CZ20032406A3 - Farmaceutický prostředek určený k potlačeníŹ léčbě nebo prevenci odhojení štěpu a farmaceutický prostředek určený ke zvýšení účinku imunosupresivních činidel - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předmětný vynález se vztahuje k farmaceutickým prostředkům, které obsahují látku, která vykazuje schopnost modulovat biologickou aktivitu AILIM, což je aktivací indukovatelná lymfocytová imunomodulační molekula (rovněž známá jako indukovatelný kostimulátor (ICOS)), zejména pak schopnost modulovat signální transdukci zprostředkovanou molekulou AILIM.

Konkrétněji se předmětný vynález vztahuje k farmaceutickým prostředkům, které obsahují látku, která vykazuje schopnost modulovat (např. inhibovat) proliferaci buněk exprimujících AILIM nebo modulovat (např. inhibovat) produkci cytokinu (například interferonu-γ nebo interleukinu-4) buňkani exprimujícími AILIM.

Ještě konkrétněji se předmětný vynález vztahuje k (1) farmaceutickým prostředkům, které jsou určeny k inhibici, léčbě nebo prevenci odhojení štěpu (imunologické odmítnutí), které doprovází transplantaci orgánu, jeho části nebo tkáně; a k (2) farmaceutickým prostředkům, které jsou určeny ke zvýšení inhibičního, terapeutického nebo preventivního účinku imunosupresivních činidel na odhojení štěpu (imunologické odmítnutí), které doprovází transplantaci orgánu, jeho části nebo tkáně.

Dosavadní stav techniky

Díky nedávnému přepracování zákonů o transplantaci orgánů bylo v Japonsku provedeno několik transplantací orgánů od pacientů po smrti mozku. V jednom případě obdrželo 7 pacientů orgány od jednoho dárce. Do budoucnosti se tedy předpokládá, že dojde k nárůstu transplantací orgánů.

Na druhé straně existují odhady, že japonských pacientů postižených závažnými kardiovaskulárními onemocněními jako jsou např. onemocnění jater (akutní selhání jater, cirhóza jater apod.), onemocnění srdce (závažné srdeční selhání, kardiomyopatie, hypetrofíe srdce apod.), onemocnění ledvin (selhání ledvin, chronická glomerulonefritida, diabetická nefropatie, pyelonefritida apod.), onemocnění plic (plicní dysfunkce obou plic apod.) a onemocnění pankreasu (léčba diabetických pacientů), pro jejichž léčbu je transplantace orgánu životně • · · · · ·

důležitá, každým rokem přibývá, a to asi 600 pacientů s onemocněním srdce, asi 3 000 pacientů s onemocněním jater a asi 500 pacientů s onemocněním plic. Zatímco legální aspekt věci je řešen, skutečným problémem, který v dané chvíli existuje, je nedostatek transplantovatených orgánů. Nedostatek orgánů je vážným problémem také v USA, které jsou v oblasti transplantací velmi pokročilí. V USA čeká přibližně 4 300 lidí (1999) na transplantaci srdce a přibližně 43 000 lidí (1999) na transplantaci ledvin. Ve skutečnosti každý rok umírá přibližně 800 lidí proto, že neobdrželi transplanované srdce a přibližně 2 300 lidí proto, že jim nebyla provedena transplantace ledviny.

Transplantace tkáně (jako je kůže, rohovka nebo kost) nebo orgánu (jako jsou játra, srdce, ledviny, plíce a pankreas) zahrnují: (1) autotransplantaci (autologní transplantace), (2) isotransplantaci, (3) alogenní transplantaci a (4) xenogenní transplantaci.

Autotransplantace se vztahuje k transplantaci části jedince do jiné části stejného jedince a příkladem tohoto typu je léčba popálenin transplantováním vlastní zdravé kůže na postižené místo.

Isotransplantace je prováděna mezi dvěma stejnými zvířaty. U lidí je tento typ transplantace prováděn mezi jedno vaječnými dvojčaty (například transplanatce jedné ledviny nebo jatemí tkáně).

Alogenní transplantace je prováděna mezi dvěma různými jedinci, kteří mají odlišný genetický základ a u lidí je tato transplantace prováděna mezi dvouvajeěnými dvojčaty nebo mezi jedinci, u nichž je absolutně vyloučena jakákoliv pokrevní příbuznost.

Xenogenní transplantace je prováděna mezi jedinci různých druhů zvířat. Příkladem je transplantace, kdy jsou tkáň nebo orgán šimpanze nebo prasete transplantovány člověku.

Jak již bylo zmíněno výše, vzhledem k vývoji legislativy týkající se transplantací orgánů se očekává nárůst alogenních transplantací od pacientů po smrti mozku. Aby však byl řešen absolutní nedostatek transplantovatelných orgánů, jsou v současné době aktivně prováděny různé výzkumy zaměřené na praktické aplikace xenogenních transplantací, konkrétněji transplantací tkání nebo orgánů savců jiných než člověk, jako např. prasat, člověku.

Zatímco problematika nedostatku transplantovatelných tkání a orgánů bude pravděpodobně vyřešena vytvořením zákonů týkajících se smrti mozku a transplantací a zlepšením technik xenogenních transplantací, existuje však při léčbě onemocnění pomocí alogenní a xenogenní transplantace ještě jedna extrémně velká překážka. Konkrétněji je touto překážkou závažné imunologické odmítnutí (odhojení štěpu) u příjemců, k němuž dochází po transplantaci tkání nebo orgánu od dárce.

• · · · · · • · · • · · · · • · · · • · ·

.....

Odhojení štěpu se vztahuje k různým imunitním odezvám, pomocí nichž se pokouší příjemce odmítnout a eliminovat transplantát (část živého organismu, která je transplantována, buňka, tkáň nebo orgán) od dárce, jehož genetická výbava je odlišná od genetické výbavy příjemce (tzn. alogenní transplantace nebo xenogenní transplantace), a to proto, že příjemce rozpozná transplantát jako cizorodou látku. Imunitní odezvy, které tuto transplantaci doprovázejí, je možno rozdělit na: (1) hyperakutní odmítnutí, což je silné odmítnutí, ke kterému dochází bezprostředně po transplantaci (2) akutní odmítnutí, které je pozorováno v průběhu několika málo měsíců po transplantaci a (3) chronické odmítání pozorované několik měsíců po transplantaci. Kromě toho, ačkoliv se buněčná imunita díky imunokompetentním buňkám reprezentovaným T buňkami a humorální imunita díky protilátkám vyskytují ve složitě koordinovaném systému, hlavní odezvou je buněčná imunita.

Výsledkem odhojení štěpu je odumírání transplantátu (nekrotizace) a jeho zaniknutí. Kromě toho se u příjemce mimo závažných systemických symptomů jako je horečka, leukocytóza a únava vyskytují také otoky a citlivost v místě transplantace. Dále se mohou vyskytnout závažné komplikace jako je infekce.

Konkrétně, je-li transplantován xenogenní štěp jako např. štěp z prasete, dochází k vážnému problému hyperakutního odmítnutí, kdy je transplantát odmítnut během několika minut.

Protože k imunologickému odmítnutí způsobenému alogenní transplantací dochází zejména díky buněčné imunitě, je k potlačení imunologického odmítnutí (odhojení štěpu), které tyto transplantace doprovází, používán omezený počet imunosupresiv, které potlačují funkci imunokompetentních buněk. Mezi tato imunosupresiva patří cyklosporin (CsA); tacrolimus (FK-506); azathioprin (AZ); mykofenolát mofetil (MMF); mizoribin (MZ); leflunomid (LEF); adrenokortikoidní steroidy (také známé jako adrenokortikoidní hormony, kortikosteroidy, kortikoidy) jako je prednisolon a methylprednisolon; sirolimus (také známý jako rapymycin); deoxyspergualin (DSG); a FTY720 (chemický název: hydrochlorid 2-amino-2-[2-(4-oktylfenyl)ethyl] -1,3 -propandiolu).

Jako imunosupresiva jsou také klinicky vyvíjeny CTLA4 a CD28, což jsou molekuly odpovědné za transdukci (převod) kostimulačních signálů nezbytných pro aktivaci T buněk (kostimulační signální transdukční molekuly) a zejména pak CTLA4 léky, které používají rozpustnou oblast CTLA4 a gen, který ji kóduje.

Na druhé straně nedávno byla podobně jako CTLA4 a CD28, což jsou kostimulační molekuly přenášející signál, jako třetí kostimulační signální transdukční molekula, která přenáší druhý signál (kostimulační signál) nezbytný pro aktivaci lymfocytů jako jsou T buňky a ve ·· ···· * · · · · · · ·· · ; · * ♦ · ··«« e ·· ··· ··· ··· *··**··* spojení se signálem reguluje funkci aktivovaných Iymfocytů jako jsou aktivované T buňky, identifikována molekula nazvaná aktivací indukovatelná lymfocytová imunomodulační molekula (AILIM; lidská, myší a krysí; Int. Immunol., 12(1), str. 51 až 55, 2000; také nazývaná indukovatelný kostimulátor (ICOS; lidský; Nátuře, 397(6716), str. 263 až 266, 1999); J. Immunol., 166(1), str. 1, 2001; J. Immunol., 165(9), str. 5 035, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun., 276(1), str. 335, 2000; Immunity, 13(1), str. 95, 2000; J. Exp. Med., 192(1), str. 53, 2000; Eur. J. Immunol., 30(4), str. 1040, 2000).

Na základě zjištění z nedávných studií, které se týkaly této molekuly, se předpokládá, že by molekula AILIM mohla být zahrnuta do různých onemocnění (např. autoimunitních onemocnění, alergií a zánětů) způsobených aktivací imunokompetentních buněk jako jsou T buňky (zejména T buňky). Neexistují však žádné zprávy o vztahu mezi funkční modulací molekuly AILIM a odhojením štěpu (imunologickým odmítnutím), které doprovází transplantaci tkáně nebo orgánu, stejně tak jako neexistují pokusy pomocí modulování aktivity molekuly AILIM potlačit, léčit nebo předcházet odmítnutí, která doprovázejí transplantace tkáně nebo orgánu.

Kromě toho byla nedávno identifikována nová molekula nazvaná B7h, B7RP-1, GL50 nebo LICOS, která je považována za ligand interagující s kostimulační signální transdukční molekulou AILIM (Nátuře. Sv. 402, č. 6763, str. 827 až 832, 1999; Nátuře Medicine, Sv. 5, č. 12, str. 1 365 až 1 369, 1999; J. Immunology, Sv. 164, str. 1 653 až 1 657, 2000; Curr. Biol., Vol. 10, č. 6, str. 333 až 336, 2000).

Identifikace těchto dvou druhů nových molekul, jmenovitě AILIM (ICOS) a B7RP-1 (Bh7, GL50, LICOS) odhalila, že kromě známých první a druhé signální transdukční cesty mezi CD28 a CD80 (B7-1)/CD86 (B7-2) a mezi CTLA4 a CD80 (B7-1) / CD 86 (B7-2), existuje třetí kostimulační signální transdukční cesta, která je nezbytná pro výše zmiňovanou aktivaci Iymfocytů jako jsou T buňky a pro kontrolu funkce aktivovaných T buněk, které pracují prostřednictvím interakce mezi AILIM (ICOS) a B7RP-1 (Bh7, GL50, LICOS).

Probíhají obsažné studie biologických funkcí těchto nových molekul, regulace funkcí Iymfocytů jako jsou T buňky přes třetí kostimulační signální transdukci molekulami a vztahu mezi novou signální transdukci a onemocněními.

Podstata vynálezu

Předmětem předmětného vynálezu je poskytnout způsoby a farmaceutická činidla, která potlačují, léčí nebo předcházejí imunologické odmítnutí (odhojení štěpu), které doprovází

• · 9 9 9 9 • · · • · · 9 · • · 9 • 9 «

.....

transplantaci tkáně nebo orgánu (alogenní transplantace nebo xenogenní transplantace), a to pomocí lékařských a farmaceutických technik (například pomocí farmaceutických činidel jako jsou nízkomolekulární sloučeniny a protilátky) s cílem modulovat biologickou funkci nové molekuly AILIM, u níž se předpokládá, že převádí druhý signál (kostimulační signál), který je nezbytný pro aktivování lymfocytů jako jsou T buňky a spolu se signálem moduluje funkci aktivovaných lymfocytů jako jsou aktivované T buňky.

Dalším předmětem je poskytnout způsob jak zvýšit supresivní účinek existujících imunosupresivních činidel (cyklosporin, azathioprin, adrenokortikoidní steroidy, FK-506, apod.), na odhojení štěpu, a to pomocí takových farmaceutických činidel, která modulují biologickou funkci AILIM (např. farmaceutická činidla jako jsou nízkomolekulární sloučeniny a protilátky).

