MXPA01007843A - Polipeptidos relacionados con la respuesta inmune - Google Patents

Abstract

Se describen polipéptidos novedosos los cuales comprenden un par receptor-ligando relacionado con la activación de células T. También se describen moléculas deácido nucleico que codifican para tales polipéptidos y vectores y células huésped para expresar los mismos. Los polipéptidos, o agonistas y antagonistas de los mismos, se utilizan para tratar desórdenes mediados por células T.

Description

POLIPÉPTIDOS RELACIONADOS CON LA RESPUESTA INMUNE CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con polipéptidos que están involucrados en la activación de linfocitos T. Específicamente, la invención se relaciona con polipéptidos coestimuladores de linfocitos T, los ácidos nucleicos que codifican para tales polipéptidos, los vectores de expresión y células huésped para producción de los polipéptidos, y composiciones y métodos para el tratamiento de enfermedades relacionadas con inmunosupresión y activación inmune.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Para una generación de una respuesta inmune apropiada de los linfocitos T (células T) , se deben proporcionar dos señales a las células T por las células presentadoras de antigenos (APC) . En primer lugar, se debe presentar el antígeno al receptor de célula T (TCR) por medio del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) , en un fenómeno que determina especificidad. En segundo lugar, se debe suministrar una señal coestimuladora independiente de antígeno por medio de acoplamiento de los miembros de la familia B7 en la APC con la proteina CD28 sobre células T. Una respuesta inmune productiva REF: 132177 lleva a proliferación, diferenciación, expansión clonal y efecto de función. En ausencia de la segunda señal coestimuladora, las células T experimentan un estado de carencia de respuesta específica a antígeno de larga duración, denominado anergia. Las células T inician la respuesta inmune, median las funciones efectoras específicas de antígeno y regulan la actividad de otros leucocitos por citocinas secretantes . El receptor de células T (TCR) diferencia a las células T de otros linfocitos y puede unir antígeno únicamente cuando se presenta por las APC dentro del contexto del MHC. La actividad funcional de una célula T particular se puede correlacionar con la expresión de antígenos de membrana tales como CD4 y CD8. Por ejemplo, células T CD4+ funcionan generalmente como células T auxiliares (TH) y se restringen a MHC clase II, mientras que las células CD8+ generalmente funcionan como células T citotóxicas (Tc) y están restringidas a MHC clase I. Los polipéptidos potentes coestimuladores de células T los cuales se han identificado previamente incluyen polipéptidos denominados B7.1 (Freeman et al. J. Immunology 143. 2714-2722 (1989), Freeman et al. Jour. Ex t . Med. 174, 625-31 (1991)) y B7.2 (Freeman et al. Science 262, 909-911 (1993), y Freeman et al. Jour. Expt. Med. 178, 2185-2192 (1993)), (o CD80 y CD86, respectivamente). Estos polipéptidos se pueden expresar de manera inducible o constitutiva en diversas APC y son ligandos unidos a membrana para CD28 y CTL4-4, respectivamente, sobre células T. CD28 (Aruffo and Seed Proc. Nati. Acad. Sci. 84, 8573-8577 (1987) y Gross et al. J. Immun. 144, 3201-3210 (1990)) se expresa en células T en reposo y media una señal coestimuladora positiva. La expresión de CTLA-4 (Brunet et al. Nature 328, 267-270 (1987) y Dariavach et al. Eur. Jour. Immun. 18, 1901-1905 (1988)) es inducida ante la activación de células T y regula de manera negativa la señal CD28, debido a su mayor afinidad de unión por B7-1 y B7.2. Los ratones sin el gen CTLA-4 muestran concentraciones notablemente altas de células T, puesto que está dañado el mecanismo de inactivación para la señal de proliferación en ausencia de CTLA-4. Este fenotipo demuestra claramente el efecto inhibidor principal que tiene la proteína coestimuladora CTLA-4 sobre la proliferación de células T. Los ratones que carecen de CD28 o B7.1 o B7.2 tienen un fenotipo menos grave, lo que indica que pueden existir vías alternativas para coestimulación de células T. Ha habido interés considerable en la vía CD28/CTLA-4 como un medio para regular la activación y proliferación de células T. Una proteína quimérica o recombinante que contiene la porción extracelular de CTLA-4 fusionada a Fc humano tiene fuertes efectos inmunosupresores y se ha estudiado en diversos ámbitos clínicos. Los anticuerpos para las proteínas B7.1 y B7.2 también se han evaluado para indicaciones similares en el área de inmunosupresión. Los anticuerpos contra CTLA-4 han demostrado utilidad en promover la activación de células T. Además, la terapia de genes B7.1 y B7.2 ha mostrado una gran promesa en el área de inmunoterapia del cáncer. Hasta ahora, CD28, CTLA-4, B7.1 y B7.2 están involucrados en una sola vía coestimuladora de células T. Dada la capacidad de modular una respuesta inmune al regular la coestimulación de células T, sería deseable identificar otros miembros de la misma vía o de una vía coestimuladora separada de células T la cual pueda tener propiedades ventajosas para regular la función de células T huésped y la respuesta inmune. En consecuencia, un objetivo de la invención es proporcionar polipéptidos novedosos para estimulación de actividad o proliferación de células T. Un objetivo adicional de la invención es utilizar los polipéptidos novedosos para la prevención y tratamiento de desórdenes inmunes mediados por células T.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LA INVENCIÓN Sorprendentemente, se han identificado dos polipéptidos novedosos de una vía coestimuladora de células T. Los polipéptidos representan un par ligando-receptor en una vía coestimuladora única la cual parece ser diferente de la vía que consiste de las proteínas descritas previamente. Los polipéptidos se denominan como proteína-1 relacionada con CD28 o CRP1 y proteína-1 relacionada con B7 o B7RP1. La invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican para los polipéptidos CRP1 y B7RP1, y polipéptidos relacionados. Una molécula de ácido nucleico aislada, de la invención, comprende una secuencia nucleotídica que se selecciona del grupo que consiste de: a) la secuencia nucleotídica que se establece en la figura ÍA (Secuencia de Identificación Número: 1); b) la secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido de los residuos 1-200 o de los residuos 21-200 como se establece en la figura ÍA (Secuencia de Identificación Número: 1) ; c) la secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido que es por lo menos aproximadamente 70 por ciento idéntico al polipéptido como se establece en la figura ÍA (Secuencia de Identificación Número:!); d) una variante alélica que se presenta de manera natural o una variante alternada, por corte y empalme, de cualquiera de los incisos (a) , (b) o (c) ; e) una secuencia nucleotídica complementaria con cualquiera de los incisos (a) , (b) o (c) ; f) una secuencia nucleotídica de los incisos b) , c) o d que codifica para un fragmento polipeptídico de por lo menos aproximadamente 25, 50, 75, 100 o más de 100 residuos aminoácidos; g) una secuencia nucleotídica de los incisos (a) , (b) o (c) , que comprende un fragmento de por lo menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100 o más de 100 nucleótidos; y h) una secuencia nucleotídica la cual hibridiza bajo condiciones astringentes con cualquiera de los incisos (a) a (g) . También se proporciona por la invención una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que se selecciona del grupo que consiste de: a) una secuencia nucleotídica como se establece en la figura 2A (Secuencia de Identificación Número: 6) o la figura 3A (Secuencia de Identificación Número: 11) o la figura 12A (Secuencia de Identificación Número:16); b) la secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido como se establece en la figura 2A (Secuencia de Identificación Número: 6) desde los residuos 1-322 o desde los residuos 47-322, o como se establece en la figura 3A (Secuencia de Identificación Número: 11) de los residuos 1-288 o de los residuos 19-288, 20-288, 21-288, 22-288, 24-288 o 28-288; o como se establece en la figura 12A, de los residuos 1-302 o de los residuos 19-302, 20-302, 21-302, 22-302, 24-302 o 28-302; c) una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido que es por lo menos aproximadamente 70 por ciento idéntico al polipéptido como se establece en la figura 2A (Secuencia de Identificación Número: 6) o la figura 3A (Secuencia de Identificación Número: 11) de la figura 12A (Secuencia de Identificación Número: 16) ; d) una variante alélica que se presenta de manera natural o una variante alternada, por corte y empalme, de cualquiera de los incisos (a) , (b) o (c) ; e) una secuencia nucleotídica complementaria con cualquiera de los incisos, (a) , (b) o (c) ; f) una secuencia nucleotídica de los incisos (b) , (c) o (d) que codifica para un fragmento polipeptídico de por lo menos aproximadamente 25, 50, 75, 100 o más de 100 residuos aminoácidos; g) una secuencia nucleotídica de los incisos (a) , (b) o (c) que comprende un fragmento de por lo menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100 o más de 100 nucleótidos ; y h) una secuencia nucleotídica la cual hibridiza bajo condiciones astringentes o rigurosas con cualquiera de los incisos (a) a (g) . La materia objeto de la invención también se relaciona con polipéptidos CRP1 y B7RP1, y polipéptidos relacionados. La invención proporciona un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de: a) la secuencia de aminoácidos que se establece en la figura 1A (Secuencia de Identificación Número: 2) ; b) la secuencia madura de aminoácidos que se establece en la figura 1A (Secuencia de Identificación Número : 2 ) que comprende una parte amino terminal madura en el residuo 21; c) un fragmento de la secuencia de aminoácidos que se establece en la figura ÍA (Secuencia de Identificación Número: 2) que comprende por lo menos aproximadamente 25, 50, 75, 100 o más de 100 residuos aminoácidos; d) un ortólogo de los incisos (a) , (b) o (c) ; y e) una variante alélica o variante alternativa, por corte y empalme, de los incisos (a) , (b) o (d) . Además, de acuerdo con la invención, se proporciona un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de: a) la secuencia de aminoácidos que se establece en la figura 2A (Secuencia de Identificación Número: 7) o figura 3A (Secuencia de Identificación Número :12) o la figura 12A (Secuencia de Identificación Número:17); b) la secuencia madura de aminoácidos, como se establece en la figura 2A (Secuencia de Identificación Número: 7) que comprende una parte amino terminal madura en los residuos 47 de la figura 3A (Secuencia de Identificación Número : 12 ) que comprende una parte amino terminal madura en cualquiera de los residuos 19, 20, 21, 22, 24 o 28 de la figura 12A (Secuencia de Identificación Número: 17) que comprende una parte amino terminal madura en cualquiera de los residuos 19, 20, 21, 22, 24 O 28; c) un fragmento de la secuencia de aminoácidos que se establece en la figura 2A (Secuencia de Identificación Número: 7) o la figura 3A (Secuencia de Identificación Número: 12) de la figura 12A Secuencia de Identificación Número: 17) que comprende por lo menos aproximadamente 25, 50, 75, 100 o más de 100 residuos aminoácidos; d) un ortólogo de los incisos (a) , (b) o (c) ; y e) una variante alélica o una variante alternativa, por corte y empalme, de los incisos (a) , (b) , (c) o (d) . También se abarcan por la invención los vectores de expresión y células huésped para la producción de los polipéptidos, anticuerpos los cuales se unen a los polipéptidos CRPl y B7RP1 y con polipéptidos relacionados, así como ensayos para detectar la unión de polipéptidos B7RP1 y polipéptidos relacionados con B7RP1, a polipéptidos CRP1 y polipéptidos relacionados con CRPl. Las composiciones farmacéuticas que comprenden CRP1 o polipéptidos relacionados con CRP1 y polipéptidos B7RP1 o polipéptidos relacionados con B7RP1 también están abarcados por la invención. Los métodos para identificar compuestos que interactúan con CRP1 o B7RP1 también se proporcionan pues son ensayos para determinar si tales compuestos son agonistas o antagonistas de la actividad de CRPl y de B7RP1. Los polipéptidos CRP1 y B7RP1 están involucrados en la coestimulación y proliferación de células T. Los polipéptidos CRP1 y B7RP1, agentes de unión selectivos de los mismos y agonistas y antagonistas de los mismos, pueden ser útiles para el diagnóstico, prevención y tratamiento de enfermedades relacionadas con el control de las respuestas de las células T. Los polipéptidos CRPl y B7RP1, los agentes de unión selectivos de los mismos y los agonistas y antagonistas de los mismos pueden ser útiles para el diagnóstico, prevención y tratamiento de desórdenes inmunes, ya sea por estimulación insuficiente de la respuesta inmune o reducción ,o inhibición de una respuesta inmune exagerada o inapropiada. El desorden inmune se puede mediar directa o indirectamente por células T. La invención proporciona el tratamiento, prevención o disminución de un desorden mediada por células T, que comprende administrar a un animal, un polipéptido CRP1 o B7RP1. La invención también proporciona un método de diagnosticar un desorden mediado por células T o una susceptbilidad a un desorden mediado por células T en un animal, que comprende determinar la presencia o la cantidad de expresión de un polipéptido CRP1 o B7RP1; y diagnosticar un desorden mediado por células T o la susceptibilidad a un desorden mediado por células T en base en la presencia o cantidad de expresión del polipéptido. Típicamente, un desorden mediado por células T es un desorden inmune el cual puede ser mediado, directa o indirectamente, por células T. El animal preferiblemente es un mamífero, y de manera más preferible un humano. La invención también proporciona un método para identificar una molécula de prueba la cual se une a un polipéptido CRP1 o B7RP1, que comprende poner en contacto el polipéptido con un compuesto de prueba y determinar el grado de unión del polipéptido al compuesto de prueba. El método se puede utilizar para identificar agonistas y antagonistas de los polipéptidos CRP1, B7RP1, o ambos. Los antagonistas de los polipéptidos CRP1, B7RP1 o ambos se pueden utilizar como agentes inmunosupresores para muchas indicaciones que incluyen desórdenes autoinmunes (tales como artritis reumatoide, psoriasis, esclerosis múltiple, diabetes y lupus eritematoso sistémico) , síndrome de choque tóxico, transplante de médula ósea y de órganos, enfermedad de intestino inflamatorio, alosensibilización debido a transfusiones sanguíneas y tratamiento de enfermedad de injerto versus huésped. Además, los antagonistas se pueden utilizar como agentes inhibidores para indicaciones mediadas por células B, dependientes de células T, que incluyen asma y alergia, y autoinmunidad mediada por anticuerpos. Los agonistas de los polipéptidos CRP1, B7RP1, o ambos, pueden ser útiles en, aunque sin restricción, la activación de células T para vigilancia y remoción de tumores . Un antagonista de la invención incluye un anticuerpo, o fragmento del mismo, el cual es reactivo con, o se une a B7RP1 o a un dominio extracelular de B7RP1, en donde el anticuerpo reduce o elimina la unión a B7RP1 a CRPl. En una modalidad, el anticuerpo se une selectivamente a B7RP1 humano o a un dominio extracelular del mismo. El anticuerpo o fragmento del mismo, el cual es un antagonista, inhibe, parcial o completamente la actividad coestimuladora inmune de B7RP1. En una modalidad preferida, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal y puede ser murino, humano, quimérico o humanizado. La invención proporciona además un método de regular la interacción de B7RP1 con CRP1, que comprende administrar a un animal un agente de unión selectivo de CRP1 o un agente de unión selectivo de B7RP1 o ambos. En una modalidad, el agente de unión selectivo es un anticuerpo el cual se une a B7RP1 y reduce o elimina la unión a B7RP1 a CRPl. La invención también proporciona un método para regular la coestimulación inmune mediada por B7RP1, que comprende administrar a un animal un agente de unión selectivo de B7RP1. El agente de unión selectivo preferiblemente es un anticuerpo el cual se une a B7RP1 e inhibe parcial o completamente la coestimulación inmune mediada por B7RP1. La invención también proporciona un método para regular la activación o proliferación de células T en un animal, que comprende administrar al animal una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido para CRP1 o B7RP1. Por ejemplo, se puede utilizar una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido B7RP1 en terapia de genes para mejorar la activación de células T en respuesta a diversos tumores . También se abarca por la invención un mamífero no humano transgénico que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de CRP1 o B7RP1. Los ácidos nucleicos para CRP1 o B7RP1 se introducen dentro del mamífero de una manera que permiten la expresión y concentraciones aumentadas en circulación de los polipéptidos CRP1 o B7RP1. El animal no humano transgénico preferiblemente es un roedor, y de manera más preferible un ratón o una rata.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. A) ADN y secuencia de aminoácidos de CRP1 murino (mCRPl) . La secuencia de señal predicha de CRP1 está subrayada en la parte amino terminal y el sitio de separación propéptido se determina experimentalmente y se indica por un asterisco. La secuencia transmembranal predicha está subrayada debajo de la parte carboxi terminal. B) Alineación de aminoácidos de la secuencia de proteína CRP1 (mCRPl) murina con CD28 murino (mCD28) .

Figura 2. A) ADN y secuencia de aminoácidos de B7RP1 murina (mB7RPl) . La secuencia de señal predicha de B7RP1 está subrayada en la parte amino terminal y el sitio de separación propéptido se determina experimentalmente y se indica por un asterisco. La secuencia transmembranal predicha está subrayada hacia la parte carboxi terminal . B) Alineación de aminoácidos de la secuencia de proteína B7RP1 murino con CD80 murino (mCD80) .

Figura 3. A) Estructura y secuencia de la región codificante de proteína de B7RP1 humana putativa (hB7RPl) . La secuencia de señal predicha de hB7RPl está subrayada en la parte amino terminal . Los sitios de separación de péptido señal predichos están marcados por asteriscos. La secuencia transmembranal predicha está subrayada hacia la parte carboxi terminal. B) Alineación de aminoácidos de la proteína hB7RPl madura putativa con la proteína B7RP1 murina madura (mB7RPl) .

Figura 4. A) Expresión de la proteína de fusión CRPl-Fc soluble de células 293T transfectadas con pcDNA3/CRPl-Fc. Los volúmenes normalizados de lisado celular o medio acondicionado se cargan y se separan en gel PAGE 10%, como se indica. El análisis Western del lisado celular y el sobrenadante de medio celular para expresión de proteínas de fusión Fc asociadas a célula (lisado celular) y secretado (medio) . El anticuerpo primario es un anticuerpo de chivo contra Fc humano (Pierce Chemical Company, Rockford, IL.). B) Expresión de la proteína de fusión B7RPl-Fc soluble de células 293T transfectadas con pcDNA3/B7RPl-Fc. Se cargan 20 µl de lisado de células normalizadas o medio sobrenadante y se separan en un gel PAGE 10%. El análisis Western se lleva a cabo como en el inciso (A) .

Figura 5. Interacción de las proteínas de fusión CRPl-Fc y B7RP1-Fc con proteínas unidas a membrana que se expresan en células COS-7. Las células COS-7 se transfectan transitoriamente con pcDNA3/CRPl, pcDNA3/B7RPl o vector pcDNA3 , solo. Se transfectan células D CHO con psDR /hCD28 y se expresan de manera estable en CD28 humano (hCD28)'. Las células que expresan CRP1, B7RP1 o hCD28 unido a membrana se representan en hileras como se indica en el lado izquierdo del panel . Las proteínas de fusión Fc se incuban con células unidas a placa, en columnas como se indica en la parte superior del panel . Después de la incubación, las células se lavan y se detectan las proteínas de fusión Fc unidas utilizando un anticuerpo contra Fc humano y análisis ACAS (Adherent Cell Analysis and Sorting; ACAS Ultima, Meridian Instruments, Inc., Okemos, MI) .

Figura 6. .Análisis FACS (clasificador de células activador por fluorescencia) de la expresión del receptor para B7RP1 (putativamente, CRP1) sobre células T CD4+ y CD8+ activadas . Los esplenocitos de ratón se activan con PMA y con ionomicina durante 12 horas. La proteína de fusión B7RP1-Fc, la proteína Fc de control (en falso-Fe) o PBS (sin tinción) se incuban con las células, se lavan y subsecuentemente se incuban con anticuerpo de chivo conjugado contra anticuerpo contra Fc hu ano-FlTC (GaHuFc-FITC) como se indica en la parte inferior de cada panel . Los anticuerpos marcadores de células (para marcadores de células T CD4 y CD8) conjugados con PE o anticuerpo de control de isotipo (isotipo de rata) conjugado con PE o bien PBS (sin tinción) , se agregaron como se indica en el lado izquierdo de cada panel individual .

Figura 7. Análisis FACS (clasificador de célula activado por fluorescencia) de la expresión de B7RP1 en células B. Análisis fluoroscitométrico de la expresión del ligando para CRP1 (presumiblemente, B7RP1) en esplenocitos de ratón. La proteína de fusión CRPl-Fc, la proteína Fc de control (en falso-Fe) o PBS (sin tinción) se incuban con las células, se lavan y se incuban subsecuentemente con anticuerpo de chivo contra Fc humano conjugado con FITC (GaHuFc-FITC) como se indica en la parte inferior de cada panel . Se agregaron anticuerpos marcador de células conjugado a PE a CD45R (CD45R es un marcador de células B) o anticuerpo de control de isotipo (isotipo de rata) o PBS (sin tinción) como se indica en el lado izquierdo de cada panel individual .

Figura 8. Análisis por FACS de la expresión del ligando mCRPl en macrófagos perifonéales . Las células perifonéales primero se diferencian en súbgrupos en base en sus propiedades de dispersión de luz (panel A) . Los macrófagos se identifican en la región 5 (R5) debido a su capacidad de dispersar fuertemente la luz hacia adelante (FSC) y lateralmente (SSC) y debido a su tinción positiva para el antígeno F4/80, un marcador para macrófagos (panel B) . Los macrófagos en la región 6 (R6) fueron separados en base de su tinción menos intensa por el antígeno F4/80 y se encontró que se tiñen por la proteína de fusión CRPl-Fc (presumiblemente debido a su expresión de B7RP1) .

Figura 9. Inhibición de proliferación de células T utilizando una proteína de fusión B7RP1-Fc. Las células T de esplenocitos de ratón se activan al incrementar las concentraciones de Concanavalina A (Con A) como se indica en la parte inferior de la gráfica. Se agregaron las proteínas de fusión mCRPl-Fc, mB7RPl, a células T enriquecidas a partir de esplenocitos en ausencia (sin adiciones) o presencia de Con A. Se utilizaron 200,000 células en los ensayos de proliferación de células T en una placa de 96 pozos. Se incubaron las células con medio (sin adiciones) o proteínas de fusión Fc como se indica en la leyenda de la gráfica. Después de 42 h, las células se someten a pulsos con H-timidina durante 6 h y después se cosechan y se determina la radioactividad incorporada. Se representan las CPM promedio y la desviación estándar de muestras por triplicado.

Figura 10. A) El nodulo linfático mesentérico normal de el ratón control #10 muestra la corteza, para corteza y médula del nodulo. Tinción con hematoxilina-eosina (H&E) ampliación 40x) . B) Nodulo linfático mesentérico marcadamente agrandado del ratón WX11 #40 con hiperplasia folicular prominente (FH) , expansión de la paracorteza e hiperplasia de la cuerda medular (MH) . H&E, 40x. C) Acercamiento de las cuerdas medulares (MC) y senos (MS) del nodulo linfático mesentérico de ratón control #10. Nótese las cuerdas medulares pequeñas compuestas en su mayor parte de linfocitos pequeños adyacentes a los senos medulares con macrófagos frescos. H&E, 400x. D) Acercamiento de las cuerdas medulares (MC) y senos (MS) de nodulo linfático mesentérico del ratón WX11 #40.

Nótense las cuerdas medulares marcadamente engrosadas constituidas de grandes números de células plasmáticas con células corporales de Russell ocasionales (flecha) . H&E, 400x.

E) Bazo normal del ratón control #10 que muestra las áreas de pulpa roja y pulpa blanca con revestimientos linfoides periarteriolares (PALS) , lOOx. Recuadro: acercamiento de la zona marginal que rodea a la pulpa blanca con linfocitos pequeños, macrófagos y células plasmáticas ocasionales, 400x.

F) Bazo del ratón WXll #6 con áreas de pulpa blanca agrandadas, que incluyen PALS y folículos (flecha) , lOOx. Recuadro : acercamiento de la zona marginal con numerosas células plasmáticas y cuerpos de Russell ocasionales, 400x. G) íleon con placa de Peyer del ratón control #25 con la zona interfolicular (flecha) flanqueada por dos folículos secundarios, 40x. H) íleon con placa de Peyer del ratón WXll #32 con folículos notablemente agrandados con centros germinales prominentes y tejido interfolicular (flecha), 40x.

Figura 11. A) Nodulo linfático mesentérico normal del ratón control #5 que muestra la corteza, paracorteza y médula del nodulo. Tinción de hematoxilina-eosina (H&E) , ampliación 40x. B) Nodulo linfático mesentérico notablemente agrandado del ratón WXll #33 con hiperplasia folicular prominente {parte superior: hileras de folículos secundarios en la corteza exterior) , expansión de la paracorteza (centro) e hiperplasia de la cuadra medular (parte inferior) . H&E, 40x. C) Tinción inmunohistoquímica del nodulo linfático mesentérico del ratón control #10 con anticuerpo contra B220 (marcador de células B) . Nótese el área cortical con tinción intensa (café) y las cuerdas medulares delgadas. La inmunotinción se realiza utilizando el método del complejo de avidina-biotina (ABC) inmunoperoxidasa (cromógeno DAB, contratinción con hematoxilina), 40x. D) Tinción inmunohistoquímica del nodulo linfático mesentérico del ratón WXll #33 con anticuerpo contra B220. Nótense los folículos corticales teñidos intensamente y las cuerdas medulares (aunque las células plasmáticas maduras en las cuerdas son negativas para B220) , 40x. E) Tinción inmunohistoquímica del nodulo linfático del ratón control #10 con anticuerpo contra CD3 (marcador de células T) . Nótese la inmunotinción de la zona paracortical del nodulo, 40x. F) Tinción inmunohistoquímica del nodulo linfático del ratón WXll #33 con anticuerpo contra CD3. Nótense las áreas agrandadas paracorticales, teñidas intensamente del nodo, 40x.

Figuras 12. A) Estructura y secuencia de la región codificante de proteína de B7RP1 humano (hB7RPl) . La secuencia de señal predicha de hB7RPl está subrayada en la parte amino terminal . Los sitios de separación de péptido de señal predicho se marcan por asteriscos . La secuencia transmembranal predicha está subrayada hacia la parte carboxi terminal. B) Alineación de aminoácidos de la proteína HB7RP1 madura putativa con la proteína B7RP1 murina madura (mB7RPl) .

Figura 13. A) Estructura y secuencia de la región codificante de proteína de CRPl humana (hCRPl) . La secuencia de señal predicha de hCRPl está subrayada en la parte amino terminal . Los sitios de separación de péptido de señal predichos están marcados por asteriscos. La secuencia transmembranal predicha está subrayada hacia la parte carboxi terminal. B) Alineación de aminoácidos de la proteína hCRPl con la proteína CRP1 murina (mB7RPl) .

Figura 14. CRPl está en las células T de memoria en reposo. Los esplenocitos en reposo de ratones con 6-7 meses de edad se someten a tinción doble utilizando B7RP-l-Fc marcado con un anticuerpo contra Fc humano conjugado con FITC y un anticuerpo conjugado con PE ya sea a CD44 (figura 14A) , CD45RB (figura 14B) o CD69 (figura 14C) .

Figura 15. Coestimulación de células T por la proteína de fusión B7RP-1-Fc. A) Proliferación de células T inducida por cantidades diferentes de B7RP-1-FC (cuadros negros), B7.2-FC (círculos negros), o control de proteína de fusión OPG-Fc (cuadros blancos) en conjunción con anticuerpo contra CD3. Las proteínas de fusión se utilizaron a diversas concentraciones para recubrir placas de 96 pozos, recubiertas previamente con FAb2 contra Fc humano (12.5 µg/ml) y anticuerpo B7RP-1-FC y B7.2-Fc coestimulan las células T de una manera dependiente de la dosis hasta 0.3 µg/ml, punto en el cual se obtiene el efecto máximo. B) Proliferación de células T inducida por B7RP-1-Fc (cuadros negros), B7.2-Fc (círculos negros) , Fc no fusionado (cuadros blancos) o sin Fc (círculos blancos) junto con anticuerpo contra CD3 (0.85 µg/ml) y en presencia de diversas concentraciones de un anticuerpo policlonal de conejo contra B7RP-1-Fc. Las proteínas de fusión de Fc se utilizan a una concentración de 0.3 µg/ml y se unen a las placas como en lo anterior. Se genera un anticuerpo contra B7RP1-1-Fc para purificar B7RP-1-Fc por inyecciones subcutáneas de antígeno emulsificado en adyuvante, y después se purifica por afinidad. Los anticuerpos se incuban durante 30 min con las proteínas de fusión Fc antes de la adición de las células. El anticuerpo contra B7RP-1-FC inhibe específicamente la proliferación de células T inducidas por B7RP1-Fc de una manera dependiente de la dosis.

