PT1149114E - Polipéptidos envolvidos na resposta imunitária - Google Patents

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Description

DESCRIÇÃO "POLIPÉPTIDOS ENVOLVIDOS NA RESPOSTA IMUNITÁRIA"
Campo da Invenção A presente invenção refere-se a polipéptidos que estão envolvidos na activação de linfócito T. Especificamente, a invenção refere-se a polipéptidos co-estimulatórios de linfócitos T, aos ácidos nucleicos codificando os polipéptidos, vectores de expressão e células hospedeiras para produção dos polipéptidos e composições e utilizações no tratamento de doenças relacionadas com imunossupressão e activação imunitária.
Antecedentes da invenção
Para a geração de uma resposta imunitária de linfócito T (célula T) apropriada, dois sinais devem ser proporcionados à célula T por células apresentadoras de antigénio (APC). Em primeiro lugar, o antigénio deve ser apresentado ao receptor de célula T (TCR) por meio de um complexo de histocompatibilidade principal (MHC), num evento que determina a especificidade. Em segundo lugar, um sinal co-estimulatório, independente de antigénio, deve ser distribuído por recrutamento de membros da família B7 na APC com a proteína de CD28 nas células T. Uma resposta imunitária produtiva conduz a proliferação, diferenciação, expansão clonal e efeito ou função. Na ausência do segundo sinal co-estimulatório, as células T são submetidas a 1 um estado de nao responsividade específica de antigénio de longa duração, designado anergia.
As células T iniciam a resposta imunitária, medeiam funções efectoras específicas de antigénio e regulam a actividade de outros leucócitos pela segregação de citocinas. 0 receptor de célula T (TCR) distingue a célula T de outros linfócitos e apenas pode ligar-se ao antigénio quando é apresentado pela APC no contexto de um MHC. A actividade funcional de uma célula T particular pode ser correlacionada com a expressão de antigénios de membrana, tais como CD4 e CD8. Por exemplo, as células T CD4+ funcionam, em geral, como células auxiliares T (TH) e são restritas a MHC de classe II, enquanto que as células CD8 + funcionam, em geral, como células T (Tc) citotóxicas e são restritas a MHC de classe I.
Potentes polipéptidos co-estimulatórios de célula T que foram identificados anteriormente, incluem polipéptidos designados B7.1 (Freeman et ai., J. Immunology 143, 2714-2722 (1989), Freeman et al., Jour. Expt. Med. 174, 625-31 (1991)) e B7.2 (Freeman et al., Science 262, 909-911 (1993) e Freeman et al., Jour. Expt. Med. 178, 2185-2192 (1993)), (ou CD80 e CD86, respectivamente). Estes polipéptidos são expressos de modo indutível ou de modo constitutivo em diversas APC e são ligandos membranares para CD28 e CTLA-4, respectivamente, em células T. O CD28 (Aruffo e Seed Proc. Natl. Acad. Sei. 8_4, 8573-8577 (1987) e Gross et al., J. Immun. 144. 3201-3210 (1990)) é expresso em células T em repouso e medeia um sinal co-estimulatório positivo A expressão de CTLA-4 (Brunet et al. Nature 328, 267-270 (1987) e Dariavach et al., Eur. Jour. Immun. 1_8, 1901-1905 (1988)) é induzida após activação de célula T e regula negativamente o sinal de CD28, devido à sua maior afinidade de ligação para B7.1 2 e BI.2. Os murganhos sem o gene de CTLA-4 exibem níveis dramaticamente elevados de células T, uma vez gue, na ausência de CTLA-4, o mecanismo interruptor para o sinal de proliferação fica comprometido. Este fenótipo demonstra claramente o importante efeito inibitório que a proteína co-estimulatória de CTLA-4 tem na proliferação de célula T. Os murganhos desprovidos de CD2 8 ou B7.1 ou B7.2 têm um fenótipo menos grave, indicando que podem existir vias alternativas para a co-estimulação de célula T.
Tem havido um considerável interesse na via de CD28/CTLA-4 como meio para regulação da activação e proliferação de célula T. Uma proteína quimérica contendo a porção extracelular de CTLA-4 fundida a Fc humana tem fortes efeitos imunossupressores e foi estudada numa variedade de quadros clínicos. Os anticorpos para proteínas de B7.1 e B7.2 também foram avaliados para indicações semelhantes na área da imunossupressão. Os anticorpos anti-CTLA-4 mostraram utilidade na promoção da activação de célula T. Além disso, a terapia génica de B7.1 e B7.2 mostrou-se muito promissora na área da imunoterapia de cancro.
Até agora, CD28, CTLA-4, B7.1 e B7.2 estão envolvidos numa única via co-estimulatória de célula T. Dada a capacidade de modulação de uma resposta imunitária pela regulação da co-estimulação de célula T, seria desejável identificar outros membros da mesma via ou uma via co-estimulatória de célula T separada que pudessem ter propriedades vantajosas na regulação da função de célula T de hospedeiro e resposta imunitária.
Consequentemente, é um objectivo da invenção proporcionar novos polipéptidos para estimulação de actividade e/ou 3 proliferação de célula T. É um objectivo adicional da invenção utilizar os novos polipéptidos para a prevenção e tratamento de distúrbios imunitários mediados por célula T.
Sumário da Invenção
Surpreendentemente, foram identificados dois novos polipéptidos de uma via co-estimulatória de célula T. Os polipéptidos representam um par ligando-receptor numa via co-estimulatória única, que parece ser distinta da via consistindo nas proteínas de CD28, CTLA-4, B7.1 e B7.2 descritas anteriormente. Os polipéptidos são referidos como proteína 1 relacionada com CD28, ou CRP1 e proteína 1 relacionada com B7, ou B7RP1. A invenção proporciona para moléculas de ácido nucleico codificando polipéptidos de B7RP1 e polipéptidos relacionados. 0 assunto da invenção também se relaciona com polipéptidos de B7RP1 e polipéptidos relacionados. A invenção é definida pelas reivindicações. Estão abrangidos pela invenção vectores de expressão e células hospedeiras para produção dos polipéptidos, anticorpos que se ligam a polipéptidos de B7RP1 e a polipéptidos relacionados e ensaios para detecção da ligação de B7RP1 e polipéptidos relacionados com B7RP1 a CRP1 e polipéptidos relacionados com CRP1. As composições farmacêuticas compreendendo B7RP1 ou polipéptidos relacionados com B7RP1 também estão abrangidas pela invenção. Também são proporcionados métodos para identificação de compostos que interagem com B7RP1, como são ensaios para 4 determinar se esses compostos são agonistas ou antagonistas de actividade de B7RP1.
Os polipéptidos de CRP1 e B7RP1 estão envolvidos na co-estimulação e proliferação de célula T. Os polipéptidos de CRP1 e B7RP1, seus agentes de ligação selectiva e seus agonistas e antagonistas, podem ser úteis para o diagnóstico, prevenção e tratamento de doenças relacionadas com o controlo de respostas de célula T.
Os polipéptidos de CRP1 e B7RP1, seus agentes de ligação selectiva e seus agonistas e antagonistas, podem ser úteis para o diagnóstico, prevenção e tratamento de distúrbios imunitários, quer para estimulação de resposta imunitária insuficiente ou redução ou inibição de uma resposta imunitária exagerada ou inapropriada. 0 distúrbio imunitário pode ser mediado directa ou indirectamente por células T. A invenção proporciona para tratamento, prevenção ou melhoramento de um distúrbio mediado por célula T, compreendendo administrar um polipéptido de B7RP1 a um animal. A invenção também proporciona para um método de diagnóstico de um distúrbio mediado por célula T ou uma susceptibilidade a um distúrbio mediado por célula T num animal, compreendendo a determinação da presença ou quantidade de expressão de um polipéptido de B7RP1; e o diagnóstico de um distúrbio mediado por célula T ou uma susceptibilidade a um distúrbio mediado por célula T, com base na presença ou quantidade de expressão do polipéptido. Tipicamente, um distúrbio mediado por célula T é um distúrbio imunitário que pode ser mediado directa ou indirectamente por células T. 0 animal é, de um modo preferido, um mamífero e, de um modo mais preferido, um humano. A invenção também proporciona 5 para um método de identificação de uma molécula de teste que se liga a um polipéptido de B7RP1, compreendendo a colocação do polipéptido em contacto com um composto de teste e a determinação da extensão de ligação do polipéptido ao composto de teste. 0 método pode ser utilizado para identificar agonistas e antagonistas de polipéptido de CRP1 e/ou B7RP1.
Os antagonistas de CRP1 e/ou polipéptidos de B7RP1 podem ser utilizados como agentes imunossupressores para muitas indicações, incluindo distúrbios auto-imunes (tais como artrite reumatóide, psoriase, esclerose múltipla, diabetes e lúpus eritematoso sistémico), síndrome de choque tóxico, transplantação de medula óssea e órgãos, doença inflamatória intestinal, alosensibilização devido a transfusões de sangue e o tratamento de doença de enxerto vs. hospedeiro. Além disso, os antagonistas podem ser utilizados como agentes inibitórios para indicações mediadas por células B dependentes de células T, incluindo asma e alergia e auto-imunidade mediada por anticorpo. Os agonistas dos polipéptidos de CRP1 e/ou B7RP1 podem ser úteis mas não estão restritos a activação de célula T para vigilância e remoção tumorais.
Um antagonista da presente divulgação inclui um anticorpo, ou seu fragmento, que é reactivo ou se liga a B7RP1 ou a um domínio extracelular de B7RP1, em que o anticorpo reduz ou elimina a ligaçao de B7RP1 a CRP1. Num aspecto, o anticorpo liga-se selectivamente a B7RP1 humana ou a um seu domínio extracelular. 0 anticorpo ou seu fragmento que é um antagonista inibe, parcial ou completamente, a actividade imunitária co-estimulatória de B7RP1. Num aspecto preferido, o anticorpo é um anticorpo monoclonal e pode ser murino, humano, quimérico ou humanizado. 6 É ainda aqui divulgado um método de regulação da interacção de B7RP1 com CRPl, compreendendo a administração a um animal de um agente de ligação selectiva de CRPl ou um agente de ligação selectivo de B7RP1 ou ambos. Num aspecto, o agente de ligação selectiva é um anticorpo que se liga a B7RP1 e reduz ou elimina a ligação a B7RP1 a CRPl. Também é aqui divulgado um método de regulação de co-estimulação imunitária mediada por B7RP1, compreendendo a administração de um agente de ligação selectivo de B7RP1 a um animal. 0 agente de ligação selectiva é, de um modo preferido, um anticorpo que se liga a B7RP1 e inibe, parcial ou completamente, a co-estimulação imunitária mediada por B7RP1. A invenção também proporciona para um método de regulação da activação ou proliferação de célula T num animal, compreendendo a administração ao animal de uma molécula de ácido nucleico codificando um polipéptido de B7RP1. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico codificando um polipéptido de B7RP1 pode ser utilizada em terapia génica para melhorar a activação de célula T em resposta a diversos tumores.
Também está abrangido pela invenção um mamífero não humano transgénico, compreendendo uma molécula de ácido nucleico codificando um polipéptido de B7RP1. Os ácidos nucleicos de B7RP1 são introduzidos no mamífero num modo que permite a expressão e níveis de circulação aumentados dos polipéptidos de B7RP1. 0 animal não humano transgénico é, de um modo preferido, um roedor e, de um modo mais preferido, um murganho ou um rato. 7
Descrição de Figuras
Figura 1. A) Sequência de ADN e aminoácidos de CRP1 murino (mCRPl). A sequência sinal prevista de CRP1 está sublinhada na terminação amino e o sítio de clivagem de pro-péptido determinado experimentalmente é indicado por um asterisco. A sequência transmembranar prevista está sublinhada em direcção à terminação carboxilo. B) Alinhamento de aminoácido da sequência de proteína de CRP1 murina (mCRPl) com CD28 murina (mCD28).
Figura 2. A) Sequência de ADN e aminoácidos de B7RP1 murino (mB7RPl). A sequência sinal prevista de B7RP1 está sublinhada na terminação amino e o sítio de clivagem de pro-péptido determinado experimentalmente é indicado por um asterisco. A sequência transmembranar prevista está sublinhada em direcção à terminação carboxilo. B) Alinhamento de aminoácido da sequência de proteína de B7RP1 murina (mB7RPl) com CD80 murina (mCD80).
Figura 3. A) Estrutura e sequência da região codificante de proteína da putativa B7RP1 humana (hB7RPl). A sequência sinal prevista de hB7RPl está sublinhada na terminação amino. Os sítios de clivagem de péptido sinal previstos estão marcados por asteriscos. A sequência transmembranar prevista está sublinhada em direcção à terminação carboxilo. B) Alinhamento de aminoácido da putativa proteína de hB7RPl madura com a proteína de B7RP1 murina madura (mB7RPl).
Figura 4. A) Expressão da proteína de fusão de CRPl-Fc solúvel de células 293T transfectadas com o pcDNA3/CRPl-Fc. Os volumes normalizados de lisado celular ou meio condicionado foram carregados e separados num gel de PAGE a 10%, como indicado. Análise de Western de lisado celular e sobrenadante de meios celulares para expressão de proteínas de fusão de Fc associadas a células (lisado celular) e segregadas (meios). 0 anticorpo primário foi o anticorpo de Fc de Cabra anti-humano (Pierce Chemical Company, Rockford, IL.). B) Expressão da proteína de fusão de B7RP1-Fc solúvel de células 293T transfectadas com o pcDNA3/ B7RP1-FC. 20 pL de lisado celular normalizado ou sobrenadante de meios foram carregados e separados num gel de PAGE a 10%. A análise de Western foi conduzida como em (A).
Figura 5. Interacção das proteínas de fusão de CRPl-Fc e B7RP1-Fc com proteínas membranares expressas em células COS-7. Células COS-7 transfectadas de um modo transiente com pcDNA3/CRP1, pcDNA3/B7RPl ou vector pcDNA3 isoladamente. As células CHO D foram transfectadas com psDRa/hCD28 e expressaram, de um modo estável, CD28 humana (hCD28). As células expressando CRP1, B7RP1 ou hCD28 ligadas por membranas são representadas em setas, como indicado no lado esquerdo do painel. As proteínas de fusão de Fc foram incubadas com as células ligadas à placa em colunas, como indicado no topo do painel. Após incubação, as células foram lavadas e as proteínas de fusão de Fc ligadas foram detectadas utilizando um anticorpo de Fc anti-humano e análise de ACAS (Análise e Triagem de Célula Aderente; ACAS Ultima, Meridian Instruments, Inc., Okemos, MI).
Figura 6. Análise de FACS (Triagem Celular de Activação por Fluorescência) da expressão do receptor para B7RP1 (putativamente, CRP1) em células T CD4+ e CD8+ activadas. Os esplenócitos de murganho foram activados com PMA e ionomicina, durante 12 horas. Proteína de fusão de B7RP1-Fc, proteína de Fc de controlo (Mock-Fc) ou PBS (sem coloração) foram incubadas com as células, lavadas e, subsequentemente, incubadas com anticorpo 9 de cabra anti-humano conjugado a Fc-FITC (GaHuFc-FITC), como indicado na parte de baixo de cada painel. Anticorpos de marcação celular (para os marcadores CD4 e CD8 de célula T) conjugados a PE, ou anticorpo de controlo de isótipo (isótipo de rato) conjugado a PE ou PBS (sem coloração) foram adicionados como indicado no lado esguerdo de cada painel individual.
Figura 7. Análise de FACS (Triagem Celular de Activação por Fluorescência) da expressão de B7RP1 em células B. Análise fluorocitométrica da expressão do ligando para CRP1 (presumivelmente, B7RP1) em esplenócitos de murganho. Proteina de fusão de CRPl-Fc, proteina de Fc de controlo (Mock-Fc) ou PBS (sem coloração) foram incubadas com as células, lavadas e, subsequentemente, incubadas com anticorpo de cabra anti-humano conjugado a Fc-FITC (GaHuFc-FITC), como indicado na parte de baixo de cada painel. Anticorpo de marcação celular conjugado a PE para CD45R (o CD45R é um marcador de célula B) ou anticorpo de controlo de isótipo (isótipo de rato) ou PBS (sem coloração) foram adicionados como indicado no lado esquerdo de cada painel individual.
Figura 8. Análise de FACS da expressão do ligando de mCRPl em macrófagos peritoneais. As células peritoneais foram, em primeiro lugar, distinguidas em subconjuntos com base nas suas propriedades de dispersão de luz (painel A) . Os macrófagos foram identificados na região 5 (R5) devido à sua capacidade de dispersarem fortemente a luz para a frente (FSC) e para os lados (SSC) e devido à sua coloração positiva para o antigénio F4/80, um marcador para macrófagos (painel B) . Os macrófagos na região 6 (R6) foram seleccionados com base na sua coloração menos intensa para o antigénio F4/80 e verificou-se serem 10 corados pela proteína de fusão de CRPl-Fc (presumivelmente devido à sua expressão de B7RP1).
Figura 9. Inibição da proliferação de célula T utilizando uma proteína de fusão de B7RP1-Fc. As células T de esplenócitos de murganho foram activadas por concentrações crescentes de Conconavalina A (Con A) , como indicado na parte de baixo do gráfico. As proteínas de fusão de CRPl-Fc, mB7RPl e B7.2-Fc foram adicionadas a células T enriquecidas de esplenócitos na ausência (sem adições) ou presença de Con A. Foram utilizadas 200000 células nos ensaios de proliferação de célula T numa placa de 96 poços. As células foram incubadas com meios (sem adições) ou proteínas de fusão de Fc, como indicado na legenda do gráfico. Após 42 h, as células foram pulsadas com H-timidina, durante 6 h, depois, recolhidas e a radioactividade incorporada determinada. Estão representados a CPM média e desvio-padrão de amostras em triplicado.
Figura 10. A) Nódulo linfático mesentérico normal do Murganho N° 10 de controlo, mostrando o córtex, paracórtex e medula do nódulo. Coloração de hematoxilina-eosina (H&E), ampliação de 40x. B) Nódulo linfático mesentérico marcadamente aumentado do Murganho N° 40 WX11, com hiperplasia folicular (FH) proeminente, expansão de paracórtex e hiperplasia de cordão medular (MH) . H&E, 40x. C) Grande plano dos cordões medulares (MC) e seios medulares (MS) do nódulo linfático mesentérico do Murganho N° 10 de controlo. Notar os pequenos cordões medulares compostos, maioritariamente, por linfócitos pequenos adjacentes a seios medulares com macrófagos carnudos. H&E, 400x. D. Grande plano dos cordões medulares (MC) e seios medulares (MS) do nódulo linfático mesentérico do Murganho N° 40 WX11. Notar os cordões medulares marcadamente espessados, compostos por um 11 grande número de células plasmáticas, com células de corpos de Russell ocasionais (seta). H&E, 400x. E) Baço normal do Murganho N° 10 de controlo mostrando áreas de polpa vermelha e polpa branca, com bainhas linfóides periarteríolares (PALS), lOOx. Inserto: grande plano da zona marginal circundando a polpa branca com linfócitos pequenos, macrófagos e células plasmáticas ocasionais, 400x. F) Baço do Murganho N° 6 WX11, com áreas aumentadas de polpa branca, incluindo PALS e foliculos (seta), lOOx. Inserto: grande plano da zona marginal, com numerosas células plasmáticas e corpos de Russell ocasionais, 400x. G) íleo com placa de Peyer do Murganho N° 25 de controlo, com a zona interfolicular (seta) flanqueada por dois foliculos secundários, 40x. H) íleo com placa de Peyer do Murganho N° 32 WX11, com foliculos marcadamente aumentados, com centros germinativos proeminentes e tecido interfolicular (seta), 40x.
Figura 11. A) Nódulo linfático mesentérico normal do Murganho N° 5 de controlo, mostrando o córtex, paracórtex e medula do nódulo. Coloração de hematoxilina-eosina (H&E), ampliação de 40x. B) Nódulo linfático mesentérico marcadamente aumentado do Murganho N° 33 WX11, com hiperplasia folicular proeminente (topo: filas de foliculos secundários no córtex externo), expansão do paracórtex (centro) e hiperplasia de cordão medular (parte de baixo). H&E, 40x. C) Coloração imuno-histoquímica do nódulo linfático mesentérico do Murganho N° 10 de controlo, com anticorpo anti-B220 (marcador de célula B). Notar a área cortical e cordões medulares finos intensamente (castanho) corados. Imunocoloração realizada utilizando o método do complexo de imunoperoxidase de avidina-biotina (ABC) (DAB chromogen, contraste de hematoxilina) , 40x. D) Coloração imuno- histoquímica do nódulo linfático mesentérico do Murganho N° 33 WX11 com anticorpo anti-B220. Notar os foliculos corticais e 12 cordões medulares intensamente corados (embora as células plasmáticas maduras nos cordões sejam negativas para B220), 40x. E) Coloração imuno-histoquímica do nódulo linfático do Murganho N° 10 de controlo com anticorpo anti-CD3 (marcador de célula T). Notar a imunocoloração da zona paracortical do nódulo, 40x. F) Coloração imuno-histoquímica do nódulo linfático do Murganho N° 33 WX11 com anticorpo anti-CD3. Notar as áreas paracorticais aumentadas, intensamente coradas, do nódulo, 40x.
Figura 12. A) Estrutura e sequência da região codificante de proteína de B7RP1 humana (hB7RPl). A sequência sinal prevista de hB7RPl está sublinhada na terminação amino. Os sítios de clivagem de péptido sinal previstos estão marcados por asteriscos. A sequência transmembranar prevista está sublinhada em direcção à terminação carboxilo. B) Alinhamento de aminoácido da putativa proteína de hB7RPl madura com a proteína de B7RP1 murina madura (mB7RPl).
Figura 13. A) Estrutura e sequência da região codificante de proteína de CRP1 humana (hCRPl). A sequência sinal prevista de hCRPl está sublinhada na terminação amino. Os sítios de clivagem de péptido sinal previstos estão marcados por asteriscos. A sequência transmembranar prevista está sublinhada em direcção à terminação carboxilo. B) Alinhamento de aminoácido da proteína de hCRPl com a proteína de CRP1 murina (mB7RPl).
Figura 14. A CRP-1 está em células T de memória em repouso. Os esplenócitos em repouso de murganhos de 6-7 meses de idade foram duplamente corados utilizando B7RP-1-Fc marcado por um anticorpo de Fc anti-humano conjugado a FITC e um anticorpo conjugado a PE para CD44 (Fig. 14A) , CD45RB (Fig. 14B) ou CD69 (Fig. 14C). 13
Figura 15. Co-estimulação de célula T por proteína de fusão de B7RP-1-FC. A) Proliferação de célula T induzida por diferentes quantidades de B7RP-1-Fc (quadrados a cheio), B7.2-Fc (círculos a cheio) ou controlo de proteína de fusão de OPG-Fc (quadrados em branco), em conjunto com anticorpo anti-CD3. As proteínas de fusão foram utilizadas a diversas concentrações para revestir placas de 96 poços pré-revestidas com FAb2 de Fc anti-humano (12,5 pg/mL) e anticorpo anti-CD3 (0,9 pg/mL). B7RP-1-Fc e B7.2-Fc co-estimulam células T, num modo dependente de dose, até 0,3 pg/mL, em que é alcançado o efeito máximo. B) Proliferação de célula T induzida por B7RP-1-Fc (quadrados a cheio), B7.2-Fc (círculos a cheio), Fc não fundida (quadrados em branco) ou sem Fc (círculos em branco) , em conjunto com um anticorpo anti-CD3 (0,85 pg/mL) e na presença de diversas concentrações de um anticorpo policlonal de coelho anti-B7RP-l-Fc. As proteínas de fusão de Fc foram utilizadas a uma concentração de 0,3 pg/mL e foram ligadas às placas, como acima. O anticorpo anti-B7RP-l-Fc foi deduzido para B7RP-1-Fc purificado por injecções subcutâneas de antigénio emulsionado em adjuvante e, depois, foi purificado por afinidade. Os anticorpos foram incubados, durante 30 min, com as proteínas de fusão de Fc, antes da adição das células. O anticorpo anti-B7RP-l-Fc inibe especificamente a proliferação de célula T induzida por B7RP-1-Fc, num modo dependente de dose.
Figura 16. Efeito das proteínas de CRP-l-Fc e B7RP-1-Fc na incidência (A) e gravidade (B) de artrite induzida por colagénio em murganhos. Os murganhos B10.RIII susceptíveis a artrite induzida por colagénio, foram imunizados na base da cauda com 10 pg de colagénio de tipo II porcino em CFA. Os murganhos receberam 100 pg de proteína de fusão, duas vezes por semana. O 14 tratamento de proteínas de fusão de Fc e PBS de controlo está indicado na legenda da figura.
Figura 17. Cólon proximal em Murganhos Transgénicos B7RP-1-F c. (A) Cólon proximal normal do Murganho N° 53F de controlo (fêmea), mostrando a parede intestinal com mucosa, submucosa, muscularis e serosa. Coloração de hematoxilina-eosina (H&E), ampliação de 40x. (B) Cólon proximal difusamente espessado do Murganho N° 111F transgénico B7RP-1-FC com hipertrofia glandular proeminente, ulceração fissurante e inflamação transmural. H&E, 40x. (C) Vista de resolução inferior de cólon proximal (como no painel B) do Murganho N° 111F transgénico B7RP-1-FC, com ulceração fissurante multifocal e inflamação transmural. H&E, 20x. (D) Grande plano da úlcera fissurante e glândulas colónicas hipertróficas do Murganho N° 111F transgénico B7RP-1-FC (mostrado nos painéis B e C acima). Notar o lúmen com exsudado mucopurulento. H&E, lOOx. (E) Grande plano de inflamação granulomatosa na submucosa do Murganho N° 112F transgénico B7RP-1-FC, com uma célula gigante multinucleada rodeada por macrófagos, linfócitos e menos neutrófilos. H&E, 400x. (F) Grande plano de inflamação granulomatosa na mucosa do murganho N° 112F transgénico B7RP-1-Fc, com macrófagos epitelióides misturados com linfócitos, células plasmáticas e menos neutrófilos subjacentes a glândulas mucosais. H&E, 400x.
Figura 18. Cólon Distai em Murganhos Transgénicos B7RP-1-Fc. (A) Cólon distai normal do Murganho N° 53F de controlo (fêmea) mostrando as camadas da parede intestinal com mucosa, submucosa, muscularis e serosa. Coloração de hematoxilina-eosina (H&E), ampliação de 40x. (B) Cólon distai difusamente espessado do Murganho N° 111F transgénico B7RP-1-Fc 15 (fêmea) com hipertrofia e hiperplasia glandular proeminente e abcessos de cripta dispersos. H&E, 40x. (C) Cólon distai difusamente espessado do Murganho N° 55M transgénico B7RP-1-FC (macho), com hipertrofia e hiperplasia glandulares proeminentes. H&E, 40x. (D) Cólon distai difusamente espessado do Murganho N° 112F transgénico B7RP-1-Fc (fêmea), com glândulas colónicas hipertróficas, agregados linfóides focais e muitos abcessos de cripta. H&E, 40x. (E) Coloração imuno-histoquimica do cólon distai do Murganho N° 112F transgénico B7RP-1-FC com anticorpo anti-CD3 (marcador de célula T). Notar a imunocoloração da mucosa superficial e placa linfóide colónica. H&E, 40x. (F) Grande plano da mucosa colónica do Murganho N° 112F transgénico B7RP-1-Fc com um abcesso de cripta (seta) e agregado linfóide composto por células B B220+ (inserto) . H&E, lOOx.
Figura 19. Intestino delgado em Murganhos Transgénicos B7RP-1-Fc. (A) Duodeno normal do Murganho N° 53F de controlo (fêmea) mostrando o lúmen, vilosidades e criptas da mucosa e submucosa subjacente, muscularis e serosa. Coloração de hematoxilina-eosina (H&E), ampliação de 40x. (B) Duodeno difusamente espessado do Murganho N° 51F transgénico B7RP-1-Fc (fêmea), com hipertrofia e hiperplasia de cripta proeminentes e infiltrado linfoplasmacítico moderado na lâmina própria. H&E, 40x. (C) Jejuno normal do murganho N° 53F de controlo (fêmea) mostrando o comprimento normal das vilosidades e criptas na mucosa jejunal. H&E, ampliação de 40x. (D) Mucosa jejunal marcadamente espessada do Murganho N° 51F transgénico B7RP-1-FC (fêmea), com hipertrofia e hiperplasia de cripta localmente extensa. H&E, 40x. (E) íleo normal do Murganho N° 53F de controlo (fêmea) mostrando o comprimento normal das vilosidades e criptas na mucosa ileal. H&E, ampliação de 40x. (F) Atrofia moderada da mucosa ileal do Murganho N° 231M transgénico 16 B7RP-1-Fc (macho), com perda focal e rombosidade das vilosidades. H&E, 40x.
Figura 20. A proteína de fusão de B7RP-1-Fc inibe o crescimento tumoral em murganhos. As células de sarcoma Meth A foram implantadas intradermicamente no abdómen de murganhos Balb/C. Nos dias 7, 10, 14 e 17, após implantação, os murganhos foram tratados com transportador (losangos escuros) ou B7RP-1-FC murino (triângulos cinzentos, Exemplo 7). O volume de tumor foi medido, como descrito no Exemplo 20, nos dias indicados após implantação. O crescimento tumoral foi monitorizado até ao dia 28. Cada grupo tinha oito murganhos.
Figura 21. Co-estimulação de célula T por B7RP-1-Fc humana. Anti-CD3 e B7RP-1 Fc humano foram utilizados para revestir placas de 96 poços e 1 x 105 células T/poço (>98% de CD3+) foram cultivadas e recolhidas como descrito no Exemplo 21. A) Co-estimulação induzida por anti-CD3 apenas (círculos a cheio), B7RP-1 Fc a 0,5 pg/mL (triângulos a cheio), OPG-Fc a 0,5 pg/mL (círculos em branco) e anti-CD28 a 5 pg/mL (triângulos em branco) , a diferentes concentrações de estimulação primária de anti-CD3. Os dados mostram que o B7RP-1-FC co-estimulou células T imunizadas com anti-CD3 com níveis semelhantes aos da co-estimulação utilizando anticorpos anti-CD28. Os dados mostrados são médias de [3H]TdR incorporado +/- SD em poços em triplicado, de uma experiência representativa de várias experiências geradas com células T isoladas de três dadores normais. B) Inibição dependente de dose de co-estimulação de B7RP-1-Fc por CRP-l-Fc. As células T foram cultivadas em poços revestidos com anti-CD3 a 0,3 pg/mL e B7RP-1-Fc a 0,5 pg/mL. Concentrações serialmente diluídas de CRP-l-Fc (círculos a cheio) ou OPG-Fc (círculos em branco) foram pré-incubadas com o 17 B7RP-1-Fc, durante 30 mi n, antes da adição de células T. Os dados mostram que CRP-l-Fc inibe a co-estimulação induzida por B7RP-1, num modo dependente de dose. A percentagem de inibição é representada graficamente contra concentração de proteína de CRP-l-Fc ou OPG-Fc. Os dados mostrados são médias de [3H]TdR incorporado +/- SD de três experiências feitas em poços em tripl içado e sao representativos de experiências geradas com dois dadores normais. C) Co-estimulação por células CHO de B7RP-1 humanas. As células T foram purificadas de sangue periférico e foram cultivadas com diversas concentrações de anti-CD3, na presença de anti-CD3 isoladamente (círculos a cheio), 1 x 104 células CHO de vector de controlo (círculos a branco) ou 1 x 104 células CHO de B7RP-1 (triângulos a cheio), como descrito no Exemplo 22. Os dados mostram que o B7RP-1 membranar co-estimulou o crescimento de célula T até um nível semelhante ao observado utilizando proteínas de fusão de B7RP-1-Fc. Os dados mostrados são a média +/- SD de culturas em triplicado e são representativos de resultados gerados com dois dadores normais. D) Produção de citocina. As células T foram cultivadas como descrito na (Figura 21A) e os sobrenadantes foram recolhidos a 48 (barras a preto) e 72 h (barra a cinzento) . Os dados mostram que a quantidade de IL-2 produzida por células co-estimuladas por B7RP-1-Fc (gráfico de topo) foi semelhante à produzida por células estimuladas por anti-CD3 e Fc de controlo, mas significativamente inferior à produzida por células co-estimuladas por anti-CD28. Os dados também mostram que a co-estimulação de B7RP-1-FC melhorou a produção de IL-10 (gráfico central) e IFN-gama (gráfico de baixo). 18
Descrição Detalhada da Invenção A invenção refere-se a novos polipéptidos, aqui referidos como CRP1 e B7RP1, que compreendem um par de receptor-ligando que está envolvido na activação de célula T. Os ADNc codificando os polipéptidos foram identificados de uma biblioteca preparada a partir de células intra-epiteliais intestinais de murganho e rastreadas com base em homologia com os polipéptidos de CD28 e CTLA-4 (para CRPl) ou polipéptidos de B7.1 e B7.2 (para B7RP1). A proteína 1 relacionada com CD28 ou CRPl, está prevista ser uma proteína transmembranar de tipo I, com uma sequência sinal e domínio extracelular na terminação amino, um domínio transmembranar e um domínio intracelular carboxiterminal (Figura 1). A proteína de CRPl de comprimento completo tem, na sua forma madura, 180 aminoácidos. A sequência líder prevista abrange cerca dos resíduos 1-20 de aminoácido (relativamente à metionina de iniciação) e o domínio extracelular da proteína madura abrange cerca dos resíduos 21-145 (Exemplo 1). O domínio transmembranar previsto abrange cerca dos resíduos 146-163 e o domínio intracelular abrange cerca dos resíduos 164-200. O domínio extracelular aminoterminal é semelhante a um gancho de Ig, com putativas cisteínas de ligação intra e intermoleculares conservadas. Além disso, um motivo "MYPPPY", que se sabia anteriormente importante para ligação de B7.1 e B7.2 a CD28 e CTLA-4, também é parcialmente conservado. CD28 e CTLA-4 são fracamente homólogos, como exemplificado pelos 26% de identidade de aminoácido entre CD28 e CTLA-4 murinos. Há 19% de identidade de aminoácido de CRPl com CD28 murino e 14% de identidade de CRPl com CTLA-4 murino. Contudo, os resíduos críticos de cisteína são conservados entre CD28, 19 CTLA-4 e CRP1 : murinos nos resíduos 42, 63, 83, 109 e 137 (relativamente à metionina de iniciação na proteína de CRP1, Ver Figura IA) Os comprimentos e localizações aproximados de proteína madura da região transmembranar relativamente à terminação carboxilo também são semelhantes em CRP1, CD28 e CTLA-4. A CRP1 humana é uma proteína transmembranar, tendo a sequência nucleotídica e de aminoácidos como mostrada na Figura 13A. A sequência líder prevista abrange cerca dos resíduos 1-19 ou cerca dos resíduos 1-20. A terminação amino madura prevista é nos resíduos 20 ou 21. De um modo preferido, a terminação amino madura é na posição 21. O domínio extracelular abrange desde qualquer das terminações amino maduras previstas até cerca do resíduo 140 de aminoácido, o domínio transmembranar abrange cerca dos resíduos 141-161 e o domínio intracelular abrange cerca dos resíduos 162-199. A proteína de CRP1 humana tem 69% de identidade com a proteína murina e as correspondentes sequências nucleotídicas são 77% idênticas. A sequência de CRP1 humana foi referida em Hutloff et al., Nature 397, 263-266 (1999) . A proteína 1 relacionada com B7 ou B7RP1, está prevista ser uma proteína transmembranar de tipo I, com uma sequência sinal e domínio extracelular na terminação amino, um domínio transmembranar e um domínio intracelular carboxiterminal (Figura 2A). A proteína de B7RP1 de comprimento completo tem, na sua forma madura, 276 aminoácidos. A sequência líder prevista abrange cerca dos resíduos 1-46 de aminoácido (relativamente à metionina de iniciação) e o domínio extracelular da proteína madura abrange cerca dos resíduos 47-279 (Exemplo 3). O domínio transmembranar previsto abrange os resíduos 280-298 e o domínio 20 intracelular abrange os resíduos 299-322. Semelhante a B7.1 e B7.2, o domínio extracelular de B7RP1 compreende dois ganchos de Ig. B7.1 e B7.2 são fracamente homólogos, como exemplificado pelos 24% de identidade de aminoácido entre B7.1 e B7.2 murinos. Há 20% de identidade de aminoácido de B7RP1 com B7.1 murino e 19% de identidade de B7RP1 com B7.2 murino. Contudo, os resíduos críticos de cisteína são conservados entre B7.1, B7.2 e B7RP1 murinos nos resíduos 62, 138, 185 e 242 (relativamente à metionina de iniciação na proteína de B7RP1, Figura 2A). 0 comprimento aproximado da proteína madura e localização da região transmembranar relativamente à terminação carboxilo também são semelhantes em mB7RPl, B7.1 e B7.2. A B7RP1 humana também é uma proteína transmembranar, com resíduo de cisteína conservado no domínio extracelular, gue são necessários para as estruturas de gancho de Ig. A seguência líder prevista abrange cerca dos resíduos 1-18, 1-19, 1-20, 1-21, 1-23 ou 1-27, como mostrado na Figura 3A. A terminação amino madura prevista pode ser em qualquer dos resíduos 19, 20, 21, 22, 24 ou 28. De um modo preferido, a terminação amino é na posição 19. O domínio extracelular abrange desde qualquer das terminações amino maduras até cerca do resíduo 259 de aminoácido. O domínio transmembranar previsto abrange cerca dos resíduos 259-274. O domínio intracelular abrange os resíduos 275-302. As sequências nucleotídica e de aminoácidos de B7RP1 humana de comprimento completo são mostradas na Figura 12A. A B7RP1 humana é cerca de 43% idêntica à proteína murina. 21 CRP1 e B7RP1 ligam-se entre si, mas CRP1 não se liga, de um modo detectável, à proteína B7.2 relacionada com B7RP1; e B7RP1 não exibe ligação detectável a CD28 ou CTLA-4 relacionadas com CRPl (Exemplo 8). Mostrou-se que a B7RP1 regula a proliferação de célula T, presumivelmente através da interacção de B7RP1 com receptores de CRPl (Exemplo 11). Deste modo, CRPl e B7RP1 representam uma nova via para regulação da proliferação e activação de célula T. A interacção de B7RP1 com CRPl pode ser regulada de maneira a que que a co-estimulação imunitária e proliferação e activação de célula T possam ser aumentadas ou diminuídas. A título exemplificativo, os anticorpos monoclonais e policlonais de anti-B7RPl deduzidos contra B7RP1 murina bloquearam a interacção de B7RP1/CRP1 e também bloquearam a proliferação de célula T induzida por uma proteína de fusão de B7RP1-FC (ver o Exemplo 17). Uma proteína de fusão de CRP-l-Fc humana bloqueou a proliferação de célula T humana induzida por B7RP-1-FC humana (Exemplo 21) . Além disso, a adição de uma proteína de fusão de CRPl-Fc retardou o começo dos sintomas artríticos num modelo de murganho de artrite reumatóide (ver o Exemplo 18) . A co-estimulação de B7RP-1/CRP-1 também pode ser aumentada por adição da proteína de fusão de B7RP-1-FC ou outros activadores desta via (Exemplo 20).
