ES2464156T3 - Polipéptidos implicados en respuesta inmunitaria - Google Patents

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Abstract

Molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos seleccionada de: a) la secuencia de nucleotidos expuesta en la figura 12A (SEQ ID NO: 16); b) la secuencia de nucle6tidos que codifica para el polipeptido expuesto en la figura 12A (SEQ ID NO: 17) de los residuos 1-302, o de los residuos 19-302, 20-302, 21-302, 22-302, 24-302 6 28-302; o c) una secuencia de nucleOtidos complementaria a cualquiera de (a) o (b).

Description

Polipeptidos implicados en respuesta innnunitaria
Campo de la invencion
La presente invenciOn se refiere a polipeptidos que estan implicados en la activacion de linfocitos T.
Especificamente, la invencion se refiere a polipeptidos coestimuladores de linfocitos T, a los acidos nucleicos que codifican para los polipeptidos, a vectores de expresi6n y celulas huespedes para la produccion de los polipeptidos y a composiciones y usos en el tratamiento de enfermedades relacionadas con inmunosupresi6n y activacion
inmunitaria.
Antecedentes de la invencion
Para la generaci6n de una respuesta inmunitaria de linfocitos T (celulas T) apropiada, deben proporcionarse dos seriales a la celula T por celulas presentadoras de antigeno (CPA). En primer lugar, debe presentarse un antigeno al receptor de celulas T (TCR) por medio de un complejo mayor de histocompatibilidad (CMH), en un acontecimiento que determina la especificidad. En segundo lugar, debe suministrarse una serial coestimuladora, independiente de antigeno mediante el acoplamiento de miembros de la familia B7 en la CPA con la proteina CD28 en celulas T. Una
respuesta inmunitaria productiva conduce a proliferaciOn, diferenciacion, expansi6n clonal y efecto o funcion. En ausencia de la segunda serial coestimuladora, las celulas T experimentan un estado de falta de receptividad especifica de antigeno de larga duracion, denominado anergia.
Las celulas T inician la respuesta inmunitaria, median en funciones efectoras especificas de antigeno y regulan la actividad de otros leucocitos secretando citocinas. El receptor de celulas T (TCR) distingue la celula T de otros linfocitos y puede unirse al antigeno solo cuando se presenta por la CPA dentro del contexto de un CMH. La
actividad funcional de una celula T particular puede correlacionarse con la expresion de antigenos de membrana, tales como CD4 y CD8. Por ejemplo, celulas T CD4+ funcionan generalmente como celulas T auxiliares (quot;helpe() (TH) y estan restringidas por CMH de clase II, mientras que las celulas CD8+ funcionan generalmente como celulas T citotoxicas (TO y estan restringidas por CMH de clase I.
Los polipeptidos coestimuladores de celulas T potentes que se han identificado previamente incluyen los polipeptidos denominados B7.1 (Freeman et al. J. Immunology 143, 2714-2722 (1989), Freeman et al. Jour. Expt. Med. 174, 625-31 (1991)) y B7.2 (Freeman etal. Science 262, 909-911 (1993) y Freeman etal. Jour. Expt. Med. 178, 2185-2192 (1993)), (o CD80 y CD86, respectivamente). Estos polipeptidos se expresan de manera o bien inducible o bien constitutiva en diversas CPA y son ligandos unidos a la membrana para CD28 y CTLA-4, respectivamente, en celulas T. CD28 (Aruffo y Seed Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 8573-8577 (1987) y Gross et al. J. lmmun. 144. 3201-3210 (1990)) se expresa en celulas T en reposo y media en una serial coestimuladora positiva.
Se induce la expresion de CTLA-4 (Brunet etal.Nature 328, 267-270 (1987) y Dariavach etal. Eur. Jour. Immun. 18, 1901-1905 (1988)) tras la activacion de celulas T y regula de manera negativa la serial de CD28, debido a su afinidad de union superior por B7.1 y B7.2. Ratones sin el gen de CTLA-4 presentan niveles drastic,amente altos de
celulas T, puesto que el mecanismo de desactivacion de la serial de proliferacion se ve alterado en ausencia de
CTLA-4. Este fenotipo demuestra claramente el efecto inhibidor principal que tiene la proteina coestimuladora CTLA4 sobre la proliferacion de celulas T. Ratones que carecen de CD28 o 87.1 o B7.2 tienen un fenotipo menos grave, lo que indica que pueden existir rutas alternativas para la coestimulacion de celulas T.
Ha habido un considerable interes en la ruta de CD28/CTLA-4 como medio para regular la proliferaciOn y activacion decelulas T. Una proteina quimerica que contiene la parte extracelular de CTLA-4 fusionada a Fc humano tiene fuertes efectos inmunosupresores y se ha estudiado en una variedad de entornos clinicos. Tambien se han evaluado
anticuerpos frente a proteinas B7.1 y B7.2 para indicaciones similares en el area de la inmunosupresiOn. Anticuerpos anti-CTLA-4 han mostrado utilidad en la promoci6n de la activacion de celulas T. Ademas, la terapia genica de B7.1 y B7.2 ha mostrado ser muy prometedora en el area de la inmunoterapia contra el cancer.
Hasta ahora, CD28, CTLA-4, B7.1 y B7.2 estan implicadas en una ruta coestimuladora de celulas T individual. Dada
la capacidad de modulacion de una respuesta inmunitaria regulando la coestimulaciOn de celulas T, seria deseable identificar otros miembros de la misma ruta coestimuladora de celulas T o separada que puedan tener propiedades ventajosas en la regulaciOn de la respuesta inmunitaria y fund& de celulas T del huesped.
Por consiguiente, es un objeto de la invencion proporcionar polipeptidos novedosos para la estimulaciOn de la actividad y/o proliferacion de celulas T. Es un objeto adicional de la invenciOn usar los polipeptidos novedosos para la prevenciOn y el tratamiento de trastornos inmunitarios mediados por celulas T.
Sumario de la invencion
Sorprendentemente, se han identificado dos polipeptidos novedosos de una ruta coestimuladora de celulas T. Los polipeptidos representan una pareja de ligando-receptor en una ruta coestimuladora (mica que parece ser distinta de la ruta que consiste en las proteinas previamente descritas CD28, CTLA-4, B7.1 y B7.2. Los polipeptidos se denominan proteina 1 relacionada con CD28, o CRP1, y proteina 1 relacionada con B7, o B7RP1.
La invencion proporciona moleculas de acido nucleic° que codifican para polipeptidos B7RP1 y polipeptidos relacionados.
El contenido de la invencion tambien se refiere a polipeptidos B7RP1 y polipeptidos relacionados.
La invencion se define mediante las reivindicaciones.
Se abarcan por la invencion vectores de expresiOn y celulas huesped para la producci6n de los polipeptidos, anticuerpos que se unen a polipeptidos B7RP1 y a polipeptidos relacionados y ensayos para detectar la union de B7RP1 y polipeptidos relacionados con B7RP1 a CRP1 y polipeptidos relacionados con CRP1. Tambien se abarcan por la invencion composiciones farmaceuticas que comprenden B7RP1 o polipeptidos relacionados con B7RP1. Tambien se proporcionan metodos para identificar compuestos que interaccionan con B7RP1 asi como ensayos
para determinar si tales compuestos son agonistas o antagonistas de la actividad de B7RP1.
Los polipeptidos CRP1 y B7RP1 estan implicados en la coestimulacion y proliferacion de celulas T. Los polipeptidos CRP1 y B7RP1, agentes de union selectiva de los mismos y agonistas y antagonistas de los mismos, pueden ser utiles para el diagn6stico, la prevencion y el tratamiento de enfermedades relacionadas con el control de respuestas de celulas T.
Los polipeptidos CRP1 y B7RP1, agentes de uni6n selectiva de los mismos y agonistas y antagonistas de los mismos, pueden ser Utiles para el diagn6stico, la prevencion y el tratamiento de trastornos inmunitarios, para o bien estimular una respuesta inmunitaria insuficiente o bien reducir o inhibir una respuesta inmunitaria exagerada o inapropiada. El trastorno inmunitario puede estar mediado directa o indirectamente por celulas T.
La invencion proporciona el tratamiento, la prevencion o la mejora de un trastorno mediado por celulas T que
comprende administrar a un animal un polipeptido B7RP1. La invencion tambien proporciona un metodo de diagnostic° de un trastorno mediado por celulas T o una susceptibilidad a un trastorno mediado por celulas T en un animal que comprende determinar la presencia o cantidad de expresi6n de un polipeptido B7RP1; y diagnosticar un trastorno mediado por celulas T o una susceptibilidad a un trastorno mediado por colulas T basandose en la presencia o cantidad de expresiOn del polipeptido. Normalmente, un trastorno mediado por celulas T es un trastorno
inmunitario que puede estar mediado directa o indirectamente por celulas T. El animal es preferiblemente un mamifero y mas preferiblemente un ser humano. La invencion tambien proporciona un metodo de identificaciOn de una molecula de prueba que se une a un polipeptido B7RP1 que comprende poner en contacto el polipeptido con un compuesto de prueba y determinar el grado de union del polipeptido al compuesto de prueba. El metodo puede usarse para identificar agonistas y antagonistas del polipeptido CRP1 y/o B7RP1.
Pueden usarse antagonistas de polipeptidos CRP1 y/o B7RP1 como agentes inmunosupresores para muchas indicaciones, incluyendo trastornos autoinmunitarios (tales como artritis reumatoide, psoriasis, esclerosis multiple, diabetes y lupus eritematoso sisternico), sindrome de choque toxic°, trasplante de medula 6sea y organos, enfermedad inflamatoria del intestino, alosensibilizacion debida a transfusiones de sangre y el tratamiento de enfermedad de injerto contra huesped. Ademas, pueden usarse antagonistas como agentes inhibidores para
indicaciones mediadas por celulas B dependientes de celulas T incluyendo asma y alergia, y autoinmunidad mediada por anticuerpos. Agonistas de los polipeptidos CRP1 y/o B7RP1 pueden ser utiles en, pero sin restringirse a, la activaciOn de celulas T para la vigilancia y eliminacion de tumores.
Un antagonista de la presente descripci6n incluye un anticuerpo, o fragmento del mismo, que es reactivo con o se une a B7RP1 o a un dominio extracelular de B7RP1 en el que el anticuerpo reduce o elimina la uni6n de B7RP1 a
CRP1. En un aspect°, el anticuerpo se une selectivamente a B7RP1 humano o a un donninio extracelular del mismo. El anticuerpo o fragmento del mismo que es un antagonista inhibe parcial o completamente la actividad coestimuladora inmunitaria de B7RP1. En un aspect° preferido, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal y puede ser murino, humano, quimerico o humanizado.
Se da a conocer ademas en el presente documento un metodo de regulacion de la interacci6n de B7RP1 con CRP1
que comprende administrar a un animal un agente de uni6n selectiva de CRP1 o un agente de union selectiva de B7RP1 o ambos. En un aspecto, el agente de uni6n selectiva es un anticuerpo que se une a B7RP1 y reduce o elimina la uni6n de B7RP1 a CRP1.
Tambien se da a conocer en el presente documento un metodo de regulacion de la coestimulacion inmunitaria mediada por B7RP1 que comprende administrar a un animal un agente de uni6n selectiva de B7RP1. El agente de union selectiva es preferiblemente un anticuerpo que se une a B7RP1 e inhibe parcial o completamente la coestimulaciOn inmunitaria mediada por B7RP1.
La invenciOn tambien proporciona un metodo de regulacion de la activacion o proliferaciOn de celulas T en un animal que comprende administrar al animal una molecula de acido nucleico que codifica para un polipeptido B7RP1. Por ejemplo, puede usarse una molecula de acid° nucleico que codifica para un polipeptido B7RP1 en terapia genica para potenciar la activaciOn de celulas T en respuesta a diversos tumores.
Tambien se abarca por la invenciOn un mamifero no humano transgenico que comprende una molecula de acido
nucleico que codifica para un polipeptido B7RP1. Se introducen los acidos nucleicos de B7RP1 en el mamifero de una manera que permite la expresi6n y niveles en circulacion aumentados de polipeptidos B7RP1. El mamifero no humano transgenico es preferiblemente un roedor, y mas preferiblemente un raton o una rata.
Descripcion de las figuras
Figura 1. A) Secuencia de aminoacidos y ADN de CRP1 murino (mCRP1). La secuencia senal predicha de CRP1 este subrayada en el extremo amino-terminal y el sitio de escision de pro-peptido determinado experimentalmente este indicado mediante un asterisco. La secuencia transmembrana predicha este subrayada hacia el extremo carboxilo terminal. B) Alineacion de aminoacidos de la secuencia de proteina CRP1 murina (mCRP1) con CD28
murina (mCD28).
Figura 2. A) Secuencia de aminoacidos y ADN de B7RP1 murino (mB7RP1). La secuencia serial predicha de B7RP1 este subrayada en el extremo amino-terminal y el sitio de escision de pro-peptido determinado experimentalmente este indicado mediante un asterisco. La secuencia transmembrana predicha este subrayada hacia el extremo carboxilo terminal. B) Alineacion de anninoacidos de la secuencia de proteina B7RP1 (mB7RP1) con CD80 murina (mCD80).
Figura 3. A) Estructura y secuencia de la region que codifica para proteina de la B7RP1 humana supuesta (hB7RP1). La secuencia sena' predicha de hB7RP1 este subrayada en el extremo amino-terminal. Los sitios de escision de peptido serial predichos estan marcados mediante asteriscos. La secuencia transmembrana predicha
este subrayada hacia el extremo carboxilo terminal. B) Alineacion de aminoacidos de la proteina hB7RP1 madura supuesta con la proteina B7RP1 murina (mB7RP1) madura.
Figura 4. A) ExpresiOn de la proteina de fusi6n CRP1-Fc soluble a partir de celulas 293T transfectadas con el pcDNA3/CRP1-Fc. Se cargaron volumenes normalizados de lisado celular o medio condicionado y se separaron en un gel PAGE al 10% tal como se indica. Analisis de tipo Western de lisado celular y sobrenadante de medios
celulares para determinar la expresi6n de proteinas de fusi6n de Fc asociadas a celulas (lisado celular) y secretadas (medios). El anticuerpo primario era anticuerpo de cabra anti-Fc humano (Pierce Chemical Company, Rockford, IL).
B) Expresion de la proteina de fusion B7RP1-Fc soluble a partir de celulas 293T transfectadas con el pcDNA3/B7RP1-Fc. Se cargaron 20 ill de lisado celular normalizado o sobrenadante de medios y se separaron en un gel PAGE al 10%. Se realizo el analisis de tipo Western como en (A).
Figura 5. InteracciOn de las proteinas de fusion CRP1-Fc y B7RP1-Fc con proteinas unidas a la membrana expresadas en celulas COS-7. Ululas COS-7 transfectadas de manera transitoria con vector pcDNA3/CRP1, pcDNA3/B7RP1 o pcDNA3 solo. Se transfectaron celulas CHO D con psDRodhCD28 y CD28 humana (hCD28) expresada de manera estable. Se representan celulas que expresan CRP1, B7RP1 o hCD28 unidas a la membrana en files tal como se indica en el lado izquierdo del panel. Se incubaron proteinas de fusion de Fc con las celulas unidas a places en columnas tal como se indica en la parte superior del panel. Tras la incubacion, se lavaron las celulas y se detectaron las proteinas de fusion de Fc unidas usando un anticuerpo anti-Fc humano y analisis ACAS
(analisis y clasificaciOn de celulas adherentes, quot;Adherent Cell Analysis and Sortingquot;; ACAS Ultima, Meridian Instruments, Inc., Okemos, MI).
Figura 6. Analisis de FAGS (clasificacion celular activada por fiuorescencia, quot;Fluorescence-ActivatedCell Sodende la expresion del receptor para B7RP1 (supuestamente, CRP1) en celulas T CD4+ y CD8+ activadas. Se activaron esplenocitos de rat& con PMA y ionomicina durante 12 horas. Se incubaron la proteina de fusion B7RP1-Fc,
proteina Fc control (simulado-Fc) o PBS (sin tinciOn) con las celulas, se lavaron y posteriormente se incubaron con anticuerpo de cabra anti-Fc humano conjugado con FITC (GaHuFc-FITC) tal como se indica en la parte inferior de cada panel. Se ariadieron anticuerpos frente a marcadores celulares (para los marcadores de celulas T CD4 y CD8) conjugados con PE, o anticuerpo control de isotipo (isotipo de rata) conjugado con PE, o PBS (sin tincion) tal
como se indica en el lado izquierdo de cada panel individual.
Figura 7. Analisis de FAGS (clasificaciOn celular activada por fiuorescencia) de la expresiOn de B7RP1 en celulas B. Analisis fluorocitometrico de la expresion del ligando para CRP1 (presumiblemente, B7RP1) en esplenocitos de ratan. Se incubaron la proteina de fusion CRP1-Fc, proteina Fc control (simulado-Fc) o PBS (sin tincion) con las
celulas, se lavaron y posteriormente se incubaron con anticuerpo de cabra anti-Fc humano conjugado con FITC (GaHuFc-FITC) tal como se indica en la parte inferior de cada panel. Se afiadieron anticuerpo frente a marcador celular conjugado con PE para CD45R (CD45R es un marcador de celulas B) o anticuerpo control de isotipo (isotipo de rata), o PBS (sin tincion), tal
como se indica en el lado izquierdo de cada panel individual.
Figura 8. Ana!Isis de FACS de la expresion de ligando de mCRP1 en macr6fagos peritoneales. Se distinguieron en primer lugar las celulas peritoneales en subconjuntos en el nivel inferior de sus propiedades de dispersion de luz (panel A). Se identificaron macrofagos en la region 5 (R5) debido a su capacidad para dispersar fuertemente la luz hacia delante (FSC) y hacia los lados (SSC) y debido a su Union positive para el antigen° F4/80, un marcador para macrofagos (panel B). Se individualizaron macrofagos en la region 6 (R6) basandose en su find& menos intensa para el antigeno F4180 y se encontr6 que se teriian mediante la proteina de fusi6n CRP1-Fc (presumiblemente
debido a su expresi6n de B7RP1).
Figura 9. Inhibicion de la proliferaciOn de celulas T usando una proteina de fusiOn B7RP1-Fc. Se activaron celulas T a partir de esplenocitos de ratify' aumentando las concentraciones de conconavalina A (Con A) tal como se indica en la parte inferior del grafico. Se ariadieron las proteinas de fusi6n CRP1-Fc, mB7RP1 y B7.2-Fc a celulas T enriquecidas a partir de esplenocitos en ausencia (sin adiciones) o presencia de Con A. Se usaron 200.000 celulas
enlos ensayos de proliferacion de celulas T en una placa de 96 pocillos. Se incubaron las celulas con medios (sin adiciones) o proteinas de fusi6n de Fc tal como se indica en la leyenda del grafico. Tras 42 h, se pulsaron las celulas con H-timidina durante 6 h, entonces se recogieron y se determino la radioactividad incorporada. Se representan las CPM promedio y la desviaciOn estandar de muestras por triplicado.
Figura 10. A) Ganglio linfatico mesenteric° normal del ratan control n.° 10 que muestra la corteza, paracorteza y
medula del ganglio. Tinci6n con hematoxilina-eosina (H&E), 40x aumentos. B) Ganglio linfatico mesenteric° notablemente agrandado del rat& VVX11 n.° 40 con hiperplasia folicular prominente (FH), expansion de la paracorteza e hiperplasia de los cordones medulares (MH). H&E, 40x. C) Primer piano de los cordones (MC) y senos (MS) medulares del ganglio linfatico mesenteric° del rat6n control n.° 10. Observense los cordones medulares pequetios compuestos por linfocitos principalmente pequerios adyacentes a senos medulares con macr6fagos
dilatados. H&E, 400x. D. Primer piano de los cordones (MC) y senos (MS) medulares del ganglio linfatico mesenteric° del rat6n VVX11 n.° 40. Observense los cordones medulares notablemente engrosados compuestos por grandes numeros de celulas plasmaticas con celulas de cuerpos de Russell ocasionales (flecha). H&E, 400x. E) Bazo normal del raton control n.° 10 que muestra las areas de pulpa roja y pulpa blanca con vainas linfoides periarteriolares (PALS), 100x. Recuadro: primer piano de la zona marginal que rodea a la pulpa blanca con linfocitos
pequetios, macr6fagos y celulas plasmaticas ocasionales, 400x. F) Bazo del rat6n M11 n.° 6 con areas de pulpa blanca agrandadas, incluyendo PALS y foliculos (flecha), 100x. Recuadro: primer piano de la zona marginal con numerosas celulas plasmaticas y cuerpos de Russell ocasionales, 400x. G) ileo con parche de Peyer del rat6n control n.° 25 con la zona interfolicular (flecha) flanqueada por dos foliculos secundarios, 40x. H) ileo con parche de Peyer del raton WX11 n.° 32 con foliculos notablemente agrandados con centros germinales prominentes y tejido
interfolicular (flecha), 40x.
Figura 11. A) Ganglio linfatico mesenteric° normal del rat6n control n.° 5 que muestra la corteza, paracorteza y medula del ganglio. Tincion con hematoxilina-eosina (H&E), 40x aumentos. B) Ganglio linfatico mesenteric° notablemente agrandado del rat& WX11 n.° 33 con hiperplasia folicular prominente (parte superior: filas de foliculos secundarios en la corteza externa), expansi6n de la paracorteza (centro) e hiperplasia de los cordones medulares (parte inferior). H&E, 40x. C) Tinci6n inmunohistoquimica del ganglio linfatico mesenteric° del rat6n control n.° 10 con anticuerpo anti-B220 (marcador de celulas B). Observese el area cortical de find& intensa (marr6n) y los cordones medulares delgados. InmunotinciOn realizada usando el metodo de complejo de avidina-biotina (ABC)inmunoperoxidasa (cronnogeno DAB, contratinciOn con hematoxilina), 40x. D) Tincion inmunohistoquimica del ganglio linfatico mesenteric° del rat6n WX11 n.° 33 con anticuerpo anti-B220. Observense los cordones medulares y
foliculos corticales de tincion intensa (aunque las celulas plasmaticas maduras en los cordones son negativas para B220), 40x. E) Tinci6n inmunohistoquimica del ganglio linfatico del rat6n control n.° 10 con anticuerpo anti-CD3 (marcador de celulas T). Observese la inmunotinci6n de la zona paracortical del ganglio, 40x. F) Tinci6n inmunohistoquimica del ganglio linfatico del rat& VVX11 n.° 33 con anticuerpo anti-CD3. Observense las areas paracorticales de tinciOn intensa, agrandadas del ganglio, 40x.
Figura 12. A) Estructura y secuencia de la region que codifica para proteina de B7RP1 humana (hB7RP1). La secuencia serial predicha de hB7RP1 esta subrayada en el extremo amino-terminal. Los sitios de escision de peptido serial predichos estan marcados mediante asteriscos. La secuencia transmembrana predicha esta
subrayada hacia el extremo carboxilo terminal. B) AlineaciOn de aminoacidos de la proteina hB7RP1 madura supuesta con la proteina B7RP1 murina (mB7RP1) madura.
Figura 13. A) Estructura y secuencia de la region que codifica para proteina de CRP1 humana (hCRP1). La secuencia serial predicha de hCRP1 esta subrayada en el extremo amino-terminal. Los sitios de escision de peptido serial predichos estan marcados mediante asteriscos. La secuencia transmembrana predicha esta subrayada hacia el extremo carboxilo terminal. B) AlineaciOn de aminoacidos de la proteina hCRP1 con la proteina CRP1 murina (mB7RP1).
Figura 14. CRP-1 esta en celulas T de memoria en reposo. Se tirieron doblemente esplenocitos en reposo de ratones de 6-7 meses de edad usando B7RP-1-Fc marcada mediante un anticuerpo anti-Fc humano conjugado con FITC y un anticuerpo conjugado con PE frente a cualquiera de CD44 (figura 14A), CD45RB (figura 14B) o CD69 (figura 14C).
Figura 15. CoestimulaciOn de celulas T mediante la proteina de fusi6n B7RP-1-Fc. A) Proliferacion de celulas T inducida por diferentes cantidades de B7RP-1-Fc (cuadrados negros), B7.2-Fc (circulos negros) o control de proteina de fusion OPG-Fc (cuadrados blancos) conjuntamente con anticuerpo anti-CD3. Se usaron proteinas de fusi6n a diversas concentraciones para recubrir placas de 96 pocillos recubiertas previamente con FAb2 anti-Fc humano (12,5 ,g/m1) y anticuerpo anti-CD3 (0,9 pg/ml). B7RP-1-Fc y B7.2-Fc coestimulan celulas T de un modo dependiente de la dosis hasta 0,3 pg/ml, a la que se logra el efecto maxim°. B) Proliferacion de celulas T inducida por B7RP-1-Fc (cuadrados negros), B7.2-Fc (circulos negros), Fc no fusionado (cuadrados blancos) o sin Fc (circulos blancos) conjuntamente con un anticuerpo anti-CD3 (0,85 lg/m1) y en presencia de diversas
concentraciones de un anticuerpo policlonal de conejo anti-B7RP-1-Fc. Se usaron proteinas de fusion de Fc a una concentraci6n de 0,3 jig/m1 y se unieron a las placas como anteriormente. Se gener6 el anticuerpo anti-B7RP-1-Fc para purificar B7RP-1-Fc mediante inyecciones subcutaneas de antigen° emulsionado en adyuvante, y luego se
purifico por afinidad. Se incubaron los anticuerpos durante 30 min. con las proteinas de fusion de Fc antes de la adiciOn de las celulas. El anticuerpo anti-B7RP-1-Fc inhibe especificamente la proliferacion de celulas T inducida por B7RP-1-Fc de un modo dependiente de la dosis.
Figura 16. Efecto de las proteinas CRP-1-Fc y B7RP-1-Fc sobre la incidencia (A) y la gravedad (B) de la artritis inducida por colageno en ratones. Se inmunizaron ratones B10.R111 susceptibles a artritis inducida por colageno en la base de la cola con 10 jig de colageno porcino tipo II en CFA. Los ratones recibieron 100 jig de proteina de fusion
dos veces a la semana. El tratamiento con PBS control y proteinas de fusi6n de Fc se indica en la leyenda de la fig ura.
Figura 17. Colon proximal en ratones transgenicos para B7RP-1-Fc. (A) Colon proximal normal del raton control n.° 53F (hembra) que muestra la pared del intestino con la mucosa, submucosa, capa muscular de la mucosa y serosa. TinciOn con hematoxilina-eosina (H&E), 40x aumentos. (B) Colon proximal engrosado de manera difusa del rat6n transgenico para B7RP-1-Fc n.° 111F con hipertrofia glandular prominente, ulceracion por agrietamiento e infiamacion transparietal. H&E, 40x. (C) Vista a menos aumentos del colon proximal (como en el panel B) del ratan transgenico para B7RP-1-Fc n.° 111F con ulceracion por agrietamiento multifocal e infiamacion transparietal. H&E, 20x. (D) Primer piano de la Olcera por agrietamiento y las glandulas colonicas hipertroficas del ratan transgenico para B7RP-1-Fc n.° 111F (mostrado en los paneles B y C anteriores). Observese la luz con exudado mucopurulento.
H&E, 100x. (E) Primer piano de la inflamacion granulomatosa en la submucosa del rat& transgenico para B7RP-1- Fc n.° 112F con una colula gigante multinucleada rodeada por macrofagos, linfocitos y menos neutrofilos. H&E, 400x. (F) Primer piano de la infiamacion granulomatosa en la mucosa del rat6n transgenico para B7RP-1-Fc n.° 112F con macrofagos epitelioides mezclados con linfocitos, celulas plasmaticas y menos neutrofilos subyacentes a las glandulas mucosas. H&E, 400x.
Figura 18. Colon distal en ratones transgenicos para B7RP-1-Fc. (A) Colon distal normal del rat& control n.° 53F (hembra) que muestra las capas de la pared del intestino con la mucosa, submucosa, capa muscular de la mucosa y serosa. Tinci6n con hematoxilina-eosina (H&E), 40x aumentos. (B) Colon distal engrosado de manera difusa del ratOn transgenico para B7RP-1-Fc n.° 111F (hembra) con hiperplasia e hipertrofia glandular prominente y abscesos cripticos dispersados. H&E, 40x. (C) Colon distal engrosado de manera difusa del raton transgenico para B7RP-1-Fc
n.° 55M (macho) con hiperplasia e hipertrofia glandular prominente. H&E, 40x. (D) Colon distal engrosado de manera difusa del ratOn transgenico para B7RP-1-Fc n.° 112F (hembra) con glandulas colonicas hipertroficas, agregados linfoides focales y muchos abscesos cripticos. H&E, 40x. (E) Tincion inmunohistoquimica del colon distal del rat6n transgenico para B7RP-1-Fc n.° 112F con anticuerpo anti-CD3 (marcador de celulas T). Observese la inmunotincion de la mucosa superficial y el parche linfoide colonic°. H&E, 40x. (F) Primer piano de la mucosa colonica del ratan
transgenico para B7RP-1-Fc n.° 112F con un absceso criptico (fiecha) y agregado linfoide compuesto por celulas B B220+ (recuadro). H&E, 100x.
Figura 19. Intestino delgado en ratones transgenicos para B7RP-1-Fc. (A) Duodeno normal del rat& control n.° 53F (hembra) que muestra la luz, las vellosidades y las criptas de la mucosa y submucosa subyacente, la capa muscular de la mucosa y la serosa. Tinci6n con hematoxilina-eosina (H&E), 40x aumentos. (B) Duodeno engrosado de manera difusa del raton transgenico para B7RP-1-Fc n.° 51F (hembra) con hiperplasia e hipertrofia de las criptas prominente e infiltrado linfoplasmacitico leve en la lamina propia. H&E, 40x. (C) Yeyuno normal del rat6n control n.° 53F (hembra) que muestra la longitud normal de las vellosidades y las criptas en la mucosa del yeyuno. H&E, 40x aumentos. (D) Mucosa del yeyuno notablemente engrosada del ratan transgenico para B7RP-1-Fc n.° 51F (hembra) con hiperplasia e hipertrofia de las criptas localmente extensa. H&E, 40x. (E) ileo normal del ratan control n.° 53F (hembra) que muestra la longitud normal de las vellosidades y las criptas en la mucosa del ileo. H&E, 40x aumentos.
(F) Atrofia lave de la mucosa del ileo del raton transgenico para B7RP-1-Fc n.° 231M (macho) con perdida focal y aplanamiento de las vellosidades. H&E, 40x.
Figura 20. La proteina de fusi6n B7RP-1-Fc inhibe el crecimiento tumoral en ratones. Se implantaron por via intradermica celulas de sarcoma Meth A en el abdomen de ratones Balb/C. En los dias 7, 10, 14 y 17, tras la
implantaciOn, se trataron los ratones con vehiculo (rombos oscuros) o B7RP-1-Fc murina (triangulos grises, ejemplo 7). Se midio el volumen tumoral, tal como se describe en el ejemplo 20, en los dias indicados tras la implantaciOn. Se monitorizo el crecimiento tumoral hasta el dia 28. Cada grupo tenia ocho ratones.
Figura 21. Coestimulacion de celulas T mediante B7RP-1-Fc humana. Se usaron anticuerpo anti-CD3 y B7RP-1-Fc humana para recubrir placas de 96 pocillos, y se cultivaron 1 x 105 celulas T/pocillo (gt;98% CD3+) y se recogieron tal como se describe en el ejemplo 21. A) Coestimulacion inducida por anticuerpo anti-CD3 sOlo (circulos negros), B7RP-1-Fc 0,5 jig/m1 (triangulos negros), OPG-Fc 0,5 prg/m1 (circulos blancos) y anticuerpo anti-CD28 5 jig/m1 (triangulos blancos) a diferentes concentraciones de estimulacion primaria con anticuerpo anti-CD3. Los datos muestran que B7RP-1-Fc coestimulaba celulas T sensibilizadas con anticuerpo anti-CD3 a niveles similares que la coestimulacion usando anticuerpos anti-CD28. Los datos mostrados son [H]l-dR media incorporada +/-DE en pocillos por triplicado a partir de un experimento representativo de varios experimentos generados con celulas T aisladas de tres donantes normales. B) Inhibicion dependiente de la dosis de la coestimulaciOn de B7RP-1-Fc por
CRP-1-Fc. Se cultivaron celulas T en pocillos recubiertos con tanto anticuerpo anti-CD3 a 0,3 ug/m1 como B7RP-1- Fc 0,5 ug/ml. Se preincubaron concentraciones diluidas en serie de CRP-1-Fc (circulos negros) u OPG-Fc (circulos blancos) con la B7RP-1-Fc durante 30 min. antes de la adicion de celulas T. Los datos muestran que CRP-1-Fc inhibe la coestimulaciOn inducida por B7RP-1 de una manera dependiente de la dosis. Se representa graficamente el porcentaje de inhibici6n frente a la concentracion de proteina CRP-1-Fc u OPG-Fc. Los datos mostrados son [3H]TdR media incorporada +/-DE de tres experimentos realizados por triplicado y son representativos de experimentos generados con dos donantes normales. C) CoestimulaciOn por B7RP-1 de celulas CHO humanas. Se purificaron celulas T de sangre periferica y se cultivaron con diversas concentraciones de anticuerpo anti-CD3 en presencia de anticuerpo anti-CD3 solo (circulos negros), 1 x 104 celulas control de vector CHO (circulos blancos) o 1x i0 celulas CHO B7RP-1 (triangulos negros), tal como se describe en el ejemplo 22. Los datos muestran que B7RP-1 unida a la membrana coestimulaba el crecimiento de celulas T en un nivel similar al observado usando proteinas de fusi6n B7RP-1-Fc. Los datos mostrados son la media +/-DE de cultivos por triplicado y son representativos de resultados generados con dos donantes normales. D) ProducciOn de citocinas. Se cultivaron celulas T tal como se describe en (figura 21A) y se recogieron sobrenadantes a las 48 (barras negras) y 72 (barras
grises) h. Los datos muestran que la cantidad de IL-2 producida por celulas coestimuladas por B7RP-1-Fc (grafico superior) era similar a la producida por celulas estimuladas por anticuerpo anti-CD3 y Fc control, pero significativamente inferior a la producida por celulas coestimuladas por anticuerpo anti-CD28. Los datos tambien muestran que la coestimulacion por B7RP-1-Fc potenciaba la produccion de IL-10 (grafico del medio) e IFN-gamma (grafico inferior).
Descripcion detallada de la invencion
La invencion se refiere a polipeptidos novedosos denominados en el presente documento CRP1 y B7RP1, que comprenden una pareja de receptor-ligando que esta implicada en la activacion de celulas T. Se identificaron ADNc que codifican para los polipeptidos a partir de una biblioteca preparada a partir de celulas intraepiteliales de intestino de rat6n y se examinaron basandose en la homologia frente a los polipeptidos CD28 y CTLA-4 (para CRP1) o los
polipeptidos B7.1 y B7.2 (para B7RP1).
Se predice que la proteina 1 relacionada con CD28, o CRP1, es una proteina transmembrana de tipo I con una secuencia serial y un dominio extracelular en el extremo amino-terminal, un dominio transmembrana y un dominio intracelular carboxilo-terminal (figura 1). La proteina CRP1 de longitud completa tiene 180 aminoacidos en su forma madura. La secuencia lider predicha se extiende aproximadamente por los residuos de aminoacido 1-20 (en relacion conla metionina de iniciaci6n) y el dominio extracelular de la proteina madura abarca aproximadamente los residuos 21-145 (ejemplo 1). El dominio transmembrana predicho se extiende aproximadamente por los residuos 146-163 y el dominio intracelular abarca aproximadamente los residuos 164-200. El dominio extracelular amino-terminal es similar a un bucle de Ig con cisteinas de union intra e intermolecular supuestas conservadas. Adernas, un motivo quot;MYPPPYquot;, que se sabia previamente que era importante para la uniOn de B7.1 y B7.2 a CD28 y CTLA-4, tambien
esta parcialmente conservado.