Figura 16. Efecto de las proteínas CRP-1 y B7RP-1-Fc en la incidencia (A) y gravedad (B) de artritis inducida por colágeno en ratones. Ratones B10.RIII susceptibles a artritis inducida por colágeno se inmunizan en la base de la cola con 10 µg de colágeno porcino tipo II en CFA. Los ratones recibieron 100 µg de la proteína de fusión dos veces por semana. Las proteínas de fusión Fc y el tratamiento PBS control se indican en la leyenda de la figura.

Figura 17. Colon Proximal en ratones transgénicos B7RP-1-Fc. (A) Colon proximal normal del ratón control #53F (hembra) que muestra la pared del intestino con mucosa, súbmucosa, parte muscular y serosa. Tinción con hematoxilina-eosina (H&E) ampliación 40x. (B) Colon proximal difusamente engrosado de un ratón transgénico B7RP-1-Fc #111F con hipertrofia glandular prominente, ulceración fisurante e inflamación transmural . H&E, 40x. (C) Vista de baja potencia del colón proximal (como en el panel B) del ratón transgénico B7RP-l-Fc #111F con ulceración fisurante multifocal e inflamación transmural. H&E, 20x. (D) acercamiento de la úlcera fisurante y glándulas colónicas hipertróficas del ratón transgénico B7RP1-1-FC #111F (que se muestra en los paneles B y C anteriores) . Nótese el lumen con exudado mucopurulento . H&E lOOx. (E) Acercamiento de la inflamación granulomatosa en la sub ucosa del ratón transgénico B7RP-1-Fc #112F con célula gigante multinucleada rodeada por macrófagos, linfocitos y pocos neutrófilos . H&E 400x. (F) Acercamiento de inflamación granulomatosa en la mucosa de ratón transgénico B7RP-1-Fc #112F con macrófagos epitelioides mezclados con linfocitos, células plasmáticas y algunos neutrófilos subyacentes a las glándulas de la mucosa. H&E 400 x. .

Figura 18. Colón distal en ratones transgénicos B7RP-l-Fc. (A) Colón distal normal de un ratón control #53F (hembra) que muestra las capas de la pared del intestino con mucosa, submucosa, capa muscular y serosa. Tinción con hematoxilina-eosina (H&E) ampliación 40x. (B) Colon distal engrosado de manera difusa del ratón transgénico B7RP-1-Fc #111F (hembra) con hipertrofia glandular prominente, e hiperplasia y abscesos crípticos dispersados, H&E, 40x. (C) Colón distal engrosado de manera difusa del ratón transgénico B7RP-1-FC #55M (macho) con hipertrofia glandular prominente e hiperplasia H&E 40x. (D) colon distal engrosado de manera difusa del ratón transgénico B7RP-1-Fc #112F (hembra) con glándulas colónicas hipertróficas agregados linfoides focales y muchos abscesos crípticos. H&E 40x. (E) Tinción inmunohistoquímica del colón distal de un ratón transgénico B7RP-1-Fc #112F con anticuerpo contra CD3 (marcado de células T) . Nótese la inmunotinción de la molécula superficial y el parche linfoide colonice H&E 40x. (F) Acercamiento de la mucosa colónica de un ratón transgénico B7RP-l-Fc #112F con un absceso críptico (flecha) y agregado linfoide compuesto de células B220+ (recuadro) . H&E lOOx.

Figura 19. Intestino delgado en ratones transgénicos B7RP-1-FC. (A) Duodeno normal de un ratón control #53F (hembra) que muestra el lumen, vellos y criptas de la mucosa y submucosa subyacente, la capa muscular y la serosa. Tinción con hematoxilina-eosina (H&E) , ampliación 40x. (B) Duodeno engrosado de manera difusa de un ratón transgénico B7RP-1-Fc #51F (hembra) con hipertrofia críptica prominente e hiperplasia e infiltrado linfoplasmacítico moderado en la lámina propria. h&E, 40x. (C) Jejuno normal de un ratón control #53F (hembra) que muestra la longitud normal de los vellos y criptas en la mucosa del jejuno. H&E, ampliación 40x. (D) Mucosa del jejuno engrosada marcadamente de un ratón transgénico B7RP-1-FC #51F (hembra) con hipertrofia extensiva local de las criptas e hiperplasia. H&E, 40x. (E) íleon normal de ratón control #53F (hembra) que muestra la longitud normal de los vellos y criptas en la mucosa del íleon. H&E, ampliación 40x. (F) Atrofia moderada de la mucosa del íleon del ratón transgénico B7RP-1-Fc #231M (macho) con pérdida focal y corte de los vellos. H&E, 40x.

Figura 20. La proteína de fusión B7RP-1-FC inhibe el crecimiento de tumores en ratones . Se implantan intradérmicamente células de sarcoma Meth A en el abdomen de ratones Balb/C. En los días 7, 10, 14 y 17 después de la implantación los ratones se tratan con vehículos (rombos negros) o con B7RP-1-FC murino (triángulos grises, ejemplo 7) . Se mide el volumen del tumor, como se describe en el ejemplo 20, los días indicados después de la implantación. Se monitorea el crecimiento del tumor hasta el día 28. Cada grupo consta de ocho ratones .

Figura 21. Coestimulación de células T por B7RP-1-Fc humano. Se utiliza Fc contra CD3 y B7RP-1-FC para recubrir placas de 96 pozos y se cultivan 1 x 105 células T/pozo (>98% CD3+) y se cosechan como se describe en el ejemplo 21. A) Coestimulación inducida únicamente por anticuerpos contra CD3 (círculos negros), 0.5 µg/ml de B7RP-1-Fc (triángulos negros), 0.5 µg/ml de OPG-Fc (círculos blancos) y 5 µg/ml de anticuerpo contra CD28 (triángulos blancos) a diferentes concentraciones de estimulación primaria contra CD3. Los datos muestran que B7RP-1-Fc coestimula a células T cebadas con anticuerpo contra CD3 hasta concentraciones similares como coestimulación utilizando anticuerpos contra CD28. Los datos que se muestran son la media de [3H] TdR incorporado +/- SD (desviación estándar) en pozos por triplicado de un experimento representativo de varios experimentos generados con células T aisladas de tres donadores normales. B) . Inhibición dependiente de la dosis de coestimulación de B7RP-1-FC por CRP-l-Fc. Se cultivan células T en pozos recubiertos tanto con anticuerpo contra CD3 a 0.3 µg/ml como con 0.5 µg/ml de B7RP-l-Fc. Las concentraciones diluidas de manera seriada de CRP-l-Fc (círculos negros) o de OPG-Fc (círculos blancos) se preincuban con B7RP-l-Fc durante 30 min antes de la adición de células T. Los datos muestran que CRP-l-Fc inhibe la coestimulación inducida por B7RP-1 de una manera dependiente de la dosis. Se gráfica el por ciento de inhibición contra la concentración de proteína CRP-l-Fc o bien OPG-Fc. Los datos que se muestran son la media de [3H] TdR incorporada +/- SD de tres experimentos realizados en pozos por triplicado y son representativos de experimentos generados con dos donadores normales. C) Coestimulación por células B7RP-1 humanas CHO. Se purifican células T de sangre periférica y se cultivan con concentraciones diversas de anticuerpo contra CD3 en presencia de anticuerpo contra CD3 solo (círculos negros) 1 x 104 células control de vector CHO (círculos blancos) o 1 x 104 células B7RP-1 CHO (triángulos negros) como se describe en el ejemplo 22. Los datos muestran que las células T coestimuladas con B7RP-1 unido a membrana cree en hasta un nivel similar al observado utilizando proteínas de fusión B7RP-1-Fc. Los datos que se muestran son la media +/- SD de cultivos por triplicado y son representativos de resultados generados con dos donadores normales . D) Producción de citocina. Se cultivan células T como se describe en (figura 21A) y los sobrenadantes se recolectan a 48 h (barras negras) y 72 h (barra gris) . Los datos muestran que la cantidad de IL-2 producida por células coestimuladas con B7RP-1-Fc (gráfica superior) son similares a las producidas por células estimuladas por anticuerpo contra CD3 y Fc control, pero significativamente menor que la producida por células coestimuladas contra CD28. Los daros también muestran que la coestimulación B7RP-l-Fc mejorado con IL-10 (gráfica media) y la producción de IFN-? (gráfica inferior) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención proporciona polipéptidos novedosos a los que se hace referencia en la presente como CRPl y B7RP-1, los cuales comprenden un par receptor de un ligando que está involucrado en la activación de células T. Se identifican los ADNc que codifican para los polipéptidos, a partir de una biblioteca preparada a partir de células intraepiteliales intestinales de ratón y se examinan en base en la homología con los polipéptidos CD28 y CTLA-4 (para CRP1) y B7.1 y B7.2 (para B7RP-1) . La proteína-1 relacionada con CD28 o CRP1, se predice que es una proteína transmembranal tipo I con una secuencia de señal y dominio extracelular en la parte amino terminal, un dominio transmembranal y un dominio intracelular carboxi terminal (figura 1) . La proteína CRP1 de longitud completa tiene 180 aminoácidos en su forma madura. La secuencia líder predicha abarca aproximadamente los residuos aminoácidos 1-20 (en relación a la metionina de inicio) y el dominio extracelular de la proteína madura abarca aproximadamente los residuos 21-145 (ejemplo 1) . El dominio transmembranal predicho abarca aproximadamente los residuos 146-163 y el dominio intracelular abarca aproximadamente los residuos 164-200. El dominio extracelular amino terminal es similar a un rizo de Ig con cisteínas de un ion intramolecular e intermolecular putativas conservadas. Además, se sabe que el motivo "MYPPPY", el cual previamente se ha demostrado que es importante para la unión de B7.1 y B7.2 a CD28 y CTLA-4, también está conservado parcialmente . CD28 y CTLA-4 son homólogos débiles como se ejemplifica por el 26% de identidad de aminoácidos entre CD28 y CTLA-4 murinos . Existe un 19% de identidad de aminoácidos de CRPl con CD28 murino y 14% de identidad de CRP1 con CTLA-4 murino. Sin embargo, los residuos de cisteína críticos se conservan entre CD28 murino, CTLA-4 y CRP1 en los residuos 42, 63, 83, 109 y 137 (en relación a la metionina de inicio en la proteína CRP1, véase la figura ÍA) . Las longitudes y localizaciones de la proteína madura aproximada de la región transmembranal en relación a la parte carboxi terminal también son similares en CRP1, CD28 y CTLA-4.

CRP1 humana ee una proteína transmembranal que tiene la secuencia nucleotídica y de aminoácidos como se muestra en la figura 3A. La secuencia líder predicha abarca aproximadamente los residuos 1-19 o aproximadamente los residuos 1-20. La parte amino terminal madura está en los residuos 20 ó 21. Preferiblemente, la parte amino terminal está en la posición 21. El dominio extracelular abarca desde cualquier parte amino terminal madura predicha hasta aproximadamente el residuo aminoácido 140, el dominio transmembranal abarca aproximadamente los residuos 141-161 y el dominio intracelular abarca aproximadamente los residuos 162-199. La proteína CRP1 humana tiene 69% de identidad con la proteína murina y las secuencias nucleotídicas correspondientes son 77% idénticas. La secuencia de CRP1 humana ha sido reportada en Hutloff et al. Nature 397, 263-266 (1999) . La proteína-1 relacionada con B7, o B7RP1, se predice que es una proteína transmembranal tipo I con una secuencia de señal y un dominio extracelular en la parte amino terminal, un dominio transmembranal y un dominio intracelular carboxi terminal (figura 2A) . La proteína B7RP1 de longitud completa tiene 276 aminoácidos en su forma madura. La secuencia líder predicha abarca aproximadamente los residuos aminoácidos 1-46 (en relación a la metionina de inicio) y el dominio extracelular de la proteína madura abarca los residuos 47-279 (ejemplo 3) . El dominio transmembranal predicho abarca los residuos 280-298 y el dominio intracelular abarca los residuos 299-322. Similar a B7.1 y B7.2, el dominio extracelular de B7RP1 comprende dos rizos Ig. B7.1 y B7.2 son homólogos débiles como se ejemplifica por el 24% de identidad de aminoácidos entre B7.1 y B7.2 murino. Existe 20% de identidad de aminoácidos de B7RP1 con B7.1 murino y 19% de identidad de B7RP1 con B7.2 murino. Sin embargo, los residuos cisteína críticos están conservados entre B7.1, B7.2 y B7RP1 murino en los residuos 62, 138, 185 y 242 (en relación a la metionina de inicio en la proteína B7RP1, figura 2A) . La longitud y localización aproximada de la proteína madura de la región transmembranal en relación a la parte carboxi terminal también son similares en mB7RPl, B7.1 y B7.2. B7RP1 humana también es una proteína transmembranal con residuo cisteína conservado en el dominio extracelular el cual es necesario para las estructuras de rizo Ig. La secuencia líder predicha abarca aproximadamente los residuos 1-18, 1-19, 1-20, 1-21, 1-23 o 1-27 como se muestra en la figura 3A. La parte amino terminal madura predicha puede ser cualquiera de los residuos 19, 20, 21, 22, 24 ó 28. Preferiblemente, la parte amino terminal está en la posición 19. El dominio extracelular abarca desde cualquiera de las partes terminales amino maduras hasta aproximadamente el residuo aminoácido 259. El dominio transmembranal predicho abarca desde aproximadamente los residuos 259-274. El dominio intracelular abarca los residuos 275-302. La secuencia nucleotídica y de aminoácidos de B7RP1 humano de longitud completa se muestra en la figura 12A. B7RP1 humana es aproximadamente 43% idéntica a la proteína murina. CRP1 y B7RP1 se unen entre si, pero CRPl no se une detectablemente a la proteína relacionada B7RP1, B7.2; y B7RP1 no muestra una unión detectable con CD28 relacionado con CRP1 o CTLA-4 (ejemplo 8) . Se muestra que B7RP1 regula la proliferación de células T, probablemente debido a la interacción de B7RP1 con los receptores CRP1 (ejemplo 11) . Por lo tanto, CRP1 y B7RP1 representan una vía novedosa para regular la proliferación y activación de células T. La interacción de B7RP1 con CRP1 se puede regular de manera tal que se pueda aumentar o disminuir la coestimulación inmune y proliferación y activación de células T. A modo de ejemplo, los anticuerpos monoclonales y policlonales contra B7RP1 generados contra B7RP1 murino bloquean la interacción B7RP1/CRP1 y también bloquea la proliferación de células T inducida por la proteína de fusión B7RP1-Fc (véase ejemplo 17) . Una proteína de fusión CRPl-Fc humana bloquea la proliferación de células T humanas inducida por B7RP-l-Fc humana (ejemplo 21) . Además, la adición de una proteína de fusión CRPl-Fc retrasa el inicio de síntomas artríticos en un modelo de ratón de artritis reumatoide (véase ejemplo 18) . La coestimulación con B7RP-1/CRP1 también se puede incrementar por la adición de la proteína de fusión B7RP-1-Fc u otros activadores de esta vía (ejemplo 20) .

MOLÉCULAS DE ACIDO NUCLEICO El término "molécula aislada de ácido nucleico" se refiere a una molécula de ácido nucleico que está libre de por lo menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la cual se asocia naturalmente, y de manera preferible está sustancialmente libre de cualquier otra molécula de ácido nucleico contaminante de mamífero. El término "variante alélica" se refiere a una de varias posibles formas alternativas que se presentan de manera natural de un gen que ocupa un locus dado en un cromosoma de un organismo. El término "variante por corte y empalme" se refiere a una molécula de ácido nucleico, habitualmente 'ARN, el cual se genera por procesamiento alternativo de secuencias de intrón en un transcrito de ARN. El término "condiciones de alta astringencia" o rigurosidad, se refiere a aquellas condiciones las cuales: (1) utilizan baja fuerza iónica y alta temperatura para lavado, por ejemplo 0.1 x SSC (NaCl 0.15M/citrato de sodio 0.0015 M) , NaDodS04 0.1% (SDS) a 50°C, o bien (2) que utilizan durante la hibridación un agente desnaturalizante tal como formamida, por ejemplo formamida 50% (vol/vol) con albúmina sérica bovina 0.1%. Ficoll/polivinilpirrolidona 0.1%/amortiguador de fosfato de sodio 50 mM a pH 6.5 con 5 x SSC (NaCl 750 mM, citrato de sodio 75 mM) a 42 °C. Otro ejemplo de condiciones de alta astringencia o rigurosidad es formamida 50% 5 x SSC, fosfato de sodio 50 mM (pH 6.8), pirofosfato de sodio 0.1%, solución de Denhardt 5 x, .ADN de esperma de salmón sonicado (50 mg/ml) , SDS 0.1%, y sulfato de dextrano 10% a 42°C, con lavados a 42°C en 0.2 x SSC y SDS 0.1%. El término "condiciones de astringencia o rigurosidad moderada" se refiere a aquellas condiciones las cuales incluyen el uso de una solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo temperatura y resistencia iónica) menos astringentes o rigurosas que las descritas antes. Un ejemplo de condiciones astringentes o rigurosas moderadas son condiciones tales como incubación durante la noche a 37°C en una solución que comprende: formamida 20%, 5 x SSC, fosfato de sodio 50 mM (pH 7.6), solución de Denhardt 5 x, sulfato de dextrano 10% y 20 µl/ml de /ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, seguido por lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50°C. Los expertos en la técnica reconocerán la manera de ajustar la temperatura, fuerza iónica y otros parámetros según sea necesario para acomodar factores tales como longitud de la sonda y similar. Los métodos de tecnología de ADN recopibinante se establecen en Sambrock et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual . Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N (1989)) o bien en Ausubel et al., eds., ( Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. and Wiley and Sons, NY (1994)), las cuales se incorporan en la presente como referencia en su totalidad. La invención proporciona moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican para los polipéptidos CRP1 y B7RP1. También se proporcionan moléculas de ácido nucleico las cuales son fragmentos, variantes alélicas, variantes por corte y empalme, o son complementarias en secuencia a moléculas que codifican para los polipéptidos CRPl y B7RP1. Las moléculas de ácido nucleico las cuales son por lo menos aproximadamente 70% idénticas a moléculas que codifican para CRPl o B7RP1, o las cuales hibridizan con moléculas que codifican para CRP1 o B7RP1 bajo condiciones de astringencia o rigurosidad moderada o alta, también se abarcan. Las moléculas de ácido nucleico pueden ser /ADNc, ADN genómico, ARN o moléculas de ácido nucleico parcial o completamente sintéticas. En las modalidades preferidas, las moléculas de ácido nucleico de la invención son por lo menos 75%, 80%, 85%, 90% o 95% idénticas a moléculas de ácido nucleico que codifican para CRP1 o B7RP1.

Se puede obtener un gen de ADNc que codifica para el polipéptido CRPl o B7RP1, o un fragmento del mismo, por ejemplo, por examen de hibridación o por amplificación por PCR de una biblioteca genómica o de ./ADNc. Las sondas o cebadores útiles para examinar la biblioteca se pueden generar en base en información de secuencia para otros genes conocidos o fragmentos de genes para la misma familia de genes o genes relacionados, por ejemplo, motivos conservados que se encuentren en polipéptidos relacionados con CRP1 o B7RP1 tales como un arreglo conservado de residuos cisteína. Además, en donde se ha identificado un gen que codifica para el polipéptido CRP1 o B7RP1 de una especie, la totalidad o una porción de ese gen se puede utilizar como una sonda para identificar genes homólogos de otras especies . Las sondas o cebadores se pueden utilizar para examinar bibliotecas de ADNc de diversas fuentes de tejido que se considera expresan en gen CRPl o B7RP1. Cuando se utilizan sondas oligonucleotídicas para examinar ADNc o bibliotecas genómicas, se pueden utilizar una de las siguientes soluciones de alta astringencia o rigurosidad. La primera de estas es 6 x SSC con pirofosfato de sodio 0.05% a 35°C-62°C, y la temperatura dependiendo de la longitud de la sonda oligonucleótidica. Por ejemplo, se lavan sondas de 14 pares de bases a 35-40°C, se lavan sondas de 17 pares de bases a 45-50°C, se lavan sondas de 20 pares de bases a 52-57°C y se lavan sondas de 23 pares de bases a 57-63°C. La temperatura se puede incrementar 2-3°C en donde el fondo de unión no específico aparezca alto. Una segunda solución de alta astringencia o rigurosidad utiliza cloruro de tetrametilamonio (TMAC) para lavar sondas oligonucleotídicas. Una solución de lavado astringente o riguroso es TMAC 3 M, Tris-HCl 50 mM, pH 8.0 y SDS 0.2%. La temperatura de lavado utilizando esta solución es una función de la longitud de la sonda. Por ejemplo, una sonda de 17 pares de bases se lava a aproximadamente 45-50°C. Otro medio para preparar un gen que codifica para un polipéptido CRP1 o B7RP1 o un fragmento del mismo es utilizar síntesis química utilizando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica tales como los descritos por Engels et al. (Agnew. Chem. Intl . Ed. , 28.716-734 (1989)). Estos métodos incluyen, por ejemplo, el fosfotriéster, fosforoamidita y métodos de H-fosfonato para síntesis de ácido nucleico. Un método preferido para tal síntesis química es la síntesis soportada por polímero utilizando la química estándar o convencional de fosforoamidita. Típicamente, el ADN que codifica para el polipéptido CRP1 o B7RP1 será de varios cientos de nucleótidos de longitud. Los ácidos nucleicos más grandes de aproximadamente 100 nucleótidos se pueden sintetizar como varios fragmentos utilizando estos métodos. Los fragmentos después se pueden unir por ligación para formar un polipéptido CRPl o B7RP1 de longitud completa. Habitualmente, el fragmento de ADN que codifica para la parte amino terminal del polipéptido tendrá un ATG, el cual codifica para un residuo metionina. Esta metionina puede o no estar presente en la forma madura de un polipéptido CRP1 o B7RP1, dependiendo de si el polipéptido producido en la célula huésped se diseña para ser secretado de esa célula. Las moléculas de ácido nucleico para CRP1 o B7RP1, los fragmentos o derivados que en si mismos no codifican para los polipéptidos que son biológicamente activos no obstante pueden ser útiles como sondas de hibridación en ensayos de diagnóstico para probar, ya sea cualitativa o cuantitativamente, para determinar la presencia de ADN o el ARN correspondiente para CRP1 o B7RP1 en tejido de mamífero o en muestras de fluido corporal . En algunos casos, puede ser deseable preparar ácido nucleico o variantes de aminoácidos de polipéptidos CRP1 o B7RP1 que se presentan de manera natural . Las variantes de ácido nucleico se pueden producir utilizando mutagénesis dirigida al sitio, amplificación por PCR u otros métodos apropiados, en donde o los cebadores tiene las mutaciones puntuales deseadas (véase Sambrook et al . , supra, and Ausubel et al., supra para descripciones de técnicas de mutagénesis) . La síntesis química utilizando los métodos descritos por Engels et al., supra, también se puede utilizar para preparar tales variantes. También se pueden utilizar otros métodos conocidos por los expertos en la técnica. Las variantes preferidas de ácido nucleico incluyen aquellas que contienen codones los cuales se han alterado para expresión óptima de polipéptidos CRP1 o B7RP1 en una célula huésped dada. Las alteraciones de codón particulares dependerán de la selección de proteína y célula huésped. Tal "optimización de codón" en un caso se puede llevar a cabo al seleccionar codones los cuales se utilizan preferencialmente en genes altamente expresados en una célula huésped dada. Los algoritmos de computadora los cuales incorporan tablas de frecuencia de codones tales como "Ecohigh. Cod" para preferencia de codones de genes bacterianos altamente expresados se pueden utilizar y se proporcionan por la University of Wisconsin Package Versión 9.0, Genetics Computer Group, Madison, Wl . Otras tablas de frecuencia de codones útiles incluyen "Celegans_high. cod" , "Celegans_lo . cod" , "Drosophila_high. cod" , Human_high. cod" , "Maize_high. cod" , y "Yeast_high. cod" . Otras variantes preferidas son aquellas que codifican cambios dé aminoácidos conservadores como se describen en lo siguiente (por ejemplo, en donde la carga o la polaridad de la cadena lateral de aminoácido que se presenta de manera natural no es alterada sustancialmente por sustitución con un aminoácido diferente (en comparación con la de tipo silvestre y aquellas designadas para generar un sitio novedoso de glicosilación o fosforilación o bien aquellas designadas para suprimir un sitio de glicosilación o fosforilación existente. El gen, ADNc o fragmento del mismo que codifica para un polipéptido CRP1 o B7RP1 se puede insertar dentro de un vector de expresión o amplificación apropiado utilizando técnicas de ligación estándar. El vector típicamente se selecciona para que sea funcional en la célula huésped particular utilizada (es decir, el vector es compatible con la maquinaria de la célula huésped de manera que se puede llevar a cabo la amplificación del gen o bien la expresión del gen) .

El gen, ADNc o fragmento del mismo que codifica para el polipéptido CRP1 o B7RP1 se puede amplificar/expresar en células huésped procarióticas, de levadura, de insectos (sistemas de baculovirus) o eucarióticas. La selección de la célula huésped dependerá en parte de si el polipéptido CRP1 o B7RP1 o fragmento del mismo va a ser glicosilado o fosforilado. Si es así, son preferibles células huésped de levadura, insecto o mamífero. Típicamente, los vectores de expresión utilizados en cualquiera de las células huésped contienen secuencias para mantenimiento de plásmido y clonación y expresión en las secuencias nucleotídicas insertadas. Tales secuencias, denominadas colectivamente como "secuencias flanqueantes" inducirán un elemento promotor y otro elemento regulador tal como un alargador, un elemento de origen de replicación, un elemento de terminación de transcripción, una secuencia de intrón completa que contiene un donador y un sitio de corte y empalme aceptor, una secuencia de péptido señal, un elemento de sitio de unión de ribosoma, una secuencia de poliadenilación, una región polienlazadora para insertar el ácido nucleico que codifica para el polipéptido que se va a expresar, y un elemento marcador seleccionable. Cada uno de estos elementos se discute a continuación. Opcionalmente, el vector puede contener una secuencia "etiqueta" es decir, una molécula oligonucleotídica localizada en el extremo 5' ó 3' de una secuencia codificante para el polipéptido CRP1 o B7RP1; la molécula oligonucleotídica codifica para PolyHis (tal como HexaHis) u otra "etiqueta" tal como el "tag" tal como el FLAG, HA (virus de influenza hemaglutinina) o myc para los cuales existen anticuerpos disponibles comercialmente. Esta etiqueta típicamente se fusiona al polipéptido ante la expresión del polipéptido y puede servir como un medio para purificación por afinidad de un polipéptido CRP1 o B7RP1 a partir de la célula huésped. La purificación por afinidad se puede llevar a cabo, por ejemplo, por cromatografía en columna utilizando anticuerpos contra la etiqueta como una matriz de afinidad. Opcionalmente, la etiqueta se puede remover subsecuentemente a partir de un polipéptido purificado de CRP1 o B7RP1 por varios medios tales como la utilización de ciertas peptidasas .

La región de bisagra y Fc de inmunoglobulina se pueden fusionar ya sea a la parte N terminal o C terminal de un polipéptido CRP1 o B7RP1 por una persona experta en la técnica. La proteína de fusión Fc subsecuente se puede purificar mediante el uso de columna de afinidad de proteína A. Una región Fc de inmunoglobulina se sabe que muestra una vida media farmacocinética prolongada in vivo y se ha encontrado que las proteínas fusionadas a una región Fc muestran una vida media sustancialmente mayor in vivo en comparación con su contraparte no fusionada. Además, la fusión a la región Fc permite la dimerización o multimerización de la molécula que puede ser útil para la bioactividad de algunas moléculas . La secuencia flanqueante puede ser homologa (es decir, de la misma especie o cepa que la célula huésped) , heteróloga (es decir, de una especie diferente a la especie de la célula huésped o cepa) , híbrida (es decir, una combinación de secuencias flanqueantes de más de una fuente) sintética o puede ser secuencias flanqueantes de ácido nucleico para CRP1 o B7RP1 nativas. Como tal, la fuente de la secuencia flanqueante puede ser cualquier organismo unicelular procariótico o eucariótico, cualquier organismo vertebrado o invertebrado o cualquier planta, con la condición de que la secuencia flanquente sea funcional, y se pueda activar por la maquinaria de la célula huésped.

