ES2290052T3 - Moleculas gl50 y usos para las mismas. - Google Patents

Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende la secuencia de nucleótido establecida en la SEQ ID NO: 1, 3, o 5.

Description

Moléculas GL50 y usos para las mismas.

Antecedentes de la invención

Con el fin de que las células T respondan a las proteínas extrañas, se deben suministrar dos señales por las células que presentan antígeno para reposar linfocitos T (APC) (Jenkins, M. y Schwartz, R. (1987) J. Exp. Med. 165:302-319; Mueller, D. L. et al. (1990) J. Immunol. 144:3701-3709). La primera señal, que le confiere especificidad a la respuesta inmune, es transducida por vía del receptor de célula T (TCR) luego del reconocimiento del péptido antigénico extraño presentado en el contexto del complejo de histocompatibilidad principal (MHC). La segunda señal, denominada coestimulación, induce las células T a proliferar y a hacerse funcionales (Lenschow et al. (1996) Annu. Rev. Immunol. 14:233). La coestimulación no es específica de antígeno, ni restringida a MHC y se cree que es suministrada por una o más moléculas de superficie de célula distintas expresadas por los APC (Jenkins, M. K. et al. (1988) J. Immunol. 140:3324-3330; Linsley, P. S. et al. (1991) J. Exp. Med. 173:721-730; Gimmi, C. D. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:6575-6579; Young, J. W. et al. (1992) J. Clin. Invest 90:229-237; Koulova, L. et al. (1991) J. Exp. Med. 173:759-762; Reiser, H. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:271-275; van-Seventer, G. A. et al. (1990) J. Immunol. 144:4579-4586; LaSalle, J. M. et al. (1991) J. Immunol. 147:774-80; Dustin, M. I. et al. (1989) J. Exp. Med. 169:503, Armitage, R. J. et al. (1992) Nature 357:80-82; Liu, Y. et al. (1992) J. Exp. Med 175:437-455).

Las proteínas CD80 (B7-1) y CD86 (B7-2) expresadas sobre los APC, son moléculas coestimuladoras críticas (Freeman et al. (1991) J. Exp. Med. 174: 625; Freeman et al. (1989) J. Immunol. 143:2714; Azuma et al. (1993) Nature 366:76; Freeman et al. (1993) Science 262:909). El B7-2 parece jugar un papel predominante durante las respuestas inmunes primarias, mientras que el B7-1, que es regulada posteriormente en el curso de una respuesta inmune, puede ser importante en prolongar las respuestas de la célula T primaria o coestimular las respuestas de la célula T secundaria (Bluestone (1995) Immunity 2:555).

Un ligando al cual el B7-1 y el B7-2 se unen, el CD28, es constitutivamente expresado sobre las células T en reposo e incrementan la expresión después de la activación. Después de señalizar a través del receptor de célula T, la ligación del CD28 y la transducción de la señal coestimuladora inducen las células T a proliferar y a secretar IL-2 (Linsley, P. S. et al. (1991) J. Exp. Med. 173:721-730; Gimmi, C. D. et al. (1991) Proc. Natl. Acad Sci. USA 88:6575-6579; June, C. H. et al. (1990) Immunol. Today 11:211-6; Harding, F. A. et al. (1992) Nature 356:607-609). Un segundo ligando, denominado CTLA4 (CD152) es homólogo al CD28 pero no se expresa sobre las células T en reposo y parece seguir la activación de la célula T (Brunet, J. F. et al. (1987) Nature 328:267-270). El CTLA4 parece ser crítico en la regulación negativa de las respuestas a la célula T (Waterhouse et al. (1995) Science 270:985). El bloqueo del CTLA4 se ha encontrado que remueve las señales inhibitorias, aunque la agregación del CTLA4 se ha encontrado que suministra las señales inhibitorias que infraregulan las respuestas de la célula T (Allison y Krummel (1995) Science 270:932). Las moléculas B7 tienen una afinidad mayor por el CTLA4 que por el CD28 (Linsley, P. S. et al. (1991) J. Exp. Med. 174:561-569) y el B7-1 y el B7-2 se ha encontrado que se unen a distintas regiones de la molécula CTLA4 y tienen diferentes cinéticas para unirse al CTLA4 (Linsley et al. (1994) Immunity 1:793).

En el pasado, los reportes de la existencia de miembros adicionales de la familia coestimuladora B7 han sido controversiales. El anticuerpo BB-1, parece reconocer un subconjunto de células mayores que las células positivas B7-1 o B7-2, argumentando la existencia de otro miembro de la familia B7, el B7-3. La identidad del B7-3 ha sido en parte se cree respondidas mediante la clonación de expresión de la cadena invariante del receptor de la célula T que utiliza el anticuerpo BB-1. Aunque la cadena invariante no está relacionada con la familia B7, esta molécula facilita un bajo grado de coestimulación cuando se evalúa mediante los ensayos de proliferación de célula T.

La WO 00/46240 describe dos polipéptidos de una ruta de coestimulación de célula T. Los polipéptidos representan un par receptor de ligando en una ruta coestimuladora única que parece ser diferente de la ruta que consiste del CD28, CTLA-4, B7.1, y B7.2. El ácido nucleico, el polipéptido, el vector, las células recombinantes, el anticuerpo, el método para la preparación de éste y su uso de acuerdo con la invención no se describen ni se sugieren por la WO 00/46240.

Muy recientemente, un receptor de superficie novedoso denominado ICOS fue descrito el cual tenía una identidad de secuencia con el CD28 (24%) y el CTLA4 (17%) (Hutloff et al. (1999) Nature 397:263; WO 98/38216). A diferencia del CD28, el ICOS mostró tener células T reguladas y estimuladas y originaron la secreción de un panel de citoquinas distintas de aquellas mediadas por la coestimulación del CD28 (Hutloff et al. (1999) Nature 397:263). El EMBL AB014553 describe mARN de Homo sapiens para la proteína KIAA0653 con homología a un precursor de proteína similar a CD80. El ácido nucleico, el polipéptido, el vector, las células recombinantes, el anticuerpo, el método para preparación de éste y su uso de acuerdo con la invención no se describen ni se sugieren por el EMBL AB014553.

La importancia de la ruta coestimuladora del B7:CD28/CTLA4 se ha demostrado in vitro y en varios sistemas de modelo in vivo. El bloqueo de esta ruta coestimulatoira da como resultado en el desarrollo de la tolerancia específica de antígeno en sistemas de murino y humano (Harding, F. A. et al. (1992) Nature 356:607-609; Lenschow, D. J. et al. (1992) Science 257:789-792; Turka, L. A. et al. (1992) Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:11102-11105; Gimmi, C. D. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6586-6590; Boussiotis, V. et al. (1993) J. Exp. Med. 178:1753-1763). Por el contrario, la expresión del B7 mediante células tumorales de murino negativas B7 inducen inmunidad específica mediada por célula T acompañado por el rechazo de tumor y duración de largo plazo a la exposición al tumor (Chen, L. et al. (1992) Cell 71:1093-1102; Townsend, S. E. y Allison, J. P. (1993) Science 259:368-370; Baskar, S. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5687-5690). Por lo tanto, la manipulación de las rutas coestimuladoras ofrece gran potencial para estimular o suprimir respuestas inmunes en humanos.

Resumen de la invención

La presente invención está basada, por lo menos en parte, en el descubrimiento de que las moléculas de ácido nucleico novedosas y los polipéptidos codificados por tales moléculas de ácido nucleico, denominados aquí como moléculas GL50. Las moléculas GL50 preferidas incluyen antígenos sobre la superficie de las células que presentan antígeno profesional (por ejemplo, linfocitos B, monocitos, células dendríticas, células Lang-erhan) y otras células que presentan antígeno (por ejemplo, queratinocitos, células endoteliales, astrositos, fibroblastos, oligodendrocitos), que coestimulan la proliferación de célula T, unidos a ligandos de receptores coestimuladors sobre células T (por ejemplo, CD28, CTLA4, y/o ICOS) y/o se unen mediante anticuerpos que reconocen los miembros de la familia B7, por ejemplo, los anticuerpos anti-GL50.

El ácido nucleico GL50 y las moléculas de polipéptido de la presente invención son útiles, por ejemplo, en modular la respuesta inmune. De acuerdo con esto, en un aspecto, esta invención suministra moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican los polipéptidos GL50, así como también fragmentos de ácido nucleico adecuados como cebadores o sondas de hibridación para la detección de los ácidos nucleicos que codifican GL50.

En una modalidad, una molécula de ácido nucleico GL50 de la invención es por lo menos 95%, 98% o más idéntica con una secuencia de nucleótido (por ejemplo, a la longitud completa de la secuencia de nucleótido) que incluye la SEQ ID NO:5, o un complemento de ésta.

En una modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico asilada incluye la secuencia de nucleótido mostrada en la SEQ ID NO: 1, 3, o 5, o un complemento de éstas. En otra modalidad preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención codifica la secuencia de aminoácido de un polipéptido GL50.

Otra modalidad de la invención caracteriza moléculas de ácido nucleico, preferiblemente las moléculas de ácido nucleico GL50, que detectan específicamente las moléculas de ácido nucleico GL50 con relación a las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos no GL50. Por ejemplo, en una modalidad, tal molécula de ácido nucleico es de por lo menos 20, 30, 40 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, u 800 nucleótidos de longitud e hibridiza bajo condiciones estrictas una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótido mostrada en la SEQ ID NO: 1, 3, o 5, o un complemento de éstas.

En otras modalidades preferidas, las moléculas de ácido nucleico de la invención codifican variantes alélicas de ocurrencia natural de un polipéptido GL50 humano, en donde las moléculas de ácido nucleico hibridizan al complemento de una molécula de ácido nucleico que incluye la SEQ ID NO:3 bajo condiciones estrictas.

Otra modalidad de la invención suministra una molécula de ácido nucleico aislada que es contrasentido a una molécula de ácido nucleico GL50, por ejemplo, la cadena codificante de una molécula de ácido nucleico GL50.

Otro aspecto de la invención suministra un vector que comprende una molécula de ácido nucleico GL50. En ciertas modalidades, el vector es un vector de expresión recombinante. En otra modalidad, la invención suministra una célula huésped que contiene un vector de la invención. La invención también suministra un método para producir un polipéptido, preferiblemente un polipéptido GL50, al cultivar en un medio adecuado, una célula huésped, por ejemplo, una célula huésped de mamífero tal como una célula de mamífero no humano, de la invención que contiene un vector de expresión recombinante, de tal forma que se produce el polipéptido.

Otro aspecto de esta invención caracteriza los polipéptidos GL50 y las proteínas aisladas o recombinantes.

En una modalidad, el polipéptido aislado es un polipéptido GL50 humano.

En aún otra modalidad, el polipéptido GL50 aislado es un polipéptido GL50 soluble.

En una modalidad adicional, el polipéptido GL50 aislado se expresa sobre la superficie de una célula, por ejemplo, tiene un dominio de transmembrana.

En una modalidad adicional, el polipéptido GL50 aislado juega un papel en coestimular la secreción de citoquina y/o la proliferación de las células T activadas. En otra modalidad, el polipéptido GL50 aislado es codificado mediante una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido que hibridiza bajo condiciones de hibridación estrictas a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO: 1, 3, o 5.

Otra modalidad de la invención caracteriza un polipéptido aislado, preferiblemente un polipéptido GL50, que es codificado por una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido de por lo menos aproximadamente 95%, 98% o más de identidad con una secuencia de nucleótido (por ejemplo, a la longitud completa de la secuencia de nucleótido) que incluye la SEQ ID NO: 5 o un complemento de ésta.

Otra modalidad de la invención caracteriza un polipéptido aislado, preferiblemente un polipéptido GL50, que comprende una secuencia de aminoácido de por lo menos aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o más de identidad para la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 4, o 6.

Esta invención caracteriza además un polipéptido GL50 aislado que es codificado por una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido que hibridiza bajo condiciones de hibridación estrictas a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO: 1, 3, o 5, o un complemento de éstas.

Los polipéptidos de la presente invención se pueden ligar operativamente a un polipéptido no GL50 (por ejemplo, las secuencias de aminoácido heterólogas) para formar proteínas de fusión. La invención caracteriza además anticuerpos, tales como anticuerpos monoclonales o policlonales, que unen específicamente los polipéptidos de la invención, preferiblemente los polipéptidos GL50. Además, los polipéptidos GL50, por ejemplo los polipéptidos biológicamente activos, se pueden incorporar en las composiciones farmacéuticas, que opcionalmente incluyen portadores farmacéuticamente aceptables.

En otro aspecto, la presente invención suministra un método para detectar la presencia de un polipéptido o una molécula de ácido nucleico GL50 en una muestra biológica al poner en contacto la muestra biológica con un agente capaz de detectar una molécula de ácido nucleico GL50 o un polipéptido de tal forma que la presencia de un polipéptido o una molécula de ácido nucleico GL50 se detecta en la muestra biológica.

En otro aspecto, la presente invención suministra un método para detectar la presencia de actividad GL50 en una muestra biológica al poner en contacto la muestra biológica con un agente capaz de detectar un indicador de la actividad del polipéptido GL50 de tal forma que la presencia de actividad del polipéptido GL50 se detecta en la muestra biológica.

En otro aspecto, la invención suministra un método para modular la actividad del polipéptido GL50 que comprende poner en contacto una célula capaz de expresar el polipéptido GL50 con un agente que modula la actividad GL50 de tal forma que la actividad GL50 en las células es modulada. En una modalidad, el agente inhibe la actividad GL50. En otra modalidad, el agente estimula la actividad GL50. En una modalidad, el agente es un anticuerpo que se une, preferiblemente de manera específica, a un polipéptido GL50. En otra modalidad, el agente modula la expresión del GL50 al modular la trascripción de un gen GL50 o la traducción de un mARN GL50. En aún otra modalidad, el agente es una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido que es contrasentido a la cadena codificante del mARN GL50 o un gen GL50.

En una modalidad, los métodos de la presente invención se utilizan para tratar un sujeto que tiene un desorden (caracterizado por un polipéptido GL50 aberrante o una expresión o actividad de ácido nucleico) o una condición que se beneficiaría de la modulación, de la super o inframodulación, de una molécula GL50 al administrar un agente el cual es un modulador GL50 para el sujeto. En una modalidad, el modulador GL50 es un polipéptido GL50. En otra modalidad el modulador GL50 es una molécula de ácido nucleico GL50. En otra modalidad una molécula moduladora GL50 que modula la interacción entre el GL50 y un ligando GL50 o una molécula que interactúa con el dominio intracelular de GL50. En aún otra modalidad, el modulador GL50 es un péptido, peptidomimético, u otra molécula pequeña. En una modalidad preferida, el desorden caracterizado por el polipéptido GL50 aberrante o la expresión de ácido nucleico es un desorden o condición del sistema inmune que se beneficiaría de la modulación de la actividad GL50.

La presente invención también suministra un ensayo de diagnóstico para identificar la presencia o ausencia de una alteración genética caracterizada por al menos uno de (i) modificación aberrante o mutación de un gen que codifica un polipéptido GL50; (ii) la regulación equivocada del gen; y (iii) la modificación post-transduccional aberrante de un polipéptido GL50, en donde la forma tipo silvestre del gen codifica un polipéptido con una actividad GL50.

En otro aspecto la invención suministra un método para identificar un compuesto que se une a o modula la actividad de un polipéptido GL50. El método incluye suministrar una composición indicadora que comprende un polipéptido GL50 que tiene una actividad GL50, poner en contacto la composición indicadora con un compuesto de prueba, y determinar el efecto del compuesto de prueba sobre la actividad GL50 en la composición indicadora para identificar un compuesto que modula la actividad de un polipéptido GL50.

En otro aspecto, la invención corresponde a un animal transgénico no humano que contiene células que llevan un transgen que codifica un polipéptido del miembro GL50.

En una modalidad, la presente invención suministra métodos para tratar cáncer que involucra administrar a un sujeto que sufre de un tumor que comprende administrar una forma estimuladora de una molécula GL50. En una modalidad preferida, la forma estimuladora de una molécula GL50 es una forma soluble de GL50 e incluye el dominio extracelular de una molécula coestimuladora. En una modalidad, la molécula coestimuladora es monoespecífica. En una modalidad, la molécula coestimuladora es dimérica. En una modalidad, la molécula coestimuladora es bivalente.

En otra modalidad preferida, la molécula coestimuladora se fusiona a la segunda proteína o polipéptido que incluye una porción de una molécula de inmunoglobulina (por ejemplo, una porción de una molécula de inmunoglobulina que incluye residuos de cisteína; una porción de una molécula de inmunoglobulina que incluye la regiones de pivoteo CH2 y CH3 de una molécula de inmunoglobulina humana; o una porción de una molécula de inmunoglobulina que incluye las regiones de pivoteo CH1, CH2, y CH3 de una molécula de inmunoglobulina humana). En aún otra modalidad, la porción de la molécula de inmunoglobulina se ha modificado para reducir la fijación de complemento y/o la unión del receptor Fc.

En aún otro aspecto, la invención pertenece a un método para reducir la proliferación de una célula tumoral que comprende poner en contacto una célula inmune con una forma activante de la molécula GL50 de tal forma que la respuesta inmune a la célula tumoral se mejora y la proliferación de la célula tumoral se reduce.

En una modalidad, la forma activante de una molécula GL50 es un polipéptido soluble que comprende el dominio extracelular del GL50.

En otra modalidad, la forma activante de una molécula GL50 es un polipéptido asociado a célula que comprende el dominio extracelular del GL50.

En aún otra modalidad, la invención corresponde a un método para seleccionar un compuesto que modula la activación mediada por GL50 de una célula inmune que comprende: i) poner en contacto un polipéptido que comprende por lo menos un dominio de polipéptido GL50 con un compuesto de prueba y un compañero de unión GL50 y ii) identificar los compuestos que modulan la interacción del polipéptido con el compañero de unión GL50 para identificar de esta manera los compuestos que modulan la activación mediada por GL50 de una célula inmune.

En una modalidad, el polipéptido comprende un dominio GL50 seleccionado del grupo que consiste de: un dominio de transmembrana, un dominio citoplasmático, y un dominio extracelular.

En una modalidad, el dominio es una variante de empalme de un dominio citoplasmático GL50.

En una modalidad, el dominio del polipéptido GL50 comprende por lo menos una sustitución de aminoácido.

En un aspecto, la invención corresponde a un método para seleccionar un compuesto que modula la transducción de señal en una célula inmune que comprende poner en contacto una célula inmune que exprese una molécula GL50 con un compuesto de ensayo y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para modular la transducción de señal por vía del GL50 para identificar de esta manera un compuesto que modula una señal en una célula inmune.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótido completa del GL50-1 de murino (mGL50-1), con base en el clon de la secuencia de señal (posición 1-519) y el clon aislado RecA (posición 374-27 18). Los nucleótidos predichos que codifican una secuencia de señal son puestos en recuadro y se subraya el dominio de transmembrana hidrófobo.

La Figura 2 muestra la secuencia de nucleótido del producto de murino GL50-2 (mGL50-2).

La Figura 3 muestra un alineamiento de secuencia del mGL50-1 y el producto mGL50-2. Ocurre una divergencia de secuencia en el nucleótido 1027 para el mGL50-1 y en el 960 para el mGL50-2.

La Figura 4 muestra un RT-PCR específico de isoforma de mGL50-1 y mGL50-2.

La Figura 5 muestra un análisis Northern Blot específico de isoforma del mGL50-1 y el mGL50-2.

La Figura 6 muestra la secuencia de nucleótido del producto AB014553 RACE. La región en el recuadro es un área de divergencia entre la secuencia de cADN AB014553 publicada y el producto RACE. El cebador RACE en nicho se extiende desde la posición 1a la 22, que corresponde a los nucleótidos 655 al 676.

La Figura 7 muestra un alineamiento del producto RACE traducido y del cADN AB014553 publicado. La divergencia ocurre en los residuos 299 del cADN AB014553 publicado y los residuos 123 del producto RACE.

La Figura 8 muestra la secuencia del GL50 humano (hGL50).

La Figura 9 muestra el análisis gráfico de hidropatía del GL50, el producto RACE AB014553 fusionado (hGL50), y el B7-1 y B7-2 de ratón y humano. Los perfiles de hidropatía significativos se ven entre el GL50 y el AB014553.

La Figura 10 muestra un análisis Southern blot RT-PCR del cADN AB014553 publicado y los producto RACE AB014553.

La Figura 11 muestra un análisis northern de múltiples inmunotransferencias de ARN de tejido humano. Las secuencias codificantes del hGL50/AB014553 se utilizaron como sondas.

La Figura 12 muestra un análisis pileup de hGL50, mGL50-1, hB7-1, mB7-2, hB7-2, mB7-2 en el cual el péptido de señal, los dominios similares a Ig, la transmembrana, y los dominios citoplasmáticos se indican. Los residuos de transmembrana hidrófobos predichos se subrayan y los asteriscos denotan residuos que contribuyen a la estructura Ig. Las cisternas extracelulares y los triptófanos, indicadores de la estructura Ig, se muestran en negrilla.

La Figura 13 muestra un análisis de dendrograma que representan las distancias genéticas entre las proteínas B7-1, B7-2 y GL50. El Y08823 es la proteína similar a CD80 de pollo y el MM867065_1 es la butirofilina de ratón.

La Figura 14 muestra los resultados de un estudio de transfección de GL50 COS. El mGL50-1 se expresó en las células COS seguido por teñido con ICOS-Ig, CD28-Ig, CTLA4-Ig. La unión del ICOS Ig mediante las células que expresan el mGL50-1 se detectaron.

La Figura 15 describe un diagrama esquemático del mGL50-1 y el mGL50-2. La divergencia de secuencia, indicada por la línea vertical, ocurre en el nucleótido 1027 para el mGL50-1 y 960 para el mGL50-2. La secuencia repetitiva (recuadro achurado) se encuentra en el 3' UTR del mGL50-2 que comprende los nucleótidos 1349-1554. El punteado y las cabezas de flecha representan los oligonucleótidos utilizados en el análisis RT-PCR. Las líneas horizontales representan sondas utilizadas en el análisis Northern blot.

La Figura 16 describe un alineamiento de secuencia de proteína entre el mGL50-1, mGL50-2, hGL50, y Y08823. Las secuencias se alinearon con PileUp, y los residuos compartidos entre estas moléculas son puestos en recuadro. Las letras por encima de las secuencias denotan las estructuras de péptido secundaria como predichas para el Y08823 con base en la estructura de cristal del B7-1. El exon que codifica las secuencias del dominio 1 citoplasmático hGL50 se indican mediante una barra marcada Cy-1.

La Figura 17 describe un análisis citométrico de flujo del ICOS que se une a las proteínas relacionada con el GL50 de ratón, humana y pollo. Las células COS transfectadas con plásmidos de expresión que codifican mGL50-1, mGL50-2, hGL50, y la proteína similar a B7 de pollo Y08823 se incubaron en el mlCOS-mlgG2am, hICOS-mlgG2am o mCTLA4-mlgG2am, seguido por teñido secundario con biotina IgG2a anti-ratón y la detección con estreptavidina-PE.

La Figura 18 describe ICOS que se une a WEHI 231. Las cantidades tituladas de mlCOS-mlgG2am o mCTLA4-mlgG2am se utilizaron para teñir células WEHI 231 en la presencia de anticuerpos anti B7-1 y B7-2 de bloqueo en controles de isotipo.

La Figura 19 describe ICOS que se une a las células ES no diferenciadas. El análisis de las células ES no diferenciadas contra teñidas con los reactivos anti-B7-1 y mICOS-mlgG2am dieron como resultado un teñido positivo para ambos el B7-1 y los ligandos ICOS.

La Figura 20 describe el inmunofenotipo de los subconjunto de esplenocito Balb/c y RAG1 -/-. Se presentan dos gráficas dimensionales de 10,000 células teñidas; las muestras con 50,000 puntos de datos se indican mediante asteriscos. (A) esplenocitos enriquecidos de ratones Balb/C o RAG1 -/- se tiñeron con mICOS-mlgG2am y los anticuerpos conjugados a FITC contra CD3, CD24, CD45R/B220, pan NK, MHC clase II, o CD40. Para un fenotipo adicional las células CD4+, ICOS-ligando+, células RAG1 -/- se tiñeron con un anti-CD4 marcado con PE y un anti-CD11c marcado con FITC. (B) Los esplenocitos enriquecidos de RAG1 -/- y los ratones Balb/C (no tratados, activados con ConA, o activados con LPS) se tiñeron con mlCOS-mlgG2am y anticuerpos a CD4, CD8, CD19, CD11b, CD11c y CD69.

La Figura 21 describe una representación filogenética de los ligandos GL50/B7 y los receptores CD28/CTLA4/
ICOS. Los filogramas de distancia proporcional se generaron utilizando la distancia genética expresada como sustituciones por 100 aminoácidos. (A) Filograma de las proteínas relacionadas con GL50/B7. Acceso No. MMU67065_1 representa butirofilina de ratón, (B) Filograma de las proteínas ICOS/CD28/CTLA4.

La Figura 22 describe la proliferación y la inducción de citoquina mediante la coestimulación GL50 de células T, en la ausencia o la presencia de anticuerpos de bloqueo anti-CD28. Nota: el hGL50.Fc es el mismo que el hGL50-IgG2am.

La Figura 23 describe la proliferación de célula T inducida por coestimulación GL50 en la presencia de concentraciones varias de anticuerpos de bloqueo anti-CD28 y estimulación anti-CD3.

La Figura 24 describe la inducción de citoquina mediante coestimulación GL50 en células T en la ausencia o presencia de estimulación CD28.

La Figura 25 describe la capacidad del GL50-IgG2a para inhibir el crecimiento del tumor en los ratones.

La Figura 26 describe la secuencia de la proteína de fusión hICOS-mlgG2am. (A) La secuencia de nucleótido que codifica el hICOS-mlgG2am (establecida como la SEQ ID NO:23). La secuencia líder de oncostatina-M se codifica mediante los nucleótidos subrayados. Los nucleótidos en recuadro codifican el dominio IgG2am de ratón de la proteína de fusión. El sitio de iniciación de traducción se indica por una X. Los intrones y las regiones no traducidas se indican mediante una línea punteada. El codon de parada se indica por un subrayado doble. (B) La secuencia de aminoácido predicha (establecida como la SEQ ID NO:24) de la proteína de fusión hICOS-mlgG2am.

La Figura 27 describe la secuencia de la proteína de fusión mICOS-mlgG2am. (A) La secuencia de nucleótido que codifica el mICOS-mlgG2am (establecida como la SEQ ID NO:25). La secuencia líder de oncostatina-M se codifica mediante los nucleótidos subrayados. Los nucleótidos en recuadro codifican el dominio IgG2am de ratón de la proteína de fusión. El sitio de iniciación de traducción se indica por una X. Los intrones y las regiones no traducidas se indican mediante una línea punteada. El codon de parada se indica por un subrayado doble. (B) La secuencia de aminoácido predicha (establecida como la SEQ ID NO:26) de la proteína de fusión mICOS-mlgG2am.

La Figura 28 describe la secuencia de la proteína de fusión hGL50-mlgG2am. (A) La secuencia de nucleótido que codifica el hGL50-mlgG2am (establecida como la SEQ ID NO:27). La secuencia líder de oncostatina-M se codifica mediante los nucleótidos subrayados. Los nucleótidos en recuadro codifican el dominio IgG2am de ratón de la proteína de fusión. El sitio de iniciación de traducción se indica por una X. Los intrones y las regiones no traducidas se indican mediante una línea punteada. El codon de parada se indica por un subrayado doble. (B) La secuencia de aminoácido predicha (establecida como la SEQ ID NO:28) de la proteína de fusión hGL50-mlgG2am.

La Figura 29 describe la secuencia de la proteína de fusión mGL50-mlgG2am. (A) La secuencia de nucleótido que codifica el mGL50-mlgG2am (establecida como la SEQ ID NO:29). La secuencia líder de oncostatina-M se codifica mediante los nucleótidos subrayados. Los nucleótidos en recuadro codifican el dominio IgG2am de ratón de la proteína de fusión. El sitio de iniciación de traducción se indica por una X. Los intrones y las regiones no traducidas se indican mediante una línea punteada. El codon de parada se indica por un subrayado doble. (B) La secuencia de aminoácido predicha (establecida como la SEQ ID NO:30) de la proteína de fusión mGL50-mlgG2am.

La Figura 30 describe el teñido ICOS-Ig de varios tipos de células esplénicas.

La Figura 31 describe la reducción de la tumorigenicidad de las células tumorales transfectadas con GL50.

Descripción detallada de la invención

Además de los antígenos de activación del linfocito B previamente caracterizados, por ejemplo, B7-1 y B7-2, existen otros antígenos sobre la superficie de las células que presentan antígeno (por ejemplo, células B, monocitos, células dendríticas, células Langerhan, queratinocitos, células endoteliales, astrositos, fibroblastos, oligodendrocitos) que coestimulan las células T.

La presente invención está basada, por lo menos en parte, en el descubrimiento de moléculas novedosas, denominadas aquí como polipéptidos GL50. El GL50-1 de murino (mGL50-1) se aisló de una librería de nodo linfáticos de ratón activados con IL-12. La secuencia de nucleótido del mGL50-1 se muestra en la SEQ ID NO:1. La secuencia de polipéptidos derivada del mGL50-1 de ratón de longitud completa se muestra en la SEQ ID NO:2. La secuencia comparte aproximadamente 20% de la identidad de secuencia con el B7-1 de ratón y el B7-2 de ratón. El mGL50-1 codifica un polipéptido de 322 aminoácidos que contiene una secuencia líder, dominios similares a Ig extracelulares, un dominio de transmembrana hidrófobo, y un dominio intracelular que comprende un residuo de tirosina.

El 3' RACE PCR con ARN de linfocito de sangre periférica de ratón (PBL) reveló una forma alternativamente empalmada del GL50 de ratón (mGL50-2). La secuencia de nucleótido de murino GL50-2 (mGL50-2) se muestra en la SEQ ID NO:3. La secuencia de nucleótido codificada por un polipéptido que tiene un dominio intracelular de 27 aminoácidos divergente, que incluye tres tirosinas adicionales, una región no traducida 3' con una señal de poliadenilación de consenso, y una cola poli A que se muestra en la SEQ ID NO:4. Las transcripciones tanto del mGL50-1 como del mGL50-2 se encontraron mediante RT-PCR y el análisis Northern blot y fueron predominantemente localizados en órganos linfoides de los paneles de tejido múltiple. Las secuencias GL50 del murino identificadas se encontraron que estaban relacionadas con el clon de cADN de cerebro humano previamente reportado, Número de Acceso del GenBank AB014553.

El 3' RACE del cADN PBL de humano se desarrolló para identificar los clones humanos relacionados con GL50 de murino. Se identificaron los clones que codifican las secuencias 3' alternativas. La secuencia de nucleótido del clon GL50 humano resultante (hGL50 [AB014553-RACE]) se muestra en la SEQ ID NO:5. La secuencia de nucleótido codifica una proteína de 309 aminoácidos de la cual comparte aproximadamente 26% de identidad de secuencia de aminoácido con el mGL50-1, 28% de identidad con el mGL50-2, y secuencia de aminoácidos, aproximadamente 13% de identidad de la secuencia de aminoácido con el B7-1 humano, y aproximadamente 13% de identidad de la secuencia de aminoácido con B7-2 humano y de ratón.

Los ensayos citométricos de flujo utilizando proteína de fusión GL50-1 Ig de murino como un reactivo demostró unión a los transfectantes COS que expresan el ICOS de ratón, pero no a las células que expresan CD28 o CTLA-4. Estos resultados confirman que las moléculas GL50 son miembros novedosos de la familia B7 de las moléculas.

Ácido Nucleico GL50 y Moléculas de Polipéptido

En una modalidad, las moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención codifican polipéptidos eucarióticos GL50.

La familia GL50 de moléculas comparte un número de regiones conservadas, que incluyen dominios de señal, los dominios IgV y los dominios IgC. Por ejemplo, en el caso del mGL50-1 (SEQ ID NO:1), la secuencia del mGL50-1 de 2718 nucleótidos de consenso codifica una proteína de 322 aminoácidos con una masa predicha de 36 kDa. La gráfica de hidropatía de la estructura de lectura abierta predijo una estructura que corresponde a una secuencia líder (codificada por aproximadamente los nucleótidos 67 a 195), un dominio extracelular (codificado por aproximadamente los nucleótidos 196 a 904), una región de transmembrana hidrófoba (codificada por aproximadamente los nucleótidos 905 a 961) y un dominio citoplasmático intracelular potencial (codificado por aproximadamente los nucleótidos 962 a 1032). La división del péptido de señal se predijo en la posición 46 en la secuencia de aminoácido. En una modalidad, el dominio extracelular de un polipéptido GL50 comprende los dominios IgV e IgC después de la división de la secuencia de señal, perno ni la transmembrana ni los dominios citoplasmáticos de un polipéptido GL50 (por ejemplo, que corresponden a la secuencia de aminoácido desde aproximadamente el aminoácido 47-277 del GL50-1 o la secuencia de aminoácido desde aproximadamente el aminoácido 22 a aproximadamente el aminoácido 278 del hGL50 como se estableció en la Figura 16).

El análisis de la secuencia de aminoácido mGL50 sugirió una similitud estructural al dominio Ig en el dominio citoplasmático de la proteína. Para mantener una estructura similar a Ig, 4 cisteínas se encontraron en el dominio extracelular, permitiendo la posibilidad de la unión intramolecular y la conformación estructural diferente que corresponde a un dominio similar a IgV y un dominio similar a IgC. Estas regiones son ambas dominios miembros de la superfamilia Ig y son reconocidos en la técnica. Estos dominios corresponden a unidades estructurales que tienen diferentes patrones de doblamiento conocidos como dobleces Ig. Los dobleces Ig están comprendidos de un sándwich de dos láminas \beta, que consisten cada una de cadenas \beta antiparalelas de 5-10 aminoácidos con una unión disulfuro conservada entre las dos láminas en su mayoría, pero no todas, dominios. Los dominios IgC del Ig, TCR, y las moléculas MHC comparten los mismos tipos de patrones de secuencia y se denominan como un conjunto C1 dentro de la superfamilia Ig. Otros dominios IgC caen dentro de otros conjuntos. Los dominios IgV también comparten patrones de secuencia y son llamados dominios de conjunto V. Los dominios IgV son más largos que los dominios C y forman un par adicional de cadenas \beta.

Un alineamiento del mGL50-2, mGL50-1, hGL50, y la molécula Y08823 de pollo se representan en la Figura 16. Cada una de las moléculas comprende un péptido de señal, un dominio similar a IgV, un dominio similar a IgC, un dominio de transmembrana y un dominio citoplasmático. Los dominios del mGL50-2, hGL50, y Y08823 corresponden a aquellos en el mGL50-1 están representes en la Figura 16.

Un alineamiento de proteína se hizo de los polipéptidos GL50, la secuencia AB014553 publicada, y las secuencias B7-1 y B7-2 de humano y de ratón utilizando el programa de alineamiento de proteína Geneworks con los parámetros ajustados a: costa a espacio abierto = 5, costa a espacio largo = 5, longitud diagonal mínima = 4, descentrado diagonal máximo = 130, corte de consenso = 50%, y uso de la matriz Pam 250. Los resultados del alineamiento se presentan adelante en la Tabla 1.

TABLA 1

1

La tabla 1 muestra que el polipéptido hGL50 tiene aproximadamente 59% de identidad de secuencia de aminoácido con el polipéptido codificado por el AB014553 y aproximadamente 40% de la identidad de secuencia de aminoácido con el mGL50-1 y el mGL50-2. El mGL50-1 y el mGL50-2 comparten un más alto grado de identidad de secuencia aminoácido aproximadamente a 92%. Los polipéptidos GL50 comparten aproximadamente el 20% de la identidad de secuencia de aminoácido con las otras moléculas de la familia B7.

Se hizo otro alineamiento para determinar la extensión de la relación entre las secuencias de la proteína GL50, hGL50, B7-1, de humano, B7-1 de ratón, B7-2 de ratón, B7-2 de humano. Utilizando el análisis Pileup (figura 12), 18 sitio de aminoácido se alinearon idénticamente entre las 6 moléculas dentro del dominio extra celular. De las 32 posiciones que definen las dobleces similares a IgV e IgC predichos de la molécula B7, 13 son idénticamente conservados entre todas las 6 moléculas, la mayoría notablemente o más notablemente las 4 cisteínas que permiten el dobles intra molecular de los dominios. Otras áreas de conservación de secuencia significativas también se ven en el dominio extra celular, pero de manera interesante las identidades de las secuencias GL50 en ciertos sitios alineados más cercanamente con el B7-1 o B7-2 (identidad calificación de 8). Por ejemplo, un residuo de valina que corresponde a la posición 86 del mGL50-1 es compartido por el hGL50, y las secuencias B7-2, pero no la B7-1. De manera similar, la tiroxina en la posición 87 del mGL50-1 de ratón se conserva en los sitios correspondientes del hGL50 y el B7-1, pero no el B7-2. De las 16 posiciones con calificaciones de identidad de las posiciones 8,5 son compartidas por el mGL50-1/hGL50 y B7-1 de ratón, 4 posiciones son compartidas entre el mGL50-1/hGL50 y B7-2 de ratón y 6 posiciones son compartidas entre el B7-1 y el B7-2. Con base en la estructura del péptido, estos resultados sugieren que la secuencias GL50 ocupan un espacio filogenético paralelo a la familia B7 de las proteínas.

El análisis de filogenia molecular (Grow Tree) que mide la distancia genética en términos de sustituciones por aminoácidos resulto en un dendrograma (figura 13) con agrupamiento independiente del hGL50 (85), m/hB7-2 (68) y m/hB7-1 (88) de ratón. Como un grupo exterior, se utilizó el mmu67065_1 (butirofilina de ratón). El clon de pollo Y08823 también se encontró que estaba más cercanamente alineado con las secuencias GL50 (\sim140) que las secuencias B7(215-320) que indican que estas secuencias comprenden una subfamilia distinta de proteínas. Las distancias entre las ramificaciones GL50, B7-2 y B7-1 subirían de manera alta (216-284), que gran numero de las sustituciones a ocurrido entre estas moléculas en razón a la inserción del linaje humano y de roedor. Las distancias genéticas entre las moléculas de ácido nucleico GL50 se presentan adelante en la tabla 2.

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TABLA 2 Distancias genéticas entre los miembros de la familia B7

2

Varios aspectos de la invención se describen con detalle adicional en las siguientes subsecciones:

I. Definiciones

Como se utiliza aquí el término "célula inmune" incluye células que son de origen hematopoyético y que juegan un papel en la respuesta inmune. Las células inmunes incluyen linfocitos tales como las células B y las células T; células asesinas naturales, células mieloides, tales como monocitos, macrófagos, eosinófilos, células mástiles, basofilos y granulositos.

Como se utiliza aquí, el término "célula T" incluye células T CD4+ y células T de CD8+. El término célula T también incluye tanto las células T tipo adyuvante 1T como las células T tipo adyuvante 2 T. El término "célula que presenta antígeno" incluye células que presentan antígeno profesional (por ejemplo linfocitos B, monocitos, células dendríticas, células Langerhans) así como también otras células que presentan antígeno (por ejemplo keratinocitos, células endoteliales, astrositos, fibroblastos, oligodendrocitos).

Como se utiliza aquí, el término "respuesta inmune" incluye respuestas inmunes mediadas por célula T y/o mediadas por célula B que son influenciadas por la modulación de la coestimulacion de la célula T. las respuestas inmunes de ejemplo incluyen respuestas de célula T, por ejemplo producción de citoquina, y las citotoxicidad celular. Además, el término respuesta inmune incluyen las respuestas inmunes que son indirectamente afectadas por la activación de la célula T, por ejemplo, la producción de anticuerpo (respuestas humorales) y la activación de las células de respuesta de citoquina, por ejemplo, macrófagos.

Como se utiliza aquí, el término "receptor coestimulador" incluye receptores que trasmiten una señal coestimuladora a una célula inmune, por ejemplo CD28. Como se utiliza aquí el término "receptores inhibitorios" incluyen receptores que trasmiten una señal negativa a una célula inmune (por ejemplo CTLA4). Una señal inhibitoria transducida por un receptor inhibitorio puede ocurrir aun si un receptor coestimulador (tal como el CD28) no esta presente en la célula inmune y, así, no es simplemente una función de competición entre los receptores inhibitorios y los receptores coestimuladores para la unión de las moléculas coestimuladoras (Fallarino et al. (1998) J. Exp. Med. 188: 205). La trasmisión de la señal inhibitoria a una célula inmune puede dar como resultado no respuesta o alergia o muerte celular programada de una célula inmune. Preferiblemente la transmisión de una señal inhibitoria opera a través de un mecanismo que no involucra la apoptosis. Como se utiliza aquí el término "apoptosis" incluye muerte programada de célula que se puede caracterizar utilizando técnicas que con conocidas en el arte. La muerte de la célula apoptócica se puede caracterizar, por ejemplo, por el encogimiento de la célula, apiñamiento de membrana y condensación de cromatina que culmina en la fragmentación de la célula. Las células que sufren apoptosis también despliegan un patrón característico de una división de ADN internucleosomal.

Además de las diferencias en los tipos de receptores diferentes formas de moléculas coestimuladoras pueden ser activantes o inhibitorias. Por ejemplo, en el caso de un receptor activante se puede trasmitir una señal por ejemplo una forma multivalente de una molécula coestimuladora que dan como resultado en la reticulación de un receptor activante, o una señal que se puede inhibir, por ejemplo mediante una forma de una comolécula coestimularia que se une a un receptor activante pero que no trasmite una señal activante, por ejemplo a competir con formas activantes de moléculas coestimuladoras para unirse al receptor. (Ciertas formas solubles de moléculas coestimuladoras pueden ser inhibitorias, con sin embargo, existen casos en los cuales una molécula soluble puede ser estimuladora). De manera similar, dependiendo de la forma de la molécula coestimuladora que se une a un receptor inhibitorio, una señal se puede trasmitir, (por ejemplo, mediante una forma multivalente de una molécula coestimuladora que da como resultado a la reticulación de un receptor activante) o se puede inhibir una señal (por ejemplo mediante una forma de molécula coestimuladora que se une a una receptor de inhibitorio, pero que no trasmite una señal inhibitoria). Los efectos de varios agentes moduladores se pueden demostrar fácilmente utilizando ensayos de selección de rutina como se describió aquí.

