CZ200254A3

CZ200254A3 - Lidská protilátka, DNA, vektor, buňka, genově rekombinantní hostitel, farmaceutický prostředek a způsob určování látek

Info

Publication number: CZ200254A3
Application number: CZ200254A
Authority: CZ
Inventors: Takashi Tsuji; Katsunari Tezuka; Nobuaki Hori
Original assignee: Japan Tobacco, Inc.
Priority date: 2000-05-18
Filing date: 2001-05-15
Publication date: 2002-06-12
Also published as: HUP0202532A2; CA2344086A1; CA2635963C; TWI316546B; JP2002034581A; US7988965B2; SG153626A1; PT1158004E; NO333921B1; HUP0202532A3; SK287862B6; EP2216343A1; MXPA02000687A; AU4388101A; US20040180052A1; NZ516411A; CZ302902B6; DK1158004T3; SG187990A1; SG135917A1

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká lidských protilátek, které se vážou k AILIM (imunomodulační molekula lymfocytů, která je indukována aktivací, také označována jako ICOS (indukovatelný kostimulátor)); lidských monoklonálních protilátek nebo jejich části, které se vážou k AILIM; DNA kódující uvedenou lidskou monoklonální protilátku nebo její část, nebo části uvedené DNA; buněk (včetně genově rekombinantních buněk) produkujících lidskou monoklonální protilátku nebo její část, lidské monoklonální protilátky nebo její části, která je produkována genově rekombinantními buňkami; farmaceutického prostředku, který obsahuje protilátku proti AILIM, pro léčení poruch spojených s opožděnou alergií; způsobů určování, kvantifikace nebo testování sloučenin, které se vážou k AILIM nebo k ligandu AILIM; a soupravy použité pro provádění uvedených metod.

Dosavadní stav techniky

V těle živých savců existují imunitní systémy, které vylučují patogenní mikroorganizmy (viry, bakterie, parazity atd.) nebo cizí molekuly (obojí jsou nazývány v následujícím textu “antigen”), které vnikly do živého těla. Jeden z nich je nazýván systém přirozené imunitní odpovědi, jiný z nich je nazýván systém získané imunitní odpovědi. První z nich je vylučovací mechanizmus, zahrnující fagocytózu pomocí fagocytů (polymorfonukleární leukocyty, monocyty. makrofágy atd.), působení buněk přirozených zabíječů (NK) a nespecifické rozpoznávání, jako je opsonizace antigenu pomocí komplementů. Druhý systém, systém získané imunitní odpovědi, je vylučovací mechanizmus zprostředkovaný lymfocyty (hlavně T buňky a B buňky), které získaly specificitu k antigenu (jmenovitě aktivované lymfocyty). B buňky, které získaly specificitu k antigenu napadají antigen vyskytující se vně buněk pomocí produkce protilátek, specifických k antigenu. T buňky, které získaly specificitu k antigenu (jmenovité aktivované T buňky), jsou klasifikovány na pomocné T buňky a cytotoxické T buňky (cytotoxický lymfocyt, CTL). Pomocné T buňky regulují diferenciaci B buněk a • · • · · · • · · · • · · · · · • · · · · · • · · · · • · · · • · · · · • · · · • · ·· ···· produkci protilátek, a rozrušují antigen ve spolupráci s fagocyty. Cytotoxické lymfocyty, CTL, napadají virem infikované buňky (Experimental Mediáne: dodatek, “Bio Science Term Library, Immunity”, Yodosha, str. 14 až 17 (1995)).

Toto získání specificity k antigenu u T buněk (jmenovitě aktivovaných T buněk) je započato v průběhu rozpoznávání antigenu, představovaného buňkami prezentujícími antigen (APC), jako je makrofág, B buňky nebo dendritické buňky, T buňkami. Buňky prezentující antigen jej zpracovávají a prezentují tyto zpracované antigeny tím, že je naváží na hlavní histokompatibilitní komplex (MHC). T buňky obdrží primární signál pro aktivaci buněk (nebo získání specificity) tím, že rozpoznají zpracované antigeny prezentované buňkami prezentujícími antigen tak, že je vytvořen mezi receptorem T buněk (TcR) a CD3 antigenem, který se nachází na povrchu buněčné membrány (komplex TcR/CD3).

Avšak tímto TcR/CD3 komplexem zprostředkovaný primární signál nemůže aktivovat T buňky dostatečně a vede to k nedostatečné odezvě nebo klonální anergii, takže buňky potom nemohou reagovat na žádnou působící stimulaci. Vylučování interleukinu 2 (IL-2) je nezbytné pro T buňky aby se aktivovaly, aby se diferencovaly na klony T buněk, specifické k antigenům a aby se množily. Ve stavu klonové anergie jsou jsou T buňky inaktivovány tím, že neprodukují IL-2 a tedy se nedělí. Jmenovitě aktivace T buněk doprovázená produkcí cytokinů jako je IL-2, vyžaduje sekundární signál, který následuje po signálu prvním, tj. vytvoření TcR/CD3 komplexu. Tento sekundární signál je nazýván signál kostimulační.

T buňky obdrží tento sekundární signál a přenesou jej do buněk pomocí interakce (adheze buněk) s molekulami jinými než je MHC na buňkách prezentujících antigen, a molekulami jinými než je komplex TcR/CD3 na povrchu T buněk. Tento sekundární signál zruší buněčnou anergii (klonovou anergii) a buňky aktivuje.

Třebaže některé části mechanizmu přenosu sekundárního signálu mezi buňkami prezentujícími antigen a lymfocyty, jako jsou T buňky, nebyly ještě detailně objasněny, dosud provedenými studiemi bylo zjištěno, že faktorem důležitým pro přenos sekundárního signálu je interakce mezi CD28 (také nazývaný Tp44, T44 nebo 9,3 antigen), což je molekula na povrchu buňky, exprimovaná hlavně na T buňkách a buňkách brzlíku, a CD80 (také nazývaný B7-1, B7, BB1 nebo B7/BB1), což je molekula na povrchu buňky, exprimovaná na buňkách prezentujících antigen (makrofágy, monocyty, dendritické buňky atd.) a CD86 (také nazývaný B7-2 nebo B70), který je také • · molekulou na povrchu buňky, exprimovanou na buňkách prezentujících antigen (hlavně adheze buněk probíhá vazbou mezi těmito molekulami). Dále bylo experimentálně objasněno, že interakce antigenu 4 spojeného a cytolytickými T lymfocyty (CTLA-4), u něhož se předpokládá, že jeho exprese je zesílena v závislosti na sekundárním signálu, s CD80 (B7-1) a CD86 (B7-2) (hlavně adheze buněk probíhající vazbou mezi těmito molekulami), také hraje důležitou úlohu při regulaci aktivace t buněk pomocí sekundárního signálu. Jinými slovy, regulování aktivace T buněk přenosem sekundárního signálu zahrnuje alespoň interakci mezi CD28 a CD80/CD86, zesílení exprese CTLA-4, u níž se předpokládá, že na této interakci závisí, a interakci mezi CTLA-4 a CD80/CD86.

O CD28 je známo, že se jedná o kostimulační molekulu, přenášející sekundární signál (kostimulační signál), vyžadovaný pro aktivaci T buněk a pro zbavení se anergie. Sekundární signál, přenášený vazbou této molekuly k molekulám kostimulátoru CD80 (B7-1) a CD86 (B7-2) na buňkách prezentujících antigen (adheze buněk probíhající vazbou mezi těmito molekulami), stabilizuje mRNA cytokinů typu Th1 a následkem toho podnítí u T buněk produkci velkého množství cytokinů typu Th1, jako jsou IL-2, IFNy a TFNa. Exprese CTLA-4 je indukována primárním signálem, přeneseným přes TcR/CD3, a exprese je také zvýšena sekundárním signálem, přeneseným vazbou mezi CD28 a CD80. Ukazuje se, že CTLA-4 dostává tyto signály proto, aby potlačoval funkci T buněk, což je v protikladu k aktivaci T buněk sekundárním signálem, přenášeným CD28.

Lidský CD28 a CTLA-4 jsou glykoproteiny typu I, jejichž molekulové hmotnosti jsou 44 000 Da, respektive 41 000 až 43 000 Da. Oba mají doménu podobnou imunoglobulinu, která patří do nadrodiny imunoglobulinů, a oba fungují jako molekula účastnící se buněčné adheze a jako molekula účastnící se přenosu signálu.

Lidský CD28 tvoří homodimer s disulfidovou vazbou, zatímco CTLA-4 existuje jako monomer. Oba geny pro CD28 a CTLA-4 jsou umístěny na lidském chromozomu na místě “2g33” a na myším chromozomu na místě “1C”, a jsou složeny ze čtyř (4) exonů. Lidský CD28 a CTLA-4 jse skládají z 220, respektive 223 aminokyselin, počítaje v to i vedoucí sekvence, přičemž homologie mezi nimi je 20 až 30 %..

Ligandy pro CD28 a CTLA-4 jsou u člověka a myši CD80 (B7-1) a CD86. CTLA4 má asi 20x vyšší afinitu k oběma ligandům než CD28. Bylo zjištěno, že struktura aminokyselinové sekvence “MYPPPY (Met-Tyr-Pro-Pro-Tyr)”, konzervované u • · · · živočišných druhů je důležitá pro vazbu CD28 a CTLA-4 na CD80 (B7-1). Bylo také publikováno, že když je stimulován CD28, pak se kináza PI3 (fosfoinozitid 3' kináza, PI3K) spojuje s fosforylováným zbytkem tyrozinu v částečné sekvenci ΎΜΜΜ (Tyr-MetMet-Met)” v CD28 a že CD28 hraje důležitou roli ve vnitrobuněčném přenosu signálu touto “YxxM” strukturou. Dále bylo oznámeno, že CTLA-4 má také sekvenci představovanou “YxxM”, jmenovitě “YVKM (Tyr-Val-Lys-Met)” ve své cytoplazmatické oblasti a že poté co je stimulován, s touto sekvencí asociuje SYP.

CD28 je specificky exprimován v tymocytech v T buňkách periferní krve, a CTLA-4 je specificky exprimován v aktivovaných T buňkách (Buněčné inženýrství: doplněk, “Příručka o adhezních molekulách”, Shujunsha, str. 93 až 102 (1994); tamtéž str. 120 až 136; Experimentální lékařství: doplněk, “Knihovna termínů biologických věd, Imunita”, Yodosha, str. 94 až 98 (1995); Experimentální lékařství: doplněk, “Knihovna termínů biologických věd, Vnitrobuněčný přenos signálu”, Yodosha, str. 58-59 (1997); Nihon Rinsho, sv. 55, č. 6, str. 215 až 220 (1997)).

Bylo tak zjištěno, že při regulaci funkce T buněk (aktivace a inhibice funkce T buněk) je důležitá interakce mezi mnoha molekulami, jako jsou kostimulační molekuly (CD28, CD80 (B7-1, CD86 (B7-2) atd.) a CTLA-4, který s nimi spolupracuje, a tato skutečnost upoutala pozornost ke vztahu mezi molekulami a nemocemi a k léčení nemocí pomocí regulace funkce těchto molekul.

Jak bylo popsáno výše, ačkoli živočich aktivuje svůj systém získané imunitní odpovědi proti antigenům, které jsou tělu cizí, má také imunologickou toleranci, takže nevykazuje imunitní odpověď proti vlastním složkám (autoantigen). Pokud je imunologická tolerance z nějakého důvodu porušena, objeví se imunitní odpověď proti autoantigenům, T buňky reagující a autoantigenem jsou indukovány pomocí stejného mechanizmu, který byl uveden výše, nastane abnormální stav imunity a jsou tak způsobeny různé autoimunitní choroby.

Jinými slovy, protože buňky (APC) prezentující v normálních tkáních nestimulující antigeny neexprimují kostimulační molekuly, pokud je imunitní systém živočicha normální, T buňky jsou ve stavu kdy neodpovídají a udržují imunologickou toleranci, přestože existují s autoantigenem reagující T buňky, které s autoantigenem reagují. Bylo předpokládáno, že v abnormálním stavu imunity je, kvůli abnormálnímu přebytku a kontinuální expresi kostimulačních molekul, aktivováno více T buněk reagujících s autoantigenem, čímž dojde ke vzniku autoimunitní choroby.

• · • · · · • · ··· · · · «·*· ····· ♦ · · » » V

Z tohoto hlediska je v poslední době navrhováno mnoho způsobů, jak léčit různé autoimunitní choroby pomocí modulování přenosu kostimulačních signálů, například výše uvedeného přenosu signálu mezi CD28/CTLA-4 a CD80/CD86.

Výsledky takových pokusů dosud neosvětlily detailně mechanizmus aktivace T buněk interakcí mezi kostimulačními molekulami a s nimi souvisejícími molekulami. V tomto mechanizmu mohou být zahrnuty jiné neznámé molekuly.

Nedávno byla určena nová kostimulační molekula, jako je výše popsaná “CD28” a “CTLA-4”, o níž se má za to, že provádí přenos druhého signálu (kostimulačního signálu) podstatného pro aktivaci lymfocytů jako jsou T buňky a s uvedeným signálem spojenou funkční regulaci aktivovaných lymfocytů, jako jsou aktivované T buňky. Tato molekula byla označena jako AILIM (imunomodulační molekula indukující aktivací lymfocytů) (u lidí, myší a krys): Int. Immunol., sv. 12, č. 1, str. 51 až 55, 2000), také označovaná jako ICOS (indukující kostimulátor) (u lidí: Nátuře, sv. 397, č. 6716, str. 263 až 266, 1999).

Na druhé straně byly teprve nedávno určeny nové molekuly nazývané B7h, B7RP-1, GL50 nebo LICOS, které jsou ligandy (AILIM ligandy), interagující s touto kostimulační přenosovou molekulou AILIM (ICOS) (Nátuře, sv. 402, č. 6763, str. 827 až 832, 1999; Nátuře Medicine, sv. 5, č. 12, str. 1365 až 1369, 1999; J. Immunology, sv. 164, str. 1653 až 1657, 2000; Curr. Biol., sv. 10, č. 6, str. 333 až 336, 2000).