Moléculas de Ácido Nucleico A expressão "molécula de ácido nucleico isolada" refere-se a uma molécula de ácido nucleico que está isenta de, pelo menos, uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual está naturalmente associada e, de um modo preferido, substancialmente 22 isenta de quaisquer outras moléculas de ácido nucleico mamíferas contaminantes. A expressão "variante alélico" refere-se a uma de várias formas alternativas de ocorrência natural possíveis de um gene ocupando um determinado lócus num cromossoma de um organismo. A expressão "variante de excisão" refere-se a uma molécula de ácido nucleico, habitualmente ARN, que é gerada por processamento alternativo de sequências intrónicas num transcrito de ARN. A expressão "condições de estringência elevada" refere-se às condições que: (1) empregam baixa força iónica e elevada temperatura para lavagem, por exemplo, 0,1 X SSC (NaCl a 0,015 M/citrato de sódio a 0,0015 M) NaDodSCU (SDS) a 0,1%, a 50 °C, ou (2) empregam, durante a hibridação, um agente desnaturante, tal como formamida, por exemplo, formamida a 50% (vol/vol), com albumina de soro bovino a 0,1%/Ficol a 0,1%/polivinilpirrolidona a 0,1%/tampão de fosfato de sódio a 50 mM, a pH 6,5, com 5 X SSC (NaCl a 750 mM, citrato de sódio a 75 mM) , a 42 °C. Outro exemplo de condições de estringência elevada é formamida a 50%, 5 x SSC, fosfato de sódio a 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sódio a 0,1%, 5 x solução de Denhardt, ADN de esperma de salmão sonicado (50 pg/mL) , SDS a 0,1% e sulfato de dextrano a 10%, a 42 °C, com lavagem a 42 °C em 0,2 x SSC e SDS a 0,1%. A expressão "condições de estringência moderada" refere-se às condições que incluem a utilização de uma solução de lavagem e condições de hibridação (e. g., temperatura e força iónica) menos estringentes do que as descritas acima. Um exemplo de 23 condições moderadamente estringentes são condições tal como incubação de um dia para o outro, a 37 °C, numa solução compreendendo: formamida a 20%, 5 x SSC, fosfato de sódio a 50 mM (pH 7,6), 5 x solução de Denhardt, sulfato de dextrano a 10% e ADN de esperma de salmão cisalhado desnaturado a 20 pL/mL, seguido de lavagem dos filtros em 1 x SSC, a cerca de 37-50 °C. O especialista na técnica reconhecerá como ajustar a temperatura, força iónica e outros parâmetros conforme necessário, para acomodar factores, tais como comprimento de sonda e semelhantes.
Os métodos de tecnologia de ADN recombinante são expostos em Sambrook et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.I. (1989)) e/ou Ausubel et al., ed., (Current Protocols in
Molecular Biology, Green Publishers Inc. e Wiley and Sons, N.I. (1994)). A invenção proporciona para moléculas de ácido nucleico isoladas codificando polipéptidos de B7RP1. Também são proporcionadas moléculas de ácido nucleico que são fragmentos, variantes alélicos, variantes de excisão ou são complementares em sequência a moléculas codificando polipéptidos de B7RP1. Também são divulgadas moléculas de ácido nucleico que são, pelo menos, cerca de 70% idênticas a moléculas codificando CRP1 ou B7RP1 ou que se hibridam a moléculas codificando CRP1 ou B7RP1 sob condições de estringência moderada ou elevada. As moléculas de ácido nucleico podem ser ADNc, ADN genómico, ARN ou uma molécula de ácido nucleico parcial ou totalmente sintética. Em aspectos preferidos, as moléculas de ácido nucleico da presente divulgação são, pelo menos, cerca de 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% 24 idênticas a moléculas de ácido nucleico codificando CRP1 ou B7RP1.
Um gene ou ADNc codificando um polipéptido de CRP1 ou B7RP1 ou seu fragmento, pode ser obtido, por exemplo, por hibridação, rastreio ou amplificação de PCR de uma biblioteca genómica ou de ADNc. As sondas ou iniciadores úteis para o rastreio da biblioteca podem ser gerados com base em informação de sequência para outros genes ou fragmentos de genes conhecidos da mesma família de genes ou uma família de genes relacionada, por exemplo, motivos conservados verificados em polipéptidos relacionados com CRP1 ou B7RP1, tal como uma matriz conservada de resíduos de cisteína. Além disso, onde tenha sido identificado um gene codificando um polipéptido de CRP1 ou B7RP1 de uma espécie, a totalidade ou uma porção desse gene pode ser utilizada como uma sonda para identificar genes homólogos de outra espécie. As sondas ou iniciadores podem ser utilizados para rastrear bibliotecas de ADNc de diversas fontes de tecidos que se considera que expressam o gene de CRP1 ou B7RP1.
Onde sondas oligonucleotídicas são utilizadas para rastrear bibliotecas de ADNc ou genómicas, pode ser utilizada uma das duas soluções de estringência elevada seguintes. A primeira destas é 6 X SSC com pirofosfato de sódio a 0,05%, a 35 °C-62 °C, com a temperatura dependendo do comprimento da sonda oligonucleotídica. Por exemplo, sondas de 14 pares de bases são lavadas a 35-40 °C, sondas de 17 pares de bases são lavadas a 45-50 °C, sondas de 20 pares de bases são lavadas a 52-57 °C e sondas de 23 pares de bases são lavadas a 57-63 °C. Onde a ligação de fundo não específica pareça elevada, a temperatura pode ser aumentada 2-3 °C. Uma segunda solução de estringência elevada utiliza cloreto de tetrametilamónio (TMAC) 25 para lavagem de sondas oligonucleotídicas. Uma solução de lavagem estringente é TMAC a 3 M, Tris-HCl a 50 mM, pH 8,0 e SDS a 0,2%. A temperatura de lavagem utilizando esta solução é uma função do comprimento da sonda. Por exemplo, uma sonda de 17 pares de bases é lavada a cerca de 45-50 °C.
Outro meio para preparar um gene codificando um polipéptido de CRP1 ou B7RP1 ou seu fragmento, é empregar síntese química utilizando métodos bem conhecidos do especialista na técnica, tais como os descritos por Engels et al., (Agnew. Chem. Intl. Ed., 28:716-734 (1989)). Estes métodos incluem, inter alia, os métodos de fosfotriéster, fosforamidito e H-fosfonato, para a síntese de ácido nucleico. Um método preferido para essa síntese química é a síntese suportada por polímero utilizando química de fosforamidito corrente. Tipicamente, o ADN codificando um polipéptido de CRP1 ou B7RP1 terá várias centenas de nucleótidos em comprimento. Utilizando estes métodos, os ácidos nucleicos superiores a cerca de 100 nucleótidos podem ser sintetizados como vários fragmentos. Os fragmentos podem, depois, ser ligados em conjunto para formar um polipéptido de CRPl ou B7RP1 de comprimento completo. Habitualmente, o fragmento de ADN codificando a terminação amino do polipéptido terá um ATG, que codifica um resíduo de metionina. Esta metionina pode ou não estar presente na forma madura de um polipéptido de CRPl ou B7RP1, dependendo se o polipéptido produzido na célula hospedeira é concebido para ser segregado desde essa célula.
As moléculas de ácido nucleico de CRPl ou B7RP1, fragmentos e/ou derivados que não codificam eles mesmos polipéptidos que são biologicamente activos podem, não obstante, ser úteis como sondas de hibridação em ensaios de diagnóstico para testar, qualitativa ou quantitativamente, para a presença de ADN de CRPl 26 ou B7RP1 ou ARN correspondente, em amostras de tecido ou fluido corporal de mamífero.
Em alguns casos, pode ser desejável preparar variantes de ácido nucleico e/ou aminoácido de polipéptidos de CRP1 ou B7RP1 de ocorrência natural. Os variantes de ácido nucleico podem ser produzidos utilizando mutagénese dirigida pontual, amplificação por PCR ou outros métodos apropriados, onde o(s) iniciador(es) tem (têm) as mutações pontuais desejadas, (ver Sambrook et al., supra, e Ausubel et al., supra, para descrições de técnicas de mutagénese). A síntese química utilizando métodos descritos por Engels et al., supra, também pode ser utilizada para preparar esses variantes. Também podem ser utilizados outros métodos conhecidos do especialista na técnica.
Os variantes de ácido nucleico preferidos incluem aqueles contendo codões, que foram alterados para expressão óptima de polipéptidos de CRP1 e B7RP1 numa determinada célula hospedeira. As alterações de codão particulares dependerão da selecção de proteína e célula hospedeira. Essa "optimização de codão" pode, num caso, ser efectuada pela selecção de codões que são utilizados, de um modo preferido, em genes altamente expressos numa determinada célula hospedeira. Algoritmos de computador que incorporam tabelas de frequência de codão, tal como "Ecohigh. Cod", para preferência de codão de genes bacterianos altamente expressos, podem ser utilizados e são proporcionados pelo University of Wisconsin Package, Versão 9.0, Genetics Computer Group, Madison, WI. Outras tabelas de frequência de codão úteis incluem "Celegans_high.cod", "Celegans_low.cod", "Drosophila_high.cod", "Human_high.cod", "Maize_high.cod" e "Yeast_high.cod". Outros variantes preferidos são aqueles codificando alterações conservativas de aminoácido, como 27 descrito abaixo (e. g., em que a carga ou polaridade da cadeia lateral de aminoácido de ocorrência natural nao é substancialmente alterada por substituição com um aminoácido diferente), em comparação com o tipo selvagem, e/ou aqueles concebidos para gerar um novo sítio(s) de glicosi lação e/ou fosforilaçao ou aqueles concebidos para delecionar um sitio(s) de glicosilação e/ou fosforilação existente. 0 gene, ADNc ou seu fragmento codificando um polipéptido de CRP1 ou B7RP1, pode ser inserido num vector de expressão ou amplificação apropriado, utilizando técnicas de ligação correntes. 0 vector é, tipicamente, seleccionado para ser funcional na célula hospedeira particular empregue (i. e., o vector é compatível com a maquinaria da célula hospedeira, de modo a que a amplificação do gene e/ou expressão do gene possa ocorrer). 0 gene, ADNc ou seu fragmento codificando o polipéptido de CRP1 ou B7RP1 pode ser amplif icado/expresso em células hospedeiras procarióticas, de levedura, de insecto (sistemas de baculovírus) e/ou eucarióticas. A selecção da célula hospedeira dependerá, em parte, se o polipéptido de CRP1 ou B7RP1 ou seu fragmento se destina a ser glicosilado e/ou fosforilado. Se assim for, as células hospedeiras de levedura, de insecto ou mamíferas são preferidas.
Tipicamente, os vectores de expressão utilizados em qualquer das células hospedeiras conterão sequências para manutenção plasmídica e clonagem e expressão de sequências nucleotídicas inseridas. Essas sequências, referidas colectivamente como "sequências flanqueadoras", incluirão um promotor e outros elementos regulatórios, tais como um estimulador(es), um elemento de origem de replicação, um elemento de terminação transcricional, uma sequência intrónica 28 completa contendo um sítio de excisão dador e aceitador, uma sequência de péptido sinal, um elemento de sítio de ligação de ribossoma, uma sequência de poliadenilação, uma região poliadaptadora para inserção do ácido nucleico codificando o polipéptido a ser expresso e um elemento marcador seleccionável. Cada destes elementos é discutido abaixo. Opcionalmente, o vector pode conter uma sequência de "marcador", i. e., uma molécula oligonucleotídica localizada na extremidade 5' ou 3' de uma sequência codificante de polipéptido de CRP1 ou B7RP1; a molécula oligonucleotídica codifica poliHis (tal como hexaHis) ou outro "marcador", tais como FLAG, HA (hemaglutinina de vírus Influenza) ou myc, para as quais existem anticorpos comercialmente disponíveis. Este marcador está, tipicamente, fundida ao polipéptido após expressão do polipéptido e pode servir como um meio para purificação de afinidade de um polipéptido de CRP1 ou B7RP1 a partir da célula hospedeira. A purificação de afinidade pode ser alcançada, por exemplo, por cromatografia de coluna, utilizando anticorpos contra o marcador como uma matriz de afinidade. Opcionalmente, o marcador pode ser subsequentemente removido de um polipéptido de CRP1 ou B7RP1 purificado por diversos meios, tal como utilizando determinadas peptidases. A região de articulação e Fc de imunoglobulina humana pode ser fundida na terminação N ou terminação C de um polipéptido de CRP1 ou B7RP1 por um especialista na técnica. A proteína de fusão de Fc subsequente pode ser purificada por utilização de uma coluna de afinidade de Proteína A. Sabe-se que uma região de Fc de imunoglobina exibe uma longa semi-vida farmacocinética in vivo e verificou-se que as proteínas fundidas a uma região de Fc exibem uma semi-vida substancialmente maior in vivo comparada com as equivalentes não fundidas. Do mesmo modo, a fusão à 29 região de Fc permite para dimerização e/ou multimerização da molécula que pode ser útil para a bioactividade de algumas moléculas. A sequência flanqueadora pode ser homóloga (i. e., da mesma espécie e/ou estirpe que a célula hospedeira), heteróloga (i. e., de uma espécie excluindo a espécie ou estirpe da célula hospedeira), híbrida (i. e., uma combinação de sequências flanqueadoras de mais do que uma fonte) , sintética ou podem ser as sequências flanqueadoras de ácido nucleico de CRP1 ou B7RP1 nativas. Como tal, a fonte da sequência flanqueadora pode ser qualquer organismo procariótico ou eucariótico unicelular, qualquer organismo vertebrado ou invertebrado ou qualquer planta, desde que a sequência flanqueadora seja funcional e possa ser activada pela maquinaria da célula hospedeira.
As sequências flanqueadoras úteis nos vectores desta invenção podem ser obtidas por qualquer de vários métodos bem conhecidos na técnica. Tipicamente, as sequências flanqueadoras úteis aqui, excluindo a sequência flanqueadora de ácido nucleico de CRP1 ou B7RP1, terão sido anteriormente identificadas por mapeamento e/ou por digestão de endonuclease de restrição e podem, deste modo, ser isoladas da fonte de tecido adequada, utilizando as endonucleases de restrição apropriadas. Em alguns casos, a sequência nucleotídica completa da sequência flanqueadora pode ser conhecida. Aqui, a sequência flanqueadora pode ser sintetizada utilizando os métodos descritos acima para síntese ou clonagem de ácido nucleico.
Onde a totalidade ou apenas uma porção da sequência flanqueadora seja conhecida, pode ser obtida utilizando PCR e/ou pelo rastreio de uma biblioteca genómica com fragmentos 30 oligonucleotídicos e/ou de sequência flanqueadora adequados da mesma ou de outra espécie.
Onde a sequência flanqueadora não seja conhecida, um fragmento de ADN contendo uma sequência flanqueadora pode ser isolado de um fragmento de ADN maior que pode conter, por exemplo, uma sequência codificante ou mesmo outro gene ou genes. 0 isolamento pode ser alcançado por digestão por endonuclease de restrição utilizando uma ou mais enzimas cuidadosamente seleccionadas para isolar o fragmento de ADN apropriado. Após digestão, o fragmento desejado pode ser isolado por purificação de gel de agarose, coluna Qiagen® ou outros métodos conhecidos do especialista na técnica. A selecção de enzimas adequadas para realizar esta finalidade será facilmente evidente para alguém com conhecimentos gerais na técnica. 0 elemento de origem de replicação é, tipicamente, uma parte de vectores de expressão procarióticos adquiridos comercialmente e auxilia na amplificação do vector numa célula hospedeira. A amplificação do vector até um determinado número de cópia pode, em alguns casos, ser importante para expressão óptima do polipéptido de CRP1 ou B7RP1. Se o vector de escolha não contiver um sitio de origem de replicação, pode ser quimicamente sintetizado com base numa sequência conhecida e ligado ao vector. 0 elemento de terminação de transcrição está tipicamente localizado em 3' da extremidade de uma sequência codificante de polipéptido de CRPl ou B7RP1 e serve para terminar a transcrição de um polipéptido de CRPl ou B7RP1. Habitualmente, o elemento de terminação de transcrição em células procarióticas é um fragmento rico em G-C, seguido de uma sequência de poli T. 31
Embora o elemento seja facilmente clonado a partir de uma biblioteca ou até mesmo adquirido comercialmente como parte de um vector, também pode ser facilmente sintetizado utilizando métodos para síntese de ácido nucleico, tais como os descritos acima.
Um elemento génico marcador seleccionável codifica uma proteína necessária para a sobrevivência e crescimento de uma célula hospedeira, cultivada num meio de cultura selectivo. Os genes marcadores de selecção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, e. g., ampicilina, tetraciclina ou canamicina, para células hospedeiras procarióticas; (b) complementam deficiências auxotróficas da célula; ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis de meios complexos. São marcadores seleccionáveis preferidos o gene de resistência à canamicina, o gene de resistência à ampicilina e o gene de resistência à tetraciclina. 0 elemento de ligação de ribossoma, geralmente denominado sequência de Shine-Dalgarno (procariotas) ou a sequência de Kozak (eucariotas) é, habitualmente, necessário para iniciação traducional de ARNm. 0 elemento está, tipicamente, localizado a 3' do promotor e a 5' da sequência codificante do polipéptido de CRP1 ou B7RP1 a ser sintetizado. A sequência de Shine-Dalgarno é variada mas é, tipicamente, uma polipurina (i. e., tendo um elevado teor de A-G) . Muitas sequências de Shine-Dalgarno foram identificadas, cada qual pode ser facilmente sintetizada utilizando os métodos expostos acima e utilizadas num vector procariótico.
Nos casos onde é desejável que um polipéptido de CRP1 ou B7RP1 seja segregado da célula hospedeira, uma sequência sinal 32 pode ser utilizada para dirigir a exportação do polipéptido da célula hospedeira. Um dominio transmembranar de CRP1 ou B7RP1 também é inactivado por mutação ou deleção para prevenir a conjugação à membrana de hospedeiro. Tipicamente, a sequência sinal é posicionada na região codificante de um gene ou ADNc de CRP1 ou B7RP1 ou directamente na extremidade 5' de uma região codificante génica de CRP1 ou B7RP1. Foram identificadas muitas sequências sinal e qualquer das que sejam funcionais na célula hospedeira seleccionada podem ser utilizadas em conjunto com um gene ou ADNc de CRP1 ou B7RP1. Por conseguinte, a sequência sinal pode ser homóloga ou heteróloga a um gene ou ADNc de CRP1 ou B7RP1 e pode ser homóloga ou heteróloga a um gene ou ADNc de polipéptidos de CRP1 ou B7RP1. Além disso, a sequência sinal pode ser quimicamente sintetizada utilizando métodos expostos acima.
Na maioria dos casos, a secreção do polipéptido da célula hospedeira por meio da presença de um péptido sinal, resultará na remoção da metionina aminoterminal do polipéptido.
Em muitos casos, a transcrição de um gene ou ADNc de CRPl ou B7RP1 é aumentada pela presença de um ou mais intrões no vector; isto é particularmente verdadeiro onde um polipéptido de CRPl ou B7RP1 é produzido em células hospedeiras eucarióticas, especialmente células hospedeiras mamíferas. Os intrões utilizados podem ser de ocorrência natural dentro de um gene de CRPl ou B7RP1, especialmente onde o gene utilizado seja uma sequência genómica de comprimento completo ou um seu fragmento. Onde o intrão não seja de ocorrência natural dentro do gene (como para a maioria dos ADNc), o(s) intrão (ões) pode(m) ser obtido(s) de outra fonte. A posição do intrão com respeito à sequência flanqueadora em 5' e um gene de CRPl ou B7RP1 é, em 33 geral, importante, uma vez que para ser eficaz o intrão deve ser transcrito. Como tal, onde um gene de CRP1 ou B7RP1 inserido no vector de expressão seja uma molécula de ADNc, a posição preferida para o intrão é 3' em relação ao sitio de inicio de transcrição e 5' em relação à sequência de terminação de transcrição de poliA. De um modo preferido, o intrão ou intrões estarão localizados num ou noutro lado (i. e., 5' ou 3') do ADNc, de modo a que não interrompam esta sequência codificante. Qualquer intrão de qualquer fonte, incluindo quaisquer organismos virais, procarióticos e eucarióticos (planta ou animal), pode ser utilizado para praticar esta invenção, desde que seja compatível com a(s) célula(s) hospedeira(s) dentro da(s) qual(is) está inserido. Também estão aqui incluídos intrões sintéticos. Opcionalmente, mais de um intrão pode ser utilizado no vector.
Onde um ou mais dos elementos expostos acima não estiverem já presentes no vector a ser utilizado, podem ser obtidos e ligados individualmente ao vector. Os métodos utilizados para obtenção de cada dos elementos são bem conhecidos do especialista na técnica.
Os vectores preferidos para a prática desta invenção são os que são compatíveis com células hospedeiras bacterianas, de insecto e mamíferas. Esses vectores incluem, inter alia, pCRII, pCR3 e pcDNA3.1 (Invitrogen Company, San Diego, CA), pBSII (Stratagene Company, La Jolla, CA), pET15b (Novagen, Madison, WI), pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.), pEGFP-N2 (Clontech, Paio Alto, CA), pETL (BlueBacII; Invitrogen) e pFastBacDual (Gibco/BRL, Grand Island, N.I.). 34
Depois do vector ter sido construído e uma molécula de ácido nucleico codificando um polipéptido de CRP1 ou B7RP1, de comprimento completo ou truncado, ter sido inserida no sítio adequado do vector, o vector completo pode ser inserido numa célula hospedeira adequada para amplificação e/ou expressão polipeptídica.
As células hospedeiras podem ser células hospedeiras procarióticas (tal como E. coli) ou células hospedeiras eucarióticas (tal como uma célula de levedura, uma célula de insecto ou uma célula de vertebrado). A célula hospedeira, quando cultivada sob condições apropriadas, pode sintetizar um polipéptido de CRPl ou B7RP1 que pode ser, subsequentemente, recolhido do meio de cultura (se a célula hospedeira o segregar para o meio) ou directamente da célula hospedeira que o produz (se não for segregado) . Após recolha, um polipéptido de CRPl ou B7RP1 pode ser purificado utilizando métodos, tais como cromatografia de crivo molecular, cromatografia de afinidade e semelhantes. A selecção da célula hospedeira apropriada para a produção de polipéptido de CRPl ou B7RP1 dependerá de diversos factores, tais como níveis de expressão desejados, modificações polipeptídicas que sejam requeridas para actividade, tais como glicosilação ou fosforilação, ou facilidade de enrolamento numa molécula biologicamente activa. Células ou linhas celulares adequadas podem ser células mamíferas, tais como células de ovário de hámster Chinês (CHO), células 293 ou 293T de rim embrionário humano (HEK) ou células 3T3. A selecção de células hospedeiras mamíferas adequadas e métodos para transformação, cultivo, amplificação, 35 rastreio e produção e purificação de produto são conhecidos na técnica. Outras linhas celulares mamíferas adequadas são as linhas celulares COS-1 e COS-7 de macaco e a linha celular CV-1. Células hospedeiras mamíferas exemplificativas adicionais incluem linhas celulares de primata e linhas celulares de roedor, incluindo linhas celulares transformadas. Também são adequadas células diplóides normais, estirpes celulares derivadas de cultura in vitro de tecido primário, assim como explantes primários. As células candidatas podem ser genotipicamente deficientes no gene de selecção ou podem conter um gene de selecção actuando de modo dominante. Outras linhas celulares mamíferas adequadas incluem, mas não estão limitadas, a células de neuroblastoma N2A de murganho, HeLa, células L-929 de murganho, linhas 3T3 derivadas de murganhos Swiss, Balb-c ou NIH, linhas celulares de BHK ou HaK de hámster.
Analogamente úteis como células hospedeiras são as células bacterianas. Por exemplo, as diversas estirpes de E. coli (e. g., HB101, DH5oí, DH10 e MC1061) são bem conhecidas como células hospedeiras no campo da biotecnologia. Também podem ser empregues neste método diversas estirpes de B. subtilis, Pseudomonas spp., outros Bacillus spp., Streptomyces spp. e semelhantes.
Muitas estirpes de células de levedura conhecidas dos especialistas na técnica também estão disponíveis como células hospedeiras para a expressão dos polipéptidos da presente invenção.
Além disso, onde desejado, podem ser utilizados sistemas de células de insecto nos métodos da presente invenção. Esses sistemas são descritos, por exemplo, em Kitts et al., 36
Lucklow (Curr. Opin. (Biotechniques, b4:810-817 (1993)),
Biotechnol., _4:564-572 (1993)) e Lucklow et al., (J. Virol., 6_7: 4566-4579 (1993)). As células de insecto preferidas são Sf-9 e Hi5 (Invitrogen, Carlsbad, CA). A "transformação" ou "transfecção" de um vector de expressão na célula hospedeira seleccionada pode ser alcançada utilizando métodos, tais como cloreto de cálcio, electroporação, micro-injecção, lipofecção ou o método de DEAE-dextrano. O método seleccionado será, em parte, uma função do tipo de célula hospedeira a ser utilizada. Estes métodos e outros métodos adequados são bem conhecidos do especialista na técnica e são expostos, por exemplo, em Sambrook et al., supra.
As células hospedeiras transformadas ou transfectadas com um vector de expressão podem ser cultivadas utilizando meios correntes, bem conhecidos do especialista na técnica. Os meios conterão, habitualmente, todos os nutrientes necessários para o crescimento e sobrevivência das células. Os meios adequados para o cultivo de células E. coli são, por exemplo, Luria Broth (LB) e/ou Terrific Broth (TB) . Os meios adequados para cultivo de células eucarióticas são RPMI 1640, MEM, DMEM, todos eles podem ser suplementados com soro e/ou factores de crescimento, como requerido pela linha celular particular sendo cultivada. Um meio adequado para culturas de insecto é o meio de Grace, suplementado com yeastolate, hidrolisado de lactalbumina e/ou soro de vitelo fetal, conforme necessário.
Tipicamente, um antibiótico ou outro composto útil para crescimento selectivo das células transformadas é apenas adicionado como um suplemento aos meios. O composto a ser utilizado será ditado pelo elemento marcador seleccionável 37 presente no plasmideo, com o qual a célula hospedeira foi transformada. Por exemplo, onde o elemento marcador seleccionável seja resistência à canamicina, o composto adicionado ao meio de cultura será a canamicina. A quantidade de um polipéptido de CRP1 ou B7RP1 produzido na célula hospedeira pode ser avaliada utilizando métodos correntes conhecidos na técnica. Esses métodos incluem, sem limitação, análise de transferência de Western, electroforese em gel de SDS-poliacrilamida, electroforese em gel não desnaturante, separação por HPLC, imunoprecipitação e/ou ensaios de actividade, tal como ensaios de deslocamento de gel de ligação de ADN.
Se um polipéptido de CRP1 ou B7RP1 tiver sido concebido para ser segregado das células hospedeiras, a maioria do polipéptido pode ser encontrada no meio de cultura celular. Os polipéptidos preparados deste modo não irão, tipicamente, possuir uma metionina aminoterminal, uma vez que é removida durante a secreção desde a célula. Se, contudo, um polipéptido de CRP1 ou B7RP1 não for segregado das células hospedeiras, estará presente no citoplasma e/ou no núcleo (para células hospedeiras eucarióticas) ou no citosol (para células hospedeiras de bactérias gram-negativas) e pode ter uma metionina aminoterminal. A purificação de um polipéptido de CRP1 ou B7RP1 de solução pode ser alcançada utilizando uma variedade de técnicas. Se o polipéptido tiver sido sintetizado de modo a que contenha um marcador, tal como Hexa-histidina (CRP1 ou B7RP1 hexaHis) ou outro péptido pequeno, tais como FLAG (Eastman Kodak Co., New Haven, CT) ou myc (Invitrogen, Carlsbad, CA) na sua terminação 38 carboxilo ou amino, pode ser essencialmente purificado num processo de uma etapa, pela passagem do polipéptido com marcador através de uma coluna de afinidade onde a matriz de coluna tem uma elevada afinidade para o marcador ou para o polipéptido directamente (i. e., um anticorpo monoclonal reconhecendo especificamente um polipéptido de CRP1 ou B7RP1). Por exemplo, a poli-histidina liga-se com grande afinidade e especificidade a níquel, deste modo uma coluna de afinidade de níquel (tal como as colunas de níquel da Qiagen®) pode ser utilizada para purificação de CRPl ou B7RP1/poliHis. (Ver, por exemplo, Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Secção 10.11.8, John Wiley & Sons, Nova Iorque (1993)).
Onde um polipéptido de CRPl ou B7RP1 seja preparado sem um marcador conjugado e sem anticorpos disponíveis, podem ser utilizados outros processos bem conhecidos para purificação. Esses processos incluem, sem limitação, cromatografia de permuta iónica, cromatografia de crivo molecular, HPLC, electroforese em gel nativo, em combinação com eluição de gel e focalização isoeléctrica preparativa (máquina/técnica de "Isoprime", Hoefer Scientific). Em alguns casos, para se alcançar pureza aumentada, duas ou mais destas técnicas podem ser combinadas.
Se for antecipado que um polipéptido de CRPl ou B7RP1 se encontre principalmente intracelularmente, o material intracelular (incluindo corpos de inclusão para bactérias gram-negativas) pode ser extraído da célula hospedeira utilizando qualquer técnica corrente conhecida do especialista na técnica. Por exemplo, as células hospedeiras podem ser lisadas para libertarem o conteúdo do periplasma/citoplasma por prensa Francesa, homogeneização e/ou sonicação, seguida de centrifugação. 39
Se um polipéptido de CRP1 ou B7RP1 tiver formado corpos de inclusão no citosol, os corpos de inclusão podem, frequentemente, ligar-se às membranas celulares internas e/ou externas e, deste modo, após centrifugação, encontrar-se-ão, principalmente, no material de sedimento. 0 material de sedimento pode, depois, ser tratado a extremos de pH ou com agente caotrópico, tais como um detergente, guanidina, derivados de guanidina, ureia ou derivados de ureia, na presença de um agente de redução, tal como ditiotreitol a pH alcalino ou tris carboxietilo fosfina a pH ácido, para libertar, desagregar e solubilizar os corpos de inclusão. 0 polipéptido, na sua forma agora solúvel, pode, depois, ser analisado utilizando electroforese em gel, imunoprecipitação ou semelhantes. Se for desejado isolar um polipéptido de CRP1 ou B7RP1, o isolamento pode ser alcançado utilizando métodos correntes, tais como os expostos abaixo e em Marston et al., (Meth. Enz., 182:264-275 (1990)). Em alguns casos, após isolamento, um polipéptido de CRP1 ou B7RP1 pode não ser biologicamente activo. Podem ser utilizados diversos métodos para "reenrolamento" ou conversão do polipéptido na sua estrutura terciária e geração de ligações dissulfureto para restaurar a actividade biológica. Esses métodos incluem a colocação do polipéptido solubilizado em contacto com uma solução tendo um pH habitualmente acima de 7 e na presença de uma concentração particular de um caotrópico apropriado. Na maioria dos casos, a solução de reenrolamento/oxidação também conterá um agente de redução ou o agente de redução e a forma oxidada correspondente, numa razão especifica, para gerar um potencial redox particular, permitindo para a ocorrência de rearranjo de dissulfureto na formação da(s) ponte(s) de cisteina da proteína. Alguns dos pares redox geralmente utilizados incluem cisteína/cistamina, glutationo 40 (GSH)/ditiobis GSH, cloreto cúprico, ditiotreitol (DTT)/ditiano DTT, 2-mercaptoetanol(bME)/ditio-b(ME) . Em muitos casos, um co-solvente é necessário para aumentar a eficiência do reenrolamento e os reagentes mais comuns utilizados para este efeito incluem glicerol, polietilenoglicol de diversos pesos moleculares e arginina.