Como se utiliza aquí el término "coestimular" con referencia a las células inmunes activadas incluyen la capacidad de una "molécula coestimuladora" para suministrar una segunda señal mediadas por receptor no activante (una "señal coestimuladora") que induce proliferación o función efectuadota. Por ejemplo, una señal coestimuladora puede dar como resultado una secreción de citoquina, por ejemplo, en una célula T o que ha recibido una señal mediada por el receptor de célula T. Las células inmunes que han recibido la señal mediada por el receptor de célula, por ejemplo, por vía de un receptor activante se denominan aquí como "células inmunes activadas".

Como se utiliza aquí el término "receptor activante" incluye los receptores de célula inmune que se unen al antígeno, los antígenos en complejo (por ejemplo en el contesto de las moléculas MHC) o que se unen a anticuerpos. Tales receptores activantes incluyen receptores de célula T (TCR), receptores de célula B (BCR), receptores de citoquina, receptores LPS, receptores de complemento, y receptores Fc.

Por ejemplo, los receptores de célula T están presentes en las células T y están asociados con las moléculas CD3. Los receptores de células T están estimulados por el antígeno del contesto de las moléculas MHC (así como también los reactivos activantes de célula T policlonales). La activación de la célula T por vía del TCR da como resultado números cambios, por ejemplo, fosforilación de proteína, cambios en el lípido de membrana, flujo de iones, alteraciones de nucleótidos cíclicos, cambio de trascripción de ARN, cambios de síntesis de proteína, y cambios de volumen de célula.

Como se utiliza aquí el término "señal inhibitoria" se refiere a una señal trasmitida por vía de un receptor inhibitorio (por ejemplo CTLA4) sobre una célula inmune. Tal señal antagonisa una señal por vía de un receptor activante (por ejemplo por vía de una molécula TCR, CD3, BCR o Fc) y puede resultar en, por ejemplo, la inhibición de una segunda generación mensajera; una inhibición de proliferación; una inhibición de la función efectuadota en la célula inmune, por ejemplo, fagocitosis producida, producción de anticuerpo reducida, citotoxicidad celular reducida, la falla de la célula inmune para producir mediadores, (tales como citoquinas (por ejemplo IL-2) y/o mediadores de respuesta alérgicas); o el desarrollo de alergia.

Como se utiliza aquí, el término "adyuvantes" incluye agentes que potencian la respuesta inmune a un antígeno (por ejemplo un antígeno asociado a tumor). Los adyuvantes se pueden administrar en conjunto con moléculas coestimuladoras para aumentar adicionalmente la respuesta inmune.

Como se utiliza aquí el término "monoespecifico" incluye moléculas que tiene solo una especificidad, por ejemplo, ellas se unen específicamente a su ligando análogo, por ejemplo, CD28, CTLA4, o ICOS sobre células T. Tales agentes monoespecíficos no han sido trabajados por ingeniería para incluir especificidades adicionales y, así, no se unen de una manera de blanco a las otras moléculas de superficies celular. Como se utiliza aquí el término "oligoespecíficos" incluyen moléculas que tienen más de una especificidad, por ejemplo, que tiene una especificidad adicional para una molécula diferente de para su ligando análogo, por ejemplo, una especificidad para una molécula de superficie celular, tal como un antígeno asociado a tumor o un receptor de célula T. Como se utiliza aquí, el término "bivalente" incluye moléculas coestimuladoras solubles que tienen dos sitios de unión para interacción con su ligando con molécula. Como se utiliza aquí, el término "dimérico" incluye formas que están presente como homodímeros, es decir, como una unidad comprendida por dos subunidades idénticas que son unidas juntas, por ejemplo, mediante uniones de sulfuro. Como se utiliza aquí, el término "multimérico" incluye formas solubles que tienen más de dos subunidades.

En otra modalidad, la forma activante de una molécula GL50 es una molécula GL50 soluble. Como se utiliza aquí, el término "soluble" incluye moléculas, por ejemplo, moléculas coestimuladoras, que no son células asociadas. Las moléculas coestimuladoras solubles retiene la función de la célula de las moléculas asociadas a célula de las cuales ellas se derivan, por ejemplo, ellas son capaces de unirse a sus ligandos análogos sobre células T y mediar la transducción de señal por vía del CD28 y/o la molécula CTLA4 sobre una célula T, sin embargo ellas están en forma insoluble, es decir, no están unidas a membrana. Preferiblemente, las composiciones solubles comprenden un dominio extra celular de una molécula coestimuladora.

Preferiblemente, tal forma soluble de un GL50 comprende por lo menos una porción del dominio extra celular de la molécula GL50. Como se utiliza aquí, el término "dominio extra celular de una molécula GL50" incluye una porción de una molécula GL50 a la cual, en la forma asociada a la célula de la molécula GL50, es extra celular. Preferiblemente, el dominio extra celular es el dominio extra celular de la molécula GL50 humana. En una modalidad, la molécula coestimuladora soluble comprende un dominio extra celular de una molécula GL50 y comprende además una secuencia de señal.

Como se utiliza aquí, el término "sin respuesta" incluye la refractividad de las células inmunes a la estimulación, por ejemplo, la estimulación por vía de un receptor activante o una citoquina. La no respuesta puede ocurrir, por ejemplo, en razón a la exposición a inmunosupresores o a la exposición de altas dosis de antígeno. Como se utiliza aquí, el término "alergias" o "tolerancia" incluye la refractividad para activar la estimulación mediada por receptor. Tal refractividad es generalmente específica de antígeno y persiste después de que la exposición al antígeno tolerante ha cesado. Por ejemplo, la alergia en las células T (opuesta a la no respuesta) se caracteriza por la falta de producción de citoquina, por ejemplo, IL-2. La alergia de célula T ocurre cuando las células T están expuestas a antígeno y reciben una primera señal (un receptor de célula T o una señal remediada por CD3) en ausencia de una segunda señal (una señal coestimuladora). Bajo estas condiciones, la reexposición de las células al mismo antígeno (aun si ocurre la reexposición en la presencia de la molécula coestimuladora) resulta en falla para producir las citoquinas y, así, falla para proliferar. Las células T alérgicas pueden, sin embargo, montar respuestas a antígenos no relacionados y pueden proliferar si se cultivan con citoquinas (por ejemplo IL-2). Por ejemplo, la alergia de la célula T también se puede observar por la falta de producción de IL-2 por los linfocitos T medidos mediante ELISA o por un ensayo de proliferación utilizando una línea de célula indicadora. Alternativamente, se puede utilizar una construcción de gen reportero. Por ejemplo, las células T alérgicas fallan al inicial la trascripción del gen IL-2 inducido por un promotor eterólogo bajo el control del mejorador del gen IL-2 5' o mediante un multímero de la secuencia AP 1 que se puede encontrar dentro del mejorador (Kang et al. (1992) Science 257:1134).

El polipéptido GL50 y las moléculas de ácido nucleico comprenden una familia de moléculas que tiene ciertas características estructurales y funcionales conservadas. El término "familia" cuando se refiere a las moléculas de proteína y ácido nucleico de la invención están destinadas pretenden significar dos o más proteínas o moléculas de ácido nucleico que tienen un dominio estructural común o un motivo y tiene homología de secuencia de aminoácido o nucleótido como se definió aquí. Tales miembros de familia pueden ser de ocurrencia natural o no natural y pueden ser de especies iguales o diferentes. Por ejemplo, una familia puede contener una primera proteína de origen humano, así como también otras proteínas distintas de origen humano o alternativamente, pueden contener homólogos de origen no humano. Los miembros de una familia también pueden tener características funcionales comunes. Las moléculas GL50 descritas aquí son miembros de la familia mayor de moléculas, la familia B7 de las moléculas coestimuladoras. El término "familia B7" o "molécula B7" como se utiliza aquí incluyen moléculas coestimuladoras que comparten la homología de secuencia con los polipéptidos B7, por ejemplo, con B7-1, B7-2, B7-3 (reconocidos por el anticuerpo de BB-1), y/o GL50. Por ejemplo, como se muestra en la tabla 1 anterior, el B7-1 humano y el B7-2 humano comparten aproximadamente el 20% de la identidad de secuencia de aminoácido. Además, la familia B7 de moléculas comparte una función común, por ejemplo, la capacidad de unirse aleando de la familia B7 (por ejemplo uno o más de los CD28, CTLA4, o ICOS) y/o sus ligandos sobre las células inmunes y tiene la capacidad de inhibir o inducir la coestimulacion de las células inmunes.

Como se utiliza aquí el término "actividad" con respecto al polipéptido GL50 incluye actividades que son inherentes en la estructura de un polipéptido GL50. El término "actividad" incluye la capacidad de modular una señal coestimuladora en células T activadas para inducir la proliferación y/o la secreción de citoquina. Además, el término "actividad" incluye la capacidad de un polipéptido GL50 a unir a su ligando natural o su compañero de unión. Preferiblemente, el ligando al cual se une el polipéptido GL50 es una molécula ICOS. Como se utiliza aquí, las "formas activantes" de las moléculas coestimuladoras trasmiten una señal por vía de un receptor coestimulador (por ejemplo una señal que activa una célula inmune si el receptor es un receptor inhibitoria que trasmite una señal coestimuladora (por ejemplo CD28, o ICOS) o una señal inhibitoria si el receptor es uno que trasmite una señal negativa a una célula inmune (por ejemplo CTLA4). Las formas inhibitorias de una molécula coestimuladora evitan la trasmisión de una señal a una célula inmune (por ejemplo, una señal coestimuladora o una señal negativa).

Como se utiliza aquí el término "tumor" incluye neoplasias uterinas malignas (cancerosa), (por ejemplo carcinomas, sarcomas, leucemias, y linfomas). El término "cáncer" incluye tumores malignos primarios (por ejemplo aquellas células que no han migrado a sitios en el cuerpo del sujeto diferentes del sitio del tumor original) y tumos malignos secundarios (por ejemplo aquellos que sufren de metástasis, la migración de las células tumorales a sitios secundarios se son diferentes del sitio del tumor original).

Como se utiliza aquí, una molécula de ácido nucleico "de ocurrencia natural" se refiere a una molécula de ARN o ADN que tiene una secuencia de nucleótido que ocurre en la naturaleza (por ejemplo codifica una proteína natural).

Como se utiliza aquí, una molécula de ácido nucleico "contrasentido" comprende una secuencia de nucleótido que es complementaria a una molécula de ácido nucleico "consentido" que codifica una proteína, por ejemplo, complementaria a la cadena codificante de una molécula de cADN de doble cadena, complementaria a una secuencia de mARN o complementaria a la cadena codificante de un gen. De acuerdo con esto, la molécula de ácido nucleico contrasentido puede unirse con hidrogeno a la molécula de ácido nucleico consentido.

Como se utiliza aquí, el término "región codificante" se refiere a regiones de secuencia nucleica que comprenden codones que son traducidos en los residuos de aminoácido, mientras que el término "región no codificante" se refiere a regiones de una secuencia de nucleótido que no es traducida en aminoácidos (por ejemplo iones no traducidas 5' y 3').

Como se utiliza aquí, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capas de transportar otro ácido nucleico al cual este esta ligado. Una tipo de vector es un "plásmido" que se refiere a un anillo de ADN de doble cadena circular en el cual pueden estar ligados los segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vectores es un vector viral en donde los segmentos de ADN adicionales se pueden ligar a un genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped es la cual ellos son introducidos (por ejemplo vectores bacteriales que tienen un origen bacterial de replicación y vectores de mamífero episomales). Otros vectores (por ejemplo los vectores de mamífero no episomal) son integrados en el genoma de una célula huésped luego de la introducción en la célula huésped y de esta manera se replican a lo largo del genoma del huésped. Más aún, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes el cual ellos están operativamente ligados. Tales vectores son demonizados aquí como "vectores de expresión recombinantes" o simplemente "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante están a menudo en la forma de plasmados. En la presente especificación, "plásmido" y "vector" se pueden utilizar intercambiablemente como los plásmidos en la más comúnmente utilizada forma de vector. Sin embargo, la invención pretende incluir otras de tales formas de vectores de expresión, tales como los vectores virales (por ejemplo los retrovirus de replicación defectuosa, los adenovirus y los virus adnoasociados), que sirven a funciones equivalentes.

Como se utiliza aquí, el término "célula huésped" pretende referir a una célula en la cual el ácido nucleico de la invención, tal como un vector de expresión recombinante de la invención, se ha introducido. Los términos "célula huésped" y "célula huésped recombinante" son utilizados intercambiablemente aquí. Se debe entender que tales términos no se refieren solamente a las células sujeto particular sino a la progenie o a la progenie potencial de tales células. En razón a que pueden ocurrir ciertas modificaciones en las generaciones sucesivas debido a mutación o a influencias ambientales, tal progenie puede de hecho, ser no idéntica a la célula padre, pero aun están incluidas en el alcance del término como se utiliza aquí.

Como se utiliza aquí "un animal transgénico" se refiere a un animal no humano, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ratón en el cual uno o más de las células de los animales incluyen un "transgen". El término "transgen" se refiere a un ADN exógeno que se integra en el genoma de una célula del cual se desarrolla el animal transgénico y que permanece en el genoma del animal maduro, por ejemplo dirigiendo la expresión de un producto de gen codificado en una o más tipos de célula o tejidos del animal transgénico.

Como se utiliza aquí, un "animal recombinante homologo" se refiere aun tipo de animal no humano transgenico, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ratón, en el cual el gen endógeno se ha alterado mediante recombinación homologa entre el gen endógeno y una molécula de ADN exogena inducida en una célula de animal, por ejemplo, una célula embrionica del animal, antes del desarrollo del animal.

Como se utiliza aquí, una "proteína aislada" se refiere a una proteína que esta sustancialmente libre de otras proteínas, material celular y medio de cultivo cuando se aísla de las células o se produce mediante técnicas de ADN recombinante, o precursores químicos o otros químicos cuando se sintetiza químicamente.

El término "anticuerpo" como se utiliza aquí también incluye una "porción de unión de antígeno" de una anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo"). El término "porción de unión de antígeno" como se utiliza aquí como se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retiene la capacidad a unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo GL50). Se ha visto que la función que se une ha antígeno de un anticuerpo se puede desarrollar mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completo. Ejemplos de fragmentos de unión comprendidos dentro del término " porción de unión de antígeno" de un anticuerpo incluyen (I) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')_{2}, un fragmento bivalente que comprende dos fragmento Fab ligados a un puente de sulfuro en la región de pioteo; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un brazo simple de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste de un dominio VH y (vi) una región determinante de complementariedad aislada (CDR). Adicionalmente, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH se han codificados por genes separados ellos se pueden unir, utilizando métodos recombinantes, mediante un ligador sintético que les posibilita ser hechos como una cadena de proteína simple en la cual las regiones VL y VH pares forman moléculas monovalentes (conocidas como Fv (scFv) de cadena simple; ver por ejemplo Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; y Osbourn et al. 1998, Nature Biotechnology 16:778). Tales anticuerpo de cadena simple también pretenden estar comprendidos dentro del término "porción de unión de antígeno" de un anticuerpo. Cualquiera de las secuencias VH y VL del scFv específicos se pueden ligar a una región constante de inmunoglobulina humana es cADN o secuencias genomitas, con el fin de general vectores de expresión que codifican las moléculas IgG completas u otros isotipos. El VH y el V1 también se pueden utilizar en la generación de Fab, Fv o otros fragmentos de inmunoglobulinas utilizando química de proteínas o tecnología de ADN recombinate. Otras formas de anticuerpo de cadena simple, tales como los anticuerpos también están comprendidas. Los diacuerpos son anticuerpo bivalente, biespecíficos en los cuales los dominios VH y VL se expresan sobre una cadena de polipéptido simple, pero utilizando un ligador que es demasiado corto para permitir el paso entre los dos dominios en la misma cadena forzando de esta manera los dominios aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión de antígeno (ver por ejemplo Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123).

Aun adicionalmente, un anticuerpo de una porción de unión de antígeno de este puede ser parte de moléculas de inmunoadhesión mayores, formado por una sucesión covalente o no covalente del anticuerpo o porción de anticuerpo con una o más proteínas o péptidos. Ejemplos de tales moléculas de inmunoadhesion incluyen el uso de una región núcleo de estreptavidina para hacer una molécula scFv tetramerica (Kipriyanov, SM., et al (1195) Human Antibodies y Hybridomas 6:93-101). Y el uso de un residuo de cisteína un péptido marcador y una polihistidina C-terminal tag para hacer moléculas scFv bivalentes y biotiniladas (Kipriyanov, S.M., et al. (1994) Mol. Immunol 31:1047-1058). Las porciones de anticuerpo, tales como los fragmentos Fab y F(ab')_{2}, se pueden preparar de moléculas de anticuerpos completos utilizando técnicas convencionales, tales como la digestión de papaina o pepsina, respectivamente, de los anticuerpos completos. Más aún, los anticuerpos, las porciones de anticuerpo y las moléculas de inmunoadhesión se puede obtener utilizando técnicas de ADN recombinante estándar, como se describieron aquí.

Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales; xenogeneicos, alogeneicos, o singeneicos; o formas modificadas de estos, por ejemplo humanizados, quiméricos, etc. Preferiblemente, los anticuerpos de la invención se unen específicamente o sustancialmente de manera especifica a moléculas GL50. Los términos "anticuerpo monoclonales" y "composición de anticuerpo monoclonal", como se utiliza aquí como se refieren a una población de moléculas de anticuerpo que contienen solamente unas especies del sitio de unión de anticuerpo capas de inmuno reaccionar con un epitopo particular de un antígeno, mientras que el término "anticuerpo policlonales" y "composición de anticuerpo policlonal" se refiere a una población de moléculas de anticuerpo que contienen múltiples especies del sitios de unión de antígeno capaces de interactuar con un antígeno particular. Una composición de anticuerpo monoclonal, despliega típicamente una afinidad de unión simple por una antígeno particular con la cual este inmuno reacciona.

El término "anticuerpo humanizado" como se utiliza aquí, pretende incluir anticuerpos hechos mediante célula no humana que tienen regiones variables y constantes que se han alterado para semejarse más cercanamente anticuerpos que serian hechos mediante una célula humana. Por ejemplo, al alterar la secuencia de aminoácido de anticuerpo no humano para incorporar los aminoácidos encontrados en las secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanizados de la invención pueden incluir residuos de aminoácido no codificados por las secuencias de inmunoglobulina a línea germinal humana (por ejemplo mutaciones introducidas mediante mutagénesis aleatoria o especifica del sitio in vitro o en mutación somática in vivo), por ejemplo en los CDR. El término "anticuerpo humanizado" como se utiliza aquí, también incluye anticuerpos en el cual la secuencia CDR derivada de la línea germinal de otras especies de mamífero, tal como un ratón se han injertado en las secuencias de estructura humanas.

Un "anticuerpo aislado", como se utiliza aquí pretende referirse a un anticuerpo que esta sustancialmente libre de otros anticuerpos que tiene diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo un anticuerpo aislado que se une específicamente a GL50 esta sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente antígenos diferentes de GL50). Más aún, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otros materiales y/o químicos celulares.

Como se utiliza aquí, "compañero de unión" es una molécula blanco a una molécula con un polipéptido GL50 que se une o interactúa en la naturaleza (por ejemplo un ligando o una molécula interactuadota intracelular (tal como una molécula que actúa corriente arriba o corriente abajo del GL50 en una celda de transducción de señal)), de tal forma que se logra la actividad del GL50.

El término "transducción de señal" pretende comprender el procesamiento de las señales físicas o químicas provenientes del ambiente extra celular a través de la membrana celular y hacia la célula y pueden ocurrir a través de uno o varios mecanismos tales como la activación/inactivación de enzimas (tales como proteasas, u otras enzimas que pueden alterar patrones de fosforilación otras modificaciones post transduccionales) la activación de canales de ion o almacenes de ion intracelular, activación de enzima efectuadota por vía de intermedios de proteína que se unen a nucleótido de guanina, formación de inositol fosfato, activación o inactivación de adenil ciclasa, activación directa (o inhibición) del factor trascripcional y/o activación. Una "celda de señalización" se refiere a los componentes involucrados en la "transducción de señal" de una señal partícula en una célula.

Existe una correspondencia conocida y definida entre la secuencia de aminoácido de una proteína particular y la secuencia de nucleótido que pueden codificar para la proteína, como se definió en el código genético (mostrado adelante). De manera similar, existen una correspondencia conocida y definida entre las secuencia de nucleótido de una molécula de ácido nucleico particular y la secuencia de aminoácido codificada por medio de la cual la molécula de ácido nucleico, codificada por esa secuencia de ácido muno nucleico, como se definió por el código genético.

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Una característica importante bien conocida del código genético es la redundancia, por medio de la cual para la mayoría de los aminoácidos utilizados para hacer proteínas, más de una tripleta de nucleótido codificante se puede emplear (ilustrada anteriormente). Por lo tanto, un número de diferentes secuencias de nucleótido puede codificar para una secuencia de aminoácido dada. Tales secuencias de nucleótido son consideradas equivalentes en razón a que ellas resulten en la producción de la misma secuencia de aminoácidos en todos los organismos (aunque ciertos organismos puedan traducir alguna secuencia más eficientemente que otros no hacen). Más aún, ocasionalmente una variante metilada de una purina o pirimidina se puede encontrar en una secuencia de nucleótido dada. Tales mutilaciones no afectan la relación codificante entre el codón de trinucleótido y el aminoácido correspondiente.

En vista de lo anterior, la secuencias de nucleótido de la molécula de ADN o ARN que codifica para el polipéptido GL50 de la invención (o cualquier porción de esta) se puede utilizar para derivar la secuencia de aminoácido GL50, utilizando el código genético para traducir a la molécula de ADN o ARN en una secuencia de aminoácido. De manera similar, para cualquier secuencia de aminoácido GL50, las correspondientes secuencias de nucleótidos que pueden codificar el polipéptido GL50 se pueden deducir del código genético (el cual en razón de su redundancia producirá múltiples secuencias de ácidos nucleicos para cualquier secuencia de aminoácido dada). Así, la descripción y/o la exposición de una secuencia de nucleótido GL50 se debe considerar también que incluye la descripción y/o la exposición a la secuencia de aminoácido codificada con la secuencia de nucleótido. De manera similar, la descripción y/o la muestra de la secuencia de aminoácido GL50 aquí se debe considerar que también incluyen la descripción y/o la exposición de todas las secuencias de nucleótido posibles que pueden codificar la secuencia de aminoácido.

II. Moléculas de ácido nucleico aisladas

Un aspecto de la invención pertenece a moléculas de ácido nucleico aisladas que codifica los polipéptidos GL50 o porciones biológicamente activas de estas, así como también fragmentos de ácido nucleico suficientes para uso como sondas de hibridación para identificar las moléculas de ácido nucleico que codifica GL50 (por ejemplo GL50 mARN) y fragmentos para uso como cebadores PCR para la amplificación o mutación de las moléculas de ácido nucleico GL50. Como se utiliza aquí, el término "molécula de ácido nucleico" pretende incluir moléculas de ADN (por ejemplo cADN o ADN genómico) y las moléculas de ARN (por ejemplo mARN) y análogos del ADN o ARN generados utilizando análogos de nucleótido. La molécula de ácido nucleico puede ser de cadena simple o de cadena doble, pero preferiblemente es ADN de cadena doble.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" es aquella que se separa de las otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Por ejemplo, con relación al ADN genómico el término "aislado" incluye moléculas de ácido nucleico que son separadas del cromo soma con el cual el ADN genómico esta naturalmente asociado. Preferiblemente, una molécula de ácido nucleico "aislada" esta libre de secuencias que flanquean de manera natural el ácido nucleico (es decir secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del cual la molécula de ácido nucleico se deriva. Por ejemplo, en varias modalidades, la molécula de ácido nucleico GL50 aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, o 0.1 kb de secuencias de nucleótido las cuales flanquean de manera natural a la molécula de ácido nucleido en el ADN genómico de la célula de la cual se deriva el ácido nucleico. Más aún, una molécula de ácido nucleico "aislada" tal como una molécula de cADN, puede estar sustancialmente libre de otro material celular o un medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos cuando se sintetiza químicamente. Una molécula de ácido nucleico GL50 "aislada" puede, sin embargo, estar ligada a otras secuencias de nucleótido que normalmente no flanquean las secuencias GL50 en el ADN (por ejemplo la secuencia de nucleótido GL50 pueden estar ligadas a secuencias de vector). En ciertas modalidades preferidas una molécula de ácido nucleico "aislada" tal como una molécula de cADN, también puede ser libre de otro material celular. Sin embargo, no es necesario para la molécula de ácido nucleico GL50 ser libre de otro material celular para ser considerada "aislada" (por ejemplo la molécula de ADN GL50 separada de otro ADN de mamífero e insertada en una célula bacterial seria aun considerada como "aislada").

Una molécula de ácido nucleico de la presente invención, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO: 1, 3, o 5, o una porción de esta, se puede aislar utilizando técnicas de biología molecular estándar y la información de las secuencias suministrada aquí. Por ejemplo, utilizando toda o la porción de la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1, 3, o 5, o como una sonda de hibridación, las moléculas de ácido nucleico GL50 se pueden aislar utilizando la hibridación estándar y técnicas de clonación (por ejemplo como se describe en Sambrook, J. et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Más aún, la molécula de ácido nucleico que comprende toda o una porción de la SEQ ID No: 1, 3, o 5, se puede aislar mediante reacción de cadena de polimerasa (PCR) utilizando los cebadores de oligonucleótidos sintéticos diseñados con base en la secuencia de la SEQ ID NO: 1, 3, o 5 respectivamente.

Un ácido nucleico de la invención se puede amplificar utilizando cADN, mARN o alternativamente, ADN genómico como molde y los cebadores de oligonucleótido apropiados de acuerdo con las técnicas de amplificación PCR estándar. El ácido nucleico así amplificado se puede clonar en un vector apropiado y caracterizado mediante un análisis de secuencia de ADN. Adicionalmente, los oligonucleótidos que corresponden a las secuencias de nucleótido GL50 se pueden preparar mediante técnicas sintéticas estándar, por ejemplo, utilizando un sintetizador de ADN automatizado.

En una modalidad preferida la molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende la secuencia de nucleótido mostrada en la SEQ ID No: 1, 3, o 5.

En una modalidad, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende una molécula de ácido nucleico que es un complemento de la secuencia de nucleótido mostrada en la SEQ ID NO: 1, 3, o 5, una porción de cualquiera de estas secuencias de nucleótido. Una molécula de ácido nucleico que es complementaria a la secuencia de nucleótido mostrada en la SEQ ID No: 1, 3, o 5, es aquella que es suficientemente complementaria a la secuencia de nucleótido mostrada en la SEQ ID NO: 1, 3, o 5, respectivamente, de tal forma que esta pueda hibridizar la secuencia de nucleótido mostrada en la SEQ ID NO: 1, 3, o 5, respectivamente formando de esta manera un duplex estable.

En aun otra modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención comprende una secuencia de nucleótido que es por lo menos aproximadamente 95%, 98% o más homologa con la secuencia de nucleótido (por ejemplo la longitud completa de la secuencia de nucleótido) mostrada en la SEQ ID No: 1, 3, o 5, a una porción de cualquiera de estas secuencias de nucleótido.

Más aún, la molécula de ácido nucleico de la invención puede comprender solamente una porción de la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1, 3, o 5, por ejemplo un fragmento que se puede utilizar como una sonda o cebador de un fragmento que codifica una porción biológicamente activa de un polipéptido GL50. La secuencia de nucleótido determinada de la clonación de los genes GL50 permite la generación de sondas y cebadores diseñados para uso en identificar y/o clonar otros miembros de la familia GL50 así como también los homólogos de la familia GL50 de otras especies. La sonda y/o cebador típicamente comprende un oligonucleótido sustancialmente purificado. En una modalidad, el oligonucleótido comprende una región de la secuencia de nucleótido que hibridiza bajo condiciones estrictas por lo menos aproximadamente 12 o 15, preferiblemente aproximadamente 20 o 25, más preferiblemente aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 75, o 100 nucleótidos consecutivos de una secuencia con sentido de la SEQ ID NO: 1, 3, o 5, o de una variante o mutante alérgica de ocurrencia natural de la SEQ ID No: 1, 3, o 5. En otra modalidad la molécula de ácido nucleico de la presente invención comprende una secuencia de nucleótido que es por lo menos aproximadamente 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 900, 1000 o 1100 nucleótidos de longitud e hibridiza bajo condiciones de hibridación estrictas a una molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1, 3, o 5.

En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico de la invención comprende por lo menos 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o 1100 nucleótidos contiguos de la SEQ ID No: 1, 3 o 5.

En una modalidad, la molécula de ácido nucleico de la invención, por ejemplo, para uso como una sonda no incluye la porción de la SEQ ID NO: 1 desde aproximadamente los nucleótidos 1-370 de la SEQ ID NO: 5.

Preferiblemente, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende por lo menos una porción de la región codificante de la SEQ ID NO: 1 (mostrada en los nucleótidos 67-1032) o la SEQ ID NO: 3 (mostrada en los nucleótidos 1-1041) o la SEQ ID NO:5 (mostrada en los nucleótidos 24-950). En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico de la invención comprende la región codificante completa de la SEQ ID NO: 1, 3 o 5.

En otras modalidades, la molécula de ácido nucleico de la invención tiene por lo menos 70% de identidad, más preferiblemente 80% de identidad, y aun más preferiblemente 90% de identidad con una molécula de ácido nucleico que comprende: por lo menos aproximadamente 300, 400, 500, 600, 700, 800, o aproximadamente 900 nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, 3 o 5, y por lo menos aproximadamente 1000 o 1100 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 1 o 3.

Las sondas basadas en las secuencias de nucleótido GL 50 se puede utilizar para detectar los transcriptos o las secuencia genómicas que codifican las mismas o proteínas homologas. En modalidades preferidas, la sonda comprende además un grupo de marcación unido a esta, por ejemplo, el grupo de marcación puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un cofactor de enzima. Tales sondas se pueden utilizar como parte de un kit de prueba diagnostica para identificar las células o tejidos que expresan de manera equivocada un polipéptido GL50, tal como al medir un nivel de un ácido nucleico que codifica GL50 en una muestra de células de un sujeto por ejemplo detectando los niveles de mARN GL50 o determinando si el gen GL50 genómico se ha mutado o suprimido.

Un fragmento de ácido nucleico que codifica una "porción biológicamente activa de un polipéptido GL50" se puede preparar al aislar una porción de la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO: 1, 3 o 5, que codifica un polipéptido que tiene una actividad biológica GL50 (las actividades biológicas de los polipéptidos GL50 se describen aquí) expresando la porción codificada de polipéptido GL50 (por ejemplo mediante expresión recombinante in vitro) y evaluando la actividad de la porción codificada del polipéptido GL50.

Las moléculas de ácido nucleico que difieren de la SEQ ID NO: 1, 3, o 5 debido a la degeneración del código genético, y así codifican el mismo una proteína miembro GL50 como aquella codificada por la SEQ ID No: 1, 3 o 5 están comprendidas por la invención. De acuerdo con esto en otra modalidad, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención tiene una secuencia de nucleótido que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácido mostrada en la SEQ ID NO: 4 o 6. En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención tiene una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido GL50.

Además de la secuencia de nucleótido GL50 mostradas en la SEQ ID NO: 1, 3, o 5, se apreciara por aquellos expertos en la técnica que los polimorfismos de la secuencia de ADN que conduce a cambios en la secuencia de aminoácido de los polipéptidos GL50 pueden existir dentro de una población (por ejemplo la población humana). Tales polimorfismos genéticos en los genes GL50 pueden existir entre individuos dentro de una población debida a la variación alélica natural. Como se utiliza aquí, los términos "gen" y "gen recombinante" se refieren a moléculas de ácido nucleico que incluyen una estructura de lectura abierta que codifica un polipéptido GL50, preferiblemente un polipéptido GL50 de mamífero y puede además incluir secuencias reguladoras no codificantes, e intrones. Tales variaciones alélicas naturales incluyen tanto polipéptidos GL50 funcionales como no funcionales y pueden típicamente resultar en una varianza de 1-5% en la secuencia de nucleótidos del GL50. Cualquiera y todas las tales variaciones de nucleótido y los polimorfismos de aminoácido resultantes en los genes GL50 que son el resultado de la variación alélica natural y que no alteran la actividad funcional del polipéptido GL50 pretenden están dentro del alcance de la invención.

Más aún, las moléculas de ácido nucleico que codifican otros miembros de la familia GL50 y, así, que tienen una secuencia de nucleótido que difieren de la secuencias de la familia GL50 de la SEQ ID NO: 1, 3 o 5 están destinadas a estar dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, otro mGL50-1 se puede identificar con base en la secuencia de nucleótido del hGL50. Más aún, las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos GL50 de diferentes especies, y así que tienen una secuencia de nucleótidos que difieren de la secuencia GL50 de las SEQ ID NO: 1, 3, o 5 están destinadas a estar dentro del alcance del la invención. Por ejemplo, un ortólogo del mGL50-1 se puede identificar con base en la secuencia de nucleótido de murino.

Las moléculas de ácido nucleico que corresponden a las variantes alélicas naturales y a los homólogos y a las moléculas GL50 de la invención se pueden aislar, por ejemplo, con base en su homología con los ácidos nucleicos GL50 descritos aquí utilizando los cADN descritos aquí o porciones de estos, como son las de hibridación de acuerdo con las técnicas de hibridación estándar. Por ejemplo, un ADN GL50 se puede aislar de un ADN de una librería de ADN genómico humano utilizando una porción de la SEQ ID NO: 1, 3, o 5 como una sonda de hibridación y técnicas de hibridación estándar (por ejemplo como se describió en Sambrook, J. et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Más aún, una molécula de ácido nucleico que comprende todo a una porción del gen GL50 se puede aislar mediante reacción de cadena de polimerasa utilizando cebadores de oligonucleótidos diseñados con base en la secuencias de la SEQ ID NO: 1, 3, o 5. Por ejemplo, el mARN se puede aislar de células (por ejemplo mediante procedimiento de extracción de guanidinio.tiocianato de Chirgwin et al. (1979) Bochemistry 18:5294-5299) y cADN se puede prepara utilizando transcriptaza inversa (por ejemplo transcriptaza inversa Molones MLV, disponible de Gibco/BRL, Bethesda, MD; o transcriptaza inversa a AMV, disponible de Seikagaku América, Inc, San Petersburgo, FL). Los cebadores de oligonucleótidos sintéticos para la amplificación PCR se pueden diseñar con base en la secuencia de nucleótido mostrada en la SEQ ID NO: 1, 3, o 5. Una molécula de ácido nucleico de la invención se puede amplificar utilizando un cADN, o alternativamente, ADN genómico, como un molde y los cebadores de oligonucleótido apropiado de acuerdo con las técnicas de amplificación PCR estándar. El ácido nucleico así amplifico se puede clonar en un vector apropiado y ser caracterizado mediante un análisis de secuencia de ADN. Además, los oligonucleótidos que corresponden a la secuencia de nucleótido GL50 se pueden preparar mediante técnicas sintéticas estándar, por ejemplo, utilizando un sintetizador de ADN automatizado.

En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico aislada de la invención se puede identificar con base en la identidad de secuencia de nucleótido compartida utilizando un algoritmo matemático. Tales algoritmos son subrayados con más de detalle adelante (ver, por ejemplo sección III).

En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico aislada en la invención o tiene por lo menos 15, 20, 25, 30 o más nucleótidos de longitud e hibridiza bajo condiciones estrictas a la molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO: 1, 3, o 5. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico tiene por lo menos 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, o 600 nucleótidos de largo. Como se utiliza aquí, el término "hibridiza bajo condiciones estrictas" pretende describir condiciones de hibridación y lavado bajo las cuales las secuencias de nucleótido por lo menos 30%, 40%, 50% o 60% homologas una a la otra típicamente permanecen hibridizados una a la otra. Preferiblemente, las condiciones son tales que las secuencias por lo menos de aproximadamente el 70%, más preferiblemente por lo menos aproximadamente el 80%, aun más preferiblemente por lo menos aproximadamente el 85% o el 90% homologas una a la otra típicamente permanecen hibridizadas una a la otra. Tales condiciones estrictas son conocidas por aquellos expertos en la técnica y se pueden encontrar en los Current Protocols en Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY. (1989), 6.3.1-6.3.6. un ejemplo preferidos no limitante de condiciones de hibridación estrictas son la hibridación en cloruro de sodio 6X/citrato de sodio (SSC) aproximadamente 45ºC, seguido por una o más lavados en 0.2 X SSC, 0.1%SDS a 50-65ºC. Preferiblemente, ninguna molécula de ácido nucleico aislada de la invención que hibridiza bajo condiciones estrictas a la secuencia SEQ ID NO: 1, 3, o 5 corresponde a una molécula de ácido nucleico de ocurrencia natural.

Como se utiliza aquí, una molécula de ácido nucleico de "ocurrencia natural" se refiere a la molécula de ARN o ADN que tiene una secuencia de nucleótido que ocurre en la naturaleza (por ejemplo, codifica una proteína natural). Además de la secuencia de nucleótido GL50 mostrados en la SEQ ID NO: 1, 3, o 5 se apreciara por aquellos expertos en la técnica que los polimorfismos de la secuencia de ADN que conduce a cambios menores en la secuencias de nucleótidos y aminoácido de un GL50 pueden existir dentro de una población. Tales polimorfismos genéticos en un gen GL50 pueden existir entre individuos dentro de una población debido a la variación alélica natural. Tales variaciones alélicas naturales pueden típicamente dar como resultado 1-5% de varianza en la secuencia de nucleótido del gen. Tales variaciones de nucleótido y polimorfismos de aminoácido resultante en el GL50 que son el resultado de la variación
alélica natural y que no alteran la actividad funcional del polipéptido GL50 están dentro del alcance de la invención.

Además de los variantes alélicas de ocurrencia natural de las secuencias GL50 que pueden existir en la población, el experto apreciara adicionalmente que se puede introducir cambios menores mediante la mutación en la secuencia de nucleótido, por ejemplo, de las SEQ ID NO: 1, 3 o 5, conduciendo de esta manera a cambios en la secuencias de aminoácido de la proteína codificada, sin alterar la actividad funcional de un polipéptido GL50. Por ejemplo, las sustituciones de nucleótido que conducen a las sustituciones de aminoácido en los residuos de aminoácido "no esenciales" se pueden hacer en la secuencia de la SEQ ID NO: 1, 3 o 5. Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que se puede alterar de la secuencia tipo silvestre de una molécula de ácido nucleico GL50 (por ejemplo la secuencia de la SEQ ID NO: 1, 3 o 5) sin alterar la actividad funcional de la molécula GL50. Los residuos de ejemplo que no son esenciales, por lo tanto, susceptibles de sustitución, se pueden identificar por un experto en la técnica al desarrollar un alineamiento de aminoácidos de los miembros de la familia B7 (o de los miembros de la familia GL50) y determinar unos residuos que no son conservados. Tales residuos, en razón a que ellos no son conservados, son más probablemente susceptibles de sustitución.

De acuerdo con esto, otro aspecto de la invención pertenece a las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos GL50 que contiene cambios en los residuos de aminoácido que no son esenciales para una actividad GL50. Tales polipéptidos GL 50 difieren en la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 4 o 6 reteniendo aun una actividad GL50 inherente. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una variante no natural del polipéptido GL50 se puede secretar al introducir uno o más sustituciones de nucleótido adiciones o supresiones en la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO: 1, 3 o 5 de tal forma que una o más sustituciones de aminoácido, adiciones o supresiones e introducen en la proteína codificada. Las mutaciones se pueden introducir en la SEQ: 1, 3 o 5 mediante técnicas estándar, tales como la mutagénesis dirigida de sitio y la mutagénesis mediada por PCR. Preferiblemente, las sustituciones de aminoácido conservadoras son hechas en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales. Una "sustitución de aminoácido conservadora" es aquella en la cual el residuo de aminoácido es remplazado con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de los residuos de aminoácidos que tiene cadenas laterales similares se han definido en la técnica, incluyendo cadenas laterales básicas (por ejemplo lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales plurales no cargadas (por ejemplo glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadenas laterales beta ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo tiroxina, fenilalanina, triptofano, histidina). Así, un residuo de aminoácido no esencial en un GL50 es preferiblemente remplazado con otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadena lateral.

Alternativamente, de otra modalidad, las mutaciones se pueden introducir aleatoriamente entre todo o parte de una secuencia codificante GL50, tal como mediante mutagénesis de saturación o mutagénesis de casete racional, y los mutantes resultante se pueden seleccionar por seleccionar por su capacidad para unirse a un ligando, o unirse a unas moléculas interactuadoras intracelulares para identificar los mutantes que retiene la actividad funcional luego de la mutagénesis, la proteína mutante GL50 codificada se puede expresar recombinantemente en una célula huésped y la actividad funcional de la proteína mutante se puede determinar utilizando los ensayos disponibles en la técnica para evaluar una actividad GL50.

De acuerdo con esto, otro aspecto de la invención corresponde a las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos GL50 que contiene cambios en los residuos de aminoácido que no son esenciales para la actividad. Los alineamientos de homología tales como los análisis Pileup mostrados aquí como se pueden utilizar para seleccionar los aminoácidos que pueden ser susceptibles de alteración. Por ejemplo, los 18 sitios de aminoácido que se alinean idénticamente entre las 6 moléculas dentro del dominio extra celular son bien conservados y son, por lo tanto menos probablemente susceptibles de alteración. Similarmente, de las 32 posiciones que definen los dobleces similares a IgV y similares a IgC predichos de las moléculas de la familia B7, 13 son idénticamente conservados entre las 6 moléculas, más notablemente las 4 cisteínas que permiten el dobles intra molecular de los dominios. Por lo tanto, estos aminoácidos son poco probablemente susceptibles de alteración. Otras áreas de conservación de secuencia significativa fueron vistan en el dominio extra celular. Por ejemplo, el residuo de valina que corresponde a la posición 86 del mGL50-1 es compartida por el hGL50, y las secuencias B7-2 pueden no ser susceptibles de alteración. De manera similar, la tiroxina en la posición 87 del mGL50-1 de ratón se conserva en los sitios correspondientes en el hGL50 y el B7-1. Las 16 posiciones con calificaciones de identidad de 8 (las 5 posiciones son compartidas por mGL50-1/hGL50 y B7-1 de ratón, 4 posiciones compartidas entre el mGL50-1/hGL50 y B7-2 de ratón, y 6 posiciones son compartidas entre el B7-1 y B7-2) pueden ser no susceptibles de alteración. Además, las posiciones en la tras membrana y/o los dominios intra plasmáticos conservados entre los miembros de la familia GL50 (en particular los residuos de tiroxina en transmembrana o el dominio citoplasmático de la molécula GL50). De nuevo, estas posiciones son poco probablemente susceptibles de alteración si va hacer mantenida a la actividad GL50).