Určení těchto dvou nových druhů molekul, jmenovitě AILIM (ICOS) a B7RP-1 (B7h, GL50, LICOS), jako součásti cesty přenosu kostimulačního signálu, který je důležitý pro výše uvedenou aktivaci lymfocytů jako jsou T buňky a pro kontrolu funkce aktivovaných T buněk ukázalo, že existuje nová, třetí cesta interakce mezi AILIM (ICOS) a B7RP-1 (B7h, GL50, LICOS), vedle známých cest prvního a druhého signálu, které jsou již známé jako cesta přenosu mezi CD28 a CD80 (B7-1)/CD86 (B7-2), a cesta přenosu mezi CTLA4 a CD80 (B7-1 )/CD86 (B7-2).

V současné době probíhají studie biologických funkcí těchto nových molekul, jejich kontrolních funkcí u lymfocytů, jako jsou T buňky, pokud se týká třetí cesty přenosu kostimulačního signálu těmito molekulami, a vztahu mezi novým přenosem signálu a nemocemi (J. Immunol., 166(1), str. 1, 2001; J. Immunol., 165(9), str. 5035, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun., 276(1), str. 335, 2000; Immunity, 13(1), str. 95, 2000; J. Exp. Med., 192(1), str. 53, 2000; Eur. J. Immunol., 30(4), str. 1040, 2000; WO 01/15 732).

• · · ·

Podstata vynálezu

Přesněji řečeno, předmětem tohoto vynálezu, je zjistit biologické funkce nové molekuly AILIM, považované stejně jako “CD28” a “CTLA-4” za molekulu, která přenáší sekundární signál (kostimulační signál), který je podstatný pro aktivaci lymfocytů, jako jsou T buňky, a která kontroluje funkce aktivovaných lymfocytů, jako jsou aktivované T buňky, odhalit vztahy mezi expresí AILIM a nemocemi; a poskytnout způsoby a léčiva, která potlačují vývoj různých nemocí, závislých na způsobu exprese AILIM nebo které léčí nemoci tím, že kontrolují biologické funkce AILIM za pomoci léčebných a farmaceutických postupů (například lék jako je monoklonální protilátka nebo sloučenina s nízkou molekulární hmotností).

Aby bylo dosaženo výše uvedených cílů, autoři předloženého vynálezu aktivně prováděli studie lidských protilátek (zvláště lidských monoklonálních protilátek) proti savčím AILIM (zvláště lidskému AILIM) a výsledkem bylo, že jako první na světě připravili imunizací transgenních myší, upravených pomocí genetických rekombinačních technik tak, aby produkovaly lidské protilátky spolu s AILIM (přesněji frakci buněčných membrán buněk, které exprimují AILIM) různé monoklonální protilátky, které se vážou k AILIM, zvláště takové, které se vážou k lidskému AILIM a které regulují přenos signálu, zprostředkovaný lidským AILIM.

Protože protilátky (zvláště monoklonální protilátky), která jsou předmětem tohoto vynálezu, jsou odvozeny od člověka, neindukují žádné prudké imunitní odmítnutí, které by bylo způsobeno imunogenitou proti člověku, HAMA (antigenicita myších antigenú pro lidský organizmus) u hostitele jako celku, která byla velkým problémem (vedlejší účinek) při terapii pomocí proti látkových léčiv, obsahujících protilátky pocházející ze savců jiných než je člověk, jako je například myš, a tak dramaticky zvyšují hodnotu protilátek jako léku.

Proto jsou lidské protilátky (zvláště lidské monoklonální protilátky) vázající se k savčím AILIM (zvláště lidskému AILIM), které jsou předmětem tohoto vynálezu, a farmaceutické prostředky obsahující uvedené lidské protilátky (zvláště lidské monoklonální protilátky), užitečné jakožto léky pro kontrolu různých fyziologických reakcí, které se vztahují k AILIM zprostředkovanému přenosu kostimulačního signálu k

9 9

9 ·· buňkám exprimujícím AILIM (například množení buněk exprimujících AILIM, produkci cytokinů v buňkách exprimujících AILIM, imunitní cytolýzu nebo apoptózu buněk exprimujících AILIM, schopnost indukovat cytotoxicitu proti buňkám exprimujících AILIM, která je závislá na protilátkách, a podobně), přičemž neindukují u hostitele imunitní odmítnutí v důsledku HAMA, a/nebo jsou také vhodné jako léky pro potlačení a zabránění vývoje příznaků a/nebo vývoje různých poruch, týkajících se přenosu signálu zprostředkovaného uvedeným AILIM, a jako lék pro léčení nebo prevenci uvedené poruchy.

Přesněji řečeno, farmaceutické prostředky, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jsou schopny kontrolovat (potlačovat nebo stimulovat) množení buněk exprimujících AILIM nebo produkci cytokinů (například interferonů γ nebo interleukinů 4 atd. buňkami exprimujícími AILIM, čímž umožní potlačení různých patologických stavů a léčbu nebo prevenci různých poruch, způsobených odchylnými fyziologickými jevy, které mají vztah k přenosu signálu, zprostředkovanému AILIM.

Použití farmaceutických prostředků, které jsou předmětem tohoto vynálezu, umožňuje potlačení, prevenci a/nebo léčení například různých poruch (například revmatická artritida, roztroušená skleróza, autoimunitní zánět štítné žlázy, alergická dermatitida kontaktního typu, chronická zánětlivá dermatóza jako je kožní lišej, systémový lupus erythematodes, diabetes mellitus závislý na inzulínu, lupénka, atd.) klasifikované jako autoimunní nebo alergické poruchy (zvláště autoimunitní nemoc a opožděná alergie způsobené buněčnou imunitou); artropatie (například revmatická artritida (RA) a osteoartritida (OA)), zánět (např. hepatitida); reakce štěpu proti hostiteli (GVH reakce); nemoc v důsledku reakce štěpu proti hostiteli (GVHD); imunitní odmítnutí doprovázející transplantaci (homoplasty nebo heteroplasty) tkáně (tkáně jako je kůže, rohovka, kost, atd.) nebo orgánu (játra, srdce, plíce, ledviny, slinivka, atd.); imunitní odpověď vyvolaná cizím antigenem nebo autoantigenem (například produkce protilátek proti uvedenému antigenu, množení buněk, produkce cytokinů); a poruchy, které jsou možná způsobeny abnormální intestinální imunitou (přesněji zánětlivé intestinální poruchy (zvláště nemoc štěpu a vředová kolitida)), potravní alergie atd.

Dále v oblasti potlačení/léčení imunitního odmítnutí, které doprovází transplantaci výše popsaných tkání a orgánů, je možno posílit potlačující účinek na odmítnutí transplantace, vyvíjený známým imunosupresivním činidlem, pomocí farmaceutického prostředku, který je předmětem tohoto vynálezu, společně s ttt· uvedenými léky, které byly použity pro potlačení imunitního odmítnutí v příslušném transplantačním zákroku.

Dále, farmaceutický prostředek, který je předmětem tohoto vynálezu, může být aplikován pro léčení nebo prevenci jakýchkoli zánětlivých nemocí, pro které jsou rozličné steroidy indikovány jako protizánětlivé.

Farmaceutický prostředek, který je předmětem tohoto vynálezu, může být aplikován pro léčení zánětlivé nemoci, jako je například zánět provázející různé artritidy (například revmatická artritida, osteoartritida), zápal plic, hepatitida (včetně virové hepatitidy), zánět provázející infekční nemoci, zánětlivé střevní nemoci, střevní katar, nefritida (zánět provázející glomerulonefritidu, fibróza ledvin), gastritida, zánět cévy, zánět slinivky, zánět pobřišnice, bronchitida, zánět myokardu, zánět mozku, zánět při poranění při ischemické chorobě (ischemické poranění myokardu), zánět způsobený imunitním odmítnutím po transplantaci tkáně či orgánu, popálením, různé záněty kůže (lupénka, kontaktní alergická dermatitida, kožní lišej který je chronickou zánětlivou chorobou kůže), záněty při mnohočetných poruchách orgánů, zánět po operaci PTCA nebo PTCR, zánět provázející arteriosklerózu a autoimunitní zánět štítné žlázy.

Dále použitím metody pro určování látek, které se vážou k AILIM nebo k ligandu AILIM, která je jedním z předložených vynálezů, je získána možnost vyhledat a vybrat farmaceuticky aktivní látky (chemicky syntetizované sloučeniny nebo protilátky), které mají potenciální aktivitu léčit různé poruchy tím, že se vážou k AILIM nebo k ligandu AILIM, a interakcí s nimi regulují přenos signálu.

Přesněji řečeno, předložený vynález je vynález popsaný v následujících bodech (1) až (108).

(1) Lidská protilátka, která se váže k AILIM.

(2) Lidská protilátka podle bodu (1), kde uvedený AILIM je lidského původu.

(3) Lidská monoklonální protilátka, která se váže k AILIM nebo k jeho části.

(4) Lidská monoklonální protilátka podle bodu (3) nebo její část, kde uvedený AILIM je lidského původu.

(5) Lidská monoklonální protilátka podle bodů (3) nebo (4) nebo její část, kde uvedená lidská monoklonální protilátka má schopnost potlačovat přenos signálu do buňky, který je zprostředkován AILIM.

(6) Lidská monoklonální protilátka podle bodu (5) nebo její část, kde uvedená aktivita potlačit přenos signálu je buď (a) nebo (b) z následujících bodů:

• ·

4 « 4

(a) schopnost potlačovat množení buněk exprimujících AILIM, nebo (b) schopnost potlačovat produkci cytokinů v buňkách exprimujících AILIM.

(7) Lidská monoklonální protilátka podle bodu (6) nebo její část, kde uvedený cytokin je jedním z cytokinů produkovaných T buňkou typu Th1 nebo Th2.

(8) Lidská monoklonální protilátka podle bodu (7) nebo její část, kde uvedeným cytokinem je interferon γ nebo interleukin 4.

(9) Lidská monoklonální protilátka podle bodu (5) nebo její část, kde uvedená lidská monoklonální protilátka má schopnost zabránit reakci smíšených lymfocytů.

(10) Lidská monoklonální protilátka podle bodů (3) nebo (4) nebo její část, kde uvedená lidská monoklonální protilátka má schopnost indukovat přenos signálu do buňky, který je zprostředkován AILIM.

(11) Lidská monoklonální protilátka podle bodu (10) nebo její část, kde uvedená aktivita indukovat přenos signálu je (a) nebo (b) z následujících bodů:

(a) schopnost indukovat množení buněk exprimujících AILIM, nebo (b) schopnost indukovat produkci cytokinů v buňkách exprimujících AILIM.

(12) Lidská monoklonální protilátka podle bodu (11) nebo její část, kde uvedený cytokin je jedním z cytokinů produkovaných T buňkou typu Th1 nebo Th2.

(13) Lidská monoklonální protilátka podle bodu (12) nebo její část, kde uvedeným cytokinem je interferon γ nebo interleukin 4.

(14) Lidská monoklonální protilátka podle bodů (3) nebo (4) nebo její část, kde uvedená lidská monoklonální protilátka má schopnost indukovat cytotoxicitu proti buňkám exprimujícím AILIM, která je závislá na protilátkách, a/nebo imunitní cytolýzu nebo apoptózu buněk exprimujících AILIM.

(15) Lidská monoklonální protilátka podle bodů (3) nebo (4) nebo její část, kde konstanta rychlosti vazby (ka) mezi uvedenou monoklonální protilátkou a AILIM je 1,0 x 10³ (1/M.s) nebo více.

(16) Lidská monoklonální protilátka podle bodu (15) nebo její část, kde uvedená konstanta rychlosti vazby (ka) je 1,0 x 10⁴ (1/M.s) nebo více.

(17) Lidská monoklonální protilátka podle bodu (16) nebo její část, kde uvedená konstanta rychlosti vazby (ka) je 1,0 χ 10⁵ (1/M.s) nebo více.

(18) Lidská monoklonální protilátka podle bodů (3) nebo (4) nebo její část, kde konstanta rychlosti disociace (kd) mezi uvedenou monoklonální protilátkou a AILIM je 1,0 χ 10'³ (1/s) nebo méně.

• · • · · · (19) Lidská monoklonální protilátka podle bodu (18) nebo její část, kde uvedená konstanta rychlosti disociace (kd) je 1,0 x 10^-4 (1/s) nebo méně.

(20) Lidská monoklonální protilátka podle bodu (19) nebo její část, kde uvedená konstanta rychlosti disociace (kd) je 1,0 x 10'⁵ (1/s) nebo méně.

(21) Lidská monoklonální protilátka podle bodů (3) nebo (4) nebo její část, kde disociační konstanta (Kd) mezi uvedenou monoklonální protilátkou a AILIM je 1,0 x 10^-6(M) nebo méně.

(22) Lidská monoklonální protilátka podle bodu (21) nebo její část, kde uvedená disociační konstanta (Kd) je 1,0 x 10'⁷ (M) nebo méně.

(23) Lidská monoklonální protilátka podle bodu (22) nebo její část, kde uvedená disociační konstanta (Kd) je 1,0 x 10⁸ (M) nebo méně.

(24) Lidská monoklonální protilátka podle bodu (23) nebo její část, kde uvedená disociační konstanta (Kd) je 1,0 x 10'⁹ (M) nebo méně.

(25) Lidská monoklonální protilátka podle bodu (4) nebo její část, kde DNA kódující

V oblast těžkého řetězce uvedené lidské monoklonální protilátky je odvozena bud ze segmentu 1-02 nebo 3-13 V genu těžkého řetězce lidského imunoglobulinu.

(26) Lidská monoklonální protilátka podle bodu (4) nebo její část, kde DNA kódující

V oblast lehkého řetězce uvedené lidské monoklonální protilátky je odvozena buď ze segmentu L5 nebo A27 V genu lehkého řetězce lidského imunoglobulinu.

(27) Lidská monoklonální protilátka podle bodů (25) nebo (26) nebo její část, kde DNA kódující V oblast těžkého řetězce uvedené lidské monoklonální protilátky je odvozena buď ze segmentu 1-02 nebo 3-13 V genu těžkého řetězce lidského imunoglobulinu, a kde DNA kódující V oblast lehkého řetězce uvedené lidské monoklonální protilátky je odvozena buď ze segmentu L5 nebo A27 V genu lehkého řetězce lidského imunoglobulinu.