Os polipéptidos de CRP1 ou B7RP1, seus fragmentos e/ou derivados, também podem ser preparados por métodos de síntese química (tal como síntese peptídica de fase sólida) utilizando técnicas conhecidas na matéria, tais como as expostas por Merrifield et al., (J. Am. Chem. Soc., 8_5:2149 (1963)), Houghten et al., (Proc Natl Acad. Sei. USA, 8_2:5132 (1985)) e Stewart e Young (Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984)). Esses polipéptidos podem ser sintetizados com ou sem uma metionina na terminação amino. Os polipéptidos ou fragmentos de CRP1 ou B7RP1 sintetizados quimicamente podem ser oxidados utilizando métodos expostos nestas referências para formar pontes dissulfureto. Espera-se que os polipéptidos ou fragmentos de CRP1 ou B7RP1 tenham actividade biológica comparável à dos polipéptidos de CRP1 ou B7RP1 produzidos recombinantemente ou purificados de fontes naturais e, deste modo, podem ser utilizados alternadamente com polipéptido de CRP1 ou B7RP1 recombinante ou natural.
Polipéptidos A expressão "polipéptido de CRP1 ou B7RP1" refere-se a um polipéptido tendo a sequência de aminoácidos da Figura IA (SEQ ID N°: 2), Figura 2A (SEQ ID N°: 7) ou Figura 3A (SEQ ID N°: 12) e todos os polipéptidos relacionados aqui 41 descritos. Os polipéptidos relacionados incluem variantes alélicos, variantes de excisão, fragmentos, derivados, variantes de substituição, deleção e inserção, polipéptidos de fusão e ortólogos. Esses polipéptidos relacionados podem ser polipéptidos maduros, i. e., polipéptido desprovido de um péptido sinal. Um polipéptido de CRP1 ou B7RP1 pode ou não ter metionina aminoterminal, dependendo do modo como são preparados. A expressão "fragmento de polipéptido de CRP1 ou B7RP1" refere-se a um péptido ou polipéptido que é inferior à sequência de aminoácidos de comprimento completo de um polipéptido de CRP1 ou B7RP1, como exposto na Figura IA (SEQ ID N° : 2), Figura 2A (SEQ ID N°: 7) ou Figura 3A (SEQ ID N°: 12). Esse fragmento pode resultar de truncamento na terminação amino, truncamento na terminação carboxilo e/ou uma deleção interna na sequência polipeptidica. Esses fragmentos de polipéptido de CRPl ou B7RP1 podem ser preparados com ou sem uma metionina aminoterminal. Além disso, os fragmentos de polipéptido de CRPl ou B7RP1 podem ser variantes de excisão de ocorrência natural, outros variantes de excisão e fragmentos resultando de actividade de protease in vivo ocorrendo naturalmente. Os fragmentos de polipéptido de CRPl ou B7RP1 preferidos incluem formas solúveis de CRPl ou B7RP1 que não têm um domínio transmembranar funcional e compreendem parte ou a totalidade do domínio extracelular de CRPl ou B7RP1. A expressão "variantes de polipéptido de CRPl ou B7RP1" refere-se a polipéptidos de CRPl ou B7RP1 cujas sequências de aminoácidos contêm uma ou mais substituições, deleções e/ou adições de sequência de aminoácidos, em comparação com as sequência de aminoácidos de polipéptidos de CRPl ou B7RP1 expostas na Figura IA (SEQ ID N°: 2), Figura 2A (SEQ ID N°: 7) 42 ou Figura 3A (SEQ ID N°: 12) . Esses variantes de polipéptido de CRP1 ou B7RP1 podem ser preparados a partir dos correspondentes variantes de moléculas de ácido nucleico de polipéptidos de CRP1 e B7RP1 que têm uma sequência de ADN que varia em conformidade com as sequências de ADN para polipéptidos de CRPl ou B7RP1.
Como aqui utilizado, A expressão "derivados de polipéptido de CRPl ou B7RP1" refere-se a polipéptidos de CRPl ou B7RP1, seus variantes ou fragmentos, que foram modificados quimicamente como, por exemplo, por adição de um ou mais polímeros solúveis em água, hidratos de carbono ligados a N ou ligados a 0, açúcares, fosfatos e/ou outras dessas moléculas, onde a molécula ou moléculas não estão naturalmente conjugadas a polipéptidos de CRPl ou B7RP1 de tipo selvagem. Os derivados incluem, ainda, a deleção de um ou mais grupos químicos naturalmente conjugados ao polipéptido de CRPl ou B7RP1.
Como aqui utilizado, A expressão "polipéptidos de CRPl ou B7RP1 biologicamente activos", "fragmentos de polipéptido de CRPl ou B7RP1 biologicamente activos", "variantes de polipéptido de CRPl ou B7RP1 biologicamente activos" e "derivados de polipéptido de CRPl ou B7RP1 biologicamente activos" referem-se a polipéptidos de CRPl ou B7RP1 tendo, pelo menos, uma das actividades caracteristicas de CRPl ou B7RP1. Outra actividade é a capacidade de CRPl ou B7RP1 estimularem a proliferação e/ou activação de célula T. 0 termo "ortólogo" refere-se a um polipéptido que corresponde a um polipéptido identificado de uma espécie. Por exemplo, os polipéptidos de B7RP1 de murganho e humanos são considerados ortólogos. 43 A expressão "sequência de aminoácidos madura" refere-se a um polipéptido desprovido de uma sequência lider. A expressão "polipéptido isolado" refere-se a um polipéptido que está isento de, pelo menos, um polipéptido contaminante que se encontra no seu ambiente natural e, de um modo preferido, substancialmente isento de quaisquer outros polipéptidos mamíferos contaminantes. 0 termo "identidade", como conhecido na técnica, é uma relação entre as sequências de duas ou mais moléculas de ácido nucleico ou dois ou mais polipéptidos, como determinado pela comparação das sequências. Na técnica, "identidade", também significa o grau de parentesco de sequência entre sequências polipeptídicas ou moléculas de ácido nucleico, consoante o caso, como determinado pela correspondência entre segmentos de sequências nucleotídicas ou de aminoácidos. A "identidade" mede a percentagem de correspondências idênticas entre duas ou mais sequências, com os alinhamentos de lacunas abordados por programas de computador particulares (i. e., "algoritmos"). 0 termo "semelhança" refere-se a um conceito relacionado mas, em contraste com "identidade", uma medida de semelhança inclui correspondências idênticas e correspondências de substituição conservativa. Uma vez que as substituições conservativas se aplicam a polipéptidos e não a moléculas de ácido nucleico, a semelhança apenas trata de comparações de sequência polipeptídica. Se duas sequências polipeptídicas têm, por exemplo, 10/20 aminoácidos idênticos e os restantes são todos substituições não conservativas, então a percentagem de identidade e semelhança seriam ambas 50%. Se, no mesmo exemplo, existirem mais 5 posições onde existem substituições 44 conservativas, então a percentagem de identidade permanece 50%, mas a percentagem de semelhança seria 75% (15/20) . Por conseguinte, nos casos onde existem substituições conservativas, o grau de semelhança entre duas sequências polipeptidicas será superior à percentagem de identidade entre essas duas sequências. As substituições "conservativas" de aminoácidos são aqui descritas abaixo em referência à Tabela I. Com base na Tabela I, as substituições conservativas de aminoácidos são aminoácidos alternados seleccionados do mesmo agrupamento, e. g., básicos, acidicos, polares não carregados e não polares. Por exemplo, as substituições conservativas de aminoácidos para arginina seriam lisina e histidina. A identidade e semelhança podem ser facilmente calculadas por métodos conhecidos, incluindo, mas não limitados aos descritos em Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nova Iorque, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nova Iorque, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A.M., e Griffin, H.G., ed., Humana Press, Nova Jérsia, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von
Heinje, G., Academic Press, 1987; e Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., ed., M. Stockton Press, Nova Iorque, 1991; e Carillo, H. e Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988) .
Os métodos preferidos para determinar a identidade e/ou semelhança são concebidos para proporcionarem a maior correspondência entre as sequências testadas. Os métodos para determinar a identidade e semelhança estão codificados em programas de computador publicamente disponíveis. Os métodos de programas de computador preferidos para determinar a identidade 45 e semelhança entre duas sequências incluem, mas não estão limitados, ao pacote do programa GCG, incluindo GAP (Devereux, J., et ai., Nucleic Acids Research 1_2 (1):387 (1984); Genetics
Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), BLASTP, BLASTN e FASTA (Atschul, S.F. et al., J. Molec. Biol. 215:403-410 (1990). 0 programa BLAST X está publicamente disponível a partir do National Center for Biotechnology
Information (NCBI) e outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCB NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). O bem conhecido algoritmo de
Smith-Waterman também pode ser utilizado para determinar a identidade. A titulo exemplificativo, utilizando o algoritmo de computador GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), dois polipéptidos para os quais a percentagem de identidade de sequência deva ser determinada, são alinhados para correspondência óptima dos seus respectivos aminoácidos (a "secção correspondida", como determinado pelo algoritmo). Uma penalidade de abertura de lacuna (que é calculada como 3 X a diagonal média; a "diagonal média" é a média da diagonal da matriz de comparação sendo utilizada; a "diagonal" é a pontuação ou número atribuído a cada correspondência de aminoácido perfeita pela matriz de comparação particular) e uma penalidade de extensão de lacuna (que é, habitualmente, 1/10 vezes a penalidade de abertura de lacuna), assim como uma matriz de comparação, tais como PAM 250 ou BLOSUM 62, são utilizadas em conjunto com o algoritmo. Uma matriz de comparação corrente (ver Dayhoff et al., em: Atlas of Proteln Sequence and Structure, vol. 5, sup. 3 (1978) para a matriz de comparação PAM250; ver Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sei 46 USA, 8_9:10915-10919 (1992) para a matriz de comparação BLOSUM 62)) também é utilizada pelo algoritmo.
Os parâmetros preferidos para a comparação de sequências polipeptidicas incluem os seguintes:
Algoritmo: Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. _48: 443-453 (1970)
Matriz de comparação: BLOSUM 62 de Henikoff e Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 89_: 10915-10919 (1992)
Penalidade de Lacuna: 12
Penalidade de Comprimento de Lacuna: 4
Limiar de Semelhança: 0 0 programa GAP é útil com os parâmetros acima. Os parâmetros mencionados acima são os parâmetros predefinidos para comparações polipeptídicas (juntamente com nenhuma penalidade para lacunas de extremidade) utilizando o algoritmo GAP.
Os parâmetros preferidos para a comparação de sequências de moléculas de ácido nucleico incluem os seguintes:
Algoritmo: Needleman e Wunsch, J. Mol Biol. 48:443-453 (1970)
Matriz de comparação: correspondências = +10, não correspondências = 0
Penalidade de Lacuna: 50
Penalidade de Comprimento de Lacuna: 3 O programa GAP também é útil com os parâmetros acima. Os parâmetros mencionados acima são os parâmetros predefinidos para comparações de moléculas de ácido nucleico.
Outros algoritmos, penalidades de abertura de lacuna, penalidades de extensão de lacuna, matrizes de comparação e limiares de semelhança exemplificativos, etc., podem ser utilizados pelos especialistas na técnica, incluindo os expostos no Manual do Programa, Wisconsin Package, Versão 9, Setembro de 1997. As escolhas particulares a serem realizadas dependerão da comparação especifica a ser realizada, tais como ADN com ADN, proteína com proteína, proteína com ADN; e, além disso, se a comparação for entre pares de sequências (caso em que GAP ou BestFit são, em geral, preferidos) ou entre uma sequência e uma base de dados de sequências de grandes dimensões (caso em que FASTA ou BLASTA são preferidos).
Os polipéptidos que são, pelo menos, cerca de 70 por cento idênticos terão, tipicamente, uma ou mais substituições, deleções e/ou adições de aminoácidos, em comparação com um polipéptido de CRP1 ou B7RP1 de tipo selvagem. Numa forma de realização preferida, os polipéptidos terão cerca de 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade com polipéptidos de CRPl ou B7RP1. Habitualmente, as substituições do resíduo nativo serão alanina ou um aminoácido conservativo, de modo a ter-se pouco ou nenhum efeito na carga líquida, polaridade ou hidrofobicidade globais do polipéptido. As substituições conservativas são expostas na Tabela I abaixo. 48
Tabela I
Substituições Conservativas de Aminoácidos Básicos: arginina lisina histidina Acídicos: ácido glutâmico ácido aspártico
Nao Carregados Polares: glutamina
Nao Polares: asparagma serina treonina tirosina fenilalanina triptofano cisteína glicina alanina valina prolina metionina leucina norleucina isoleucina
Os derivados de polipéptido de B7RP1 estão abrangidos pela invenção. Numa forma de realização, as composições de 49 polipéptido de B7RP1 quimicamente modificadas, nas quais os polipéptidos de B7RP1 estão ligados a um polímero, estão incluídas no âmbito da presente invenção. 0 polímero seleccionado é, tipicamente, solúvel em água, de modo que a proteína à qual está conjugado não precipite num ambiente aquoso, tal como um ambiente fisiológico. 0 polímero seleccionado é, habitualmente, modificado para ter um único grupo reactivo, tal como um éster activo para acilação ou um aldeído para alquilação, de modo que o grau de polimerização possa ser controlado, como proporcionado nos presentes métodos. 0 polímero pode ser de qualquer peso molecular e pode ser ramificado ou não ramificado. Uma mistura de polímeros está incluída no âmbito da invenção. De um modo preferido, para utilização terapêutica da preparação de produto final, o polímero será farmaceuticamente aceitável. 0 polímero solúvel em água ou sua mistura pode ser seleccionado do grupo consistindo, por exemplo, em polietilenoglicol (PEG), monometoxi-polietilenoglicol, dextrano, celulose ou outros polímeros à base de hidrato de carbono, poli-(N-vinilpirrolidona) polietilenoglicol, homopolímero de propilenoglicol, um copolimero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (e. g., glicerol) e álcool polivinílico.
Para as reacções de acilação, o(s) polímero(s) seleccionado deve(m) ter um único grupo éster reactivo. Para alquilação redutora, o(s) polímero(s) seleccionado(s) deve(m) ter um único grupo aldeído reactivo. Um aldeído reactivo preferido é o propionaldeído de polietilenoglicol, que é estável em água ou seus derivados de mono C1-C10 alcoxilo ou ariloxilo (ver a Patente U.S. N° 5252714). 50 A peguilação de polipéptidos de CRP1 ou B7RP1 pode ser efectuada por qualquer das reacções de peguilação conhecidas na técnica, como descrito, por exemplo, nas seguintes referências: Focus on Growth Factors 3_: 4-10 (1992); documentos EP 0154316; e EP 0401384. De um modo preferido, a peguilação é efectuada por meio de uma reacção de acilação ou uma reacção de alquilação com uma molécula de polietilenoglicol reactiva (ou um polímero solúvel em água reactivo análogo), como descrito abaixo.
Um polímero solúvel em água particularmente preferido para utilizar aqui é o polietilenoglicol, abreviado PEG. Como aqui utilizado, polietilenoglicol pretende abranger qualquer das formas de PEG que têm sido utilizadas para derivatizar outras proteínas, tais como mono-alcoxi-(C1-C10)- ou ariloxi-polietilenoglicol.
Em geral, a derivatização química pode ser realizada sob quaisquer condições adequadas utilizadas para fazer reagir uma substância biologicamente activa com uma molécula polimérica activada. Os métodos para a preparação de polipéptidos de CRP1 e B7RP1 peguilados compreenderão, em geral, as etapas de (a) reacção do polipéptido com polietilenoglicol (tais como um éster reactivo ou derivado aldeído de PEG), sob condições pelas quais o polipéptido de CRP1 ou B7RP1 se torne conjugado a um ou mais grupos de PEG e (b) obtenção do(s) produto(s) reaccional(ais). Em geral, as condições reaccionais óptimas para as reacções de acilação serão determinadas com base em parâmetros conhecidos e no resultado desejado. Por exemplo, quanto maior a razão de PEG:proteína, maior a percentagem de produto poli-peguilado. 51
Em geral, as condições que podem ser aliviadas ou moduladas pela administração de conjugados poliméricos de CRP1 ou B7RP1 incluem as aqui descritas para polipéptidos de CRP1 ou B7RP1 não conjugados. Contudo, os conjugados aqui divulgados podem ter actividades adicionais, actividade biológica melhorada ou reduzida, ou outras caracteristicas, tal como semi-vida aumentada ou diminuída, em comparação com as moléculas não derivatizadas.
Os polipéptidos, fragmentos, variantes e derivados de CRP1 ou B7RP1 podem ser empregues isoladamente, em conjunto ou em combinação com outras composições farmacêuticas. Os polipéptidos, fragmentos, variantes e derivados de CRP1 ou B7RP1 podem ser utilizados em combinação com citocinas, factores de crescimento, antibióticos, anti-inflamatórios e/ou agentes quimioterapêuticos, como é apropriado para a indicação sendo tratada. A presente divulgação proporciona para agentes de ligação selectiva de CRP1 ou B7RP1. Um agente de ligação selectiva refere-se a uma molécula tendo especificidade para CRP1 ou B7RP1 e pode incluir uma proteína, péptido, ácido nucleico, hidrato de carbono, lípido ou composto de baixo peso molecular. Um agente de ligação selectiva interage com CRP1 ou B7RP1 e, por sua vez, regula a ligação de CRP1 a B7RP1. Num aspecto, um agente de ligação selectiva bloqueia parcial ou completamente a ligação de CRP1 a B7RP1 e inibe parcial ou completamente, pelo menos, uma actividade biológica de CRP-1 ou B7RP-1, tal como actividade co-estimulatória imunitária. Noutro aspecto, o agente de ligação selectiva é um anticorpo. 0 anticorpo pode ser imunorreactivo com CRP1 ou B7RP1 e é, de um modo preferido, imunorreactivo com B7RP1. Ainda noutro aspecto da divulgação, um anticorpo reactivo 52 com B7RP1 liga-se a um epitopo em B7RP1, de modo a que a ligação a CRP1 seja parcial ou completamente bloqueada e, pelo menos, uma actividade biológica de B7RP1, tal como actividade co-estimulatória imunitária, seja parcial ou completamente inibida. 0 termo parcialmente inibido significa que ocorreu, pelo menos, um nível detectável de inibição. 0 termo "inibiu completamente" significa que não ocorreu aumento adicional em inibição.
Os polipéptidos, fragmentos, variantes e/ou derivados de CRP1 ou B7RP1 podem ser utilizados para preparar anticorpos utilizando métodos conhecidos na técnica. Deste modo, anticorpos que reagem com os polipéptidos de B7RP1, assim como fragmentos reactivos desses anticorpos, também estão contemplados como estando no âmbito da presente invenção. Os anticorpos podem ser policlonais, monoclonais, recombinantes, quiméricos, de cadeia única e/ou bi-específicos. Tipicamente, o anticorpo ou seu fragmento será de origem humana, ou será "humanizado", i. e., preparado de modo a prevenir ou minimizar uma reacção imunitária ao anticorpo quando administrado a um doente. 0 fragmento de anticorpo pode ser qualquer fragmento que seja reactivo com polipéptidos de CRP1 e B7RP1 da presente invenção, tais como Fab, Fab', etc. Também são aqui divulgados os hibridomas gerados pela apresentação de qualquer polipéptido de CRP1 ou B7RP1, ou seus fragmentos, como um antigénio a um mamífero seleccionado, seguido de fusão de células (e. g., células de baço) do mamífero com determinadas células cancerígenas, para criar linhas celulares imortalizadas por técnicas conhecidas. Os métodos empregues para gerar essas linhas celulares e anticorpos dirigidos contra a totalidade ou porções de um polipéptido de CRP1 ou B7RP1 humano da presente invenção também estão abrangidos por esta invenção. 53
Os anticorpos monoclonais da invenção incluem anticorpos "quiméricos", nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga à sequência correspondente em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencendo a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo à sequência correspondente em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencendo a outra classe ou subclasse de anticorpo, assim como fragmentos desses anticorpos, desde que exibam a actividade biológica desejada (Patente U.S. N° 4816567; Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 8jL, 6851-6855 (1985)).
Numa forma de realização preferida, o anticorpo anti-CRPl ou B7RP1 quimérico é um anticorpo "humanizado". Os métodos para humanização de anticorpos não humanos são bem conhecidos na técnica. Em geral, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácido introduzidos em si de uma fonte que é não humana. A humanização pode ser realizada seguindo métodos conhecidos na técnica (Jones, et al., Nature 321, 522-525 (1986); Riechmann, et al., Nature, 332, 323-327 (1988); Verhoeyen, et al., Science 239, 1534-1536 (1988)), pela substituição de regiões determinantes de complementaridade (CDR) de roedor pelas correspondentes regiões de um anticorpo humano.
Também estão abrangidos pela invenção anticorpos anti-B7RPl totalmente humanos. Esses anticorpos podem ser produzidos por imunização com um antigénio de CRP1 ou B7RP1 de animais transgénicos (e. g., murganhos) que, na ausência de produção de imunoglobulina endógena, são capazes de produzirem um repertório de anticorpos humanos. Ver, por exemplo, Jakobovits, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 90, 2551-2555 (1993); Jakobovits, et al., 54
Nature 362, 255-258 (1993). Os anticorpos humanos também podem ser produzidos em bibliotecas de apresentação fágica (Hoogenboom, et al., J. Mol. Biol. 227, 381 (1991); Marks, et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991).
Os agentes de ligação selectiva da invenção podem ser utilizados para regular a ligação de CRP1 a B7RP1 e regular, pelo menos, uma actividade biológica mediada por CRP1 e B7RP1, tal como co-estimulação imunitária. Um exemplo desses agentes de ligação selectiva são os anticorpos imunorreactivos com B7RP1. Os anticorpos podem ser utilizados terapeuticamente, de forma a inibir a ligação do polipéptido de CRP1 e B7RP1 ao seu parceiro de ligação. Os anticorpos podem ainda ser utilizados para efeitos de diagnóstico in vivo e in vitro, tal como na forma marcada, para detectar a presença de polipéptido de CRP1 e B7RP1 num fluido corporal ou amostra celular.
Composições Farmacêuticas e Administração
As composições farmacêuticas de polipéptidos de B7RP1 estão no âmbito da presente invenção. Essas composições podem compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipéptido ou fragmentos, variantes ou derivados em mistura com um veiculo farmaceuticamente aceitável. Em aspectos preferidos, as composições farmacêuticas compreendem polipéptidos de B7RP1 como formas solúveis que compreendem parte ou a totalidade de um domínio extracelular de B7RP1. Tipicamente, um composto terapêutico de polipéptido de B7RP1 será administrado na forma de uma composição compreendendo polipéptido, fragmento, variante ou derivado purificados, em conjunto com um ou mais veículos, excipientes ou diluentes fisiologicamente aceitáveis. 0 material 55 de veículo pode ser água para injecção, de um modo preferido, suplementada com outros materiais comuns em soluções para administração a mamíferos. Solução salina tamponada neutra ou solução salina misturada com albumina sérica são veículos exemplificativos apropriados. De um modo preferido, o produto é formulado como um liofilizado utilizando excipientes apropriados (e. g., sacarose). Outros veículos, diluentes e excipientes correntes podem ser incluídos conforme desejado. Outras composições exemplificativas compreendem tampão de Tris, de pH de cerca 7,0-8,5 ou tampão de acetato de pH de cerca 4,0-5,5, que podem ainda incluir sorbitol ou um substituto adequado para o efeito.
As composições farmacêuticas de B7RP1 podem ser administradas parentericamente. Alternativamente, as composições podem ser administradas intravenosa ou subcutaneamente. Quando administradas sistemicamente, as composições terapêuticas para utilização nesta invenção podem ser na forma de uma solução aquosa apirogénica, parentericamente aceitável. A preparação dessas soluções de proteína farmaceuticamente aceitáveis, tendo em conta o pH, isotonicidade, estabilidade e semelhantes, está dentro do estado da técnica.
As formulações terapêuticas de composições de polipéptido de B7RP1, úteis para a prática da presente invenção, podem ser preparadas para armazenamento pela mistura da composição seleccionada tendo o grau de pureza desejado com veículos, excipientes ou estabilizantes fisiologicamente aceitáveis opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edição, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company (1990)) na forma de um bolo liofilizado ou uma solução aquosa. Os veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são não tóxicos para os receptores 56 e, às dosagens e concentrações empregues, são, de um modo preferido, inertes e incluem tampões, tais como fosfato, citrato ou outros ácidos orgânicos; antioxidantes, tal como ácido ascórbico; polipéptidos de baixo peso molecular; proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacáridos, dissacáridos e outros hidratos de carbono, incluindo glucose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, tal como EDTA; álcoois de açúcar, tais como manitol ou sorbitol; contra-iões de formação de sal, tal como sódio; e/ou tensioactivos não iónicos, tais como Tween, pluronics ou polietilenoglicol (PEG).
Uma quantidade eficaz de uma composição(ões) de polipéptido de B7RP1 a ser empregue terapeuticamente dependerá, por exemplo, dos objectivos terapêuticos, tal como a indicação relativamente à qual o polipéptido de B7RP1 está a ser utilizado, a via de administração e o estado do doente. Consequentemente, para obter o efeito terapêutico óptimo, será necessário que o terapeuta titule a dosagem e modifique a via de administração conforme requerido. Uma dosagem diária típica pode variar desde cerca de 0,1 pg/kg até 100 mg/kg ou mais, dependendo dos factores mencionados acima. Tipicamente, um clínico administrará a composição até ser atingida uma dosagem que alcance o efeito desejado. A composição pode, por conseguinte, ser administrada como uma dose única ou como duas ou mais doses (que podem ou não conter a mesma quantidade de um polipéptido de B7RP1) ao longo do tempo ou como uma infusão contínua por meio de um dispositivo de implantação ou cateter. 57 À medida que são conduzidos estudos adicionais, irá emergir informação com respeito a níveis de dosagem apropriados para tratamento de diversos estados em diversos doentes e o especialista comum, considerando o contexto terapêutico, o tipo de distúrbio sob tratamento, a idade e saúde geral do receptor, será capaz de averiguar o doseamento apropriado. A composição de polipéptido de B7RP1 a ser utilizada para administração in vivo deve ser estéril. Isto pode ser facilmente alcançado por filtração através de membranas de filtração estéreis. Onde a composição seja liofilizada, a esterilização, utilizando estes métodos, pode ser conduzida antes ou a seguir à liofilização e reconstituição. A composição para administração parentérica será, geralmente, armazenada na forma liofilizada ou em solução.
As composições terapêuticas são, em geral, colocadas num recipiente tendo uma porta de acesso estéril, por exemplo, um saco de solução intravenosa ou frasquinho tendo uma rolha perfurável por uma agulha de injecção hipodérmica. A via de administração da composição está em conformidade com métodos conhecidos, e. g., oral, injecção ou infusão pelas vias intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparênquimatosa), intracerebroventricular, intramuscular, intra-ocular, intra-arterial ou intralesional; ou por sistemas de libertação sustida ou dispositivo de implantação que pode, opcionalmente, envolver a utilização de um cateter. Onde desejado, as composições podem ser administradas continuamente por infusão, injecção de bólus ou por dispositivo de implantação. 58
Alternativamente ou além disso, a composição pode ser administrada localmente, por meio de implantação na área afectada de uma membrana, esponja ou outro material apropriado sobre o qual o polipéptido de B7RP1 foi absorvido.
Onde um dispositivo de implantação seja utilizado, o dispositivo pode ser implantado em qualquer tecido ou órgão adequado e a distribuição de um polipéptido de B7RP1 pode ser directamente através do dispositivo por meio de bólus ou por meio de administração continua ou por meio de cateter utilizando infusão continua. Um polipéptido de B7RP1 pode ser administrado numa formulação ou preparação de libertação sustida. Exemplos adequados de preparações de libertação sustida incluem matrizes poliméricas semipermeáveis na forma de artigos perfilados, e. g., filmes, ou microcápsulas. As matrizes de libertação prolongada incluem poliésteres, hidrogéis, polilactidas (documentos U.S. 3773919, EP 58481), copolímeros de ácido L-glutâmico e gama etil-L-glutamato (Sidman et ai., Biopolymers, 22: 547-556 (1983)), poli (2-hidroxietil-metacrilato) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., b5: 167-277 (1981)] e Langer,
Chem. Tech., 12_: 98-105 (1982)), etileno e acetato de vinilo (Langer et al., supra) ou ácido poli-D(-)-3-hidroxibutirico (documento EP 133988). As composições de libertação sustida também podem incluir lipossomas, que podem ser preparados por qualquer de vários métodos conhecidos na técnica (e. g., Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Scl. USA, 8_2: 3688-3692 (1985); documentos EP 36676; EP 88046; EP 143949).
Em alguns casos, pode ser desejável utilizar composições de polipéptido de B7RP1 num modo ex vivo. Aqui, células, tecidos ou órgãos que tenham sido removidos do doente são expostos a composições de polipéptido de B7RP1, após o que as células, 59 tecidos e/ou órgãos sao subsequentemente implantados de volta no doente.
Noutros casos, um polipéptido de B7RP1 pode ser distribuído através da implantação em doentes de determinadas células que foram geneticamente manipuladas, utilizando métodos, tais como os aqui descritos, para expressar e segregar os polipéptidos, fragmentos, variantes ou derivados. Essas células podem ser células animais ou humanas e podem ser derivadas de tecido do próprio doente ou de outra fonte, humana ou não humana. Opcionalmente, as células podem ser imortalizadas. Contudo, de modo a diminuir a probabilidade de uma resposta imunológica, prefere-se que as células sejam encapsuladas para evitar a infiltração de tecidos circundantes. Os materiais de encapsulação são, tipicamente, invólucros ou membranas poliméricas biocompatíveis, semipermeáveis, que permitem a libertação do(s) produto(s) de proteína mas previnem a destruição das células pelo sistema imunitário do doente ou por outros factores prejudiciais dos tecidos circundantes.
Os métodos utilizados para a encapsulação de membrana de células são familiares ao especialista na técnica e a preparação de células encapsuladas e sua implantação em doentes pode ser alcançada sem experimentação indevida. Ver, e. g., as Patentes U.S N° 4892538; 5011472; e 5106627. Um sistema para encapsulação de células vivas é descrito no documento PCT WO 91/10425 (Aebischer et al.). As técnicas para a formulação de uma variedade de outros meios de distribuição sustida ou controlada, tais como veículos lipossomais, partículas ou esferas bio-erodíveis, também são conhecidas dos especialistas na técnica e são descritas, por exemplo, na Patente U.S. 60 Ν° 5653975. As células, com ou sem encapsulação, podem ser implantadas em tecidos ou órgãos corporais adequados do doente.
Como discutido acima, pode ser desejável tratar preparações celulares com um ou mais polipéptidos, variantes, derivados e/ou fragmentos de B7RP1. Isto pode ser alcançado pela exposição, por exemplo, de células compreendendo células T, tal como células de medula óssea, ao polipéptido, variante, derivado ou fragmento directamente, onde está numa forma que é permeável à membrana celular. Por exemplo, células compreendendo células T podem ser expostas a um polipéptido de B7RP1, de modo a activar a função de célula T e as células assim tratadas são implantadas no doente.
Alternativamente, pode ser empregue terapia génica. Um modo no qual a terapia génica pode ser aplicada é utilizar um gene de B7RP1 (ADN genómico, ADNc e/ou ADN sintético codificando um polipéptido de B7RP1 ou um seu fragmento, variante ou derivado) que pode estar ligado de um modo operativo a um promotor constitutivo ou indutivel para formar uma "construção de ADN de terapia génica". 0 promotor pode ser homólogo ou heterólogo ao gene de B7RP1 endógeno, desde que seja activo no tipo de célula ou tecido dentro do qual a construção será inserida. Outros componentes da construção de ADN de terapia génica podem, opcionalmente, incluir, conforme requerido, moléculas de ADN concebidas para integração especifica de sitio (e. g., sequências flanqueadoras endógenas úteis para recombinação homóloga), promotor especifico de tecido, estimulador(es) ou silenciador(es), moléculas de ADN capazes de proporcionarem uma vantagem selectiva em relação à célula parental, moléculas de ADN úteis como marcadores para identificar células transformadas, sistemas de selecção negativa, agentes de ligação 61 específicos de célula (como, por exemplo, para direccionamento celular) factores de internalização específicos de célula e factores de transcrição para melhorar a expressão por um vector, assim como factores para possibilitar a preparação de vector.
Esta construção de ADN de terapia génica pode ser, depois, introduzida nas células do doente (ex vivo ou in vivo). Um meio para introdução da construção de ADN de terapia génica é por meio de vectores virais. Os vectores virais adequados tipicamente utilizados em terapia génica para distribuição de construções de ADN de terapia génica incluem, sem limitação, vectores de adenovírus, vírus adeno-associado, vírus herpes simplex, lentivírus, papiloma vírus e retrovírus. Alguns destes vectores, tais como vectores retrovirais, distribuirão a construção de ADN de terapia génica no ADN cromossómico das células do doente e a construção de ADN de terapia génica pode integrar-se no ADN cromossómico; outros vectores funcionarão como epissomas e a construção de ADN de terapia génica permanecerá no citoplasma. A utilização de vectores de terapia génica é descrita, por exemplo, nas Patentes U.S. N° 5672344, 5399346.