Výsledkem rozsáhlého výzkumu vztahujícího se k biologické funkci savčí AILIM a ke způsobu potlačení imunologického odmítnutí (odhojení štěpu), což je vážný problém doprovázející transplantaci (alogenní transplantaci nebo xenogenní transplantaci) štěpů (buňky, tkáně nebo orgán), bylo zjištění autorů vynálezu, že (1) farmaceutická činidla, která modulují funkci AILIM, významně potlačují imunologické odmítnutí (odhojení štěpu) doprovázející transplantaci tkáně(í) nebo orgánu(ů) a že (2) supresivní účinek existujících imunosupresivních činidel na odhojení štěpu je zvyšován pomocí farmaceutických činidel, která modulují funkci AILIM. Na základě tohoto byl předmětný vynález dokončen.

Farmaceutický prostředek podle předmětného vynálezu lze použít jako farmaceutickou látku pro modulování různých reakcí in vivo, v nichž je zahrnut přenos kostimulačního signálu do buněk exprimujících AILIM zprostředkovaný molekulou AILIM (např. proliferace buněk exprimujících AILIM, produkce cytokinu(ů) buňkami exprimujícími AILIM, imunocytolýza nebo apoptóza buněk exprimujících AILIM a aktivita indukovat cytotoxicitu buněk závisející na protilátkách proti buňkám exprimujícím AILIM) a/nebo jako farmaceutickou látku určenou k prevenci nástupu a/nebo rozvoje různých onemocnění, v nichž je zahrnuta signální transdukce zprostředkovaná molekulou AILIM a k léčbě nebo profylaxi onemocnění.

Konkrétněji může farmaceutický prostředek podle předmětného vynálezu modulovat (potlačovat nebo podporovat) proliferaci buněk exprimujících AILIM nebo může modulovat (inhibovat nebo podporovat) produkci cytokinů (např. interferonu γ nebo interleukinu 4) buňkami exprimujícími AILIM a může předcházet různým chorobným stavům vyvolaným různými fyziologickými fenomény, v nichž je zahrnuta signální transdukce zpostředkovaná molekulou AILIM a může umožňovat léčbu nebo prevenci různých onemocnění.

Použití farmaceutických prostředků podle předmětného vynálezu umožňuje potlačení, prevenci a/nebo léčbu imunologického odmítnutí (odhojení štěpu), což je vážným problémem v

• · ··· · • · · • · · · · • · · s · · ·

.....

terapiích, kdy je transplantován (alogenní transplantace nebo xenogenní transplantace) orgán (játra, srdce, plíce, ledviny, pankreas apod.), jejich část nebo tkáň (jako je kůže, rohovka a kost) od dárce příjemci, který trpí závažným kardiovaskulárním onemocněním.

Kromě toho umožňuje použití farmaceutického prostředku podle tohoto vynálezu zvýšit účinek již existujících imunosupresivních činidel, která jsou v těchto transplantačních terapiích podávána za účelem potlačit imunologické odmítnutí.

Ještě konkrétněji jsou předmětné vynálezy následující:

(1) Farmaceutický prostředek určený pro potlačení, léčbu nebo prevenci odhojení štěpu, které doprovází transplantaci orgánu, jeho části nebo tkáně, přičemž zmíněný prostředek obsahuje látku, která vykazuje schopnost modulovat signální transdukci zprostředkovanou molekulou AILIM a farmaceuticky přijatelný nosič.

(2) Farmaceutický prostředek určený ke zvýšení účinku jednoho nebo více imunosupresivních činidel na potlačení, léčbu nebo prevenci odhojení štěpu, které doprovází transplantaci orgánu, jeho části nebo tkáně, přičemž zmíněný prostředek obsahuje látku, která vykazuje aktivitu modulovat signální transdukci zprostředkovanou molekulou AILIM a farmaceuticky přijatelný nosič.

(3) Farmaceutický prostředek podle bodu (2), kde zmíněným imunosupresivním činidlem je jedno nebo více terapeutických činidel vybraných ze skupiny, kterou tvoří azathioprin, adrenokortikoidní steroid, cyklosporin, mizoribin a tacrolimus (FK-506), mykofenolát mofetil, leflunomid, sirolismus, deoxyspergualin, FTY720 a CTLA4.

(4) Farmaceutický prostředek podle libovolného bodu (1) až (3), kde zmíněnou transplantací je alogenní transplantace.

(5) Farmaceutický prostředek podle libovolného bodu (1) až (3), kde zmíněnou transplantací je xenogenní transplantace.

(6) Farmaceutický prostředek podle libovolného bodu (1) až (5), kde zmíněným orgánem jsou játra, srdce, ledviny, plíce nebo pankreas.

(7) Farmaceutický prostředek podle libovolného bodu (1) až (5), kde zmíněnou tkání je kůže, rohovka nebo kostní tkáň.

(8) Farmaceutický prostředek podle libovolného bodu (1) až (7), kde zmíněnou látkou je bílkovinná látka.

(9) Farmaceutický prostředek podle bodu (8), kde zmíněná bílkovinná látka je vybrána ze skupiny, kterou tvoří:

a) protilátka, která se váže na AILIM nebo část zmíněné protilátky;

b) polypeptid obsahující celou extracelulámí oblast AILIM nebo její část;

·· ···· • · ♦ • · · · · • · · · • · · ·· ··· ··· ··· ·· ’μ

c) fúzní polypeptid obsahující celou extracelulární oblast AILIM nebo její část a celou konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu nebo její část; a

d) polypeptid, který se váže na AILIM.

(10) Farmaceutický prostředek podle libovolného bodu (1) až (7), kde zmíněnou látkou je nebílkovinná látka.

(11) Farmaceutický prostředek podle bodu (10), kde zmíněnou nebílkovinnou látkou je DNA, RNA nebo chemicky syntetizovaná sloučenina.

Předmětné vynálezy jsou detailněji popsány níže, a to prostřednictvím definování termínů a způsobů produkce látek používaných v předmětném vynálezu.

Zde používaný termín savčí znamená lidský, kravský, kozí, králičí, myší, krysí, křeččí a z morčete; výhodnější je lidský, kravský, krysí, myší nebo křeččí a zejména výhodný je lidský.

AILIM podle tohoto vynálezu je zkratka pro aktivací indukovatelnou lymfocytovou imunomodulační molekulu a znamená molekulu na povrchu savčí buňky, která má strukturu a funkci již v publikacích popsanou (J. Immunol., 166(1), str. 1, 2001; J. Immunol., 165(9), str. 5 035, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun., 276(1), str. 335, 2000; Immunity, 13(1), str. 95, 2000; J. Exp. Med., 192(1), str. 53, 2000; Eur. J. Immunol., 30(4), str. 1040, 2000; Int. Immunol., 12(1), str. 51, 2000; Nátuře, 397(6716), str. 263, 1999; přístupové číslo GenBank Accession Number: BAA82129 (lidská); BA 82128 (krysí); BAA82127 (z varianty krysy); BAA82126 (myší)).

Zejména výhodně tento termín označuje AILIM lidského původu (např. International Immunology, Sv. 12(1), str. 51 až 55, 2000).

Molekula AILIM je také nazývána ICOS (Nátuře, Sv. 397, č. 6716, str. 263 až 266, 1999) nebo JTT-1 antigen/JTT-2 antigen (neprozkoumaná publikovaná japonská patentová přihláška č. (JP-A) Hei 11-29 599, mezinárodní patentová přihláška č. WO98/38 216). Všechny tyto molekuly se vztahují ke stejné molekule.

Kromě toho molekula „AILIM“ uváděná v tomto vynálezu zahrnuje polypeptid, který má aminokyselinové sekvence AILIM z každého savce popsaného v již dříve publikované literatuře a zejména výhodně také polypeptid, který má podstatně stejnou aminokyselinovou sekvenci jako je sekvence lidské AILIM. Mezi molekuly „AILIM“ podle předmětného vynálezu jsou zahrnuty také varianty lidské AILIM, které jsou podobné dříve identifikovaným variantám AILIM pocházejících z potkana (přístupové číslo GenBank Accession Number: BAA82127).

Slovní spojení „který má podstatně stejnou aminokyselinovou sekvenci“ znamená, že „AILIM“ podle předmětného vynálezu zahrnuje polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci, v níž bylo substituováno, deletováno a/nebo modifikováno více aminokyselin,

• · · · « · • · · • · · · · • · · • · ·

.....

výhodněji 1 až 10 aminokyselin, zejména výhodně 1 až 5 aminokyselin a polypeptidy, které mají aminokyselinové sekvence, do nichž bylo přidáno více aminokyselin, výhodněji 1 až 10 aminokyselin, konkrétně výhodně 1 až 5 aminokyselin a to pokud polypeptidy mají podstatně stejné biologické vlastnosti jako polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v předcházejících zprávách.

Těchto substitucí, delecí nebo inzercí aminokyselin je možno dosáhnout běžnými postupy (Experimental Medicine: SUPPLEMENT, „Handbook of Genetic Engineering“ (1992), atd.).

Mezi příklady těchto postupů patří např. místní mutace syntetického oligonukleotidu (mutace za vzniku dvouřetězcové struktury s mezerami), bodová mutace, kterou je za pomoci dusitanu nebo siřičitanu náhodně začleněna bodová mutace, postup jímž je pomocí enzymu Bal31 připraven deleční mutant atd., kazetová mutace, snímání za pomoci spojovače, chybná inkorporace, chybné párování s primerem, syntéza úseku DNA atd.

Místní mutace syntetického oligonukleotidu může být provedena např. následovně. Oblast, která má být mutována, je klonována do fágového vektoru Ml3, který má mutaci amber, s cílem připravit jednořetězcovou fágovou DNA. Poté co je DNA RF I vektoru Ml 3, který nemá mutaci amber, působením restrikčních enzymů linearizována, je DNA smísena s výše zmíněnou jednovláknovou fágovou DNA, je denaturována a připojena, čímž vznikne „dvouřetězcová DNA s mezerami“. Syntetický oligonukleotid, do něhož jsou mutace začleněny, je hybridizován s dvouřetězcovou DNA s mezerami a reakcí s DNA polymerázou a DNA ligázou je připravena cirkulární dvojvláknová DNA. Touto DNA jsou transfekovány buňky E. coli mutS, které nemají dostatečnou aktivitu opravující chybné páry. Buňky E. coli, které nemají žádnou supresorovou aktivitu, jsou rostoucími fágy infikovány a pouze fágy, které nemají mutace amber jsou testovány a vybrány.

Způsob, jímž je pomocí dusitanu začleněna bodová mutace, využívá např. princip, který je zmíněn níže. Jestliže je DNA ošetřena dusitanem, jsou nukleotidy deaminovány, aby mohlo dojít ke změně adeninu na hypoxantin, cytosinu na uráčil a guaninu na xantin. Je-li deaminovaná DNA začleněna do buněk, jsou „A:T“ a „G:C“ nahrazeny „G:C“ a „A:T“, protože hypoxantin, uráčil a xantin se při replikaci DNA párují s cytosinem, adeninem a thyminem. Takže fragmenty jednovláknové DNA ošetřené dusitanem jsou hybridizovány s „dvouřetězcovou DNA s mezerami“ a potom jsou mutantní kmeny odděleny stejným způsobem jako v případě místně řízené mutace syntetického oligonukleotidu.

Termín „cytokin“, který se v předmětném vynálezu vyskytuje ve spojení „produkce cytokinu buňkami exprimujícími AILIM“ znamená libovolný cytokin produkovaný buňkami exprimujícími AILIM (zejména T-buňkami).

·· ····

I ·»·· • · • ··· • · · • ♦ ♦ * • · · · ·· ··

Příklady T buněk jsou T buňky typu Thl a Th2 a cytokin podle předmětného vynálezu konkrétně znamená cytokin produkovaný T buňkami typu Thl a/nebo libovolný cytokin produkovaný T buňkami typu Th2.

Mezi cytokiny produkované T buňkami typu Thl patří IFN-γ, IL-2, TNF, IL-3 a mezi cytokiny produkované T buňkami typu Th2 patří IL-3, IL-4, IL-5, IL-10 a TNF (Cell, Sv. 30, č. 9, str. 343 až 346, 1988).

Termín látka, který je používán v předmětném vynálezu, zejména ve spojení „látka vykazující schopnost modulovat signální transdukci zprostředkovanou molekulou AILIM“ a zejména pak „látka vykazující schopnost inhibovat proliferaci buněk exprimujících AILIM nebo inhibovat produkci cytokinu buňkami exprimujícími AILIM“ znamená libovolnou přirozeně se vyskytující nebo uměle připravenou látku.