Las secuencias flanqueantes útiles en los vectores de esta invención se pueden obtener por cualquiera de los diversos métodos bien conocidos en la técnica. Típicamente, las secuencias flanqueantes útiles en la presente además de la secuencia flanqueante de ácido nucleico para CRP1 o B7RP1 previamente se habrán identificado por mapeo por digestión con endonucleasa de restricción y por lo tanto se pueden aislar de la fuente de tejido apropiado utilizando las endonucleasas de restricción apropiadas. En algunos casos, se puede conocer la secuencia nucleotídica completa de la secuencia flanqueante. Aquí, la secuencia flanqueante se puede sintetizar utilizando los métodos descritos antes para la síntesis o clonación de ácido nucleico. En donde se conoce la totalidad o únicamente una porción de la secuencia flanqueante, se puede obtener utilizando PCR o examen de una biblioteca genómica con una secuencia oligonucleotídica o flanqueante adecuada de fragmentos de la misma u otras especies . Cuando no se conoce la secuencia flanqueante, se puede aislar un fragmento de ADN que contiene una secuencia flanqueante a partir de una pieza más grande de ADN que puede contener, por ejemplo, una secuencia codificante o incluso otro gen o genes . El aislamiento se puede llevar a cabo por digestión con endonucleasas de restricción utilizando una o más enzimas seleccionadas cuidadosamente para aislar el fragmento apropiado de ADN. Después de la digestión, se puede aislar el fragmento deseado por purificación en gel de agarosa, columna QiagenMR u otros métodos conocidos por los expertos en la técnica. La selección de las enzimas adecuadas para llevar a cabo este propósito serán evidentes fácilmente para una persona habitualmente experta en la técnica. El elemento de origen de replicación típicamente es parte de los vectores de expresión procarióticos adquiridos comercialmente y ayuda en la amplificación del vector en una célula huésped. La amplificación del vector a cierto número de copias en algunos casos puede ser importante para expresión óptima del polipéptido CRP1 o B7RP1. Si el vector de elección no contiene un origen de sitio de replicación, se puede sintetizar uno químicamente en base en una secuencia conocida, y se puede ligar en el vector. El elemento de terminación de transcripción típicamente se localiza 3 ' del extremo de una secuencia codificante para el polipéptido CRP1 o B7RP1 y sirve para terminar la transcripción de un polipéptido CRP1 o B7RP1. Habitualmente, el elemento de terminación de transcripción en células procarióticas es un fragmento rico en G-C seguido por una secuencia poli T. Aunque el elemento se clona fácilmente a partir de una biblioteca o incluso se compara comercialmente como parte de un vector, también se puede sintetizar fácilmente utilizando métodos para síntesis de ácido nucleico tales como los descritos antes. Un elemento de gen marcador seleccionable codifica para una proteína necesaria para la supervivencia y crecimiento de una célula huésped que crece en un medio de cultivo selectivo. Los genes marcadores de selección típicos codifican para proteínas que: (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo ampicilina, tetraciclina o cana icina para células huésped procarióticas, (b) complementan deficiencias auxotróficas de la célula; o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles del medio complejo. Los marcadores seleccionables preferidos son el gen de resistencia a canamicina, el gen de resistencia a ampicilina y el gen de resistencia a tetraciclina. El elemento de unión de ribosoma, denominado comúnmente como la secuencia de Shine-Dalgarno (procariotas) o la secuencia Kozak (eucariotas) habitualmente es necesario para el inicio traduccional de ARNm. El elemento típicamente se localiza 3 ' respecto al promotor y 5 ' respecto a la secuencia codificante para el polipéptido CRP1 o B7RP1 que se va a sintetizar. La secuencia de Shine-Dalgarno se hace variar pero típicamente es una polipurina (es decir, que tiene un contenido alto de A-G) . Se han identificado muchas secuencias de Shine-Dalgarno, cada una de las cuales se puede sintetizar fácilmente utilizando métodos que se establecen en lo anterior y que se utilizan en un vector procariótico. En aquellos casos en los que es deseable que el polipéptido CRP1 o B7RP1 sea secretado de la célula huésped, se puede utilizar una secuencia de señal para dirigir la exportación del polipéptido de la célula huésped. También se puede inactivar un dominio transmembranal de CRP1 o B7RP1 por mutación o supresión para evitar la unión a la membrana del huésped. Típicamente, la secuencia de señal se coloca en la región codificante de un gen para CRP1 o B7RP1 o /ADNc o directamente en el extremo 5 ' de una región que codifica para el gen para CRP1 o B7RP1. Se han identificado muchas secuencias de señal y cualquiera de ellas es funcional en la célula huésped seleccionada y se puede utilizar junto con un gen o ADNc para CRP1 o B7RP1. Por lo tanto, la secuencia de señal puede ser homologa o heteróloga a un gen o ADNc para CRP1 o B7RP1 y puede ser homologa o heteróloga a un gen o ADNc para polipéptidos CRP1 o B7RP1. Adicionalmente, la secuencia de señal puede ser sintetizada químicamente utilizando métodos que se establecen en lo anterior. En la mayor parte de los casos, la secreción del polipéptido a partir de la célula huésped vía la presencia de un péptido señal resultará en la remoción de la metionina amino terminal del polipéptido.

En muchos casos, la transcripción de un gen para CRP1 o B7RP1 o ADNc se incrementa por la presencia de uno o más intrones en el vector. Esto es particularmente válido cuando se produce un polipéptido CRP1 o B7RP1 en células de huéspedes eucarióticas, especialmente células huéspedes de mamífero. Los intrones utilizados se pueden presentar naturalmente dentro de un gen CRP1 o B7RP1, especialmente cuando el gen utilizado es una secuencia genómica de longitud completa o un fragmento de la misma . Cuando el intrón no se presenta de manera natural dentro del gen (como en la mayor parte de los /ADNc) , el o los intrones se pueden obtener de otra fuente. La posición del intrón con respecto a la secuencia flanqueante 5 ' y un gen CRP1 o B7RP1 generalmente es importante, pues el intrón debe ser transcrito como efectivo. De esta manera, cuando se inserta un gen para CRP1 o B7RP1 dentro del vector de expresión y este es una molécula de ADNc, la posición preferida para el intrón es 3' respecto al sitio de inicio de transcripción, y 5' respecto al preferiblemente el intrón o intrones se localizarán en un lado o en otro (es decir, 5' o 3') del ADNc de manera que no interrumpa esta secuencia de codificación. Cualquier intrón de cualquier fuente, que incluye cualquier organismo viral, procariótico y eucariótico (vegetal o animal) se puede utilizar para llevar a la práctica esta invención con la condición de que sea compatible con la célula o células huésped dentro de las cuales se inserta. También se incluye aquí los intrones sintéticos. Opcionalmente, se puede utilizar en el vector más de un intrón. En donde uno o más de los elementos que se establecen antes no están listos presentes en el vector que se va a utilizar, se pueden obtener individualmente y se ligan en el vector. Los métodos utilizados por obtener cada uno de estos elementos son bien conocidos por los expertos en la técnica. Los vectores preferidos para llevar a la práctica esta invención son aquellos los cuales son compatibles con células huésped bacterianas, de insecto y de mamífero. Tales vectores incluyen, por ejemplo, pCRII, pCR3 y pcDNA3.1 (Invitrogen Company, San Diego, CA) , pBSII (Stratagene Company, La Jolla, CA) , pET15b (Novagen, Madison, Wl) , pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) , pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, CA) , pETL (BlueBacII; Invitrogen), y pFastBacDual (Gibco/BRL, Grand Island, NY) . Después de que el vector se ha construido y se ha insertado una molécula de ácido nucleico que codifica para una longitud completa o truncada del polipéptido CRP1 o B7RP1 dentro del sitio apropiado del vector, el vector completado se puede insertar dentro de una célula huésped adecuada para amplificación o expresión del polipéptido. Las células huésped pueden ser células huésped procarióticas (tales como E. coli) o células huésped eucarióticas (tales como una célula de levadura, una célula de insecto o una célula de vertebrados) . La célula huésped, cuando se cultiva bajo condiciones apropiadas, puede sintetizar un polipéptido CRP1 o B7RP1 el cual subsecuentemente se puede recolectar del medio de cultivo (si la célula huésped lo secreta al medio) o directamente de la célula huésped produciéndola (si no se secreta) . Después de la recolección, se puede purificar un polipéptido CRP1 o B7RP1 utilizando métodos tales como cromatografía de tamiz molecular, cromatografía de afinidad y similar. La selección de la célula huésped apropiada para la producción del polipéptido CRP1 o B7RP1 dependerá de varios factores tales como los niveles de expresión deseados, modificaciones de polipéptido que se requiere para actividad tal como glicosilación o fosforilación, o facilidad de plegado o renaturalización en una molécula biológicamente activa. Las células o líneas de células adecuadas pueden ser células de mamífero, tales como células de ovario de hámster chino (CHO) , células de riñon embriónico humano (HEK) 293 o 293 T o células 3T3. La selección de las células huéspedes de mamífero adecuadas y los métodos para su transformación, cultivo, amplificación, examen y producción de producto y purificación se conocen en la técnica. Otras líneas de células de mamífero adecuadas son las líneas de células de mono COS-1 y COS-7, y la línea de células CV-1. Además, las células huésped de mamífero ejemplares incluyen líneas de células de primate y líneas de células de roedor que incluyen líneas de células transformadas. Las células diploides normales, cepas de células derivadas de cultivo in vitro de tejido primario así como explantes primarios, también son adecuados. Las células candidato pueden ser genotípicamente deficientes en el gen de selección o pueden contener un gen de selección que actúe de manera dominante. Otras líneas de células de mamífero adecuadas incluyen, pero no se limitan a células N2A de neuroblastoma de ratón, células HeLa, células de ratón L-929, líneas 3T3 derivadas de ratones Swiss, Balb-c o NIH, líneas de células de hámster BHK o HaK. De manera similarmente útil como células huésped son las células bacterianas. Por ejemplo, las diversas cepas de E. coli (por ejemplo HB101, DH50, DH10 y MC1061) son bien conocidas como células huéspedes en el campo de la biotecnología. También se pueden utilizar en este método diversas cepas de B . subtilis, Pseudomonas spp., u otras Bacillus spp. , Streptomyces spp y similares. Muchas cepas de células de levadura conocido por los expertos en la técnica también están disponibles como células huésped para la expresión de los polipéptidos de la presente invención. De manera adicional, cuando se desee, se pueden utilizar sistemas de células de insecto en los métodos de la presente invención. Tales sistemas se describen por ejemplo en Kitts et al. (Biotechniques, 14:810-817 1993)), Lucklow ( Curr.

Opin . Biotechnol . , 4:564-572 (1993)) y Lucklow et al. (J. Virol . , 67..45S6-4579 (1993)) . Las células de insecto preferidas son Sf-9 y Hi5 (Invitrogen Carlsbad, CA) . Los términos "transformación" o "transfección" de un vector de expresión en la célula huésped seleccionada se puede llevar a cabo utilizando tales métodos como cloruro de calcio, electroporación, microinyección, lipofección o método de DEAE dextrano. El método seleccionado en parte será una función del tipo de célula huésped que se utilice. Estos métodos y otros métodos adecuados son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica y se establecen, por ejemplo en Sambrook et al., supra . Las células huésped transformadas o transfectadas con un vector de expresión se pueden cultivar utilizando un medio estándar bien conocido por los expertos en la técnica. El medio habitualmente contendrá todos los nutrientes necesarios para el crecimiento y supervivencia de las células . Los medios adecuados para cultivo de células E. coli son, por ejemplo, caldo Luria (LB) o caldo Terrific (TB) . Los medios adecuados para cultivo de células eucarióticas son RPMI 1640, MEM, DMEM, todos los cuales se pueden suplementar con suero o factor de crecimiento y según se requiera por la línea de células particular que se cultive. Un medio adecuado para cultivos de insectos es el medio de Grace suplementado con yeastolato, hidrolizado de lactalbumina o suero bovino fetal, según sea necesario. Típicamente, un antibiótico u otro compuesto útil para crecimiento selectivo de las células transformadas únicamente se agrega como un suplemento al medio. El compuesto que se va a utilizar estará definido por el elemento marcador seleccionable presente en el plásmido con el cual se transforma la célula huésped. Por ejemplo, cuando el elemento marcador seleccionable es resistencia a canamicina, el compuesto agregado al medio de cultivo será canamicina. La cantidad de polipéptido CRP1 o B7RP1 producido en la célula huésped se puede evaluar utilizando métodos convencionales o estándar conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen, sin limitación, análisis de transferencia Western (Western blot) , electroforesis en gel de SDS-policarilamida, electroforesis en gel no desnaturalizante, separación por CLAR, inmunoprecipitación o ensayo de actividad tales como ensayos de desplazamiento de gel por unión de ADN. Si se ha designado un polipéptido CRP1 o B7RP1 para ser secretado de las células huésped, la mayor parte del polipéptido se puede encontrar en el medio de cultivo de la célula. Los polipéptidos preparados de esta manera típicamente no poseen una metionina amino terminal, pues se remueve durante la secreción de la célula. Sin embargo, si un polipéptido CRP1 o B7RP1 no es secretado de las células huéspedes, estará presente en el citoplasma o el núcleo (para células huésped eucarióticas) o en el citosol (para células huésped bacterias gram negativas) y también puede tener una metionina amino terminal . La purificación de un polipéptido CRP1 o B7RP1 de la solución se puede llevar a cabo utilizando diversas técnicas . Si se ha sintetizado un polipéptido que contiene una etiqueta tal como hexahistidina (CRP1 o B7RPl/hexaHis) u otro péptido pequeño tal como FLAG (Eastman Kodak Co., New Haven, CT) omyc, ya sea en su parte carboxilo o amino terminal, puede ser purificado esencialmente en un proceso de una etapa al hacer pasar el polipéptido etiquetado a través de una columna de afinidad en donde la matriz de la columna tiene afinidad por la etiqueta o por el polipéptido directamente (es decir, un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente un polipéptido CRP1 o B7RP1) . Por ejemplo, la polihistidina se une con gran afinidad y especificidad a níquel, y por lo tanto una columna de afinidad de níquel (tales como las columnas de níquel QiagenMR) se pueden utilizar para purificación de CRP1 o B7RPl/polyHis . (Véase por ejemplo, Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Sección 10.11.8, John Wiley & Sons, New York (1993)). Cuando se prepara un polipéptido CRP1 o B7RP1 sin una etiqueta unida, y no están disponibles anticuerpos, se pueden utilizar otros procedimientos bien conocidos para purificación.

Tales procedimientos incluyen, sin limitación, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de tamiz molecular, CLAR, electroforesis en gel nativo en combinación con elución en gel y enfoque isoeléctrico preparativo (máquina/técnica "Isoprime", Hoefer Scientific) . En algunos casos, se pueden combinar dos o más de estas técnicas para obtener la pureza que se desee. Se anticipa que un polipéptido CRP1 o B7RP1 se encontrará principalmente intracelularmente, el material intracelular (incluyendo cuerpos de inclusión para bacterias gram negativas) se puede extraer de la célula huésped utilizando cualquier técnica estándar conocida por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las células huésped pueden ser lisadas para liberar el contenido del periplasma/citoplasma mediante una prensa French, homogeneización o sonicación seguido por centrifugación. Si el polipéptido CRP1 o B7RP1 ha formado cuerpos de inclusión en el citosol, los cuerpos de inclusión con frecuencia se unen a las membranas celulares interiores o exteriores y por lo tanto se encontrarán principalmente en el material sedimentado después de la centrifugación. El material sedimentado después se puede tratar a pH extremos o con un agente caotrópico tal como un detergente, guanidina, derivados de guanidina, urea o derivados de urea en presencia de un agente reductor tal como ditiotritol a pH alcalino o Tris carboxietilfosfina a pH ácido para liberar, descomponer y solubilizar los cuerpos de inclusión. El polipéptido en esta forma, ahora soluble, se puede analizar después utilizando electroforesis en gel, inmunoprecipitación o similar. Si se desea aislar un polipéptido CRP1 o B7RP1, el aislamiento se puede llevar a cabo utilizando métodos convencionales o estándar tales como los que se establecen antes y en Marston et al. (Meth Enz . , 182 :264-275 (1990)). En algunos casos, un polipéptido CRP1 o B7RP1 puede no ser biológicamente activo cuando se aisla. Se pueden utilizar diversos métodos para "renaturalizar" o convertir al polipéptido a su estructura terciaria y generar enlaces disulfuro, para restaurar la actividad biológica. Tales métodos incluyen poner en contacto al péptido solubilizado con una solución que tenga un pH habitualmente superior a 7 y en presencia de una concentración particular de un caótropo apropiado. En la mayor parte de los casos, la solución de renaturalización/oxidación también contendrá un agente reductor o un agente reductor y la forma oxidada correspondiente en una relación específica para generar un potencial redox particular que permita que se produzca la transferencia disulfuro en la formación de los puentes cisteína de la proteína. Algunos de los pares redox utilizados comúnmente incluyen cisteína/cistamina , glutati (GSH) /ditiobis GSH, cloruro cúprico, ditiotreitol (DTT) /ditiano DTT, 2-mercaptoetanol (bME) /ditio-b (ME) . En muchos casos, es necesario un cosolvente para incrementar la eficiencia de la renaturalización y los reactivos más comunes utilizados para este propósito incluyen glicerol, polietilenglicol de diversos pesos moleculares y arginina. Los polipéptidos CRP1 o B7RP1, fragmentos o derivados de los mismos también se pueden preparar por métodos de síntesis química (tales como síntesis de péptidos en fase sólida) utilizando técnicas conocidas en el arte tales como las que se establecen por Merrifield et al., (J". Am . Chem. Soc. , j3j5:2149 (1963)), Houghten et al., (Proc. Nati . Acad. Sci . USA, J2:5132 (1985)) y Stewart and Young (Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984)). Tales polipéptidos se pueden sintetizar con o sin una metionina en la parte amino terminal. Los polipéptidos CRP1 o B7RP1 sintetizados químicamente o sus fragmentos se pueden oxidar utilizando métodos que se establecen en estas referencias para formar puentes disulfuro. Los polipéptidos CRP1 o B7RP1 o fragmentos se espera que tengan actividad biológica comparable con los polipéptidos CRP1 o B7RP1 producidos de manera recombinante o purificados de fuentes naturales, y por lo tanto se pueden utilizar intercambiablemente con el polipéptido CRP1 o B7RP1 recombinante o natural .

POLIPEPTIDOS El término "polipéptido CRP1 o B7RP1" se refiere a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la figura ÍA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2), la figura 2A (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 7) O la figura 3A (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 12) y todos los polipéptidos relacionados que se describen aquí. Los polipéptidos relacionados incluyen variantes alélicas, variantes de corte y empalme, fragmentos, derivados, variantes por sustitución, supresión e inserción, polipéptidos de fusión y ortólogos. Los polipéptidos relacionados pueden ser polipéptidos maduros, es decir, un polipéptido que carece de un péptido señal . Un polipéptido CRP1 o B7RP1 puede o no tener la metionina amino terminal, dependiendo de la manera en que se preparó . El término "fragmento de polipéptido CRP1 o B7RP1" se refiere a un péptido o polipéptido que es menor que la secuencia de aminoácidos de longitud completa de un polipéptido CRP1 o B7RP1 como se establece en la figura 1A (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2), la figura 2A (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 7) o la figura 3A (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 12) . Tal fragmento puede resultar de la forma truncada en la parte amino terminal , forma truncada en la parte carboxi terminal o una supresión interna a la secuencia polipeptídica. Tales fragmentos de polipéptidos CRP1 o B7RP1 se pueden preparar con o sin la metionina amino terminal. Además, los fragmentos de polipéptidos CRP1 o B7RP1 pueden ser variantes de corte y empalme que se presenten de manera natural, otras variantes de corte y empalme y fragmentos que resultan de actividad de proteasa in vivo que se presenta de manera natural . Los fragmentos polipeptídicos CRP1 o B7RP1 preferidos incluyen formas solubles de CRP1 o B7RP1 las cuales carecen de un dominio transmem ranal funcional y comprenden parte de la totalidad del dominio extracelular de CRP1 o B7RP1. El término "variantes del polipéptido CRP1 o B7RP1" se refiere a polipéptidos CRP1 o B7RP1 cuyas secuencias de aminoácidos contienen una o más sustituciones, supresiones o adiciones de secuencia de aminoácidos en comparación con los polipéptidos CRPl o B7RP1 en las secuencias de aminoácidos que se establecen en la figura ÍA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2), la figura 2A (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 7) o figura 3A (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 12) . Tales variantes de polipéptidos CRP1 o B7RP1 se pueden preparar a partir de las variantes de moléculas de ácido nucleico de los polipéptidos CRP1 o B7RP1 correspondientes, las cuales tienen una secuencia de ADN que varía en consecuencia a partir de las secuencias de ADN para los polipéptidos CRP1 o B7RP1. Como se utiliza en la presente, el término "derivados de polipéptido CRP1 o B7RP1" se refiere a polipéptidos de CRP1 o B7RP1, variantes o fragmentos de los mismos que han sido modificados químicamente, como por ejemplo por adición de uno o más polímeros solubles en agua, carbohidratos N enlazados u 0 enlazados, azúcares, fosfatos u otras moléculas similares, en donde la molécula o moléculas no se unen naturalmente a los polipéptidos CRPl o B7RP1 de tipo silvestre. Los derivados incluyen además la supresión de uno o más grupos químicos unidos naturalmente al polipéptido CRP1 o B7RP1. Como se utiliza en la presente, los términos "polipéptidos CRP1 o B7RP1 biológicamente activos", "fragmentos polipeptídicos de CRP1 o B7RP1 biológicamente activos", "variantes del polipéptido de CRP1 o B7RP1 biológicamente activas" y "derivados de polipéptido CRP1 o B7RP1 biológicamente activos", se refiere a polipéptidos CRP1 o B7RP1 que tienen por lo menos una de las actividades características de CRP1 o B7RP1. Una actividad es la unión de B7RP1 a CRPl. Otra actividad es la capacidad de CRP1 o B7RP1 para estimular la proliferación o activación de células T. El término "ortólogo" se refiere a un polipéptido que corresponde a un polipéptido identificado de una especie. Por ejemplo, los polipéptidos B7RP1 de ratón y de humano se consideran ortólogos. El término "secuencia madura de aminoácidos" se refiere a un polipéptido que carece de una secuencia líder.

El término "polipéptido aislado" se refiere a un polipéptido que está libre de por lo menos un polipéptido contaminante que se encuentra en su ambiente natural , y preferiblemente de manera sustancialmente libre de cualquier otro polipéptido contaminante de mamífero. El término "identidad" como se conoce en la técnica, es una relación entre las secuencias de dos o más moléculas de ácido nucleico o dos o más polipéptidos, determinados al comparar las secuencias. En la técnica "identidad" también significa el grado de relación de secuencia entre el polipéptido o secuencia de molécula de ácido nucleico según sea el caso, determinado por la coincidencia o pareamiento entre cadenas de secuencias de nucleótidos o de aminoácidos. "Identidad" mide el por ciento de coincidencias idénticas entre dos o más secuencias con alineaciones de separación dirigidas por programa de computadora particulares (es decir, "algoritmos" ) . El término "similitud" se refiere a un concepto relacionado, pero en contraste con "identidad" una medida de similitud incluye coincidencias idénticas y coincidencias en sustituciones conservadoras . Puesto que las sustituciones conservadoras se aplican a polipéptidos y no a moléculas de ácido nucleico, la similitud únicamente se relaciona con comparaciones de secuencias polipeptídicas . Si dos secuencias polipeptídicas tienen, por ejemplo, 10/20 aminoácidos idénticos y el resto son sustituciones no conservadoras, entonces el por ciento de identidad y de similitud sería de 50%. En el mismo ejemplo, existen 5 posiciones más en donde existen sustituciones conservadoras, entonces el por ciento de identidad permanece en 50%, pero el por ciento de similitud podría ser de 75% (15/20) . Por lo tanto, en casos en donde existen sustituciones conservadoras, el grado de similitud entre dos secuencias polipeptídicas será mayor que el por ciento de identidad entre estas dos secuencias . Las sustituciones "conservadoras" de aminoácidos se describen aquí en lo siguiente con referencia a la tabla I. En base en la tabla I, las sustituciones conservadoras de aminoácidos son aminoácidos alternativos que se seleccionan del mismo agrupamiento, por ejemplo básico, ácido, polar no cargado y no polar. Por ejemplo, las sustituciones conservadoras de aminoácidos para arginina podrían ser lisina e histidina. La identidad y similitud se pueden calcular fácilmente por métodos conocidos que incluyen, pero que no se limitan los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Blocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1 , Griffin, A.M. , and Griffin, H.G.,. eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math . , 48:1073 (1988). Los métodos preferidos para determinar identidad o similitud se diseñan para proporcionar la coincidencia más grande entre las secuencias que se prueban. Los métodos para determinar identidad y similitud se codifican en programas de computadora disponibles públicamente. Los métodos de programa de computadora preferidos para determinar identidad y similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan al paquete de programa GCG, que incluye GAP (Devereux, J., et al . , Nucleic Acids Research 12:(1):387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wl) , BLASTP, BLASTN, and FASTA (Astchul, S.F. et al., J". Molec . Biol . 215:403-410 (1990) . El programa BLAST-X está disponible públicamente del National Center for Biotechnology information (NCBI) y de otras fuentes (BLAST, Manual , Altschul, S., et al. NCB NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., ". Mol . Biol . 215:403-410 (1990) . El algoritmo bien conocido de Smith Waterman también se puede utilizar para determinar identidad.

A modo de ejemplo, utilizando el algoritmo de computadora GAO (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wl) , dos polipéptidos para los cuales se va a determinar el por ciento de identidad de secuencias se alinean para coincidencia óptima de sus aminoácidos respectivos (el "alcance coincidente" determinado por el algoritmo") . Una penalidad de abertura de separación (la cual se calcula como 3 X en la diagonal promedio; la "diagonal promedio" es el promedio de la diagonal de la matriz de comparación que se utiliza; la "diagonal" es la calificación del número asignado a cada coincidencia perfecta de aminoácido por la matriz de comparación particular) y una penalidad de extensión de separación (la cual habitualmente es 1/10 veces la penalidad de abertura de separación) así como una matriz de comparación tal como PAM 250 o BLOSUM 62 son las que se utilizan junto con el algoritmo. Una matriz de comparación estándar (véase Dayhoff et al., en: Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp. 3 (1978) para la matriz de comparación PAM250, véase Henikoff et al., Proc. Nati . Acad. Sci USA, 89.10915-10919 (1992) para BLOSUM 62 de matriz de comparación) también se utiliza por el algoritmo. Los parámetros preferidos para comparación de secuencia de polipéptidos incluyen los siguientes: Algoritmo: Needleman and Wunsch, J. Mol . Biol . 48:443-453 (1970) . Matriz de comparación: BLOSUM 62 de Henikoff and Henikoff, Proc. Nati, Acad. SCi . USA £¿: 10915-10919 (1992) Penalidad de separación: 12 Penalidad de longitud de separación: 4 Umbral de similitud: 0 El programa GAP es útil con los parámetros anteriores. Los parámetros mencionados antes son los parámetros implícitos para comparaciones de polipéptidos (además de carencia de penalidad para las separaciones de extremo) utilizando el algoritmo GAP. Los parámetros preferidos para separación de secuencia de moléculas de ácido nucleico incluyen lo siguiente: Algoritmo: Needleman and Wunsch, J". Mol . Biol . 4¿:443-453 (1970) . Matriz de comparación: coincidencia = +10, mala coincidencia = 0 Penalidad de separación: 50 Penalidad de longitud de separación: 3 El programa GAP también es útil con los parámetros anteriores . Los parámetros mencionados antes son los parámetros implícitos para comparaciones de moléculas de ácido nucleico. Otros algoritmos ejemplares, penalidades y abertura de separación, penalidades de extensión de separación, matrices de comparación, umbrales de similitud, etc., se pueden utilizar por aquellos expertos en la técnica que incluyen aquellos establecidos en el Program Manual, Wisconsin Package, Versión 9, septiembre de 1997. Las elecciones particulares dependerán de la comparación específica que se realice, tal como ADN a ADN, proteína a proteína, proteína a ADN; y adicionalmente, si la comparación es entre pares de secuencias (en cuyo caso se prefieren generalmente GAP o bestFit) o entre una secuencia y una base de datos grande de secuencias (en cuyo caso se prefieren FASTA o BLASTA) . Los polipéptidos que son por lo menos aproximadamente 70% idénticos típicamente tendrán una o más sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos en comparación con el polipéptido CRP1 o B7RP1 tipo silvestre. En la modalidad preferida, los polipéptidos tendrán aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad con los polipéptidos CRP1 o B7RP1. Habitualmente, las sustituciones del residuo nativo serán por alanina, o un aminoácido conservador de manera que tenga poco o nulo efecto en la carga neta, polaridad o hidrofobicidad total del polipéptido. Las sustituciones conservadoras se establecen en la tabla 1 siguiente.