CD28 y CTLA-4 son debilmente homOlogas tal como se muestra a modo de ejemplo por la identidad de aminoacidos del 26% entre CD28 y CTLA-4 murinas. Hay una identidad de aminoacidos del 19% de CRP1 con CO28 murina y una identidad del 14% de CRP1 con CTLA-4 murina. Sin embargo, se conservan residuos de cisteina criticos entre CD28, CTLA-4 y CRP1 murinas en los residuos 42, 63, 83, 109 y 137 (en relacion con la metionina de iniciacion en la proteina CRP1, %/ease la figura 1A). Las longitudes de la proteina madura aproximadas y las ubicaciones de la regi6n transmembrana en relacion con el extremo carboxilo-terminal son tambien similares en CRP1, CO28 y CTLA
4.
CRP1 humana es una proteina transmembrana que tiene la secuencia de aminoacidos y nucleotidos mostrada en la figura 13A. La secuencia lider predicha se extiende por aproximadamente los residuos 1-19 o aproximadamente los residuos 1-20. El extremo amino-terminal maduro predicho esta en los residuos 20 6 21. Preferiblemente, el extremo amino-terminal maduro esta en la posicion 21. El dominio extracelular se extiende desde cualquiera de los extremos amino-terminales maduros predichos hasta aproximadamente el residuo de aminoacido 140, el dominio transmembrana se extiende por aproximadamente los residuos 141-161 y el dominio intracelular se extiende por aproximadamente los residuos 162-199. La proteina CRP1 humana tiene una identidad del 69% con la proteina
murina y las secuencias de nucleotidos correspondientes son identicas al 77%. Se notifico la secuencia de CRP1 humana en Hutloff etal.Nature 397, 263-266 (1999).
Se predice que la proteina 1 relacionada con B7, o B7RP1, es una proteina transmembrana de tipo I con una secuencia serial y un dominio extracelular en el extremo amino-terminal, un dominio transmembrana y un dominio intracelular carboxilo-terminal (figura 2A). La proteina B7RP1 de longitud completa tiene 276 aminoacidos en su forma madura. La secuencia lider predicha se extiende por aproximadamente los residuos de aminoacido 1-46 (en relacion con la metionina de iniciacion) y el dominio extracelular de la proteina madura abarca los residuos 47-279 (ejemplo 3). El dominio transmembrana predicho se extiende por los residuos 280-298 y el dominio intracelular
abarca los residuos 299-322. Similar a B7.1 y B7.2, el dominio extracelular de B7RP1 comprende dos bucles de lg.
B7.1 y B7.2 son debilmente hornologas tal como se muestra a modo de ejemplo por la identidad de aminoacidos del 24% entre B7.1 y B7.2 murinas. Hay una identidad de aminoacidos del 20% de B7RP1 con B7.1 murina y una
identidad del 19% de B7RP1 con B7.2 murina. Sin embargo, se conservan residuos de cisteina criticos entre B7.1, B7.2 y B7RP1 murinas en los residuos 62, 138, 185 y 242 (en relacion con la metionina de iniciaciOn en la proteina B7RP1, figura 2A). La longitud de la proteina madura aproximada y la ubicaci6n de la regi6n transmembrana en relacion con el extremo carboxilo-terminal son tambien similares en mB7RP1, B7.1 y B7.2.
B7RP1 humana es tambien una proteina transmembrana con residuos de cisteina conservados en el dominio extracelular que son necesarios para estructuras de bucle de lg. La secuencia lider predicha abarca aproximadamente los residuos 1-18, 1-19, 1-20, 1-21, 1-23 6 1-27 tal como se muestra en la figura 3A. El extremo amino-terminal maduro predicho puede estar en cualquiera de los residuos 19, 20, 21, 22, 24 6 28. Preferiblemente,
el extremo amino-terminal esta en la posicion 19. El dominio extracelular se extiende desde cualquiera de los
extremos amino-terminales maduros hasta aproximadamente el residuo de aminoacido 259. El dominio transmembrana predicho se extiende por aproximadamente los residuos 259-274. El dominio intracelular abarca los residuos 275-302. La secuencia de aminoacidos y nucleotidos de B7RP1 humana de longitud complete se muestra en la figura 12A. B7RP1 humana es identica aproximadamente al 43% a la proteina murina.
CRP1 y B7RP1 se unen entre si, pero CRP1 no se une de manera detectable a la proteina relacionada con B7RP1
B7.2; y B7RP1 no presenta uniOn detectable a CTLA-4 o CD28 relacionada con CRP1 (ejemplo 8). Se mostro que B7RP1 regula la proliferacion de celulas T, presumiblemente a trues de la interacci6n de B7RP1 con receptores de CRP1 (ejemplo 11). Por tanto, CRP1 y B7RP1 representan una ruta novedosa para regular la proliferacion y activaciOn de celulas T.
La interaccion de B7RP1 con CRP1 puede regularse de tal manera que la coestimulacion inmunitaria y la proliferacion y activacion de celulas T pueda aumentarse o disminuirse. A modo de ejemplo, anticuerpos monoclonales y policlonales anti-B7RP1 generados contra B7RP1 murina bloqueaban la interacci6n B7RP1/CRP1 y tambien bloqueaban la proliferaciOn de celulas T inducida por una proteina de fusi6n B7RP1-Fc (vease el ejemplo 17). Una proteina de fusi6n CRP-1-Fc humana bloqueaba la proliferacion de celulas T inducida por B7RP-1-Fc humana (ejemplo 21). Ademas, la adici6n de una proteina de fusion CRP1-Fc retrasaba la apariciOn de sintomas
artriticos en un modelo de ratan de artritis reumatoide (vease el ejemplo 18). La coestimulacion por B7RP-1/CRP-1 tambien puede aumentarse mediante la adiciOn de la proteina de fusi6n B7RP-1-Fc u otros activadores de esta ruta (ejemplo 20).
Molecules de acid° nucleico
El termino quot;molecule de acid° nucleico aisladaquot; se refiere a una molecule de acid° nucleico que esta libre de al menos una molecule de acido nucleico contaminante con la que esta asociada de manera natural, y de manera preferible sustancialmente libre de cualquier otra molecule de acid° nucleico de mamifero contaminante.
El termino quot;veriente alelicaquot; se refiere a una de varies posibles formas alternatives que se producen de manera natural de un gen que ocupa un locus dado en un cromosoma de un organismo.
El termino quot;variante de corte y empalmequot; se refiere a una molecule de acid° nucleico, habitualmente ARN, que se genera mediante el procesamiento alternativo de secuencias de intrones en un transcrito de ARN.
El termino quot;condiciones de alta rigurosidadquot; se refiere a las condiciones que: (1) emplean baja fuerza ionica y alta temperatura para laver, por ejemplo, 0,1 X SSC (NaCI 0,015 M/citrato de sodio 0,0015 M), NaDodSO4 al 0,1% (SDS) a 50°C o (2) emplean durante la hibridaci6n un agente desnaturalizante tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (vol/vol) con all:A:nine serica bovine al 0,1%/Ficoll al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampon fosfato de sodio
50 mM a pH 6,5 con 5 X SSC (NaCI 750 mM, citrato de sodio 75 mM) a 42°C. Otro ejemplo de condiciones de alta rigurosidad es formamida al 50%, 5 x SSC, fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sodio al 0,1%, 5 x solucion de Denhardt, ADN de esperma de salmOn sonicado (501.1g/m1), SDS al 0,1% y sulfato de dextrano al 10% a 42°C, con lavados a 42°C en 0,2 x SSC y SOS al 0,1%.
El termino quot;condiciones de rigurosidad moderadasquot; se refiere a las condiciones que incluyen el uso de una disoluciOn
de lavado y condiciones de hibridacion (por ejemplo, temperatura y fuerza ionica) menos rigurosas que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas son condiciones tales como incubacion durante la noche a 37°C en una disolucion que comprende: formamida al 20%, 5 x SSC, fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5 x solucion de Denhardt, sulfato de dextrano al 10% y ADN de esperma de salmon fragmentado
desnaturalizado 20 pl/ml, seguido por lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50°C. El expert° en la tecnica reconocera corm ajustar la temperatura, fuerza ionica y otros parametros segun sea necesario para adaptarse a factores tales como longitud de sonda y similares.
Se exponen metodos de tecnologia de ADN recombinante en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)) y/o Ausubel et al. , eds., (Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. y Wiley and Sons, NY (1994)).
Lainvencion proporciona molecules de acido nucleico aisladas que codifican para polipeptidos B7RP1. Tambien se proporcionan molecules de acid° nucleico que son fragmentos, variantes alelicas, variantes de corte y empalme o son complementarias en secuencia a molecules que codifican para polipeptidos B7RP1. Tambien se dan a conocer
molecules de acid° nucleico que son identicas al menos aproximadamente al 70% a molecules que codifican para CRP1 o B7RP1 o que se hibridan con molecules que codifican para CRP1 o B7RP1 en condiciones de rigurosidad moderada o alta. Las molecules de acid° nucleico pueden ser ADNc, ADN genornico, ARN o una molecule de acid° nucleico parcial o totalmente sintetica. En aspectos preferidos, las molecules de acid° nucleico de la presente
descripcion son identicas al menos aproximadamente al 75%, al 80%, al 85%, al 90% o al 95% a molecules de acid° nucleico que codifican para CRP1 o B7RP1.
Puede obtenerse un gen o ADNc que codifica para un polipeptido CRP1 o B7RP1 o fragmento del mismo, por ejemplo, mediante examen por hibridacion o amplificaciOn por PCR de una biblioteca de ADNc o genomica. Pueden generarse sondas o cebadores Utiles para examinar la biblioteca basandose en la informaci6n de secuencia para otros genes o fragmentos de genes conocidos de la misma familia de genes o una familia relacionada, por ejemplo, motivos conservados encontrados en polipeptidos relacionados con CRP1 o B7RP1 tales como una serie conservada de residuos de cisteina. Ademas, cuando se ha identificado un gen que codifica para un polipeptido CRP1 o B7RP1 de una especie, puede usarse todo o una parte de ese gen como sonda para identificar genes homOlogos de otra especie. Las sondas o los cebadores pueden usarse para examinar bibliotecas de ADNc de
diversas fuentes de tejido que se cree que expresan el gen de CRP1 o B7RP1.
Cuando se usan sondas oligonucleotidicas para examinar bibliotecas de ADNc o genomicas, puede usarse una de las siguientes dos disoluciones de alta rigurosidad. La primera de estas es 6 X SSC con pirofosfato de sodio al 0,05% a 35°C-62°C, dependiendo la temperatura de la longitud de la sonda oligonucleotidica. Por ejemplo, se lavan sondas de 14 pares de bases a 35-40°C, se lavan sondas de 17 pares de bases a 45-50°C, se lavan sondas de 20
pares de bases a 52-57°C y se lavan sondas de 23 pares de bases a 57-63°C. La temperatura puede aumentarse 2- 3°C cuando la union no especifica de fondo parezca alta. Una segunda disolucion de alta rigurosidad utilize cloruro de tetrametilamonio (TMAC) para laver sondas oligonucleotidicas. Una disolucion de lavado rigurosa es TMAC 3 M, Tris-HCI 50 mM, pH 8,0 y SDS al 0,2%. La temperatura de lavado usando esta disolucion es una funcion de la longitud de la sonda. Por ejemplo, una sonda de 17 pares de bases se lava a aproximadamente 45-50°C.
Otro medio para preparar un gen que codifica para un polipeptido CRP1 o B7RP1 o fragmento del mismo es emplear sintesis quimica usando metodos bien conocidos por el expert° en la tecnica tal coma los descritos por Engels etal. (Agnew. Chem. Intl. Ed., 28:716-734 (1989)). Estos metodos incluyen, entre otros, los metodos de fosfotriester, fosforamidita y H-fosfonato para la sintesis de acid° nucleico. Un metodo preferido pare tal sintesis quimica es sintesis soportada sobre polimero usando quimica de fosforamidita convencional. Normalmente, el ADN que codifica
para un polipeptido CRP1 o B7RP1 tendra varios cientos de nucleotidos de longitud. Pueden sintetizarse acidos nucleicos mayores de aproximadamente 100 nucleOtidos coma varios fragmentos usando estos metodos. Los fragmentos pueden ligarse entonces entre si para formar un polipeptido CRP1 o B7RP1 de longitud complete. Habitualmente, el fragmento de ADN que codifica para el extremo amino-terminal del polipeptido tendra un ATG, que codifica para un residuo de metionina. Esta metionina puede estar presente o no en la forma madura de un
polipeptido CRP1 o B7RP1, dependiendo de si el polipeptido producido en la celula huesped este disehado para secretarse a partir de esa celula.
Molecules de ecido nucleico de CRP1 o B7RP1, fragmentos y/o derivados que no codifican por si mismos pare polipeptidos que sean biologicamente activos pueden no obstante ser utiles coma sondas de hibridaci6n en ensayos de diagnostic° para someter a prueba, o bien cualitativamente o bien cuantitativamente, la presencia de ADN de
CRP1 o B7RP1 o ARN correspondiente en muestras de fluidos corporales o tejidos de mamiferos.
En algunos casos, puede ser deseable preparar variantes de acid° nucleico y/o aminoacidos de polipeptidos CRP1 o B7RP1 que se producen de manera natural. Pueden producirse variantes de acid° nucleico usando mutagenesis dirigida al sitio, amplificacion par PCR u otros metodos apropiados, cuando el/los cebador(es) tienen las mutaciones puntuales deseadas (vease Sambrook et al. , citado anteriormente, y Ausubel et al. , citado anteriormente, para
descripciones de tecnicas de mutagenesis). Tambien puede usarse sintesis quimica usando metodos descritos par Engels etal. ,citado anteriormente, para preparar tales variantes. Pueden usarse tambien otros metodos conocidos par el expert° en la tecnica.
Las variantes de acid° nucleico preferidas incluyen las que contienen codones que se han alterado para lograr una expresi6n Optima de polipeptidos CRP1 y B7RP1 en una celula huesped dada. Las alteraciones de codones particulares dependeran de la seleccion de proteina y celula huesped. Tal quot;optimizacion de codonesquot; puede Ilevarse a cabo, en un caso, seleccionando codones que se usan preferentemente en genes altamente expresados en una celula huesped dada. Pueden usarse algoritmos informaticos que incorporan tablas de frecuencias de codones tales coma quot;Ecohigh.Codquot; para la preferencia de codones de genes bacterianos altamente expresados y se proporcionan par el University of Wisconsin Package version 9.0, Genetics Computer Group, Madison, WI. Otras tablas de frecuencia de codones utiles incluyen quot;Celegans_high.codquot;, quot;Celeganslow.codquot;, quot;Drosophila_high.codquot;, quot;Human_high.codquot;, quot;Maize_high.codquot; y quot;Yeast_high.codquot;. Otras variantes preferidas son las que codifican para cambios de aminoacidos conservativos tal como se describe a continuacion (par ejemplo, en los que la carga o polaridad de la cadena lateral del aminoacido que se produce de manera natural no se altera sustancialmente par la sustitucion can un aminoacido diferente) en comparaci6n con el silvestre, y/o las disehadas para o bien generar un
sitio/sitios de glicosilacion y/o fosforilacion novedoso(s), o bien las disehadas para delecionar un sitio/sitios de glicosilacion y/o fosforilacion existente(s).
El gen, ADNc o fragmento del mismo que codifica para un polipeptido CRP1 o B7RP1 puede insertarse en un vector de expresiOn o amplificacion apropiado usando tecnicas de liganniento convencionales. El vector se selecciona normalmente para que sea funcional en la celula huesped particular empleada (es decir, el vector es compatible con la maquinaria de la celula huesped de manera que puede producirse la amplificacion del gen y/o la expresi6n del
gen). El gen, ADNc o fragmento del mismo que codifica para el polipeptido CRP1 o B7RP1 puede amplificarse/expresarse en celulas huesped procariotas, de levadura, de insecto (sistemas de baculovirus) y/o eucariotas. La seleccion de la celula huesped dependera en parte de si el polipeptido CRP1 o B7RP1 o fragmento del mismo va a glicosilarse y/o fosforilarse. Si es asi, son preferibles celulas huesped de levadura, de insecto o de mamifero.
Normalmente, los vectores de expresiOn usados en cualquiera de las °Mules huesped contendran secuencias para el mantenimiento de plasmidos y la clonacion y expresi6n de secuencias de nucleotidos insertadas. Tales secuencias, denominadas colectivamente quot;secuencias flanqueantesquot;, incluiran un promotor y otros elementos reguladores tales como un potenciador/potenciadores, un elemento de origen de replicacion, un elemento de terminacion de la transcripcion, una secuencia de intr.& complete que contiene un sitio de corte y empalme donador
yaceptor, una secuencia de peptido señal, un elemento de sitio de union al ribosoma, una secuencia de poliadenilacion, una regi6n de poliligador para inserter el acido nucleico que codifica para el polipeptido que ve a expresarse y un elemento de marcador seleccionable. Cada uno de estos elementos se comenta a continuaciOn. Opcionalmente, el vector puede contener una secuencia de quot;etiquetaquot;, es decir, una molecule de oligonucleOtido
ubicada en el extremo 5' o 3' de una secuencia que codifica para polipeptido CRP1 o B7RP1; la molecule de
oligonucleotido codifica para poliHis (tal como hexaHis), u otra quot;etiquetaquot; tal como FLAG, HA (hemaglutinina de virus influenza) o myc para la que existen anticuerpos disponibles comercialmente. Este etiqueta se fusiona normalmente al polipeptido tras la expresion del polipeptido, y puede servir como medio para la purificaci6n por afinidad de un polipeptido CRP1 o B7RP1 de la celula huesped. La purificacion por afinidad puede lograrse, por ejemplo, mediante cromatografia en columna usando anticuerpos contra la etiqueta como matriz de afinidad. Opcionalmente, la etiqueta puede eliminarse posteriormente de un polipeptido CRP1 o B7RP1 purificado por diversos medios tales como usando determinadas peptidasas.
La region Fc y bisagra de inmunoglobulina humana pueden fusionarse en el extremo o bien N-terminal o bien Cterminal de un polipeptido CRP1 o B7RP1 por un expert° en la tecnica. La proteina de fusi6n de Fc posterior puede purificarse mediante el uso de una columna de afinidad de proteina A. Se sabe que una regi6n Fc de
inmunoglobulina presenta una semivida farmacocinetica large in vivo y se ha encontrado que proteinas fusionadas a una region Fc presentan una semivida sustancialmente mayor in vivo en comparacion con el hornologo no fusionado. Ademas, la fusi6n a la regi6n Fc permite la dimerizacion y/o multimerizaciOn de la molecule que puede ser Otil para la bioactividad de algunas molecules.
La secuencia flanqueante puede ser hornologa (es decir, de la misma especie y/o cepa que la celula huesped),
heterologa (es decir, de una especie distinta de la especie o cepa de la celula huesped), hibrida (es decir, una combinaci6n de secuencias flanqueantes de mas de una fuente), sintetica o puede ser las secuencias flanqueantes de acido nucleico de CRP1 o B7RP1 natives. Como tal, la fuente de la secuencia flanqueante puede ser cualquier organismo procariota o euc,ariota unicelular, cualquier organismo vertebrado o invertebrado o cualquier planta, siempre que la secuencia flanqueante sea funcional en, y pueda activarse por, la maquinaria de la celula huesped.
Las secuencias flanqueantes utiles en los vectores de esta invencion pueden obtenerse mediante cualquier de varios nnetodos bien conocidos en la tecnica. Normalnnente, las secuencias flanqueantes utiles en el presente documento distintas de secuencias flanqueantes de acid° nucleico de CRP1 o B7RP1 se habran identificado previamente mediante mapeo y/o mediante digestion con endonucleasas de restricciOn y por tanto pueden aislarse de la fuente de tejido apropiada usando las endonucleasas de restriccion apropiadas. En algunos casos, puede
conocerse la secuencia de nucleotidos complete de la secuencia flanqueante. En este caso, puede sintetizarse la secuencia flanqueante usando los metodos descritos anteriormente para la sintesis o clonacion de acid° nucleico.
Cuando se conoce toda o solo una parte de la secuencia flanqueante, puede obtenerse usando PCR y/o examinando una biblioteca genomica con fragmentos de secuencias flanqueantes y/u oligonucleatidos adecuados de la misma u otra especie.
Cuando no se conoce la secuencia flanqueante, puede aislarse un fragmento de ADN que contiene una secuencia flanqueante de un trozo mayor de ADN que puede contener, por ejemplo, una secuencia codificante o incluso otro gen o genes. El aislamiento puede lograrse mediante digestion con endonucleasas de restriccion usando una o mas enzimas seleccionadas cuidadosamente para aislar el fragmento de ADN apropiado. Tras la digestion, puede aislarse el fragmento deseado mediante purificaciOn en gel de agarosa, columna Qiagene u otros metodos
conocidos por el expert° en la tecnica. La seleccion de enzimas adecuadas para lograr este fin sera facilmente evidente para un experto habitual en la tecnica.
El elemento de origen de replicacion es normalmente una parte de vectores de expresion procariotas adquiridos comercialmente, y ayuda en la amplificacion del vector en una celula huesped. La amplificacion del vector hasta un determinado nOmero de copias puede ser, en algunos casos, importante para la expresion Optima del polipeptido CRP1 o B7RP1. Si el vector de elecciOn no contiene un sitio de origen de replicaciOn, puede sintetizarse uno
quimicamente basandose en una secuencia conocida, y ligarse en el vector.
El elemento de terminacion de la transcripciOn este ubicado normalmente en 3' del extremo de una secuencia que codifica para polipeptido CRP1 o B7RP1 y sirve para terminar la transcripcion de un polipeptido CRP1 o B7RP1. Habitualmente, el elemento de terminacion de la transcripcion en celulas procariotas es un elemento rico en G-C
seguido por una secuencia de poll T. Aunque el elemento se clone facilmente a partir de una biblioteca o incluso se adquiere comercialmente como parte de un vector, tambien puede sintetizarse facilmente usando metodos para sintesis de acid° nucleico tales como los descritos anteriormente.
Un elemento de gen marcador seleccionable codifica para una proteina necesaria para la supervivencia y el crecimiento de una celula huesped hecha crecer en un medio de cultivo selectivo. Los genes marcadores de
seleccion tipicos codifican para proteinas que (a) confieren resistencia a antibi6ticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, tetraciclina o kanamicina para celulas huesped procariotas, (b) complementan deficiencias auxotroficas de la celula; o (c) suministran nutrientes criticos no disponibles a partir de medios complejos. Marcadores seleccionables preferidos son el gen de resistencia a kanamicina, el gen de resistencia a ampicilina y el gen de resistencia a tetraciclina.
El elemento de union al ribosoma, denominado comunmente la secuencia Shine-Dalgarno (procariotas) o la secuencia Kozak (eucariotes), es habitualmente necesario para la iniciaciOn de la traduccion de ARNm. El elemento este ubicado normalmente en 3' con respecto al promotor y en 5' con respect° a la secuencia codificante del polipeptido CRP1 o B7RP1 que ve a sintetizarse. La secuencia Shine-Dalgarno varia pero es normalmente una polipurina (es decir, que tiene un alto contenido en A-G). Se han identificado muchas secuencias Shine-Dalgarno,
cada una de las cuales puede sintetizarse facilmente usando metodos expuestos anteriormente y usarse en un vector procariota.
En aquellos casos en los que sea deseable que un polipeptido CRP1 o B7RP1 se secrete de la celula huesped, puede usarse una secuencia señal para dirigir la exported& del polipeptido de la celula huesped. Tambien se inactive un dominio transmembrana de CRP1 o B7RP1 mediante muted& o delecion para impedir la union a la membrana del huesped. Normalmente, la secuencia serial se coloca en la regi6n codificante de un ADNc o gen de CRP1 o B7RP1, o directamente en el extremo 5' de la region codificante de un gen de CRP1 o B7RP1. Se han identificado muchas secuencias sena!, y puede usarse cualquiera de ellas que sea funcional en la celula huesped seleccionada conjuntamente con un ADNc o gen de CRP1 o B7RP1. Por tanto, la secuencia serial puede ser hornologa o heterologa para un ADNc o gen de CRP1 o B7RP1, y puede ser homologa o heterologa para un ADNc o
gen de polipeptidos CRP1 o B7RP1. Adicionalmente, la secuencia seal puede sintetizarse quimicamente usando metodos expuestos anteriormente.
En la mayoria de los casos, la secreci6n del polipeptido de la celula huesped por medio de la presencia de un peptido serial dare como resultado la eliminacion de la metionina amino-terminal del polipeptido.
En muchos casos, la transcripci6n de un ADNc o gen de CRP1 o B7RP1 se aumenta mediante la presencia de uno
omas intrones en el vector; esto es particularmente deft° cuando se produce un polipeptido CRP1 o B7RP1 en celulas huesped eucariotas, especialmente celulas huesped de mamifero. Los intrones usados pueden producirse de manera natural dentro de un gen de CRP1 o B7RP1, especialmente cuando el gen usado es una secuencia gen6mica de longitud complete o un fragmento de la misma. Cuando el intr6n no se produce de manera natural dentro del gen (como para la mayoria de los ADNc), el/los inter-I/intones puede(n) obtenerse de otra fuente. La
posici6n del intren con respecto a la secuencia flanqueante en 5' y un gen de CRP1 o B7RP1 es generalmente importante, ya que el int& debe transcribirse para que sea eficaz. Como tal, cuando un gen de CRP1 o B7RP1 inserted° en el vector de expresiOn es una molecule de ADNc, la posiciOn preferida para el int& es en 3' con respect° al sitio de inicio de la transcripci6n, y en 5' con respecto a la secuencia de terminacien de la transcripci6n de poliA. Preferiblemente, el intrOn o intrones estaran ubicados en un lado o el otro (es decir, en 5' o 3') del ADNc de
manera que no interrumpan esta secuencia codificante. Puede usarse cualquier int& de cualquier fuente, incluyendo cualquier organismo viral, procariota y eucariota (planta o animal), para poner en practice esta invencion, siempre que sea compatible con la(s) celula(s) huesped(es) en la(s) que se inserta. Tambien se incluyen en el presente documento intrones sinteticos. Opcionalmente, puede usarse mas de un int& en el vector.
Cuando uno o mas de los elementos expuestos anteriormente no estan ya presentes en el vector que va a usarse, pueden obtenerse individualmente y ligarse en el vector. El expert° en la tecnica conoce bien metodos usados para obtener cada uno de los elementos.
Vectores preferidos para poner en practice esta invencion son los que son compatibles con celulas huesped bacterianas, de insecto y de mamifero. Tales vectores incluyen, entre otros, pCRII, pCR3 y pcDNA3.1 (lnvitrogen Company, San Diego, CA), pBSII (Stratagene Company, La Jolla, CA), pET15b (Novagen, Madison, WI), pGEX
(Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, CA), pETL (BlueBac11; Invitrogen) y pFastBacDual (Gibco/BRL, Grand Island, NY).
Tras haberse construido el vector y haberse inserted° una molecule de acid° nucleic° que codifica para un polipeptido CRP1 o B7RP1 truncado o de longitud complete en el sitio apropiado del vector, el vector completado
puede insertarse en una celula huesped adecuada para su amplificacion y/o expresion de polipeptidos.
Las celulas huesped pueden ser celulas huesped procariotas (tales como E. colt) o celulas huesped eucariotas (tales como una celula de levadura, una celula de insecto o una celula de vertebrado). La celula huesped, cuando se cultiva en condiciones apropiadas, puede sintetizar un polipeptido CRP1 o B7RP1 que puede recogerse
posteriormente del medio de cultivo (si la celula huesped lo secreta al medio) o directamente de la celula huesped que lo produce (si no se secreta). Tras la recogida, puede purificarse un polipeptido CRP1 o B7RP1 usando metodos tales como cromatografia de tamices moleculares, cromatografia de afinidad, y similares.
La seleccion de la celula huesped apropiada para la produccion del polipeptido CRP1 o B7RP1 dependera de diversos factores, tales como los niveles de expresion deseados, las modificaciones del polipeptido que se requieren para la actividad, tal como glicosilacion o fosforilacion, o facilidad de plegamiento para dar una molecula biologicamente active.
Celulas o lineas celulares adecuadas pueden ser celulas de mamifero, tales como celulas de ovario de hamster chino (CHO), celulas 293 o 293T de rill& embrionario humano (HEK) o celulas 3T3. La seleccion de celulas huesped de mamifero adecuadas y los metodos para la transformacion, el cultivo, la amplificacion, la seleccien y la producci6n y purificacien de productos se conocen en la tecnica. Otras lineas celulares de mamifero adecuadas son las lineas celulares COS-1 y COS-7 de mono, y la linea celular CV-1. Las celulas huesped de mamifero a modo de ejemplo adicionales incluyen lineas celulares de primate y lineas celulares de roedor, incluyendo lineas celulares transformadas. Tambien son adecuadas celulas diploides normales, cepas celulares derivadas de cultivo in vitro de tejido primario, asi como explantes primarios. Las celulas candidatas pueden ser genotipicamente deficientes en el
gen de seleccion, o pueden contener un gen de seleccion de actuaciOn dominante. Otras lineas celulares de mamifero adecuadas incluyen pero no se limitan a, celulas N2A de neuroblastoma de ratan, HeLa, celulas L-929 de rat6n, lineas 3T3 derivadas de ratones Swiss, Balb-c o NIH, lineas celulares de hamster BHK o HaK.
Utiles de manera similar como celulas huesped son celulas bacterianas. Por ejemplo, las diversas cepas de E. coil (por ejemplo, HB101, DH5a, DH10 y MC1061) se conocen bien como celulas huesped en el campo de la
biotectonologia. Pueden emplearse tambien diversas cepas de B. subtilis, Pseudomonas spp. , otros Bacillus spp. , Streptomyces spp. , y similares en este metodo.
Muchas cepas de celulas de levadura conocidas por los expertos en la tecnica tambien estan disponibles como celulas huesped para la expresi6n de los polipeptidos de la presente invencion.
Adicionalmente, cuando se desee, pueden utilizarse sistemas de celulas de insecto en los metodos de la presente
invencien. Tales sistemas se describen por ejemplo en Kitts et al. (Biotechniques, 14:810-817 (1993)), Lucklow (Curr. Opin. Biotechnol., 4:564-572 (1993)) y Lucklow et al. (J. Virol., 67:4566-4579 (1993)). Celulas de insecto preferidas son Sf-9 y Hi5 (Invitrogen, Carlsbad, CA).
Puede lograrse la quot;transformacionquot; o quot;transfecciOnquot; de un vector de expresion en la celula huesped seleccionada usando metodos tales como cloruro de calcio, electroporacion, microinyecciOn, lipofeccion o el metodo de DEAE
dextrano. El metodo seleccionado sera en parte una fund& del tipo de celula huesped que va a usarse. Estos metodos y otros metodos adecuados los conoce bien el expert° en la tecnica y se exponen, por ejemplo, en Sambrook etal. , citado anteriormente.
Las celulas huesped transformadas o transfectadas con un vector de expresiOn pueden cultivarse usando medios convencionales bien conocidos por el experto en la tecnica. Los medios contendran habitualmente todos los nutrientes necesarios para el crecimiento y la supervivencia de las celulas. Medios adecuados para cultivar celulas
E. coli son, por ejemplo, caldo Luria (LB) y/o caldo Terrific (TB). Medios adecuados para cultivar celulas eucariotas son RPM! 1640, MEM, DMEM, todos los cuales pueden complementarse con suero y/o factores de crecimiento segun se requiera por la linea celular particular que este cultivandose. Un medio adecuado para cultivos de insecto es medio de Grace complementado con extract° de levadura, hidrolizado de lactoalbOmina y/o suero de ternero fetal
segun sea necesario.
Normalmente, se afiade un antibiotic° u otro compuesto ütil para el crecimiento selectivo de las celulas transformadas sOlo como complemento para los medios. El compuesto que va a usarse estara dictado por el elemento de marcador seleccionable presente en el plasmido con el que se transform() la celula huesped. Por ejemplo, cuando el element() de marcador seleccionable es resistencia a kanamicina, el compuesto arladido al
medio de cultivo sera kanamicina.
La cantidad de polipeptido CRP1 o B7RP1 producida en la celula huesped puede evaluarse usando metodos convencionales conocidos en la tecnica. Tales metodos incluyen, sin limitacion, analisis de inmunotransferencia de tipo Western, electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, electroforesis en gel no desnaturalizante, separacion por HPLC, inmunoprecipitacion y/o ensayos de actividad tales como ensayos de desplazamiento en gel de uni6n a ADN.
Si un polipeptido CRP1 o B7RP1 se ha diseriado para secretarse de las celulas huesped, la mayoria del polipeptido puede encontrarse en el medio de cultivo celular. Los polipeptidos preparados de este modo normalmente no presentaran una metionina amino-terminal, ya que se elimina durante la secreci6n de la celula. Sin embargo, si un
polipeptido CRP1 o B7RP1 no se secreta de las celulas huesped, estara presente en el citoplasma y/o el nixie° (para celulas huesped eucariotas) o en el citosol (pare celulas huesped de bacterias Gram-negativas) y pueden tener una metionina amino-terminal.
La purificacion de un polipeptido CRP1 o B7RP1 de la disolucion puede lograrse usando una variedad de tecnicas.
Siel polipeptido se ha sintetizado de manera que contiene una etiqueta tal como hexahistidina (CRP1 o B7RP1 hexaHis) u otro peptido pequerio tal como FLAG (Eastman Kodak Co., New Haven, CT) o myc (Invitrogen, Carlsbad, CA) en su extremo o bien carboxilo o bien amino-terminal, puede purificarse esencialmente en un procedimiento de una etapa haciendo pasar el polipeptido eitquetado a traves de una columna de afinidad en la que la matriz de la columna tiene una alta afinidad por la etiqueta o por el polipeptido directamente (es decir, un anticuerpo monoclonal
que reconoce especificamente un polipeptido CRP1 o B7RP1). Por ejemplo, la polihistidina se une con gran afinidad y especificidad a niquel, por tanto puede usarse una columna de afinidad de niquel (tal como las columnas de niquel de Qiagene) para la purificacion de CRP1 o B7RP1/poliHis. (Vease por ejemplo, Ausubel et al. , eds., Current Protocols in Molecular Biology, seccion 10.11.8, John Wiley & Sons, Nueva York (1993)).
Cuando se prepara un polipeptido CRP1 o B7RP1 sin una etiqueta unida, y no este disponible ningun anticuerpo,
pueden usarse otros procedimientos bien conocidos para la purificaciOn. Tales procedimientos incluyen, sin limitacion, cromatografia de intercambio ionic°, cromatografia de tamices moleculares, HPLC, electroforesis en gel nativo en combined& con dud& del gel e isoelectroenfoque preparativo (maquina/tecnica quot;Isoprimequot;, Hoefer Scientific). En algunos casos, pueden combinarse dos o mas de estas tecnicas para lograr un aumento de pureza.
Si se anticipa que un polipeptido CRP1 o B7RP1 se encontrara principalmente de manera intracelular, el material
intracelular (incluyendo cuerpos de inclusion de bacterias Gram-negativas) puede extraerse de la celula huesped usando cualquier tecnica convencional conocida por el experto en la tecnica. Por ejemplo, las celulas huesped pueden lisarse para liberar el contenido del periplasma/citoplasma mediante prensa francesa, homogeneizaciOn y/o sonicaci6n seguido por centrifugacion.
