％であると例示されるように、ＣＤ２８とＣＴＬＡ−４は相同性が弱い。ＣＲＰ１とマウスＣＤ２８ではアミノ酸同一性が１９％であり、ＣＲＰ１とマウスＣＴＬＡ−４では同一性が１４％である。しかし、残基４２、６３、８３、１０９、および１３７（ＣＲＰ１タンパク質の開始メチオニンが基準。図１Ａ参照）においてマウスＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、およびＣＲＰ１の間で重要なシステイン残基が保存されている。おおよその成熟タンパク質長さ、およびカルボキシル末端に対する膜貫通領域の位置も、ＣＲＰ１、ＣＤ２８、およびＣＴＬＡ−４で同様である。
ヒトＣＲＰ１は、図１３Ａに示されるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を有する膜貫通タンパク質である。予測リーダー配列は残基１〜１９付近、または残基１〜２０付近にわたる。予測成熟アミノ末端は残基２０または２１である。成熟アミノ末端は位置２１が好ましい。細胞外ドメインは任意の予測成熟アミノ末端からアミノ酸残基１４０付近に広がり、膜貫通ドメインは残基１４１〜１６１付近に及び、細胞内ドメインは残基１６２〜１９９付近にわたる。ヒトＣＲＰ１タンパク質はマウスタンパク質と６９％同一であり、対応するヌクレオチド配列は７７％が同一である。ヒトＣＲＰ１の配列は、ハトロフ（Ｈｕｔｌｏｆｆ）らＮａｔｕｒｅ ３９７，２６３−２６６（１９９９）に報告されている。
Ｂ７関連タンパク質−１、すなわちＢ７ＲＰ１は、アミノ末端のシグナル配列および細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、カルボキシ末端細胞内ドメインとを有するＩ型膜貫通タンパク質であると予測される（図２Ａ）。Ｂ７ＲＰ１タンパク質の全長は、成熟形態で２７６アミノ酸である。予測リーダー配列はアミノ酸残基１〜４６付近（開始メチオニンに対して）であり、成熟タンパク質の細胞外ドメインは残基４７〜２７９を含む（実施例３）。予測膜貫通ドメインは残基２８０〜２９８にひろがり、細胞内ドメインは残基２９９〜３２２を含む。Ｂ７．１およびＢ７．２と同様に、Ｂ７ＲＰ１の細胞外ドメインは２つのＩｇループを含む。
マウスＢ７．１とＢ７．２の間のアミノ酸同一性が２４％であることで示されるように、Ｂ７．１とＢ７．２は相同性が弱い。Ｂ７ＲＰ１とマウスＢ７．１の間のアミノ酸同一性は２０％であり、Ｂ７ＲＰ１とマウスＢ７．２の間の同一性は１９％である。しかし、マウスＢ７．１、Ｂ７．２、およびＢ７ＲＰ１の間で重要なシステイン残基は、残基６２、１３８、１８５、および２４２（Ｂ７ＲＰ１タンパク質の開始メチオニンが基準、図２Ａ）において保存されている。おおよその成熟タンパク質長、およびカルボキシ末端に他意汁膜貫通領域の位置もｍＢ７ＲＰ１、Ｂ７．１、およびＢ７．２で同様である。
ヒトＢ７ＲＰ１も、Ｉｇループ構造を必要とする細胞外ドメインにシステイン残基が保存される膜貫通タンパク質である。図３Ａに示されるように予測リーダー配列は、残基１〜１８、１〜１９、１〜２０、１〜２１、１〜２３、または１〜２７の付近を含む。予測成熟アミノ末端は、残基１９、２０、２１、２２、２４、または２８のいずれであってもよい。好ましくはアミノ末端は位置１９である。細胞外ドメインは任意の成熟アミノ末端からアミノ酸残基２５９付近に広がる。予測膜貫通ドメインは残基２５９〜２７４に及ぶ。細胞内ドメインは残基２７５〜３０２を含む。ヒトＢ７ＲＰ１の全長のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は図１２Ａに示される。ヒトＢ７ＲＰ１はマウスタンパク質と約４３％が同一である。
ＣＲＰ１とＢ７ＲＰ１は互いに結合するが、ＣＲＰ１はＢ７ＲＰ１関連タンパク質Ｂ７．２とは検出可能な程度では結合せず；Ｂ７ＲＰ１はＣＲＰ１関連ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４との検出可能な結合を示さない（実施例８）。Ｂ７ＲＰ１はＴ細胞増殖を調節することが示されたが、これはＢ７ＲＰ１とＣＲＰ１受容体の相互作用のためと推測されている（実施例１１）。従ってＣＲＰ１とＢ７ＲＰ１は、Ｔ細胞の増殖と活性化を調節する新規な経路を表している。
Ｂ７ＲＰ１とＣＲＰ１の相互作用は、免疫共刺激、ならびにＴ細胞の増殖および活性化を増加または減少させることができるような方法で調節することができる。例として、マウスＢ７ＲＰ１に対して産生される抗Ｂ７ＲＰ１モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体は、Ｂ７ＲＰ１／ＣＲＰ１相互作用を遮断し、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質に誘発されるＴ細胞増殖も遮断した（実施例１７参照）。ヒトＣＲＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質は、ヒトＢ７ＲＰ−１−Ｆｃによって誘発されるヒトＴ細胞の増殖を遮断した（実施例２１）。さらに、ＣＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質を加えることによって、リウマチ様関節炎のマウスモデルの関節炎症状の発生が遅れた（実施例１８参照）。Ｂ７ＲＰ−１／ＣＲＰ−１共刺激は、Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質またはこの経路の他の活性化物質を加えることによって増大させることができる（実施例２０）。
核酸分子
用語「単離核酸分子」は、必然的に関連する少なくとも１種類の汚染核酸分子がない核酸分子を意味し、好ましくは他のあらゆる汚染哺乳鵜動物核酸分子が実質的にない核酸分子を意味する。
用語「対立遺伝子変異体」は、生物の染色体の所与の位置を占める遺伝子の数種類の可能な自然発生的別形態のうちの１つを意味する。
用語「スプライス変異体」は、ＲＮＡ転写において別のイントロン配列のプロセシングによって生成する核酸分子（通常はＲＮＡ）を意味する。
用語「高ストリンジェンシー条件」は、（１）洗浄に低イオン強度および高温を使用、例えば５０℃で０．１×ＳＳＣ（０．０１５ＭのＮａＣｌ／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム）０．１％のＮａＤｏｄＳＯ４（ＳＤＳ）、または（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド、例えば５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドなどの変性剤と０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％を使用、などの条件を意味する。フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）と５×ＳＳＣ（７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）を４２℃で使用。高ストリンジェンシー条件の別の例は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、および１０％の硫酸デキストランを４２℃で使用し、４２℃において０．２×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳで洗浄する。
用語「中ストリンジェンシー条件」は、上記よりもストリンジェンシー性の低い洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度やイオン強度）の使用を含む条件を意味する。中ストリンジェンシー条件の一例は、２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｌ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中３７℃で終夜インキュベートした後、約３７〜５０℃で１×ＳＳＣを使用してフィルターをろ過する、などの条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子の適合に必要な温度、イオン強度、および他の要因の調節方法が分かるであろう。
組換えＤＮＡ技術は、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），コールド・スプリング・パーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），コールド・スプリング・パーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ），ＮＹ（１９８９））および／またはオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編著（分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），グリーン・パブリッシャー（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ．）およびワイリー・アンド・サンズ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ），ＮＹ（１９９４））に記載されており、これらの記載内容全体を本明細書に引用する。
本発明は、ＣＲＰ１ポリペプチドおよびＢ７ＲＰ１ポリペプチドをコードする単離核酸分子を提供する。また本発明は、ＣＲＰ１ポリペプチドおよびＢ７ＲＰ１ポリペプチドをコードする分子の配列の断片、対立遺伝子変異体、スプライス変異体、または相補的なものである核酸分子も提供する。ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１をコードする分子と少なくとも約７０％が同一である核酸分子、または中または高ストリンジェンシー条件下でＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１をコードする分子とハイブリッド形成する核酸分子も本発明に含まれる。これらの核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、あるいは部分的または完全に合成した核酸分子であってもよい。好ましい実施態様では、本発明の核酸分子は、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１をコードする核酸分子と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が同一である。
ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１のポリペプチドまたはその断片をコードする遺伝子またはｃＤＮＡは、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーのハイブリッド形成スクリーングまたはＰＣＲ増幅などによって得ることができる。ライブラリーのスクリーニングに有用なプローブまたはプライマーは、同一ファミリーまたは関連ファミリーの遺伝子の他の公知の遺伝子または遺伝子断片の配列情報、例えばシステイン残基の保存配列などのＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１関連ポリペプチドに見られる保存モチーフの配列情報を基準にして生成することができる。さらに、ＣＲＰ１ポリペプチドまたはＢ７ＲＰ１ポリペプチドをコードする遺伝子がある種について同定された場合は、その遺伝子の全体または一部を他の種の相同性遺伝子の同定のプローブとして使用することができる。プローブまたはプライマーは、ＣＲＰ１遺伝子またはＢ７ＲＰ１遺伝子を発現すると考えられている種々の組織源からｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用することができる。
オリゴヌクレオチドプローブがｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーのスクリーニングに使用される場合は、以下の２種類の高ストリンジェンシー溶液のうちの１つを使用することができる。これらの溶液の第１は、６×ＳＳＣと０．０５％のピロリン酸ナトリウムを３５℃〜６２℃で使用し、この温度はオリゴヌクレオチドプローブの長さに依存する。例えば、１４塩基対プローブは３５〜４０℃で洗浄され、１７塩基対プローブは４５〜５０℃で洗浄され、２０塩基対プローブは５２〜５７℃で洗浄され、２３塩基対プローブは５７〜６３℃で洗浄される。バックグラウンドの非特異的結合が大きい場合にはこの温度を２〜３℃上昇させることができる。第２の高ストリンジェンシー溶液では、オリゴヌクレオチドプローブの洗浄に塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）を使用する。ストリンジェンシー洗浄溶液の１つは、３ＭのＴＭＡＣ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、および０．２％のＳＤＳである。この溶液が使用される洗浄温度は、プローブの長さの関数である。例えば、１７塩基対プローブは約４５〜５０℃で洗浄される。ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１のポリペプチドまたはそれらの断片をコードする遺伝子を作製する別の手段は、エンジェル（Ｅｎｇｅｌｓ）ら（Ａｇｎｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．，２８：７１６−７３４（１９８９））に記載されるものなどの当業者には公知の方法を用いる化学合成を使用することである。これらの方法としては、特に、リン酸トリエステル法、ホスホロアミダイト法、およびＨ−ホスホネート法による核酸合成が挙げられる。このような化学合成の好ましい方法は、標準的ホスホロアミダイト化合物を使用するポリマー支持合成である。通常、ＣＲＰ１ポリペプチドまたはＢ７ＲＰ１ポリペプチドをコードするＤＮＡは長さが数百ヌクレオチドとなる。約１００ヌクレオチドを超える核酸は、これらの方法を使用して数個の断片として合成することができる。次にこれらの断片を結合させて、ＣＲＰ１ポリペプチドまたはＢ７ＲＰ１ポリペプチドの全長を形成することができる。通常、ポリペプチドのアミノ末端をコードするＤＮＡ断片はメチオニン残基をコードするＡＴＧを有する。このメチオニンは、成熟形態のＣＲＰ１ポリペプチドまたはＢ７ＲＰ１ポリペプチドに存在してもしなくてもよく、これは宿主細胞で産生されるこのポリペプチドが細胞から分泌されるように計画されるかどうかに依存する。
それにも拘らず、生物活性であるポリペプチドをそれ自身コードしない、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１核酸分子、断片、及び／または誘導体は、哺乳類の組織または体液試料中のＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１のＤＮＡあるいは対応するＲＮＡの存在に対して、定性的あるいは定量的に試験する診断アッセイにおける交雑プローブとして有用である。
ある場合には、天然のＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチドの核酸及び／またはアミノ酸変異体を製造することが望ましい。核酸変異体は、プライマーが所望の点突然変異を持つ、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ増幅、または他の適切な方法を用いて産生されてよい（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，上記，及び突然変異誘発の手法の記述については、Ａｕｓｕｂｅｌら，上記を参照）。上記のＥｎｇｅｌｓらにより述べられた方法を用いての化学合成を使用して、このような変異体を製造してもよい。当業者に知られている他の方法も使用してもよい。
好ましい核酸変異体は、一定の宿主細胞におけるＣＲＰ１とＢ７ＲＰ１ポリペプチドの最適発現に対して変更されたコドンを含むものを含んでいる。特定のコドン変更は、タンパク質と宿主細胞の選択に依存する。一つの場合には、一定の宿主細胞の高度に発現された遺伝子において優先的に使用されるコドンを選択することにより、このような「コドン最適化」を行うことができる。高度に発現された細菌の遺伝子のコドン選択に対する「Ｅｃｏｈｉｇｈ．Ｃｏｄ」等のコドン頻度表を組込むコンピューターアルゴリズムが使用されてよく、これはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅバージョン９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにより提供される。他の有用なコドン頻度表は、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｌｏｗｃｏｄ」、「Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｈｕｍａｎ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｍａｉｚｅ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、及び「酵母＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」を含む。他の好ましい変異体は、野生のタイプに比べて上記に述べたような保存アミノ酸変化（例えば、天然のアミノ酸の側鎖の荷電または極性は異なるアミノ酸による置換により実質的に変えられない）をコードするもの、新規なグリコシル化及び／またはリン酸化部位を生成するように設計されたもの、または現存のグリコシル化及び／またはリン酸化部位を削除するように設計されたものである。
標準連結法を用いて、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドをコードする遺伝子、ｃＤＮＡ、またはこれらの断片を適切な発現または増幅ベクター中に挿入することができる。このベクターは、通常、使用される特別な宿主細胞において機能的であるように選択される（すなわち、このベクターは、この遺伝子の増幅及び／またはこの遺伝子の発現が起こることができるように、宿主細胞仕組みと適合している）。ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドをコードする遺伝子、ｃＤＮＡ、またはこれらの断片は、原核、酵母、昆虫（バキュロウイルス系）及び／または真核の宿主細胞において増幅／発現されてよい。この宿主細胞の選択は、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドまたはこれらの断片がグリコシル化及び／またはリン酸化されるかどうかに一部依存する。そうであるとすれば、酵母、昆虫、または哺乳類の宿主細胞が好ましい。
通常、宿主細胞のいずれかで使用される発現ベクターは、プラスミド維持及び挿入ヌクレオチド配列のクローニングと発現のための配列を含む。「隣接配列」とまとめて呼ばれるこのような配列は、プロモーター及びエンハンサー、複製エレメントの起源、転写停止エレメント、供与体と受容体またはスプライス部位を含む完全なイントロン配列、シグナルペプチド配列、リボソーム結合部位エレメント、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域及び選択マーカーエレメント等の他の調節エレメントを含む。これらのエレメントの各々は下記に述べられる。場合によっては、このベクターは、「タグ」配列、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドコーディング配列の５’または３’末端に位置するすなわちオリゴヌクレオチド分子を含んでよい。このオリゴヌクレオチド分子は、ポリヒス（ヘキサヒス等の）、または市販の抗体が存在する、ＦＬＡＧ、ＨＡ（血球凝集素インフルエンザウイルス）またはｍｙｃ等の他の「タグ」をコードする。このタグは、通常、このポリペプチドの発現時にこのポリペプチドに融合され、宿主細胞からのＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドをアフィニティ精製する手段として機能することができる。例えば、このタグに対する抗体を親和マトリックスとして用いるカラムクロマトグラフィにより、アフィニティ精製を行うことができる。場合によっては、引き続いて、このタグは、しかるべきペプチダーゼ用いる等の種々の手段により精製されたＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドから除去され得る。
当業者によれば、ヒト免疫グロブリンヒンジとＦｃ領域は、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端のいずれかに融合されてよい。引き続くＦｃ融合タンパク質は、タンパク質Ａ親和カラムを使用することにより精製され得る。免疫グロブリンＦｃ領域は、インビトロで長い薬物動力学的半減期を示すことが知られていて、Ｆｃ領域に融合されたタンパク質は、非融合品と比較して、インビトロで実質的に大きい半減期を示すことが見出されている。また、このＦｃ領域への融合により、一部の分子の生物活性に有用であるこの分子の二量化及び／または多量化が可能になる。
この隣接配列は、同種（すなわち、宿主細胞と同じ種及び／または菌株からの）、異種（すなわち、宿主細胞種または菌株と別の種からの）、雑種（すなわち、一つの以上のソースからの隣接配列の組み合わせ）、合成によるものであってよく、またはこれは、未変性のＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１核酸隣接配列であってよい。従って、この隣接配列が宿主細胞仕組みで機能的であり、活性化され得るという前提であれば、隣接配列のソースは、いかなる単一細胞の原核または真核生物体、いかなる脊椎あるいは無脊椎生物体、またはいかなる植物であってよい。
本発明のベクターにおいて有用である隣接配列は、当分野においてよく知られている方法のいずれによって得られてもよい。通常、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１核酸隣接配列以外の、ここにおいて有用な隣接配列は、マッピングにより及び／または制限エンドヌクレアーゼ消化により以前に同定されていて、このようにして、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて適当な組織ソースから単離され得る。いくつかの場合には、この隣接配列の完全なヌクレオチド配列は知られているかもしれない。ここで、この隣接配列は、核酸合成またはクローニングについて上述した方法を用いて合成されてよい。