Spojení „signální transdukce zprostředkovaná molekulou AILIM“ znamená signální transdukci přes AILIM vedoucí ke změně fenotypu v buňkách exprimujících AILIM popsaných výše nebo v následujících příkladech provedení vynálezu (změna v proliferaci buněk, aktivace buněk, inaktivace buněk, apoptóza a/nebo schopnost produkovat libovolný cytokin z buněk exprimujících AILIM).

„Látka“ může být klasifikována jako „bílkovinná látka“ a „nebílkovinná látka“.

Příkladem „bílkovinných látek“ jsou následující polypeptidy, protilátky (polyklonální protilátky, monoklonální protilátky nebo části monoklonálních protilátek).

Je-li látkou protilátka, je to výhodněji monoklonální protilátka. Je-li látkou monoklonální protilátka, nezahrnuje pouze savčí monoklonální protilátky jiného než lidského původu, ale také následující rekombinantní chimérické monoklonální protilátky, rekombinantní polidštěné monoklonální protilátky a lidské monoklonální protilátky.

Je-li látkou polypeptid, pak zahrnuje následující polypeptidy, fragmenty polypeptidů (oligopeptidů), fúzní polypeptidy a chemicky modifikované polypeptidy. Příkladem oligopeptidů jsou peptidy obsahující 5 až 30 aminokyselin, výhodněji 5 až 20 aminokyselin. Chemická modifikace může být navržena podle různých hledisek např. za účelem zvýšit poločas rozpadu v krvi v případě podávání in vivo nebo za účelem zvýšit odolnost vůči degradaci nebo za účelem zvýšit absorpci v trávicím traktu při orálních aplikacích.

Příkladem polypeptidů jsou:

(1) Polypeptid obsahující celou extracelulární oblast AILIM nebo její část;

(2) Fúzní polypeptid obsahující celou extracelulární oblast AILIM nebo její část a celou konstatntní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu nebo její část; nebo (3) polypeptid, který se váže na AILIM ·· ···· ·· ···· ► · · ► · ··· ·· ··· • 1 ► · · 4 ·· ··

Příkladem nebílkovinných látek jsou DNA, RNA a chemicky syntetizované sloučeniny.

DNA zde znamená DNA, kterou lze použít jako protisměrnou DNA obsahující částečnou nukleotidovou sekvenci DNA kódující výše uvedenou molekulu AILIM (výhodněji lidskou AILIM) nebo z ní chemicky modifikovanou DNA, která může být navržena na základě DNA (cDNA nebo genomické DNA) kódující AILIM. Konkrétně, protisměrná DNA může inhibovat transkripci DNA kódující AILIM do mRNA nebo translaci mRNA do proteinu a to hybridizováním s DNA nebo RNA kódující AILIM.

Spojení částečná nukleotidová sekvence, které je zde používáno, se vztahuje k částečné nukleotidové sekvenci obsahující libovolný počet nukleotidů v libovolné oblasti. Částečná nukleotidová sekvence zahrnuje 5 až 100 po sobě jdoucích nukleotidů, výhodněji 5 až 70 po sobě jdoucích nukleotidů, ještě výhodněji 5 až 50 po sobě jdoucích nukleotidů a ještě výhodněji 5 až 30 po sobě jdoucích nukleotidů.

Je-li DNA použita jako protisměrná DNA, může být sekvence DNA částečně chemicky modifikována s cílem prodloužit poločas rozpadu (stabilitu) v krvi při podávání DNA pacientům, zvýšit permeabilitu DNA vnitřní cytoplasmatickou membránou nebo zvýšit odolnost vůči štěpení nebo absorpci orálně podávané DNA v trávicích orgánech. Mezi chemické modifikace patří např. modifikace fosfátové vazby, ribózy, nukleotidu, cukerné složky a 3 'konce a/nebo 5 'konce ve struktuře oligonukleotidové DNA.

Mezi modifikace fosfátových vazeb patří např. přeměna jedné nebo více vazeb na fosfodiesterové vazby (D-oligo), fosfothioátové vazby, fosfodithioátové vazby (S-oligo), methylfosfonátové (MP-oligo) vazby, fosfoamidátové vazby, nefosfátové vazby nebo fosfonothioátové vazby nebo jejich kombinace.

Mezi modifikace ribózy patří např. přeměna na 2 '-fluororibózu nebo 2'-methylribózu. Modifikace nukleotidu zahrnují například přeměnu na 5-propynyluracil nebo 2-aminoadenin.

Zde používaný termín RNA znamená RNA, kterou lze použít jako protisměrnou RNA, obsahující částečnou nukleotidovou sekvenci RNA kódující výše uvedenou molekulu AILIM (výhodněji lidskou AILIM) nebo z ní chemicky modifikovanou RNA, která může být navržena na základě RNA kódující AILIM. Protisměrná RNA může inhibovat transkripci DNA kódující AILIM do mRNA nebo translaci mRNA do proteinu, a to hybridizováním s DNA nebo RNA kódující AILIM.

Spojení částečná nukleotidová sekvence, které je zde používáno, se vztahuje k částečné nukleotidové sekvenci obsahující libovolný počet nukleotidů v libovolné oblasti. Částečná nukleotidová sekvence zahrnuje 5 až 100 po sobě jdoucích nukleotidů, výhodněji 5 až 70 po • · · · · ·· · · · ····· · · · · · • · ·· · ···· · i i ··· ······

II ·· ··· ··· ··· ·· ·· sobě jdoucích nukleotidů, ještě výhodněji 5 až 50 po sobě jdoucích nukleotidů a ještě výhodněji 5 až 30 po sobě jdoucích nukleotidů.

Sekvence protisměrné RNA může být částečně chemicky modifikována s cílem prodloužit poločas rozpadu v krvi při podávání RNA pacientům, zvýšit permeabilitu RNA vnitřní cytoplasmatickou membránou nebo zvýšit odolnost vůči štěpení nebo absorpci orálně podávané RNA v trávicích orgánech. Mezi chemické modifikace patří stejné modifikace jako v případě protisměrné DNA.

Mezi příklady chemicky syntetizované sloučeniny patří libovolná sloučenina kromě výše uvedené DNA, RNA a bílkovinných látek, jejíž molekulová hmotnost je přibližně 100 až l 000 nebo menší, výhodněji sloučenina, jejíž molekulová hmotnost je přibližně 100 až 800 a ještě výhodněji s molekulovou hmotností přibližně 100 až 600.

Termín polypeptid zahrnutý do definice výše uvedené látky znamená část (fragment) polypeptidového řetězce vytvářejícího AILIM (výhodněji lidskou AILIM), výhodněji celá extracelulární oblast polypeptidu vytvářejícího AILIM (l až 5 aminokyselin může být příležitostně přidáno na N-konec a/nebo C-konec oblasti) nebo její část.

Molekula AILIM podle předmětného vynálezu je transmembránová molekula pronikající buněčnou membránou, která obsahuje l nebo 2 polypeptidové řetězce.

Zde používané spojení transmembránový protein znamená protein, který je spojen s buněčnou membránou přes hydrofóbní oblast peptidu, který jednou nebo vícekrát proniká lipidovou dvojvrstvou membrány a jehož struktura je, jako celek, složena ze tří hlavních oblastí, což jsou extracelulární oblast, transmembránová oblast a cytoplasmatická oblast. Toto uspořádání lze pozorovat u mnoha receptorů nebo povrchových molekul buňky. Tento transmebránový protein tvoří každý receptor nebo povrchovou molekulu buňky jako monomer nebo jako homodimer, heterodimer nebo oligomer spojený s jedním nebo s více řetězci, které mají stejnou nebo různou aminokyselinovou sekvenci(e).

Termín extracelulární oblast zde znamená celou částečnou strukturu (částečnou oblast) celé struktury výše uvedeného transmembránového proteinu nebo jeho část, přičemž částečná struktura existuje vně membrány. Jinými slovy znamená celou oblast transmembránového proteinu nebo její část vyjma oblasti zahrnuté do membrány (transmembránová oblast) a oblasti existující v cytoplasmě, která následuje za transmembránovou oblastí (cytoplasmatická oblast).

Fúzní polypeptid zahrnutý do výše zmíněné bílkovinné látky” znamená fúzní polypeptid obsahující celou extracelulární oblast polypeptidu tvořícího AILIM nebo její část (výhodněji lidský AILIM) a celou konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu nebo její část (Ig, výhodněji lidského Ig). Výhodněji je fúzním polypeptidem takový fúzní polypeptid,

který má extracelulární oblast AILIM a část konstantní oblasti těžkého řetězce lidského imunoglobulinu a konkrétně výhodný je fúzní polypeptid extracelulární oblasti AILIM a oblasti (Fc) těžkého řetězce lidského IgG obsahující pantovou oblast, Ch2 doménu a Ch3 doménu. Jako IgG je výhodnější IgGl a jako AILIM je výhodnější lidská, myší nebo potkaní AILIM (výhodněji lidská).

Výraz celá konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu (Ig) nebo její část , který je zde používán, znamená konstantní oblast nebo Fc oblast těžkého řetězce imunoglobulinu lidského původu (H řetězec) nebo její část. Imunoglobulinem může být libovolný imunoglobulin náležící do jakékoliv třídy nebo podtřídy. Konkrétně imunoglobuliny zahrnují IgG (IgGl, IgG2, IgG3 a IgG4), IgM, IgA (IgAl a IgA2), IgD a IgE. Výhodněji je imunoglobulinem IgG (IgGl, IgG2, IgG3 a IgG4) nebo IgM. Příkladem konkrétně výhodných imunoglobulinů podle předmětného vynálezu jsou ty imunoglobuliny, které patří mezi IgG lidského původu (IgGl, IgG2, IgG3aIgG4).

Imunoglobulin má strukturu písmene Y, ve které se nacházejí čtyři řetězce složené ze dvou stejných lehkých řetězců (řetězce L) a dvou stejných těžkých řetězců (řetězce H) spojených dohromady prostřednictvím disulfídových vazeb (S-S vazby). Lehký řetězec je složen z variabilní oblasti lehkého řetězce (Vl) a konstantní oblasti lehkého řetězce (Cl). Těžký řetězec je složen z variabilní oblasti těžkého řetězce (Vh) a konstantní oblasti těžkého řetězce (Ch).

Konstantní oblast těžkého řetězce je složena z několika domén, jejichž aminokyselinové sekvence jsou specifické pro každou třídu (IgG, IgM, IgA, IgD a IgE) a každou podtřídu (IgGl, IgG2, IgG3 a IgG4, IgAl a IgA2).

Těžký řetězec IgG (IgGl, IgG2, IgG3 a IgG4) je v pořadí od N-konce složen z V_H domény, ChI, pantové oblasti, domény Ch2 a Ch3.

Podobně i těžký řetězec IgGl je ve směru od N-konce složen z Vh domény, Cyil, pantové oblasti, domény Cyi2 a Cyj3. Těžký řetězec IgG2 je ve směru od N-konce složen z Vh domény, Cy₂l, pantové oblasti, domény Cy₂2 a Cy₂3. Těžký řetězec IgG3 je ve směru od N-konce složen z Vh domény, Cy₂l, pantové oblasti, domény Cy₂2 a Cy₂3. Těžký řetězec IgG4 je ve směru od N-konce složen z V_H domény, Cy4l, pantové oblasti, domény Cy₄2 a Cy₄3.

Těžký řetězec IgA je ve směru od N-konce složen z Vh domény, Cal, pantové oblasti, domény Ca2 a Ca3.

Podobně těžký řetězec IgAl je ve směru od N-konce složen z Vh domény, Coti 1, pantové oblasti, domény Caj2 a Caj3. Těžký řetězec IgA2 je ve směru od N-konce složen z Vh domény, Ca₂l, pantové oblasti, domény Ca₂2 a Ca₂3.

• · ·· · • · • · · · ·

Těžký řetězec IgD je ve směru od N-konce složen z Vh domény, C51, pantové oblasti, domény CÓ2 a Có3.

Těžký řetězec IgM je ve směru od N-konce složen z V_H domény, Cpi, Cp2, Cp3 a Cp4 domény a nemá pantovou oblast jako je tomu u IgG, IgA a IgD.

Těžký řetězec IgE je ve směru od N-konce složen z V_H domény, Csl, Ce2, Cs3 a Cc4 domény a nemá pantovou oblast jako je tomu u IgG, IgA a IgD.