Os meios alternativos para distribuir construções de ADN de terapia génica às células de um doente, sem utilização de vectores virais, incluem, sem limitação, transferência mediada por lipossoma, injecção directa de ADN livre, transferência mediada por receptor (complexo de ligando-ADN), electroporação, precipitação por fosfato de cálcio e bombardeamento de micropartículas (e. g., "canhão de genes"). Ver as Patentes U.S. N° 4970154, WO 96/40958, 5679559, 5676954 e 5593875. 62
Outro meio para aumentar a expressão endógena de polipéptido de B7RP1 numa célula por meio de terapia génica é inserir um ou mais elementos estimuladores no promotor do polipéptido de B7RP1, onde o(s) elemento(s) estimulador(es) pode(m) servir para aumentar a actividade transcricional de um gene do polipéptido de B7RP1. 0(s) elemento(s) estimulador(es) utilizado(s) será (serão) seleccionado(s) com base no tecido no qual se deseja activar o(s) gene(s); serão seleccionados elementos estimuladores conhecidos por conferirem activação de promotor nesse tecido. Por exemplo, se um polipéptido de B7RP1 for para ser "ligado" nas células T, o elemento estimulador do promotor lck pode ser utilizado. Aqui, a porção funcional do elemento transcricional a ser adicionado pode ser inserida num fragmento de ADN contendo o promotor do polipéptido de B7RP1 (e, opcionalmente, vector, sequência flanqueadora 5' e/ou 3', etc.) utilizando técnicas de clonagem correntes. Esta construção, conhecida como uma "construção de recombinação homóloga", pode ser, depois, introduzida nas células desejadas, ex vivo ou in vivo. A terapia génica pode ser utilizada para diminuir a expressão de polipéptido de B7RP1, pela modificação da sequência nucleotidica do(s) promotor(es) endógeno(s). Essa modificação é, tipicamente, alcançada por meio de métodos de recombinação homóloga. Por exemplo, uma molécula de ADN contendo a totalidade ou uma porção do promotor de um gene(s) de B7RP1 seleccionado para inactivação pode ser manipulada para remover e/ou substituir pedaços do promotor que regula a transcrição. Aqui, a caixa TATA e/ou o sitio de ligação de um activador transcricional do promotor podem ser delecionados utilizando técnicas correntes de biologia molecular; essa deleção pode inibir a actividade promotora reprimindo, desse modo, a 63 transcrição do correspondente gene de B7RP1. A deleção da caixa TATA ou sitio de ligação de activador de transcrição no promotor pode ser alcançada pela geração de uma construção de ADN, compreendendo a totalidade ou a porção relevante de um promotor(es) de polipéptido de B7RP1 (da mesma espécie ou uma espécie relacionada gue um gene(s) de B7RP1 a ser regulado), em gue um ou mais dos nucleótidos da caixa TATA e/ou sitio de ligação activador de transcrição são mutados por meio de substituição, deleção e/ou inserção de um ou mais nucleótidos, de modo a gue a caixa TATA e/ou sitio de ligação de activador tenha actividade diminuída ou seja tornado completamente inactivo. Esta construção, gue também conterá, tipicamente, pelo menos, cerca de 500 bases de ADN gue correspondem às regiões flanqueadoras 5' e 3' (endógenas) nativas do segmento promotor que foi modificado, pode ser introduzida nas células apropriadas (ex vivo ou in vivo), directamente ou por meio de um vector virai, como descrito acima. Tipicamente, a integração da construção no ADN genómico das células será por meio de recombinação homóloga, onde as sequências de ADN flanqueadoras 5' e 3' na construção de promotor podem servir para auxiliar a integrar a região promotora modificada por meio de hibridação no ADN cromossómico endógeno.
Onde seja desejável inibir um ou mais polipéptidos de B7RP1 também podem ser empregues outros métodos de terapia génica. Por exemplo, as moléculas de ADN ou ARN anti-sentido, que têm uma sequência que é complementar a, pelo menos, uma porção de um gene(s) de polipéptido de B7RP1, podem ser introduzidas na célula. Tipicamente, cada dessas moléculas anti-sentido será complementar ao sitio de iniciação (extremidade 5') de cada gene de B7RP1 seleccionado. Quando a molécula anti-sentido se 64 híbrida, depois, ao correspondente ARNm de polipéptido de CRP1 ou B7RP1, a tradução deste ARNm é prevenida.
Alternativamente, a terapia génica pode ser empregue para criar um inibidor dominante negativo de um ou mais polipéptidos de B7RP1. Nesta situação, o ADN codificando um polipéptido mutante, de comprimento completo ou truncado, de cada polipéptido de B7RP1 seleccionado, pode ser preparado e introduzido nas células de um doente, utilizando métodos virais ou não virais, como descrito acima. Cada desses mutantes é, tipicamente, concebido para competir com polipéptido endógeno no seu papel biológico.
Agonistas e Antagonistas A presente divulgação também proporciona para agonistas e antagonistas de CRP1 ou B7RP1 que regulam a actividade de uma ou ambas as moléculas. Os agonistas e antagonistas podem ser identificados a partir de moléculas de teste que alteram a ligação de B7RP1 a CRP1. A expressão "molécula(s) de teste" refere-se à(s) molécula(s) que está/estão sob avaliação para a capacidade de ligação a um polipéptido de CRP1 ou B7RP1 e, desse modo, alterar a ligação de B7RP1 a CRP1. De um modo preferido, a molécula de teste irá ligar-se com uma constante de afinidade de, pelo menos, cerca de 106 M.
Uma variedade de ensaios pode ser utilizada para medir a ligação de B7RP1 a CRP1. Estes ensaios podem ser utilizados para rastrear moléculas de teste para a sua capacidade de aumentarem 65 ou diminuírem a taxa e/ou extensão da ligação de B7RP1 a CRP1. Num tipo de ensaio, um polipéptido de CRP1, de um modo preferido, uma forma solúvel de CRP1, tal como um domínio extracelular, é imobilizado por conjugação ao fundo dos poços de uma placa de microtitulação. B7RP1 marcado radioactivamente e a(s) molécula (s) de teste podem ser, depois, adicionados, um de cada vez (em qualquer ordem) ou simultaneamente, aos poços. Após incubação, os poços podem ser lavados e contados utilizando um contador de cintilação para radioactividade, para determinar a extensão de ligação à proteína de CRP1 por B7RP1. Tipicamente, as moléculas serão testadas ao longo de uma gama de concentrações e uma série de poços de controlo, desprovidos de um ou mais elementos dos ensaios de teste, pode ser utilizada para exactidão na avaliação dos resultados. Uma alternativa a este método envolve a reversão das "posições" das proteínas, i. e., imobilização de B7RP1 aos poços da placa de microtitulação, incubação com a molécula de teste e CRP1 marcado radioactivamente e determinação da extensão de ligação de CRP1 (ver, por exemplo, o capítulo 18 de Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., ed., John Wiley & Sons, Nova Iorque, N.I. [1995]).
Como uma alternativa à marcação radioactiva, CRP1 ou B7RP1 podem ser conjugados a biotina e a presença de proteína biotinilada pode ser, depois, detectada utilizando estreptavidina ligada a uma enzima, tais como peroxidase de rábano [HRP] ou fosfatase alcalina [AP], que pode ser detectada colorimetricamente ou por marcação fluorescente de estreptavidina. Um anticorpo dirigido para CRP1 ou B7RP1 que está conjugado a biotina também pode ser utilizado e pode ser detectado após incubação com estreptavidina ligada a enzima ligada a AP ou HRP. 66 CRP1 e B7RP1 também podem ser imobilizados por conjugação a esferas de agarose, esferas acrílicas ou outros tipos desses substratos inertes. 0 complexo de substrato-proteina pode ser colocado numa solução contendo a proteína complementar e o composto de teste; após incubação, as esferas podem ser precipitadas por centrifugação e a quantidade de ligação entre CRP1 e B7RP1 pode ser avaliada utilizando os métodos descritos acima. Alternativamente, o complexo de substrato-proteína pode ser imobilizado numa coluna e a molécula de teste e proteína complementar passadas através da coluna. A formação de um complexo entre CRP1 e B7RP1 pode ser, depois, avaliada utilizando qualquer das técnicas expostas acima, i. e., marcação radioactiva, ligação de anticorpo ou semelhantes.
Outro tipo de ensaio in vitro que é útil para identificação de uma molécula de teste, que aumenta ou diminui a formação de um complexo de CRP1/B7RP1, é um sistema detector de ressonância de plasmónio de superfície, tal como o sistema de ensaio da Biacore (Pharmacia, Piscataway, NJ) . 0 sistema da Biacore pode ser efectuado utilizando o protocolo do fabricante. Este ensaio envolve, essencialmente, a ligação covalente de CRP1 ou B7RP1 a um chip sensor revestido por dextrano que está situado num detector. 0 composto de teste e a outra proteína complementar podem ser, depois, injectados na câmara contendo o chip sensor, simultanêa ou sequencialmente e a quantidade de proteína complementar que se liga pode ser avaliada com base na alteração na massa molecular que está fisicamente associada ao lado revestido com dextrano do chip sensor; a alteração na massa molecular pode ser medida pelo sistema detector. 67
Em alguns casos, pode ser desejável avaliar dois ou mais compostos de teste em conjunto para utilização no aumento ou diminuição da formação de um complexo de CRP1/B7RP1. Nestes casos, os ensaios expostos cima podem ser facilmente modificados pela adição desse(s) composto(s) de teste adicional(ais), simultaneamente com ou subsequente ao primeiro composto de teste. As restantes etapas no ensaio são como exposto acima.
Ensaios in vitro, tais como os descritos acima, podem ser utilizados de um modo vantajoso para rastrear rapidamente um grande número de compostos para efeitos na formação de complexo por CRP1 e B7RP1. Os ensaios podem ser automatizados para rastrear compostos gerados nas bibliotecas de apresentação fágica, péptido sintético e síntese química.
Os compostos que aumentam ou diminuem a formação de complexo de CRP1 e B7RP1 também podem ser rastreados em cultura celular utilizando células e linhas celulares expressando cada polipéptido. As células e linhas celulares podem ser obtidas de qualquer mamífero mas, de um modo preferido, serão de humano ou outras fontes primatas, caninas ou roedoras. A ligação de B7RP1 a células expressando CRP1 na superfície é avaliada na presença ou ausência de moléculas de teste e a extensão da ligação pode ser determinada, por exemplo, por citometria de fluxo, utilizando um anticorpo biotinilado para B7RP1. Os ensaios de cultura celular podem ser utilizados, de um modo vantajoso, para avaliar ainda compostos que dão positivo em ensaios de ligação de proteína descritos acima. 68
Utilizações Terapêuticas
Os polipéptidos da invenção e seus agonistas e antagonistas podem ser utilizados para regular a função de célula T. Os agonistas e antagonistas incluem as moléculas que regulam a actividade de CRP1 e/ou B7RP1 e aumentam ou diminuem, pelo menos, uma actividade de uma proteína de CRP1 ou B7RP1, tal como uma actividade associada a funções de célula T, por exemplo, activação de célula T. Os agonistas ou antagonistas podem ser co-factores, tais como uma proteína, péptido, hidrato de carbono, lípido ou molécula de baixo peso molecular, que interagem com CRP1 ou B7RP1 e, desse modo, regulam a sua actividade. Os potenciais agonistas ou antagonistas polipeptídicos incluem anticorpos que reagem com formas solúveis ou membranares de CRP1 ou B7RP1 que compreendem parte ou a totalidade dos domínios extracelulares das referidas proteínas. As moléculas que regulam a expressão de CRP1 ou B7RP1 incluem, tipicamente, ácidos nucleicos codificando proteína de CRP1 ou B7RP1 que podem actuar como reguladores anti-sentido de expressão.
Os polipéptidos de CRP1 ou B7RP1 e seus agonistas e antagonistas podem ser utilizados no tratamento de doença auto-imune, sobrevivência de enxerto, activação de célula imunitária para inibição do crescimento de célula tumoral, doenças mediadas por célula B dependente de célula T e imunoterapia génica de cancro. Numa forma de realização, os antagonistas ou inibidores da função de CRP1 e/ou B7RP1 podem ser benéficos para aliviar os sintomas em doenças com disfunção crónica de célula imunitária. As doenças auto-imunes, tais como lúpus eritematoso sistémico, artrite reumatóide, púrpura trombocitopénica imunitária (ITP) e psoríase, podem ser tratadas 69 com antagonistas ou inibidores de CRP-1/B7RP-1. Além disso, as doenças inflamatórias crónicas, tais como doença inflamatória intestinal (doença de Crohn e colite ulcerativa), doença de Grave, tiroidite de Hashimoto e diabetes Mellitus, também podem ser tratadas com inibidores para CRP-1/B7RP-1. Como descrito no Exemplo 18, CRP-l-Fc inibe e B7RP-1-Fc melhora, o começo da doença num modelo de doença de artrite reumatóide de roedor. Estes efeitos opostos suportam, neste modelo, um papel agonistico para a proteína de B7RP-1-Fc e um papel antagonista para a proteína de CRP-l-Fc. Os resultados também ilustram como as respostas de célula T podem ser reguladas por manipulação desta via e a significância desta via na progressão da artrite reumatóide. Além disso, como descrito no Exemplo 19, a expressão de B7RP-1-Fc in vivo estimula um fenótipo de doença inflamatória intestinal (IBD) em murganhos transgénicos. Este exemplo suporta o papel para B7RP-1/CRP-1 no desenvolvimento da inflamação no intestino. Por conseguinte, os antagonistas da via de B7RP-1/CRP-1 podem ser utilizados para tratar IBD humana.
Os antagonistas de CRP1 ou B7RP1 podem ser utilizados como agentes imunossupressores para transplantação de medula óssea e órgão e podem ser utilizados para prolongar a sobrevivência de enxerto. Esses antagonistas podem proporcionar vantagens significativas em relação ao tratamento existente. A terapia de transplantação de medula óssea e órgão tem de lidar com a rejeição mediada por célula T das células ou tecidos estranhos pelo hospedeiro. Os presentes regimes terapêuticos para inibição da rejeição mediada por célula T envolvem tratamento com os fármacos ciclosporina ou FK506. Embora os fármacos sejam eficazes, os doentes sofrem de sérios efeitos secundários, incluindo hepatotoxicidade, nefrotoxicidade e neurotoxicidade. 0 alvo para a classe de ciclosporina/FK506 da terapêutica é 70 calcineurina, uma fosfatase com expressão ubíqua. Uma vez que a expressão de CRP1 está restrita a células T, os inibidores de CRP1 ou B7RP1 podem não ter os graves efeitos secundários observados com a utilização dos presentes agentes imunoterapêuticos.
Os antagonistas de CRP1 ou B7RP1 podem ser utilizados como agentes imunossupressores para distúrbios auto-imunes, tais como artrite reumatóide, psoríase, esclerose múltipla, diabetes e lúpus eritematoso sistémico.
Os antagonistas da via co-estimulatória mediada por CRP1/B7RP1 também podem ser utilizados para aliviar a síndrome de choque tóxico, doença inflamatória intestinal, alossensibilização devido a transfusões sanguíneas, doenças mediadas por célula B dependente de célula T e o tratamento de doença de enxerto vs. hospedeiro.
Anticorpos, proteínas solúveis compreendendo, por exemplo, domínios extracelulares e outros reguladores de CRP1 ou B7RP1 que resultam em activação prolongada ou melhorada de célula T podem ser utilizados para aumentar a resposta imunitária a tumores. 0 Exemplo 20 mostra que B7RP-1-FC pode inibir o crescimento de célula tumoral em murganhos. De modo semelhante, o B7RP-1-Fc humano ou outros activadores da via de B7RP-1/CRP-1, podem ser utilizados para melhorar as respostas imunitárias contra tumores humanos. A actividade antitumoral é, em geral, considerada como tendo um forte componente de linfócito T citolítico. De facto, os efeitos antitumorais das proteínas de fusão de B7-Fc (Sturmhoefel et ai., Câncer Res. 59: 4964-4972, 1999) eram mediados por células T CD8+ citolíticas. Uma vez que o CRP-1 também é expresso em células T CD8+ citolíticas 71 (Exemplo 9), é provável que os efeitos antitumorais demonstrados no Exemplo 20 fossem devidos à acção de B7RP-1-Fc nas células CD8+. A via de B7RP-1/CRP-1 também pode ser manipulada para regular resposta CTL num número de outros quadros clínicos, incluindo transplantação alógena de enxerto, doença de enxerto vs. hospedeiro e doenças auto-imunes. A terapia génica utilizando genes de B7RP1 da invenção pode ser utilizada em imunoterapia de cancro. Os genes de B7RP1 introduzidos em células cancerígenas podem transformá-las em células apresentadoras de antigénio que podem ser reconhecidas pelas células T do sistema imunitário quando introduzidas de volta num animal. O reconhecimento das células tumorais transfectadas pelas células T resulta na erradicação de células tumorais expressando ou não expressando o gene de B7RP1. Esta abordagem de imunoterapia pode ser utilizada para diversas leucemias, sarcomas, melanomas, adenocarcinomas, carcinomas da mama, tumores da próstata, carcinomas do pulmão, carcinomas do cólon e outros tumores. Esta invenção abrange a utilização do gene de B7RP1, num modo semelhante, para melhorar a activação de célula T em resposta a uma variedade de tumores.
Como descrito no Exemplo 14, o fenótipo de murganhos transgénicos expressando B7RP1 indica que o B7RP1 é importante no controlo da produção de anticorpo. Os agonistas e antagonistas da actividade da proteína de B7RP1 podem ser úteis nas indicações terapêuticas que exigem a inibição ou melhoramento da produção de anticorpo.
Por exemplo, muitas vacinas actuam pela dedução de uma resposta de anticorpo eficaz e específica. Algumas vacinas, especialmente aquelas contra microrganismos intestinais (e. g., 72 vírus da Hepatite A e Salmonelas), deduzem uma resposta de anticorpo de curta duração. É desejável potenciar e prolongar esta resposta, de modo a aumentar a eficácia da vacina. Por conseguinte, os anticorpos de B7RP1 solúveis ou em activação para CRP1 podem servir como um adjuvante vacinai.
As respostas antivirais também podem ser melhoradas por activadores ou agonistas da via de B7RP-1/CRP-1. Os dados no Exemplo 20 indicam que a imunidade celular é melhorada por B7RP-1-Fc. O melhoramento das funções imunitárias celulares por B7RP-1-Fc ou outros activadores da via de B7RP-1/CRP-1 também pode ser benéfico na eliminação de células infectadas por vírus. Num modo complementar, o B7RP-1-Fc tem efeitos nas funções imunitárias humorais que podem melhorar as respostas mediadas por anticorpo, como observado no Exemplo 13, que pode funcionar para auxiliar a eliminar o vírus do corpo.
De modo oposto, há um número de estados clínicos que seria melhorado pela inibição da produção de anticorpo. A hipersensibilidade é uma resposta imunitária normalmente benéfica que é exagerada ou inapropriada e conduz a reacções inflamatórias e lesão tecidular. As reacções de hipersensibilidade que são mediadas por anticorpo podem ser particularmente susceptíveis a antagonismo por inibidores da actividade de B7RP1. As alergias, febre dos fenos, asma e edema agudo causam reacções de hipersensibilidade de tipo I e estas reacções podem ser suprimidas por inibidores de proteína, anticorpo ou molécula pequena de actividade de B7RP1.
As doenças que causam reacções de hipersensibilidade mediadas por anticorpo, incluindo lúpus eritematoso sistémico, artrite (artrite reumatóide, artrite reactiva, artrite 73 psoriática) , nefropatias (glomerulonefrite, tubulopatias membranosas, mesangiocapilares, segmentais focais, necrosantes focais, crescênticas, proliferativas), distúrbios de pele (pênfigo e penfigóide, eritema nodoso), endocrinopatias (tiroidite - de Grave, Hashimoto - diabetes Mellitus dependente de insulina), diversas pneumopatias (especialmente alveolite extrínseca), diversas vasculopatias, doença celíaca, com produção aberrante de IgA, muitas anemias e trombocitopenias, síndrome de Guillain-Barre e miastenia grave, podem ser tratadas com antagonistas de B7RP1.
Além disso, distúrbios linfoproliferativos, tais como mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom e crioglobulinemias, podem ser inibidos por antagonistas de proteína, anticorpo ou molécula pequena de B7RP1 • Finalmente, a doença de enxerto versus hospedeiro, um distúrbio imunitário "artificial", pode beneficiar da inibição da produção de anticorpo por antagonistas de B7RP1.
Os exemplos seguintes são oferecidos para ilustrar, de um modo mais completo, a invenção, mas não são interpretados como limitando o seu âmbito.
Exemplo 1
Sequência de ADNc e de Aminoácido de CRP1
Os murganhos C57/Black 6 fêmea foram sacrificados e os intestinos delgados foram excisados e as placas de Peyer foram removidas. 0 tecido de intestino delgado foi aberto por excisão 74 e lavado para remover muco e outros detritos. A camada epitelial, que contém as células intra-epiteliais intestinais (ilEL) , foi libertada por agitação suave em RPMI-1640 suplementado com ditiotreitol (DTT) a 1 mM, durante 20 minutos, a 37 °C. As células dissociadas foram passadas através de um filtro de 100 μ, lavadas em 50 mL de RPMI-1640, misturadas para separação adicional de grumos de células e, depois, passadas através de um passador de 40 μ para se obter populações de células únicas. Estas células foram, depois, lavadas novamente num volume de 50 mL de RPMI-1640, para garantir a remoção do DTT residual. 0 tecido foi, depois, agitado e lavado como anteriormente para reunir as restantes ilEL. As ilEL foram separadas das células adiposas e a maioria das células epiteliais num gradiente de Percol de 3 etapas, com as ilEL a formarem bandas na interface de 40% a 80%. Estas células foram, depois, lavadas, duas vezes, com RPMI-1640 para remover vestígios de Percol, imunocoradas com anticorpo de CD103 (integrina alfa IEL) e separadas num separador de células FACs Star. Estas células separadas foram, depois, utilizadas para preparar ARN total directamente utilizando Trizol (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) ou activadas, de um dia para o outro, em anticorpos de activação ligados a placa, que reticulam os TCR gama/delta, TCR alfa/beta ou CD3. O ARN foi preparado como acima e agregado para utilização na construção de bibliotecas de ADNc de EST.
Um clone de ADNc, designado smil2-00082-al, continha homologia de sequência nucleotídica com CD28 (Figura 1B). A tradução da sequência e subsequente comparação com proteínas conhecidas numa base de dados pública revelou 19% de identidade de aminoácido com CD28 murina (Figura 1B). Esta baixa homologia foi significativa porque a CD28 murina partilha apenas 26% de 75 identidade de aminoácido com CTLA-4 murina. Verificou-se que todas as putativas cisteinas que se pensa serem criticas para ligação intra- e inter-molecular de cisterna na família de CD28/CTLA-4 eram conservadas (resíduos de aminoácido 83, 109 e 137; relativamente à metionina de iniciação). Além disso, o comprimento global da putativa grelha de leitura aberta e a posição relativa do domínio transmembranar eram semelhantes aos de CD28 e CTLA-4. 0 gene de CRP1 foi denominado Proteína 1 Relacionada com CD28.
Exemplo 2
Clonagem de ADNc de CRP1 Humana A sequência de ácidos nucleicos codificando proteína de CRP1 humana é identificada pelos seguintes processos. Uma biblioteca de ADNc humano foi preparada a partir de linfócitos enriquecidos de sangue periférico humano de voluntários humanos normais. Os linfócitos foram purificados e os glóbulos vermelhos foram removidos por Meios de Separação de Linfócitos (ICN Pharmaceuticals, Inc., Costa Mesa, CA). As células foram, depois, activadas, de um dia para o outro, em meios contendo PMA a 10 ng/mL, ionomicina a 500 ng/mL e anticorpos de activação ligados a placa para CD3. O ARN total foi preparado a partir das células activadas pelo método de Trizol (Gibco/BRL) e o ARN poli A foi isolado por purificação de esferas Dynal. O ADNc foi preparado a partir do ARN poli A isolado e seleccionado por tamanho para fragmentos de ADNc maiores. O ADNc seleccionado por tamanho foi, depois, ligado ao plasmídeo pSPORT (Gibco/BRL). O ADN codificando a proteína de CRP1 humana é obtido pelo rastreio da biblioteca de ADNc de linfócito activado, por protocolos de 76 hibridação de placa de bacteriófago recombinante ou de colónia de bactérias transformadas (Sambrook et al., Supra). A biblioteca de ADNc de fago ou plasmídeo é rastreada utilizando sondas marcadas radioactivamente derivadas do clone do gene de CRPl murino, como descrito no Exemplo 1 e Figura 1. As sondas são utilizadas para rastrear filtros de nylon levantados da biblioteca plaqueada. Estes filtros são pré-hibridados, durante 4 h, a 42 °C, em formamida a 50%, 5X SSPE, 2X solução de Denhardt, SDS a 0,5% e ADN de esperma de salmão a 100 pg/mL e, depois, hibridados durante 24 h, a 42 °C, em formamida a 50%, 5X SSPE, 2X solução de Denhardt, SDS a 0,5%, ADN de esperma de salmão a 100 pg/mL e sonda de mB7RPl a 5 ng/mL. As transferências são lavadas em 2X SSC, SDS a 0,1%, durante 10 min, à T. A. , IX SSC, SDS a 0,1%, durante 10 min, a 50 °C, 0,2X SSC, SDS a 0,1%, durante 10 min, a 50 °C, depois, novamente 0,2X SSC, durante 10 min, a 50 °C. Os insertos obtidos de quaisquer clones de CRPl humana são sequenciados e analisados, como descrito no Exemplo 1.
Exemplo 3
Sequência de ADN e de Aminoácido de B7RP1
Um clone de ADNc, designado smill-00003-g5, continha homologia de sequência nucleotídica com B7.1 (CD80) e B7.2 (CD86). A tradução da sequência (Figura 2A) e subsequente comparação com proteínas conhecidas numa base de dados pública revelou 20% de identidade de aminoácido com B7.1 murina (Figura 2B). Esta baixa homologia foi significativa porque a B7.1 murina partilha apenas 24% de identidade de aminoácido com B7.2 murina. Apesar desta baixa homologia, os resíduos críticos 77 de cisteína são conservados entre a grelha de leitura aberta deste clone e B7.1 e B7.2 murinas nos resíduos 62, 138, 185 e 242 (relativamente à metionina de iniciação, Figura 2B). 0 comprimento aproximado da proteína madura e a localização da região transmembranar relativamente à terminação carboxilo também são semelhantes na putativa ORF deste clone, em comparação com B7.1 e B7.2. 0 gene de B7RP1 foi denominado
Proteína 1 Relacionada com B7.
Exemplo 4
Clonagem de ADNc de B7RP1 Humana
Uma pesquisa de homologia blast do Genbank (GCG, University of Wisconsin), utilizando a sequência de B7RP1 murina (ver Figura 2), retribuiu um clone (AB014553) contendo uma sequência de 4358 pb com 1679 pb de ORF. Os iniciadores de clonagem de PCR foram concebidos de acordo com esta sequência. Um fragmento de ADN de 1313 pb foi obtido por RACE 5' e 3', utilizando ADNc de Nódulo Linfático Humano Marathon-Ready™ (Clontech, Paio Alto, CA), de acordo com os processos recomendados pelo fabricante.
Iniciadores utilizados para B7RP1 humana de comprimento completo:
2083-75 ACC ATG CGG CTG GGC AGT CCT GGA (SEQ ID N°: 25)
2083-76 TGG TGA CCT ACC ACA TCC CAC AG (SEQ ID N°: 26) 78 2083-77 TCC GAT GTC ATT TCC TGT CTG GC (SEQ ID N° : 27) 2083-78 GCT CTG TCT CCG GAC TCA CAG CCC (SEQ ID N° : 28) 2113-29 GTG GCA GCA AAC TTC AGC GTG CCC GTC G (SEQ ID N° : 29) 2113-30 CCC AAC GTG TAC TGG ATC AAT AAG ACG G (SEQ ID N° : 30) 2113-31 GCG TGC TGA GGA TCG CAC GGA CCC CCA G (SEQ ID N° : 31)
Os iniciadores 2083-75 e 2083-76 foram utilizados para amplificar a extremidade 5' do gene utilizando protocolos de RACE. Os iniciadores 2083-77, 2083-78, 2113-29, 2113-30 e 2113-31, foram utilizados para amplificar a extremidade 3' do gene utilizando protocolos de RACE. A sequência nucleotidica resultante continha uma ORF de 288 resíduos de aminoácido, começando na metionina. A sequência de aminoácidos de B7RP1 humana madura prevista foi, depois, comparada com a sequência madura de aminoácidos de B7RP1 de murganho (Figura 3B) e verificou-se que partilham 48% de identidade de aminoácido. Esta homologia é significativa porque a homologia entre espécies é baixa com o gene de CD80 (B7.1), de facto, as CD80 de murganho e humana partilham apenas 41% de identidade de aminoácido. Importante, a proteína de B7RP1 humana conserva resíduos críticos de cisteína necessários para estruturas de gancho de Ig (resíduos de aminoácido 16, 92, 138, 194 e 195, relativamente à proteína madura, Figura 3B) . Além 79 disso, o comprimento global e posição do domínio transmembranar são consistentes com um homólogo de B7RP1 humana.
Exemplo 5
Expressão de ARN de B7RP1
Hibridação in situ de ARN utilizando sondas de ARN para o gene de B7RP1. Tecidos de murganho adulto foram fixos em paraformaldeído a 4%, embebidos em parafina e seccionados a 5 pm. Antes da hibridação in situ, os tecidos foram permeabilizados com HC1 a 0,2 M, seguido de digestão com Proteinase K e acetilação com trietanolamina e anidrido acético. As secções foram hibridadas, de um dia para o outro, a 55 °C, com uma ribossonda marcada com 33P, de 969 bases, correspondendo aos nucleótidos 1 a 969 da sequência de B7RP1 de murganho. O excesso de sonda foi removido por digestão de ARNse, seguido de uma série de lavagens em tampão com concentrações decrescentes de sal e, depois, uma lavagem de estringência elevada em 0,1X SSC, a 55 °C. As lâminas foram mergulhadas em emulsão NTB2 Kodak, expostas a 4 °C, durante 2-3 semanas, reveladas e contrastadas com hematoxilina e eosina. As secções foram examinadas com iluminação de campo escuro e luz transmitida para permitir a avaliação simultânea da morfologia tecidular e do sinal de hibridação. A análise do ARN de B7RP1 por hibridação in situ mostrou que o ARN de B7RP1 era altamente expresso em áreas de maturação linfóide e activação de linfócito. O ARN de B7RP1 foi expresso nos tecidos linfóides do timo, placas de Peyer do intestino, baço e nódulos linfáticos. A expressão nestes tecidos linfóides 80 demonstrou que o ARN de B7RP1 era, em geral, expresso nas áreas de célula B e outro envolvimento de APC. Estas regiões incluem a área de medula do timo, os foliculos primários dos nódulos linfáticos e as regiões foliculares e cúpula das placas de Peyer. A expressão de ARN de B7RP1 é altamente especifica das regiões de envolvimento de APC em tecidos linfóides. A análise de vários tecidos não linfóides também revelou expressão de B7RP1 em regiões de envolvimento de APC. No pulmão, verificou-se expressão de B7RP1 nas regiões submucosais, consistente com uma função no processamento antigénico. No intestino delgado, o ARN de B7RP1 verificou-se na lâmina própria. De um modo notável, verificou-se uma secção de fígado lesionado, que mostrou infiltração linfocitária que se sobrepôs com a expressão de ARN de B7RP1. Esta coincidência de expressão de B7RP1 com acumulação linfocitária em resposta a lesão tecidular indica, fortemente, que o B7RP1 está envolvido na activação de linfócito.
Exemplo 6
Expressão de ARN de CRP1
Hibridação in situ de ARN utilizando sondas de ARN para o gene de CRP1. Os tecidos de murganho foram preparados como no Exemplo 5. A permeabilização de tecido, hibridação de sonda, tratamento de lâmina e coloração de tecido foram como descrito no Exemplo 5. As secções foram hibridadas, de um dia para o outro, a 55 °C, com uma ribossonda marcada com 33P, de 603 bases, correspondendo aos nucleótidos 1 a 603 da sequência de CRP1 de murganho. As secções foram examinadas com iluminação de campo 81 escuro e luz transmitida para permitir a avaliaçao simultânea da morfologia tecidular e do sinal de hibridação.
Os nódulos linfáticos de murganhos normais ou um murganho tratado com oxazolona foram seccionados e analisados para expressão de ARN de CRP1. 0 nódulo linfático de murganho sensibilizado mostrou maior expressão de ARN de CRP1 do que o nódulo linfático de murganho normal. A expressão de CRP1 foi no paracórtex, uma região de actividade de célula T. Por conseguinte, a expressão de ARN de CRP1 é consistente com a da expressão de linfócito T e é regulada positivamente após activação de célula T.
Exemplo 7
Expressão e Purificação de Proteínas de Fusão de CRPl-Fc e B7RP1-FC
Para construir o vector de expressão de ADN para a proteína de fusão de CRPl-Fc, a sequência codificante para os primeiros 147 aminoácidos aminoterminais da CRP1 foi fundida, em fase, à sequência codificante para os 235 aminoácidos carboxiterminais do gene de Fc humano (isótipo IgGl) e ligada na sequência poliadaptadora de pcDNA3 (pcDNA3/CRPl-Fc) . Para construir o vector de expressão de ADN para a proteína de fusão de CRPl-Fc, a sequência codificante para os primeiros 147 aminoácidos aminoterminais da CRPl foi fundida, em fase, à sequência codificante para os 235 aminoácidos carboxiterminais do gene de Fc humano (isótipo IgGl) e ligada na sequência poliadaptadora de pcDNA3 (pcDNA3/CRPl-Fc). As sequências codificantes de CRPl e B7RP1 continham sequências da terminação N de cada proteína até, 82 mas não incluindo, a putativa região transmembranar de cada proteína. As células 293T foram transfectadas com pcDNA3/CRPl-Fc ou pcDNA3/B7RP1-Fc utilizando o reagente de transfecção FuGene 6 (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) . Após quatro dias, os meios condicionados foram recolhidos e as proteínas de fusão de Fc foram purificadas por cromatografia em descontínuo, utilizando Proteína A Sepharose (Pharmacia). As proteínas de fusão de Fc ligadas à coluna foram eluídas com três volumes de coluna de Tampão de Eluição Immunopure Gentle (Pierce) e, depois, foram dialisadas contra 150 volumes de HEPES a 20 mM, NaCl a 100 mM, pH 7,5. A proteína dialisada foi concentrada utilizando concentrados de centrifugação Macrosep, MWCO de 30 kD (Pall Filtron) e as concentrações de proteína foram calculadas utilizando coeficientes de extinção derivados da sequência de aminoácidos de cada proteína. A expressão da proteína de fusão de CRPl-Fc é mostrada na Figura 4A, a expressão da proteína de fusão de B7CPR1-Fc é mostrada na Figura 4B.
Exemplo 8
Identificação de CRP1 e B7RP1 como um Par de Receptor-ligando
De modo a determinar se as novas proteínas eram parte da mesma via co-estimulatória que a contendo CD28, CTLA-4, B7.1 e B7.2, foi utilizado um ensaio de apresentação de superfície de célula. Este ensaio utiliza análise de ACAS (Análise e Triagem de Célula Aderente) para analisar se as proteínas membranares expressas em células interagem com diversas proteínas de fusão de Fc. As células expressando proteínas membranares, indicadas 83 no lado esquerdo da Figura 5, foram incubadas com proteínas de fusão de Fc, indicadas no topo da figura.
As células Cos-7, cultivadas em meios DMEM com FBS a 10%, foram plaqueadas a 500000 células/poço numa placa de 24 poços. As células foram transfectadas utilizando o reagente FuGene 6 (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN). Para cada transfecção, 3 pL de reagente FuGene 6 foram adicionados a 47 pL de meios DMEM isentos de soro. Após uma incubação de 10 min, à temperatura ambiente, a mistura foi adicionada a 0,25 pg de plasmídeo, gota a gota e, depois, foi incubada durante 15 minutos. A mistura acima foi, depois, adicionada às células com 0,5 mL de DMEM com FBS a 10%. As células foram incubadas a 3 7 °C, numa atmosfera de C02 a 5%. Como um controlo, células CHO D, transfectadas de um modo estável com um plasmídeo de expressão contendo o ADNc para CD28 humana, também foram plaqueadas a 500000 células/poço, numa placa de 24 poços.