Aun otro aspecto de la invención corresponde a moléculas de ácido nucleico de moléculas GL50 de ocurrencia no natural que son quiméricas y que ellas comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifican el dominio de tras membrana o citoplasmático GL50 que ellas no comprenden de manera natural. Por ejemplo, en una modalidad, los dominios de tras membrana y/o citoplasmáticos del dominio GL50 pueden ser "intercambiadas" o "barajadas" utilizando técnicas de biología molecular estándar para crear moléculas GL50 que tienen propiedades de transducción de señal alteradas comparadas con la molécula GL50 de ocurrencia natural. Tales moléculas de ácido nucleico y polipéptido también están abarcadas por la invención.

En aun otro aspecto, las moléculas de ácido nucleico GL50 se pueden trabajar con ingeniería para comprender las secuencias de ácido nucleico que codifican por lo menos una porción de otro miembro de la familia B7, por ejemplo, B7-1 y B7-2. Por ejemplo, utilizando técnicas estándar, las moléculas de ácido nucleico se pueden hacer que codifiquen las moléculas GL50/B7 hibridas con unión de ligando y/o propiedades de señalización que difieren de aquellas vistas en las moléculas de ocurrencia natural. Por ejemplo, en una modalidad, la secuencia de GL50 de pollo (Y08823) se puede utilizar para diseñar moléculas con propiedades de señalización y/o unión alteradas. Las similitud de la secuencias entre las aves GL50 de la forma de mamífero de las moléculas y su diferencia en la preferencia de ligando se pueden explotar para este fin. Por ejemplo, la sustitución progresiva de los residuos conservados entre la proteína similar a GL50 aviar (Y08823) y GL50 con aquellos encontrados en el GL50 (para hacer la molécula más similar a GL50) puede resultar en una molécula funcional que se une al ICOS y al CD28 y al CTLA4. La fusión Ig u otras construcciones que comprenden las proteínas GL50/B7 hibridas se pueden utilizar para lograr la activación diferencial o la inhibición de poblaciones de célula blanco y desviando los fenotipos de célula T. Tales moléculas de ácido nucleico y polipéptido están abarcadas por la invención.

Aun otro aspecto de la invención corresponde a la moléculas de ácido nucleicos aisladas que codifican una proteínas de fusión GL50. Tales moléculas de ácido nucleico, que comprenden por lo menos una primera secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido GL50, un polipéptido o un péptido operativamente ligado a una segunda secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido no GL50, un polipéptido péptido, se pueden preparar mediante técnicas de ADN recombinante estándar.

En una modalidad preferida, un polipéptido GL50 mutante se puede evaluar por la capacidad A: 1) coestimular (o inhibir la coestimulación de por ejemplo en formas solubles) la proliferación y/o la función efectuada (por ejemplo secreción de citoquina (tal como, por ejemplo, IL-2 i IL-10) de las células T activadas; 2) unirse a un anticuerpo anti-B7 y/o 3) unirse a un ligando GL50 (por ejemplo a CD28, CTLA4, y/o ICOS).

Además de las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos GL50 descritos anteriormente, otro aspecto de la invención pertenece a las moléculas de ácido nucleico aisladas que con contrasentido a esta. Una molécula de ácido nucleico "contrasentido" comprende una secuencia de nucleótido que es complementaria a una molécula de ácido nucleico "consentido" que codifica una proteína, por ejemplo, complementaria a la cadena codificante de una molécula de cADN de doble cadena o complementaria a la secuencia a mARN. De acuerdo con esto, una molécula de ácido nucleico contrasentido puede ser unida con hidrogeno a la molécula de ácido nucleico con consentido. La molécula de ácido nucleico contrasentido que puede ser complementaria a la cadena codificante GL50 completa, o solamente una porción de ésta. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico contrasentido es contrasentido a una "región codificante" de la cadena codificante de una secuencia de nucleótido que codifica GL50. El término "región codificante" se refiere a la región de la secuencia de nucleótido que comprende los codones que son traducidos en los residuos de aminoácido. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico o contrasentido es contrasentido a una "región no codificante" de la cadena codificante de una secuencia de nucleótido que codifica el GL50. El término "región no codificante" se refiere a la secuencia 5' y 3' que flanquea la región codificante que no son traducidas en los aminoácidos (es decir también denominadas como regiones no traducidas 5' y 3').

Dadas las secuencias de cadena codificante que codifica el GL50 descrito aquí, las moléculas de ácido nucleico contrasentido de la invención se pueden designar de acuerdo con las reglas de pares base de Watson y Crack. La molécula de ácido nucleico contrasentido puede ser complementaria a la región codificante completa del mRNA del GL50, pero más preferiblemente es un oligonucleótido que es contrasentido a solamente una porción de la región codificante o no codificante del mRNA del GL50. Por ejemplo, el oligonucleótido contrasentido puede ser complementario a la región que circunda el sitio de inicio de la traducción del mARN del GL50. Un oligonucleótido contrasentido puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, o 50 nucleótidos de largo. Una molécula de ácido nucleico contrasentido de la invención se puede construir utilizando síntesis química y reacciones de ligación enzimática utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un ácido nucleico contrasentido (por ejemplo un oligonucleótido contrasentido) puede ser químicamente sintetizado utilizando nucleótidos de ocurrencia natural de nucleótidos variadamente modificados designados para incrementa o diseñados para incrementar la estabilidad biológica de las moléculas o para incrementar la estabilidad física del duplex formado entre los ácidos nucleicos contrasentido y consentido, y por ejemplo se pueden utilizar nucleótidos sustituidos por derivados de fosforotioato y acridina. Ejemplos de nucleótidos modificados que se pueden utilizar para general el ácido nucleico contrasentido incluyen 5-fluorouracil, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitocina, 5-(carboxihidroxilmetil) uracilo, 5-carboximetilaminometil, 2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inopina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitocina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2tiotiracil, beta-D-mannosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-tiocitosina, 5-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracilo-5-oxiacetico (v), wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, metilester de ácido uracilo-5-oxiacetico, ácido uracilo-5-oxiacetico (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo, (acp3)w, y 2,6-diaminopurina. Alternativamente, el ácido nucleico contrasentido se puede producir biológicamente utilizando un vector de expresión en el cual el ácido nucleico se ha subclonado en una orientación contrasentido (es decir el ARN trascrito desde el aminoácido insertado estará
en una orientación contrasentido a un ácido nucleico blanco de interés, descrito además en las siguientes subsección).

Las moléculas de ácido nucleico contra sentido de la invención se administran típicamente a un sujeto o se generan in situ de tal forma que ellas hibridizan con o unidas al mARN celular y/o el ADN genómico y codifica un polipéptido GL50 para inhibir de esta manera la expresión de la proteína, por ejemplo, al inhibir la transcripción y/o la traducción. La hibiridización puede ser mediante complementariedad de nucleótido convencional para formar un duplex estable o, por ejemplo, en el caso de una molécula de ácido nucleico contrasentido que se une a los duplex de ADN, a través de interacciones especificas en la ranura principal de la hélice doble. Un ejemplo de una ruta de administración de unas moléculas de ácido nucleico contrasentido de la invención incluyen la inyección directa en el sitio del tejido. Alternativamente, las moléculas de ácido nucleico contrasentido se pueden modificar a células objetivos seleccionadas y luego administradas sistémicamente. Por ejemplo, para la administración sistémica, las moléculas contrasentido se pueden modificar de tal forma que ellas se unan específicamente a los receptores y antígenos expresados sobre una superficie de célula seleccionada, por ejemplo, al enlazar las moléculas de ácido nucleico contrasentido a péptidos o anticuerpos que se unen a receptores o antígenos de superficie celular. Las moléculas de ácido nucleico contrasentido también pueden suministrar las células que utilizan los vectores descritos aquí. Para lograr las suficientes concentraciones intracelulares de las moléculas antisentido, las construcciones de vector en las cuales la molécula de aminoácido contrasentido se coloca bajo el control, de un promotor pol II o pol III fuerte se prefieren.

En aun otra modalidad, la molécula de ácido nucleico contrasentido de la invención es una molécula de ácido nucleico \alpha-anomérica. Una molécula de ácido nucleico \alpha-anomérica forma híbridos de cadena doble específicos con ARN complementario en el cual, contrario a las \beta-unidades usuales, las cadenas corren paralelas una a la otra (Gautiltier et al., (1987) Nucleic Acids. Res. 15:6625-6641). La molécula de ácido nucleico contrasentido también puede comprender un 2'-o-metilribonucleotido (Inouse et al. (1987) Nucleic Acids. Res. 15:6131-6148) o un análogo de ARN y un ADN (Inouse et al. (1987) FEBS Lett. 215:327-330).

En aun otra modalidad, la molécula de aminoácido contrasentido de la invención es una ribozima. Las ribozimas son moléculas de ARN catalítico con actividad de ribonucleaza que son capaces de dividir un ácido nucleico de hebra simple tal como un mARN, en el cual ellos tienen una región complementaria. Así, las ribozimas (por ejemplo las ribozimas cabeza de martillo (descritas en Haseloff y Gerlach (1988) Nature 334:585-891)) se pueden utilizar para dividir cataliticamente los trascritos de mARN de GL50 para inhibir de esta manera la traducción del mARN de GL50. Una ribozima que tiene especificidad para una ácido nucleico que codifica al GL50 se puede diseñar con base en la secuencia de nucleótido del GL50 descrito aquí (por ejemplo la SEQ ID NO: 1, 3, o 5). Por ejemplo, un derivado de tetrahimena L-19 IVS ARN se puede construir en el cual la secuencia de nucleótido del sitio activo es complementaria a la secuencia de nucleótido hacer dividida en el a mARN que codifica el GL50. Ver, por ejemplo, Cech et al. Patente U.S No. 4.987.071; y Cech et al. Patente U.S No. 5.116.742. De manera alternativa, el a mARN del GL50 se puede utilizar para seleccionar el ARN catalítico que tiene la actividad de ribonucleasa especifica de un grupo de moléculas de ARN. Ver, por ejemplo, Bartel, D. y Szostak, J.W. (1993) Science 261:1411-1418.

Alternativamente, la expresión del gen GL50 se puede inhibir mediante las secuencias de nucleótido blanco complementarias a la región regulatoria del GL50 (por ejemplo el promotor y/o los mejoradores del GL50) para formar estructuras helicoidales triples que eviten la transcripción del gen GL50 en las células blanco. Ver en general, Helene, C. 81991) Anticancer Drug Des. 6(6): 569-84; Helene, C. et al (1992) Ann. N, Y. Acad. Sci, 660:27-36; y Maher, L.J. (1992) Bioessays 14(12):807-15.

En aun otra modalidad, las moléculas de ácido nucleico GL50 de la presente invención se pueden modificar en la porción base, la porción de azúcar y la estructura de fosfato para mejorar, por ejemplo, la estabilidad, hibridación, o solubilidad de la molécula. Por ejemplo, la estructura de deoxiribosa fosfato de las moléculas de ácido nucleico se pueden modificar para general ácidos nucleicos péptido (ver Hyrup B. y Nielsen, P.E. (1996) Bioorg. Med. Chem. 4(1):5-23). Como se utiliza aquí, los términos "ácidos nucleicos péptidos" o "PNA" se refieren a semejantes de ácidos nucleico, por ejemplo, semejantes de ADN en el cual la estructura de deoxiribosa fosfato se remplaza por una estructura de seudopéptido y solamente se retienen las 4 nucleobases naturales. La estructura neutra de los PNA se han mostrado que permite la hibridación específica al ADN y al ARN bajo condiciones de resistencia iónica baja. La síntesis de los oligómeros de PNA se pueden estabilizar utilizando protocolos de síntesis de péptido de fase sólida estándar como se describen en Hyrup y nielsen (1996) supra; Perry-O'Keefe et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14670-675.

Los PNA de las moléculas de ácido nucleico GL50 se pueden utilizar en aplicaciones terapéuticas diagnostica. Por ejemplo, los PNA se pueden utilizar como agentes contrasentido o de antígeno para la modulación especifica de secuencia de la expresión de gen mediante, por ejemplo, o al, por ejemplo, inducir la trascripción y contrarrestar o disminuir la traducción o inhibir la replicación. Los PNA de las moléculas de ácido nucleico GL50 también se pueden utilizar en el análisis de mutaciones de pares bases simples en un gen (por ejemplo mediante sujetamiento de PCR dirigido por PNA); como sondas de restricción artificial cuando se utilizan en combinación con otras enzimas, (por ejemplo nucleasas S1 (Hyrup y Nielsen (1996) supra)); o como sondas o cebadores para secuenciación o hibridación de ADN (Hyrup y Nielsen (1996) supra; Perry-O'Keefe (1996) supra).

En otra modalidad los PNA del GL50 se pueden modificar (por ejemplo, para mejorar su estabilidad o absorción celular), al unir grupos lipofilicos u otros grupos de ayuda al PNA, mediante la formación de las quimeras de PNA-DNA, o mediante el uso de liposomas u otras técnicas de suministro de droga conocidas en el arte. Por ejemplo, las quimeras de PNA-ADN de las moléculas de ácido nucleico GL50 se pueden generar las cuales pueden combinar las propiedades ventajosas del PNA y el ADN. Tales quimeras permiten que las enzimas de reconocimiento de ADN (por ejemplo ARNasa y ADN polimerasa), para interactuar con la porción de ADN mientras que la porción de PNA suministraría alta afinidad de unión y especificidad. Las quimeras de PNA-DNA se pueden ligar utilizando ligadores de longitudes apropiadas seleccionadas en términos de apilamiento de base, numero de enlaces entre las nucleobases y la orientación (Hyrup y Nielsen (1996) supra). La síntesis de las quimeras PNA-ADN se pueden derivar como se describió en Hyrup y Nielsen (1996) supra y Finn P.J. et al. (1996) Nucleic Acidic Res. 24(17):3357-63. Por ejemplo, una cadena de ADN se puede sintetizar sobre un soporte sólido utilizando una química de acoplamiento de fosforamidita estándar y los análogos de nucleocido modificados, por ejemplo, 5'-(4-metoxitritil) amino-5'-deoxitimidina fosfaramidita, se pueden utilizar como entre un PNA y el esquema 5'de ADN (Mag, M. et al (1989) Nucleic Acid Res. 17:5973-88). Los monómeros de PNA se acoplan entonces de una manera paso a paso para producir una molécula quimérica con un segmente de 5'PNA y un segmento de 3'ADN (Finn et al. (1996) supra). Alternativamente, las moléculas quiméricas se pueden sintetizar con un segmento de 5'ADN y un segmento de 3'PNA (Peterser, K.H. et al. (1975) Bioorganic Med. Chem. Lett, 5:1119-11124).

En otras modalidades, el oligonucleótido puede incluir otros grupos anexos tales como péptidos (por ejemplo, para receptores de célula huésped blanco in vivo), o agentes que faciliten el trasporte a través de la membrana celular (ver, por ejemplo Letsinger et al. (1989) Proc. Natl. Acad Sci. USA 86:6553-6556; Lemaitre et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652; Publicación PCT No W088/09810) o la barrera sangre-cerebro (ver, por ejemplo, Publicación PCT No W089/10134). Además, los oligonucleótidos se pueden modificar con agentes de división de hibridación-disparo (ver, por ejemplo, Krol et al. (1988) Biotechniques 6:958-976) o agentes de intercalantes. (Ver, por ejemplo Zon (1988) Pharm. Res. 5:539-549). Para este fin, el oligonucleótido se puede conjugar con otra molécula, (por ejemplo un péptido, un agente de reticulación disparado por hibridación, un agente de trasporte, o un agente de división disparado por hibridación).

III. Polipéptidos GL50 aislados y anticuerpos anti-GL50

Un aspecto de la invención corresponde a polipéptido GL50 aislados en porciones biológicamente activas de estas, así como también fragmentos de polipéptido adecuados para uso como inmunógenos para generar anticuerpos anti GL50. En una modalidad, los polipéptidos GL50 nativos se pueden aislar de las células o tejidos fuentes mediante un esquema de purificación apropiado utilizando técnicas de purificación de proteína estándar. En otra modalidad, los polipéptidos GL50 son producidos mediante técnicas de ADN recombinante. Alternativamente a la expresión recombinante, un polipéptido GL50 o un polipéptido se pueden sintetizar químicamente utilizando técnicas de síntesis de péptido estándar.

Una proteína "aislada" o "purificada" o una porción biológicamente activa de esta sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes provenientes de la célula o la fuente de tejido de la cual se deriva el polipéptido GL50, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos cuando se sintetiza químicamente. La expresión "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de polipéptido GL50 en el cual la proteína se separa de los componentes celulares de las células de las cuales este se aísla o se produce recombinantemente. En una modalidad, la expresión "sustancialmente libre de material celular" incluye las preparaciones de polipéptido GL50 que tiene menos de aproximadamente 30% (en peso seco) del polipéptido no GL50 (también denominado aquí como "proteína contaminante") más preferiblemente menos de aproximadamente el 20% de polipéptido no GL50 aun más preferiblemente menos de aproximadamente 10% de polipéptido no GL50, y más preferiblemente monos de aproximadamente 5% de polipéptido no GL50. Cuando el polipéptido GL50 o la porción biológicamente activa de este es recombinantemente producida, también es preferiblemente sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente el 20%, más preferiblemente menos de aproximadamente menos de aproximadamente el 10% y más preferiblemente menos de aproximadamente 5% del volumen de la preparación de proteína.

La expresión "sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos" incluye las preparaciones de polipéptido GL50 en la cual la proteína se separa de los precursores químicos u otros químicos que están involucrados en la síntesis de la proteína. En una modalidad, la expresión "sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos" incluye preparaciones de polipéptido GL50 que tiene menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de los precursores químicos y de los químicos no GL50, más preferiblemente menos de aproximadamente el 20% de los precursores químicos y los químicos no GL50, aun más preferiblemente menos de aproximadamente el 10% de los precursores químicos o los químicos no GL50, y más preferiblemente menos de aproximadamente el 5% de los precursores químicos o los químicos no GL50.

Otro aspecto de la invención corresponde a los polipéptidos GL50 aislados. Preferiblemente, los polipéptidos GL50 comprenden la secuencia de aminoácido codificada por la SEQ ID NO: 1, 3, o 5. En otra modalidad preferida la proteína comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO 4 o 6. en otras modalidades, la proteína tiene por lo menos 50%, al menos 60% de identidad de aminoácido, más preferiblemente 70% de identidad de aminoácido, más preferiblemente 80%, y aun más preferiblemente 90% o 95% de identidad de aminoácido con la secuencia de aminoácido mostrada en la SEQ ID NO: 4 o 6.

En otras modalidades, la invención suministra porciones aisladas de un polipéptido GL50. Los polipéptidos GL50 comprenden un dominio de polipéptido GL50. Dominios polipéptidos GL50 de ejemplos se muestran en la Figura 12 e incluyen los dominios similares a IgV, similares a IgC, de trasmembrana y citoplasmáticos.

La invención corresponde además a formas solubles de los polipéptidos GL50. Tales formas se pueden ser de ocurrencia natural o ser trabajadas por ingeniería y pueden comprender, por ejemplo, un dominio extra celular de un polipéptido GL50. en una modalidad, el dominio extra celular de un polipéptido GL50 comprende los dominios IgV e IgC después de dividir la secuencia de señal, pero no los dominios de trasmembrana y citoplasmáticos del polipéptido GL50 (por ejemplo que corresponden a la secuencia de aminoácido desde aproximadamente el aminoácido 22-258 de la SEQ ID NO: 6).

Las porciones biológicamente activas de un polipéptido GL50 incluyen péptidos que comprenden la secuencias de aminoácidos suficientemente homólogas a o derivadas de la secuencia de aminoácido del polipéptido GL50, que incluyen menos aminoácidos que la longitud completa de los polipéptidos GL50, y exhiben por lo menos una actividad del polipéptido GL50. Típicamente, las porciones biológicamente activas comprenden un dominio o motivo al menos una actividad del polipéptido GL50. Una porción biológicamente activa de un polipéptido GL50 puede ser un polipéptido el cual es, por ejemplo, de por lo menos 10, 25, 50, 100, 150, 200 o más aminoácidos de longitud.

Para determinar la identidad porcentual de dos secuencias de aminoácido o de dos secuencias de ácido nucleico, las secuencias están alineadas para propósitos de comparación optima (por ejemplo se pueden introducir espacios en uno o ambos de la primera y segunda secuencias de aminoácido o ácido nucleico para alineamiento optimo). En una modalidad preferida, la longitud de una secuencia de referencia alineada para propósitos de comparaciones de por lo menos 30%, preferiblemente por lo menos 40%, más preferiblemente por lo menos 50%, o aun más preferiblemente por
lo menos 60%, y aun más preferiblemente por lo menos 70%, 80%, o 90% de longitud o las secuencias de referencia.

Los residuos en las posiciones correspondientes son entonces comparados y cuando una posición en una secuencia es ocupada por el mismo residuo que la posición correspondiente en la otra secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. La identidad porcentual entre las dos secuencias, por lo tanto, es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las dos secuencias (es decir, % de identidad = # de posiciones idénticas/total # de posiciones x 100). La identidad porcentual entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, tomando en cuenta el número de espacios, y la longitud de cada espacio, que son introducidas para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. Como se utiliza aquí "identidad" de aminoácido o ácido nucleico es equivalente a "homología" de aminoácido o ácido nucleico.

La comparación de las secuencias y la determinación de la identidad porcentual entre las dos secuencias se puede lograr utilizando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para comparación de las secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873. Tal algoritmo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. Las búsquedas del nucleótido BLAST se pueden desarrollar con el programa NBLAST calificación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener los homólogos de las secuencias de nucleótido a las moléculas de ácido nucleico de la invención. Las búsquedas de proteína BLAST se pueden desarrollar con el programa XBLAST, calificación = 50, longitud de palabra = 3
para obtener los homólogos de las secuencias de aminoácido a las moléculas de proteína de la invención. Para obtener los alineamientos espaciados para propósitos de comparación, el BLAST espaciado se puede utilizar como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Research 25(17):3389. Cuando se utilizan los programas BLAST y BLAST espaciado, los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST) se pueden utilizar. Ver http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Otro ejemplo preferido, no limitante de un algoritmo utilizado para la comparación de las secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, CABIOS (1989). Tal algoritmo se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0 o 2.OU) que es parte del paquete de software de alineamiento de secuencia GCG. Cuando se utiliza el programa ALING para comparar las secuencias de aminoácido, se utiliza una tabla de residuo de peso PAM120, una pena de longitud de espacio de 12, y una pena de espacio de 4.

Como otro ejemplo, el programa de alineamiento en el programa Geneworks (por Oxford Molecular; por ejemplo, versión 2.5.1) se puede utilizar con los parámetros establecidos como sigue: creación de espacio = 16, pena de extensión = 4, matriz de calificación = fastadna.cmp, y un factor PAM de constante.

Otro ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para el alineamiento de las secuencias de proteína es el algoritmo Lipman-Pearson (Lipman y Pearson (1985) Science 227:1435). Cuando se utiliza el algoritmo Lipman-Pearson, se puede utilizar una tabla de residuo de peso PAM250, una pena de longitud de espacio de 12, y una pena de espacio de 4 y un Kutple de 2. Un ejemplo preferido, no limitante de un algoritmo matemático utilizado para el alineamiento de las secuencias de ácido nucleico es el algoritmo Wilbur-Lipman (Wilbur y Lipman (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726). Cuando se utiliza el algoritmo Wilbur-Lipman, una ventana de 20, una pena de espacio de 3, Ktuple de 3 se pueden utilizar. Tanto el algoritmo Lipman-Pearson como el algoritmo Wilbur-Lipman se incorporan, por ejemplo, en el programa MegAlign (por ejemplo, versión 3.1.7) que es parte del paquete de software de análisis de secuencia DNASTAR.

Los algoritmos adicionales para el análisis de secuencia son conocidos en la técnica, e incluyen ADVANCE y ADAM., descritos en Torelli y Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci. 10:3; y FASTA, descrito en Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444.

En una modalidad preferida, la identidad porcentual entre dos secuencias de aminoácido se determina utilizando el programa GAP en el paquete de software GCG, utilizando la matriz Blosum 62 o una matriz PAM250, y un peso de espacio de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6. En aún otra modalidad preferida, la identidad porcentual entre dos secuencias de nucleótido se determina utilizando el programa GAP en el paquete de software GCG, utilizando un NWSgapdna. La matriz CMP y el peso de espacio de 40, 50, 60, 70, u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6.

Los alineamientos de proteína también se pueden hacer utilizando un programa de alineamiento de proteína global de Geneworks (por ejemplo, versión 2.5.1) con el costo del ajuste de espacio abierto en 5, el costo del ajuste de espacio alargado en 5, la longitud diagonal mínima ajustada a 4, el descentrado diagonal máximo ajustado a 130, el corte de consenso ajustado al 50% y utilizando la matriz Pam 250.

Las secuencias de ácido nucleico y de proteína de la presente invención se pueden utilizar además como una "secuencia consulta" para desarrollar una búsqueda contra las bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar otros miembros de la familia o las secuencias relacionadas. Tales búsquedas se pueden desarrollar utilizando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Las búsquedas del nucleótido BLAST se pueden desarrollar con el programa NBLAST, calificación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener las secuencias de nucleótido homólogas a las moléculas de ácido nucleico GL50 de la invención. Las búsquedas de proteína BLAST se pueden desarrollar con el programa XBLAST, calificación = 50, longitud de palabra = 3
para obtener las secuencias de aminoácido homólogas a las moléculas del polipéptido GL50 de la invención. Para obtener los alineamientos espaciados para propósitos de comparación, se puede utilizar el BLAST Espaciado como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y BLAST Espaciado, los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST) se pueden utilizar. Por ejemplo, las secuencias de nucleótido de la invención se pueden analizar utilizando la matriz Blastn por defecto 1-3 con penas de espacio ajustadas en: existencia 11 y extensión 1. Las secuencias de aminoácido de la invención se pueden analizar utilizando las configuraciones por defecto: la matriz Blosum62 con penas de espacio ajustadas en existencia 11 y en extensión 1. Ver http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

La presencia de las regiones carboxilo divergentes sobre los clones RACE ilustrados por los alineamientos de secuencia sugieren que las funciones de señalización alternativa se puedan desarrollar por medio de estas moléculas diferentes por las tirosinas adicionales en el dominio intracelular de estas moléculas. A la fecha, solamente se han desarrollado estudios esporádicos para determinar la señalización intracelular para el B7-1 o el B7-2. Sobre la base de la presencia de tirosinas de dominio citoplasmático sobre las secuencias GL50, uno puede predecir que tales eventos de señalización existen. La inspección de los dominios citoplasmáticos de ratón y humano y el B7-1 y B7-2 muestran una similitud despreciable y también se ha sugerido que el dominio citoplasmático B7 pueda ser completamente dispensable, con base en la capacidad reportada de las moléculas B7 a funcionar en las construcciones ancladas a gpi a las que les falta completamente las secuencias citoplasmáticas. De acuerdo con esto, en un modalidad, los residuos de tirosina en el dominio intracelular de una molécula de tirosina GL50 se pueden alterar para modular la señalización intracelular por vía de un polipéptido GL50.

La invención también suministra proteínas quiméricas o de fusión GL50. Como se utiliza aquí, una "proteína quimérica" GL50 o una "proteína de fusión" comprende un polipéptido GL50 operativamente ligado a un polipéptido no GL50. Un "polipéptido GL50" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que corresponde al polipéptido GL50, mientras que un "polipéptido no GL50" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que corresponde a un proteína que no es sustancialmente homóloga al polipéptido GL50, por ejemplo, una proteína que es diferente del polipéptido GL50 y que se deriva de un organismo igual o diferente. Dentro de la proteína de fusión GL50 el polipéptido GL50 puede corresponder a todo o a una porción de un polipéptido GL50. En una modalidad preferida, una proteína de fusión GL50 comprende por lo menos una porción biológicamente activa de un polipéptido GL50, por ejemplo un dominio extracelular de un polipéptido GL50. Dentro de la proteína de fusión, el término "operativamente ligado" pretende indicar que el polipéptido GL50 y el polipéptido no GL50 se fusionan en la estructura uno con el otro. El polipéptido no GL50 se puede fusionar al N-terminal o C-terminal del polipéptido GL50.

Por ejemplo, en una modalidad, la proteína de fusión es una proteína de fusión del miembro GST-GL50 en el cual las secuencias del miembro GL50 se fusionan al C-terminal de las secuencias GST. En otra modalidad, la proteína de fusión es una proteína de fusión del miembro GL50-HA en la cual la secuencia de nucleótido del miembro GL50 se inserta en un vector tal como el vector pCEP4-HA (Herrscher, R. F. et al. (1995) Genes Dev. 9:3067-3082) de tal forma que las secuencias del miembro GL50 se fusionan en estructura a una etiqueta de epítopo de hemaglutinina de influenza. Tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de un miembro GL50 recombinante o se pueden utilizar cuando se desea una molécula que no se une a un receptor Fc.

Una proteína de fusión GL50 se puede producir mediante la expresión recombinante de una secuencia de nucleótido que codifica un primer péptido que tienen actividad GL50 y una secuencia de nucleótido que codifica un segundo péptido que corresponde a un porción que altera la solubilidad, afinidad, estabilidad o valencia del primer péptido, por ejemplo, una región constante de inmunoglobulina. Preferiblemente, el primer péptido consiste de una porción de un polipéptido GL50 (por ejemplo, una porción de residuos de aminoácido de la secuencias mostrada en la SEQ ID NO:4, o 6 que es suficiente para coestimular las células T activadas. El segundo péptido puede incluir una región constante de inmunoglobulina, por ejemplo, un dominio C\gamma1 humano o un dominio C\gamma4 (por ejemplo, las regiones CH2 y CH3 de pivoteo del IgC\gamma1 humano, o el IgC\gamma4 humano, ver por ejemplo, Capon et al. patente US 5,116,964, 5,580,756, 5,844,095 y similares, incorporadas aquí como referencia).

Las proteínas de fusión Ig GL50 particularmente preferidas incluyen la porción de dominio extracelular o dominio similar a región variable de un hGL50 acoplado a una región constante de inmunoglobulina. La región constante de inmunoglobulina puede contener modificaciones genéticas que reducen o eliminan la actividad efectuadora inherente en la estructura de inmunoglobulina. Por ejemplo, el ADN que codifica la porción extracelular de un polipéptido GL50 se puede unir al ADN que codifica las regiones CH2 y CH3 pivotantes del IgC\gamma1 y/o IgC\gamma4 humanos modificados mediante mutagénesis dirigida de sitio, por ejemplo, como se enseña en la WO 97/28267.

Las secuencias de nucleótido y aminoácido de las construcciones GL50 e ICOS solubles de ejemplo se presentan en las Figuras 26-29. La Figura 26 establece tanto el ácido nucleico de la proteína de fusión ICOS humana de ejemplo como la secuencia de aminoácido, la Figura 27 establece una secuencia de ácido nucleico y aminoácido de la proteína de fusión ICOS de murino de ejemplo, la Figura 28 establece una secuencia de aminoácido y ácido nucleico de proteína de fusión GL50 humana de ejemplo, y la Figura 29 establece una secuencia de ácido nucleico y aminoácido de proteína de fusión GL50 de murino de ejemplo.

Como proteína de fusión GL50 Ig resultante puede tener solubilidad alterada, afinidad de unión, estabilidad y/o valencia (es decir, el número de sitios de unión disponibles por molécula) y puede incrementar la eficiencia de la purificación de la proteína. Las proteínas de fusión y los péptidos producidos mediante técnicas recombinantes se puede secretar y aislar de una mezcla de células y medios que contienen la proteína o el péptido. Alternativamente, la proteína o el péptido se pueden retener citoplasmáticamente y las células cosechar, lisar y asilar la proteína. Un cultivo de célula típicamente incluye las células huéspedes, medios y otros subproductos. Los medios adecuados para el cultivo de célula son bien conocidos en la técnica. La proteína y los péptidos se pueden aislar de los medios de cultivo de célula, las células huéspedes, o ambos utilizando técnicas conocidas en el arte para purificar las proteínas y los péptidos. Las técnicas para transfectar células huéspedes y purificar proteínas y péptidos son bien conocidas en el arte.

Preferiblemente, una proteína de fusión GL50 de la invención se produce mediante técnicas de ADN recombinante estándar. Por ejemplo, los fragmentos de ADN codificantes para las diferentes secuencias de polipéptido están ligadas juntas en estructura de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo empleando terminales acabados truncados o extremo titubeante para ligación, digestión de enzima de restricción para suministrar los terminales apropiados, llenado de extremos cohesivos según sea apropiado, tratamiento de fosfatasa alcalina para evitar la unión indeseable, y ligación enzimática. En otra modalidad, el gen de fusión se puede sintetizar mediante técnicas convencionales que incluyen sintetizadores de ADN automatizados. De manera alternativa, la amplificación PCR de los fragmentos de gen se puede llevar a cabo utilizando iniciadores de anclaje que pueden dar origen a salientes complementarias entre dos fragmentos de genes consecutivos que pueden ser subsecuentemente hibridizados y reamplificados para generar una secuencia de gen quimérica (ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. eds. John Wiley & Sons: 1992). Más aún, muchos vectores de expresión que ya están comercialmente disponibles codifican una porción de fusión (por ejemplo, un polipéptido GST o una etiqueta de epítopo HA). Un ácido nucleico codificante GL50 se puede clonar en tal vector de expresión de tal forma que la porción de fusión esté ligada en estructura al polipéptido GL50.

En otra modalidad, la proteína de fusión es un polipéptido GL50 que contiene una secuencia de señal heteróloga en su terminal N. En ciertas células huéspedes (por ejemplo, células huéspedes de mamífero), la expresión y/o secreción del GL50 se puede incrementar a través del uso de una secuencia de señal heteróloga.

Las proteínas de fusión GL50 de la invención se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas y administrar a un sujeto in vivo. El uso de las proteínas de fusión GL50 puede ser útil terapéuticamente para el tratamiento de afecciones inmunológicas, por ejemplo, enfermedades auto-inmunes o en el caso de transplante. Más aún, las proteínas de fusión GL50 de la invención se pueden utilizar como inmunógenos para producir los anticuerpos anti-GL50 en un sujeto, para purificar los ligandos GL50 y en la selección de ensayos para identificar moléculas que inhiban la interacción del GL50 con un ligando GL50.

La presente invención también pertenece a variantes de los polipéptidos GL50 que funcionan como los agonistas GL50 (semejantes) o como antagonistas GL50. Las variantes de los polipéptidos GL50 se pueden generar mediante mutagénesis, por ejemplo, una mutación de punto discreto o truncamiento de un polipéptido GL50. Un agonista de los polipéptidos GL50 puede retener sustancialmente al mismo, o un subconjunto, de las actividades biológicas de la forma de ocurrencia natural de un polipéptido GL50. Un antagonista de un polipéptido GL50 puede inhibir una o más de las actividades de la forma de ocurrencia natural del polipéptido GL50 al, por ejemplo, modular competitivamente una actividad celular de un polipéptido GL50. Así, los efectos biológicos específicos se pueden elicitar mediante el tratamiento con una variante de función limitada. En una modalidad, el tratamiento de un sujeto con una variante que tiene un subconjunto de actividades biológicas de la forma de ocurrencia natural de la proteína tiene más pocos efectos colaterales en un sujeto en relación con el tratamiento con la forma de ocurrencia natural del polipéptido GL50.

En una modalidad, las variantes de un polipéptido GL50 que funcionan como agonistas GL50 (semejantes) o como antagonistas GL50 se pueden identificar al seleccionar librerías combinatoriales de mutantes, por ejemplo mutantes de truncamiento, de un polipéptido GL50 para el agonista del polipéptido GL50 o la actividad antagonista. En una modalidad, una librería variada de variantes GL50 se genera mediante mutagénesis combinatorial al nivel del ácido nucleico y es codificada por una librería de gen variada. Una librería variada de variantes GL50 se puede producir al, por ejemplo, ligar enzimáticamente una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en las secuencias de gen de tal forma que un conjunto degenerado de secuencias GL50 potenciales es expresable como polipéptido individuales, o alternativamente, como un conjunto de proteínas de fusión mayor (por ejemplo, para despliegue de fago) que contiene el conjunto de secuencias GL50 allí. Existe una variedad de métodos que se pueden utilizar para producir las librerías de las variantes GL50 potenciales de una secuencia de oligonucleótido degenerada. La síntesis química de una secuencia de gen degenerada se puede desarrollar en un sintetizador de ADN automático, y el gen sintético luego ligado a un vector de expresión apropiado. El uso de un conjunto degenerado de genes permite el suministro, en una mezcla, de todas las secuencias que codifican el conjunto deseado de secuencias GL50 potenciales. Los métodos para sintetizar oligonuncleótidos de degeneración son conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Narang, S. A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198: 1056; lke et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:477.

Además, las librerías de fragmentos de una secuencia codificadora de polipéptido GL50 se puede utilizar para generar una población variada de fragmentos GL50 para el clivado y la posterior selección de las variantes de un polipéptido GL50. En una modalidad, una librería de fragmentos de secuencia codificante se puede generar al tratar un fragmento PCR de cadena doble de una secuencia codificante GL50 con una nucleasa bajo condiciones en donde el corte ocurre solamente aproximadamente una vez por molécula, desnaturalizando el ADN de cadena doble, renaturalizando el ADN para formar un ADN de cadena doble que puede incluir pares con sentido/contrasentido provenientes de diferentes productos cortados, removiendo las porciones de cadena simple de los dúplex reformados mediante el tratamiento con nucleasa S1, y ligando la librería de fragmento resultante en un vector de expresión. Mediante este método, una librería de expresión se puede derivar que codifica el N-terminal, C-terminal y los fragmentos internos de varios tamaños del polipéptido GL50.

Son conocidas varias técnicas en el arte para clivar productos de gen de librerías combinatorias hechas mediante mutaciones o truncamiento de punto, y para clivar librerías de cADN para productos de gen que tienen una propiedad seleccionada. Tales técnicas son adaptables para el clivado rápido de las librerías de gen generadas mediante la mutagénesis combinatorial de los polipéptidos GL50. Las técnicas más ampliamente utilizadas, que son susceptibles de análisis completo, para clivar librerías de genes grandes que típicamente incluyen clonar la librería de gen en vectores de expresión replicables, transformando las células apropiadas con las librerías resultantes de vectores, y expresando los genes combinatoriales bajo condiciones en las cuales la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se detectó. La mutagénesis de ensamble recursivo (REM), una nueva técnica que mejora la frecuencia de los mutantes funcionales en las librerías, se puede utilizar en combinación con los ensayos de clivado para identificar las variantes GL50 (Arkin y Youvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delagrave et al. (1993) Protein Eng. 6(3):327-331.

En una modalidad, los ensayos basados en célula se pueden explotar para analizar una librería GL50 variada. Por ejemplo, una librería de vectores de expresión se puede transfectar en una línea celular que sintetiza y secreta habitualmente GL50. las células transfectadas son luego cultivadas de tal forma que el GL50 y el GL50 mutante particular se secretan y el efecto de la expresión del mutante sobre la actividad del GL50 en los sobrenadantes de la célula se puede detectar, por ejemplo, mediante cualquiera de un número de ensayos enzimáticos. El ADN de plásmido se puede entonces recuperar de las células que califican para inhibición, o alternativamente, potenciación de actividad de GL50, y los clones individuales caracterizados adicionalmente.

Además de los polipéptidos GL50 que consisten solamente de aminoácido de ocurrencia natural, los peptidomiméticos GL50 también se suministran. Los análogos de péptido son comúnmente utilizados en la industria farmacéutica como drogas no péptido con propiedades análogas a aquellas del péptido molde. Estos tipos de compuesto no péptido se denominan "miméticos de péptido" o "peptidomiméticos" (Fauchere, J. (1986) Adv. Drug Res. 15:29; Veber y Freidinger (1985) TINS p.392; y Evans et al. (1987) J. Med. Chem. 30:1229; que se incorporan aquí como referencia) y son usualmente desarrollados con la ayuda de modelamiento molecular computarizado. Los miméticos de péptido que son estructuralmente similares a los péptidos terapéuticamente útiles se pueden utilizar para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. En general, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una actividad biológica o farmacológica), tal como el GL50 humano, pero tienen uno o más enlaces de péptido opcionalmente reemplazados por un enlace seleccionado del grupo que consiste de: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (cis y trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2-, y -CH2SO-, mediante métodos conocidos en la técnica y descritos además en las siguientes referencias: Spatola, A. F. en "Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins" Weinstein, B., ed., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983); Spatola, A. F., Vega Data (marzo 1983), Vol. 1, publicación 3, "Peptide Backbone Modifications" (resumen general); Morley, J. S. (1980) Trends Pharm. Sci. pp. 463-468 (resumen general); Hudson, D. et al. (1979) Int. J. Pept. Prot. Res. 14:177-185 (-CH2NH-, -CH2CH2-); Spatola, A. F. et al. (1986) Life Sci. 38:1243-1249 (-CH2-S); Hann, M. M. (1982) J. Chem. Soc. Perkin Trans. I. 307-314 (-CH-CH-, cis y trans); Almquist, R. G. et al. (190) J. Med. Chem. 23:1392-1398 (-COCH2-); Jennings-White, C. et al. (1982) Tetrahedron Lett. 23:2533 (-COCH2-); Szelke, M. et al. European Appln. EP 45665 (1982) CA: 97:39405 (1982)(-CH(OH)CH2-); Holladay, M. W. et al. (1983) Tetrahedron Lett. (1983) 24:4401-4404 (-C(OH)CH2-); y Hruby, V. J. (1982) Life Sci. (1982) 31:189-199 (-CH2-S-); cada uno de los cuales se incorpora aquí como referencia. Un enlace no péptido particularmente preferido es -CH2NH-. Tales miméticos de péptido pueden tener ventajas significativas sobre las modalidades de polipéptido, que incluyen, por ejemplo: producción más económica, mayor estabilidad química, propiedades farmacológicas mejoradas (vida media, absorción, potencia, eficacia, etc.), especificidad alterada (por ejemplo, un amplio espectro de actividades biológicas), antigenicidad reducida, y otros. La marcación de los peptidomiméticos usualmente involucra la unión covalente de uno o más marcadores, directamente a través de un espaciador (por ejemplo, un grupo amida) a posición(s) no interfirientes sobre el peptidomimético que son predichas mediante datos de actividad de estructura cuantitativa y/o modelamiento molecular. Tales posiciones no interfirientes, generalmente son posiciones que no forman contactos directos con las macromoléculas a las cuales se une el peptidomimético para producir el efecto terapéutico. La derivación (por ejemplo, marcación) de peptidomiméticos no deben interferir sustancialmente con la actividad biológica o farmacológica deseada del peptidomimético.