Je-li např. IgG podroben působení papainu, je štěpen v N-koncové oblasti před disulfídovými vazbami existujícími v pantové oblasti, kde disulfidové vazby spojují dva těžké řetězce za vzniku dvou stejných Fab, v nichž je fragment těžkého řetězce složený z Vh a C_H1 spojen s jedním lehkým řetězcem prostřednictvím disulfidové vazby; a jednoho Fc, v němž jsou dva stejné fragmenty těžkého řetězce složené z pantové oblasti, domény Ch2 a domény Ch3 spojeny prostřednitcvím disulfidových vazeb (viz Immunology Illustrated, původní 2. vydání, Nankodo, str. 65 až 75 (1992); a Focus of Newest Medical Science Recognition Mechanism of Immune Systém, Nankodo, str. 4 až 7 (1991); atd).

Zejména výše zmiňovaná část konstantní oblasti těžkého řetězce imunoglobulinu znamená část konstantní oblasti těžkého řetězce imunoglobulinu, která má výše uvedené strukturní charakteristiky a výhodněji to je konstantní oblast bez Cl domény nebo Fc oblasti. Konkrétním příkladem je oblast složená z pantové oblasti, domény C2, a domény C3 každého IgG, IgA a IgD nebo oblast složená z domény C2, domény C3 a domény C4 každého IgM a IgE. Konkrétně výhodným příkladem je Fc oblast IgGl lidského původu.

Fúzní polypeptid zmiňovaný výše má tu výhodu, že je velmi jednoduché ho přečistit pomocí afínitní kolonové chromatografíe, kde se využívá vlastností proteinu A, který se specificky váže na imunoglobulinový fragment, protože fúzní polypeptid podle předmětného vynálezu má část konstantní oblasti (např. Fc) imunoglobulinu jako je výše zmíněný IgG jako fúzního partnera. Kromě toho, protože jsou dostupné různé protilátky proti Fc různých imunoglobulinů, je velmi snadné provést imunostanovení fúzních polypeptidů za pomoci protilátek proti Fc.

Polypeptid, který se váže na AILIM je zahrnut v polypeptidů zahrnutém v definici výše uvedené látky.

Konkrétním příkladem polypeptidů, který se váže na AILIM je celý polypeptid nebo jeho část, obsahující známou molekulu označovanou jako B7h, B7RP-1, GL50 nebo LICOS, což je ligand, který interaguje s molekulou AILIM (Nátuře, Sv. 402, č. 6763, str. 827 až 832, 1999; Nátuře Medicine, Sv. 5, č. 12, str. 1365 až 1369, 1999; J. Immunology, Sv. 164, str. 1653 až 1657, 2000; Curr. Biol., Sv. 10, č. 6, str. 333 až 336, 2000).

Polypeptidem je výhodněji takový polypeptid, který obsahuje celou extracelulární oblast výše zmíněných ligandů (B7h, B7RP-1, GL50 nebo LICOS) nebo její část nebo fúzní polypeptid obsahující polypeptid a celou konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu (výhodněji lidského imunoglobulinu) nebo její část. Zde se vyskytující spojení extracelulární oblast a konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu mají stejný význam jako je uveden výše.

Polypeptidy, části polypeptidů (fragmenty) a fúzní polypeptidy, které jsou zmiňovány výše, nemusí být produkovány pouze technologií rekombinantní DNA jak je uvedeno níže, ale také způsobem, který je v dané oblasti techniky velmi dobře znám jako chemická syntéza nebo způsob buněčné kultury nebo jejich modifikace.

Protilátkou podle předmětného vynálezu může být polyklonální protilátka (antisérum) nebo monoklonální protilátka proti savčí AILIM (konkrétně výhodně lidské AILIM) definované výše a výhodněji monoklonální protilátka.

Protilátkou je taková protilátka, která vykazuje schopnost inhibovat proliferaci buněk exprimujících AILIM a to tím, že se váže na AILIM, nebo vykazuje schopnost inhibovat produkci interferonu-γ nebo interleukinu-4 a to buňkami exprimujícími AILIM prostřednictvím jejich vazby na AILIM.

Protilátky podle předmětného vynálezu mohou být přirozené protilátky získané imunizací savců jako jsou myši, krysy, křečci, morčata a králíci antigenem jako jsou buňky (přirozené buňky, buněčné linie, nádorové buňky apod.) exprimující AILIM podle předmětného vynálezu, transformanty připravené pomocí technologie rekombinantní DNA tak, aby došlo k nadměrné expresi AILIM na jejich povrchu, polypeptidy vytvářející AILIM nebo výše zmiňované fúzní polypeptidy obsahující polypeptid AILIM nebo extracelulární oblast molekuly AILIM. Mezi protilátky podle předmětného vynálezu patří také chimérické protilátky a polidštěné protilátky (CDR-štěpové protilátky, CDR-grafted antibodies), které mohou být produkovány technologií rekombinantní DNA a lidské protilátky, které mohou být produkovány pomocí transgenních zvířat produkujících lidské protilátky.

Mezi monoklonální protilátky patří protilátky libovolného isotypu IgG, IgM, IgA, IgD nebo IgE. IgG nebo IgM jsou výhodnější.

Polyklonální protilátka (antisérum) nebo monoklonální protilátka mohou být produkovány známými způsoby. Konkrétně jsou savci, výhodněji myš, krysa, křeček, morče, králík, kočka, pes, prase, koza, kůň nebo kráva nebo ještě výhodněji myš, krysa, křeček, morče nebo králík imunizováni antigenem, který je zmíněn výše, v případě potřeby spolu s Freundovým adjuvans.

Polyklonální protilátka může být získána ze séra takto imunizovaného zvířete. Monoklonální protilátky jsou produkovány následovně. Z buněk produkujících protilátku, které jsou získány z imunizovaného zvířete, a z myelomových buněk, které nejsou schopny produkovat vlastní protilátky, jsou připraveny hybridomy. Hybridomy jsou klonovány a vybrány jsou ty klony, které produkují monoklonální protilátky vykazující specifickou afinitu k antigenu, který byl použit pro imunizaci savce.

Konkrétně mohou být monoklonální protilátky připraveny následovně. Imunizace je prováděna jednou nebo vícekrát a to formou injekce nebo implantování výše zmíněného antigenu jakožto imunogenu, v případě potřeby spolu s Freundovým adjuvants, subkutánně, intramuskulárně, intravenózně, do tlapky nebo intraperitonálně do savce jiného než je člověk jmenovitě myši, krysy, křečka, morčete nebo králíka, výhodněji myši, krysy nebo křečka (včetně transgenního zvířete vytvořeného tak, aby produkovalo protilátky původem od jiného savce jako je např. transgenní myš produkující lidské protilátky, jak je to uvedeno níže). Imunizace jsou obvykle prováděny jednou až čtyřikrát, každá vždy po 1 až 14 dnech od první imunizace. Buňky produkující protilátky jsou z takto imunizovaného savce získány 1 až 5 dní po poslední imunizaci. Frekvence a interval imunizací může být zvolen podle např. vlastností použitého imunogenu.

Hybridomy, které vylučují monoklonální protilátku, mohou být připraveny způsobem podle Kohlera a Milsteina (Nátuře, Sv. 256, str. 495 až 497, (1975)) nebo způsobem, který je modifikací tohoto postupu. Konkrétně jsou hybridomy připraveny fúzí buněk, které produkují protilátku, obsažených ve slezině, místní uzlině, kostní dřeni nebo mandli, výhodněji ve slezině, které byly získány ze savce jiného než člověk imunizovaného výše uvedeným způsobem, s myelomy, které nemají schopnost produkovat vlastní protilátky a které pocházejí výhodněji ze savců jako je myš, krysa, morče, křeček, králík nebo člověk nebo ještě výhodněji myš, krysa nebo člověk.

Jako myelomy pro fúzi buněk mohou být použity například myelomy původem z myši P3/X63-AG8.653 (653), P3/NSI/l-Ag4-l (NS-1), P3/X63-Ag8.Ul (P3U1), SP2/0-Agl4 (Sp2/0, Sp2), PAI, FO, NSO nebo BW5147, myelom původem z krysy 210RCY3-Ag.2.3. nebo myelom lidského původu U-266AR1, GM1500-6TG-A1-2, UC729-6, CEM-AGR, D1R11 nebo CEM-T15.

Hybridomy produkující monoklonální protilátky mohou být testovány pomocí kultivace např. v mikrotitračních destičkách a vybrány na základě měření reaktivity supernatantu kultury v jamkách, v nichž je sledován růst hybridomu, vůči imunogenu, který byl použit k imunizaci např. pomoci enzymoimunoanalýzy jako je RIA nebo ELISA.

..... ··· ··· ··

Monoklonální protilátky mohou být produkovány z hybridomů, a to kultivací hybridomů in vitro nebo in vivo např. v ascitové tekutině myši, krysy, morčete, křečka nebo králíka, výhodněji myši nebo krysy, ještě výhodněji myši a izolováním protilátek ze vznikajícího supernatantu kultury nebo z ascitové tekutiny savce,

Kultivace hybridomů in vitro může být provedena v závislosti např. na vlastnosti buněk, které jsou kultivovány, na předmětu studie a na různých podmínkách kultivace, ve známých nutričních médiích nebo v libovolných nutričních médiích odvozených od známého základního média používaného pro růst, udržování a skladování hybridomů. Cílem kultivace je produkovat monoklonální protilátky v supernatantu kultury.

Mezi příklady základního média patří médium s nízkou koncentrací vápníku jako je např. médium Ham'F12, MCDB153 nebo MEM médium s nízkou koncentrací vápníku a médium s vysokou koncentrací vápníku, jako je médium MCDB104, MEM, D-MEM, RPMI1640, ASF104 nebo RD médium. Základní médium může obsahovat např. sérum, hormony, cytokiny a/nebo různé anorganické nebo organické látky.

Monoklonální protilátky mohou být izolovány a přečištěny ze supernatantu kultury nebo z ascitové tekutiny zmíněných výše, a to srážením nasyceným síranem amonným, srážením pomocí euglobulinu, pomocí kyseliny kapronové, kaprylové, pomocí ionexové chromatografie (DEAE nebo DE52) a afinitní chromatografie na koloně s protilátkou proti imunoglobulinu nebo s proteinem A.

Rekombinantní chimérická monoklonální protilátka je taková monoklonální protilátka, která je připravena způsoby genetického inženýrství a konkrétně znamená chimérickou protilátku jako je např. myší/lidská chimérická monoklonální protilátka, jejíž variabilní oblasti jsou odvozeny od imunoglobulinu savce jiného než člověk (myš, krysa, křeček atd.) a jejíž konstantní oblasti jsou odvozeny od lidského imunoglobulinu.

Konstantní oblast pocházející z lidského imunoglobulinu má aminokyselinovou sekvenci, která je jedinečná vždy pro každý isotyp jako je IgG (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD a IgE. Konstantní oblast rekombinantní chimérické monoklonální protilátky může být oblastí lidského imunoglobulinu náležícího k libovolnému isotypu. Výhodněji to je konstantní oblast lidského IgG.

Chimérická monoklonální protilátka může být produkována např. následovně. Není nutné říkat, že způsob produkce není omezen pouze na uvedený způsob.

Myší/lidská chimérická monoklonální protilátka může být připravena s odkazem na Experimental Medicine: SUPPLEMENT, Sv. 1.6, č. 10 (1988); a prozkoumanou publikovanou japonskou patentovou přihlášku č. (JP-B) Hei 3-73280. Jmenovitě může být připravena tak, že

jsou Ch gen (C gen kódující konstantní oblast H řetězce) získaný z DNA kódující lidský imunoglobulin a nacházející se proti směru transkripce (downstream) od aktivních Vh genů (přeskupený VDJ gen kódující variabilní oblast H řetězce) získaných z DNA kódující myší monoklonální protilátku izolovanou z hybridomu produkujícího myší monoklonální protilátku a Cl gen (C gen kódující konstantní oblast L řetězce) získaný z DNA kódující lidský imunoglobulin a nacházející se downstream od aktivních Vl genů (přeskupený VJ gen kódující variabilní oblast L řetězce) získaných z DNA kódující myší monoklonální protilátku izolovanou z hybridomu inzertovány do stejného nebo odlišného vektoru v expresibilním stavu. Poté následuje transformování hostitelských buněk expresním vektorem a kultivace transformantů.