Após 48 h, o meio com reagente de transfecção foi removido e as células foram lavadas, duas vezes, com RPMI mais FBS a 5%. 10 a 20 ng de proteínas de fusão de Fc purificadas, em 1 mL de meios, foram adicionados às células que foram incubadas, durante 30 min, sobre gelo. As células foram lavadas, três vezes, com RPMI mais FBS a 5% e, depois, foram incubadas com 2 pL de anticorpo de Fc anti-humano conjugado a FITC (1 mg/mL), durante outros 30 min, sobre gelo. Após três lavagens sucessivas com RPMI, as células foram cobertas com 250 pL de meios RPMI, sem vermelho de fenol, para análise de ACAS. A análise de ACAS das células que se ligaram às diversas proteínas de fusão de Fc demonstrou que a proteína de B7RP1 se ligou a CRP1, mas não às proteínas na via co-est imulatória 84 conhecida, CD28 ou CTLA-4. De modo oposto, a CRP1 interagiu com B7RP1, mas não B7.2, um componente na via conhecida. (Ver Figura 5). Estes resultados indicam fortemente que CRP1 e B7RP1 representam um novo par de receptor-ligando, análogo a CD28 e B7.2. Contudo, uma vez que CRP1 e B7RP1 não interagem com B7.2, CTLA-4 ou CD28, são separados e independentes da via co-estimulatória conhecida.
Exemplo 9
Identificação de Células Expressando Receptores de B7RP1 A proteína de fusão de B7RP1-Fc foi utilizada para detectar células que expressavam receptores para B7RP1 incluindo, presumivelmente, a proteína de CRP1 (ver o Exemplo 6), por análise de FACS. Os baços foram removidos de murganhos C57/Black 6 fêmea, triturados em filtros de malha de 100 mícron para libertação de linfócitos, passados através de filtros de 70 mícron e, depois, lavados em 50 mL de RPMI-1640. Foram sedimentados a 1500 rpm, ressuspensos em RPMI fresco, misturados para separação das células em grumos e passados através de um filtro de 40 mícron. As células T a serem activadas foram semeadas em placas de 6 poços em RPMI-1640, FBS a 5%, 1XPSG, PMA, ionomicina e incubadas, a 37 °C, CO2 a 5%, de um dia para o outro. A activação de célula T foi verificada por confirmação visual após 12 h.
As células de baço activadas para imunocoloração foram lavadas em tampão de lavagem de PBS, BSA a 0,5% (Path-ocyte 4, ICN Pharmaceuticals), ressuspensas e, depois, aliquotadas em volumes de 100 pL. Foram adicionados 15 pg/mL de proteína de 85 fusão de CRPl-Fc ou de proteína de fusão de B7RP1-F c (1,5 pg/amostra), conforme apropriado e, depois, as misturas foram incubadas sobre gelo, durante 30 min, com mistura ocasional. As células foram lavadas, duas vezes, em 5,0 mL de tampão de lavagem. A ligação das proteínas de fusão foi visualizada com 2 pg de anticorpo secundário de cabra anti-humano conjugado (GaHuFc-FITC), num volume de 100 pL, para coloração celular. Os anticorpos marcadores celulares conjugados com PE foram adicionados com o GaHUFc-FITC, assim como controlos de anticorpo conjugado a isótipo-PE, onde indicado (isótipo de rato) . As amostras foram incubadas sobre gelo e lavadas como anteriormente. A visualização foi feita por análise de FACScan com activação de canal nas populações de linfócitos. A coloração dupla com anticorpos de CD4+ e a proteína de fusão de B7RP1-FC indicou que as células expressaram o marcador de CD4 e o receptor para B7RP1, presumivelmente CRPl (Figura 6). De modo semelhante, a coloração dupla com anticorpos de CD8+ e a proteína de fusão de B7RP1-FC demonstrou que as células expressaram os receptores de CD8 e B7RP1 (Figura 6) . Não foi possível detectar, de modo fidedigno, essas células de coloração dupla em preparações de esplenócitos inactivados. Uma vez que CD4 e CD8 são marcadores de linfócitos T, pode postular-se que a CRPl é expressa em células T CD4+ e CD8+ activadas. Estes dados são consistentes com a expressão aumentada de ARN de CRPl nas regiões de célula T de nódulos linfáticos de murganhos sensibilizados, em comparação com murganhos normais (Exemplo 6) . 86
Exemplo 10
Identificação de Células Expressando Ligandos de CRP1 A proteína de fusão de CRPl-Fc foi utilizada para detectar células que expressavam ligandos para CRP1 incluindo, presumivelmente, a proteína de B7RP1 (ver o Exemplo 8), por análise de FACS (Figura 7). Os esplenócitos foram preparados como no Exemplo 8, excepto que a etapa de activação de célula T de 12 h foi omitida e as células foram analisadas directamente. Os esplenócitos foram corados duplamente com anticorpos marcadores de CD45R (B220) e a proteína de fusão de CRPl-Fc. Foram detectadas células que expressavam o marcador de célula B CD45R e os putativos ligandos para CRP1 incluindo, presumivelmente, B7RP1 (Exemplo 8). Por conseguinte, concluiu-se que B7RP1 é expresso em células B, um tipo de célula apresentadora de antigénio. Estes dados são consistentes com a expressão de ARN de B7RP1 em regiões de célula B de diversos tecidos linfóides (Exemplo 5).
Análise de FACS da expressão de B7RP1 em macrófagos peritoneais (Figura 8). As células peritoneais foram recolhidas por lavagem local de um murganho normal e lavadas antes de serem incubadas com a proteína de fusão de CRPl-Fc ou a proteína de Fc, como um controlo ou com o anticorpo monoclonal F4/80 (que detecta um antigénio específico para macrófagos) ou um anticorpo monoclonal de controlo de isótipo correspondido irrelevante. As células foram, depois, novamente lavadas e incubadas com anticorpo de cabra anti-humano conjugado a Fc-FITC. Após lavagem adicional, as células foram avaliadas num analisador de FACS para as suas propriedades de dispersão de luz e coloração de fluorescência. As células peritoneais foram, em primeiro lugar, 87 distinguidas em subconjuntos com base nas suas propriedades de dispersão de luz (Figura 8A). Os macrófagos foram identificados na região 5 (R5) devido à sua capacidade de dispersarem fortemente a luz para a frente (FSC) e para os lados (SSC) e devido à sua coloração positiva para o antigénio F4/80, um marcador para macrófagos (Figura 8B). Os macrófagos na região 6 (R6) foram seleccionados com base na sua coloração menos intensa para o antigénio F4/80 e verificou-se serem corados pela proteína de fusão de CRPl-Fc (Figura 8C). Estes dados indicam que os ligandos para CRP1 incluindo, possivelmente, B7RP1, são expressos em macrófagos, uma célula apresentadora de antigénio profissional. Isto é consistente com a função de CRP1 e B7RP1 na activação de linfócito T.
Exemplo 11
Actividade Inibitória in vitro da Proteína de Fusão de
B7RP1-Fc em Linfócitos T Estimulados com Con A
Os esplenócitos de murganho foram preparados como no Exemplo 8 e enriquecidos para linfócitos T por selecção negativa (R and D Systems, Inc., Minneapolis, MN)). Foram utilizados 200000 esplenócitos em ensaios de proliferação de célula T, numa placa de 96 poços de fundo redondo. As células foram incubadas, durante 1 h, com meios (sem adições), proteínas de fusão de CRPl-Fc, B7RP1-Fc ou B7.2-Fc, como indicado na Figura 9. Os meios (sem adições) ou Con A, a diversas concentrações, foram adicionados como indicado na parte de baixo da Figura 9. As
células foram, depois, incubadas a 37 °C e CO2 a 5%. Após 42 h, as células foram pulsadas com 3H-timidina, durante 6 h, recolhidas e a radioactividade incorporada determinada. A CPM média e o desvio-padrão de amostras em triplicado estão representados na Figura 9.
As proteínas de fusão de Fc não demonstraram, por elas mesmas, actividade estimulatória ou inibitória significativa de célula T, contudo, na presença de Con A a 1 pg/mL e 3 pg/mL, as proteínas de fusão de B7RP1-Fc e de B7.2-FC conhecida mostraram actividade inibitória significativa (Figura 9). A elevadas concentrações (10 pg/mL), a estimulação de Con A resulta em morte celular, presumivelmente através de sobreactivação das células T. A adição de B7RP1-Fc ou B7.2-Fc protegeu significativamente as células dos efeitos prejudiciais de concentrações elevadas de Con A. Nas funções inibitórias e protectoras, o efeito pela proteína de B7RP1-FC foi superior ao da proteína de B7.2-FC nas células estimuladas com Con A. Estes dados indicam que a proteína de B7RP1 funciona para regular a proliferação de célula T.
Exemplo 12
Distribuição sistémica da proteína de fusão de B7RP1-Fc em murganhos transgénicos A proteína de fusão de B7RP1-Fc descrita no Exemplo 7 foi subclonada num vector de expressão específico de ApoE de fígado (Simonet et al., J. Clin. Invest. 9_4, 1310-1319 (1994) e Pedido PCT N° US94/11675). A região codificante foi excisada de pCEP4/B7RPl-Fc utilizando as enzimas de restrição Spe I e Not I e o fragmento subclonado nos mesmos sítios no vector de expressão específico de ApoE de fígado anteriormente mencionado. O plasmídeo resultante, HE-B7RP1-Fc, foi sequenciado através da 89 sua região codificante de proteína e sequências flanqueando a região codificante, para garantir que era isento de mutação. 0 plasmídeo foi amplificado e purificado através de duas séries de centrifugação de gradiente de densidade de CsCl. 0 ADN plasmídico purificado foi digerido com as enzimas de restrição Cia I e Ase I e o inserto do transgene de 1,5 kb foi purificado por electroforese em gel de agarose. 0 fragmento purificado foi diluído para uma solução de injecção stock de 1 pg/mL em Tris a 5 mM, pH 7,4 e EDTA a 0,2 mM. Os embriões de célula única de murganhos da variedade BDF1 X BDF1 foram injectados, essencialmente como descrito (Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8_2, 4338 (1985)), excepto que as agulhas de injecção foram biseladas e siliconizadas antes de utilização. Os embriões foram cultivados, de um dia para o outro, numa incubadora de CO2 e 15 a 20 embriões de 2 células foram transferidos para os ovidutos de murganhos fêmea CD1 pseudoprenhes.
Após o termo da gravidez, da implantação nos embriões microinjectados foi obtida uma descendência de 56. A descendência foi rastreada por amplificação de PCR do transgene integrado nas amostras de ADN genómico. A região alvo para amplificação era uma região de 369 pb do intrão de Apo E humana que foi incluído no vector de expressão. Os oligos utilizados para amplificação de PCR foram: 5'-GCC TCT AGA AAG AGC TGG GAC-3' (SEQ ID N°: 32) 5'-CGC CGT GTT CCA TTT ATG AGC-3' (SEQ ID N°: 33)
As condições para o PCR foram: 94 °C durante 2 min, 1 ciclo; 94 °C durante 1 min, 63 °C durante 20 s e 72 °C durante 30 s, 30 ciclos. Da descendência original de 56, 7 foram 90 identificados como murganhos fundadores transgénicos positivos para PCR. Às 12 semanas de idade, nove fundadores transgénicos (murganho N° 1, 2, 4, 6, 8, 30, 32, 33, 40) e cinco controlos (murganho N° 5, 9, 10, 25, 28) foram sacrificados para análise de necropsia e patológica. O ARN celular total foi isolado dos fígados dos animais fundadores e ninhadas de controlo negativo como descrito (McDonald et al., Meth. Enzymol. 152, 219 (1987)). A análise de transferência de Northern foi realizada nestas amostras para avaliar o nível da expressão do transgene. Aproximadamente 10 pg de ARN total de cada animal foram resolvidos por géis desnaturantes de electroforese em agarose (Ogden et al., Meth. Enzymol. 152, 61 (1987)), depois, transferidos para membrana de nylon HYBOND-N (Amersham) e sondados com ADN de inserto de mB7RPl-Fc marcado com 32P dCTP. A hibridação foi realizada durante 1 h, a 63 °C, em Solução ExpressHyb (Clonetech) e 2-4 X 106 CPM de sonda marcada/mL de tampão de hibridação. Após hibridação, as transferências foram lavadas, duas vezes, em 2X SSC, SDS a 0,1%, à temperatura ambiente, durante 5 min cada e, depois, duas vezes, em 0,1X SSC, SDS a 0,1%, a 55 °C, durante 15-20 min cada. A expressão do transgene em ninhadas de fundadores e de controlo foi determinada após auto-radiografia.
As análises de transferência de Northern indicaram que sete dos fundadores transgénicos expressaram níveis detectáveis do ARN de transgene (murganho N° 1, 2, 6, 8, 32, 33 e 40) . Os murganhos de controlo negativo e três fundadores (N° 4, 30 e 31) não expressaram níveis detectáveis de ARN. Uma vez que se determinou que a proteína de fusão de B7RP1-Fc é segregada de células mamíferas em cultura (Figura 4B e Exemplo 7), a 91 expressão do ARNm de transgene deverá ser indicativa do nível de produto génico distribuído sistemicamente.
Exemplo 13
Actividade biológica da proteína de fusão de B7RP1-Fc
Sete dos murganhos transgénicos (murganho N° 1, 2, 6, 8, 32, 33, e 40) e cinco ninhadas de controlo (N° 5, 9, 10, 25 e 28) foram sacrificados para análise de necropsia e patológica utilizando os seguintes processos: Antes da eutanásia, todos os animais tinham os seus números de identificação verificados, depois, foram pesados, anestesiados e o sangue retirado. O sangue foi guardado como soro e sangue total para um painel completo de química sérica e hematologia. A radiografia foi realizada imediatamente após a anestesia terminal por inalação letal de C02 e antes da dissecção grosseira. Os tecidos foram, depois, removidos e fixos em Zn-formalina tamponada a 10% para examinação histológica. Os tecidos recolhidos incluíam o fígado, baço, pâncreas, estômago, duodeno, íleo, placas de Peyer, cólon, rim, órgãos reprodutivos, pele, glândulas mamárias, ósseo, cérebro, coração, pulmão, timo, traqueia, esófago, glândulas tiróide/paratiróide, jejuno, ceco, recto, glândulas supra-renais, gordura branca e castanha, nervo ciático, medula óssea, bexiga urinária e músculo esquelético. Antes da fixação, os pesos de órgão intacto foram determinados para o fígado, coração, estômago, rim, supra-renais, baço e timo. Após fixação, os tecidos foram processados em blocos de parafina e foram obtidas secções de 3 pm. 92 A imuno-histoquímica para o marcador de linfócito B, B220, e o marcador de linfócito T, CD3, foi realizada. Para detectar a expressão de B220 ou CD3, secções de 4 pm fixas em formalina, embebidas em parafina, foram desparafinadas e hidratadas com água desionizada. As secções foram neutralizadas com peróxido de hidrogénio a 3%, bloqueadas com Protein Block (Lipshaw, Pittsburgh, PA) e incubadas em anticorpo monoclonal de rato para B220 (Pharmingen, San Diego, CA) ou anticorpo policlonal de coelho para CD3 (Dako, Carpinteria, CA) . Os anticorpos foram detectados por imunoglobulinas de coelho anti-rato ou de cabra anti-coelho biotiniladas, estreptavidina conjugada a peroxidase (BioGenex, San Ramon, CA) com DAB como cromogéneo (Biotek, Santa Barbara, CA). As secções foram contrastadas com hematoxilina.
Neste estudo, os sinais clínicos normais foram referidos durante a fase em vida do estudo. As radiografias de corpo intacto dos murganhos transgénicos eram comparáveis àquelas dos murganhos de controlo. Os parâmetros hematológicos globais dos murganhos transgénicos eram comparáveis aos do grupo de controlo negativo, embora estivessem presentes alterações esporádicas em murganhos individuais: os transgénicos N° 8 e N° 40 tinham níveis aumentados de globulina sérica (hiperglobulinemia) e os N° 32 e N° 33 tinham níveis de globulina na gama normal elevada, acompanhados de níveis de albumina na gama normal baixa, o que é um padrão geralmente verificado com estimulação antigénica crónica do sistema imunitário. Os pesos dos órgãos dos outros murganhos transgénicos não foram significativamente diferentes daqueles do grupo de controlo.
As seguintes alterações histopatológicas estavam presentes nos murganhos transgénicos: Os nódulos linfáticos mesentéricos dos murganhos B7RP1-F c transgénicos estavam moderadamente a 93 marcadamente aumentados, quando comparados com os murganhos de controlo (Fig. 10A-10D; Fig. 11A-11E). O córtex tinha hiperplasia folicular proeminente, verificada como folículos secundários aumentados (Fig. 10B-11B), com grandes centros germinativos contendo maioritariamente células B B220+ (Fig. 11D) e poucas células T CD3+ dispersas (Fig. 11F) . A área paracortical (célula T CD3+) também estava moderadamente aumentada (Fig. 11B-11F) e os seios medulares tinham números ligeiramente aumentados de macrófagos carnudos (histiocitose sinusal). A alteração mais conspícua nos nódulos estava presente nos cordões medulares, que estavam moderadamente a marcadamente expandidos em grande número de células plasmáticas bem diferenciadas nos murganhos transgénicos B7RP1-Fc (Fig. 10D) . No murganho N° 40 transgénico, também foi verificado um pequeno número de corpos de Russell dispersos (i. e., células plasmáticas com vesículas intracitoplasmáticas proeminentes, de grandes dimensões, redondas, contendo imunoglobulinas) nos cordões medulares (Fig. 10D). Interessantemente, os outros nódulos linfáticos internos e periféricos (e. g., cervical, inguinal) tinham características morfológicas semelhantes de hiperplasia linfóide reactiva, sugestiva de uma resposta sistémica. Estas constatações são consistentes com uma estimulação imunitária crónica, em curso, com melhoramento da reacção imunitária humoral, que conduz a proliferação de célula B e diferenciação terminal em células plasmáticas. O baço de murganhos transgénicos B7RPl-Fc tinha áreas de polpa branca aumentadas de modo variável, com hiperplasia linfóide reactiva moderada, envolvendo particularmente os folículos secundários de célula B com centros germinativos proeminentes e bainhas de célula T periarteríolares, quando comparado com os murganhos de controlo (Fig. 10E-10F). Outra 94 constatação conspícua em murganhos transgénicos B7RP1-Fc foi plasmacitose mínima a branda na zona marginal circundando as áreas de polpa branca e na polpa vermelha adjacente. 0 murganho N° 6 transgénico tinha poucos corpos de Russell dispersos (Fig. 10F, inserto). A polpa vermelha tinha hematopoiese extramedular branda a moderada, que era comparável à verificada nos murganhos de controlo (Fig. 10E).
As pequenas placas de Peyer intestinais estavam moderadamente a marcadamente aumentadas nos murganhos transgénicos B7RP1-Fc em relação às dos murganhos de controlo (Fig. 10G) e tinham folículos muito grandes, com centros germinativos proeminentes, particularmente nos murganhos N° 40 e N° 32 transgénicos (Fig. 10H) . Além disso, houve um aumento mínimo (no N° 32) a brando (nos N° 8 e N° 33) no número de linfócitos e células plasmáticas (misturadas com um infiltrado de eosinófilo brando no íleo do murganho N° 32) na camada de lâmina própria espessada da mucosa, que estava presente no intestino delgado, mas mais proeminente no cólon dos murganhos transgénicos. Os grandes agregados linfóides intestinais (GALT) também estavam ligeiramente mais proeminentes em alguns murganhos transgénicos B7RP1-FC (particularmente os murganhos N° 8 e N° 2) do que no grupo de controlo.
Em geral, os outros tecidos examinados, incluindo o timo, medula óssea, fígado, pulmão, coração, pâncreas, rins, glândula supra-renal, tiróide, paratiróide, traqueia, órgãos reprodutivos, bexiga urinária, glândula mamária, pele, músculo esquelético, nervo periférico, cérebro, esófago, estômago, intestino delgado e grosso, osso (fémur/tíbia), articulação rígida, gordura branca e castanha, pareciam normais e 95 comparáveis às alterações de fundo detectadas nos murganhos de controlo.
Os dados deste estudo demonstram que a sobre-expressão da quimera de Fc de proteína relacionada com B7 (B7RP1-Fc) em murganhos transgénicos induz um fenótipo caracterizado por hiperplasia linfóide reactiva proeminente detectada no baço, nódulos linfáticos periféricos e internos e tecido linfóide associado a intestino, como hiperplasia folicular, expansão de áreas de célula T e plasmacitose conspícua, acompanhada de hiperglobulinemia em alguns animais. A plasmacitose é acompanhada de níveis superiores de IgG em circulação (média ± SD = 597 + 298 mg/mL em murganhos transgénicos vs. 209 + 80 mg/mL em ninhadas de controlo, n = 7, P < 0,05, teste t), em particular IgG2a (217 ± 100 mg/mL vs. 75 ± 29 mg/mL, n = 7, P < 0,01, teste t). A indução de IgG2a está normalmente associada a citocinas Thl, tal como IFN-g. Deste modo, B7RP-1 induz a proliferação de células T e B e estimula as células B a diferenciarem-se em células plasmáticas e a produzirem imunoglobulina.
Estas alterações são consistentes com uma resposta imunitária sistémica persistente, com hiperestimulação do braço humoral do sistema imunitário, que resulta em estimulação, proliferação e diferenciação de células B em células plasmáticas de produção de anticorpo em todos os órgãos linfóides examinados.
Conclui-se, da marcada hiperplasia linfóide demonstrada nos murganhos transgénicos B7RP1-FC, que a proteína de B7RP1 tem actividade biológica in vivo significativa, relacionada com estimulação do sistema imunitário. 96
Exemplo 14
Clonagem de B7RP1 Humana
Os linfócitos periféricos em circulação humanos normais foram separados de glóbulos vermelhos utilizando o Meio de Separação de Linfócito (ICN Pharmaceuticals) . As células T foram, depois, activadas com anticorpo anti-CD3 ligado a placa, a 10 pg/mL (Immunotech, Westbrook, ME), PMA a 10 ng/mL e ionomicina a 500 ng/mL, de um dia para o outro (16 horas), a 37 °C e CO2 a 5%. O ARN total foi, depois, preparado a partir das células utilizando o reagente TRIzol (Gibco BRL) . As células foram sedimentadas por centrifugação e o sedimento celular foi ressuspenso em 1 mL de reagente TRIzol para cada 5 X 106 células e incubado, à temperatura ambiente, durante 5 min. Foram, depois, adicionados 0,2 mL de clorofórmio por 1 mL de reagente TRIzol original. Os tubos foram agitados vigorosamente à mão, durante 15 segundos e incubados, durante 3 minutos, à T.A. e centrifugados a 13000 rpm, durante 15 min, a 4 °C. Após centrifugação, a fase aquosa superior clara que contém o ARN foi recolhida e a amostra de ARN foi precipitada pela adição de álcool isopropílico. A solução foi, depois, incubada a T.A. durante 10 min, 0 ARN sedimentado, lavado com etanol 75% e depois, centrifugado a 15000 rpm, durante 5 min, a 4 °C. ' sedimento foi seco ao ar, ressuspenso em água isenta de ARNse, depois, aliquotado e armazenado a -80 °C, até utilização posterior. A biblioteca foi construída utilizando o Sistema de Plasmídeo Superscript para síntese de ADNc e Clonagem de 97
Plasmídeo (Gibco BRL) . Resumidamente, insertos de ADNc com um tamanho médio de 2 kb, foram ligados ao vector pSport no sitio de clonagem SalI/NotI. Os plasmídeos ligados foram electroporados em E. coli competente para transformação Electromax (Gibco BRL), titulados e plaqueados a quinze mil colónias por placa de LB (ampicilina a 100 pg/mL). 300000 colónias foram levantadas em membranas de transferência de hibridação de rastreio de colónia/placa (NEN Life Sciences), desnaturadas em NaOH a 0,5 N, NaCl a 1,5 M, durante 5 minutos, depois, sucessivamente neutralizadas, durante 5 minutos cada, nos seguintes tampões, Tris HC1 a 1 M, pH 8,0, Tris HC1 a 0,5 M, pH 8,0 e NaCl a 1,5 M e 2X SSC. Os filtros foram, depois, reticulados por irradiação ultravioleta e cozidos, durante 30 min, a 80 °C, numa estufa a vácuo. Os filtros foram pré-lavados extensivamente em 2X SSC, a 42 °C, para remover detritos, depois, pré-hibridados, a 42 °C, em formamida a 50%, 5X SSPE, 5X solução de Denhardt, SDS a 0,5%, ADN de esperma de salmão a 100 pg/mL, durante 2 horas. A biblioteca de ADNc de linfócito humano foi rastreada com um fragmento de ADN de 895 pb tendo os nucleótidos 1-711, como mostrado na Figura 3A, 16 7 pb imediatamente 5' do codão de metioniza iniciador na Figura 3A e 17 pb imediatamente 3' da posição 711 na Figura 3A. Esta sequência 5' a montante, de 167 pares de bases, foi obtida por RACE de 5' do ADNc de HuB7RPl (Exemplo 4) e foi libertada de um vector TOPO TA (Invitrogen, Carlsbad, CA) no sítio de clivagem da enzima de restrição Eco RI. Este inserto foi purificado duas vezes num gel de TAE agarose a 0,8%. Um kit de purificação de gel de ADN (Qiagen) foi utilizado para isolar o inserto de ADN da agarose. 98
Os 125 ng do fragmento de ADN foram marcados com 32P dCTP (Amersham) seguindo o protocolo do sistema de marcação de iniciação aleatória Redi-Prime 2 (Amersham). Os filtros de levantamento de colónia foram, depois, deixados hibridar com a sonda, a 42 °C, no seguinte tampão, de um dia para o outro, a 42 °C; formamida a 50%, 5X SSPE, 2X solução de Denhardt, SDS a 0,5%, ssDNA a 100 mg/mL. A actividade especifica da sonda foi 2,38 X 109 cpm/pg de ADN, em aproximadamente 2 ng de sonda marcada por mL de tampão de hibridação. A sonda foi removida e
guardada para a série seguinte de rastreio. Os filtros foram depois, lavados em 2X SSC, SDS a 0,1%, T.A, durante 15 min seguido de IX SSC , SDS a 0,1%, a 55 °C, durante 15 min e IX SSC SDS a 0,1%, a 60 °C, durante 10 min. Os filtros foram embrulhados em plástico e expostos a filme de auto-radiografia, de um dia para o outro, a -80 °C, com 2 ecrãs de intensificação. Três clones positivos independentes foram identificados. As exposições foram alinhadas às placas bacterianas e os clones positivos raspados, diluídos e replaqueados em placas de LB com ampicilina a 100 pg/mL, cultivados, de um dia para o outro, como anteriormente e as colónias foram levantadas, preparadas e sondadas, como descrito anterior. Três colónias de clone independentes foram isoladas, o ADN foi isolado e o ADN sequenciado para cada clone em triplicado. O comprimento completo da proteína de B7RP1 humana é 302 aminoácidos. O comprimento polipeptídico e posição relativa do domínio transmembranar são consistentes com outros membros da família de B7. O gene de B7RP1 humana tem 43% de identidade de aminoácido com o clone de murganho. Este grau de homologia é significativo, uma vez que as proteínas de CD80 de murganho e humanas são apenas 41% idênticas. Entre os genes de murganho e 99 humanos são conservados, de um modo notável, os resíduos de cisteína nas posições de aminoácido 37, 113, 158, 215 e 216.
Exemplo 15
Clonagem de CRP1 Humana
Uma pesquisa de homologia blast do Genbank (GCG, University of Wisconsin), utilizando a sequência de B7RP1 murina (ver a Figura 2), retribuiu um clone genómico (Acesso GenBank N° AQ022676) contendo uma sequência de 104 pb que mostrou elevada homologia com o gene de CRP1 murina. Os iniciadores de clonagem de PCR foram concebidos para se sobreporem a esta sequência. 5'-GCA TAT TTA TGA ATC CCA-3' (SEQ ID N°: 34) 5'-ACT ATT AGG GTC ATG CAC-3' (SEQ ID N°: 35)
Utilizando os iniciadores acima, um fragmento de ADN de 151 pb da CRP1 murina foi amplificado por PCR utilizando, como molde, o plasmídeo de CRP1 murino descrito na Figura 1 e Exemplo 1. Os 125 ng do ADN foram marcados com 32P dCTP (Amersham) seguindo o protocolo do sistema de marcação de iniciação aleatória Redi-Prime 2 (Amersham). Os filtros de levantamento de colónia de bibliotecas de sangue periférico humano, descritos no Exemplo 15, foram, depois deixados hibridar com a sonda no seguinte tampão de hibridação, de um dia para o outro (15 h) , a 41 °C, formamida a 50%, 5X SSPE, 2X solução de
Denhardt, SDS a 0,5%, ssDNA a 100 pg/mL. A actividade especifica da sonda foi 3,52 X 109 cpm/pg de ADN, 1,5 ng de sonda marcada/mL de tampão de hibridação. A sonda foi retirada e guardada para a 100 série seguinte de rastreio. Os filtros foram, depois, lavados em 2X SSC, SDS a 0,1%, à T.A., durante 10 min, seguido de IX SSC, SDS a 0,1%, a 37 °C, durante 7 minutos, 40 °C, durante 7 minutos, 44 °C, durante 7 minutos, depois, 50 °C, durante 7 minutos, monitorizando continuamente a taxa a que os filtros libertavam a sonda marcada. Os filtros foram embrulhados em plástico e expostos a filme, de um dia para o outro, a -80 °C, com 2 ecrãs de intensificação. Este método revelou 9 possíveis clones positivos independentes. As exposições foram alinhadas às placas bacterianas e os clones positivos raspados, depositados em 200 pL de SOC, 2 diluições seriais de 1:10 foram realizadas e 70 pL da segunda diluição foram replaqueados em placas de LB contendo ampicilina a 100 pg/mL e cultivados, de um dia para o outro, como anteriormente. As colónias foram levantadas, preparadas e sondadas como anteriormente. Oito clones independentes foram isolados e o ADN preparado pelo método miniprep da Qiagen.
Um clone de ADNc, contendo uma grelha de leitura aberta de 199 aminoácidos, foi obtido (Figura 13A) . Este clone de ADNc continha homologias de nucleótido e aminoácido com o clone de CRP1 murino descrito no Exemplo 1 e Figura 1. Os nucleótidos correspondendo à grelha de leitura aberta deste clone humano eram 77% idênticos ao gene de CRP1 murina. A tradução da sequência humana e subsequente comparação com a proteína de CRP1 murina revelou 69% de identidade de aminoácido com a proteína murina (Figura 13B). Além disso, o motivo entre os aminoácidos 114 a 119, "FDPPPF", era conservado entre os genes de CRP1 murina e humana. Este motivo corresponde ao motivo "MYPPPY" na CD28 murina e humana que é essencial para a interacção da proteína B7. Além disso, as cisteínas nas posições de aminoácido 42, 109 e 141 também são conservadas. Estas 101 cisteínas correspondem a cisteínas em CD28 e CTLA-4 que estão envolvidas na formação de gancho de Ig e dimerização de dissulfureto intermolecular. A semelhança próxima com CRP1 murina e semelhanças estruturais com a família de homologia de CD28 indica que se trata do homólogo de CRP1 humana.
Exemplo 16 A CRP-1 é expressa em linfócitos T de memória em repouso
De modo a estudar a expressão de CRP-1 em células T de memória, células T esplénicas foram recolhidas de murganhos de 6-7 meses de idade. Estas células foram coradas duplamente utilizando B7RP-1-FC marcada por um anticorpo de Fc anti-humano conjugado a FITC e um anticorpo conjugado a PE para CD44, CD45RB ou CD69. A coloração com a proteína de fusão de B7RP-1-Fc detecta a expressão da proteína de CRP-1 nestas células T. Os murganhos mais velhos mostram mais células T esplénicas CRP-1+ do que murganhos mais jovens. Interessantemente, um número conspícuo destas células são CD44 elevada (Fig 14a) e CD45RB baixa (Fig 14b), um perfil típico de células T de memória. Estas células T de memória CRP-1+ estão num estado de repouso, uma vez que não expressam o marcador de activação CD69 (Fig. 14c) . A expressão de CRP-1 em células T de memória indica que a CRP-1 tem funções co-estimulatórias em células T de memória. 102
Exemplo 17
Co-estimulação de célula T in vitro inibida por anticorpos para B7RP-1.
Para determinar se a proteína de B7RP-1 tem relevância funcional para células T, incubaram-se células T CD3+ com a proteína de fusão de B7RP-1-F c e um anticorpo anti-CD3 num ensaio de proliferação in vitro. Anticorpos policlonais de B7RP1 de coelho anti-murganho ou anticorpos monoclonais de B7RP1 de rato anti-murganho foram, depois, utilizados para inibir especificamente a proliferação co-estimulada por B7RP1-Fc in vitro.
Preparação de anti-soro policlonal de coelho de B7RP-1
Três coelhos brancos da Nova Zelândia (5-8 lb. de peso inicial) foram injectados, IM, com proteína de B7RP1 murina. Cada coelho foi imunizado no dia 1 com 150 pg de proteína de B7RP1 murina, emulsionada num volume igual de adjuvante completo de Hunters Titer Max. Reforços adicionais (dias 14 e 28) foram realizados pelo mesmo processo. Os títulos de anticorpo foram monitorizados por EIA. Após o segundo reforço, os anti-soros revelaram títulos moderados de anticorpo. Um sangramento de produção de 30 mL foi, depois, obtido de cada animal. Este foi repetido cada semana, durante 6 semanas. Os anticorpos policlonais foram, depois, purificados por cromatografia de agarose de proteína A, seguida de selecção negativa de cromatografia de afinidade de proteína de Fc e selecção positiva por cromatografia de afinidade de B7RP-1-Fc. 103
Preparaçao de anticorpo monoclonal de B7RP1 de rato anti-murino
Os anticorpos monoclonais de B7RP1 de rato anti-murinos foram gerados como descrito em Practical Immunology, segunda edição (1980; L. Hudson e F.C. Hay; Blackwell Scientific Publications; St. Louis, MO). Resumidamente, ratos de Lou (Harlan; Indianapolis, IN) foram injectados intraperitonealmente com proteína de fusão de muB7RPl-Fc, emulsionada em Adjuvante de Freund, a intervalos de 4 semanas. Três dias antes da fusão, os ratos foram reforçados intravenosamente com muB7RPl solúvel. No dia da fusão, o animal foi sacrificado sob dióxido de carbono e o baço removido de modo asséptico. A suspensão de células únicas foi gerada utilizando um Stomacher de tecido. Os esplenócitos e células de mielomas de Y3-Agl.2.3 (American Type Culture Collection; Rockville, MD) foram lavados em meios isentos de soro, depois, fundidos pela adição de polietilenoglicol (PEG 1500; Boehringer Mannheim Biochemicals; Indianapolis, IN). As células foram enxaguadas uma vez, ressuspensas em meios contendo soro e plaqueadas em placas de cultura de tecidos de 96 poços. Dez a 12 dias mais tarde, os meios de cada poço foram testados para anticorpo específico para B7RP1 por meio de um Ensaio de Imunoabsorção Enzimática (EIA) directo. As células de poços indicando potencial ligação foram cultivadas para culturas de 10 mL e congeladas em azoto líquido. Os meios de cada cultura foram ainda testados em citometria de fluxo e num ensaio funcional de proliferação de célula T. Aqueles determinados como sendo de interesse por estes métodos foram plaqueados para colónias de célula única, seleccionados novamente por EIA e as 104 linhas celulares finais mantidas para geração de anticorpo. Os anticorpos foram purificados dos meios celulares por cromatografia de agarose de proteína A.