Tabla 1 Sustituciones de aminoácidos conservadores Básico: argmma lisina histidina Acido ácido glutámico ácido aspártico Polar sin carga: glutamina asparagina serina treonina tirosina No polar: fenilalanina triptófano cisteína glicina alanina valina prolina metionina leucina norleucina isoleucina Los derivados del polipéptido CRP1 o B7RP1 se proporcionan por la invención. En una modalidad, las composiciones de polipéptido CRP1 o B7RP1 modificadas químicamente, en las cuales los polipéptidos CRP1 o B7RP1 están unidos a un polímero se incluyen dentro del alcance de la presente invención. El polímero seleccionado típicamente es soluble en agua de manera que la proteína a la cual se une no precipita en un ambiente acuoso, tal como un ambiente fisiológico. El polímero seleccionado habitualmente se modifica para tener un grupo reactivo único, tal como un éster activo para acilación o un aldehido para alquilación, de manera que el grado de polimerización se puede controlar como se proporcione en los presentes métodos. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede estar ramificado o sin ramificar. Se incluyen dentro del alcance de la invención una mezcla de polímeros. Preferiblemente, para uso terapéutico de la preparación de producto final, el polímero será farmacéuticamente aceptable. El polímero soluble en agua o una mezcla del mismo se puede seleccionar del grupo que consiste, por ejemplo, de polietilenglicol (PEG) , monometoxipolietilenglicol, dextrano, celulosa, u otros polímeros basados en carbohidrato, poli- (N-vinilpirrolidona) , polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, un copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo glicerol) y alcohol polivinílico.

Para las reacciones de acilación, el o los polímeros seleccionados pueden tener un grupo éster reactivo único. Para alquilación reductiva, los polímeros seleccionados pueden tener un grupo aldehido reactivo único. Un aldehido reactivo preferido es propionaldehído polietilenglicol, el cual es estable en agua o derivados mono alcoxi o ariloxi de 1 a 10 átomos de carbono de los mismos (véase la patente de los Estados Unidos Número 5,252,714). La pegilación de los polipéptidos CRPl o B7RP1 se puede llevar a cabo por cualquiera de las reacciones de pegilación conocidas en la técnica como se describe, por ejemplo en las siguientes referencias: Focus on Growth Factors 1:4-10 (1992); y en EP 0 154 316 y EP 0 401 384. Preferiblemente, la pegilación se lleva a cabo vía una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula reactiva de polietilenglicol (o un polímero soluble en agua reactivo análogo) como se describe en lo siguiente. Un polímero soluble en agua particularmente preferido para uso en la presente es polietilenglicol, abreviado PEG. Como se utiliza en la presente, polietilenglicol significa abarcar cualquiera de las formas de PEG que se han utilizado para derivatizar otras proteínas, tales como mono-alcoxi (de 1 a 10 átomos de carbono) o ariloxi-polietilenglicol . En general, la derivatización química se puede llevar a cabo bajo cualquier condición adecuada utilizada para hacer reaccionar una sustancia biológicamente activa con una molécula de polímero activada. Los métodos para preparar polipéptidos CRP1 o B7RP1 pegilados en general comprenderán las etapas de (a) hacer reaccionar el polipéptido con polietilenglicol (tal como un éster reactivo o derivado de aldehido de PEG) bajo condiciones en las cuales el polipéptido CRP1 o B7RP1 se une a uno o más grupos PEG, y (b) obtener los productos de reacción. En general, las condiciones de reacción óptimas para las reacciones de acilación se determinarán en base en parámetros conocidos y el resultado deseado. Por ejemplo, cuanto más grande sea la relación de PEG:proteína mayor será el porcentaje de producto polipegilado. Generalmente, las condiciones las cuales pueden regular o modular la administración de conjugados de polímero CRP1 o B7RP1 incluyen aquellas descritas en la presente para polipéptidos CRP1 o B7RP1 no conjugados. Sin embargo, el conjugado que se describe aquí puede tener actividades adicionales, actividad biológica aumentada o reducida u otras características tales como vida media aumentada o disminuida en comparación con las moléculas no derivatizadas . Los polipéptidos, fragmentos, variantes o derivados de CRP1 o B7RP1 se pueden utilizar solos, juntos o en combinación con otras composiciones farmacéuticas. Los polipéptidos, fragmentos, variantes y derivados de CRP1 o B7RP1 se pueden utilizar en combinación con citocinas, factores de crecimiento, antibióticos, antiinflamatorios o agentes quimioterapéuticos según sea apropiado para la indicación de que se trate. La invención proporciona agentes de unión selectivos de CRP1 o B7RP1. Un agente de unión selectivo se refiere a una molécula que tiene especifidad por CRP1 o B7RP1 y que puede incluir una proteína, péptido, ácido nucleico, carbohidrato, lípido o compuesto de peso molecular pequeño. Un agente de unión selectivo interactúa ya sea con CRP1 o B7RP1 y a su vez regula la unión de CRP1 o B7RP1. En una modalidad, un agente de unión selectivo bloquea parcial o completamente la unión de CRPl o B7RP1 e inhibe parcial o completamente por lo menos una actividad biológica de CRP-1 o B7RP-1 tal como la actividad coestimuladora inmune. En otra modalidad, el agente de unión selectivo es un anticuerpo. El anticuerpo puede ser inmuno-reactivo ya sea con CRP1 o B7RP1 y preferiblemente es inmuno-reactivo con B7RP1. En otra modalidad adicional de la invención, un anticuerpo reactivo con B7RP1 se une a un epitopo en B7RP1 de manera que la unión a CRP1 es bloqueada parcial o completamente y por lo menos una actividad biológica de B7RP1, tal como la actividad coestimuladora inmune, es inhibida parcial o completamente . El término parcialmente inhibido significa que se ha producido un nivel de inhibición por lo menos detectable. El término completamente inhibido significa que ya no se produce un incremento en la inhibición.

Los polipéptidos, fragmentos, variantes o derivados de CRP1 o B7RP1 se pueden utilizar para preparar anticuerpos utilizando métodos conocidos en la técnica. Por lo tanto, los anticuerpos que reaccionan con los polipéptidos CRP1 o B7RP1, así como los fragmentos reactivos de tales anticuerpos, también se contemplan dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos pueden ser policlonales, monoclonales, recombinantes, quiméricos, de una sola cadena o biespecíficos . Típicamente, el anticuerpo o fragmento del mismo es de origen humano o puede ser "humanizado", es decir, se prepara de manera que evita o minimiza una reacción inmune al anticuerpo cuando se administra a un paciente. El fragmento de anticuerpo puede ser cualquier fragmento que sea reactivo con los polipéptidos CRP1 y B7RP1 de la presente invención, tales como Fab, Fab', etc . También se proporciona por esta invención los hibridomas generados al presentar cualquier polipéptido CRP1 o B7RP1 o fragmentos de los mismos como un antígeno a un mamífero seleccionado, seguido por células de fusión (por ejemplo células del bazo) del mamífero con ciertas células cancerosas para crear líneas de células inmortalizadas por técnicas conocidas. Los métodos utilizados para generar tales líneas de células de anticuerpos dirigidos contra la totalidad o porciones de un polipéptido CRP1 o B7RP1 humano de la presente invención también están abarcados por esta invención.

Los anticuerpos monoclonales de la invención incluyen anticuerpos "quiméricos" en los cuales una porción de la cadena pesada o ligera es idéntica u homologa a una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de las cadenas son idénticas u homologas a la secuencia correspondiente en los anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de tales anticuerpos en la medida en que muestren la actividad biológica deseada (patente de los Estados Unidos Número 4,816,567; Morrison, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. £1. 6851-6855 (1985)). En una modalidad preferida, el anticuerpo quimérico contra CRP1 o B7RP1 es un anticuerpo "humanizado" . Los métodos para inmunizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos aminoácidos introducidos en el mismo de una fuente la cual es no humana. La humanización se puede llevar a cabo siguiendo los métodos conocidos en la técnica (Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Riechmann, et al . , Nature 332, 323-327 (1988); Verhoeyen, et al . , Science 219, 1534-1536 (1988)), al sustituir regiones de erminadoras de complementariedad de roedor (CDR) por las regiones correspondientes de un anticuerpo humano .

También se abarcan por la invención anticuerpos contra CRP1 o contra B7RP1 completamente humanos . Tales anticuerpos se pueden producir por inmunización con un antígeno CRP1 o B7RP1 de animales transgénicos (por ejemplo ratones) que son capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de inmunoglobulina. Véase, por ejemplo, Jakobovits, et al., Proc,. Nati. Acad. Sci. 90 , 2551-2555 (1993); Jakobovits, et al., Nature 362, 255-258 (1993) . También se pueden producir anticuerpos humanos mediante bibliotecas de exhibición de fago (Hoogenboom, et al . , J. Mol. Biol. 227, 381 (1991); Marks , et al., J. Mol. Biol. 222. 581 (1991) . Los agentes de unión selectivos de la invención se pueden utilizar para regular la unión de CRP1 a B7RP1 y regular por lo menos una actividad biológica mediada por CRP1 y B7RP1 tal como la coestimulación inmune. Un ejemplo de tales agentes de unión selectivos son anticuerpos inmuno-reactivos ya sea con CRP1 o B7RP1. Los anticuerpos se pueden utilizar terapéuticamente, en la medida que inhiban la unión del polipéptido CRP1 y B7RP1 a su asociado de unión. Los anticuerpos se pueden utilizar además para propósitos de diagnóstico in vivo e in vi tro, por ejemplo en forma marcada para detectar la presencia del polipéptido CRP1 y B7RP1 en un fluido corporal o una muestra celular.

COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Y ADMINISTRACIÓN Las composiciones farmacéuticas de los polipéptidos CRP1 o B7RP1 están dentro del alcance de la presente invención. Tales composiciones pueden comprender una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido o fragmentos, variantes o derivados en mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable. En modalidades preferidas, las composiciones farmacéuticas comprenden polipéptidos CRP1 o B7RP1 como formas solubles las cuales comprenden parte o la totalidad de un dominio extracelular de CRP1 o B7RP1. Típicamente, un compuesto terapéutico del polipéptido CRP1 y B7RP1 se administrará en forma de una composición que comprende un polipéptido, fragmento, variante o derivado purificado junto con uno o más portadores, excipientes o diluyentes fisiológicamente aceptables . El material portador puede ser agua para inyección, suplementada preferiblemente con otros materiales comunes en soluciones para administración a mamíferos. Solución salina amortiguada neutra o solución salina mezclada con albúmina sérica son portadores apropiados ejemplares. Preferiblemente, el producto se formula como un liofilizado utilizando excipientes apropiados (por ejemplo sacarosa) . Se pueden incluir según se desee otros portadores, diluyentes y excipientes convencionales o estándar. Otras composiciones ejemplares comprenden amortiguador Tris de aproximadamente pH 7.0-8.5, o amortiguador de acetato de aproximadamente pH 4.0-5.5 el cual puede incluir además sorbitol o un sustituto adecuado para el mismo. Las composiciones farmacéuticas de CRPl o B7RP1 se pueden administrar por vía parenteral. Alternativamente, las composiciones se pueden administrar por vía intravenosa o subcutánea. Cuando se administra sistémicamente, las composiciones terapéuticas para uso en esta invención pueden estar en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable libre de pirógenos. La preparación de tales soluciones proteínicas farmacéuticamente aceptables, al considerar el pH, isotonicidad, estabilidad y similares, están dentro de la habilidad de la técnica. Las formulaciones terapéuticas de las composiciones de polipéptido CRPl y B7RP1 útiles para llevar a la práctica la presente invención se pueden preparar por almacenamiento al mezclar la composición seleccionada que tiene el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizantes fisiológicamente aceptables opcionales (Remington ' s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company (1990)) en forma de una torta liofilizada o una solución acuosa. Los portadores, excipientes o estabilizantes aceptables son no tóxicos en los receptores y preferiblemente son inertes a las dosificaciones y concentraciones utilizadas e incluyen amortiguadores tales como fosfato, citrato u otros ácidos orgánicos; antioxidantes tales como ácido ascórbico; polipéptidos de peso molecular bajo; proteínas tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos u otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa o dextrina; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; o tensoactivos no iónicos tales como Tween, Pluronics o polietilenglicol (PEG) . Una cantidad efectiva de una composición o composiciones polipeptídicas de CRP1 o B7RP1 para ser utilizadas terapéuticamente dependerán, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos tales como la indicación para la cual se va a utilizar el polipéptido CRP1 y B7RP1, la vía de administración y la condición del paciente. En consecuencia, será necesario que el médico titule la dosificación y modifique la vía de administración según se requiera para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosificación diaria típica puede variar desde aproximadamente 0.1 µg/kg hasta 100 mg/kg o más, en base en los factores mencionados antes. Típicamente, un médico administrará la composición hasta que se alcance una dosificación que proporcione el efecto deseado. Por lo tanto, - 1? -la composición se puede administrar como una dosis única o como dos o más dosis (las cuales pueden o no contener la misma cantidad de un polipéptido CRP1 o B7RP1) con respecto al tiempo, o como una infusión continua vía un dispositivo de implantación o catéter. Conforme se llevan a cabo estudios adicionales, la información surgirá respecto a los niveles de dosificación apropiados para el tratamiento de diversas condiciones en diversos pacientes y una persona habitualmente experta en la técnica, considerando el contexto terapéutico, el tipo de desorden bajo tratamiento, la edad y salud general del receptor, será capaz de determinar la dosificación apropiada. La composición de polipéptido CRP1 o B7RP1 que se va a utilizar para administración in vivo debe ser estéril . Esto se lleva a cabo fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estéril. Cuando la composición está liofilizada, se puede llevar a cabo la esterilización utilizando estos métodos ya sea antes de, o después de la liofilización y reconstitución. La composición para administración parenteral habitualmente se almacenará en forma liofilizada o en solución. Las composiciones terapéuticas generalmente se colocan dentro de un recipiente que tiene un orificio de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un frasco que tiene un tapón que se puede perforar por una aguja para inyección hipodérmica.

La vía de administración de la composición está de acuerdo con los métodos conocidos y puede ser por ejemplo por inyección o infusión oral o bien por infusión intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (dentro del parénquima) , intracerebroventricular , intramuscular, intraocula intraarterial o vía intralesional, o por sistemas de liberación sostenida o un dispositivo de implantación el cual puede involucrar opcionalmente el uso de un catéter. Cuando se desea, las composiciones se pueden administrar continuamente por infusión, inyección en bolo o por un dispositivo de implantación. De manera alternativa o adicional, la composición se puede administrar localmente vía implantación dentro del área afectada de una membrana, esponja u otro material apropiado sobre el cual se ha absorbido el polipéptido CRP1 y B7RP1. Cuando se utiliza un dispositivo de implantación, el dispositivo se puede implantar dentro de cualquier tejido u órgano adecuado y se puede llevar a cabo el suministro del polipéptido CRP1 o B7RP1 directamente a través del dispositivo vía bolo, o vía administración continua, o vía un catéter utilizando infusión continua. Se puede administrar un polipéptido CRP1 o B7RP1 en una formulación de liberación sostenida o una preparación. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices de polímero semipermeables en forma de artículos conformados, por ejemplo películas o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles, polilactidas (documento de los Estados Unidos 3,773,919, documento EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de gamma etilo (Sidman et al. Biopoly ers 22.: 547-556 (1983)), poli (metacrilato de 2-hidroxietilo) (Langer et al., J". Biomed. Mater. Res . , 15: 167-277 (1981)] y Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)), acetato de etilenvinilo (Langer et al., supra± o ácido poli-D(-) -3-hidroxibutírico (EP 133,988). Las composiciones de liberación sostenida también pueden incluir liposomas los cuales se pueden preparar por cualquiera de los diversos métodos conocidos en la técnica (por ejemplo Eppstein et al., Proc. Nati . Acad. Sci . USA, 82:3688-3692 (1985); EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949). En algunos casos puede ser deseable utilizar las composiciones de polipéptido CRP1 o B7RP1 de una manera ex vivo . Aquí, las células, tejidos u órganos que se han removido del paciente se exponen a composiciones polipeptídicas CRP1 o B7RP1 después de lo cual las células, tejidos u órganos subsecuentemente se implantan de regreso en el paciente. En otros casos, se puede suministrar un polipéptido CRP1 o B7RP1 a través de implantación en pacientes de ciertas células que se han sometido a ingeniería genética utilizando métodos como los descritos aquí, para expresar y secretar los polipéptidos, fragmentos, variantes o derivados. Tales células pueden ser células animales o humanas y se pueden derivar del tejido propio del paciente o de otra fuente, ya sea humana o no humana. Opcionalmente, las células se pueden inmortalizar. Sin embargo, con el fin de disminuir la oportunidad de una respuesta inmunológica, se prefiere que las células se encapsulen para evitar la infiltración de los tejidos circundantes. Los materiales de encapuslación típicamente son biocompatibles, recintos poliméricos semipermeables o membranas que permiten la liberación de los productos proteínicos pero que evitan la destrucción de las células por el sistema inmune del paciente o por otros factores dañinos de los tejidos circundantes . Los métodos utilizados para encapsulación en membranas de las células son familiares para aquellos expertos en la técnica y la preparación de células encapsuladas y su implantación en pacientes se puede llevar a cabo sin experimentación indebida. Véanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Números 4,892,538; 5,011,472; y 5.106,627. Un sistema para encapsular células vivas se describe en PCT WO 91/10425 (Aebischer et al.). Las técnicas para formular diversos medios para liberación sostenida o controlada, tales como portadores de liposomas, partículas bioeosionables o esferas, también son conocidos por aquellos expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos Número 5,653,975. Las células, con o sin encapsulación, se pueden implantar dentro de tejidos u órganos corporales adecuados del paciente . Como se discute en lo anterior, puede ser deseable tratar preparaciones de células con uno o más polipéptidos, variantes derivados o fragmentos de CRP1 o B7RP1. Esto se puede llevar a cabo al exponer, por ejemplo, células que comprenden células T, tales como células de médula ósea, al polipéptido, variante, derivado o fragmento, directamente, en donde está en forma que es permeable a la membrana celular. Por ejemplo, las células que comprenden células T se pueden exponer a un polipéptido B7RP1 con el fin de activar la función de células T y las células tratadas de esta manera se implantan en el paciente . De manera alternativa, se puede utilizar la terapia de genes. Una manera en la cual se puede aplicar la terapia de genes es utilizar un gen para CRP1 o B7RP1 (ya sea ADN genómico, ADNc o ADN sintético que codifica para un polipéptido CRPl o B7RP1, o un fragmento, variante o derivado del mismo) el cual se puede enlazar operablemente a ' un promotor constitutivo o inducible para formar un "constructo de ADN de terapia de gen" . El promotor puede ser homólogo o heterólogo al gen endógeno para CRP1 o B7RP1, con la condición de que sea activo en la célula o tipo de tejido dentro del cual se va a insertar la construcción. Otros componentes de la construcción de A N de terapia de gen pueden incluir opcionalmente, según se requiera, moléculas de ADN diseñadas para integración específica de sitio (por ejemplo secuencias flanqueantes endógenas útiles para recombinación homologa) , promotor específico de tejido, mejoradores o silenciadores, moléculas de ADN capaces de proporcionar una ventaja selectiva sobre la célula parental, moléculas de ADN útiles como etiquetas para identificar células transformadas, sistemas de selección negativa, agentes de unión específicos de célula (tales como, por ejemplo, direccionamiento de células) , factores de internalización específicos de célula y factores de transcripción para mejorar la expresión por un vector así como factores para permitir la manufactura del vector. Esta construcción de ADN de terapia de genes después se puede introducir dentro de las células del paciente (ya sea ex vivo o in vivo) . Un medio para introducir la construcción de ADN de terapia de gen es vía vectores virales . Los vectores virales adecuados típicamente utilizados en terapias de genes par suministro de las construcciones de ADN de terapia de gen incluyen, sin limitación, adenovirus, virus adenoasociado, virus de herpes simplex, lentivirus, virus de papiloma y vectores retrovirales. Algunos de estos vectores, tales como los vectores retrovirales, suministrarán la construcción de ADN de terapia de gen al ADN cromosómico de las células del paciente y la construcción de ADN de terapia de gen se puede integrar en el ADN cromosómico; otros vectores funcionarán como episomas y la construcción de ADN de terapia de gen permanecerá en el citoplasma. El uso de vectores de terapia de gen se describe por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos Números 5,672,344, 5,399,346. Un medio alternativo para suministrar construcciones de ADN de terapia de gen a las células de un paciente sin el uso de vectores virales incluye, sin limitación, transferencia mediada por liposomas, inyección directa de ADN desnudo, transferencia mediada por receptor (complejo ligando-ADN) , electroporación, precipitación con fosfato de calcio y bombardeo con micropartículas (por ejemplo, "pistola de genes") . Véanse la patente de los Estados Unidos 4,970,154, y los documentos WO 96/40958, 5.679,559, 5,676,954 y 5,593,875. Otro medio para incrementar la expresión endógena del polipéptido CRP1 o B7RP1 en una célula vía terapia de gen es insertar uno o más elementos alargadores dentro del promotor para el polipéptido CRP1 o B7RP1, en donde el o los elementos alargadores pueden servir para incrementar la actividad transcripcional de un gen para el polipéptido CRP1 o B7RP1. El o los elementos alargadores utilizados se seleccionarán en base en el tejido en el cual uno desea activar el o los genes,- los elementos alargadores que se sabe confieren activación de promotor en este tejido se seleccionarán. Por ejemplo, si se va a "activar" un polipéptido CRP1 o B7RP1 en células T, se puede utilizar el elemento alargador promotor Ick . Aquí, la porción funcional del elemento transcripcional que se va a agregar puede insertarse en un fragmento de ADN que contiene un promotor para el polipéptido CRP1 o B7RP1 (y opcionalmente, el vector, la secuencia flanqueante 5' o 3' o ambas, etc.), utilizando técnicas de clonación estándar o convencionales . Esta construcción, conocida como "construcción de recombinación homologa" después se puede introducir en las células deseadas ya sea ex vivo o in vivo . Se puede utilizar la terapia de genes para disminuir la expresión del polipéptido CRP1 o B7RP1 al modificar la secuencia de nucleótidos del promotor o promotores endógenos . Tal modificación típicamente se lleva a cabo vía métodos de recombinación homologa. Por ejemplo, una molécula de ADN que contiene la totalidad o una porción del promotor de un gen o genes CRP1 o B7RP1 que se seleccionan para inactivación se pueden someter a ingeniería para remover o sustituir piezas del promotor que regulen la transcripción. Aquí, la caja TATA o el sitio de unión de un activador transcripcional del promotor se pueden suprimir utilizando técnicas de biología molecular convencional o estándar; tal supresión puede inhibir la actividad del promotor por lo que reprime la transcripción del gen para CRP1 o B7RP1 correspondiente. La supresión de la caja TATA o el sitio de unión de activador de transcripción en el promotor se puede llevar a cabo al generar una construcción de ADN que comprende la totalidad o la porción relacionada de uno o varios promotores para el polipéptido CRP1 o B7RP1 (de la misma especie o de especies relacionadas como un gen o genes para CRP1 o B7RP1 que van a ser regulados) en el cual uno o más de la caja TATA o de los nucleótidos del sitio de unión activadores transcripcionales se mutan vía sustitución, supresión o inserción de uno o más nucleótidos de manera que la caja TATA o el sitio de unión de activador tienen actividad disminuida o se vuelven completamente inactivos. Esta construcción, la cual típicamente contiene además por lo menos aproximadamente 500 bases de ADN que corresponden a las regiones nativas (endógena) y flanqueante 5' y 3' del segmento promotor que ha sido modificado, se pueden introducir en las células apropiadas (ya sea ex vivo o in vivo) ya sea directamente o vía un vector viral como se describe antes . Típicamente, la integración de la construcción en el ADN genómico de las células será vía recombinación homologa, en donde las secuencias de ADN flanqueantes 5 ' y 3 ' en la construcción del promotor pueden servir para ayudar a integrar la región promotora modificada vía hibridación al ADN cromosómico endógeno .

También se pueden utilizar otros métodos de terapia de genes en donde sea deseable inhibir uno o más polipéptidos CRP1 o B7RP1. Por ejemplo, las moléculas de ADN antisentido o de ARN las cuales tienen una secuencia que ee complementaria a por lo menos una porción de un gen o genes para el polipéptido CRP1 o B7RP1 seleccionados se pueden introducir en la célula. Típicamente, cada una de tales moléculas antisentido será complementaria al sitio de inicio (extremo 5') de cada uno de loe genee para CRP1 o B7RP1 eeleccionadoe . Cuando la molécula antisentido despuée hibridiza al ARNm polipeptídico para CRP1 o B7RP1 correspondiente, se evita la traducción de este ARNm. De manera alternativa, se puede utilizar la terapia de genes para crear un inhibidor negativo dominante de uno o más polipéptidos CRP1 o B7RP1. En esta situación, el ADN que codifica para un polipéptido de longitud completa o truncado mutante de cada uno de los polipéptidos CRP1 o B7RP1 seleccionados se puede preparar e introducir dentro de las células de un paciente utilizando métodos virales o no virales como se describe en lo anterior. Cada uno de tales mutantes típicamente se diseña para competir con el polipéptido endógeno en su papel biológico.