La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia de aminoácido GL50 con el D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) se puede utilizar para generar más péptidos estables. Además, los péptidos constreñidos que comprenden una secuencia de aminoácido GL50 o una variación de secuencia sustancialmente idéntica se puede generar mediante los métodos conocidos en la técnica (Rizo y Gierasch (1992) Annu. Rev. Biochem. 61:387, incorporado aquí como referencia); por ejemplo, al agregar residuos de cisteína internos capaces de formar puentes de disulfuro intramoleculares que ciclizen el péptido.

Las secuencias de aminoácido de los polipéptidos GL50 identificados aquí le posibilitarán a aquellos expertos en la técnica producir polipéptidos que corresponden a las secuencias de péptido GL50 y las variantes de secuencia de éstas. Tales polipéptidos se pueden producir en células huéspedes procarióticas o eucarióticas mediante la expresión de polinucleótidos que codifican una secuencia de péptido GL50, la frecuencia como parte de un polipéptido mayor. Alternativamente, tales péptidos se pueden sintetizar mediante métodos químicos. Los métodos para la expresión de las proteínas heterólogas en los huéspedes recombinantes, la síntesis química de los polipéptidos, y la traducción in vitro son bien conocidos en la técnica y se describen además en Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 2da Ed., Cold Spring Harbor, N.Y.; Berger y Kimmel, Methods in Enzymology, Volumen 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press. Inc., San Diego, Calif.; Merrifield, J. (1969) J. Am. Chem. Soc. 91:501; Chaiken I. M. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. 11:255; Kaiser et al. (1989) Science 243:187; Merrifield, B. (1986) Science 232: 342; Kent, S.B.H. (1988) Annu. Rev. Biochem. 57:957; y Offord, R.E. (1980) Semisynthetic Proteins, Wiley Publishing, que se incorporan aquí como referencia).

Los péptidos se pueden producir, típicamente mediante síntesis química directa, y utilizar por ejemplo, como agonistas o antagonistas de una interacción del ligando GL50/GL50. Los péptidos se pueden producir como péptidos modificados, con porciones no péptido unidas mediante enlace covalente al N-terminal y/o del C-terminal. En ciertas modalidades preferidas, el carboxi terminal o el amino terminal, o ambos, son químicamente modificados. Las modificación más comunes de los grupos amino y carboxilo terminal son la acetilación y la amidación, respectivamente. Las modificaciones del amino terminal tales como la acilación (por ejemplo, acetilación) o alquilación (por ejemplo, metilación) y las modificaciones de carboxi terminal tales como la amidación, así como también otras modificaciones terminales, que incluyen la ciclización, se pueden incorporar en varias modalidades de la invención. Ciertas modificaciones amino terminales y/o carboxi terminales y/o extensiones de péptido a la secuencia núcleo pueden suministrar ventajas físicas, químicas, bioquímicas, y propiedades farmacológicas, tales como: estabilidad mejorada, potencia incrementada y/o eficacia, resistencia a las seroproteasas, propiedades farmacocinéticas deseadas, y otras. Los péptidos se pueden utilizar terapéuticamente para tratar enfermedad, por ejemplo, al alterar la coestimulación en un paciente.

Un polipéptido GL50 aislado, o una porción o fragmento de éste, se puede utilizar como un inmunógeno para generar anticuerpos que se unen a GL50 utilizando técnicas estándar de preparación de anticuerpo policlonal y monoclonal. Un polipéptido GL50 de longitud completa se puede utilizar o, alternativamente, la invención suministra fragmentos de péptido antigénico de GL50 para uso como inmunógenos. El péptido antigénico del GL50 comprende por lo menos 8 residuos de aminoácido y comprende un epítopo de GL50 de tal forma que un anticuerpo generado contra el péptido forma un complejo inmune específico con GL50. Preferiblemente, el péptido antigénico comprende por lo menos 10 residuos de aminoácido, más preferiblemente por lo menos 15 residuos de aminoácido, aún más preferiblemente por lo menos 20 residuos de aminoácido, y más preferiblemente por lo menos 30 residuos de aminoácido.

Alternativamente, un fragmento de péptido antigénico de un polipéptido GL50 se puede utilizar como inmunógeno. Un fragmento de péptido antigénico del polipéptido GL50 comprende típicamente por lo menos 8 residuos de aminoácido de la secuencia de aminoácido mostrada en la SEQ ID NO:4, o 6 y comprende un epítopo de un polipéptido GL50 de tal forma que un anticuerpo generado contra el péptido forma un complejo inmune con una molécula GL50. Los epítopos preferidos comprendidos por el péptido antigénico son regiones del GL50 que están localizadas sobre la superficie de la proteína, por ejemplo, regiones hidrofílicas. En una modalidad, un anticuerpo se une sustancialmente de manera específica a una molécula GL50. En otra modalidad, un anticuerpo se une específicamente a un polipéptido GL50.

Preferiblemente, el péptido antigénico comprende por lo menos aproximadamente 10 residuos de aminoácido, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 15 residuos de aminoácido, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 20 residuos de aminoácido, y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 30 residuos de aminoácido. Los epítopos preferidos comprendidos por el péptido antigénico son regiones de un polipéptido GL50 que está localizados sobre la superficie de la proteína, por ejemplo, regiones hidrofílicas, y que son únicas a un polipéptido GL50. En una modalidad tales epítopos pueden ser específicos para unos polipéptidos GL50 de unas especies, tal como de ratón o humano (es decir, un péptido antigénico que cubre una región de un polipéptido GL50 que no es conservada a través de especies se utiliza como inmunógeno; tales residuos no conservados se pueden determinar utilizando un alineamiento tal como aquel suministrado aquí). Un análisis de hidrofobicidad estándar del polipéptido GL50 se puede desarrollar para identificar las regiones hidrofílicas.

Un inmunógeno GL50 típicamente se utiliza para preparar anticuerpos al inmunizar un sujeto adecuado (por ejemplo, conejo, cabra, ratón u otro mamífero) con el inmunógeno. Una preparación inmunogénica apropiada puede contener, por ejemplo, un polipéptido GL50 recombinantemente expresado o un péptido GL50 químicamente sintetizado. La preparación puede además incluir un adyuvante, tal como un adyuvante completo o incompleto de Freund, o un agente inmunoestimulador similar. La inmunización de un sujeto adecuado con una preparación GL50 inmunogénico induce una respuesta de anticuerpo anti-GL50 policlonal.

De acuerdo con esto, otro aspecto de la invención pertenece a los anticuerpos anti-GL50. Los anticuerpos anti-GL50 policlonales se pueden preparar como se describió anteriormente al inmunizar un sujeto adecuado con un inmunógeno GL50. El título del anticuerpo anti-GL50 en el sujeto inmunizado se puede monitorear durante el tiempo mediante técnicas estándar, tal como con un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) utilizando un polipéptido GL50 inmovilizado. Si se desea, las moléculas de anticuerpo dirigidas contra el polipéptido GL50 se pueden aislar del mamífero (por ejemplo, de la sangre) y además purificar mediante técnicas bien conocidas, tal como cromatografía de proteína A para obtener la fracción del IgG. En un tiempo apropiado después de la inmunización, por ejemplo, cuando los títulos del anticuerpo anti- GL50 son más altos, las células que producen el anticuerpo se pueden obtener del sujeto y utilizar para preparar los anticuerpos monoclonales mediante técnicas estándar, tal como la técnica de hibridoma originalmente descrita por Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495-497 (ver también, Brown et al. (1981) J. Immunol. 127:539-46; Brown et al. (1980) J. Biol. Chem. 255:4980-83; Yeh et al. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:2927-31; y Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29:269-75), la más reciente técnica de hidridoma de célula B humana (Kozbor et al. (1983) Immunol. Today 4:72), la técnica EBV hibridoma (Cole et al. (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) o técnicas trioma. La tecnología para producir hirbidomas de anticuerpo monoclonal es bien conocida (ver en forma general Kenneth, R. H. in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); Lerner, E. A. (1981) Yale J. Biol. Med. 54:387-402; Gefter, M. L. et al. (1977) Somatic Cell Genet., 3:231-36). En resumen, una línea celular inmortal (típicamente un mieloma) se fusiona a los linfocitos (típicamente esplenocitos) de un mamífero inmunizado con un inmunógeno GL50 como se describió anteriormente, y los sobrenadantes del cultivo de las células de hibridoma resultantes se clivan para identificar un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un polipéptido GL50.

Cualquiera de muchos protocolos bien conocidos utilizados para fusionar linfocitos y líneas celulares inmortalizadas se pueden aplicar para el propósito de generar un anticuerpo monoclonal anti-GL50 (ver, por ejemplo, Galfre, G. et al. (1977) Nature 266:55052; Gefter et al. (1977) supra; Lerner (1981) supra; Kenneth, Monoclonal Antibodies, supra). Más aún, el trabajador experto apreciará que existen muchas variaciones de tales métodos que también serían útiles. Típicamente, la línea celular inmortal (por ejemplo, una línea celular de mieloma) se deriva de las mismas especies de mamífero que los linfocitos. Por ejemplo, los hibridomas de murino se pueden hacer al fusionar linfocitos de un ratón inmunizado con una preparación inmunogénica de la presente invención con una línea celular de ratón inmortalizada. Las líneas celulares inmortales preferidas son las líneas celulares de mieloma de ratón que son sensibles al medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"). Cualquiera de un número de líneas celulares de mieloma se puede utilizar como un compañero de fusión de acuerdo a las técnicas estándar, por ejemplo, las líneas de mieloma P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 o Sp2/O-Ag14. Estas líneas de mieloma están disponibles del American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Md. Típicamente, las células de mieloma de ratón sensibles a HAT se fusionan a los esplenocitos de ratón utilizando polietilen glicol ("PEG"). Las células de hibridoma que resultan de la fusión son entonces seleccionadas utilizando un medio HAT, que mata las células de mieloma no fusionadas y fusionadas improductivamente (muerte de espelnocitos no fusionados después de varios días en razón a que ellos no son transformados). Las células de hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal de la invención se detectan al clivar los sobrenadantes de cultivo de hibridoma para los anticuerpos que se unen a la molécula GL50, por ejemplo, utilizando un ensayo ELISA estándar.

Como una alternativa para preparar hibridomas que secretan anticuerpo monoclonal, un anticuerpo anti-GL50 monoclonal se puede identificar y aislar al clivar una librería de inmunoglobulina combinatoria recombinante (por ejemplo, una librería de despliegue de fago de anticuerpo) con un GL50 y de esta manera aislar los miembros de la librería de inmunoglobulina que se unen a un polipéptido GL50. Los kits para generar y clivar las librerías de despliegue de fago están comercialmente disponibles (por ejemplo, the Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catálogo No. 27-9400-01; and the Stratagene SurfZAP^{TM} Phage Display Kit, Catálogo No. 240612). Adicionalmente, los ejemplos de métodos y reactivos particularmente susceptibles para uso en generar y seleccionar librería de despliegue de anticuerpo se puede encontrar en, por ejemplo, Ladner et al. Patente U.S. No. 5,223,409; Kang et al. Publicación Internacional No. WO 92/18619; Dower et al. Publicación Internacional No. WO 91/17271; Winter et al. Publicación Internacional No. WO 92/20791; Markland et al. Publicación Internacional No. WO 92/15679; Breitling et al. Publicación Internacional No. WO 93/01288; McCafferty et al. Publicación Internacional No. WO 92/01047; Garrard et al. Publicación Internacional No. WO 92/09690; Ladner et al. Publicación Internacional No. WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Biotechnology (NY) 9:1369-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clarkson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580; Garrard et al. (1991) Biotechnology (NY) 9:1373-1377; Hoogen-boom et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4133-4137; Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982; y McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554.

Adicionalmente, los anticuerpos anti-GL50 recombinantes, tales como los anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que comprenden tanto las porciones humanas como no humanas, que se pueden hacer utilizando técnicas de ADN recombinante estándar, están dentro del alcance de la invención. Tales anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados se pueden producir mediante técnicas de ADN recombinante conocidas en el arte, por ejemplo utilizando los métodos descritos en Robinson et al. Publicación de Patente Internacional PCT/US86/02269; Akira et al. Solicitud de Patente Europea 184, 187; Taniguchi, M. Solicitud de Patente Europea 171,496; Morrison et al. Solicitud de Patente Europea 173,494; Neuberger et al. Solicitud PCT WO 86/01533; Cabilly et al. Patente U.S. No. 4,816,567; Cabilly et al. Solicitud de Patente Europea 125,023; Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Cancer Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; y Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison, S. L. (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) Biotechniques 4:214; Winter Patente U.S. No. 5,225,539; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; y Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060.

Además, los anticuerpos humanizados se pueden hacer de acuerdo a los protocolos estándar tales como aquellos descritos en la Patente US 5,565,332. En otra modalidad, las cadenas de anticuerpo o los miembros pares de unión específicos se pueden producir mediante la recombinación entre los vectores que comprenden las moléculas de ácido nucleico que codifican una fusión de una cadena de polipéptido de un miembro par de unión específico y un componente de un paquete de despliegue genéico replicable y los vectores que contienen moléculas de ácido nucleico que codifican una segunda cadena de polipéptido de un miembro par de unión simple utilizando técnicas conocidas en el arte, por ejemplo, como se describe en las patentes US 5,565,332, 5,871,907, o 5,733,743. El uso de los anticuerpos intracelulares para inhibir la proteína funcionan en una célula es también conocido en la técnica (ver, por ejemplo, Carlson, J. R. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:2638-2646; Biocca, S. et al. (1990) EMBO J. 9:101-108; Werge, T. M. et al. (1990) FEBS Lett. 274:193-198; Carlson, J. R. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7427-7428; Marasco, W. A. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-7893; Biocca, S. et al. (1994) Biotechnology (NY) 12:396-399; Chen, S-Y. et al. (1994) Hum. Gene Ther. 5:595-601; Duan, L et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5075-5079; Chen, S-Y. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5932-5936; Beerli, R. R. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:23931-23936; Beerli, R. R. et al. (1994) Biochem. Biophys. Res. Commun. 204:666-672; Mhashilkar, A. M. et al. (1995) EMBO J. 14:1542-1551; Richardson, J. H. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3137-3141; Publicación PCT No. WO 94/02610 de Marasco et al.; y Publicación PCT No. WO 95/03832 de Duan et al.).

En una modalidad, un anticuerpo para uso en la presente invención es un anticuerpo bioespecífico. Un anticuerpo bioespecífico tiene sitios de unión para dos diferentes antígenos dentro de una molécula de anticuerpo simple. La unión de antígeno puede ser simultánea o secuencial. Los triomas y los hibridomas híbridos son dos ejemplos de líneas celulares que pueden secretar anticuerpos bioespecíficos. Ejemplos de anticuerpos bioespecíficos producidos mediante un hibridoma híbrido o un trioma se describen en la Pat. U.S. 4,474,893. Los anticuerpos bioespecíficos se han construido por medios químicos (Staerz et al. (1985) Nature 314:628, y Perez et al. (1985) Nature 316:354) y la tecnología de hibridoma (Staerz y Bevan (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:1453, y Staerz y Bevan (1986) Immunol. Today 7:241). Los anticuerpos bioespecíficos también se describen en la patente U.S. 5,959,084. Los fragmentos de los anticuerpos bioespecíficos se describen en la patente U.S. 5,798,229.

Los agentes biespecíficos también se pueden generar al elaborar heterohibridomas al fusionar hibridomas u otras células que hacen diferentes anticuerpos, seguidas por la identificación de clones que producen y co-ensamblan ambos anticuerpos. Ellos también se pueden generar mediante la conjugación química o genética de cadenas o porciones de inmunoglobulina completas de éstas tales como las secuencias Fab y Fv. Por ejemplo, los agentes bioespecíficos que se unen al complejo receptor de célula T, el complejo receptor de célula B, el CD40, el ligando CD40, CD2, o CD45 (además del GL50 o ICOS) se pueden desarrollar.

Un anticuerpo anti-GL50 (por ejemplo, anticuerpo monoclonal) se puede utiliza para aislar un polipéptido GL50 mediante técnicas estándar, tales como cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación. Los anticuerpos anti-GL50 pueden facilitar la purificación de los polipéptidos GL50 naturales provenientes de células y de polipéptidos GL50 recombinantemente producidos expresados en células huéspedes. Más aún, un anticuerpo anti-GL50 se puede utilizar para detectar un polipéptido GL50 (por ejemplo, en un lisado celular o en un sobrenadante celular). Además, los anticuerpos al GL50 se pueden utilizar para bloquear la interacción entre el GL50 y un ligando o compañero de unión. La detección se puede facilitar al acoplar (es decir, ligar físicamente) el anticuerpo a una sustancia detectable. De acuerdo con esto, en una modalidad, un anticuerpo anti-GL50 de la invención se marca con una sustancia detectable. Ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radioactivos. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de cola de caballo, fosfatasa alcalina, \beta-galactosidaza, o acetilcolinesteraza; ejemplos de complejos de grupo prostético adecuado incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferota, fluorescina, isotiocianato de fluorescina, rodamina, diclorotriazinilamina fluorescina, dansil cloruro o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; y ejemplos de material radioactivo adecuado incluye ^{125}I, ^{131}I, ^{35}S, y ^{3}H.

Aún otro aspecto de la invención corresponde a los anticuerpos anti-GL50 que son obtenibles mediante un proceso que comprende:

(a)

inmunizar un animal con un polipéptido GL50 inmunogénico, o una porción inmunogénica de éste única al polipéptido GL50; y

(b)

aislar de los anticuerpos del animal que se une específicamente al polipéptido GL50.

IV. Vectores de Expresión Recombinante y Células Huéspedes

Otro aspecto de la invención pertenece a vectores, preferiblemente vectores de expresión, que contienen un ácido nucleico que codifica una proteína de la familia GL50 (o una porción de ésta). Como se utiliza aquí, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual éste ha estado ligado. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un aro de ADN de cadena doble circular en el cual los segmentos de ADN adicionales se pueden ligar. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde los segmentos de ADN adicionales se pueden ligar en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la cual ellos están introducidos (por ejemplo, vectores bacteriales que tienen un origen bacterial de replicación y vectores mamíferos episomales). Otros vectores (por ejemplo, vectores mamíferos no episomales) se integran en el genoma de una célula huésped luego de la introducción en la célula huésped, y de esta manera se replican a lo largo del genoma huésped. Más aún ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes a los cuales ellos están operativamente ligados. Tales vectores se denominan aquí como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante están a menudo en la forma de plásmidos. En la presente especificación, "plásmido" y "vector" se pueden utilizar intercambiablemente en razón a que el plásmido es la forma de vector más comúnmente utilizada. Sin embargo, la invención pretende incluir tales otras formas de los vectores de expresión, tal como los vectores virales (por ejemplo, la replicación de adenovirus y retrovirus detectables y de los adenovirus asociados), que sirven para funciones equivalentes.

Los vectores de expresión recombinantes de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped, lo que significa que los vectores de expresión recombinante incluye una o más secuencias regulatorias, seleccionadas sobre la base de la célula huésped a ser utilizada para la expresión, que está operativamente ligada a la secuencia de ácido nucleico a ser expresada. Dentro de un vector de expresión recombinante, "operablemente ligado" se pretende significar que la secuencia de nucleótido de interés está ligada a la o las secuencias reguladoras de una manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótido (por ejemplo, en un sistema de trascripción/traducción in vitro o en una célula huésped cuando el vector es introducido dentro de la célula huésped). El término "secuencia regulatoria" pretende incluir promotores, mejoradores y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel (1990) Methods Enzymol. 185:3-7. Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótido en muchos tipos de células huéspedes y aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótido solamente en ciertas células huéspedes (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas de tejido). Se apreciará por aquellos expertos en la técnica que el diseño del vector de expresión puede depender de tales factores como la elección de la célula huésped a ser transformada, el nivel de expresión de la proteína deseada, y similares. Los vectores de expresión de la invención se pueden introducir en las células huéspedes para producir de esta manera las proteínas o los péptidos, incluyendo las proteínas de fusión o los péptidos, codificados por los ácidos nucleicos como se describieron aquí (por ejemplo, las proteínas de la familia GL50, las formas mutantes de los polipéptidos GL50 o porciones de éstas, las proteínas de fusión, y similares).

En una modalidad de la invención, los vectores comprenden solamente un dominio transmembrana o intracelular de una molécula GL50 que puede ser trabajada por ingeniería. Tales construcciones se pueden utilizar para modular la señalización intracelular por vía de moléculas GL50, por ejemplo, y actuar como mutantes negativos dominantes.

Los vectores de expresión recombinante de la invención se pueden diseñar para la expresión de los polipéptidos GL50 en células procarióticas o eucarióticas. Por ejemplo, los polipéptidos GL50 se pueden expresar en células bacterianas tales como E. coli, células de insecto (utilizando vectores de expresión de baculovirus) células de levadura o células de mamífero. Las células huéspedes adecuadas se discuten además en Goeddel (1990) supra. Alternativamente, el vector de expresión recombinante se puede transcribir y traducir in vitro, por ejemplo utilizando secuencias reguladoras promotoras T7 y polimerasa T7.

La expresión de las proteínas en procariotes es más a menudo llevada a cabo en E. coli con vectores que contienen los promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de las proteínas de fusión o no fusión. Los vectores de fusión agregan un número de aminoácidos a la proteína codificada allí, usualmente el terminal amino de la proteína recombinante. Tales vectores de fusión típicamente sirven tres propósitos: 1) incrementar la expresión de la proteína recombinante; 2) incrementar la solubilidad de la proteína recombinante; y 3) ayudar en la purificación de la proteína recombinante al actuar como un ligando en la purificación de afinidad. A menudo, en los vectores de expresión de fusión, un sitio de división proteolítica se introduce en la unión de la porción de fusión y la proteína recombinante para posibilitar la separación de la proteína recombinante proveniente de la porción de fusión posterior a la purificación de la proteína de fusión. Tales enzimas, y sus secuencias de reconocimiento homólogas, incluyen el Factor Xa, trombina y enteroquinasa. Los vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B. y Johnson, K. S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) los cuales se fusionan a glutathione S-transferasa (GST), la proteína de unión de maltosa E, o la proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante objetivo.

Las proteínas de fusión purificadas se pueden utilizar terapéuticamente, en ensayos de actividad GL50, (por ejemplo, ensayos directos o ensayos competitivos descritos en detalle adelante), o generar anticuerpos específicos para los polipéptidos GL50, por ejemplo.

Ejemplos de vectores de expresión de E. coli sin fusión inducibles adecuados incluyen pTrc (Amann et al. (1988) Gene 69:301-315) y pET 11d (Studier et al. (1990) Methods Enzymol. 185:60-89). La expresión del gen objetivo proveniente del vector pTrc confía en la trascripción de polimerasa de ARN huésped proveniente del promotor de fusión trp-lac híbrido. La expresión del gen objetivo proveniente del vector pET 11d confía en la trascripción de un promotor de fusión T7 gn10-lac mediado por una polimerasa de ARN viral coexpresada (T7 gn1). Esta polimerasa viral es suministrada por las cepas huéspedes BL21(DE3) o HMS174(DE3) de un profago residente que se localiza en un gen T7 gn1 bajo control trascripcional del promotor lacUV5.

Una estrategia para maximizar la expresión del polipéptido recombinante en E. coli es expresar el polipéptido en una bacteria huésped con una capacidad afectada de dividir proteolíticamente el polipéptido recombinante (Gottesman, S. (1990) Methods EnzymoL 185:119-128). Otra estrategia es alterar la secuencia de ácido nucleico del ácido nucleico a ser insertado en un vector de expresión de tal forma que los codones individuales para cada aminoácido son aquellos preferencialmente utilizados en E. coli (Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Tal alteración de las secuencias de ácido nucleico de la invención se pueden llevar a cabo mediante técnicas estándar de síntesis de ADN.

En otra modalidad, el vector de expresión GL50 es un vector de expresión de levadura. Ejemplos de vectores para expresión en levadura S. cerivisae incluye pYepSec1 (Baldari et al. (1987) EMBO J. 6:229-234), pMFa (Kurjan y Herskowitz (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego CA), y picZ (Invitrogen Corp, San Diego, CA).

De manera alternativa, un polipéptido GL50 se puede expresar en células de insecto utilizando vectores de expresión de baculovirus. Los vectores de baculovirus disponibles para la expresión de polipéptidos en células de insecto cultivadas (por ejemplo, células Sf9) incluye las series pAc (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) y las series pVL (Lucklow, V. A. y Summers, M. D. (1989) Virology 170:31-39).

En aún otra modalidad, una molécula de ácido nucleico de la invención se expresa en células de mamífero que utiliza un vector de expresión de mamífero. Ejemplos de los vectores de expresión de mamífero incluyen pMex-Neol, pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329:840) y pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187-195). Cuando se utilizan células de mamífero, las funciones del control del vector de expresión son a menudo suministradas por elementos reguladores virales. Por ejemplo, los promotores comúnmente utilizados se derivan de polioma, Adenovirus 2, citomegalovirus y Virus de Simio 40. Para otros sistemas de expresión adecuados para tanto células procarióticas como eucarióticas ver capítulos 16 y 17 de Sambrook, J. et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2da ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

En otra modalidad, el vector de expresión de mamífero recombinante es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico preferencialmente en un tipo de célula particular (por ejemplo, elementos reguladores específicos de tejido se utilizan para expresar el ácido nucleico). Los elementos reguladores específicos de tejido son conocidos en la técnica. Ejemplos no limitantes de promotores específicos de tejido adecuado incluyen el promotor de albúmina (específica del hígado; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1:268-277), los promotores específicos linfoides (Calame y Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275), en particular los promotores de los receptores de célula T (Winoto y Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733) y las inmunoglobulinas (Banerji et al. (1983) Cell 33:729-740); Queen y Baltimore (1983) Cell 33:741-748), los promotores específicos de neurona (por ejemplo, el promotor de neurofilamento; Byrne y Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477), los promotores específicos de páncreas (Edlund et al. (1985) Science 230:912-916), y los promotores específicos de glándula mamaria (por ejemplo el promotor de suero de leche; Patente U.S. No. 4,873,316 y la Publicación de Solicitud Europea No. 264,166). Los promotores desarrolladamente regulados también están comprendidos, por ejemplo los promotores hox de murino (Kessel y Gruss (1990) Science 249:374-379) y el promotor de \alpha-fetoproteína (Campes y Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546).

Más aún, los sistemas reguladores inducibles para uso en células de mamífero son conocidos en la técnica, por ejemplo los sistemas en los cuales la expresión del gen es regulada mediante iones de metal pesados (ver, por ejemplo, Mayo et al. (1982) Cell 29:99-108; Brinster et al. (1982) Nature 296:39-42; Searle et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:1480-1489), choque de calor (ver por ejemplo, Nouer et al. (1991) en Heat Shock Response, Nouer, L., ed. CRC, Boca Raton, FL, pp 167-220), hormonas (ver por ejemplo, Lee et al. (1981) Nature 294:228-232; Hynes et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2038-2042; Klock et al. (1987) Nature 329:734-736; Israel y Kaufman (1989) Nucleic Acids Res. 17:2589-2604; y la Publicación PCT No. WO 93/23431), moléculas relacionadas con FK506 (ver por ejemplo, la Publicación PCT No. WO 94/18317) o tetraciclinas (Gossen, M. y Bujard, H. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Gossen, M. et al. (1995) Science 268:1766-1769; la Publicación PCT No. WO 94/29442; y la Publicación PCT No. WO 96/01313). De acuerdo con esto, en otra modalidad, la invención suministra un vector de expresión recombinante en el cual un ADN de GL50 es operativamente ligado a un promotor eucariótico inducible, permitiendo de esta manera la expresión inducible de un polipéptido GL50 en células eucarióticas.

La invención suministra además un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ADN de la invención clonada en el vector de expresión en una orientación contrasentido. Esto es, la molécula de ADN está operativamente ligada a una secuencia regulatoria de manera que permite la expresión (por trascripción de la molécula de ADN) de una molécula de ARN que es contrasentido al mARN del GL50. Las secuencias reguladoras operativamente ligadas a una molécula de ácido nucleico clonada en la orientación contrasentido se pueden escoger las cuales dirigen la expresión continua de una molécula ARN contrasentido en una variedad de tipos de célula, por ejemplo los promotores virales y/o mejoradores, o las secuencias reguladoras se pueden escoger que dirigen la expresión específica tipo constitutiva, especifica de tejido o de célula del ARN contrasentido. El vector de expresión contrasentido puede estar en la forma de un plásmido recombinante, un fagémido o un virus atenuado en el cual los ácidos nucleicos contrasentido se producen bajo el control de una región regulatoria de alta eficiencia, cuya actividad se puede determinar por el tipo de célula en la cual se introduce el vector. Para una discusión de la regulación de la expresión del gen que utiliza los genes contrasentido ver Weintraub, H. et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986.

Otro aspecto de la invención pertenece a las células huéspedes en las cuales un vector de expresión recombinante de la invención se ha introducido. Los términos "célula huésped" y "célula huésped recombinante" se utilizan intercambiablemente aquí. Se entiende que tales términos se refieren no solamente a la célula sujeto particular sino a la progenie o progenie potencial de tal célula. En razón a que pueden ocurrir ciertas modificaciones en las generaciones sucesivas debido a mutación o a influencias ambientales, tales progenies pueden de hecho, no ser idénticas a la célula padre, pero aún están incluidas dentro del alcance del término como se utiliza aquí.

Una célula huésped puede ser cualquier célula procariótica o eucariótica. Por ejemplo, un polipéptido GL50 se puede expresar en células bacterianas tales como E. coli, células de insecto, células de levadura o mamífero (tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS). Otras células huéspedes adecuadas son conocidas por aquellos expertos en la técnica.

El ADN del vector se puede introducir en células procarióticas o eucarióticas por vía de técnicas convencionales de transformación o transfección. Como se utiliza aquí, los términos "transformación" y "transfección" pretenden referirse a una variedad de técnicas en el arte para introducir ácido nucleico extraño (por ejemplo ADN) en una célula huésped, incluyendo coprecipitación de fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, o electroporación. Los métodos adecuados para transformar o transfectar células huéspedes se pueden encontrar en Sambrook, et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2ed, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), y otros manuales de laboratorio.

Para la transfección estable de las células de mamífero, se conoce que, dependiendo del vector de expresión y la técnica de transfección utilizada, solamente una pequeña fracción de las células puede integrar el ADN extraño en el genoma. Con el fin de identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica una marcador seleccionable (por ejemplo resistencia los antibióticos) es generalmente introducido en las células huéspedes junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a la droga, tal como el G418, la higromicina y el metotrexato. El ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable se puede introducir en una célula huésped en el mismo vector que aquella que codifica un polipéptido GL50 o se puede introducir sobre un vector separado. Las células transfectadas establemente con el ácido nucleico introducido se pueden identificar mediante selección de droga (por ejemplo, células que han incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán, aunque otras células mueran).

Una célula huésped de la invención, tal como una célula huésped procariótica o eucariótica en cultivo, se puede utilizar para producir (es decir, expresar) un polipéptido GL50. De acuerdo con esto, la invención suministra además métodos para producir un polipéptido GL50 utilizando las células huéspedes de la invención. En una modalidad, el método comprende cultivar las células huéspedes de la invención (en el cual se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica un polipéptido GL50) en un medio adecuado de tal forma que se produzca un polipéptido GL50. En otra modalidad, el método comprende además aislar un polipéptido GL50 del medio o de las ciertas células huéspedes de la invención también se pueden utilizar para producir animales transgénicos no humanos. Por ejemplo, en una modalidad, una célula huésped de la invención es un oocito fertilizado o una célula madre embriónica dentro de la cual se han introducido las secuencias que codifican GL50. Tales células huéspedes pueden ser entonces utilizadas para crear animales transgénicos no humanos en los cuales las secuencias GL50 exógenas se han introducido en su genoma o animales recombinantes homólogos en los cuales las secuencias GL50 endógenas se han alterado. Tales animales son útiles para estudiar la función y/o actividad de un polipéptido GL50 y para identificar y/o evaluar módulos de actividad GL50. Como se utiliza aquí, un "animal transgénico" es un animal no humano, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un roedor tal como una rata o ratón, en el cual una o más de las células del animal incluyen un transgen. Otros ejemplos de animales transgénicos que incluyen primates no humanos, ovejas, perros, vacas, cabras, pollos, anfibios, y similares. Un transgen es ADN exógeno que se integra en el genoma de una célula de la cual se desarrolló el animal transgénico y que permanece en el genoma del animal maduro, dirigiendo de esta manera la expresión de un producto de gen codificado en uno o más tipos de células o tejidos del animal transgénico. Como se utiliza aquí, un "animal homólogo recombinante" es un animal no humano, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ratón, en el cual el gen GL50 endógeno se ha alterado mediante recombinación homóloga entre el gen endógeno y una molécula de ADN exógena introducida en una célula del animal, por ejemplo, una célula embriónica del animal, antes del desarrollo del animal.

Un animal transgénico de la invención se puede crear al introducir un ácido nucleico que codifica el GL50 en el pronucleo macho de un oocito fertilizado, por ejemplo, mediante microinyección, infección retroviral, y permitiéndole al oocito desarrollarse en un animal padrino hembra pseudopreñado. La secuencia mGL50-1 de la SEQ ID NO:1, 3, o 5 se puede introducir como un transgen en el genoma de un animal no humano. Alternativamente, un homólogo no humano de un gen hGL50, tal como un gen GL50 de ratón o rata, se puede utilizar como un transgen. Alternativamente, un homólogo de gen GL50, tal como otro miembro de la familia GL50, se puede aislar con base en la hibridación a las secuencias de aADN de la familia GL50 de la SEQ ID NO:1, 3 o 5 (descrita además en la subsección I anterior) y utilizada como un transgen. Las secuencias intrónicas y las señales de poliadenilación también se pueden incluir en el transgen para incrementar la eficiencia de expresión del transgen. Una secuencia o secuencias reguladoras específicas de tejido pueden ser ligadas operablemente a un transgen GL50 para dirigir la expresión de un polipéptido GL50 a células particulares. Los métodos para generar los animales transgénicos por vía de manipulación de embrión y microinyección, particularmente animales tales como ratones, se han vuelto convencionales en la técnica y se describe, por ejemplo, en las Patentes U.S. Nos. 4,736,866 y 4,870,009, ambas de Leder et al., la Patente U.S. No. 4,873,191 de Wagner et al. y en Hogan, B., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986). Los métodos similares se utilizan para la producción de otros animales transgénicos. Un animal fundador transgénico se puede identificar con base en la presencia de un transgen GL50 en su genoma y/o expresión del mARN GL50 en tejidos o células de animales. Un animal fundador transgénico se puede entonces utilizar para criar animales adicionales que lleven el transgen. Más aún, los animales transgénicos que llevan un transgen que codifica un polipéptido GL50 pueden ser además criados en otros animales transgénicos que lleven otros
transgenes.

Para crear un animal homólogo recombinante, se prepara un vector que contiene por lo menos una porción de un gen GL50 en el cual se ha introducido una supresión, a adición o sustitución para alterar de esta manera, por ejemplo, irrumpir funcionalmente, el gen GL50. El gen GL50 puede ser un gen humano (por ejemplo, la SEQ ID NO: 1, 3 o 5), pero más preferiblemente, es un homólogo no humano de un gen hGL50 (por ejemplo, un cADN aislado mediante hibridación estricta con la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO:1, 3, o 5). Por ejemplo, un gen GL50 de ratón se puede utilizar para construir un vector de recombinación homólogo adecuado para alterar un gen GL50 endógeno en el genoma de ratón. En una modalidad preferida, el vector se diseña de tal forma que, luego de la recombinación homóloga, el gen GL50 endógeno es funcionalmente afectado (es decir, ya no codifica una proteína funcional; también denominada como un vector "knock out"). Alternativamente, el vector se puede diseñar de tal forma que, luego de la recombinación homóloga, el gen GL50 endógeno se muta o altera de otra manera pero aún codifica una proteína funcional (por ejemplo, una región regulatoria corriente arriba se puede alterar para alterar de esta manera la expresión del polipéptido GL50 endógeno). En un vector de recombinación homólogo, la porción alterada del gen GL50 es flanqueada por sus extremos 5' y 3' mediante una secuencia de ácido nucleico adicional del gen GL50 para permitir que ocurra la recombinación homóloga entre el gen GL50 exógeno llevado por el vector y un gen GL50 endógeno en una célula madre embriónica. La secuencia del ácido nucleico GL50 de flanqueo adicional es de longitud suficiente para la recombinación homóloga exitosa con el gen endógeno. Típicamente, varios kilobases de ADN de flanqueo (tanto en los extremos 5' y 3') se incluyen en el vector (ver por ejemplo, Thomas, K.R. y Capecchi, M. R. (1987) Cell 51:503 para una descripción de los vectores de recombinación homólogos). El vector se introduce en una línea de célula madre embriónica (por ejemplo, mediante electroporación) y las células en las cuales el gen GL50 introducido se ha recombinado homólogamente con el gen GL50 endógeno son seleccionadas (ver por ejemplo, Li, E. et al. (1992) Cell 69:915). Las células seleccionadas son entonces inyectadas en un blastocisto de un animal (por ejemplo, un ratón) para formar quimeras de agregación (ver por ejemplo, Bradley, A. in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987) pp. 113-152). Un embrión quimérico puede ser entonces implantado en un animal padrino hembra pseudopreñado adecuado y el embrión llevado a término. La progenie que habita el ADN homólogamente recombinado en sus células germinales se puede utilizar para criar animales en los cuales todas las células del animal contienen el ADN homólogamente recombinado mediante la transmisión de la línea germinal del transgen. Los métodos para construir vectores de recombinación homólogos y animales recombinantes homólogos se describen además en Bradley, A. (1991) Current Opinion in Biotechnology 2:823-829 y en la Publicación Internacional PCT No. WO 90/11354 de Le Mouellec et al.; WO 91/01140 de Smithies et al.; WO 92/0968 de Zijlstra et al.; y WO 93/04169 de Berns et al.

Además de lo anterior, el experto apreciará que otras aproximaciones conocidas en la técnica de recombinación homóloga se pueden aplicar a la presente invención. Los sistemas de integración específicos de sitio ayudados por enzima son conocidos en la técnica y se pueden aplicar para integrar una molécula de ADN en un sitio predeterminado en una segunda molécula de ADN objetivo. Ejemplos de tales sistemas de integración ayudados por enzima incluyen un sistema objetivo de Cre con recombinasa-lox (por ejemplo, como se describe en Baubonis, W. y Sauer, B. (1993) Nucl. Acids. Res. 21:2025-2029; y Fukushige, S. y Sauer, B. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7905-7909) y el sistema objetivo FRT FLP recombinasa (por ejemplo, como se describe en Dang, D. T. y Perrimon, N. (1992) Dev. Genet. 13:367-375; y Fiering, S. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8469-8473). Los sistemas de recombinación homóloga inducibles regulados por tetraciclina, tales como se describe en la Publicación PCT No. WO 94/29442 y la Publicación PCT No. WO 96/01313, también se puede utilizar.

Por ejemplo, en otra modalidad, los animales no humanos transgénicos se pueden producir que contengan sistemas seleccionados que les permita la expresión regulada del transgen. Un ejemplo de tales sistemas es el sistema de recombinasa cre/loxP de bacteriófago P1. Para la descripción del sistema de recombinasa cre/loxP, ver por ejemplo, Lakso et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236. Otro ejemplo de un sistema de recombinasa es el sistema de recombinasa FLP de Saccharomyces cerevisiae (O'Gorman et al. (1991) Science 251:1351-1355. Si un sistema de recombinasa cre/loxP se utiliza para regular la expresión del transgen, los animales que contienen los transgenes que codifican tanto la recombinasa Cre como la proteína seleccionada se requieren. Tales animales se pueden suministrar a través de la construcción de animales transgénicos "dobles", por ejemplo, al coincidir dos animales transgénicos, uno que contiene un transgen que codifica una proteína seleccionada y el otro que contiene un transgen que codifica un recombinasa.

Los clones de los animales transgénicos no humanos descritos aquí también se pueden producir de acuerdo con los métodos descritos en Wilmut, I. et al. (1997) Nature 385:810-813 y las Publicaciones Internacionales Nos. WO 97/07668 y WO 97/07669. En resumen, una célula, por ejemplo, una célula somática, del animal transgénico se puede aislar e inducir para salir del ciclo de crecimiento e ingresar a la fase G_{o}. La célula quiescente se puede entonces fusionar, por ejemplo, a través del uso de pulsos eléctricos, a un oocito enucleado de un animal de la misma especie del cual se aísla la célula quiescente. El oocito reconstruido es luego cultivado de tal forma que éste desarrolle una mórula o blastocito y luego se transfiera al animal padrino hembra pseudopreñado. El recién nacido de este animal padrino hembra será un clon del animal del cual la célula, por ejemplo, la célula somática, se aisló.