Konkrétně, DNA jsou nejdříve obvyklými způsoby extrahovány z hybridomů produkujících myší monoklonální protilátky, poté jsou naštěpeny příslušnými restrikčními enzymy (např. EcoRI a HindlII), jsou podrobeny elektroforéze (např. v 0,7% agarózovém gelu) a poté jsou analyzovány pomocí Southern blotu. Po fixování elektroforetického gelu např. v roztoku ethidium bromidu a po vytofografování gelu je gel označen, dvakrát promyt vodou a je umístěn na 15 min. do 0,25 M HC1. Poté je gel za mírného míchání 10 min. promýván v 0,4 N roztoku NaOH. DNA jsou obvyklým způsobem přenášeny po dobu 4 h na filtr. Filtr je poté dvakrát promyt roztokem 2 x SSC. Poté co je filtr dostatečně vysušen, je zahříván při teplotě 75 °C po dobu 3 h. Poté je filtr podroben při teplotě 65 °C 30 min působení roztoku 0,1 x SSC/0,1% SDS. Poté je umístěn do roztoku 3xSSC/0,l% SDS. Získaný filtr je podroben působení prehybridizačního roztoku v plastovém sáčku po dobu 3 až 4 h při teplotě 65 °C.

Dále pak jsou do sáčku přidány ³²P-značená próba DNA a hybridizační roztok a reakce probíhá při teplotě 65 °C po dobu 12 h. Po ukončení hybridizace je filtr promýván vhodnou koncentrací soli, při vhodné reakční teplotě a po vhodnou dobu (např. 2x SSC/0,1% SDS, laboratorní teplota, 10 min.). Filtr je vložen do plastového sáčku, který obsahuje malý objem roztoku 2x SSC a po uzavření sáčkuje podroben autoradiografii.

Přeskupený VDJ gen a VJ gen kódující H řetězec a L řetězec myší monoklonální protilátky jsou identifikovány pomocí Southern blotu, který je zmíněn výše. Fragment obsahující identifikovaný DNA fragment je centrifugováním v hustotním gradientu sacharózy frakcionován a je inzertován do fágového vektoru (např. Charon 4A, Charon 28, XEMBL3 a ZEMBL4). Fágovým vektorem je transformována E. coli (např. LE392 a NM539) s cílem vytvořit genomovou knihovnu. Genomová knihovna je testována pomocí hybridizace plaků jako je např. metoda Benton-Davisova (Science, Sv. 196, str. 180 až 182 (1977)) za použití příslušných prób (J gen H řetězce, J gen L řetězce (k) apod.). Cílem je získat pozitivní klony obsahující přeskupený VDJ gen nebo VJ gen. Sestrojením restrikční mapy a stanovením nukleotidové • · ··· • · ·· · · · sekvence získaných klonů je potvrzováno, zda byly získány geny obsahující požadovaný přeskupený Vh (VDJ) gen nebo Vl (VJ) gen.

Jsou izolovány lidský Ch gen a lidský C_L gen použité pro chimerizaci. Například, je-li chimérická protilátka produkována s lidským IgGl, je Cyl gen izolován jako Ch gen a Ck gen jako Cl gen. Tyto geny mohou být izolovány z lidské genomové knihovny s myším Cyl genem a myším Ck genem, které odpovídají lidskému Cyl genu a lidskému Ck genu, jakožto próbami, což má tu výhodu, že mezi nukleotidovými sekvencemi myšího imunoglobulinového genu a lidského imunoglobulinového genu existuje vysoký stupeň homologie.

Konkrétně, DNA fragmenty obsahující lidský Ck gen a zesilující oblast jsou izolovány z genomové knihovny lidského λ Charon 4A HaelII-AluI (Cell, Sv. 15, str. 1157 až 1174 (1978)), např. pomocí HindlII-BamHI fragmentu klonu Igl46 o velikosti 3 kb (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, Sv. 75, str. 4 709 až 4 713 (1978)) a EcoRI fragmentu klonu MEP10 o velikosti 6,8 kb (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, Sv. 78, str. 474 až 478 (1981)) jako prób. Kromě toho např. poté co byla lidská zárodečná hepatocytová DNA naštěpena enzymem HindlII a byla frakcionována elektroforézou v agarózovém gelu, byl fragment o velikosti 5,9 kb inzertován do λ788 a poté byl pomocí výše uvedených prób izolován gen Cyl.

Pomocí takto získaného myšího Vh genu, myšího Vl genu, lidského Ch genu a lidského Cl genu a je-li brána v úvahu promotorová oblast a zesilující oblast, je do expresního vektoru jako je pSV2gpt nebo pSV2neo za pomoci příslušných restrikčních enzymů a DNA ligázy obvyklým způsobem inzertován lidský Ch gen downstream od myšího Vh genu a lidský Cl gen je inzertován downstream od myšího Vl genu. V tomto případě mohou být chimérické geny pro myší Vh gen/lidský Ch gen a pro myší Vl gen/lidský Cl gen inzertovány do stejného expresního vektoru nebo do různých expresních vektorů.

Takto připravený(é) expresní vektor(y) s inzertováným chimérickým genem jsou začleněny do myelomů, které neprodukují protilátky, např. P3X63.Ag8.653 buňky nebo SP210 buňky, pomocí fuze protoplastů, DEAE-dextranu, fosforečnanu vápenatého nebo pomocí elektroporace. Transformanty jsou testovány a vybírány pomocí kultivace v médiu obsahujícím léčivo, které odpovídá genu rezistence vůči danému léčivu, který byl inzertován do expresního vektoru a poté jsou získány buňky, které produkují požadované chimérické monoklonální protilátky.

Požadované chimérické monoklonální protilátky jsou získány ze supematantu kultury buněk produkujících protilátku, které jsou takto testovány.

Polidštěná monoklonální protilátka (CDR-štěpová protilátka) podle předmětného vynálezu je monoklonální protilátka připravená postupy genetického inženýrství a konkrétně * · * * · · · · · ·· ··· ··· ··· ·· ·· znamená polidštěnou monoklonální protilátku, kde část nebo celé oblasti určující komplementaritu hypervariabilního úseku pocházejí z oblastí určujících komplementaritu hypervariabilního úseku monoklonální protilátky savce jiného než člověk (myš, krysa, křeček, apod.), úseky základní struktury variabilní oblasti pocházejí z úseků základní struktury variabilní oblasti lidského imunoglobulinu a konstantní oblast pochází z konstantní oblasti lidského imunoglobulinu.

Oblasti určující komplementaritu hypervariabilního úseku existují v hypervariabilním úseku variabilní oblasti protilátky a znamenají tři oblasti, které se přímo a komplementárně vážou na antigen (zbytky určující komplementaritu, CDR1, CDR2 a CDR3). Úseky základní struktury variabilní oblasti znamenají čtyři poměrně konzervativní oblasti ležící po směru transkripce (upstream), proti směru transkripce (downstream) nebo mezi třemi oblastmi určujícími komplementaritu (úsek základní struktury, FR1, FR2, FR3 a FR4).

Jinými slovy polidštěná monoklonální protilátka znamená takovou protilátku, v níž byly všechny oblasti kromě části nebo celých oblastí určujících komplementaritu hypervariabilního úseku monoklonální protilátky savčího původu avšak jiného než lidského nahrazeny jejich odpovídajícími oblastmi pocházejícími z lidského imunoglobulinu.

Konstantní oblast pocházející z lidského imunoglobulinu má aminokyselinovou sekvenci jedinečnou vždy pro každý isotyp jako je IgG (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD a IgE. Konstantní oblastí polidštěné monoklonální protilátky podle předmětného vynálezu může být oblast lidského imunoglobulinu náležícího k libovolnému isotypu. Výhodněji to je konstantní oblast lidského IgG. Úseky základní struktury konstantní oblasti pocházející z lidského imunoglobulinu nejsou konkrétně vymezeny.

Polidštěná monoklonální protilátka může být produkována např. následovně. Není třeba zdůrazňovat, že tento způsob produkce není limitující.

Rekombinantní polidštěná monoklonální protilátka odvozená od myší monoklonální protilátky může být připravena např. technikami genetického inženýrství, viz publikovaný japonský překlad mezinárodní publikace (JP-WA) ě. Hei 4- 506 458 a JP-A Sho 62-296 890. Jmenovitě alespoň jeden CDR gen myšího H řetězce a alespoň jeden CDR gen myšího L řetězce, odpovídající CDR genu myšího H řetězce jsou izolovány z hybridomů, které produkují myší monoklonální protilátku a gen lidského H řetězce kódující celé oblasti kromě CDR lidského H řetězce odpovídající CDR myšího H řetězce, která je zmíněna výše, a gen lidského L řetězce kódující celou oblast kromě CDR lidského L řetězce odpovídající CDR myšího L řetězce zmíněné výše, jsou izolovány z lidských imunoglobulinových genů.

···· • · · • · ··· • · · ·· ·· · ·· «··· • · · ··· • · · · ·· ··

Takto izolovaný(é) CDR gen(y) myšího H řetězce a gen(y) lidského H řetězce jsou inzertovány do příslušného vektoru tak, aby mohly být exprimovány. Podobně pak CDR gen(y) myšího L řetězce a gen(y) lidského L řetězce jsou inzertovány do jiného vhodného vektoru tak, aby mohly být exprimovány. Někdy mohou být CDR gen(y) myšího H řetězce/gen(y) lidského H řetězce a CDR gen(y) myšího L řetězce/ gen(y) lidského L řetězce inzertovány do stejného expresního vektoru. Hostitelské buňky jsou transformovány takto připraveným expresním vektorem s cílem produkovat transformanty, které produkují polidštěnou monoklonální protilátku. Kultivací transformantů je ze supematantu kultury získána požadovaná polidštěná monoklonální protilátka.

Lidská monoklonální protilátka je imunoglobulin, v němž jsou celé oblasti obsahující variabilní a konstantní oblast H řetězce a variabilní a konstantní oblast L řetězce tvořící imunoglobulin odvozeny z genů kódujících lidský imunoglobulin.

Lidská protilátka (výhodněji lidská monoklonální protilátka) může být produkována dobře známými způsoby např. stejným způsobem jako v případě produkce polyklonálních nebo monoklonálních protilátek uvedených výše pomocí imunizace antigenem transgenního zvířete připraveného integrováním alespoň genu lidského imunoglobulinu do místa daného genu savce jiného než je člověk např. myši.

Transgenní myš produkující lidské protilátky je připravena např. způsobem, který je popsán v Nátuře Genetics, Sv. 7, str. 13 až 21 (1994); Nátuře Genetics, Sv. 15, str. 146 až 156 (1997); JP-WA Hei 4-504 365; JP-WA Hei 7-509 137; Nikkei Science, 6, str. 40 až 50 (1995); WO94/25 585; Nátuře, 368, str. 856 až 859 (1994); a JP-WA č. Hei 6-500 233.

Kromě toho mohou být rovněž použity nedávno vyvinuté způsoby přípravy proteinu lidského původu z mléka transgenní krávy nebo prasete (Nikkei Science, str. 78 až 84 (duben, 1997)).

Termín „část protilátky“, který je používán v předmětném vynálezu, znamená částečnou oblast monoklonální protilátky uvedené výše. Konkrétněji to znamená F(ab')2, Fab', Fab, Fv (variabilní fragment protilátky), sFv, dsFv (disulfidem stabilizovaný Fv) nebo dAb (protilátka s jednou doménou) (Exp. Opin. Ther. Patents, Sv. 6, č. 5, str. 441 až 456 (1996)).

„F(ab')2 a „Fab' “ mohou být produkovány působením proteázy jako je pepsin a papain na imunoglobulin (monoklonální protilátku) a znamenají fragment protilátky vytvořený štěpením imunoglobulinu blízko disulfídových vazeb v pantových oblastech, které existují mezi každými dvěma H řetězci. Například papain štěpí IgG upstream od disulfídových vazeb v pantových oblastech, které existují mezi každými dvěma H řetězci, za vzniku dvou homologních fragmentů protilátky, v nichž je L řetězec složen z Vl (variabilní oblast L řetězce) a Cl (konstantní oblast L ·· A··· » · A

AAAA > · A » A · • A AAA

A A AA řetězce) a fragment H řetězce složen zVh (variabilní oblast H řetězce) a Qfyl (γΐ oblast v konstantní oblasti H řetězce), spojených v C koncových oblastech disulfídovými vazbami. Každý z těchto dvou homologních fragmentů protilátky je označován jako Fab'. Pepsin také štěpí IgG downstream od disulfidových vazeb v pantových oblastech, které existují mezi každými dvěma H řetězci, za vzniku fragmentu protilátky, který je mírně delší než je fragment, v němž jsou dva výše zmiňované Fab ' spojeny v pantové oblasti. Tento fragment protilátky je označován jako F(ab')2.