Agonistas y antagonistas La invención también proporciona agonistas y antagonistas de CRP1 o B7RP1 los cuales regulan la actividad de cualquiera o de ambas moléculas. Los agonistae y antagonietas se pueden identificar a partir de moléculas de prueba las cuales alteran la unión de B7RP1 a CRPl. El término "moléculas de prueba" se refiere a moléculas que están bajo evaluación para determinar su capacidad para unirse a un polipéptido CRP1 o B7CRP1 y por lo tanto alteran la unión de B7RP1 a CRPl. Preferiblemente, la molécula de prueba se unirá con una constante de afinidad de por lo menos aproximadamente 106 M. Se pueden utilizar diversos ensayos para medir la unión de B7RP1 a CRPl. Estos ensayos se pueden utilizar para examinar moléculas de prueba para determinar su capacidad para incrementar o disminuir la velocidad o grado de unión de B7RP1 a CRPl. En un tipo de ensayo, un polipéptido CRP1, preferiblemente una forma soluble de CRPl tal como un dominio extracelular, se inmoviliza por unión al fondo de los pozos de una placa de microtitulación. Después se pueden agregar B7RP1 radiomarcado y la molécula o moléculas de prueba ya sea una a la vez (en cualquier orden) o bien simultáneamente a los pozos. Después de incubación, los pozos se pueden lavar y se realiza una cuenta utilizando contador de centelleo para determinar radioactividad y determinar el grado de unión de la proteína CRP1 por B7RP1. Típicamente, las moléculas se probarán en un intervalo de concentraciones, y una serie de pozos de control que carecen de uno o más elementos de los ensayos de prueba se pueden utilizar para determinar la precisión en la evaluación de los resultados. Una alternativa a este método involucra invertir las "posiciones" de las proteínas, es decir, inmovilizar B7RP1 a los pozos de placa de microtitulación, incubar con la molécula de prueba y CRP1 radiomarcado y determinar el grado de unión de CRP1 (véase, por ejemplo, capítulo 18 de Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al . , eds., John Wiley & Sons, New York, NY [1995]). Como una alternativa al radiomarcado, se puede conjugar CRP1 o B7RP1 a biotina, y en presencia de proteína biotinada después se puede detectar utilizando estreptavidina unida a una enzima, tal como peroxidasa de rábano [HRP] o fosfatasa alcalina [AP] , lo cual se pude detectar colorimétricamente o bien por etiquetado fluorescente de estreptavidina. Un anticuerpo detectado a CRP1 o B7RP1 que se conjuga a biotina también se puede utilizar y se puede detectar después de la incubación con estreptavidina unida a enzima, unida a AP o HRP. También se pueden inmovilizar CRP1 y B7RP1 por unión a esferas de agarosa, esferas acrílicas u otros tipos de tales sustratos inertes. El complejo sustrato-proteína se puede colocar en una solución que contenga la proteína complementaria y el compuesto de prueba. Después de la incubación, las esferas se pueden precipitar por centrifugación y se puede determinar la cantidad de unión entre CRP1 y B7RP1 utilizando los métodos descritos antes. De manera alternativa, el complejo sustrato-proteína se puede inmovilizar en una columna y la molécula de prueba y la proteína complementaria pasan sobre la columna. La formación de un complejo entre CRP1 y B7RP1 después se puede determinar utilizando cualquiera de las técnicas que se establecen antes, es decir, radiomarcado, unión de anticuerpos o similar. Otro tipo de ensayo in vitro que es útil para identificar una molécula de prueba la cual incrementa o disminuye la formación de un complejo CRP1/B7RP1 es un sistema detector de resonancia de plasmón de superficie tal como el sistema de ensayo Biacore (Pharmacia, Piscataway, NJ) . El sistema Biacore se puede llevar a cabo utilizando el protocolo del fabricante. Este ensayo involucra esencialmente la unión covalente ya sea de CRP1 o B7RP1 a un chip sensor recubierto con dextrano que se localiza en un detector. El compuesto de prueba y la otra proteína complementaria después se pueden inyectar dentro de la cámara que contiene el chip sensor ya sea simultánea o secuencialmente y se puede determinar la cantidad de proteína complementaria que se une, en base en el cambio en la masa molecular la cual se asocia físicamente con el lado recubierto con dextrano del chip sensor; el cambio en la masa molecular se puede medir por el sistema detector. En algunos casos, puede ser deseable evaluar dos o más compuestos de prueba juntos para uso en la formación en aumento o disminución de un complejo CRP1/B7RP1. En estos casos, se pueden modificar fácilmente los ensayos que se establecen en lo anterior al agregar tales compuestos de prueba adicionales, simultáneamente o bien, de manera subsecuente al primer compuesto de prueba. El resto de las etapas en el ensayo son como se establecen antes. Se pueden utilizar ventajosamente los ensayos in vitro tales como los descritos antes, para examinar rápidamente números grandes de compuestos para efectos en la formación de complejos por CRP1 y B7RP1. Los ensayos se pueden automatizar para examinar compuestos generados en exhibición de fagos, péptido sintético sin bibliotecas de síntesis química. Los compuestos los cuales incrementan o disminuyen la formación de complejo de CRP1 y B7RP1 también se pueden examinar en cultivo celular utilizando células y líneas de células que expresan cualquiera de los polipéptidos. Las células y líneas de células se pueden obtener de cualquier mamífero, pero preferiblemente serán de fuentes humanas o de otro primate, canina o de roedor. La unión de B7RP1 a células que expresan CRP1 en la superficie se evalúa en presencia o ausencia de moléculas de prueba y se puede determinar el grado de unión, por ejemplo, por citometría de flujo utilizando un anticuerpo biotinado a B7RP1. Los ensayos de cultivo de células se pueden utilizar ventajosamente para evaluar adicionalmente compuestos que presentan una calificación positiva en los ensayos de unión de proteína descritos antes.

Usos terapéuticos Los polipéptidos de la invención y los agonistas y antagonistas de los mismos se pueden utilizar para regular la función de células T. Los agonistas y antagonistas incluyen aquéllas moléculas las cuales regulan la actividad de CRP1, B7RP1 o ambas y que incrementan o disminuyen por lo menos una actividad de una proteína CRP1 o B7RP1 tales como una actividad asociada con las funciones de células T, por ejemplo activación de células T. Los agonistas o antagonistas pueden ser cofactores, tales como una proteína, péptido, carbohidrato, lípido o molécula de peso molecular pequeño, la cual interactúa ya sea con CRP1 o B7RP1 y de esta manera regula su actividad. Los agonistas o antagonistas potenciales de polipéptido incluyen anticuerpos que reaccionan ya sea con formas solubles o unidas a membrana de CRP1 o B7RP1 las cuales comprenden parte o la totalidad de los dominios extracelular de tales proteínas. Las moléculas que regulan la expresión de CRP1 o B7RP1 típicamente incluyen ácidos nucleicos que codifican para la proteína CRP1 o B7RP1 y que pueden actuar como reguladores antisentido de expresión. Los polipéptidos CRP1 o B7RP1, y los agonistas o antagonistas de los mismos, se pueden utilizar en el tratamiento de enfermedades autoinmunes, supervivencia de injertos, activación de células inmunes para inhibir el crecimiento de células tumorales, enfermedades mediadas por células B dependientes de células T e inmunoterapia de genes contra el cáncer. En una modalidad, la función de los antagonistas o inhibidores de CRP1 o B7RP1, o ambos, puede ser benéfica para aliviar síntomas en enfermedades con disfunción crónica de células inmunes. Las enfermedades autoinmunes tales como lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, púrpura trombositopénica inmune (ITP) y psoriasis, se pueden tratar con antagonistas o inhibidores de CRP-1/B7RP-1. Además, las enfermedades inflamatorias crónicas tales como enfermedad de intestino inflamatorio (enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa) , la enfermedad de Grave, la tiroiditis de Hashimoto y diabetes mellitus también se pueden tratar con inhibidores para CRP-1/B7RP-1 como se describe en el Ejemplo 18, CRP-l-Fc inhibe y B7RP-1-Fc incrementa el inicio de enfermedad en un modelo en roedor de enfermedad de artritis reumatoide. Estos efectos supuestos en este modelo sustentan un papel agonista para la proteína B7RP-1-Fc y un papel antagonista para la proteína CRP-l-Fc. Los resultados también ilustran cómo se pueden regular las respuestas de células T por manipulación de esta vía y la importancia de esta vía en el progreso de artritis reumatoide. Además, como se describe en el Ejemplo 19, la expresión de B7RP-1-FC in vivo estimula un fenotipo de enfermedad de intestino inflamatorio (IBD) en ratones transgénicos . Este ejemplo sustenta el papel por B7RP-1/CRP-1 en el desarrollo de inflamación en el intestino. Por lo tanto, los antagonistas de la vía B7RP-1/CRP-1 se pueden utilizar para tratar IBD humana . Se pueden utilizar los antagonistas de CRP1 o B7RP1 como agentes inmunosupresores para médula ósea y transplante de órganos y se pueden utilizar para prolongar la supervivencia de injerto. Tales antagonistas pueden proporcionar ventajas significativas sobre el tratamiento existente. La terapia de médula ósea y transplante de órganos debe rivalizar con el rechazo mediado por células T de las células extrañas o del tejido, por el huésped. Los regímenes terapéuticos actuales para inhibir el rechazo mediado por células T involucran el tratamiento con los medicamentos ciclosporina o FK506. Aunque loe medicamentos son efectivoe, loe pacientes padecen de efectos colaterales graves que incluyen hepatotoxicidad, nefrotoxicidad y neurotoxicidad. El objetivo para la clase de ciclosporina/FK506 terapéutica es calcineurina, una fosfatasa con expresión ubicua. Puesto que la expresión de CRPl se limita a células T, los inhibidores de CRP1 o B7RP1 pueden carecer de los efectos colaterales graves que se observan con el uso de los actuales agentes inmunoterapéuticos . Se pueden utilizar antagonistas de CRP1 o B7RP1 como agentes inmunosupresores para desórdenee autoinmunee, tales como artritie reumatoide, psoriasis, esclerosie múltiple, diabetee y lupue eritematoeo eietémico. Loe antagonistas de la vía coestimuladora mediada por CRP1/B7RP1 también se pueden utilizar para aliviar el síndrome de choque tóxico, la enfermedad de intestino inflamatorio, la alosensibilización debida a transfusiones sanguíneas, enfermedades mediadas por células B dependientes de células T, y el tratamiento de la enfermedad de injerto versus huésped. Los anticuerpos, proteínas solubles que comprende por ejemplo dominios extracelular y otros reguladores de CRP1 o B7RP1 que resulten en activación prolongada o mejorada de células T, se pueden utilizar para incrementar la respuesta inmune contra tumores. El ejemplo 20 muestra que B7RP-l-Fc puede inhibir en ratones el crecimiento de células tumorales. De manera similar, B7RP-1-Fc humano, u otros activadores de la vía B7RP-1/CRP-1 se pueden utilizar para mejorar las respuestas inmunes contra tumores humanos . La actividad antitumoral generalmente se considera que tiene un fuerte componente citolítico de linfocitos T. De hecho, los efectos antitumorales de las proteínas de fusión B7-Fc (Sturmhoefel et al., Cáncer Res. 59: 4964-4972, 1999) son mediados por células T CD8+ citolíticae. Puesto que CRP-1 también se expresa en células T CD8+ citolíticas (ejemplo 9) , es probable que los efectos antitumorales demostrados en el Ejemplo 20 se deban a la acción de B7RP-1-Fc sobre células CD8+. También se puede manipular la vía de B7RP-1/CRP-1 para regular la respueeta de CTL en muchos otros ámbitos clínicos que incluyen transplante de aloinjertos, enfermedad de injerto versus huésped y enfermedades autoinmunes . La terapia de genes utilizando los genes B7RP1 de la invención se puede utilizar en inmunoterapia contra el cáncer. Los genes B7RP1 introducidos en célulae canceroeae pueden transformarlos en células presentadorae de antígeno que se pueden reconocer por células T del sistema inmune cuando se introducen nuevamente en un animal . El reconocimiento de células tumoralee tranefectadae por las células T reeulta en la erradicación tanto de células tumorales que expresan, o que no expresan el gen B7RP1. Esta eolución de inmunoterapia se puede utilizar para diversas leucemias, sarcomas, melanomas, adenocarcinomas, carcinomas de mama, tumores de próstata, carcinomas de pulmón, carcinomas de colon y otros tumores. Esta invención abarca la utilización del gen B7RP1 de una manera similar para mejorar la activación de células T en respuesta a diversos tumores . Como se describe en el Ejemplo 14, el fenotipo de ratones tranegénicos que expresan B7RP1 indica que B7RP1 es importante en el control de producción de anticuerpos . La actividad de los agonistas y antagonistas de la proteína B7RP1 puede ser útil en indicaciones terapéuticas que requieren la inhibición o mejoría de la producción de anticuerpo. Por ejemplo, muchas vacunas actúan induciendo una respuesta de anticuerpo efectiva y específica. Algunas vacunas, especialmente aquéllas contra microorganismoe inteetinales (por ejemplo virus de hepatitis A y salmonela) , inducen una respueeta de anticuerpo de corta duración. Ee deseable prolongar esta respuesta con el fin de incrementar la efectividad de la vacuna. Por lo tanto, los anticuerpos solubles B7RP1 o activantee para CRP1 pueden eervir como un adyuvante para una vacuna . Lae reepuestas antivirales también se pueden mejorar por activadores o agonistae de la vía B7RP-1/CRP-1. Loe datoe en el Ejemplo 20 indican que la inmunidad celular se incrementa por B7RP-l-Fc. El mejoramiento de las funciones inmunes celulares por B7RP-1-Fc, u otros activadores de la vía B7RP-l/CRP-l también pueden ser benéficos para eliminar célulae infectadas por virus. De manera complementaria, B7RP-l-Fc tiene efectos sobre las funciones inmunes tumorales que pueden mejorar lae respuestae mediadae por anticuerpos, como se observa en el Ejemplo 13, en donde pueden funcionar para ayudar a aclarar y eliminar virus del cuerpo.

Invereamente, existen muchas condiciones clínicas que pueden ser disminuidae por la inhibición de producción de anticuerpo. La hipereeneibilidad es una respuesta inmune normalmente benéfica que está exagerada o es inapropiada y lleva a reacciones inflamatorias y daño tisular. Las reacciones de hipersensibilidad las cuales son mediadas por anticuerpo pueden ser particularmente susceptibles a antagonismo por inhibidores de la actividad de B7RP1. Las alergias, fiebre de heno, asma y edema agudo provocan reacciones de hiperseneibilidad tipo I y estas reacciones pueden ser suprimidas por proteína, anticuerpo o inhibidores de moléculas pequeñas de actividad de B7RP1. Las enfermedades que causan reacciones de hipersensibilidad mediadas por anticuerpos, incluyen a lupus eritematoso sistémico, artritis (artritis reumatoide, artritis reactiva, artritis psoriática) , nefropatías (glomerulonef ritis, membranosa, mesengio capilar, segmental focal, focal necrotizante, crescéntica, prolif erativa-tubulopatías) , desórdenee cutáneoe (pénfigo y penfigoide, eritema nodoeo) , endocrinopatías (tiroiditis - enfermedad de Grave, de Hashimoto - diabetes mellitus dependiente de insulina) y diversas pneumopatías (eepecialmente alveolitie extrínseca) , diversae vaeculopatíae, enfermedad coeliaca con producción aberrante de IgA, muchae anemias y trombositopenias, síndrome de Guillain-Barre, miastenia gravis, se pueden tratar con antagonistae de B7RP1. Ademáe, loe deeórdenee linfoproliferativos tales como mieloma múltiple, macroglobul inemia de Waldenstrom y crioglobulinemas se pueden inhibir por anticuerpos de proteína o por antagonistas de moléculas pequeñas de B7RP1. Finalmente, la enfermedad de injerto versus huésped, un desorden inmune "artificial" puede beneficiarse de la inhibición de producción de anticuerpo por antagonistas de B7RP1. Se ofrecen los siguientee ejemploe para ilustrar de manera máe completa la invención, pero no se consideran como limitantes del alcance de la misma.

Ejemplo 1 Secuencia de ADN y de aminoácidos para CRP1 Se sacrifican 6 ratones hembra C57/Black y se extirpa el intestino delgado, y ee retiran lae placae de Peyer. El tejido del intestino delgado se rebana, se deja abierto y ee lava para remover el moco y otros residuos. La capa epitelial la cual contiene las células intraepiteliales intestinales (ilEL) se libera por agitación suave en RPMI-1640 suplementado con ditiotreitol 1 mM (DTT) durante 20 minutos a 37 °C. Las célulae dieociadae se hacen pasar a través de un filtro 100 µm y se lavan en 50 ml de RPMI-1640, se mezclan para descomponer adicionalmente los grupos de células y despuée ee hacen pasar a través de un tamiz de 40 µm para obtener poblaciones de células solae . Eetae célulae después se lavan nuevamente en 50 ml de volumen de RPMI-1640 para asegurar la remoción de DTT residual. El tejido después se agita y se lava como en lo anterior para recuperar las ilEL remanentes. Las ilEL se separan de las células adipoeae y la mayor parte de lae célulae epitelialee en un gradiente de Percol de tree etapae con la banda de ilEL en la interfaee de 40% a 80%. Eetas células después se lavan doe vecee con RPMI-1640 para remover lae trazas de Percol, ee inmunotiñen con anticuerpoe CD103 (integrina alfa IEL) y se separan en un clasificador de células FACs Star. Estas células clasificadas despuée ee utilizan para preparar ARN total directamente utilizando Trizol (Gibco BRL, Gaithereburg, MD) o se activan durante la noche en anticuerpos activadores unidos a placa, los cualee dan reacción cruzada con TCR gamma/delta, TCR alfa/beta o CD3. Se prepara el ARN como en lo anterior y ee acumula para ueo al construir las bibliotecas de ADNc EST. Una clona de ADNc, designada smil2-00082-al, contiene homología de secuencia nucleotídica con CD28 (figura IB) . La traducción de la secuencia y cooperación subsecuente con proteínas conocidas en una base de datos pública muestra 19% de identidad de aminoácidos con CD28 murino (figura IB) . Esta homología baja es significativa debido a que CD28 murino comparte solo 26% de identidad de aminoácidos con CTLA-4 murino. La totalidad de las cisteínas putativas que se consideran críticas para la unión de cisteína intramolecular e intermolecular en la familia CD28/CTLA-4 se encuentra que están conservadas (residuos aminoácidos 83, 109 y 137; en relación a la metionina de inicio) . Además, la longitud total del marco de lectura abierta putativo y la porción relativa del dominio transmembranal son similaree a loe de CD28 y CTLA-4. Denominamos al gen CRP1, por proteína-1 relacionada con CD28.

E emplo 2 Clonación de ADNc para CRP1 humana, Se identifica por los siguientes procedimientos la secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína CRP1 humana . Se prepara una biblioteca de .ADNc humano a partir de linfocitos enriquecidoe de eangre humana periférica de voluntarioe humanoe normales . Se purifican los linfocitos y se separan loe eritrocitoe por Lymphocyte Separation Media (ICN Pharmaceuticale, Inc., Coeta Meea, CA) . Lae célulae deepués se activan durante la noche en medio que contiene 10 ng/ml de PMA, 500 ng/ml de ionomicina y anticuerpos activantes unidos a placa, a CD3. Se prepara el ARN total de las células activadas por el método Trizol (Gibco/BRL) y se aisla ARN poliA por purificaciones en eeferas Dynal . Se elabora ADNc a partir de ARN poliA aislado y ee selecciona por tamaño para los fragmentos de ADNc más grandes . El ADNc seleccionado por tamaño después se liga en el plásmido pSPORT (Gibco/BRL) . Se obtiene ADN que codifica para la proteína CRP1 humana por examen de la biblioteca de ADNc de linfocitos activados ya sea por placa de bacteriófago recombinante, o bien por protocolo de hibridación de colonias bacterianas transformadas (Sambrook et al. Supra) . El fago o la biblioteca de ADNc plasmídica ee examina utilizando sondas marcadas radioactivamente derivadas de la clona de gen CRP1 murino como se describe en el Ejemplo 1 y en la figura 1. Se utilizan las sondae para examinar filtroe de nylon levantados a partir de la biblioteca ee brada en placa. Estos filtros se prehibridizan durante 4 h a 42 °C en formamida 50%, 5X SSPE, solución de Denhardt 2X, SDS 0.5% y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón y después se hibridiza durante 24 h a 42 °C en formamida 50%, 5X SSPE, solución de Denhardt 2X, SDS 0.5%, 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón y 5 ng/ml de la sonda mB7RPl . Las manchas se lavan en 2X SSC, SDS 0.1% durante 10 min a rt (temperatura ambiente), IX SSC, SDS 0.1% durante 10 min a 50 °C, 0.2X SSC, SDS 0.1% durante 10 min a 50 °C y después 0.2X SSC durante 10 min a 50°C nuevamente. Los insertoe que se obtienen de cualquiera de las clonas CRP1 humanas se secuencian y analizan como ee describe en el Ejemplo 1.

Ejemplo 3 Secuencia de .ADN y de aminoácidos de B7RP1 Una clona de ADNc, designada smill-00003-g5, contiene homología de secuencia nucleotídica con B7.1 (CD80) y B7.2 (CD86) . La traducción de la secuencia (figura 2A) y comparación subsecuente con proteínas conocidas en una base de datos pública muestra 20% de identidad de aminoácidos con B7.1 murina (figura 2B) . Esta baja homología es significativa debido a que B7.1 murina comparte 24% de identidad de aminoácidos con B7.2 murina. Peee a eeta baja homología, loe residuoe cieteína críticos se conservan entre el marco de lectura abierta de esta clona y B7.1 y B7.2 murina en los residuos 62, 138, 185 y 242 (en relación a la metionina iniciadora, figura 2B) . La longitud de la proteína madura aproximada y la posición de la región transmembranal en relación a la parte carboxi terminal también son similaree en el ORF putativo de eeta clona, en comparación con B7.1 y B7.2. Denominamoe al gen B7RP1 por proteína-1 relacionada con B7.

Ejemplo 4 Clonación de ADN para B7RP1 humana La búsqueda de homología con Genbank blast (GCG, University of Wisconsin) utilizando la secuencia B7RP1 murina (véase la figura 2) recupera una clona (7AB014553) que contiene una secuencia de 4358 pb con 1679 pb del ORF. Se diseñan cebadores de clonación por PCR de acuerdo con esta secuencia. Se obtiene un fragmento de ADN de 1313 pb por medio de 5' y 3" RACE utilizando ADNc Human Lymph Node Marathon-ReadyM (Clontech, Palo Alto, CA) de acuerdo con los procedimientos recomendados por los fabricantes . Los cebadores utilizados para B7RP1 humano de longitud completa: 2083-75 ACC ATG CGG CTG GGC AGT CCT GGA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 25) 2083-76 TGG TGA CCT ACC ACA TCC CAC AG (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 26) 2083-77 TCC GAT GTC ATT TCC TGT CTG GC (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 27) 2083-78 GCT CTG TCT CCG GAC TCA CAG CCC (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 28) 2113-29 GTG GCA GCA AAC TTC AGC GTG CCC GTC G (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 29) 2113-30 CCC AAC GTG TAC TGG ATC AAT AAG ACG G (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 30) 2113-31 GCG TGC TGA GGA TCG CAC GGA CCC CCA G (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 31) Se utilizan los cebadores 2083-75 y 2083-76 para amplificar el extremo 5' del gen utilizando protocolos RACE. Se utilizan los cebadores 2083-77, 2083-78, 2113-29, 2113-30, y 2113-31 para amplificar el extremo 3' del gen utilizando protocolos RACE. La secuencia nucleotídica resultante contiene un ORF de 288 residuoe aminoácidoe que comienzan en la metionina. La secuencia de aminoácidos B7RP1 humana madura predicha despuée se compara con la secuencia de aminoácidoe B7RP1 de ratón madura (figura 3B) y se encuentra que comparte 48% de identidad de aminoácidos. Eeta homología ee eignificativa debido a que la homología entre eepecies es baja con el gen CD80 (B7.1) , de hecho, CD80 de ratón y humano comparten eolo 41% de identidad de aminoácidoe. De manera importante, la proteína B7RP1 humana coneerva residuos cisteína críticos necesarios para estructurae de rizo Ig (reeiduoe aminoácidos 16, 92, 138, 194 y 195, en relación a la proteína madura, Figura 3B) . Además, la longitud total y la posición del dominio transmembranal son consistentes con el homólogo B7RP1 humano.

Ejemplo 5 Expresión de ARN para B7RP1 La hibridación de ARN in situ utilizando sondae de ARN para el gen B7RP1. Se fijan tejidos de ratón adultos en paraformaldehído 4%, se embeben en parafina y se cortan a 5 µm. Antes de la hibridación in situ, los tejidos se permeabilizan con HCl 0.2M, seguido por digestión con proteinasa K y acetilación con trietinolamina y anhídrido acético. Las secciones se hibridizan durante la noche a 55 °C con una ribosonda de 969 bases marcada con 33P que corresponde a los nucleótidos 1 a 969 de la eecuencia B7RP1 de ratón. Se remueve el exceso de sonda p . digestión con RNasa, seguido por una serie de lavados en amortiguador con concentraciones cada vez menores de eal y después con un lavado de alta astringencia o rigurosidad en 0. IX SSC a 55°C. Los cortes se sumergen en emulsión Kodak NTB2, ee exponen a 4°C durante 2-3 semanas, se revelan y se contratiñen con hematoxilina y eosina. Los cortes se examinan con campo oscuro e iluminación con luz transmitida para permitir la evaluación simultánea de la morfología del tejido y la señal de hibridación. El análisis del ARN para B7RP1 mediante hibridación in situ muestra que el ARN para B7RP1 se expresa en gran medida en áreas de maduración linfoide y activación de linfocitos. El ARN para B7RP1 se expresa en tejidos linfoides del timo, placas de Peyer del intestino, bazo y nodulos linfáticos. La expresión dentro de estos tejidos linfoides demuestra que el ARN B7RP1 generalmente se expresa en las áreas de células B y en otrae relaciones de APC. Estas regiones incluyen el área de la médula del timo, los folículos primarios de los nodulos linfáticos y las regiones folicular y de domo de las placas de Peyer. La expresión de ARN para B7RP1 es altamente específica para las regiones relacionadas con APC en tejidos linfoides. El análisis de varios tejidos no linfoides también muestra expresión en regiones de relación con APC. En el pulmón, ee encuentra que la expreeión de B7RP1 en las regiones submucoealee, lo que ee coneistente con una función en el procesamiento de antígenos. En el intestino delgado, se encuentra ARN para B7RP1 en la lámina propria. De manera notable, encontramos una sección de hígado dañado, la cual muestra infiltración linfocítica que se superpone con la expresión de ARN para B7RP1. Esta coincidencia de la expresión de B7RP1 con acumulación de linfocitos en respueeta a tej ido dañado indica fuertemente que B7RP1 eetá relacionado con la activación de linfocitos .

Ejemplo 6 Expresión de ARN para CRP1 La hibridación in situ de ARN utilizando sondas de ARN para el gen CRPl. Se prepara tejido de ratón como en el Ejemplo 5. La permeabilización de tejido, hibridación con sonda, tratamiento de cortes y tinción de tejido se realizan como se describe en el Ejemplo 5. Lae secciones se hibridizan durante la noche a 55 °C con una ribosonda de 603 bases marcada con 33P que corresponde a los nucleótidos 1 a 603 de la secuencia CRP1 de ratón. Lae secciones ee examinan con campo oscuro e iluminación de luz transmitida para permitir la evaluación eimultánea de la morfología del tejido y la eeñal de hibridación. Se realizan secciones de nodulos linfáticos de ratones normales o de ratones tratados con oxazolona y se analizan para la expresión de ARN para CRPl. El nodulo linfático de ratón seneibilizado muestra mayor expreeión de ARN para CRPl en comparación con el nodulo linfático de ratón normal . La expreeión de CRP1 eetá en la paracorteza, una región de actividad de célulae T. Por lo tanto, la expreeión de ARN CRP1 ee consistente con la expresión del linfocito T y es regulada para su activación ante la activación de célulae T.

Ejemplo 7 Expreeión y purificación de proteínas de fusión CRPl-Fc y B7RP1-FC Para construir el vector de expresión de ADN para la proteína de fusión CRPl-Fc, la secuencia codificante para los primeros 147 aminoácidos de la parte amino terminal de CRP1 se fusionan, en marco con la secuencia codificante para los 235 aminoácidoe de la parte carboxi terminal del gen para Fc humana (isotipo IgGl) y se ligan con la secuencia polienlazadora de pcDNA3 (pcDNA3/CRPl-Fc) . Para construir el vector de expresión de ADN para la proteína de fusión B7RP1-FC, se fusiona la secuencia codificante para los primeros 269 aminoácidos de la parte amino terminal de B7RP1, en marco, con la secuencia codificante para la parte carboxi terminal de 235 aminoácidoe del gen Fc humano (ieotipo IgGl) y ee liga dentro de la eecuencia polienlazadora de pcDNA3 (pcDNA3 /CRPl-Fc) . Lae secuencias codificantes para las secuencias contenidae tanto en CRP1 como en B7RP1 a partir de la parte N terminal de cada proteína hasta, pero sin incluir, la región transmembranal putativa de cada proteína. Se transfectan células 293T ya sea con pcDNA3 /CRPl-Fc o pcDNA3/B7RPl-Fc utilizando el reactivo de transfección FuGene 6 (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolie, IN) . Deepuée de cuatro días, se recolecta el medio acondicionado y se purifican las proteínas de fusión Fe por cromatografía por lotes utilizando proteína A Sepharose (Pharmacia) . Lae proteínae de fusión Fc unidas a la columna se eluyen con tres volúmenes de columna del Immunopure Gentle Elution Buffer (Pierce) , y después se dializa contra 150 volúmenes de HEPES 20 mM, NaCl 100 mM, pH 7.5. La proteína dializada se concentra utilizando concentrados centrífugos Macrosep, MWCO 30 kD (Pall Filtron) , y se calculan las concentraciones de proteína utilizando coeficientes de extinción derivados de la secuencia de aminoácidos de cada proteína. En la figura 4A se muestra la expresión de la proteína de fusión CRPl-Fc, en la figura 4B, se muestra la expresión de la proteína de fusión B7RP1-Fc.

Ejemplo 8 Identificación de CRP1 y B7RP1 como un par receptor-ligando Con el fin de determinar si las proteínae novedosas son parte de la misma vía coestimuladora en la medida en que contienen CD28, CTLA-4, B7.1 y B7.2, utilizamos un ensayo de exhibición de superficie celular. Este ensayo utiliza el análisis ACAS (Análisie y clasificación de células adherentes) para analizar ei lae proteínae unidae a membrana expreeadas en célulae interactúan con diversas proteínas de fusión Fc . Las células que expresan proteínas unidas a membrana, indicadas en el lado izquierdo de la figura 5, se incuban con proteínas de fusión Fc, indicadas en la parte superior de la figura.