(28) Lidská monoklonální protilátka podle bodu (27) nebo její část, kde DNA kódující

V oblast těžkého řetězce uvedené lidské monoklonální protilátky je odvozena ze segmentu 1-02 V genu těžkého řetězce lidského imunoglobulinu, a DNA kódující V oblast lehkého řetězce uvedené lidské monoklonální protilátky je odvozena ze segmentu L5 V genu lehkého řetězce lidského imunoglobulinu.

(29) Lidská monoklonální protilátka podle bodu (27) nebo její část, kde DNA kódující

V oblast těžkého řetězce uvedené lidské monoklonální protilátky je odvozena ze segmentu 3-13 V genu těžkého řetězce lidského imunoglobulinu, a DNA kódující V • · · * »·♦· oblast lehkého řetězce uvedené lidské monoklonální protilátky je odvozena ze segmentu A27 V genu lehkého řetězce lidského imunoglobulinu.

(30) Lidská monoklonální protilátka podle bodu (4) nebo její část, kde variabilní oblast těžkého řetězce uvedené lidské monoklonální protilátky má aminokyselinovou sekvenci, definovanou podle kteréhokoli z následujících bodů (a) až (f);

(a) aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 20 do 117 ze SEQ ID NO: 28, (b) aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 20 do 117 SEQ ID NO: 28, v níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků deletován nebo substituován, nebo do níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků vložen nebo přidán, (c) aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 20 do 116 ze SEQ ID NO: 32, (d) aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 20 do 116 ze SEQ ID NO: 32, v níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků deletován nebo substituován, nebo do níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků vložen nebo přidán, (e) aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 20 do 116 ze SEQ ID NO: 36, nebo (f) aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 20 do 116 ze SEQ ID NO: 36, v níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků deletován nebo substituován, nebo do níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků vložen nebo přidán.

(31) Lidská monoklonální protilátka podle bodu (4) nebo její část, kde polypeptid těžkého řetězce uvedené lidské monoklonální protilátky má aminokyselinovou sekvenci, definovanou podle kteréhokoli z následujících bodů (a) až (f):

(a) aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 20 do 470 ze SEQ ID NO: 28, (b) aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 20 do 470 ze SEQ ID NO: 28, v níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků deletován nebo substituován, nebo do níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků vložen nebo přidán, (c) aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 20 do 470 ze ··· ·· · · · · · ····· ·· · «· ·

SEQ ID NO: 32, (d) aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 20 do 470 ze SEQ ID NO: 32, v níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků deletován nebo substituován, nebo do níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků vložen nebo přidán, (e) aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 20 do 470 ze SEQ ID NO: 36, nebo (f) aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 20 do 470 ze SEQ ID NO: 36, v níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků deletován nebo substituován, nebo do níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků vložen nebo přidán.

(32) Lidská monoklonální protilátka podle bodu (4) nebo její část, kde polypeptid lehkého řetězce uvedené lidské monoklonální protilátky má aminokyselinovou sekvenci, definovanou podle kteréhokoli z následujících bodů (a) až (f):

(a) aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 23 do 116 ze SEQ ID NO: 30, (b) aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 23 do 116 ze SEQ ID NO: 30, v níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků deletován nebo substituován, nebo do níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků vložen nebo přidán, (c) aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 21 do 116 ze SEQ ID NO: 34, (d) aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 21 do 116 ze SEQ ID NO: 34, v níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků deletován nebo substituován, nebo do níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků vložen nebo přidán.

(e) aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 21 do 116 ze SEQ ID NO: 38, nebo (f) aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 21 do 116 ze SEQ ID NO: 38, v níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků deletován nebo substituován, nebo do níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků vložen nebo přidán.

(33) Lidská monoklonální protilátka podle bodu (4) nebo její část, kde polypeptid • · · · • · · lehkého řetězce uvedené lidské monoklonální protilátky má aminokyselinovou sekvenci, definovanou podle kteréhokoli z následujících bodů (a) až (f):

(a) aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 23 do 236 ze SEQ ID NO: 30, (b) aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 23 do 236 ze SEQ ID NO: 30, v níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků deletován nebo substituován, nebo do níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků vložen nebo přidán.

(c) aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 21 do 236 ze SEQ ID NO: 34, (d) aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 21 do 236 ze SEQ ID NO: 34, v níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků deletován nebo substituován, nebo do níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků vložen nebo přidán.

(e) aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 21 do 236 ze SEQ ID NO: 38, nebo (f) aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 21 do 236 ze SEQ ID NO: 38, v níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků deletován nebo substituován, nebo do níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků vložen nebo přidán.

(34) Lidská monoklonální protilátka podle bodu (4) nebo její část, kde uvedená lidská monoklonální protilátka má následující charakteristiky, uvedené v bodech (a) a (b):

(a) variabilní oblast těžkého řetězce má aminokyselinovou sekvenci, která obsahuje sekvenci aminokyselin od 20 do 117 ze SEQ ID NO: 28, a (b) variabilní oblast lehkého řetězce má aminokyselinovou sekvenci, která obsahuje sekvenci aminokyselin od 23 do 116 ze SEQ ID NO: 30.

(35) Lidská monoklonální protilátka podle bodu (4) nebo její část, kde uvedená lidská monoklonální protilátka má následující charakteristiky, uvedené v bodech (a) a (b):

(a) variabilní oblast těžkého řetězce má aminokyselinovou sekvenci, která obsahuje sekvenci aminokyselin od 20 do 470 ze SEQ ID NO: 28, a (b) variabilní oblast lehkého řetězce má aminokyselinovou sekvenci, která • · • · · · obsahuje sekvenci aminokyselin od 23 do 236 ze SEQ ID NO: 30.

(36) Lidská monoklonální protilátka podle bodu (4) nebo její část, kde uvedená lidská monoklonální protilátka má následující charakteristiky, uvedené v bodech (a) a (b):

(a) variabilní oblast těžkého řetězce má aminokyselinovou sekvenci, která obsahuje sekvenci aminokyselin od 20 do 116 ze SEQ ID NO: 32, a (b) variabilní oblast lehkého řetězce má aminokyselinovou sekvenci, která obsahuje sekvenci aminokyselin od 21 do 116 ze SEQ ID NO: 34.

(37) Lidská monoklonální protilátka podle bodu (4) nebo její část, kde uvedená lidská monoklonální protilátka má následující charakteristiky, uvedené v bodech (a) a (b):

(a) variabilní oblast těžkého řetězce má aminokyselinovou sekvenci, která obsahuje sekvenci aminokyselin od 20 do 470 ze SEQ ID NO: 32, a (b) variabilní oblast lehkého řetězce má aminokyselinovou sekvenci, která obsahuje sekvenci aminokyselin od 21 do 236 ze SEQ ID NO: 34.

(38) Lidská monoklonální protilátka podle bodu (4) nebo její část, kde uvedená lidská monoklonální protilátka má následující charakteristiky, uvedené v bodech (a) a (b):

(a) variabilní oblast těžkého řetězce má aminokyselinovou sekvenci, která obsahuje sekvenci aminokyselin od 20 do 116 ze SEQ ID NO: 36, a (b) variabilní oblast lehkého řetězce má aminokyselinovou sekvenci, která obsahuje sekvenci aminokyselin od 21 do 116 ze SEQ ID NO: 38.

(39) Lidská monoklonální protilátka podle bodu (4) nebo její část, kde uvedená lidská monoklonální protilátka má následující charakteristiky, uvedené v bodech (a) a (b):

(a) variabilní oblast těžkého řetězce má aminokyselinovou sekvenci, která obsahuje sekvenci aminokyselin od 20 do 470 ze SEQ ID NO: 36, a (b) variabilní oblast lehkého řetězce má aminokyselinovou sekvenci, která obsahuje sekvenci aminokyselin od 21 do 236 ze SEQ ID NO: 38.

(40) Lidská monoklonální protilátka podle kteréhokoli z bodů (3) až (29) nebo její část, kde uvedená lidská monoklonální protilátka je monoklonální protilátka původem z transgenního savce, ne však člověka, schopného produkovat lidské protilátky.

(41) Lidská monoklonální protilátka podle bodu (40) nebo její část, kde uvedená » » • · 9 · • · • · · • · lidská monoklonální protilátka je získána imunizací transgenního savce, ne však člověka, schopného produkovat lidské protilátky, buňkami exprimujícími AILIM, frakcí membrán, odvozenou z uvedených buněk, celými molekulami, ze kterých sestává AILIM nebo jeho část, nebo geny kódující AILIM nebo jeho část.

(42) Lidská monoklonální protilátka podle bodů (40) nebo (41) nebo její část, kde uvedený transgenní savec, ne však člověk, je transgenní myš.

(43) DNA nebo její část, kódující polypeptid vybraný ze skupiny zahrnující (a) až (f), uvedené dále:

(a) polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 20 do 117 ze SEQ ID NO: 28, (b) polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 23 do 116 ze SEQ ID NO: 30, (c) polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 20 do 116 ze SEQ ID NO: 32, (d) polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 21 do 116 ze SEQ ID NO: 34, (e) polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 20 do 116 ze SEQ ID NO: 36, a (f) polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 21 do 116 ze SEQ ID NO: 38.

(44) DNA nebo její část, kódující polypeptid vybraný ze skupiny zahrnující (a) až (f), uvedené dále:

(a) polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 20 do 470 ze SEQ ID NO: 28, (b) polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 23 do 236 ze SEQ ID NO: 30, (c) polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 20 do 470 ze SEQ ID NO: 32, (d) polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 21 do 236 ze SEQ ID NO: 34, (e) polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 20 do 470 ze SEQ ID NO: 36, a (f) polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 21 do • 4

4 · 4 44 4 4444 • •444 44 4 ·« t

236 ze SEQ ID NO: 38.

(45) DNA nebo její část, vybranou ze skupiny zahrnující (a) až (f), uvedené dále:

(a) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 126 do 419 ze SEQ ID NO: 27, (b) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 105 do 386 ze SEQ ID NO: 29, (c) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 151 do 441 ze SEQ ID NO: 31, (d) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 88 do 375 ze SEQ ID

NO: 33, (e) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 153 do 443 ze SEQ ID NO: 35, a (f) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 93 do 380 ze SEQ ID

NO: 37.

(46) DNA nebo její část, vybranou ze skupiny zahrnující (a) až (f), uvedené dále:

(a) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 69 do 1481 ze SEQ ID NO: 27, (b) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 39 do 749 ze SEQ ID

NO: 29, (c) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 94 do 1506 definované v SEQ ID NO: 31, (d) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 28 do 738 ze SEQ ID

NO: 33, (e) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 96 do 1508 ze SEQ ID NO: 35, a (f) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 33 do 743 ze SEQ ID

NO: 37.

(47) Vektor obsahující DNA podle kteréhokoli z bodů (43) až (46).

(48) Vektor podle bodu (47), obsahující DNA podle kteréhokoli z následujících bodů (a) až (c):

(a) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 126 do 419 ze SEQ ID NO: 27, (b) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 151 do 441 ze SEQ φφ • » · · *♦ »· • » · « « · 4 • · · « · · · » *· · ·

ID NO: 31, or (c) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 153 do 443 ze SEQ ID NO: 35.

(49) Vektor podle bodu (47) obsahující DNA podle kteréhokoli z následujících bodů (a) až (c):

(a) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 69 do 1481 ze SEQ ID NO: 27, (b) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 94 do 1506 ze SEQ ID NO: 31, nebo (c) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 96 do 1508 ze SEQ ID NO: 35.

(50) Vektor podle bodu (47) obsahující DNA podle kteréhokoli z následujících bodů (a) až (c):

(a) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 105 do 386 ze SEQ ID NO: 29, (b) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 88 do 375 ze SEQ ID NO: 33, nebo (c) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 93 do 380 ze SEQ ID

NO: 37.

(51) Vektor podle bodu (47) obsahující DNA podle kteréhokoli z následujících bodů (a) až (c):

(a) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 39 do 749 ze SEQ ID

NO: 29, (b) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 28 do 738 ze SEQ ID NO: 33, nebo (c) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 33 do 743 ze SEQ ID

NO: 37.

(52) Vektor podle bodu (47) obsahující DNA podle následujících bodů (a) a (b):

(a) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 126 do 419 ze SEQ ID NO: 27, a (b) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 105 do 386 ze SEQ ID NO: 29.

(53) Vektor podle bodu (47) obsahující DNA podle následujících bodů (a) a (b):

• · • ♦ Λ ·

»* • · • * «· ··· · ·» • ♦ · · «··· ··· ·· ·· aa ·* ·+ »·*» (a) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 69 do 1481 ze SEQ ID NO: 27, a (b) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 39 do 749 ze SEQ ID

NO: 29.

(54) Vektor podle bodu (47) obsahující DNA podle následujících bodů (a) a (b):

(a) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 151 do 441 ze SEQ ID NO: 31, a (b) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 88 do 375 ze SEQ ID

NO: 33.

(55) Vektor podle bodu (47) obsahující DNA podle následujících bodů (a) a (b):

(a) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 94 do 1506 ze SEQ ID NO: 31, a (b) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 28 do 738 ze SEQ ID

NO: 33 (56) Vektor podle bodu (47) obsahující DNA podle následujících bodů (a) a (b):

(a) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 153 do 443 ze SEQ ID NO: 35, a (b) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 93 do 380 ze SEQ ID

NO: 37.

(57) Vektor podle bodu (47) obsahující DNA podle následujících bodů (a) a (b):

(a) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 96 do 1508 ze SEQ ID NO: 35, a (b) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 33 do 743 ze SEQ ID

NO: 37.

(58) Buňka produkující lidskou monoklonální protilátku podle kteréhokoli z bodů (3) až (42).