この隣接配列のすべてまたは一部のみが知られている場合には、ＰＣＲを用いて及び／または同じあるいはもう一つの種からの好適なオリゴヌクレオチド及び／または隣接配列断片によりゲノムライブラリーをスクリーニングすることによりこれを得てよい。
この隣接配列が知られていない場合には、隣接配列を含むＤＮＡの断片は、例えば、コーディング配列または更にもう一つの遺伝子を含む更に大きな片のＤＮＡから単離されてよい。単離は、一つあるいはそれ以上の慎重に選ばれた酵素を用いて、適当なＤＮＡ断片を単離する、制限エンドヌクレアーゼ消化により行われてよい。消化の後、所望の断片は、アガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムまたは当業者に知られた他の方法により単離されてよい。この目的を果たすための好適な酵素の選択は、当分野分野の通常の技術を持つ者には容易に明白になるであろう。
複製エレメントの起源は、通常、購入される原核の発現ベクターの一部であり、宿主細胞においてこのベクターの増幅を助ける。しかるべきコピー数迄のこのベクターの増幅は、ある場合には、ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチドの最適な発現に重要であり得る。選択したベクターが複製部位の起源を含まないならば、これは既知の配列に基づいて化学的に合成され、このベクター中に連結されてよい。
この転写停止エレメントは、通常、ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチドのコーディング配列の末端の３’に位置し、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドの転写を停止させる機能をする。通常、原核細胞中の転写停止エレメントは、Ｇ−Ｃに富む断片とそれに続くポリＴ配列である。このエレメントはライブラリーから容易にクローンされるか、あるいは更にベクターの一部として購入される一方、また、上述の方法等の核酸合成の方法を用いて、容易に合成され得る。
選択マーカー遺伝子エレメントは、選択的培養基中で育成された宿主細胞の生き残りと成長に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核の宿主細胞に対する抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシンに耐性を賦与し、（ｂ）細胞の栄養要求性欠乏症を補い、または（ｃ）複雑な培地から得られない重要な栄養物を供給するタンパク質をコードする。好ましい選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、及びテトラサイクリン耐性遺伝子である。
普通、シャイン−ダルガルノ配列（原核細胞）またはＫｏｚａｋ配列（真核細胞）と呼ばれるリボソーム結合エレメントは、ｍＲＮＡの翻訳開始に通常必要である。このエレメントは、このプロモーターに３’に、また合成されるべきＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドのコーディング配列に５’に通常位置する。シャイン−ダルガルノ配列は変るが、通常、ポリプリン（すなわち、高Ａ−Ｇ含量を有する）である。多数のシャイン−ダルガルノ配列が同定されており、その各々は、上記に示し、そして原核のベクターに使用される方法を用いて、容易に合成され得る。
ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドが宿主細胞から分泌されるのが望ましい場合には、宿主細胞からポリペプチドの移行を方向付けするために、シグナル配列が使用されてよい。ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１膜貫通ドメインは、また、宿主膜への結合を防ぐために、突然変異または欠失により不活性化される。通常、このシグナル配列は、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１遺伝子またはｃＤＮＡのコーディング領域に、あるいはＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１遺伝子コーディング領域の５’末端に直接に位置される。多数のシグナル配列が同定されており、選ばれた宿主細胞中で機能性であるシグナル配列のいずれもＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１遺伝子またはｃＤＮＡと一緒に使用されてよい。それゆえ、シグナル配列は、ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１遺伝子またはｃＤＮＡに同種あるいは異種であってよく、ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチド遺伝子またはｃＤＮＡに同種あるいは異種であってよい。加えて、このシグナル配列は、上記に示した方法を用いて化学的に合成されてよい。
大多数の場合において、シグナルペプチドの存在によるこの宿主細胞からのポリペプチドの分泌は、結果としてこのポリペプチドからアミノ末端メチオニンを生成する。
多くの場合、ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１遺伝子またはｃＤＮＡの転写は、このベクター中の一つあるいはそれ以上のイントロンの存在により増大する。これは、ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチドが真核の宿主細胞、特に哺乳類の宿主細胞中で産生する場合に特に当てはまる。使用されるイントロンは、使用される遺伝子が完全な長さのゲノム配列またはこれの断片である、ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１遺伝子内で天然に生じるものであってよい。このイントロンは、この遺伝子（または大多数のｃＤＮＡに関して）内で天然に生じるものでない場合には、このイントロンは他の源から得られてよい。このイントロンは転写されて有効になるので、５’隣接配列とＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１遺伝子に対するこのイントロンの位置は、一般に重要である。従って、発現ベクター中に挿入されるＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１遺伝子がｃＤＮＡ分子である場合には、このイントロンに好ましい位置は、転写スタート部位の３’及びポリＡ転写停止配列の５’である。好ましくは、このイントロンは、このコーディング配列を妨害しないように、ｃＤＮＡの一方または他方（すなわち、５’または３’）に位置する。本発明を実施するするのに、挿入される宿主細胞と適合するという前提ならば、いかなるウイルス、原核及び真核の（植物または動物）生物体をも含む、いかなる源からのいかなるイントロンも使用しうる。また、ここには合成イントロンも含まれる。場合によっては、一つ以上のイントロンがベクターに使用しうる。
上記に示した一つあるいはそれ以上のエレメントが使用されるべきベクター中に既に存在しない場合には、これらを個別に得て、このベクターに連結してよい。このエレメントの各々を得るために使用される方法は、当業者によく知られている。
本発明を実施するための好ましいベクターは、細菌、昆虫、及び哺乳類の宿主細胞と適合するものである。このようなベクターは、とりわけ、ｐＣＲＩＩ、ｐＣＲ３、及びｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＬａＪａｌｌａ，ＣＡ）、ｐＥＴｌ５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）、ｐＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃＩＩ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を含む。
このベクターが構築され、完全な長さをコードする核酸分子または切断されたＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチドがこのベクターの適当な部位に挿入された後、増幅及び／またはポリペプチド発現に好適な宿主細胞にできあがったベクターを挿入してよい。
宿主細胞は、原核宿主細胞（大腸菌等の）または真核宿主細胞（酵母細胞、昆虫細胞、または脊椎動物の細胞等の）であってよい。この宿主細胞は、適切な条件下で培養した場合、ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチドを合成することができ、引き続いて、培養基（宿主細胞が培地中にそれを分泌するならば）から、あるいはそれを産生する宿主細胞からそれを直接に収集（それが分泌されないならば）することができる。収集後、ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチドは、モレキュラーシーブクロマトグラフィー、親和クロマトグラフィー等の方法を用いて、精製され得る。
ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチドの産生に適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、グリコシル化またはリン酸化等の活性に必要とされるポリペプチド変性、または生物活性分子への折り畳みの容易さ等の種々の因子に依存する。
好適な細胞または細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＲ０）、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３または２９３Ｔ細胞、または３Ｔ３細胞等の哺乳類の細胞であってよい。好適な哺乳類の宿主細胞の選択及び転換、培養、増幅、スクリーニング及び産物生産及び精製のための方法は、当分野で知られている。他の好適な哺乳類の細胞株は、サルＣＯＳ−１及びＣＯＳ−７細胞株とＣＶ−１細胞株である。更なる例示の哺乳類の宿主細胞は、転換細胞株を含む、霊長類細胞株及び齧歯類細胞株を含む。正常な２倍体細胞、１次組織、並びに１次外植体のインビトロ培養に由来する細胞菌株もまた好適である。候補細胞は、遺伝子型として選択遺伝子欠乏であっても、あるいは主に作用する選択遺伝子を含んでよい。他の好適な哺乳類の細胞株は、限定ではないがマウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓ、Ｂａｌｂ−ｃ由来の３Ｔ３株、またはＮＩＨマウス、ＢＨＫまたはＨａＫハムスター細胞株を含む。
宿主細胞として同様に有用なのは、細菌細胞である。例えば、大腸菌の種々の菌株（例えば、ＨＢ１０１、ＤＨ５α、ＤＨ１０、及びＭＣ１０６１）がバイオテクノロジーの分野で宿主細胞としてよく知られている。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、他のＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．などの種々の菌株もこの方法で使用されてよい。
当業者に知られている酵母細胞の多数の菌株もまた本発明のポリペプチドを発現する宿主細胞として入手できる。
加えて、所望の場合には、昆虫細胞系が本発明の方法で利用されてよい。このような系は、例えばＫｉｔｔｓら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４：８１０−８１７（１９９３））、Ｌｕｃｋｌｏｗ（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４：５６４−５７２（１９９３））及びＬｕｃｋｌｏｗら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１２：４５６６−４５７９（１９９３））に記述されている。好ましい昆虫細胞は、Ｓｆ−９とＨｉ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）である。
塩化カルシウム、電気穿孔法、マイクロインジェクション、リポフェクションまたはＤＥＡＥ−デキストラン法等の方法を用いて、発現ベクターの選ばれた宿主細胞中への「転換」または「トランスフェクション」を行ってよい。選ばれた方法は、一部、使用されるべき宿主細胞のタイプの機能である。これらの方法及び他の好適な方法は、当業者によく知られていて、例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋらに示されている。
発現ベクターにより転換あるいはトランスフェクションされる宿主細胞は、当業者によく知られた標準培地を用いて培養されてよい。この培地は、普通、この細胞の成長と生き残りに必要なすべての栄養素を含有する。大腸菌細胞を培養するための好適な培地は、例えば、Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）及び／またはＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）である。真核細胞を培養するのに好適な培地は、ＲＰＭＩ １６４０、ＭＥＭ、ＤＭＥＭであり、これらのすべては、培養される特別な細胞株にように必要とされるのに従って、血清及び／または成長因子により補われる。昆虫培養に好適な培地は、必要に従って、酵母オレエート、ラクトアルブミン加水分解物、及び／またはウシ胎仔血清により補われるグレース（Ｇｒａｃｅ）の培地である。
通常、転換された細胞の選択成長に有用な抗生物質または他の化合物のみがサプルメントとして培地に添加される。使用される化合物は、宿主細胞を転換したプラスミド上に存在する選択マーカーエレメントにより決定付けられる。例えば、この選択マーカーエレメントがカナマイシン耐性である場合には、培養基に添加される化合物はカナマイシンである。
この宿主細胞中に産生されるＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチドの量は、当分野において知られている標準的な方法を用いて評価され得る。このような方法は、限定ではないが、ウエスタンブロット分析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分離、免疫沈澱、及び／またはＤＮＡ結合ゲルシフトアッセイ等の活性アッセイを含む。
宿主細胞から分泌されるようにＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドを設計した場合には、大部分のポリペプチドが細胞培養基中に見出されてよい。このように製造されたポリペプチドは、この細胞からの分泌時に除去されるので、通常、アミノ末端メチオニンを保持しない。しかしながら、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドが宿主細胞から分泌されない場合には、それは、細胞質及び／または核（真核宿主細胞に対して）中に、またはサイトソル（グラム陰性バクテリア宿主細胞に対して）中に存在し、アミノ末端メチオニンを有してよい。
種々の手法を用いて溶液からのＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドの精製を行うことができる。ヘキサヒスチジン（ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１／ヘキサヒス）等のタグ、またはＦＬＡＧ（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．，ＮｅｗＨａｖｅｎ，ＣＴ）またはｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）等の他の小ペプチドをそのカルボキシルまたはアミノ末端で含むように、このポリペプチドを合成した場合、このカラムマトリックスがタグに対して、あるいは直接的にポリペプチドに対して高親和性を持つならば（すなわち、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体）、タグを付けたポリペプチドを親和カラムに通すことにより、１段階プロセスで本質的に精製してよい。例えば、ポリヒスチジンは、大きな親和性と特異性でニッケルに結合し、このようにしてニッケルの親和カラム（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ニッケルカラム等の）をＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１／ポリヒスの精製に使用することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｔｉｏｎ１０．１１．８，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）を参照）。
タグを付けずにＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドを製造し、抗体が入手できない場合には、精製によく知られた方法を使用することができる。このような方法は、限定ではないが、イオン交換クロマトグラフィー、モレキュラーシーブクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ゲル溶離と組み合わせた未変性ゲル電気泳動、及び合成的等電点電気泳動（「Ｉｓｏｐｒｉｍｅ」マシン／手法、Ｈｏｅｆｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む。ある場合には、２つあるいはそれ以上のこれらの方法を組み合わせて、純度の増大を達成しうる。
ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチドが主として細胞内に見出されることが期待される場合には、当業者に知られた任意の標準的な手法を用いて、この細胞内材料（グラム陰性バクテリア用の封入体を含む）を宿主細胞から抽出することができる。例えば、フレンチプレス、均質化、及び／または高周波による分解とそれに続く遠心分離により、この宿主細胞を溶解して、ペリプラズム／細胞質の内容物を放出させることができる。
ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドがサイトソル中に封入体を形成した場合には、この封入体は、時には内及び／または外の細胞膜に結合することができ、このようにして遠心分離後主としてペレット材料中に見出される。次に、このペレット材料は、ｐＨの両極端で、あるいは洗浄剤、グアニジン、グアニジン誘導体、尿素、または尿素誘導体等のカオトロピック剤により、アルカリ性ｐＨでジチオトレイトールまたは酸性ｐＨでトリスカルボキシエチルホスフィン等の還元剤の存在下で処理され、この封入体を放出、分割、及び可溶化することができる。次に、ゲル電気泳動、免疫沈澱などを用いて、溶解した形のこのポリペプチドを分析することができる。ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドを単離することを所望する場合には、下記及びＭａｒｓｔｏｎら、（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１８２：２６４−２７５（１９９０））に示すような標準方法を用いて、単離を行ってよい。ある場合には、ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチドは単離時に生物活性でなくてよい。「再折りたたみ」あるいはこのポリペプチドを３級構造に変換し、そしてジスルフィド結合を生成する種々の方法を使用して、生物活性を取り戻すことができる。このような方法は、可溶化ポリペプチドを通常７以上のｐＨを持つ溶液と特別な濃度の適切なカオトロープの存在下で接触することを含む。また、大多数の場合、再折りたたみ／酸化溶液は、還元剤またはタンパク質のシステイン架橋の形成においてジスルフィド混合を起こさせる特別なレドックス電位を生じる還元剤と対応する酸化形を特定の比で含む。普通に使用されるレドックス対の一部は、システイン／シスタミン、グルタチオン（ＧＳＨ）／ジチオビスＧＳＨ、塩化第２銅、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）／ジチアンＤＴＴ、２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂ（ＭＥ）を含む。多数の例において、再折りたたみの効率を増大するために、共溶媒が必要であり、この目的に使用される更に普通の試剤は、グリセロール、種々の分子量のポリエチレングリコール、及びアルギニンを含む。
また、化学合成方法（固相ペプチド合成等の）により、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄらにより示されたもの（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９（１９６３））、Ｈｏｕｇｈｔｅｎら（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：５１３２（１９８５））、及びＳｔｅｗａｒｔ及びＹｏｕｎｇ（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ（１９８４））等の当分野において知られた手法を用いて、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチド、断片、及び／またはこれらの誘導体を製造してもよい。このようなポリペプチドは、アミノ末端上にメチオニンの有無のいずれで合成されてよい。これらの文献に示される方法を用いて、化学合成されたＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチドまたは断片を酸化して、ダイサルファイド架橋を形成してよい。ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチドまたは断片は、組み換えで製造された、あるいは天然源から精製されたＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチドに匹敵する生物活性を有すると予期され、このように、組み換えあるいは天然のＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチドと入れ替えて使用してもよい。
ポリペプチド
「ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチド」という用語は、図１Ａ（配列番号２）、図２Ａ（配列番号７）または図３Ａ（配列番号１２）及びここで説明されたすべての関連ポリペプチドのアミノ酸配列を持つポリペプチドを指す。関連ポリペプチドは、対立変異体、スプライス変異体、断片、誘導体、置換、欠失、及び挿入変異体、融合ポリペプチド、及びオルトログを含む。このような関連ポリペプチドは、成熟ポリペプチド、すなわち、シグナルペプチドを欠いたポリペプチドであってよい。ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチドは、これらを製造する方法に依って、アミノ末端メチオニンであってよく、あるいはそうでなくてもよい。
「ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチド断片」という用語は、図１Ａ（配列番号２）、図２Ａ（配列番号７）または図３Ａ（配列番号１２）に示すような、ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチドの完全長さ未満であるアミノ酸配列のペプチドまたはポリペプチドを指す。このような断片は、アミノ末端での切断、カルボキシ末端での切断、及び／またはポリペプチド配列への内部の欠失の結果から生じうる。このようなＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチド断片は、アミノ末端メチオニンの有無のいずれで製造されてよい。加えて、ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチド断片は、天然由来のスプライス変異体、他のスプライス変異体、及び天然に生じるインビボ活性の結果生じる断片であってよい。好ましいＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチド断片は、機能性膜貫通ドメインを欠き、ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１のいずれかの細胞外ドメインの一部または全部を構成するＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１の可溶性の形態を含む。
「ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチド変異体」という用語は、図１Ａ（配列番号２）、図２Ａ（配列番号７）または図３Ａ（配列番号１２）に示すＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドアミノ酸配列に比較して、アミノ酸配列が一つあるいはそれ以上のアミノ酸配列置換、欠失、及び／または付加を含むＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチドを指す。従って、ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチドに対するＤＮＡ配列から変るＤＮＡ配列を持つ対応するＣＲＰ１及びＢ７ＲＰ１ポリペプチド核酸分子変異体から、このようなＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチド変異体を製造することができる
ここで使用される時、「ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチド誘導体」という用語は、例えば、一つあるいはそれ以上の水溶性ポリマー、Ｎ−結合あるいはＯ−結合炭水化物、糖、リン酸塩、及び／または分子が野生型のＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチドに天然に結合していない、他のこのような分子の添加により化学的に変性したＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰｌポリペプチド、変異体、またはこれらの断片を指す。誘導体は、ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチドに天然に結合した一つあるいはそれ以上の化学基の欠失を更に含む。
ここで使用される時、「生物活性のＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチド」、「生物活性のＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチド断片」、「生物活性のＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチド変異体」、及び「生物活性のＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチド誘導体」という用語は、ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１特有の少なくとも一つの活性を持つＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチドを指す。一つの活性はＣＲＰ１へのＢ７ＲＰ１の結合である。他の活性は、ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１がＴ−細胞増殖及び／または活性化を刺激する能力である。
「オルトログ」という用語は、種から同定されるポリペプチドに対応するポリペプチドを指す。例えば、マウス及びヒトＢ７ＲＰ１ポリペプチドはオルトログと考えられる。
「成熟したアミノ酸配列」という用語は、リーダー配列を欠くポリペプチドを指す。
「単離されたポリペプチド」という用語は、その自然な環境中で見出される少なくとも一つの汚染性のポリペプチドを含まない、そして好ましくはいかなる他の汚染性の哺乳類のポリペプチドも実質的に含まないポリペプチを指す。
「同一性」という用語は、当分野において知られているように、配列を比較することにより決定される２つあるいはそれ以上の核酸分子または２つあるいはそれ以上のポリペプチドの配列間の関係である。当分野においては、「同一性」は、また、場合に応じて、ヌクレオチドあるいはアミノ酸配列の列間の一致により決定されるような、ポリペプチドまたは核酸分子配列間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」は、特別なコンピュータープログラム（すなわち、「アルゴリズム」）により扱われるギャップ配列により２つあるいはそれ以上の配列の間の同一性一致のパーセントを測定する。
「類似性」という用語は、関連する概念を指すが、対照的に、「同一性」とは、同一性一致と保存的置換一致の双方を含む。保存的置換はポリペプチドに当てはまり、核酸分子には当てはまらないので、類似性は、ポリペプチド配列の比較を扱うのみである。２つのポリペプチド配列が例えば、１０／２０同一のアミノ酸を持ち、残りがすべて非保存的置換である場合には、同一性と類似性のパーセントは双方とも５０％である。同じ試料において、保存的置換がある、更に５つの位置がある場合には、パーセント同一性は５０％のままであるが、パーセント類似性は７５％である（１５／２０）。それゆえ、保存的置換がある場合には、２つのポリペプチド配列の間の類似性の程度は、これらの２つの配列の間のパーセント同一性よりも高い。「保存的」アミノ酸置換はここでは下記に表Ｉを参照して記述されている。表Ｉに基づくと、保存アミノ酸置換は、同じグループ、例えば、塩基性、酸性、非帯電極性、及び非極性から選ばれる交互のアミノ酸である。例えば、アルギニンに対する保存アミノ酸置換は、リジン及びヒスチジンである。
同一性と類似性は、限定ではないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ編，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ１，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及び Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；及びＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，及びＬｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：ｌ０７３（１９８８）に記述されているものを含む、既知の方法により容易に計算できる。
同一性及び／または類似性を求める好ましい方法は、試験する配列の間の最大一致を与えるように設計される。同一性と類似性を求める方法は、公に入手できるコンピュータープログラムにコード化されている。２つの配列間の同一性と類似性を求める好ましいコンピュータープログラムの方法は、限定ではないが、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ， Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１）：３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，及びＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）を含む、ＧＣＧプログラムパッケージを含む。ＢＬＡＳＴ Ｘプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）及び他の源（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、ＮＣＢ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））から公に入手できる。また、同一性を求めるのに、よく知られたＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用してもよい。
例として、コンピューターアルゴリズムギャップ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、パーセント配列同一性を求めるべき２つのポリペプチドは、各アミノ酸（このアルゴリズムにより求められるような「一致したスパン」）の最適マッチングに対して並べられる。ギャップオープニングペナルティ（３Ｘ平均対角線として計算される；「平均対角線」は、使用されている比較マトリックスの対角線の平均である。「対角線」は、特別な比較マトリックスにより各々の完全なアミノ酸一致に割り当てられた得点または数であり、そして、ギャップエクステンションペナルティ（通常、ギャップオープニングペナルティの１／１０倍である）、並びにＰＡＭ ２５０またはＢＬＯＳＵＭ ６２等の比較マトリックスがアルゴリズムと一緒に使用される。標準比較マトリックス（ＰＡＭ ２５０比較マトリックスに対しては、Ｄａｙｈｏｆｆら，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５巻，補遺３（１９７８）を参照；ＢＬＯＳＵＭ ６２比較マトリックスに対しては、Ｈｅｎｉｋｏｆｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）を参照）もまたアルゴリズムにより使用される。
ポリペプチド配列比較に対する好ましいパラメーターは、次を含む。
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３４５３（１９７０）
比較マトリックス：ＨｅｎｉｋｏｆｆからのＢＬＯＳＵＭ ６２及びＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）
ギャップペナルティ：１２
ギャップ長さペナルティ：４
類似性のしきい値：０
ＧＡＰプログラムは上記パラメーターにより有用である。この上述のパラメーターは、ギャップアルゴリズムを用いたポリペプチド比較（末端ギャップに対する無ペナルティと一緒に）のデフォルトパラメーターである。
核酸分子配列比較の好ましいパラメーターは次を含む。
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）
比較マトリックス：一致＝＋１０、ミスマッチ＝０
ギャップペナルティ：５０
ギャップ長さペナルティ：３
また、ＧＡＰプログラムは上記パラメーターによっても有用である。この上述のパラメーターは、核酸分子比較のデフォルトパラメーターである。
他の例示のアルゴリズム、ギャップオープニングペナルティ、ギャップエクステンションペナルティ、比較マトリックス、類似性のしきい値などを当業者によりＰｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ，バージョン９，１９９７年９月に示したものを含めて使用してよい。行われるべき特別な選択は、ＤＮＡ対ＤＮＡ、タンパク質対タンパク質、タンパク質対ＤＮＡ等の行われるべき特定の比較、及び加えて、この比較が一対の配列（ＧＡＰまたはＢｅｓｔＦｉｔが一般的に好ましい）の間であるか、あるいはまたは一つの配列と配列の大きなデータベース（ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴＡが好ましい）の間であるかどうかにに依存する。
少なくとも約７０パーセント同一であるポリペプチドは、野生型のＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチドと比較して、一つあるいはそれ以上のアミノ酸置換、欠失、及び／または付加を通常有する。好ましい実施形態においては、ポリペプチドは、ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチドに対して約７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有する。通常、未変性の残渣の置換は、ポリペプチドの正味の全帯電、極性、または疎水性に殆ど、あるいは全く影響を及ぼさないように、アラニン、または保存アミノ酸のいずれかである。保存的置換は下記の表Ｉに示される。
Figure 0005658695
ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチド誘導体が本発明により提供される。一つの実施形態においては、ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチドがポリマーに結合している化学変性されたＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチド組成物は、本発明の範囲内に含まれている。選ばれたポリマーは、通常水溶性であり、そこで、ポリマーが結合しているタンパク質は生理的環境等の水性環境において沈殿しない。選ばれたポリマーは、通常、アシル化のための活性エステルまたはアルキル化のためのアルデヒド等の単一の反応性基を持つように変性されて、重合度は本発明の方法に提供されるように制御されてよい。このポリマーは、いかなる分子量であってよく、分岐あるいは非分岐であってよい。本発明の範囲内に入れられているのは、ポリマーの混合物である。好ましくは、最終製品製造の治療への使用のためには、このポリマーは医薬として許容されるものである。
水溶性ポリマーまたはこれらの混合物は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、または他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキサイド／エチレンオキサイドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）及びポリビニルアルコールからなる群から選ばれてよい。
このアシル化反応のためには、選ばれたポリマーは単一の反応性エステル基を有しなければならない。還元アルキル化のためには、選ばれたポリマーは単一の反応性アルデヒド基を有しなければならない。好ましい反応性アルデヒドは、水安定であるポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、またはモノＣ１−Ｃ１０アルコキシまたはこれらのアリールオキシ誘導体（米国特許第５，２５２，７１４号を参照）である。
ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチドのペギル化（Ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）は、例えば次の文献に記述されているような、当分野において知られている任意のペギル化反応により行われてよい。Ｆｏｃｕｓｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ３：４−１０（１９９２）；ＥＰ ０ １５４ ３１６；及びＥＰ ０ ４０１ ３８４。好ましくは、このペギル化は、アシル化反応またはアルキル化反応により反応性ポリエチレングリコール分子（または同族の反応性水溶性ポリマー）により下記に述べるように行われる。
ここでの使用に特に好ましい水溶性ポリマーは、ＰＥＧと略記されるポリエチレングリコールである。ここで使用される時、ポリエチレングリコールは、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコール等の他のタンパク質を誘導体化するのに使用されたいかなる形のＰＥＧを包含するとの意味である。
一般に、生物活性物質と活性化されたポリマー分子とを反応するのに使用されるいかなる好適な条件下でも、化学的誘導体化を行ってよい。ペギル化されたＣＲＰ１及びＢ７ＲＰ１ポリペプチドを製造する方法は、一般に（ａ）ポリペプチドとポリエチレングリコール（ＰＥＧの反応性エステルあるいはアルデヒド誘導体）とを、ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチドが一つあるいはそれ以上のＰＥＧ基に結合される条件下で反応し、そして（ｂ）反応生成物を得るステップを含んでなる。一般に、アシル化反応の最適な反応条件は、既知のパラメーターと所望の結果をベースにして決められる。例えば、ＰＥＧ：タンパク質の比が大きい程、ポリペギル化された製品のパーセンテージは大きい。
一般に、ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリマーコンジュゲートの投与により軽減あるいは調節される状態は、非共役のＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチドについてここで述べたものを含む。しかしながら、ここに開示されているコンジュゲートは、追加の活性、増進あるいは低下した生物活性、または非誘導体化された分子に比較して、増加あるいは減少した半減期等の他の特性を有してよい。
ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチド、断片変異体、及び誘導体は、単独で、一緒に、あるいは他の医薬組成物と組み合わせて使用されてよい。ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチド、断片、変異体、及び誘導体は、治療される適応に適切であるように、サイトカイン、成長因子、抗生物質、抗炎症剤、及び／または化学治療剤と組み合わせて使用されてよい。
本発明は、ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１の選択的結合剤を提供する。選択的結合剤は、ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１に特異性を持つ分子を指し、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、リピッドまたは小分子量化合物を含んでよい。選択的結合剤は、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１のいずれかと相互作用し、次には、ＣＲＰ１のＢ７ＲＰ１への結合を調節する。一つの実施形態においては、選択的結合剤は、ＣＲＰ１のＢ７ＲＰ１への結合を部分的あるいは完全に阻止し、免疫同時刺激活性等のＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１の少なくとも一つの生物活性を部分的あるいは完全に抑制する。もう一つの実施形態においては、選択的結合剤は抗体である。この抗体は、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１のいずれかと免疫反応性であってよく、好ましくはＢ７ＲＰ１と免疫反応性である。本発明の更にもう一つの実施形態においては、Ｂ７ＲＰ１と反応性である抗体は、Ｂ７ＲＰ１上のエプチオープ（ｅｐｔｉｏｐｅ）に結合して、ＣＲＰ１への結合が部分的あるいは完全に阻止され、免疫同時刺激活性等のＢ７ＲＰ１の少なくとも一つの生物活性が部分的あるいは完全に抑制される。部分的に抑制されるという用語は、少なくとも検出し得るレベルの抑制が起こったことを意味する。完全に抑制されるという用語は、抑制の更なる増加が起こらなかったことを意味する。
当分野で知られている方法を用いて抗体を製造するのに、ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチド、断片、変異体、及び／または誘導体を使用してよい。このように、ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチド、並びにこのような抗体の反応性断片と反応する抗体もまた本発明の範囲内として考慮される。この抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、組み換え、キメラ、単一鎖及び／または両特異的であってよい。通常、この抗体またはこの断片は、ヒト起源であるかあるいは、「ヒト化されている」、すなわち、または患者に投与した場合に、この抗体への免疫反応を防止あるいは最少化するように製造される。この抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’等の本発明のＣＲＰ１及びＢ７ＲＰ１ポリペプチドと反応性であるいかなる断片であってよい。また、本発明により提供されるのは、任意のＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチドまたはこれらの断片を抗原として選ばれた哺乳類に与え、続いて哺乳類の細胞（例えば、脾臓細胞）をしかるべきガン細胞と融合して、不死化された細胞株を知られた手法により作り出すことにより生じるヒドリドマス（ｈｙｄｒｉｄｏｍａｓ）である。本発明のヒトＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチドの全部または一部に特異的なこのような細胞株及び抗体を生じるのに使用される方法も本発明により包含される。