Si un polipeptido CRP1 o B7RP1 ha formado cuerpos de inclusiOn en el citosol, los cuerpos de inclusion pueden
unirse a menudo a las membranas celulares interna y/o externa y por tanto se encontraran principalmente en el material sedimentado tras la centrifugacion. El material sedimentado puede tratarse entonces a pH extremos o con un agente caotrOpico tal como un detergente, guanidina, derivados de guanidina, urea o derivados de urea en presencia de un agente reductor tal como ditiotreitol a pH alcalino o tris-carboxietilfosfina a pH acid° para liberar, romper y solubilizar los cuerpos de inclusiOn. El polipeptido en su forma ahora soluble puede analizarse entonces
usando electroforesis en gel, inmunoprecipitaci6n o similares. Si se desea aislar un polipeptido CRP1 o B7RP1, el aislamiento puede lograrse usando metodos convencionales tales como los expuestos a continuaci6n y en Marston et al. (Met. Enz., 182:264-275 (1990)). En algunos casos, un polipeptido CRP1 o B7RP1 puede no ser biologicamente activo tras su aislamiento. Pueden usarse diversos metodos para quot;replegarquot; o convertir el polipeptido a su estructura terciaria y generar enlaces disulfuro para restaurar la actividad biologica. Tales metodos incluyen
poner en contacto el polipeptido solubilizado con una disolucion que tiene un pH habitualmente por encima de 7 y en presencia de una concentracion particular de un caotropo apropiado. En la mayoria de los casos, la disolucion de replegamiento/oxidaciOn contendra tambien un agente reductor o el agente reductor y la forma oxidada correspondiente ester) en una razon especifica para generar un potencial redox particular que permite que se produzca el intercambio de disulfuros en la formed& del/de los puente(s) de cisteina de la proteina. Algunas de las
parejas redox comOnmente usadas incluyen cisteina/cistamina, glutation (GSH)/ditiobis GSH, cloruro cuprico, ditiotreitol (DTT)/ditiano DTT, 2-mercaptoetanol (bME)/ditio-b(ME). En muchos casos, es necesario un codisolvente para aumentar la eficacia del replegamiento y los reactivos mas comunes usados para este fin incluyen glicerol, polietilenglicol de diversos pesos moleculares y arginina.
Tambien pueden prepararse polipeptidos CRP1 o B7RP1, fragmentos y/o derivados de los mismos mediante
metodos de sintesis quimica (tal como sintesis de peptidos en fase solida) usando tecnicas conocidas en la tecnica tales como las expuestas por Merrifield etal. , (J. Am. Chem. Soc., 85:2149 (1963)), Houghten etal. (Proc Natl Acad. Sci. USA, 82:5132 (1985)), y Stewart y Young (Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984)). Tales polipeptidos pueden sintetizarse con o sin una nnetionina en el extremo amino-terminal. Pueden oxidarse polipeptidos CRP1 o B7RP1 o fragmentos sintetizados quimicamente usando metodos expuestos en estas
referencias para formar puentes disulfuro. Se espera que polipeptidos CRP1 o B7RP1 o fragmentos tengan actividad biologica comparable a polipeptidos CRP1 o B7RP1 producidos de manera recombinante o purificados de fuentes naturales, y por tanto puedan usarse de manera intercambiable con polipeptido CRP1 o B7RP1 natural o
recombinante.
Polipeotidos
El termino quot;polipeptido CRP1 o B7RP1quot; se refiere a un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de la figura 1A (SEQ ID NO: 2), figura 2A (SEQ ID NO: 7) o figura 3A (SEQ ID NO: 12) y todos los polipeptidos relacionados descritos en el presente documento. Los polipeptidos relacionados incluyen variantes alelicas, variantes de corte y empalme, fragmentos, derivados, variantes de sustituci6n, delecion e insercion, polipeptidos de fusi6n y ortOlogos. Tales polipeptidos relacionados pueden ser polipeptidos maduros, es decir, un polipeptido que
carece de un peptido serial. Un polipeptido CRP1 o B7RP1 puede tener o no una metionina amino-terminal,
dependiendo de la manera en la que se preparan.
El termino quot;fragmento de polipeptido CRP1 o B7RP1quot; se refiere a un peptido o polipeptido que es menor que la secuencia de aminoacidos de longitud complete de un polipeptido CRP1 o B7RP1 tal como se expone en la figura 1A (SEQ ID NO: 2), figura 2A (SEQ ID NO: 7) o figura 3A (SEQ ID NO: 12). Un fragmento de este tipo puede resultar de truncamiento en el extremo amino-terminal, truncamiento en el extremo carboxilo-terminal y/o una delecion interna en la secuencia de polipeptido. Tales fragmentos de polipeptidos CRP1 o B7RP1 pueden prepararse con o sin una metionina amino-terminal. Adernas, fragmentos de polipeptidos CRP1 o B7RP1 pueden ser variantes de code y empalme que se producen de manera natural, otras variantes de corte y empalme y fragmentos que resultan de actividad proteasa in vivo que se produce de manera natural. Los fragmentos de polipeptido CRP1 o B7RP1
preferidos incluyen formas solubles de CRP1 o B7RP1 que carecen de un dominio transmembrana funcional y comprenden parte o todo del dominio extracelular de o bien CRP1 o bien B7RP1.
El termino quot;variantes de polipeptido CRP1 o B7RP1quot; se refiere a polipeptidos CRP1 o B7RP1 cuyas secuencias de aminoacidos contienen una o mas sustituciones, deleciones y/o adiciones de la secuencia de aminoacidos en comparaci6n con las secuencias de aminoacidos de polipeptidos CRP1 o B7RP1 expuestas en la figura 1A (SEQ ID
NO:2), figura 2A (SEQ ID NO: 7) o figura 3A (SEQ ID NO: 12). Tales variantes de polipeptidos CRP1 o B7RP1 pueden prepararse a partir de las variantes de moleculas de acid° nucleico de polipeptidos CRP1 y B7RP1 correspondientes, que tienen una secuencia de ADN que varia por consiguiente de las secuencias de ADN para polipeptidos CRP1 o B7RP1.
Tal como se usa en el presente documento, el termino quot;derivados de polipeptido CRP1 o B7RP1quot; se refiere a
polipeptidos CRP1 o B7RP1, variantes o fragmentos de los mismos, que se han modificado quirnicamente, como por ejemplo, mediante adicion de uno o mas polimeros solubles en agua, hidratos de carbono unidos a N o unidos a 0, azucares, fosfatos y/u otras moleculas de este tipo, en los que la molecule o molecules no estan unidas de manera natural a polipeptidos CRP1 o B7RP1 silvestres. Los derivados incluyen edemas la deleciOn de uno o mas grupos quimicos unidos de manera natural al polipeptido CRP1 o B7RP1.
Tal como se usa en el presente documento, los terminos quot;polipeptidos CRP1 o B7RP1 biologicamente activosquot;, quot;fragnnentos de polipeptido CRP1 o B7RP1 biologicamente activosquot;, quot;variantes de polipeptido CRP1 o B7RP1 biologicamente activesquot; y quot;derivados de polipeptido CRP1 o B7RP1 biolOgicamente activosquot; se refieren a polipeptidos CRP1 o B7RP1 que tienen al menos una de las actividades caracteristicas de CRP1 o B7RP1. Una actividad es union de B7RP1 a CRP1. Otra actividad es la capacidad de CRP1 o B7RP1 para estimular la
proliferacion y/o activacion de celulas T.
El termino quot;ortologoquot; se refiere a un polipeptido que corresponde a un polipeptido identificado de una especie. Por ejemplo, polipeptidos B7RP1 de ser humano y rat6n se consideran ortologos.
El termino quot;secuencia de aminoacidos maduraquot; se refiere a un polipeptido que carece de una secuencia lider.
El termino quot;polipeptido aisladoquot; se refiere a un polipeptido que este libre de al menos un polipeptido contaminante que se encuentra en su entorno natural, y de manera preferible sustancialmente libre de cualquier otro polipeptido de mamifero contaminante.
El termino quot;identidadquot;, tal como se conocen en la tecnica, es una relacion entre las secuencias de dos o mas molecules de acid° nucleico o dos o mas polipeptidos, tal como se determina comparando las secuencias. En la tecnica, quot;identidadquot; tambien significa el grado de relaciOn de secuencia entre secuencias de molecules de polipeptido
oacido nucleic°, tal como puede ser el caso, tal como se determina por la coincidencia entre hebras de secuencias de nucleditidos o aminoacidos. La quot;identidadquot; mide el porcentaje de coincidencias identicas entre dos o mas secuencias con alineaciones de huecos tratadas mediante programas informaticos particulares (es decir, quot;algoritmosquot;).
El termino quot;similitudquot; se refiere a un concepto relacionado, pero en contraposicion a quot;identidadquot;, una medida de
similitud incluye tanto coincidencias identicas como coincidencias de sustituciones conservatives. Puesto que las sustituciones conservativas se aplican a polipeptidos y no a moleculas de acid° nucleico, la similitud solo se ocupa de comparaciones de secuencias de polipeptido. Si dos secuencias de polipeptido tienen, por ejemplo, 10/20 aminoacidos identicos, y el resto son sustituciones no conservatives, entonces el porcentaje de identidad y similitud serian ambos del 50%. Si en el mismo ejemplo hay 5 posiciones mas en las que hay sustituciones conservatives,
entonces el porcentaje de identidad sigue siendo del 50%, pero el porcentaje de similitud seria del 75% (15/20). Por tanto, en casos en los que hay sustituciones conservatives, el grado de similitud entre dos secuencias de polipeptido sere mas alto que el porcentaje de identidad entre esas dos secuencias. Se describen sustituciones de aminoacidos
quot;conservativasquot; a continuacion en el presente documento en referencia a la table I. Basandose en la table I, sustituciones de aminoacidos conservatives son aminoacidos alternativos seleccionados de la misma agrupacion, por ejemplo, basicos, acidos, polares no cargados y no polares. Por ejemplo, sustituciones de aminoacidos conservativas para arginina serian lisina e histidina.
La identidad y similitud pueden calcularse facilmente mediante metodos conocidos, incluyendo pero sin limitarse a los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988;
Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, parte 1, Griffin, A.M., y Griffin, KG., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M. Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J. Applied
Math., 48:1073 (1988).
Los metodos preferidos para determinar la identidad y/o similitud ester) disefiados para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias sometidas a prueba. Los metodos para determinar la identidad y similitud se codifican en programas informaticos disponibles publicamente. Los metodos de programas informaticos preferidos para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete de programas GCG, incluyendo GAP (Devereux, J., et al. , Nucleic Acids Research 12(1):387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), BLASTP, BLASTN y FASTA (Atschul, S.F. etal. , J. Molec. Biol. 215:403-410 (1990). El programa BLAST X este disponible pilblicamente del National Center for Biotechnology Information (NCBI) y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., etal.NCB NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., etal.,J.Mol. Biol. 215:403-410 (1990). Tambien puede usarse el algoritmo de Smith Waterman bien conocido para determinar la
identidad.
A modo de ejemplo, usando el algoritmo informatico GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), se alinean dos polipeptidos para los que va a determinarse el porcentaje de identidad de secuencia para lograr una coincidencia optima de sus respectivos aminoacidos (el quot;tramo coincidentequot;, tal como se determina mediante el algoritmo). Se usan una penalized& por aperture de huecos (que se calcula como 3 X la diagonal promedio; la quot;diagonal promedioquot; es el promedio de la diagonal de la matriz de compared& que este usandose; la quot;diagonalquot; es la puntuaci6n o el ni,mero asignado a cada coincidencia de aminoacidos perfecta por la matriz de comparaci6n particular) y una penalized& por extensi6n de huecos (que es habitualmente 1/10 veces la penalized& por aperture de huecos), asi como una matriz de comparaci6n tal como PAM 250 o BLOSUM 62 conjuntamente con el algoritmo. Tambien se usa por el algoritmo una matriz de compared& convencional (vease
Dayhoff et al. , en: Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, sup. 3 (1978) para la matriz de compared PAM250; vease Henikoff et al. , Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:10915-10919 (1992) para la matriz de compared BLOSUM 62).
Los parametros preferidos para la comparaci6n de secuencias de polipeptido incluyen los siguientes:
Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48.: 443-453 (1970)
Matriz de comparaci6n: BLOSUM 62 de Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA.89:10915-10919 (1992)
PenalizaciOn por huecos: 12
Penalized& por longitud de huecos: 4
Umbral de similitud: 0
El programa GAP es Litil con los parametros anteriores. Los parametros mencionados anteriormente son parametros por defecto para comparaciones de polipeptidos (junto con sin penalized& para huecos de extremos) usando el algoritmo GAP.
Los parametros preferidos para la comparaciOn de secuencias de acid° nucleico incluyen los siguientes:
Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48:443-453 (1970)
Matriz de comparaciOn: coincidencias = +10, apareamiento errOneo = 0
PenalizaciOn por huecos: 50
PenalizaciOn por longitud de huecos: 3
El programa GAP tambien es atil con los parametros anteriores. Los parametros mencionados anteriormente son los parametros por defecto para comparaciones de molecules de acid° nucleic°.
Pueden usarse otros algoritmos, penalizaciones por aperture de huecos, penalizaciones por extension de huecos,
matrices de comparaciOn, umbrales de similitud, etc. a modo de ejemplo por los expertos en la tecnica, incluyendo los expuestos en el Program Manual, Wisconsin Package, version 9, septiembre de 1997. Las elecciones particulares que van a hacerse dependeran de la compared& especifica que va a hacerse, tal como ADN con ADN, proteina con proteina, proteina con ADN; y adicionalmente, de si la compared& es entre pares de secuencias (en cuyo caso se prefieren generalmente GAP o BestFit) o entre una secuencia y una base de datos de secuencias grande (en cuyo caso se prefieren FASTA o BLASTA).
Los polipeptidos que son identicos al menos aproximadamente al 70 por ciento tendran normalmente una o mas sustituciones, deleciones y/o adiciones de aminoacidos en comparaciOn con un polipeptido CRP1 o B7RP1 silvestre.
En una realizaciOn preferida, los polipeptidos tendran aproximadamente el 75%, el 80%, el 85%, el 90% o el 95% de identidad con polipeptidos CRP1 o B7RP1. Habitualmente, las sustituciones del residuo nativo seran o bien alanina, o bien un aminoacido conservativo de modo que tiene poco o ningun efecto sobre la carga neta global, polaridad o hidrofobicidad del polipeptido. Se exponen sustituciones conservativas en la tabla I a continuacion.
Tabla I
Sustituciones de aminoacidos conservativas
Basicos argina lisina histidina
Acidos acid°glutamico acid° aspartico
Polares no cargados glutamina asparagina serina treonina tirosina
No polares fenilalanina triptofano cisteina glicina alanina valina prolina metionina leucina norleucina isoleucina
Se abarcan derivados de polipeptido B7RP1 por la invenciOn. En una realizacion, se incluyen dentro del alcance de la presente invenciOn connposiciones de polipeptido B7RP1 modificado quimicamente en la que los polipeptidos B7RP1 estan unidos a un polinnero. El polimero seleccionado normalmente es soluble en agua de modo que la 10 proteina a la que esta unido no precipita en un entorno acuoso, tal como un entorno fisiologico. El polimero seleccionado se modifica habitualmente para que tenga un Cinico grupo reactivo, tal como un ester activo para la acilacion o un aldehido para la alquilacion, de modo que el grado de polimerizacion puede controlarse tal como se proporciona en los presentes metodos. El polimero puede ser de cualquier peso molecular, y puede estar ramificado
o no ramificado. Se incluye dentro del alcance de la invencion una mezcla de polimeros. Preferiblemente, para uso 15 terapeutico de la preparaciOn de producto final, el polimero sera farmaceuticamente aceptable.
El polimero soluble en agua o mezcla del mismo puede seleccionarse del grupo que consiste en, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), monometoxi-polietilenglicol, dextrano, celulosa u otros polimeros a base de hidratos de carbono, poli-(N-vinilpirrolidona)polietilenglicol, homopolimeros de propilenglicol, un copolimero de poli(oxido de propileno)/oxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol) y poli(alcohol vinilico).
20 Para las reacciones de acilacion, el/los polimero(s) seleccionado(s) debe(n) tener un Cinico grupo ester reactivo. Para alquilaciOn reductora, el/los polimero(s) seleccionado(s) debe(n) tener un unico grupo aldehido reactivo. Un aldehido reactivo preferido es propionaldehido de polietilenglicol, que es estable en agua, o derivados de nnonoalcoxilo o ariloxilo C1-C10 de los mismos (vease la patente estadounidense n.° 5.252.714).
Puede Ilevarse a cabo la pegilaciOn de polipeptidos CRP1 o B7RP1 mediante cualquiera de las reacciones de
25 pegilaciOn conocidas en la tecnica, tal como se describe por ejemplo en las siguientes referencias: Focus on Growth Factors 3: 4-10 (1992); documento EP 0 154 316; y document° EP 0 401 384. Preferiblemente, la pegilaciOn se Ileva a cabo por medio de una reaccion de acilaciOn o una reaccion de alquilacion con una molecula de polietilenglicol reactiva (o un polimero soluble en agua reactivo analogo) tal como se describe a continuaci6n.
Un polimero soluble en agua particularmente preferido para su uso en el presente documento es polietilenglicol,
30 abreviado PEG. Tal como se usa en el presente documento, polietilenglicol pretende abarcar cualquiera de las formas de PEG que se han usado para derivatizar otras proteinas, tales como mono-alcoxi-o ariloxi (C1-C10)polietilenglicol.
En general, la derivatizacion quimica puede realizarse en cualquier condicion adecuada usada para hacer reaccionar una sustancia biologicamente activa con una molecula de polimero activada. Los metodos para preparar 35 polipeptidos CRP1 y B7RP1 pegilados comprenderan generalmente las etapas de (a) hacer reaccionar el polipeptido con polietilenglicol (tal como un derivado de aldehido o ester reactivo de PEG) en condiciones mediante las cuales el polipeptido CRP1 o B7RP1 se une a uno o mas grupos PEG, y (b) obtener el/los producto(s) de reaccion. En
general, las condiciones de reacciOn optimas para las reacciones de acilacion se determinaran basandose en parametros conocidos y el resultado deseado. Por ejemplo, cuanto mayor sea la razOn de PEG:proteina, mayor sera el porcentaje de producto polipegilado.
Generalmente, los estados que pueden aliviarse o modularse mediante la administraci6n de conjugados de polimero
de CRP1 o B7RP1 incluyen los descritos en el presente documento para polipeptidos CRP1 o B7RP1 no conjugados. Sin embargo, los conjugados dados a conocer en el presente document° pueden tener actividades adicionales, actividad biologica potenciada o reducida u otras caracteristicas, tales como semivida aumentada o disminuida, en compared& con las molecules no derivatizadas.
Pueden emplearse polipeptidos CRP1 o B7RP1, fragmentos, variantes y derivados solos, juntos o en combinaci6n
con otras composiciones farmaceuticas. Pueden usarse polipeptidos CRP1 o B7RP1, fragmentos, variantes y derivados en combined& con citocinas, factores de crecimiento, antibioticos, antiinflamatorios y/o agentes quimioterapicos segun sea apropiado para la indicacion que este tratandose.
La presente descripcion proporciona agentes de union selective de CRP1 o B7RP1. Un agente de uniOn selective se refiere a una molecule que tiene especificidad por CRP1 o B7RP1 y puede incluir una proteina, un peptido, un acid° nucleic°, un hidrato de carbono, un lipido o un connpuesto de peso molecular pequefio. Un agente de uniOn selective interacciona con o bien CRP1 o bien B7RP1 y a su vez regula la union de CRP1 a B7RP1. En un aspecto, un agente de uni6n selective bloquea parcial o completamente la union de CRP1 a B7RP1 e inhibe parcial o completamente al menos una actividad biologica de CRP-1 o B7RP-1, tal como actividad coestimuladora inmunitaria. En otro aspecto, el agente de uni6n selective es un anticuerpo. El anticuerpo puede ser inmunorreactivo con o bien CRP1 o bien B7RP1 y es preferiblemente inmunorreactivo con B7RP1. kin en otro aspecto de la descripciOn, un anticuerpo reactivo con B7RP1 se une a un epitopo en B7RP1 de manera que la uni6n a CRP1 se bloquea parcial o completamente y al menos una actividad biologica de B7RP1, tal como actividad coestimuladora inmunitaria, se inhibe parcial o completamente. El termino parcialmente inhibido significa que se ha producido al menos un nivel detectable de inhibici6n. El termino completamente inhibido significa que no se ha producido aumento adicional en la
inhibici6n.
Pueden usarse polipeptidos CRP1 o B7RP1, fragmentos, varientes y/o derivados para preparar anticuerpos usando metodos conocidos en la tecnica. Por tanto, tambien se contemplan anticuerpos que reaccionan con los polipeptidos B7RP1, asi como fragmentos reactivos de tales anticuerpos, como dentro del alcance de la presente invencion. Los anticuerpos pueden ser policlonales, monoclonales, recombinantes, quimericos, de cadena sencilla y/o
biespecificos. Normalmente, el anticuerpo o fragmento del mismo sera o bien de origen humano, o bien estara quot;humanizadoquot;, es decir, preparado de modo que evita o minimiza una rend& inmunitaria frente al anticuerpo cuando se administra a un paciente. El fragmento de anticuerpo puede ser cualquier fragmento que sea reactivo con polipeptidos CRP1 y B7RP1 de la presente invencion, tal como, Fab, Fab', etc. Tambien se dan a conocer en el presente documento los hibridomas generados mediante la presented& de cualquier polipeptido CRP1 o B7RP1 o fragmentos del mismo como antigen° a un mamifero seleccionado, seguido por fusion de las celulas (por ejemplo, celulas de bazo) del mamifero con determinadas celulas cancerosas para crear lineas celulares inmortalizadas mediante tecnicas conocidas. Los metodos empleados para generar tales lineas celulares y anticuerpos dirigidos contra todo o partes de un polipeptido CRP1 o B7RP1 humano de la presente invencion tambien se abarcan por esta invenciOn.
Los anticuerpos monoclonales de la invenciOn incluyen anticuerpos quot;quimericosquot; en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es identica a u hornologa a una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es/son identicas a u hornologa(s) a una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, asi conno fragmentos de tales anticuerpos, siempre
que presenten la actividad biologica deseada (patente estadounidense n.° 4.816.567; Morrison, et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. 81., 6851-6855 (1985)).
En una realizaciOn preferida, el anticuerpo anti-CRP1 o B7RP1 quimerico es un anticuerpo quot;humanizadoquot;. Se conocen bien en la tecnica metodos para humanizar anticuerpos no humanos. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o mas residuos de aminoacido introducidos en el mismo a partir de una fuente que no es
humana. La humanized& puede realizarse siguiendo metodos conocidos en la tecnica (Jones, et al. , Nature 321, 522-525 (1986); Riechmann, et al. , Nature, 332, 323-327 (1988); Verhoeyen, et al. , Science 239, 1534-1536 (1988)), sustituyendo regiones determinantes de complementerieded (CDR) de rat& por las regiones correspondientes de un anticuerpo humano.
Tambien se abarcan por la invencion anticuerpos anti-B7RP1 completamente humanos. Tales anticuerpos pueden
producirse mediante inmunizaci6n con un antigeno CRP1 o B7RP1 de animales transgenicos (por ejemplo, ratones) que pueden producir un repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de produccion de inmunoglobulinas endogenes. Veanse, por ejemplo, Jakobovits, etal. , Proc. Natl. Acad. Sci. 90, 2551-2555 (1993); Jakobovits, etal. , Nature 362, 255-258 (1993). Tambien pueden producirse anticuerpos humanos en bibliotecas de presentacion en fago (Hoogenboom, etal.,J.Mol. Biol. 227, 381 (1991); Marks, etal. , J.Mol. Biol. 222, 581 (1991).
Pueden usarse agentes de uniOn selective de la invencion para regular la union de CRP1 a B7RP1 y regular al menos una actividad biolOgica mediada por CRP1 y B7RP1 tal como coestimulaciOn inmunitaria. Un ejemplo de tales agentes de union selective son anticuerpos inmunorreactivos con B7RP1. Los anticuerpos pueden usarse terapeuticamente, tal como para inhibir la union del polipeptido CRP1 y B7RP1 a su pareja de union. Los anticuerpos
pueden usarse edemas para fines de diagnostic° in vivo e in vitro, tal como en forma marcada para detectar la presencia de polipeptido CRP1 y B7RP1 en una muestra de celulas o fluido corporal.
Composiciones farmaceuticas y administraciOn
Composiciones farmaceuticas de polipeptidos B7RP1 estan dentro del alcance de la presente invencion. Tales composiciones pueden comprender una cantidad terapeuticamente eficaz del polipeptido o fragmentos, variantes o derivados en mezcla con un portador farmaceuticamente aceptable. En aspectos preferidos, las composiciones farmaceuticas comprenden polipeptidos B7RP1 como formas solubles que comprenden parte de o todo un dominio extracelular de B7RP1. Normalmente, se administrara un compuesto terapeutico de polipeptido B7RP1 en forma de una composicion que comprende polipeptido, fragmento, variante o derivado purificado conjuntamente con uno o mas portadores, excipientes o diluyentes fisiolOgicamente aceptables. El material portador puede ser agua para
inyecci6n, preferiblemente complementada con otros materiales comunes en disoluciones para su administracion a mamiferos. Solucion saline tamponada neutra o solucion salina mezclada con albOmina serica son portadores apropiados a modo de ejemplo. Preferiblemente, el producto se formula como un liofilizado usando excipientes apropiados (por ejemplo, sacarosa). Pueden incluirse otros portadores, diluyentes y excipientes habituales segOn se desee. Otras composiciones a modo de ejemplo comprenden tampon Tris de aproximadamente pH 7,0-8,5, o tampon acetato de aproximadamente pH 4,0-5,5, que pueden incluir edemas sorbitol o un sustituto adecuado del mismo.
Las composiciones farmaceuticas de B7RP1 pueden administrarse por via parenteral. Alternativamente, las composiciones pueden administrarse por via intravenosa o por via subcutanea. Cuando se administran por via sistemica, las composiciones terapeuticas para su uso en esta invencion pueden estar en forma de una disolucion
acuosa aceptable por via parenteral, libre de pir6genos. La preparaci6n de tales disoluciones de proteinas farmaceuticamente aceptables, con adecuada atencion al pH, la isotonicidad, la estabilidad y similares, este dentro de la experiencia de la tecnica.
Pueden prepararse formulaciones terapeuticas de composiciones de polipeptido B7RP1 utiles para poner en practica la presente invencion para su almacenamiento mezclando la composicion seleccionada que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizadores fisiologicamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ediciOn, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company (1990)) en forma de una torte liofilizada o una disoluciOn acuosa. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tOxicos para los receptores y preferiblemente son inertes a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato u otros acidos organicos; antioxidantes tales como acido ascorbico; polipeptidos de bajo
peso molecular; proteinas, tales como albOmina serica, gelatine o inmunoglobulinas; polimeros hidrofilos tales como polivinilpirrolidona; aminoacidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacaridos, disacaridos y otros hidratos de carbono incluyendo glucose, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azOcar tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; y/o tensioactivos no i6nicos tales como Tween, Pluronic o polietilenglicol (PEG).
Una cantidad eficaz de una composicion/composiciones de polipeptido B7RP1 que va a emplearse terapeuticamente dependera, por ejemplo, de los objetivos terapeuticos tales como la indicacion para la que este usandose el polipeptido B7RP1, la via de administraciOn y el estado del paciente. Por consiguiente, sera necesario que el terapeuta valore la dosificacion y modifique la via de administracion segun se requiera para obtener el efecto terapeutico Optimo. Una dosificacion diaria tipica puede oscilar entre aproximadamente 0,1 jig/kg y hasta 100 mg/kg
omas, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Normalmente, un medico administrara la composicion hasta que se alcance una dosificaci6n que logra el efecto deseado. Por tanto, puede administrarse la composicion como una Unica dosis o como dos o mas dosis (que pueden contener o no la misma cantidad de un polipeptido B7RP1) a lo largo del tiempo, o como una infusion continua por medio de un dispositivo de implantaciOn
o cateter.
Amedida que se realicen estudios adicionales, surgira informacion referente a niveles de dosificacion apropiados para el tratamiento de diversos estados en diversos pacientes, y el expert° habitual podra determinar la dosificacien apropiada, considerando el contexto terapeutico, el tipo de trastorno en tratamiento, la edad y la salud general del
receptor.
La composicion de polipeptido B7RP1 que va a usarse para la administracion in vivo debe ser esteril. Esto se logra
facilmente mediante filtracion a traves de membranas de filtracion esteril. Cuando se liofiliza la composici6n, puede realizarse la esterilizacion usando estos metodos o bien antes de, o bien despues de, la liofilizaciOn y reconstitucion. La composicion para la administracion parenteral se almacenara habitualmente en forma liofilizada o en disoluciOn.
Las composiciones terapeuticas se colocan generalmente en un envase que tiene un orificio de acceso esteril, por ejemplo, una balsa o un vial de disoluciOn intravenosa que tiene un tap& perforable mediante una aguja de
inyecci6n hipodermica.
La via de administracion de la composicion es acorde con metodos conocidos, por ejemplo oral, inyeccion o infusion por vias intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimatosa), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial o intralesional, o mediante sistemas de liberacion sostenida o dispositivo de implantaciOn que puede implicar opcionalmente el uso de un cateter. Cuando se desee, las composiciones pueden administrarse de manera continua mediante infusiOn, inyeccion en bolo o mediante dispositivo de implantacion.
Alternativa o adicionalmente, la composicion puede administrarse localmente por medio de implantacion en el area afectada de una membrana, esponja u otro material apropiado sobre el que se ha absorbido polipeptido B7RP1.
Cuando se usa un dispositivo de implantacion, el dispositivo puede implantarse en cualquier tejido u organ°
adecuado, y la administracion de un polipeptido B7RP1 puede ser directamente a traves del dispositivo por medio de bolo, o por medio de administracion continua, o por medio de cateter usando infusion continua. Puede administrarse un polipeptido B7RP1 en una formulacion o preparacion de liberaciOn sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberacion sostenida incluyen matrices polimericas semipermeables en forma de articulos conformados, por ejemplo peliculas o microcapsulas. Las matrices de liberacion sostenida incluyen poliesteres,
hidrogeles, polilactidas (documentos U.S. 3.773.919, EP 58.481), copolimeros de acido L-glutamico y gamma etil-Lglutamato (Sidman et al, Biopolymers, 22: 547-556 (1983)), poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) (Langer et al. , J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981)] y Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)), acetato de etilenvinilo (Langer et al. , citado anteriormente) o poli(acido D(-)-3-hidroxibutirico) (documento EP 133.988). Las composiciones de liberacion sostenida tambien pueden incluir liposomas, que pueden prepararse mediante cualquiera de varios metodos conocidos en la tecnica (por ejemplo, Eppstein et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 (1985); documentos EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949).
En algunos casos, puede ser deseable usar composiciones de polipeptido B7RP1 de manera ex vivo. En este caso, las celulas, los tejidos o los 6rganos que se han retirado del paciente se exponen a composiciones de polipeptido B7RP1 tras lo cual se implantan posteriormente las celulas, los tejidos y/o los 6rganos de nuevo en el paciente.
Enotros casos, puede administrase un polipeptido B7RP1 mediante implantacion en pacientes de determinadas celulas que se han modificado mediante ingenieria genetica, usando metodos tales como los descritos en el presente documento, para expresar y secretar los polipeptidos, fragmentos, variantes o derivados. Tales celulas pueden ser celulas animales o humanas, y pueden derivarse del tejido del propio paciente o de otra fuente, o bien humana o bien no humana. Opcionalmente, las celulas pueden inmortalizarse. Sin embargo, con el fin de disminuir
la posibilidad de una respuesta inmunologica, se prefiere que las celulas se encapsulen para evitar la infiltracion de tejidos circundantes. Los materiales de encapsulacion son normalmente envolturas o membranas polimericas biocompatibles, semi-permeables que permiten la liberacion del/de los producto(s) proteicos pero impiden la destruccion de las celulas por el sistema inmunitario del paciente o por otros factores perjudiciales de los tejidos circundantes.
Los metodos usados para la encapsulacion en membranas de celulas son familiares para el expert° en la tecnica, y la preparaciOn de celulas encapsuladas y su implantacion en pacientes pueden lograrse sin excesiva experimentacion. \Manse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.°s 4.892.538; 5.011.472; y 5.106.627. Se describe un sistema para encapsular celulas vivas en el documento PCT WO 91/10425 (Aebischer etal.) . Los expertos en la tecnica tambien conocen tecnicas para formular una variedad de otros medios de administraci6n
sostenida o controlada, tales como portadores liposornicos, perlas o particulas bioerosionables, y se describen, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 5.653.975. Las celulas, con o sin encapsulacion, pueden implantarse en Organos o tejidos corporales adecuados del paciente.
Tab como se comento anteriormente, puede ser deseable tratar preparaciones celulares con uno o mas polipeptidos B7RP1, variantes, derivados y/o fragmentos. Esto puede lograrse exponiendo, por ejemplo, celulas que comprenden
celulas T, tales como celulas de medula osea, al polipeptido, la variante, el derivado o el fragmento directamente, cuando esta en una forma que es permeable para la membrana celular. Por ejemplo, pueden exponerse celulas que comprenden celulas T a un polipeptido B7RP1 con el fin de activar la fund& de celulas T y las celulas asi tratadas se implantan en el paciente.
Alternativamente, puede emplearse terapia genica. Una manera en la que puede aplicarse la terapia genica es usar un gen de B7RP1 (cualquiera de ADN gen6mico, ADNc y/o ADN sintetico que codifican para un polipeptido B7RP1,
o un fragmento, una variante o un derivado del mismo) que puede unirse operativamente a un promotor constitutivo
o inducible para formar un quot;constructo de ADN de terapia genicaquot;. El promotor puede ser homOlogo o heterologo con respecto al gen de B7RP1 end6geno, siempre que sea activo en el tipo de celula o tejido en el que se insertara el constructo. Otros componentes del constructo de ADN de terapia genica pueden incluir opcionalmente, segOn se requiera, moleculas de ADN disenadas para la integraci6n especifica de sitio (por ejemplo, secuencias flanqueantes
end6genas Utiles para la recombinaci6n homOloga), promotor especifico de tejido, potenciador(es) o silenciador(es), moleculas de ADN que pueden proporcionar una ventaja selectiva con respecto a la celula original, moleculas de ADN utiles como marcadores para identificar celulas transformadas, sistemas de seleccion negativa, agentes de uniOn especifica a celulas (como, por ejemplo, para direccionamiento celular), factores de internalizacion especificos
de celulas y factores de transcripci6n para potenciar la expresi6n mediante un vector asi como factores pare permitir la preparaci6n del vector.
Este constructo de ADN de terapia genica puede introducirse entonces en las celulas del paciente (o bien ex vivo o bien in vivo) . Un medio para introducir el constructo de ADN de terapia genica es por medio de vectores virales. Los vectores virales adecuados usados normalmente en terapia *lice para el suministro de constructos de ADN de terapia genica incluyen, sin limitaciOn, vectores de adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes simple, lentivirus, virus del papiloma y retrovirus. Algunos de estos vectores, tales como vectores retrovirales, suministraran el constructo de ADN de terapia genica al ADN cromos6mico de las celulas del paciente, y el constructo de ADN de terapia genica puede integrarse en el ADN cromosomico; otros vectores funcionaran como episomas y el constructo
de ADN de terapia *lice permanecera en el citoplasma. El uso de vectores de terapia genica se describe, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.°s 5.672.344, 5.399.346.