(59) Buňka podle bodu (58), kde se jedná o fúzovanou buňku, získanou fúzí B buňky, pocházející od savce schopného produkovat uvedenou lidskou monoklonální protilátku, a myelomové buňky, pocházející ze savce.

(60) Genově rekombinantní hostitel transformovaný přenesením DNA popsané dále v bodě (a) nebo vektorem obsahujícím uvedenou DNA, DNA popsané dále v (b) nebo vektorem obsahujícím uvedenou DNA, nebo obojími DNA popsanými dále v (a) a (b) nebo vektorem obsahujícím obojí uvedené DNA:

• · · · • · 9 ·· · ··«· ····· ·· · · · * • ·· ··· · ··· · · ···· ···· · · ♦ . _ «· · » ·· « · ····«· (a) DNA kódující polypeptid těžkého řetězce nebo jeho část, z monoklonální protilátky, která se váže k lidskému AILIM; nebo (b) DNA kódující polypeptid lehkého řetězce nebo jeho část, z monoklonální protilátky, která se váže k lidskému AILIM.

(61) Genově rekombinantní hostitel podle bodu (60), kde uvedená monoklonální protilátka je lidská monoklonální protilátka.

(62) Genově rekombinantní hostitel podle bodu (60) nebo (61), kde uvedený hostitel je savčí buňka.

(63) Genově rekombinantní hostitel podle bodu (60) nebo (61), kde uvedený hostitel je oplodněné savčí vajíčko.

(64) Genově rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z bodů (60) až (63), kde uvedený polypeptid těžkého řetězce je vybrán ze skupiny sestávající z následujících (a) až (c):

(a) polypeptid těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 20 do 117 ze SEQ ID NO: 28, (b) polypeptid těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 20 do 116 ze SEQ ID NO: 32, a (c) polypeptid těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 20 do 116 ze SEQ ID NO: 36.

(65) Genově rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z bodů (60) až (63), kde uvedený polypeptid těžkého řetězce je vybrán ze skupiny sestávající z následujících (a) až (c):

(a) polypeptid těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 20 do 470 ze SEQ ID NO: 28, (b) polypeptid těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 20 do 470 ze SEQ ID NO: 32, a (c) polypeptid těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 20 do 470 ze SEQ ID NO: 36.

(66) Genově rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z bodů (60) až (63), kde uvedený polypeptid lehkého řetězce je vybrán ze skupiny sestávající z následujících (a) až (c):

(a) polypeptid těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 23 do 116 ze SEQ ID NO: 30, • · ·· ·· ··«· *· ·· ·· ·· · ···· ···· ·· · · · · (b) polypeptid těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 21 do 116 ze SEQ ID NO: 34, a (c) a polypeptid těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 21 do 116 ze SEQ ID NO. 38.

(67) Genově rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z bodů (60) až (63), kde uvedený polypeptid lehkého řetězce je vybrán ze skupiny sestávající z následujících (a) až (c):

(a) polypeptid lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 23 do 236 ze SEQ ID NO: 30, (b) polypeptid lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 21 do 236 ze SEQ ID NO: 34, a (c) polypeptid lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 21 do 236 ze SEQ ID NO: 38.

(68) Genově rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z bodů (60) až (63), kde uvedené polypeptidy těžkého a lehkého řetězce jsou definovány dále v bodech (a) respektive (b):

(a) polypeptid těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 20 do 117 ze SEQ ID NO: 28, a (b) polypeptid lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 23 do 116 ze SEQ ID NO: 30.

(69) Genově rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z bodů (60) až (63), kde uvedené polypeptidy těžkého a lehkého řetězce jsou definovány dále v bodech (a) respektive (b):

(a) polypeptid těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 20 do 470 ze SEQ ID NO: 28, a (b) polypeptid lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 23 do 236 ze SEQ ID NO: 30.

(70) Genově rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z bodů (60) až (63), kde uvedené polypeptidy těžkého a lehkého řetězce jsou definovány dále v bodech (a) respektive (b):

(a) polypeptid těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 20 do 116 ze SEQ ID NO: 32, a (b) polypeptid lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 21 do 116 ze SEQ ID NO: 34.

(71) Genově rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z bodů (60) až (63), kde uvedené polypeptidy těžkého a lehkého řetězce jsou definovány dále v bodech (a) respektive (b):

(a) polypeptid těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 20 do 470 ze SEQ ID NO: 32, a (b) polypeptid lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 21 do 236 ze SEQ ID NO: 34.

(72) Genově rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z bodů (60) až (63), kde uvedené polypeptidy těžkého a lehkého řetězce jsou definovány dále v bodech (a) respektive (b):

(a) polypeptid těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 20 do 116 ze SEQ ID NO: 36, a (b) polypeptid lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 21 do 116 ze SEQ ID NO: 38.

(73) Genové rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z bodů (60) až (63), kde uvedené polypeptidy těžkého a lehkého řetězce jsou definovány dále v bodech (a) respektive (b):

(a) polypeptid těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 20 do 470 ze SEQ ID NO: 36, a (b) polypeptid lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 21 do 236 ze SEQ ID NO: 38.

(74) Genové rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z bodů (60) až (63), kde DNA kódující uvedený polypeptid těžkého řetězce je DNA definovaná v kterémkoli z následujících bodů (a) až (c):

(a) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 126 do 419 ze SEQ ID NO: 27, (b) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 151 do 441 ze SEQ ID NO: 31, a (c) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 153 do 443 ze SEQ ID NO: 35.

(75) Genově rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z bodů (60) až (63), kde DNA kódující uvedený polypeptid těžkého řetězce je DNA definovaná v kterémkoli z • · • · • · · · • · následujících bodů (a) až (c):

(a) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 69 do 1481 ze SEQ ID NO: 27, (b) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 94 do 1506 ze SEQ ID NO: 31, a (c) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 96 do 1508 ze SEQ ID NO: 35.

(76) Genově rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z bodů (60) až (63), kde DNA kódující uvedený polypeptid lehkého řetězce je DNA definovaná v kterémkoli z následujících bodů (a) až (c):

(a) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 105 do 386 ze SEQ ID NO: 29, (b) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 88 do 375 ze SEQ ID NO: 33, a (c) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 93 do 380 ze SEQ ID

NO: 37.

(77) Genově rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z bodů (60) až (63), kde DNA kódující uvedený polypeptid lehkého řetězce je DNA definovaná v kterémkoli z následujících bodů (a) až (c):

(a) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 39 do 749 ze SEQ ID

NO: 29, (b) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 28 do 738 ze SEQ ID NO: 33, a (c) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 33 do 743 ze SEQ ID

NO: 37.

(78) Genově rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z bodů (60) až (63), kde DNA kódující uvedený polypeptid těžkého řetězce je DNA definovaná dále v bodu (a), a DNA kódující uvedený polypeptid lehkého řetězce je DNA definovaná dále v bodu (b):

(79) Genově rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z bodů (60) až (63), kde DNA • * • · • · kódující uvedený polypeptid těžkého řetězce je DNA popsána dále v bodu (a), a DNA kódující uvedený polypeptid lehkého řetězce je DNA popsána dále v bodu (b):

(a) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 69 do 1481 ze SEQ ID NO: 27, a (b) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 39 do 749 ze SEQ ID

NO: 29.

(80) Genově rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z bodů (60) až (63), kde DNA kódující uvedený polypeptid těžkého řetězce je DNA popsána dále v bodu (a), a DNA kódující uvedený polypeptid lehkého řetězce je DNA popsána dále v bodu (b):

NO. 33.

(81) Genově rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z bodů (60) až (63), kde DNA kódující uvedený polypeptid těžkého řetězce je DNA popsána dále v bodu (a), a DNA kódující uvedený polypeptid lehkého řetězce je DNA popsána dále v bodu (b):

NO: 33.

(82) Genově rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z bodů (60) až (63), kde DNA kódující uvedený polypeptid těžkého řetězce je DNA popsána dále v bodu (a), a DNA kódující uvedený polypeptid lehkého řetězce je DNA popsána dále v bodu (b):

NO: 37.

(83) Genově rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z bodů (60) až (63), kde DNA kódující uvedený polypeptid těžkého řetězce je DNA popsána dále v bodu (a), a DNA kódující uvedený polypeptid lehkého řetězce je DNA popsána dále v bodu (b):

(a) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 96 do 1508 ze SEQ ID NO: 35, a (b) DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 33 do 743 ze SEQ ID • ·

NO. 37.

(84) Lidská monoklonální protilátka nebo její část, produkovaná genově rekombinantním hostitelem (za předpokladu, že je vyloučen případ, kdy je uvedeným hostitelem oplozené vajíčko) podle kteréhokoli z bodů (60) až (62), nebo podle kteréhokoli z bodů (64) až (83).

(85) Farmaceutický prostředek obsahující lidskou protilátku podle bodu (1) nebo (2), a farmaceuticky přijatelný nosič.

(86) Farmaceutický prostředek obsahující lidskou monoklonální protilátku podle kteréhokoli z bodů (3) až (42) nebo její část, a farmaceuticky přijatelný nosič.

(87) Farmaceutický prostředek obsahující lidskou monoklonální protilátku podle bodu (84) nebo její část, a farmaceuticky přijatelný nosič.

(88) Farmaceutický prostředek podle kteréhokoli z bodů (85) až (87), kde uvedený farmaceutický prostředek je používán pro potlačení přenosu signálu do buňky, který je zprostředkován AILIM.

(89) Farmaceutický prostředek podle kteréhokoli z bodů (85) až (87), kde uvedený farmaceutický prostředek je používán pro zabránění množení buněk exprimujících AILIM.

(90) Farmaceutický prostředek podle kteréhokoli z bodů (85) až (87), kde uvedený farmaceutický prostředek je používán pro zabránění produkce cytokinu v buňkách exprimujících AILIM.

(91) Farmaceutický prostředek podle kteréhokoli z bodů (85) až (87), kde uvedený farmaceutický prostředek je používán pro indukci přenosu signálu zprostředkovaného AILIM do buňky.

(92) Farmaceutický prostředek podle kteréhokoli z bodů (85) až (87), kde uvedený farmaceutický prostředek je používán pro indukci množení buněk exprimujících AILIM.

(93) Farmaceutický prostředek podle kteréhokoli z bodů (85) až (87), kde uvedený farmaceutický prostředek je používán pro indukci produkce cytokinu v buňkách exprimujících AILIM.

(94) Farmaceutický prostředek podle kteréhokoli z bodů (85) až (87), kde uvedený farmaceutický prostředek je používán pro indukci cytotoxicity závislé na protilátkách proti buňkám exprimujících AILIM, a/nebo imunitní cytolýzy nebo apoptózy buněk exprimujících AILIM.

• · ·· ·· ·· ···» ·· • *· · * · · · · ····· · · · ·· • ·· ··· · * · · ·

’.........

(95) Farmaceutický prostředek pro prevenci, léčení nebo ochranu proti alergii opožděného typu, který obsahuje látku, která má schopnost modulovat přenos signálu zprostředkovaného AILIM, a farmaceuticky přijatelný nosič.

(96) Farmaceutický prostředek podle bodu (95), kde látkou je protein.

(97) Farmaceutický prostředek podle bodu (96), kde protein je vybrán ze skupiny zahrnující:

a) protilátka, která se váže k AILIM nebo k jeho části;

b) polypeptid obsahující celou extracelulární oblast AILIM nebo její část;

c) fúzní polypeptid obsahující celou extracelulární. oblast AILIM nebo její část, a celou konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu nebo její část; a

d) polypeptid, který se váže k AILIM.

(98) Farmaceutický prostředek podle bodu (97), kde uvedená protilátka, která se váže k AILIM, je lidská protilátka podle bodu (1) nebo (2).

(99) Farmaceutický prostředek podle bodu (97), kde uvedená protilátka, která se váže k AILIM, je lidská monoklonální protilátka podle kteréhokoli z bodů (3) až (42).

(100) Farmaceutický prostředek podle bodu (97), kde uvedená protilátka proti AILIM je lidská monoklonální protilátka podle bodu (84).

(101) Farmaceutický prostředek podle bodu (95), kde látkou je neproteinová látka.

(102) Farmaceutický prostředek podle bodu (101), kde neproteinovou látkou je DNA, RNA nebo chemicky syntetizovaná sloučenina.

(103) Způsob určování látek, které se vážou k AILIM nebo k ligandům AILIM, který se skládá z následujících kroků:

(a) příprava nerozpustného nosiče, na kterém je imobilizována celá extracelulární oblast AILIM nebo její část;

(b) příprava polypeptidů obsahujícího celou extracelulární oblast ligandu AILIM nebo její část, označenou značící látkou, která vydává detekovatelný signál;

(c) reagování nerozpustného nosiče z kroku (a) s polypeptidem z kroku (b);

(d) reagování nerozpustného nosiče z kroku (a), polypeptidů z kroku (b) a uvedené látky v jakémkoli zvoleném pořadí;

(e) detekování signálu vydávaného uvedenou značící látkou obsaženou v komplexu, který vzniká v kroku (c), respektive signálu vydávaného uvedenou značící látkou obsaženou v komplexu, který vzniká v kroku (d); a (f) porovnání velikosti obou signálů, detekovaných v kroku (e).

• · (104) . Způsob určování látek, které se vážou k AILIM nebo k ligandům AILIM, který se skládá z následujících kroků:

(a) příprava nerozpustného nosiče, na kterém je imobilizována celá extracelulární oblast ligandu AILIM nebo její část;

(b) příprava polypeptidu obsahujícího celou extracelulární oblast AILIM nebo její část, označenou značící látkou, která vydává detekovatelný signál;

(c) reagování nerozpustného nosiče z kroku (a) s polypeptidem z kroku (b);

(d) reagování nerozpustného nosiče z kroku (a), polypeptidu z kroku (b) a uvedené látky v jakémkoli zvoleném pořadí;

(e) detekování signálu vydávaného uvedenou značící lětkou obsaženou v komplexu, který vzniká v kroku (c), respective signálu vydávaného uvedenou značící látkou obsaženou v komplexu, který vzniká v kroku (d); a (f) porovnání velikosti obou signálů, detekovaných v kroku (e).