Preparaçao de célula T e ensaio de proliferação de célula T
As células T dos baços de murganhos C57B1/6 (fêmeas de 8-12 semanas de idade, Charles River Laboratories) foram purificadas por selecção negativa, através de uma coluna enriquecimento de célula T murina (R&D Systems). As células T foram, depois, utilizadas directamente ou ainda purificadas por lise de anticorpo e complemento, como se segue. As células foram ressuspensas (2,5 X 106 células/mL) em meio RPMI contendo anticorpos (todos a 10 pg/mL e da Pharmingen) contra CDllb murina (Clone Ml/70), NK-1.1 (Clone PK136), CD8a (Clone 53-6.7), I-Ab (Clone M5/114.15.2), CDllc (Clone HL3) e o antigénio de B220 (Clone RA3-6B2) . As células foram, depois, incubadas sobre gelo, durante 30 min, sedimentadas a 1200 rpm, ressuspensas em 4:1, vol/vol, de RPMI:complemento de coelho (Sigma, N° S-7764) e incubadas durante 30 min adicionais, a 37 °C. As células foram sedimentadas novamente e o tratamento de complemento foi repetido. Antes do plaqueamento, as células foram lavadas com RPMI contendo FCS a 10%. As placas de 96 poços de fundo em U foram revestidas com um anticorpo anti-CD3 (Clone 145-2C11, Pharmingen), a concentrações variando entre 0 e 1,2 pg/mL) e Fab2 de IgG anti-humano (Sigma, 12,5 pg/mL) , de um dia para o outro, a 4 °C, seguido de uma incubação de 6-9 h, a 37 °C. As células T (1 x 105/poço) foram cultivadas na ausência ou presença de diversas proteínas de fusão de Fc, durante 48 h e foram pulsadas, durante as últimas 18 horas, com 1 pCi de 3H-timidina. As proteínas de Fc de controlo incluíram uma 105 proteína de fusão de OPG e Fc e um fragmento de proteína de Fc não fundido. As células foram, depois, recolhidas e a radioactividade incorporada foi contada. B7RP-1-Fc co-estimula as células T a proliferarem, num modo dependente de dose (Fig. 15a) e um anticorpo anti-B7RP-l-Fc inibe especificamente esta co-estimulação de um modo dependente de dose (Fig. 15b).
Exemplo 18
Os inibidores da via de CRP-1/B7RP-1 diminuem o começo da artrite reumatóide induzida por colagénio. A artrite induzida por colagénio (CIA) é um modelo animal de poliartrite auto-imune em roedores e primatas que tem muitas semelhanças com a artrite reumatóide em humanos. A imunização com espécies heterólogas de colagénio de tipo II (CII) induz uma resposta auto-imune para CII que conduz ao desenvolvimento de CIA em estirpes de murganho susceptíveis. As estirpes congénitas de murganhos com H-2r e H-2q são altamente susceptíveis a CIA. A CIA é mediada pelos efeitos sinérgicos de células T e anticorpo reactivos para CII. CII porcina (Nabozny et ai., Autoimmunity 20, 51-58 (1995)) foi dissolvida em ácido acético a 0,01 N, a uma concentração de 2 mg/mL e, depois, foi emulsionada a uma razão 1:1 com CFA (Difco) . Murganhos susceptíveis a artrite B10.RIII (H-2r) (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) foram imunizados com 10 0 pL de emulsão, intradermicamente, na base da marcador. Os murganhos foram monitorizados 2-3 vezes por semana para o desenvolvimento de artrite. A gravidade de artrite foi determinada utilizando um sistema de graduação para cada pata como se segue: 0: sem artrite; 1: vermelhidão ou inchaço em 1-3 dedos; 2: inchaço grave da pata; 3: anquilose de 106 articulaçao. A pontuação de cada membro foi somada, para dar uma gama de gravidade desde 0 até 12 para cada animal.
Os murganhos foram injectados com 100 pg (em 200 pL) de proteina intraperitonealmente, duas vezes por semana. O tratamento começou 1 dia após a imunização com CII porcina e foi interrompido no dia 52 pós-imunização. A experiência foi conduzida em grupos de tratamento de 10 murganhos e os animais com pontuações de 1 ou acima foram pontuados como positivos. Os resultados são mostrados na Figura 16 e Tabela 1. TABELA 1
Efeito das proteínas de fusão de Fc de CRP-1, B7RP-1, CTLA-4 e B7.2 no começo da artrite Média +/-s.d. dia de
Grupos de tratamento começo CTLA4-F c 60,0±0,0 CRPl-Fc 48,9±13,2 B7.2-FC 28,4±14,1 B7RP1-F c 33,9±16,6 PBS 37,7±17,1
Em murganhos tratados com a proteína de fusão de CRPl-Fc, o começo dos sintomas artríticos foram retardados em, aproximadamente, 10 dias, em comparação com os murganhos tratados com PBS. Isto demonstra que a inibição da via de 107 CRP-1/B7RP-1 pode aliviar os sintomas da doença neste modelo de murganho de artrite reumatóide.
Os murganhos tratados com B7RP-1-Fc ou B7.2-Fc mostraram um começo precoce da doença (Tabela 1 e Figura 16a), com um aumento na gravidade artrítica (Figura 16b), em comparação com os controlos tratados com PBS. Isto indica que a proteína de fusão de B7RP-1-Fc melhora a resposta imunitária de célula T. Essa actividade pode ser útil na geração de imunidade antitumoral in vivo.
Os efeitos opostos por CRP-l-Fc e B7RP-1-Fc, neste modelo de murganho de artrite reumatóide, indicam que a via pode ser manipulada para estimular ou inibir a progressão da doença. 0 direccionamento da proteína de CRP-1 com B7RP-1-F c solúvel melhora a doença, ao passo que a interacção de CRP-l-Fc solúvel com B7RP-1 inibe os sintomas da doença.
Exemplo 19 B7RP-1-Fc induz um fenótipo de doença inflamatória intestinal em murganhos transgénicos. A sobreexpressão persistente da proteína relacionada com B7 (B7RP1-Fc) em murganhos transgénicos de 22 a 25 semanas de idade (Exemplo 12) induz um fenótipo surpreendente de doença inflamatória intestinal (IBD), com marcado espessamento e inflamação crónica do intestino delgado e grosso (enterocolite) e perda de peso em alguns animais. Histologicamente, as alterações inflamatórias mais graves verificaram-se no cólon proximal e distai, com alterações mais brandas no intestino 108 delgado. 0 cólon proximal estava marcadamente espessado, com ulceração fissurante, inflamação transmural e hipertrofia da mucosa colónica, ao passo que o cólon distai tinha hipertrofia mucosal difusa (ou erosão focal e atrofia glandular) sem ulceração. 0 intestino delgado proximal tinha hipertrofia mucosal branda a marcada, com alterações inflamatórias mais brandas, ao passo que o intestino delgado distai (ileo) tinha hipertrofia mucosal branda em alguns animais e atrofia noutros murganhos. As alterações intestinais eram mais graves e consistentemente verificadas nos murganhos transgénicos B7RP-1 fêmea, mas também foram observadas em vários dos murganhos transgénicos macho neste estudo. É interessante notar que as caracteristicas histológicas verificadas no cólon proximal, incluindo a ulceração fissurante e a inflamação granulomatosa crónica transmural com células gigantes multinucleadas, assemelham-se mais estreitamente às verificadas na doença de Crohn do que a colite ulcerativa em humanos. Morfologicamente, esta colite também mimetiza a IBD descrita em murganhos deficientes em interleucina 10, que desenvolve deperdição, anemia e enterocolite afectando o seu aparelho intestinal integral (Kuhn et al. 1993; Sartor 1995;
Leach et al., 1999) . Como nos murganhos knockout de IL-10, as alterações iniciais nos murganhos transgénicos B7RP-1-Fc consistem em infiltrados focais brandos de células inflamatórias na lâmina própria, sem hiperplasia epitelial colónica (Exemplo 13). Em murganhos mais velhos, os segmentos colónicos afectados tornam-se espessados, devido a hipertrofia/hiperplasia glandular e inflamação crónica. Os cólones proximais e distais dos murganhos B7RP-1-Fc tinham colite moderada a grave, com caracteristicas histológicas de doença inflamatória intestinal (IBD). Os segmentos afectados do cólon proximal (Figura 17B-17D) 109 estavam difusamente espessados, devido a hipertrofia e hiperplasia epitelial glandular proeminente, com elongamento e dilatação das glândulas mucosais (Fig. 17B), que tinham um aumento do número de figuras mitóticas e raros abcessos de cripta, mas retiveram células caliciformes com mucina (Fig. 17D) . A mucosa tinha inflamação crónica difusa na lâmina própria que, em alguns animais, se prolongava transmuralmente para envolver as camadas subjacentes da parede intestinal, incluindo a submucosa, muscularis, serosa e o tecido gordo mesentérico adjacente (Fig. 17B-17C). Os infiltrados inflamatórios consistiam em linfócitos (predominantemente célula TCD3+, CD44+), células plasmáticas e macrófagos epitelióides (Fig. 17F) misturados com alguns neutrófilos e células gigantes multinucleadas ocasionais (Fig. 17E), caracteristicas da inflamação granulomatosa crónica. Os agregados linfóides (maioritariamente células B220+ misturadas com um pequeno número de células CD3+) também estavam presentes na mucosa e em volta de vasos sanguíneos mais pequenos na submucosa e camadas mais profundas, incluindo gordura mesentérica (Fig. 17C). 0 lúmen continha exsudado mucopurulento ou mucoso (Fig. 17D). Nestes murganhos transgénicos B7RP-1-Fc verificou-se evidência grave de colite, com ulceração fissurante multifocal da mucosa e inflamação transmural (Fig. 17B-17C). 0 cólon distai dos murganhos transgénicos B7RP-1-FC também estava difusamente espessado e hiperplásico, com elongamento, basofilia e dilatação das glândulas colónicas (Fig. 18B-18G), algumas das quais continham abcessos de cripta (Fig. 18D e 18F) e muco. A lâmina própria tinha um infiltrado inflamatório difuso brando de linfócitos (predominantemente células CD3+, CD44+, particularmente na mucosa superficial; Fig. 18E), assim como células plasmáticas e agregados focais de macrófagos 110 epitelióides misturados com alguns neutrófilos. Os agregados linfóides (predominantemente de células B220+; Fig. 18D e 18F) também estavam dispersos por toda a mucosa. 0 intestino delgado de murganhos transgénicos B7RP-1-Fc tinha alterações mais variáveis, incluindo hipertrofia e hiperplasia mucosal e de cripta branda a focalmente marcada (Fig. 19B e 19D com razões de cripta/vilosidades variando entre 1:4 e 1.5:1, em comparação com 1:10 nos murganhos de controlo), acompanhadas de um infiltrado predominantemente linfoplasmacitico na lâmina própria. A hiperplasia mucosal era mais proeminente no intestino delgado proximal, incluindo o duodeno (Fig. 19B) e, particularmente, no jejuno (Fig. 19D). A arguitectura de cripta estava focalmente desarranjada e displásica nos murganhos mais gravemente afectados (Fig. 19D). Em contraste, os intestinos delgados distais (ileo) de alguns murganhos tinham atrofia vilosa branda, fragmentada, da mucosa ileal (Fig. 19F) com rombosidade, espessamento ou perda focal das vilosidades (com uma razão de cripta: vilosidade de 1:1 ou inferior, em vez da razão normal de 1:2), ao passo que outros murganhos tinham hipertrofia mucosal ileal branda. A proteína de fusão de B7RP-1-FC actua para activar células que são responsáveis pela dedução de um fenótipo muito semelhante ao da doença de Crohn humana. Isto indica que as células que podem ser responsáveis pela inflamação na doença de Crohn são activadas pela proteína de fusão de B7RP-1-F c. Os inibidores solúveis de proteína, anticorpo ou molécula pequena de B7RP-1 podem, por conseguinte, ser úteis na inibição de IBD. 111
Exemplo 20 A proteína de fusão de B7RP-1-FC inibe o crescimento tumoral em murganhos
Para examinar o efeito de B7RP-1 e CRP-1 no crescimento do sarcoma de Meth A murino imunogénico, investigou-se se a B7RP-1-FC solúvel afecta o crescimento de um sarcoma de Meth A estabelecido em murganhos Balb/c.
As células de sarcoma de Meth A em crescimento exponencial foram implantadas por injecção intradérmica de 0,5 milhões de células no abdómen de murganhos Balb/c no dia 0. No dia 7, quando os tumores atingiram -100 mm3, os murganhos foram tratados com transportador (PBS) ou B7RP-1-Fc (8 mg/kg), subcutaneamente, no pescoço, nos dias 7, 10, 14 e 17. Os diâmetros bidimensionais dos tumores foram medidos por compassos e o volume de tumor (em mm3) foi estimado utilizando a fórmula: Volume de tumor = [{(largura)2xcomprimento}/2]. O crescimento tumoral foi monitorizado até ao dia 28. Cada grupo tinha oito murganhos.
0 padrão de crescimento do sarcoma de Meth A do tumor de controlo era bifásico: uma fase inicial lenta foi seguida de uma fase exponencial relativamente rápida. Nos murganhos tratados com B7RP-1-Fc, o crescimento do tumor foi significativamente mais lento na fase exponencial rápida. No dia 28, os volumes médios dos murganhos de controlo e tratados com B7RP1-FC foram 1410 mm3 e 580 mm3, respectivamente (Figura 20). Por conseguinte, o tratamento de B7RP-1-Fc inibiu significativamente o crescimento tumoral neste modelo. Os dados sugerem, fortemente, a utilidade terapêutica benéfica da proteína de B7RP-1-FC 112 solúvel e outros activadores da via de B7RP-1/CRP-1 no tratamento de tumores imunogénicos. A actividade antitumoral imunológica está estreitamente associada à função de linfócito T citolitica (CTL) . Consistentemente, a proteína de B7RP-1-FC é expressa em células T CD8+ citolíticas (Exemplo 9, Figura 6). Estes dados suportam fortemente as funções de B7RP-1 em células T CD8+ citolíticas. B7RP-1-Fc, ou outros estimuladores da via de B7RP-1/CRP-1, podem, por conseguinte, ser utilizados para melhorar as funções de célula T citolitica e celulares imunitárias para um número de indicações não relacionadas com cancro.
Exemplo 21
Inibição da actividade de B7RP-1 humana in vitro
Para determinar se a B7RP-1 humana tem propriedades co-estimulatórias positivas, testaram-se células expressando B7RP-1 humana e proteína de fusão de B7RP-1-FC humana em ensaios de proliferação de célula T. A proteína de fusão de B7RP-1-Fc humana foi construída pela fusão de sequências génicas correspondendo aos aminoácidos 1 a 247 a uma sequência génica parcial de IgGl humana (Exemplo 14) . A proteína de fusão de CRP-l-Fc humana foi construída pela fusão de sequências génicas correspondendo aos aminoácidos 1 a 146 a uma sequência génica parcial de IgGl humana (Exemplo 2). Os métodos de construção, expressão e purificação de ambas as proteínas de fusão foram conduzidos como descrito no Exemplo 7. A B7RP-1-Fc demonstrou actividades co-estimulatórias que são dependentes da estimulação de anti-CD3 (Figura 21a) . Além disso, esta actividade pode ser 113 especificamente inibida com a proteína de CRP-l-Fc solúvel (Figura 21b). Foram obtidos efeitos co-estimulatórios semelhantes utilizando células CHO que expressam B7RP-1 humana, membranar, contendo a sequência codificante integral (Figura 21c). A produção de citocinas por células T humanas sob as condições de proliferação in vitro acima foi determinada. Os sobrenadantes de culturas de células T estimuladas durante 48 e 72 horas foram analisados para IL-2, IL-10 e IFN-gama por ELISA, de acordo com as especificações do fabricante (BioSource International). Os níveis de IFN-gama e IL-10 foram significativamente aumentados; contudo, contrariamente ao caso com a co-estimulação de CD28, a IL-2 não foi induzida de um modo notável (Figura 21d). Os níveis aumentados de IFN-gama, uma citocina de Thl, correlacionam-se com as funções de B7RP-1 para aumentar IgG2a, como descrito no Exemplo 13.
Os ensaios de co-estimulação de célula T in vitro foram conduzidos como se segue. As células T humanas altamente purificadas (>98% de CD3+) foram isoladas por selecção negativa de PBMC deplecionadas de aderência, frescas ou descongeladas, utilizando esferas magnéticas marcadas com mAb (Miltenyi Biotec). As células T (1 x 105 células/poço) foram cultivadas em poços em triplicado em placas de 96 poços em 200 pL/poço de RPMI + FCS a 10%. Para avaliar a co-estimulação de B7RP-1-Fc, diversas concentrações de anti-CD3 (Pharmingen) e 10 pg/mL de Fc de IgG anti- humana (Sigma) , em 100 pL de lx PBS, foram pré-revestidas em placas de fundo em U por uma incubação, a 4 °C, de um dia para o outro. As Fc de igG, anti-CD3 e anti-humana, nao ligadas foram removidas e as células foram cultivadas na presença ou ausência de diversas concentrações de 114 B7RP-1-Fc, controlo de OPG-Fc ou anti-CD28 (Pharmingen). Para inibição de CRP-l-Fc de co-estimulação de B7RP-1-FC, as células T foram cultivadas em poços pré-revestidos com Fc de IgG anti-CD3 a 0,33 pg/mL e anti-humana a 10 pg/mL, com B7RP-1-Fc a 0,5 pg/mL na presença de CRP-l-Fc ou OPG-Fc serialmente diluídas, começando a 10 pg/mL. Para avaliar a co-estimulação por células CHO expressando B7RP-1, as células T foram cultivadas em placas de fundo plano com diversas concentrações de anti-CD3 solúvel, na presença ou ausência de diversas quantidades de células CHO de B7RP-1 tratadas com mitomicina C ou células CHO de vector. Para testar para proliferação de célula T, as culturas foram pulsadas com 1 pCi/poço de [3H]TdR, durante as últimas 18 h de uma cultura de 72 h. A proliferação de célula T foi determinada por incorporação de [3H]TdR. Os resultados de uma experiência representativa de três dadores aleatórios são expressos como CPM média incorporada +/- SD. Para análises de produção de citocina, as células foram cultivadas durante 48 e 72 horas e os sobrenadantes foram recolhidos para ELISA.
Estas experiências mostram que a porção extracelular de B7RP-1 humana, como descrito no Exemplo 14, quando fundida a um fragmento de Fc humano, pode co-estimular as células T in vitro. Esta co-estimulação é inibida por CRP-l-Fc e, deste modo, demonstra como um inibidor solúvel de B7RP-1 humana pode funcionar. Os ensaios in vitro, tal como aquele aqui descrito, utilizando B7RP-1 e CRP-1 humanas, poderiam ser utilizados para rastrear para inibidores de anticorpo, proteína solúvel, pepticorpos ou molécula pequena da actividade de B7RP-1/CRP-1. 115 LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> AMGEN INC.
<120> NOVOS PÉPTIDOS ENVOLVIDOS NA RESPOSTA IMUNITÁRIA
<130> A-579A <140> 09/264527 <141> 1999-03-08 <160> 35 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 600 <212> ADN <213> murganho <220>
<221> CDS <222> Complemento ((1)..(600)) <400> 1 atg aag ccg tac ttc tgc cgt gtc ttt gtc ttc tgc ttc cta ate aga 48 Met 1 Lys Pro Tyr Phe 5 Cys Arg Vai Phe Vai 10 Phe Cys Phe Leu Ile 15 Arg Ctt tta aca gga gaa ate aat ggc teg gee gat cat agg atg ttt tea 96 Leu Leu Thr Gly 20 Glu Ile Asn Gly Ser 25 Ala Asp His Arg Met 30 Phe Ser ttt cac aat gga ggt gta cag att tet tgt aaa tac cct gag act gtc 144 Phe His Asn 35 Gly Gly Vai Gin Ile 40 Ser Cys Lys Tyr Pro 45 Glu Thr Vai 116 192 192 cag cag tta aaa atg cga Gin Gin 50 Leu Lys Met Arg ctc acc aag acc aag gga Leu 65 Thr Lys Thr Lys Gly 70 atg ctc tgt cta tat cat Met Leu Cys Leu Tyr 85 His aac aac cca gac age tcc Asn Asn Pro Asp 100 Ser Ser att ttt gac cca cct cct Ile Phe Asp 115 Pro Pro Pro ttg cat att tat gaa tcc Leu His 130 Ile Tyr Glu Ser ccc gta ggg tgt gca gct Pro 145 Vai Gly Cys Ala Ala 150 ctt ate ate tgg ttt tca Leu Ile Ile Trp Phe 165 Ser cct aat agt gaa tac atg Pro Asn Ser Glu 180 Tyr Met tet aga ctt gca ggt gtg Ser Arg Leu 195 <210> 2 <211> 200 <212> PRT Ala Gly Vai ttg ttc aga gag aga gaa Leu 55 Phe Arg Glu Arg Glu 60 age gga aat gcg gtg tcc Ser Gly Asn Ala Vai 75 Ser ctg tca aac aac age gtc Leu Ser Asn Asn 90 Ser Vai cag gga age tat tac ttc Gin Gly Ser 105 Tyr Tyr Phe ttt caa gaa agg aac ctt Phe Gin 120 Glu Arg Asn Leu cag ctc tgc tgc cag ctg Gin 135 Leu Cys Cys Gin Leu 140 ttc gtt gtg gta ctc Ctt Phe Vai Vai Vai Leu 155 Leu gtc ctc tgc gaa Vai Leu Cys Glu ttt gga tgc ata 480 Phe Gly Cys Ile 160 aaa aag aaa tac gga tcc Lys Lys Lys Tyr Gly Ser 170 ttc atg gcg gca gtc aac Phe Met Ala Ala Vai Asn 185 acc tca Thr Ser 200 ate aag aat cca 240 11e Lys Asn Pro 80 tet ttt ttc cta 288
Ser Phe Phe Leu 95 tgc age ctg tcc 336
Cys Ser Leu Ser 110 agt çga gga tat 384
Ser Gly Gly Tyr 125 aag ctc tgg cta 432
Lys Leu Trp Leu agt gtg cat gac 528 Ser Vai His Asp 175 aca aac aaa aag 576 Thr Asn Lys Lys 190 600 <213> murganho <400> 2
Met 1 Lys Pro Tyr Phe 5 Cys Arg Vai Phe Vai 10 Phe Cys Phe Leu Ile 15 Arg Leu Leu Thr Gly 20 Glu Ile Asn Gly Ser 25 Ala Asp His Arg Met 30 Phe Ser Phe His Asn 35 Gly Gly Vai Gin Ile 40 Ser Cys Lys Tyr Pro 45 Glu Thr Vai 117
Gin Gin 50 Leu Lys Met Arg Leu 55 Phe Arg Glu Arg Glu 60 Vai Leu Cys Glu Leu 65 Thr Lys Thr Lys Gly 70 Ser Gly Asn Ala Vai 75 Ser Ile Lys Asn Pro 80 Met Leu Cys Leu Tyr 85 His Leu Ser Asn Asn 90 Ser Vai Ser Phe Phe 95 Leu Asn Asn Pro Asp 100 Ser Ser Gin Gly Ser 105 Tyr Tyr Phe Cys Ser 110 Leu Ser Ile Phe Asp 115 Pro Pro Pro Phe Gin 120 Glu Arg Asn Leu Ser 125 Gly Gly Tyr Leu His 130 Ile Tyr Glu Ser Gin 135 Leu Cys Cys Gin Leu 140 Lys Leu Trp Leu Pro 145 Vai Gly Cys Ala Ala 150 Phe Vai Vai Vai Leu 155 Leu Phe Gly Cys Ile 160 Leu Ile Ile Trp Phe 165 Ser Lys Lys Lys Tyr 170 Gly Ser Ser Vai His 175 Asp Pro Asn Ser Glu 180 Tyr Met Phe Met Ala 185 Ala Vai Asn Thr Asn 190 Lys Lys Ser Arg Leu Ala Gly Vai Thr Ser 195 <210> 3 <211> 200 <212> PRT <213> murganho <400> 3
Met 1 Lys Pro Tyr Phe 5 Cys Arg Vai Phe Vai 10 Phe Cys Phe Leu Ile 15 Arg Leu Leu Thr Gly 20 Glu Ile Asn Gly Ser 25 Ala Asp His Arg Met 30 Phe Ser Phe His Asn 35 Gly Gly Vai Gin Ile 40 Ser Cys Lys Tyr Pro 45 Glu Thr Vai Gin Gin 50 Leu Lys Met Arg Leu 55 Phe Arg Glu Arg Glu 60 Vai Leu Cys Glu 118
Leu Thr Lys Thr Lys Gly Ser Gly Asn Ala Vai Ser Ile Lys Asn Pro 65 70 75 80
Met Leu Cys Leu Tyr His Leu Ser Asn Asn Ser Vai Ser Phe Phe Leu 85 90 95
Asn Asn Pro Asp Ser Ser Gin Gly Ser Tyr Tyr Phe Cys Ser Leu Ser 100 105 110
Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Gin Glu Arg Asn Leu Ser Gly Gly Tyr 115 120 125
Leu His Ile Tyr Glu Ser Gin Leu Cys Cys Gin Leu Lys Leu Trp Leu 130 135 140
Pro Vai Gly Cys Ala Ala Phe Vai Vai Vai Leu Leu Phe Gly Cys Ile 145 150 155 160
Leu Ile Ile Trp Phe Ser Lys Lys Lys Tyr Gly Ser Ser Vai His Asp 165 170 175
Pro Asn Ser Glu Tyr Met Phe Met Ala Ala Vai Asn Thr Asn Lys Lys 180 185 190
Ser Arg Leu Ala Gly Vai Thr Ser 195 200 <210> 4 <211> 218 <212> PRT <213> murganho <400> 4
Met 1 Thr Leu Arg Leu 5 Leu Phe Leu Ala Leu 10 Asn Phe Phe Ser Vai 15 Gin Vai Thr Glu Asn 20 Lys ile Leu Vai Lys 25 Gin Ser Pro Leu Leu 30 Vai Vai Asp Ser Asn 35 Glu Vai Ser Leu Ser 40 Cys Arg Tyr Ser Tyr 45 Asn Leu Leu Ala Lys 50 Glu Phe Arg Ala Ser 55 Leu Tyr Lys Gly Vai 60 Asn Ser Asp Vai Glu 65 Vai Cys Vai Gly Asn 70 Gly Asn Phe Thr Tyr 75 Gin Pro Gin Phe Arg 80 119
Ser Asn Ala Glu Phe 85 Asn Cys Asp Gly Asp 90 Phe Asp Asn Glu Thr 95 Vai Thr Phe Arg Leu 100 Trp Asn Leu His Vai 105 Asn His Thr Asp Ile 110 Tyr Phe Cys Lys Ile 115 Glu Phe Met Tyr Pro 120 Pro Pro Tyr Leu Asp 125 Asn Glu Arg Ser Asn 130 Gly Thr Ile Ile His 135 Ile Lys Glu Lys His 140 Leu Cys His Thr Gin 145 Ser Ser Pro Lys Leu 150 Phe Trp Ala Leu Vai 155 Vai Vai Ala Gly Vai 160 Leu Phe Cys Tyr Gly 165 Leu Leu Vai Thr Vai 170 Ala Leu Cys Vai Ile 175 Trp Thr Asn Ser Arg 180 Arg Asn Arg Leu Leu 185 Gin Vai Thr Thr Met 190 Asn Met Thr Pro Arg 195 Arg Pro Gly Leu Thr 200 Arg Lys Pro Tyr Gin 205 Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro 210 215
<210> 5 <211> 234 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 5
Met 1 Xaa Xaa Xaa Xaa 5 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 10 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 Arg Leu Leu Xaa Xaa 20 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 25 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 40 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 45 Xaa Xaa Xaa 120
Vai Xaa 50 Xaa Ser Cys Xaa Tyr 55 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 Xaa Xaa Leu Xaa Xaa 70 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 75 Vai Xaa Xaa Cys Xaa 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 90 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 95 Xaa Xaa Xaa Cys Xaa 100 Xaa Xaa Xaa Xaa Asn 105 Xaa Xaa Vai Xaa Phe 110 Xaa Leu Xaa Asn Xaa 115 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 120 Xaa Xaa Tyr Phe Cys 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 130 Xaa Pro Pro Pro Xaa 135 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 140 Ser Xaa Gly Xaa Xaa 145 Xaa His Ile Xaa Glu 150 Xaa Xaa Leu Cys Xaa 155 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 160 Lys Leu Xaa Trp Xaa 165 Leu Xaa Vai Xaa Xaa 170 Xaa Xaa Xaa Phe Xaa 175 Xaa Xaa Xaa Leu Leu 180 Xaa Xaa Xaa Xaa Leu 185 Xaa Xaa Ile Trp Xaa 190 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 200 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 205 Xaa Pro Xaa Xaa Xaa 210 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 215 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 220 Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 225 230 <210> 6 <211> 966 <212> ADN <213> murganho <2 2 0>