Los medios alternativos para suministrar constructos de ADN de terapia genica a las celulas de un paciente sin el uso de vectores virales incluyen, sin limitacion, transferencia mediada por liposomas, inyeccion directa de ADN desnudo, transferencia mediada por receptor (complejo ligando-ADN), electroporacion, precipitaci6n con fosfato de
calcio y bombardeo de microparticulas (por ejemplo, quot;pistola genicaquot;). Veanse las patentes estadounidenses n.°s 4.970.154, WO 96/40958, 5.679.559, 5.676.954 y 5.593.875.
Otros medios para aumentar las expresi6n de polipeptido B7RP1 end6geno en una celula por medio de terapia genica es inserter uno o mas elementos potenciadores en el promotor de polipeptido B7RP1, en los que el/los elemento(s) potenciador(es) puede(n) servir para aumentar la actividad transcripcional de un gen de polipeptido B7RP1. El/los elemento(s) potenciador(es) usado(s) se seleccionara(n) basandose en el tejido en el que se desea activar el/los gen(es); se seleccionaran elementos potenciadores que se sabe que confieren activacion del promotor en ese tejido. Por ejemplo, si va a quot;activarsequot; un polipeptido B7RP1 en celulas T, puede usarse el elemento potenciador del promotor Ick. En este caso, la parte funcional del elemento transcripcional que va a afiadirse puede insertarse en un fragmento de ADN que contiene un promotor de polipeptido B7RP1 (y opcionalmente, vector,
secuencia flanqueante en 5' y/o 3', etc.) usando tecnicas de cloned& convencionales. Este constructo, conocido como quot;constructo de recombinaci6n homologaquot; puede introducirse entonces en las celulas deseadas o bien ex vivo o bien in vivo.
Puede usarse terapia genica para disminuir la expresion de polipeptido B7RP1 modificando la secuencia de nucleotidos del/de los promotor(es) end6geno(s). Tal modificaciOn se logra normalmente por medio de metodos de recombinaci6n homologa. Por ejemplo, una molecule de ADN que contiene todo o una parte del promotor de un gen/genes de B7RP1 seleccionado(s) para su inactivacion puede modificarse mediante ingenieria genetica para eliminar y/o sustituir trozos del promotor que regulan la transcripcion. En este caso, la caja TATA y/o el sitio de union de un activador transcripcional del promotor pueden delecionarse usando tecnicas de biologia molecular convencionales; tal deleciOn puede inhibir la actividad del promotor reprimiendo de ese modo la transcripci6n del gen de B7RP1 correspondiente. La delecion de la caja TATA o el sitio de union del activador transcripcional en el promotor puede lograrse generando un constructo de ADN que comprende todo o la parte relevante de un promotor/promotores de polipeptido B7RP1 (de la misma o de una especie relacionada que un gen/genes de B7RP1 que va(n) a regularse) en el que uno o mas de los nucleotidos de la caja TATA y/o del sitio de uni6n del activador transcripcional se mutan por medio de sustitucion, delecion y/o inserci6n de uno o mas nucleotidos de modo que la
caja TATA y/o el sitio de union del activador tiene actividad disminuida o se vuelve completamente inactivo. Este constructo, que normalmente tambien contendra al menos aproximadamente 500 bases de ADN que se corresponden con las regiones fianqueentes en 5' y 3' natives (endOgenas) del segmento del promotor que se ha modificado, puede introducirse en las celulas apropiadas (o bien ex vivo o bien in vivo) o bien directamente o bien por medio de un vector viral tal como se describio anteriormente. La integraci6n del constructo en el ADN genomico
de las celulas sere normalmente por medio de recombinacion homologa, en la que las secuencias de ADN flanqueantes en 5' y 3' en el constructo de promotor pueden servir para ayudar a integrar la region de promotor modificada por medio de hibridaci6n en el ADN cromosomico endogeno.
Tambien pueden emplearse otros metodos de terapia genica en los que es deseable inhibir uno o mas polipeptidos B7RP1. Por ejemplo, pueden introducirse molecules de ADN o ARN antisentido, que tienen una secuencia que es
complementaria a al menos una parte de un gen/genes seleccionado(s) de polipeptido B7RP1 en la celula. Normalmente, cada una de tales molecules antisentido sera complementaria al sitio de iniciacion (extremo 5') de cada gen de B7RP1 seleccionado. Cuando la molecule antisentido se hibrida entonces con el ARNm de polipeptido B7RP1 correspondiente, se impide la traduccion de este ARNm.
Alternativamente, puede emplearse terapia genica para crear un inhibidor dominante negativo de uno o mas
polipeptidos B7RP1. En esta situaci6n, el ADN que codifica para un polipeptido truncado o de longitud complete mutante de cada polipeptido B7RP1 seleccionado puede prepararse e introducirse en las celulas de un paciente usando metodos o bien virales o bien no virales tal como se describio anteriormente. Cada uno de tales mutantes se disefia normalmente para competir con el polipeptido endogeno en su papel biolOgico.
Aoonistas y antagonistas
La presente descripciOn tambien proporciona agonistas y antagonistas de CRP1 o B7RP1 que regulan la actividad de cualquiera o ambas moleculas. Pueden identificarse agonistas y antagonistas a partir de moleculas de prueba que alteran la union de B7RP1 a CRP1.
El tannin° quot;molecula(s) de pruebaquot; se refiere a la(s) molecula(s) que esta(n) en evaluacion para determinar su
capacidad para unirse a un polipeptido CRP1 o B7RP1 y de ese modo alterar la uni6n de B7RP1 a CRP1. Preferiblemente, la molecula de prueba se unlit con una constante de afinidad de al menos aproximadamente 106 M.
Puede usarse una variedad de ensayos para medir la union de B7RP1 a CRP1. Estos ensayos pueden usarse para examinar moleculas de prueba para determinar su capacidad para aumentar o disminuir la tasa o el grado de union de B7RP1 a CRP1. En un tipo de ensayo, un polipeptido CRP1, preferiblemente una forma soluble de CRP1 tal como un dominio extracelular, se inmoviliza mediante union al fondo de los pocillos de una placa de microtitulacion. Entonces pueden afiadirse B7RP1 radiomarcado y la(s) molecula(s) de prueba o bien uno cada vez (en cualquier orden) o bien simultaneamente a los pocillos. Tras la incubacion, pueden lavarse los pocillos y contarse usando un contador de centelleo para determinar la radioactividad para determinar el grado de uni6n a proteina CRP1 por B7RP1. Normalmente, las moleculas se someteran a prueba a lo largo de un intervalo de concentraciones, y puede usarse una serie de pocillos de control quo carecen de uno o mas elementos de los ensayos de prueba para determinar la precision on la evaluacion de los resultados. Una alternativa a este metodo implica invertir las quot;posicionesquot; de las proteinas, es decir, inmovilizar B7RP1 en los pocillos de la placa de microtitulacion, incubar con la molecula de prueba y CRP1 radiomarcada y determinar el grado de union de CRP1 (vease, por ejemplo, el
capitulo 18 de Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel etal. , eds., John Wiley & Sons, Nueva York, NY [1995]).
Como alternativa al radiomarcaje, pueden conjugarse CRP1 o B7RP1 con biotina y puede detectarse entonces la presencia de proteina biotinilada usando estreptavidina unida a una enzima, tal como peroxidasa del rabano [HRP] o fosfatasa alcalina [AP], que pueden detectarse colorimetricamente o mediante etiquetado fluorescente de
estreptavidina. Tambien puede usarse un anticuerpo dirigido frente a CRP1 o B7RP1 quo esta conjugado con biotina y puede detectarse tras la incubaciOn con estreptavidina unida a enzima unida a AP o HRP.
Tambien pueden inmovilizarse CRP1 y B7RP1 mediante union a perlas de agarosa, perlas acrilicas u otros tipos de tales sustratos inertes. Puede ponerse el complejo de sustrato-proteina en una disolucion quo contiene la proteina complementaria y el compuesto de prueba; tras la incubacion, pueden precipitarse las perlas mediante
centrifugaciOn y puede evaluarse la cantidad de uniOn entre CRP1 y B7RP1 usando los metodos descritos anteriormente. Alternativamente, puede inmovilizarse el complejo sustrato-proteina en una columna y hacerse pasar la molecula de prueba y la proteina complementaria a lo largo de la columna. Entonces puede evaluarse la formacion de un complejo entre CRP1 y B7RP1 usando cualquiera de las tecnicas expuestas anteriormente, es decir, radiomarcaje, union a anticuerpos, o similares.
Otro tipo de ensayo in vitro quo es Otil para identificar una molecula de prueba quo aumenta o disminuye la formacion de un complejo CRP1/B7RP1 es un sistema de detector de resonancia de plasmones superficiales tal como el sistema de ensayo Biacore (Pharmacia, Piscataway, NJ). El sistema Biacore puede Ilevarse a cabo usando el protocolo del fabricante. Este ensayo implica esencialmente la union covalente de o bien CRP1 o bien B7RP1 a un chip sensor recubierto con dextrano quo se coloca on un detector. El compuesto de prueba y la otra proteina
complementaria pueden inyectarse entonces en la camara quo contiene el chip sensor o bien simultaneamente o bien secuencialmente y puede evaluarse la cantidad de proteina complementaria quo se une basandose on el carnbio on la masa molecular quo se asocia fisicamente con el lado recubierto con dextrano del chip sensor; puede medirse el cambio en la masa molecular mediante el sistema detector.
En algunos casos, puede ser deseable evaluar dos o mas compuestos de prueba juntos para su uso en el aumento
ola disminuciOn de la formaci6n de un complejo CRP1/B7RP1. En estos casos, los ensayos expuestos anteriormente pueden modificarse facilmente afiadiendo tal/tales compuesto(s) de prueba adicional(es) o bien simultaneamente con, o bien posteriormente a, el primer compuesto de prueba. El resto de las etapas en el ensayo son tal como se expuso anteriormente.
Pueden usarse ventajosamente ensayos in vitro tales como los descritos anteriormente para examinar rapidamente
grandes numeros de compuestos para determinar efectos sobre la formaciOn de complejos por CRP1 y B7RP1. Los ensayos pueden automatizarse para examinar compuestos generados en bibliotecas de presentaci6n en fago, de peptidos sinteticos y de sintesis quimica.
Tambien pueden examinarse compuestos quo aumentan o disminuyen la formaci6n de complejos de CRP1 y B7RP1 on cultivo celular usando celulas y lineas celulares quo expresan cualquier polipeptido. Pueden obtenerse celulas y Itneas celulares de cualquier mamifero, pero preferiblemente seran de fuentes de ser humano u otro primate, caninas o de roedor. La union de B7RP1 a celulas que expresan CRP1 en la superficie se evalita en presencia o ausencia de moleculas de prueba y puede determinarse el grado de uni6n mediante, por ejemplo, citometria de flujo usando un anticuerpo biotinilado frente a B7RP1. Pueden usarse ensayos de cultivo celular ventajosamente para evaluar adicionalmente compuestos de puntuacion positiva en ensayos de uni6n a proteinas descritos
anteriormente.
Usos terapeuticos
Los polipeptidos de la invenciOn, y agonistas y antagonistas de los mismos, pueden usarse para regular la funci6n de celulas T. Los agonistas y antagonistas incluyen aquellas moleculas que regulan la actividad de CRP1 y/o B7RP1 yo bien aumentan o bien disminuyen al menos una actividad de una proteina CRP1 o B7RP1 tal como una actividad asociada con funciones de celulas T, por ejemplo, activacion de celulas T. Los agonistas o antagonistas pueden ser cofactores, tales como una proteina, un peptido, un hidrato de carbono, un lipido o una molecula de peso molecular pequerio, que interaccionan con o bien CRP1 o bien B7RP1 y de ese modo regulan su actividad. Los posibles agonistas o antagonistas de polipeptidos incluyen anticuerpos que reaccionan con formas o bien solubles o bien
unidas a membrana de CRP1 o B7RP1 que comprenden parte de o todos los dominios extracelulares de dichas proteinas. Las moleculas que regulan la expresi6n de CRP1 o B7RP1 incluyen normalmente acidos nucleicos que codifican para proteina CRP1 o B7RP1 que pueden actuar como reguladores antisentido de la expresion.
Pueden usarse polipeptidos CRP1 o B7RP1, y agonistas y antagonistas de los mismos, en el tratamiento de enfermedad autoinmunitaria, supervivencia a injerto, activacion de celulas inmunitarias para inhibir el crecimiento de celulas tumorales, enfermedades mediadas por celulas B dependientes de celulas T e inmunoterapia genica contra el cancer. En una realizacion, los antagonistas o inhibidores de la funci6n de CRP1 y/o B7RP1 pueden ser beneficiosos para aliviar sintomas en enfermedades con disfunciOn de celulas inmunitarias cronica. Pueden tratarse enfermedades autoinmunitarias, tales como lupus eritematoso sisternico, artritis reumatoide, pOrpura trombocitopenica inmunitaria (PTI) y psoriasis, con antagonistas o inhibidores de CRP-1/B7RP-1. Adernas, tambien pueden tratarse enfermedades inflamatorias cronicas, tales como enfermedad inflamatoria del intestino (enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto y diabetes mellitus con inhibidores para CRP-1/B7RP-1. Tal como se describe en el ejemplo 18, CRP-1-Fc inhibe y B7RP-1-Fc potencia, la apariciOn de enfermedad en un modelo de enfermedad de artritis reumatoide de roedor. Estos efectos opuestos en este modelo apoyan un papel agonista para la proteina B7RP-1-Fc y un papel antagonista para la proteina CRP-1-Fc. Los
resultados tambien ilustran corn° pueden regularse las respuestas de celulas T mediante manipulacion de esta ruta y la importancia de esta ruta en la progresi6n de artritis reumatoide. Ademas, tal como se describe en el ejemplo 19, la expresiOn de B7RP-1-Fc in vivo estimula un fenotipo de enfermedad inflamatoria del intestino (Ell) en ratones transgenicos. Este ejemplo apoya el papel de B7RP-1/CRP-1 en el desarrollo de inflamacion en el intestino. For tanto, pueden usarse antagonistas de la ruta de B7RP-1/CRP-1 para tratar Ell humana.
Pueden usarse antagonistas de CRP1 o B7RP1 como agentes inmunosupresores para trasplante de medula osea y 6rganos y pueden usarse para prolongar la supervivencia del injerto. Tales antagonistas pueden proporcionar ventajas significativas con respecto al tratamiento existente. La terapia de trasplante de medula 6sea y 6rganos debe lidiar con el rechazo mediado por celulas T del tejido o las celulas foraneas por el huesped. Los regimenes terapeuticos actuales para inhibir el rechazo mediado por celulas T implican tratamiento con los farmacos
ciclosporina o FK506. Aunque los farmacos son eficaces, los pacientes padecen graves efectos secundarios, incluyendo hepatotoxicidad, nefrotoxicidad y neurotoxicidad. La diana para la clase de ciclosporina/FK506 de compuestos terapeuticos es calcineurina, una fosfatasa con expresion ubicua. Puesto que la expresion de CRP1 esta restringida a celulas T, los inhibidores de CRP1 o B7RP1 pueden carecer de los graves efectos secundarios observados con el uso de los agentes inmunoterapeuticos actuales.
Pueden usarse antagonistas de CRP1 o B7RP1 como agentes inmunosupresores para trastornos autoinmunitarios, tales como artritis reumatoide, psoriasis, esclerosis mirltiple, diabetes y lupus eritematoso sistemico.
Tambien pueden usarse antagonistas de la ruta coestimuladora mediada por CRP1/B7RP1 para aliviar sindrome de choque toxic°, enfermedad inflamatoria del intestino, alosensibilizaciOn debida a transfusiones de sangre, enfermedades mediadas por celulas B dependientes de celulas T y el tratamiento de enfermedad de injerto contra
huesped.
Pueden usarse anticuerpos, proteinas solubles que comprenden por ejennplo dominios extracelulares y otros reguladores de CRP1 o B7RP1 que dan como resultado activacion de celulas T prolongada o potenciada para aumentar la respuesta inmunitaria frente a tumores. El ejemplo 20 muestra que B7RP-1-FC puede inhibir el crecimiento de celulas tumorales en ratones. De manera similar, pueden usarse B7RP-1-Fc humana, u otros activadores de la ruta de B7RP-1/CRP-1, para potenciar respuestas inmunitarias contra tumores humanos. Generalmente se considera que la actividad antitumoral tiene un componente de linfocitos T citoliticos fuerte. De hecho, los efectos antitumorales de proteinas de fusion B7-Fc (Sturmhoefel et al., Cancer Res. 59: 4964-4972, 1999) estaban mediados por celulas T CD8+ citoliticas. Puesto que CRP-1 tambien se expresa en celulas T CD8+ citoliticas (ejemplo 9), es probable que los efectos antitumorales demostrados en el ejemplo 20 se debieran a la
accion de B7RP-1-Fc sobre celulas CD8+. La ruta de B7RP-1/CRP-1 tambien puede manipularse para regular la respuesta de CTL en varios otros entornos clinicos, incluyendo trasplante de aloinjerto, enfermedad de injerto contra huesped y enfermedades autoinmunitarias.
Puede usarse terapia genica usando genes de B7RP1 de la invencion en inmunoterapia contra el cancer. Los genes de B7RP1 introducidos en celulas cancerosas pueden transformarlas en celulas presentadoras de antigen° que
pueden reconocerse por las celulas T del sistema inmunitario cuando vuelven a introducirse en un animal. El
reconocimiento de las celulas tumorales transfectadas por las celulas T da como resultado la erradicaciOn de las celulas tumorales tanto que expresan como que no expresan, el gen de B7RP1. Este enfoque de inmunoterapia puede usarse para diversas leucemias, sarcomas, melanomas, adenocarcinomas, carcinomas de mama, tumores de
pr6stata, carcinomas de pulmon, carcinomas de colon y otros tumores. Esta invencion abarca el uso del gen de B7RP1 de manera similar para potenciar la activaciOn de celulas T en respuesta a una variedad de tumores.
Tal como se describe en el ejemplo 14, el fenotipo de ratones transgenicos que expresan B7RP1 indica que B7RP1 es importante en el control de la producci6n de anticuerpos. Los agonistas y antagonistas de la actividad de la proteina B7RP1 pueden ser (tiles en indicaciones terapeuticas que requieren la inhibicion o potenciaci6n de la
produccion de anticuerpos.
Por ejemplo, muchas vacunas actilan provocando una respuesta de anticuerpos eficaz y especifica. Algunas vacunas, especialmente aquellas contra microorganismos intestinales (por ejemplo virus de la hepatitis A y salmonelas), provocan una respuesta de anticuerpos de vida corta. Es deseable potenciar y prolongar esta respuesta con el fin de aumentar la eficacia de la vacuna. Por tanto, B7RP1 soluble o anticuerpos activantes frente a
CRP1 pueden servir como adyuvante de vacuna.
Tambien pueden potenciarse respuestas antivirales mediante activadores o agonistas de la ruta de B7RP-1/CRP-1. Los datos en el ejemplo 20 indican que se potencia la inmunidad celular mediante B7RP-1-FC. La potenciacion de funciones inmunitarias celulares mediante B7RP-1-Fc, u otros activadores de la ruta de B7RP-1/CRP-1, tambien puede ser beneficiosa en la eliminacion de celulas infectadas por virus. De un modo complementario, B7RP-1-Fc
tiene efectos sobre funciones inmunitarias humorales que pueden potenciar respuestas mediadas por anticuerpos tal como se observa en el ejemplo 13 que pueden funcionar para ayudar a aclarar el virus libre del organismo.
A la inversa, existen varios estados clinicos que mejorarian mediante la inhibicion de la producci6n de anticuerpos. La hipersensibilidad es una respuesta inmunitaria normalmente beneficiosa que es exagerada o inapropiada, y conduce a reacciones inflamatorias y dem tisular. Las reacciones de hipersensibilidad que estan mediadas por
anticuerpos pueden ser particularmente susceptibles a antagonismo mediante inhibidores de la actividad de B7RP1. Alergias, rinitis polinica, asma y edema agudo provocan reacciones de hipersensibilidad de tipo I, y estas reacciones pueden suprimirse mediante inhibidores de proteina, anticuerpo o molecula pequeria de la actividad de B7RP1.
Las enfermedades que provocan reacciones de hipersensibilidad mediadas por anticuerpos, incluyendo lupus eritematoso sistemico, artritis (artritis reumatoide, artritis reactiva, artritis psoriasica), nefropatias (glomerulonefritis,
membranosa, mesangiocapilar, focal y segmentaria, necrotizante focal, crescentica, proliferativa -tubulopatias), trastornos cutaneos (penfigo y penfigoide, eritema nudoso), endocrinopatias (tiroiditis, de Grave, de Hashimoto, diabetes mellitus insulinodependiente), diversas neumopatias (especialmente alveolitis extrinseca), diversas vasculopatias, enfermedad celiaca, con produccion aberrante de IgA, muchas anemias y trombocitopenias, sindrome de Guillain-Barre y miastenia grave, pueden tratarse con antagonistas de B7RP1.
Adernas, pueden inhibirse trastornos linfoproliferativos, tales como mieloma mUltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom y crioglobulinemias, mediante antagonistas de proteina, anticuerpo o molecula pequefia de B7RP1.
Finalmente, la enfermedad de injerto contra huesped, un trastorno inmunitario quot;artificialquot;, puede beneficiarse de la inhibicion de la produccion de anticuerpos mediante antagonistas de B7RP1.
Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar mas completamente la invencion, pero no se considera que limiten el alcance de la misma.
Ejemolo 1
Secuencia de aminoacidos y de ADNc de CRP1
Se sacrificaron ratones C57/Black 6 hembra, y se extirparon los intestinos delgados y se separaron los parches de Peyer. Se abrio mediante corte el tejido del intestino delgado y se lave) para eliminar la mucosidad y otros residuos. Selibero la capa epitelial, que contiene las celulas intrahepiteliales intestinales (iIEL), mediante agitaci6n suave en RPMI-1640 complementado con ditiotreitol 1 mM (DTT), durante 20 minutos a 37°C. Se hicieron pasar celulas disociadas a traves de un filtro de 100 IA, se lavaron en 50 ml de RPMI-1640, se mezclaron para romper adicionalmente los grumos de celulas y entonces se hicieron pasar a traves de un cedazo de 40 IA para obtener poblaciones de celulas individuales. Entonces se lavaron de nuevo estas celulas en un volumen de 50 ml de RPMI1640 para garantizar la eliminacion del DTT residual. Entonces se agito el tejido y se lavo como anteriormente para reunir las ilEL restantes. Se separaron las ilEL de las celulas adiposas y la mayoria de las celulas epiteliales en un gradiente de Percol de 3 etapas, formando una banda las IIEL en la superficie de contacto del 40% al 80%. Entonces se lavaron estas celulas dos veces con RPM 1-1640 para eliminar trazas de Percol, se inmunotifieron con anticuerpos frente a CD103 (integrina alfa IEL) y se separaron en un clasificador celular FACs Star. Entonces se usaron estas celulas clasificadas para preparar ARN total directamente usando Trizol (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), o se activaron durante la noche sobre anticuerpos activantes unidos a placas, que reticulan el TCR gamma/delta, TCR alfa/beta o CD3. Se prepare) el ARN como anteriormente y se agrup6 para su uso en la construcciOn de bibliotecas
de ADNc de EST.
Un don de ADNc, designado smiI2-00082-al, contenia homologia de secuencia de nucleotidos con CD28 (figura 1B). La traducci6n de la secuencia y la posterior comparacion con proteinas conocidas en una base de datos pCiblica revelaron un 19% de identidad de aminoacidos con CD28 murina (figura 1B). Esta baja homologia era significativa
porque CD28 murina comparte solo un 26% de identidad de aminoacidos con CTLA-4 murina. Se encontro que todas las supuestas cisteinas que se pensaba que eran criticas para uniones de cisteina intra e intermoleculares en la familia de CD28/CTLA-4 estaban conservadas (residuos de aminoacido 83, 109 y 137; en relaciOn con la metionina de iniciaci6n). Ademas, la longitud global del marco de lectura abierto supuesto y la posici6n relativa del dominio transmembrana eran similares a las de tanto CD28 coma CTLA-4. Se nombr6 el gen CRP1, para proteina 1 relacionada con CD28.
Ejemplo 2
Clonacion de ADNc de CRP1 humana
Se identifica la secuencia de acido nucleico que codifica para la proteina CRP1 humana mediante los siguientes procedimientos. Se preparo una biblioteca de ADNc humano a partir de linfocitos enriquecidos de sangre humana periferica de voluntarios humanos normales. Se purificaron lot linfocitos y se eliminaron los globulos rojos mediante medios de separacion de linfocitos (ICN Pharmaceuticals, Inc., Costa Mesa, CA). Entonces se activaron las celulas durante la noche en medios que contenian PMA 10 ng/ml, ionomicina 500 ng/ml y anticuerpos activantes unidos a placas frente a CD3. Se preparo ARN total a partir de las celulas activadas mediante el metodo de Trizol (Gibco/BRL) y se aislo ARN de poli A mediante purificacion con perlas Dynal. Se prepar6 ADNc a partir del ARN de poli A aislado y se seleccion6 el tame° para los fragmentos de ADNc mas grandes. Entonces se ligo el ADNc de tamario seleccionado en el plasmido pSPORT (Gibco/BRL). Se obtiene ADN que codifica para la proteina CRP1 humana examinando la biblioteca de ADNc de linfocitos activados mediante protocolos de hibridaci6n de o bien placas de bacteri6fagos recombinantes o bien colonias de bacterias transformadas (Sambrook et al. Citado anteriormente). Se examina la biblioteca de ADNc de fagos o plasmidos usando sondas marcadas radiactivamente derivadas del clan del gen de CRP1 murina tal como se describe en el ejemplo 1 y la figura 1. Se usan las sondas para examinar filtros de nailon obtenidos par levantamiento a partir de la biblioteca sembrada en placas. Se hibridan previamente estos filtros durante 4 h a 42°C en formamida al 50%, 5X SSPE, 2X soluciOn de Denhardt, SDS al 0,5% y ADN de esperma de salmon 100 pg/m1 y luego se hibridan durante 24 h a 42°C en formamida al 50%, 5X SSPE, 2X soluciOn de Denhardt, SDS al 0,5%, ADN de esperma de salmOn 100 gg/m1 y sonda mB7RP1 5 ng/ml. Se lavan las transferencias en 2X SSC, SDS al 0,1% durante 10 min. a TA, 1X SSC, SDS al 0,1% durante 10 min. a 50°C, 0,2X SSC, SDS al 0,1% durante 10 min. a 50°C, luego 0,2X SSC durante 10 min. a 50°C de nuevo. Se secuencian los insertos obtenidos a partir de cualquier don de CRP1 humana y se analizan tal como se describe en el ejemplo
1.
Ejemplo 3
Secuencia de aminoacidos y ADN de B7RP1
Un clan de ADNc, designado smi11-00003-g5, contenia homologia de secuencia de nucleotidos con B7.1 (CD80) y B7.2 (CD86). La traduccion de la secuencia (figura 2A) y la posterior comparacion con proteinas conocidas en una base de datos publica revelaron un 20% de identidad de aminoacidos con B7.1 murina (figura 2B). Esta baja homologia era significativa porque B7.1 murina comparte sOlo un 24% de identidad de aminoacidos con B7.2
murina. A pesar de esta baja homologia, se conservan residuos de cisteina criticos entre el marco de lectura abierto de este clan y B7.1 y B7.2 murinas en los residuos 62, 138, 185 y 242 (en relacion con la metionina de iniciaciOn, figura 2B). La longitud de la proteina madura aproximada y la ubicaciOn de la regi6n transmembrana en relaciOn con el extremo carboxilo-terminal son tambien similares en el ORF supuesto de este clan, en comparaciOn con B7.1 y B7.2. Se nombrO el gen B7RP1, para proteina 1 relacionada con B7.
Eiemplo 4
Clonacion de ADNc de B7RP1 humana
Una bOsqueda de homologia Blast en Genbank (GCG, University of Wisconsin) usando la secuencia de B7RP1 murina (vease la figura 2) recuperO un clan (AB014553) que contenia una secuencia de 4358 pb con 1679 pb de ORE. Se disenaron cebadores de clonacion de PCR segun esta secuencia. Se obtuvo un fragmento de ADN de
1313 pb mediante RACE en 5' y 3' usando ADNc de ganglios linfaticos humanos Marathon-ReadyTM (Clontech, Palo Alto, CA) segiin los procedimientos recomendados par el fabricante.
Cebadores usados para B7RP1 humana de longitud completa:
2083-75 ACCATG CGG CTG GGC AGT CCT GGA
(SEQ ID NO: 25)
2083-76 TGGTGA CCT ACC ACA TCC CAC AG
(SEQ ID NO: 26)
2083-77 TCCGAT GTC ATT TCC TGT CTG GC
(SEQ ID NO: 27)
5 2083-78 GCTCTG TCT CCG GAC TCA CAG CCC
(SEQ ID NO: 28)
2113-29 GTGGCA GCA AAC TTC AGC GTG CCC GTC G
(SEQ ID NO: 29)
2113-30 CCC MC GTG TAC TGG ATC MT MG ACG G
10 (SEQID NO: 30)
2113-31 GCGTGC TGA GGA TCG CAC GGA CCC CCA G
(SEQ ID NO: 31)
Se usaron los cebadores 2083-75 y 2083-76 para amplificar el extremo 5' del gen usando protocolos de RACE. Se usaron los cebadores 2083-77, 2083-78, 2113-29, 2113-30 y 2113-31, para amplificar el extremo 3' del gen usando 15 protocolos de RACE.
La secuencia de nucleotidos resultantes contenia un ORF de 288 residuos de aminoacido que comenzaba en la metionina. Entonces se compar6 la secuencia de aminoacidos de B7RP1 humana madura predicha con la secuencia de aminoacidos de B7RP1 de ratOn madura (figura 3B) y se encontr6 que compartian un 48% de identidad de aminoacidos. Esta homologia es significative porque la homologia entre especies es baja con el gen de CD80
20 (B7.1), de hecho, CD80 humana y de ratan comparten sOlo un 41% de identidad de aminoacidos. De manera importante, la proteina B7RP1 humana conserve residuos de cisteina criticos necesarios para estructuras de bucles de Ig (residuos de aminoacido 16, 92, 138, 194 y 195, en relacion con la proteina madura, figura 3B). Ademas, la longitud global y la posicion del dominio transmembrana concuerdan con un hornologo de B7RP1 humana.
Ejemplo 5
25 Expresion de ARN de B7RP1
Hibridacion in situ de ARN usando sondas de ARN para el gen de B7RP1. Se fijaron tejidos de ratan adulto en paraformaldehido al 4%, se incrustaron en parafina y se cortaron a 5 pin Antes de la hibridacion in situ, se permeabilizaron los tejidos con HCL 0,2 M, seguido por digestiOn con proteinasa K, y acetilacion con trietanolamina y anhidrido acetic°. Se hibridaron las secciones durante la noche a 55°C con una ribosonda marcada con 33P de 969 30 bases correspondiente a los nucleotidos 1 a 969 de la secuencia de B7RP1 de rat6n. Se elimino la sonda en exceso mediante digestion con ARNasa, seguido por una serie de lavados en tamp6n con concentraciones de sal decrecientes, y luego un lavado de alta rigurosidad en 0,1X SSC a 55°C. Se mojaron los portaobjetos en emulsion NTB2 de Kodak, se expusieron a 4°C durante 2-3 semanas, se revelaron y se contratifieron con hematoxilina y eosina. Se examinaron las secciones con campo oscuro e iluminaciOn con luz transmitida para permitir la evaluacion
35 simultanea de la morfologia tisular y la serial de hibridaciOn.
El anelisis del ARN de B7RP1 mediante hibridacion in situ mostr6 que el ARN de B7RP1 se expresaba altamente en zonas de maduraci6n linfoide y activaciOn de linfocitos. Se expresaba ARN de B7RP1 en los tejidos linfoides del timo, parches de Peyer del intestino, bazo y ganglios linfaticos. La expresi6n dentro de estos tejidos linfoides demostr6 que el ARN de B7RP1 se expresaba generalmente en las zonas de implicacion de celulas B y otras CPA. 40 Estas regiones incluyen la zona de la medula del timo, los foliculos primarios de los ganglios linfaticos, y las regiones folicular y de cOpula de los parches de Peyer. La expresion de ARN de B7RP1 es altamente especifica para las regiones de implicacion de CPA en tejidos linfoides. El analisis de varios tejidos no linfoides tambien revel6 expresi6n de B7RP1 en regiones de implic,acion de CPA. En el pulmOn, se encontra expresion de B7RP1 en las regiones submucosas, lo que concuerda con una fund& en el procesamiento de antigenos. En el intestino delgado,
45 seencontro ARN de B7RP1 en la lamina propia. De manera notable, se encontr6 una secci6n de higado dead°, que mostraba infiltracion de linfocitos que se solapaba con la expresi6n de ARN de B7RP1. Esta coincidencia de expresi6n de B7RP1 con acumulacion de linfocitos en respuesta a deo tisular indica fuertemente que B7RP1 este implicada en la activacion de linfocitos.
Ejemplo 6
50 Expresi6n de ARN de CRP1
Hibridacion in situ de ARN usando sondas de ARN para el gen de CRP1. Se prepararon tejidos de rat& como en el
ejemplo 5. La permeabilizacion del tejido, la hibridacion de las sondas, el tratamiento de los portaobjetos y la find de los tejidos fueron tal como se describe en el ejemplo 5. Se hibridaron secciones durante la noche a 55°C con una ribosonda marcada con 33P de 603 bases correspondiente a los nucleotidos 1 a 603 de la secuencia de CRP1 de
raton. Se examinaron las secciones con campo oscuro e iluminaciOn con luz transmitida para permitir la evaluacion simultanea de la morfologia tisular y la senal de hibridaci6n.
Se extirparon ganglios linfaticos de ratones normales o un rat& tratado con oxazolona y se analizaron para determinar la expresi6n de ARN de CRP1. El ganglio linfatico de rat6n sensibilizado mostraba mayor expresion de ARN de CRP1 que el ganglio linfatico de ratOn normal. La expresion de CRP1 era en la paracorteza, una region de
actividad de celulas T. Por tanto, la expresi6n de ARN de CRP1 concuerda con la expresiOn de linfocitos T y se regula por incremento tras la activaciOn de celulas T.
Ejemplo 7
Expresi6n y purificaciOn de proteinas de fusi6n CRP1-Fc y B7RP1-Fc
Para construir el vector de expresi6n de ADN para la proteina de fusion CRP1-Fc, se fusion6 la secuencia
codificante para los primeros 147 aminoacidos amino-terminales del CRP1, en marco, con la secuencia codificante para los 235 aminoacidos carboxilo-terminales del gen de Fc humano (isotipo IgG1) y se ligaron dentro de la secuencia de poliligador de pcDNA3 (pcDNA3/CRP1-Fc). Para construir el vector de expresi6n de ADN para la proteina de fusiOn B7RP1-Fc, se fusiono la secuencia codificante para los primeros 269 aminoacidos aminoterminales de la B7RP1, en marco, con la secuencia codificante para los 235 aminoacidos carboxilo-terminales del gen de Fc humano (isotipo IgG1) y se ligaron dentro de la secuencia de poliligador de pcDNA3 (pcDNA3/B7RP1-Fc). Las secuencias codificantes de tanto CRP1 como B7RP1 contenian secuencias del extremo N-terminal de cada proteina hasta, pero no incluyendo, la region transmembrana supuesta de cada proteina. Se transfectaron celulas 293T con o bien pcDNA3/CRP1-Fc o bien pcDNA3/B7RP1-Fc usando el reactivo de transfeccion FuGene 6 (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN). Tras cuatro dias, se recogieron los medios condicionados y se purificaron las proteinas de fusion de Fc mediante cromatografia discontinua usando proteina A Sepharose (Pharmacia). Se eluyeron las protelnas de fusi6n de Fc unidas a la columna con tres volumenes de columna de tampon de elucion lmmunopure Gentle (Pierce), y entonces se dializaron frente a 150 volOmenes de HEPES 20 mM, NaC1 100 mM, pH 7,5. Se concentro la proteina dializada usando concentrados centrifugos Macrosep, MWCO de 30 kD (Pall Filtron), y se calcularon las concentraciones de proteina usando coeficientes de extinciOn derivados de la secuencia de aminoacidos de cada proteina. Se muestra la expresi6n de la proteina de fusi6n CRP1-Fc en la figura 4A, se muestra la expresion de la proteina de fusion B7CPR1-Fc en la figura 4B.