本発明のモノクローナル抗体は、所望の生物活性を示す限り（米国特許第４，８１６，５６７；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１，６８５１−６８５５（１９８５））、重及び／または軽鎖の一部が特別な種に由来する、あるいは特別な抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一あるいは相同であり、一方、鎖の残りがもう一つの種に由来する、あるいはもう一つの抗体クラスまたはサブクラス、並びにこのような抗体の断片に属する抗体における対応する配列と同一あるいは相同である、「キメラ」抗体を含む。
好ましい実施形態においては、キメラ抗−ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１抗体は「ヒト化された」抗体である。非ヒト抗体をヒト化する方法は当分野においてよく知られている。一般に、ヒト化された抗体は、非ヒトである源からその中に導入される、一つあるいはそれ以上のアミノ酸残渣を有する。当分野において知られている方法（Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３２１，５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９１５３４−１５３６（１９８８））に従って、齧歯類の相補性決定領域（ＣＤＲ）にヒト抗体の対応する領域を置き換えることにより、ヒト化を行うことができる。
また、本発明により包含されているのは、完全にヒトの抗−ＣＲＰ１または抗−Ｂ７ＲＰ１抗体である。内生免疫グロブリン産生の不存在下でヒト抗体のレパートリーを産生する能力のあるトランスジェニック動物（例えば、マウス）のＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１抗原による免疫化により、このような抗体を製造してよい。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０、２５５１−２５５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３６２，２５５−２５８（１９９３）を参照のこと。また、ファージディスプレイライブラリ（ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）においてヒト抗体を製造することもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７，３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２．，５８１（１９９１））。
本発明の選択的結合剤を使用して、ＣＲＰ１のＢ７ＲＰ１への結合を調節し、ＣＲＰ１及びＢ７ＲＰ１により媒介される、免疫同時刺激等の少なくとも一つの生物活性を調節してよい。このような選択的結合剤の例は、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１との抗体免疫反応性である。ＣＲＰ１とＢ７ＲＰ１ポリペプチドのその結合パートナーへの結合を抑制する等、この抗体を治療的に使用してよい。インビトロ及びインビトロ診断の目的でラベルされた形などでこの抗体を更に使用して、体液または細胞試料中のＣＲＰ１及びＢ７ＲＰ１ポリペプチドの存在を検出してよい。
医薬組成物と投与
ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチドの医薬組成物は、本発明の範囲内である。このような組成物は、医薬として許容し得るキャリアとの混合物での治療として有効な量のポリペプチドまたは断片、変異体、または誘導体を含んでなってよい。好ましい実施形態においては、医薬組成物は、ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチドを、ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１細胞外ドメインの一部または全部を含んでなる、可溶性の形態として含んでなる。通常、ＣＲＰ１及びＢ７ＲＰ１ポリペプチド治療用化合物は、一つあるいはそれ以上の生理学的に許容し得るキャリア、賦形剤、または希釈剤と一緒に、精製されたポリペプチド、断片、変異体、または誘導体を含んでなる、組成物の形で投与される。このキャリア材料は、好ましくは哺乳類への投与用に溶液中の普通の他の材料と共に補われる、注射用の水であってよい。中性の緩衝された生理食塩水または血清アルブミンと混合した生理食塩水が例示の適切なキャリアである。好ましくは、この製品は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥品として配合される。他の標準キャリア、希釈剤、及び賦形剤は、所望に応じて入れられてよい。他の例示的組成物は、ソルビトールまたはこれの好適な代替品を更に含む、約ｐＨ７．０−８．５のトリスバッファー、または約ｐＨ４．０−５．５の酢酸塩バッファーを含んでなる。
ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１医薬組成物は、非経口で投与され得る。あるいは、この組成物は、静脈注射であるいは皮下注射で投与されてよい。全身的に投与する場合には、本発明の使用での治療用組成物は、発熱物質を含まない、非経口で許容し得る水溶液の形であってよい。ｐＨ、アイソトニック性、安定性などに関するこのような医薬として許容し得るタンパク質溶液の製造は、当分野の技術内である。
所望の程度の純度を持つ選ばれた組成物を、オプションの生理的に許容し得るキャリア、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８版Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９０））と凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形で混合することにより、本発明を実施するのに有用なＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチド組成物の治療用配合物を貯蔵用に製造してよい。許容し得るキャリア、賦形剤または安定剤は、服用者に非毒性であり、好ましくは使用される投与量と濃度で不活性であり、そしてリン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸等の酸化防止剤；低分子量ポリペプチド；、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン等のアミノ酸；モノサッカライド、ジサッカライド、及びグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；マニトールまたはソルビトール等のシュガーアルコール；ナトリウム等の対イオンを形成する塩；及び／またはトウイーン、プルロニックスまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
治療に使用されるべき有効な量のＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチド組成物は、例えば、ＣＲＰ１及びＢ７ＲＰ１ポリペプチドが使用される適応、投与経路、及び患者の状態等の治療目標に依存する。従って、療法士が最適な治療効果を得るのに必要とされるように、投与量を求めて、投与経路を調節することが必要である。通常の１日の投与量は、上述の因子に依って、約０．１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇあるいはそ以上迄の範囲であってよい。通常、臨床医は、所望の効果を得る投与量に到達する迄この組成物を投与する。この組成物は、それゆえ、時間にわたって、単一投与として、あるいは２あるいはそれ以上の投与（同じ量のＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチドを含んでも、あるいは含まなくともよい）として、あるいインプランテーション器具またはカテーテルにより連続的な輸液として投与されてよい。
更なる試験を行うのに従って、種々の患者における種々の状態を治療するための適切な投与量レベルに関する情報が出てきて、通常の熟練作業者は、治療の状況、治療を受けている疾患のタイプ、服用者の年齢と全般的な健康を考慮して、適当な投与を確定することが可能であろう。
インビボ投与に使用されるべきＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチド組成物は無菌でなければならない。これは、無菌の濾過膜により濾過することにより容易に行われる。この組成物を凍結乾燥された場合には、これらの方法を用いる殺菌は、凍結乾燥と再構成に先立って、あるいは続いて行われてよい。非経口投与用のこの組成物は、通常、凍結乾燥された形で、あるいは溶液で貯蔵される。
この治療用組成物は、一般に無菌アクセスポートを持つ容器、例えば、皮下注射針で突き刺すことができるストッパーを持つ静脈注射溶液バックまたはバイアル中に入れられる。
この組成物の投与経路は、知られている方法、例えば、皮下、腹腔内、大脳内（柔細胞内）、大脳室内、筋肉内、眼球内、動脈内、あるいは病変内（ｉｎｔｒａｌｅｓｉｏｎａｌ）の経路による、あるいは持続放出系または場合によってはカテーテルの使用を含む埋め込み器具による経口注入または輸液と一致する。所望の場合には、この組成物は、輸液、丸薬注入により、またはインプランテーション器具により連続的に投与されてよい。
あるいはまたはそれに加えて、この組成物は、埋め込みを経て、ＣＲＰ１及びＢ７ＲＰ１ポリペプチドを吸収した膜、スポンジ、または他の適切な材料の患部中に局所的に投与されてよい。埋め込み器具を使用する場合には、この器具はいかなる好適な組織または器官中にも埋め込まれ、ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチドの送達は、丸薬を経た、または連続投与を経た、または連続的な輸液を用いるカテーテルを経た器具を直接的に通されてよい。ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチドは、持続放出配合物または調合物で投与されてよい。持続放出調合物の好適な例は、半透過性ポリマーマトリックスを成形された物品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形で含む。持続放出マトリックスは、ポリエステル、ハイドロゲル、ポリラクチド（Ｕ．Ｓ．３，７７３，９１９、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸のコポリマー及びガンマエチルＬ−グルタメート（Ｓｉｄｍａｎら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタアクリレート）（ＬａｎｇｅｒらＪ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ，１５：１６７−２７７（１９８１）］及びＬａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、上記）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）を含む。持続放出組成物は、また、当分野において知られているいくつかの方法（例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８−３６９２（１９８５）；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９）のいずれかにより製造することができる、リポソームも含む。
ある場合には、ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチド組成物をエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）の方法で使用することが望ましいかもしれない。ここで、患者から取り出した細胞、組織、または器官がＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチド組成物を曝らし、その後、この細胞、組織、または器官を患者に埋め込みにより戻す。
他の場合には、ＣＲＰ１あるいはＢ７ＲＰ１ポリペプチドを、ここで述べたもの等の方法を用いて、遺伝子的に設計されたしかるべき細胞を患者の中に埋め込むことにより送達して、ポリペプチド、断片、変異体、または誘導体を発現し、分泌してよい。このような細胞は、動物あるいはヒト細胞であってよく、患者自身の組織から、あるいはまたはヒトまたは非ヒトのいずれかのもう一つの源から送達されてよい。場合によっては、この細胞は不死化されてよい。しかしながら、免疫応答の機会を減少させるために、この細胞をカプセル化して、取巻く組織の浸潤を避けることが好ましい。カプセル化材料は、タンパク質生成物を放出させるが、患者の免疫系により、あるいは取巻く組織からの他の有害因子により細胞の破壊を防止する通常生体適合性の、半透過性ポリマーの囲いまたは膜である。
細胞の膜被包のために使用される方法は当業者に熟知されており、被包細胞の調製と患者への移植は多大の実験を必要とせずに実現できる。例えば、米国特許第４，８９２，５３８号、同第５，０１１，４７２号及び同第５，１０６，６２７号参照。生存細胞を被包するための系がＰＣＴ ＷＯ９１／１０４２５号（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら）に述べられている。リポソーム担体、生体内腐食性粒子又はビーズのような様々な他の持続性又は制御された送達方法を製剤するための手法も当業者に既知であり、例えば米国特許第５，６５３，９７５号に記述されている。被包された又は被包されていない細胞を患者の適当な体組織又は器官に移植することができる。
上述したように、細胞製剤を１個又はそれ以上のＣＲＰ１又はＢ７ＲＰ１ポリペプチド、変異体、誘導体及び／又は断片で処理することが望ましいと考えられる。これは、例えば骨髄細胞のようなＴ細胞を含む細胞を、細胞膜透過性の形態の当該ポリペプチド、変異体、誘導体又は断片に直接接触させることによって実施できる。例えば、Ｔ細胞の機能を活性化するためにＴ細胞を含む細胞をＢ７ＲＰ１ポリペプチドに接触させることができ、そのように処理した細胞を患者に移植する。
その代わりに、遺伝子治療を用いることもできる。遺伝子治療が適用できる１つの方法は、「遺伝子治療ＤＮＡ構築物」を形成するために構成的又は誘導性プロモーターに機能的に連結されうるＣＲＰ１又はＢ７ＲＰ１遺伝子（ＣＲＰ１又はＢ７ＲＰ１ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及び／又は合成ＤＮＡ、あるいはその断片、変異体又は誘導体）を使用して、「遺伝子治療ＤＮＡ構築物」を形成することである。プロモーターは、構築物を挿入する細胞又は組織型において活性であることを条件として、内因性ＣＲＰ１又はＢ７ＲＰ１遺伝子に相同性あるいは非相同性のいずれでもよい。遺伝子治療ＤＮＡ構築物の他の成分は、任意に、必要に応じて、位置特異的組込みのために設計されたＤＮＡ分子（例えば相同的組換えのために有用な内因性隣接配列）、組織特異的プロモーター、エンハンサー又はサイレンサー、親細胞に比べて選択的優越性を提供することができるＤＮＡ分子、形質転換細胞を同定するための標識として有用なＤＮＡ分子、負の選択系、細胞特異的結合物質（例えば、細胞標的に関して）、細胞特異的インターナリゼーション因子、及びベクターによる発現を高めるための転写因子ならびにベクターの製造を可能にする因子を含みうる。
次にこの遺伝子治療ＤＮＡ構築物を患者の細胞に挿入することができる（エクスビボ又はインビボで）。遺伝子治療ＤＮＡ構築物を挿入するための１つの方法は、ウイルスベクターによるものである。遺伝子治療ＤＮＡ構築物の送達のために遺伝子治療において典型的に使用される適当なウイルスベクターは、限定されることなく、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、乳頭腫ウイルス、及びレトロウイルスベクターを含む。レトロウイルスベクターのようなこれらのベクターの一部は、遺伝子治療ＤＮＡ構築物を患者の細胞の染色体ＤＮＡに送達し、遺伝子治療ＤＮＡ構築物は染色体ＤＮＡに入り込むことができる；他のベクターはエピソームとして機能し、遺伝子治療ＤＮＡ構築物は細胞質中にとどまる。遺伝子治療ベクターの使用は、例えば米国特許第５，６７２，３４４号、同第５，３９９，３４６号に述べられている。
ウイルスベクターを使用せずに遺伝子治療ＤＮＡ構築物を患者の細胞に送達するための代替的手段は、限定されることなく、リポソームを介した移入、裸のＤＮＡの直接注入、レセプタを介した移入（リガンド−ＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、及び微粒子撃ち込み（例えば「遺伝子ガン」）を含む。例えば米国特許第４，９７０，１５４号、ＷＯ９６／４０９５８号、５，６７９，５５９号、５，６７６，９５４号及び５，５９３，８７５号参照。
遺伝子治療を通して細胞における内因性ＣＲＰ１又はＢ７ＲＰ１ポリペプチドの発現を高めるためのもう１つの方法は、１つ又はそれ以上のエンハンサー要素をＣＲＰ１又はＢ７ＲＰ１ポリペプチドプロモーター内に挿入することであり、エンハンサー要素はＣＲＰ１又はＢ７ＲＰ１ポリペプチド遺伝子の転写活性を高めるために働くことができる。使用されるエンハンサー要素は、遺伝子を活性化することを所望する組織に基づいて選択され、その組織においてプロモーターの活性化をもたらすことが知られているエンハンサー要素が選択される。例えば、ＣＰＲ１又はＢ７ＲＰ１ポリペプチドをＴ細胞において「発動（ｔｕｒｎｅｄ ｏｎ）」させようとする場合は、ｌｃｋプロモーターエンハンサー要素が使用できる。この場合には、標準的なクローニング手法を使用して、付加する転写要素の機能的部分を、ＣＲＰ１又はＢ７ＲＰ１ポリペプチドプロモーター（及び任意に、ベクター、５’及び／又は３’隣接配列、等々）を含むＤＮＡの断片に挿入することができる。その後、「相同的組換え構築物」として知られるこの構築物をエクスビボ又はインビボのいずれかで所望する細胞に挿入することができる。
内因性プロモーターのヌクレオチド配列を改変することにより、遺伝子治療を使用してＣＲＰ１又はＢ７ＲＰ１ポリペプチドの発現を低下させることができる。そのような改変は、典型的には相同的組換え法を通して実施される。例えば、不活性化のために選択したＣＰＲ１又はＢ７ＲＰ１遺伝子のプロモーターの全部又は一部を含むＤＮＡ分子を構築して、転写を調節するプロモーターの断片を取り除く及び／又は置き換えることができる。ここでは、標準的な分子生物学手法を使用して、プロモーターのＴＡＴＡボックス又は転写活性化因子の結合部位が欠失されうる。そのような欠失はプロモーター活性を阻害し、それによって対応するＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１遺伝子の転写を抑制することができる。プロモーターにおけるＴＡＴＡボックス又は転写活性化因子結合部位の欠失は、ＴＡＴＡボックス及び／又は活性化因子結合部位の活性が低下する又は完全に不活性となるように、１個又はそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失及び／又は挿入を通して１個又はそれ以上のＴＡＴＡボックス及び／又は転写活性化因子結合部位のヌクレオチドが突然変異を起こす、ＣＲＰ１又はＢ７ＲＰ１ポリペプチドプロモーターの全部又は該当部分（調節されるＣＲＰ１又はＢ７ＲＰ１遺伝子と同じ又は関連種からの）を含むＤＮＡ構築物を作製することによって実施できる。典型的には、改変されたプロモーターセグメントの天然（内因性）５’及び３’隣接領域に対応する、少なくとも約５００塩基のＤＮＡを同時に含むこの構築物は、直接又は上述したようなウイルスベクターを通して、適切な細胞内に挿入されうる（エクスビボ又はインビボのいずれかで）。典型的には、細胞のゲノムＤＮＡへの構築物の組込みは相同的組換えを通して行われ、プロモーター構築物内の５’及び３’隣接ＤＮＡ配列は、内因性染色体ＤＮＡへのハイブリダイゼーションを通して改変されたプロモーター領域の組込みを助けるように働くことができる。
１個又はそれ以上のＣＲＰ１又はＢ７ＲＰ１ポリペプチドを阻害することを所望する場合、他の遺伝子治療法も使用しうる。例えば、選択したＣＲＰ１又はＢ７ＲＰ１ポリペプチドの少なくとも一部に相補的な配列を持つアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡ分子を細胞に挿入することができる。典型的には、そのような各々のアンチセンス分子は、各々の選択したＣＲＰ１又はＢ７ＲＰ１遺伝子の開始部位（５’末端）に相補的である。その後アンチセンス分子が対応するＣＲＰ１又はＢ７ＲＰ１ポリペプチドｍＲＮＡにハイブリダイズするときに、このｍＲＮＡの翻訳が妨げられる。
その代わりに、遺伝子治療を使用して、１個又はそれ以上のＣＲＰ１又はＢ７ＲＰ１ポリペプチドの優性の負の阻害因子を創造することができる。この状況では、各々の選択したＣＲＰ１又はＢ７ＲＰ１ポリペプチドの突然変異体完全長又はトランケートポリペプチドをコードするＤＮＡを調製し、上述したようなウイルス又は非ウイルス法を用いて患者の細胞に挿入することができる。そのような各々の突然変異体は、典型的にはその生物学的役割において内因性ポリペプチドと競合するように設計される。
作用物質と拮抗物質
本発明はまた、ＣＲＰ１とＢ７ＲＰ１のいずれか又は両方の分子の活性を調節する、ＣＲＰ１又はＢ７ＲＰ１の作用物質と拮抗物質を提供する。作用物質と拮抗物質は、ＣＲＰ１へのＢ７ＲＰ１の結合を変化させる被験分子から同定されうる。
「被験分子」という用語は、ＣＲＰ１又はＢ７ＲＰ１ポリペプチドに結合し、それによってＣＲＰ１へのＢ７ＲＰ１の結合を変化させる能力についての評価の対象である分子を指す。好ましくは、被験分子は少なくとも約１０６Ｍの親和定数で結合する。