<221> CDS <222> Complemento ((1)..(966)) 121 <400> 6 atg cag cta aag tgt ccc tgt ttt gtg tcc ttg gga acc agg cag cct 48 Met 1 Gin Leu Lys Cys 5 Pro Cys Phe Val Ser 10 Leu Gly Thr Arg Gin 15 Pro gtt tgg aag aag etc cat gtt tet age ggg ttc ttt tet ggt ctt ggt 96 Vai Trp Lys Lys 20 Leu His Vai Ser Ser 25 Gly Phe Phe Ser Gly 30 Leu Gly ctg ttc ttg ctg ctg ttg age age etc tgt gct gee tet gea gag act 144 Leu Phe Leu 35 Leu Leu Leu Ser Ser 40 Leu Cys Ala Ala Ser 45 Ala Glu Thr gaa gtc ggt gea atg gtg ggc age aat gtg gtg etc age tgc att gac 192 Glu Vai 50 Gly Ala Met Vai Gly 55 Ser Asn Val Val Leu 60 Ser Cys Ile Asp ccc cac aga ege cat ttc aac ttg agt ggt ctg tat gtc tat tgg caa 240 Pro 65 His Arg Arg His Phe 70 Asn Leu Ser Gly Leu 75 Tyr Val Tyr Trp Gin 80 ate gaa aac cca gaa gtt teg gtg act tac tac ctg cct tac aag tet 288 Ile Glu Asn Pro Glu 85 Vai Ser Vai Thr Tyr 90 Tyr Leu Pro Tyr Lys 95 Ser cca ggg ate aat gtg gac agt tcc tac aag aac agg ggc cat ctg tcc 336 Pro Gly He Asn 100 Vai Asp Ser Ser Tyr 105 Lys Asn Arg Gly His 110 Leu Ser ctg gac tcc atg aag cag ggt aac ttc tet ctg tac ctg aag aat gtc 384 Leu Asp Ser 115 Met Lys Gin Gly Asn 120 Phe Ser Leu Tyr Leu 125 Lys Asn Val acc cct cag gat acc cag gag ttc aca tgc cgg gta ttt atg aat aca 432 Thr Pro 130 Gin Asp Thr Gin Glu 135 Phe Thr Cys Arg Val 140 Phe Met Asn Thr gee aca gag tta gtc aag ate ttg gaa gag gtg gtc agg ctg cgt gtg 480 Ala 145 Thr Glu Leu Vai Lys 150 Ile Leu Glu Glu Val 155 Val Arg Leu Arg Val 160 gea gea aac ttc agt aca cct gtc ate age acc tet gat age tcc aac 528 Ala Ala Asn Phe Ser 165 Thr Pro Val Ile Ser 170 Thr Ser Asp Ser Ser 175 Asn ccg ggc cag gaa cgt acc tac acc tgc atg tcc aag aat ggc tac cca 576 Pro Gly Gin Glu 180 Arg Thr Tyr Thr Cys 185 Met Ser Lys Asn Gly 190 Tyr Pro gag ccc aac ctg tat tgg ate aac aca acg gac aat age cta ata gac 624 Glu Pro Asn 195 Leu Tyr Trp Ile Asn 200 Thr Thr Asp Asn Ser 205 Leu Ile Asp acg gct ctg cag aat aac act gtc tac ttg aac aag ttg ggc ctg tat 672 Thr Ala 210 Leu Gin Asn Asn Thr 215 Val Tyr Leu Asn Lys 220 Leu Gly Leu Tyr gat gta ate age aca tta agg etc cct tgg aca tet cgt ggg gat gtt 720 Asp 225 Vai Ile Ser Thr Leu 230 Arg Leu Pro Trp Thr 235 Ser Arg Gly Asp Val 240 122 ctg tgc tgc gta gag aat gtg gct ctc cac cag aac ate act age att 768 Leu Cys Cys Vai Glu 245 Asn Vai Ala Leu His 250 Gin Asn Ile Thr Ser 255 Ile age cag gea gaa agt ttc act gga aat aac aca aag aac cca cag gaa 816 Ser Gin Ala Glu 260 Ser Phe Thr Gly Asn 265 Asn Thr Lys Asn Pro 270 Gin Glu acc cac aat aat gag tta aaa gtc ctt gtc ccc gtc ctt gct gta ctg 864 Thr HiS Asn 275 Asn Glu Leu Lys Vai 280 Leu Vai Pro Vai Leu 285 Ala Vai Leu gcg gea gcg gea ttc gtt tcc ttc ate ata tac aga ege acg cgt ccc 912 Ala Ala 290 Ala Ala Phe Vai Ser 295 Phe Ile Ile Tyr Arg 300 Arg Thr Arg Pro cac cga age tat aca gga ccc aag act gta cag ctt gaa ctt aca gac 960 His 305 cac His Arg gee Ala Ser Tyr Thr Gly 310 Pro Lys Thr Vai Gin 315 Leu Glu Leu Thr Asp 320 966 <210> 7 <211> 322 <212> PRT <213> murganho <400> 7
Met Gin Leu Lys Cys Pro Cys Phe Vai Ser Leu Gly Thr Arg Gin Pro 15 10 15
Vai Trp Lys Lys Leu His Vai Ser Ser Gly Phe Phe Ser Gly Leu Gly 20 25 30
Leu Phe Leu Leu Leu Leu Ser Ser Leu Cys Ala Ala Ser Ala Glu Thr 35 40 45
Glu Vai 50 Gly Ala Met Vai Gly 55 Ser Asn Vai Vai Leu 60 Ser Cys Ile Asp Pro 65 His Arg Arg His Phe 70 Asn Leu Ser Gly Leu 75 Tyr Vai Tyr Trp Gin 80 Ile Glu Asn Pro Glu 85 Vai Ser Vai Thr Tyr 90 Tyr Leu Pro Tyr Lys 95 Ser Pro Gly Ile Asn 100 Vai Asp Ser Ser Tyr 105 Lys Asn Arg Gly His 110 Leu Ser 123
Leu Asp Ser 115 Met Lys Gin Gly Asn 120 Phe Ser Leu Tyr Leu 125 Lys Asn Val Thr Pro 130 Gin Asp Thr Gin Glu 135 Phe Thr Cys Arg Val 140 Phe Met Asn Thr Ala 145 Thr Glu Leu Vai Lys 150 Ile Leu Glu Glu Val 155 Val Arg Leu Arg Val 160 Ala Ala Asn Phe Ser 165 Thr Pro Val Ile Ser 170 Thr Ser Asp Ser Ser 175 Asn Pro Gly Gin Glu 180 Arg Thr Tyr Thr Cys 185 Met Ser Lys Asn Gly 190 Tyr Pro Glu Pro Asn 195 Leu Tyr Trp Ile Asn 200 Thr Thr Asp Asn Ser 205 Leu Ile Asp Thr Ala 210 Leu Gin Asn Asn Thr 215 Val Tyr Leu Asn Lys 220 Leu Gly Leu Tyr Asp 225 Vai Ile Ser Thr Leu 230 Arg Leu Pro Trp Thr 235 Ser Arg Gly Asp Val 240 Leu Cys Cys Vai Glu 245 Asn Val Ala Leu His 250 Gin Asn Ile Thr Ser 255 Ile Ser Gin Ala Glu 260 Ser Phe Thr Gly Asn 265 Asn Thr Lys Asn Pro 270 Gin Glu Thr His Asn 275 Asn Glu Leu Lys Val 280 Leu Val Pro Val Leu 285 Ala Val Leu Ala Ala 290 Ala Ala Phe Val Ser 295 Phe Ile Ile Tyr Arg 300 Arg Thr Arg Pro His 305 Arg Ser Tyr Thr Gly 310 Pro Lys Thr Val Gin 315 Leu Glu Leu Thr Asp 320
His Ala <210> 8 <211> 322 <212> PRT <213> murganho <400> 8
Met Gin Leu Lys Cys Pro Cys Phe Vai Ser Leu Gly Thr Arg Gin Pro 15 10 15 124
Vai Trp Lys Lys Leu His Vai Ser 20
Ser Gly Phe Phe Ser Gly Leu Gly 25 30
Leu Phe Leu Leu Leu Leu Ser Ser 35 40
Leu Cys Ala Ala Ser Ala Glu Thr 45
Glu Vai Gly Ala Met Vai Gly Ser 50 55
Pro His Arg Arg His Phe Asn Leu 65 70
Ile Glu Asn Pro Glu Vai Ser Vai 85
Pro Gly Ile Asn Vai Asp Ser Ser 100
Leu Asp Ser Met Lys Gin Gly Asn 115 120
Thr Pro Gin Asp Thr Gin Glu Phe 130 135
Ala Thr Glu Leu Vai Lys Ile Leu 145 150
Ala Ala Asn Phe Ser Thr Pro Vai 165
Pro Gly Gin Glu Arg Thr Tyr Thr 180
Glu Pro Asn Leu Tyr Trp Ile Asn 195 200
Thr Ala Leu Gin Asn Asn Thr Vai 210 215
Asp Vai Ile Ser Thr Leu Arg Leu 225 230
Leu Cys Cys Vai Glu Asn Vai Ala 245
Ser Gin Ala Glu Ser Phe Thr Gly 260
Thr His Asn Asn Glu Leu Lys Vai 275 280
Ala Ala Ala Ala Phe Vai Ser Phe 290 295
His Arg Ser Tyr Thr Gly Pro Lys 305 310
His Ala
Asn Vai Vai Leu Ser Cys Ile Asp 60
Ser Gly Leu Tyr Vai Tyr Trp Gin 75 80
Thr Tyr Tyr Leu Pro Tyr Lys Ser 90 95
Tyr Lys Asn Arg Gly His Leu Ser 105 110
Phe Ser Leu Tyr Leu Lys Asn Vai 125
Thr Cys Arg Vai Phe Met Asn Thr 140
Glu Glu Vai Vai Arg Leu Arg Vai 155 160
Ile Ser Thr Ser Asp Ser Ser Asn 170 175
Cys Met Ser Lys Asn Gly Tyr Pro 185 190
Thr Thr Asp Asn Ser Leu Ile Asp 205
Tyr Leu Asn Lys Leu Gly Leu Tyr 220
Pro Trp Thr Ser Arg Gly Asp Vai 235 240
Leu His Gin Asn Ile Thr Ser Ile 250 255
Asn Asn Thr Lys Asn Pro Gin Glu 265 270
Leu Vai Pro Vai Leu Ala Vai Leu 285
Ile Ile Tyr Arg Arg Thr Arg Pro 300
Thr Vai Gin Leu Glu Leu Thr Asp 315 320 125 <210> 9 <211> 306 <212> PRT <213> murganho <400> 9
Met 1 Ala Cys Asn Cys 5 Gin Leu Met Gin Asp 10 Thr Pro Leu Leu Lys 15 Phe Pro Cys Pro Arg 20 Leu Ile Leu Leu Phe 25 Val Leu Leu Ile Arg 30 Leu Ser Gin Vai Ser 35 Ser Asp Val Asp Glu 40 Gin Leu Ser Lys Ser 45 Val Lys Asp Lys Vai 50 Leu Leu Pro Cys Arg 55 Tyr Asn Ser Pro His 60 Glu Asp Glu Ser Glu 65 Asp Arg Ile Tyr Trp 70 Gin Lys His Asp Lys 75 Val Val Leu Ser Val 80 Ile Ala Gly Lys Leu 85 Lys Val Trp Pro Glu 90 Tyr Lys Asn Arg Thr 95 Leu Tyr Asp Asn Thr 100 Thr Tyr Ser Leu Ile 105 Ile Leu Gly Leu Val 110 Leu Ser ASp Arg Gly 115 Thr Tyr Ser Cys Val 120 Val Gin Lys Lys Glu 125 Arg Gly Thr Tyr Glu 130 Vai Lys His Leu Ala 135 Leu Val Lys Leu Ser 140 Ile Lys Ala Asp Phe 145 Ser Thr Pro Asn Ile 150 Thr Glu Ser Gly Asn 155 Pro Ser Ala Asp Thr 160 Lys Arg Ile Thr Cys 165 Phe Ala Ser Gly Gly 170 Phe Pro Lys Pro Arg 175 Phe Ser Trp Leu Glu 180 Asn Gly Arg Glu Leu 185 Pro Gly Ile Asn Thr 190 Thr Ile Ser Gin Asp 195 Pro Glu Ser Glu Leu 200 Tyr Thr Ile Ser Ser 205 Gin Leu Asp Phe Asn 210 Thr Thr Arg Asn His 215 Thr Ile Lys Cys Leu 220 Ile Lys Tyr Gly Asp Ala 225 His Vai Ser Glu 230 Asp Phe Thr Trp Glu 235 Lys Pro Pro Glu Asp 240 126
Pro Pro Asp Ser Lys 245 Asn Thr Leu Val Leu 250 Phe Gly Ala Gly Phe 255 Gly Ala Vai Ile Thr 260 Vai Val Val Ile Val 265 Val Ile Ile Lys Cys 270 Phe Cys Lys His Arg 275 Ser Cys Phe Arg Arg 280 Asn Glu Ala Ser Arg 285 Glu Thr Asn Asn Ser 290 Leu Thr Phe Gly Pro 295 Glu Glu Ala Leu Ala 300 Glu Gin Thr Val
Phe Leu 305 <210> 10 <211> 327 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 10
Met 1 Xaa Xaa Xaa Cys 5 Xaa Cys Xaa Xaa Xaa 10 Leu Xaa Xaa Xaa Xaa 15 Pro Xaa Xaa Xaa Xaa 20 Leu Xaa Xaa Xaa Xaa 25 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 30 Leu Xaa Leu Phe Xaa 35 Leu Leu Xaa Xaa Xaa 40 Ser Xaa Xaa Xaa Xaa 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 Xaa Xaa Xaa Xaa Val 55 Xaa Xaa Xaa Val Xaa 60 Leu Xaa Cys Xaa Xaa 65 Xaa Xaa Xaa Xaa His 70 Xaa Xaa Xaa Ser Xaa 75 Xaa Xaa Xaa Tyr Trp 80 Gin Xaa Xaa Xaa Xaa 85 Xaa Val Xaa Xaa Xaa 90 Xaa Xaa Leu Xaa Xaa 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 Xaa Val Xaa Xaa Xaa 105 Tyr Lys Asn Arg Xaa 110 Xaa Xaa 127
Xaa Leu Xaa 115 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 120 Xaa Xaa Ser Leu Xaa 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 130 Xaa Xaa Asp Xaa Xaa 135 Xaa Xaa Xaa Cys Xaa 140 Val Xaa Xaa Xaa Xaa 145 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 150 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 155 Xaa Val Xaa Leu Xaa 160 Xaa Xaa Ala Xaa Phe 165 Ser Thr Pro Xaa Ile 170 Xaa Xaa Ser Xaa Xaa 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 Xaa Arg Xaa Xaa Thr 185 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 190 Gly Xaa Pro Xaa Pro 195 Xaa Xaa Xaa Trp Xaa 200 Xaa Asn Xaa Xaa Xaa 205 Xaa Xaa Xaa Ile Xaa 210 Thr Xaa Xaa Xaa Xaa 215 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 220 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 225 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 230 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 235 Xaa Thr Xaa Xaa Xaa 240 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 245 Xaa Xaa Xaa val Xaa 250 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 255 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 260 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 265 Xaa Asn Xaa Xaa Xaa 270 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Val Xaa Val xaa Xaa 275 280 285 Xaa Xaa 290 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 295 Xaa Xaa Xaa Phe Xaa 300 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 305 Arg Xaa Xaa Xaa Xaa 310 Ser Xaa Thr Xaa Gly 315 Pro Xaa Xaa Xaa Xaa 320 Xaa Glu Xaa Thr Xaa Xaa Xaa 325 <210> 11 <211> 864 <212> ADN <213> murganho <22 0>
<221> CDS <222> Complemento ((1)..(864)) 128 <40 0> 11 atg Met 1 cgg Arg ctg Leu ggc Gly agt Ser 5 cct Pro cga Arg gct Ala gat Asp act Thr 20 cag Gin gag Glu gtg Vai gag Glu ctc Leu 35 age Ser tgc Cys gct Ala gat Asp gtt Vai 50 tac Tyr gta Vai tat Tyr tgg Trp tac Tyr 65 cac His ate Ile cca Pro cag Gin aac Asn 70 cgg Arg aac Asn cga Arg gcc Ala ctg Leu 85 atg Met tcc Ser ctg Leu ege Arg ttg Leu 100 ttc Phe aac Asn tgc Cys ctg Leu gtg Vai 115 ttg Leu age Ser caa Gin gag Glu gtt Vai 130 aca Thr ctg Leu cat His gtg Vai gcc Ala 145 ccc Pro cac His age Ser ccc Pro tcc Ser 150 ata Ile aac Asn ggc Gly tac Tyr ccc Pro agg Arg 165 aac Asn age Ser ctg Leu ctg Leu 180 gac Asp cag Gin atg Met cgg Arg ggc Gly 195 ttg Leu tat Tyr gac Asp ccc Pro age Ser 210 gtg Vai aac Asn att Ile ggc Gly aac Asn 225 ctg Leu act Thr gtc Vai ggc Gly age Ser 230 gga ctg ctc ttc ctg ctc Gly Leu Leu Phe 10 Leu Leu aag gaa gtc aga gcg atg Lys Glu Vai 25 Arg Ala Met tgc cct gaa gga age cgt Cys Pro 40 Glu Gly Ser Arg caa acc agt gag teg aaa Gin 55 Thr Ser Glu Ser Lys 60 açc tcc ttg gaa aac gtg Ser Ser Leu Glu Asn 75 Vai tea ceg gcc ggc atg ctg Ser Pro Ala Gly 90 Met Leu gtc acc ccc cag gac gag Vai Thr Pro 105 Gin Asp Glu tcc ctg gga ttc cag gag Ser Leu 120 Gly Phe Gin Glu gea gea aac ttc age gtg Ala 135 Ala Asn Phe Ser Vai 140 cag gat gag ctc acc ttc Gin Asp Glu Leu Thr 155 Phe ccc aac gtg tac tgg ate Pro Asn Vai Tyr Trp Ile 170 gct ctg cag aat gac acc Ala Leu Gin 185 Asn Asp Thr gtg gtc age gtg ctg agg Vai Vai 200 Ser Vai Leu Arg tgc tgc ata gag aac gtg Cys 215 Cys Ile Glu Asn Vai 220 cag aca gga aat gac ate Gin Thr Gly Asn Asp 235 Ile ttc Phe age Ser age Ser 15 ctt Leu 48 gta Vai ggc Gly 30 age Ser gac Asp 96 ttt Phe 45 gat Asp tta Leu aat Asn 144 acc Thr gtg Vai gtg Vai acc Thr 192 gac Asp age Ser ege Arg tac Tyr 80 240 cgg Arg ggc Gly gac Asp 95 ttc Phe 288 cag Gin aag Lys 110 ttt Phe cac His 336 gtt Vai 125 ttg Leu age Ser gtt Vai 384 ccc Pro gtc Vai gtc Vai age Ser 432 acg Thr tgt Cys aca Thr tcc Ser 160 480 aat Asn aag Lys acg Thr gac Asp 528 175 gtc Vai ttc Phe 190 ttg Leu aac Asn 576 ate Ile 205 gea Ala cgg Arg acc Thr 624 ctt Leu ctg Leu cag Gin cag Gin 672 gga Gly gag Glu aga gac Arg Asp 240 720 129 aag ate aca gag aat cca gtc agt acc ggc gag aaa aac gcg gee acg 768 Lys Ile Thr Glu Asn 245 Pro Vai Ser Thr Gly 250 Glu Lys Asn Ala Ala 255 Thr tgg age ate ctg gct gtc ctg tgc ctg ctt gtg gtc gtg gcg gtg gee 816 Trp Ser Ile Leu 260 Ala Vai Leu Cys Leu 265 Leu Vai Vai Vai Ala 270 Vai Ala ata ggc tgg gtg tgc agg gac cga tgc ctc caa cac age tat gea ggt 864 Ile Gly Trp 275 Vai Cys Arg Asp Arg 280 Cys Leu Gin His Ser 285 Tyr Ala Gly <210> 12 <211> 288 <212> PRT <213> murganho <40 0> 12
Leu Leu Phe Ser Ser 15 Leu Ala Met Vai Gly 30 Ser Asp Ser Arg Phe 45 Asp Leu Asn Ser Lys 60 Thr Vai Val Thr Asn 75 Vai Asp Ser Arg Tyr 80 Met Leu Arg Gly Asp 95 Phe Asp Glu Gin Lys 110 Phe His Gin Glu Vai 125 Leu Ser Val Ser Vai 140 Pro Val Val Ser Thr 155 Phe Thr Cys Thr Ser 160 Trp Ile Asn Lys Thr 175 Asp
Met Arg Leu Gly Ser Pro Gly Leu Leu Phe 15 10
Arg Ala Asp Thr Gin Glu Lys Glu Vai Arg 20 25
Vai Glu Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly 35 40
Asp Vai Tyr Vai Tyr Trp Gin Thr Ser Glu 50 55
Tyr His Ile Pro Gin Asn Ser Ser Leu Glu 65 70
Arg Asn Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly 85 90
Ser Leu Arg Leu Phe Asn Vai Thr Pro Gin 100 105
Cys Leu Vai Leu Ser Gin Ser Leu Gly Phe 115 120
Glu Vai Thr Leu His Vai Ala Ala Asn Phe 130 135
Ala Pro His Ser Pro Ser Gin Asp Glu Leu 145 150
Ile Asn Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Vai Tyr 165 170 130
Asn Ser Leu Leu 180 Asp Gin Ala Leu Gin 185 Asn Asp Thr Val Phe 190 Leu Asn Met Arg Gly 195 Leu Tyr Asp Val Val 200 Ser Val Leu Arg Ile 205 Ala Arg Thr Pro Ser 210 Vai Asn Ile Gly Cys 215 Cys Ile Glu Asn Val 220 Leu Leu Gin Gin Asn 225 Leu Thr Vai Gly Ser 230 Gin Thr Gly Asn Asp 235 Ile Gly Glu Arg Asp 240 Lys Ile Thr Glu Asn 245 Pro Val Ser Thr Gly 250 Glu Lys Asn Ala Ala 255 Thr Trp Ser Ile Leu 260 Ala Val Leu Cys Leu 265 Leu Val Val Val Ala 270 Val Ala Ile Gly Trp 275 Vai Cys Arg Asp Arg 280 Cys Leu Gin His Ser 285 Tyr Ala Gly <2 10> 13 <2 11> 267 <2 12> PRT <2 13> Humano <4 Λ O O 13
Glu 1 Lys Glu Val Arg 5 Ala Met Val Gly Ser 10 Asp Val Glu Leu Ser 15 Cys Ala Cys Pro Glu 20 Gly Ser Arg Phe Asp 25 Leu Asn Asp Val Tyr 30 Val Tyr Trp Gin Thr 35 Ser Glu Ser Lys Thr 40 Val Val Thr Tyr His 45 Ile Pro Gin Asn Ser 50 Ser Leu Glu Asn Val 55 Asp Ser Arg Tyr Arg 60 Asn Arg Ala Leu Met 65 Ser Pro Ala Gly Met 70 Leu Arg Gly Asp Phe 75 Ser Leu Arg Leu Phe 80 Asn Val Thr Pro Gin 85 Asp Glu Gin Lys Phe 90 His Cys Leu Val Leu 95 Ser Gin Ser Leu Gly 100 Phe Gin Glu Val Leu 105 Ser Val Glu Val Thr 110 Leu His Val Ala Ala 115 Asn Phe Ser Val Pro 120 Val Val Ser Ala Pro 125 His Ser Pro Ser Gin 130 Asp Glu Leu Thr Phe 135 Thr Cys Thr Ser Ile 140 Asn Gly Tyr Pro 131
Arg 145 Pro Asn Vai Tyr Trp 150 Ile Asn Lys Thr Asp 155 Asn Ser Leu Leu Asp 160 Gin Ala Leu Gin Asn 165 Asp Thr Vai Phe Leu 170 Asn Met Arg Gly Leu 175 Tyr Asp Vai Vai Ser 180 Vai Leu Arg Ile Ala 185 Arg Thr Pro Ser Vai 190 Asn Ile Gly Cys Cys 195 Ile Glu Asn Vai Leu 200 Leu Gin Gin Asn Leu 205 Thr Vai Gly Ser Gin 210 Thr Gly Asn Asp Ile 215 Gly Glu Arg Asp Lys 220 Ile Thr Glu Asn Pro 225 Vai Ser Thr Gly Glu 230 Lys Asn Ala Ala Thr 235 Trp Ser Ile Leu Ala 240 Vai Leu Cys Leu Leu 245 Vai Vai Vai Ala Vai 250 Ala Ile Gly Trp Vai 255 Cys Arg Asp Arg Cys Leu Gin His Ser Tyr Ala Gly 260 265 <210> 14 <211> 276 <212> PRT <213> murganho <400> 14
Glu 1 Thr Glu Val Gly 5 Ala Met Val Gly Ser 10 Asn Val Val Leu Ser 15 Cys Ile Asp Pro His 20 Arg Arg His Phe Asn 25 Leu Ser Gly Leu Tyr 30 Val Tyr Trp Gin Ile 35 Glu Asn Pro Glu Val 40 Ser Val Thr Tyr Tyr 45 Leu Pro Tyr Lys Ser 50 Pro Gly Ile Asn Val 55 Asp Ser Ser Tyr Lys 60 Asn Arg Gly His Leu 65 Ser Leu Asp Ser Met 70 Lys Gin Gly Asn Phe 75 Ser Leu Tyr Leu Lys 80 Asn Val Thr Pro Gin 85 Asp Thr Gin Glu Phe 90 Thr Cys Arg Val Phe 95 Met Asn Thr Ala Thr 100 Glu Leu Val Lys Ile 105 Leu Glu Glu Val Val 110 Arg Leu 132
Arg Vai Ala 115 Ala Asn Phe Ser Thr 120 Pro Vai Ile Ser Thr 125 Ser Asp Ser Ser Asn 130 Pro Gly Gin Glu Arg 135 Thr Tyr Thr Cys Met 140 Ser Lys Asn Gly Tyr 145 Pro Glu Pro Asn Leu 150 Tyr Trp Ile Asn Thr 155 Thr Asp Asn Ser Leu 160 Ile Asp Thr Ala Leu 165 Gin Asn Asn Thr Vai 170 Tyr Leu Asn Lys Leu 175 Gly Leu Tyr Asp Vai 180 Ile Ser Thr Leu Arg 185 Leu Pro Trp Thr Ser 190 Arg Gly Asp Vai Leu 195 Cys Cys Vai Glu Asn 200 Vai Ala Leu His Gin 205 Asn Ile Thr Ser Ile 210 Ser Gin Ala Glu Ser 215 Phe Thr Gly Asn Asn 220 Thr Lys Asn Pro Gin 225 Glu Thr His Asn Asn 230 Glu Leu Lys Vai Leu 235 Vai Pro Vai Leu Ala 240 Vai Leu Ala Ala Ala 245 Ala Phe Vai Ser Phe 250 Ile Ile Tyr Arg Arg 255 Thr Arg Pro His Arg 260 Ser Tyr Thr Gly Pro 265 Lys Thr Vai Gin Leu 270 Glu Leu Thr Asp His 275 Ala
<210> 15 <211> 280 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 15
Glu 1 Xaa Glu Vai Xaa 5 Ala Met Gly Vai Ser 10 Xaa Vai Xaa Leu Ser 15 Cys Xaa Xaa Pro Xaa 20 Xaa Xaa Xaa Phe Xaa 25 Leu Xaa Xaa Xaa Tyr 30 Vai Tyr 133
Trp Gin Xaa 35 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 40 Xaa Vai Thr Tyr Xaa 45 Xaa Pro Xaa Xaa Ser 50 Xaa Xaa Xaa Asn Vai 55 Asp Ser Xaa Tyr Xaa 60 Asn Arg Xaa Xaa Xaa 65 Ser Xaa Xaa Xaa Met 70 Xaa Xaa Gly Xaa Phe 75 Ser Leu Xaa Leu Xaa 80 Asn Vai Thr Pro Gin 85 Asp Xaa Gin Xaa Phe 90 Xaa Cys Xaa Vai Xaa 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 105 Leu Xaa Xaa Xaa Vai 110 Xaa Leu Xaa Vai Ala 115 Ala Asn Phe Ser Xaa 120 Pro Vai Xaa Ser Xaa 125 Xaa Xaa Ser Xaa Xaa 130 Xaa Xaa Xaa Glu Xaa 135 Thr Xaa Thr Cys Xaa 140 Ser Xaa Asn Gly Tyr 145 Pro Xaa Pro Asn Xaa 150 Tyr Trp Ile Asn Xaa 155 Thr Asp Asn Ser Leu 160 Xaa Asp Xaa Ala Leu 165 Gin Asn Xaa Thr Vai 170 Xaa Leu Asn Xaa Xaa 175 Gly Leu Tyr Asp Vai Xaa Ser Xaa Leu Arg Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Xaa 195 Cys Cys Xaa Glu Asn 200 Vai Xaa Leu Xaa Gin 205 Asn Xaa Thr Xaa Xaa 210 Ser Gin Xaa Xaa Xaa 215 Xaa Xaa Gly Xaa Xaa 220 Lys Xaa Xaa Xaa Xaa 225 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 230 Xaa Lys Xaa Xaa Xaa 235 Xaa Xaa Xaa Xaa Leu 240 Ala Vai Leu Xaa Xaa 245 Xaa Xaa Xaa Vai Xaa 250 Xaa Xaa Ile Xaa Xaa 255 Xaa Xaa Arg Xaa Arg 260 Xaa Xaa Xaa Xaa Ser 265 Tyr Xaa Gly Xaa Xaa 270 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 275 <210> 16 <211> 1294 <212> ADN <213> Humano 134 <220> <221> 5 ' UTR <222> (D .. (199) <220> <221> CDS <222> (200) . . (11 <400> 16 gctggtacgc ctgcaggtac cggtccggaa ttcccgggtc gacccacgcg tccgcccacg 60 cgtccgcggg agcgcagtta gagccgatct cccgcgcccc gaggttgctc ctctccgagg 120 tctcccgcgg cccaagttct ccgcgccccg aggtctccgc gccccgaggt ctccgcggcc 180 cgaggtctcc gcccgcacc atg cgg ctg ggc agt cct gga ctg ctc ttc ctg 232
Met Arg Leu Gly Ser Pro Gly Leu Leu Phe Leu 15 10 ctc ttc age age ctt cga gct gat act cag gag aag gaa gtc aga gcg 280 Leu Phe Ser Ser 15 Leu Arg Ala Asp Thr 20 Gin Glu Lys Glu Val 25 Arg Ala atg gta ggc age gac gtg gag ctc age tgc gct tgc cct gaa gga age 328 Met Vai Gly 30 Ser Asp Vai Glu Leu 35 Ser Cys Ala Cys Pro 40 Glu Gly Ser cgt ttt gat tta aat gat gtt tac gta tat tgg caa acc agt gag teg 376 Arg Phe 45 Asp Leu Asn Asp Vai 50 Tyr Val Tyr Trp Gin 55 Thr Ser Glu Ser aaa acc gtg gtg acc tac cac ate cca cag aac age tcc ttg gaa aac 424 Lys 60 Thr Vai Vai Thr Tyr 65 His Ile Pro Gin Asn 70 Ser Ser Leu Glu Asn 75 gtg gac age ege tac cgg aac cga gee ctg atg tea ccg gee ggc atg 472 Vai Asp Ser Arg Tyr 80 Arg Asn Arg Ala Leu 85 Met Ser Pro Ala Gly 90 Met ctg cgg ggc gac ttc tcc ctg ege ttg ttc aac gtc acc ccc cag gac 520 Leu Arg Gly Asp 95 Phe Ser Leu Arg Leu 100 Phe Asn Val Thr Pro 105 Gin Asp gag cag aag ttt cac tgc ctg gtg ttg age caa tcc ctg gga ttc cag 568 Glu Gin Lys 110 Phe His Cys Leu Val 115 Leu Ser Gin Ser Leu 120 Gly Phe Gin gag gtt ttg age gtt gag gtt aca ctg cat gtg gea gea aac ttc age 616 Glu Vai 125 Leu Ser Vai Glu Vai 130 Thr Leu His Val Ala 135 Ala Asn Phe Ser gtg ccc gtc gtc age gee ccc cac age ccc tcc cag gat gag ctc acc 664 Vai 140 Pro Vai Vai Ser Ala 145 Pro His Ser Pro Ser 150 Gin Asp Glu Leu Thr 155 135 ttc acg tgt aca tcc ata aac ggc tac ccc agg ccc aac gtg tac tgg 712 Phe Thr Cys Thr Ser 160 Ile Asn Gly Tyr Pro 165 Arg Pro Asn Vai Tyr 170 Trp ate aat aag acg gac aac age ctg ctg gac cag gct ctg cag aat gac 760 Ile Asn Lys Thr 175 Asp Asn Ser Leu Leu 180 Asp Gin Ala Leu Gin 185 Asn Asp acc gtc ttc ttg aac atg cgg ggc ttg tat gac gtg gtc age gtg ctg 808 Thr Vai Phe 190 Leu Asn Met Arg Gly 195 Leu Tyr Asp Vai Vai 200 Ser Vai Leu agg ate gea cgg acc ccc age gtg aac att ggc tgc tgc ata gag aac 856 Arg Ile 205 Ala Arg Thr Pro Ser 210 Vai Asn Ile Gly Cys 215 Cys Ile Glu Asn gtg ctt ctg cag cag aac ctg act gtc ggc age cag aca gga aat gac 904 Vai 220 Leu Leu Gin Gin Asn 225 Leu Thr Vai Gly Ser 230 Gin Thr Gly Asn Asp 235 ate gga gag aga gac aag ate aca gag aat cca gtc agt acc ggc gag 952 Ile Gly Glu Arg Asp 240 Lys Ile Thr Glu Asn 245 Pro Vai Ser Thr Gly 250 Glu aaa aac gcg gee acg tgg age ate ctg gct gtc ctg tgc ctg ctt gtg 1000 Lys Asn Ala Ala 255 Thr Trp Ser Ile Leu 260 Ala Vai Leu Cys Leu 265 Leu Vai gtc gtg gcg gtg gee ata ggc tgg gtg tgc agg gac cga tgc etc caa 1048 Vai Vai Ala 270 Vai Ala Ile Gly Trp 275 Vai Cys Arg Asp Arg 280 Cys Leu Gin cac age tat gea ggt gee tgg gct gtg agt ccg gag aca gag etc act 1096 His Ser 285 Tyr Ala Gly Ala Trp 290 Ala Vai Ser Pro Glu 295 Thr Glu Leu Thr ggc cac gtt tgaccggagc tcaccgccca gagcgtggac agggcttccg 1145
Gly His Vai 300 tgagacgcca ccgtgagagg ccaggtggca gcttgagcat ggactcccag actgcagggg 1205 agcacttggg gcagccccca gaaggaccac tgctggatcc cagggagaac ctgctggcgt 1265 tggctgtgat cctggaatga ggccctttc 1294 <210> 17 <211> 302 <212> PRT <213> Humano <400> 17
Met 1 Arg Leu Gly Ser 5 Pro Gly Leu Leu Phe 10 Leu Leu Phe Ser Ser 15 Leu Arg Ala Asp Thr 20 Gin Glu Lys Glu Vai 25 Arg Ala Met Vai Gly 30 Ser Asp 136
Vai Glu Leu 35 Ser Cys Ala Cys Pro 40 Glu Gly Ser Arg Phe 45 Asp Leu Asn Asp Vai 50 Tyr Vai Tyr Trp Gin 55 Thr Ser Glu Ser Lys 60 Thr val Val Thr Tyr 65 Hls Ile Pro Gin Asn 70 Ser Ser Leu Glu Asn 75 Vai Asp Ser Arg Tyr 80 Arg Asn Arg Ala Leu 85 Met Ser Pro Ala Gly Met 90 Leu Arg Gly Asp 95 Phe Ser Leu Arg Leu 100 Phe Asn Vai Thr Pro 105 Gin Asp Glu Gin Lys 110 Phe His Cys Leu Vai 115 Leu Ser Gin Ser Leu 120 Gly Phe Gin Glu Vai 125 Leu Ser Val Glu Vai 130 Thr Leu His Vai Ala 135 Ala Asn Phe Ser Vai 140 Pro Val Val Ser Ala 145 Pro His Ser Pro Ser 150 Gin Asp Glu Leu Thr 155 Phe Thr Cys Thr Ser 160 Ile Asn Gly Tyr Pro 165 Arg Pro Asn Vai Tyr 170 Trp Ile Asn Lys Thr 175 Asp Asn Ser Leu Leu 180 Asp Gin Ala Leu Gin 185 Asn Asp Thr Vai Phe 190 Leu Asn Met Arg Gly 195 Leu Tyr Asp Vai Vai 200 Ser Vai Leu Arg Ile 205 Ala Arg Thr Pro Ser 210 Vai Asn Ile Gly Cys 215 Cys Ile Glu Asn Vai 220 Leu Leu Gin Gin Asn 225 Leu Thr Vai Gly Ser 230 Gin Thr Gly Asn Asp 235 Ile Gly Glu Arg Asp 240 Lys Ile Thr Glu Asn 245 Pro Vai Ser Thr Gly 250 Glu Lys Asn Ala Ala 255 Thr Trp Ser Ile Leu 260 Ala Vai Leu Cys Leu 265 Leu Vai Vai Vai Ala 270 Val Ala Ile Gly Trp 275 Vai Cys Arg Asp Arg 280 Cys Leu Gin His Ser 285 Tyr Ala Gly Ala Trp 290 Ala Vai Ser Pro Glu 295 Thr Glu Leu Thr Gly 300 His Val <210> 18 <211> 302 <212> PRT <213> Humano 137 <40 0> 18
Met Arg Leu Gly Ser Pro Gly Leu 1 5
Arg Ala Asp Thr Gin Glu Lys Glu 20
Vai Glu Leu Ser Cys Ala Cys Pro 35 40
Asp Vai Tyr Vai Tyr Trp Gin Thr 50 55
Tyr His Ile Pro Gin Asn Ser Ser 65 70
Arg Asn Arg Ala Leu Met Ser Pro 85
Ser Leu Arg Leu Phe Asn Vai Thr 100
Cys Leu Vai Leu Ser Gin Ser Leu 115 120
Glu Vai Thr Leu His Vai Ala Ala 130 135
Ala Pro His Ser Pro Ser Gin Asp 145 150
Ile Asn Gly Tyr Pro Arg Pro Asn 165
Asn Ser Leu Leu Asp Gin Ala Leu 180
Met Arg Gly Leu Tyr Asp Vai Vai 195 200
Pro Ser Vai Asn Ile Gly Cys Cys 210 215
Asn Leu Thr Vai Gly Ser Gin Thr 225 230
Lys Ile Thr Glu Asn Pro Vai Ser 245
Trp Ser Ile Leu Ala Vai Leu Cys 260
Ile Gly Trp Vai Cys Arg Asp Arg 275 280
Ala Trp Ala Vai Ser Pro Glu Thr 290 295
Leu Phe Leu Leu Phe Ser Ser Leu 10 15
Vai Arg Ala Met Vai Gly Ser Asp 25 30
Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn 45
Ser Glu Ser Lys Thr Vai Vai Thr 60
Leu Glu Asn Vai Asp Ser Arg Tyr 75 80
Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe 90 95
Pro Gin Asp Glu Gin Lys Phe His 105 110
Gly Phe Gin Glu Vai Leu Ser Vai 125
Asn Phe Ser Vai Pro Vai Vai Ser 140
Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser 155 160
Vai Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp 170 175
Gin Asn Asp Thr Vai Phe Leu Asn 185 190
Ser Vai Leu Arg Ile Ala Arg Thr 205
Ile Glu Asn Vai Leu Leu Gin Gin 220
Gly Asn Asp Ile Gly Glu Arg Asp 235 240
Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Thr 250 255
Leu Leu Vai Vai Vai Ala Vai Ala 265 270
Cys Leu Gin His Ser Tyr Ala Gly 285
Glu Leu Thr Gly His Vai 300 138 <2 Λ ο \—1 19 <2 Λ \—1 \—1 322 <2 Λ CN \—1 PRT <2 13> murganho <4 Λ Ο Ο 19
Met 1 Gin Leu Lys Cys 5 Pro Cys Phe Vai Ser 10 Leu Gly Thr Arg Gin 15 Pro Vai Trp Lys Lys 20 Leu His Vai Ser Ser 25 Gly Phe Phe Ser Gly 30 Leu Gly Leu Phe Leu 35 Leu Leu Leu Ser Ser 40 Leu Cys Ala Ala Ser 45 Ala Glu Thr Glu Vai 50 Gly Ala Met Vai Gly 55 Ser Asn Vai Vai Leu 60 Ser Cys Ile Asp Pro 65 His Arg Arg His Phe 70 Asn Leu Ser Gly Leu 75 Tyr Vai Tyr Trp Gin 80 Ile Glu Asn Pro Glu 85 Vai Ser Vai Thr Tyr 90 Tyr Leu Pro Tyr Lys 95 Ser Pro Gly Ile Asn 100 Vai Asp Ser Ser Tyr 105 Lys Asn Arg Gly His 110 Leu Ser Leu Asp Ser 115 Met Lys Gin Gly Asn 120 Phe Ser Leu Tyr Leu 125 Lys Asn Vai Thr Pro 130 Gin Asp Thr Gin Glu 135 Phe Thr Cys Arg Vai 140 Phe Met Asn Thr Ala 145 Thr Glu Leu Vai Lys 150 Ile Leu Glu Glu Vai 155 Vai Arg Leu Arg Vai 160 Ala Ala Asn Phe Ser 165 Thr Pro Vai Ile Ser 170 Thr Ser Asp Ser Ser 175 Asn Pro Gly Gin Glu 180 Arg Thr Tyr Thr Cys 185 Met Ser Lys Asn Gly 190 Tyr Pro Glu Pro Asn 195 Leu Tyr Trp Ile Asn 200 Thr Thr Asp Asn Ser 205 Leu Ile Asp Thr Ala 210 Leu Gin Asn Asn Thr 215 Vai Tyr Leu Asn Lys 220 Leu Gly Leu Tyr Asp 225 Vai Ile Ser Thr Leu 230 Arg Leu Pro Trp Thr 235 Ser Arg Gly Asp Vai 240 Leu Cys Cys Vai Glu 245 Asn Vai Ala Leu His 250 Gin Asn Ile Thr Ser 255 Ile Ser Gin Ala Glu 260 Ser Phe Thr Gly Asn 265 Asn Thr Lys Asn Pro 270 Gin Glu 139
Thr His Asn Asn Glu Leu Lys Vai Leu Vai Pro Vai Leu Ala Vai Leu 275 280 285
Ala Ala Ala Ala Phe Vai Ser Phe Ile Ile Tyr Arg Arg Thr Arg Pro 290 295 300