V. Composiciones Farmacéuticas

Los moduladores GL50 ("compuestos activos") de la invención (por ejemplo, agentes GL50 inhibitorios o estimulatorios, que incluyen las moléculas de ácido nucleico GL50, polipéptidos, anticuerpos, o compuestos identificados como moduladores de una actividad GL50) se pueden incorporar en las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración. Tales composiciones típicamente comprenden la molécula de ácido nucleico, el polipéptido, o el anticuerpo y un portador farmacéuticamente aceptable. Como se utiliza aquí el lenguaje "portador farmacéuticamente aceptable" está destinado a incluir cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, isotónicos y agentes retardadores de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de tales medios y agentes para las sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto hasta ahora como cualquier medio convencional o agente que es incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso de éste en las composiciones. Los compuestos activos suplementarios también se pueden incorporar en las composiciones.

Una composición farmacéutica de la invención es formulada para ser compatible con su ruta pretendida de administración. Ejemplos de rutas de administración incluyen administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (tópica), transmucosal, y rectal. Las soluciones o suspensiones utilizadas para aplicación parenteral, intradérmica, o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijados, polietilen glicoles, glicerina, propilenglicol u otros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como benzil alcohol o metil parabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilenodiaminotetraacético; amortiguadores tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral se puede incluir en ampollas, jeringas desechables o frascos de dosis múltiples hechos de vidrio o plástico.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (donde son solubles en agua) o las dispersiones y los polvos estériles para la preparación extemporánea de las soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL^{TM} (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina amortiguada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida en la proporción en que exista una fácil aplicación con jeringa. Ésta debe ser estable bajo las condiciones de elaboración y almacenamiento y se debe preservar contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un solvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilen glicol líquido, y similares) y mezclas adecuadas de éstos. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensoactivos. La prevención de la acción de los microorganismos se puede logar mediante varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede consolidar al incluir en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar al incorporar el compuesto activo (por ejemplo, un polipéptido GL50, una molécula de ácido nucleico, o un anticuerpo anti-GL50) en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, como se requiera, seguido por esterilización filtrada. En general, las dispersiones se preparan al incorporar el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de los polvos estériles para la preparación de las soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado por vacío y secado por congelamiento que produce un polvo del ingrediente activo más algún ingrediente adicional deseado de la solución filtrada previamente estéril de ésta.

Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un portador comestible. Ellas se pueden incluir en cápsulas de gelatina o comprimirse en tabletas. Para el propósito de la administración terapéutica oral, el compuesto activo se puede incorporar con excipientes y utilizar en forma de tabletas, pastillas o cápsulas. Las composiciones orales también se pueden preparar utilizando portador fluido para uso como un enjuague bucal, en donde el compuesto en el portador fluido se aplica oralmente y escupido y expectorado o tragado. Los agentes de unión farmacéuticamente compatibles, y/o los materiales adyuvantes se pueden incluir como parte de la composición. Las tabletas, píldoras, cápsulas, pastillas y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes o compuestos de una naturaleza similar; un ligador tal como celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa; un agente desintegrante tal como ácido algínico, Primogel, o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Esterotes; un deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente endulzante tal como sucrosa o sacarina; o un agente saborizante tal como menta, metil salicilato, o sabor a naranja.

Para la administración mediante inhalación, los compuestos se suministran en forma de un pulverizado de aerosol proveniente de un recipiente presurizado o un dispensador que contiene un propulsante adecuado, por ejemplo, gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.

La administración sistémica también puede ser por medios de transmucosa o transdérmicos. Para la administración por transmucosa o transdérmica, los penetrantes apropiados a la barrera a ser permeada se utilizan en la formulación. Tales penetrantes son generalmente conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosal, detergentes, sales biliares, y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosal se puede lograr a través del uso de pulverizadores nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en ungüentos, emplastos, geles, o cremas como se conocen generalmente en la técnica.

Los compuestos también se pueden preparar en la forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para suministro rectal.

En una modalidad, los compuestos activos se preparan con portadores que protegerán el compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Los polímeros biodegradables, biocompatibles se pueden utilizar, tales como etileno vinil acetato, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de tales formulaciones serán evidentes para aquellos expertos en la técnica. Los materiales también se pueden obtener comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposomales (incluyendo los liposomas objetivo para las células infectadas con anticuerpos monoclonales a antígenos virales) también se pueden utilizar como portadores farmacéuticamente aceptables. Estos se pueden preparar de acuerdo a los métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la Patente U.S. No. 4,522,811.

Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de dosis unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosis. La forma de dosis unitaria como se utiliza aquí se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para el sujeto a ser tratado; cada unidad contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado en asocio con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas de dosis unitarias de la invención se dictan por y son directamente dependientes de las características únicas del compuesto activo y del efecto terapéutico particular a ser logrado, y las limitaciones inherentes en la técnica de componer tal compuesto activo para el tratamiento de indivi-
duos.

La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales compuestos se puede determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos de células o en animales experimentales, por ejemplo, para determinar el LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) y el ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50% de la población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y éste se puede expresar como la proporción LD50/ED50. Los compuestos que exhiben grandes índices terapéuticos son los preferidos. Aunque los compuestos que exhiben efectos colaterales tóxicos se pueden utilizar, se debe tener cuidado al diseñar el sistema de suministro que apunte a tales compuestos al sitio específico del tejido afectado con el fin de minimizar el daño potencial a las células no infectadas y, de esta manera, reducir los efectos colaterales.

Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y los estudios en animales se pueden utilizar para formular un rango de dosis para uso en humanos. La dosis de tales compuestos descansa preferiblemente en el rango de concentraciones circulantes que incluyen el ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este rango dependiendo de la forma de dosificación empleada y la ruta de administración utilizada. Para cualquier compuesto utilizado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente desde los ensayos de cultivo celular. Una dosis se puede formular en modelos animales para lograr un rango de concentración en el plasma circulante que incluye el IC50 (es decir, la concentración del compuesto de ensayo que logre una inhibición máxima media de los síntomas) como se determinó en el cultivo celular. Tal información se puede utilizar para determinar más precisamente las dosis útiles en humanos. Los niveles en el plasma se pueden medir, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alto desempeño.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención se pueden insertar en vectores y utilizar como vectores de terapia de gen. Los vectores de terapia de gen se pueden suministrar a un sujeto mediante, por ejemplo, inyección intravenosa, administración local (ver la Patente U.S. 5,328,470) o mediante inyección estereotáctica (ver por ejemplo, Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057). La preparación farmacéutica del vector de terapia de gen puede incluir el vector de terapia de gen en un diluyente aceptable, o puede comprender una matriz de liberación lenta en la cual se incluya el vehículo de suministro de gen. De manera alternativa, donde se pueda producir el vector de suministro de gen completo intacto de las células recombinantes, por ejemplo, vectores retrovirales, la preparación farmacéutica puede incluir una o más células que produzcan el sistema de suministro de gen.

Las composiciones farmacéuticas se pueden incluir en un recipiente, paquete, o dispensador junto con las instrucciones para la administración.

VI. Usos y Métodos de la Invención

Las moléculas de ácido nucleico, polipéptidos, homólogos de proteínas, y anticuerpos descritos aquí se pueden utilizar en uno o más de los siguientes métodos: a) métodos de tratamiento, por ejemplo, modulación ascendente o descendente de la respuesta inmune; b) selección de ensayos; c) medicina predictiva (por ejemplo, ensayos de diagnóstico, ensayos de pronóstico, ensayos de monitoreo clínico, y farmacogenéticos). Las moléculas de ácido nucleico aisladas de la invención se pueden utilizar, por ejemplo, para expresar el polipéptido GL50 (por ejemplo, por vía de un vector de expresión recombinante en una célula huésped en aplicaciones de terapia de gen), para detectar mARN GL50 (por ejemplo, en una muestra biológica) o una alteración genética en un gen GL50, y para modular La actividad GL50, como se describe adicionalmente adelante. Los polipéptidos GL50 se pueden utilizar para tratar trastornos caracterizados por producción excesiva o insuficiente de Inhibidores GL50. Adicionalmente, los polipéptidos GL50 se pueden utilizar para selección de ligandos GL50 de ocurrencia natural, para selección de drogas o compuestos que modulan la actividad GL50, así como también para tratar trastornos caracterizados por producción excesiva o insuficiente del polipéptido GL50 o la producción de Formas de polipéptido GL50 que tienen actividad aberrante o reducida comparada con El polipéptido tipo silvestre GL50. Más aún, los anticuerpos anti-GL50 de la invención se pueden utilizar para detectar y aislar Polipéptidos GL50, regular la biodisponibilidad de los Polipéptidos GL50, y modular la actividad GL50 por ejemplo, modular respuestas inmunes.

A. Métodos de tratamiento

La presente invención suministra métodos profilácticos y terapéuticos para tratar un sujeto en riesgo de (o susceptible a) un trastorno o que tiene un trastorno asociado con la actividad o expresión del GL50 aberrante o un trastorno que se podría beneficiar de la modulación de la actividad GL50.

1. Métodos profilácticos

En un aspecto, la invención suministra un método para prevenir en un sujeto, una enfermedad o condición asociada con una actividad o expresión GL50 aberrante, al administrar al sujeto el polipéptido GL50 o un agente que modula la expresión del polipéptido GL50 o al menos una actividad GL50. Los sujetos en riesgo de una enfermedad que se origina o contribuye por la actividad o expresión del GL50 aberrante se puede identificar mediante, por ejemplo, cualquier combinación de ensayos de diagnóstico o pronóstico como se describe aquí. La administración de un agente profiláctico puede ocurrir antes de la manifestación de síntomas característicos de la aberrancia GL50, tal que una enfermedad o trastorno se evita o, alternativamente, se retrasa en su progresión. Dependiendo del tipo de la condición o aberrancia GL50, por ejemplo, un polipéptido GL50, un agente Agonista GL50 o antagonista GL50 se puede utilizar para tratar el sujeto. El agente apropiado se puede determinar con base en selección de ensayos descritos aquí.

2. Métodos terapéuticos

Otro aspecto de la invención pertenece a los métodos para modular la actividad o expresión GL50 para propósitos terapéuticos. De acuerdo con esto, en una modalidad de ejemplo, el método de modulación de la invención involucra poner en contacto una célula con un polipéptido GL50 o agente que modula una o más de las actividades del polipéptido GL50 asociado con la célula. Un agente que modular La actividad del polipéptido GL50 puede ser un agente como se describe aquí, tal como un ácido nucleico o un polipéptido, una molécula objetivo de ocurrencia natural de un polipéptido GL50 (por ejemplo, un ligando GL50), a un anticuerpo GL50, un Agonista o antagonista GL50, un péptido mimético de un Agonista o antagonista GL50, u otra molécula pequeña. En una modalidad, el agente estimula una o más Actividades GL50. Ejemplos de tales agentes estimuladores incluyen agentes que estimulan la interacción del GL50 con un receptor estimulador o inhibidor de la interacción de GL50 con un receptor inhibidor, por ejemplo, polipéptido GL50 activo, ciertas formas solubles de Las moléculas GL50, y una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido GL50 que se ha introducido en la célula. En otra modalidad, el agente inhibe una o más actividades GL50. Ejemplos de tales agentes inhibidores incluyen agentes que disminuyen la interacción del GL50 y un receptor coestimulador o promover la interacción entre el GL50 y un receptor inhibidor, por ejemplo, moléculas de ácido nucleico GL50 anti codificantes, anticuerpos anti-GL50, e Inhibidores GL50. Estos métodos modulares se pueden desarrollar in Vitro (por ejemplo, al cultivar la célula con el agente) o, alternativamente, in vivo (por ejemplo, al administrar el agente a un sujeto). Como tal, la presente invención suministra métodos para tratar un individuo afligido con una enfermedad o trastorno que se podría beneficiar de la modulación de un polipéptido GL50, por ejemplo, un trastorno lo pudiera beneficiar de la modulación ascendente o descendente de la respuesta inmune, o que se caracteriza por la expresión aberrante o la actividad de un polipéptido GL50 o molécula de ácido nucleico. En una modalidad, el método involucra administrar un agente (por ejemplo, un agente identificado mediante un ensayo de selección descrito aquí), o la combinación de agentes que modulan (por ejemplo, sobre regulan o subregulan) la actividad o expresión GL50. En otra modalidad, el método involucra administrar un polipéptido GL50 o molécula de ácido nucleico como terapia para compensar la actividad o expresión del GL50 aberrante o reducida.

La estimulación de la actividad GL50 es deseable en situaciones en las que el GL50 se subregula anormalmente y/o en la que la actividad GL50 incrementada tiene probablemente un efecto benéfico. Así mismo, la inhibición de la actividad GL50 es deseable en situaciones en las que el GL50 se sobre regula normalmente y/o en la que la actividad GL50 reducida tiene probablemente un efecto benéfico.

3. Subregulación de Respuestas inmunes

Es posible subregular la función de un polipéptido GL50, y por lo tanto subregular las respuestas inmunes, en un número de formas. La subregulación puede estar en la forma de inhibición o bloqueo de una respuesta inmune ya en progreso o puede involucrar evitar la inducción de una respuesta inmune. Las funciones de las células T activadas se puede inhibir, por ejemplo, al suprimir Las respuestas de células T o al inducir tolerancia específica en Células T, o al conducir a la producción de citoquinas que amortiguan la respuesta inmune.

La inmuno supresión de las respuestas de célula T es generalmente un proceso específico sin antígeno, activo que conduce a respuestas de células T reducidas y puede requerir exposición continúa de las Células T al agente supresor. La tolerancia, que involucra no inducir sensibilidad o anergia en Células T, se distingue de la inmuno supresión en que es generalmente específica de antígeno y persiste después que la exposición al agente tolerante ha cesado. Operacionalmente, la tolerancia puede ser demostrada por la falta de sensibilidad de la célula T luego de la reexposición al antígeno específico en donde ocurre la reexposición en la ausencia del agente de tolerancia.

Por ejemplo, los Polipéptidos GL50, (que inducen formas no activas de un polipéptido GL50) o anticuerpos anti-GL50 que resultan en la falla de suministrar una señal coestimuladora a las Células T que han recibido una señal de activación primaria, se pueden utilizar para bloquear la interacción del GL50 entre el GL50 y sus ligandos en las Células T y por lo tanto suministrar unos medios específicos mediante los cuales originar la inmuno supresión y/o inducir la tolerancia en un sujeto. Tal bloqueo de formas de inhibición de los Polipéptidos GL50 y las proteínas de fusión y los anticuerpos de bloqueo se puede identificar mediante por su capacidad para inhibir la proliferación de células T c y/o producción de citoquina cuando se agregan a un ensayo de coestimulación in Vitro como se describe aquí y se conoce en la técnica. En contraste a las formas inhibidoras de un polipéptido GL50, las formas de activación (tal como un polipéptido GL50 de superficie celular intacta y ciertas formas solubles de GL50) preferiblemente transmiten una señal coestimuladora a las Células T, que resulta en una secreción incrementada de citoquinas (por ejemplo, IL-10) cuando se comparan con las células T activas que no han recibido una señal coestimuladora.

En una modalidad, las proteínas de fusión que comprenden el péptido primero GL50 fusionado a un segundo péptido que tiene una actividad de otro Antígeno linfocito B (por ejemplo, B7-1 o B7-2) se pueden utilizar para modificar las respuestas inmunes mediadas por células T. Alternativamente, dos péptidos separados que tiene una actividad de Antígeno de linfocito B, (por ejemplo, un polipéptido GL50 más un polipéptido B7-2 y/o B7-1), o combinación de anticuerpos de bloqueo (por ejemplo, anticuerpos contra un polipéptido GL50 con anticuerpos monoclonales anti-B7-2 y/o anti-B7-2) se pueden combinar como una composición única o administrar de forma separada (simultáneamente o secuencialmente), para sobre regular o subregular las respuestas inmunes mediadas por células T en un sujeto. Adicionalmente, una cantidad terapéuticamente activa de uno o más péptidos que tienen una actividad de polipéptido GL50, con actividad B7-1 y/o B7-2 se pueden utilizar en conjunto con otros reactivos inmuno moduladores para influenciar las respuestas inmunes. Ejemplos de otros reactivos de inmuno modulación incluyen los anticuerpos de bloqueo, (por ejemplo, contra CD28, CTLA4, y/o ICOS, o contra otros marcadores de célula T, o contra citoquinas), las proteínas de fusión (por ejemplo, CTLA4Ig), o drogas inmuno supresoras, (por ejemplo, rapamicina, cicloesporina A o FK506).

Los péptidos producidos a partir de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención también pueden ser útiles en la construcción de agentes terapéuticos que bloquean la función de las células T mediante la destrucción de la célula T. Por ejemplo, como se describe, las formas solubles, secretadas de un polipéptido GL50 o anticuerpos que se unen a un ligando en una célula T se pueden utilizar. Tales formas secretadas se pueden construir mediante técnicas de ingeniería genética estándar. Al unir una forma soluble de un polipéptido GL50 o anticuerpo a una toxina tal como ricina, un agente capaz de prevenir la activación de célula T se puede elaborar. La infusión de uno o una combinación de inmuno toxinas, (por ejemplo, GL50-ricina con B7-2-ricina y/o B7-1-ricina), en un paciente puede resultar en la muerte de Células T, particularmente de las células T activas que expresan mayores cantidades de CD28, CTLA4, y/o ICOS o GL50.

Otro método para evitar la función de un polipéptido GL50 es a través del uso de un oligonucleótido triple o anti codificante. Por ejemplo, un oligonucleótido complementario al área alrededor de un sitio de iniciación de traducción de polipéptido GL50, se puede sintetizar. Uno o más oligonucleótidos anti codificantes se pueden agregar al medio celular, típicamente en 200 \mug/ml, o administrar a un paciente para evitar la síntesis de un polipéptido GL50. El oligonucleótido anti codificante es tomado por las células e hibridiza a un mARN GL50 para evitar traducción. Alternativamente, un oligonucleótido un oligonucleótido que se une al ADN dicatenario para formar una construcción triple para evitar el desenrollamiento del ADN y la transcripción se pueden utilizar. Como un resultado, se bloquea la síntesis de un polipéptido GL50.

La subregulación o prevención de una más funciones de polipéptido GL50, por ejemplo, evitar la síntesis de linfoquina de alto nivel mediante células T activadas, será útil en situaciones de transplante de tejidos, piel y órganos y en enfermedad de anfitrión Vs. injerto (GVHD). Por ejemplo, el bloqueo de la función de las células T resultará en destrucción de tejido reducida en transplantes de tejido. Típicamente, en transplantes de tejido, el rechazo del transplante se inicia a través de su reconocimiento como externo por las células T, seguido por la reacción inmune que destruye el transplante. La administración de una molécula que inhibe o bloquea la interacción de un antígeno de linfocito B7 con sus ligandos naturales en células inmunes (tal como una forma monomérica, soluble de un polipéptido GL50 solo o en conjunto con una forma monomérica de un péptido B7 diferente (por ejemplo, B7-1, B7-2) o bloqueo de anticuerpo), antes de que el transplante pueda conducir a la unión de la molécula a los ligando naturales en células inmunes sin trasmitir la correspondiente señal coestimuladora. La función de bloqueo del antígeno del linfocito B en esta forma evita la síntesis de citoquina mediante células inmunes, tal como las Células T y, así, actúa como un inmuno supresor. Más aún, la falta de coestimulación también puede ser suficiente para energizar las Células T, induciendo por lo tanto tolerancia en un sujeto. La inducción de la tolerancia a largo plazo por los reactivos de bloqueo de Antígeno de linfocito B puede evitar la necesidad de administración repetida de estos reactivos de bloqueo. Para alcanzar la inmuno supresión suficiente o la tolerancia en un sujeto, también puede ser necesario bloquear la función de una combinación de Antígenos de linfocito B. Por ejemplo, puede ser deseable para bloquear la función del polipéptido GL50 B7-1 y GL50, B7-2 y GL50, o B7-1 y B7-2, al administrar una forma soluble de una combinación de péptidos que tienen la actividad de cada uno de estos antígenos o los anticuerpos de bloqueo contra estos antígenos (separadamente o juntos en una única composición) antes de trasplante. Alternativamente, las formas de inhibición de los Polipéptidos GL50 se pueden utilizar con otros agentes de supresión tal como los anticuerpos de bloqueo contra otros Marcadores de células T o contra citoquinas, otras proteínas de fusión, por ejemplo, CTLA4Ig, o drogas inmuno supresoras.

La eficacia de reactivos de bloqueo particulares en evitar el rechazo de trasplante de órganos o GVHD se pueden evaluar utilizando modelos animales que son predictivos de eficacia en humanos. Debido a que los polipéptidos B7 exhiben conservación de aminoácidos a través de las especies, es probable que otros antígenos GL50 puedan funcionar a través de especies, por lo tanto permitiendo el uso de reactivos compuestos de proteínas humanas en sistemas animales. Ejemplos de sistemas apropiados que se pueden utilizar incluyen injertos cardíacos alogenéicos en ratas e injertos de células islote pancreáticas senogénicas en ratones, ambos se han utilizado para examinar los efectos inmuno supresores de las proteínas de fusión CTLA4Ig in vivo como se describe en Lenschow et al., Science, 257: 789-792 (1992) y Turka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 11102-11105 (1992). Adicionalmente, modelos de murinos de GVHD (ver Paul ed., Fundamental Immunology, Raven Press, New York, 1989, pp. 846-847) se pueden utilizar para determinar el efecto de la función de bloqueo de un polipéptido GL50 in vivo el desarrollo de esa enfermedad.

Bloquear una función de polipéptido GL50, por ejemplo, mediante el uso de un péptido que tiene una actividad de polipéptido GL50 sola o en combinación con un péptido que tiene la actividad B7-1 y/o un péptido que tiene la actividad B7-2, también puede ser terapéuticamente útil para tratar enfermedades auto inmunes. Muchos trastornos auto inmunes son el resultado de una activación inapropiada de las Células T que son reactivas contra auto tejido y el que promueven la producción de citoquinas y auto anticuerpos involucrados en la patología de las enfermedades.

Evitar la activación de Células T auto reactivas puede reducir o eliminar los síntomas de enfermedad. La administración de reactivos que bloquean la coestimulación de Células T al interrumpir las interacciones de receptor: ligando de Antígenos de linfocito B s se pueden utilizar para inhibir Activación de células T y evitar la producción de auto anticuerpos o citoquinas derivadas de células t que puede estar involucras en el proceso de la enfermedad. Adicionalmente, los reactivos de bloqueo puede inducir tolerancia específica de antígeno de Células T auto reactivas que puede conducir al alivio a largo plazo de la enfermedad. La eficacia de los reactivos de bloqueo en evitar o aliviar los trastornos auto inmunes se puede determinar utilizando un número de modelos animales bien caracterizados de enfermedades auto inmunes humanas. Los Ejemplos incluyen encefalitis auto inmune experimental en murinos, lupus eritematoso sistémico en MRL/IprlIpr en ratones o ratones NZB híbridos, artritis por colágeno auto inmune en murinos, diabetes mellitus en ratones NOD y ratas BB, y miastenia gravis experimental en murinos (ver Paul ed., Fundamental Immunology, Raven Press, New York, 1989, pp. 840-856).

La respuesta del anticuerpo IgE en alergia atópica es altamente dependiente de células T y, así, la inhibición de Antígeno linfocito B inducido por Activación de células T puede ser útil terapéuticamente en el tratamiento de alergias reacciones alérgicas. Una forma inhibidora de un polipéptido GL50, tal como un péptido que tiene una actividad de polipéptido GL50 sola o en combinación con otro Antígeno de linfocito B, tal como B7-1 o B7-2, se puede administrar a un sujeto alérgico para inhibir las respuestas alérgicas mediadas por células T en el sujeto. La inhibición de coestimulación GL50 de Células T se puede lograr mediante la exposición a alérgenos en conjunto con moléculas MHC apropiadas. Las reacciones alérgicas pueden ser sistémicas o locales en naturaleza, dependiendo de la ruta de entrada del alérgeno y el patrón de disposición del IgE en mastocitos o basofilos. Así, puede ser necesario inhibir las respuestas alérgicas mediadas por células T localmente o sistémicamente mediante administración apropiada de una forma inhibidora de un polipéptido GL50.

La inhibición de la Activación de células T a través del bloqueo de la función de antígeno GL50 también puede ser terapéuticamente importante en infecciones víricas de Células T. Por ejemplo, en el síndrome de deficiencia inmune adquirida (SIDA), la replicación vírica se estimula por Activación de células T. El Bloqueo de una función GL50 puede conducir a un nivel más bajo de replicación y por lo tanto mejorar el curso del SIDA. Adicionalmente, también puede ser deseable para bloquear la función de combinación de Antígeno de linfocito B es decir, GL50 con B7-2 y/o B7-1.

En una modalidad de la invención, una miembro de la familia GL50 induce preferencialmente la secreción IL-10 mediante una célula T (Hutloff et al. (1999) Nature 397: 263). El IL-10, mientras promueve el desarrollo de respuestas tipo Th2, también conduce a la subregulación de la producción de ciertas citoquinas, y una submodulación de inmunidad mediada por la célula, por ejemplo, al reducir la activación macrófaga (Bai et al. (1997) Clin. Immunol. Immunopathol. 83: 117; Koch et al. (1996) J. Exp. Med. 184: 741; de Vries (1995) Ann. Med 27: 537).

De acuerdo con esto, en una modalidad de la invención, incrementar la actividad del miembro de la familia GL50 puede conducir a una submodulación de una respuesta inmune mediada por célula. Así, en una modalidad de la invención las respuestas inmunes mediadas por células se reducen al incrementar La actividad GL50.

4. Sobre regulación de respuestas inmunes

La sobre regulación de una respuesta inmune, por ejemplo, al promover una actividad estimuladora del GL50 también puede ser útil en terapia. La sobre regulación de respuestas inmunes puede estar en la forma de mejorar una respuesta inmune existente o elicitar una respuesta inmune inicial. Por ejemplo, mejorar una respuesta inmune a través de estimulación de GL50 puede ser útil en casos de infección vírica. Las infecciones víricas se despejan principalmente por Células T citolíticas. De acuerdo con la presente invención, se considera que los polipéptidos GL50 que interactúan con sus ligandos naturales en las Células T pueden resultar en un incremento de la actividad citolítica de al menos algunas de las Células T. La adición de una forma de activación del GL50, solo, o en combinación con una forma de activación de un polipéptido de familia B7 diferente para estimular la actividad de células T a través de la ruta de coestimulación podría ser así terapéuticamente útil en situaciones en donde la separación rápida o cuidadosa del virus puede ser benéfica. Estas incluirían enfermedades víricas de la piel tal como Herpes o zóster, en cuyos casos el polipéptido GL50 soluble monovalente o multivalente o una combinación de tales péptidos con un péptido que tiene una actividad B7-1 y/o un péptido que tiene una actividad B7-2 se suministra tópicamente a la piel. Adicionalmente, las enfermedades víricas sistémicas tales como influenza, el resfriado común, y la encefalitis se puede aliviar por la administración sistemática de las formas estimuladoras de GL50.

Alternativamente, las respuestas inmunes antivíricas se pueden mejorar en un paciente infectado al remover las Células T del paciente, coestimular las Células T in Vitro con APC pulsado por antígeno vírico o expresar un péptido GL50 (solo o en combinación con un péptido que tiene Actividad B7-1 y/o un péptido que tiene Actividad B7-2) o junto con una forma estimuladora de un péptido GL50 soluble (solo o en combinación con un péptido que tiene Actividad B7-1 y/o un péptido que tiene Actividad B7-2) y reintroducir las células T activadas in Vitro en el paciente. Otro método de mejorar las respuestas inmunes anti víricas podría ser aislar las células infectadas de un paciente, transfectarlas con una molécula de ácido nucleico que codifica un péptido que tiene la actividad de un Antígeno de linfocito B como se describe aquí tal como la células que expresan todo o una porción de un antígeno GL50 sobre su superficie, y reintroducir las células transfectadas en el paciente. Las células infectadas podría ahora ser capaces de suministrar una señal coestimuladora a, y por lo tanto de activar, las Células T in vivo.

Formas estimuladoras de las moléculas GL50 también pueden ser utilizadas profilácticamente en vacunas contra varios patógenos. La inmunidad contra un patógeno, por ejemplo, un virus, se puede inducir al vacunar con una proteína vírica junto con una forma estimuladora de un polipéptido GL50 en un adyuvante apropiado. Alternativamente, un vector de expresión que codifica genes para antígeno patogénico y un péptido que tiene la actividad de un antígeno y GL50, por ejemplo, un vector de expresión del virus vaccinia construido con ingeniería para expresar una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína vírica y una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido GL50 como se describe aquí, se pueden utilizar para vacunación. Las vacunas de ADN se pueden administrar mediante una variedad de medios, por ejemplo, por inyección (por ejemplo, intramuscular, intradérmica, o mediante inyección biolística de partículas de ADN recubiertas con oro en la epidermis con una pistola para genes que utiliza un acelerador de partículas o gas comprimido para inyectar las partículas en la piel (Haynes et al. (1996) J Biotechnol. 44: 37)). Alternativamente, Las vacunas de ADN se pueden administrar por medios no invasivos. Por ejemplo, el ADN formulado en lípidos o puro se puede suministra al sistema respiratorio o objetivo, por ejemplo, mediante parches Peyers mediante suministro oral de ADN (Schubbert (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 961). Los microorganismos atenuados se pueden utilizar para suministro a las superficies con mucosa. (Sizemore et al. 1995. Science. 270: 29). En una modalidad, el antígeno se administra concurrentemente con una forma estimuladora de una molécula GL50.

En otra aplicación, la sobre regulación de o mejora de la función GL50 puede ser útil en la inducción de inmunidad de tumor. En una modalidad, la molécula GL50 se asocia con células. Las células de Tumor (por ejemplo, sarcoma, melanoma, linfoma, leucemia, neuroblastoma, carcinoma) transfectadas con un ácido nucleico que codifica al menos un Antígeno GL50 se puede administrar a un sujeto para superar la tolerancia específica del tumor en el sujeto. Si se desea, la célula del tumor se puede transfectar para expresar una combinación de polipéptidos B7 (por ejemplo, B7-1, B7-2, GL50). Por ejemplo, las células de tumor obtenidas de un paciente se pueden transfectar ex vivo con un vector de expresión que dirige la expresión de un polipéptido GL50 solo, o en conjunto con un péptido que tiene Actividad B7-1 y/o Actividad B7-2. Las células de tumor transfectadas se regresan al paciente para resultar en la expresión de los péptidos en la superficie de las células transfectadas. Alternativamente, las técnicas de terapia de gen se pueden utilizar para objetivo de una célula de tumor para transfección in vivo.

La presencia del péptido que tiene la actividad de una molécula GL50 sobre la superficie de la célula del tumor suministra la señal de coestimulación necesaria para que las Células T induzcan una respuesta inmune mediada por células T contra las células de tumor transfectadas. Adicionalmente, las células de tumor que les falta las moléculas MHC clase I o MHC clase II, o que fallan en expresar cantidades suficientes de moléculas MHC clase I o MHC clase II, se puede transfectar con ácido nucleico que codifica todo o una porción de (por ejemplo, una porción truncada del dominio citoplásmico) de una proteína de cadena \alpha MHC clase I y proteína micro globulina \beta_{2} o una proteína de cadena \alphaMHC clase II y una proteína de cadena \beta MHC clase II para expresar por lo tanto proteínas MHC clase I o MHC clase II en la superficie celular. La expresión de la clase I o MHC clase II apropiadas en conjunto con un péptido que tiene la actividad de un Antígeno linfocito B (por ejemplo, B7-1, B7-2, GL50) induce una respuesta inmune mediada por células T contra las células de tumor transfectadas. Opcionalmente, un gen que codifica una construcción anti codificadote que bloquea la expresión de una MHC clase II asociada con proteína, tal como la cadena invariante, también se puede cotransfectar con un ADN que codifica un polipéptido GL50 para promover la presentación de tumor asociado con antígenos y inducir la inmunidad específica de tumor. Expresión de células de tumor de murino negativos B7-1 y B7 que se han mostrado por inducir inmunidad específica mediada por células T acompañadas por rechazo de tumor y protección prolongada para inoculación de tumor en ratones (Chen, L. et al. (1992) Cell 71: 1093-1102; Townsend, S. E. y Allison, J. P. (1993) Science 259: 368-370; Baskar, S. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5687-5690). Así, la inducción de una respuesta inmune mediada por células T en un sujeto humano puede ser suficiente para superar la tolerancia específica del tumor en el sujeto.

En otra modalidad, una forma de activación de uno o más péptidos GL50 (por ejemplo, expresado sobre una superficie celular) se puede administrar a un paciente que tiene un tumor para suministrar una señal coestimuladora a las células T con el fin de inducir inmunidad anti tumor utilizando técnicas que se conocen en el arte.

En una modalidad especifica, las células T se obtienen a partir de un sujeto y se cultivan ex vivo para expandir la población de las células T. En una modalidad adicional las células T se administran luego a un sujeto. Las células T se pueden estimular para proliferar in Vitro, por ejemplo, al suministrar a las células T una señal de activación primaria y una señal coestimuladora, como se conoce en la técnica. Varias formas de los polipéptidos GL50 también se pueden utilizar para coestimular la proliferación de células T. En una modalidad las células T se cultivan ex vivo de acuerdo con el método descrito en la solicitud PCT No. WO 94/29436. La molécula coestimuladora puede ser soluble, unida a una membrana celular o unida a una superficie sólida, tal como un lecho.

B. Identificación de Citoquinas Inducidas por Coestimulación mediada por GL50

Las moléculas GL50 como se describen aquí se pueden utilizar para identificar citocinas que se producen por las células T en respuesta a la estimulación mediante un polipéptido GL50. La células T se pueden estimular sub óptimamente in Vitro con una señal de activación primaria, tal como un éster de forbol, anticuerpo anti-CD3 o preferiblemente antígeno en asociación con una molécula MHC clase II, y dada una señal coestimuladora mediante una forma estimuladora del antígeno GL50, por ejemplo mediante una célula transfectada con ácido nucleico que codifica un polipéptido GL50 y que expresa el péptido sobre su superficie o mediante una forma estimuladora, soluble del péptido. Las citoquinas conocidas liberadas en el medio se pueden identificar por ELISA o por la capacidad de un anticuerpo que bloquea la citosina para inhibir la proliferación de células T o proliferación de otros tipos de células que se inducen por la citosina. Un kit ELISA IL-4 esta disponible de Genzyme (Cambridge MA), como es un anticuerpo de bloqueo IL-7. Los anticuerpos de bloqueo contra IL-9 e IL-12 están disponibles de Genetics Institute (Cambridge, MA).

Un ensayo de coestimulación de células T como se describió anteriormente también se puede utilizar en un método para identificar citocinas novedosas que se pueden inducir por coestimulación. Por ejemplo, cuando la estimulación de la ruta CD28/CTLA4 parece mejorar la secreción IL-2, la estimulación de la ruta ICOS parece mejorar la secreción IL-10 (Hutloff et al. 199. Nature 397: 263). Si una actividad particular inducida luego de coestimulación, por ejemplo, proliferación de células T, no se puede inhibir por la adición de anticuerpos de bloqueo para citoquinas conocidas, la actividad puede resultar de la acción de una citosina desconocida. Luego de coestimulación, esta citosina puede ser purificada a partir del medio por métodos convencionales y su actividad medida por su capacidad para inducir la proliferación de células T.

Para identificar las citocinas que pueden evitar la inducción de tolerancia, un ensayo de coestimulación de células T in vitro como se describió anteriormente se puede utilizar. En este caso, las células T podrían dar la activación de señal primaria y poner en contacto con la citosina seleccionada, pero no se les daría la señal coestimuladora. Después de lavar y reposar las células T, las células podrían ser reinoculadas con una señal de activación primaria y una señal coestimuladora. Si las células T no responden (por ejemplo, proliferan o producen citocinas) ellas han llegado a tolerar y las citocinas no han evitado la inducción de tolerancia. Sin embargo, si las células T responden, la inducción de tolerancia se ha evitado por la citosina. Aquellas citocinas que son capaces de evitar la inducción de tolerancia se pueden objetivar para bloqueo in vivo en conjunto con reactivos que bloquean los antígenos del linfocito B como un medio más eficiente para inducir tolerancia en receptores de transplantes o sujetos con enfermedades autoinmunes. Por ejemplo, uno puede administrar un reactivo de bloqueo GL50 junto con un anticuerpo de bloqueo de citosina a un sujeto.

C. Identificación de Moléculas que Influencian la Coestimulación

Otra aplicación del péptido que tiene la actividad de un antígeno lindoncito B novedoso de la invención es iluso de uno o más de estos péptidos en ensayos de selección para descubrir como moléculas indefinidas que son moduladores de unión de ligando coestimulador y/o de señalización intracelular a través de las células T luego de coestimulación. Por ejemplo, un ensayo de unión de fase sólida que utiliza un péptido que tiene la actividad de una molécula GL50, se puede utilizar para identificar moléculas a las que el GL50 se une y/o que inhibe la unión del antígeno con un ligando de célula T apropiado (por ejemplo, CD28, CTLA4, o ICOS). Adicionalmente, un ensayo de coestimulación de células T in vitro como se describió anteriormente se puede utilizar para identificar moléculas que interfieren con la señalización intracelular a través de las células T luego de coestimulación como se determina por la capacidad de estas moléculas para inhibir la proliferación de células T y/o la producción de citosina (aunque no evitan la unión de una molécula GL50 a su ligando). Por ejemplo, el compuesto ciclosporina A y la rapamicina inhiben la activación de células T a través de la estimulación por vía de la ruta de receptor de célula T pero no por vía de la ruta CD28/CTLA4. Por lo tanto, esta involucrada en la estimulación una ruta de señalización intracelular diferente. Las moléculas que interfieren con la señalización intracelular por vía del CD28/CTLA4 y/o la ruta ICOS pueden ser efectivos como agente inmunosupresores in vivo con o sin el uso de un inmunosupresor adicional tal como ciclosporina A o rapamicina.

D. Identificación de Moléculas que Modulan la Expresión de un Polipéptido GL50

Los anticuerpos producidos utilizando las proteínas y péptidos de la presente invención se pueden utilizar en un ensayo de selección para moléculas que modulan la expresión del polipéptido GL50 en células. Por ejemplo, las moléculas que efectúan la señalización intracelular que conduce a la inducción de la expresión de polipéptidos GL50 por ejemplo, en respuesta a señales de activación, se pueden identificar al ensayar la expresión de uno o más polipéptidos GL50 sobre la superficie celular. El teñido inmunofluorescente reducido mediante un anticuerpo antiGL50 en la presencia de la molécula podría indicar que la molécula inhibe las señales intracelulares. Las moléculas que sobreregulan la expresión del polipéptido GL50 resultan en un teñido inmunofluorescente incrementado. Alternativamente, el efecto de una molécula sobre la expresión de un polipéptido GL50 se puede determinar al detectar lo niveles de mARN GL50 celulares utilizando una sonda de la presente invención. Por ejemplo, una célula que expresa un polipéptido GL50 se puede poner en contacto con una molécula para se ensayada, y un incremento o reducción en los niveles mARN GL50 en la célula detectado por técnicas estándar, tal como análisis de hibridación Northern o dot blot convencional de mARN o total poli (A^{+}) ARN total utilizando una sonda mGL50-1 etiquetada con un marcador detectable. Las moléculas que modulan la expresión de un polipéptido GL50 pueden ser terapéuticamente útiles para sobreregular o subregular respuestas inmunes solas o en conjunto con reactivos de estimulación o bloqueos solubles. Por ejemplo, una molécula que inhibe la expresión del GL50 se puede administrar junto con un reactivo de bloqueo GL50 para propósitos inmunosupresores. Las moléculas que se pueden probar en los ensayos descritos anteriormente incluyen citocinas tal como IL-4, \gammaINF, IL-10, IL-12, GM-CSF y prostagladinas.

E. Ensayos de Selección

La invención suministra un método (también referido aquí como un "ensayo de selección") para identificar moduladores, es decir, compuestos de ensayo o candidatos o agentes (por ejemplo, péptidos, péptidos miméticos, moléculas pequeñas u otras drogas) que se unen a los polipéptidos GL50 o porciones de estos, tienen un efecto estimulador o inhibidor en, por ejemplo, la actividad GL50 o la expresión GL50.

En una modalidad, la invención suministra ensayos para seleccionar candidatos o compuestos de ensayo que se unen a o modulan la actividad de un polipéptido GL50 o polipéptido o porción biológicamente activo de este, por ejemplo, modula la capacidad del polipéptido GL50 para interactuar con un compañero de unión (por ejemplo, un ligando de contacto o interactuador intracelular). Por ejemplo, en una modalidad las porciones de dominio extracelular del GL50 se pueden utilizar. En otra modalidad, también se pueden utilizar las porciones del dominio citoplásmico de una molécula GL50. En otras modalidades, se pueden usar las pociones del dominio de transmembrana de una molécula GL50.

En una modalidad, las formas variantes de un polipéptido que comprende un dominio GL50 se pueden utilizar en un ensayo de selección. Por ejemplo, los dominios GL50 que comprenden una alteración de aminoácido (por ejemplo, que se han mutagenenizado, utilizando, por ejemplo mutagénesis de cassette o aleatorias) se pueden utilizar en ensayos de selección del sujeto. Alternativamente, las variantes de empalme de los dominios intracelulares GL50 (por ejemplo, dominio intracelular GL50-1, dominio citoplásmico GL50-2 o exones adicionales identificados luego de secuenciamiento del cromosoma 21 o identificados por PCR RACE) se pueden seleccionar para los compuestos. Tales variante GL50 se pueden utilizar para identificar compuestos con actividad contra un rango de molécula GL50 y pueden identificar residuos de aminoácidos esenciales para la actividad GL50.

Los compuestos de ensayo de la presente invención se pueden obtener utilizando cualquiera de los numerosos enfoques en métodos de librerías combinatorios conocidos en la técnica, que incluye: librerías biológicas; librerías de fase de solución o fase sólidas paralelas espacialmente dirigibles; métodos de librería sintéticos que requieren de convuloción; el método de librería "compuesto 1-un lecho"; y métodos de librería sintéticos que utilizan selección de cromatografía de afinidad. El enfoque de la librería biológica se limita al librerías de péptido mientras los otros cuatro enfoques son aplicables péptidos, librerías de moléculas pequeñas u oligómeros sin péptido de los compuestos (Lam, K. S. (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145).