ＣＲＰ１へのＢ７ＲＰ１の結合を測定するためには様々なアッセイが使用できる。これらのアッセイを使用して、ＣＲＰ１へのＢ７ＲＰ１の結合の速度又は度合を上昇させる又は低下させる能力に関して被験分子をスクリーニングすることができる。１つの種類のアッセイでは、ＣＲＰ１ポリペプチド、好ましくは細胞外ドメインのような可溶性形態のＣＲＰ１を、マイクロタイタープレートのウエルの底に付着させることによって固定する。次に放射標識Ｂ７ＲＰ１と被験分子を１つずつ（いずれかの順序で）又は同時にウエルに加えることができる。インキュベーション後、ウエルを洗浄し、シンチレーション計数器を使用してＢ７ＲＰ１のＣＲＰ１タンパク質への結合の度合を調べるために放射能を測定することができる。典型的には、分子を一定の濃度範囲にわたって試験し、結果の評価の正確さを確認するために試験アッセイの１つ又はそれ以上の要素を欠く一連の対照ウエルが使用できる。これに代わる方法は、タンパク質の「位置」を逆にする、すなわちＢ７ＲＰ１をマイクロタイタープレートのウエルに固定し、被験分子と放射標識ＣＲＰ１をインキュベーションして、ＣＲＰ１の結合の度合を測定することを含む（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ［１９９５］の１８章参照）。
放射標識に代わる方法として、ＣＲＰ１又はＢ７ＲＰ１をビオチンに結合し、比色定量によって又はストレプタビジンの蛍光標識によって検出することができる、ホースラディシュペルオキシダーゼ［ＨＲＰ］又はアルカリホスファターゼ［ＡＰ］のような酵素に連結されたストレプタビジンを使用してビオチニル化タンパク質の存在を検出することができる。ビオチンに結合したＣＲＰ１又はＢ７ＲＰ１に対して特異的な抗体も使用でき、ＡＰ又はＨＲＰに連結された酵素連結ストレプタビジンとのインキュベーション後、検出することができる。
ＣＲＰ１及びＢ７ＲＰ１はまた、アガロースビーズ、アクリルビーズ又は他の種類のそのような不活性物質への接着によって固定しうる。基質−タンパク質複合体を相補的タンパク質と被験化合物を含む溶液に入れる；インキュベーション後、遠心分離によってビーズを沈澱させ、上述した方法を用いてＣＲＰ１とＢ７ＲＰ１間の結合の量を評価することができる。その代わりに、基質−タンパク質複合体をカラムに固定し、被験分子と相補的タンパク質をカラムに通過させることができる。次に上記に述べた手法、すなわち放射標識、抗体結合、等のいずれかを用いてＣＲＰ１とＢ７ＲＰ１間の複合体の形成を評価することができる。
ＣＲＰ１／Ｂ７ＲＰ１複合体の形成を増加させる又は減少させる被験分子を同定するために有用なもう１つのタイプのインビトロアッセイは、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイ系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）のような表面プラスモン共鳴検出器システムである。Ｂｉａｃｏｒｅシステムは製造者のプロトコールを使用して実施しうる。このアッセイは基本的に、検出器内に位置するデキストラン被覆センサーチップへのＣＲＰ１又はＢ７ＲＰ１のいずれかの共有結合を含む。次に、被験化合物と他の相補的タンパク質を同時に又は連続的にセンサーチップが入ったチェンバー内に注入し、結合する相補的タンパク質の量を、センサーチップのデキストラン被覆側と物理的に関連する分子量の変化に基づいて評価することができる；分子量の変化は検出器システムによって測定できる。
一部の場合には、ＣＲＰ１／Ｂ７ＲＰ１複合体の形成を増加させる又は減少させるのに使用するため、２個又はそれ以上の被験化合物を一緒に評価することが望ましいと考えられる。これらの場合、そのような付加被験化合物を最初の被験化合物と同時に又は最初の被験化合物に続いて加えることにより、上記に述べたアッセイを容易に修正することができる。アッセイの残りの段階は上述した通りである。
上に述べたようなインビトロアッセイは、ＣＲＰ１又はＢ７ＲＰ１による複合体形成への作用に関して多数の化合物を速やかにスクリーニングするために好都合に使用しうる。ファージディスプレイ、合成ペプチド及び化学合成ライブラリーにおいて生成される化合物をスクリーニングするためにアッセイを自動化することができる。
ＣＲＰ１及びＢ７ＲＰ１の複合体形成を上昇させる又は低下させる化合物はまた、いずれかのポリペプチドを発現する細胞及び細胞系統を使用した細胞培養においてもスクリーニングしうる。細胞と細胞系統はどのような哺乳類からも入手しうるが、好ましくはヒト又は他の霊長類、イヌ、げっ歯類ソースからのものである。表面上にＣＲＰ１を発現する細胞へのＢ７ＲＰ１の結合を被験化合物の存在下又は不在下で評価し、結合の度合を、例えばＢ７ＲＰ１に対するビオチニル化抗体を使用するフローサイトメトリーによって測定することができる。細胞培養アッセイは、上述したタンパク結合アッセイにおいて陽性と判定された化合物をさらに評価するために好都合に使用しうる。
治療用途
本発明のポリペプチド、及びその作用物質と拮抗物質は、Ｔ細胞の機能を調節するために使用しうる。作用物質と拮抗物質は、ＣＲＰ１及び／又はＢ７ＲＰ１活性を調節し、Ｔ細胞機能に関連する活性、例えばＴ細胞の活性化のような、ＣＲＰ１又はＢ７ＲＰ１タンパク質の少なくとも１つの活性を上昇させる又は低下させる分子を含む。作用物質又は拮抗物質は、ＣＲＰ１又はＢ７ＲＰ１のいずれかと相互作用し、それによってそれらの活性を調節する、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、又は低分子量分子のような補因子でありうる。潜在的なポリペプチド作用物質又は拮抗物質は、当該タンパク質の細胞外ドメインの一部又は全部を含む、可溶性又は膜結合形態のＣＲＰ１又はＢ７ＲＰ１と相互作用する抗体を含む。ＣＲＰ１又はＢ７ＲＰ１発現を調節する分子は、典型的には発現のアンチセンス調節因子として働きうる、ＣＲＰ１又はＢ７ＲＰ１タンパク質をコードする核酸を含む。
ＣＲＰ１又はＢ７ＲＰ１ポリペプチド及びその作用物質と拮抗物質は、自己免疫疾患、移植片の生存、腫瘍細胞の増殖を抑制するための免疫細胞の活性化、Ｔ細胞依存性Ｂ細胞仲介疾患、及び癌遺伝子免疫療法の治療において使用しうる。１つの実施態様では、ＣＲＰ１及び／又はＢ７ＲＰ１機能の拮抗物質又は阻害因子は、慢性免疫細胞機能不全を有する疾患において症状を軽減するために有益であると考えられる。全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、及び乾癬のような自己免疫疾患は、ＣＲＰ−１／Ｂ７ＲＰ−１の拮抗物質又は阻害因子で治療しうる。さらに、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎）、グレーヴズ病、橋本甲状腺炎、及び糖尿病のような慢性炎症性疾患も、ＣＲＰ−１／Ｂ７ＲＰ−１に対する阻害因子で治療できる。実施例１８の中で述べるように、げっ歯類の慢性関節リウマチ疾患モデルにおいて、ＣＲＰ−１−Ｆｃは疾患の発症を抑制し、Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃは発症を促進する。このモデルにおけるこれら正反対の作用は、Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃタンパク質に関する作用性の役割とＣＲＰ−１−Ｆｃタンパク質についての拮抗性の役割を裏付ける。その結果はまた、この経路の操作によってＴ細胞応答をどのように調節することができるか、そして慢性関節リウマチの進行におけるこの経路の重要性を示している。さらに、実施例１９で述べるように、インビボでのＢ７ＲＰ−１−Ｆｃの発現はトランスジェニックマウスにおいて炎症性腸疾患（ＩＢＤ）表現型を刺激する。この実施例は、腸の炎症発生におけるＢ７ＲＰ−１／ＣＲＰ−１の役割を裏付ける。それ故、Ｂ７ＲＰ−１／ＣＲＰ−１経路の拮抗物質はヒトＩＢＤを治療するために使用しうる。
ＣＲＰ１又はＢ７ＲＰ１の拮抗物質は、骨髄及び臓器移植のための免疫抑制剤として使用でき、移植片の生存を延長させるために使用しうる。そのような拮抗物質は既存の治療に比べて重要な利益を提供しうる。骨髄及び臓器移植療法は、宿主によるＴ細胞仲介の異種細胞又は異種組織拒絶反応と戦わねばならない。Ｔ細胞仲介の拒絶反応抑制するための現在の治療レジメンは、シクロスポリン又はＦＫ５０６薬剤による治療を含む。薬剤は有効であるが、患者は肝毒性、腎毒性及び神経毒性を含めた深刻な副作用に悩まされる。シクロスポリン／ＦＫ５０６クラスの治療薬の標的は、遍在発現するホスファターゼ、カルシニューリンである。ＣＲＰ１の発現はＴ細胞に限定されるので、ＣＲＰ１又はＢ７ＲＰ１の阻害因子は現在の免疫治療薬の使用に関して認められる重篤な副作用がないと考えられる。
ＣＲＰ１又はＢ７ＲＰ１の拮抗物質は、慢性関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、糖尿病、及び全身性エリテマトーデスのような自己免疫疾患のための免疫抑制剤として使用しうる。
ＣＲＰ１／Ｂ７ＲＰ１を介する共同刺激経路の拮抗物質はまた、トキシックショック症候群、炎症性腸疾患、輸血によるアロ感作、Ｔ細胞依存性Ｂ細胞仲介疾患を軽減するため、及び対宿主性移植片病の治療のために使用しうる。
抗体、例えば細胞外ドメインを含む可溶性タンパク質、及びＴ細胞活性化の延長又は促進をもたらすＣＲＰ１又はＢ７ＲＰ１の他の調節因子が、腫瘍に対する免疫応答を高めるために使用できる。実施例２０は、Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃがマウスにおいて腫瘍細胞の増殖を阻害しうることを示している。同様に、ヒトＢ７ＲＰ−１−Ｆｃ又はＢ７ＲＰ−１／ＣＲＰ−１経路の他の活性化因子は、ヒト腫瘍に対する免疫応答を増強するために使用しうる。抗腫瘍活性は一般に、強力な細胞溶解性Ｔリンパ球成分を持つとみなされる。実際に、Ｂ７−Ｆｃ融合タンパク質の抗腫瘍作用（Ｓｔｕｒｍｈｏｅｆｅｌら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：４９６４−４９７２，１９９９）は、細胞溶解性ＣＤ８＋Ｔ細胞によって仲介された。ＣＲＰ−１も細胞溶解性ＣＤ８＋Ｔ細胞上で発現されるので（実施例９）、実施例２０で明らかにされた抗腫瘍作用はＣＤ８＋細胞へのＢ７ＲＰ−１−Ｆｃの作用によるものであったと考えられる。Ｂ７ＲＰ−１／ＣＲＰ−１経路はまた、同種移植片移植、対宿主性移植片病、及び自己免疫疾患を含めた多くの他の臨床状況においてＣＴＬ応答を調節するために操作できる。
本発明のＢ７ＲＰ１遺伝子を使用する遺伝子治療は、癌免疫療法において使用しうる。癌細胞内に挿入されたＢ７ＲＰ１遺伝子は、動物の体内にもどされたときに免疫系のＴ細胞によって認識されうる抗原呈示細胞へと癌細胞を形質転換することができる。Ｔ細胞によるトランスフェクションされた腫瘍細胞の認識は、Ｂ７ＲＰ１遺伝子を発現する又は発現しない腫瘍細胞の根絶をもたらす。この免疫療法アプローチは、様々な白血病、肉腫、黒色腫、腺癌、乳癌、前立腺腫瘍、肺癌、結腸癌及び他の腫瘍のために使用しうる。本発明は、様々な腫瘍に対する応答においてＴ細胞の活性化を高めるためにＢ７ＲＰ１遺伝子を同様に使用することを包含する。
実施例１４で述べるように、Ｂ７ＲＰ１を発現するトランスジェニックマウスの表現型は、Ｂ７ＲＰ１が抗体産生の制御において重要であることを示唆する。Ｂ７ＲＰ１タンパク質活性の作用物質及び拮抗物質は、抗体産生の抑制又は強化を必要とする治療適応症において有用であると考えられる。
例えば、多くのワクチンは有効で特異的な抗体応答を惹起することによって作用する。一部のワクチン、特に腸内微生物（例えばＡ型肝炎ウイルス及びサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｓ））に対するものは、短命な抗体応答を惹起する。ワクチンの有効性を高めるためにはこの応答を増強し、延長させることが望ましい。それ故、可溶性Ｂ７ＲＰ１又はＣＲＰ１に対する活性化抗体は、ワクチンアジュバントとして役立つと考えられる。
抗ウイルス応答はまた、Ｂ７ＲＰ−１／ＣＲＰ−１経路の活性化因子又は作用物質によっても増強されうる。実施例２０のデータは、細胞性免疫がＢ７ＲＰ−１−Ｆｃによって高められることを示している。Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃ又はＢ７ＲＰ−１／ＣＰＲ−１経路の他の活性化因子による細胞性免疫機能の増強はまた、ウイルス感染細胞を排除する上でも有益であると考えられる。補足的に、Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃは、体内から遊離ウイルスを清掃するのを助ける働きをすると考えられる、実施例１３で認められたような抗体仲介応答を増強しうる対液性免疫機能に影響を及ぼす。
逆に、抗体産生の抑制によって改善される多くの臨床条件がある。過敏症は、誇張された又は不適切な、常態では有益な免疫応答であり、炎症反応と組織損傷を導く。抗体が仲介する過敏症反応は、Ｂ７ＲＰ１活性の阻害因子による拮抗作用を特に受けやすいと考えられる。アレルギー、枯草熱、喘息、及び急性浮腫はＩ型過敏症反応を引き起こすが、これらの反応はＢ７ＲＰ１活性のタンパク質、抗体又は小分子阻害因子によって抑制されうる。 全身性エリテマトーデス、関節炎（慢性関節リウマチ、反応性関節炎、乾癬性関節炎）、ネフロパシー（膜性、脈管膜毛細管性、巣状分節性、巣状壊死性、半月性、増殖性−糸球体腎炎、尿細管症）、皮膚疾患（天疱瘡及び類天疱瘡、結節性紅斑）、内分泌障害（甲状腺炎−グレーヴズ病、橋本甲状腺炎、インスリン依存性糖尿病）、種々の肺疾患（特に外因性肺胞炎）、種々の血管症、ＩｇＡの異常産生を伴う小児脂肪便症、多くの貧血及び血小板減少症、ギヤン−バレー症候群、及び重症筋無力症を含めて、抗体仲介の過敏症反応を引き起こす疾患がＢ７ＲＰ１拮抗物質によって治療できる。
さらに、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、及びクリオグロブリン血症のようなリンパ球増殖性疾患が、Ｂ７ＲＰ１のタンパク質、抗体、又は小分子拮抗物質によって抑制しうる。
最後に、「人為的」免疫疾患である対宿主性移植片病は、Ｂ７ＲＰ１拮抗物質による抗体産生の抑制によって恩恵を受けるであろう。
下記の実施例は本発明をさらに詳しく説明するために提示するものであるが、本発明の範囲を制限するものとみなされるべきではない。
実施例１
ＣＲＰ１ ｃＤＮＡおよびアミノ酸配列
雌Ｃ５７／ブラック６マウスを犠牲にして、小腸を切除し、パイエル板を除去した。小腸組織を切開し、洗浄して、粘膜および他の壊死組織片を除去した。１ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０中で、２０分間、３７℃で穏やかに撹拌することによって、腸上皮内細胞（ｉＩＥＬ）を含有する上皮層を解離させた。解離した細胞を１００μフィルターに通して、５０ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０中で洗浄し、混合して細胞の凝集塊をさらに破壊し、その後、４０μストレーナーを通して、単一細胞集団を得た。その後、これらの細胞を、体積５０ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０で再び洗浄して、残留ＤＴＴを確実に除去した。その後、その組織を撹拌し、前のように洗浄して、残留ｉＩＥＬを採集した。３段階のパーコール勾配を用いて、ｉＩＥＬを４０％〜８０％界面でバンディングしながら、ｉＩＥＬを脂肪細胞および最上皮細胞から分離した。その後、これらの細胞をＲＰＭＩ−１６４０で２回洗浄して極微量のパーコールを除去し、ＣＤ１０３（インテグリンαＩＥＬ）抗体で免疫染色して、ＦＡＣｓ Ｓｔａｒ セルソーターを用いて分離した。その後、これらの選別細胞は、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を直接用いて全ＲＮＡを準備するために用いるか、あるいはγ−／δ−ＴＣＲ、α−／β−ＴＣＲ、またはＣＤ３を架橋するプレート結合活性化抗体を用いて一晩活性化するかした。ＲＮＡを以上のように準備し、ＥＳＴ ｃＤＮＡライブラリを造るためにプールした。
ｓｍｉ１２−０００８２−ａ１で表わされるｃＤＮＡクローンは、ＣＤ２８（図１Ｂ）と相同のヌクレオチド配列を含んでいた（図１Ｂ）。配列の翻訳および公開データベース中の既知タンパク質とのその後の比較は、１９％のアミノ酸がマウスＣＤ２８と同一であることを示した。マウスＣＤ２８は、マウスのＣＴＬＡ−４と同一のアミノ酸を２６％しか共有しないため、この低相同性は有意である。ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４系統における分子内および分子間システイン結合にとって重要であると考えられる推定システインのすべてが、保存されることが分かった（アミノ酸残基８３、１０９および１３７；開始メチオニンに関して）。さらに、推定オープンリーディングフレームの全長および膜内外領域の相対位置は、ＣＤ２８およびＣＲＬＡ−４の両方のものと類似していた。遺伝子ＣＲＰ１をＣＤ２８関連プロテイン−１と名づけた。
実施例２
ヒトＣＲＰ１ ｃＤＮＡのクローニング
ヒトＣＲＰ１プロテインをコードする核酸配列は、以下の手順によって同定する。ヒトｃＤＮＡライブラリは、健康なボランティアから得たヒト抹梢血からの濃縮リンパ球から製造した。リンパ球を精製し、赤血球をリンパ球分離培地（ＩＮＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＩＮＣ．，Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ，ＣＡ）によって除去した。その後、１０ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ、５００ｎｇ／ｍＬのイノマイシン、およびＣＤ３に対するプレート結合活性化抗体を含有する培地中で、一晩、その細胞を活性化させた。Ｔｒｉｚｏｌ法によって活性化された細胞（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）から全ＲＮＡを準備し、ダイナルビード精製によってポリＡ ＲＮＡを分離した。ｃＤＮＡは、分離したポリＡ ＲＮＡから製造し、サイズは最大ｃＤＮＡ断片を選択した。その後、サイズ選択ｃＤＮＡは、プラスミドｐＳＰＯＲＴ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）にライゲーションさせた。ヒトＣＲＰ１タンパク質をコードするＤＮＡは、組換えバクテリオファージプラークまたは形質転換細菌コロニーハイブリダゼーションプロトコル（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｓｕｐｒａ）のいずれかにより活性化リンパ球ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングすることによって得る。ファージまたはプラスミドｃＤＮＡライブラリは、実施例１および図１に記載のマウスＣＲＰ１遺伝子クローンから誘導される放射性標識したプローブを用いてスクリーニングする。プローブを用いて、プレーティングしたライブラリから切り離したナイロンフィルタをスクリーニングする。これらのフィルタは、５０％ホルムアミド、５Ｘ ＳＳＰＥ、２Ｘ デンハート溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍＬのサケ精子ＤＮＡ中、４２℃で４時間予備ハイブリダイズし、その後、５０％ホルムアミド、５Ｘ ＳＳＰＥ、２Ｘ デンハート溶液、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍＬのサケ精子ＤＮＡおよび５ｎｇ／ｍＬのｍＢ７ＲＰ１プローブ中、４２℃で２４時間ハイブリダイズする。ブロットは、２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１０分間、１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃で１０分間、０．２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃で１０分間洗浄し、その後、０．２Ｘ ＳＳＣ中、５０℃で１０分間、再び洗浄する。一切のヒトＣＲＰ１クローンから得られた挿入物を配列し、実施例１に記載したように分析する。
実施例３
Ｂ７ＲＰ１ ＤＮＡおよびアミノ酸配列
ｓｍｉ１１−００００３−ｇ５で表わされるｃＤＮＡクローンは、Ｂ７．１（ＣＤ８０）およびＢ７．２（ＣＤ８６）と相同のヌクレオチド配列を含んでいた。配列の翻訳（図２Ａ）および公開データベース中の既知タンパク質とのその後の比較は、２０％のアミノ酸がマウスＢ７．１と同一であることを示した（図２Ｂ）。マウスＢ７．１は、マウスＢ７．２と同一のアミノ酸を２４％しか共有しないため、この低相同性は有意であった。この低相同性にもかかわらず、臨界システイン残基は、このクローンのオープンリーディングフレームとマウスＢ７．１およびＢ７．１との間、残基６２、１３８、１８５および２４２（開始メチオニンに関して、図２Ｂ）において保存される。Ｂ７．１およびＢ７．１と比較すると、このクローンの推定ＯＲＦおける適切な成熟タンパク質長およびカルボキシ末端に対する膜内外領域の位置も類似している。我々は遺伝子Ｂ７ＲＰ１をＢ７関連タンパク質−１と名づけた。
実施例４
ヒトＢ７ＲＰ１ ｃＤＮＡのクローニング
マウスＢ７ＲＰ１配列（図２参照）を用いるＧｅｎｂａｎｋ芽細胞相同性調査（ＧＣＧ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）は、１６７９ｂｐのＯＲＦを有する４３５８ｂｐの配列を含むクローン（ＡＢ０１４５５３）を検索した。ＰＣＲクローニングプライマーは、この配列にしたがって設計した。Ｈｕｍａｎ Ｌｙｍｐｈ Ｎｏｄｅ Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用い、製造業者の指示した手順に従って、５’および３’ＲＡＣＥにより１３１３ｂｐのＤＮＡ断片を得た。
ヒトＢ７ＲＰ１全長に用いたプライマー：
Figure 0005658695
 プライマー２０８３−７５および２０８３−７６は、ＲＡＣＥプロトコルを用いて遺伝子の５’末端を増幅させるために用いた。プライマー２０８３−７７、２０８３−７８、２１１３−２９、２１１３−３０および２１１３−３１は、ＲＡＣＥプロトコルを用いて遺伝子の３’末端を増幅させるために用いた。
得られたヌクレオチド配列は、メチオニンで開始する２８８のアミノ酸残基のＯＲＦを含んでいた。その後、予測成熟ヒトＢ７ＲＰ１アミノ酸配列を成熟マウスＢ７ＲＰ１アミノ酸配列と比較して（図３Ｂ）、同一のアミノ酸を４８％共有することがわかった。ＣＤ８０（Ｂ７．１）を用いると化学種間の相同性が低く、実際に、マウスおよびヒトのＣＤ８０は、同一のアミノ酸を４１％しか共有しないため、この相同性は有意である。重要なことに、ヒトＢ７ＲＰ１タンパク質は、Ｉｇループ構造（成熟タンパク質に関するアミノ酸残基１６、９２、１３８、１９４および１９５、図３Ｂ）に必要な臨界システイン残基を保存する。さらに、膜内外領域の全長および位置は、ヒトＢ７ＲＰ１ホモログと一致する。
実施例５
Ｂ７ＲＰ１ ＲＮＡの発現