Ejemplo 8
Identificacion de CRP1 y B7RP1 como pareja de receptor-ligando
Con el fin de determinar si las proteinas novedosas eran parte de la misma ruta coestimuladora que la que contiene
CD28, CTLA-4, B7.1 y B7.2, se utilizO un ensayo de presentacion en la superficie celular. Este ensayo usa analisis ACAS (analisis y clasificacion de celulas adherentes) para analizar si proteinas unidas a la membrana expresadas en celulas interaccionan con diversas proteinas de fusi6n de Fc. Se incubaron celulas que expresaban proteinas unidas a la membrana, indicadas en el lado izquierdo de la figura 5, con proteinas de fusiOn de Fc, indicadas en la parte superior de la figura.
Se sembraron en placa celulas Cos-7, hechas crecer en medios DMEM con FBS al 10%, a 500.000 celulas/pocillo en una placa de 24 pocillos. Se transfectaron las celulas usando el reactivo FuGene 6 (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN). Para cada transfecciOn, se ariadieron 3 1.11 de reactivo FuGene 6 a 47 pl de medio DMEM libre de suero. Tras una incubacion de 10 min. a temperatura ambiente, se afiadio la mezcla a 0,25 pg de plasmido gota a gota y entonces se incubo durante 15 minutos. Entonces se ariadiO la mezcla anterior a las celulas
con 0,5 ml de DMEM con FBS al 10%. Se incubaron las celulas a 37°C en una atm6sfera del 5% de CO2. Como control, se sembraron en placa tambien celulas CHO D, transfectadas de manera estable con un plasmido de expresion que contenia el ADNc para CD28 humana, a 500.000 calulas/pocillo en una placa de 24 pocillos.
Tras 48 h, se elimino el medio con reactivo de transfecciOn y se lavaron las celulas dos veces con RPM! mas FBS al 5%. Se afiadieron de 10 a 20 ng de proteinas de fusiOn de Fc purificadas en 1 ml de medio a las celulas, que se incubaron durante 30 min. sobre hielo. Se lavaron las celulas tres veces con RPM! mas FBS al 5% y entonces se
incubaron con 2 j.tl de anticuerpo anti-Fc humano conjugado con FITC (1 mg/ml) durante otros 30 min. sobre hielo. Tras tres lavados sucesivos con RPMI, se cubrieron las celulas con 250 itI de medio RPMI sin rojo fenol para el analisis ACAS.
El analisis ACAS de las celulas que se unfan a las diversas proteinas de fusi6n de Fc demostro que la proteina B7RP1 se unia a CRP1, pero no a las proteinas en la ruta coestinnuladora conocida, CD28 o CTLA-4. A la inversa, CRP1 interaccionaba con B7RP1, pero no con 87.2, un componente en la ruta conocida. (Vease la figura 5). Estos resultados indican fuertemente que CRP1 y B7RP1 representan una pareja de receptor-ligando novedosa, analoga a
CD28 y B7.2. Sin embargo, puesto que CRP1 y B7RP1 no interaccionan con B7.2, CTLA-4 o CD28, ester) separadas y son independientes de la ruta coestimuladora conocida.
Ejemplo 9
Identificacion de celulas que expresan receptores de B7RP1
SeutilizO la proteina de fusion B7RP1-Fc para detectar celulas que expresaban receptores para B7RP1, presumiblemente incluyendo la proteina CRP1 (vease el ejemplo 6), mediante analisis de FACS. Se extrajeron bazos de ratones C57/Black 6 hembra, se trituraron sobre filtros de malla de 100 micr6metros para liberar los linfocitos, se hicieron pasar a trues de filtros de 70 micr6metros y entonces se lavaron en 50 ml de RPMI-1640. Se sedimentaron a 1500 rpm, se resuspendieron en RPM! nuevo, se mezclaron para romper los grumos de celulas y se
hicieron pasar a traves de un filtro de 40 micremetros. Se sembraron las celulas T que iban a activarse en places de 6 pocillos en RPMI-1640, FBS al 5%, 1XPSG, PMA, ionomicina, y se incubaron a 37°C, el 5% de CO2 durante la noche. Se comprob6 la activaciOn de celulas T mediante confirmaciOn visual tras 12 h.
Se lavaron celulas de bazo activadas para la inmunotinciOn en tampon de lavado de PBS, BSA al 0,5% (Path-ocyte 4, ICN Pharmaceuticals), se resuspendieron y entonces se alicuotaron en volumenes de 100 1.11 Se atiadieron 15iig/m1 de o bien la proteina de fusion CRP1-Fc o bien la proteina de fusion B7RP1-Fc (1,5 pg/muestra) segun fuese apropiado, y entonces se incubaron las mezclas sobre hielo durante 30 min. con mezclado ocasional. Se lavaron las celulas dos veces en 5,0 ml de tampOn de lavado. Se visualize) la uniOn de las proteinas de fusiOn con 2 14 de anticuerpo secundario de cabra conjugado anti-ser humano (GaHuFc-FITC) en un volumen de 100 41 para cada tinci6n celular. Se ariadieron anticuerpos frente a marcadores celulares conjugados con PE con el GaHUFcFITC, asi como controles de anticuerpo conjugado con PE de isotipo control cuando se indique (isotipo de rata). Se incubaron as muestras sobre hielo y se lavaron como anteriormente. Se realizO la visualizacion mediante analisis de FACScan con separacion en las poblaciones de linfocitos. La tinciOn doble con anticuerpos CD4+ y la proteina de fusiOn B7RP1-Fc indico que las celulas expresaban tanto el marcador CD4 como el receptor para B7RP1, presumiblemente CRP1 (figura 6). De manera similar, la tincion doble con anticuerpos CD8+ y la proteina de fusi6n
B7RP1-Fc demostr6 que las celulas expresaban receptores para tanto CD8 como B7RP1 (figura 6). No pudo detectarse de manera fiable celulas con tal tinci6n doble en preparaciones de esplenocitos inactivados. Puesto que CD4 y CD8 son marcadores de linfocitos T, puede postularse que CRP1 se expresa en celulas T CD4+ y CD8+ activadas. Estos datos concuerdan con el aumento de la expresi6n de ARN de CRP1 en las regiones de celulas T de ganglios linfaticos de ratones sensibilizados en comparaci6n con ratones normales (ejemplo 6).
Ejemplo 10
Identificacion de celulas que expresan ligandos de CRP1
Se utilizO la proteina de fusi6n CRP1-Fc para detectar celulas que expresaban ligandos para CRP1, presumiblemente incluyendo la proteina B7RP1 (vease el ejemplo 8), mediante analisis de FAGS (figura 7). Se prepararon esplenocitos como en el ejemplo 8, excepto porque se omitiO la etapa de activacien de celulas T de 12 h yse analizaron directamente las celulas. Se tifieron de manera doble esplenocitos con anticuerpos frente al marcador CD45R (B220) y la proteina de fusiOn CRP1-Fc. Se detectaron celulas que expresaban tanto el marcador de celulas B CD45R como los supuestos ligandos para CRP1, presumiblemente incluyendo B7RP1 (ejemplo 8). Por tanto, se concluye que B7RP1 se expresa en celulas B, un tipo de celula presentadora de antigeno. Estos datos
concuerdan con la expresiOn de ARN de B7RP1 en regiones de celulas B de diversos tejidos linfoides (ejemplo 5).
Ane!Isis de FAGS de la expresiOn de B7RP1 sobre macrOfagos peritoneales (figura 8). Se recogieron celulas peritoneales mediante lavado local de un ratOn normal y se lavaron antes de incubarse con la proteina de fusion CRP1-Fc o la proteina Fc como control o con el anticuerpo monoclonal frente a F4/80 (que detecta un antigen° especifico para macrofagos) o un anticuerpo monoclonal de control irrelevante, de isotipo coincidente. Entonces se lavaron las celulas de nuevo y se incubaron con anticuerpo de cabra anti-Fc humano conjugado con FITC. Tras laver adicionalmente, se evaluaron las celulas en un analizador de FAGS para determinar su dispersi6n de luz y propiedades de tincion de fluorescencia. Se distinguieron en primer lugar celulas peritoneales en subconjuntos en el nivel inferior de sus propiedades de dispersi6n de luz (figura 8A). Se identificaron macrofagos en la region 5 (R5) debido a su capacidad para dispersar fuertemente la luz hacia delante (FSC) y hacia los lados (SSC) y debido a su tinci6n positive para el antigeno F4/80, un marcador para macrefagos (figura 8B). Se individualizaron macrofagos en
la region 6 (R6) basandose en su find& menos intensa para el antigeno F4/80 y se encontro que se terlian mediante la proteina de fusion CRP1-Fc (figura 8C). Estos datos indican que se expresan ligandos para CRP1, posiblemente incluyendo B7RP1, en macr6fagos, una celula presentadora de antigeno profesional. Esto concuerda con la funcion de CRP1 y B7RP1 en la activacion de linfocitos T.
Ejemplo 11
Actividad inhibidora in vitro de la proteina de fusi6n B7RP1-Fc sobre linfocitos T estimulados con ConA
Se prepararon esplenocitos de rat6n como en el ejemplo 8 y se enriquecieron en linfocitos T mediante seleccion negative (R and D Systems, Inc., Minneapolis, MN)). Se usaron 200.000 esplenocitos en ensayos de proliferacion de
celulas T en una placa de fondo redondo de 96 pocillos. Se incubaron las celulas durante 1 h con medio (sin adiciones), proteinas de fusiOn CRP1-Fc, B7RP1-Fc o B7.2-Fc, tal como se indica en la figura 9. Se afiadieron medio (sin adiciones), o Con A a diversas concentraciones tal como se indica en la parte inferior de la figura 9. Entonces se incubaron las celulas a 37°C y el 5% de 002. Tras 42 h, se pulsaron las celulas con 3H-timidina durante 6 h, se
recogieron y se determino la radioactividad incorporada. Se representan en la figura 9 las CPM promedio y la desviacion estandar de muestras por triplicado.
Las proteinas de fusi6n de Fc no demostraron actividad inhibidora o estimuladora de celulas T significativa por si mismas, sin embargo, en presencia de Con A 11..tg/m1 y 3 jig/ml, las proteinas de fusi6n tanto B7RP1-Fc como B7.2- Fc mostraron actividad inhibidora significativa (figura 9). A altas concentraciones (10 pg/m1), la estimulacion con Con
Ada como resultado muerte celular, presumiblemente a traves de sobreactivacion de las colulas T. La adici6n de o bien B7RP1-Fc o bien B7.2-Fc protegia significativamente las celulas de los efectos perjudiciales de altas concentraciones de Con A. En funciones tanto inhibidoras como protectoras, el efecto por la proteina B7RP1-Fc era mayor que el de la proteina B7.2-Fc sobre las celulas estimuladas con Con A. Estos datos indican que la proteina B7RP1 funciona regulando la proliferacion de celulas T.
Eiemolo 12
AdministraciOn sistemica de proteina de fusi6n B7RP1-Fc en ratones transgenicos
Se subclone) la proteina de fusi6n B7RP1-Fc descrita en el ejemplo 7 en un vector de expresion especifico de higado ApoE (Simonet etal. J. Olin. Invest. 94, 1310-1319 (1994) y solicitud PCT n.° US94/11675). Se corto la region codificante de pCEP4/B7RP1-Fc usando las enzimas de restricci6n Spe I y Not I, y se subclon6 el fragmento en los
mismos sitios en el vector de expresiOn especifico de higado ApoE mencionado anteriormente. Se secuencie) el plasmido resultante, HE-B7RP1-Fc, a trues de su regi6n que codifica para proteina, y las secuencias que flanquean la region codificante, para garantizar que estaba libre de mutaci6n.
Se amplifico el plasmido y se purific6 a traves de dos rondas de centrifugacion en gradiente de densidad de CsCl. Se digiri6 el ADN de plasmido purificado con las enzimas de restricci6n Cla I y Ase I, y se purifico el insert() transgenico de 1,5 kb mediante electroforesis en gel de agarosa. Se diluy6 el fragmento purificado en una disolucion de inyecci6n madre de 1 jig/m1 en Tris 5 mM, pH 7,4 y EDTA 0,2 mM. Se sometieron a inyeccion embriones unicelulares de ratones cruzados BDF1 X BDF1 esencialmente tal como se describe (Brinster et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4338 (1985)), excepto porque las agujas de inyecci6n se biselaron y siliconizaron antes de su uso. Se cultivaron los embriones durante la noche en un incubador con CO2 y se transfirieron de 15 a 20 embriones
de2 celulas a los oviductos de ratones hembra CD1 pseudoprefiadas.
Tras el periodo de embarazo, se obtuvieron 56 crias de la implantacion en los embriones microinyectados. Se examinaron las crias mediante amplificacion por PCR del transgen integrado en muestras de ADN gen6mico. La regi6n diana para la amplificacion era una regi6n de 369 pb del intr6n Apo E humano que se incluy6 en el vector de expresi6n. Los oligos usados para la amplificaciOn por PCR fueron:
5'-GCC TCT AGA AAG AGO TGG GAC-3' (SEQ ID NO: 32)
5'-CGC CGT GTT CCA ITT ATG AGC-3' (SEQ ID NO: 33)
Las condiciones para la PCR fueron: 94°C durante 2 min., 1 ciclo; 94°C durante 1 min., 63°C durante 20 s y 72°C durante 30 s, 30 ciclos. De las 56 crias originales, se identificaron 7 como ratones fundadores transgenicos positivos por PCR.
Alas 12 semanas de edad, se sacrificaron nueve fundadores transgenicos (rat& n.° 1, 2, 4, 6, 8, 30, 32, 33, 40) y cinco controles (raton n.° 5, 9, 10, 25, 28) para la necropsia y el analisis patologico. Se aisIO el ARN celular total de los higados de los animales fundadores y compafieros de camada control negativo tal como se describe (McDonald et al. Met. Enzymol. 152, 219 (1987)). Se realize) analisis de transferencia de tipo Northern en estas muestras para evaluar el nivel de expresi6n transgenica. Se resolvieron aproximadamente 10 1.19 de ARN total de cada animal mediante geles desnaturalizantes de electroforesis en agarosa (Ogden etal.Met. Enzymol. 152, 61 (1987)), luego se transfirieron a una membrana de nailon HYBOND-N (Amersham) y se estudiaron con sonda con ADN de insert° de mB7RP1-Fc marcado con 32P dCTP. Se realizo la hibridacion durante 1 h a 63°C en disolucion ExpressHyb (Clonetech) y 2-4 X 106 CPM de sonda marcada/ml de tamp6n de hibridaciOn. Tras la hibridacion, se lavaron las transferencias dos veces en 2X SSC, SDS al 0,1% a temperatura ambiente durante 5 min. cada una, y luego dos
veces en 0,1X SSC, SDS al 0,1% a 55°C durante 15-20 min. cada una. Se determine' la expresi6n del transgen en fundadores y companeros de camada control tras autorradiografia.
Los analisis de transferencia de tipo Northern indicaron que siete de los fundadores transgenicos expresaban niveles detectables del ARN del transgen (raton n.° 1, 2, 6, 8, 32, 33 y 40). Los ratones control negativo y tres fundadores (n.° 4, 30 y 31) no expresaban niveles detectables de ARN. Puesto que se determine) que la proteina de fusion
B7RP1-Fc se secretaba de celulas de mamifero en cultivo (figura 4B y ejemplo 7), la expresi6n del ARNm del transgen debe ser indicativa del nivel de producto genico administrado por via sisternica.
Eiemplo 13
Actividad biologica de la proteina de fusi6n B7RP1-Fc
Se sacrificaron siete de los ratones transgenicos (ratan n.° 1, 2, 6, 8, 32, 33 y 40) y cinco companeros de camada control (n.° 5, 9, 10, 25 y 28) para la necropsia y el analisis patolOgico usando los siguientes procedimientos: antes dela eutanasia, se verificaron los nOrneros de identificaciOn de todos los animales, entonces se pesaron, se anestesiaron y se les extrajo sangre. Se guard6 la sangre como suero y como sangre completa para un panel de hematologia y quimica del suero completo. Se realize) radiografia justo despues de la anestesia terminal mediante inhalacion de CO2 letal, y antes de la disecciOn macroscopica. Entonces se extrajeron los tejidos y se fijaron en formalina de Zn tamponada al 10% para el examen histolOgico. Los tejidos recogidos incluian el higado, bazo, pancreas, est6mago, duodeno, ileo, parches de Peyer, colon, rinon, organos reproductores, piel, glandulas mamarias, hueso, cerebro, corazon, pulmon, timo, traquea, esofago, glandulas tiroides/paratiroides, yeyuno, ciego, recto, glandulas suprarrenales, grasa blanca y parda, nervio ciatico, medula 6sea, vejiga urinaria y MOSCUI0 esqueletico. Antes de la fijaci6n, se determinaron los pesos de los organos completos para el higado, coraz6n, estomago, rinon, glandulas suprarrenales, bazo y timo. Tras la fijacion, se procesaron los tejidos para obtener
bloques de parafina, y se obtuvieron secciones de 3 prrn.
Se realizo inmunohistoquimica par el marcador de linfocitos B, B220, y el marcador de linfocitos T, CD3. Para detectar expresion de B220 o CD3, se desparafinaron secciones de 4 tirn fijadas en formalina, incrustadas en parafina y se hidrataron con agua desionizada. Se extinguieron las secciones con per6xido de hidrogeno al 3%, se bloquearon con Protein Block (Lipshaw, Pittsburgh, PA) y se incubaron en anticuerpo monoclonal de rata frente a
B220 (Pharmingen, San Diego, CA) o anticuerpo policlonal de conejo frente a CD3 (Dako, Carpinteria, CA). Se detectaron los anticuerpos mediante inmunoglobulinas de conejo anti-rata o de cabra anti-conejo biotiniladas, conjugadas con peroxidasa-estreptavidina (BioGenex, San Ramon, CA) con DAB como cromogeno (Biotek, Santa Barbara, CA). Se contratirieron las secciones con hematoxilina.
En este estudio, se notificaron signos clinicos normales durante la fase en vida del estudio. Las radiografias de
cuerpo completo de los ratones transgenicos eran comparables a las de los ratones control. Los parametros hematologicos globales de los ratones transgenicos eran comparables a los del grupo control negativo, aunque estaban presentes cambios esporadicos en ratones individuales: n.° 8 y n.° 40 transgenicos tenian niveles de globulina en suero aumentados (hiperglobulinemia) y n.° 32 y n.° 33 tenian niveles de globulina en el intervalo normal alto acompaliados por niveles de albirmina en el intervalo normal bajo, que es un patron comunmente
observado con estimulacion antigenica cronica del sistema inmunitario. Los pesos de los 6rganos de los otros ratones transgenicos no eran significativamente diferentes de los del grupo control.
Estaban presentes los siguientes cambios histopatologicos en los ratones transgenicos: Los ganglios linfaticos mesentericos de los ratones transgenicos para B7RP1-Fc estaban de moderadamente a notablemente agrandados en comparaciOn con los ratones control (figura 10A-10D; figura 11A-11E). La corteza tenia hiperplasia folicular prominente observada como foliculos secundarios agrandados (figura 10B-11B) con centros germinales grandes que contenian principalmente celulas B B220+ (figura 11D) y unas cuantas celulas T CD3+ dispersadas (figura 11F). La zona paracortical (celulas T CD3+) estaba tambien moderadamente agrandada (figura 11B-11F) y los senos medulares tenian nOmeros ligeramente aumentados de macr6fagos dilatados (histiocitosis sinusal). El cambio mas Ilamativo en los ganglios estaba presente en los cordones medulares, que estaban de levemente a notablemente expandidos por grandes nirmeros de celulas plasmaticas bien diferenciadas en los ratones transgenicos para B7RP1-Fc (figura 10D). En el ratan transgenico n.° 40, tambien se encontraron pequenos nirmeros de cuerpos de Russell dispersados (es decir, celulas plasmaticas con vesiculas intracitoplasmaticas prominentes, grandes, redondas que contienen inmunoglobulinas) en los cordones medulares (figura 10D). De manera interesante, los otros ganglios linfaticos internos y perifericos (por ejemplo cervical, inguinal) tenian caracteristicas morfologicas
similares de hiperplasia linfoide reactiva indicativa de una respuesta sistemica. Estos hallazgos concuerdan con una estimulaciOn inmunitaria cronica, en curso con potenciaciOn de la reacciOn inmunitaria humoral, que conduce a proliferacion de celulas B y diferenciaci6n terminal en celulas plasmaticas.
El bazo de ratones transgenicos para B7RP1-Fc tenia zonas de pulpa blanca agrandadas de manera variable con hiperplasia linfoide reactiva moderada que implica particularmente los foliculos secundarios de celulas B con centros germinales prominentes y vainas de celulas T periarteriolares en comparaci6n con los ratones control (figura 10E10F). Otro hallazgo Ilamativo en ratones transgenicos para B7RP1-Fc era plasmacitosis de minima a leve en la zona marginal que rodea a las zonas de pulpa blanca y en la pulpa roja adyacente. El rat6n transgenico n.° 6 tenia unos cuantos cuerpos de Russell dispersados (figura 10F, recuadro). La pulpa roja tenia hematopoyesis extramedular de
leve a moderada, que era comparable a la observada en los ratones control (figura 10E).
Los parches de Peyer del intestino delgado estaban de levemente a notablemente agrandados en los ratones transgenicos para B7RP1-Fc con respecto a los de los ratones control (figura 10G) y tenian foliculos muy grandes con centros germinales prominentes, particularmente en el rat6n transgenico n.° 40 y n.° 32 (figura 10H). Adernas, habia un aumento de minimo (en n.° 32) a leve (en n.° 8 y n.° 33) en los nOmeros de linfocitos y celulas plasmaticas (mezclado con un infiltrado eosinofilico leve en el ileo del raton n.° 32) en la capa de lamina propia engrosada de la
mucosa, que estaba presente en el intestino delgado, pero mas prominente en el colon de los ratones transgenicos.
Los agregados linfoides intestinales grandes (GALT) eran tambien ligeramente mas prominentes en algunos ratones transgenicos para B7RP1-Fc (particularmente el raton n.° 8 y n.° 2) que en el grupo control.
Generalmente, los otros tejidos examinados, incluyendo el timo, medula osea, higado, pulmon, corazon, pancreas, rifiones, glandula suprarrenal, tiroides, paratiroides, traquea, 6rganos reproductores, vejiga urinaria, glandula
mamaria, piel, meisculo esqueletico, nervio periferico, cerebro, es6fago, estornago, intestino delgado y grueso, hueso (femur/tibia), babilla, grasa blanca y parda parecian normales y comparables con los cambios de fondo detectados en los ratones control.
Los datos de este estudio demuestran que la sobreexpresi6n de la quimera proteina relacionada con B7-Fc (B7RP1- Fc) en ratones transgenicos induce un fenotipo caracterizado por hiperplasia linfoide reactive prominente detectada enel bazo, los ganglios linfaticos perifericos e internos y el tejido linfoide asociado al intestino, como hiperplasia folicular, expansi6n de zonas de celulas T y plasmacitosis Ilamativa acompariadas por hiperglobulinennia en algunos animales. La plasmacitosis va acompariada de niveles superiores de IgG circulante (media ± DE = 597 + 298 mg/ml en ratones transgenicos frente a 209 + 80 mg/ml en companeros de camada control, n = 7, P lt;0,05, prueba de la t), en particular IgG2a (217 ± 100 mg/ml frente a 75 ± 29 mg/ml, n = 7, P lt;0,01, prueba de la t). La induccion de IgG2a
este asociada normalmente con citocinas Th1 tales como IFN-g. Por tanto, B7RP-1 induce proliferacion de celulas B y T y estimula a celulas B para que se diferencien en celulas plasmaticas y para que produzcan inmunoglobulina.
Estos cambios concuerdan con una respuesta inmunitaria sisternica persistente con hiperestimulacion del brazo humoral del sistema inmunitario que da como resultado estimulacion, proliferaciOn y diferenciacion de celulas B en celulas plasmaticas que producen anticuerpos a lo largo de todos los 6rganos linfoides examinados.
Seconcluye a partir de la hiperplasia linfoide marcada demostrada en los ratones transgenicos para B7RP1-Fc que la proteina B7RP1 tiene actividad biologica in vivo significative, relacionada con estimulacion del sistema inmunitario.
Ejemplo 14
ClonaciOn de B7RP1 humana
Se separaron linfocitos perifericos circulantes humanos normales de globulos rojos usando medio de separacion de
linfocitos (ICN Pharmaceuticals). Entonces se activaron las celulas T con anticuerpo anti-CD3 unido a places 10 pg/m1 (Immunotech, Westbrook, ME), PMA 10 ng/ml y ionomicina 500 ng/ml durante la noche (16 horas) a 37°C y el 5% de CO2. Entonces se prepare) el ARN total de las celulas usando reactivo TRIzol (Gibco BRL). Se sedimentaron las celulas mediante centrifugaci6n y se resuspendio el sedimento celular en 1 ml de reactivo TRIzol por cada 5 X 106 celulas y se incubo a temperatura ambiente durante 5 min. Se afiadieron entonces 0,2 ml de
cloroformo por 1 ml de reactivo TRIzol original. Se agitaron los tubos vigorosamente a mano durante 15 segundos y
se incubaron durante 3 minutos a TA y se centrifugaron a 13.000 rpm durante 15 min. a 4°C. Tras la centrifugaciOn, se recogio la fase acuosa superior transparente que contiene el ARN y se precipit6 el ARN de muestras mediante la adicion de alcohol isopropilico. Entonces se incubo la disolucion a TA durante 10 min., se sedimento el ARN, se lavO con etanol al 75% y entonces se centrifugo a 15.000 rpm durante 5 min. a 4°C. Se sec6 al aire el sedimento, se
resuspendi6 en agua libre de ARNasa, entonces se alicuote) y se almacen6 a -80°C hasta su uso posterior.
Se construy6 la biblioteca usando el sistema de plasmidos Superscript para sintesis de ADNc y cloned& de plasmidos (Gibco BRL). En resumen, se ligaron insertos de ADNc con un tamatio promedio de 2 kb en el vector pSport en el sitio de cloned& Sa11/Not1. Se sometieron a electroporacion los plasmidos ligados en E. coli competente para transformaciOn Electromax (Gibco BRL), se titularon y se sembraron en place a quince mil colonies por place de LB (ampicilina 100 pig/m1). Se obtuvieron por levantamiento 300.000 colonias sobre membranas de transferencia de hibridacion de examen de colonias/placas (NEN Life Sciences), se desnaturalizaron en NaOH 0,5 N, NaCI 1,5 M durante 5 nninutos, entonces se neutralizaron sucesivamente durante 5 minutos cada uno en los
siguientes tampones, Tris HCI 1 M pH 8,0, Tris HCI 0,5 M pH 8,0 y NaCI 1,5 M y 2X SSC. Entonces se reticularon los filtros mediante irradiacion ultravioleta y se cocieron durante 30 min. a 80°C en un horno de vacio. Se lavaron previamente los filtros extensamente en 2X SSC a 42°C para eliminar los residuos, entonces se hibridaron previamente a 42°C en formamida al 50%, 5X SSPE, 5X soluciem de Denhardt, SDS al 0,5%, ADN de esperma de salmOn 100 jig/ml, durante 2 horas.
Se examine) la biblioteca de ADNc de linfocitos humanos con un fragmento de ADN de 895 pb que tenia los nucleotidos 1-711 tal como se muestra en la figura 3A, 167 pb inmediatamente en 5' con respecto al cod6n de metionina iniciador en la figura 3A y 17 pb inmediatamente en 3' con respecto a la posici6n 711 en la figura 3A. Se obtuvo esta secuencia en el sentido de 5' de 167 pares de bases mediante RACE en 5' del ADNc de HuB7RP1 (ejemplo 4) y se libero de un vector TOPO TA (lnvitrogen, Carlsbad, CA) en el sitio de escision de enzima de restriccion Eco RI. Se purific6 dos veces este insert° en un gel TAE de agarosa al 0,8%. Se us6 un kit de purificacion
de gel de ADN (Qiagen) para aislar el insert° de ADN de la agarosa.
Se marcaron 125 ng del fragmento de ADN con 32P dCTP (Amersham) siguiendo el protocolo del sistema de marcaje Prime al azar Redi-Prime 2 (Amersham). Entonces se permitio que los filtros obtenidos por levantamiento de las colonies se hibridaran durante la noche con la sonda a 42°C en el siguiente tampon durante la noche a 42°C;
formamida at 50%, 5X SSPE, 2X solucion de Denhardt, SDS at 0,5%, ADNes 100 mg/ml. La actividad especifica de la sonda era de 2,38 X 109 cpm/ilg de ADN, en aproximadamente 2 ng de sonda marcada par ml de tampon de hibridacion. Se retir6 la sonda y se guard6 para la siguiente ronda de examen. Entonces se lavaron los filtros en 2X SSC, SDS at 0,1% TA durante 15 min., seguido por 1X SSC, SDS at 0,1% a 55°C durante 15 min. y lx SSC, SDS at 0,1% a 60°C durante 10 min. Se envolvieron los filtros en plastic° y se expusieron a pelicula de autorradiografia durante la noche a -80°C con 2 pantallas de potenciacion. Se identificaron tres clones positivos independientes. Se alinearon las exposiciones con las placas bacterianas y se rasparon los clones positivos, se diluyeron y volvieron a sembrarse en placa sabre placas LB con ampicilina 100 pg/ml, se hicieron crecer durante la noche coma anteriormente y se obtuvieron por levantamiento las colonias, se prepararon y se estudiaron con sonda tat coma se
describio anteriormente. Se aislaron tres colonias de clones independientes, se aislo el ADN y se secuenci6 el ADN para cada clon por triplicado.
La longitud completa de la proteina B7RP1 humana es de 302 aminoacidos. La longitud del polipeptido y la posici6n relativa del dominio transmembrana concuerdan con otros miembros de la familia de B7. El gen de B7RP1 humana tiene un 43% de identidad de aminoacidos con el clon de rat6n. Este grado de homologia es significativo puesto que las proteinas CD80 de rat6n y ser human° son sOlo identicas at 41%. Los residuos de cisteina en las posiciones de aminoacido 37, 113, 158, 215 y 216 estan notablemente conservados entre los genes de raton y ser humano.
Ejemplo 15
Clonacion de CRP1 humana
Una bCisqueda de homologia Blast en Genbank (GCG, University of Wisconsin) usando la secuencia de B7RP1
murina (vease la figura 2) recuper6 un clon genornico (n.° de registro de Gen Bank AQ022676) que contenia una secuencia de 104 pb que mostraba alta homologia con el gen de CRP1 murina. Se disefiaron cebadores de clonaciOn par PCR para que se solapasen con esta secuencia.
5'-GCA TAT TTA TGA ATC CCA-3' (SEQ ID NO: 34)
5'-ACT AU AGG GTC ATG CAC-3' (SEQ ID NO: 35)
Usando los cebadores anteriores, se amplifico par PCR un fragmento de ADN de 151 pb de la CRP1 murina usando el plasmido de CRP1 murina descrito en la figura 1 y el ejemplo 1 coma molde. Se marcaron 125 ng del ADN con 32P dCTP (Amersham) siguiendo el protocolo del sistema de marcaje Prime al azar Redi-Prime 2 (Amersham). Entonces se permitiO que los filtros obtenidos par levantamiento a partir de las bibliotecas de sangre periferica humana descritas en el ejemplo 15 se hibridaran con la sonda en el siguiente tampOn de hibridaci6n durante la noche (15 h) a 41°C, formamida at 50%, 5X SSPE, 2X solucion de Denhardt, SDS at 0,5%, ADNes 100 gg/ml. La actividad especifica de la sonda era de 3,52 X 109 cpm/14 de ADN, 1,5 ng de sonda marcada/ml de tampon de hibridaci6n. Se retir6 la sonda y se guardo para la siguiente ronda de examen. Entonces se lavaron los filtros en 2X SSC, SDS at 0,1% a TA durante 10 min., seguido par lx SSC, SDS at 0,1% a 37°C durante 7 minutos, 40°C durante 7 minutos, 44°C durante 7 minutos, luego 50°C durante 7 minutos, monitorizando de manera continua la velocidad a la que los filtros liberaban la sonda marcada. Se envolvieron los filtros en plastic° y se expusieron a una pelicula durante la noche a -80°C con 2 pantallas de potenciacion. Este metodo revel6 9 posibles clones positivos independientes. Se alinearon las exposiciones can las placas bacterianas y se rasparon los clones positivos, se depositaron en 200 Al de SOC, se realizaron 2 diluciones en serie de 1:10 y volvieron a sembrarse en placa 70 pi de la segunda dilucion sabre placas LB que contenian ampicilina a 100 pg/m1 y se hicieron crecer durante la noche
coma anteriormente. Se obtuvieron par levantamiento las colonias, se prepararon y se estudiaron con sonda coma anteriormente. Se aislaron ocho clones independientes y se preparo el ADN mediante el metodo miniprep de Qiagen.
Se obtuvo un clan de ADNc que contenia un marco de lectura abierto de 199 aminoacidos (figura 13A). Este clan de ADNc contenia homologias de nucleotidos y aminoacidos con el clan de CRP1 murina descrito en el ejemplo 1 y la figura I. Los nucleotidos correspondientes at marco de lectura abierto de este clan humano eran identicos at 77% at gen de CRP1 murina. La traducci6n de la secuencia humana y la posterior comparaci6n can la proteina CRP1 murina revelo un 69% de identidad de aminoacidos can la proteina murina (figura 13B). Adernas, el motivo entre los aminoacidos 114 a 119, quot;FDPPPFquot;, se conservaba entre los genes de CRP1 humana y murina. Este motivo corresponde at motivo quot;MYPPPYquot; en CD28 humana y murina que es esencial para la interacci6n par la proteina B7. Ademas, las cisteinas en las posiciones de aminoacido 42, 109 y 141 tambien se conservan. Estas cisteinas
corresponden a las cisteinas en CD28 y CTLA-4 que estan implicadas en la formacion de bucles de Ig y dimerizaci6n de disulfuros intermoleculares. La estrecha similitud con CRP1 murina, y similitudes estructurales con la familia de homologia de CD28, indican que este es el homologo de CRP1 humana.
Ejemplo 16
CRP-1 se expresa en linfocitos T de memoria en reposo
Con el fin de estudiar la expresion de CRP-1 en celulas T de memoria, se recogieron celulas T esplenicas de ratones
de 6-7 meses de edad. Se tirieron de manera doble estas celulas usando B7RP-1-Fc marcada mediante un anticuerpo anti-Fc humano conjugado con FITC y un anticuerpo conjugado con PE frente a o bien CD44 o bien CD45RB o bien CD69. La tinci6n con la proteina de fusiOn B7RP-1-Fc detecta la expresiOn de proteina CRP-1 en estas celulas T. Ratones mas ancianos muestran mas celulas T esplenicas CRP-1+ que ratones mas jovenes. De manera interesante, un nOrnero Ilamativo de estas celulas son altas en CD44 (figura 14a) y bajas en CD45RB (figura
14b), un perfil tipico de celulas T de memoria. Estas celulas T de memoria CRP-1+ estan en un estado de reposo, puesto que no expresan el marcador de activacion C069 (figura 14c). La expresion de CRP-1 en celulas T de memoria indica que CRP-1 tiene funciones coestimuladoras en celulas T de memoria.