Ejemplos de métodos para las síntesis de librerías moleculares se pueden encontrar en la técnica, por ejemplo en: DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al. (1993) Science 261: 1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; y en Gallopetal. (1994) J. Med. Chem. 37:1233.

Las librerías de compuestos pueden presentar en disolución (por ejemplo, Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421), o en glóbulos (Lam (1991) Nature 354 :82-84), chips (Fodor (1993) Nature 364: 555-556), bacterias (Ladner USP 5,223,409), esporas (Ladner USP '409), plásmidos (Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869) o en fagos (Scott and Smith (1990) Science 249: 386-390); (Devlin (1990) Science 249: 404- 406); (Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 6378-6382); (Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301-310); (Ladner supra.).

En otra modalidad, un ensayo es un ensayo basado en células que comprende poner en contacto una célula que expresa una molécula objetivo GL50 (por ejemplo, un ligando GL50 tal como ICOS o molécula interactuadota intracelular) con un compuesto de ensayo y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para modular (por ejemplo estimular o inhibir) la actividad de la molécula objetivo GL50. En una modalidad se identifica una molécula objetivo GL50, por ejemplo, en un ensayo de dos o tres híbridos. En otra modalidad, una molécula interactuadora se define utilizando métodos estándar para reticulación GL50 para moléculas vecinas seguido por inmunoprecipitación utilizando anticuerpos antiGL50.

En una modalidad, las porciones de las regiones intracelulares y/o o transmembrana como se definen por los gráficos de hidropatía o dominios como se define por la estructura de exón puede ser como un señuelo en los ensayos 2-híbridos para determinar los compañeros de unión para estos dominios. Loas proteínas que interactúan se pueden utilizar en ensayos para cuantificar el grado de unión GL50 para los compañeros de interacción potencialmente para producción o ensayos de control de calidad. En otra modalidad, las variantes de empalme se dominio citoplásmico se pueden utilizar en diferentes ensayos 2-híbridos para recolectar en rango completo de interactuadores de proteína que se unen a cualquier variante de empalme GL50.

Determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para modular la actividad de una molécula objetivo GL50 se puede lograr, por ejemplo, al determinar la capacidad del polipéptido GL50 para unirse a o interactuar con la molécula objetivo GL50 o su ligando. La determinación de la capacidad del polipéptido GL50 para unirse a o interactuar con un ligando de una molécula GL50 se puede lograr, por ejemplo, mediante unión directa.

En un ensayo de unión directa, el polipéptido GL50 se puede acoplar con un radioisotopo o etiqueta enzimática de tal manera que la unión del polipéptido GL50 a la molécula objetivo GL50 se pueden determinar al detectar el polipéptido GL50 etiquetado en un complejo. Por ejemplo, Las moléculas GL50, por ejemplo, Polipéptidos GL50, se pueden etiquetar con ^{125}I, ^{35}S, ^{14}C, o ^{3}H, directa o indirectamente, y el radioisotopo detectado por el conteo directo de radioemisión o por conteo de centelleo. Alternativamente, las moléculas GL50 se pueden etiquetar enzimáticamente con, por ejemplo, peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, o luciferasa, y la etiqueta enzimática detectada por determinación de conversión de un sustrato apropiado para producto.

También están dentro del alcance de esta invención para determinar la capacidad de un compuesto para modular la interacción entre el GL50 y su molécula objetivo, sin el etiquetado de cualquiera de los interactuadores. Por ejemplo, se puede utilizar un microfisiometro para detectar la interacción del GL50 con su molécula objetivo sin la etiqueta de GL50 o la molécula objetivo. McConnell, H. M. et al. (1992) Science 257: 1906-1912. Como se utiliza aquí, un "microfisiometro" (por ejemplo, Cytosensor) es un instrumento analítico que mide la proporción en la que una célula acidifica su ambiente utilizando un sensor potenciométrico dirigible por luz (LAPS). Los cambios en su proporción de acidificación se pueden utilizar como un indicador de la interacción entre el compuesto y el receptor.

En una modalidad preferida, determinar la capacidad del polipéptido GL50 para unirse a o interactuar con el compañero de unión GL50 se puede lograr al determinar la actividad de compañero de unión. Por ejemplo, la actividad de la molécula objetivo se puede determinar al detectar la inducción de un segundo mensajero celular al objetivo (por ejemplo, para fosforilar el GL50 u otro sustrato en los residuos tirosina), detectar la actividad catalítica/enzimática del objetivo en sustrato apropiado, detectar la inducción de un gen reportero (que comprende un elemento regulador sensible a objetivo ligado operativamente a un ácido nucleico que codifica un marcador detectable, por ejemplo, cloranfenicol acetil transferasa), o detectar una respuesta celular regulada por objetivo. Por ejemplo, la determinación de la capacidad del polipéptido GL50 para unirse a o interactuar con una molécula objetivo GL50 se puede lograr, por ejemplo, al medir la capacidad de un compuesto para submodular la Coestimulación de células T en un ensayo de proliferación, o al interferir con la capacidad de un polipéptido GL50 para unirse a anticuerpos que reconocen una porción del polipéptido GL50.

En aún otra modalidad, un ensayo de la presente invención es un ensayo libre de células en el que un polipéptido GL50 o porción biológicamente activa de esta se pone en contacto con un compuesto de ensayo y la capacidad del compuesto de ensayo para unirse a el polipéptido GL50 o porción biológicamente activa de esta se determina. La unión del compuesto de ensayo al polipéptido GL50 se puede determinar directa o indirectamente como se describió anteriormente. En una modalidad preferida, el ensayo incluye poner en contacto el polipéptido GL50 o porción biológicamente activa de este con un compuesto conocido que se une al GL50 para formar una mezcla de ensayo, poner en contacto la mezcla de ensayo con un compuesto de ensayo, y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para interactuar con un polipéptido GL50, en donde determinar la capacidad del compuesto de ensayo para interactuar con un polipéptido GL50 comprende determinar la capacidad del compuesto de ensayo para unirse preferencialmente al polipéptido GL50 o porción biológicamente activa de este según se compara con el compuesto conocido.

En otra modalidad, el ensayo es un ensayo libre de células en el que un polipéptido GL50 o porción biológicamente activa de esta se pone en contacto con un compuesto de ensayo y la capacidad del compuesto de ensayo para modular (por ejemplo, estimular o inhibir) la actividad del polipéptido GL50 o porción biológicamente activa de esta se determina. Determinar la capacidad del compuesto de ensayo para modular la actividad de un polipéptido GL50 se puede lograr, por ejemplo, al determinar la capacidad del polipéptido GL50 para unirse a la molécula objetivo GL50 o ligando mediante uno de los métodos descritos anteriormente para determinar la unión directa. Determinar la capacidad del polipéptido GL50 para unirse a la molécula objetivo GL50 también se puede lograr utilizando una tecnología tal como el Análisis de Interacción Biomolecular en Tiempo Real (BIA). Sjolander, S. and Urbaniczky, C. (1991) Anal. Chem. 63: 2338-2345 and Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705. Como se utiliza aquí, "BIA" es una tecnología para estudiar interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin etiquetar ninguna de las interacciones (por ejemplo, BIAcore). Los cambios en el fenómeno óptico de la resonancia de plasmón de superficie (SPR) se pueden utilizar como una indicación de interacciones de tiempo real entre moléculas biológicas.

En una modalidad alternativa, determinar la capacidad del compuesto de ensayo para modular la actividad de un polipéptido GL50 se puede lograr al determinar la capacidad del polipéptido GL50 para modular adicionalmente la actividad de una molécula objetivo GL50 (por ejemplo, un componente de ruta de transducción de señal mediada por GL50). Por ejemplo, la actividad de la molécula efectora en un objetivo apropiado se puede determinar, o la unión del efector a un objetivo apropiado se puede determinar como se describió previamente.

En aún otra modalidad, el ensayo libre de células involucra poner en contacto un polipéptido GL50 o porción biológicamente activa de esta con un compuesto conocido que se une al polipéptido GL50 para formar una mezcla de ensayo, poner en contacto la mezcla de ensayo con un compuesto de ensayo, y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para interactuar con el polipéptido GL50, en donde determinar la capacidad del compuesto de ensayo para interactuar con el polipéptido GL50 comprende determinar la capacidad del polipéptido GL50 para unirse preferencialmente a o modular la actividad de una molécula objetivo GL50.

Los ensayos libres de células de la presente invención son sensibles al uso de formas unidas a membrana y/o solubles de proteínas (por ejemplo, Polipéptidos GL50 o porción biológicamente activa de estas, o receptores a los que se une el GL50). En el caso de ensayos libres de células en el que se utiliza una membrana unida forma una proteína (por ejemplo, un receptor GL50 de superficie celular) puede ser deseable utilizar un agente de solubilización de tal manera que la forma de membrana unida de la proteína se mantiene en solución. Ejemplos de tales agente de solubilización incluyen detergentes no iónicos tal como n-octilglucosido, n-dodecilglucosido, n-dodecilmaltosida, octanoil-N-metilglucamida, decanoil-N-metilglucamida, Triton®X-100, Triton®X-114, Thesit^{X}, Isotridecipoli (etilenglicol éter)_{n}, 3-[(3-colamidopropil)dimetilaminio]-1-propano sulfonato (CHAPS), 3-[(3-colamidopropil)dimetilaminio]-2-hidroxi-1-propano sulfonato (CHAPSO), o N-dodecil=N,N-dimetil-3-amonio-1-propano sulfonato.

En una modalidad de los métodos de ensayo anteriores de la presente invención, puede ser deseable inmovilizar el GL50 o su molécula objetivo para facilitar la separación de complejos de formas no complejas de un o ambas proteína, así como también acomodar la automatización del ensayo. La unión de un compuesto de ensayo a un polipéptido GL50, o interacción de un polipéptido GL50 con una molécula objetivo en la presencia y ausencia de un compuesto candidato, se puede lograr en cualquier recipiente adecuado para contener los reactivos. Ejemplos de tales recipientes incluyen placas de microtítulo, tubos de ensayo, y tubos para microcentrifugar. En una modalidad, una proteína de fusión se puede suministrar que agrega un dominio que permite una o ambas proteínas a ser unidas a una matriz. Por ejemplo, proteínas de fusión GL50/glutation-S-transferasa o proteínas de fusión objetivo glutation-S-transferasa se pueden adsorben en glóbulos de gluitation sefarosa (Sigma Chemical, St. Louis, MO) o placas de microtítulo derivadas de glutationa, que luego se combinan con el compuesto de ensayo o el compuesto de ensayo y la proteína objetivo no adsorbida o polipéptido GL50, y la mezcla incubada bajo condiciones conductivas para formación de complejos (por ejemplo, en condiciones fisiológicas para sal y pH). Luego de incubación, los glóbulos, pozos de placas de microtítulo se lavan para remover cualquier componente no unido, la matriz inmovilizada en el caso de los glóbulos, el complejo determina directamente o indirectamente, por ejemplo, como se describió anteriormente. Alternativamente, los complejos se pueden disociar de la matriz, y el nivel de unión GL50 o actividad se determina utilizando técnicas estándar.

Otras técnicas para inmovilizar proteínas o matrices también se pueden utilizar en ensayos de selección de la invención Por ejemplo, un polipéptido GL50 o una molécula objetivo GL50 se puede inmovilizar utilizando conjugación de biotina y estreptavidina. El polipéptido GL50 biotilinado o las moléculas objetivo se pueden preparar a partir de biotin-NHS (N-hidroxi-succinimida) utilizando técnicas bien conocidas en el arte (por ejemplo, kit de biotinilización, Pierce Chemicals, Rockford, IL), e inmovilizadas en los pozos de 96 placas de pozos cubiertas con estreptavidina (Pierce Chemical). Alternativamente, los anticuerpos reactivos con el Polipéptido GL50 o las moléculas objetivo pero que no interfieren con la unión del polipéptido GL50 con su molécula objetivo se pueden derivar de los pozos de la placa, y los objetivos despegados o polipéptidos GL50 atrapados en los pozos por conjugación de anticuerpo. Los métodos para detectar tales complejos, en adición a aquellos descritos anteriormente para los complejos GST inmovilizados, incluyen inmuno detección de complejos utilizando anticuerpo reactivos con polipéptido GL50 o molécula objetivo, así como también ensayos ligados a enzimas que se basan en la detección de una actividad enzimática asociada con el polipéptido GL50 o molécula objetivo.

En otra modalidad, los moduladores de la expresión GL50 se identifican en un método en donde una célula se pone en contacto con un compuesto candidato y la expresión del mARN GL50 o proteína en la célula se determina. El nivel de expresión del mARN GL50 o proteína en la presencia del compuesto candidato se compara con el nivel de expresión del mARN GL50 o proteína en la ausencia del compuesto candidato. El compuesto candidato se puede identificar luego como un modular de la expresión GL50 basado en esta comparación. Por ejemplo, cuando la expresión del mARN GL50 o proteína es mayor (por ejemplo, estadísticamente significativamente mayor) en la presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato se identifica como un estimulador del mARN GL50 o expresión de proteína. Alternativamente, cuando la expresión del mARN GL50 o proteína es menor (por ejemplo, estadísticamente significativamente menor) en la presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato se identifica como un inhibidor del mARN GL50 o expresión de proteína. El nivel del mARN GL50 o expresión de proteína en las células se pueden determinar por los métodos descritos aquí para detectar mARN GL50 o proteína.

En aún otro aspecto de la invención, los polipéptidos GL50, por ejemplo, moléculas unidas a membrana o solubles o proteínas de estos (por ejemplo, porciones citoplásmicas o de transmembrana), se pueden utilizar como "proteínas de señuelo en un ensayo" de dos híbrido o ensayo de tres híbridos (ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 5,283,317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14: 920-924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696; y Brent W094/10300), para identificar otras proteínas que se unen a o interactúan con el GL50 ("proteínas de unión GL50" o "GL50-bp") y están involucradas en la actividad GL50. Tales proteínas de unión GL50 también están involucradas probablemente en la propagación de señales mediante los polipéptidos GL50 o los objetivos GL50 como, por ejemplo, elementos corriente debajo de una ruta de señalización mediada por GL50. Alternativamente, tales proteínas de unión GL50 pueden ser inhibidores GL50.

El sistema de dos híbridos se basa en la naturaleza modular de la mayoría de los factores de transcripción, que consisten de dominios de activación y unión de ADN separables.

En resumen, el ensayo utiliza dos construcciones de ADN diferentes. En una construcción, el gen que codifica para un polipéptido GL50 se fusiona con un gen que codifica el dominio de unión de ADN de un factor de transcripción conocido (por ejemplo, GAL-4). En otra construcción, una secuencia de ADN, de una librería de secuencias de ADN; que codifica una proteína no identificada ("prey" o "muestra") se funciona a un gen que codifica para el dominio de activación del factor de transcripción conocido. Si el "señuelo" y las proteínas "prey" son capaces de interactuar, in vivo, forman un complejo dependiente de GL50, la unión al ADN y los dominios de activación del factor de transcripción se ubican en proximidad cercana. Esta proximidad permite la transcripción de un gen reportero (por ejemplo LacZ) que se liga operablemente a un sitio de regulación transcripcional sensible al factor de transcripción. La expresión del gen reportero se puede detectar y las colonias celulares que contienen el factor de transcripción funcional se pueden aislar y utilizar para obtener el gen clonado que codifica la proteína que interactúa con el polipéptido GL50.

Esta invención adicionalmente pertenece a agentes novedosos identificados mediante los ensayos de selección descritos anteriormente. De acuerdo con esto, está dentro del alcance de esta invención utilizar adicionalmente un agente identificado como se describe aquí en un modelo animal apropiado. Por ejemplo, un agente identificado como se describió aquí (por ejemplo, un agente de modulación GL5, una molécula de ácido nucleico GL50 anti codificante, un anticuerpo específico GL50, o un compañero de unión GL50) se pueden utilizar en un modelo animal para determinar the eficacia, toxicidad, o efectos colaterales del tratamiento con tal un agente. Alternativamente, un agente identificado como se describe aquí también se puede utilizar en un modelo animal para determinar el mecanismo de acción de tal un agente. Adicionalmente, esta invención pertenece a usos de agentes novedosos identificados mediante los ensayos de selección descritos anteriormente para tratamientos como se describe aquí.

F. Ensayos de detección

Las Porciones o fragmentos de las secuencias de cADN identificadas aquí (y las secuencias de gen completo correspondientes) se pueden utilizar en numerosas formas como reactivos de polinucleótidos. Por ejemplo, estas secuencias se pueden utilizar para: (i) mapear sus respectivos genes en un cromosoma; y, así, ubicar las regiones de genes asociadas con enfermedades genéticas; (ii) identificar un individuo a partir de una muestra biológica (tipificación de tejidos); y (iii) ayudar en la identificación forense de una muestra biológica. Estas aplicaciones se describen en las subsecciones adelante.

1. Mapeo de cromosoma

El GL50 se ha mapeado para el cromosoma humano 21q22. De acuerdo con esto, las porciones o fragmentos de las secuencias de nucleótido GL50 (codificantes y no codificantes), descritas aquí, se pueden utilizar para correlacionar estas secuencias con genes asociados con la enfermedad.

La posición física de una secuencia en el cromosoma se puede correlacionar con datos de mapeo genéticos. (Tales datos se encuentran, por ejemplo, en V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man, disponible en línea en Johns Hopkins University Welch Medical Library). Las relaciones entre un gen y una enfermedad, mapeados para la misma región cromosómica, se pueden identificar luego a través de análisis de enlace (co-herencia de genes artísticamente adyacentes), descrito en, por ejemplo, Egeland, J. et al. (1987) Nature, 325: 783-787.

Más aún, las diferencias en las secuencias de ADN entre individuos afectados y no afectados con una enfermedad asociada con el gen GL50, se pueden determinar. Si se observa una mutación en algunos o todos los individuos afectados pero no en ningún individuo no afectado, entonces probablemente la mutación es el agente causante de la enfermedad particular. La comparación de los individuos afectados y no afectados involucra generalmente buscar primero alteraciones estructurales en los cromosomas, tal como eliminaciones o traslocaciones que son visibles a partir de cromosomas dispersos o detectables utilizando PCR basados en esa secuencia de ADN. Finalmente, el secuenciamiento completo de los genes a partir de varios individuos se puede desarrollar para confirmar la presencia de una mutación y para distinguir mutaciones de polimorfismos.

2. Tipificación de tejido

Las secuencias GL50 de la presente invención también se pueden utilizar para identificar individuos a partir de muestras biológicas. El ejército de los Estados unidos, por ejemplo, considera el uso del polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) para identificación de su personal. En esta técnica, un ADN genómico de un individuo se digiere con una o más enzimas de restricción, y se sondean en un Southern blot para producir bandas únicas para identificación. Este método no sufre las limitaciones actuales de las "etiquetas de perro" que se pueden perder, cambiar o robar, haciendo difícil la identificación positiva. Las secuencias de la presente invención son útiles como marcadores de ADN adicionales para RFLP (descritas en la patente U. S. 5,272, 057).

Adicionalmente, las secuencias de la presente invención se pueden utilizar para suministrar una técnica alternativa que determina la secuencia de ADN base por base actual de las porciones seleccionadas de un genoma de un individuo. Así, las secuencia de nucleótido GL50 descritas aquí se pueden utilizar par preparar dos cebadores PCR a partir de los extremos 5' y 3' de las secuencias. Estos cebadores se pueden utilizar luego para amplificar el ADN de un individuo y posteriormente secuenciarlo.

Los paneles de secuencia de ADN correspondientes de individuos, preparados en esta forma, pueden suministrar identificaciones individuales únicas, ya que cada individuo tendrá un único conjunto de secuencias de ADN debido a diferencias alélicas. Las secuencias de la presente invención se pueden utilizar para obtener tales secuencias de identificación de individuos y de tejido. Las secuencias de nucleótido GL50 de la invención representan únicamente porciones del genoma humano. La variación alélica ocurre a algún grado en las regiones de codificación de estas secuencias, y con un mayor grado en las regiones no codificantes. Se estima que la variación alélica entre individuos humanos ocurra con una frecuencia de aproximadamente una vez por cada 500 bases. Cada una de las secuencias descritas aquí puede, en algún grado, ser utilizada como un estándar contra el que el ADN de un individuo se puede comparar para propósito de identificación. Debido a que mayores números de polimorfismos ocurren en las regiones no codificantes, son necesarias menos secuencias para diferenciar individuos. Las secuencias no codificantes de la SEQ ID NO: 1, 3, o 5, pueden suministrar confortablemente identificación individual positiva con un panel de cebadores que cada uno produce una secuencia no codificante amplificada de 100 bases. Si se utilizan secuencias de codificación predichas, un número más apropiado de cebadores para identificación individual positiva sería
500-2,000.

Si un panel de reactivos de secuencias de nucleótido GL50 descritas aquí se utiliza para generar una base de datos de identificación única para un individuo, aquellos mismos reactivos se pueden utilizar después para identificar tejido a partir de ese individuo. Utilizando la base de datos de identificación única, la identificación positiva del individuo, vivo o muerto, se puede hacer a partir de muestras de tejido extremadamente pequeñas.

3. Uso de secuencias GL50 parciales en biología forense

También se pueden utilizar técnicas de identificación basadas en ADN en biología forense. La biología forense es un campo científico que emplea la tipificación genética de evidencia biológica encontrada en una escena del crimen como un medio para identificar positivamente, por ejemplo, un perpetrador de un crimen. Para hacer tal una identificación, la tecnología PCR se pueden utilizar para amplificar las secuencias de ADN tomadas a partir de muestras biológicas muy pequeñas tal como tejidos, por ejemplo, cabello o piel, o fluidos corporales, por ejemplo, sangre, saliva, o semen encontrado en una escena de un crimen. La secuencia amplificada luego se puede comparar con un estándar, permitiendo por lo tanto la identificación del origen de la muestra biológica.

Las secuencias de la presente invención se pueden utilizar para suministrar reactivos de polinucleótido, por ejemplo, cebadores PCR, objetivados a un lugar específico en el genoma humano, que pueden mejorar la confiabilidad de las identificaciones forenses basadas en ADN al, por ejemplo, suministrar otro "marcador de identificación" (es decir otra secuencia de ADN que es único para un individuo en particular). Como se mencionó anteriormente, la información de secuencia con base actual se puede utilizar para la identificación como una alternativa a los patrones formados por restricción de enzima generada por fragmentos. Las secuencias objetivadas para las regiones no codificantes son particularmente apropiadas para este uso como números mayores de polimorfismos que ocurren en las regiones no codificantes, haciendo más fácil diferenciar individuos utilizando esta técnica. Ejemplos de reactivos de polinucleótido incluyen las secuencias de nucleótido GL50 o porciones de esta que tienen que tienen una longitud de al menos 20 bases, preferiblemente al menos 30 bases.

Las secuencias de nucleótido GL50 descritas aquí se pueden utilizar adicionalmente para suministrar reactivos de polinucleótido, por ejemplo, sondas etiquetadas o etiquetables que se pueden utilizar en, por ejemplo, una técnica de hibridización in situ, para identificar un tejido específico, por ejemplo, tejido cerebral. Esto puede ser muy útil en caso en donde se presente un patólogo forense con un tejido de origen desconocido. Los paneles de tales sondas GL50 se pueden utilizar para identificar tejidos por especies y/o por tipo de órgano.

En una forma similar, estos reactivos, por ejemplo, las sondas o cebadores GL50 se pueden utilizar para selección de cultivo de tejido para contaminación (es decir, selección de la presencia de una mezcla de diferentes tipos de células en un cultivo).

G. Medicina predictiva

La presente invención también pertenece al campo de la medicina predictiva en la que ensayos de diagnóstico, ensayos de pronóstico, y ensayos de monitoreo clínico se utilizan para propósitos de pronóstico (predictivos) por lo cual tratan un individuo profilácticamente. De acuerdo con esto, un aspecto de la presente invención se relaciona con ensayos de diagnóstico para determinar el polipéptido GL50 y/o la expresión del ácido nucleico así como también la actividad GL50, en el contexto de una muestra biológica (por ejemplo, sangre, suero, células, tejidos) para determinar por lo cual si un individuo está afligido por una enfermedad o trastorno, o está en riesgo de desarrollar un trastorno, asociado con la actividad o expresión GL50 aberrante. La invención también suministra ensayos para pronóstico (o predictivos) para determinar si un individuo está en riesgo de desarrollar un trastorno asociado con el polipéptido GL50, expresión de ácido nucleico o actividad. Por ejemplo, las mutaciones en un gen GL50 se pueden ensayar en una muestra biológica. Tales ensayos se pueden utilizar para propósito predictivo o de pronóstico para tratar por lo tanto profilácticamente a un individuo antes del inicio de un trastorno caracterizado por o asociado con el polipéptido GL50, expresión de ácido nucleico o actividad.

Otro aspecto de la invención pertenece al monitoreo de la influencia de agentes (por ejemplo, drogas, compuestos) en la expresión o actividad de el GL50 en ensayos clínicos.

Estos y otros agentes se describen en más detalle en las siguientes secciones.

1. Ensayos de diagnóstico

Un método de ejemplo para detectar la presencia o ausencia del polipéptido GL50 o ácido nucleico en una muestra biológica involucra obtener una muestra biológica a partir de un sujeto de ensayo y poner en contacto la muestra biológica con un compuesto o un agente capaz de detectar el polipéptido GL50 o ácido nucleico (por ejemplo, mARN, ADN genómico) que codifica el polipéptido GL50 tal como la presencia del polipéptido GL50 o ácido nucleico se detecta en la muestra biológica. Un agente preferido para detectar el mARN GL50 o ADN genómico es una sonda de ácido nucleico etiquetada capaz de hibridar al mARN GL50 o ADN genómico.

La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un ácido nucleico hGL50, de tal manera que el ácido nucleico para la SEQ ID NO: 1, 3, o 5, o una porción de este, tal como un oligonucleótido de al menos 15, 30, 50, 100, 250 o 500 nucleótidos de longitud y suficiente para hibridizar específicamente bajo condiciones rigurosas al mARN GL50 o ADN genómico. Otras sondas adecuadas para uso en los ensayos de diagnóstico de la invención se describen aquí.

Un agente preferido para detectar el polipéptido GL50 es un anticuerpo capaz de unir al polipéptido GL50, preferiblemente un anticuerpo con una etiqueta detectable. Los Anticuerpos pueden ser policlonales, o más preferiblemente, monoclonales. Un anticuerpo intacto, o un fragmento de este (por ejemplo, Fab o F(ab')_{2}) se pueden utilizar. El término "etiquetado", con respecto a la sonda o anticuerpo, está destinado a abarcar el etiquetado directo de la sonda o anticuerpo al acoplar (es decir, unir físicamente) una sustancia detectable a la sonda o anticuerpo, así como también el etiquetado indirecto de la sonda o anticuerpo mediante reactividad con otro reactivo que es etiquetado directamente. Ejemplos de etiquetado indirecto incluyen detección de un anticuerpo primario utilizando un anticuerpo secundario etiquetado fluorescentemente y un extremo etiquetado de una sonda de ADN con biotina de tal manera que este se puede detectar con estreptavidina etiquetada fluorescentemente.

El término "muestra biológica" está destinado a incluir tejidos, células y fluidos biológicos aislados de un sujeto, así como también tejidos, células y fluidos presentes dentro de un sujeto. Esto es, el método de detección de la invención se pueden utilizar para detectar mARN GL50, proteína, o ADN genómico en una muestra biológica in Vitro así como también in vivo. Por ejemplo, las técnicas in Vitro para e hibridaciones in situ. En las técnicas in Vitro para la detección del polipéptido GL50 incluyen ensayos inmuno absorbentes ligados a enzima (ELISA), Western blot, inmuno precipitaciones e inmuno fluorescencia. Las técnicas in Vitro para la detección de GL50 ADN genómico incluyen hibridaciones Southern. Adicionalmente, las técnicas in Vitro para la detección del polipéptido GL50 incluyen introducir en un sujeto un anticuerpo anti-GL50 etiquetado. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser etiquetado con un marcador radioactivo cuya presencia y ubicación en un sujeto se puedan detectar por técnicas de formación de imágenes estándar.

En una modalidad, la muestra biológica contiene moléculas de proteína a partir del sujeto de ensayo. Alternativamente, la muestra biológica puede contener moléculas de mARN a partir del sujeto de ensayo o moléculas de ADN genómico a partir del sujeto de ensayo. Una muestra biológica preferida en una muestra de suero aislada por medios convencionales de un sujeto.

En otra modalidad, los métodos adicionalmente involucran obtener una muestra de control biológico a partir de un sujeto de control, poner en contacto la muestra de control con un compuesto o agente capaz de detectar el polipéptido GL50, mARN, o ADN genómico, de tal manera que la presencia del polipéptido GL50, mARN o ADN genómico se detecta en la muestra biológica, y comparar la presencia del polipéptido GL50, mARN o ADN genómico en la muestra de control con la presencia del polipéptido GL50, mARN o ADN genómico en la muestra de ensayo.

La invención también abarca kits parar detectar la presencia del GL50 en una muestra biológica. Por ejemplo, el kit puede comprender un compuesto etiquetado o agente capaz de detectar el polipéptido GL50 o mARN en una muestra biológica; medios para determinar la cantidad de GL50 en la muestra; y medios para comparar la cantidad de GL50 en la muestra con un estándar. El compuesto o agente se puede empacar en un contenedor adecuado. El kit puede adicionalmente comprender instrucciones para utilizar el kit para detectar el polipéptido GL50 o ácido nucleico.

2. Ensayos de pronóstico

Los métodos de diagnóstico descritos aquí puede adicionalmente utilizarse para identificar sujetos que tienen o están en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno asociado con la actividad o expresión GL50 aberrante. Por ejemplo, los ensayos descritos aquí, tal como los ensayos de diagnóstico precedentes o los siguientes ensayos, se pueden utilizar para identificar un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar un trastorno asociado con el polipéptido GL50, la actividad o expresión de ácido nucleico. Así, la presente invención suministra un método para identificar una enfermedad o trastorno asociado con la actividad o expresión GL50 aberrante en la que una muestra de ensayo se obtiene de un sujeto y el polipéptido GL50 o ácido nucleico (por ejemplo, mARN, ADN genómico) se detecta, en donde la presencia del polipéptido GL50 o ácido nucleico es un diagnostico para un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno asociado con la expresión o actividad del GL50 aberrante. Como se utiliza aquí, una "muestra de ensayo" se refiere a una muestra biológica obtenida de un sujeto de interés. Por ejemplo, una muestra de ensayo puede ser un fluido biológico (por ejemplo, suero), muestra celular, o tejido.

Adicionalmente, los ensayos de pronóstico descritos aquí se pueden utilizar para determinar si un agente (por ejemplo, un agonista, antagonista, peptidomimético, proteína, péptido, ácido nucleico, molécula pequeña, u otra droga candidata) se pueden administrar a un sujeto para tratar una enfermedad o trastorno asociado con la expresión o actividad GL50 aberrante. Así, la presente invención suministra métodos para determinar si un sujeto se puede tratar efectivamente con un agente para un trastorno asociado con la actividad o expresión GL50 aberrante en el que se obtiene una muestra de ensayo y el polipéptido GL50 o la actividad o expresión de ácido nucleico se detecta (por ejemplo, en donde en la donde la abundancia del polipéptido GL50 o la actividad o expresión de ácido nucleico es diagnóstico para un sujeto que se puede administrar el agente o para tratar un trastorno asociado con la actividad o expresión GL50 aberrante).

Los métodos de la invención también se pueden utilizar para detectar alteraciones genéticas en un gen GL50, por lo tanto determinando si un sujeto con el gen alterado está en riesgo de un trastorno asociado con el gen GL50. En modalidades preferidas, los métodos incluyen detectar, en una muestra de las células del sujeto, la presencia o ausencia de una alteración genética caracterizada por al menos una alteración que afecta la integridad de un gen que codifica la proteína GL5, o la mis-expresión del gen GL50. Por ejemplo, tales alteraciones genéticas se puedan detectar al discernir la existencia de al menos uno de 1) una eliminación de uno o más nucleótidos de un gen GL50; 2) una adición de uno o más nucleótidos para un gen GL50; 3) una sustitución de uno o más nucleótidos de un gen GL50, 4) una redisposición cromosómica de un gen GL50; 5) una alteración en el nivel de una trascripción ARN mensajera de un gen GL50, 6) modificación aberrante de un gen GL50, tal como un patrón de mutilación del ADN genómico, 7) la presencia de un patrón de empalme tipo no silvestre de un transcripción ARN mensajera de un gen GL50, 8) un nivel tipo no silvestre de un polipéptido GL50, 9) pérdida alélica de un gen GL50, y 10) modificación post traduccional inapropiada de un polipéptido GL50. Como se describe aquí, existe un gran número de técnicas de ensayo conocidas en el arte que se pueden utilizar para detectar alteraciones en un gen se GL50. Una muestra biológica preferida es un tejido o muestra de suero aislado por medios convencionales de un sujeto, por ejemplo, una muestra de tejido de corazón.

En ciertas modalidades, la detección de la alteración involucra el uso de una sonda/cebador en una reacción de cadena de polimerasa (PCR) (ver, por ejemplo, Patente Estadounidense Nos. 4,683,195 y 4,683,202), tal como anclaje PCR o RACE PCR, o, Alternativamente, en una reacción de ligado de cadena (LCR) (ver, por ejemplo, Landegran et al. (1988) Science 241: 1077-1080; y Nakazawa et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 360-364), la última de las cuales puede ser particularmente útil para detectar mutaciones de punto en el gen GL50 (ver Abravaya et al. (1995) Ácido nucleico s Res. 23: 675-682). Este método puede incluir las etapas de recolectar una muestra de células de un paciente, aislar el ácido nucleico (por ejemplo, genómico, mARN o ambos) de la células de la muestra, poner en contacto la muestra de ácido nucleico con uno o más cebadores hibridan específicamente a un gen GL50 bajo condiciones tales que la hibridación y amplificación del gen GL50 (si está presente) ocurre, y detectar la presencia o ausencia de un producto de amplificación, o detectar el tamaño del producto de amplificación y comparar la longitud con una muestra de control. Se anticipa que el PCR y/o LCR pueden ser deseables de utilizar como una etapa de amplificación preliminar en conjunto con cualquiera de las técnicas utilizadas para detectar mutaciones descritas aquí.

Los métodos de amplificación alternativos incluyen: replicación de secuencia auto sostenida (Guatelli, J. C. et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878), sistema de amplificación transcripcional (Kwoh, D. Y. et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173- 1177), Replicasa Q-Beta (Lizardi, P. M. et al. (1988) Bio-Technology 6: 1197), o cualquier otro método de amplificación de ácido nucleico, seguido por la detección de las moléculas amplificadas utilizando técnicas bien conocidas por aquellos expertos en el arte. Estos esquemas de detección son especialmente útiles para la detección de moléculas de ácido nucleico si tales moléculas están presentes en números muy bajos.

En una modalidad alternativa, las mutaciones en un gen GL50 de una muestra de célula se puede identificar mediante alteraciones en los patrones de clivaje de restricción de enzima. Por ejemplo, la muestra y el control de ADN se aísla, amplifican (opcionalmente), se digieren con uno o más endonucleasas de restricción, y se determinan los tamaños de longitud de fragmento mediante electrofóresis de gel y se comparan. Las diferencias en tamaños de longitud de fragmento entre la muestra y el ADN de control indican mutaciones en la muestra de ADN. Más aún, el uso de ribozimas específicos de secuencia (ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 5,498,531) se pueden utilizar para clasificar la presencia de mutaciones específicas mediante desarrollo o pérdida de un sitio de clivaje de ribozima.

En otros modalidades, las mutaciones genéticas en GL50 se puede identificar mediante al hibridar una muestra y con un ácido nucleico de control, por ejemplo, ADN o ARN, para ensayos de alta densidad que contienen cientos o miles de sondas de oligonucleótidos (Cronin, M. T. et al. (1996) Human Mutation 7: 244-255; Kozal, M. J. et al. (1996) Nature Medicine 2: 753-759). Por ejemplo, las mutaciones genéticas en GL50 se pueden identificar en dos ensayos dimensionales que contienen sondas de ADN generadas por luz como se describe en Cronin, M. T. et al. Supra. En resumen, un primer ensayo de hibridación de sondas se pueden utilizar para explorar a través de tramos largos de ADN en una muestra y control para identificar cambios base entre las secuencias al hacer disposiciones lineales de sondas traslapantes secuenciales. Esta etapa permite la identificación de mutaciones de punto. Esta etapa es seguida por un segundo ensayo de hibridación que permite la caracterización de mutaciones específicas al utilizar ensayos de sonda especializados más pequeños complementarios a todas las variantes de mutaciones detectadas. Cada ensayo de mutación está compuesto de conjuntos de sondas paralelos, uno complementario al gen tipo silvestre y el otro complementario al gen mutante.

En aún otra modalidad, cualquier variedad de reacciones de secuenciamiento conocidas en la técnica se pueden utilizar para secuencia directamente al gen GL50 y las mutaciones detectadas al comparar la secuencia de la muestra GL50 con la secuencia tipo silvestre correspondiente (control) secuencia. Ejemplos de reacciones de secuenciamiento incluyen aquellas con base en las técnicas desarrolladas por Maxam y Gilbert ((1977) Proc. Natl. Acad Sci. USA 74: 560) o Sanger ((1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463). También se contempla que cualquiera de una variedad de procedimientos de secuenciamiento automatizados se pueden utilizar cuando se desarrolla los ensayos de diagnóstico ((1995) Biotechniques 19: 448), que incluyen secuenciamiento por espectrometría de masa (ver, por ejemplo, Publicación internacional PCT No. WO 94/16101; Cohen et al. (1996) Adv. Chromatogr. 36: 127-162; y Griffin et al. (1993) Appl. Biochem. Biotechnol. 38: 147-159).

Otros métodos para detectar mutaciones en el gen GL50 incluyen métodos en los que la protección de los agentes de clivaje se utilizan para detectar bases disparejas en ARN/ARN o hetero dúplex ARN/ADN (Myers et al. (1985) Science 230: 1242). En general, la técnica de "clivaje disparejo" inicia al suministrar hetero dúplex formados al hibridar ARN o ADN (etiquetado) que contiene la secuencia GL50 tipo silvestre con ARN o ADN potencialmente mutante obtenido de una muestra de tejido. Los dúplex de doble hebra se tratan con un agente que cliva las regiones de hebra sencilla del dúplex tal como el que existirá debido a los pares base disparejos entre las hebras de muestra y control. Por ejemplo, se pueden tratar los dúplex ARN/ADN con híbridos RNasa y ADN/ADN tratados con S1 nucleasa para digerir enzimáticamente las regiones disparejas. En otras modalidades, los dúplex ADN/ADN o ARN/ADN se pueden tratar con peróxido de ósmio o hidroxilamina y con piperidina con el fin de digerir las regiones disparejas. Después de digestión de las regiones disparejas, el material resultante se separa luego por tamaño en geles de poliacrilamida desnaturalizantes para determinar el sitio de la mutación. Ver, por ejemplo, Cotton et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397; Saleeba et al. (1992) Methods Enzymol. 217: 286-295. En una modalidad preferida, el ADN o ARN de control puede ser etiquetado para detección.

En todavía otra modalidad, la reacción de clivaje dispareja emplea una o más proteínas que reconocen los pares base disparejos en ADN bicatenario (también llamado enzimas "de reparación de ADN disparejo") en sistemas definidos para detectar y mapear mutaciones de punto en GL50 obtenido de muestras de células. Por ejemplo, la enzima mutY de E. coli cliva el A en G/A disparejo y glicosila el ADN timidina de las células HeLA que clivan T a G/T disparejo (Hsu et al. (1994) Carcinogenesis 15: 1657-1662). De acuerdo con una modalidad de ejemplo, una sonda con base en una secuencia GL50, por ejemplo, una secuencia GL50 tipo silvestre, se hibridiza con un cADN u otro producto de ADN a partir de una célula de ensayo. El dúplex se trata con una enzima de reparación de ADN disparejo, y los productos de clivaje, si existen, se pueden detectar a partir de protocolos de electrofóresis o similares. Ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 5,459, 039.

En otras modalidades, alteraciones en la movilidad electroforética se utilizarán para identificar mutaciones en los genes GL50. Por ejemplo, se puede utilizar el polimorfismo de conformación monocatenario (SSCP) para detectar diferencias en movilidad electroforética entre ácidos nucleicos tipo silvestre y mutantes (Orita et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 86: 2766, ver también Cotton (1993) Mutat. Res. 285: 125-144; y Hayashi (1992) Genet. Anal. Tech. Appl. 9: 73-79). Los fragmentos de ADN monocatenarios de ácidos nucleicos GL50 de muestra y control se desnaturalizan y se les permite renaturalizar. La estructura secundaria de ácidos nucleicos monocatenarios varía de acuerdo con la secuencia, la alteración resultante en la movilidad electroforética permite la detección de aún un único cambio base. Los fragmentos de ADN se pueden etiquetar o detectar con sondas etiquetadas. La sensibilidad del ensayo se puede mejorar al utilizar ARN (a diferencia de ADN), en lo que la estructura secundaria es más sensible a un cambio en secuencia. En una modalidad preferida, el método objeto utiliza análisis hetero dúplex para separar moléculas hetero dúplex bicatenarias sobre la base de cambios en la movilidad electroforética (Keen et al. (1991) Trends Genet 7: 5).

En aún otra modalidad el movimiento de fragmentos tipo silvestre o mutantes en geles de poliacrilamida que contienen un gradiente de desnaturalizante se ensaya utilizando electrofóresis de gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) (Myers et al. (1985) Nature 313: 495). Cuando el DGGE se utiliza como el método de análisis, el ADN se modificará para asegurar que no se desnaturalice completamente, por ejemplo al agregar un GC de aproximadamente 40 bp de ADN rico en GC de alta fusión por PCR. En una modalidad adicional, se utiliza un gradiente de temperatura en lugar de un gradiente de desnaturalización para identificar las diferencias en la movilidad del control y la muestra de ADN (Rosenbaum y Reissner (1987) Biophys. Chem. 265: 12753).