Termín předmětného vynálezu „odhojení štěpu“ se vztahuje k různým imunitním odezvám, pomocí nichž se donor, jehož genetické vybavení je odlišné od genetického vybavení příjemce (tj. allogenní transplantace nebo xenogenní transplantace), pokouší odmítnout a eliminovat transplantát (část živého těla, která je transplantována; buňka, tkáň nebo orgán), a to proto, že příjemce transplantát rozpozná jako cizí látku. Imunitní odezvy, které tuto transplantaci doprovázejí, mohou být klasifikovány na (1) hyperakutní odmítnutí, což je silné odmítnutí, které se vyskytuje bezprostředně po transplantaci, (2) akutní odmítnutí, které je pozorováno v průběhu několika málo měsíců po transplantaci a (3) chronické odmítání pozorované několik měsíců po transplantaci. Kromě toho, ačkoliv se buněčná imunita díky imunokompetentním buňkám reprezentovaným T buňkami a humorální imunita díky protilátkám vyskytují ve velmi složitě kontrolovaném systému, hlavní odezvou je buněčná imunita.

Výsledkem odhojení štěpuje odumírání štěpu (nekrotizace) a jeho zaniknutí. Kromě toho se u pacienta kromě závažných systemických symptomů jako je horečka, leukocytóza a únava, objeví také otoky a citlivost v místě transplantace. Mimo to se mohou vyskytnout také závažné komplikace jako je infekce.

Konkrétně, je-li transplantován xenogenní štěp jako je štěp z prasete, dochází k závažnému problému hyperakutního odmítnutí, kdy je transplantát odmítnut během několika minut.

Termín „transplantát nebo štěp“ používaný v předmětném vynálezu se vztahuje k „orgánu nebo jeho části“ nebo k “tkáni“, které jsou transplantovány příjemci, kterým je savec, od dárce, kterým je také savec.

Spojení „orgán nebo jeho část“ vztahující se k transplantaci podle vynálezu se týká libovolného orgánu nebo jeho části, který tvoří živý organismus savce (výhodněji člověka nebo prasete a zejména výhodně člověka). Výhodnějším příkladem jsou játra, srdce, plíce, pankreas, ledvina, tlusté střevo, tenké střevo nebo jejich části. Zejména výhodná jsou játra nebo jejich část.

Termín „tkáň“ vztahující se k transplantaci podle předmětného vynálezu se týká libovolné tkáně, která pochází z živého organismu savce (výhodněji člověka nebo prasete a ··· · · · · 9 9 9 ····· · · * · · • · · · · ···· · • · · · · ···· ·· 999 999 999 99 99 výhodněji člověka). Výhodnějším příkladem je kůže, rohovka, kost nebo srdeční chlopeň; tyto příklady však nejsou v žádném směru limitující.

Termín předmětného vynálezu imunosupresivní činidlo se vztahuje k libovolnému jednomu nebo k více již existujícím imunosupresivním činidlům, která jsou používána k potlačení imunologického odmítnutí (odhojení štěpu) v příjemci, které je způsobeno transplantací štěpu v klinické transplantaci buněk, tkání nebo orgánů, jejichž výroba a prodej jako farmaceutického činidla byla povolena vládními institucemi; nebo k libovolnému jednomu nebo více imunosupresivním činidlům, které jsou v současnosti používány v klinických nebo preklinických zkouškách nebo budou použity v klinických zkouškách v budoucnosti a jejichž výroba a prodej jako farmaceutického činidla může být po zkouškách povolena vládní institucí.

Tato imunosupresivní činidla nejsou používána pouze samostatně, ale také v kombinaci se 2, 3, nebo více činidly. Termín imunosupresivní činidlo tedy zahrnuje použití jednoho typu farmaceutického činidla nebo kombinované použití více farmaceutických činidel (výhodněji použité v kombinaci se 2 nebo 3 činidly).

Imunosupresivní činidlo je výhodně např. jedno nebo více farmaceutických činidel vybraných ze skupiny, kterou tvoří cyklosporin (CsA); tacrolimus (FK-506); azathioprin (AZ); mykofenolát mofetil (MMF); mizoribin (MZ); leflunomid (LEF); adrenokortikoidní steroidy (jinak nazývané adrenokortikoidní hormony, kortikosteroidy, kortikoidy) jako je prednisolon a methyprednisolon; sirolimus (jinak označovaný rapamycin); deoxysperqualin (DSG); FTY720 (chemický název 2-amino-2-[2-(4-oktylfenyl)ethyl]-l,3-propandiol hydrochlorid) a CTLA4 lék popsaný níže. Zejména výhodné jsou buď tacrolimus (FK-506) nebo cyklosporin.

Termín podle předmětného vynálezu CTLA4 lék se vztahuje k léku, který jako aktivní složku obsahuje (1) polypeptid obsahující celý CTLA4 (včetně molekul s prakticky stejnou aminokyselinovou sekvencí) nebo celou extracelulární oblast lidského CTLA4 (cytotoxický antigen 4 spojený s T lymfocyty; <aminokyselinová sekvence> přístupové číslo GenBank Accession No. NP 005 205; <cDNA> přístupové číslo GenBank Accession No. NM 005 214 nebo pouze její část; (2) fúzní polypeptid obsahující celou extracelulární oblast lidského CTLA4 nebo její část a celý jiný protein nebo jeho část (zejména výhodněji celou konstantní oblast lidského imunoglobulinového těžkého řetězce nebo její část) (dále zkracováno jako CTLA4-IgFc nebo CTLA4-Ig); nebo (3) DNA, která může poskytnout savci (zejména výhodně člověku) polypeptid podle (1) nebo fúzní polypeptid podle (2) nebo vektor obsahující DNA (zejména výhodnější je plasmid obecně používaný v genové terapii nebo virový vektor pocházející z viru (retrovirus, adenovirus, virus vázaný na adenin atd.).

• · · · · · • · · · · ·

·· ·· · · · • « * · · • · · · · · • · · · · · «·· «·· ·· ··

Každý z termínů/spojení jako je extracelulární oblast, část, konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu, fúzní polypeptid, a prakticky stejný má stejný význam jako je definován výše.

Existuje řada zpráv o významném imunosupresivním účinku výše uvedeného CTLA4-Ig. Například významný imunosupresivní účinek látky Y100F (tyrosin v pozici 100 je nahrazen fenylalaninem) objevený firmou Bristol-Myers Squibb/Repligen byl potvrzen řadou experimentů na zvířatech a tento produkt patří rovněž mezi CTLA4 léky podle vynálezu (Igaku no Ayumi, Sv. 194, 14, str. 1 195 až 1 200, 2000; J. Clin. Invest., Vol. 103, str. 1 223 až 1 225, 1999;

N. Engl. J. Med., Sv. 335, str. 1 369 až 1 377, 1996; J. Exp. Med., Sv. 178, str. 1 801 až 1 806, 1993; Blood, Sv. 94, str. 2 523 až 2 529, 1999; Nátuře Med., Sv. 6, str. 464 až 469, 2000; Blood, Sv. 83, str. 3 815 až 3 823, 1995; J. Clin. Invest., Sv. 2, str. 473 až 482, 1998; Blood, Sv. 85, str. 2 607 až 2 612, 1995; N. Engl. J. Med., Vol. 340, str. 1 704 až 1 714, 1999; N. Engl. J. Med., Sv. 335, str. 1 369 až 1 377, 1996; J. Clin Invest., Sv. 103, str. 1 243 až 1 252, 1999).

Spojení podle předmětného vynálezu farmaceuticky přijatelný nosič zahrnuje masťový základ, ředidlo, plnidlo a rozvolňovadlo, stabilizátor, konzervační látku, pufr, emulzifikátor, aromatické látky, barvivo, sladidlo, činidlo zvyšující viskozitu, ochucovadlo, činidlo zvyšující rozpustnost nebo některá další aditiva. Za pomoci jednoho nebo více těchto nosičů může být farmaceutický prostředek formulován do tablet, pilulek, prášků, granulí, injekcí, roztoků, kapslí, pastilek, léčebných nápojů, suspenzí, emulsí, sirupů apod.

Farmaceutický prostředek může být podáván orálně nebo parenterálně. Mezi další formy parenterálního podávání patří roztok pro zevní aplikaci, čípky pro rektální aplikaci a pesar, které jsou předepisovány běžným způsobem a které mohou obsahují jednu nebo více aktivních složek.

Dávkování se může lišit podle věku, pohlaví, hmotnosti pacienta a podle symptomů které se u něj vyskytují, podle účinku léčby, způsobu podání, délky léčení, druhu aktivní přísady (látky podle předmětného vynálezu uvedené výše) obsažené ve farmaceutickém prostředku apod. Farmaceutický prostředek může být obvykle podáván dospělým v dávce 10 pg až 1 000 mg (nebo 10 pg až 500 mg) na jednu dávku. V závislosti na různých podmínkách může být v některých případech dostatečná dávka nižší než je dávka uvedená výše a v jiných případech může být dostatečná třeba dávka vyšší než je dávka zmíněná výše.

Injekce může být připravena rozpuštěním nebo suspendováním protilátky v netoxickém, farmaceuticky přijatelném nosiči jako je fyziologický roztok nebo komerčně dostupná destilovaná voda určená pro injekce, pomocí nichž se upravuje koncentrace na rozmezí 0,1 pg protilátky/ml nosiče až 10 mg protilátky/ml nosiče. Takto připravená injekce může být v případě, kdy je léčba nezbytně nutná, podána člověku v dávce od 1 pg do 100 mg/kg tělesné hmotnosti, • · · · · · • ··· • « • « » ··· • · · · · · · • · · · · • · · · · · • · · · · · ··· ··· ·· ·· výhodněji v rozmezí od 50 pg do 50 mg/kg tělesné hmotnosti, a to jednou nebo vícekrát za den. Příkladem způsobu aplikace jsou lékařsky vhodné způsoby aplikace jako je intravenózní injekce, subkutánní injekce, intradermální injekce, intramuskulámí injekce, intraperitonální injekce apod., výhodněji intravenózní injekce.

Injekce může být připravena také pomocí nevodného rozpouštědla (např. propylenglykol, polyethylenglykol, rostlinný olej jako je olivový olej, alkohol jako je ethanol), suspenze nebo emulze.

Injekce může být sterilizována filtrací přes filtr oddělující bakterie, smícháním s baktericidním činidlem nebo pomocí záření. Injekce může být připravena také tak, že se připraví až těsně před použitím. Zejména se jedná o lyofilizovaný sterilní pevný prostředek, který může být před použitím rozpuštěn ve sterilní destilované vodě určené pro injekce nebo v jiném rozpouštědle.

Farmaceutický prostředek podle předmětného vynálezu je použitelný zejména pro potlačení, prevenci a/nebo léčbu imunologického odmítnutí (odhojení štěpu), což je vážný problém při léčbách, kdy je od dárce transplantován (allogení transplantací nebo xenogení transplantací) příjemci trpícímu závažnou kardiovaskulární chorobou orgán (játra, srdce, plíce, ledvina, pankreas apod.) nebo jeho část nebo tkáň (jako je kůže, rohovka a kost).

Kromě toho může farmaceutický prostředek podle tohoto vynálezu zvýšit účinek na potlačení odhojení štěpu (imunologické odmítnutí) existujících imunosupresivních činidel podávaných za účelem potlačit odhojení štěpu během takových transplantací, kdy je farmaceutický prostředek použit v kombinaci s imunosupresivními činidly.

Popis obrázků ve výkresech

Obrázek 1 ukazuje vliv protilátky proti AILIM a/nebo imunosupresivního činidla na potlačení imunologického odmítnutí (odhojení štěpu) doprovázejícího transplantaci orgánu. Jako ukazatel, je použito prodloužení doby přežívání transplantátu v příjemci, jemuž byla transplantována játra od dárce.

Obrázek 2 ukazuje vliv protilátky proti AILIM a/nebo imunosupresivního činidla na potlačení imunologického odmítnutí (odhojení štěpu), jehož výskyt doprovází transplantaci orgánu. Jako ukazatel je použito prodloužení doby přežívání štěpu transplantovaných jater od dárce v příjemci.

Obrázek 3 ukazuje vliv protilátky proti AILIM (jinak nazývané protilátka proti ICOS) na potlačení imunologického odmítnutí (odhojení štěpu), jehož výskyt doprovází transplantace • · · · · · ·♦ ·

Ύ· wz......

• · · • · · · · : : :

• · · · · orgánu. Jako ukazatel je použito prodloužení doby přežívání transplantovaného srdce dárce v příjemci.

Obrázek 4 je fotografie ukazující stupeň infiltrace buněk exprimujících AILIM do transplantovaného srdce.