Se eiembran en placas células Coe-7, que crecen en medio DMEM con FBS 10% a 500,000 célulae/pozo en una placa de 24 pozoe . Lae célulae se transfectan utilizando el reactivo FuGene 6 (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) . Para cada transfección, se agregan 3 µl de reactivo FuGene 6 a 47 µl de medio DMEM libre de suero. Después de incubación durante 10 min a temperatura ambiente, la mezcla se agrega a 0.25 µg del plásmido a gotas y después se incuba durante 15 minutos . La mezcla anterior después se agrega a las células con 0.5 ml de DMEM con FBS 10%. Las células se incuban a 37 °C en una atmósfera de C02 5%. Como un control, también se siembran en placas células CHO D- transfectadae de manera eetable con un pláemido de expresión que contiene el ADNc para CD28 humano, a 500,000 células/pozo en una placa de 24 pozoe. Después de 48 h, se remueve el medio con reactivo de transfección y las células se lavan dos veces con RPMI máe FBS 5%. Se agregan 10 a 20 ng de proteínas de fusión Fc purificadas en 1 ml de medio a las células, las cuales ee incuban durante 30 min en hielo. Lae célulae ee lavan tres veces con RPMI más FBS 5% y después se incuban con 2 µl de anticuerpo contra Fc humano conjugado con FITC (1 mg/ml) durante otros 30 min en hielo. Deepués de tres lavados suceeivoe con RPMI, lae células se cubren con 250 µl de medio RPMI sin rojo de fenol, para análisie ACAS.

El análisis ACAS de las células que se unen a diversas proteínas de fusión Fc demuestran que la proteína B7RP1 unida a CRP1, pero no lae proteínae en la vía coestimuladora conocida, CD28 o CTLA-4. Inversamente, CRP1 interactúa con B7RP1, pero no B7.2, un componente en la vía conocida (véase la figura 5) . Estos resultadoe sugieren fuertemente que CRP1 y B7RP1 representan un par novedoso de receptor-ligando, análogo a CD28 y B7.2. Sin embargo, puesto que CRP1 y B7RP1 no interactúan con B7.2 , CTL-4 o CD28, están separados e independientes de la vía coestimuladora conocida.

Ejemplo 9 Identificación de células que expresan los receptores B7RP1 Se utiliza la proteína de fusión B7RP1-Fc para detectar células que expresan receptores para B7RP1, y que probablemente incluyan a la proteína CRP1 (véase el ejemplo 6) por análisis FACS. Se extirpan los bazos de seis ratas hembra C57/Black, se trituran en filtros de malla de 100 micrómetros para liberar los linfocitos, se hacen pasar a través de filtros de 70 micrómetros y después se lavan en 50 ml de RPMI-1640. Después se sedimentan a 500 rpm, se resuspenden en RPMI fresco, se mezclan para descomponer lae célulae ocupadae y ee hacen pasar a través de un filtro de 40 micrómetros. Las células T que se van a activar se siembran en placae de 6 pozos en RPMI-1640, FBS 5%, 1XPSG, PMA, ionomicina y se incuban a 37°C, C02 5% durante la noche. Se verifica la activación de célulae T por confirmación vieual deepués de 12 h. Las células de bazo activadas por inmunotinción se lavan en PBS, BSA 0.5% (Path-ocyte 4, ICN Pharmaceuticals) de amortiguador de lavado, se resuspenden y despuée ee forman alícuotas en volúmenes de 100 µl . Se agregan 15 mg/ml ya sea de la proteína de fusión CRPl-Fc o la proteína de fusión B7RP1-FC (1.5 µg/muestra) según sea apropiado y después las mezclas se incuban en hielo durante 30 min con mezclado ocasional. Las células se lavan dos veces en 5.0 ml de amortiguador de lavado. La unión de las proteínas de fusión se visualizan con 2 µg de anticuerpo secundario conjugado de chivo, contra humano (GaHuFc-FITC) en volumen de 100 µl, para tinción de célulae . Loe anticuerpos marcadores de células conjugados con PE se agregan con GaHUFc-FITC, aeí como los controles de anticuerpo conjugados al isotipo PE control cuando se indica (isotipo de rata) . Las muestras se incuban en hielo y ee lavan como en lo anterior. La vieualización se realiza por análisis FACScan con compuerta en las poblacionee de linfocito. La tinción doble con anticuerpoe CD4+ y la proteína de fusión B7RP1-Fc indican que las células expresan tanto el marcador CD4 y el receptor para B7RP1, probablemente CRP1 (figura 6) . De manera similar, la tinción doble con los anticuerpos CD8+ y la proteína de fueión B7RP1-Fc demuestran que las células expresan ambos receptores, CD8 y B7RP1 (figura 6) . No podemos detectar de manera confiable tales células de tinción doble en preparaciones de esplenocitos inactivados . Puesto que CD4 y CD8 son marcadores de linfocitos T, podemos postular que CRP1 se expresa en célulae T CD4+ y CD8+ activadae . Eetoe datoe son consistentes con la expresión aumentada de ARN para CRP1 en las regiones de células T de nodulos linfáticos a partir de ratones sensibilizadoe en comparación con ratonee normales (Ejemplo 6) .

Ejemplo 10 Identificación de célulae que expreean ligandos para CRP1 Se utiliza la proteína de fusión CRPl-Fc para detectar célulae que expresan ligandos para CRP1, y que probablemente incluyen la proteína B7RP1 (véase el Ejemplo 8) por análisis FACS (figura 7) . Se preparan esplenocitoe como en el Ejemplo 8, excepto que se omite la etapa de activación de células T de 12 h y las células se analizan directamente. Los esplenocitos se someten a tinción doble con anticuerpos marcadores CD45R (B220) y la proteína de fusión CRPl-Fc. Se detectan las células que expresan el marcador de célula B CD45R y loe ligandoe putativoe para CRP1, que probablemente incluyen B7RP1 (Ejemplo 8) . Por lo tanto, concluimoe que B7RP1 ee expresa en células B, un tipo de célula presentadora de antígeno. Estoe datoe son consistentes con la expresión de ARN1 para B7RP1 en regiones de células B de varios tejidos linfoides (Ejemplo 5) . El análisie por FACS de la expreeión de B7RP1 en macrófagos perifonéales (figura 8) . Se recolectan células perifonéales por lavado local de un ratón normal y se lavan antes de incubarse con proteína de fusión B7RP1-Fc o la proteína Fc como control, o con el anticuerpo monoclonal F4/80 (el cual detecta un antígeno específico para macrófagos) o un anticuerpo monoclonal de control pareado en isotipo, no relacionado. Lae célulae deepués ee lavan nuevamente y se incuban con anticuerpo de chivo contra Fc humano, conjugado con FITC. Después del lavado adicional, las células se determinan en un analizador FACS para determinar su dispersión de luz y sus propiedades de tinción de fluorescencia. Las célulae perifonéales se diferencian primero en subgrupos en el fundamento de sus propiedades de difusión de luz (figura 8A) . Los macrófagos se identifican en la región 5 (R5) debido a su capacidad para difundir fuertemente la luz hacia el frente (FSC) y lateralmente (SSC) y debido a su tinción positiva para el antígeno F4/80, un marcador para macrófagos (figura 8B) . Los macrófagoe en la región 6 (R6) fueron eeparados en base de su tinción menos intensa para el antígeno F4/80 y se encuentra que se tiñen por la proteína de fusión CRPl-Fc (figura 8C) . Estos datoe indican que los ligandos para CRP1, posiblemente incluyen a B7RP1 y se expresan en macrófagos, una célula profesional presentadora de antígeno. Esto es consistente con la función de CRPl y B7RP1 en la activación de linfocitos T.

E emplo 11 Actividad inhibidora in vitro de la proteína de fueión B7RP1-FC en linfocitos T estimulados con ConA Se preparan esplenocitos de ratón como en el Ejemplo 8 y se enriquecen para linfocitos T por selección negativa (R y D Systeme, Inc., Minneapolis, MN) ) . Se utilizan 200,000 esplenocitos y los ensayos de proliferación de células T en placas de fondo redondo de 96 pozos. Las células se incuban durante 1 h con medio (sin adiciones), CRPl-Fc, B7RP1-Fc o B7.2-Fc, proteínas de fusión como ee indica en la figura 9. El medio (sin adiciones) o Con A a diversas concentraciones se agrega como se indica en la parte inferior de la figura 9. Lae células después se incuban a 37 °C y C02 5%. Deepuée de 42 h lae célulae ee pulean con 3H-timidina durante 6 h, ee coeechan y ee determina la radioactividad incorporada. Lae CPM promedio y la desviación eetándar de mueetrae por duplicado se representan en la figura 9.

Las proteínae de fueión Fc no demueetran actividad eetimuladora o inhibidora de célulae T eignificativae por eí mismas. Sin embargo, en presencia de 1 µg/ml y 3 µg/ml de Con A, lae proteínae de fueión tanto B7RP1-FC como B7.2-Fc conocidae muestran actividad inhibidora significativa (figura 9) . A altas concentraciones (10 µg/ml) la estimulación con Con A resulta en muerte celular, probablemente a travée de sobreactivación de las células T. La adición de B7RP1-Fc o B7.2-Fc protege de manera significativa a las células de los efectos dañinos de altas concentraciones de Con A. En las funciones inhibidora y protectora, el efecto de la proteína B7RP1-Fc es mayor que el de la proteína B7.2-Fc en las células estimuladas con Con A. Estoe datoe indican que la proteína B7RP1 funciona para regular la proliferación de célulae T.

Ejemplo 12 Suministro sietémico de la proteína de fusión B7RP1-Fc en ratones tranegénicoe La proteína de fueión B7RP1-Fc deecrita en el Ejemplo 7 ee subclona en un vector de expresión específico ApoE-hígado (Simonet et al. J. Clin. Invest. 94, 1310-1319 (1994) y eolicitud PCT No. US94/11675) . La región codificante ee corta a partir de pCEP4/B7RPl-Fc utilizando lae enzimae de restricción, Spe I y Not I, y el fragmento se subclona en los mismos sitios en el vector de expresión específico de hígado ApoE mencionado previamente. El plásmido resultante, HE-B7RP1-Fc se secuencia a través de su región codificante de proteína y las secuencias que flanquean a la región codificante, para asegurar que está libre de mutaciones. El plásmido se amplifica y purifica a través de dos rondas de centrifugación por gradiente de densidad con CsCl. El ADN de plásmido purificado se digiere con las enzimas de restricción, Cía I y Ase I, y la inserción del transgen de 1.5 kb se purifica por electroforesie en gel de agarosa. El fragmento purificado se diluye a una solución de inyección concentrada de 1 µg/ml en Tris 5 mM, pH 7.4 y EDTA 0.2 mM. Los embriones de células solae de ratonee BDFl X BDFl-cría se inyectan esencialmente como se describe (Brinster et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA £2., 4338 (1985)), excepto que lae agujae de inyección ee bieelan y ee eiliconizan antee de eu ueo. Loe embrionee se cultivan durante la noche en un incubador con C02 y 15 a 20 embriones de 2 células se transfieren a los oviductos de ratones hembra CD1 pseudoembarazadas . Deepués de terminar el embarazo, ee obtienen 56 descendientes de la implantación en los embriones microinyectados. La descendencia se examina por amplificación por PCR del transgen integrado en las muestras de ADN genómico. La región objetivo para amplificación es una región de 369 pb del intrón ApoE humano el cual se incluye en el vector de expresión. Los oligonucleótidos utilizados para amplificación por PCR fueron : ' -GCC TCT AGA AAG AGC TGG GAC-3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 32) 5' -CGC CGT GTT CCA TTT ATG AGC-3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 33) Las condiciones para las PCR fueron: 94 °C durante 2 min, 1 ciclo; 94°C durante 1 min, 63 °C durante 20 seg y 72 °C durante 30 seg, 30 ciclos. De los 56 descendientee originales, 7 se identificaron como ratonee fundadoree tranegénicoe PCR poeitivoe. A lae 12 semanas de edad, los nueve fundadores transgénicos (ratones #1, 2, 4, 6, 8, 30, 32, 33, 40) y cinco controles (ratones #5, 9, 10, 25, 28) se sacrifican para necropsia y análisis patológico. Se aisla el ARN celular total de los hígados de los animales fundadores y de sus contrapartes control negativas como se describe (McDonald et al. Meth. Enzymol. 152 , 219 (1987)) . Se realiza análisis de transferencia Northern (Northern blot) en las muestras para determinar el nivel de expresión transgénica. Aproximadamente 10 µg del ARN total de cada animal se separa por geles de deenaturalización en electroforesis de agarosa (Ogden et al. Meth. Enzymol. 152, 61 (1987) ) , y después se transfiere a una membrana de nylon HYBOND-N (Amersham) y se sondea con ADN inserto 32P dCTP-marcado mB7RPl-Fc. La hibridación se realiza durante 1 h a 63 °C en solución ExpreseHyb (Clonetech) y 2-4 X 106 CPM de la eonda marcada/ml de amortiguador de hibridación. Después de la hibridación, las manchas se lavan dos veces en 2X SSC, SDS 0.1% a temperatura ambiente durante 5 min cada uno, y deepués dos veces en 0.1X SSC, SDS 0.1% a 55°C durante 15-20 min cada una. La expresión del transgen en los fundadores y sus contrapartes control se determina después de autorradiografía. El análisie de traneferencia Northern indica que eiete de loe fundadoree tranegénicos expresan concentraciones detect bles del ARN tranegénico (ratón #1, 2, 6, 8, 32, 33 y 40) . Loe ratonee control negativos y tres fundadores (#4, 30 y 31) no expresan concentraciones detectables de ARN. Puesto que se determinó que la proteína de fusión B7RP1-Fc es secretada de células de mamífero en cultivo (figura 4B y Ejemplo 7), la expresión del ARNm tranegénico debe eer indicativo de la concentración del producto de gen euminietrado sistémicamente) .

Ejemplo 13 Actividad biológica de la proteína de fusión B7RPl-Fc Siete de los ratones transgénicos (ratón #1, 2, 6, 8, 32, 33 y 40) y cinco contrapartes control (#5, 9, 10, 25 y 28) se sacrifican para necropsia y análieie patológico utilizando los siguientes procedimientos: antes de la eutanasia, todos los animales tenían números de identificación verificados y después se pesan, anestesian y se extrae sangre. La sangre se guarda como suero y como sangre total para química eérica completa y un panel de hematología. La radiografía se realiza justo después de la anestesia terminal por inhalación mortal de C02 y antes de la dieección general. Los tejidos se extirpan posteriormente y se fijan en Zn formalina amortiguada 10% para examen histológico. Los tejidos recolectados incluyen hígado, bazo, páncreas, estómago, duodeno, íleon, placa de Peyer, colon, riñon, órganos reproductores, piel, glándulas mamarias, hueso, cerebro, corazón, pulmón, timo, tráquea, eeófago, glándula tiroide/paratiroide, yeyuno, ciego, recto, glándulas suprarrenales, grasa blanca y café, nervio ciático, médula ósea, vejiga urinaria y múeculo eequelético. Antes de la fijación, se determinan loe peeoe totalee de los órganos para hígado, corazón, estómago, riñon, euprarrenales, bazo y timo. Despuée de la fijación, los tejidos se procesan en bloques de parafina y se obtienen cortes de 3 µm. Se realiza la inmunohistoquímica para marcador de linfocito B, B220 y el marcador de linfocito T, CD3. Para detectar la expresión de B220 o CD3 , se desparafinizan secciones de 4 µm incrustadas en parafina, y fijadas en formalina y se hidratan con agua desionizada. Las secciones se enjuagan con peróxido de hidrógeno 3% y se bloquean con Protein Block (Lipshaw, Pitteburg, PA) y ee incuban en anticuerpo monoclonal de rata a B220 (Pharmingen, San Diego, CA) o anticuerpo policlonal de conejo a CD3 (Dako, Carpintería, CA) . Los anticuerpos se detectan por inmunoglobulinas biotinadas de conejo contra rata o de chivo contra conejo, estreptavidina conjugada con peroxidasa (BioGenex, San Ramón, CA) con DAB como cromágeno (Biotek, Santa Barbara, CA) . Las secciones se someten a contratinción con hematoxilina. En este estudio, se reportan signos clínicos normales durante la fase en vida del estudio. Las radiografías corporales completas de los ratones transgénicos son comparables a las de los ratones control. Los parámetros hematológicos totales de los ratones transgénicos son comparables con los del grupo control negativo, aunque eetán preeentee cambioe esporádicos en ratones individuales : los animales transgénicos #8 y #40 tienen concentraciones incrementadas de globulina sérica (hiperglobulinemia) y #32 y #33 tienen concentraciones de globulina en el intervalo normal alto acompañado por concentraciones de albúmina en el intervalo normal bajo, lo cual es un patrón que comúnmente se observa con estimulación antigénica crónica del eietema inmune. Los pesoe - 1.22 -de los órganos de los otros ratones transgénicos no son significativamente diferentes de los del grupo control . Los siguientes cambios histopatológicos están presentes en los ratones tranegénicoe : loe nóduloe linfáticoe meeentéricoe de loe ratonee B7RP1-Fc tranegénicoe eetán agrandados de manera moderada a marcada cuando se comparan con los ratones control (Fig. 10A-10D; Fig. 11A-11E) . La corteza tiene hiperplaeia folicular prominente que ee obeerva como folículos secundarios agrandados (Fig. 10B-11B) con centros germinales grandee que contienen en eu mayor parte célulae B B220+ (Fig. 11D) y algunas células T CD3+ dispereadae (Fig. 11F) . El área paracortical (célula T CD3+) también está agrandada moderadamente (Fig. 11B-11F) y los senos medulares tienen números ligeramente aumentados de macrófagos frescoe (histocitosis de los senos) . El cambio más conspicuo en los nodos eetá presente en las cuerdas medulares, lae cuales están expandidas de moderada a marcadamente por grandes cantidades de célulae plasmáticas bien diferenciadas en los ratones transgénicoe B7RP1-Fc (figura 10D) . En el ratón tranegénico #40, también ee encontraron números pequeños de cuerpos de Ruseell dispersados (es decir, células plasmáticae con veeículas prominentes grandes, redondas e intracitoplásmicas que contienen inmunoglobulinas) en las cuerdas medulares (figura 10D) . De manera interesante, los otros nóduloe linfáticoe internoe y periféricoe (por ejemplo cervicalee, ipginales) tienen rasgos morfológicos similares de hiperplasia linfoide reactiva sugestivo de una respueeta eistémica. Estos hallazgos son consistentee con una estimulación inmune en proceso crónica con mejoramiento de la reacción inmune humoral lo que lleva a proliferación de células B y diferenciación terminal en células plasmáticas . El bazo de los ratones transgénicos B7RP1-Fc tiene áreas de pulpa blanca agrandadas de manera variable con hiperplasia linfoide reactiva moderada que involucra particularmente los folículos secundarios de células B con centros germinales prominentes y cubiertas de células T periarteriolares cuando ee comparan con ratonee control (Fig. 10E-10F) . Otro hallazgo conepicuo en loe ratonee tranegénicos B7RP1-Fc es plasmacitosis mínima a moderada en la zona marginal que rodea las áreas de pulpa blanca y en la pulpa roja adyacente. El ratón transgénico #6 tiene algunos cuerpos de Russell dispersados (figura 10F, inserción) . La pulpa roja tiene hematopoyesis extramedular media a moderada, la cual es comparable con la que ee observa en los ratones control (figura 10E) . Las placas de Peyer de intestino delgado se agrandan de manera moderada a marcada en ratones transgénico B7RP1-Fc sobre la de loe ratonee control (figura 10G) y tienen folículoe muy grandes con centros germinales prominentes, particularmente en ratones transgénicos #40 y #32 (Fig. 10H) . Además, existe un incremento mínimo (en #32) a moderado (en #8 y #33) en los números de linfocitos y células plasmáticas (mezclado con un infiltrado eosinofílico moderado en el íleon del ratón #32) en la capa de lámina propria engrosada de la mucosa, la cual está preeente en el intestino delgado, pero es más prominente en el colon de ratones transgénicos. Los agregados linfoides intestinales grandes (GALT) también son ligeramente más prominentes en algunos ratones transgénicos B7RP1-Fc (particularmente el ratón #8 y #2) en comparación con el grupo control. Generalmente, los otros tejidos examinados que incluyen timo, médula ósea, hígado, pulmón, corazón, páncreas, ríñones, glándula suprarrenal, tiroide, paratiroides, tráquea, órganos reproductores, ve iga urinaria, glándula mamaria, piel, músculo esquelético, nervio periférico, cerebro, esófago, estómago, intestino delgado y grueso, hueso (fémur/tibia) , articulación de la babilla, grasa blanca y café aparecen normales y comparables con los cambios de fondo detectados en los ratones control . Los datos de estudio demuestran que la sobreexpreeión de la quimera Fc de proteína relacionada con B7 (B7RP1-Fc) en ratones transgénicos induce un fenotipo caracterizado por hiperplasia linfoide reactivo prominente detectada en el bazo, nodulos linfáticos periféricos e internos y tejido linfoide asociado con intestino, como hiperplasia folicular, expansión de las áreas de célula T y plaemacitoeie conspicua acompañada por hiperglobulinemia en algunos animales. La plasmacitoeie ee acompañada por concentraciones máe altas de IgG circulante (media ± SD = 597 ± 597 ± 298 mg/ml en ratones tranegénicoe, versus 209 ± 80 mg/ml en sus contrapartes control, n = 7, P < 0.05, prueba t) , en particular IgG2a (217 ± 100 mg/ml versus 75 ± 29 mg/ml, n = 7, P < 0.01, prueba t) . La inducción de lgG2a normalmente se asocia con citosinas Thl tales como IFN-g. Por lo tanto, B7RP-1 induce proliferación de células B y T y estimula a las células B para que se diferencien en células plaemáticas y para que produzcan inmunoglobulina. Estos cambios son consistentes con una respueeta inmune sistémica persistente con hiperestimulación del brazo humoral del eietema inmune lo que reeulta en eetimulación, proliferación y diferenciación de células T plasmáticas productoras de anticuerpo a través de los órganos linfoides examinados . Concluimoe a partir de la hiperplaeia linfoide notable que ee demuestra en ratones transgénicos B7RP1-Fc en la proteína B7RP1 tiene actividad biológica in vivo significativa, en relación con la estimulación del sistema inmune .

Ejemplo 14 Clonación de B7RP1 humana Los linfocitos periféricos circulantes humanos normales se separan de los eritrocitos utilizando Lymphocyte Separation Médium (ICN Pharmaceuticals) . Las célulae T deepuée se activan con 10 µg/ml en anticuerpo contra CD3 unido a placa (Immunotech, Westbrook, ME) , 10 ng/ml de PMA y 500 ng/ml de ionomicina durante la noche (16 horas) a 37°C y C02 5%. El ARN total después se prepara de las células utilizando reactivo TRIzol (Gibco BRL) . Las células se sedimentan por centrifugación y el sedimento celular se resuspende en 1 ml de reactivo TRIzol por cada 5 X 106 células y ee incuba a temperatura ambiente durante 5 min. Después se agregan 0.2 ml de cloroformo por 1 ml de reactivo TRIzol original . Los tubos se agitan vigorosamente a mano durante 15 segundos y se incuban durante 3 minutos a RT (temperatura ambiente) y se centrifugan a 13,000 rpm durante 15 min a 4°C. Después de la centrifugación, la fase acuosa superior transparente la cual contiene el ARN se recolecta y el ARN demuestra se precipita por la adición de alcohol isopropílico. La solución despuée se incuba a RT durante 10 min, el ARN se eedimenta, ee lava con etanol 75% y deepuée se centrifuga a 15,000 rpm durante 5 min a 4°C. El sedimento se seca al aire, se resuspende en agua libre de ARNsa y después se forman alícuotas y se almacenan a -80 °C hasta su uso posterior.

La biblioteca ee construye utilizando el eietema SuperScript Plaemid para síntesis de ADNc y Plasmid Cloning (Gibco BRL) . Brevemente, las inserciones de ADNc con un tamaño promedio de 2 kb ee ligan en el vector pSport en el sitio de clonación Sall/Notl. Los plásmidoe ligadoe ee someten a electroporación en transformación Electromax competente E. coli (Gibco BRL) , se titulan y se siembran en placa a quince mil coloniae por placa LB (ampicilina, 100 µg/ml) . Se levantan 300,000 coloniae sobre las membranas de transferencia de hibridación de tamiz colonia/placa (NEN Life Sciences) , se desnaturalizan en NaOH 0.5 N, NaCl 1.5 M durante 5 minutos y después se neutralizan sucesivamente durante 5 min, cada una en los siguientes amortiguadores. Tris HCl 1 M pH 8.0, Tris HCl 0.5 M, pH 8.0 y NaCl 1.5 M y 2X SSC. Los filtros después ee reticulan por irradiación ultravioleta y se someten a calentamiento durante 30 min a 80 °C en un horno de vacío. Los filtros se lavan previamente de manera extensa en 2X SSC a 42 °C para remover los residuoe, deepuée ee prehibridizan a 42 °C en formamida 50%, SSPE 5X, solución de Denhardt 5X, SDS 0.5%, 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón, durante 2 horas. La biblioteca de .ADNc linfocítica humana se examina con un fragmento de ADN de 895 pb que tiene nucleótidos 1-711 como se muestra en la figura 3A, 167 pbs inmediatamente 5' respecto al codón iniciador de metionina en la figura 3A y 17 pbs inmediatamente 3' a la posición 711 en la figura 3A.

Eeta eecuencia hacia el extremo 5' de 167 paree de baees se obtiene por 5' RACE del ADNc para HuB7RPl (Ejemplo 4) y se libera de un vector TOPO TA (Invitrogen, Carlsbad, CA) en un sitio de separación de enzima de restricción ECO Rl . Esta inserción se purifica dos veces en un gel de TAE agarosa 0.8%. Se utiliza un equipo de purificación en gel de ADN (Qiagen) para aislar la ineerción de ADN de la agaroea. Se marcan 125 ng del fragmento de ADN con 32P dCTP (Amersham) siguiendo el protocolo del sistema de marcado de cebador aleatorio Redi-Prime 2 (Amereham) . Deepués los filtros de elevación de colonia se permite que hibridicen con la sonda a 42 °C en el siguiente amortiguador durante la noche a 42 °C; formamida 50%, 5X SSPE, eolución de Denhardt 2X, SDS 0.5%, 100 mg/ml de eeADN. La actividad específica de la sonda es de 2.38 X 109 cpm/µg de ADN en aproximadamente 2 ng de eonda marcada por ml de amortiguador de hibridación. La eonda se remueve y se guarda para la siguiente ronda de exploración. Loe filtroe deepuée ee lavan en 2X SSC, SDS 0.1% RT durante 15 min, seguido por IX SSC, SDS 0.1% a 55 °C durante 15 min, y IX SSC, SDS 0.1% a 60 °C durante 10 min. Los filtros se envuelven en plástico y ee exponen a película de autorradiografía durante la noche a -80 °C con doe tamicee mejoradoree. Se identifican tres clonas positivas independientes. Las exposiciones se alinean a las placas bacterianas y se raspan las clonas positivas, se diluyen y se vuelven a sembrar en placa sobre placae LB con 100 µg/ml de ampicilina, ee hacen crecer durante la noche como en lo anterior y lae coloniae ee levantan, se preparan y se realizan sondas como se describe previamente. Se aislan tres colonias de clonas independientes, se aisla el 7ADN y se secuencia el ADN para cada clona por triplicado. La longitud completa de la proteína B7RP1 humana es de 302 aminoácidos. La longitud del polipéptido y la posición relativa de la línea transmembranal es consistente con otros miembros de la familia B7. El gen para B7RP1 humana tiene 43% de identidad de aminoácidos con la clona de ratón. Este grado de homología es significativo pueeto que lae proteínas CD80 de ratón y de humano son únicamente 41% idénticas. De manera conservada notablemente entre los genes de ratón y de humano están los residuos cisteína en las posiciones de aminoácidos 37, 113, 158, 215 y 216.

Ejemplo 15 Clonación de CRP1 humana Una búsqueda de homología blast Genbank (GCG, Univereity of Wieconein) utilizando la eecuencia B7RP1 murina (véaee la figura 2) recupera una clona genómica (Acceso Gen Bank No. AQ022676) que contiene una secuencia de 104 pb que muestra alta homología con el gen CRP1 murino. Se diseñan cebadores para clonación por PCR para superpoeición con esta secuencia.