Ejemplo 17
CoestimulaciOn de celulas T in vitro inhibida por anticuerpos frente a B7RP-1.
Para determinar si la proteina B7RP-1 tiene relevancia funcional para celulas T, se incubaron celulas T CD3+ con la proteina de fusi6n B7RP-1-Fc y un anticuerpo anti-CD3 en un ensayo de proliferacion in vitro. Entonces se usaron anticuerpos policlonales de conejo anti-B7RP1 de rat& o anticuerpos monoclonales de rata anti-B7RP1 de rat6n para inhibir especificamente la proliferaciOn coestimulada por B7RP1-Fc in vitro.
Preoaracion de antisuero voliclonal de conejo frente a B7RP-1
Se les inyecto a tres conejos blancos New Zealand (peso inicial de 5-8 libras) por via i.m. proteina B7RP1 murina. Se inmuniz6 cada conejo en el dia 1 con 150 jig de proteina B7RP1 murina emulsionada en un volumen igual de adyuvante completo Hunters Titer Max. Se realizaron refuerzos adicionales (dias 14 y 28) mediante el mismo procedimiento. Se monitorizaron los titulos de anticuerpo mediante EIA. Tras el segundo refuerzo, los antisueros revelaron titulos de anticuerpo moderados. Entonces se obtuvo una sangria de produccion de 30 ml en cada animal. Se repiti6 esto cada semana durante 6 semanas. Entonces se purificaron anticuerpos policlonales mediante cromatografia de proteina-A agarosa, seguido por selecciOn negativa mediante cromatografia de afinidad de
proteina Fc y seleccion positiva mediante cromatografia de afinidad de B7RP-1-Fc.
Preparaci6n de anticuerpos monoclonales de rata anti-B7RP1 murina
Segeneraron anticuerpos monoclonales de rata anti-B7RP1 murina tal como se describe en Practical Immunology, segunda edicion (1980; L. Hudson y F.C. Hay; Blackwell Scientific Publications; St. Louis, MO). En resumen, se les inyect6 a ratas Lou (Harlan; Indianapolis, IN) por via intraperitoneal proteina de fusion muB7RP1-Fc emulsionada en adyuvante de Freund a intervalos de 4 semanas. Tres dias antes de la fusion, se reforzaron las ratas por via intravenosa con muB7RP1 soluble. En el dia de la fusion, se sacrifice) el animal con di6xido de carbon° y se extrajo
el bazo de manera aseptica. Se genera una suspension de celulas individuales usando un homogeneizador de tejido. Se lavaron tanto esplenocitos como celulas de mieloma Y3-Ag1.2.3 (Coleccion Americana de Cultivos Tipo; Rockville, MD) en medio fibre de suero, luego se fusionaron mediante la adici6n de polietilenglicol (PEG 1500; Boehringer Mannheim Biochemicals; Indianapolis, IN). Se enjuagaron las celulas una vez, se resuspendieron en medio que contenia suero y se sernbraron en placa en placas de cultivo tisular de 96 pocillos. De diez a 12 dias despues, se someti6 a prueba el medio de cada pocillo para detectar anticuerpo especifico frente a B7RP1 mediante un ensayo de inmunoabsorciOn ligado a enzimas (EIA) directo. Se hicieron crecer celulas de los pocillos que indicaban posible uni6n hasta cultivos de 10 ml y se congelaron en nitrogen° liquido. Se sometio a prueba adicionalmente el medio de cada cultivo en citometria de flujo y en un ensayo de proliferacion de celulas T funcional. Se sembraron en placa las que se determine) que eran de interes mediante estos nietodos para dar colonias de
celulas individuales, se seleccionaron de nuevo mediante EIA y se mantuvieron lineas celulares finales para la generacion de anticuerpos. Se purificaron los anticuerpos del medio celular mediante cromatografia de proteina Aagarosa.
Preparacion de celulas T y ensayo de proliferaciOn de celulas T
Se purificaron celulas T de los bazos de ratones C57B1/6 (hembras de 8-12 semanas de edad, Charles River Laboratories) mediante seleccion negativa a traves de una columna de enriquecimiento de celulas T murinas (R&D Systems). Entonces se usaron las celulas T o bien directamente o bien se purificaron adicionalmente mediante anticuerpos y lisis del complemento tal como sigue. Se resuspendieron las celulas (2,5 X 106 celulas/m1) en medio RPMI que contenia anticuerpos (todas a 10 jig/mly de Pharmingen) contra CD11 b murina (don M1/70), NK-1.1 (don PK136), CD8a (don 53-6.7), I-Ab (don M5/114.15.2), CD11c (don HL3) y el antigen° B220 (don RA3-6B2). Entonces se incubaron las celulas sobre hielo durante 30 min., se sedimentaron a 1200 rpm, se resuspendieron en RPMI:complemento de conejo 4:1 vol/vol (Sigma, n.° S-7764) y se incubaron durante 30 min. adicionales a 37°C. Se sedimentaron de nuevo las celulas, y se repitio el tratamiento con complemento. Antes de sembrar en placa, se lavaron las celulas con RPMI que contenia FCS al 10%. Se recubrieron placas de 96 pocillos con fondo de U con un anticuerpo anti-CD3 (don 145-2C11, Pharmingen) a concentraciones que oscilaban entre 0 y 1,2 jig/m1), y Fab2 anti
IgG humana (Sigma, 12,5 jig/m1) durante la noche a 4°C, seguido por una incubacion de 6-9 h a 37°C. Se cultivaron celulas T (Ix 10f/pocillo) en ausencia o presencia de diversas proteinas de fusion de Fc durante 48 h y se pulsaron durante las ultimas 18 horas con 1 jiCi de 3H-timidina. Las proteinas Fc control incluian una proteina de fusion de OPG y Fc y un fragment° de proteina Fc no fusionado. Entonces se recogieron las celulas y se conto la
radioactividad incorporada. B7RP-1-Fc coestimula celulas T para que proliferen de un modo dependiente de la dosis (figura 15a), y un anticuerpo anti-B7RP-1-Fc inhibe especificamente esta coestimulacion de manera dependiente de la dosis (figura 15b).
Eiemplo 18
5 lnhibidores de la ruta de CRP-1/B7RP-1 disminuyen la aparicion de artritis reumatoide inducida por colageno.
La artritis inducida por colageno (A1C) es un modelo animal de poliartritis autoinmunitaria en roedores y primates que tiene muchas similitudes con la artritis reumatoide en seres humanos. La inmunizacion con una especie heterologa de colageno tipo II (CII) induce una respuesta autoinmunitaria frente a CII que conduce al desarrollo de AIC en cepas de ratones susceptibles. Cepas congenicas de ratones con H-21 y H-2q son altamente susceptibles a AIC. AIC 10 esta mediada por los efectos sinergicos de tanto celulas T reactivas con CII como anticuerpos. Se disolvi6 CII porcino (Nabozny etal. ,Autoimmunity 20, 51-58 (1995)) en acid° acetico 0,01 N a una concentraciOn de 2 mg/ml y entonces se emulsiono a una razon 1:1 con CFA (Difco). Se inmunizaron ratones susceptibles a artritis B10.R111 (H
21) (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) con 1001.11 de emulsion por via intradermica en la base de la cola. Se monitorizaron los ratones 2-3 veces a la semana para detectar el desarrollo de artritis. Se determin6 la gravedad de
15 laartritis usando un sistema de clasificacion para cada garra tal como sigue: 0: sin artritis; 1: enrojecimiento o hinchazOn en 1-3 dedos; 2: hinchaz6n grave de la garra; 3: anquilosis articular. Se sum6 la puntuaci6n de cada extremidad para proporcionar un intervalo de gravedad de desde 0 hasta 12 para cada animal.
Se les inyectaron a los ratones 100 ug (en 200 111) de proteina por via intraperitoneal dos veces a la semana. El tratamiento comenzo 1 dia tras la inmunizaci6n con CII porcino y se detuvo en el dia 52 tras la inmunizaci6n. Se
20 realizo el experimento en grupos de tratamiento de 10 ratones, y animales con puntuaciones de 1 o superiores se puntuaron como positivos. Se muestran los resultados en la figura 16 y la tabla 1.
TABLA 1
Efecto de proteinas de fusi6n CRP-1, B7RP-1, CTLA-4 y B7.2 Fc sobre la aparicion de artritis
Grupos de tratamiento Diade aparicion, media +/- d.e. CTLA4-Fc 60,0+0,0 CRP1-Fc 48,9±13,2 B7.2-Fc 28,4+14,1 B7RP1-Fc 33,9+16,6 PBS 37,7+17,1
En ratones tratados con proteina de fusion CRP1-Fc, la aparicion de sintomas artriticos se retras6 aproximadamente
25 10 dias en comparacion con los ratones tratados con PBS. Esto demuestra que la inhibicion de la ruta de CRP1/B7RP-1 puede aliviar sintomas de la enfermedad en este modelo de ratOn de artritis reumatoide.
Ratones tratados con B7RP-1-Fc o B7.2-Fc mostraban una aparicion mas temprana de la enfermedad (tabla 1 y figura 16a) con un aumento de la gravedad artritica (figura 16b) en comparaci6n con los controles tratados con PBS. Esto indica que la proteina de fusion B7RP-1-Fc potencia la respuesta inmunitaria de celulas T. Tal actividad puede
30 serOtil en la generacion de inmunidad antitumoral in vivo.
Los efectos opuestos de CRP-1-Fc y B7RP-1-Fc en este modelo de ratan de artritis reumatoide indican que la ruta puede manipularse para o bien potenciar o bien inhibir la progresion de la enfermedad. La seleccion como diana de la proteina CRP-1 con B7RP-1-Fc soluble potencia la enfermedad, mientras que la interaccion de CRP-1-Fc soluble con B7RP-1 inhibe los sintomas de la enfermedad.
35 Ejemplo 19
B7RP-1-Fc induce un fenotipo de enfermedad inflamatoria del intestino en ratones transgenicos.
La sobreexpresion persistente de la proteina relacionada con B7 (B7RP1-Fc) en ratones transgenicos de 22 a 25 semanas de edad (ejemplo 12) induces un fenotipo sorprendente de enfermedad inflamatoria del intestino (Ell) con engrosamiento marcado e inflamacion cronica de los intestinos delgado y grueso (enterocolitis) y perdida de peso en 40 algunos animales. HistolOgicamente, se encontraron los cambios inflamatorios mas graves en el colon proximal y distal, con cambios mas leves en el intestino delgado. El colon proximal estaba notablemente engrosado con ulceracion por agrietamiento, inflamaci6n transparietal e hipertrofia de la mucosa colonica, mientras que el colon distal tenia hipertrofia difusa de la mucosa (o erosiOn focal y atrofia glandular) sin ulceracion. El intestino delgado proximal tenia hipertrofia de la mucosa de leve a marcada con cambios inflamatorios mas !eves, mientras que el
45 intestino delgado distal (ileo) tenia hipertrofia leve de la mucosa en algunos animales y atrofia en otros ratones. Los cambios intestinales eran los mas graves y se hallaron de manera constante en los ratones transgenicos para B7RP1 hembra, pero tambien se observaron en varios de los ratones transgenicos macho en este estudio.
Es interesante observar que las caracteristicas histolOgicas halladas en el colon proximal, incluyendo la ulceracion
por agrietamiento y la inflamaciOn granulomatosa cronica transparietal con celulas gigantes multinucleadas, se asemejan mas estrechamente a las observadas en la enfermedad de Crohn que en colitis ulcerosa en seres humanos. Morfologicamente, esta colitis tambien imita la Ell descrita en ratones deficientes en interleucina-10, que desarrollan consuncion, anemia y enterocolitis que afectan a todo su tracto intestinal (Kuhn etal. 1993; Sartor 1995; Leach etal. 1999). Como en los ratones deficientes en IL-10, los cambios iniciales en los ratones transgenicos para
B7RP-1-Fc consisten en infiltrados leves, focales de celulas inflamatorias en la lamina propia sin hiperplasia epitelial colonica (ejemplo 13). En ratones mas ancianos, los segmentos colonicos afectados se engrosan debido a hipertrofia/hiperplasia glandular e inflamaci6n cr6nica.
Los colones proximales y distales de los ratones B7RP-1-Fc tenian colitis de moderada a grave con caracteristicas histologicas de enfermedad inflamatoria del intestino (Ell). Los segmentos afectados del colon proximal (figura 17B17D) estaban engrosados de manera difusa, debido a hipertrofia e hiperplasia glandular prominente con alargamiento y dilatacion de las glandulas mucosas (figura 17B), que tenian numeros aumentados de figuras mit6ticas y abscesos cripticos poco comunes, pero conservaban celulas caliciformes con mucina (figura 17D). La mucosa tenia inflamaci6n crOnica difusa en la lamina propia, que en algunos animales se extendia de manera
transparietal implicando las capas subyacentes de la pared del intestino, incluyendo la submucosa, la capa muscular de la mucosa, la serosa y el tejido graso mesenteric° adyacente (figura 17B-17C). Los infiltrados inflamatorios consistian en linfocitos (predominantemente celulas T CD3+, CD44+), celulas plasmaticas y macr6fagos epitelioides (figura 17F) mezclados con algunos neutrOfilos y celulas gigantes multinucleadas ocasionales (figura 17E), caracteristicas de inflamacion granulomatosa cr6nica. Tambien estaban presentes agregados linfoides (principalmente celulas B220+ mezcladas con pequehos niimeros de celulas CD3+) en la mucosa y alrededor de vasos sanguineos mas pequetios en la submucosa y capas mas profundas, incluyendo grasa mesenterica (figura 17C). La luz contenia exudado mucopurulento o mucoso (figura 17D). Se hallaron pruebas serias de colitis, con ulceracion por agrietamiento multifocal de la mucosa e inflarnacion transparietal (figura 17B-17C), en estos ratones transgenicos para B7RP-1-Fc.
El colon distal de los ratones transgenicos para B7RP-1-Fc tambien estaba engrosado de manera difusa y era hiperplasico con alargamiento, basofilia y dilatacion de las glandulas colonicas (figura 18B-18G), algunas de las cuales contenian abscesos cripticos (figura 18D y 18F) y mucosidad. La lamina propia tenia un infiltrado inflamatorio difuso leve de linfocitos (predominantemente celulas CD3+, CD44+, particularmente en la mucosa superficial; figura 18E), asi como celulas plasmaticas y agregados focales de macrofagos epitelioides mezclados con algunos
neutrofilos. Tambien estaban dispersos agregados linfoides (de predominantemente celulas B220+; figura 18D y 18F) por toda la mucosa. El intestino delgado de ratones transgenicos para B7RP-1-Fc tenia mas cambios variables, incluyendo hipertrofia e hiperplasia mucosa y criptica de leve a focalmente marcada (figura 19B y 19D con razones de criptas/vellosidades que oscilan entre 1:4 y 1,5:1, en comparaciOn con 1:10 en los ratones control) acompatiadas por un infiltrado predominantemente linfoplasmacitico en la lamina propia. La hiperplasia de la mucosa era lo mas prominente en el intestino delgado proximal, incluyendo el duodeno (figura 19B) y particularmente el yeyuno (figura 19D). La arquitectura de las criptas estaba focalmente alterada y era displasica en los ratones mas gravemente afectados (figura 19D). En cambio, los intestinos delgados distales (ileo) de algunos ratones, tenian atrofia vellosa leve, irregular de la mucosa del ileo (figura 19F) con aplanamiento, engrosamiento o perdida focal de vellosidades (con una raz6n de criptas:vellosidades de 1:1 o menos, en lugar de la razon normal de 1:2), mientras que otros ratones tenfan hipertrofia leve de la mucosa del fleo.
La proteina de fusi6n B7RP-1-Fc actua activando celulas que son responsables de provocar un fenotipo muy similar al de la enfermedad de Crohn humana. Esto indica que las celulas que pueden ser responsables de la inflamaci6n en la enfermedad de Crohn se activan por la proteina de fusiOn B7RP-1-Fc. Por tanto, inhibidores de proteina soluble, anticuerpo o molecule pequeha de B7RP-1 pueden ser utiles en la inhibicion de Ell.
Eiemplo 20
La proteina de fusi6n B7RP-1-Fc inhibe el crecimiento tumoral en ratones
Para examinar el efecto de B7RP-1 y CRP-1 sobre el crecimiento del sarcoma Meth A murino inmunogenico, se investigo si la B7RP-1-Fc soluble afecta al crecimiento de un sarcoma Meth A establecido en ratones Balb/c.
Se implantaron celulas de sarcoma Meth A en crecimiento exponencial mediante inyecciOn intradermica de 0,5 millones de celulas en el abdomen de ratones Balb/c en el dia 0. En el dia 7, cuando los tumores alcanzaron
— 100 mm3, se trataron los ratones con o bien vehiculo (PBS) o bien B7RP-1-Fc (8 mg/kg), por via subcutanea en el cuello en los dias 7, 10, 14 y 17. Se midieron los diametros bidimensionales de los tumores mediante calibres y se estimo el volumen tumoral (en mm3) usando la formula: Volumen tumoral = [{(anchura) 2x longitud}/2]. Se monitoriz6 el crecimiento tumoral hasta el dia 28. Cada grupo tenia ocho ratones.
El patr6n de crecimiento de sarcoma Meth A del tumor control era bifasico: a una fase inicial lenta le seguia una fase exponencial relativamente rapida. En ratones tratados con B7RP-1-Fc, el crecimiento del tumor era significativamente mas lento en la fase exponencial rapida. En el dia 28, los volumenes promedio de los ratones control y tratados con B7RP1-Fc eran de 1410 mm3 y 580 mm3, respectivamente (figura 20). Por tanto, el tratamiento con B7RP-1-Fc inhibio el crecimiento tumoral significativamente en este modelo. Los datos sugieren fuertemente la
utilidad terapeutica beneficiosa de la proteina B7RP-1-Fc soluble, y otros activadores de la ruta de B7RP-1/CRP-1, en el tratamiento de tumores inmunogenicos.
La actividad antitumoral inmunologica esta estrechamente asociada con la funci6n de linfocitos T citoliticos (CTL). Consecuentemente, se expresa la proteina B7RP-1-Fc en celulas T CD8+ citoliticas (ejemplo 9, figura 6). Estos
5 datos apoyan fuertemente que B7RP-1 funciona en celulas T CD8+ citoliticas. Por tanto, puede usarse B7RP-1-Fc, u otos estimuladores de la ruta de B7RP-1/CRP-1, para potenciar funciones inmunitarias celulares y de celulas T citoliticas para varias indicaciones no relacionadas con cancer.
Eiemplo 21
Inhibicion de la actividad de B7RP-1 humana in vitro
Para determinar si B7RP-1 humana tiene propiedades coestimuladoras positivas, se sometieron a prueba celulas que expresaban B7RP-1 humana y proteina de fusion B7RP-1-Fc humana en ensayos de proliferacion de celulas T. Se construyo la proteina de fusi6n B7RP-1-Fc humana fusionando secuencias genicas correspondientes a los aminoacidos 1 a 247 con una secuencia genica de IgG1 humana parcial (ejemplo 14). Se construyo la proteina de fusion CRP-1-Fc humana fusionando secuencias genicas correspondientes a los aminoacidos 1 a 146 con una
15 secuencia genica de IgG1 humana parcial (ejemplo 2). Se realizaron los metodos de construccion, expresion y purificacion de ambas proteinas de fusi6n tal como se describe en el ejemplo 7. B7RP-1-Fc demostr6 actividades coestimuladoras que dependen de la estimulaciOn con anticuerpo anti-CD3 (figura 21a). Adernas, esta actividad puede inhibirse especificamente con proteina CRP-1-Fc soluble (figura 21b). Se obtuvieron efectos coestimuladores similares usando celulas CHO que expresan B7RP-1 humana, unida a la membrana, que contiene toda la secuencia
codificante (figura 21c).
Se determin6 la produccion de citocinas por celulas T humanas en las condiciones de proliferacion in vitro anteriores. Se analizaron los sobrenadantes de cultivos de celulas T estimulados durante 48 y 72 horas para detect& IL-2, IL-10 e IFN-gamma mediante ELISA segOn las especificaciones del fabricante (BioSource International). Los niveles de IFN-gamma e IL-10 estaban significativamente aumentados; sin embargo, a diferencia
25 del caso con coestimulacion con CD28, IL-2 no estaba notablemente inducida (figura 21d). Los niveles aumentados de IFN-gamma, una citocina Th1, se correlacionan con las funciones de B7RP-1 aumentando IgG2a, tal como se describe en el ejemplo 13.
Se realizaron ensayos de coestimulaciOn de celulas T in vitro tal como sigue. Se aislaron celulas T humanas altamente purificadas (gt;98% CD3+) mediante seleccion negativa de PBMC nuevas o descongeladas, agotadas por adherencia usando perlas magneticas marcadas con AcM (Miltenyi Biotec). Se cultivaron celulas T (1 x 105 celulas/pocillo) en pocillos por triplicado en placas de 96 pocillos en 200 pl/pocillo de RPM! + FCS al 10%. Para evaluar la coestimulacion con B7RP-1-Fc, se recubrieron previamente placas con fondo de U con diversas concentraciones de anticuerpo anti-CD3 (Pharmingen) y Fc anti-IgG humana 10 pg/m1 (Sigma) en 100 IA de lx PBS mediante una incubacion a 4°C durante la noche. Se eliminaron el anticuerpo anti-CD3 y Fc anti-IgG humana no 35 unidos y se cultivaron las celulas en presencia o ausencia de diversas concentraciones de B7RP-1-Fc, OPG-Fc control o anticuerpo anti-CD28 (Pharmingen). Para la inhibiciOn por CRP-1-Fc de la coestimulacion con B7RP-1-Fc, se cultivaron celulas T en pocillos recubiertos previamente con anticuerpo anti-CD3 0,33 pg/mly Fc anti-IgG humana 10 jig/m1 con B7RP-1-Fc 0,5 jig/m1 en presencia de CRP-1-Fc u OPG-Fc diluida en serie, comenzando a 10 1.1g/ml. Para evaluar la coestimulacion por celulas CHO que expresan B7RP-1, se cultivaron celulas T en placas de fondo piano con diversas concentraciones de anticuerpo anti-CD3 soluble en presencia o ausencia de diversas cantidades de celulas CHO B7RP-1 tratadas con mitomicina-C o celulas vector CHO. Para someter a prueba la proliferacion de celulas T, se pulsaron cultivos con [31-1]TdR 1 uCi/pocillo durante las Oltimas 18 h de un cultivo de 72 h. Se determino la proliferacion de celulas T mediante la incorporaciOn de [3H]TdR. Se expresan los resultados de un experiment° representativo de tres donantes al azar como CPM medias incorporadas +/-DE. Para analisis de producci6n de
45 citocinas, se cultivaron las celulas durante 48 y 72 horas y se recogieron los sobrenadantes para el ELISA.
Estos experimentos muestran que la parte extracelular de B7RP-1 humana, tal como se describe en el ejemplo 14, cuando se fusiona a un fragment° de Fc humano, puede coestimular celulas T in vitro. Esta coestimulacion se inhibe por CRP-1-Fc y por tanto se demuestra corn° puede funcionar un inhibidor soluble de B7RP-1 humana. Podrian usarse ensayos in vitro, tales como los descritos en el presente documento usando B7RP-1 y CRP-1 humanas, para
seleccionar inhibidores de anticuerpo, proteina soluble, pepticuerpo o molecula pequefia de la actividad de B7RP1/CRP-1.
Lista de secuencias
lt;110gt; AMGEN INC.
lt;120gt; POLIPEPTIDOS NOVEDOSOS IMPLICADOS EN RESPUESTA INMUNITARIA
55 lt;130gt; A-579A
lt;140gt; 09/264.527
lt;141gt;
lt;160gt;35
lt;170gt; PatentIn ver. 2.1
lt;210gt; 1
5 lt;211gt;600
lt;212gt; ADN
lt;213gt; rat
lt;220>
lt;221gt; CDS
10 lt;222gt; Complemento ((1) .. (600))
lt;400gt; 1
atg aag cog tac ttc tgc cgt gte ttt gte tte tgc tte cta atc aga 48 Met Lys Pro Tyr Phe Cys Arg Val Phe Val Phe Cys Phe Leu Ile Arg 1 5 10 15
ctt tta aca qqa qaa atc eat gge tcg gcc gat cat agq atg ttt tea 96 Leu Leu Thr Gly Giu Ile Mn Gly Ser Ala Asp His Arg Met Phe Ser 20 25 30
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aac aae cca gae age tee cag gga age tat tac ttc tgc age etg tcc 336 Mn Mn Pro Asp Ser Ser Gin Gly Ser Tyr Tyr Phe Cys Ser Lieu Ser 100 105 110
sit ttt cea cet cet ttt caa gee egg aae ctt agt gga gga tat 384 Ile Phe p Pro Pro Pro Phe Gin Giu Arg Mn Leu Sex Giy Gly Tyr 5 120 125
ttg cat etc tat gaa tcc cag etc tgc tgc cag ctg aag etc tgg eta 432 Lei His Ile Tyr Glu Ser Gin Lela Cys Cys Gin Leu Lys Leu Trp Leu 130 135 140
cee gta ggg tgt gca gct tic gtt gtg gta etc ett ttt gga tgc ata 480 Pro Val Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val Leu Leu Phe Gly Cys Ile 145 150 155 160
ctt atc atc tgg ttt tca aaa aag aaa tac gga tcc agt gtg cat gac 528 Leu Ile Ile Trpthe Set Lys Lys Lys Tyr Gly Ser Ser Val His Asp 165 170
cct
aat agt gaa tac a tg ttc a tg gcg gca gtc aac aca aac aaa aag 576
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Ser Glu Tyr M et the Me t Ala Ala Va l Asn Thr Asn Lys Lys
1 8 0
185 190
tct aga ctt gca ggt gtg acc tca 600 Ser Arg Leu Ala Gly Val Thr Ser 195 200
lt;210gt; 2
lt;211gt; 200
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; rat
lt;400gt; 2
Met Lys Pro Tyr Phe Cys Arg Val Phe Val Phe Cys Phe Leu Ile Arg 1 5 10 15
Leu Leu Thr Gly Glu Ile Mn Gly Ser Ala Asp His Arg Met Phe Ser 20 25 30
Phe His Asn Gly Gly Val Gin Ile Ser Cys Lys Tyr Pro Giu Thr Val 35 40 45
Gin Gin Leu Lys Met Arg Leu Phe Arg Glu Arg Giu Val Leu Cys Giu 50 55 60
Leu Thr Lys Thr Lys Gly Ser Gly Asn Ala Val Set Ile Lys Mn Pro 85 70 75 80
Met Leu Cys Leu Tyr His Leu Ser Mn Mn Ser Val Ser Phe Phe Leu 85 90 95
Mn Asn Pro Asp Ser Ser Gin Gly Ser Tyr Tyr Phe Cys Ser Leu Ser 100 105 110
Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Gin Glu Arg Mn Leu Set Gly Gly Tyr 115 120 125
Leu His Ile Tyr Clu Ser Gin Leu Cys Cys Gin Leu Lys Leu Trp Leu 130 135 140
Pro Val Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val Leu Leu Phe Gly Cys Ile 145 150 155 160
Leu Ile lie Trp Phe Ser Lys Lys Lys Tyr Giy Set* Ser Val His Asp 165 170 175
Pro Asn Ser Giu Tyr Met Phe Met Ala Ala Val Mn Thr Mn Lys Lys 180 185 190
Set Arg Leu Ala Gly Val Thr Set 195 200
lt;210gt;3
lt;211gt; 200
lt;212gt;PRT lt;213gt;ratem lt;400gt;3
Met Lys Pro Pyr Phe Cys Arg Vol Phe Val Phe Cys Phe Leu Ile Arg 5 10 15 Len beu Phi Gly Gin Ile Asn Gly Ser Ala Asp His Arg Met Phe Ser 20 25 30 Phe His Asn Gly Gly Val Gin Ile Ser Cys Lys Tyr Pro Giu Thr Vol 35 40 45 Gin Gin Len Lys Met Arg Leu Phe Arg Glu Arg Glu Vol Len Cys Gin 50 55 60 Leu Thr Lys Thr Lys Gly Ser Gly Mn Ala Vol Ser Ile Lys Mn Pro 65 70 75 80 Met Len Cys Len Tyr His Len Ser Mn Asn Sex Vol Ser Phe phe Lou 85 90 95 Mn Mn Pro Asp Set Ser Gin Gly Ser Tyr Tyr Phe Cys Ser Lou Ser 100 105 110 Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Gin Glu Arg Mn Leu Ser Gly Gly Tyr 115 120 125 Leu His Ile Tyr Glu Ser Gin Leu Cys Cys Gin Leu Lys Len Trp Len
130 135 140 Pro Val Gly Cys Ala Ala Phe Val Vol Vol Leu Leu Phe Gly Cys lie 145 150 155 160
Len Ile Ile Trp Phe Sex- Lys Lys Lys Tyr Gly Ser Ser Val His Asp 165 170 175 Pro Mn Ser Clu Tyr Met Phe Met Ala Ala Val Mn Phi Mn Lys Lys 180 185 190 Lou Ala Gly Vol Phi S r 195 200
lt;210gt;4
lt;211gt; 218
lt;212gt; PRT
lt;213gt; ratan 10 lt;400gt;4
Met Thr Leu Arg Leu Leu Phe Leu Ala Leu Asn Phe Phe Ser Val Gin 1
5 10 15
Val Thr Glu Asn Lys lie Leu Val Lys Gin Ser Pro Leu Leu Val Val 20 25 30
Asp Ser Mn Giu Val Ser Leu Ser Cys Arg Tyr Ser Tyr Asn Leu Leu 35 40 45
Ala Lys Glu Phe Arg Ala Ser Leu Tyr Lys Gly Val Mn Ser Asp Val 50 55 60
Glu Val Cys Val Gly Mn Gly Mn Phe Thr Tyr Gin Pro Gin Phe Arg 65 70 75 80
Ser Asn Ala Glu Phe Mn Cys Asp Gly Asp Phe Asp Mn Giu Thr Val 85 90 95
Thr Phe Arg Leu Trp Mn Leu His Val Asn His Thr Asp Ile Tyr Phe 100 105 110
Cys Lys Ile Giu Phe Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Mn Glu Arg 115 120 125
Ser sn Gly Thr Ile Ile His Ile Lys Glu Lys His Leu Cys His Thr 30 135 140
Gin Sex* Ser Pro lays Leu Phe Trp Ala Lei val Val Val Ala Gly Val 145 150 155 160
Leu Phe Cys Tyr Gly Lieu Leu Val Thr Val Ala Leu Cys Val Ile Trp 165 170 175
Thr Asn Ser Arg Arg Mn Arg Leu Leu Gin Val Thr Thr Met,Asn Met 180 185 190
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Lou Thr Arg Lys Pro Tyr Gin Pro Tyr Ala 195 200 205
Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro 210 215
lt;210gt; 5
lt;211gt; 234 5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220>
lt;223gt; Descripci6n de secuencia artificial: Oligonucleotido sintetico
lt;400gt; 5
Met Xaa xaa Xaa Xaa 5
Leo Leu Xaa Xaa Xaa 20
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35
Val Xaa Xaa Ser Cys 50
Xaa Xaa Xaa Leu Xaa 65
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85
Xaa Xaa Cys Xaa Xaa 100
Xaa Asn Xaa Xaa Xaa 115
Xaa Xaa Xaa Pro Pro 130
Xaa Xaa Kis Ile Xaa 145
Lys Leu Xaa Trp Xaa 165
Xaa Xaa Lieu Leu Xaa 180
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195
Xaa Xaa Xaa X a Xaa 210
Xaa Xaa Ala Xaa Xaa 225
lt;210gt;6
lt;211gt; 966 5 lt;212gt; ADN
lt;213gt; rat6n
lt;220>
lt;221gt; CDS
lt;222gt; Complemento ((1) .. (966)) 10 lt;400gt;6
Xaa Xaa Xaa Xaa
Xaa Xaa Xaa Xaa 25
Xaa Xaa Xaa Xaa 40
Xaa Tyr Xaa Xaa 55
Xaa Xaa Xaa Xaa
70 Xaa Xaa
Xaa Xaa
Xaa Xaa
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G u Xaa 150
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Xaa Xaa
Xaa Xaa
Xaa Xaa 215
Xaa Xaa 230
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 60
Xaa Xaa Val Xaa Xaa Cys Xaa 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 90 95
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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Gly Xaa 140
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130 135 140
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gcg gca gcg gca ttc gtt tcc ttc atc ata tac ago cgc acg cgt ccc 912 Ala Ala Ala Ala Phe Val Ser Phe Ile Ile Tyr Arg Arg 'Mr Arg Pro 290 295 300
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cac gcc 966 His Ala
lt;210gt; 7
lt;211gt; 322
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lt;400gt; 7
n Leu Lys Cys Pro Cys Phe Val Ser Leu Gly Thr Arg Gin Pro 10 15
Val Trp Lys Lys Leu His Val Ser Ser Gly Phe Phe Ser G y Leu Gly 20 25 30
Leu Phe Lieu Leu Leu Leu Ser Ser Let, Cys Ala Ala Ser Ala Glu Thr 35 40 45
Giu Val Gly Ala Met Val Gly Ser Asn Val Val Leu Set Cys Ile Asp 50 55 60
Pro His Arg Arg His Phe Asn Leu Ser Gly Leu Tyr Val Tyr Try Gin 65 70 75 80
Ile Giu A n Pro Glu Val Ser Val Thr Tyr Tyr Leu Pro Tyr Lys Ser 85 90 95
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Ala Thr Giu Leu Val Lys Ile Lieu Glu Giu Val Val rg Leu Arg Val 145 150 155 160
Ala Ala Asn Phe Ser Thr Pro Val Ile Ser Thr Ser Asp Ser Set Asn 165 170 175
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Leu Cys Cys Val Giu As Val Ala Leu His Gin Asn Ile Thr Ser Ile 245 250 255
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His Arg Ser Tyr Thr Gly Pro Lys Thr Val Gin Leu Glu Leu Thr Asp 305 310 315 320
His Ala
lt;210gt;8
lt;211gt; 322
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; ratan
lt;400gt; 8 44
Met Gin Leu Lys Cys Pro Cys Phe Val Sex' Leu Giy Thr Arg Gin Pro
1
5 10 15
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Pro His Arg Arg His Phe Mn Leu Set Gly Leu Tyr Val Tyr Trp Gin 65 70 75 80
Ile Glu Mn Pro Glu Val Ser Val Thr Tyr Tyr Leu Pro Tyr Lys Set 85 90 95
Pro Gly Ile Mn Val Asp Ser Set Tyr Lys Asa A q Gly His Leu Ser. 100 105 110 ,
Leu Asp Ser Met Lys Gin Gly Mn Phe Set Leu Tyr Leu Lys Mn Val 115 120 125
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His Arg Set Tyr ?hr Gly Pro Lys Thr Val Gin Leu Glu Leta Thr Asp 305 310 315 320
His Ala
lt;210gt;0
lt;211gt; 306
lt;212gt; PRT
lt;213gt; rat6n
lt;400gt; 9
Met Ala Cys Asn Cys Gin Leu Met Gin Asp Thr Pro Leu Leu Lys Phe 1 5 10 15
Pro Cys Pro Arg Leu Ile Leu Leu Phe val Leu Leu Ile Arg Leu Ser 20 25 30
Gin Val Ser Ser Asp Val Asp Glu Gin Leu Ser Lys Ser Val Lys Asp. 35 40 45
Lys Val Leu Leu Pro Cys Arg Tyr ASn Ser Pro His Glu Asp Glu ser 50 55 60
Glu Asp Arg Ile Tyr Trp Gin Lys His Asp Lys Val Val Leu Ser Val 65 70 75 80
Ile A: a Gly Lys Leu Lys Val Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Leu 85 90 95
Tyr Asp Asn Thr Thr Tyr Ser Lou Ile lie Lou Gly Leu Val Leu Ser 100 105 110
Asp Arg Gly Thr Tyr Ser Cye Val Val Gin Lys Lys Glu Arg Giy Thr 115 120 125
Tyr Glu Val Lye His Leu Ala Leu Val Lys Leu Set Ile Lys Ala Asp 130 135 140
Phe Ser Thr Pro Asn lie Thr Glu Ser Gly ken Pro Set Ala Asp Thr 145 150 155 160
Lys Arg Ile Thr Cys Phe Ala Ser Giy Gly Phe Pro Lys Pro Arg Phe 165 170 175
Ser Trp Leu Glu Asn Gly Arg Glu Leu Pro Giy Ile Asn Thr Thr Ile 180 185 190