Obrázek 5 ukazuje vliv protilátky proti AILIM a/nebo AdCTLA4-Ig na potlačení imunologického odmítnutí (odhojení štěpu), jehož výskyt doprovází transplantace orgánu. Jako ukazatel je použito prodloužení doby přežití štěpu transplantovaného srdce dárce v příjemci.

Obrázek 6 ukazuje vliv anti-AILIM použité v kombinaci s AdCTLA4-Ig na potlačení imunologického odmítnutí (odhojení štěpu) doprovázející transplantaci orgánu. Jako ukazatel je použito přežívání štěpu transplantovaného srdce (primární transplantace srdce a sekundární transplantace srdce) a transplantované kůže (primánu transplantace kůže) v příjemci.

Příklady provedení vynálezu

Předmětný vynález bude nyní doložen specifickými příklady, které však nejsou sestaveny tak, aby byly vymezeny pouze na provedení popsaná v příkladech.

Příklad 1 Potlačení odhojení štěpu látkou modulující AILIM při transplantaci jater <1> Materiál a metody <1-1> Zvířata

Jako příjemci byly použity dospělé krysy kmene Lewis (samci, 210 až 250 g) a jako dárci krysy kmene DA (samci, 210 až 250 g).

<l-2> Monoklonální protilátka proti krysí AILIM

Byla použita monoklonální protilátka přečištěná z ascitové tekutiny nebo ze supematantu kultury získané in vitro nebo in vivo kultivací již dříve uvedeného hybridomu JTT-1 (tento hybridom byl uložen 11. října 1996 v National Institute of Bioscience and Human-Technology, Advanced Industrial Science and Technology, Ministry of Economy, Trade and Industry, což je mezinárodní depozitámí organizace certifikovaná v rámci Budapest Treaty. Mezinárodní přístupové číslo: FERM BP-5707). Tento hybridom produkuje myší monoklonální protilátku proti krysí AILIM (myší monoklonální protilátka proti krysímu JTT-1 antigenu) (JP-A Hei

11-29599 (příklady 1 a 2) a mezinárodní patentová přihláška č. WO 98/38216 (příklady 1 a 2)). Pro zjednodušení je tato protilátka dále označována jako protilátka proti AILIM.

<l-3> Transplantace jater

Játra dárce krysy kmene DA byla již známým způsobem podle Kamada a kol. transplantována příjemci, a to krysám kmene Lewis (Surgery, 93, str. 64, 1983; Transplantation, 30, str. 43, 1980; Transplantation, 28, str. 47,1979).

Konkrétně, játra získaná od krys kmene DA byla promyta proplachováním ledovou sterilní destilovanou vodou portální žílou. Poté byla zahájena transplantace jater kryse kmene Lewis a to pdvázáním supra-hepatální duté žíly. Poté byly pomocí speciální techniky portální žíla a inířa-hepatální dutá žíla propojeny (Transplant. Proč., 19, str. 1 158, 1987; Transplantation, 43, str. 745,1987).

Pokud krysa-příjemce zahynula v průběhu tří dnů po ukončení transplantace, bylo toto označeno jako technické selhání transplantace. Výsledkem experimentu byl procento úspěšnosti transplantace 95 %.

<l-4> Podání protilátky proti AILIM a/nebo imunosupresivního činidla

Po ukončení transplantace byly každé kryse kmene Lewis (každá skupina zahrnovala 5 až 9 zvířat) podána protilátka proti AILIM a/nebo imunosupresivní činidlo FK-506 v dávkách a v časech, které jsou popsány mze. Den, kdy byla transplantace ukončena, byl označen jako den 0 (0).

Jako kontrola byla použita skupina, které nebyla podána ani protilátka proti AILIM ani imunosupresivní činidlo FK-506.

1. Protilátka proti AILIM (1 mg/kg; intravenózní injekce; den 0)

2. Protilátka proti AILIM (1 mg/kg; intravenózní injekce; den 0 a den 6)

3. Protilátka proti AILIM (1 mg/kg; intravenózní injekce; den 0, 3 a 6)

4. Protilátka proti AILIM (1 mg/kg; intravenózní injekce; den 0,3, 6,9 a 12)

5. Protilátka proti AILIM (0,3 mg/kg; intravenózní injekce; den 0,3,6,9 a 12)

6. FK-506 (1 mg/kg; intramuskulámí injekce; den 0)

7. Protilátka proti AILIM (1 mg/kg; intravenózní injekce; den 0) a FK-506 (1 mg/kg; intramuskulámí injekce; den 0)

Doba přežívání štěpu transplantovaných jater v příjemci byla vyhodnocena a určena podle Kaplan-Meierova testu.

♦ · ···· • · • ··· • ··*· • · * • · · ·· ·*· <2> Výsledky

Výsledky jsou uvedeny na obr.l a obr. 2. Část dat na obr. 2 jsou aktualizovaná data z obr. 1.

Výsledkem experimentu byla skutečnost, že u skupiny, které byla 3 krát nebo 5 krát po transplantaci podána protilátka proti AILIM (1 mg/kg), bylo pozorováno významné prodloužení doby přežití štěpu transplantovaných jater ve srovnání s kontrolní skupinou.

Dále u skupiny, které byla 5 krát po transplantaci podána nízká dávka protilátky proti AILIM (0,3 mg/kg), bylo rovněž pozorováno významné prodloužení doby přežití štěpu transplantovaných j ater.

Dále bylo překvapivě zjištěno, že byla-li protilátka proti AILIM podána pouze jednou v kombinaci s FK-506, což je imunosupresivní činidlo používané v lékařství pro více účelů, byla doba přežití štěpu transplantovaných jater velmi prodloužena a byla podstatně delší než v případě, když bylo jednou podáno pouze FK-506.

Na základě těchto výsledků bylo oznámeno následující:

1) Protilátka proti AILIM významně potlačuje odhojení štěpu (imunologické odmítnutí), které doprovází transplantaci štěpu např. orgánu.

2) Odhojení štěpu, které doprovází transplantaci transplantátu jako je orgán, může být použitím protilátky proti AILIM v kombinaci s imunosupresivním činidlem ještě více potlačeno v porovnání s případem, kdy je použito pouze jedno z nich.

Příklad 2 Potlačení imunologického odmítnutí látkou modulující AILIM při transplantaci srdce.

< 1 > Činidla, zvířata a způsoby testování <1-1> Dospělé myši kmene C3H/He (samci, 6 týdnů staří) byly použity jako příjemci a myši kmene BALB/c (samci, 6 týdnů staří) jako dárci.

<l-2> Příprava monoklonální protilátky proti myši AILIM

Příprava byla provedena následovně:

Pomocí cDNA kódující celou aminokyselinovou sekvenci již dříve uvedené myší AILIM (Int. Immunol., Sv. 12, 1, str. 51 až 55, 2000) byla standardním způsobem za pomoci genové rekombinantní technologie připravena transformovaná buňka exprimující myší AILIM.

<· 9999

9 9

9 9·· • · 9 9 •9 · •9 999 • 9 ···· • · 9 • 9 9 • · 9 9 • ♦· 9

99

9 • · • 9 9 9 • 9 9999 • · 9

9

Transformovaná buňka byla homogenizována a odstředěna na ultracentrifuze (100 OOOxg) a odstředěný zůstatek obsahující membránovou frakci byl shromážděn a suspendován v PBS. Získaná membránová frakce byla v rámci první imunizace (den 0) injekcí vpravena spolu s kompletním Freundovým adjuvans do tlapky krysy kmene Wistar. Dále byla membránová frakce podávána jako antigen do tlapky v den 7, den 14 a den 28. Dva dny po poslední imunizaci byly shromážděny buňky místních uzlin.

Buňky místních uzlin a buňky myšího myelomu PAI (JCR č. B0113; Res. Disclosure, Sv. 217, str. 155, 1982) byly smíseny v poměru 5:1 a tuzí buněk za pomoci fuzního činidla polyethylenglykolu 4000 (Boehringer Mannheim) byl připraven hybridom produkující monoklonální protilátku. Výběr hybridomu byl proveden prostřednictvím kultivace v médiu ASF104 s HAT (Ajimoto) obsahujícím 10% zárodečné telecí sérum a aminopterin.

Pomocí průtokového cytometru EPICS-ELITE byla měřena intenzita fluorescence buněk fixovaných reakcí supematantů kultury každého hybridomu s výše uvedenými rekombinantmmi transfekovanými buňkami exprimujícími myší AILIM a poté reakcí s anti-krysími IgG značenými FITC (Cappel). Cílem měření bylo potvrdit reaktivitu monoklonálních protilátek produkovaných v supematantu kultury každého hybridomu vůči myší AILIM. Výsledkem byl zisk několika hybridomů, které produkovaly monoklonální protilátky, které vykazovaly reaktivitu vůči myší AILIM.

Jeden z těchto hybridomů byl pojmenován B10.5. Tento hybridom (10⁶ až 10⁷ buněk/0,5 ml/myš) byl injekcí vpraven intraperitonálně do ICR myši kmene nu/nu (samice, 7 až 8 týdnů staré). Po deseti až dvaceti dnech byla myši v anestézii provedena laparotomie a z ascitu bylo standardním postupem připraveno větší množství krysí monoklonální protilátky proti myší AILIM (IgG2a). Dále je tato protilátka pro zjednodušení označována jako protilátka proti AILIM.

<l-3> Transplantace srdce

Postupem, který byl již uveden dříve, byla transplantována srdce dárce myši kmene BALB/c do břicha příjemce myši kmene C3H/He. Vymizení pulsace transplantovaného srdce bylo považováno za ukončení odhojení štěpu.

<2> pokus 1 (podání protilátky proti AILIM)

Každé myši kmene C3H/He (10 myší), u nichž byla provedena transplantace, byla podána protilátka proti AILIM (10 mg/kg), a to bezprostředně po transplantaci (den 0; 200 pg), v • 9

9999

9 9

9 999 ·· 9 •9 9

999 •9 9999 • 9 ·

9 9 • · 9 9

9 9 9 ·· 99

9 • 9 9

9 9 • · 9 99 • 9 9

9 den 2 (200 gg), v den 4 (200 gg), den 7 (200 gg) a den 10 (100 gg). Jako kontrola byla použita skupina (25 myší), které nebyla podána žádná protilátka proti AILIM.

Doba přežívání štěpu transplantovaného srdce v příjemci po transplantaci byla zjištěna a stanovena pomocí Kaplan-Meierova testu.

Průměrná doba přežití štěpu transplantovaného srdce u příjemců byla následující: (skupina, jíž byla podávána protilátka proti AILIM) doba přežití štěpu: 9 dní u 1 myši, 10 dní u 3 myší, 13 dní u 4 myší, 16 dní u 2 myší (kontrolní skupina) doba přežití štěpu: 6 dní u 2 myší, 7 dní u 9 myší, 8 dní u 7 myší, 9 dní u 3 myší, 10 dní u myší doba přežití štěpu u kontrolní skupiny, jíž nebyla protilátka proti AILIM podána, byla 7,9 dní, a naopak u skupiny, které protilátka proti AILIM podána byla, to bylo 12,3 dní. U skupiny, které byla podána protilátka proti AILIM, bylo rovněž prokázáno významné prodloužení doby přežití štěpu transplantovaného srdce.

<3> pokus 2 (podání protilátky proti AILIM)

Zvířata (dárci a příjemci) a protilátka proti AILIM, které byly použity, byly stejné jako tomu bylo výše.

Transplantace srdce byla provedena stejným způsobem jako v pokusu 1.

Každé myši kmene C3H/He, u které byla provedena transplantace, byla intraperitonálně aplikována protilátka proti AILIM (100 gg/den), a to bezprostředně po transplantaci (den 0), v den 2, v den 4, den 7 a den 10. Jako kontrola byla použita skupina, které nebyla podána protilátka proti AILIM.

Průměrná doba přežití štěpu transplantovaného srdce v příjemci myši byla přibližně 7,7 dní u kontrolní skupiny, zatímco u skupiny, které byla podávána protilátka proti AILIM, to bylo přibližně 40,9 dní (střední hodnota: 29 dní/ maximální hodnota: 120 dní) (obr. 3). U skupiny, které byla podávána protilátka proti AILIM, bylo rovněž prokázáno významné prodloužení doby přežití štěpu transplantovaného srdce.

Kromě toho u každé kontrolní myši (bez terapeutické léčby po transplantaci srdce) a u myší, kterým byla po transplantaci podána protilátka proti AILIM, byl standardní metodou fixování hematolyxylinem/eosinem (HE fixování) analyzován stupeň infiltrace buněk exprimujících AILIM (ICOS) do transplantovaného srdce.