Ｂ７ＲＰ１遺伝子に対してＲＮＡプローブ用いるＲＮＡインシチューハイブリダイゼーション。成体マウス組織を４％パラホルムアルデヒド中に固定し、パラフィン包理して、５μｍの薄切りにした。インシチューハイブリダイゼーションの前に、組織を０．２ＭのＨＣｌで易透化し、続いて、プロテイナーゼＫを用いて消化して、トリエタノールアミンおよび無水酢酸を用いてアセチル化した。一晩、５５℃で、マウスＢ７ＲＰ１配列のヌクレオチド１〜９６に対応する９６９塩基の３３Ｐ標識リボプローブを用いて、切片をハイブリダイズした。ＲＮアーゼ消化によって過剰のプローブを除去し、続いて、漸減塩濃度の緩衝液中で一連の洗浄を行い、その後、０．１Ｘ ＳＳＣ中、５５℃で高ストリンジェンシー洗浄を行った。スライドをＫｏｄａｋ ＮＴＢ２エマルジョンに浸漬し、４℃で２〜３週間露光して、現像し、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて対比染色した。切片標本を暗視野および透過光照明法を用いて試験することによって、組織形態学およびハイブリダイゼーションシグナルを同時に評価することができた。
インシチューハイブリダイゼーションによるＢ７ＲＰ１ ＲＮＡの分析は、Ｂ７ＲＰ１ ＲＮＡがリンパ系成熟領域において非常に発現することを示した。Ｂ７ＲＰ１ ＲＮＡは、胸腺のリンパ系組織、腸、脾臓およびリンパ節のパイエル板において発現した。これらのリンパ系組織内の発現は、Ｂ７ＲＰ１ ＲＮＡが、一般に、Ｂ細胞領域およびその他のＡＰＣ関与領域において発現することを実証していた。これらの領域には、胸腺の髄質領域、リンパ節の１次濾胞、およびパイエル板の濾胞およびドーム領域が挙げられる。Ｂ７ＲＰ１ ＲＮＡの発現は、リンパ系組織におけるＡＰＣ関与領に極めて特異的なものである。
一部の非リンパ系組織の分析も、ＡＰＣ関与領域におけるＢ７ＲＰ１発現を示した。肺において、Ｂ７ＲＰ１発現は、抗原処理に関する機能と一致する粘膜下領域において見られた。小腸において、Ｂ７ＲＰ１ ＲＮＡは、粘膜固有層において見られた。特に、Ｂ７ＲＰ１ ＲＮＡの発現と重複するリンパ球湿潤を示す損傷肝臓部分を発見した。Ｂ７ＲＰ１発現の組織損傷に応じたリンパ球蓄積との一致は、Ｂ７ＲＰ１がリンパ球活性化に関与することを強く示している。
実施例６
ＣＲＰ１ ＲＮＡの発現
ＣＲＰ１遺伝子に対してＲＮＡプローブを用いるＲＮＡインシチューハイブリダイゼーション。マウスの組織は、実施例５の場合のように準備した。組織の易透化、プローブハイブリダイゼーション、スライド処理、および組織染色は、実施例５に記載したとおりであった。切片は、一晩、５５℃で、マウスＣＲＰ１配列のヌクレオチド１〜６０３に対応する６０３塩基の３３Ｐ標識リボプローブを用いて、ハイブリダイズした。切片標本を暗視野および透過光照明法を用いて試験することによって、組織形態学およびハイブリダイゼーションシグナルを同時に評価することができた。
正常なマウスまたはオキサゾロンで処理したマウスからのリンパ節を薄切りにし、ＣＲＰ１ ＲＮＡ発現について分析した。感作マウスリンパ節は、正常なマウスのリンパ節より大きいＣＲＰ１ ＲＮＡ発現を示した。ＣＲＰ１の発現は、Ｔ細胞活性領域である傍皮質にあった。従って、ＣＲＰ１ ＲＮＡの発現は、Ｔリンパ球発現のものと一致し、Ｔ細胞活性次第で向上調節される。
実施例７
ＣＲＰ１−ＦｃおよびＢ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質の発現および精製
ＣＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質についてのＤＮＡ発現ベクターを構成するために、ＣＲＰ１の第一アミノ末端１４７アミノ酸についてのコード配列は、ヒトＦｃ遺伝子のカルボキシ末端２３５アミノ酸（アイソタイプＩｇＧ１）についてのコード配列、フレーム内に融合させ、ｐｃＤＮＡ３のポリリンカー配列内にライゲーションした（ｐｃＤＮＡ３／ＣＲＰ１−Ｆｃ）。Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質につてのＤＮＡ発現ベクターを構成するために、Ｂ７ＲＰ１の第一アミノ末端２６９アミノ酸についてのコード配列は、ヒトＦｃ遺伝子のカルボキシ末端２３５アミノ酸（アイソタイプＩｇＧ１）についてのコード配列、フレーム内に融合させ、ｐｃＤＮＡ３のポリリンカー配列内にライゲーションした（ｐｃＤＮＡ３／Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ）。ＣＲＰ１およびＢ７ＲＰ１、両方のコード配列は、各タンパク質のＮ−末端から、そこは含まないが、各タンパク質の推定膜内外領域までの配列を含んでいた。２９３Ｔ細胞には、ＦｕＧｅｎｅ６形質移入試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて、ｐｃＤＮＡ３／ＣＲＰ１−ＦｃまたはｐｃＤＮＡ３／Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃのいずれかを形質移入した。４日後、調整培地を回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いるバッチクロマトグラフィーによって、Ｆｃ融合タンパク質を精製した。カラムに結合したＦｃ融合タンパク質を３カラム容量のＩｍｍｕｎｏｐｕｒｅ Ｇｅｎｔｌｅ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて溶離し、その後、体積１５０の２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）に透析させた。Ｍａｃｒｏｓｅｐ遠心コンセントレート、３０ｋｄ ＭＷＣＯ（Ｐａｌｌ Ｆｉｌｔｒｏｎ）を用いて、透析したタンパク質を濃縮し、各タンパク質のアミノ酸配列から誘導される吸光係数を用いてタンパク質濃度を計算した。ＣＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質の発現を図４Ａに示し、Ｂ７ＣＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質の発現を図４Ｂに示す。
実施例８
レセプター−リガンド対としてのＣＲＰ１およびＢ７ＲＰ１の同定
新規タンパク質が、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７．１およびＢ７．２を含むものと同じ共同刺激性経路であるかを決定するために、細胞表面画像分析を用いた。この分析は、ＡＣＡＳ（Ａｄｈｅｒｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｓｏｒｔｉｎｇ／粘着細胞分析および選別）分析を用いて、細胞中で発現した膜結合タンパク質が種々のＦｃ融合タンパク質と相互作用するかを分析するものである。膜結合タンパク質を発現する細胞（図５の左側に示す）をＦｃ融合タンパク質（同図の上に示す）と共にインキュベートした。
１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中で増殖させたＣｏｓ−７細胞を２４ウエルのプレートに５００，０００細胞／ウエルでプレーティングした。ＦｕＧｅｎｅ６試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて細胞に形質移入した。各形質移入について、３μＬのＦｕＧｅｎｅ６試薬を血清を含有しない４７μＬのＤＭＥＭ培地に添加した。室温で１０分間インキュベートした後、混合物を０．２５μｇのプラスミドに一滴ずつ添加し、その後、１５分間インキュベートした。その後、１０％ＦＢＳを含有する０．５ｍＬのＤＭＥＭと共に上の混合物を細胞に添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２雰囲気のもとでインキュベートした。対照として、ヒトＣＤ２８についてのｃＤＮＡを含む発現プラスミドで安定的に形質移入したＣＨＯ Ｄ細胞も、２４ウエルのプレートに５００，０００細胞／ウエルでプレーティングした。
４８時間後、形質移入試薬を含有する培地を除去し、細胞をＲＰＭＩと５％ＦＢＳで２回洗浄した。１ｍＬの培地中、１０〜２０ｎｇの精製Ｆｃ融合タンパク質を細胞に添加し、これを３０分間氷上でインキュベートした。細胞をＲＰＭＩと５％ＦＢＳで３回洗浄し、その後、２μＬのＦＩＴＣ結合抗ヒトＦｃ抗体（１ｍｇ／ｍＬ）と共に、さらに３０分間氷上でインキュベートした。ＲＰＭＩを用いて３回連続洗浄した後、細胞は、ＡＣＡＳ分析用のために、フェノールレッドを含有しない２５０μＬのＲＰＭＩ培地を用いて転化させた。
種々のＦｃ融合タンパク質を結合した細胞のＡＣＡＳ分析は、Ｂ７ＲＰ１タンパク質がＣＲＰ１に結合していることを示したが、既知の共同刺激性経路におけるタンパク質、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４は示さなかった。逆に言えば、ＣＲＰ１はＢ７ＲＰ１と相互作用したが、既知経路における成分、Ｂ７．２とは相互作用しなかった。（図５参照）。これらの結果は、ＣＲＰ１およびＢ７ＲＰ１が、ＣＤ２８およびＢ７．２のアナログである新規レセプター−リガンド対を表わすことを強く示している。しかし、ＣＲＰ１およびＢ７ＲＰ１は、Ｂ７．２、ＣＴＬＡ−４、またはＣＤ２８と相互作用しないため、それらは離れており、既知の共同刺激性経路から独立している。
実施例９
Ｂ７ＲＰ１レセプターを発現する細胞の同定
Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質を用いて、ＣＲＰ１タンパク質を含有すると推定されるＢ７ＲＰ１に対するレセプターを発現する細胞（図６参照）をＦＡＣＳ分析によって検出した。雌Ｃ５７／ブラック６マウスから脾臓を除去して、１００μメッシュフィルターを用いて磨砕し、リンパ球を解離させて、７０μフィルターを通し、その後、５０ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０中で洗浄した。それらを１５００ｒｐｍでペレット化して、新しいＲＰＭＩに再懸濁させ、混合して凝集細胞を破壊し、４０μフィルターを通した。活性化させるべきＴ細胞をＲＰＭＩ−１６４０、５％ＦＢＳ、１ＸＰＳＧ、ＰＭＡ、イノマイシン中で６ウエルのプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で、一晩インキュベートした。１２時間後、Ｔ細胞の活性化を視覚的確認によりチェックした。
免疫染色用の活性化脾臓細胞をＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ（Ｐａｔｈ−ｏｃｙｔｅ ４、ＩＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）洗浄緩衝液中で洗浄して、再懸濁させ、その後、体積１００μＬで分取した。ＣＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質またはＢ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質、いずれかの１５μｇ／ｍＬを適切に添加し（１．５μｇ／サンプル）、その後、その混合物を氷上で３０分間、時折混合しながらインキュベートした。細胞を５．０ｍＬの洗浄緩衝液中で２回洗浄した。細胞染色用の１００μＬ容積中、２μｇのヤギ抗ヒト（ＧａＨｕＦｃ−ＦＩＴＣ）複合第２抗体を用いて融合タンパク質の結合を視覚化した。ＰＥと複合した細胞マーカー抗体をＧａＨＵＦｃ−ＦＩＴＣ、ならびに指示された抗体対照（ラットアイソタイプ）と複合した対照アイソタイプ−ＰＥと共に添加した。そのサンプルを氷上でインキュベートし、前のごとく洗浄した。リンパ球集団にゲートを設けるＦＡＣＳｃａｎ分析によって、視覚化を行った。ＣＤ４＋抗体およびＢ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質を用いた二重染色は、細胞がＣＤ４マーカーとＢ７ＲＰ１に対するレセプター、おそらくＣＲＰ１との両方を発現することを示した（図６）。同様に、ＣＤ８＋抗体およびＢ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質を用いた二重染色は、細胞がＣＤ８レセプターおよびＢ７ＲＰ１レセプターの両方を発現することを実証した（図６）。非活性化脾細胞試料中では、こうした二重染色細胞を確実に検出することはできなかった。ＣＤ４およびＣＤ８はＴリンパ球マーカーであるので、ＣＲＰ１は活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上で発現されると仮定することができる。これらのデータは、正常なマウスと比較して、感作マウスからのリンパ節のＴ細胞領域において増加したＣＲＰ１ ＲＮＡの発現と一致する（実施例６）。
実施例１０
ＣＲＰ１リガンドを発現する細胞の同定
ＣＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質を用いて、Ｂ７ＲＰ１タンパク質を含有すると推定されるＣＲＰ１に対するリガンドを発現する細胞（実施例８参照）をＦＡＣＳ分析によって検出した（図７）。脾細胞は、実施例８の場合のように準備したが、１２時間のＴ細胞活性化段階を省略し、細胞を直接分析した。脾細胞は、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）マーカー抗体およびＣＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質を用いて二重染色した。ＣＤ４５Ｒ Ｂ細胞マーカーとＢ７ＲＰ１を含有すると推定されるＣＲＰ１に対する推定リガンド（実施例８）との両方を発現する細胞を検出した。従って、Ｂ７ＲＰ１は、抗原提示細胞タイプのＢ細胞上で発現されると推断する。これらのデータは、種々のリンパ系組織のＢ細胞領域におけるＢ７ＲＰ１ ＲＮＡの発現（実施例５）と一致した。
腹腔マクロファージ上でのＢ７ＲＰ１の発現のＦＡＣＳ分析（図８）。腹腔細胞を局所洗浄によって正常なマウスから採集し、ＣＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質または対照としてのＦｃタンパク質と共に、あるいはＦ４／８０モノクローナル抗体（マクロファージに対して特異的な抗原を検出する）または無関係なアイソタイプ対応モノクロナール抗体と共にインキュベートする前に洗浄した。その後、再び細胞を洗浄し、ヤギ抗ヒトＦｃ−ＦＩＴＣ複合抗体と共にインキュベートした。さらなる洗浄の後、細胞は、ＦＡＣＳ分析機で光拡散および蛍光染色性について評価した。腹腔細胞は、それらの光拡散性によってサブセット中で最初に識別された（図８Ａ）。マクロファージは、光を前方（ＦＳＣ）および横向き（ＳＳＣ）に強く拡散させる能力のため、およびマクロファージに対するマーカーであるＦ４／８０抗原に対して染色陽性であるため、領域５（Ｒ５）内で確認した（図８Ｂ）。領域６（Ｒ６）内のマクロファージは、Ｆ４／８０抗原に対するさほど強くない染色性をもとに選抜され、またＣＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質によって染色されることが分かった（図８Ｃ）。これらのデータは、Ｂ７ＲＰ１を含有することができるＣＲＰ１に対するリガンドが、プロフェッショナル抗原提示細胞であるマクロファージ上で発現されることを示している。これは、Ｔリンパ球活性化におけるＣＲＰ１およびＢ７ＲＰ１機能と一致する。
実施例１１
Ｃｏｎ Ａ刺激Ｔリンパ球上のＢ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質のインヴィトロ抑制作用
マウス脾細胞を実施例８の場合のように準備し、ネガティブ選択によってＴリンパ球を濃縮した（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）。２００，０００の脾細胞を９６ウエルの丸底プレートにおけるＴ細胞増殖分析に用いた。細胞は、培地（添加なし）、図９に示したＣＲＰ１−Ｆｃ、Ｂ７ＰＲ１−ＦｃまたはＢ７．２−Ｆｃ融合タンパク質と共に１時間インキュベートした。培地（添加なし）、または種々の濃度でのＣｏｎ Ａを図９の下に示したとおり添加した。その後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。４２時間後、細胞に３Ｈ−チミジンを６時間適用し、回収して、組込まれた放射活性を決定した。３つの同じサンプルからの平均ＣＰＭおよび標準偏差を図９に示す。
Ｆｃ融合タンパク質は、それ自体では有意なＴ細胞刺激活性または抑制活性を示さなかったが、１μｇ／ｍＬおよび３μｇ／ｍＬのＣｏｎ Ａの存在のもとで、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃおよび既知のＢ７．２―Ｆｃ融合タンパク質は、有意な抑制活性を示した（図９）。高濃度（１０μｇ／ｍＬ）では、Ｃｏｎ Ａ刺激作用は、おそらくＴ細胞の過剰活性化によって細胞死をもたらす。Ｂ７ＲＰ１−ＦｃまたはＢ７．２−Ｆｃ、いずれかを添加すると、細胞は高濃度のＣｏｎ Ａの有害作用から著しく保護された。抑制および保護機能の両方において、Ｂ７ＰＲ１−Ｆｃタンパク質によるＣｏｎ Ａ刺激細胞への影響は、Ｂ７．２−Ｆｃタンパク質より大きかった。これらのデータは、Ｂ７ＲＰ１タンパク質が機能して、Ｔ細胞増殖を調整することを示している。
実施例１２
トランスジェニックマウスにおけるＢ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質の全身送達
実施例７に記載したＢ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質は、ＡｐｏＥ肝臓特異的発現ベクターにさらにクローニングした（Ｓｉｍｏｎｅｔら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４，１３１０−１３１９（１９９４）およびＰＣＴ出願番号ＵＳ９４／１１６７５）。制限酵素、Ｓｐｅ ＩおよびＮｏｔ Ｉを用いてコード領域をｐＣＥＰ４／Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃから切除して、破片を前述のＡｐｏＥ肝臓特異的発現ベクター中の同じ部位にさらにクローニングした。得られたプラスミド、ＨＥ−Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃをそのタンパク質コード領域およびコード領域の側面に位置する配列を通して配列し、突然変異体が確実に含まれないようにした。
プラスミドを増幅させ、ＣｓＣ１密度勾配遠心法を２回行って精製した。精製したプラスミドＤＮＡを制限酵素、Ｃｌａ ＩおよびＡｓｅ Ｉを用いて消化し、１．５ｋｂのトランスジーン挿入物をアガロースゲル電気泳動法によって精製した。精製した破片を希釈して、５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）および０．２ｍＭのＥＤＴＡ中１μｇ／ｍＬの保存注射溶液にした。使用前に注射針を斜めに切り、シリコーン処理したことを除いて、本質的には（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２，４３３８（１９８５））に記載されているとおりにＢＤＦ１ Ｘ ＢＤＦ１−交配マウスからの単個細胞胚を注入した。胚をＣＯ２インキュベータ内で一晩培養し、１５〜２０の２−細胞胚を偽妊娠ＣＤ１雌マウスの卵管に移入した。
満期妊娠の後、微量注入した胚に基づく体内移植から５６の子孫を得た。ゲノムＤＮＡサンプルに組込まれたトランスジーンのＰＣＲ増幅によって、その子孫をスクリーニングした。増幅の標的領域は、発現ベクター中に含まれるヒトＡｐｏ Ｅイントロンの３６９ｂｐ領域であった。ＰＣＲ増幅に用いたオリゴは：
Figure 0005658695
 であった。
ＰＣＲについての条件は、９４℃で２分間を１サイクル、９４℃で１分間、６３℃で２０秒間、そして７２℃で３０秒間を３０サイクルであった。５６の原子孫のうち７匹をＰＣＲ陽性トランスジェニックファウンダーマウスとして確認した。
１２週齢において、９匹のトランスジェニックファウンダー（マウス＃１、２、４、６、８、３０、３２、３３、４０）および５匹の対照（マウス＃５、９、１０、２５、２８）を屍検および病理学分析のために犠牲にした。全細胞性ＲＮＡをファウンダー動物および陰性対照同腹子の肝臓から、（ＭｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２，２１９（１９８７））に記載されているように分離した。これらのサンプルを用いてノーザン法分析を行い、トランスジーン発現のレベルを評価した。アガロース電気泳動変性ゲル（Ｏｇｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２，６１（１９８７））によって、各動物から約１０μｇの全ＲＮＡを分離し、その後、ＨＹＢＯＮＤ−Ｎナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移送して、３２Ｐ ｄＣＴＰ標識ｍＢ７ＲＰ１−Ｆｃ挿入ＤＮＡを用いてプローブした。ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）およびハイブリダイゼーション緩衝液１ｍＬあたり２〜４ Ｘ １０６ＣＰＭの標識プローブ中、６３℃で１時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションに続いて、ブロットを２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で２回、各５分間洗浄し、その後、０．１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５５℃で２回、各１５〜２０分間洗浄した。ファウンダーおよび対照同腹子におけるトランスジーンの発現は、オートラジオグラフ法に従って決定した。
ノーザン法分析は、７匹のトランスジェニックファウンダーが検出可能レベルのトランスジーンＲＮＡを発現することを示した（マウス＃１、２、６、８、３２、３３および４０）。陰性対照マウスおよび３匹のファウンダー（＃４、３０および３１）は、検出可能レベルのＲＮＡを発現しなかった。Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質は、培養状態の哺乳動物細胞から分泌されるものと決めたので（図４Ｂおよび実施例７）、トランスジーンｍＲＮＡの発現は、全身送達遺伝子産物レベルを示すはずである。
実施例１３
Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質の生物活性