(105) Způsob podle bodu (103) nebo (104), kde uvedený polypeptid, obsahující celou extracelulární oblast AILIM nebo její část, je fúzní polypeptid, který obsahuje polypeptid, obsahující celou extracelulární oblast AILIM nebo její část, a celou konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu nebo její část.

(106) Způsob podle bodu (103) nebo (104), kdy uvedený polypeptid, obsahující celou extracelulární oblast ligandu AILIM nebo její část, je fúzní polypeptid, který obsahuje polypeptid, obsahující celou extracelulární oblast ligandu AILIM nebo její část, a celou konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu nebo její část.

(107) Způsob podle kteréhokoli z bodů (103) až (106), kdy uvedený AILIM je lidský AILIM.

(108) Způsob podle kteréhokoli z bodů (103) až (107), kdy uvedený ligand AILIM je lidský ligand AILIM.

Předložené vynálezy jsou zde dále podrobně popsány definováním terminologie předloženého vynálezu.

Termín “savec” zde znamená člověka, hovězí dobytek, kozu, králíka, myš, krysu, křečka a morče; přednost je dávána člověku, králíkovi, kryse, křečkovi nebo myši, a zvláštní přednost je dávána člověku, kryse, křečkovi nebo myši.

Termíny “savci, lišící se od člověka” a “savci, ne však člověk” zde znamenají totéž a označují všechny savce definované výše, kromě člověka.

Termín “aminokyselina” zde znamená každou aminokyselinu existující v přírodě, • · · ·· ·· '* “ přednost je dávána těm, které jsou dále uvedeny v abecedním pořádku podle třípísmenového systému nebo jednopísmenového systému jejich značení:

Glycin (Gly/G), alanin (Ala/A), valin (ValA/), leucin (Leu/L), izoleucin (lle/l), serin (Ser/S), treonin (Thr/T), kyselina asparagová (Asp/D), kyselina glutamová (Glu/E), asparagin (Asn/N), glutamin (Gln/Q), lyzin (Lys/K), arginin (Arg/R), cystein (Cys/C), metionin (Met/M), fenylalanin (Phe/F), tyrozin (Tyr/Y), tryptofan (Trp/W), histidin (His/H), prolin (Pro/P).

Termín “AILIM” zde znamená zkratku pro “imunomodulační molekula indukující aktivaci lymfocytů”, která označuje povrchovou molekulu savčí buňky, jejíž struktura a funkce byly popsány v předchozí zprávě, s výhodou se jedná zvláště o AILIM odvozenou od člověka (například International Immunology, sv. 12, č. 1, str. 51 až 55; GenBank přístupové číslo: BAA82129 (člověk), BAA82128 (krysa), BAA82127 (krysí varianta) a BAA82126 (myš)).

Alternativně je tento AILIM označován také jako ICOS (nepřezkoumaná publikovaná japonská patentová přihláška (JP-A) č. Hei 11-29 599, mezinárodní patentová přihláška č. WO 98/38 216), a tyto zkratky označují tutéž molekulu.

Termín “ligand AILIM” zde znamená povrchovou molekulu buňky, která interaguje s uvedenou kostimulační molekulou AILIM (ICOS) a je označována jako B7h, B7RP-1, GL50 nebo LICOS (Nátuře, sv. 402, č. 6763, str. 827 až 832, 1999; Nátuře Medicine, sv. 5, č. 12, str. 1365 až 1369, 1999; J. Immunology, sv. 164, str. 1653 až 1657, 2000; Curr. Biol. sv. 10, č. 6, str. 333 až 336, 2000).

Dále zde používaný termín “AILIM” také zahrnuje polypeptid, který má v podstatě shodnou aminokyselinovou sekvenci jako AILIM každého savce, které jsou popsány v odkazech, a zvláště je výhodné, když se shoduje se sekvencí lidského AILIM. Tedy varianta lidského AILIM, která je podobná již uvedené krysí variantě AILIM (GenBank přístupové číslo: BAA82127), je také zahrnuta do “AILIM” tohoto vynálezu.

Termín “ligand AILIM” je zde také definován tak, že má podobný význam, jak bylo uvedeno výše.

Zde používaný termín “polypeptidy, které mají v podstatě shodnou aminokyselinovou sekvenci” znamená varianty polypeptidů, jak jsou popsány dále.

Tedy jestliže tyto varianty polypeptidů mají biologické vlastnosti v podstatě rovnocenné s přírodním typem AILIM (zvláště výhodně s AILIM pocházejícím od člověka), patří mezi polypeptidy tohoto vynálezu. Například ty, které mají • · aminokyselinovou sekvenci jako přírodní typ AILIM, v nichž je množství aminokyselinových zbytků, s výhodou 1 až 10 aminokyselinových zbytků, nejvýhodněji 1 až 5 aminokyselinových zbytků deletováno a/nebo modifikováno, a k nimž je množství aminokyselinových zbytků, s výhodou 1 až 10 aminokyselinových zbytků, nejvýhodněji 1 až 5 aminokyselinových zbytků přidáno.

Dále mohou být varianty polypeptidů, které mají v molekule množství těchto substitucí, delecí, modifikací a adicí aminokyselinových zbytků.

AILIM (zvláště lidský AILIM) a ligand AILIM (zvláště lidský ligand AILIM), které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou být připraveny, vedle techniky genové rekombinace, pomocí vhodného použití dobře známých postupů a technik z tohoto oboru, jako jsou metoda chemické syntézy, metoda pěstování buněčných kultur, atd., nebo pomocí těchto metod s některými modifikacemi.

Takové substituce, delece nebo inzerce aminokyselin mohou být dosaženy pomocí obvyklých postupů (Experimental Medicine: dodatek, “Příručka genového inženýrství” (1992); atd.).

Příklady metod pro vytváření mutovaných polypeptidů zmíněných výše, jsou místně cílená mutageneze pomocí syntetických oligonukleotidů (metoda přerušované dvouřetézcové DNA), bodová mutageneze, při níž je bodová mutace náhodně vnesena pomocí působení dusitanu nebo siřičitanu, metoda, kdy je deleční mutanta připravena pomocí enzymu Bal31 a podobně, kazetová mutageneze, metoda prohledávání spojovníku, metoda chybné inkorporace, metoda chybně párujících komplementárních primerů, metoda syntézy DNA segmentů atd.

Místně cílená mutageneze pomocí syntetických oligonukleotidů (metoda přerušované dvouřetézcové DNA), může být provedena například následujícím způsobem. Oblast, do níž je požadováno vnesení mutací, je klonována do fágového vektoru M13, který nese mutaci amber, a je připravena jednořetězcová fágová DNA. Poté, co je RF I DNA vektoru M13 bez mutace amber linearizována působením restrikčního enzymu, je DNA smíchána s jednořetězcovou fágovou DNA, uvedenou výše, denaturována a teplotně hybridizována, čímž se vytvoří dvouřetězcová DNA s přerušením. Syntetický oligonukleotid, do kterého byly vneseny mutace, je hybridizován s dvouřetězcovou DNA s přerušením, a pomocí reakce s DNA polymerázou a DNA • · ligázou je v ní připravena uzavřená kruhová dvouřetězcové DNA. Touto DNA jsou transfekovány buňky E. coli mutS, které postrádají schopnost opravy chybného párování. Buňky E. coli, které postrádají supresorovou aktivitu jsou infikovány rostoucími fágy a jsou vyhledávány pouze fágy bez mutace amber.

Metoda, kterou je vnášena bodová mutace pomocí dusitanu používá například princip, který je popsán dále. Jestliže je na DNA působeno dusitanem, báze jsou deaminovány, čímž se změní adenin na hypoxantin, cytozin na uráčil a guanin na xantin. Jestliže je deaminovaná DNA vnesena do buněk, “A:Τ’, respektive “G:C” jsou zaměněny za “G:C”, respektive “A:T”, protože hypoxantin, uráčil a xantin vytvářejí při replikaci DNA bázové páry s cytozinem, adeninem, respektive tyminem. Jednořetězcové DNA fragmenty, na které bylo působeno dusitanem, jsou hybridizovány s dvouřetězcovou DNA s přerušením a potom jsou mutované kmeny odděleny stejným způsobem, jako při místně cílené mutagenezi pomocí syntetických oligonukleotidů (metoda duplexu s mezerami).

Dále termín “AILIM” zde také zahrnuje “část” uvedeného AILIM. V tomto popise “část” znamená polypeptid obsahující jakoukoli částečnou sekvenci aminokyselinové sekvence výše uvedeného AILIM.

Je výhodné, když uvedená část označuje extracelulární oblast výše uvedeného AILIM (zvláště výhodně lidského AILIM) nebo jakoukoli její část.

“Ligand AILIM”, který je předmětem tohoto vynálezu, je také definován tak, že má podobný význam, jak bylo uvedeno výše.

“Část” uvedeného AILIM (s výhodou extracelulární oblasti AILIM nebo jakékoli její části) může být připravena pomocí postupů dobře známých v tomto oboru, jak jsou popsány dále, nebo podle modifikovaných postupů genové rekombinační techniky nebo chemické syntetické metody, nebo vhodným štěpením AILIM (zvláště výhodně lidského AILIM), izolovaného pomocí techniky buněčné kultury za použití proteolytických enzymů a podobně.

“Část ligandu AILIM” může být také připravena podobnými metodami, jak bylo popsáno výše.

“Lidská protilátka”, která je předmětem tohoto vynálezu, je lidská protilátka, která se váže k výše definovanému AILIM nebo jeho části (zvláště výhodné je, když se jedná o lidský AILIM nebo jeho část). Přesněji to znamená polyklonální protilátku (lidská polyklonální protilátka, lidské antisérum) pocházející z člověka nebo monoklonální • · protilátku (lidská monoklonální protilátka) pocházející z člověka.

“Lidská monoklonální protilátka”, která je předmětem tohoto vynálezu, je lidská monoklonální protilátka, která se váže k výše definovanému AILIM nebo jeho části (zvláště výhodně je, když se jedná o lidský AILIM nebo jeho část).

Přesněji řečeno, všechny oblasti obsahující variabilní a konstantní oblasti těžkého řetězce (řetězec H) a variabilní a konstantní oblasti lehkého řetězce (řetězec L) se skládají z lidského imunoglobulinu, který je odvozen z genu kódujícího uvedený lidský imunoglobulin. Řetězec L je představován lidským κ řetězcem nebo lidským λ řetězcem.

Lidská monoklonální protilátka, která se váže k AILIM (zvláště výhodné je, když se jedná o lidský AILIM), který je předmětem tohoto vynálezu, nebo k jeho části, je lidská monoklonální protilátka, která má charakteristiky definované v kterémkoli z výše uvedených bodů (5) až (42) nebo (84).

Přesněji řečeno, tento termín zahrnuje různé lidské monoklonální protilátky, které mají různé charakteristiky a průmyslové využití, jak je dále popsáno v příkladech a obrázcích.

Výhodné provedení lidské monoklonální protilátky, která je předmětem tohoto vynálezu, je taková lidská monoklonální protilátka, která se váže k AILIM nebo jeho části, a je definovaná v kterémkoli z výše uvedených bodů (5) až (42) nebo (84).

Nejvýhodnějším provedením je lidská monoklonální protilátka, která se váže k lidskému AILIM, jak je popsáno v bodu (30 nebo (39).

“Lidská monoklonální protilátka”, která je předmětem tohoto vynálezu, může být připravena imunizací následujících transgenních savců, jiných než člověk, kteří produkují lidskou protilátku, pomocí jakýchkoli imunogenů (antigenů), popsaných dále.

(a) přirozená buňka nebo uměle založená buněčná linie, exprimující výše zmíněný AILIM (zvláště výhodné je, když se jedná o lidský AILIM) na buněčném povrchu;

(b) genově rekombinovaná buňka připravená pomocí genově rekombinačních technik tak, že exprimuje výše zmíněný AILIM (zvláště výhodné je, když se jedná o lidský AILIM) na buněčném povrchu;

(c) buněčný lyzát získaný rozpuštěním buněk zmíněných výše v bodech (a) nebo (b), nebo fragment polypeptidu AILIM (zvláště výhodné je, když se jedná o lidský AILIM), vyčištěný z uvedeného buněčného lyzátu;

• ♦ · · (d) genově rekombinovaná buňka připravená pomocí genově rekombinačních technik tak, že exprimuje část (zvláště výhodně extracelulární oblast nebo jakýkoli její výhodný peptid) výše definovaného AILIM (zvláště výhodné je, když se jedná o lidský AILIM) ve formě rozpustného polypeptidů;

(e) supernatant buněčné kultury získaný kultivováním genově rekombinované buňky uvedené výše v bodu (d) nebo extracelulární oblast polypeptidů (rozpustný AILIM) AILIM (zvláště výhodné je, když se jedná o lidský AILIM), vyčištěný z uvedeného supernatantu buněčné kultury; nebo (f) část (zvláště výhodně extracelulární oblast nebo jakýkoli její výhodný peptid) chemicky syntetizovaného AILIM (zvláště výhodné je, když se jedná o lidský AILIM).

Dále může také být monoklonální protilátka, která je předmětem tohoto vynálezu, získána ze supernatantu buněčné kultury při kultivaci “genově rekombinovaného hostitele” [zde je uvedeným hostitelem eukaryotická buňka, ne však oplozené vajíčko (s výhodou savčí buňky, jako jsou CHO, lymfocyty a myelomové buňky)], které mohou být připraveny transformováním hostitele pomocí cDNA (s výhodou vektorem, který obsahuje cDNA), kódující jak těžký tak lehký řetězec takové lidské monoklonální protilátky, která je předmětem tohoto vynálezu, pomocí genově rekombinačních technik, a která produkuje genově rekombinovanou lidskou monoklonální protilátku.

Přesněji řečeno, lidská monoklonální protilátka, která je předmětem tohoto vynálezu, může být získána kultivací genově rekombinantních hostitelů, popsaných v jakémkoli z výše zmíněných bodů (60) až (62) nebo (64) až (80) tohoto vynálezu (zde je uvedeným hostitelem eukaryotická buňka, ne však oplozené vajíčko (s výhodou savčí buňky, jako jsou CHO, lymfocyty a myelomové buňky)).