• 9 99·· ·· 9999 • · • 9

9 <

• 9 9 • 9 9 9 ·· 9 9999

9 9

9

U neléčené skupiny byla pozorována významná infiltrace buněk exprimujících AILIM (ICOS) i nekróza srdečního svalu (fixovaná část). Na druhé straně u transplantovaného srdce myši, které byla podána protilátka proti AILIM, nebyla pozorována žádná nekróza srdečního svalu a bylo potvrzeno významné snížení infiltrace buněk exprimujících AILIM (ICOS) (obr. 4).

Příklad 3 Potlačení imunologických odmítnutí látkami modulujícími AILIM při transplantacích srdce a kůže <1 > Činidla, zvířata a způsoby testování < 1 -1 > Adenovirový vektor

Rekombinantní adenovirus obsahující expresní kazetu buď cDNA kódující hCTLA4-Ig (fuzní protein obsahující extracelulámí oblast lidské CTLA4 a lidského Fc) nebo gen pro β-galaktosidázu z E. coli (lacZ) byl produkován homologní rekombinací mezi expresní kosmidovou kazetou pAdex/CAhCTLA4-Ig (Transplantation, Sv. 68, 6, str. 758, 1999) a genomem rodičovského kmene adenoviru (Proč. Nati. Acad. Sci. USA., Sv. 90,24, str. 11 498 až 11 502, 1993).

Poté byl rekombinantní virus namnožen v linii buněk 293 pocházející z lidské ledviny. Takto připravený virový vektor byl shromážděn a skladován zmrazením na -80 °C. Rekombinantní adenovirus obsahující cDNA hCTLA4-Ig byl pojmenován AdCTLA4-Ig a adenovirus obsahující LacZ byl pojmenován AdLacZ.

<l-2> Zvířata a protilátka

Dospělí samci krysy kmene Lewis (RT¹) (210 až 250 g) byli použiti jako příjemci a dospělí samci krysy kmene DA (RTl^a) nebo krysy kmene BN (RTlⁿ) (210 až 250 g) byli použiti jako dárci.

Dále byla použita myší monoklonální protilátka proti krysí AILIM připravená v příkladu

1.

<l-3> Transplantace srdce a kůže a způsob testování

Srdce získaná z krys kmene DA byla transplantována již známým postupem (J. Thorac.

Cardiovasc. Surg., Sv. 57, 2, str. 225 až 229, 1969) do břicha krys kmene Lewis. Bezprostředně po transplantaci srdce byla příjemcům intravenózně v jediné dávce podána protilátka proti krysí AILIM (1 mg/kg) a/nebo AdCTLA4-Ig (10⁹ jednotek tvořících plaky; pfu).

·· ·««· • · 999 • · 9 9 • · 9 ·· 999 •9 99*9

9 9 •99 • · 9 • 9 9 9

9· 99 • 9

9 9 • 999

9

Jako kontrola byla použita skupina transplantovaných zvířat, kterým nebyla podána ani protilátka proti krysí AILIM ani AdCTLA4-Ig a skupina transplantovaných zvířat, kterým byl podán AdLacZ. Způsob léčby každé skupiny zvířat je uveden mže.

Skupina 1: Allogenní transplantace (Lewis/DA) bez imunosupresivní léčby

Skupina 2: Isogenní transplantace (Lewis/Lewis) bez imunosupresivní léčby

Skupina 3: Allogenní transplantace (Lewis/DA) s podáním AdLacZ

Skupina 4: Allogenní transplantace (Lewis/DA) s podáním AdCTLA4-Ig

Skupina 5: Allogenní transplantace (Lewis/DA) s podáním protilátky proti AILIM

Skupina 6: Allogenní transplantace (Lewis/DA) s podáním AdCTLA4-Ig a protilátky proti AILIM

Vymizení pulsace transplantovaného srdce bylo považováno za ukončení odhojení štěpu. Odhojem štěpu bylo potvrzeno histologicky analýzou monojademých buněk, které se infiltrovaly do tkáně transplantovaného srdce a nekrózou svalových buněk standardním postupem resp. HE fixací.

Do postranní hrudní stěny příjemců skupiny 4 a skupiny 6, u nichž transplantované srdce přežívalo dlouhou dobu, byl 140 den po transplantaci srdce transplantován dostatečně silný štěp kůže od dárce krysy kmene DA. Po transplantaci kůže nebyla použita imunosupresivní léčba protilátkou proti AILIM, AdCTLA4-Ig nebo podobných. Konec doby odhojení štěpu kůže byl stanoven tehdy, když stupeň vizuálně pozorovatelného štěpu kůže poklesl na 10 % nebo méně v porovnáním s počátečním stavem.

Poté bylo 200. den po první transplantaci srdce krysy kmene DA pomocí speciální techniky (Acta. Pathol. Microbiol. Scand. [A], Sv. 79, 4, str. 366 až 372, 1971) znovu transplantováno srdce dárce krysy kmene DA do krční oblasti 3 příjemců ze skupiny 6, u kterých docházelo k náznakům odhojení štěpu po transplantaci kůže dárce.

150. den od první transplantace srdce od dárců krysy kmene DA byla srdce dárců krysy kmene BN transplantována zbývajícím krysám ze skupiny 6, u nichž transplantované srdce přežívalo dlouho.

Statistické vyhodnocení stupně přežívání transplantátu u příjemců bylo provedeno podle Kaplan-Meierova testu.

<2> Výsledky experimentu

Jak je uvedeno na obr. 5, výrazné prodloužení doby přežívání štěpu transplantovaného srdce u příjemců, nebylo ve srovnání se skupinou neléčených zvířat, u nichž byla provedena

• · • · • · · • ··· • · xenogenní transplantace (skupina 1), pozorováno u skupiny zvířat, kterým byl podáván AdLacZ (skupina 3) a u skupiny zvířat, kterým byla aplikována jedna dávka protilátky proti AILIM (skupina 5).

Na druhé straně u skupiny zvířat, kterým byl podáván AdCTLA4-Ig (skupina 4) byla doba přežívání štěpu transplantovaného srdce (původně transplantovaného srdce krysy kmene DA) významně prodloužena (průměr: přibližně 64 dní). Kromě toho u tří krys ze skupiny 4 (10 krys) byla zjištěna doba přežívání štěpu transplantovaného srdce 100 dní nebo déle (Obr. 5).

Dále, u skupiny zvířat, u nichž byla použita kombinace AdCTLA4-Ig a protilátky proti AILIM (skupina 6), byla doba přežívání štěpu transplantovaného srdce (původní srdce krysy kmene DA) prodloužena neomezeně (300 dní a déle) u všech příjemců (obr. 5).

U příjemců ze skupiny 4 bylo transplantované srdce (původně transplantované srdce dárce krysy kmene DA) odmítnuto spolu s odmítnutím transplantované kůže, zatímco u příjemců skupiny 6 nebylo odmítnutí transplantovaného srdce pozorováno.

Jak je ukázáno na obr. 6, došlo u všech příjemců skupiny 4 a skupiny 6, kteří byli podrobeni transplantaci kůže od dárce, k odmítnutí transplantované kůže. U skupiny 6 však bylo v porovnání se skupinou 4 a kontrolní skupinou, u nichž došlo k úplnému odhojení transplantované kůže po 12 dnech nebo méně po transplantaci kůže, úplné odhojení poněkud zpožděno a bylo zjištěno po 16 dnech nebo méně. Tento výsledek ukazuje, že kombinované použití AdCTLA4-Ig a protilátky proti AILIM může posunout odhojení transplantované kůže ve srovnání s případem, kdy je použit pouze AdCTLA4-Ig.

Zajímavé je, že u příjemců ze skupiny 6, u nichž bylo potvrzeno dlouhodobé přežívání štěpu transplantovaného srdce (původní srdce krysy kmene DA), byla transplantovaná kůže zcela odmítnuta, viz výše, ale bylo pozorováno přežívání transplantátu po neomezenou dobu u podruhé transplantovaného srdce (srdce dárce krysy kmene DA transplantované podruhé). Kromě toho u příjemců původně transplantované srdce dárce přežívalo experiment.

U příjemce ze skupiny 6, jemuž byla transplantována srdce dárce krysy kmene DA, původně transplantovaná srdce krysy kmene DA pulsovala dále a v průběhu experimentu přežívala, ale srdce dárce krysy kmene BN transplantovaná podruhé byla odhojena za dobu, která je podobná výsledkům u zvířat skupiny 1.

Průmyslová využitelnost

Farmaceutické prostředky podle předmětného vynálezu jsou velmi využitelné při potlačování, prevenci a/nebo při léčbě imunologického odmítnutí (odhojení štěpu), což je vážný ·· ··»· • · · · · I • ···« » · φ • · · ♦ · . « • ♦ · · · · I ·· ··· ·· ·· ·» ···· ·· · • · · • »·· problém, který transplantace (allogenní transplantace nebo xenogenní transplantace) orgánů (játra, srdce, plíce, ledviny, pankreas atd.), jejich částí nebo tkání (kůže, rohovka, kost atd.) od dárce příjemcům, kteří trpí závažnými kardiovaskulárními onemocněními, doprovází.

Farmaceutické prostředky podle předmětného vynálezu mohou také výrazněji potlačit odhojení štěpu, a to tehdy, jsou-li použity v kombinaci s již existujícími imunosupresivy, které jsou podávány za účelem potlačit odhojení štěpu (imunologická odmítnutí) u těchto transplantací.

Farmaceutický prostředek, který obsahuje lidskou protilátku proti AILIM, zahrnutý do farmaceutických prostředků podle tohoto vynálezu, je velmi užitečným lékem, protože ani v případě, že je protilátka pocházející od myši podávána lidem, nemá žádné vedlejší účinky jako je alergie.

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   Farmaceutický prostředek určený k potlačení, léčbě nebo prevenci odhojení štěpu, které doprovází transplantaci orgánu, jeho části nebo tkáně, vyznačující se t í m, že obsahuje látku, která vykazuje schopnost modulovat signální transdukci zprostředkovanou AILIM a farmaceuticky přijatelný nosič.

   Farmaceutický prostředek určený ke zvýšení účinku jednoho nebo více imunosupresivních činidel na potlačení, léčbu nebo prevenci odhojení štěpu, které doprovází transplantaci orgánu, jeho části nebo tkáně, vyznačující se tím, že obsahuje látku, která vykazuje schopnost modulovat signální transdukci zprostředkovanou AILIM a farmaceuticky přijatelný nosič.

   Farmaceutický prostředek podle nároku 2, v y z n a č u j í c í se t í m, že zmíněným imunosupresivním činidlem je jedno nebo více terapeutických činidel vybraných ze skupiny, kterou tvoří azathioprin, adrenokortikoidní steroid, cyklosporin, mizoribin a tacrolimus (FK-506), mykofenolát mofetil, leflunomid, sirolimus, deoxysperqualin, FTY720 a CTLA4 lék.

   Farmaceutický prostředek podle libovolného nároku 1 až 3, v y z n a č u j í c í se tím, že zmíněnou transplantací je alogenní transplantace.

   Farmaceutický prostředek podle libovolného nároku 1 až 3, v y z n a č u j í c í se tím, že zmíněnou transplantací je xenogenní transplantace.

   Farmaceutický prostředek podle libovolného nároku 1 až 5, v y z n a č u j í c í se tím, že zmíněným orgánem jsou játra, srdce, ledviny, plíce nebo pankreas.

   Farmaceutický prostředek podle libovolného nároku 1 až 5,vyznačující setím, že zmíněnou tkání je kůže, rohovka nebo kostní tkáň.

   Farmaceutický prostředek podle libovolného nároku 1 až 7, v y z n a č u j í c í se tím, že zmíněnou látkou je bílkovinná látka.

   ·· ···· • · · · · * · · ·· 999 ··· ··· ·· ♦·

   9. Farmaceutický prostředek podle nároku 8, vyznačující se tím, že zmíněná bílkovinná látka je vybrána ze skupiny, kterou tvoří:

   a) protilátka, která se váže na AILIM nebo část zmíněné protilátky;

   b) polypeptid obsahující celou extracelulární oblast AILIM nebo její část;

   c) fúzní polypeptid obsahující celou extracelulární oblast AILIM nebo její část a celou konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu nebo její část; a

   d) polypeptid, který se váže na AILIM.

   10. Farmaceutický prostředek podle libovolného nároku laž 7, vyznačující se tím, že zmíněnou látkou je nebílkovinná látka.

   11. Farmaceutický prostředek podle nároku 10, v y z n a č u j i c i se t i m, že zmíněnou nebílko vinnou látkou je DNA, RNA nebo chemicky syntetizovaná sloučenina.