' -GCA TAT TTA TGA-ATC CCA-31 (SECUENCIA DE IDENTIDAD NÚMERO: 34) 5 ' -ACT ATT AGG GTC ATG CAC-3" (SECUENCIA DE IDENTIDAD NÚMERO: 35) Utilizando los cebadores anteriores, un fragmento de ADN de 151 pb de CRP1 murino se amplifica por PCR utilizando el plásmido CRP1 murino descrito en la figura 1 y el Ejemplo 1 como plantilla. 125 ng del ADN se marcan con 32P dCTP (Amerhsam) eeguido por Redi-Prime 2 (Amereham) como protocolo de eistema de marcado de cebador aleatorio. Los filtros de elevación de colonia de las bibliotecas de sangre periférica humana descritas en el Ejemplo 15 despuée ee permite que hibridicen con la eonda en el eiguiente amortiguador de hibridación durante la noche (15 h) a 41°C, formamida 50%, 5X SSPE, ?olución de Denhardt 2X, SDS 0.5%, 100 µg/ml de eeADN. La actividad eepecífica de la eonda ee de 3.52 X 109 cpm/µg de ADN, 1.5 ng de eonda marcada/ml de amortiguador de hibridación. La sonda se jala y se guarda para la siguiente ronda de examen. Los filtros despuée ee lavan en 2X SSC, SDS 0.1% a RT durante 10 min, eeguido por IX SSC, SDS 0.1% a 37 °C durante 7 min, 40 °C durante 7 min, 44 °C durante 7 min, y después 50 °C durante 7 min, vigilando continuamente la velocidad a la cual los filtros liberan la sonda marcada. Los filtroe ee envuelven en pláetico y ee exponen a la película durante la noche a -80 °C con doe pantallas de mejoramiento. Este método muestra 9 posiblee clonas positivae independientee . Lae expoeicionee ee alinean con lae placae bacterianas y las clonas positivae se raspan, se depositan en 200 µl de SOC, 2 diluciones seriadas de 1:10 se realizan y 70 µl de la segunda dilución se vuelven a sembrar en placa sobre placas LB que contienen ampicilina a 100 µg/ml y se hacen crecer durante la noche como en lo anterior. Lae colonias se levantan, ee preparan y se sondean como en lo anterior. Se aislan ocho clonas independientee y ee prepara el ADN por el método de minipreparación Qiagen. Se obtiene una clona de ADNc que contiene un marco de lectura abierta de 199 aminoácidoe (figura 13A) . Eeta clona de ADNc contiene homologíae nucleotídicae y de aminoácidos con la clona CRP1 murina descrita en el Ejemplo 1 y la figura 1. Los nucleótidos que correeponden al marco de lectura abierta de eeta clona humana son 77% idénticos con el gen CRP1 murino. La traducción de la secuencia humana y la comparación subeecuente con la proteína CRP1 murina mueetra 69% de identidad de aminoácidoe con la proteína murina (figura 13B) . Además, el motivo entre los aminoácidos 114 y 119, "FDPPPF", se conserva entre los genes CRP1 murino y humano. Este motivo corresponde al motivo "MYPPPY" en CD28 murino y humano que es esencial para la interacción de la proteína B7. Además, las cisteínas en las posicionee de aminoácidoe 42, 109 y 141 también ee coneervan. Eetas cisteínae corresponden a las cisteínas en CD28 y CTLA-4 que están involucradas en la formación del rizo Ig y la dimerización de disulfu intermolecular. La similitud estrecha con CRP1 murina y las similitudes estructurales con la familia de homología CD28 indican que este ee el homólogo CRP1 humano.

Ejemplo 16 CRP-1 se expresa en linfocitos T de memoria en reposo Con el fin de estudiar la expresión CRP-1 en células T de memoria, se recolectan células T del bazo de ratones de 6-7 meses de edad. Estas células se someten a tinción doble utilizando B7RP-1-Fc marcado por un anticuerpo contra Fc humano conjugado con FITC y un anticuerpo conjugado con PE ya sea para CD44, CD45RB o CD69. La tinción con la proteína de fusión B7RP-1-Fc detecta la expresión de la proteína CRP-1 en estas células T. Los ratones más viejos muestran más células T del bazo CRP-+ en comparación con los ratones más jóvenes. De mane interesante, un número conspicuo de estas células son altas CD44 (Figura 14a) y bajas en CD45RB (Figura 14b) , un perfil típico de las células T de memoria. Estae célulae T de memoria CRP-1+ están en estado de reposo, puesto que no expresan el marcador de activación CD69 (Figura 14c) . La expresión de CRP-1 en células T de memoria indica que CRP-1 tiene funciones coestimuladoras en células T de memoria.

Ejemplo 17 Coestimulación de células T in vi tro inhibida anticuerpos para B7RP-1.

Para determinar si la proteína B7RP-1 tie importancia funcional con las células T, incubamos células T CD3+ con la proteína de fusión B7RP-1-Fc y con un anticuerpo contra CD3 en un ensayo de proliferación in vi tro . Después se utilizaron anticuerpos policlonales de conejo contra B7RP1 o anticuerpos monoclonales de rata contra B7RP1 para inhibir específicamente la proliferación in vi tro coestimulada por B7RP1-FC.

Preparación de antisuero policlonal de conejo B7RP-1 Se inyectó a tres conejos blancoe New Zealand (con un peeo inicial de 2.3-3.6 kg (5-8 librae) con proteína B7RP1 murina. Cada conejo ee inmunizó en el día 1 con 150 µg de proteína B7RP1 murina emuleificada en un volumen igual de adyuvante completo de juntae Titer Max. Se llevaron a cabo refuerzos adicionales (días 14 y 28) por el m procedimiento. Se vigilaron loe títuloe de anticuerpo por EIA. Deepuée del eegundo refuerzo los antisueros mostraron títulos moderados de anticuerpos. Después se obtiene una extracción de sangre de producción de 30 ml de cada animal. Esto se repite cada semana durante 6 semanae . Loe anticuerpoe policlonalee después se purificaron por cromatografía en agarosa proteína A, seguido por cromatografía de afinidad de proteína Fc de selección negativa y selección positiva por cromatografía de afinidad B7RP-l-Fc.

Preparación de anticuerpo de rata monoclonal contra B7RP1 murino Se generaron anticuerpos monoclonales de rata contra B7RP1 murino como se describe en Practical Immulogy, segunda edición (1980; L. Hudson y F.C. Hay; Blackwell Scientific Publications; St . Louie, MO) . Brevemente se inyectó a ratas Lou (Harían; Indianapolis, IN) intraperitonealmente con proteína de fusión MUB7RP1-FC emulsificada el adyuvante de Freund a intervaloe de 4 eemanae . Tree días antes de la infusión, se refuerza a las ratas intravenosamente con muB7RPl soluble. En el día de la fusión, el animal se sacrifica bajo dióxido de carbono y se extirpa el bazo asépticamente. Se genera una suspensión de células utilizando solas utilizando tejido estomacal . Tanto los estrenocitos como las células de mieloma Y3-Agl.2.3 (American Type Culture Collection; Rockville, MD) se lavan en medio libre de suero y deepuée ee fueionan por adición de polietilenglicol (PEG 1500; Boehringer Mannheim Biochemicale; Indianapolis, IN) . Las células se enjuagan una vez ee resuspenden en medio que contiene suero y se siembran en placas, en placas de cultivo de 96 pozos. De 10 a 12 días deepués, el medio de cada pozo se prueba para determinar anticuerpos específicos para B7RP1 vía un ensayo inmun solvente unido a enzima (EIA) directo. Las células de los pozos que indican potencial de unión se hacen crecer a cultivos de 10 ml y se congelan en nitrógeno líquido. El medio de cada cultivo se prueba adicionalmente en citrometría de flujo y en un ensayo de proliferación de células T funcional. Aquelloe que se determina son de interés por estos método se siembran en placa con colonias de células únicae, se seleccionan nuevamente por EIA, y las líneas de célulae finales ee mantienen para generación de anticuerpoe. Loe anticuerpoe ee purifican del medio de célula por cromatografía en agaroea y proteína A.

Preparación de células A y ensayoe de proliferación de células I Se purifican células T de los bazos de ratones C57B1/6 (hembras de 8-12 semanas de edad, Charles River Laboratories) por selección negativa a través de una columna de enriquecimiento de células T murinas (R&D Systeme) . Las células T despuée ee utilizan directamente o se purifican adicionalmente por lisis con anticuerpo y complemento como sigue se resuspenden -las célulae (2.5 x 106 célulae /ml) en medio RPMI que contiene anticuerpoe (todoe a 10 µg/ml y de Pharmingen) contra CDllb murino (clona Ml/70) , NK-1.1 (Clona PK136) , CD8a (clona 53-6.7), I-Ab (clona M5/114.15.2) , CDllc (clona HL3) , y el antígeno B220 (clona RA3-6B2) . Lae células despuée se incuban en hielo durante 30 min, se siembran a 1200 rpm, ee reeuependen en 4:1 vol/vol de RPMI : complemento de conejo (Sigma, #5-7764) , y ee incuba durante 30 min adicionales a 37 °C. Las célulae ee eedimentan nuevamente y ee repite el tratamiento con complemento. Antee de sembrar en placa, lae célulae ee lavan con RPMI que contiene FCS 10%. Se recubren placae de 96 pozos con fondo en U con anticuerpo contra CD3 (Clona 145-2C11, Pharmigen) a concentraciones que varían entre 0 a 1.2 µg/ml) y Fab2 contra IgG humana (Sigma, 12.5µg/ml) durante la noche a 4°C, eeguido por incubación durante 6-9 horas a 37 °C. Se cultivan células T (1 X 10s / pozo) en ausencia o preeencia de variae proteínae de fueión Fc durante 48 h y ee pulean durante por lo menos 18 horae con un 1 µCi de 3H-timidina. Las proteínas Fc control incluyen una proteína de fusión de OPG y Fc, y un fragmento de proteína Fc no fusionado. Las células deepués se cosechan y se cuenta la radioactividad incorporada. B7RP-1-Fc coestimula células T para que proliferen de una manera dependiente de la dosis ( Figura 15a) y el ant i cuerpo contra B7RP - 1 - Fc inhibe especí f i camente e s coestimulación dependiente de la dosie (Figura 15b) .

Ej emplo 18 Inhibidoree de la vía CRP-1/B7RP-1 dieminuyen el inicio de artritie reumatoide inducida por colágeno.

La artritis inducida por colágeno (CÍA) es un modelo animal de poliartritis autoinmune en roedores y primates que tiene similitudes con artritis reumatoide en humanos. La inmunización con especies heterólogas de colágeno tipo II (CII) induce una respueeta autoinmune a CII que lleva al desarrollo de CÍA en cepa de ratones eueceptiblee . Las cepas congénicas de ratonee con H-2r y H-2q son altamente susceptibles a CÍA. CÍA es mediada por los efectos sinergísticos de células T reactivas a CII y anticuerpos. Se disuelve CII porcina (Nabozny et al., Autoimmunity 20, 51-58 (1995)) en ácido acético 0.01N a una concentración de 2mg/ml y después se emulsifica en una relación 1:1 con CFA (Difco) . Se inmuniza a ratones sueceptiblee a artritis B10.RUI (H-2r) (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) con 100 µl de emulsión intradérmicamente en la base de la cola. Se vigila a los ratones 2-3 veces por semana para determinar el desarrollo de artritis. Se determina la gravedad de artritis utilizando un sistema de graduación para cada almohadilla como sigue 0: sin artritis; 1: enrojecimiento o hinchazón en 1-3 dedos; 2: hinchazón grave de la pata; 3: anquilosis en la articulación. La clasificación de cada miembro se suma para proporcionar un intervalo de gravedad de 0 a 12 para cada animal . Se inyecta a los ratones con 100 µg (en 200 µL) de proteína intraperitonealmente , dos veces por semana. E tratamiento comienza en el día 1 después de la inmunización con CII porcina y se detiene en el día 52 post inmunización. El experimiento se lleva a cabo en grupos de tratamiento de 10 ratones y los animales con calificacionee de 1 o euperioree se califican como positivos. Los resultados se muestran en la Figura 16 de la Tabla 1.

T/ABLA 1 Efecto de las proteínas de fusión CRP-1, B7RP-1, CTLA-4 Y B7.2 Fc en el inicio de artritis.

Grupos de tratamiento Media+/-s.d. día de inicio CTLA4-FC 60.0±0.0 CRPl-Fc 48.9±13.2 B7.2-FC 28.4±14.1 B7RP1-FC 33.9±16.6 PBS 37.7±17.1 En ratones tratados con proteína de fueión CRPl-Fc, el inicio de síntomas artríticos se retarda en aproximadamente 10 días, en comparación con los ratones tratados con PBS. Esto demuestra que la inhibición de la vía CRP-1/B7RP-1 puede aliviar los síntomas de enfermedad en este modelo de ratón de artritis reumatoide. Los ratones tratados con B7RP-l-Fc o B7.2-Fc muestran un inicio más temprano de enfermedad (Tabla 1 y Figura 16a) con un incremento en la gravedad artrítica (Figura 16b) en comparación con los controles tratados con PBS. Esto indica que la proteína de fusión B7RP-1-Fc mejora la respuesta inmune de las células T. Tal actividad puede ser útil para generar inmunidad antitumoral in vivo . Los efectos opuestoe por CRP-l-Fc y B7RP-l-Fc en ese modelo de ratón de artritis reumatoide indica que la vía puede ser manipulada para mejorar o inhibir el progreso de la enfermedad. El direccionamiento de la proteína CRP-1 con B7RP-l-Fc soluble mejora la enfermedad mientras que la interacción de CRP-l-Fc soluble con B7RP-1 inhibe los síntomas de la enfermedad .

E emplo 19 B7RP-l-Fc induce un fenotipo de enfermedad de intestino inflamatorio en ratones transgénicos .

La sobre expresión persistente de la proteína relaciona con B7 (B7RP1-Fc) en ratones transgénicoe de 22 a 25 semanas de edad (Ejemplo 12) induce un fenotipo sorprendente de enfermedad de intestino inflamatorio (IBD) con engrosamiento marcado e inflamación crónica de los inteetinoe delgado y grueeo (enterocolitie) y pérdida de peso en algunos animales. Histológicamente, los cambios inflamatorios más graves se encuentran en el colon proximal y distal, con cambios moderados en el intestino delgado. El colon proximal se engrosa marcadamente con ulceración fisurante, inflamación transmural e hipertrofia de la mucosa colónica, mientras que el colon distal tiene hipertrofia mucosal difusa (o erosión focal y atrofia glandular) sin ulceración. El intestino delgado proximal tiene hipertrofia mucosal moderada a marcada con cambios inflamatorios más moderados, mientras que el intestino delgado distal (íleon) tiene hipertrofia mucosal moderada y en algunos animales y atrofia en otros ratonee. Los cambios inteetinalee son máe gravee y ee encuentran de manera consistente en ratones transgénicoe B7RP-1 hembra, pero también ee observan en varios de los ratonee tranegénicoe macho en eete estudio. Es interesante hacer notar que los rasgos histológicos encontrados en el colon proximal, que incluyen la ulceración fisurante y la inflamación granulomatosa crónica transmural con células gigantes multinucleadas recuerda muy cercanamente a la que se observa en la enfermedad de Crohn que la colitis ulcerativa en humanos. Morfológicamente, esta colitis también imita el IBD descrito en ratones deficientes en interleucina-10, los cuales desarrollan desperdicio, anemia y enterocolitis que afecta a la totalidad del tractointestinal (Kuhn et al. 1993; Sartor 1995; Leach et al. 1999). Al igual que en ratones agénicos para IL-10, loe cambioe inicialee en ratones transgénicos B7RP-1-Fc consiste de infiltrados moderados focalee de células inflamatorias en la lámina propria sin hiperplasia pitelial colónica (Ejemplo 13) . En ratones más viejos, los segmentos colónicos afectados se engrosan debido a hipertrofia/hiperplasia glandular e inflamación crónica. Los colones proximal y distal de los ratones B7RP-1-Fc tienen colitis moderada a grave con rasgos histológicos de enfermedad de intestino inflamatorio (IBD) . Los segmentoe afectados del colon proximal (Figura 17B-17D) se encuentran engrosadoe de manera difuea, debido a la hipertrofia epitelial glandular prominente e hiperplasia con elongación y dilatación de las glándulas mucosales (Figura 17B) . Lo cual tiene números aumentados de cantidades mitóticas y abecesos crípticoe raroe, pero retienen lae célulae de globo con mucina (Figura 17D) . La mucosa tiene inflamación crónica difusa en la lámina propria con algunos animales extendiéndose transmuralmente para involucrar las capas subyacentes de la pared del intestino que incluyen la submucosa, capa muscular, serosa y el tejido graso mesentérico adyacente (Figuras 17B-17C) . Los infiltrados inflamatorios consisten de linfocitos (predominantemente células T CD3+ CD44+) , células plasmáticas y macrófagos epiteloides (Figura 17F) mezclados con algunos neutrófilos y células gigantes multinucleadas ocasionales (Figura 17E) , característico de la inflamación granulomatosa crónica. También están preeentee agregadoe linfoides (de manera principal células B220+ mezclado con números pequeños de células CD3+) también presentes en la mucosa y alrededor de los vasos sanguíneoe máe pequeños en la submucosa y capas más profundas que incluyen grasa mesentérica (Figura 17C) . El lumen contiene exudado mucopµrulento o mucoso (Figura 17D) . Se encuentra evidencia grave de colitis con ulceración fisurante multifocal de la mucosa e inflamación transmural (Figura 17B-17C) en estos ratones transgénicos B7RP-1-Fc. El colon distal de los ratones transgénicoe B7RP-1-FC también se engrosa de manera difusa y ee vuelve hiperpláeico con elongación, basofilia y dilatación de las glándulas colónicae (Figura 18B-18G) , algunas de las cuales contienen abscesos crípticos (Figura 18D y 18F) y moco. La lámina propria tiene infiltrado inflamatorio difuso moderado de linfocitoe (predominantemente células CD3+, CD44+, particularmente en la mucosa superficial; Figura, 18E) , así como células plasmáticas y agregados focales de macrófagos epitelioides mezclados con algunos neutrófilos. También se dispersan a través de la mucosa agregadoe linfoidee (predominantemente de célulae B220+; Figurae 18D y 18F) . El inteetino delgado de loe ratonee tranegénicoe B7RP-l-Fc tiene cambios más variables, que incluyen hipertrofia mucosal y críptica marcada moderada a focalmente e hiperplasia (Figuras 19B y 19D con relación de cripta/vellos que varían de 1:4 a 1.5:1, en comparación con 1:10 en loe ratonee control) acompañado por un infiltrado predominantemente linfoplaemacítico en la lámina propria. La hiperplasia mucosal es más prominente en el intestino delgado proximal, incluyendo el duodeno (Figura 19B) y particularmente el yeyuno (Figura 19D) . La arquitectura de cripta se daña focalmente y se vuelve displáeica en ratonee afectadoe de manera más grave (Figura 19D) . En contraste, los intestinos delgados distales (íleon) de algunos ratonee, tienen atrofia velloea de parches moderada de la mucosa del íleon (Figura 19F) con formaciones romas, engrosamiento o pérdida focal de vellos (con una relación de cripta: vellos de 1:1 o menos, en vez de la relación normal de 1:2), mientras que otros ratones presentan hipertrofia mucosal moderada del íleon. La proteína de fusión B7RP-1-Fc actúa para activar células que son las responeablee de inducir un fenotipo muy eimilar al de la enfermedad de Crohn en humanos . Esto indica que las células pueden ser las responeables de la inflamación en la enfermedad de Crohn son activadas por la proteína de fusión B7RP-l-Fc. La proteína soluble, en anticuerpo o inhibidores de moléculas pequeñas de B7RP-1 por lo tanto pueden ser útiles para inhibir IBD.

Ejemplo 20 La proteína de fusión B7RP-1-FC inhibe el crecimiento de tumores en ratones Para examinar el efecto B7RP-1- y CRP-1 en el crecimiento de sarcoma Meth A murinoinmunogénico, investigamoe si los efectos de B7RP-1-Fc soluble afectan el crecimiento de un sarcoma Meth A establecido en ratones Balb/c. Se implantan células de sarcoma Meth A de crecimiento exponencial por inyección intradérmica de 0.5 millones de célulae en el abdomen de ratonee Balb/c en el día 0. En el día 7, cuando loe tumoree alcanzan ~ 100 mm3, ee trata a loe ratones ya sea con vehículo (PBS) o B7RP-1-Fc (8mg/kg) subcutáneamente en el cuello, los días 7, 10, 14 y 17. Loe diámetros bidimensionales de los tumores se miden por calibradores y se estima el volumen de tumor (en mm3) utilizando la fórmula: volumen de tumor = [{(anchura (2 x 1 longitud} /2] . El crecimiento del tumor se vigila hasta el día 28. Cada grupo tiene ocho ratones. El patrón de crecimiento de sarcoma Meth A del tumor control es bifásico: una fase inicial lenta seguida por una faee exponencial relativamente rápida. En ratonee tratados con B7RP-1-Fc, el crecimiento del tumor es significativamente más lento en la fase exponencial rápida. En el día 28, los volúmenes promedio de los ratones control y tratadoe con B7RP-1-Fc fueron de 1410 mm3 y 580 mm3, respectivamente (Figura 20) . Por lo tanto, el tratamiento con B7RP-1-FC inhibe significativamente el crecimiento del tumor en este modelo. Los datos sugieren fuertemente la utilidad terapéutica benéfica de la proteína B7RP-1-Fc soluble y otros activadoree de la vía B7RP-1/CRP-1, en el tratamiento de tumores inmunogénicos. La actividad antitumoral inmunológica está relaciona estrechamente con la función de los linfocitos T citolíticos (CTL) . De manera consistente, la proteína B7RP-l-Fc se expresa en células T CD8+ citolíticas (Ejemplo 9, figura 6) . Estoe datoe euetentan fuertemente las funciones de B7RP-1 en células T CD8+ citolíticas. B7RP-1-FC, u otros estimuladores de la vía B7RP-1/CRP-1 por lo tanto se pueden utilizar para mejorar lae funcionee inmunes de células T citolíticas y celulares para muchas indicaciones no relacionadas con cáncer.

Ejemplo 21 Inhibición de la actividad de B7RP-1 humana in vitro Para determinar si B7RP-1 humana tiene propiedades coestimuladoras positivas, probamos células que expresan B7RP-1 humana y la proteína de fusión B7RP-1-Fc en eneayos de proliferación de células T. La proteína de fusión B7RP-1-Fc humana se construye el fusionar secuencias de genes que corresponden a los aminoácidos 1 a 247 con una secuencia de gen IgGl humana parcial (Ejemplo 14) . La proteína de fusión CRPl-Fc humana se construye al fusionar secuencias de genes que corresponden a los aminoácidos 1 a 146 con una eecuencia de gen IgGl humana parcial (Ejemplo 2) . Loe métodos de construcción, expresión y purificación de ambas proteínas de fusión se llevan a cabo como se describe en el Ejemplo 7. B7RP-1-Fc demuestra actividades coestimuladoras que dependen de estimulación contra CD3 (Figura 21a) . Además, esta actividad se puede inhibir específicamente con proteína CRP-l-Fc soluble (Figura 21b) . Se obtienen efectos coestimuladores similares utilizando células CHO que expresan B7RP-1 humana unida a membrana que contiene la totalidad de la secuencia codificante (Figura 21c) . La producción de citocinas por células T humanas bajo las condiciones de proliferación in vi tro anteriores se determina. Los sobrenadantes de cultivo de células T estimuladas durante 48 y 72 horas se analizan para IL-2, IL-10 e IFN-gamma por ELISA de acuerdo con las especificaciones del fabricante (BioSource International) . Las concentraciones de IFN-gamma e IL-10 se encuentran incrementadas de manera significativa; sin embargo, a diferencia del caso con la coestimulación con CD28, y IL-2 no se induce de manera notable (Figura 2ld) . Las concentraciones incrementadas de IFN-gamma, una citocina Thl se correlacionan con las porciones de B7RP-1 para incrementar IgG2a, como se describe en el Ejemplo 13. Los ensayos de coestimulación de células T in vitro se llevan a cabo como sigue. Se aislan células T humanas altamente purificadas (>98% CD3+) por selección negativa de PBMC frescas ó recalentadas, de adherencia suprimida utilizando esferae magnéticas marcadas con mAb (Miltenyi Biotec) . se cultivan células T (1 x 10S células/pozo) en pozos por triplicado en placas de 96 pozos en 200 µl/pozo de RPMI + FCS 10%. Para evaluar la coestimulación de B7RP-1-Fc, se recubren previamente diversas concentraciones de anticuerpo contra CD3 y (Pharmingen) y 10 µg/ml de Fc contra IgG humana (Sigma) en 100 µl de IX PBS en placas de fondo de U por incubación a 4CC durante la noche. El Fc contra CD3 y contra IgG humana no unido se remueve, y las células se cultivan en presencia o ausencia de diversas concentraciones de B7RP-1-Fc, OPG-Fc control o anticuerpo CD28 (Pharmingen) . Para inhibición de CRP-l-Fc de coestimulación de B7RP-1-Fc, se cultivan células T en 0.33 µg/ml de anticuerpo contra CD3 y 10 µg/ml de Fc contra IgG humana con pozos cubiertos previamente con 0.5 µg/ml de B7RP-1-Fc en presencia de CRP-l-Fc o de OPG-Fc diluido de manera serial, comenzando a 10 µg/ml. Para evaluar la coestimulación por células CHO que expresan B7RP-1, se cultivan células T en placas de fondo plano con diversas concentraciones de anticuerpo contra CD3 soluble en presencia o ausencia de diversas cantidades de células B7RP-1 CHO tratadas con mitomicina C o células vector CHO. Para probar la proliferación de células T, los cultivos se pulsan con 1 uCi/pozo [3H] TdR durante las últimas 18 h de un cultivo de 72 h. La proliferación de células T se determina por incorporación de [3H]TdR. Los resultados de un experimento representativo de tres donadores aleatorios se expresa como CPM media incorporada +/- SD. Para análisis de producción de citocina, se cultivan células durante 48 y 72 horas y se recolectan los sobrenadantes para someterlos a ELISA. Estos experimentos muestran que la porción extracelular de B7RP-1 humano, como se describe en el Ejemplo 14, cuando se fusiona al fragmento Fc humano, puede coestimular células T in vitro. Esta coestimulación es inhibida por CRP-l-Fc y por lo tanto demuestra cómo puede funcionar un inhibidor soluble de B7RP-1 humano. En ensayoe in vitro, talee como loe que se describen aquí utilizando B7RP-1 y CRP-1 humano, se pueden utilizar para examinar anticuerpos, proteína soluble, pepticuerpos o inhibidores moleculares pequeños de la actividad de B7RP-1/CRP-1.