Dále lidská monoklonální protilátka, která je předmětem tohoto vynálezu, může být lidská monoklonální protilátka, která má jaká jakýkoli isotyp, patřící k IgG (lgG1, lgG2, lgG3 a lgG4), IgH, IgA (lgA1 a lgA2), IgD nebo IgE. Je výhodné, když uvedená monoklonální protilátka patří k IgG (lgG1, lgG2, lgG3 a lgG4), ještě výhodněji lgG1, lgG2 nebo lgG4.

Lidská monoklonální protilátka, která je předmětem tohoto vynálezu, může být připravena imunizací transgenních savců, jiných než člověk, kteří produkují lidskou protilátku, jako je například transgenní myš produkující lidskou protilátku popsaná dále, pomocí jakýchkoli imunogenů (antigenů), zmíněných výše v bodech (a) až (f), za použití známých, obecně používaných metod.

Tedy například transgenní savec, jiný než člověk, který produkuje lidskou protilátku, je imunizován uvedeným antigenem v kombinaci s Freudovým adjuvans, jak okolnosti vyžadují. Polyklonální protilátka může být získána ze séra, odebraného tomuto imunizovanému zvířeti. Monoklonální protilátka může být vyrobena tak, že jsou připraveny fúzní buňky (hybridomy) z buněk produkujících protilátku, které jsou izolovány z uvedeného imunizovaného zvířete a myelomových buněk, které nemají schopnost produkovat autoprotilátky, a klonováním těchto hybridomů tak, aby byl vybrán klon produkující monoklonální protilátku se specifickou afinitou k antigenu použitému pro imunizaci savce.

Přesněji řečeno, monoklonální protilátka může být připravena tak, jak je popsáno dále. Tedy uvedený transgenní savec, jiný než člověk, který produkuje lidskou protilátku (zvláště výhodně “transgenní myš produkující lidskou protilátku”), je imunizován injekčním podáním jakéhokoli z imunogenů uvedených výše v bodech (a) až (c) intradermálně, intramuskulárně, nitrožilně, do tlapek nebo intraperitoneálně, jednou nebo vícekrát, nebo transplantováním uvedeného imunogenu do tohoto savce. Obvykle jsou imunizace prováděny jednou až čtyřikrát v intervalech jeden až 14 dní po první imunizaci. Buňky produkující protilátky jsou z takto imunizovaných savců získány jeden až pět dnů po poslední imunizaci. Frekvence a intervaly imunizace mohou být vhodně uspořádány např. v závislosti na vlastnostech použitého imunogenu.

Hybridomy, které vylučují lidskou monoklonální protilátku, mohou být připraveny podle metody Kóhlera a Milsteina (Nátuře, sv. 256, str. 495 až 497 (1975)) a jeho modifikovanou metodou. Hybridomy jsou tedy připravovány fúzí buněk produkujících protilátku, které jsou obsaženy ve slezině, lymfatických uzlinách, kostním morku nebo mandlích, s výhodou ve slezině, získaných z transgenního savce, jiného než člověk, který produkuje lidskou protilátku, a je imunizován jak bylo popsáno výše, a myelomových buněk, které nemají schopnost produkovat autoproti látky, které jsou odvozeny s výhodou ze savce jako je myš, krysa, morče, křeček, králík nebo člověk, a výhodněji z myši, krysy nebo člověka.

Například je možno jako myelomy pro buněčnou fúzi použít z myší pocházející myelomy P3/X63-AG8.653 (ATCC č. CRL-1580), P3/NSI/1-Ag4-1 (NS-1), P3/X63- Ag8.U1 (P3U1), SP2/0-Ag14 (Sp2/0, Sp2), NSO, PAI, FO, nebo BW5147, z krys pocházející myelomy 210RCY3-Ag.2.3., nebo z člověka pocházející myelomy U266AR1, GM1500-6TG-A1-2, UC729-6, CEM-AGR, D1R11, nebo CEM-T15.

'· · ··· ·· · · :· I • ···· . . · · ϊ .

: :: : · : :. : ’ : · ·

..............

Buňky produkující monoklonální protilátku (například hybridomy), mohou být vyhledávány tak, že jsou buňky kultivovány například v mikrotitračních destičkách, a je měřena reaktivita supernatantu z těchto kultur v jamce, v níž je pozorovatelný růst hybridomu, s imunogenem použitým pro imunizaci zmíněnou výše, například pomocí enzymatických imunologických testů, jako je radioimunologický test (RIA) a imunoabsorbční test s vázaným enzymem (ELISA).

Monoklonální protilátky mohou být produkovány pomocí hybridomů tak, že hybridomy jsou kultivovány in vitro nebo in vivo jako například v ascitové tekutině myši, krysy, morčete, křečka nebo králíka, s výhodou myši nebo krysy, výhodněji myši, a izolováním protilátek z výsledného supernatantu kultury nebo z ascitové tekutiny savce.

Monoklonální protilátky, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou být ve velkém měřítku připravovány pomocí následující metody:

(1) geny (cDNA atd.) kódující jak těžký, tak lehký řetězec uvedené monoklonální protilátky jsou z uvedených hybridomů klonovány;

(2) klonované geny kódující jak těžký, tak lehký řetězec jsou vloženy do oddělených vektorů nebo jednoho vektoru a tak je připraven expresní vektor;

(3) uvedený expresní vektor je přenesen do oplozeného vajíčka požadovaného savce, jiného než je člověk (například kozy);

(4) uvedené oplozené vajíčko s přeneseným genem je transplantováno do dělohy matky-pěstounky, aby byl získáno chimerní zvíře, jiné než je člověk;

(5) dalším křížením uvedené chimerní kozy s jiným savcem, jiným než je člověk, je připraven transgenní savec, jiný než je člověk (skot, koza, ovce nebo prase) s geny kódujícími uvedený jak těžký tak lehký řetězec, vložené jako endogenní gen; a (6) z mléka uvedeného transgenního savce, jiného než je člověk, je ve velkém měřítku získána monoklonální protilátka odvozená z uvedeného genu pro monoklonální protilátku (Nikkei Science, duben, 1997, str. 78 až 84).

In vitro kultivace buněk, produkujících monoklonální protilátky, může být provedena v závislosti na např. vlastnostech kultivovaných buněk, předmětu testující studie, a různých podmínkách kultivačních postupů, za použití známého živného média nebo jakéhokoli živného média odvozeného ze známého základního média pro růst, udržování a uložení hybridomů, a produkovat tak monoklonální protilátky do supernatantu buněčné kultury.

Příklady základních médií jsou média s nízkou koncentrací vápníku, jako jsou • · · · médium Ham'F12, médium MCDB153 nebo médium MEM s nízkou koncentrací vápníku, a média s vysokou koncentrací vápníku, jako jsou médium MCDB104, médium MEM, médium D-MEM, médium RPMI1640, médium ASF104 nebo médium RD. Základní média mohou obsahovat například séra, hormony, cytokiny a/nebo různé anorganické a organické látky, v závislosti na konkrétním objektu kultivace.

Monoklonální protilátky mohou být izolovány a čištěny ze supernatantu kultury nebo ascitové tekutiny, zmíněných výše, pomocí srážení nasyceným síranem amonným, srážením pomocí euglobulinu, srážením pomocí kyseliny kapronové, srážením pomocí kyseliny kaprylové, iontovýměnnou chromatografií (DEAE nebo DE52), afinitní chromatografií pomocí sloupce s navázanými protilátkami proti imunoglobulinu nebo pomocí sloupce a navázaným proteinem A.

Lidská monoklonální protilátka, která je předmětem tohoto vynálezu, zahrnuje lidské monoklonální protilátky složené z těžkého řetězce a/nebo lehkého řetězce, jejichž aminokyselinová sekvence v každém řetězci má jeden nebo více aminokyselinových zbytků deletován, substituován nebo přidán.

Termín “více aminokyselinových zbytků” zde znamená více aminokyselin, přesněji 1 až 10 aminokyselinových zbytků, s výhodou 1 až 5 aminokyselinových zbytků.

Částečná modifikace (delece, substituce, inzerce nebo adice), jak byly popsány výše, mohou být vneseny do aminokyselinové sekvence lidské monoklonální protilátky, která je předmětem tohoto vynálezu, pomocí částečné změny sekvence bází, která kóduje uvedenou aminokyselinovou sekvenci. Tato částečná změna sekvence bází může být vnesena standardní metodou pomocí dobře známé techniky místně cílené mutageneze (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, sv. 81, str. 5662 až 5666, 1984).

Termín „transgenní savec, ne však člověk, produkující lidskou protilátku“, zvláště transgenní myš produkující lidskou protilátku, která je výhodným provedením předloženého vynálezu, může být připravena podle publikované literatury (Nátuře Genetice, sv. 7, str. 13 až 21, 1994; Nátuře Genetics, sv. 15, str. 146 až 156, 1997; publikovaný japonský překlad mezinárodní přihlášky č. Hei 4-504 365; publikovaný japonský překlad publikace č. Hei 7-509 137; Nikkei Science, červen, str. 40 až 50, 1995; mezinárodní patentová publikace č. WO 94/25 585; Nátuře, sv. 368, str. 856 až 859, 1994; a publikovaný japonský překlad publikace č. Hei 6-500 233, atd.).

Přesněji řečeno, uvedená transgenní myš produkující lidskou protilátku může být • · · · • · • · • · · Λ · ·· ·· připravena například pomocí techniky, sestávající z následujících postupů:

(1) příprava knockoutované myši, jejíž vlastní gen pro těžký řetězec imunoglobulinu je funkčně inaktivován tím, že je alespoň část genového lokusu vlastního myšího těžkého řetězce imunoglobulinu substituována pomocí homologické rekombinace s markér genem pro toleranci k léku (jako je gen tolerance k neomycinu);

(2) příprava knockoutované myši, jejíž vlastní gen pro lehký řetězec imunoglobulinu (zvláště gen pro κ řetězec) je funkčně inaktivován tím, že je alespoň část genového lokusu vlastního myšího lehkého řetězce imunoglobulinu substituována pomocí homologické rekombinace s markér genem pro toleranci k léku (jako je gen tolerance k neomycinu);

(3) příprava transgenní myši u níž je požadovaná oblast lidského genu těžkého řetězce imunoglobulinu vložena do myšího chromozomu pomocí vektoru, představovaného umělým kvasinkovým chromozomem (YAC), schopným nést obrovský gen;

(4) příprava transgenní myši u níž je požadovaná oblast lidského genu lehkého řetězce imunoglobulinu (zvláště gen pro κ řetězec) je vložena do myšího chromozomu pomocí vektoru, představovaného umělým kvasinkovým chromozomem (YAC), schopným nést obrovský gen; a (5) příprava transgenní myši, jejíž vlastní geny jak pro těžký, tak pro lehký řetězec imunoglobulinu jsou oba funkčně inaktivovány a do jejíhož chromozomu jsou vloženy požadované oblasti jak lidského genu pro těžký, tak pro lehký řetězec imunoglobulinu, křížením knockoutované a transgenní myši, které jsou uvedeny výše v bodech (1) až (4), ve zvoleném pořadí.

Výše popsaná knockoutovaná myš může být připravena pomocí záměny vhodné oblasti vlastního myšího imunoglobulinového genu za cizí markér gen (jako je např. gen pro toleranci k neomycinu) na základě homologické rekombinace, aby došlo k inaktivaci uvedeného genu a nebyl přitom přestavěn. Pro inaktivaci pomocí výše uvedené homologické rekombinace může být použita například metoda označovaná jako pozitivní negativní selekce (PNS) (Nikkei Science, květen, str. 52 až 62, 1994).

Funkční inaktivace genu těžkého řetězce imunoglobulinu může být dosaženo například vnesením poškození do části J oblasti nebo C oblasti (například Cp oblasti). Funkční inaktivace genu lehkého řetězce imunoglobulinu (například κ řetězce) může být dosaženo například vnesením poškození do části J oblasti nebo C oblasti, nebo ♦

0 00·· oblastí za hranicemi J oblasti a C oblasti.

Transgenní myš může být připravena postupem, který je obvykle používán pro přípravu transgenních živočichů (například viz “Nejnovější návod pro pokusy s živočišnými buňkami”, LIC press, kapitola 7, str. 361 až 408, (1990)). Přesněji řečeno, například HPRT-negativní (bez genu pro hypoxantinguaninfosforibosyltransferázu) ES buňka (embryonální kmenová buňka), pocházející z blastocysty normální myši, je pomocí fúzní metody pro sféroplasty fúzována s kvasinkou obsahující vektor YAC, ve kterém je vložen gen kódující uvedený těžký řetězec lidského imunoglobulinu nebo jeho část, a HPRT gen. Buňky ES, jejichž vlastní myší gen je spojen s uvedeným cizím genem, jsou vybrány pomocí selekční HAT metody. Potom jsou vybrané ES buňky vpraveny pomocí mikroinjekce do oplozeného vajíčka, získaného z jiné normální myši (blastocysta) (Proč. Natí. Acad. Sci. USA, sv. 77, č. 12, str. 7380 až 7384 (1980); patent US č. 4 873 191). Blastocysta je transplantována do dělohy jiné normální myši jako matky-pěstounky. Potom se myší matce-pěstounce narodí chimerní transgenní myši. Křížením chimerní transgenní myši s normální myší jsou získány heterogenní transgenní myši. Vzájemným křížením heterogenních transgenních myší jsou podle Mendelových zákonů získány homogenní transgenní myši.

Termín “část monoklonální protilátky” v předloženém vynálezu znamená částečnou oblast výše zmíněné lidské monoklonální protilátky, která je předmětem tohoto vynálezu, a přesněji se jedná o F(ab’)2, Fab’, Fab, Fv (variabilní fragment protilátky), sFv, dsFv (disulfidovou vazbou stabilizovaný Fv), nebo dAb (protilátka s jednou doménou) (Exp. Opin. Ther. Patents, sv. 6, č. 5, str. 441 až 456 (1996)).