７匹のトランスジェニックマウス（マウス＃１、２、６、８、３２、３３および４０）および５匹の対照同腹子（＃５、９、１０、２５および２８）を以下の手順を用いる屍検および病理学分析のために犠牲にした。安楽死させる前に、すべての動物のＩＤ番号を確認し、その後、体重を計り、麻酔をかけて、血液を取った。血液は、全血清化学および血液学パネルのために、血清および全血の両方として保管した。致死性ＣＯ２吸入による終末麻酔の直後、グロス解剖の前にＸ線撮影を行った。その後、組織試験のために組織を除去し、１０％Ｚｎ−ホルマリン緩衝液中に固定した。回収した組織には、肝臓、脾臓、膵臓、胃、十二指腸、回腸、パイエル板、結腸、腎臓、生殖器官、皮膚、乳腺、骨、脳、心臓、肺、胸腺、気管、食道、甲状腺／副甲状腺、空腸、盲腸、直腸、副臓、白色および褐色脂肪、坐骨神経、骨髄、膀胱、および骨格筋が挙げられる。固定前に、肝臓、心臓、胃、腎臓、副腎、脾臓、および胸腺について全器官重量を測定した。固定後、組織をパラフィンブロックに加工して、３μｍの切片を得た。
Ｂリンパ球マーカー、Ｂ２２０およびＴリンパ球マーカー、ＣＤ３についての免疫組織化学法を実施した。Ｂ２２０またはＣＤ３発現を検出するために、ホルマリン固定し、パラフィン包理した４μｍ切片を脱パラフィン化し、脱イオン水に水和した。切片は、３％過酸化水素を用いて反応停止させ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋ（Ｌｉｐｓｈａｗ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を用いてブロックして、Ｂ２２０に対するラットモノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）またはＣＤ３に対するウサギポリクローナル抗体（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）中でインキュベートした。クロマーゲンとしてＤＡＢ（Ｂｉｏｔｅｋ，Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を用いて、ビオチニル化ウサギ抗ラットまたはヤギ抗ウサギ免疫グロブリン、ペルオキシダーゼ複合ストレプタビジン、（ＢｉｏＧｅｎｅｘ，Ｓａｎ Ｒａｍｏｎ，ＣＡ）により、抗体を検出した。切片をヘマトキシリンで対比染色した。
この研究では、寿命がある段階での研究中に、正常な臨床症状が報告された。トランスジェニックマウスの全身放射線写真を対照マウスのものと比較した。トランスジェニックマウスの全血液学的パラメータを陰性対照群ののものと比較したが、個々のマウスに孤立の変化が存在した。トランスジーン系＃８および＃４０は、増大した血清グロブリンレベル（グロブレン過剰血）を有し、そして＃３２および＃３３は、免疫系の慢性抗原刺激により一般に見られるパターンである低い正常範囲のアルブミンレベルを随伴する高い正常範囲のグロブリンレベルを有した。その他のトランスジェニックマウスの器官重量は、対照群のものとさほど差がなかった。
トランスジェニックマウスには以下の病理組織学的変化が存在した。トランスジェニックＢ７ＲＰ１−Ｆｃマウスの腸間膜リンパ節は、対照マウスと比較して中等度〜著しく肥大した（図１０Ａ〜１０Ｄ；図１１Ａ〜１１Ｅ）。皮質は、主としてＢ２２０＋ Ｂ細胞（図１１Ｄ）、そして少数の散在ＣＤ３＋ Ｔ細胞（図１１Ｆ）を含む大きな胚中心を有する肥大した第二濾胞（図１０Ｂ〜１１Ｂ）のように見える隆起濾胞過形成を有した。傍皮質（ＣＤ３＋ Ｔ細胞）領域も中等度に肥大化し（図１１Ｂ〜１１Ｆ）、髄洞は、わずかに増加した数の肉マクロファージ（洞組織球増殖）を有した。節における最も顕著な変化は、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウスにおける多数の分化型プラズマ細胞によって穏やか〜著しく膨張した髄索に存在した（図１０Ｄ）。トランスジェニックマウス＃４０において、少数の散在ラッセル体（すなわち、免疫グロブリンを含有する隆起した大きく丸い細胞質内小疱）も髄索内に見られた（図１０Ｄ）。興味深いことに、その他の内部および抹消リンパ節（例えば、頚部、鼠径部）は、全身応答を思わせる類似の形態学的特徴の活性リンパ細網細胞増生を有した。これらの発見は、Ｂ細胞増殖およびプラズマ細胞への終末分化を導く体液性免疫反応を強化させる慢性進行性免疫刺激と一致する。
Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウスの脾臓は、対照マウスと比較して、特に、胚中心隆起を伴うＢ細胞第二濾胞および細動脈周囲Ｔ細胞鞘が関係する中程度活性リンパ組織過形成により可変的に肥大した白色脾髄領域を有した（図１０Ｅ〜１０Ｆ）。Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウスにおけるもう一つの顕著な発見は、白色脾髄領域周囲の帯域および隣接赤色脾髄における最小限〜軽度のプラズマ細胞増加であった。トランスジェニックマウス＃６は、少数の散在ラッセル体を有した（図１０Ｆ、挿入）。赤色脾髄は、対照マウスに見られるものと比較して、軽度〜中程度の骨髄外造血を有した（図１０Ｅ）。
小腸パイエル板は、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウスにおいて、対照マウスのものに比べ軽度〜著しく肥大し（図１０Ｇ）、また、特にトランスジェニックマウス＃４０および＃３２において、胚中心が突起した非常に大きな濾胞を有した（図１０Ｈ）。さらに、小腸内に存在する粘膜であるが、トランスジェニックマウスの結腸内ではより大きく突起した粘膜の濃化粘膜固有層中のリンパ球およびプラズマ細胞の数（マウス＃３２の回腸における軽度好酸性浸潤と混合）について、最小限（＃３２において）〜軽度（＃８および＃３３）の増加があった。大腸リンパ球系凝集体（ＧＡＬＴ）も、対照群中に比べ、一部のＢ７ＲＰ１−Ｆｃマウス（特に、マウス＃８および＃２）中でわずかに大きく突起していた。
胸腺、骨髄、肝臓、肺、心臓、膵臓、腎臓、副臓、甲状腺、副甲状腺、気管、生殖器官、膀胱、乳腺、皮膚、骨格筋、抹消神経、脳、食道、胃、小および大腸、骨（大腿骨／頚骨）、後膝関節、正常に見え、対照マウスにおいて検出された背景変化と比較できる白色および褐色脂肪を含むその他の組織をあまねく試験した。
この研究からのデータは、トランスジェニックマウスにおけるＢ７関連タンパク質Ｆｃキメラ（Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ）の過剰発現が、脾臓、抹消および内部リンパ節、および消化管関連リンパ系組織において検出される突起した反応性リンパ組織過形成によって特徴づけられる、濾胞過形成、Ｔ細胞領域の膨張、および一部の動物においてグロブリン過剰血を随伴する顕著なプラズマ細胞増加などの表現型を誘導することを実証している。プラズマ細胞増加は、より高レベルの循環ＩｇＧ（±ＳＤ ＝ トランスジェニックマウスにおける５９７±２９８ｍｇ／ｍＬ 対 対照同腹子における２０９±８０ｍｇ／ｍＬ、ｎ＝７、Ｐ＜０．０５、ｔ ｔｅｓｔを意味する）、特に、ＩｇＧ２ａ（２１７±１００ｍｇ／ｍＬ 対 ７５±２９ｍｇ／ｍＬ、ｎ＝７、Ｐ＜０．０１、ｔ ｔｅｓｔ）を随伴する。ＩｇＧ２ａの誘導は、通常、ＩＦＮ−ｇなどのＴｈ１サイトカインに関連する。従って、Ｂ７ＲＰ−１は、ＢおよびＴ細胞増殖を誘導し、Ｂ細胞を刺激してプラズマ細胞に分化させ、免疫グロブリンを生成する。
これらの変化は、試験したリンパ器官全体にわたって、抗体生産プラズマ細胞にＢ細胞刺激、増殖および分化をもたらす体液性上肢免疫系の過剰刺激に対する持続性全身免疫応答と一致する。
Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウスにおいて実証される著しいリンパ組織過形成から、我々は、Ｂ７ＲＰ１タンパク質が免疫系刺激に関連する有意な生体内生物活性を有するものと推断する。
実施例１４
ヒトＢ７ＲＰ１のクローニング
正常なヒト循環抹消リンパ球をリンパ球分離培地（ＩＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を用いて赤血球から分離した。その後、１０μｇ／ｍＬのプレート結合抗ＣＤ３抗体（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ，ＭＥ）、１０ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ、および５００ｎｇ／ｍＬのイノマイシンを用いて、一晩（１６時間）、３７℃、５％ＣＯ２で、Ｔ細胞を活性化した。その後、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いて全ＲＮＡを細胞から準備した。遠心分離によって細胞をペレット化し、その細胞ペレットを各々５ ｘ １０６の細胞に対して１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ試薬に再懸濁させて、室温で５分間インキュベートした。その後、原ＴＲＩｚｏｌ試薬１ｍＬあたり０．２ｍＬのクロロホルムを添加した。試験管を手で１５秒間激しく振り、３分間室温でインキュベートして、１３，０００ｒｐｍで１５分間、４℃で遠心分離した。遠心分離後、ＲＮＡを含有する水性上澄み相を回収し、イソプロピルアルコールの添加によってサンプルＲＮＡを沈殿させた。その後、溶液を室温で１０分間インキュベートし、ＲＮＡをペレット化して、７５％のエタノールで洗浄し、その後、１５，０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離した。ペレットを空気乾燥して、ＲＮアーゼを含有しない水に再懸濁させ、その後、分取して、後で用いるまで−８０℃で保管した。
ｃＤＮＡ合成用のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ ＳｙｓｔｅｍおよびＰｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いてライブラリを構築した。簡単に言えば、平均サイズ２ｋｂのｃＤＮＡ挿入物をＳａｌ１／Ｎｏｔ１クローニング部位においてｐＳｐｏｒｔベクターにライゲーションした。ライゲーションしたプラスミドは、Ｅｌｅｃｔｒｏｍａｘ 形質転換担当Ｅ．コリ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）へのエレクトロポレーションを施し、滴定して、ＬＢプレートあたり１５，０００コロニー（アンピシリン１００μｇ／ｍＬ）でプレーティングした。３００，０００のコロニーを切離してコロニー／プラークスクリーンハイブリダイゼーション伝達膜（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｎｅｃｅ）に送り、０．５ＮのＮａＯＨ、１．５ＭのＮａＣｌ中で５分間変性させ、その後、次の緩衝液、１ＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．５ＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および１．５ＭのＮａＣｌならびに２Ｘ ＳＳＣ中で各５分間、連続して中和した。その後、フィルターを紫外線照射によって架橋し、真空オーブン内で３０分間８０℃で焼いた。フィルターを２Ｘ ＳＳＣ中、４２℃で大いに予備洗浄して壊死組織片を除去し、その後、４２℃で、５０％ホルムアミド、５Ｘ ＳＳＰＥ、５Ｘ デンハート溶液、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍＬのサケ精液ＤＮＡ中で、２時間予備ハイブリダイズした。
図３Ａに示すヌクレオチド１〜７１１を有する８９５ｂｐのＤＮＡ断片、１６７ｂｐｓの５’直から図３中〜開始メチオニンコドン、および１７ｂｐｓの３’直〜図３Ａ中の位置７１１を用いてヒトリンパ球ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングした。１６７塩基対のこの上流５’配列は、ＨｕＢ７ＲＰ１ ｃＤＮＡの５’ＲＡＣＥによって得られ（実施例４）、Ｅｃｏ ＲＩ 制限酵素切断部位においてＴＯＰＯ ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から解離させた。この挿入物を０．８％アガロースＴＡＥゲルを用いて２回精製した。ＤＮＡゲル精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、アガロースからＤＮＡ挿入物を分離した。
Ｒｅｄｉ−Ｐｒｉｍｅ２（Ａｍｅｒｓｈａｍ）ランダム第一標識システムプロトコルに従って、１２５ｎｇのＤＮＡ断片を３２Ｐ ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて標識した。その後、コロニーリフトフィルターは、プローブを用いて４２℃でハイブリダイズさせた。次の緩衝液、５０％ホルムアミド、５Ｘ ＳＳＰＥ、２Ｘ デンハート溶液、０．５％ＳＤＳ、１００ｍｇ／ｍＬのｓｓＤＮＡ中で、一晩、４２℃。プローブの比活性は、ハイブリダイゼーション緩衝液１ｍＬにつき約２ｎｇの標識プローブ中、２．３８ｘ１０９ｃｐｍ／μｇのＤＮＡであった。プローブを除去し、次回のスクリーニングのために保管した。その後、フィルターを２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ ＲＴ中で１５分間、続いて１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５５℃で１５分間、そして１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６０℃で１０分間洗浄した。フィルターをプラスチック中にラップし、一晩、−８０℃で、２つの増強スクリーンを用いてオートラジオグラフィーフィルムに曝した。３つの独立した陽性クローンを同定した。暴露したものを細菌プレートに配列して、陽性クローンをスクラップし、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを用いて希釈してＬＢプレート上に再びプレーティングし、前のように一晩増殖させて、コロニーを切り離し、準備して、前に記載したようにプローブした。３つの独立したクローンコロニーを分離し、ＤＮＡを分離して、同じ３つのクローンそれぞれについてＤＮＡを配列した。
ヒトＢ７ＲＰ１タンパク質の全長は、３０２アミノ酸である。ポリペプチド長および膜内外領域の関係位置は、Ｂ７系列の他の構成員と一致した。ヒトＢ７ＲＰ１遺伝子は、マウスクローンと一致するアミノ酸を４３％有する。マウスおよびヒトＣＤ８０タンパク質は４１％しか一致しないので、この相同性度は有意である。マウスとヒトの間で特に保存される遺伝子は、アミノ酸位置３７、１１３、１５８、２１５および２１６におけるシステイン残基である。
実施例１５
ヒトＣＲＰ１のクローニング
マウスＢ７ＲＰ１配列（図２参照）を使用したＧｅｎｂａｎｋ芽細胞相同性検索（ＧＣＧ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）により、マウスＣＲＰ１遺伝子と高い相同性を示す１０４ｂｐ配列を含むゲノムクローン（Ｇｅｎ Ｂａｎｋアクセス番号ＡＱ０２２６７６）を取り出した。この配列とオーバーラップするＰＣＲクローニングプライマーを設計した。
Figure 0005658695
上記のプライマーを使用し、図１と実施例１に示したマウスＣＲＰ１プラスミドを鋳型としてマウスＣＲＰ１の１５１ｂｐ ＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した。かかるＤＮＡ １２５ｎｇを、Ｒｅｄｉ−Ｐｒｉｍｅ ２（Ａｍｅｒｓｈａｍ）ランダムプライム標識システムプロトコールに従って３２Ｐ ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で標識した。実施例１５で述べるヒト末梢血ライブラリーからのコロニーリフトフィルターを下記のハイブリダイゼーション緩衝液中４１℃でひと晩（１５時間）、プローブとハイブリダイズさせた；５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、２×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ ｓｓＤＮＡ。プローブの比放射能は３．５２×１０９ｃｐｍ／μｇ ＤＮＡ、１．５ｎｇ標識プローブ／ｍｌハイブリダイゼーション緩衝液であった。プローブを取り出し、次回のスクリーニングのために保存した。次にフィルターを２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおいて室温で１０分間洗浄し、その後１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにより３７℃で７分間、４０℃で７分間、４４℃で７分間、さらに５０℃で７分間、フィルターが標識プローブを放出する速度を絶えずモニターしながら洗浄した。フィルターをプラスチックに包み、２枚の増感紙を用いて−８０℃でひと晩フィルムに暴露した。この方法は、可能性のある９個の独立した陽性クローンを明らかにした。暴露したものを細菌プレートに整列し、陽性クローンを削りとり、２００μｌ ＳＯＣに入れて、１：１０の２回の連続希釈を行い、２回目の希釈液から７０μｌを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレートに接種して上記のようにひと晩増殖させた。コロニーを採取し、調製して、上記のようにプローブした。８個の独立クローンを分離し、Ｑｉａｇｅｎミニプレップ法によってＤＮＡを調製した。
１９９個のアミノ酸のオープンリーディングフレームを含むｃＤＮＡクローンを得た（図１３Ａ）。このｃＤＮＡクローンは、実施例１と図１に示したマウスＣＲＰ１クローンとヌクレオチド及びアミノ酸の相同性を有していた。このヒトクローンのオープンリーディングフレームに対応するヌクレオチドは、マウスＣＲＰ１遺伝子と７７％同一であった。ヒト配列の翻訳及びそれに続くマウスＣＲＰ１タンパク質との比較は、マウスタンパク質と６９％のアミノ酸同一性を明らかにした（図１３Ｂ）。さらに、アミノ酸１１４から１１９の間のモチーフ、「ＦＤＰＰＰＦ」は、マウスとヒトＣＲＰ１遺伝子間で保存されていた。このモチーフは、マウスにおける「ＭＹＰＰＰＹ」モチーフ及びＢ７タンパク質の相互作用にとって必須のヒトＣＤ２８に対応する。さらに、アミノ酸４２、１０９及び１４１位のシステインも保存されていた。これらのシステインはＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４におけるシステインに対応し、Ｉｇループの形成と分子間ジスルフィド二量体化に関与する。マウスＣＲＰ１との緊密な類似性及びＣＤ２８ホモロジーファミリーとの構造的類似性は、これがヒトＣＲＰ１の同族体であることを示唆している。
実施例１６
ＣＲＰ−１は休止記憶Ｔリンパ球上に発現される
記憶Ｔ細胞上のＣＲＰ−１発現を調べるため、６−７ヵ月齢のマウスから脾Ｔ細胞を採集した。これらの細胞を、ＦＩＴＣ複合抗ヒトＦｃ抗体及びＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＢ、又はＣＤ６９のいずれかに対するＰＥ複合抗体によって標識したＢ７ＲＰ−１−Ｆｃを使用して二重染色した。Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質による染色は、これらのＴ細胞でのＣＲＰ−１タンパク質の発現を検出する。より高齢のマウスは若齢マウスよりも多くのＣＲＰ−１＋脾Ｔ細胞を示す。興味深いことに、顕著な数のこれらの細胞が、記憶Ｔ細胞に典型的なプロフィールである、ＣＤ４４が高く（図１４ａ）、ＣＤ４５ＲＢが低い（図１４ｂ）。これらのＣＲＰ−１＋記憶Ｔ細胞は、活性化マーカーであるＣＤ６９を発現しないため（図１４ｃ）、休止状態にある。記憶Ｔ細胞上のＣＲＰ−１発現は、ＣＲＰ−１が記憶Ｔ細胞への共同刺激機能を持つことを示唆する。
実施例１７
Ｂ７ＲＰ−１に対する抗体によって阻害される、インビトロでのＴ細胞の共同刺激
Ｂ７ＲＰ−１タンパク質がＴ細胞と機能的関連性を持つかどうかを調べるため、インビトロ増殖アッセイにおいてＣＤ３＋Ｔ細胞をＢ７ＲＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質及び抗ＣＤ３抗体と共にインキュベーションした。次にウサギ抗マウスＢ７ＲＰ１ポリクローナル抗体又はラット抗マウスＢ７ＲＰ１モノクローナル抗体を使用して、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃが共同刺激するインビトロでの増殖を特異的に阻害した。
Ｂ７ＲＰ−１ウサギポリクローナル抗血清の調製
３匹のニュージーランド白色ウサギ（初期重量５−８ポンド）にマウスＢ７ＲＰ１タンパク質を筋肉内注射した。各々のウサギを１日目に、等量のＨｕｎｔｅｒｓ Ｔｉｔｅｒ Ｍａｘ完全アジュバントに乳化したマウスＢ７ＲＰ１タンパク質１５０μｇで免疫した。さらに同じ手順で追加免疫（１４日目と２８日目）を実施した。ＥＩＡによって抗体価をモニターした。２回目の追加免疫後、抗血清は中等度の抗体価を示した。各々の動物から３０ｍｌの採血を行った。これを週に１回６週間にわたって繰り返した。その後ポリクローナル抗体をプロテインＡアガロースクロマトグラフィーによって精製し、次いでＦｃタンパクアフィニティークロマトグラフィーによる陰性選択及びＢ７ＲＰ−１−Ｆｃアフィニティークロマトグラフィーによる陽性選択を実施した。
ラット抗マウスＢ７ＲＰ１モノクローナル抗体の調製
ラット抗マウスＢ７ＲＰ１モノクローナル抗体を、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第２版（１９８０；Ｌ．Ｈｕｄｓｏｎ ａｎｄ Ｆ．Ｃ．Ｈａｙ；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に述べられているように作製した。簡単に述べると、Ｌｏｕラット（Ｈａｒｌａｎ；Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）に、フロイントアジュバントに乳化したｍｕＢ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパクを４週間隔で腹腔内注入した。融合の３日前に、ラットを可溶性ｍｕＢ７ＲＰ１により静脈内経路で追加免疫した。融合の当日、動物を二酸化炭素下で犠牲屠殺し、無菌的に脾を切除した。組織ストマカーを用いて単細胞懸濁液を調製した。脾細胞とＹ３−Ａｇ１．２．３．骨髄腫細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）の両方を無血清培地中で洗浄し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ １５００；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を加えて融合した。細胞を１回すすぎ、血清含有培地に再懸濁して、９６穴の組織培養プレートに接種した。１０−１２日後、各々の穴からの培地を、直接酵素免疫測定法（ＥＩＡ）によりＢ７ＲＰ１に対する特異性抗体に関して試験した。潜在的な結合を示す穴からの細胞を１０ｍｌ培養物に増殖させ、液体窒素中で冷凍した。各培養からの培地をフローサイトメトリー及び機能的Ｔ細胞増殖アッセイにおいてさらに試験した。これらの方法によって興味深いと判定されたものを単細胞コロニーに接種し、再びＥＩＡによって選択して、最終的な細胞系統を抗体作製のために保持した。プロテインＡアガロースクロマトグラフィーによって細胞培地から抗体を精製した。