Ejemplos de otras técnicas para detectar mutaciones de punto incluyen, pero no se limitan a, hibridación de oligonucleótido selectiva, amplificación selectiva, o extensión de cebador selectivo. Por ejemplo, los cebadores de oligonucleótido se pueden preparar en los cuales la mutación conocida se coloca centralmente y luego se hibrida para objetivar ADN bajo condiciones que permitan la hibridación solo si se un encuentra un case perfecto (Saiki et al. (1986) Nature 324: 163); Saiki et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6230). Tales oligonucleótidos de alelo específico se hibridan con ADN objetivo amplificado con PCR o un número de mutaciones diferentes cuando los oligonucleótidos se unen a la membrana de hibridación e hibridan con ADN objetivo etiquetado.

Alternativamente, la tecnología de amplificación específica de alelo que depende la amplificación selectiva de PCR se puede utilizar en conjunto con la presente invención. Los oligonucleótidos utilizados como cebadores para amplificación específica pueden llevar la mutación de interés en el centro de la molécula (de tal forma que la amplificación depende de la hibridación diferencial) (Gibbs et al. (1989) nucleico Acids Res. 17: 2437-2448) o en el extremo 3' al final de un cebador en donde, bajo condiciones apropiadas, se puede evitar el desparejamiento, o reducir la extensión de polimerasa (Prossner et al. (1993) Tibtech 11: 238). Adicionalmente puede ser deseable introducir un sitio de restricción novedoso en la región de la mutación para crear detección basada en clivaje (Gasparini et al. (1992) Mol. Cell Probes 6: 1). Se anticipa que en ciertas modalidades la amplificación también puede ser desarrollada utilizando la ligasa Taq para amplificación (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88: 189). En tales casos, la ligación ocurrirá solo si existe un case perfecto en el extremo 3' de la secuencia 5' haciendo posible detectar la presencia de una mutación conocida en un sitio específico al buscar la presencia o ausencia de amplificación.

Los métodos descritos aquí se pueden desarrollar, por ejemplo, al utilizar kits de diagnóstico preempacados que comprenden al menos una sonda de ácido nucleico o reactivo de anticuerpo descrito aquí, que se puede utilizar convenientemente, por ejemplo, en el ámbito clínico para diagnosticar pacientes que exhiben síntomas o historia familiar de una enfermedad o trastorno que involucra un gen GL50.

Adicionalmente, cualquier tipo celular o tejido en el que se expresa el GL50 se puede utilizar en los ensayos de pronóstico descritos aquí.

VII. Administración de agentes de modulación del GL50

Los agentes de modulación agentes de la invención se administran a los sujetos en forma biológicamente compatible adecuado para administración farmacéutica in Vivo para mejorar o suprimir la respuesta inmune mediada por células T. Por "forma biológicamente compatible adecuada para administración in vivo" significa una forma de la proteína a ser administrada en la que cualquier efecto tóxico se compensa por el efecto terapéutico de la proteína. El término sujeto está destinado a incluir organismos vivientes en los que se puede elicitar una respuesta inmune, por ejemplo, mamíferos. Ejemplos de sujetos incluyen humanos, perros, gatos, ratones, ratas, y especies transgénicas de estos. La administración de un agente como se describe aquí puede estar en cualquier forma farmacológica que incluye una
cantidad terapéuticamente activo de un agente solo o en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.

La administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de las composiciones terapéuticas de la presente invención se define como una cantidad efectiva, en dosis y durante periodos de tiempo necesarios para alcanzar el resultado deseado. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente modulador GL50 puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo, y peso del individuo, y la capacidad del péptido para elicitar una respuesta deseada en el individuo. El régimen de dosis se puede ajustar para suministrar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, varias dosis divididas se pueden administrar diariamente o la dosis se puede reducir proporcionalmente según se indique por la exigencia de la situación terapéutica.

El agente de modulación GL50 (por ejemplo, un péptido, una molécula de ácido nucleico, o un anticuerpo) se pueden administrar en una forma conveniente tal como inyección (subcutánea, intravenosa, etc.), administración oral, inhalación, aplicación transdérmica, o administración rectal. Dependiendo de la ruta de administración, el compuesto activo se puede recubrir de un material para proteger el compuesto de la acción de las enzimas, ácidas y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto. Por ejemplo, para administrar el agente de modulación GL50 por otra ruta de administración parenteral, puede ser necesario recubrir el péptido con, o coadministrar el péptido con, un material para evitar su inactivación.

Un agente de modulación GL50 se puede administrar a un individuo en un portador diluyente o adyuvante apropiado, coadministrar con inhibidores de enzima o en un portador apropiado tal como liposomas. Los diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen salina y soluciones de amortiguación acuosas. El adyuvante se utiliza en su sentido más amplio e incluye cualquier compuesto de estimulación inmune tal como interferón. Los adyuvantes contemplados aquí incluyen resorcinoles, tensoactivos no iónicos tales como polioxieileno oleil éter y n-hexadecil polietilen éter. Inhibidores de enzima incluyen inhibidores de tripsina pancreática, diisopropilfluorofosfato (DEEP) y trasilol. Los Liposomas incluyen emulsiones agua en aceite en agua así como también liposomas convencionales (Stearn et al., (1984) J. Neuroinmunol 7: 27).

El compuesto activo también se puede administrar parenteralmente o intra peritonealmente.

Las dispersiones también se pueden preparar en glicerol, polietilenglicol líquido, y mezclas de estos y en aceites. Bajo condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones pueden contener un preservativo para evitar el crecimiento de microorganismos.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de dispersiones o soluciones inyectables estériles. En todos los casos, las composiciones deben ser estériles y deben ser fluidas para que exista fácil suministro con jeringa. Esta debe ser estable bajo condiciones de fabricación y almacenamiento y se deben preservar contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de estos. Se puede mantener la fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensoactivos. La prevención de la acción de microorganismos se puede lograr mediante varios agentes anti fúngicos y anti bacterianos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tal como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede llevar a cabo al incluir en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar al incorporar compuestos activos (por ejemplo, un polipéptido GL50 o un anticuerpo anti-GL50) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido por esterilización filtrada. Generalmente, se preparan las dispersiones al incorporar el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos para la preparación son secado por congelamiento y secado al vacío que produce un polvo del ingrediente activo (por ejemplo, péptido) más cualquier ingrediente adicional deseado de una disolución filtrada esterilizada previamente de ésta.

Cuando un compuesto se protege de forma adecuada, como se describió anteriormente, la proteína se puede administrar oralmente, por ejemplo, con un diluyente inerte o un portador comestible asimilable. Como se utiliza aquí "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes anti fúngicos y anti bacterianos, agentes retardantes de la absorción e isotónicos, y similares. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activos es bien conocido en la técnica. Excepto en cuanto a cualquier agente o medio convencional sea incompatible con el compuesto activo, el uso de este en las composiciones tera-
péuticas se contempla. Los compuestos complementarios activos también se pueden incorporar en las composiciones.

Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de dosis unitaria para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma de dosificación unitaria como se utiliza aquí se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos mamíferos a ser tratados; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas de dosificación unitaria de la invención se dictan por y son directamente dependientes de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a ser alcanzado, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de formación de compuestos tal como un compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.

En una modalidad de la presente invención una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo para un polipéptido GL50 se administra a un sujeto. Comos e define aquí, una cantidad terapéuticamente efectiva de anticuerpo (es decir, una dosificación efectiva) varía de aproximadamente 0.001 a 30 mg/kg de peso corporal, preferiblemente 0.01 a 25 mg/kg de peso corporal, más preferiblemente aproximadamente 0.1 a 20 mg/kg de peso corporal, y aún más preferiblemente aproximadamente 1 a 10 mg/kg, 2 a 9 mg/kg, 3 a 8 mg/kg, 4 a 7 mg/kg, o 5 a 6 mg/kg de peso corporal. El experto apreciara que ciertos factores pueden influenciar la dosis requerida para tratar efectivamente un sujeto, que incluye pero no se limita a la severidad de la enfermedad o trastorno, tratamientos previos, salud general y/o edad del sujeto, y otras enfermedades presentes. Más aún, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo puede incluir un tratamiento único o, preferiblemente, puede incluir una serie de tratamientos. En un ejemplo preferido, se trata un sujeto con un anticuerpo en el rango entre aproximadamente 0.1 a 20 mg/kg de peso corporal, unas vez por semana durante entre aproximadamente 1 a 10 semanas, preferiblemente entre 2 a 8 semanas, más preferiblemente entre aproximadamente 3 a 7 semanas, y aún más preferiblemente aproximadamente 4, 5, o 6 semanas. También se apreciará que la dosis efectiva de anticuerpo utilizado para tratamiento puede incrementar o reducir el curso de un tratamiento particular. Los cambios en la dosis pueden resultar de los resultados de ensayos de diagnostico como se describe aquí.

Monitorear la influencia de agentes (por ejemplo, drogas o compuestos) sobre la expresión o actividad de un polipéptido GL50 se puede aplicar no solo en selección de droga básica, sino también en ensayos clínicos. Por ejemplo, la efectividad de un determinado agente mediante un ensayo de selección como se describe aquí para incrementar la expresión del gen GL50, los niveles de proteína, o actividad GL50 sobreregulada, se pueden monitorear en ensayos clínicos de los sujetos que exhiben expresión de gen GL50 reducida, niveles de proteína o actividad GL50 subregulada. Alternativamente, la efectividad de un agente determinado por un ensayo de selección para reducir la expresión del gen GL50, niveles de proteína, o actividad GL50 subreguladas, se pueden monitorear en ensayos clínicos de sujetos que exhiben expresión del gen GL50 incrementada, niveles de proteína, o actividad GL50 sobreregulada. En tales ensayos clínicos, la actividad o expresión de un gen GL50, y preferiblemente, otros genes que se han implicado en un trastorno se pueden utilizar como una "lectura" o marcadores del genotipo de una célula particular.

Por ejemplo, y no por vía de limitación, los genes, que incluyen el GL50, que se modulan en células por tratamiento con un agente (por ejemplo, compuesto, droga o molécula pequeña) que modulan la actividad GL50 (por ejemplo, identificado en un ensayo de selección como se describe aquí) se pueden identificar. Así, para estudiar los efectos de los agentes en un trastorno asociado con GL50, por ejemplo, en un ensayo clínico, las células se pueden aislar y el ARN se prepara y analiza para los niveles de expresión del GL50 y otros genes implicados en el trastorno asociado con GL50, respectivamente. Los niveles de expresión del gen (es decir, un patrón de expresión de gen) se pueden cuantificar por análisis Northern blot o RT-PCR, como se describe aquí, o alternativamente al medir la cantidad de proteína producida por uno de los métodos como se describe aquí, o al medir los niveles de actividad del GL50 u otros genes. De esta forma, el patrón de expresión de gen puede servir como un marcador, indicador de la respuesta fisiológica de las células al agente. De acuerdo con esto, el estado de respuesta se puede determinar antes, y en varios puntos durante el tratamiento del individuo con el agente.

En una modalidad preferida, la presente invención suministra un método para monitorear la efectividad del tratamiento de un sujeto con un agente (por ejemplo, un agonista, antagonista, peptidomimético, proteína, péptido, ácido nucleico, molécula pequeña, u otra droga candidata identificada por lo ensayos de selección descritos aquí) que comprende la etapas de (i) obtener una muestra de preadministración de un sujeto antes de antes de la administración de el agente; (ii) detectar el nivel de expresión de un polipéptido GL50, mARN, o ADN genómico en la muestra de preadministración; (iii) obtener una o más muestras postadministración del sujeto; (iv) detectar el nivel de expresión o actividad del polipéptido GL50, mARN, o ADN en muestras post administración; (v) comparar el nivel de expresión o actividad del polipéptido GL50, mARN, o ADN genómico en la muestra de preadministración con el polipéptido GL50, mARN, o ADN genómico en la muestra o muestras postadministración; y (vi) alterar la administración del agente al sujeto de acuerdo con esto. Por ejemplo, la administración incrementada del agente puede estar deseable para incrementar la expresión o actividad del GL50 a niveles mayores de los detectados, es decir, incrementar la efectividad del agente. Alternativamente, la administración reducida del agente puede ser deseable para reducir la expresión o actividad de GL50 a niveles menores que los detectados, es decir reducir la efectividad del agente. De acuerdo con tal una modalidad, se puede utilizar la actividad o expresión GL50 como un indicador de la efectividad de un agente, aún en la ausencia de una respuesta fenotípica observable.

Esta invención se ilustra adicionalmente por los siguientes ejemplos que non se deben constituir como limitantes. Los contenidos de todas las referencias, patentes y solicitudes de patentes publicadas citadas a lo largo de esta solicitud, así como también las figuras y la lista de secuencias se incorporan aquí como referencia.

Ejemplos

Se utilizan los siguientes materiales y métodos en los ejemplos.

Aislamiento de ARN y cepa de ratón: ratones (C57B1/6) inyectados con células de carcinoma de vejiga 10E5 MB49 tratadas con 1 \mug/ratón recombinante IL12 en los días 7-11 y 14-18. Se aísla ARN de los nodos linfáticos en los días 9 (75%), 12 (20%) y 19 (5%) se agrupan posteriormente. Se extrae ARN utilizando RNAStat 60 (teltest B) seguido por poli A+ ARN enriquecido utilizando ARN enriquecido utilizando el sistema de aislamiento magnético poli Attract (Promega). El cADN se sintetiza con RT (Gibco BRL). La fuentes adicionales de cADN incluyen una librería de timo fetal de ratón (C3H/Hej) y linfocitos de sangre periférica de ratón derivados de punción cardíaca de C57B1/6). Trampa de señal: los protocolos de trampa de señal se siguen como se describe por Jacobs et al. (1997. Gene. 198:289). En resumen, el cADN de tamaño fraccionado se clona unidireccionalmente en el plásmido de expresión invertasa pSUC2T7M130RI. Una librería de expresión de clones de plásmido se genera en E. coli y se introduce posteriormente en la cepa suc2-deficiente invertasa de levadura. Los clones de señal atrapados representados en la librería de levadura se seleccionan mediante cultivo de 2 días en placas agar YPR. Trescientos treinta y tres clones se seleccionan aleatóriamente se mini preparan y se secuencian.

Análisis de secuencia: se utiliza FastX, pFam, Pileup, GrowTree y Sigcleave del paquete GCG Wisconsin, y Geneworks 2.5.1 para manipulación de secuencias de ADN, análisis de secuencias y búsqueda en base de datos. En la Figura 12, las clasificaciones de identidad para análisis "pileup" se determina de acuerdo con los siguiente valores: par 1x = 1; par 2x = 2; par 3x = 3; 3 de una clase = 4; 3 de una clase más par 1x = 5; 2x 3 de una clase = 6; 4 de una clase = 7; 4 de una clase más par 1x = 8; 5 de una clase = 9. El modulo Lasergene DNAstar Genequest se utiliza para delinear los límites intrón-exón del hGL50 contra el número de acceso # HS21 C098. Se desarrolla análisis adicional con el paquete SeqWeb Wisconsin GCG utilizando TFASTA, TBLASTN, ProfileScan. Se generan filogramas de distancia proporcional mediante el GrowTree basado en la distancia genética utilizando algoritmos de corrección Kimura. La salida gráfica se reformatea posteriormente para reflejar grupos familiares.

Amplificación rápida 3' de extremos cADN: se desarrolla el RACE3' utilizando cebadores (GL50) VL118 (CCCG
CAGTCTGCGCTCGCACC; SEQ ID NO:7), VL116 (GTCGACCCACCATGCAGCTAAAGTGTCCCTG; SEQ ID NO:8), (AB014553) VL141 (CGTGTACTGGATCAATAAGACGG; SEQ ID NO:9), VL142 (ACAACAGCCTGCTG
GACCAGGC; SEQ ID NO:10), (Poli A-oligo) VL054 (CCAGTGAGCAGAGTGACG; SEQ ID NO:11), VL055 (GAGGACTCGAGCTCAAGC; SEQ ID NO:12). Se enriquecen linfocitos de células sanguíneas periféricas de ratón (PBL) para linfocitos mediante centrifugación con densidad utilizando linfote M de acuerdo con el protocolo del fabricante. El PBL humano se aísla por centrifugación de densidad Ficoll-paque de muestras de leukopac humanas. El ARN total se extrae de los linfocitos como se describe adelante. Se logra la transcripción inversa utilizando el cebador VL053 (CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGCTTTTTTTTTTTT; SEQ ID NO:18), 5 \mug de ARN total y SuperScript RT (Gibco-BRL) de acuerdo con el protocolo del fabricante en reacciones de 20 \mul. Se utiliza 0.5-1.0 \mul de cADN RT-sintetizado por procedimiento RACE. Se desarrolla el RACE 3' de acuerdo con el método de Frohman, M. A. (1993) Métodos Emzymol. 218: 340-356.

Aislamiento de ARN y análisis: el ARN total se deriva de la células CCE ES, sacos de embriones/yemas Swiss Webster y linfocitos de sangre periférica C57B1/6 y se extraen utilizando RNAstat 60 (Tel-Test B, Friendswood TX) acompañado por la barrera de gel de fase-seguro (Eppendorf). El ARN se fracciona utilizando el sistema Northern Max (Ambion) y se transfiere a un ZetaProbe GT (BioRad) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se compran múltiples paneles de ARN de tejido (Clontech) y se utilizan de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los solutos se hibridan a fragmentos de ADN radioetiquetados que abarcan los oligonucleótidos 984-1340 del clon mGL50-2 (357 bp; SEQ ID NO: 3), que corresponde a la región no traducida 3', mientras que los fragmentos que corresponden a la secuencia de codificación del mGL50 se utilizan para detectar las transcripciones mGL50-1 y mGL50-2. Se desarrollan hibridaciones a 65ºC con Express Hyb (Clontech) durante la noche y posteriormente lavado con 0.1X SSC y 1% SDS en temperaturas de hibridación hasta que se alcanza una señal de índice de ruido adecuada. Los solutos se exponen a placas de fosfoimagen y película auto radiográfica para formación de imágenes.

Análisis de expresión de gen: para análisis de adecuada RT-PCR, primero se desarrolla síntesis de cADN de hebra como se describió anteriormente para los procedimientos RACE, seguido por reacciones de 25 \mul de amplificación por duplicado (utilizando Advantage Taq, Clontech) con los cebadores RLEE 001 y RLEE005 para mGL50-1 y los cebadores RLEE 001 y RLEE003 para mGL50-2. Los cebadores GAPDH-F y GAPDH-R se utilizan como controles de amplificación positivos. Los oligonucleótidos GAPDH-F (TGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGC; SEQ ID NO:19); GAPDH-R (CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC (SEQ ID NO:20); RLEE001 (CATCACTAGCATTAGC
CAGGC; SEQ ID NO:13); RLEE003 (TGATGTTGTGAAGCTGAGTGC; SEQ ID NO:14); RLEE005 (TCATGAGC
ATCGAGCATCG; SEQ ID NO:15); VL142 (ACAACAGCCTGCTGGACCAGGC; SEQ ID NO:10); VL162B (TCAC
GAGAGCAGAAGGAGCAGGTTCC; SEQ ID NO:16); y VL163B (GGGCCCCCCAGAACCTGCTGCTTCC; SEQ ID NO:17) se diseñan para la amplificación PCR de las regiones de dominio extracelular del los clones mGL50-1, GL50-RACE, AB014553 cADN y AB014553-RACE. Los paneles de cADN humano y de ratón derivados de poli A+ ARN que abarcan tejidos linfoides y no linfoides (Clontech) se utilizan como una fuente para análisis PCR. Las condiciones de ciclización son 5 min 95ºC de etapa de desnaturalización seguido por 35 ciclos de 1 min a 95ºC, 1 min a 60ºC, y 1 min a 72ºC. La reacción se termina luego de una extensión de 10 min 72ºC: las condiciones de ciclización para mGL50 y mGL50-2 PCR son de 95ºC durante 1 min, 60ºC durante 1 min, y 72ºC durante 2 min durante 33 ciclos, mientras que se desarrolla GAPDH PCR utilizando 30 ciclos.

Para el análisis Northern blot, los solutos de ADN comercialmente preparados (Clontech) se hibridan para fragmentos de ADN radioetiquetados que abarcan los nucleótidos 1065-1588 de mGL50-1 (494 bp; SEQ ID NO:1), o los nucleótidos 984-1340 del clon mGL50-2 (357 bp; SEQ ID NO: 3).

Citometría de flujo: se transfectan células COS con mGL50-1 o DAP-12 cADN en vectores de expresión
pcADN3.1-CTGFP. La transfección se logra utilizando el reactivo de tranfección lipofectamina (Life Technologies) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Las Células se cosechan 3 días después de transfección. Se utiliza 10% de suero de conejo para bloquear la unión no específica a las células. Las Células se tiñen a temperatura ambiente durante 20 minutos con 200 ng de proteínas de fusión en 100 \mul de PBS 2% FCS. Las Células se lavan y se desarrolla un teñido secundario con IgG anti ratón de cabra ligado con P. Las Células se tiñen con yoduro de propidio inmediatamente antes de citometría de flujo. Se desarrolla control por transfección COS positiva con hCTLA4 cADN seguido por identificación de células teñidas positivamente con anti CTLA4 ligado con PE.

Las suspensiones celulares para análisis citométrico se aíslan de esplenocitos de Balb/c (\approx3 meses de edad) y se lavan una vez con DMEM, 10% de suero fetal de becerro inactivado por calor (JR BioScience), 2 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina (Irvine Scientific, Santa Ana, CA), 20 \muM 2-betamercaptoetanol (Sigma Co., St. Louis, MO), piruvato de sodio MEM, y aminoácidos no esenciales MEM (Life Technologies, Rockville, MD). Los glóbulos rojos se lisan con amortiguador de lisado ACT y se lavan una vez. Los esplenocitos (\sim1 X 10^{7}células/ml/pozo) de ratones Balb/c se cultivan con 25 \mug/ml LPS (Sigma) o 10 ng/ml PMA, 1 \mug/ml de ionomicina. Las Células se tiñen con anticuerpos etiquetados FITC - (BD-Pharmingen) y reactivo mICOS-mIgG2am, seguido por análisis citométrico de flujo utilizando el paquete de software FACalibur y CellQuest (BD).

La separación celular se desarrolla utilizando selección magnética de micro glóbulo anti-FITC (Miltenyi Biotec) seguido por determinación de citometría de flujo de enriquecimiento de células T.

Proteínas de fusión Ig: Las proteínas de fusión de IgG2a con mICOS, hICOS, mGL50-1, y hGL50 se construyen para uso en los siguientes ejemplos. La notación IgG2am indica que el dominio IgG2a se muta para reducir la función efectora (como en Steurer, W. et al. (1995) J. Inmunol. 155: 1165-74). Las secuencias de aminoácido y nucleótido de hICOS-mlgG2am se presentan en la Figura 26 y se establecen como la SEQ ID NOs: 23 y 24, respectivamente. Las secuencias de aminoácido y nucleótido de mICOS-mIgG2am se presentan en la Figura 27 y se establecen como SEQ ID NOs: 25 y 26, respectivamente. Las secuencias de aminoácido y nucleótido de hGL50-mlgG2am se presentan en Figura 28 y se establecen como SEQ ID NOs: 27 y 28, respectivamente. Las secuencias de aminoácido y nucleótido de mGL150-mIgG2am se presentan en Figura 29 y se establecen como SEQ ID NOs: 29 y 30, respectivamente.

Ejemplo 1 Aislamiento de moléculas mGL50-1

El cADN que codifica las proteínas secretadas derivadas de ARN de nodos linfáticos de ratón tratados con IL-12 se colocan bajo selección genética para secuencias de señal al utilizar el método de trampa de secuencia de señal para Saccharomyces cerevisiae (Jacobs et al. De un total de 333 clones de cADN: invertasa aislados y secuenciados, 1 clon de cADN parcial con identidad de secuencia limitada con B7-1 se identifica y denomina mGL50-1 (Figura 1, SEQ ID NO: 1). El aislamiento del cADN de longitud completa mediado por RecA de una librería de cADN de timo fetal de ratón resulta en la generación de 4 clones de cADN adicionales que contienen 3' regiones no traducidas así como también traslapar el clon de secuencia atrapado de señal parcial.

La secuencia mGL50-1 de nucleótido 2718 codifica una proteína de aminoácido 322 con una masa predicha de 36 kDa. La gráfica de hidropatía del cuadro de lectura abierto predice una estructura que corresponde a una secuencia líder (de aproximadamente 1-46 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; codificado por los nucleótidos 67 a 195 de la SEQ ID NO: 1), un dominio extra celular (de aproximadamente 47-279 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; codificados por los nucleótidos 196 a 904 de la SEQ ID NO: 1), una región de transmembrana hidrófoba (de aproximadamente aminoácidos 280-298 de la SEQ ID NO: 2; codifica por aproximadamente 905 a 961 nucleótidos de la SEQ ID NO: 1) y un dominio citoplásmico potencial intracelular (de aproximadamente 299-322 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; codificados por aproximadamente 962 a 1032 nucleótidos de la SEQ ID NO: 1). El clivaje del péptido de señal se predice en la posición 46 en la secuencia de aminoácidos. El análisis del mGL50-1 por el programa de predicción de motivo de proteína Pfam sugiere la similitud estructural con el dominio Ig en el dominio citoplásmico de la proteína. Al mantener una estructura similar a Ig, las 4 cisteínas se encuentran en el dominio extra celular, lo que permite la posibilidad de unión intramolecular y conformación estructural distinta que corresponde a un dominio similar a IgV y un dominio similar a IgC, con base en el dominio de delineación. La comparación de la secuencia FastX en la que las proteínas traducidas se buscan a través de la base de datos GenBank produce un número de clones de cADN identificados con las similitudes de secuencia que incluyen AB014553, B7-1, B7-2, y Y08823. Los dominios que corresponden en los polipéptidos en la familia B7 se muestran en la Figura 12.

Ejemplo 2 Aislamiento de una forma Alternativamente empalmada de GL50

Para determinar el alcance de la heterogeneidad de transcripción, el RACE3' se desarrolla para aislar las variantes de empalme del GL50-1 de murino. Utilizando los cebadores de oligonucleótido5' anidados específicos que corresponden a las secuencias corriente arriba y que incluyen el sitio de iniciación del mGL50-1, los productos PCR amplificados se generan a partir del cADNs derivado de PBL de ratón. Luego de la hibridación para oligonucleótidos radio etiquetados internos para la región de codificación mGL50-1 se detectan las señales de hibridación claras, la posterior clonación de los productos de hibridación PCR positivos seguido por análisis de secuencia revelan secuencias RACE en las que ninguno es idéntico a la secuencia mGL50-1 consensus derivado de librería de timo fetal de ratón. Dos conjuntos de productos PCR, representados por múltiples clones con poliadenilación extensiva de longitudes diferentes, se encuentra que codifican una forma alternativamente empalmada del GL50. Un producto representativo, un producto 1759 bp, denomino mGL50- 2, codifica un residuo de polipéptido 347 en longitud con una masa molecular predicha de 39 kDa (Figura 2, Figura 15).

Se presenta una alineación del mGL50-1 y mGL50-2 en la Figura 3. La alineación de las secuencias de mGL50-1 y mGL50-2 demuestra la identidad completa del nucleótido 67 (sitio de iniciación metionina/mGL50-2 RACE) para el nucleótido 1027 del cADN, con la excepción de dos nucleótidos encontrados en los múltiples productos mGL50-2 (nucleótidos 531 y 710, que conducen a un residuo arginina a histidina en 237 de la secuencia de aminoácido predicha (Figura 3)). Estas dos discrepancias de nucleótido se deben más probablemente a diferencias de cepa entre los ratones utilizados como material de partida de ARN, en razón a que múltiples PCR separados producen disparidades idénticas codificadas. Las secuencias corrientes debajo de la posición 1027 del mGL50-1 y la posición 961 del mGL50-2 son divergentes entre las dos moléculas (Figura 3). Las secuencias mGL50-1 y mGL50-2 contienen señal de poliadenilación AATAAA consensus corriente arriba la cola poli-A (13 bp para mGL50-2,16 bp para mGL50-1). Como un resultado de las secuencia 3' alternativas que codifican el terminal carboxi, el mGL50-2 le falta los 2 aminoácidos finales del mGL50-1 pero incorporan 27 aminoácidos novedosos adicionales en el dominio citoplásmico. La secuencia de aminoácido predicha del mGL50-2 indica presencia de tres residuos tirosina únicos, Y325, Y328, y Y333, en el terminal carboxi, en adición a los residuos tirosina Y299 y Y307 compartidos por las moléculas mGL50-1 y mGL50-2. La base de datos GenBank busca secuencias no cADN reveladas con similitud al dominio 3' de codificación divergente del producto mGL50-2, con la excepción de una secuencia repetitiva compleja (bases 1349-1554) también encontrada en numerosas secuencias geonómicas (por ejemplo, números de acceso AC005818, AC006508, y AF115517), así como también en mARN conocido (desmin de ratón: Z18892; y servivin de ratón: AF115517). No se encuentran tales secuencias repetitivas no traducidas en el mGL50-1.

Ejemplo 3 Identificación de un ortólogo humano de GL50

Después que se identifican los clones GL50 de murino, la búsqueda en la base de datos y las comparaciones posteriores sugieren que los clones de ratón mGL50-1 y mGL50-2 pueden tener homología con el cADN aislado de cerebro de humano, clon KIAA 0653 (número de acceso #AB014553; Ishikawa et al. (1998) ADN Res. 5: 169). El AB014553 se ha descrito como un cADN 4.3 kb localizado en el cromosoma 21, que codifica un proteína de aminoácido 558 putativa con una masa molecular de 60 kDa. En razón a que la longitud del cADN AB014553 y la proteína codificada son casi 2 veces mayor que el mGL50-1, esto no fue probablemente aquel AB014553 que es un ortólogo humano de las secuencias GL50 de ratón. Sin embargo, el análisis de los primeros 303 residuos de la secuencia de proteína AB014553 deducida indica similitud con mGL50-l, que excluye la región de péptido de señal del cADN.

En razón a que el AB014553 se deriva por fraccionamiento de tamaño de cADN grande, el AB014553 se considera que representa una transcripción variante que también existe como un producto de gen más pequeño. Para saber si un producto más pequeño existe, los análisis RACE 3' del PBL humano con oligonucleótidos (VL142 (ACAA
CAGCCTGCTGGACCAGGC; SEQ ID NO: 10) y VL141 (CGTGTACTGGATCAATAAGACGG; SEQ ID NO: 9)) que corresponden a los dominios extra celulares del AB014553 se desarrollan con homología de secuencia con GL50. Se aíslan cuatro productos RACE que codifican un cuadro de lectura abierto idéntico para el AB014553 a partir de 24 residuos de aminoácidos (partiendo del punto del cebador RACE) al residuo 123 (Figura 6). Del residuo 123 adelante, el producto AB014553 RACE diverge de la secuencia de cADN resultante en 88 nucleótidos alternativos con una región codificante 3' que codifica 9 aminoácidos, codón de terminación, y un dominio no traducido corto. Esta región 3' alterna resulta en un codón de terminación prematuro en el clon AB014553 RACE comparado con el cADN AB014553 (Figura 7). La longitud total predicha del polipéptido deducido codificado por este producto transcrito alternativamente, después de surgir como la secuencia 5' del cADN AB014553 es de 309 aminoácidos, consistente con un ortólogo de proteína humana para secuencias de proteína GL50 de ratón, referidas como hGL50 (Figura 8).

Ejemplo 4 Alienación pollos B7-1

Luego de la alineación con un pollo B7-1 caracterizado previamente (No. de Acceso Y08823), emerge un patrón de secuencias de dominio citoplásmico conservadas entre estas moléculas. Dentro de la región intracelular, las secuencias de proteína hGL50 exhiben 34% de identidad (9/26 residuos alineados) con mGL50-1, mientras que los pollos Y08823 exhiben 57% de identidad (8/14 residuos alineados) con GL50 o GL50-2 de ratón o humano que resultan en un motivo consensus de (R) (R) (R) [XX] (Q) (H) (X/-) SY (T) (G) (P) (SEQ ID NO: 21), en donde los aminoácidos en paréntesis están disponibles entre los tres genes, los aminoácidos en paréntesis se comparten entre dos de los tres genes, y los aminoácidos sin paréntesis o llaves se comparten por todos los tres genes. Una búsqueda en la base de datos fastA para las proteínas con homología para su motivo produce dos entradas de ratón, Veli-2 (No. de Acceso. AF087694) y MALS-2, un homólogo C. elegans LIN-7 (No. de Acceso. AF173082), que codifica las secuencias idénticas con el motivo RRRQQHHSYT (SEQ ID NO: 22). Este dominio único se ubica en el terminal carboxi del Veli-2 pero no está presente en los isómeros Veli-1 o Veli-3, y se extiende más allá del área de homología con C. elegans LIN-7.

Ejemplo 5 Expresión de moléculas GL50

Reacciones RT-PCR específicas mGL50-1 y mGL50-2 en paneles de cADN comerciales resulta en abundantes productos PCR generados en corazón, bazo, pulmón, hígado, músculos esqueléticos, riñón, testículos, de embriones de 7-15 días y PBL. Se detecta producto insignificante con muestras de cerebro de transcripciones mientras que los niveles bajos de producto se detectan en muestras de testículos de mGL50-2 (Figura 4). Mediante análisis Northern blot de solutos de ARN comerciales que utilizan sondas específicas para el dominio extra celular compartido de mGL50-1 y mGL50- 2 o las regiones 3' no traducidas del mGL50-2 o mGL50-1, la hibridación diferencial se encuentra entre las dos moléculas. Mientras ambas sonadas de dominio extra celular y la sonda específica mGL50-1 hibridan un mensaje \approx2. 7 kb claramente detectable en corazón, cerebro, bazo, pulmón, hígado, músculo del esqueleto, riñón y muestras de testículos (idénticos a los patrones previamente vistos en solutos específicos para mGL50-1 (Ling et al. (2000) J. Inmunol. 164: 1653-7), la sonda específica mGL50-2 hibrida a una transcripción de 1.7 kb detectada solo en muestras corazón, bazo y riñón, que sugieren que las transcripciones mGL50-2 se transcriben concurrentemente como un subconjunto limitado de tejidos con la más alta expresión mGL50-1 (Figura 5). En los solutos poli A+ AR, la hibridación utilizando la sonda específica UTR 3' mGL50-2 se detecta claramente en muestras que representan las células ES no diferenciadas, cuerpos de embriones de 10 días, saco de yema embriónica de 12.5 días, e hígado fetal de 15 días. En contraste, la hibridación utilizando la sonda de secuencia de codificación de cADN mGL50-1 revela claramente la transcripción en todas las muestras examinadas.

Para evaluar la distribución de tejido de los clones cADN AB014553 cADN y RACE AB014553, se desarrollan análisis southern blot/RT-PCR bajo condiciones similares como para las secuencias GL50 descritas anteriormente. Utilizando los cebadores de oligonucleótidos específicos para la amplificación del cADN AB014553 publicado (VL142 (ACAACAGCCTGCTGGACCAGGC; SEQ ID NO: 10) y VL163B (GGGCCCCCCAGAACCTGCTGCTTCC; SEQ ID NO: 17)), el PCR resulta en la ausencia completa de cualquier señal de cADN AB014553 detectable para todas las muestras probadas (Figura 10). Las posibles explicaciones para la falta de productos RT-PCR que representan las secuencias de cADN AB014553 publicadas puede ser el uso de oligonucleótidos no optimizados, baja abundancia extrema de la trascripción objetivo, o ausencia actual de esta forma del producto. Las condiciones RT-PCR específicas para el AB014553 RACE utilizando cebadores de oligonucleótido VL142 y VL162B resultan en la detección de un producto de amplificación de 350 bp en riñón, pulmón, ovario, hígado fetal, y leucocito, con el más alto nivel de productos amplificados detectados en hígado fetal. Sorprendentemente, no se detecta virtualmente ninguna señal en el bazo, pulmón, timo, o nodo estos resultados son consistentes con el reporte publicado de la distribución de transcripción AB014553 (Ishikawa et al. (1998) ADN Res. 5: 169) en una supervisión más pequeña de un panel de cADN de tejido, pero no complementa los patrones de distribución de tejido observados para las moléculas GL50.

A diferencia de los clones mGL50-1 y mGL50-2 en los cuales las regiones no traducidas 3' divergentes y largas están presentes, los productos RACE AB014553 contienen solo 88 bp de secuencia que divergen de aquella del cADN AB014553. A pesar de esto, no es posible diseñar sondas de nucleótido de actividad específica suficiente para la detección del producto RACE. Utilizando las sondas de región de codificación para las hibridaciones northern hGL50 se desarrollan en solutos de ARN de tejido múltiples humanos comerciales para evaluar la distribución de transcripción (Figura 11). Los resultados indican la presencia de un número de transcripciones encontradas en todo los tejidos con tamaño molecular aproximado de 2.4 kg, 3. 0 kb, 7.0 kb, con los niveles más altos de señal presentes en muestras de cerebro, corazón, riñón e hígado. Las señales de hibridación se detectan en colon y timo. Una transcripción adicional de 8.5 kb se detecta en un subconjunto del panel, que incluye timo, bazo, riñón, hígado, pulmón y PBL mientras que se detecta una transcripción de 3.8 kb en muestra de pulmón y PBL. Solo se detecta una transcripción única de 1.1 kb en muestras de PBL y corresponde al tamaño predicho del hGL50 si las secuencias 5' y 3' no traducidas se incluye. La determinación de otras transcripciones menores es difícil debido a los límites del rango de sensibilidad del soluto. Ninguna de las transcripciones obvias se correlaciona con el cADN AB014553 de 4.3 kb publicado, lo que sugiere que en esta secuencia puede no existir en la naturaleza o se puede expresar en niveles más bajos que los límites detectables. La comparación entre los solutos hGL50 y el monitoreo hGL50 RT-PCR comparten la característica común de tener la mayor señal en los tejidos de riñón y menos señal en tejidos relacionados con linfocitos tal como el timo, bazo y PBL.

Ejemplo 6 Relación de los polipéptidos GL50 con otros Polipéptidos

Para determinar el alcance de la relación entre el mGL50-1, hGL50 y B7-1 y B7-2 de ratón, se desarrollan alineaciones de secuencia de proteína. A partir del análisis Pileup (Figura 12), 18 ubicaciones de aminoácidos alineados idénticamente entre todas las seis moléculas dentro del dominio extra celular. De las 32 posiciones que definen los pliegues similares a IgV y similares a IgC predichos de la molécula B7, 13 son idénticos conservados entre todas las seis moléculas, en su mayoría notablemente las cuatros cisteínas que permiten el pliegue intra molecular de los dominios. Otras áreas de conservación de secuencias significativas también se ven en el dominio extra celular, pero de manera interesante las identidades de las secuencias hGL50/mGL50 en ciertas ubicaciones alineadas más cercanamente con B7-1 o B7-2 (clasificación de identidad de 8). Por ejemplo, el residuo valina que corresponde a la posición 77 del mGL50-1 se comparte por el hGL50, y las secuencias B7-2 de murino y humano, pero no la B7-1. Así mismo, la tirosina en la posición 78 del mGL50-1 se conserva en ubicaciones correspondientes en hGL50 y B7-1 humano y de murino, pero no B7-2. De las 16 posiciones con clasificaciones de identidad de las posiciones 8,5 se comparten por el mGL50-l/hGL50 y B7-1, se comparten 4 posiciones entre el mGL50-1, hGL50 y B7-2, y las 6 posiciones se comparten entre el B7-1 y B7-2.

Basados en la estructura de péptidos, estos resultados sugieren que las secuencias mGL50/hGL50 ocupan un espacio filogenético paralelo a la Familia B7 de proteínas. El análisis de filogenia Molecular (GrowTree) que mide la distancia genética en términos de sustituciones por 100 aminoácidos resulta en un dendrograma (Figura 13) con agrupamiento independiente del mGL50/hGL50 (85), m/hB7-2 (68) y m/hB7-1 (88). Como un grupo de salida, se utiliza el mmu67065_1 (butirofilina de ratón). El clon de pollo Y08823 también se encuentra que está más alineado con las secuencias GL50/AB014553 (\approx140) que las secuencias (215-320, que indican que estas secuencias comprenden una subfamilia distinta de proteínas. Las Distancias entre las ramificaciones GL50/AB014553, B7-2 y B7-1 son grandes (216-284), lo que sugiere que los números grandes de sustituciones han ocurrido entre estas moléculas en razón de la incepción del linaje de roedor y humano.

El CTLA4 humano y de ratón (ver por ejemplo, Dariavach, P. et al. (1988) Eur. J. Immune. 18: 1901; Número de Acceso GenBank L15006; Patente Estadounidense 5,434, 131) e ICOS (Hutloff et al. (1999) Nature 397: 263; WO 98/38216) también se analizan para relaciones filogenéticos utilizando los mismos parámetros. Las distancias genéticas revelan un patrón que es distinto a aquel visto para las proteínas similares a B7. Como se indica en reportes anteriores, la distancia genética entre el ICOS y CD28 humano y de ratón (176-2570) es más cercano que aquel del CTLA4 (261-405). Por comparación, la distancia genética entre el CD28 y CTLA4 es mucho menor (143-1670), que indica que la relación estructural entre los miembros de la familia de receptor no son paralelos a aquellos de la familia de ligandos.

Ejemplo 7 Demostración de unión de GL50 con ICOS

Para determinar si el GL50 es un ligando para ICOS, CTLA4, o CD28 de murino, los estudios de unión de transfección se desarrollan con vectores de expresión mGL50-1 (Figura 14). El cADN de control negativo DAP-12 humano o mGL50-1 se transfecta en células COS seguido por teñido con proteínas de fusión ICOS-Ig, CD28-Ig o CTLA-4-Ig o Ig de murino normal. Las células COS se tiñen dos días después de transfección con 5 \mug/ml de proteína de fusión, seguido por anticuerpo PE etiquetado anti ratón de cabra. Mediante citometría de flujo, la unión de células COS transfectadas GL50 se detecta solo por el reactivo ICOS-Ig (15%), mientras se detecta la unión insignificante para el CD28-Ig, CTLA4-Ig o Ig de ratón normal utilizado como un reactivo de teñido negativo. Ninguna unión de cualquier proteína de fusión se detecta para las transfecciones de cADn DAP-12. Estos resultados sugieren que el GL50 es un ligando para ICOS- Ig.