“F(ab’)₂” and “Fab”’ mohou být připraveny tak, že na imunoglobulin (monoklonální protilátku) je působeno proteázou jako je pepsin a papain, a označují fragment protilátky vytvořený štěpením imunoglobulinu v blízkosti disulfidových vazeb v pantových oblastech, které se nacházejí mezi každými dvěma H řetězci. Například papain štěpí IgG proti směru transkripce od disulfidových vazeb v pantových oblastech, které se nacházejí mezi každými dvěma H řetězci, a vytváří dva homologické fragmenty protilátky, ve kterých L řetězec, skládající se z V_L (L řetězec variabilní oblasti) a C_L (L řetězec konstantní oblasti) a fragment H řetězce, skládající se z V_H (H řetězec variabilní oblasti) a C_Hy1 (y1 oblast konstantní oblasti H řetězce), jsou spojeny v jejich C koncových oblastech disulfidovou vazbou. Každý z těchto dvou homologických fragmentů protilátek je nazýván Fab’. Pepsin také štěpí IgG po směru transkripce od tt ··»9 disulfidových vazeb v pantových oblastech, které se nacházejí mezi každými dvěma H řetězci, a vytváří fragment protilátky, který je poněkud větší než je fragment, v němž jsou dva výše uvedené Fab’ spojeny v pantové oblasti. Tento fragment protilátky je nazýván F(ab’)₂.

“Konstanta rychlosti vazby (ka)” zde znamená hodnotu označující vazebnou sílu (stupeň) uvedené monoklonální protilátky připojit se k antigenu, která je spočítána na základě kinetiky reakce protilátka antigen. “Konstanta rychlosti disociace (kd)” zde znamená hodnotu označující tendenci k disociaci (stupeň disociace) uvedené monoklonální protilátky od antigenu. “Disociační konstanta (Kd)” je hodnota získaná dělením uvedené “konstanty rychlosti disociace (kd)” hodnotou “konstanty rychlosti vazby (ka)”. Tyto konstanty jsou používány k popsání afinity monoklonální protilátky k antigenu a její schopnosti neutralizovat antigen.

Tyto konstanty mohou být analyzovány pomocí různých metod a mohou být snadno analyzovány pomocí komerční testovací soupravy BiacoreX (Amersham Pharmacia) nebo podobnou soupravou, podle návodu a experimentálních údajů, připojených k uvedené soupravě. Hodnoty ka, kd a Kd, získané pomocí zmíněné soupravy jsou vyjádřeny v jednotkách 1/M.s, 1/s, respektive M (mol). Vyšší hodnoty ka znamenají silnější schopnost testované monoklonální protilátky vázat antigen, a nižší hodnoty Kd ukazují na silnější schopnost protilátky neutralizovat antigen.

Lidská monoklonální protilátka, která je předmětem tohoto vynálezu, zahrnuje takové, které mají hodnoty ka, kd nebo Kd takové, jak je ukázáno v následujících bodech (1) až (3):

(1) lidská monoklonální protilátka, která se váže k lidskému AILIM nebo jeho části s konstantou rychlosti vazby (ka) 1,0 x 10⁴ (1/M.s) nebo více, s výhodou 1,0 x 10⁵(1/M.s) nebo více.

(2) lidská monoklonální protilátka, která se váže k lidskému AILIM nebo jeho části s konstantou rychlosti disociace (kd) 1,0 x W⁴ (1/s) nebo méně, s výhodou 1,0 x 10'⁵ (1/s) nebo méně.

(3) lidská monoklonální protilátka, která reaguje s lidským AILIM nebo jeho části s konstantou rychlosti disociace (Kd) 1,0 χ 10'⁷ (M) nebo méně, s výhodou 1,0 x W⁸(M) nebo méně a ještě výhodněji 1,0 χ 10’⁹ (M) nebo méně.

V tomto případě je čekáváno, že každá z výše popsaných hodnot ka, kd a Kd bude slabě fluktuovat v závislosti na různých podmínkách v době měření s tolerancí • · « « • v ·»» * chyb, ale prakticky nebudou obecně fluktuovat poměry těchto hodnot.

“Buňka produkující monoklonální protilátku” nebo genově rekombinovanou lidskou monoklonální protilátku produkující “genově rekombinantní hostitel”, který je předmětem tohoto vynálezu (zde uváděný hostitel je buňka s výjimkou oplozeného vajíčka), označuje jakoukoli buňku produkující výše zmiňovanou lidskou monoklonální protilátku, která je předmětem tohoto vynálezu.

Přesněji řečeno, například zahrnuje buňky popsané v jakémkoli z následujících bodů (1) až (3), ale není omezena pouze na ně:

(1) B buňka produkující monoklonální protilátky, získaná imunizací výše zmíněného transgenního savce, jiného než člověk, produkujícího lidské protilátky výše definovaným imunogenem (antigenem), a odebráním buněk z tohoto imunizovaného živočicha.

(2) výše zmíněná fúzní buňka (hybridom), získaná fúzí takto získané lidské B buňky produkující lidskou monoklonální protilátku s myelomovou buňkou, odvozenou ze savce.

(3) genově rekombinovaná buňka produkující lidskou monoklonální protilátku, získaná transformací buňky s výjimkou uvedené B buňky a hybridomů (například buňka CHO (buňky z vaječníku čínského křečka), buňka BHK (z ledvin novorozených křečků), lymfocyt jako je myelom) s genem kódujícím tuto lidskou monoklonální protilátku (gen kódující těžký řetězec nebo gen kódující lehký řetězec nebo oba geny), který je izolován z této B buňky produkující lidskou monoklonální protilátku nebo z fúzní buňky (hybridom), produkující lidskou monoklonální protilátku.

Zde termín „genově rekombinovaná buňka produkující genově rekombinovanou lidskou monoklonální protilátku“, uvedená výše v bodu (3), znamená hlavně genově rekombinovanou buňku produkující genově rekombinovanou lidskou monoklonální protilátku, vytvářenou B buňkou popsanou výše v bodu (1) nebo hybridomem zmíněným výše v bodu (2).

Výraz „hostitel“ v termínu „genově rekombinantní hostitel“ v tomto vynálezu zahrnuje vedle různých savčích buněk, jak byly popsány výše, oplozená vajíčka jakéhokoli savce, jiného než člověka (koza, vepř, ovce, hovězí dobytek atd.). Přenesením genu (gen kódující těžký řetězec nebo gen kódující lehký řetězec, nebo oba geny) kódujícího jakoukoli monoklonální protilátku (s výhodou lidskou monoklonální protilátku) proti lidskému AILIM, která je předmětem tohoto vynálezu, do *· »··* ·· · · ·· tohoto oplozeného vajíčka, může být získáno genové rekombinované oplozené vajíčko, které je předmětem tohoto vynálezu. Toto genově rekombinované oplozené vajíčko je použito pro přípravu transgenního živočicha pro získávání výše zmíněných proteinů z mléka ve velkém měřítku (Nikkei Science, duben, 1997, str. 78 až 84).

„Látka“ která je předmětem tohoto vynálezu, přesněji „látka která má schopnost modulovat přenos signálu, zprostředkovaný AILIM“, ještě přesněji „látka která má schopnost inhibovat množení buněk exprimujících AILIM nebo inhibovat produkci cytokinu buňkou exprimující AILIM“, znamená přirozenou látku přítomnou v přírodě nebo libovolnou uměle připravenou látku.

Výraz „látka“ podobající se „látce, která se váže k AILIM“ a „látka, která se váže k ligandu AILIM“ zde také znamená jakoukoli přirozenou látku v přírodě nebo jakoukoli uměle připravenou látku.

Výraz „přenos signálu zprostředkovaný AILIM“ zde znamená přenos signálu přes AILIM, vedoucí ke změně libovolného fenotypu u buněk exprimujících AILIM (množení buněk, aktivace buněk, inaktivace buněk, apoptoza a/nebo změna schopnosti produkovat libovolný cytokin v buňkách exprimujících AILIM).

„Látka“ může být klasifikována v zásadě do skupin „proteinová látka“ a „neproteinová látka“.

Příklady „proteinových látek“ jsou následující peptidy: protilátka (polyklonální protilátka, monoklonální protilátka nebo část monoklonální protilátky a zvláště výhodně lidská protilátka, zmíněná výše).

Pokud je látkou protilátka, je výhodné aby to byla monoklonální protilátka. Pokud je látkou monoklonální protilátka, látka zahrnuje nejen monoklonální protilátku odvozenou ze savce, jiného než je člověk, ale také rekombinantní chimerní monoklonální protilátku, rekombinantní zušlechtěnou monoklonální protilátku a lidskou monoklonální protilátku.

“Rekombinantní chimerní monoklonální protilátka” je zde monoklonální protilátka připravená pomocí genového inženýrství a přesněji to znamená chimerní protilátku jako je chimerní monoklonální protilátka myš/člověk, jejíž variabilní oblasti jsou odvozeny z imunoglobulinu savce, jiného než člověka (myš, krysa, křeček, atd.), a jejíž konstantní oblasti jsou odvozeny z lidského imunoglobulinu.

„Zušlechtěná monoklonální protilátka (protilátka se štěpem CDR)“, která je předmětem tohoto vynálezu, je monoklonální protilátka připravená pomocí genového *· ·· • · · «

9 » • · · 9

9 * ·· ···· *· *··· «· ··

I · 9 » · 99* » · * • · · ·· ·· • · ·

9 9 « • · · *

4· ·· inženýrství a přesněji to znamená zušlechtěnou monoklonální protilátku, kde části nebo celé oblasti určující komplementaritu hypervariabilních oblastí jsou odvozeny z oblastí určujících komplementaritu hypervariabilních oblastí monoklonální protilátky savce, jiného než člověka (myš, krysa, křeček, atd.), podpůrné oblasti ve variabilní oblasti jsou odvozeny z podpůrných oblastí ve variabilní oblasti lidského imunoglobulinu, a konstantní oblast je odvozena z konstantní oblasti lidského imunoglobulinu.

Oblasti určující komplementaritu hypervariabilních oblastí se nacházejí v hypervariabilní oblasti variabilní oblasti protilátky a jedná se o tři oblasti, které se přímo a komplementárně vážou k antigenu (komplementaritu určující zbytky, CDR1, CDR2 a CDR3). Podpůrné oblasti ve variabilní oblasti označují čtyři poměrně konzervované oblasti ležící proti směru transkripce, po směru transkripce nebo mezi třemi komplementaritu určujícími oblastmi (podpůrná oblast, FR1, FR2, FR3 a FR4).

Jinými slovy zušlechtěné monoklonální protilátka znamená takovou protilátku, v níž všechny oblasti s výjimkou části nebo celých oblastí určujících komplementaritu v hypervariabilní oblasti monoklonální protilátky pocházející ze savce, jiného než člověk, byly zaměněny odpovídajícími oblastmi, odvozenými z lidského imunoglobulinu.

Konstantní oblast, odvozená z lidského imunoglobulinu má aminokyselinovou sekvenci příslušející každému isotypu, jako jsou IgG (lgG1, lgG2, lgG3, lgG4), IgM, IgA, IgD, a IgE. Konstantní oblast zušlechtěné monoklonální protilátky, která je předmětem tohoto vynálezu, může být konstantní oblast z lidského imunoglobulinu, patřícího k jakémukoliv isotypu. S výhodou se jedná o konstantní oblast z lidského IgG. Podpůrné oblasti v konstantní oblasti, pocházející z lidského imunoglobulinu, nejsou nijak zvláště omezeny.

Pokud je látkou, která je předmětem tohoto vynálezu, polypeptid, látka zahrnuje následující polypeptid, fragment polypeptidu (oligopeptid), fúzní polypeptid a jakýkoli z vyjmenovaných polypeptidů chemicky modifikovaný. Příkladem oligopeptidu jsou peptidy obsahující 5 až 30 aminokyselin, s výhodou 5 až 20 aminokyselin. Chemická modifikace může být navržena v závislosti na účelu, například prodloužení poločasu výskytu v krvi v případě podávání in vivo, nebo zvýšená odolnost k degradaci nebo zvýšená absorbce v trávicím traktu při orálním podávání

Příklady polypeptidů jsou následující:

(1) polypeptid obsahující celou extracelulární oblast AILIM nebo její část;

• · • · • · · · • · · · · ···· ···· · · · · · * (2) fúzní polypeptid obsahující celou extracelulární oblast AILIM nebo její část a celou konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu, nebo jeho část; nebo (3) polypeptid, který se váže k AILIM.

Příklady “neproteinových” látek jsou DNA, RNA a chemicky syntetizovaná sloučenina.

Výraz „DNA” zde znamená „DNA obsahující částečnou nukleotidovou sekvenci DNA nebo chemicky modifikovanou DNA této sekvence”, která je vhodná jako negativní řetězec DNA farmaceuticky upravený na základě nukleotidové sekvence DNA (včetně cDNA a genomové DNA) kódující AILIM (s výhodou lidský AILIM). Negativní řetězec DNA může inhibovat transkripci DNA kódující AILIM na mRNA, nebo translaci mRNA na protein tím, že hybridizuje s DNA nebo RNA kódující AILIM.

Výraz částečná nukleotidová sekvence, jak je použit zde, znamená částečnou nukleotidovou sekvenci obsahující libovolný počet nukleotidů v libovolné oblasti. Částečná nukleotidová sekvence sestává z 5 až 100 po sobě následujících nukleotidů, s výhodou 5 až 70 po sobě následujících nukleotidů, ještě výhodněji 5 až 50 po sobě následujících nukleotidů, a ještě výhodněji 5 až 30 po sobě následujících nukleotidů.

Když je DNA použita jako negativní řetězec DNA pro farmaceutické účely, DNA sekvence může být částečně chemicky modifikována kvůli prodloužení poločasu přetrvávání koncentrace DNA, podané pacientům, v krvi (stabilitě), pro zvýšení permeability intracytoplasmatické membrány pro DNA, pro zvýšení odolnosti k degradaci nebo pro zvýšení absorbce orálně podávané DNA v trávicích orgánech. Chemická modifikace zahrnuje, například modifikaci fosfátových vazeb, ribózy, nukleotidových bází, cukerné složky, 3' konce a/nebo 5' konce ve struktuře oligonukleotidové DNA.