Ｔ細胞の調製及びＴ細胞増殖アッセイ
Ｃ５７Ｂ１／６マウス（８−１２週齢の雌性、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の脾からのＴ細胞を、マウスＴ細胞強化カラム（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を通して陰性選択によって精製した。その後Ｔ細胞を直接使用するか、若しくは次のような抗体と補体の溶解によってさらに精製した。細胞を、マウスＣＤ１１ｂ（クローンＭ１／７０）、ＮＫ−１．１（クローンＰＫ１３６）、ＣＤ８ａ（クローン５３−６．７）、Ｉ−Ａｂ（クローンＭ５／１１４．１５．２）、ＣＤ１１ｃ（クローンＨＬ３）、及びＢ２２０抗原（クローンＲＡ３−６Ｂ２）に対する抗体（すべて１０μｇ／ｍｌ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎより）を含むＲＰＭＩ培地に懸濁した（２．５×１０６細胞／ｍｌ）。次に細胞を氷上で３０分間インキュベーションし、１２００ｒｐｍでペレット化して、４：１ｖ／ｖのＲＰＭＩ：ウサギ補体（Ｓｉｇｍａ，Ｎｏ．Ｓ−７７６４）中に懸濁し、３７℃でさらに３０分間インキュベーションした。再び細胞をペレット化し、補体処理を繰り返した。平板培養の前に、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩで細胞を洗浄した。Ｕ底９６穴プレートを、０から１．２μｇ／ｍｌの濃度範囲の抗ＣＤ３抗体（クローン１４５−２Ｃ１１，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及び抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ２（Ｓｉｇｍａ，１２．５μｇ／ｍｌ）により４℃でひと晩被覆し、次いで３７℃で６−９時間インキュベーションした。Ｔ細胞（１×１０５／穴）を種々のＦｃ融合タンパクの不在下又は存在下で４８時間培養し、最後の１８時間は１μＣｉの３Ｈ−チミジンでパルスした。対照Ｆｃタンパクは、ＯＰＧとＦｃの融合タンパク及び非融合Ｆｃタンパク断片を含んだ。その後細胞を採集し、取り込まれた放射能を測定した。Ｂ７ＲＰ−１−ＦｃはＴ細胞を用量依存的に共同刺激して増殖させ（図１５ａ）、抗Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃ抗体はこの共同刺激を用量依存的に阻害する（図１５ｂ）。
実施例１８
ＣＲＰ−１／Ｂ７ＲＰ−１経路の阻害因子は、コラーゲンによって誘発される慢性関節リウマチの発症を低下させる
コラーゲン誘発の関節炎（ＣＩＡ）は、ヒトにおける慢性関節リウマチと多くの類似性を持つ、げっ歯類及び霊長類での自己免疫性多発性関節炎の動物モデルである。異種のＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）による免疫はＣＩＩに対する自己免疫応答を誘発し、感受性のあるマウス系統においてＣＩＡの発症を導く。Ｈ−２ｒ及びＨ−２ｑを有する類似遺伝子型系統のマウスはＣＩＡに対して極めて感受性が高い。ＣＩＡは、ＣＩＩ反応性Ｔ細胞と抗体の共力作用によって仲介される。ブタＣＩＩ（Ｎａｂｏｚｎｙら、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０，５１−５８（１９９５））を２ｍｇ／ｍｌの濃度で０．０１Ｎ酢酸に溶解し、次に１：１の比率でＣＦＡ（Ｄｉｆｃｏ）により乳化した。関節炎感受性Ｂ１０．ＲＩＩＩ（Ｈ−２ｒ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）を、尾の基部において乳剤１００μｌにより皮内経路で免疫した。マウスを関節炎の発症に関して週に２−３回モニターした。関節炎の重症度は、各々の足について次のような採点システムを用いて判定した：０：関節炎なし；１：１−３本の足指に発赤又は腫脹；足の重篤な腫脹；３：関節強直。各々の肢の評点を合計し、各動物について０から１２の重症度範囲を決定した。
マウスにタンパク質１００μｇ（２００μＬ中）を週に２回、腹腔内経路で注入した。処置は、ブタＣＩＩによる免疫の１日後に開始し、免疫後５２日目に中止した。１０匹のマウスから成る処置群において実験を行い、１又はそれ以上の評点を有する動物を陽性と判定した。結果を図１６及び表１に示す。
Figure 0005658695
ＣＲＰ１−Ｆｃ融合タンパクで処置したマウスでは、ＰＢＳ処置マウスと比較して関節炎症状の発現が約１０日間遅延した。これは、ＣＲＰ−１／Ｂ７ＲＰ−１経路の阻害がこの慢性関節リウマチのマウスモデルにおいて疾患の症状を軽減しうることを示している。
Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃ又はＢ７．２−Ｆｃで処置したマウスは、ＰＢＳ処置した対照と比較すると、関節炎の重症度の上昇（図１６ｂ）を伴って疾患の早期発症（表１及び図１６ａ）を示した。これは、Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃ融合タンパクがＴ細胞免疫応答を増強することを示唆している。そのような活性は、インビボで抗腫瘍免疫を生じさせる上で有用と考えられる。
慢性関節リウマチのこのマウスモデルにおけるＣＲＰ−１−Ｆｃ及びＢ７ＲＰ−１−Ｆｃの反対の作用は、疾患の進行を促進する又は阻害するように経路を操作できることを示唆する。可溶性Ｂ７ＲＰ−１−ＦｃによるＣＲＰ−１タンパクのターゲティングは疾患を促進するが、Ｂ７ＲＰ−１と可溶性ＣＲＰ−１−Ｆｃの相互作用は疾患の症状を抑制する。
実施例１９
Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃはトランスジェニックマウスにおいて炎症性腸疾患表現型を誘導する。
２２−２５週齢のトランスジェニックマウスにおけるＢ７関連タンパク（Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ）の持続的な過剰発現は、一部の動物において小腸及び大腸の著しい肥厚と慢性炎症（腸炎）及び体重減少を伴った炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の著明な表現型を誘導する。組織学的には、近位及び遠位結腸において最も重症の炎症性変化が認められ、小腸ではより軽度の変化が認められた。近位結腸は、裂溝状潰瘍、経壁炎症、及び結腸粘膜の肥厚を伴って著しく肥厚していたが、遠位結腸は、潰瘍形成を伴わない散在性粘膜肥厚（又は限局性びらん及び腺萎縮）を有していた。近位小腸は、より軽度の炎症性変化を伴って軽度から著明な粘膜肥厚を示し、一方遠位小腸（回腸）は、一部の動物では軽度の粘膜肥厚、また別の動物では萎縮を示した。腸の変化は、雌性Ｂ７ＲＰ−１トランスジェニックマウスにおいて最も重症であり、一貫して認められたが、本試験では雄性トランスジェニックマウスの一部においても認められた。
裂溝状潰瘍及び多核巨細胞を伴った経壁性慢性肉芽腫性炎症を含めて、近位結腸で認められた組織学的特徴が、ヒトにおける潰瘍性結腸炎よりもクローン病で認められるものにより密接に類似していることは興味深い。形態学的には、この結腸炎はまた、インターロイキン−１０欠損のマウスにおいて記述されているＩＢＤに類似しており、この疾患は消耗、貧血、及び腸管全体を冒す腸炎を発現する（Ｋｕｈｎら、１９９３；Ｓａｒｔｏｒ，１９９５；Ｌｅａｃｈら、１９９９）。ＩＬ−１０ノックアウトマウスにおけるように、Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃトランスジェニックマウスでの初期変化は、結腸上皮肥厚を伴わない粘膜固有層における炎症細胞の軽度で限局性の浸潤から成る（実施例１３）。より高齢のマウスでは、罹患した結腸セグメントは腺肥大／過形成と慢性炎症のため肥厚する。Ｂ７ＲＰ１マウスの近位及び遠位結腸は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の組織学的特徴を持つ中等度から重度の結腸炎を有していた。近位結腸の罹患セグメント（図１７Ｂ−１７Ｄ）は、粘液腺の伸長と拡大を伴った顕著な腺上皮肥厚と過形成のため、広汎に肥厚しており（図１７Ｂ）、粘液腺は有糸分裂像の数の増大とまれな陰窩膿瘍を有していたが、ムチンを含む杯細胞は保持していた（図１７Ｄ）。粘膜は、固有層に広汎な慢性炎症があり、一部の動物では膜を越えて拡大し、粘膜下組織、筋層、漿液、及び隣接する腸間膜脂肪組織を含めて腸管壁の下層にまで及んでいた（図１７Ｂ−１７Ｃ）。炎症性浸潤は、慢性肉芽腫性炎症の特徴である、いくつかの好中球及び時として多核巨細胞が混じった（図１７Ｅ）、リンパ球（主としてＣＤ３＋、ＣＤ４４＋Ｔ細胞）、プラスマ細胞、及び類上皮マクロファージ（図１７Ｆ）から成った。リンパ球様凝集物（少数のＣＤ３＋細胞が混じった、主にＢ２２０＋細胞）も、粘膜中及び腸間膜脂肪を含めた粘膜下組織と深層のより微小な血管の周囲に存在した（図１７Ｃ）。管腔は粘液膿性又は粘液性の滲出物を含んでいた（図１７Ｄ）。これらのＢ７ＲＰ−１−Ｆｃトランスジェニックマウスにおいて、粘膜の多病巣性裂溝状潰瘍と経壁性炎症（図１７Ｂ−１７Ｃ）を伴う結腸炎の深刻な証拠が認められた。
Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃトランスジェニックマウスの遠位結腸も、結腸腺の伸長、好塩基球増加及び拡大を伴って広汎に肥厚し、増殖しており（図１８Ｂ−１８Ｇ）、その内の一部は陰窩膿瘍（図１８Ｄ及び１８Ｆ）及び粘液を含んでいた。粘膜固有層は、リンパ球（主としてＣＤ３＋、ＣＤ４４＋細胞、特に浅粘膜において；図１８Ｅ）の軽度の散在性炎症性浸潤、ならびにプラスマ細胞と一部好中球が混じった類上皮マクロファージの巣状凝集物を有していた。リンパ球様凝集物（主としてＢ２２０＋細胞；図１８Ｄ及び１８Ｆ）も粘膜全体に散らばっていた。Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃトランスジェニックマウスの小腸は、粘膜固有層の主としてリンパプラスマ細胞性浸潤を伴った、軽度から局所的に著明な粘膜及び陰窩の肥厚と過形成（図１９Ｂ及び１９Ｄ、陰窩／絨毛比は、対照マウスでの１：１０と比較して、１：４から１．５：１）を含めて、より多様な変化を有していた。粘膜過形成は、十二指腸（図１９Ｂ）、そして特に空腸（図１９Ｄ）を含めた近位小腸において最も顕著であった。最も重症のマウスでは、陰窩構造が局所的に混乱し、形成異常であった（図１９Ｄ）。これに対し、一部のマウスの遠位小腸（回腸）は、絨毛の鈍化、肥厚又は局所的喪失（陰窩：絨毛比は、正常比１：２に対して１：１又はそれ以下）を伴った回腸粘膜の軽度で斑状の絨毛萎縮を有しており、また他の一部のマウスは軽度の回腸粘膜肥厚を有していた。
Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃ融合タンパクは、ヒトクローン病のものに非常に類似した表現型を誘発する役割を担う細胞を活性化するように働く。これは、クローン病における炎症の原因と考えられる細胞がＢ７ＲＰ−１−Ｆｃ融合タンパクによって活性化されることを示唆する。Ｂ７ＲＰ−１の可溶性タンパク、抗体又は小分子阻害因子は、それ故、ＩＢＤを抑制する上で有用と考えられる。
実施例２０
Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃ融合タンパクはマウスにおける腫瘍増殖を抑制する
免疫原性マウスＭｅｔｈ Ａ肉腫の増殖へのＢ７ＲＰ−１及びＣＲＰ−１の作用を調べるため、可溶性Ｂ７ＲＰ−１−ＦｃがＢａｌｂ／ｃマウスの確認されたＭｅｔｈ Ａ肉腫の増殖に影響を及ぼすかどうかを検討した。
対数増殖するＭｅｔｈ Ａ肉腫細胞を、０日目にＢａｌｂ／ｃマウスの腹部に５０万個の細胞を皮内注入して移植した。７日目に腫瘍が〜１００ｍｍ３に達し、７、１０、１４及び１７日目にマウスを賦形剤（ＰＢＳ）又はＢ７ＲＰ−１−Ｆｃ（８ｍｇ／ｋｇ）のいずれかにより皮下経路で処置した。腫瘍の二次元直径をカリパスで測定し、次の式を用いて腫瘍容積（ｍｍ３）を算定した：腫瘍容積＝［｛（幅）２×長さ｝／２］。２８日目まで腫瘍増殖をモニターした。各々の群は８匹のマウスで構成された。
対照腫瘍のＭｅｔｈ Ａ肉腫増殖パターンは二相性であった：緩慢な初期相の後に比較的迅速な対数期が続いた。Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃ処置マウスでは、腫瘍の増殖は迅速な対数期において有意に緩慢であった。２８日目に、対照とＢ７ＲＰ−１−Ｆｃ処置マウスの平均容積はそれぞれ１４１０ｍｍ３と５８０ｍｍ３であった（図２０）。それ故、Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃ処置はこのモデルにおいて腫瘍の増殖を有意に抑制した。データは、免疫原性腫瘍の治療における可溶性Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃタンパク及びＢ７ＲＰ−１／ＣＲＰ−１経路の他の活性化因子の有益な治療上の有用性を強く示唆している。
免疫学的抗腫瘍活性は、細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の機能と緊密に結びついている。一貫して、Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃタンパクは細胞溶解性ＣＤ８＋Ｔ細胞上で発現される（実施例９、図６）。これらのデータは、細胞溶解性ＣＤ８＋Ｔ細胞へのＢ７ＲＰ−１の機能を強く裏付けるものである。Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃ又はＢ７ＲＰ−１／ＣＲＰ−１経路の他の刺激因子は、それ故、多くの非癌関連適応症に関して細胞溶解性Ｔ細胞及び細胞性免疫機能を増強するために使用しうるであろう。
実施例２１
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒトＢ７ＲＰ−１活性の阻害
ヒトＢ７ＲＰ−１が正の同時刺激性を有するかどうかを同定するために、我々は、Ｔ細胞増殖アッセイにおけるヒトＢ７ＲＰ−１およびヒトＢ７ＲＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質を発現する細胞を試験した。ヒトＢ７ＲＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質を、部分的ヒトＩｇＧ１遺伝子配列へのアミノ酸１〜２４７に対応する遺伝子配列の融合によって構築した（実施例１４）。ヒトＣＲＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質を、部分的ヒトＩｇＧ１遺伝子配列へのアミノ酸１〜１４６に対応する遺伝子配列の融合によって構築した（実施例１４）。両融合タンパク質の構築法、発現法、および精製法を、実施例７に記載のように行った。Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃは、抗ＣＤ３刺激に依存する同時刺激活性を示した（図２１ａ）。さらに、この活性を、溶解性ＣＲＰ−１−Ｆｃタンパク質で特異的に阻害することができる（図２１ｂ）。全コード配列を含む、膜結合ヒトＢ７ＲＰ−１を発現するＣＨＯ細胞を用いて、類似の同時刺激効果が得られた（図２１ｃ）。
上記のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖条件下でのヒトＴ細胞によるサイトカインの産生を同定した。４８時間および７２時間刺激したＴ細胞培養物由来の上清を、製造者の仕様書（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に従ったＥＬＩＳＡによってＩＬ−２、ＩＬ−１０、およびＩＦＮ−γについて分析した。ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０レベルは有意に増加したが、ＣＤ２８同時刺激の場合と異なり、ＩＬ−２は特に誘導されなかった（図２１ｄ）。実施例１３に記載のように、ＩＦＮ−γ（Ｔｈ１サイトカイン）レベルの増加は、ＩｇＧ２ａを増加させるＢ７ＲＰ−１の機能と相関する。
ｉｎ ｖｉｔｒｏＴ細胞同時刺激アッセイを、以下のように行った。高度に精製したヒトＴ細胞（＞９８％ ＣＤ３＋）を、ｍＡｂ標識磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いた新鮮または解凍した接着減少ＰＢＭＣのネガティブ選択によって単離した。Ｔ細胞（１×１０５細胞／ウェル）を、９６ウェルの３連のウェルにおいて２００μｌ／ウェル ＲＰＭＩ＋１０％ ＦＣＳ中で培養した。Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃ同時刺激を評価するために、種々の濃度の抗ＣＤ−３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および１０μｇ／ｍｌ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｓｉｇｍａ）の１００μｌ １×ＰＢＳ溶液を４℃で一晩のインキュベーションによってＵ底プレート上にプレコートした。非結合抗ＣＤ３および抗ヒトＩｇＧ Ｆｃを取り除き、細胞を種々の濃度のＢ７ＲＰ−１−Ｆｃ、ＯＰＧ−Ｆｃコントロール、または抗ＣＤ２８（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の存在下または非存在下で培養した。Ｂ７ＲＰ−１−Ｆｃ同時刺激のＣＲＰ−１−Ｆｃ阻害用に、連続希釈したＣＲＰ−１−ＦｃまたはＯＰＧ−Ｆｃの存在下で、０．５μｇ／ｍｌＢ７ＲＰ−１−Ｆｃを含む０．３３μｇ／ｍｌ抗ＣＤ−３および１０μｇ／ｍｌ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃプレコートウェル中で、１０μｇ／ｍｌから開始してＴ細胞を培養した。Ｂ７ＲＰ−１を発現するＣＨＯ細胞による同時刺激を評価するために、種々の量のマイトマイシン−Ｃ処理ＣＨＯ Ｂ７ＲＰ−１細胞またはＣＨＯベクター細胞の存在下または非存在下で、種々の濃度の溶解性抗ＣＤ３を含む平底プレート中でＴ細胞を培養した。Ｔ細胞増殖について試験するために、７２時間の培養の最後の１８時間に１ ｕＣｉ／ウェル ［３Ｈ］ＴｄＲで培養物をパルスした。Ｔ細胞増殖を、［３Ｈ］ＴｄＲ組み込みによって同定した。３つの無作為なドナー由来の１つの代表的な実験結果を、平均ＣＰＭ組み込み＋／−ＳＤで示す。サイトカイン産生分析用に、細胞を４８時間および７２時間培養し、ＥＬＩＳＡ用に上清を回収した。
３つの実験は、実施例１４に記載するように、ヒトＦｃ断片に融合した場合、ヒトＢ７ＲＰ−１の細胞外部分は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ細胞を同時刺激することができることを示す。この同時刺激は、ＣＲＰ−１−Ｆｃで阻害されるので、これは、ヒトＢ７ＲＰ−１の溶解性インヒビターがどのように機能し得るのかを示す。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ（本明細書中に記載のヒトＢ７ＲＰ−１およびＣＲＰ−１を用いたアッセイ）を使用して、Ｂ７ＲＰ−１／ＣＲＰ−１活性の抗体、溶解性タンパク質、ペプチ体、または小分子インヒビターをスクリーニングすることができる。
本発明は好ましい実施形態に関して記載しているが、当業者により変形形態および修正形態が実施されることが理解される。したがって、添付の特許請求の範囲は、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲内で実施されるこのような全ての等価な変形形態を対象とすることが意図される。

Claims (9)

  1. 配列番号１３のポリペプチドに特異的に結合する、抗体またはその断片。
  2. モノクローナル抗体またはその断片である、請求項１に記載の抗体またはその断片。
  3. ヒト抗体またはその断片である、請求項１に記載の抗体またはその断片。
  4. ヒト化もしくはＣＤＲ移植抗体またはその断片である、請求項１に記載の抗体またはその断片。
  5. Ｂ７ＲＰ１のＣＲＰ１への結合を阻害する、請求項１に記載の抗体またはその断片であって、Ｂ７ＲＰ１は、図１２Ａ（配列番号１７）に記載の成熟アミノ酸配列を含み、ＣＲＰ１は、図１３Ａ（配列番号２２）に記載の成熟アミノ酸配列を含む、前記抗体またはその断片。
  6. ポリペプチドに特異的に結合する、抗体またはその断片であって、
    前記ポリペプチドが、
    （１）
    ａ）図１２Ａ（配列番号１６）に記載のヌクレオチド配列、
    ｂ）図１２Ａ（配列番号１６）に記載のポリペプチドの残基１〜３０２、もしくは残基２２〜３０２をコードするヌクレオチド配列、および
    ｃ）（ａ）または（ｂ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、
    からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子によってコードされる、ポリペプチド；または
    （２）
    ａ）図１２Ａ（配列番号１７）に記載のアミノ酸配列、および
    ｂ）残基２２の成熟アミノ末端を含む図１２Ａ（配列番号１７）に記載の成熟アミノ酸配列、
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
    であり、
    Ｂ７ＲＰ１のＣＲＰ１への結合を阻害し、ここで、Ｂ７ＲＰ１は、図１２Ａ（配列番号１７）に記載の成熟アミノ酸配列を含み、ＣＲＰ１は、図１３Ａ（配列番号２２）に記載の成熟アミノ酸配列を含む、前記抗体またはその断片。
  7. 請求項１又は６で定義された抗体またはその断片および薬学的に受容可能なキャリア、アジュバント、可溶化剤、安定剤、または抗酸化剤を含む組成物。
  8. 動物の免疫応答を抑制する医薬を製造するための、請求項１又は６で定義された抗体またはその断片の使用。
  9. 動物の免疫応答を抑制するための、請求項１又は６で定義された抗体またはその断片。
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