His Arg Ser Tyr Thr Gly Pro Lys Thr Vai Gin Leu Glu Leu Thr Asp 305 310 315 320
His Ala
<210> 20 <211> 329 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 20
Met 1 Xaa Leu Xaa Xaa 5 Pro Xaa Xaa Xaa Xaa 10 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 25 Xaa Xaa Xaa Xaa Gly 30 Leu Xaa Leu Phe Xaa 35 Leu Leu Xaa Ser Ser 40 Leu Xaa Ala Xaa Xaa 45 Xaa Glu Xaa Glu Vai 50 Xaa Ala Met Vai Gly 55 Ser Xaa Vai Xaa Leu 60 Ser Cys Xaa Xaa Pro 65 Xaa Xaa Xaa Xaa Phe 70 Xaa Leu Xaa Xaa Xaa 75 Tyr Vai Tyr Trp Gin 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 Xaa Xaa Vai Thr Tyr 90 Xaa Xaa Pro Xaa Xaa 95 Ser Xaa Xaa Xaa Asn 100 Vai Asp Ser Xaa Tyr 105 Xaa Asn Arg Xaa Xaa 110 Xaa Ser Xaa Xaa Xaa 115 Met Xaa Xaa Gly Xaa 120 Phe Ser Leu Xaa Leu 125 Xaa Asn Vai Thr Pro 130 Gin Asp Xaa Gin Xaa 135 Phe Xaa Cys Xaa Vai 140 Xaa Xaa Xaa Xaa 140
Xaa 145 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 150 Xaa Leu Xaa Xaa Xaa 155 Val Xaa Leu Xaa Val 160 Ala Ala Asn Phe Ser 165 Xaa Pro Val Xaa Ser 170 Xaa Xaa Xaa Ser Xaa 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Glu 180 Xaa Thr Xaa Thr Cys 185 Xaa Ser Xaa Asn Gly 190 Tyr Pro Xaa Pro Asn 195 Xaa Tyr Trp Ile Asn 200 Xaa Thr Asp Asn Ser 205 Leu Xaa Asp Xaa Ala 210 Leu Gin Asn Xaa Thr 215 Val Xaa Leu Asn Xaa 220 Xaa Gly Leu Tyr Asp 225 Vai Xaa Ser Xaa Leu 230 Arg Xaa Xaa Xaa Thr 235 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 240 Xaa Cys Cys Xaa Glu 245 Asn Vai Xaa Leu Xaa 250 Gin Asn Xaa Thr Xaa 255 Xaa Ser Gin Xaa Xaa 260 Xaa Xaa Xaa Gly Xaa 265 Xaa Xaa Lys Xaa Xaa 270 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2 75 Xaa Xaa Xaa Lys Xaa 280 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 285 Xaa Leu Ala Vai Leu 290 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 295 Val Xaa Xaa Xaa Ile 300 Xaa Xaa Xaa Xaa Arg 305 Xaa Arg Xaa Xaa Xaa 310 Xaa Ser Tyr Xaa Gly Xaa 315 Xaa Xaa Val Xaa 320 Xaa Glu Xaa Xaa Leu Thr Xaa His Xaa 325 <210> 21 <211> 1370 <212> ADN <213> Humano <220> <221> 5'UTR <222> (1)..(165) <220>
<221> CDS <222> (166) .. (762) 141 <400> 21 aacaatttca cacaggaaac agctatgacc atgattacgc caagctctaa tacgactcac 60 tatagggaaa gctggtacgc ctgcaggtac cggtccggaa ttcccgggtc gacccacgcg 120 tccgtgaaca ctgaacgcga ggactgttaa ctgtttctgg caaac atg aag tca ggc 177
Met Lys Ser Gly 1 ctc tgg tat ttc ttt ctc ttc tgc ttg ege att aaa gtt tta aca gga 225 Leu 5 Trp Tyr Phe Phe Leu 10 Phe Cys Leu Arg Ile 15 Lys Val Leu Thr Gly 20 gaa ate aat ggt tct gcc aat tat gag atg ttt ata ttt cac aac gga 273 Glu Ile Asn Gly Ser 25 Ala Asn Tyr Glu Met 30 Phe Ile Phe His Asn 35 Gly ggt gta caa att tta tgc aaa tat cct gac att gtc cag caa ttt aaa 321 Gly Vai Gin Ile 40 Leu Cys Lys Tyr Pro 45 Asp Ile Val Gin Gin 50 Phe Lys atg cag ttg ctg aaa ggg ggg caa ata ctc tgc gat ctc act aag aca 369 Met Gin Leu 55 Leu Lys Gly Gly Gin 60 Ile Leu Cys Asp Leu 65 Thr Lys Thr aaa gga agt gga aac aca gtg tcc att aag agt ctg aaa ttc tgc cat 417 Lys Gly 70 Ser Gly Asn Thr Vai 75 Ser Ile Lys Ser Leu 80 Lys Phe Cys His tct cag tta tcc aac aac agt gtc tct ttt ttt cta tac aac ttg gac 465 Ser 85 Gin Leu Ser Asn Asn 90 Ser val Ser Phe Phe 95 Leu Tyr Asn Leu Asp 100 cat tct cat gcc aac tat tac ttc tgc aac cta tca att ttt gat cct 513 His Ser His Ala Asn 105 Tyr Tyr Phe Cys Asn 110 Leu Ser Ile Phe Asp 115 Pro cct cct ttt aaa gta act ctt aca gga gga tat ttg cat att tat gaa 561 Pro Pro Phe Lys 120 Vai Thr Leu Thr Gly 125 Gly Tyr Leu His Ile 130 Tyr Glu tca caa Ctt tgt tgc cag ctg aag ttc tgg tta ccc ata gga tgt gea 609 Ser Gin Leu 135 Cys Cys Gin Leu Lys 140 Phe Trp Leu Pro Ile 145 Gly Cys Ala gcc ttt gtt gta gtc tgc att ttg gga tgc ata ctt att tgt tgg ctt 657 Ala Phe 150 Vai Vai Vai Cys Ile 155 Leu Gly Cys Ile Leu 160 Ile Cys Trp Leu aca aaa aag aag tat tca tcc agt gtg cac gac cct aac ggt gaa tac 705 Thr 165 Lys Lys Lys Tyr Ser 170 Ser Ser Val His Asp 175 Pro Asn Gly Glu Tyr 180 atg ttc atg aga gea gtg aac aca gcc aaa aaa tct aga ctc aca gat 753 Met Phe Met Arg Ala 185 Vai Asn Thr Ala Lys 190 Lys Ser Arg Leu Thr 195 Asp gtg acc cta taatatggaa ctctggcacc caggcatgaa gcacgttggc 802
Vai Thr Leu cagtfcttcct caacttgaag tgcaagattc tcttatttcc gggaccacgg agagtctgac 862 142 ttaactacat acatcttctg ctggtgtttt gttcaatctg gaagaatgac tgtatcagtc 922 aatggggatt ttaacagact gccttggtac tgccgagtcc tctcaaaaca aacaccctct 982 tgcaaccagc tttggagaaa gcccagctcc tgtgtgctca ctgggagtgg aatccctgtc 1042 tccacatctg ctcctagcag tgcatcagcc agtaaaacaa acacatttac aagaaaaatg 1102 ttttaaagat gccaggggta ctgaatctgc aaagcaaatg agcagccaag gaccagcatc 1162 tgtccgcatt tcactatcat actacctctt ctttctgtag ggatgagaat tcctctttta 1222 atcagtcaag ggagatgctt caaagctgga gctattttat ttctgagatg ttgatgtgaa 1282 ctgtacatta gtacatactc agtactctcc ttcaattgct gaaccccagt tgaccatttt 1342 accaagactt tagatgcttt cttgtgcc 1370 <210> 22 <211> 199 <212> PRT <213> Humano <400> 22
Met 1 Lys Ser Gly Leu 5 Trp Tyr Phe Phe Leu 10 Phe Cys Leu Arg Ile 15 Lys Vai Leu Thr Gly 20 Glu Ile Asn Gly Ser 25 Ala Asn Tyr Glu Met 30 Phe Ile Phe His Asn 35 Gly Gly Vai Gin Ile 40 Leu Cys Lys Tyr Pro 45 Asp Ile Vai Gin Gin 50 Phe Lys Met Gin Leu 55 Leu Lys Gly Gly Gin 60 Ile Leu Cys Asp Leu 65 Thr Lys Thr Lys Gly 70 Ser Gly Asn Thr Vai 75 Ser Ile Lys Ser Leu 80 Lys Phe Cys His Ser 85 Gin Leu Ser Asn Asn 90 Ser Vai Ser Phe Phe 95 Leu Tyr Asn Leu Asp 100 His Ser His Ala Asn 105 Tyr Tyr Phe Cys Asn 110 Leu Ser Ile Phe Asp 115 Pro Pro Pro Phe Lys 120 Vai Thr Leu Thr Gly 125 Gly Tyr Leu His Ile 130 Tyr Glu Ser Gin Leu 135 Cys Cys Gin Leu Lys 140 Phe Trp Leu Pro 143
Ile 145 Gly Cys Ala Ala Phe 150 Vai Vai Vai Cys Ile 155 Leu Gly Cys Ile Leu 160 Ile Cys Trp Leu Thr 165 Lys Lys Lys Tyr Ser 170 Ser Ser Vai His Asp 175 Pro Asn Gly Glu Tyr 180 Met Phe Met Arg Ala 185 Vai Asn Thr Ala Lys 190 Lys Ser Arg Leu Thr 195 Asp Vai Thr Leu <210> 23 <211> 199 <212> PRT <213> Humano <400> 23
Met Lys Ser Gly Leu Trp Tyr Phe Phe Leu Phe Cys Leu Arg Ile Lys 1 5 10 15 Vai Leu Thr Gly 20 Glu Ile Asn Gly Ser 25 Ala Asn Tyr Glu Met 30 Phe Ile Phe His Asn 35 Gly Gly Vai Gin Ile 40 Leu Cys Lys Tyr Pro 45 Asp Ile Vai Gin Gin 50 Phe Lys Met Gin Leu 55 Leu Lys Gly Gly Gin 60 Ile Leu Cys Asp Leu 65 Thr Lys Thr Lys Gly 70 Ser Gly Asn Thr Vai 75 Ser Ile Lys Ser Leu 80 Lys Phe Cys His Ser 85 Gin Leu Ser Asn Asn 90 Ser Vai Ser Phe Phe 95 Leu Tyr Asn Leu Asp 100 His Ser His Ala Asn 105 Tyr Tyr Phe Cys Asn 110 Leu Ser Ile Phe Asp 115 Pro Pro Pro Phe Lys 120 Vai Thr Leu Thr Gly Gly Tyr 125 Leu His Ile 130 Tyr Glu Ser Gin Leu 135 Cys Cys Gin Leu Lys 140 Phe Trp Leu Pro Ile 145 Gly Cys Ala Ala Phe 150 Vai Vai Vai Cys Ile 155 Leu Gly Cys Ile Leu 160 144
Ile Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Vai His Asp Pro 165 170 175
Asn Gly Glu Tyr Met Phe Met Arg Ala Vai Asn Thr Ala Lys Lys Ser 180 185 190
Arg Leu Thr Asp Vai Thr Leu 195 <210> 24 <211> 200 <212> PRT <213> murganho <400> 24
Met 1 Lys Pro Tyr Phe 5 Cys Arg Vai Phe Vai 10 Phe Cys Phe Leu Ile 15 Arg Leu Leu Thr Gly 20 Glu Ile Asn Gly Ser 25 Ala Asp His Arg Met 30 Phe Ser Phe His Asn 35 Gly Gly Vai Gin Ile 40 Ser Cys Lys Tyr Pro 45 Glu Thr Val Gin Gin 50 Leu Lys Met Arg Leu 55 Phe Arg Glu Arg Glu 60 Val Leu Cys Glu Leu 65 Thr Lys Thr Lys Gly 70 Ser Gly Asn Ala Vai 75 Ser Ile Lys Asn Pro 80 Met Leu Cys Leu Tyr 85 His Leu Ser Asn Asn 90 Ser Val Ser Phe Phe 95 Leu Asn Asn Pro Asp 100 Ser Ser Gin Gly Ser 105 Tyr Tyr Phe Cys Ser 110 Leu Ser Ile Phe Asp 115 Pro Pro Pro Phe Gin 120 Glu Arg Asn Leu Ser 125 Gly Gly Tyr Leu His 130 Ile Tyr Glu Ser Gin 135 Leu Cys Cys Gin Leu 140 Lys Leu Trp Leu Pro 145 Vai Gly Cys Ala Ala 150 Phe Vai Vai Vai Leu 155 Leu Phe Gly Cys Ile 160 Leu Ile Ile Trp Phe 165 Ser Lys Lys Lys Tyr 170 Gly Ser Ser Val His 175 Asp 145
Pro Asn Ser Glu Tyr Met Phe Met Ala Ala Vai Asn Thr Asn Lys Lys 180 185 190
Ser Arg Leu Ala Gly Vai Thr Ser 195 200
<210> 25 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 25 accatgcggc tgggcagtcc tgga 24
<210> 26 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 26 tggtgaccta ccacatccca cag 23 <210> 27 <211> 23 146
<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 27 tccgatgtca tttcctgtct ggc 23
<210> 28 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido
Sintético <400> 28 gctctgtctc cggactcaca gccc 24
<210> 29 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido
Sintético 147 <400> 29 gtggcagcaa acttcagcgt gcccgtcg 28
<210> 30 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido
Sintético <400> 30 cccaacgtgt actggatcaa taagacgg 28
<210> 31 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido
Sintético <400> 31 gcgtgctgag gatcgcacgg acccccag 28
<210> 32 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial 148 <220> <220> Artificial: Oligonucleótido <223> Descrição de Sequência Sintético <400> 32 21 gcctctagaa agagctggga c <210> 33 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Sintético <400> 33 cgccgtgttc catttatgag c <210> 34 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Sintético <400> 34 gcatatttat gaatccca
Artificial: Oligonucleótido 21
Artificial: Oligonucleótido 18 149
<210> 35 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220>
Oligonucleótido <223> Descrição de Sequência Artificial: Sintético <400> 35 18 actattaggg tcatgcac
Lisboa, 9 de Maio de 2014 150

Claims (35)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Molécula de ácido nucleico isolada, compreendendo uma sequência nucleotídica seleccionada de: a) a sequência nucleotídica como exposta na Figura 12A (SEQ ID N°: 16); b) a sequência nucleotídica codificando o polipéptido como exposto na Figura 12A (SEQ ID N°: 17) dos resíduos 1-302 ou dos resíduos 19-302, 20-302, 21-302, 22-302, 24-302 ou 28-302; ou c) uma sequência nucleotídica complementar a qualquer de (a) ou (b) .
  2. 2. Molécula de ácido nucleico da Reivindicação 1, em que a sequência nucleotídica está ligada, de um modo operativo, a uma sequência de controlo de expressão.
  3. 3. Célula hospedeira compreendendo a molécula de ácido nucleico da Reivindicação 2.
  4. 4. Célula hospedeira da Reivindicação 3 que é uma célula eucariótica.
  5. 5. Célula hospedeira da Reivindicação 3 que é uma célula procariótica.
  6. 6. Processo para a produção de um polipéptido codificado pelo ácido nucleico da reivindicação 1 ou 2, compreendendo o 1 cultivo de uma cultura da célula hospedeira da Reivindicação 3 em meio de cultura adequado e o isolamento do polipéptido da cultura.
  7. 7. Polipéptido produzido pelo processo da Reivindicação 6.
  8. 8. Polipéptido codificado pela molécula de ácido nucleico da Reivindicação 1.
  9. 9. Polipéptido isolado compreendendo a sequência de aminoácidos seleccionada de: a) a sequência de aminoácidos como exposta na Figura 3A (SEQ ID N°: 12) ou Figura 12A (SEQ ID N°: 17); ou b) a sequência de aminoácidos madura, como exposta na Figura 3A (SEQ ID N°: 12), compreendendo uma terminação amino madura em qualquer dos resíduos 19, 20, 21, 22, 24 ou 28, ou Figura 12A (SEQ ID N \—1 o compreendendo uma terminação amino madura em qualquer dos resíduos 19, 20, 21, 22, 24 ou 28 .
  10. 10. Anticorpo ou seu fragmento que se liga ao polipéptido da Reivindicação 7 .
  11. 11. Anticorpo ou seu fragmento que se liga ao polipéptido da Reivindicação 8.
  12. 12 . Anticorpo ou seu fragmento que se liga ao polipéptido da Reivindicação 9 . 2
  13. 13. Anticorpo ou seu fragmento da Reivindicação 10, 11 ou 12 que é um anticorpo monoclonal ou seu fragmento.
  14. 14. Anticorpo ou seu fragmento da Reivindicação 10, 11 ou 12 que é um anticorpo humano ou seu fragmento.
  15. 15. Anticorpo ou seu fragmento da Reivindicação 10, 11 ou 12 que é um anticorpo humanizado ou enxertado com CDR ou um seu fragmento.
  16. 16. Anticorpo ou seu fragmento da Reivindicação 10 que inibe a ligação do polipéptido da Reivindicação 7, 8 ou 9 ao polipéptido maduro, como exposto na Figura 13A.
  17. 17. Composição compreendendo o polipéptido da Reivindicação 7, 8 ou 9 e um veiculo, adjuvante, solubilizante, estabilizante ou antioxidante farmaceuticamente aceitável.
  18. 18. Polipéptido da Reivindicação 7, 8 ou 9 que foi modificado quimicamente.
  19. 19. Polipéptido da Reivindicação 18 que foi modificado quimicamente por adição de um ou mais polímeros solúveis em água.
  20. 20. Polipéptido de fusão compreendendo o polipéptido da Reivindicação 7, 8 ou 9 fundido a uma sequência de aminoácidos heteróloga.
  21. 21. Polipéptido de fusão da Reivindicação 20, em que a sequência de aminoácidos heteróloga é um domínio constante de IgG ou seu fragmento. 3
  22. 22. Utilização de um polipéptido da Reivindicação 7, 8 ou 9 para a preparação de um medicamento para tratamento, prevenção ou melhoramento de um distúrbio mediado por célula T.
  23. 23. Método de diagnóstico de um distúrbio mediado por célula T, ou uma susceptibilidade a um distúrbio mediado por célula T num animal, compreendendo: a) determinação da presença ou quantidade de expressão do polipéptido da Reivindicação 7, 8 ou 9; e b) diagnóstico de um distúrbio mediado por célula T, ou uma susceptibilidade a um distúrbio mediado por célula T, com base na presença ou quantidade de expressão do polipéptido.
  24. 24. Método de identificação de uma molécula de teste que se liga ao polipéptido da Reivindicação 7, 8 ou 9 compreendendo: a) colocação do polipéptido da Reivindicação 7, 8 ou 9 em contacto com uma molécula de teste; e b) determinação da extensão de ligação do polipéptido à molécula de teste.
  25. 25. Método da Reivindicação 24 compreendendo, ainda, a determinação da actividade do polipéptido quando ligado à molécula de teste.
  26. 26. Utilização de uma molécula de ácido nucleico da Reivindicação 1 ou 2 para a preparação de um medicamento para a regulação da activação ou proliferação de célula T num animal. 4
  27. 27. Mamífero nao humano transgénico, compreendendo a molécula de ácido nucleico da Reivindicação 2.
  28. 28. Utilização de um antagonista para a preparação de um medicamento para supressão de uma resposta imunitária num animal, em que o antagonista é um anticorpo ou seu fragmento que se liga ao polipéptido da Reivindicação 7, 8 ou 9 .
  29. 29. Polipéptido da Reivindicação 7, 8 ou 9 para tratamento, prevenção ou melhoramento de um distúrbio mediado por célula T.
  30. 30. Molécula de ácido nucleico da Reivindicação 1 ou 2 para utilização na regulação da activação ou proliferação de célula T num animal.
  31. 31. Antagonista para supressão de uma resposta imunitária num animal, em que o antagonista é um anticorpo ou seu fragmento que se liga ao polipéptido da Reivindicação 7, 8 ou 9.
  32. 32. Utilização da Reivindicação 28 para o tratamento de distúrbios auto-imunes.
  33. 33. Antagonista da Reivindicação 31 para utilização no tratamento de distúrbios auto-imunes.
  34. 34. Utilização da reivindicação 32 ou do antagonista da Reivindicação 33, em que o distúrbio auto-imune é qualquer 5 um de artrite reumatóide, psoríase, esclerose múltipla, diabetes e lúpus eritematoso sistémico.
  35. 35. Utilização de um antagonista para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença inflamatória crónica, em que o antagonista é um anticorpo ou seu fragmento que se liga ao polipéptido da Reivindicação 7, 8 ou 9. Lisboa, 9 de Maio de 2014 6
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TW (1) TWI274058B (pt)
WO (1) WO2000046240A2 (pt)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7112655B1 (en) 1997-02-27 2006-09-26 Japan Tobacco, Inc. JTT-1 protein and methods of inhibiting lymphocyte activation
JP3521382B2 (ja) 1997-02-27 2004-04-19 日本たばこ産業株式会社 細胞間接着及びシグナル伝達を媒介する細胞表面分子
DE19821060A1 (de) 1997-09-23 1999-04-15 Bundesrepublik Deutschland Let Ko-stimulierendes Polypeptid von T-Zellen, monoklonale Antikörper sowie die Herstellung und deren Verwendung
US7435796B1 (en) 1999-02-03 2008-10-14 Amgen Inc. Antibodies which bind B7RP1
JP5000804B2 (ja) * 1999-02-03 2012-08-15 アムジエン・インコーポレーテツド 免疫応答に関与する新規ポリペプチド
US8624010B1 (en) 1999-02-03 2014-01-07 Steven K. Yoshinaga Nucleic acids encoding B7RP1
US7708993B2 (en) * 1999-02-03 2010-05-04 Amgen Inc. Polypeptides involved in immune response
AU6458400A (en) * 1999-08-11 2001-03-13 Isis Innovation Limited Nucleic acid, polypeptides, assays, therapeutic methods and means
JP3871503B2 (ja) 1999-08-30 2007-01-24 日本たばこ産業株式会社 免疫性疾患治療剤
JP4210454B2 (ja) 2001-03-27 2009-01-21 日本たばこ産業株式会社 炎症性腸疾患治療剤
EP1900816A3 (en) * 1999-09-21 2008-03-26 Genetics Institute, LLC GL50 molecules and uses therefor
US6521749B1 (en) * 1999-09-21 2003-02-18 Genetics Institute, Inc. GL50 nucleic acids and uses therefor
JP3597140B2 (ja) 2000-05-18 2004-12-02 日本たばこ産業株式会社 副刺激伝達分子ａｉｌｉｍに対するヒトモノクローナル抗体及びその医薬用途
JP4236925B2 (ja) * 2000-11-28 2009-03-11 アムジエン・インコーポレーテツド 免疫応答に関与する新規ポリペプチド
US20040152156A1 (en) * 2001-01-04 2004-08-05 Jeffrey Encinas Regulation of human b7-h2 protein
CA2434690A1 (en) * 2001-01-16 2002-09-06 Curagen Corporation Proteins, polynucleotides encoding them and methods of using the same
AU2002308267A1 (en) * 2001-01-16 2002-10-03 Bayer Aktiengesellschaft Regulation of human icos v protein
JP4212278B2 (ja) 2001-03-01 2009-01-21 日本たばこ産業株式会社 移植片拒絶反応抑制剤
NZ530765A (en) 2001-06-26 2006-11-30 Amgen Fremont Inc Antibodies that bind OPGL and compositions and methods for the treatment of bone diseases
WO2005103086A1 (en) 2004-04-23 2005-11-03 Bundesrepublik Deutschland letztvertreten durch das Robert-Koch-Institut vertreten durch seinen Präsidenten Method for the treatment of t cell mediated conditions by depletion of icos-positive cells in vivo
EP3673919A1 (en) * 2005-06-14 2020-07-01 Amgen Inc. Self-buffering protein formulations
NO345593B1 (no) * 2005-07-18 2021-05-03 Amgen Inc Humane anti-B7RP1 nøytraliserende antistoffer
AU2011265342B2 (en) * 2005-07-18 2014-12-04 Amgen Inc. Human anti-B7RP1 neutralizing antibodies
AU2013203437A1 (en) * 2005-07-18 2013-05-02 Amgen Inc. Human anti-B7RP1 neutralizing antibodies
CA2630483C (en) 2005-12-08 2015-05-19 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to o8e
US9458246B2 (en) 2013-03-13 2016-10-04 Amgen Inc. Proteins specific for BAFF and B7RP1
JOP20140087B1 (ar) 2013-03-13 2021-08-17 Amgen Inc بروتينات مخصصة ل baff و b7rp1 وإستخداماتها
IL280738B (en) * 2014-04-16 2022-07-01 Juno Therapeutics Gmbh Methods, kits and device for increasing cell populations
AU2016215175B2 (en) * 2015-02-06 2021-09-16 Heat Biologics, Inc. Vector co-expressing vaccine and costimulatory molecules
US10023635B2 (en) 2015-03-23 2018-07-17 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies to ICOS
ITUB20151014A1 (it) * 2015-05-27 2016-11-27 Univ Degli Studi Del Piemonte Orientale Amedeo Avogadro Ligandi del recettore b7h nel trattamento di osteopenia e osteoporosi
CA2998208A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Jounce Therapeutics, Inc. Gene signatures for determining icos expression
JP6884858B2 (ja) 2016-10-21 2021-06-09 アムジエン・インコーポレーテツド 医薬製剤及びその製造方法
EP3502140A1 (en) * 2017-12-21 2019-06-26 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of tumor targeted icos agonists with t-cell bispecific molecules

Family Cites Families (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
EP0088046B1 (de) 1982-02-17 1987-12-09 Ciba-Geigy Ag Lipide in wässriger Phase
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
EP0143949B1 (en) 1983-11-01 1988-10-12 TERUMO KABUSHIKI KAISHA trading as TERUMO CORPORATION Pharmaceutical composition containing urokinase
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
US4970154A (en) 1987-10-09 1990-11-13 Baylor College Of Medicine Method for inserting foreign genes into cells using pulsed radiofrequency
US5106627A (en) 1987-11-17 1992-04-21 Brown University Research Foundation Neurological therapy devices
US5158881A (en) 1987-11-17 1992-10-27 Brown University Research Foundation Method and system for encapsulating cells in a tubular extrudate in separate cell compartments
US4892538A (en) 1987-11-17 1990-01-09 Brown University Research Foundation In vivo delivery of neurotransmitters by implanted, encapsulated cells
US5672344A (en) 1987-12-30 1997-09-30 The Regents Of The University Of Michigan Viral-mediated gene transfer system
US5011472A (en) 1988-09-06 1991-04-30 Brown University Research Foundation Implantable delivery system for biological factors
ATE135370T1 (de) 1988-12-22 1996-03-15 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
US5776963A (en) * 1989-05-19 1998-07-07 Hoechst Marion Roussel, Inc. 3-(heteroaryl)-1- (2,3-dihydro-1h-isoindol-2-yl)alkyl!pyrrolidines and 3-(heteroaryl)-1- (2,3-dihydro-1h-indol-1-yl)alkyl!pyrrolidines and related compounds and their therapeutic untility
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5676954A (en) 1989-11-03 1997-10-14 Vanderbilt University Method of in vivo delivery of functioning foreign genes
US5521288A (en) * 1990-03-26 1996-05-28 Bristol-Myers Squibb Company CD28IG fusion protein
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
EP1179350A3 (en) 1993-08-12 2003-01-02 Cytotherapeutics, Inc. Encapsulated cell system for implantation into the human CNS
US6268212B1 (en) 1993-10-18 2001-07-31 Amgen Inc. Tissue specific transgene expression
US5484720A (en) 1994-09-08 1996-01-16 Genentech, Inc. Methods for calcium phosphate transfection
EP0832269A1 (en) 1995-06-07 1998-04-01 Baylor College Of Medicine Nucleic acid transporters for delivery of nucleic acids into a cell
US5679559A (en) 1996-07-03 1997-10-21 University Of Utah Research Foundation Cationic polymer and lipoprotein-containing system for gene delivery
JP3521382B2 (ja) 1997-02-27 2004-04-19 日本たばこ産業株式会社 細胞間接着及びシグナル伝達を媒介する細胞表面分子
US7112655B1 (en) * 1997-02-27 2006-09-26 Japan Tobacco, Inc. JTT-1 protein and methods of inhibiting lymphocyte activation
EP1017723B1 (de) * 1997-09-23 2007-01-10 Bundesrepublik Deutschland letztvertreten durch Den Direktor des Robert-Koch-Instituts Ko-stimulierendes polypeptid von t-zellen, monoklonale antikörper sowie die herstellung und deren verwendung
DE19821060A1 (de) * 1997-09-23 1999-04-15 Bundesrepublik Deutschland Let Ko-stimulierendes Polypeptid von T-Zellen, monoklonale Antikörper sowie die Herstellung und deren Verwendung
JP5000804B2 (ja) 1999-02-03 2012-08-15 アムジエン・インコーポレーテツド 免疫応答に関与する新規ポリペプチド
US7708993B2 (en) * 1999-02-03 2010-05-04 Amgen Inc. Polypeptides involved in immune response
US7435796B1 (en) * 1999-02-03 2008-10-14 Amgen Inc. Antibodies which bind B7RP1
AU6458400A (en) 1999-08-11 2001-03-13 Isis Innovation Limited Nucleic acid, polypeptides, assays, therapeutic methods and means
JP3871503B2 (ja) 1999-08-30 2007-01-24 日本たばこ産業株式会社 免疫性疾患治療剤
US6521749B1 (en) 1999-09-21 2003-02-18 Genetics Institute, Inc. GL50 nucleic acids and uses therefor
EP1900816A3 (en) 1999-09-21 2008-03-26 Genetics Institute, LLC GL50 molecules and uses therefor
AU2001245396A1 (en) 2000-03-02 2001-09-12 Mayo Foundation For Medical Education And Research Hb7-h2, a novel co-stimulatory molecule
US6635750B1 (en) 2000-07-20 2003-10-21 Millennium Pharmaceuticals, Inc. B7-H2 nucleic acids, members of the B7 family
US7030255B2 (en) * 2004-03-09 2006-04-18 Lyondell Chemical Technology, L.P. Oxidation process with in-situ H202 generation and polymer-encapsulated catalysts therefor
NO345593B1 (no) * 2005-07-18 2021-05-03 Amgen Inc Humane anti-B7RP1 nøytraliserende antistoffer
US8615703B2 (en) 2010-06-04 2013-12-24 Micron Technology, Inc. Advanced bitwise operations and apparatus in a multi-level system with nonvolatile memory

Also Published As

Publication number Publication date
NZ551331A (en) 2008-08-29
EP2332978B1 (en) 2014-04-02
HUP0105337A2 (hu) 2002-04-29
US8470317B2 (en) 2013-06-25
CA2362126A1 (en) 2000-08-10
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CA2640956A1 (en) 2000-08-10
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EP1149114A2 (en) 2001-10-31
JP5000804B2 (ja) 2012-08-15
DK2332978T3 (da) 2014-06-23
DK1149114T3 (da) 2014-06-23
JP2012110333A (ja) 2012-06-14
TWI274058B (en) 2007-02-21
DK2332976T3 (da) 2014-06-23
ES2464165T3 (es) 2014-05-30
ES2464161T3 (es) 2014-05-30
CA2362126C (en) 2017-01-17
CA2640956C (en) 2012-07-03
JP2002539770A (ja) 2002-11-26
AU2859200A (en) 2000-08-25
HK1159127A1 (en) 2012-07-27
AU773954B2 (en) 2004-06-10
WO2000046240A3 (en) 2000-12-21
NZ583002A (en) 2011-12-22
EP2332976B1 (en) 2014-04-02
EP2796465A1 (en) 2014-10-29
KR20010101987A (ko) 2001-11-15
PT2332976E (pt) 2014-05-23
ES2464156T3 (es) 2014-05-30
IL229857A0 (en) 2014-01-30
CN1346370A (zh) 2002-04-24
PT2332978E (pt) 2014-05-23
EP1149114B1 (en) 2014-04-02
CN1309734C (zh) 2007-04-11
EP2332976A1 (en) 2011-06-15
SI1149114T1 (sl) 2014-08-29
SI2332976T1 (sl) 2014-08-29
US20140256652A1 (en) 2014-09-11
CY1115101T1 (el) 2016-12-14
IL144635A (en) 2014-05-28
EP2332978A1 (en) 2011-06-15
NZ513349A (en) 2004-03-26
US20090208504A1 (en) 2009-08-20
HUP0105337A3 (en) 2011-01-28
CY1115099T1 (el) 2016-12-14
WO2000046240A2 (en) 2000-08-10
IL144635A0 (en) 2002-05-23
HK1159128A1 (en) 2012-07-27
SI2332978T1 (sl) 2014-08-29

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JP5658695B2 (ja) 免疫応答に関与する新規ポリペプチド
US7708993B2 (en) Polypeptides involved in immune response
US7435796B1 (en) Antibodies which bind B7RP1
AU2002217969B2 (en) Polypeptides involved in immune response
AU2002217969A1 (en) Polypeptides involved in immune response
US8624010B1 (en) Nucleic acids encoding B7RP1
ZA200106287B (en) Novel polypeptides involved in immune response.
MXPA01007843A (en) Novel polypeptides involved in immune response