Aunque la presente invención se ha descrito en términos de las modalidades preferidas, se entiende que se le ocurrirán variaciones y modificaciones a los expertoe en la técnica. Por lo tanto, ee pretende que las reivindicaciones anexas cubran la totalidad de variaciones y equivalentes que se encuentran dentro del alcance de la invención como se reivindica.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> .AMGEN INC. <120> <130> A-579A <140> 09/264,527 <141> 08-03-1999 :160> 35 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 600 <212> ADN <213> ratón <220> <221> CDS <222> Complemento ( (1) .. (600) ) <400> atg aag ceg tac ttc tgc cgt gtc ttt gtc ttc tgc ttc cta ate aga Met Lys Pro Tyr Phe Cys Arg Val Phe Val Phe Cys Phe Leu lie Arg 1 5 10 15 ctt tta acá gga gaa ate aat ggc tcg gcc gat cat agg atg ttt tea Leu Leu Thr Gly Glu lie Asn Gly Ser Ala Asp His Arg Met Phe Ser 20 25 30 ttt cae aat gga ggt gta cag att tet tgt aaa tac ect gag act gtc Phe His Asn Gly Gly Val Gln He Ser Cys Lys Tyr Pro Glu Thr Val 35 40 45 cag cag tta aaa atg cga ttg ttc aga gag aga gaa gtc etc tgc gaa Gln Gln Leu Lys Met Arg Leu Phe Arg Glu Arg Glu Val Leu Cys Glu 50 55 60 etc acc aag acc aag gga age gga aat gcg gtg tec ate aag aat cea Leu Thr Lys Thr Lye Gly Ser Gly Aen Ala Val Ser He Lye Aen Pro ' 65 70 75 80 atg etc tgt cta tat cat ctg tea aac aac age gtc tet ttt ttc cta Met Leu Cye Leu Tyr Hie Leu Ser Asn Asn Ser Val Ser Phe Phe Leu 85 90 95 aac aac cea gac age tec cag gga age tat tac ttc tgc age ctg tec Asn Asn Pro Asp Ser Ser Gln Gly Ser Tyr Tyr Phe Cys Ser Leu Ser 100 105 110 att ttt gac cea ect 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(864)) <400> 11 atg cgg ctg ggc agt ect gga ctg etc ttc ctg etc ttc age age ct Met Arg Leu Gly Ser Pro Gly Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ser Ser Le 1 5 10 15 cga gct gat act cag gag aag gaa gtc aga gcg atg gta ggc age ga Arg Ala Aep Thr Gln Glu Lye Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Ae 20 25 30 gtg gag etc age tgc gct tgc ect gaa gga age cgt ttt gat tta aa Val Glu Leu Ser Cye Ala Cye Pro Glu Gly Ser Arg Phe Aep Leu As 35 40 45 gat gtt tac gta tat tgg caá acc agt gag.teg aaa acc gtg gtg ac Asp Val Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lye Thr Val Val Th 50 55 60 tac cae ate cea cag aac age tec ttg gaa aac gtg gac age cgc ta Tyr His He Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Ty 65 70 75 8 cgg aac cga gcc ctg atg tea ceg gcc ggc atg ctg cgg ggc gac tt Arg Asn Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Ph 85 90 95 tec ctg cgc ttg ttc aac gtc acc ecc cag gac gag cag aag ttt ca Ser Leu Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe Hi 100 105 110 tgc ctg gtg ttg age caá tec ctg gga ttc cag gag gtt ttg age gt Cye Leu' Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Va 115 120 125 gag gtt acá ctg cat gtg gca gca aac ttc age gtg ecc gtc gtc ag Glu Val Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Se 130 135 140 gcc ecc cae age ecc tec cag gat gag etc acc ttc acg tgt acá te Ala Pro His Ser Pro Ser Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Se 145 150 155 16 ata aac ggc tac ecc agg ecc aac gtg tac tgg ate aat aag acg ga He Asn Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp He Asn Lye Thr As 165 170 175 aac age ctg ctg gac cag gct ctg cag aat gac acc gtc ttc ttg aa Asn Ser Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu As 180 185 190 atg cgg ggc ttg tat gac gtg gtc age gtg ctg agg ate gca cgg ac Met Arg Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg He Ala Arg Th 195 200 205 ecc age gtg aac att ggc tgc tgc ata gag aac gtg ctt ctg cag ca Pro Ser Val Asn He Gly Cys Cye He Glu Aen Val Leu Leu Gln Gl 210 215 220 aac ctg act gtc ggc age cag acá gga aat gac ate gga gag aga ga Aen Leu Thr Val Gly Ser Gln Thr Gly Aen Aep He Gly Glu Arg As 225 230 235 24 aag ate acá gag aat cea gtc agt acc ggc gag aaa aac gcg gcc ac Lys He Thr Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Th 245 250 255 tgg age ate ctg gct gtc ctg tgc ctg ctt gtg gtc gtg gcg gtg gcc Trp Ser He Leu Ala Val Leu Cys Leu Leu Val Val Val Ala Val Ala 260 265 270 ata ggc tgg gtg tgc agg gac cga tgc etc caá cae age tat gca ggt He Gly Trp Val Cys Arg Asp Arg Cys Leu Gln His Ser Tyr Ala Gly 275 280 285 <210> 12 <211> 288 <212> PRT <213> ratón <400> 12 Met Arg Leu Gly Ser Pro Gly Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ser Ser Leu 1 5 10 15 Arg Ala Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp 20 25 30 Val Glu Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn 35 40 45 Asp Val Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr 50 55 60 Tyr His He Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Ty 65 70 75 80 Arg Asn Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe 85 90 95 Ser Leu Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His 100 105 110 Cys Leu Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val 115 120 125 Glu Val Thr Leu His Val Ala Ala Aen Phe Ser Val Pro Val Val Ser 130 135 140 Ala Pro Hie Ser Pro Ser Gln Aep Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser 14? 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170 175 Asn Ser Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn 180 185 190 Met Arg Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg He Ala Arg Thr 195 200 205 Pro Ser Val Asn He Gly Cys Cys He Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln 210 215 220 Asn Leu Thr Val Gly Ser Gln Thr Gly Asn Aep He Gly Glu Arg Aep 225 230 235 240 Lye He Thr Glu Aen Pro Val Ser Thr Gly Glu Lye Aen Ala Ala Thr 245 250 255 Trp Ser He Leu Ala Val Leu Cys Leu Leu Val Val Val Ala Val Ala 260 265 270 He Gly Trp Val Cys Arg Asp Arg Cys Leu Gln His Ser Tyr Ala Gly 275 280 285 Ala Trp Ala Val Ser Pro Glu Thr Glu Leu Thr Gly Hie Val 290 295 300 <210> 18 <211> 302 <212> PRT <213> Humano <400> 18 Met Arg Leu Gly Ser Pro Gly Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ser Ser Leu 1 5 10 15 Arg Ala Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp 20 25 30 Val Glu Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn 35 40 45 Asp Val Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lye Thr Val Val Thr 50 55 60 Tyr His He Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr 65 70 75 80 Arg Asn Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe 85 90 95 Ser Leu Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His 100 105 110 Cys Leu Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val 115 120 125 Glu Val Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser 130 135 140 Ala Pro His Ser Pro Ser Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser 145 150 155 160 He Asn Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp He Asn Lye Thr Aep 165 170 175 Aen Ser Leu Leu Aep Gln Ala Leu Gln Aen Aep Thr Val Phe Leu Aen 180 185 190 Met Arg Gly Leu Tyr Aep Val Val Ser Val Leu Arg He Ala Arg Thr 195 200 205 Pro Ser Val Asn He Gly Cys Cys He Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln 210 215 220 Asn Leu Thr Val Gly Ser Gln Thr Gly Asn Asp He Gly Glu Arg Asp 225 230 235 240 Lys He Thr Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Thr 245 250 255 Trp Ser He Leu Ala Val Leu Cys Leu Leu Val Val Val Ala Val Ala 260 265 270 He Gly Trp Val Cys Arg Asp Arg Cys Leu Gln His Ser Tyr Ala Gly 275 280 285 Ala Trp Ala Val Ser Pro Glu Thr Glu Leu Thr Gly His Val 290 295 300 <210> 19 <211> 322 <212> PRT <213> ratón <400> 19 Met Gln Leu Lys Cys Pro Cys Phe Val Ser Leu Gly Thr Arg Gln Pro 1 5 10 15 Val Trp Lys Lys Leu His Val Ser Ser Gly Phe Phe Ser Gly Leu Gly 20 25 30 Leu Phe Leu Leu Leu Leu Ser Ser Leu Cys Ala Ala Ser Ala Glu Thr 35 40 45 Glu Val Gly Ala Met Val Gly Ser Asn Val Val Leu Ser Cys He Asp 50 55 60 Pro His Arg Arg His Phe Asn Leu Ser Gly Leu Tyr Val Tyr Trp Gln 65 70 75 80 He Glu Asn Pro Glu Val Ser Val Thr Tyr Tyr Leu Pro Tyr Lys Ser 85 90 95 Pro Gly He Asn Val Asp Ser Ser Tyr Lys Asn Arg Gly His Leu Ser 100 105 110 Leu Asp Ser Met Lys Gln Gly Asn Phe Ser Leu Tyr Leu Lys Asn Val 115 120 125 Thr Pro Gln Asp Thr Gln Glu Phe Thr Cys Arg Val Phe Met Asn Thr 130 135 140 Ala Thr Glu Leu Val Lys He Leu Glu Glu Val Val Arg Leu Arg Val 145 150 155 160 Ala Ala Asn Phe Ser Thr Pro Val He Ser Thr Ser Asp Ser Ser Asn 165 170 175 Pro Gly Gln Glu Arg Thr Tyr Thr Cys Met Ser Lys Asn Gly Tyr Pro 180 185 190 Glu Pro Asn Leu Tyr Trp He Asn Thr Thr Asp Asn Ser Leu He Asp 195 200 205 Thr Ala Leu Gln Asn Asn Thr Val Tyr Leu Aen Lys Leu Gly Leu Tyr 210 215 220 Asp Val He Ser Thr Leu Arg Leu Pro Trp Thr Ser Arg Gly Asp Val 225 230 235 240 Leu Cys Cys Val Glu Asn Val Ala Leu His Gln Asn He Thr Ser He 245 250 255 Ser Gln Ala Glu Ser Phe Thr Gly Asn Asn Thr Lys Asn Pro Gln Glu 260 265 270 Thr His Asn Asn Glu Leu Lys Val Leu Val Pro Val Leu Ala Val Leu 275 280 285 Ala Ala Ala Ala Phe Val Ser Phe He He Tyr Arg Arg Thr Arg Pro 290 295 300 His Arg Ser Tyr Thr Gly Pro Lys Thr Val Gln Leu Glu Leu Thr Asp 305 310 315 320 His Ala <210> 20 <211> 329 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleó sintético <400> 20 Met Xaa Leu Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Leu Xaa 20 25 30 Leu Phe Xaa Leu Leu Xaa Ser Ser Leu Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Glu Xaa 35 40 45 Glu Val Xaa Ala Met Val Gly Ser Xaa Val Xaa Leu Ser Cys Xaa Xaa 50 55 60 Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Tyr Val Tyr Trp Gln 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Thr Tyr Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Ser 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Asn Val Asp Ser Xaa Tyr Xaa Asn Arg Xaa Xaa Xaa Ser 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Met Xaa Xaa Gly Xaa Phe Ser Leu Xaa Leu Xaa Asn Val 115 120 125 Thr Pro Gln Asp Xaa Gln Xaa Phe Xaa Cye Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa 130 135 140 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Val Xaa Leu Xaa Val 145 150 155 160 Ala Ala Aen Phe Ser Xaa Pro Val Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Thr Xaa Thr Cye Xaa Ser Xaa Asn Gly Tyr Pro 180 185 190 Xaa Pro Asn Xaa Tyr Trp He Asn Xaa Thr A sp Asn Ser Leu Xaa Asp 195 200 205 Xaa Ala Leu Gln Aen Xaa Thr Val Xaa Leu Aen Xaa Xaa Gly Leu Tyr 210 215 220 Aep Val Xaa Ser Xaa Leu Arg Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 225 230 235 240 Xaa Cye Cye Xaa Glu Aen Val Xaa Leu Xaa Gln Aen Xaa Thr Xaa Xaa 245 250 255 Ser Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa 260 265 270 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Ala 275 280 285 Val Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa He Xaa Xaa Xaa Xaa 290 295 300 Arg Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Tyr Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Val Xaa 305 310 315 320 Xaa Glu Xaa Xaa Leu Thr Xaa His Xaa 325 <210> 21 <211> 1370 <212> ADN <213> Human <220> <221> 5* UTR <222> (1) .. (165) <220> <221> CDS <222> (166) .. (762) <400> 21 aacaatttca cacaggaaac agctatgacc atgattacgc caagctctaa tacgactcac tatagggaaa gctggtacgc ctgcaggtac cggtccggaa ttcccgggtc gacccacgcg tccgtgaaca ctgaacgcga ggactgttaa ctgtttctgg caaac atg aag tea ggc Met Lys Ser Gly 1 etc tgg tat ttc ttt etc ttc tgc ttg cgc att aaa gtt tta acá gga Leu Trp Tyr Phe Phe Leu Phe Cys Leu Arg He Lys Val Leu Thr Gly 5 10 15 20 gaa ate aat ggt tet gcc aat tat gag atg ttt ata ttt cae aac gga Glu 'lie Asn Gly Ser Ala Asn Tyr Glu Met Phe He Phe His Asn Gly 25 30 35 ggt gta caá att tta tgc aaa tat ect gac att gtC Cag caá ttt aaa Gly Val Gln He Leu Cys Lys Tyr Pro Asp He Val Gln Gln Phe Lys 40 45 50 atg cag ttg ctg aaa ggg ggg caá ata etc tgc gat etc act aag acá Met Gln Leu Leu Lys Gly Gly Gln He Leu Cys Asp Leu Thr Lys Thr 55 60 65 aaa gga agt gga aac acá gtg tec att aag agt ctg aaa ttc tgc cat Lys Gly Ser Gly Asn Thr Val Ser He Lys Ser Leu Lys Phe Cys Hie 70 75 80 tet cag tta tec aac aac agt gtc tet ttt ttt cta tac aac ttg gac Ser Gln Leu Ser Aen Asn Ser Val Ser Phe Phe Leu Tyr Asn Leu Asp 85 90 95 100 cat tet cat gcc aac tat tac ttc tgc aac cta tea att ttt gat ect His Ser ?is Ala Aen Tyr Tyr Phe Cye Aen Leu Ser He Phe Aep Pro 105 110 115 ect ect ttt aaa gta act ctt acá gga gga tat ttg cat att tat gaa Pro Pro Phe Lys Val Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Leu His He Tyr Glu 120 125 130 tea caá ctt tgt tgc cag ctg aag ttc tgg tta ecc ata gga tgt gca Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu Lys Phe Trp Leu Pro He Gly Cys Ala 135 140 145 gcc ttt gtt gta gtc tgc att ttg gga tgc ata ctt att tgt tgg ctt Ala Phe Val Val Val Cys He Leu Gly Cys He Leu He Cys Trp Leu 150 155 160 acá aaa aag aag tat tea tec agt gtg cae gac ect aac ggt gaa tac Thr Lys Lye Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn Gly Glu Tyr 165 170 175 180 atg ttc atg aga gca gtg aac acá gcc aaa aaa tet aga etc acá gat Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg Leu Thr Asp 185 190 195 gtg acc cta taatatggaa ctctggcacc caggcatgaa gcacgttggc 802 Val Thr Leu cagttttcct caacttgaag tgcaagattc tettatttec gggaccacgg agagtctgac ttaactacat acatettetg ctggtgtttt gttcaatctg gaagaatgac tgtatcagtc aatggggatt ttaacagact gccttggtac tgccgagtcc tctcaaaaca aacaccctct tgcaaccagc tttggagaaa gcccagctcc tgtgtgctca ctgggagtgg aatccctgtc tccacatctg ctcctagcag tgcatcagcc agtaaaacaa acacatttac aagaaaaatg ttttaaagat gccaggggta ctgaatctgc aaagcaaatg ageagecaag gaccagcatc tgtccgcatt tcactatcat actacctctt etttetgtag ggatgagaat tcctctttta atcagtcaag ggagatgett caaagctgga getattttat ttctgagatg ttgatgtgaa ctgtacatta gtacataetc agtactctcc ttcaattgct gaaccccagt tgaccatttt accaagactt tagatgettt cttgtgcc <210> 22 <211> 199 <212> PRT <213> Humano <400> 22 Met Lys Ser Gly Leu Trp Tyr Phe Phe Leu Phe Cys Leu Arg He Lys • 1 5 10 15 Val Leu Thr Gly Glu He Aen Gly Ser Ala Aen Tyr Glu Met Phe He 20 25 30 Phe Hie Aen Gly Gly Val Gln He Leu Cys Lys Tyr Pro Asp He Val 35 40 45 Gln Gln Phe Lys Met Gln Leu Leu Lys Gly Gly Gln He Leu Cys Asp 50 55 60 Leu Thr Lys Thr Lys Gly Ser Gly Asn Thr Val Ser He Lys Ser Leu 65 70 75 80 Lys Phe Cys His Ser Gln Leu Ser Asn Asn Ser Val Ser Phe Phe Leu 85 90 95 Tyr Asn Leu Aep Hie Ser Hie Ala Aen Tyr Tyr Phe Cys Asn Leu Ser 100 105 110 He Phe Asp Pro Pro Pro Phe Lys Val Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Leu 115 120 125 His He Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu Lys Phe Trp Leu Pro 130 135 140 He Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val Cys He Leu Gly Cys He Leu 145 150 155 160 He Cys Trp Leu Thr Lys Lye Lye Tyr Ser Ser Ser Val Hie Aep Pro 160 170 175 Aen Gly Glu Tyr Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser 180 185 190 Arg Leu Thr Asp Val Thr Leu 195 <210> 23 <211> 199 <212> PRT <213> Humano <400> 23 Met Lys Ser Gly Leu Trp Tyr Phe Phe Leu Phe Cys Leu Arg He Lys 10 15 Val Leu Thr Gly Glu He Asn Gly Ser Ala Asn Tyr Glu Met Phe He 20 25 30 Phe His Asn Gly Gly Val Gln He Leu Cys Lys Tyr Pro Asp He Val 35 40 45 Gln Gln Phe Lys Met Gln Leu Leu Lys Gly Gly Gln He Leu Cys Asp 50 55 60 Leu Thr Lys Thr Lys Gly Ser Gly Asn Thr Val Ser He Lys Ser Leu 65 70 75 80 Lys Phe Cys His Ser Gln Leu Ser Asn Asn Ser Val Ser Phe Phe Leu 85 90 95 Tyr Asn Leu Asp His Ser His Ala Asn Tyr Tyr Phe Cys Asn Leu Ser 100 105 ' 110 He Phe Aep Pro Pro Pro Phe Lye Val Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Leu 115 120 125 Hie He Tyr Glu Ser Gln Leu Cye Cye Gln Leu Lys Phe Trp Leu Pro 130 135 140 He Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val Cys He Leu Gly Cys He Leu 145 150 155 160 He Cys Trp Leu Thr Lye Lye Lye Tyr Ser Ser Ser Val Hie Asp Pro 165 170 175 Asn Gly Glu Tyr Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lye Ser 180 185 190 Arg Leu Thr Asp Val Thr Leu 195 <210> 24 <211> 200 <212> PRT <213> ratón <400> 24 Met 'Lys Pro Tyr Phe Cys Arg Val Phe Val Phe Cys Phe Leu He Arg 1 5 10 15 Leu Leu Thr Gly Glu He Asn Gly Ser Ala Asp His Arg Met Phe Ser 20 25 30 Phe His Asn Gly Gly Val Gln He Ser Cys Lys Tyr Pro Glu Thr Val 35 40 45 Gln Gln Leu Lys Met Arg Leu Phe Arg Glu Arg Glu Val Leu Cys Glu 50 55 60 Leu Thr Lys Thr Lys Gly Ser Gly Asn Ala Val Ser He Lys Asn Pro 65 70 75 80 Met Leu Cye Leu Tyr Hie Leu Ser Aen Asn Ser Val Ser Phe Phe Leu 85 90 95 Asn Asn Pro Asp Ser Ser Gln Gly Ser Tyr Tyr Phe Cys Ser Leu Ser 100 105 110 He Phe Asp Pro Pro Pro Phe Gln Glu Arg Asn Leu Ser Gly Gly Tyr 115 120 125 Leu His He Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu Lys Leu Trp Leu 130 135 .140 Pro Val Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val Leu Leu Phe Gly Cys He 145 150 155 160 Leu He He Trp Phe Ser Lys Lys Lys Tyr Gly Ser Ser Val His Asp 165 170 175 Pro Aen Ser Glu Tyr Met Phe Met Ala Ala Val Aen Thr Aen Lye Lye 180 185 190 Ser Arg Leu Ala Gly Val Thr Ser 195 200 <210> 25 <211> 24 <212> .ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la eecuencia artificial: Oligonucleó sintético <400> 25 accatgcggc tgggcagtcc tgga 24 <210> 26 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleó sintético <400> 26 tggtgaccta ccacatccca cag 23 <210> 27 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleó sintético <400> 27 tccgatgtca tttcctgtct ggc 23 <210> 28 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleó sintético <400> 28 gctctgtctc cggactcaca gccc 24 <210> 29 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleó sintético <400> 29 gtggeageaa acttcagcgt gcccgtcg <210> 30 <211:> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucle sintético <400> 30 cccaacgtgt actggatcaa taagacgg <210> 31 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucle sintético <400> 31 gcgtgctgag gategeaegg acccccag <210> 32 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial : Oligonucle sintético <400> 32 geetetagaa agagetggga c <210> 33 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucle sintético <400> 33 cgccgtgttc catttatgag c <210> 34 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223: Descripción de la secuencia artificial : Oligonucle eintético <400> 34 gcatatttat gaatccca <210> 35 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Deecripción de la eecuencia artificial: Oligonucle sintético <400: 35 actattaggg tcatgcac 18 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (31)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Una molécula aislada de ácido nucleico caracterizada porque comprende una secuencia nucleotídica que se selecciona del grupo que consiete de: a) la secuencia nucleotídica que se establece en la figura ÍA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1) ; b) la secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido de los residuoe 1-200 o de loe residuos 21-200 como se establece en la figura ÍA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1) ; c) una secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido que es por lo menos aproximadamente 70 por ciento idéntico al polipéptido que se establece en la figura ÍA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1) ; d) una variante alélica que se presenta de manera natural o una variante alternativa de corte y empalme, de cualquiera de los incisos (a) , (b) o (c) ; e) una secuencia nucleotídica complementaria con cualquiera de los incisos (a) , (b) o (c) ,- f) una secuencia nucleotídica de los incisos (b) , (c) o (d) que codifica para un fragmento polipeptídico de por lo menos aproximadamente 25, 50, 75, 100 o más de 100 residuoe aminoácidos; g) una secuencia nucleotídica de los incisoe (a) , (b) o (c) que comprende un fragmento de por lo menos 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100 o más de 100 nucleótidos; y h) una secuencia nucleotídica la cual hibridiza bajo condiciones astringentes o de rigurosidad con cualquiera de los incisoe (a) a (g) .

2. Una molécula aislada de ácido nucleico, caracterizada porque comprende una secuencia nucleotídica que se selecciona del grupo que consiete de: a) la eecuencia nucleotídica como se establece en la figura 2A (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 11) o la figura 3A (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6) o la figura 12A (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 16); b) la secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido como se establece en la figura 2A (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6) de los residuos 1-322 o de los residuoe 47-322 o como se establecen en la figura 3A (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 11) de los reeiduos 1-288 o de los reeiduoe 19-288, 20-288, 21-288, 22-288, 24-288, o 28-288 o como se establece en la figura 12A de los residuos 1-302 o de los residuoe 19-302, 20-302, 21-302, 22-302, 24-302 o 28-302; c) una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido que es por lo menos aproximadamente 70% idéntico al polipéptido como se establece en la figura 2A (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6) o la figura 3A (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 11) O la figura 12A (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6) ; d) una variante alélica que se presenta de manera natural o una variante alternativa de corte y empalme de cualquiera de los incisos (a) , (b) o (c) ; e) una secuencia nucleotídica complementaria con cualquiera de los incisos (a) , (b) o (c) ; f) una secuencia nucleotídica de los incisoe (b) , (c) o (d) que codifica para un fragmento polipeptídico de por lo menos aproximadamente 25, 50, 75, 100 o máe de 100 reeiduos aminoácidos ; g) una secuencia nucleotídica de los incisos (a) , (b) o (c) que comprende un fragmento de por lo menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100 o más de 100 nucleótidos; y h) una secuencia nucleotídica la cual hibridiza bajo condiciones astringentes o de rigurosidad con cualquiera de los incisos (a) a (g) .

3. La molécula de ácido nucleico, de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque la secuencia nucleotídica está unida operablemente a la secuencia de control de expresión.

4. Una célula huésped, caracterizada porque comprende a la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 2.

5. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque es una célula eucariótica.

6. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque es una célula procariótica .

7. Un proceso para producir un polipéptido, caracterizado porque comprende hacer crecer un cultivo de la célula huésped de conformidad con la reivindicación 3 en un medio de cultivo adecuado y aielar el polipéptido del cultivo.

8. Un polipéptido, caracterizado porque ee produce por el proceso de conformidad con la reivindicación 7.

9. Un polipéptido, caracterizado porque está codificado por la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1.

10. Un polipéptido, caracterizado porque está codificado por la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 2.

11. Un polipéptido aislado, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiete de: a) la eecuencia de aminoácidos que se establece en la figura ÍA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2); b) la secuencia madura de aminoácidos como se establece en la figura ÍA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2) que comprende una parte amino terminal madura en el residuo 21; c) un fragmento de la secuencia de aminoácidos que se establece en la figura ÍA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2) que comprende por lo menos aproximadamente 25, 50, 75, 100 o máe de 100 reeiduoe aminoácidos; d) un ortólogo de los incisoe (a) , (b) o (c) ; y e) una variante alélica o variante alternativa de corte y empalme de loe incisos (a) , (b) , (c) o (d) .

12. Un polipéptido aislado, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidoe que ee selecciona del grupo que consiste de: a) la secuencia de aminoácidos que se establece en la figura 2A (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 7) o la figura 3A (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 12) o la figura 12A (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 17) ; b) la secuencia madura de aminoácidos que se establece en la figura 2A (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 7) que comprende una parte amino terminal madura en los residuoe 47, o la figura 3A (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 12) que comprende una parte amino terminal madura de cualquiera de los residuos 19, 20, 21, 22, 24 ó 28 o de la figura 12A (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 17) que comprende una parte amino terminal madura de cualquiera de los residuoe 19, 20, 21, 22, 24 ó 28; c) un fragmento de la eecuencia de aminoácidos que se establece en la figura 2A (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 7) o la figura 3A (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 12) o la figura 12A (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 17) que comprende por lo menos aproximadamente 25, 50, 75, 100 o más de 100 residuoe aminoácidos; d) un ortólogo de los incisos (a) , (b) o (c) ; y e) una variante alélica o variante alternativa por corte y empalme de los incieos (a) , (b) , (c) o (d) .

13. Un anticuerpo o fragmento del mismo, caracterizado porque se une específicamente al polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 9, 10, 11 ó 12.

14. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque es un anticuerpo monoclonal .

15. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque es un anticuerpo humano .

16. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque es un anticuerpo humanizado o injertado con CDR.

17. El anticuerpo o fragmento, de conformidad con la reivindicación 13 , caracterizado porque se une a B7RP1 o al dominio extracelular de B7RP1.

18. El anticuerpo o fragmento, de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque inhibe la unión de B7RP1 a CRPl.

19. Una composición, caracterizada porque comprende el polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 9, 10, 11 ó 12, y un portador, adyuvante, solubilizante, estabilizante o antioxidante farmacéuticamente aceptable.

20. Un polipéptido, caracterizado porque comprende un derivado del polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 9, 10, 11 ó 12.

21. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque está modificado covalentemente con un polímero soluble en agua.

22. Un polipéptido de fusión, caracterizado porque comprende el polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 9, 10, 11 ó 12 , fusionado a una secuencia heteróloga de aminoácidos .

23. El polipéptido de fusión, de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la secuencia heteróloga de aminoácidos es un dominio constante de IgG o un fragmento del mismo .

24. Un método para tratar, evitar o disminuir un desorden mediado por células T, caracterizado porque comprende administrar a un animal, el polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 9, 10, 11 ó 12.

25. Un método para diagnóstico de un desorden mediado por células T o la susceptibilidad a un desorden mediado por células T en un animal, el método está caracterizado porque comprende: a) determinar la presencia o cantidad de expresión del polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 9, 10, 11 ó 12; y b) diagnosticar un desorden mediado por células T o una susceptibilidad a un desorden mediado por células T en base en la presencia o cantidad de expresión del polipéptido.

26. Un método para identificar una molécula de prueba la cual se une a un polipéptido, caracterizado porque comprende : a) poner en contacto al polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 9, 10, 11 ó 12 con una molécula de prueba; y b) determinar el grado de unión del polipéptido a la molécula de prueba.

27. E l mé t odo de c onf ormidad con l a reivindicación 26, caracterizado porque comprende además determinar la actividad del polipéptido cuando se une al compuesto.

28. Un método para regular la activación o proliferación de células T en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar al animal la molécula de ácido nucleico de conformidad con las reivindicacionee 1, 2 6 3.

29. Un mamífero transgénico no humano, caracterizado porque comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 3.

30. Un método para euprimir una reepuesta inmune en un animal, caracterizado porque comprende administrar al animal un antagonista de CRP-1 o B7RP-1.

31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el antagonista es un anticuerpo el cual une B7RP-1. POLIPÉPTIDOS RELACIONADOS CON LA RESPUESTA INMUNE RESUMEN DE LA INVENCIÓN Se describen polipéptidos novedosos los cuales comprenden un par receptor-ligando relacionado con la activación de células T. También se describen moléculas de ácido nucleico que codifican para tales polipéptidos y vectores y células huésped para expresar los mismos . Los polipéptidos, o agonistas y antagonistas de los mismos, se utilizan para tratar desórdenes mediados por células T.