Ser Gin Asp Pro Glu Ser Giu Leu Tyr Thr Ile Ser Ser Gin Leu Asp 195 200 205
Phe Asn Thr Thr Arg Asn His Thr Ile Lys Cys Leu Ile Lys Tyr Gly 210 215 220
Asp Ala His Val Ser Glu Asp Phe Thr Trp Glu Lys Pro Pro Giu Asp 225 230 215 240
Pro Pro Asp Ser Lys Asn Thr Leu Val Leu Phe Gly Ala Gly Phe Gly 245 250 255
Ala Val lie Thr Val Val Val Ile Val Val Ile Ile Lys Cys Phe Cys 260 265 270
Lys His Arg ser Cys Phe Arg Arg Asn Glu Ala Ser Arg Glu Thr Aan 275 280 285
Asn Ser Lou Thr Phe Gly Pro Glu Glu Ala L u Ala Glu Gin Thr Val 290 295 300
Phe Leu 305
lt;210gt;10
lt;211gt; 327
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
5 lt;220>
lt;223gt; Descripci6n de secuencia artificial: Oligonucleotido sintetico
lt;400gt; 10
Met Xaa Xaa Xaa cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa L•u Xaa Xaa Xaa Xaa Pro 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa 20 25 30
Leu Phe Xaa Lieu L,eu Xaa Xaa Xaa Sex Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Val Xaa Lieu Xaa Cys Xaa 50 55 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Trp 65 70 75 80
Gin Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa xaa Leu Xaa Xaa Xaa 85 90 95
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Tyr Lys Asn Arg Xaa Xaa Xaa 100 105 110
Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Leu Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125
Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Val Xaa Xaa Xaa 130 135 140
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Lem Xaa 145 150 155 160
Xaa X a Ala Xaa Phe Ser Thr Pro Xaa Ile Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa 165 170 175
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Thr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa 180 185 190
Pro Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205
Ile Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 210 215 220
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa 225 230 235 240
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 245 250 255
Xaa xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa As Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 260 265 270
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Val Xaa Val Xaa Xaa
275 280 285
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa xaa Xaa Xaa Xaa 290 295 300
Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Thr Xaa Gly Pro Xaa Xaa Xaa Xaa 305 310 315 320
Xaa Glu Xaa Thr Xaa Xaa 325 lt;210gt;11 lt;211gt;864
lt;212gt; ADN 5 lt;213gt; rat6n
lt;220>
lt;221gt; CDS
lt;222gt; Complemento ((1) .. (864)) lt;400gt;11
atg egg ctg ggc agt cct gga ctg etc ttc ctg etc tte age age ctt 48 Met Arg Lieu Gly Ser Pro Gly Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ser Ser Leu 5 10 15
cga get gat act cag gag aag gas gte aga geg atg gta ggc age gac 96 Arg Ala Asp Thr Gin Glu Lys Giu Val Arg Ala Met Val Sly Ser Asp 20 25 30
gtg gag etc age tgc get tge cct gas gga age cgt ttt gat tta sat 144 Val Glu Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn 35 40 45
gat gtt tac gta tat tgg caa ace agt gag tcg aaa ace gtg gtg acc 192 Asp Val Tyr Val Tyr Trp Gin Thr Ser Glu ser Lys Thr Val Val Thr 50 55 60
tac cae ate cca cag aac age tee ttg gaa aac gtg gac age ege tac 240 Tyr His Ile Pro Gin Asn Ser Ser Lau Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr 65 70 75 80
egg aac cga gee ctg atg tca egg gee ggc atg ctg egg ggc gac ttc 288 Arg Asn Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe 85 90 95
tee ctg cgc ttg ttc sac gtc ace ccc cag gac gag cag aag ttt cac 336 Ser Leu Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gin Asp Glu Gin Lys Phe His 100 105 110
tgc ctg gtg ttg age caa tee ctg gga ttc cag gag gtt ttg age gtt 384 Cys Leu Val Leu Ser Gin Set Lev Gly Phe Gin Glu Val Leu Ser Val 115 120 125
gag gtt sea ctg cat gtg gca gca sac tte age gtg egg gtc gtc age 432 Giu Val Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser 130 135 140
gee cce eac age cce tee cag gat gag etc ace tte aeg tgt aca tee 480 Ala Pro His Ser Pro Ser Gin Asp Glu Lela Thr Phe Thr Cya Thr Ser 145 150 155 160
ata aac ggc tac ece agg ecc sac gtg tac tgg ate aat aag acg gac 528 Ile Mn Gly Tyr Pro Arg Pro Mn Val Tyr Trp Ile Mn Lys Thr Asp
165 170 175
aac age ctg ctg gac cag get ctg cag aat gac acc gtc ttc ttg aac 576 Asn Ser Leu Leu Asp Gin Ala Len Gin Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn 180 185 190
atg cgg ggc ttg tat gac gtg gtc agc gtg ctg agg atc gca cgg ace 624 Met Arg Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr 195 200 205
ccc age gtg aac aft ggc tgc tgc ata gag aac gtg att ctg cag cag 672 Pro Ser Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Len Leu Gin Gin 210 215 220
aac ctg act gtc ggc agc cag aca gga aat gac atc gga gag aga gac 720 Asn Leu Thr Val Gly Ser Gin Thr Gly Asn Asp Ile Gly Gin Arg Asp 225 230 235 240
aag ate aca gag aat cca gtc agt ace ggc gag aaa aac qcg gee aeg 768 Lys Ile Thr Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Thr 245 250 255
tgg age atc ctg get gtc ctg tgc ctg ctt gtg gtc gtg gcg gtg gee 816 Trp Ser Ile Leu Ala Val Leu Cys Len Lau Val Val Val Ala Val Ala 260 265 270
ata ggc tgg gtg tgc egg gee cga tge ctc caa cac age tat gca ggt 864 Ile Gly Trp Val eye Arg Asp Arg Cys Len Gin His Sex-Tyr Ala Gly 275 280 285
lt;210gt; 12
lt;211gt; 288
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; rat6n
lt;400gt; 12
Met Arg Leu Gly Ser Pro Gly Leo 5
Arg Ala Asp Thr Gin Giu Lys Glu 20
Val Glu Leu Ser Cys Ala Cys Pro 35 40
Asp Val Tyr Val Tyr Trp Gin Thr 50 55
Tyr His Ile Pro Gin Mn Ser Ser 65 70
Arg Mn Arg Ala Leo Met Ser Pro 85
Ser L u Arg Leo Phe Mn Val Thr
Leo Phe Leo Leu Phe Ser Ser Leo 10 15
Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp 25 30
Gb dy Ser Arg Phe Asp Leo Mn 45
Ser Giu Ser Lys Thr Val val Thr 60
Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr 75 80,
Ala Gly Met Leo Arg Gly Asp Phe 90 95
Pro Gin Asp Glo Gin Lys Phe His
100 105 110
Cys Leu Val Leu Ser Gin Ser Leu 115 3.20
Glu Val Thr Leo His Val Ala Ala 130 135
Ala Pro His Ser Pro Ser Gin Asp 145 150
Ile Asn Gly Tyr Pro Arg Pro Mn 165 -
Mn Ser Leo Leu Asp Gin Ala Leo 180
Met Arg Gly Leo Tyr Asp Val Val 195 200
Pro Ser Val Mn Ile Giy Cys Cys 210 215
Mn Leu Thr Val Gly Ser Gin Thr 225 230
Lys Ile Thr Giu Mn Pro Val Ser 245,
Trp Ser Ile Leu Ala Val Leo Cys 260
Ile Gly Trp Val Cys Arg Asp Arg 275 280
lt;210gt; 13
lt;211gt; 267 5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; ser humano
lt;400gt; 13
Gly Phe Gin Giu Val Leu Ser Val
Mn Phe Ser Val 140
Glu Leu Thr Phe 155
val Tyr Trp Ile 170
Gin Mn Thr 185
Leo Arg
Asn Val 220
Asp Ile 235
Thr Gly Glu Lys 250
Leo Leu Val Val 265
Cys Leo Gin His
125 Pro Val Val Ser
Thr Cys Thr Ser 160
Mn Lys Thr Asp 175
Val Phe Leu Asn 190
Ile Ala Ar Thr 205
Leu Leo Gin Gin
Gly Glu Arg Asp 240
Mn Ala Ala Thr 255
Val Ala Val Ala 270
Ser Tyr Ala Gly 285
Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu Leu Ser ys 1 5 10 15
Ala Cys Pro Glu G y Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val Tyr Val Tyr 20 25 30
Trp Gin Thr Ser Giu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His Ile Pro Gin 35 40 45
Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn Ar Ala Leu 50 55 60
Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu Arg Leu Phe 65 70 75 80
Asn Val Thr Pro Gin Asp Glu Gin Lys Phe His Cys Leu Val Leu ser 85 90 95
Gin Ser Leu Gly Phe Gin Glu Val Leu Ser Val Glu Val Thr Leu His 100 105 110
Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser Ala Pro His Ser Pro 115 120 125
Ser Gin Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser Ile Asn Gly Tyr Pro 130 135 140
Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp Asn Ser Leu Leu Asp 145 150 155 160
Gln Ala Leu Gin Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn Met Arg Gly Leu Tyr 165 170 175
Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr Pro Ser Val Asn lie 180 185 190
Giy Cys Cys Ile Giu Asn Val Leu Leu Gin Gin Asn Leu ?hr Val Gly 295 200 205
Ser Gin Thr Gly Asn Asp Ile Gly Glu Arg Asp Lys Ile Thr Glu Asn 210 215 220
Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Ash Ala Ala Thr Trp Ser Ile Leu Ala 225 230 235 240
Val Leu Cys Leu Leu Val Val Val Ala Val Ala lie Gly Trp Val Cys 245 250 255
Arg Asp Arg Cys Leu Gin His Ser Tyr Ala Gly 260 265
lt;210gt; 14
lt;211gt;276 5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; ratan
lt;400gt; 14
54
Giu Thr Glu Val Giy Ala Met Val Gly Set Asn Val Val Lou Set Cys 1 5
10 15
Asp Pro His Arg Arg His Pile Asn Leu Set Gly Lou Tyr Val Tyr 20 25 30
Trp Gin lIe Glu Mn Pro Giu Val Ser Vol Thr Tyr Tyr Leu Pro Tyr 35
40 45
Lys Ser Pro Gly Ile Asn Val Asp Set Ser Tyr Lys Mn Arg Gly His 50 55 60
Leu Set Lou Asp Set Met Lys Gin Gly Asn Pile Set Lou Tyr Leu Lys 65 70 75
BO
Mn Val Thr pro Gin Asp Thr Gin Glu Phe Thr Cys Arg Val Pile Met 85 90 95
Mn Thr Ala Tilt Glu Leu Val Lys Ile Leu Glu Glu Val Val Arg Lou 100 105 110
Arg Val Ala Ala A8n Phe Ser Tilt Pro Val Ile Ser Thr Ser Asp Set 115 120 125
Set Mn Pro Gly Gin Giu Arg Tilt Tyr Thr Cys Met Ser Lys Asn Gly 30 135 140
Tyr Pro Glu Pro Mn Lieu Tyr Trp Ile Mn Thr Tilt Asp Asn Set Lou 145 150 155 160
Ile Asp Tilt Ala Leu Gin Mn Mn Thr Val Tyr Leu Mn Lys Leu Gly 165 170 115
Leu Tyr Asp Val Ile Set Tilt Leu Arg Lou Pro Trp Tilt Set Arg Gly 180 185 190
Asp Vol Leu Cys Cys Val Glu Mn Val Ala Leu His Gin Mn Ile Tilt 195 200 205
Ser lie Set Gin Ala Glu Set Phe Tilt Gly Mn Asn Tilt Lys Mn Pro 210 215 220
Gin Glu Thr His Mn Mn Giu Lou Lys Val Leu Val Pro Val Leu Ala 225 230 235 240
Val Leu Ala Ala Ala Ala Phe Val Set Pile Ile Ile Tyr Arg Arg Tilt 245 250 255
Arg Pro His Arg Sex-Tyr Tilt Giy Pro Lys Thr Val Gin Leu Glu lieu 260 265 270
Thr Asp His Ala 275
lt;210gt; 15
lt;211gt; 280
5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
55
lt;220>
lt;223gt; DescripciOn de secuencia artificial: oligonucleotido sintetico
lt;400gt; 15
Giu Xaa Glu Val Xaa Ala Met Gly Val Ser Xaa Val Xaa Leu Ser Cys 1 5 10 15
Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Tyr Val Tyr 20 25 30
Trp Gin Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa X•a Xaa Val Thr Tyr Xaa Xaa Pro Xaa 5 40 45
Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Asn Val Asp Ser Xaa Tyr Xaa Asn Arg Xaa Xaa 50 55 60
Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Met Xaa Xaa Gly Xaa Phe Ser Leu Xaa Lieu Xaa 65 70 75 80
Asn Val Thr Pro Gin Asp Xaa Gin Xaa Phe Xaa Cys Xaa Val Xaa Xaa 85 90 95
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lev Xaa Xaa Xaa Val Xaa Leu 100 105 110
Xaa Val Ala Ala Asn Phe Ser xaa Pro Val Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Ser 115 120 125
Xaa Xaa xaa Xaa Xaa Glu Xaa Thr Xaa Thr Cys Xaa Ser Xaa Asn Gly 130 135 140
Tyr Pro Xaa Pro Asn Xaa Tyr Trp Ile Asn Xaa Thr Asp Asn Ser Leu 145 150 155 160
Xaa Asp Xaa Ala Leu Gin Mn Xaa Thr Val Xaa Leu Asn Xaa Xaa Gly 165
170 175 lieu Tyr Asp Val Xaa Ser Xaa Leu Arg Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa
180 185 190
Xaa Xaa Xaa cys Cys xaa Glu Asn Val Xaa Leu Xaa Gin Mn Xaa Thr 195 200 205
Xaa Xaa Ser Gin Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Xaa 210 215 220
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu 225 230 235 240
Ala Val Leu Xaa Xaa aa Xfka Xaa Val Xaa Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa 245 250 255
Xaa Arg Xaa Arc' Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Tyr Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa 260 265 270
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 275 280
lt;210gt;16 lt;211gt;1294
lt;212gt;ADN lt;213gt;serhumano 5 lt;220>
lt;221gt;UTRen5' lt;222gt;(1) ..(199)
lt;220>
lt;221gt;CDS
10 lt;222gt;(200) ..(1105)
lt;400gt;16
gctggtacgc ctgcaggtac cggtccggaa ttcccgggtc gacccacgcg tccgcccacg 60
cgtccgcggg agcgcagtta gagccgatct cecgcgcccc gaggttgctc ctctccgagg 120
teteccgegg cccaagttct ccgcgcaccg aggtotccgc gccccgaggt ctccgcggcc 180
cgaggtctcc gcccgcacc atg cqg ctg ggc agt cct gga ctg ctc ttc ctg 232 Met Arg Lea Gly Ser Pro Gly Lea Lea Phe Lea 1 5 10
ctc ttc agc agc ctt cga gct gat act cag gag aag gaa gtc aga geg 280 Lea Phe Ser Ser Lea Arg Ala Asp Thr Gin Gila Lys Glu Val Arg Ala 15 20 25
atg gta ggc age gac gtg gag etc age tgc (Jct tgc cct gas gga agc 328 Met Val Gly Ser Asp Val Glu Lieu Ser Cys Ala Cys Pro Giu Gly Ser 30 35 40
cgt ttt gat tta aat gat gtt tac gta tat tgg caa acc agt gag tcg 376 Arg he Asp Leu Asn Asp Val Tyr Val Tyr Trp Gin Thr Ser Glu Ser 45 50 55
aaa ace gtg gtg acc tac cac etc cca cag aae age tcc ttg gee aac 424 Lys Thr Val Val Thr Tyr His Ile Pro Gin Asn Ser Ser Lea Glu An 60 65 70 75
gtg gac age cgc tee egg aac cga gee ctg atg tca ccg gee ggc atg 472 Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn Arg Ala Lieu Met Ser Pro Ala Gly Met 80 85 90
ctg cgg ggc gac ttc tcc ctg cgc ttg ttc aac gtc ace ccc cag gac 520 Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gin Asp 95 100 105
gag cag aag ttt cac tgc ctg gtg ttg age caa tcc ctg gga ttc cag 568 Glu Gin Lys Phe His Cys Leu Val Leu Ser Gin Ser Leu Gly Phe Gin 110 115 120
gag gtt ttg age gtt gag gtt aca ctg cat gtg gca gca aac ttc agc Giu Val Leu Ser Val Glu Val Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser 125 130 135
gtg ccc gtc gtc agc gcc ccc cac agc ccc tcc cag gat gag ctc acc 664 Val Pro Val Val Ser Ala Pro His Ser Pro Ser Gin Asp Glu Leu Thr 140 145 150 155
ttc aeg tgt aca tee ata aac gqc tac ccc agg ccc aaC gtq tac tgg 712 Phe Thr Cys Thr Ser Ile Asn Gly Tyr Pro Arg Pro An Val Tyr Trp 160 165 170
ate aat aag acg gac aac age ctg ctg gac cag gct ctg cag aat gac 760 Ile Asn Lys Thr Asp Asn Ser Leu Lieu Asp Gin Ala Leu Gin Asn Asp 175 180 185
ace gtc ttc ttg aac atg egg ggc ttg tat gac gtg gtc age gtg Ctg 808 Thy Val Phe Leu Asn Met Arg Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val lieu 190 195 200
egg ate gca egg acc ccc age gtg sac att ggc tgc tgc ata gag sac 856 Arg Ile Ala Avg Thy Pro Ser Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn 205 210 215
gtg ctt ctg cag cag sac ctg act gtc ggc agc cag aca gga aat gac 904 Val Leu Leu Gin Gin Asn Leu Thr Val Gly Ser Gin Thy (fly Asn Asp 220 225 230 235
ate gga gag aga gee aag ate ace gag aat cca gtc agt ace ggc gag 952 Ile Gly Glu Arg Asp Lys Ile Thr Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu 240 245 250
ass aac gcg gcC acg tgg agc ate ctg get gtc ctg tgc ctg ctt gtg 1000 Lys Asn Ala Ala Thr Trp Ser Ile Lau Ala Val Leu Cys Leu Leu Val 255 260 265
gtc gtg gcg gtg gcc eta ggc tgg gtg tgc egg gee cga tgc etc caa 1048 Val Val Ala Val Ala Ile Gly Trp Val Cys Arg Asp Arg Cys Leu Gin 270 275 280
cac agc tat gca ggt gcc tgg get gtg agt ccg gag aca gag etc act 1096 His Ser Tyr Ala Gly Ala Trp Ala Val Ser Pro Glu Thr Glu Leu Thr 285
290 295
qgc cac gtt tgaccggagc tcaccgccca gagcgtggac agggct ccg 1145 Gly His Val 300
tgagac cca ccgtgagagg ccaggtggca gcttgagcat ggactcceag actgcag gg 1205
agcacttggg gcagccccca gaaggaccac tgctggatcc cagggagaac ctgctggcgt 1265
tggctgtqat cctggaatga ggccctttc 1294
lt;210gt;17
lt;211gt;302
lt;212gt; PRT
lt;213gt; ser humano lt;400gt;17
Met Arq Lieu Giy Ser Pro Gly Lieu Lieu Phe Lieu Lieu Phe Ser Ser Lieu 5 10 15
Arg Ala Asp Thr G u Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp
20 Val Glu Leu Ser 35 Asp Val Tyr Val 50 Tyr His Ile Pro
Arg Asn Arg Ala
Ser Lieu Arg Lieu 100
Cys Lieu Val Lieu 115
Glu Val Thr Lieu
25 30 Cys Ala Cys Pro Glu Giy Ser Phe Asp Lieu Mn 40 45 Tyr Trp Gin Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr 55 60
Gin Mn Ser Ser Lieu Glu Mn Val Asp Ser Arg Tyr 70 75 80 Lieu Met Ser Pro Ala Gly Met Lieu Arg Giy Asp Phe
85 90 95 Phe Mn Val Thr Pro Gin Asp Giu Gin Lys Phe His 105 110
Ser Gin Ser Lieu Gly Phe Gin Glu Val Lieu Ser Val 120 125 His Val Ala Ala Mn Phe Ser Val Pro Val Val Ser
130 135 140
Ala Pro His Ser Pro Ser Gin Asp Glu Leu Thr Pie Thr Cys Thr ser 145
150 155 160
Ile Mn Gly Tyr
Asn Ser Lieu Lieu 180
Arg Gly Lieu 195
Pro Ser Val Mn
Pro Arq Pro Mn Val Tyr Trp Ilie Mn Lys Thr Asp 165 170 175
Asp Gin Ala Lieu Gin Mn Asp Thr Val Phe Lieu Asn 185 190
Tyr Asp Val Val Ser Val Lieu Arg Ile Ala Arg Thr 200 205
Ile G].y Cys Cys Ile Glu Asn Val Lieu Lieu Gin Gin
210 215 220
Mn Lieu Thr Val Gly Ser Gin Thr Giy Asn Asp Ile Gly Glu Arg Asp 225 230 235 240
Lys Ile Thr Glu Mn Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Mn Ala Ala Thr 245 250 255
Trp Ser Ile Lieu Ala Val Lieu Cys Lieu Lieu Val Val Val Ala Val Ala 260 265 270
Ile Gly Trp Val Cys Arg Asp Arg Cys Lieu Gin His Ser Tyr Ala Gly 275 280 285
Ala Trp Ala V Pro Glu Thr Glu Leu Thr Gly His Val 290 295 300
lt;210gt; 18 lt;211gt;302
lt;212gt; PRT
lt;213gt; ser humano
5 lt;400gt;18
Arg Leu Gly Ser Pro Gly Leu Leu Phe Leu Leu Phe set Set Leu 5 10 15
Arg Ala Asp Thr Gin Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Oly Ser Asp 20 25 30
Val Giu Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn 35 40 45
Asp Val Ty: Val Tyr Trp Gin Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr 50 55 60
Tyr His Ile Pro Gin Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr 65 70 75 80
Arg Asn Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Lau Arg Gly Asp Phe 85 90 95
Ser Leu Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gin Asp Glu Gin Lys Phe His 100 105 110
CyS Leu Val Leu Ser Gin Ser Leu Gly Phe Gin Glu Val Leu Ser Val 115 120 125
Glu Val Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser 130 135 140
Ala Pro His Ser Pro Ser Gin Asp Glu Leu Thr Phe Thr C s Thr Ser 145 150 155 160
Ile Asn Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp 165 170 175
Asn Ser Leu Leu Asp Gin Ala Leu Gin Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn 180 185 190
Met Arg Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr 195 200 205
Pro Ser Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gin Gin 210 215 220
Asn Leu Thr Val Gly Ser Gin Thr Gly Asn Asp Ile Gly Glu Arg Asp 225 230 235 240
Lys Ile Thr Glu Asn Pro Val Ser Thr'Gly Glu Lys Asn Ala Ala Thr 245 250 255
Trp Ser Ile Leu Ala Val Leu Cys Leu Leu Val Val Val Ala Val Ala 260 265
270
lie Gly Trp Val Cys Arg Asp Arg Cys Leu Gin His Ser Tyr Ala Gly 275 280 285
Ala Trp Ala Val Ser Pro Glu Thr Gil] Leu Thr Gly His Val 290 295 300
lt;210gt; 19
lt;211gt; 322
lt;212gt; PRT
lt;213gt; rat6n
lt;400gt; 19
Met Gin Leu Lys Cys Pro Cys Phe Val Ser Leu dy Thr Arg Gin Pro 5 10 15
Val Trp Lys Lys Leu His Val Sr Set Gly Phe Phe Ser Gly Leu Gly 20 25 30
lieu Phe Leu lieu Leu lieu Ser Ser lieu Cys Ala Ala Ser Ala Glu Thr 35 40 45
Giu Val Gly Ala Met Val Gly Set Mn Val Val Leu ser Cys Ile Asp 50 60
55
Pro is Arg Arg His Phe Asn lieu Sex GlY u Tyr Val Tyr Trp Gin 65 70 5 80
Ile Giu Mn Pro Glu Vol Ser Vol Thr Tyr Tyr lieu Pro Tyr Lys Ser. 85 90 95
Pro Gly Tie Mn Val Asp Ser. Ser Tyr Lys Mn Arg Giy His Leu Ser 100 105 110
lieu Asp Set Met Lys Gin G y Asn Phe Ser lieu Tyr lieu Lys Mn Vol 115 120 125
Thr Pro Gin Asp Thr Gin Giu Phe Thr Cys Arg Vol Phe Met Mn Thr 130 135 140
Ala Thr Giu lieu Val Lys Ile lieu Glu Giu Val Val Arg lieu Arg Val 145 150 155 160
Ala Ala Mn Phe Se.r Thr Pro Val lie Set Thr Ser Asp Sex Sex-Mn 165 170 175
Pro Gly Gin Glu Arg Thr Tyr Thr Cys Met Set Lys Mn Gly Tyr Pro 180 185 190
Glu Pro Mn lieu Tyr Trp Ile Mn Thr Thr Asp Asn Sex lieu Ile Asp 195 200 205
Thr Ala lieu Gin Asn Mn Thr Val Tyr lieu Mn Lys Leu Gly lieu Tyr 210 215 220
Asp Val Ile Ser Thr lieu Arc; lieu Pro Trp Thr Ser Arg Gly Asp Val 225 230 235 240
lieu Cys Cys Vol Glu Asn Val Ala lieu His Gln Mn Ile Thr Sex' Ile 245 250 255
Set Gin Ala Giu Ser Phe Thr Gly Mn Mn Thr Lys Mn Pro Gin Giu 260 265 270
Thr His Mn Asn Glu lieu Lys Vol Leu Vol Pro Vol Leu Ala Val lieu 275 280 285
Ala Ala Ala Ala Ole Vol Ser Phe lie Ile Tyr Arg Arg Thr Arg Pro 290 295 300
His A g S•r Tyr Thr Gly Pro Lys Thr Val Gin Leu Giu Leu Thr Asp 305 310 315 320
His Ala
lt;210gt;20 lt;211gt;329
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220>
lt;223gt; DescripciOn de secuencia artificial: Oligonucleotido sintetico
lt;400gt; 20
Met Xaa Leu Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 ,15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Leu Xaa 20 25 30
Lieu Pe Xaa Lau Leu Xaa Ser Ser Leu Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Glu Xaa 35 40 45
Glu Val Xaa Ala Met Val Gly Ser Xaa Val Xaa Leu Ser-Cys Xaa Xaa 50 55 60
Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Tyr Val Tyr Trp Gin 65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Thr Tyr Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Ser 85 90 95
Xaa Xaa Xaa Mn Val Asp Ser Xaa Tyr Xaa Mn Arg Xaa Xaa Xaa Ser 100 105 110
Xaa Xaa Xaa Met Xaa Xaa Gly Xaa Phe Ser Leu Xaa Leu Xaa Mn Val 115 120 125
Thr Pro Gin Asp Xaa Gin Xaa Phe Xaa Cys Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa 130 135 140
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Val Xaa Leu Xaa Val 145 150 155 160
Ala Ala Mn Phe Ser Xaa Pro Val Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa 165 170 175
Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Thr Xaa Thr Cys Xaa Ser Xaa Mn Gly Tyr Pro 180 185 190
Xaa Pro A n Xaa Tyr Trp Ile Mn Xaa Thr Asp Asn Ser Leu Xaa Asp 195 200 205
Xaa Ala Leu Gin Mn Xaa Thy Val Xaa Leu Mn Xaa Xaa Gly Leu Tyr 210 215 220
Asp Val Xaa Ser Xaa Leu Arg Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 225 230 235 240
Xaa Cys CyS Xaa Gin Mn Val Xaa Leu Xaa Gin Mn Xaa Thr Xaa Xaa 245 250 255
Ser Gin Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Lys Xaa xaa xaa xaa 260 265 270
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Ala 275 280 285
Val Leu Xaa Xaa Xaa Xaa xaa Val Xaa Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa 290 295 300
Arg Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Tyr Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Val Xaa 305 310 315 320
Xaa Glu Xaa Xaa Leu Thr Xaa His Xaa 325
lt;210gt;21
lt;211gt; 1370
lt;212gt; ADN 5 lt;213gt; ser humano
lt;220>
lt;221gt; UTR en 5'
lt;222gt; (1) .. (165)
lt;220> 10 lt;221gt; CDS
lt;222gt; (166) .. (762)
lt;400gt; 21
aacaatttca cacaggaaac agctatgacc atgattacgc caagctctaa tacgactcac 60,
tatagggaaa gctggtacgc ctgcaggtac cggtccggaa ttcccgggtc gacccacgcg 120
tccgtgaaca ctgaacgcga ggactgttaa ctqtttctgg caaac atg aag tca ggc 177 met Lys Ser Gly 1
ctc tgg tat ttc ttt ctc ttc tgc ttg cgc att aaa gtt tta aca gga 225 Leu Trp Tyr Pho the Lieu Phe Cys Leu Arg Ile Lys Val Leu Thr Gly 5 10 15 20
gaa atc act ggt tct gcc aat tat gag atg ttt ata ttt cac aac gga 273 Giu Ile Asn Gly Ser Ala Asn Tyr Glu Met the Ile Phe His Asti Gly 25 30 35
ggt gta caa att tta tgc aaa tat cct •ac att gtc cag caa ttt aaa 321 Gly Val Gin lie Leu Cys Lys Tyr Pro Asp Ile Val Gin Gin Phe Lys 40 45 50
atg cag ttg ctg aaa cmg ggg caa eta ctc tgc gat ctc act aag ace 36.9 Met Gin Leu Leu Lys Gly Gly Gin Ile Leu Cys Asp Leu Thr Lys Thr 55 60 65
aaa gga agt gga aac ace gtg tcc att aag agt ctg aaa ttc tgc cat 417 Lys Gly Ser Gly Asn Thr Val Ser Ile Lys Ser Leu Lys Phe Cys His 70 75 80,
tct cag tta tcc aac aac agt gtc tct ttt ttt cta tac aac ttg gac 465 Ser Gin Leu Ser Asn Asn Ser Val Ser Phe Phe Leu Tyr Asn Lou AS 85 90 95 100
cat tct cat gcc aac tat, tac ttc tgc aac cta tca att ttt gat cct 513
His Ser His Ala Asn Tyr Tyr Phe Cys Asn Leu Ser Ile Phe Asp Pro 105 110 115
cct cct ttt aaa gta act ctt ace gga gga tat ttg cat att tat gaa 561 Pro Pro Phe Lys Val Phi-Leu Thr Sly Gly Tyr Leal His Ile Tyr Glu 120 125 130
tca caa ctt tgt tgc cag ctg aag ttc tgg tta ccc ata gga tgt gca 609 Ser Gin Leu Cys Cys Gin Lieu Lys Phe Trp Leu Pro Ile Giy Cys Ala 135 140 145
gcc ttt gtt gta gtc tgc att ttg gga tgc eta ctt att tgt tgg ctt 657 Ala Phe Val Val Val Cys Ile Leu Sly Cys Ile Leu Ile Cys Trp Leu 150 155 160
aca aaa aag aag tat tca tcc agt gtg cac gac cct aac ggt gaa tac 705 Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn Sly Glu Tyr 165 170 175 180,
atg ttc atg aga gca gtg aac aca gcc aaa aaa tct age ctc ace gat 753 met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg Leu Thr Asp 185 190 195
gtg acc cta taatatggaa ctct gcacc caggcatgaa gcacgttggc 802 Val Thr Leu cagttttcct caacttgaag tgcaagattc tcttatttcc gggaccaCgg agagtctgac 862 ttaactacat acatcttctg ctggtgtttt gttcaatctg gaagaatgac tgtatcagtc 922 aatggggatt ttaacagact gccttggtac tgccgagtcc tctcaaaaca aacaccctct 982 tgcaaccagc tttggagaaa gcccagctcc tgbgtgctca ctgggagtgg aatccctgtc 1042 tccacatctg ctcctagcag tgcatcagcc agtaaaacaa acacatttac aagaaaaatg 1102 ttttaaagat gccaggggta ctgaatctgc aaagcaaatg agcagccaag gaccagcatc 1162 tgtccgcatt tcactatcat actacctctt ctttctgtag ggatqagaat tcctctttta 1222 atcagtcaag ggagatgctt caaagctgga gctattttat ttctgagatg ttgatgtgaa 1282 ctgtacatta gtacatactc agtactctcc ttcaattgct gaaccccagt tgaccatttt 1342 aCCaagactt tagatgcttt cttgtgcc 1370
lt;210gt;22
lt;211gt; 199
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; ser humano
lt;400gt; 22
Lys Ser Gly Leii Trp Tyr Phe Phe Leu Phe Cys Leu Arg lie Lys 5 10 15
Val Leu Thr Gly Glu lie Aen Gly Ser Ala Asn Tyr Glu Met Phe Ile 20 25 30
Phe His Asn Giy Gly Val Gin Ile lieu Cys Lys Tyr Pro Asp Ile Val 35 40 45
Gin Gin Phe Lys Met Gin Leu Leu Lys Gly Gly Gin Ile Leu Cys Asp 50 55 60
L u Thr Lys Thr Lys Gly Ser Gly Asn Thr Val Ser Ile Lys Ser Leu 65 70 75 80
Lys Phe Cys His Ser Gin Leu Ser Asn Asn Ser Val Sex Phe Phe Leu 85 90 95
Tyr Asn Leu Asp His Ser His Ala Asn Tyr Tyr Phe Cys Asn Leu Ser 100 105 110
Ile Phe Asp Pro Pro Pro Pihe Lys Val Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Leu 115 120 125
His Ile Tyr Glu Ser Gin Leu Cys Cys Gin Leu Lys Phe Trp Leu Pro 130 135 140
Ile Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val Cys Ile Leu Gly Cys Ile Leu 145 150 155 160
Ile Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro 165 170 175
Asn Gly Glu Tyr Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser 180 185 190
Arg Leu Thr Asp Val Thr Leu 195
lt;210gt;23
lt;211gt; 199 5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; ser humano
lt;400gt; 23
Met Lys Ser Gly Leu Trp Tyr Phe Pie Leu Phe Cys Leu Arg Ile Lys 5 10 15 Val Leu Thr Gly G u Ile Asn Gly Ser Ala Asn Tyr Glu Met Phe Ile 20 25 30 Phe His Asn G].y Gly Val Gin Ile Leu Cys Lys Tyr Pro Asp Ile Val 35 40 45 Gin Gin Phe Lys Met Gin Leu Leu Lys Gly Gly Gin Ile Leu Cys Asp 50 55 60
Leu Thr Lys Thr Lys Gly Ser Gly Asn Thr Val Sex Ile Lys Ser Leu 65 70 75 80 Lys phe Cys His Ser Gin Leu Sex Asn Asn Ser Val Ser Phe Phe Leu
85 90 95 Tyr Asn Leu Asp His Ser His Asn Tyr Tyr Phe Cys Asn Leu ser 100 105 110 Ile Phe Asp Pro Pro, Pro Phe Lys Val Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Lau 115
120 125
His lie Tyr Giu Ser Gin Leu Cys Cys Gin Leu Lys Phe Trp Leu Pro 30 135 140
Ile Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val Cys Ile Leu Gly Cys Ile Leu 145 150 155 160
Ile Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro 165 170 175
Asn Gly Giu Tyr Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser 180 185 190
Arg L u,Thr Asp Val Thr Leu 195
lt;210gt;24 lt;211gt;200 5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; rat
lt;400gt; 24
Met Lys Pro Tyr Phe Cys Arg Val Phe Val Phe Cys Phe Leu lie Arg 1 5 10 15
Leu Leu Thr Gly Glu Ile Aan Gly Ser Ala Asp His Mg Met Phe Ser 20 25 30
Phe His Asn Gly Gly Val Gin Ile Ser Cys Lys Tyr Pro Giu Thr Val 35 40 45
Gin Gin Leu Lys Met Arg Lieu Phe Arg Giu Arg Giu Val Leu Cys Glu 50 55 60
Lou Thr Lys Thr Lys Gly Ser Gly Mn Ala Val Ser Ile Lys Asn Pro 65 70 75 SO
Met Leu Cys Leu Tyr His Leu Ser Asn Asn Ser Val Ser Phe Phe Leu 85 90 95
Mn Mn Pro Asp Set Ser Gin Gly Ser. Tyr Tyr Phe Cys Set Leu Ser 100 105 110
Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Gin Glu Arg Mn Leu Ser GIy Gly Tyr 115 120 125
Leu His Ile Tyr Giu Set Gin Leu Cys Cys Gin Leu Lys Leu Trp Leu 130 135 140
Pro Val Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val Leu Leu Phe Gly Cys Ile 145 150 155 160
Leu Ile Ile Trp Phe Set Lys Lys Lys Tyr Gly Ser Ser Val His Asp 165 170 175
Pro Mn Ser Giu Tyr Met Phe Met Ala Ala Val Mn Thr Mn Lys Lys 180 185 190
Ser Arg Lou Ala Gly Val Thr $ r 195 200
lt;210gt;25
lt;211gt; 24
lt;212gt; ADN 5 lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220>
lt;223gt; Descripci6n de secuencia artificial: OligonucleOtido sintetico
lt;400gt; 25 accatgcggc tgggcagtcc tgga
10 lt;210gt;26
lt;211gt; 23
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220>
lt;223gt; DescripciOn de secuencia artificial: Oligonucledtido sintetico
lt;400gt; 26
tggtgacc a ccacatccca cag
lt;210gt;27 lt;211gt;23
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220>
lt;223gt; Descripcion de secuencia artificial: Oligonucleotido sintetico
lt;400gt; 27 tccgatgtca tttcctgtct ggc
lt;210gt;28
lt;211gt; 24
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220>
lt;223gt; DescripciOn de secuencia artificial: OligonucleCtido sintetico
lt;400gt; 28
gctctgtctc cggactcaca gccc
lt;210gt; 29
lt;211gt; 28
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220>
lt;223gt; Descripcion de secuencia artificial: Oligonucleotido sintetico
lt;400gt; 29
gtggcagcaa acttcagcgt gcccgtcg
lt;210gt;30
lt;211gt; 28
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220>
lt;223gt; Descripcion de secuencia artificial: Oligonucledtido sintetico
lt;400gt; 30 cccaacgtgt actggatcaa taagacgg
lt;210gt;31 lt;211gt;28
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220>
lt;223gt; DescripciOn de secuencia artificial: OligonucleOtido sintetico
lt;400gt; 31 gcgtgctqag gatcgccgg acccccag
lt;210gt;32 lt;211gt;21
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220>
lt;223gt; Descripcion de secuencia artificial: OligonucleOtido sintetico
lt;400gt; 32 gcctc agaa agagctgqga c
lt;210gt;33
lt;211gt; 21
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220>
lt;223gt; Descripci6n de secuencia artificial: OligonucleOtido sintetico
lt;400gt; 33
cgccgtgttc cattta gag c
lt;210gt; 34 lt;211gt;18
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220>
lt;223gt; Descripcion de secuencia artificial: OligonucleOtido sintetico
lt;400gt; 34 gcatatttat çiaatccca
lt;210gt;35
lt;211gt;18
lt;212gt; ADN
73
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220>
lt;223gt; Descripci6n de secuencia artificial: Oligonucleotido sintetico
lt;400gt; 35 actattaggq tcatqcac

Claims (37)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Molecula de acid° nucleic° aislada que comprende una secuencia de nucleotidos seleccionada de: a) la secuencia de nucleotidos expuesta en la figura 12A (SEQ ID NO: 16); b) la secuencia de nucle6tidos que codifica para el polipeptido expuesto en la figura 12A (SEQ ID NO: 17)
    delos residuos 1-302, o de los residuos 19-302, 20-302, 21-302, 22-302, 24-302 6 28-302; o c) una secuencia de nucleOtidos complementaria a cualquiera de (a) o (b).