Aunque no se encuentra bajo las condiciones de unión específicas aquí, puede ser que el GL50 también sea capaz de señalización a través del CD28 o CTLA-4 dado los datos publicados que muestran la actividad de unión más débil de las moléculas B7 al CD28 que el CTLA-4 (Greenfield, E. A. et al. (1998) Crit. Rev. Inmunol. 18: 389) en ensayos basados en células.

Ejemplo 8 Transcripciones mGL50-2 codifican proteínas de superficie celular funcionales

Para demostrar que las transcripciones mGL50-2 codifican proteínas de superficie celular funcional, se utilizan vectores que expresan las regiones de codificación mGL50 bajo el control transcripcional del promotor alfa EF- 1 para transfectar células COS. Mediante la citometría de flujo, se encuentra que el mICOS- mIgG2am y hICOS-mIgG2am se unen a células mGL50-1 y mGL50-2 transfectadas (9-14%) mientras que se observa unión insignificante con mCTLA4- mIgG2am (< 1%), que indica que los dominios codificados por los residuos adicionales en la cola carboxi alterna encontrados en el mGL50-2 no afecta la movilización de superficie de esta proteína (Figura 17). Es también notable que el hICOS-mIgG2am una ambas moléculas, lo que sugiere que los receptores ICOS, similares a los receptores CTLA4 y CD28, retienen la capacidad de unir ligandos cuando se ensayan contra objetivos a través de los límites de las especies primates/roedores.

Se examinan otras líneas celulares de ratón para la presencia de ligando ICOS de superficie. Las células WEHI231 se han mostrado previamente por tener expresión de superficie de B7-1 y B7-2, mientras que las células ES se han mostrado por exhibir solo B7-1. El teñido mCTLA4-mIgG2am de las células WEHI 231 son claramente detectables utilizando 8 ng/ml de reactivo, mientras que el teñido mICOS-mIgG2am es mínimamente detectable en niveles que parte de 1 \mug/ml.

Estos resultados sugieren que la afinidad de unión del reactivo mCTLA4-mIgG2am a las Moléculas B7 es al menos 100 veces mayor que el reactivo mICOS-mIgG2am que se une al GL50 en las células WEHI, similar a la baja afinidad de unión medida entre el CD28-Ig y las B7. En la presencia de los anticuerpos de bloqueo, la unión mCTLA4-mIgG2am al WEHI 231 se abroga totalmente, mientras que no se observa ningún efecto en la unión mICOS-mIgG2am a las células, que conforman las potencias WEHI 231 B7-1 o B7-2 específicas de unión con mICOS-mIgG2am (Figura 18). Para corroborar la evidencia del análisis de lotus de ARN que demuestran la presencia de GL50 en células representativas de el ambiente embriónico anterior (ver anterior), las células CCE ES no diferenciadas se analizan por teñido directo con anticuerpos para B7-1 y teñido indirecto con proteína de fusión mICOS-mIgG2am. Las células ES no diferenciadas reñidas con anti-B7-1 (Figura 19) revelan un cambio de fluorescencia de 1-log sobre el fondo, consistente con observaciones previas (Ling, V. et al. (1998) Exp. Cell. Res. 241: 55-65), y un cambio de fluorescencia de mitad-log sobre el fondo con teñido mICOS-mIgG2am, que demuestra la exhibición de superficie simultanea de las moléculas tipo GL50 y B7 en un sistema que refleja la masa celular interna no diferenciada de embriones pre implantación.

Ejemplo 9 Expresión de GL50 en subpoblaciones de esplenocitos

Análisis fenotípico de la mayoría de tipos celulares de esplenocitos que exhiben proteínas de superficie GL50 revelan que la unión mICOS-mIg es más fácilmente detectable en células B CD19+ más fenotípicas, aunque es evidente que otros tipos celulares de esplenocitos exhiben teñido ICOS-Ig (ver Figura 30). Para identificar adicionalmente otras células aisladas frescas que exhiben GL50, se comparan esplenocitos Balb/C tipo silvestre con esplenocitos RAG1-/- que les falta células B y Células T maduras. Los resultados se presentan la Figura 20 y la Tabla 3.

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Como se espera, los esplenocitos de Balb/C revelan altos niveles de unión mICOS-mIgG2am (Figuras 20A y B) para células B fenotípicas (CD19, B220, CD40 >94%), mientras que niveles inferiores se encuentran Células T fenotípicas y subconjuntos de células T (CD3+, CD4+, y CD8+; < 10%), macrófagos (CD 11 b, 26%), células dendríticas (CD 11 c, 43%) y células NK (pan-NK, 20%). La unión mICOS-mIgG2am también se detecta en marcadores linfoides más generales CD24 y células clase II (94%). El análisis Northern blot (utilizando una sonda específica mGL50-1) demuestra que las transcripciones GL50 se expresan en esplenocitos de RAG1-/-ratón. Esta sugiere que en la ausencia de células T o B, el GL50 se expresa todavía en otras subpoblaciones de esplenocitos. Consistente con estas observaciones, el análisis de RAG 1-/- esplenocitos (Figura 20B) demuestra que ellos son CD3-, CD8-, CD19-, y CD40-, y que el CD11 b+ restante (35%) y CD11 c+ (55%) son fácilmente contra teñidas con mICOS-mIgG2am. Bajos niveles (<5%) de teñido ICOS-Ig también son evidentes en células B220+, panNK+, y CD69+. No se entiende actualmente porque existe una disparidad en niveles de teñido mICOS-mIg entre estos tres marcadores en RAG1-/- esplenocitos, cuando se comparan con niveles mayores detectados en esplenocitos Balb/c. El teñido de células CD4+ (45%) y CD24+ (28%) mICOS-mIgG también son evidentes en RAG1-/- esplenocitos a pesar de la ausencia de teñido para otros Marcadores de células T. El teñido CD4+ se ha reportado previamente en células dendríticas (Aicher, A. et al. (2000) J Inmunol. 164: 4689-96), y este se soportó por la presencia de una población celular positiva doble CD4+, CD 11 c+ en estos ratones (Figura 20C). La presencia de transcripciones GL50 en conjunto con la unión mICOS-mIgG de macrófago fenotípico y de subconjuntos de células dendríticas en RAG1-/- esplenocitos verifica la presencia del ligando-ICOS en antígeno profesional que presenta células que pueden ser señalización potenciada a través del ICOS in vivo.

Ejemplo 10 Expresión de variante de empalme GL50 mARN en subpoblaciones de esplenocitos y células embriónicas

En razón que el ligando ICOS parece existir como al menos dos variantes de empalme, se desarrollan experimentos para evaluar semi cuantitativamente la presencia de las transcripciones GL50-1 y GL50-2 en poblaciones celulares de esplenocitos. Los esplenocitos de Balb/C cultivados en la presencia de LPS o ConA se encuentran que sobre regulan el ligando-COS en todo los esplenocitos examinados (Figura 20). Para determinar si la estimulación preferencial de estas células origina sobre regulación diferencial de las transcripciones GL50-1 o GL50-2, se detectan las transcripciones GL50-1 y GL50-2 mediante RT-PCR utilizando iniciadores de oligonucleótido de transcripción específico y conjuntos de sondas de hibridación. Los resultados se presentan en Tabla 4.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Se desarrollan amplificaciones por duplicado seguido por detección auto radiográfica de muestras GL50 de solutos.

- representa la ausencia de señal en muestras por duplicado.

+/- representa la presencia de señal en uno de las muestras por duplicado.

+ representa la presencia de señal dentro de ambos miembros de muestras por duplicado.

\text{++} representa la saturación radiográfica de la señal con muestras por duplicado.

(+) representa la detección visual de productos GAPDH amplificados mediante teñido de bromuro de etidio.

Subconjuntos de células Balb/C CD4+, CD8+ y CD19+ y subconjuntos de células RAG1-/-CD11 b+ y CD 11 c+ se enriquecen hasta >90% de pureza mediante separación de glóbulos. Los análisis RT- PCR por duplicado de las muestras de ARN de cantidad normalizada revelan transcripciones GL50-1 y GL50-2 para estar presentes en células CD4+ T no tratadas y células B CD19+, consistente con los resultados de los análisis de citometría de flujo. Sin embargo, ni la transcripción GL50-1 ni GL50-2 se amplifican en las células T CD8+, a pesar de que la detección de proteína de superficie por FACS y el enriquecimiento de células positivas de ICOS-ligando. Es posible que la expresión CD8 GL50 esté por debajo del umbral de detectabilidad por RT-PCR, o que el ligando- ICOS CD8+ sea aún otra variante del GL50 no objetivada para detección mediante este ensayo. También, uno puede destacar la posibilidad de que la forma del ligando ICOS aparezca en las células CD8+ puede no ser GL50-1 o GL50-2, como se describe aquí, o que el ligando CD8+ ICOS pueda originar también como una proteína soluble y llegar a ser transferida a este tipo celular. La activación LPS conduce a un perfil similar a aquel visto para las células de control, con la excepción que los bajos niveles de GL50-1 se detectan en las muestras en CD8+, lo que sugiere que la estimulación LPS de las Células B puede sobre regular indirectamente la expresión de esta forma de ligando ICOS en Células T. La estimulación ConA de esplenocitos resulta en la amplificación de transcripciones GL50-1 a través de todas las muestras con una reducción de producto en las células CD19+. Las transcripciones GL50-2 se inducen en muestras CD8+ y no se detectan en las muestras CD 19+. La reducción de producto amplificado en GL50-1 y GL50-2 en células CD19+ sugiere una regulación de la transcripción de células B luego de la exposición a ConA. En RAG1-/- esplenocitos, el GL50-1 y GL50-2 se detecta en células positivas CD11 b+ y CD 11 c+, mientras que el F5M dendrítico y las células WEHI231 exhiben transcripciones GL50-1. Bajos niveles de GL50-2 se detectan en WEHI 231 y células F5M de LPS activo, mientras que no se detecta producto amplificado en las células F5M no inducidas. En las muestras que representan tejidos embriónicos, GL50-1 y GL50-2 se detectan en todas las muestras, con niveles abundantes de variantes de empalme presentes en células DO ES. Altos niveles de GL50-1 también se detectan en muestras de embrión de 12.5 días y de seco de yema de 11.5 días. Estos resultados se correlacionan con el grado de hibridación de transcripción mostrado por análisis de transferencia de ARN (ver anterior).

Ejemplo 11 La molécula similar a GL50 -de pollo Y08823 no se une al ICOS

Muy recientemente, la estructura cristal de B7-1 se redisuelve en el nivel tres ángstrom. Que revela una estructura comprendida de homodímeros simétricos rotacionalmente paralelos dos veces con residuos cargados en el dominio de terminal amino de B7-1 responsable para interacciones directas con CD28/CTLA4. Las secuencias de proteína GL50, B7-1, y B7-2 de ratón y humano exhiben 19-27% de identidad de secuencia (Tabla 5) lo que sugiere que ellos pueden también compartir similitudes estructurales.

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El análisis previo del Y08823 sugiere que las hebras beta que forman las hojas beta AGFCC'C'' no enroscadas y DEB dentro del dominio terminal amino se predicen por estar conservadas entre Y08823 y B7-1 (Ikemizu, S. et al. (2000) Immunity 12: 51-60). De manera interesante, el más alto grado de conservación de estructura secundaria predicha entre las secuencias GL50 y Y08823 también está dentro de las regiones que abarcan las hojas beta DEB del dominio amino terminal correspondiente. Las predicciones basadas en estas homologías estructurales sugieren que las identidades de secuencia en esta región pueden suministrar contactos electrostáticos inter dominio y conservar la hidropaticidad dentro del núcleo inter dominio, resultando en una estructura molecular similar compartida por las moléculas GL50 y B7 (Figura 16). Con base en estas observaciones, se evalúa el Y08823 de pollo para la capacidad de unir los receptores ICOS. Las Secuencias que representan el péptido Y08823 maduro se obtienen por RT-PCR y se subclonan en un vector de expresión, que luego de transfección de las células COS, produce una proteína de superficie funcional. Se encuentra que las células Y08823 transfectadas se une al CTLA4-Ig pero no al hICOS-mIgG2am ni al mICOS-mIgG2am (Figura 17). Aunque no se puede asegurar que la unión del Y08823 al ICOS ocurra en niveles por debajo de la detección, con base en las condiciones de ensayo utilizadas aquí, no es probable que la proteína similar a GL50 Y08823 pueda funcionar de manera cruzada como un ligando para los receptores ICOS de ratón o humanos.

La similitud genética y estructural sugiere que las proteínas tipo B7/GL50 se conservan a través de límites filogénicos extremos, y está implícito en esta interpretación que las rutas mecánicas que utilizan estas proteínas también se comparten. La evidencia de que estas proteínas tienen función similar en la señalización de células T surge la pregunta del número absoluto y los orígenes de los ligandos coestimuladores, sus receptores de cognato, y las variantes de empalme derivadas que existen. Otras proteínas que se ajustan en la estructura de la súper familia B7 Ig incluyen MOG y butirofilin, pero estas proteínas no se han determinado por participar como ligandos en ninguna ruta coestimuladora (Henry, J. et al. (1999) Inmunol. Today 20: 285-8). Con la disponibilidad de secuencia del cromosoma 21 (Hattori, M. et al. (2000) Nature 405: 311-9), la organización genómica del ligando ICOS humano se determina, indicando la presencia de al menos 2 variantes de empalme en la forma de hGL50 (Ling, V. et al. (2000) J Inmunol. 164: 1653-7) y el clon KIAA 0653 (No. de Acceso Genbank, AB014453). Entre los miembros de los genes similares a B7, la estructura genómica del B7-1, B7-2, butirofilin, y hGL50 se han reportado. Aunque los números absolutos de los exones que comprenden estos genes varía de 5 a 12, estos genes comparten estructura, en que los distintos exones codifican los dos dominios extra celulares similares a Ig, un exón codifica el dominio de transmembrana, y múltiples exones codifican el dominio citoplásmico (por ejemplo, dos exones para hGL50, dos exones para B7-2 (Jellis, C. E. et al. (1995) Inmuno genetics 42: 85-9; Borriello, F. et al. (1995) J Inmunol. 155: 5490-7), uno a dos exones para B7-1 (Borriello, F. et al. (1994) J Inmunol. 153: 5038-48), y tres exones para butirofilin (Ogg, S. L. et al. (1996) Mamm. Genome 7: 900-5)). Para el KIAA0653, la unión de empalme entre exones que codifican los dominios citoplásmicos 1 y 2 no se utiliza, resultando en una lectura de 2.9 kb en un entrón putativo 6. Luego de la alineación del, KIAA0653 con el clon HS21C098 del cromosoma 21 BA, no se encuentra que el dominio citoplásmico 3' alternativo del KIAA0653 esté en acuerdo: se encuentran 8 discrepancias de secuencia, comprendidas en 7 desfases y una eliminación de 17 biopolímeros. En contraste, la alineación de la secuencia exón del GL50 humano para HS21 C098 no revela disimilitudes de secuencia para y que incluyen el sitio de poliadenilación. Los ejemplos establecidos anteriormente muestran que GL50 humano, mGL50-1, y la variante mGL50-2 muestran alguna identidad de secuencia de aminoácido cercana al sitio de empalme para los dominios citoplásmicos 1 y 2 (mGL50-1 residuos 316-318: E-L- T; Figura 16). El punto compartido de la variación de empalme entre el hGL50/AB014553 y entre el mGL50-1/mGL50-2 sugiere el potencial de un mecanismo conservado que permite o promueve el empalme alternativo del dominio citoplásmico 2, quizás para ofrecer señalización alterna a través de la adición combinatoria de dominios funcionales alternos. La observación que el mGL50-2 y el mGL50-1 original se transcriben con especificidad de tejidos diferentes soporta la noción que la regulación de estas moléculas en la señalización celular es dependiente de el estado de activación y localización fisiológica.

La existencia de un motivo intracelular conservado entre el GL50 de mamífero y un ave Y08823, junto con la presencia de múltiples formas de GL50 con regiones carboxilo divergentes, adicionalmente sugiere que las diferencias en el dominio intracelular de estas moléculas puede conducir a distintas funciones de señalización. Esto adicionalmente se soporta por la presencia de 3 residuos de tirosina adicionales encontrados en el dominio intracelular del mGL50-2, adicionalmente a los dos compartidos con el mGL50-1. Esto contrasta con la estructura del B7-1 y B7-2, en donde a las regiones intracelulares les falta cualquier secuencia obvia conservada y se han eliminado sin afectar la actividad coestimuladora, lo que sugiere que la señalización intracelular no es una característica clave de esas proteínas B7 (Brunschwig, E. B. et al. (1995) J Inmunol. 155: 5498-505). El motivo conservado del hGL50, aunque predice estar en la porción intracelular de la molécula mediante análisis de hidrofobosidad, se encuentra que se codifica por el dominio de transmembrana de exón 5, y no el dominio-1 citoplásmico de exón 6. En el clon de cADN de Y08823 de pollo, la homología de secuencia termina dentro de tres residuos de aminoácidos que siguen al exon 6/dominio-1 citoplásmico correspondiente. Si la organización genómica del hGL50 se mantiene en Y08823, cuando el motivo conservado se codifica por la porción intracelular del dominio de transmembrana del exón 5, entonces es posible que los segmentos de ADN ortólogos para el exón 6 y exón 7, codifican los dominios citoplásmicos 1 y 2 en hGL50, que puede ser completamente ausente en pollos. En los estudios estructurales del dominio citoplásmico B7, se argumenta que aquellas secuencias pueden estar completamente dispensadas (Brunschwig, E. B. et al. (1995) J. Inmunol. 155: 5498-505). Sin embargo, el hecho que se utilizan los exones citoplásmicos alternos en B7-1 y GL50 sugiere que la adición de los dominios de exón alternos pueden haber ocurrido durante el tiempo cuando las proteínas similares a B7 novedosas se generan. Las proteínas de butilofilina similares a B7 se codifican mediante un número de variantes de empalme, la forma predominante de las que contienen un dominio citoplásmico 3 que codifican un motivo de dedo de Anillo intracelular que se utiliza quizás en transducir señalización a partir de esta molécula (Ogg, S. L. et al. (1996) Mamm. Genome 7: 900-5). Estas observaciones apoyan la idea que otras moléculas de tipo ligando, tal como GL50 y Y08823, con el motivo intracelular conservado del exón 5 y otros dominios citoplásmicos, puede tener papeles alternos como suministro de señal y moléculas de receptor de señal, que dependen del ambiente milleieu en el que se encuentra la célula.

Para definir claramente los subconjuntos celulares que muestran la expresión de superficie de GL50, se desarrolla la fenotipicación comparativa de subconjuntos RAG1-/- y Balb/esplenocitos C. Los ejemplos establecidos anteriormente muestra que el CD4+ fresco y las células lCD8+, así como también las células RAG1-/-CD1 lc+ contenían subpoblaciones de células que expresan el ligando ICOS. Estos resultados son distintos de estudios previos en donde se reporta que el ligando ICOS está ausente en las líneas de células T (Aicher, A. et al. (2000) J Inmunol. 164 (9): 4689-96) y algunas líneas celulares dendríticas (Yoshinaga, S. K. et al. (1999) Nature 402: 827-32). El análisis RT-PCR de subconjuntos de células purificadas confirma que el GL50-1 y GL50-2 se expresan en las mismas células lo que sugiere que ambas transcripciones pueden contribuir a la exhibición de superficie de unión ICOS. En adición a las células que presentan antígeno, se demuestra que la expresión inicial de los ligandos coestimuladores ocurre antes el modelo de células ES de desarrollo embriónico con la presencia de transcripciones B7-1 y GL50-1 en células no diferenciadas y en cuerpos de embriones cultivados 10 días in Vitro Ling, V. et al. (1998) Exp. Cell Res. 241: 55-65). En este estudio, adicionalmente se demuestra mediante análisis de ARN, se encuentra que las transcripciones GL50-2 están dentro de estos tejidos. Por el día 9 por la diferenciación de cuerpo embrionario, las células ematopoyéticas emergentes se semejan fenotípicamente a progenitores ematopoyéticos de saco de yema in Vivo, como se evidencia por el potencial de células c-kit+/PECAM-1+ para producir progenitores ematopoyéticos mezclados y células CD45+ para producir progenitores macrófagos en ensayos formadores de colonia (Ling, V. y Neben, S. (1997) J. Cell Physiol. 171: 104-15; Ling, V. et al. (1997) Eur. J. Inmunol. 27: 509-14). Estas células CD45+ también se encuentra que son B7-1+ y B7-2+, que sugieren fuertemente que ocurra la expresión de ligando coestimulador antes en linfopoyesis. De manera correspondiente, se encuentra altos niveles de expresión GL50-1 y GL50-2 en sitios de hematopoyesis embriónica tal como hígado fetal y saco de yema embriónico. Es valioso notar que el ligando ICOS- es inducible en cultivos de fibroblasto embriónico, un tipo celular derivado de un punto de tiempo antes de limfopoyesis definitiva, lo que sugiere que el mecanismo para señalización coestimuladora de la cascada puede ser suspendido independientemente de la formación inicial de la respuesta inmune adaptativa. Se ha postulado que las metazonas comparten rutas evolucionables comunes que ocurren en la etapa filotípica de embriogénesis, y que ciertos procesos fisiológicos de núcleo que tienen propiedades especiales relevantes para desarrollo de complejos se refleja durante este periodo de tiempo de desarrollo embriónico y después en fisiología de adultos (Kirschner, M. y Gerhart, J. (1998) Proc. Natl. Acad Sci. USA 95: 8420-7). Esto continua para determinar si los ligandos coestimuladores son parte de algunos procesos de núcleo utilizados por los sistemas adultos y embrionarios.

A pesar de la gran distancia genética entre los miembros de la familia B7, el hecho que el primate y roedor B7-1 y B7-2 retienen unión cruzada para línea filogenéticos a través del CTLA4 y CD28 sugiere la tolerancia de reemplazo de nucleótido dentro de estas moléculas de señalización a través del curso del tiempo de la historia natural. Para comparar el patrón de la divergencia filogenética entre ligandos coestimuladores y sus receptores, las secuencias de proteína CTLA4 (No. de Acceso Genbank NM009843 y NM 005214), CD28 (No. de Accesos. NM007642, NM006139, y X67915), y receptores ICOS (No. de Acceso Genbank, AJ250559 y No. de Acceso. Genseq V53199) de ratón, humano y pollo se analizan. Cuando se representa en formato gráfico los valores de distancia genética de estos receptores (Tabla 6) revelan un patrón (Figura 21) en el que las distancias entre las proteínas ICOS y CD28 son más cercanas que las distancias entre ICOS y CTLA4.

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Cuando se comparan las relaciones de secuencia de receptor entre especies, los valores de distancia para el CD28 humano/ICOS (176) son más pequeños que aquellos del CD28/ICOS de ratón (257). Así mismo, los valores de distancia CTLA4/ICOS (261) también se encuentra que son más pequeños que las distancias CTLA4/ICOS de ratón (405). Estos datos sugieren que la estructura de la molécula ICOS se deriva más probablemente de la forma del CD28 a diferencia del CTLA4. En contraste, el análisis filogenético de los ligandos coestimuladores demuestra que los valores de distancia entre elGL50 y B7-1 (243-282) son casi equivalentes a los valores de distancia entre GL50 y B7-2 (200-270). Se encuentra que el Y08823 exhibe mayor identidad de secuencia y menor distancia genética (36-37%; 131-138) para las proteínas GL50 humanas y de ratón que para las proteínas B7 (23-30%, 230-310). Las distancias genéticas casi equivalentes entre el GL50 y los miembros de la familia B7-1/B7-2 y la distancia genética no equivalente entre los miembros de la familia CD28/CTLA4 e ICOS implica las restricciones funcionales/evolutivas que guían la familia del receptor son diferentes de aquellos que guían la familia del ligando.

Las relaciones de secuencia filogenéticos pueden reflejar la ubicación genómica de estas moléculas; el B7-1 y B7-2 colocalizan al cromosoma 16 de ratón y cromosoma 3 humano, mientras que el CTLA4, CD28, y ICOS colocalizan al cromosoma 1 de ratón y al cromosoma 2q33 humano. En contraste, el lugar GL50 genético no se liga al lugar B7; el GL50 humano se ubica en el cromosoma 21q22 (Hattori, M. et al. (2000) Nature 405: 311-9) mientras el GL50 de ratón se ubica en el cromosoma 10. Mediante análisis TFastX, no se identifican homólogos similares a GL50 adicionales en el cromosoma 21, lo que sugiere que el GL50 puede no existir como una familia de genes agrupados similares a B7-1 y B7-2. Con respecto al Y08823, no es claro si esta molécula es un ortólogo verdadero de B7-1 o si el Y08823 representa una molécula similar a B7 novedosa cuyo ortólogo no sea identificado en sistemas mamíferos. Sin embargo, a partir de la identidad del 23-30% de secuencia de identidad compartido entre el B7s y Y08823, que incluyen múltiples reemplazos de aminoácido en sitios de residuo cargados, es sorprendente que estas proteínas retengan la unión cruzada funcional con CTLA4 (O'Regan, M. N. et al. (1999) Inmuno generics 49: 68-71). El resultado inesperado de Y08823 que lleva semejanza estructural más fuerte al GL50, aún retiene propiedades de unión características de B7-1 y B7-2, lo que sugiere que las restricciones estructurales y funcionales para la divergencia de estos ligandos coestimuladores es baja.

Numerosos escenarios pueden contar para las diferentes distancias genéticas medidas entre las familias de receptor y las familias de ligando. Es posible que los genes que codifican la familia de proteínas GL50/B7 emergen antes que los genes que codifican los receptores CD28/CTLA4. la formación de genes que codifican el receptor ICOS pueden haberse incrementado después durante filogenia y se pueden basar en la estructura del CD28, que resulta así en una mayor similitud al CD28 que a las moléculas CTLA4. Esta hipótesis puede contar para las numerosas proteínas similares a B7 que existen, mientras que relativamente pocos receptores similares a CD28 se han descrito. Es notable que ciertos exones de CTLA4 retienen restricciones de secuencia destacadas, aún en el nivel de mutaciones de ADN sinónimos, lo que sugiere la presencia de un mecanismo aún por ser definido que proteja el lugar de las mutaciones (Ling, V. et al. (1999) Genomics 60: 341-355). Puede ser que un mecanismo de restricción de mutación regule la región de receptor coestimuladora sobre la longitud del lugar CTLA4/CD28/ICOS, o que la presión de selección agregada en el dominio de señalización intracelular de estos receptores sea suficiente para mantener una tasa más baja de divergencia.

Los ligandos coestimuladores y los receptores pertenecen a la súper familia Ig de proteínas, que han sido definidas como aquellas proteínas que comparten homología con inmunoglobulinas en el rango del 10-20%, con enlaces de disulfuro intra cadena característicos. La aparición de artrópodos y cordados fecha hace 600 millones de años, y se ha sugerido que las moléculas que representan los progenitores putativos de la súper familia Ig so aún más recientes, probablemente están presentes en los acolomatos tal como platelmintos y nemátodos. La noción de que la súper familia Ig de proteínas es al menos tan antigua se soporta por el hallazgo que algunas proteínas similares a Ig tal como N-CAM se encuentran en mamíferos así como también insectos. El evento inmunológico "big bang" (Marchalonis, J. J. et al. (1998) Inmunol. Rev. 166: 103-22, y referencias allí) que han surgido con el sistema inmune combinatorio adaptativo basado en Ig aparece teóricamente durante la emergencia del pez "jawed" de hace 450 millones de años durante un breve espacio de tiempo geológico de 10-20 millones de años. Actualmente, ningún mecanismo mediante el cual el sistema de inmunoglobulina pueda haber emergido de la súper familia Ig de moléculas se ha definido claramente. Sin embargo, se han propuesto teorías que sugieren que los genes que codifican los dominios Ig y combinan las enzimas recombinasa necesarias para el sistema inmune combinatorio se transfieren horizontalmente en una escala suficientemente grande para ofrecer una ventaja selectiva (Bernstein, R. M. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9454- 9). Notablemente ausente es la base para una estructura bioquímica comprensiva que incorpore las características de señalización salientes de moléculas coestimuladoras de la súper familia Ig que sirven para accionar la activación celular, promover la maduración de la molécula de inmunoglobulina, e influenciar la clase de conmutación. Aunque actualmente no se sabe si los miembros del linaje de chondricthyes ancianos tal como tiburones tienen moléculas coestimuladoras, el hecho que las proteínas de coestimulación relacionadas tal como el CD28 y Y08823 están presentes en pollos sugiere que algún tipo de ruta coestimuladora está presente en miembros del linaje aviar, que emergen al menos hace 300 millones de años (Burt, D. W. et al. (1999) Nature 402: 411-3), que abren la posibilidad que la molécula Y08823 representa un primo contemporáneo de las moléculas GL50 y B7 con una semejanza más fuerte a un ligando coestimulador prototípico, a diferencia de ser un ortólogo verdadero del GL50 o B7. En contraste al linaje aviar, se postula que los linajes humano y de ratón separados aproximadamente por 100 millones de años, con genoma de ratón que experimenta redisposiciones cromosómicas extensivas (Burt, D. W. et al. (1999) Nature 402: 411-3) comparadas con aquellas vistas en pollos y humanos. No se sabe si estas redisposiciones pueden haber conducido a la separación cromosómica entre los miembros de la familia B7 y los genes que codifican las moléculas GL50. Tampoco se conoce si las aves ICOS o variantes de estas existan.

Ejemplo 12 GL50 Soluble puede coestimular las Células T humanas

La capacidad del hGL50-mIgG2am soluble de coestimular las Células T humanas se determina utilizando un ensayo de coestimulación de células T. las células T CD4+ nativas se purifican y se colocan en placas de 10% de células por pozo. Las Células se estimulan con anti-CD3 en glóbulos, utilizando un glóbulo por celda y 1 o 2 \mug de anti-CD3 por 10^{7} glóbulos. Las Células se tratan con hGL50- mIgG2am en glóbulos, utilizando un glóbulo por célula y 3 \mug hGL50-mIgG2am por 10^{7} glóbulos.

Se suministra la señalización CD28 (utilizando anti-CD28 (Farmingen)) o estimulado para determinar si la modulación del CD28 media la coestimulación que tiene cualquier efecto en coestimulación mediada por hGL50-mIgG2am.

Se ensaya la producción IL-2, la producción IL-10, y la proliferación (incorporación ^{3}H) como indicadores de coestimulación. Las Citoquinas y la proliferación se miden 72 horas después de estimulación.

Como se muestra en la Figura 22, el hGL50-mIgG2am (también llamado hGL50. Fc) puede coestimular Células T, como se muestra por el incremento en proliferación así como también la inducción de la producción IL-2 y IL-10. En la presencia de anticuerpos para CD28, que inducen coestimulación mediada por CD28, también se induce la producción IL-2. La Figura 23 muestra los efectos de variar las concentraciones de anti-CD3 y anti-CD28 en la proliferación y producción de citoquinas.

La Figura 24 muestra que agregar el anti-CD28 a las Células T estimula el anti-CD3 o anti-CD3 y e hGL50-mIgG2am soluble (para coestimulación mediada por CD28) que induce a la producción IL-2, pero no influencia la producción IL-10 mediada por hGL50.

Ejemplo 13 Tratamiento de tumores de murino utilizando estimulación de ruta ICOS/GL50

Como se estableció anteriormente, el papel de la coestimulación del ICOS/GL50 en la generación de respuestas anti tumor no se ha reportado. En este estudio, la eficacia relativa de la coestimulación ICOS/GL50 se compara con la coestimulación CD28/B7 en varios modelos de tumor de murino. Para tratamiento sistémico de los animales que tienen tumores, las proteínas de fusión B7.2-IgG2a y GL50-IgG2a de murino se generan, que consiste del dominio extra celular del B7. 2 o GL50, respectivamente, y la porción Fc de murino IgG2a. Se utiliza el IgG2a isotipo de murino como un control. Los ratones que llevan tumores de melanoma MethA o B 16F 1 se tratan subcutánemente con 50 \mug/inyección de proteína de fusión GL50-IgG2a o B7.2-IgG2a dos veces semanalmente durante tres semanas. En el modelo MethA, el tratamiento con B7. 2-IgG2a resulta en regresión de tumor hasta el 100% (Figura 25A) y la cura de los ratones (Figura 25E), y tratamiento con GL50-IgG2a resultan hasta cura del 60-90% en ratones (Figura 25E) y en retraso de crecimiento de tumor significativo del 40% (Figura 25D). En el tratamiento sistémico del melanoma B16F1 con la proteína conduce a retraso de crecimiento significativo del tumor comparable. En modelos de tumor, el tratamiento IgG2a de control no tiene efecto (Figura 25A, C, y E). En estudios de vacunas contra tumores, se utilizan modelos de carcinoma de vejiga MB49 Y melanoma B16F1. Las células de tumor se transducen con un vector que contiene el promotor EF-1 alfa que expresa el B7.1 o GL50 de murino, y se inyectan las células de tumor G418 seleccionadas (neomicin) subcutáneamente para experimentos de tumorogenicidad in vivo. La expresión del GL50 y B7-1 en células de tumor se determina mediante análisis FACS utilizando un anticuerpo monoclonal anti-mB7-1 (Pharmingen, clon 16-10A1) o proteína de fusión ICOS-IgG2a. Los resultados demuestran: (i) en el modelo B16F1, 40% de los ratones inyectados con células de tumor que expresan GL50 y 20% de ratones inyectados con B7.1 que expresan rechazo de células de tumor de sus tumores (Figura 31 A); (ii) en el modelo MB49, 30% de los ratones inyectados con células de tumor que expresan GL50 y 10% de los ratones inyectados con B7.1 expresan rechazo a las células de tumores de sus tumores (Figura 31B). Estos resultados indican que las interacciones ICOS/GL50 in vivo mejoradas, suministradas por expresiones GL50-IgG o GL50 solubles en células de tumores, tienen actividad anti tumoral significativa que es comparable con la eficacia anti tumor bien descrita de la ruta CD28/B7 en modelos de tumor en murinos.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es para conveniencia del lector solamente. No forma parte del documento de patente Europea. Aunque se ha tenido gran cuidado en la compilación de las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la EPO declina cualquier responsabilidad en este aspecto.

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<110> Ling, V. and Dunussi, K.

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<120> MOLÉCULAS GL50 NOVEDOSAS Y USOS PARA ÉSTAS

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<130> GNN-007

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<140>

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<141>

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<160> 6

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<170> Patent In Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 2718

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<212>

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<213> Mus musculus

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<220> ADN

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<221> CDS

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<222> (67)..(1032)

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<400> 1

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9

10

100

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<210> 2

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<211> 322

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 2

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11

12

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<210> 3

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<211> 1759

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1041)

\newpage

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<400> 3

13

14

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<210> 4

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<211> 347

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 4

15

16

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<210> 5

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<211> 953

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (24)..(950)

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<400> 5

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17

18

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<210> 6

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<211> 309

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

19

Claims (26)

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende la secuencia de nucleótido establecida en la SEQ ID NO: 1, 3, o 5.

2. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido establecida en las SEQ ID NOs: 4, o 6.

3. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una variante alélica de ocurrencia natural de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 4, en donde dicha variante alélica de ocurrencia natural resulta en 1-5% de variación en la secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 4.

4. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una variante alélica de ocurrencia natural de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido establecida en las SEQ ID NOs: 4 o 6, en donde dicha variante comprende los últimos 27 aminoácidos del dominio citoplásmico de la SEQ ID NO: 4 los últimos 10 aminoácidos del dominio citoplásmico de la SEQ ID NO: 6.

5. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende al menos 900 nucleótidos contiguos de las SEQ ID NOs: 3 o 5, que codifican un fragmento aislado de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 4 o 6, en donde el fragmento comprende los últimos 27 residuos de aminoácidos del dominio citoplásmico de la SEQ ID NO: 4 o los últimos 10 aminoácidos del dominio citoplásmico de la SEQ ID NO: 6.

6. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótido que es complementaria a la secuencia de nucleótido de la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 4 o 5.

7. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 4 o 5, y una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido heterólogo.

8. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 4 o 5.

9. Un vector de expresión que comprende una porción de secuencia de nucleótido de las SEQ ID NOs: 3 o 5, en donde dicha porción codifica el dominio citoplásmico de una molécula GL50 que comprende la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 4 o 6.

10. Una célula anfitriona aislada transfectada con el vector de expresión de la reivindicación 9.

11. Un método para producir un polipéptido que comprende cultivar la célula anfitriona de la reivindicación 11 en un medio de cultivo apropiado para, por lo tanto, producir el polipéptido codificado por la porción de secuencia de nucleótido de las SEQ ID NOs: 3 o 5.

12. Un polipéptido aislado seleccionado del grupo que consiste de:

a)

un fragmento aislado de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido de las SEQ ID NOs: 4, o 6, en donde el fragmento comprende los últimos 27 aminoácidos del dominio citoplásmico de la SEQ ID NO: 4 los últimos 10 aminoácidos del dominio citoplásmico de la SEQ ID NO: 6.

b)

una variante alélica de ocurrencia natural de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 4, en donde el polipéptido se codifica por una molécula de ácido nucleico que hibridiza a el complemento una molécula de ácido nucleico que consiste de la SEQ ID NO: 3 bajo condiciones rigurosas; y en donde dicha variante alélica de ocurrencia natural resulta en 1-5% de variación en la secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 4.

c)

un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido que es por lo menos 50% idéntica a la longitud completa de la secuencia de aminoácido de las SEQ ID NOs: 4 o 6 en donde el polipéptido comprende los últimos 27 aminoácidos del dominio citoplásmico de la SEQ ID NO: 4 los últimos 10 aminoácidos del dominio citoplásmico de la SEQ ID NO: 6, y en donde el polipéptido coestimula la proliferación de célula T, se une a los ligandos receptores coestimuladores en células T y/o se une mediante anticuerpos que reconocen los miembros de la familia B7.

13. El polipéptido aislado de la reivindicación 12 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 4, o 6.

14. El polipéptido de la reivindicación 13, que comprende adicionalmente secuencias de aminoácido heterólogas.

15. El polipéptido de la reivindicación 14, en donde las secuencias de aminoácido heterólogas se derivan de una molécula de inmunoglobulina.

16. Un polipéptido soluble que comprende el dominio extracelular de una molécula GL50 que comprende la SEQ ID NO:4.

17. El polipéptido soluble de la reivindicación 16, que es un polipéptido de fusión Ig.

18. Un anticuerpo que se uno selectivamente a los últimos 27 residuos de aminoácidos del polipéptido de la SEQ ID NO: 4 o los últimos 10 aminoácidos del dominio citoplásmico de la SEQ ID NO: 6, del polipéptido de la reivindicación 12.

19. El uso de un agente modulador GL50 que es un agente estimulador o inhibidor GL50 que comprende una molécula de ácido nucleico GL50 de las SEQ ID NOs: 3 o 5 o un polipéptido de la SEQ ID NOs: 4 o 6, para la preparación de un medicamento para modular la respuesta inmune en un sujeto, en donde la modulación de la respuesta inmune comprende la modulación de

(a)

transcripción de un gen GL50 o mARN GL50,

(b)

transducción de señal,

(c)

coestimulación de célula T,

(d)

la señal coestimulatoria en células T activadas,

(e)

inducción de proliferación y/o secreción de citosina, o

(f)

señalización intracelular.

De tal manera que la respuesta inmune del sujeto se estimule o suprima.

20. Uso de un anticuerpo que se une a un polipéptido GL50 que comprende las SEQ ID NOs: 4 o 6 y al menos un anticuerpo que se una a una molécula B7-1 o B7-2 para la preparación de un medicamento para modular la respuesta inmune en un sujeto, en donde la modulación de la respuesta inmune comprende la modulación de

(a)

transducción de señal,

(b)

coestimulación de célula T,

(c)

la señal coestimulatoria en células T activadas,

(d)

inducción de proliferación y/o secreción de citosina, o

(e)

señalamiento intracelular.

Tal que la respuesta inmune del sujeto se estimule o suprima.

21. Uso de una célula T activada que se pone en contacto con un polipéptido GL50 que comprende las SEQ ID NOs: 4 o 6 para la preparación de un medicamento para modular la coestimulación de célula T, en donde la coestimulación de célula T comprende la coestimulación de la secreción de citosina y/o proliferación de células T activadas tal que la coestimulación de célula T se estimula o suprime.

22. Un método para detectar la presencia de un polipéptido de la reivindicación 12 en una muestra comprende:

a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido; y

b) determinar si el compuesto se une al polipéptido en la muestra para por lo tanto detectar la presencia de un polipéptido de la reivindicación 12 en la muestra.

23. Uso de una forma de activación de una molécula GL50 que comprende las SEQ ID NOs: 4 o 6, que es capaz de transmitir una señal por vía de un receptor coestimulador, para la preparación de un medicamento para poner en contacto una célula inmune para reducir la proliferación de una célula de tumor de tal forma que se mejore la respuesta inmune de la célula de tumor y se reduzca la proliferación de la célula de tumor.

24. Uso de acuerdo con la reivindicación 23, en donde la forma de activación de una molécula GL50 es un polipéptido soluble o un polipéptido asociado a célula.

25. Un método de selección para un compuesto que estimula o suprime la activación mediada por GL50 de una célula inmune que comprende la coestimulación de la secreción y/o proliferación de citosina de células T activadas, que comprenden: i) poner en contacto un polipéptido que comprende las SEQ ID NOs: 4 o 6 con un compuesto de ensayo y un compañero de unión GL50 y ii) identificar los compuestos que modulan la interacción del polipéptido con el un compañero de unión GL50 para identificar por lo tanto los compuestos que modulan la activación mediada por GL50 de una célula inmune.

26. Un método de selección para un compuesto que estimula o suprime la transducción de señal en una célula inmune que es capaz de procesar señales químicas o físicas del ambiente extracelular a través de la membrana celular y en la célula, que comprende: poner en contacto una célula inmune que expresa una molécula GL50 que comprende las SEQ ID NOs: 4 o 6 con un compuesto de ensayo y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para modular la señal de transducción por vía de GL50 para por lo tanto identificar un compuesto que modula una señal en una célula inmune.