  2. 2.
    Molecula de acid° nucleico segOn la reivindicaciOn 1, en la que la secuencia de nucle6tidos esta operativamente unida a una secuencia de control de la expresiOn.
  3. 3.
    Celula huesped que comprende la molecula de acid° nucleico segim la reivindicaciOn 2.
  4. 4.
    Celula huesped segOn la reivindicacion 3, que es una celula eucariota.
  5. 5.
    Celula huesped sew:in la reivindicacion 3, que es una celula procariota.
  6. 6.
    Procedimiento para producir un polipeptido codificado por el acid° nucleico segim la reivindicacion 1 6 2 que comprende hacer crecer un cultivo de la celula huesped segun la reivindicacion 3 en un medio de cultivo adecuado y aislar el polipeptido del cultivo.
  7. 7.
    Polipeptido producido mediante el procedimiento sew:in la reivindicacion 6.
  8. 8.
    Polipeptido codificado por la molecula de acid° nucleico segun la reivindicacion 1.
  9. 9.
    Polipeptido aislado que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada de: a) la secuencia de aminoacidos expuesta en la figura 3A (SEQ ID NO: 12) o la figura 12A (SEQ ID NO: 17);
    b)la secuencia de aminoacidos madura expuesta en la figura 3A (SEQ ID NO: 12) que comprende un extremo amino-terminal maduro en cualquiera de los residuos 19, 20, 21, 22, 24 O 28, o la figura 12A (SEQ ID NO: 17) quo comprende un extremo amino-terminal maduro en cualquiera de los residuos 19, 20, 21, 22, 24 6 28.
  10. 10.
    Anticuerpo o fragmento del mismo, quo se une al polipeptido segOn la reivindicacion 7.
  11. 11.
    Anticuerpo o fragmento del mismo, quo se une al polipeptido segiin la reivindicacion 8.
  12. 12.
    Anticuerpo o fragmento del mismo, que se une al polipeptido segiin la reivindicacion 9.
  13. 13.
    Anticuerpo o fragmento del mismo sew:in la reivindicacion 10, 11 6 12, quo es un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo.
  14. 14.
    Anticuerpo o fragmento del mismo segLin la reivindicacion 10, 11 6 12, que es un anticuerpo humano o fragmentodel mismo.
  15. 15.
    Anticuerpo o fragmento del mismo segun la reivindicacion 10, 11 6 12, que es un anticuerpo humanizado o injertado con CDR o un fragmento del mismo.
  16. 16.
    Anticuerpo o fragmento del mismo segOn la reivindicaciOn 10, que inhibe la union del polipeptido segiin la reivindicacion 7, 8 6 9 al polipeptido maduro expuesto en la figura 13A.
  17. 17.
    Composici6n que comprende el polipeptido segOn la reivindicacion 7, 8 6 9 y un portador, adyuvante, solubilizante, estabilizador o antioxidante farmaceuticamente aceptable.
  18. 18.
    Polipeptido sew:in la reivindicaciOn 7, 8 6 9, quo se ha modificado quimicamente.
  19. 19.
    Polipeptido segijn la reivindicaciOn 18, quo se ha modificado quimicamente mediante la adicion de uno o mas polimeros solubles en agua.
  20. 20.
    Polipeptido de fusion que comprende el polipeptido segim la reivindicacion 7, 8 6 9 fusionado a una secuencia de aminoacidos heterologa.
  21. 21.
    Polipeptido de fusi6n segiin la reivindicacion 20, en el quo la secuencia de aminoacidos heterologa es un dominio constante de IgG o fragmento del mismo.
  22. 22.
    Uso de un polipeptido segOn la reivindicacion 7, 8 6 9 para la preparaci6n de un medicamento para tratar,
    prevenir o mejorar un trastorno mediado por celulas T.
  23. 23.
    Metodo de diagnostico de un trastorno mediado por celulas T o una susceptibilidad a un trastorno mediado por celulas T en un animal que comprende:
    a) determinar la presencia o cantidad de expresiOn del polipeptido segOn la reivindicaciOn 7, 8 6 9; y
    b)diagnosticar un trastorno mediado por celulas T o una susceptibilidad a un trastorno mediado por celulas T basandose en la presencia o cantidad de expresiOn del polipeptido.
  24. 24.
    Metodo de identificacion de una molecula de prueba que se une al polipeptido segiin la reivindicacion 7, 8 6 9 que comprende:
    a) poner en contacto el polipeptido sew:in la reivindicacion 7, 8 6 9 con una molecula de prueba; y b)determinar el grado de union del polipeptido a la molecula de prueba.
  25. 25.
    Metodo segin la reivindicaciOn 24, que comprende ademas determinar la actividad del polipeptido cuando este unido a la molecula de prueba.
  26. 26.
    Uso de una molecula de acid° nucleico segun la reivindicacion 1 6 2 para la preparaci6n de un medicamento para regular la activacion o proliferaciOn de celulas T en un animal.
  27. 27.
    Mamifero no humano transgenico que comprende la molecula de acido nucleico segOn la reivindicacion 2.
  28. 28.
    Uso de un antagonista para la preparaci6n de un medicamento para suprimir una respuesta inmunitaria en un animal, en el que el antagonista es un anticuerpo o fragmento del mismo que se une al polipeptido segOn la reivindicaciOn 7, 8 6 9.
  29. 29.
    Polipeptido segiin la reivindicacion 7, 8 6 9 para tratar, prevenir o mejorar un trastorno mediado por celulas
    T.
  30. 30.
    Molecula de acido nucleico segOn la reivindicacion 1 6 2 para su uso en la regulaciOn de la activacion o proliferacion de celulas T en un animal.
  31. 31.
    Antagonista para suprimir una respuesta inmunitaria en un animal, en el que el antagonista es un anticuerpo o fragmento del mismo que se une al polipeptido segun la reivindicacion 7, 8 6 9.
  32. 32.
    Usoseglin la reivindicacion 28 para el tratamiento de trastornos autoinmunitarios.
  33. 33.
    Antagonista segim la reivindicacion 31 para su uso en el tratamiento de trastornos autoinmunitarios.
  34. 34.
    Usosegiin la reivindicaciOn 32 o antagonista segOn la reivindicaciOn 33, en el que el trastorno autoinmunitario es uno cualquiera de artritis reumatoide, psoriasis, esclerosis mUltiple, diabetes y lupus eritematoso sisternico.
  35. 35.
    Uso de un antagonista para la preparacion de un medicamento para tratar una enfermedad inflamatoria cr6nica, en el que el antagonista es un anticuerpo o fragmento del mismo que se une al polipeptido segun la reivindicacion 7, 8 6 9.
    FIGURA 'IA
    AAG CCG TAC TTC TGC COT OTC 77T GTC C
    CTAATC
    45
    XPYFCRV= 7
    ,L1
    5
    LO
    15
    AGA CT? T?A ACA GGA GM ATC MT GOC TCG GCC GAT CAT AGG ATG
    90
    R I, I GE
    INGSADHRM
    20 25 30
    TTTTCA TTT CAC AAT CGA GOT OTA CAG AT? TCT TGT ANA T
    CCT 135
    FSFHNGGVOISCKYP 35
    40 45
    GAG ACT GTC CAG CAG TTA AAA ATG CGA TTG
    GAGA GM 180 ETVQQ:LKMRI,
    F R Z R E 50
    55 60
    GTC CtC TGC GM CTC ACC MG ACC MG GOA AGC GGA AM CCC GTG
    225 V r CELTKTKG NA V 65 70 75
    TCC ATC MG MT CCA ATG CTC TGT CTA TAT CAT G. TCA MG .c
    270 S 1 K N
    PNLCLYN S N N
    80 85 ,90
    AGC GTC T TTC CTA MC MC CCA GAC AGC TCC CAG OGA ACC
    315, S VSFF IoNNPDSSQGS 95 100 105
    TAT ?AC TTC TOC AGC CTG TCC AT? TTT GAC CCA CC? CC? TTT CAA 360 YYPCSLSIFOPPFFQ 110 115 120
    C ACT GCA CGA TAT TTG CAT AT? TAT CAG 40$ S C C V H 1 V S S Q. 125 130 135
    CTC TGC TGC CAG CTG MG CTA CCC GTA GOO TG? CCA OCT 450 LCCQLK P II QC & 140 145 150
    TTC CT? GTG GTA TA CT? ATC ATC TOG TTT 495 W F 60 165
    AAA AC AM T AGTG CAT GAC CC? AA? CAA 540 K K K ' C S S V H 0 PN C 170 175 180
    TCT AGA CTT 585
    TAC MG TTC MG GCG GCA GTC MC ACA MC AAA MG FKAAVNTNKKSRL
    Y M 185
    190 195
    600
    GCA GGT GTG ACC TCA AGVTS 200
    FIGURA 2A
    .TG CAG CTA AAG TO? CCC TOT TT? GTG TCC -TG =A
    ACC AGO CAG
    45 MQLKCPCF'VSLGTRQ 5
    10
    1$
    CC? OTT TOO AAG MG CTC CAT OTT TCT AGC GGG TTC
    TOT GOT 90 PvWXKLNySsGir_
    A-0 20 25
    30
    CT? GGT CTG TTC TTO CTO
    AGO GCC1= 135
    10 GI. P t.t
    ss T, C
    AAS 35 40 45
    GCA GAG ACT GM OTC ATO 0 GGC AGO MT GTO GTG CTC 180 AETEV MVOS N V V L
    SO 55 60
    AGO TGC AT? GAO CCC CAC AGA CGC CAT TTC MC CTG 225 S CIDPHAREFN
    L 65 70 -75
    TAT GTC TAT TOG CAA ATC GM MC CCA GAA OTT 'MG GTG ACT TAO 270
    YVYWQIE N PEVSVTY SO 85 90
    TAO CCT TAC MG TOT CCA 000 ATO AAT GTG GAO AG? TOO TAO 315 Y t FYKSP G I NVDS V 95 100 105
    MG MC AGO 00C CAT CTG TOO CTO GAO TOO ATO MG CAG MC 360 K N A GHLSLOSNKQ 110 115 120
    TTC DC? CTG TAO CTO AAO AT OTC ACC COD CAG GAT ACC CAG GAG 405 F S L Y L K N VTPQDTQE 125 130 135
    TTC ACA TOO COG GTA ITT ATO MT ACA GCC ACA GAO TTA OTC MG 450 FTCAVFMNTATELVK
    140 145 150
    TTO GM GAO OTC GTC AGO CTG COT GTG 00k GCA MC TTC AG? 495 LEEVVEL'AV A A N r S 155 160 165
    ACA CC? GTC ATC AGO ACC TOT GAT AGO TCC MC CCO GM 540
    • TPVISTSDSSNP 170 175 180
    CC? ACC TAO ACC TOO ATG TCC MG AAT 00C TAO CCh GAG CCC MC 585 ATYTCNSKNOYPEPN
    ,190 195
    185
    CTO TAT TOG ATC MC ACA ACt GAO MT AGO CTA ATA GAO ACG GOT YWINTTONSLIOTA
    L 200
    205 210
    MC ACT OTC TAO TTG MC MG ?TO GGC CTO TA GAT 675
    CTO CAG AAT ONNTVYLNKLO 4170
    L 215
    220 225
    GTA ATC AGO ACA TTA AGO CTC CC? TOG ACA TO? COD COG GAT OTT 720
    ISTLRLPWISRO'D V
    ✓
    235 240
    230
    FIGURA 2A (Continuacion)
    CC TGC TGC GTA GAG MT GTG GC? CTC CAC CAG AAC ATC ACT AGC
    7
    LCCV E
    NVA'LHQNITS 245 250
    255
    AT?AGCCAG GCAGAA ACT TTCACT GGAAATMCACAMGMCCCA alo I SQA .S S FTGNNTKN P 260 265
    270
    CAGGA? ACCCACMTMTGAGTTAAAAGTCCTTGTCCCCGTC CDT QETHNN ELKVLVPY4 275 280 285
    GCT GTA CTG CCC GCA GCG GCA TCC TTC ATC ATA TAC ACA 900 AAPVSF Ijyg
    A 290 295 300
    CGC ACG CGTCCCCACCGAAGCTATACAGGACCCMGACTGTACAG 945 RTRPHRSYTGPKTV .Q 305
    310 315
    966
    CTT GAA ACA GAC CAC GCC
    L £ TDH
    A 320 322
    FIGU
    ATG COG CTG GGC AGT CCT OGA CTG CC
    CTG CTC
    45
    MRLGSP 5
    15
    CT CA OCT CAT ACT CAG GAG MG GA?. GTC AG?. GCG ATO GTA GGC 90
    L_ R A *0 'T *0 •E
    X E v R A *M V 0 25
    30
    AOC GAC GTO OAG CTC AGO TQC OCT TOO CC? GM. GO?. TTT 135 S
    OVELSCACPtG 35 40 45
    OAT TTA AAT GAT GTT TAO CT?. TAT TOG CAA ACC AG?
    TOG AM 180
    O
    LNDVYVYWOTS S K SO SS 60
    ACC GTO GTO ACC TAC CAC ATC CCA CAG MC AGO TOO MC TVVTICHIPQNSS 65 70
    GTO GAO CCC TAO COG MC CC?. GCC CTG ATG TO?. COG GCC GGC 270 ✓ 0 A Y R N R A L M S P A 0 SO 85 90
    ATG CTG CGG GGC GAO TTG TTC MC GTC ACC CCC 315 II L R 0 0 LFNVTP 95 100 105
    MG TTT CAC TOO CTG GTO CTG 360 K FHCLV 110 115 120
    CAG GAG GTT AGO 071 GAG CDT ACA AT GTO OCA 405 Q E V S V E VT H V A 125 130 135
    GTO CCC GTC OTC AGO OCC CCC CAC AGO CCC TCC 450 ✓ P V VS A P KS P S 140
    145 150
    TOO MC GGC TAO CCC 495 TFTC I SINGYP
    CAG GAT ACC TTC AGO TOT AT?.
    Q
    160 165
    155
    GTG TAO TOG ATC MT AAG ACG GAO Ake AGO CTG CTG $40 VININKTEINSLL 170
    175 180
    CAC CAG GC? CTG CAG MT GAO ACC GTC TTC TTG MC ADO COG GOC 585 GOAL() ND TVFLUM 0 115 190 195
    TTG TAT CAC GTO GTC AGO GTO CTO AGO ATC GCA, COO ACC CCC AGO 630 YDVVSVLRIARTPS
    L
    201 210
    200
    MC ATT GOC TOC TGC AT?. GAG AAC GTO CDT CTG CAG MC 675 NIGCCIENVLL ON
    GTG
    ✓
    225
    220
    21$
    GAO 720
    MT CAC ATC GO?. G TVGSOTONOIGE R 0
    CTG ACT GTC GGC AOC CAG ACA GO
    L
    240
  36. 215.
    210
    FIGURA 3A (Continuacion)
    AAG ATC ACA GAG AAT CCA GTC AGT ACC GGC GAG AAA AAC GCG GCC
    765 TENPVSTGEKNAA 245 250 255
    ACG TG C ACC ATC CTG GCT GTC CTG TGC CTG CT? GTG GTC GTG GCG
    910 TWSTr.AVLC_LLVVVA 260 265 270
    GTG GCC ATA GGC TGG GTG TGC AGG GAC CGA TGC CTC CAA CAC AGC 855 VAIGWVCRORCLQRS 275 280 2e5
    TAT GCA GGT Y A G 288
    Figura 4A
    lisado medio celular condicionado
    10 20 12,5 5 10 20/ 1jjanadidos
    97 66
    ,04 N
    •
    Figura 4B
    lisado celular con B7RP1-Fc Vector solo
    rnedio control medic con B7RP1-Fc
    •
    -97 kD 66 kD 46k0 30 kD
    Figura 5
    Proteinas de fusion de Fe
    Control de Fc
    B7RP1 CRP1 B7.2 MA-4
    Origmales
    00
    B7RP1 Ululas
    CRP1
    hCD28
    Figura 6
    100
    io Simulado-Fc
    1RP1-Fc JW1104$4.002
    Sin tincion Sin tinciOn 011
    0
    in 1 0
    • Gable-of=
    37RPI-Fc
    Figura 8
    JG011499,004
    A
    0 0 200 430
    60 40 1000 MGM
    0
    Figura 9
    Estimulacion con Con A de celulas T reguladas por proteina de fusion B/RP1-Fc
    50000
    EjSin adiciones
    45000 40000
    CRP1-Fc 35000
    STRP1-Fc
    '4=
    30000 B7.2-Fc
    25000 20000 15000 10000
    5000 0 Sin adiciones 0,33
    1 3 10
    Con A ( rni)
    Figura 10
    Gangtio linfatico-control n.° 10 GI.-X11 n.° 40 .
    •
    piano d GL-control n.°
    •
    so. *
  37. 47.0
    iteo-control n.° 25 fleo-WX11 n.° 32
    ' •
    Figmr812A.
    GcTGOTACGCCTGCAGOTACCOOTCCGGAA GGGICGACCC
    -138 TCCOCGGOAGCGCAGTTAGAGCCGATCTCCCGOGCCCCGAGGTTGCTC -76 CCGCGGCCCAAOTTCTCCGCGCCCCGAGGTCTCCGCGCCCCGAGGTCTCCGCGGCCC -14 CTCCOCCCOCACC
    -1
    ATG COG CTO 0Gc AG? CC'? GGA CTO CTC TTC CTO CTC TTC AGC ACC 45
    IIRLOSPGLI,FtLp5L_q 5
    10 15
    ACT GAG MG OAk OTC AGA GCG ATG GTA GGC 90 *T * E X V R A • M 20 25
    30
    AOC CAC OTG CAC CTC AGC TGC OCT TOO CC? GM GGA AGC COT TT'? 135 SEIVEL S CACP E 0 S S F 35 40 45
    GAT TTA MT T OTT 'MC GTA TAT TOG CAA ACC ACT GAG TCG AAA 180
    L. N DV YVYWQTS E Sic 50 SS 60
    ACC OTC GTO ACC 'MC CAC MC CCA GAG MC AOC TCC TTG GM MC 225 T VVTYR/PQMSS 65 70 75
    GTG GAG AGC CGC TIC COG MC CGA GCC CT G ATO TCA CCG GCC GOC 270 ✓ OSRYR N RALMSPAG 80 85 90
    ATG CTG COG GAG TTC TCC CTG CCC TTG TTC MC GTC ACC CCC N L R DFSLRLP N V T P 95 100 105
    CAG AAG TTT CAC TOC CTG GTG TTG AOC CM TC CTG 360 Q KPMCLVL 110 115 120
    GOA TTC GAG GAG CT? TTG AGC OTT GAG OTT ACA CVO CAT GTO GCA 405 G FQSVLSVEVTLHVA 125 130 135
    GTG CCC GTC GTC AGC GCC CCC CAC: AGC CCC TCC 450
    VPVVSAPHSPS
    $
    140 145 150
    CAO GAT ACC TTC AGO TOT ACA TCC Ath MC CCC TAG CCC 495
    TFTCTSI N C V P 155 160 165
    OP
    AGO CCC MC GTG The TOG ATC MT MG AGO GAG MC AOC CTO 540 RPNVYWINKTDN S Id L 270 175 180
    GAG GAG OCT CTG CAG IA'? GAG ACC OTC ITC' TTO MC AIG COG GGC 585
    01QALQMOTVPId N M R G
    190 198
    185
    GTG OTC AGC GTO CTO AGO MC GCA C00 ACC eCC AGC 630
    TTG TAT VVSVLRIARTPS
    It 200
    205 210
    A TGCTGC ATh GAG MC OTC CTT CTG CAO CAO MC C
    C I E NV LLOQN
    215 220 225
    CTG ACT GTC GGC AGC CAG ACA GGA AAT GAC ATC GGA GAG AGA GAC
    720 LTVGEQTG N D I C. E R D 230 235 240
    AAG ADC ACA GAG AAT CCA GTC ACT ACC GGC GAG AAA AAC GCG GCC 765 K ITENPV8*TGEKNAA 245 250 255
    ACG TGG AGC ATC CTG CC? GTC C 'FCC CTG C GPO GTC GTO GCC 810 TWSILAVLCLLVVVA 260 265 270
    GPO GCC ATA GGC TGG GPO 'FCC AGG GAC CGA TGC CTC CAA CAC AGC 855 ✓ A1GWVCRDRCLQHS 275 280 285
    TAT GCA GOP GCC TOG CC? GPO ACT CCG GAG ACA GAO CTC ACT GGC 900 Y A G A W A V S P ET E L PG 300
    909 H V TERMINACION 302
    CAC CT? TGA
    CCGGAGCTCACCGCCCAGAGCGTOGACA CCGTGAGACGCCACCGTGAGAGGCCAGG 971 TGGCAGCTTGAGCATGGACTCCCAGACTGCAOGGGAGCACTTGOGGCAGCCCCCAGAAGGAC 1033 CACTGCTGGATCCCAGGGAGAACCTGCTGGCGVTGGCTGTGATCCTGGAATGAGGCCCTTTC 1095
    Figura 12B.
    set human° rat6n Consenso
    set humano rat6n Consenso
    set human° raton Consenso
    set humano ['Won Consenso
    set human° ratOn Consenso
    ser humano ratan Consenso
    set humano ratem Consenso
    MRLGSP Z -LF-t2.FSS LRADTQEKEV 25 MQLKCPCFVS LGTRQPVWKK LHVSSOFFS0 LGLFL SS LCAASAETEV
    50
    M.L.. P.... OOOOO•.•• . ... .. ...GL.LF.LL.SSL.A...E.EV 50
    RAMVOSDVEL SCACPEOSRF OLNDVYVYWQ TSESKTVVTY HIPQNSSLEN 75
    GAMVGSNVVL SCIDPHRAHF NLSGLYVYWQ /ENPEVSVTY YLPYKSPGIN 100 .AMVOS.V.L .L.. .YVYWQ VTY . .P.. S...N 100
    VDSRYRNRAL MSPAGMLRGO FSLRLFNVTP ODEQKFMCLV LSQ-SLGFOE 124 VDSSYKNRGH LSLDSMKQGN FSLYLKNVTP QDTQEFTCRV FMNTATELVX 150 VDS.Y.NR. . .S. ..M..G.FSL.L.NVTPQD.Q.F.C.V .... 150
    VLSVEVTLHV AANFSVPVVS APHSPSQ-DE LTFTCTSING YPRPNVYWIN 173
    ILEEVVRIAV AANFSTPVIS TSDSSNPGQE RTYTCMSKNO YPEPNLYWIN 200
    .L. . .V.L.VAANFS.PV.S . . .S. . . . .E .T.TC.S.NGYP•PN.YWIN 200
    KTDNSLLDQA LONDTVFLNM RGLYDVVSVL RIARTPSVNI GCCIENVLLQ 223 TTDNSLIDTA LQNNTVYLNK LGLYDVISTL RLPWTSRODV LCCVENVALH 250 .TDNSL.D.ALQN.TV.LN. .GLYDV.S.LR. . .T. . . . . .CC.ENV.L. 250
    ONLTVGSQTG ND/GERDKIT ENPVSTGEKN AATWSILAVL'CLLVVVAVAI 273 ONITSISQAE SFTGNNTKNP QETHNNELKV LV--PVLAVL AAAAFVSFII 298 QN.T..SQ.. ...G... K.. ... ..... K. 300
    GWVCRDRCLQ HSYAGAWAVS PETELTGHV 302 YR--RTR-PH RSYTOPKTVQ LE--LTDHA 322
    . . . .A.R. . . .SY.G. . . V. .E. .LT.H.
    329
    Figur
    AACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACOCCAAGCTCTAATACGA CTCACTATAGGGAAAGCTGGTACGCCTGCAGOTACCGGTCCGGAATTCCCGGGTC GACCCACQCGTCCOTGAACACTGAACGCGAGGACTOTTAACTGTTTCTGGCAAAC
    ATG
    MG TCA GGC CTC TGG TAT TTC TTT CTC TTC TGC TTG CQC ATT 45 MKSGLWY P
    FLPCt, R,
    10 IS
    AAA GTT TTA ACA GGA
    AIC MT GGT IC? C MT TAT GAG ATG 90
    $ V I% T *G • G S NYES 20
    25
    30
    TTT ATA TTT CAC
    MC GGA GOT GTA CM AT? TTA TGC AAA. TAT CCT 135 FIFHNGGVOILCXYP 35 40 45
    GTC CAS CAA TIT AAA ATG CAG ?TG CTG AAA GGG CAA 180 VQQFX N QLLKG 50
    55 -60
    ATA CTC ICC GAT CTC ACT MG ACA AAA GGA AG?
    ACA GTG 225 CDLTKTKGS T V 65 70
    75
    TCC AT? MG AG? CTG AAA TTC TGC CAT TCT CAC TCC MC MC 270 S IKSLKFCHSO S N N 80 OS 90
    G IC? TT? CTA, TAC MC GAG CAT TCT CAT GCC MC 315 ✓ $ FLYNLDHSHAN 91 100 105
    TAT TAC TTC TGC MC CTA TCA AT? TTT GAT CC? CC? CC? ?TT AAA 360 YYFCN L S IFDPIpppx 110 115 120
    GTA ACT CT? ACA OGA GGA TAT TTG CAT Al!? TAT GM TCA CAA CT? 405 ✓ TLTGGYLHIY S Q L 125 130 135
    TGT TGC CAG CTG MG CC ATA GOA. T T 450 CCOLK 140 14
    GTT GTA GTC TGC AT? TTG ATA CT? AT? TG? ACA 495 9 vv. c TL I L C 155 160 165
    AAA MG MG TAT ICA TCC AG? GTG CAC GAG CC? MC GGT GM. TAG 540
    KKYSSSVHDPNGEY . 170 175 190
    K
    C MG AGA GCA GTG MC ACA GCC AAA AAA TO! AGA CTC ACA 585 NHAVNTAKKSRLT
    185 190 195
    600
    GAT GTG ACC CTA MA
    D V T Li TERMINACION 199
    TATGGAACTCTGGCACCCAGOCATGAAGCACG TCTCAACTTGA 655 AGTGCAAGATTCTCTTATTTCCOGGACCACGGAGAGTCTGAC AACTACATACA 710
    TCTTCTGCTGGTGITTTGTTCAATCTGGAAGAATGACTGTATCAGTCAAIGGGGA 765 TTTTRACAGACTGCCTTGGTACTGCCGAGTCCTCTCAAAACAAACACCCTCTTGC 820 AACCAGC1quot;TTGGAGAAAGCCCAGCTCCTGTGTGCTCACTGGGAGTGGAATCCCTG 875 TCTCCACATCTGCTCCTAGCAGTGCATCAGCCAGTAMACAAACACATTTACAAG 930 AAAAATGTTITAAAGATGCCAGGGGTACTGAATCTGCAAAGCAAATGAGCAGCCA 985
    AGGACCAGCATCTGTCCGCATTTCACTATCATACTACCTCTTCrITCTGTAGGGA 1040 TGAGAA,TTCCTCTTTTAATCAGTCAAGGGAGATGCTTCAAAGCTGGACCTATTTT 1095 ATTTCTGAGATGTTGATOTGAACTOTACATTAGTACATACTCAGTACTCTCCTTC 1150 AATTGCTGAACCCCAGTTGACCATTTTACCAAGACTITAGATGCTTTCTTGTGCC 1205
    Figura 138
    hCRP1 MRSOLWYFFLPCLRIKIILTGEINGSANYEmFUHNOGVOILCKYPDIVW SO ii 1.11 1:.111111111.: 11 11111111 1111: III mCRP1 MKPYPCRVFVFCFL/RWITGEINGSADHRMFSPHNGGWISCKYPETVW 50
    hCRP1 FINQUiaGQILCUTTiKOSONTVSIKSIAPCHSQ6NNSVSFFLYNLD 100 II.!: :011111111111 1111. 11 1111111111 I 1 mCRP1 LKMRLFREREVLCELTKTICGSONAVSIKNpMLCLYMLSNNVV5FFLNNPD 100
    hCRP1 RSHANYYFCNLSIFDPPiTKV.TIATGOiLHIYESQLCTAFWLPIGAA 149 1 .11111111111111. 1.1111111111111111 111:1111 mCRP1 SSOGSYYPCSLSIFDPPPFQERNIASGGYLHIYESQLCCWALWLPVGCAA 150
    hCRP1 FVVVCILGCILICW1aKKRYSSSVHDPNGEYKFKRAVNTAKRSRLTDVTL 199 1111 . 11111 1 .1111 1111111 11111 1111 11111 11 mCRP1 FVVVLiFOCILITWFSKICKYOSSVHDPNORYMFMAAVNTNKKORLAGVTO 200
    a
    en
    Expresion de CRP1
    Figura 14
    A.
    90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
    7 14182125293234373942485258
    Dias tras la inmunizaciOn
    7 14 18 21 25 29 32 34 37 39 42 48 52 58
    Dias tras la inmunizacion
    Figura 16
    Figura 20
    E ec o de B7R101-Fc sobre el crechnlento tumoral de Meth A en ratones Balb-C
    Grupo1,2 iGrupo control (n=8)
    2O00,00 1800,00 Grupo 341 87RP-1-Fe 1600,00 -(ngs8) -8 rogilcg
    1400,00 1200,00 1000,00
    800,00 600,00 400,00 200,00
    0,00 5 10 15 20 25 30
    Dias tras la implantación del tumor
    A. Ratan control n.° 53F: Colon prox, 40X B. Ratàn n.° 1 F: Colon prox. 40X
    •
    C. Raton n.* 111F: Colon prox. 20X
    D. Raton n.° 111F: primer piano de mucosa 100X
    F. Raton n.° 112F: macrafagos epltelioides
    E. Raton n.° 112F: CoJule gigante, submucosa
    Figura 17
    capa muscular d
    A. Raton control a.° 53F: Colon distal. 40X B. Raton n.° 111F: Colitis distal, 40X
    D. Raton n.° 112F: Colon distal, 40X
    C. Raton n.° 55M: Colitis distal, 40X
    Ratan n.°112: primer piano, 100X
    E. Raton n.° 112: Celulas CD3+, 40X
    Figura 18
    A. Rat6n control n.° 53F: duodeno, 40X B. Raten n.° 51F: duodeno, 40X
    ia del yeyuno, 40X
    C. Raton control n.° 63F: yeyuno, 40X
    F. RatOn n.° 231M: Atrofla del Hee, 40x
    E. Raton control n.° 53F: Ile°, 40X
    Figura 19
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