Modifikace fosfátové vazby zahrnuje např. převedení jedné nebo více vazeb na fosfodiesterové vazby (D-oligo), fosforothiové vazby, fosforodithiové vazby (S-oligo), methylfosfonát (MP-oligo), fosforoamidové vazby, nefosfátové vazby nebo methylfosfonothiové vazby, nebo jejich kombinace. Modifikace ribózy zahrnuje, například, přeměnu ribózy na 2'-fluorribózu nebo 2'-O-methylribózu. Modifikace nukleotidové base zahrnuje například přeměnu na 5-propynyluracil nebo 2aminoadenin.

Výraz „RNA” zde znamená „RNA obsahující částečnou nukleotidovou sekvenci RNA nebo chemicky modifikovanou RNA této sekvence”, která je vhodná jako ** ” ” ’* ......

protismyslná RNA, farmaceuticky upravená na základě nukleotidové sekvence RNA kódující AILIM (s výhodou lidský AILIM). Protismyslná RNA může inhibovat transkripci DNA kódující AILIM na mRNA, nebo translaci mRNA na protein tím, že hybridizuje s DNA nebo RNA kódující AILIM.

Výraz částečná nukleotidové sekvence, jak je použit zde, znamená částečnou nukleotidovou sekvenci obsahující libovolný počet nukleotidů v libovolné oblasti. Částečná nukleotidové sekvence sestává z 5 až 100 po sobě následujících nukleotidů, s výhodou 5 až 70 po sobě následujících nukleotidů, ještě výhodněji 5 až 50 po sobě následujících nukleotidů, a ještě výhodněji 5 až 30 po sobě následujících nukleotidů.

Sekvence protismyslné RNA může být částečně chemicky modifikována kvůli prodloužení poločasu přetrvávání koncentrace RNA, podané pacientům, v krvi (stabilitě), pro zvýšení permeability intracytoplasmatické membrány pro RNA, pro zvýšení odolnosti k degradaci nebo pro zvýšení absorbce orálně podávané DNA v trávicích orgánech. Příkladem chemické modifikace je chemická modifikace použitá u výše uvedené protismyslné DNA.

Příklady „chemicky syntetizované sloučeniny“ jsou libovolné sloučeniny, s výjimkou výše uvedené DNA, RNA a proteinových látek, které mají molekulovou hmotnost od 100 do 1000, s výhodou sloučenin, které mají molekulovou hmotnost od 100 do 800 a ještě výhodněji s molekulovou hmotností 100 až 600.

„Polypeptid“ zahrnutý ve výše uvedené definici „látka“ znamená část (fragment) polypeptidového řetězce tvořícího AILIM (s výhodou lidský AILIM), s výhodou celou extracelulární oblast polypeptidů tvořícího AILIM nebo její část (případně může být přidáno na N-konec nebo C-konec oblasti 1 až 5 aminokyselin).

AILIM zahrnutý v předloženém vynálezu je transmembránová molekula pronikající buněčnou membránou, obsahující 1 nebo 2 polypeptidové řetězce.

Výraz „transmembránový protein“ zde znamená protein, který se spojuje s membránou pomocí hydrofobní peptidové oblasti, která proniká jednou nebo vícekrát do lipidické dvojvrstvy membrány, a jehož struktura je jako celek složena ze tří hlavních oblastí, a to extracelulární oblasti, transmembránová oblasti a cytoplazmatické oblasti, jak je to vidět u mnoha receptorů nebo povrchových buněčných molekul. Takový transmembránový protein je potom složkou každého receptoru nebo povrchové buněčné molekuly ve formě monomeru, homodimeru, heterodimeru nebo oligomeru, spolu s jiným řetězcem (řetězci) se stejnou nebo odlišnou aminokyselinovou sekvencí.

• · · ·

Výraz „extracelulární oblast“ zde znamená celou strukturu nebo část z celkové struktury (částečná oblast) výše uvedeného transmembránového proteinu, kde se část struktury nachází vně membrány. Jinými slovy, označuje celou oblast nebo část oblasti transmembránového proteinu, kromě oblasti nacházející se v membráně (transmembránová oblast) a oblasti nacházející se v cytoplazmě, která následuje za transmembránovou oblastí (cytoplazmatická oblast).

„Fúzní polypeptid“, zahrnutý ve výše uvedeném termínu „proteinová látka“ znamená fúzní polypeptid obsahující celou extracelulární oblast polypeptidů tvořícího AILIM nebo její část (s výhodou lidský AILIM), a „celou konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu nebo její část (Ig, s výhodou lidského lg)“. Je výhodné, když se jedná o fúzní polypeptid s extracelulární oblastí AILIM a částí konstantní oblasti těžkého řetězce lidského IgG, a zvláště výhodné je, když fúzní polypeptid obsahuje extracelulární oblast AILIM a oblast (Fc) těžkého řetězce lidského IgG, která obsahuje pantovou oblast, doménu CH2 a doménu CH3. Jako IgG je výhodný IgG 1 a jako AILIM jsou výhodné lidský, myší nebo krysí AILIM (s výhodou lidský).

Výraz „celá konstantní oblast těžkého řetězce lidského imunoglobulinu (lg) nebo její část“ zde znamená konstantní oblast nebo Fc oblast zde popsaného těžkého řetězce (H řetězec) imunoglobulinu, pocházejícího od člověka, nebo její část. Imunoglobulinem může být jakýkoli imunoglobulin patřící do jakékoli třídy a jakékoli podtřídy. Přesněji, příklady imunoglobulinu jsou IgG (lgG1, lgG2, lgG3 a lgG4), IgM, IgA (lgA1 a lgA2), IgD a IgE. S výhodou je imunoglobulinem IgG (lgG1, lgG2, lgG3 nebo lgG4) nebo IgM. Příklady zvláště výhodných imunoglobulinů, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jsou od člověka pocházející IgG (lgG1, lgG2, lgG3 nebo lgG4).

Imunoglobulin má strukturní jednotky ve tvaru Y, v níž jsou čtyři řetězce, složené ze dvou homologických lehkých řetězců (L řetězce) a dvou homologických těžkých řetězců (H řetězce), spojeny disulfidovými vazbami (S-S vazby). Lehký řetězec se skládá z variabilní oblasti lehkého řetězce (V_L) a konstantní oblasti lehkého řetězce (C_L). Těžký řetězec se skládá z variabilní oblasti těžkého řetězce (V_H) a konstantní oblasti těžkého řetězce (C_H).

Konstantní oblast těžkého řetězce se skládá z určitých domén, které mají aminokyselinové sekvence, charakteristické pro každou třídu (IgG, IgM, IgA, IgD a IgE) a každou podtřidu (lgG1, lgG2, lgG3 a lgG4, lgA1 a lgA2).

Těžký řetězec IgG (lgG1, lgG2, lgG3 a lgG4) je složen ve směru od N-konce z V_H, domény CH1, pantové oblasti, domény CH2 a domény CH3.

Podobně těžký řetězec lgG1 je složen ve směru od N-konce z V_H, domény Cyi 1, pantové oblasti, domény Cyi2 a domény Cyi3. Těžký řetězec lgG2 je složen ve směru od N-konce z V_H, domény Cy₂1, pantové oblasti, domény Cy₂2 a domény Cy₂3. Těžký řetězec lgG3 je složen ve směru od N-konce z V_H, domény CY3I, pantové oblasti, domény Cyý2 a domény Cy33. Těžký řetězec lgG4 je složen ve směru od N-konce z V_H, domény Cy₄1, pantové oblasti, domény Cy^. a domény Cy₄3.

Těžký řetězec IgA je složen ve směru od N-konce z V_H, domény Ca1, pantové oblasti, domény Ca2 a domény Ca3.

Podobně těžký řetězec lgA1 je složen ve směru od N-konce z V_H, domény CaU, pantové oblasti, domény Coh2 a domény Cch3. Těžký řetězec lgA2 je složen ve směru od N-konce z V_H, domény Ca₂1, pantové oblasti, domény Ca₂2 a domény Ca₂3.

Těžký řetězec IgD je složen ve směru od N-konce z V_H, domény C51, pantové oblasti, domény C52 a domény CÓ3.

Těžký řetězec IgM je složen ve směru od N-konce z V_H, domény Cp1, domény Cp2, domény Cp3 a domény Cp4, a nemá pantovou oblast, která je vidět u IgG, IgA a IgD.

Těžký řetězec IgE je složen ve směru od N-konce z V_H, domény Ce1, domény Ce2, domény Ce3 a domény Ce4, a nemá pantovou oblast, která se nachází v IgG, IgA a IgD.

Když je například na IgG působeno papainem, je rozštěpen v pantové oblasti, kde disulfidové vazby spojují dva těžké řetězce, nedaleko za disulfidovými vazbami směrem k N-konci, a vytvoří tak dva homologické Fab, ve kterých je fragment těžkého řetězce, složený z V_H a CH1, spojen disulfidovou vazbou s jedním lehkým řetězcem, a jeden Fc, v němž jsou spojeny disulfidovými vazbami dva homologické fragmenty těžkého řetězce, složené z pantové oblasti, domény CH2 a domény CH3 (viz. „Ilustrovaná imunologie“, původní 2. vydání, Nandoko, str. 65 až 75 (1992); a “Středisko nejnovější lékařské vědy ‘Rozpoznávací mechanizmus imunitního systému’”, Nankodo, str. 4 až 7 (1991); a jiné).

Výraz „část konstantní oblasti těžkého řetězce imunoglobulinu“ zmíněný výše, označuje část konstantní oblasti těžkého řetězce imunoglobulinu, který má strukturní charakteristiky uvedené výše, a s výhodou je to konstantní oblast bez domény C1 nebo • · • · · · • · · · · · · ····« ·· · · • ·· · · · · ··· ···· ···· · . _ ·· ·· ·· ··

Fc oblasti. Jejím příkladem je oblast složená z pantové oblasti, domény C2 a domény C3 z každého jednotlivého IgG, IgA a IgD, a oblast složená z domény C2 , domény C3 a domény C4 z každého jednotlivého IgM a IgE. Jejím zvláště výhodným příkladem je oblast Fc, pocházející z lidského lgG1.

Výše uvedený fúzní polypeptid má výhodu v tom, že fúzní polypeptid může být neobyčejně snadno vyčištěn pomocí afinitní chromatografie na sloupci, který využívá vlastnost proteinu A, že se specificky váže k fragmentu imunoglobulinu, protože fúzní polypeptid, který je předmětem tohoto vynálezu, má jako jednu z fúzních složek část konstantní oblasti (například Fc) imunoglobulinu, jako je např. výše zmíněný IgG. Dále, protože jsou dostupné různé protilátky proti Fc různých imunoglobulinů, je možno u fúzních polypeptidů snadno provádět imunologický test pomocí protilátek proti Fc.

Pojem „polypeptid, který se váže k AILIM“ je zahrnut v pojmu „polypeptid“, zahrnutém ve výše uvedené definici termínu „látka“.

Specifické příklady „polypeptidů, který se váže k AILIM“ je celý nebo část polypeptidů, tvořícího známý B7h, B7RP-1, GL50 nebo molekula nazývaná LICOS, což jsou ligandy, které interagují s AILIM (Nátuře, sv. 402, č. 6763, str. 827 až 832, 1999; Nátuře Medicine, sv. 5, No. 12, str. 1365 až 1369, 1999; J. Immunology, sv. 164, str. 1653 až 1657, 2000; Curr. Biol., sv. 10 č. 6, str. 333 až 336, 2000).

Je výhodné, když tímto polypeptidem je polypeptid obsahující celou extracelulární oblast nebo část extracelulární oblasti výše uvedených ligandu (B7h, B7RP-1, GL50, LICOS), nebo fúzní polypeptid, který obsahuje tento polypeptid spolu s celou konstantní oblastí nebo částí konstantní oblasti těžkého řetězce imunoglobulinu (s výhodou lidského imunoglobulinu). Termíny „extracelulární oblast“ a „konstantní oblast těžkého řetězce“ zde mají stejný význam jako výše.

Polypeptid, část polypeptidů (fragment) a fúzní polypeptid, uvedené výše, mohou být připraveny nejen pomocí rekombinační DNA technologie, jak je uváděno dále, ale také pomocí metody v oboru dobře známé, jako je syntetická chemická metoda a metoda kultivování buněčných kultur, a rovněž pomocí variant těchto metod.

Termín „protilátka“ v předloženém vynálezu může být polyklonální protilátka (antisérum) nebo monoklonální protilátka proti savčímu AILIM (zvláště výhodně proti lidskému AILIM) definovanému výše, s výhodou se jedná o monoklonální protilátku.

Přesněji je protilátkou taková protilátka, která má schopnost inhibovat množení buněk exprimujících AILIM tím, že se váže k AILIM, nebo inhibovat produkci interferonu • · · · • · · ·· · ♦··· ····· ·· · · · · • ·· ··· · ··· · · ··* ·· ·’ ·· ......

γ nebo interleukinu 4 buňkami exprimujícími AILIM tím, že se váže k AILIM.

Termín „opožděný typ přecitlivělosti“ zde označuje přecitlivělost zprostředkovanou buněčnou imunitou (zvláště zprostředkovanou T buňkami typu Th1), tedy tato přecitlivělost je zprostředkována T buňkami senzibilizovanými antigenem (paměťová T buňka, která si pamatuje antigen) a vztahuje se k jakékoli přecitlivělosti, u které trvá přibližně 24 až 48 hodin než vyvine alergickou reakci doprovázenou zánětem, který je způsoben uvedenými paměťovými T buňkami, když je živý organizmus, senzibilizovaný antigenem, vystaven opětnému kontaktu s týmž antigenem.

Tento opožděný typ přecitlivělosti zahrnuje přecitlivělost k infekčnímu patogennímu antigenu jako je přecitlivělost k tuberkulinu, pocházejícímu od Mycobacterium tuberculosis, přechodný Jones-Moteův opožděný typ přecitlivělosti k nepatrnému množství proteinu, kontaktní přecitlivělost k chemikáliím jako je chlorid kyseliny pikrové nebo rostlinný toxin jako je lak, nebo přecitlivělost týkající se odmítnutí štěpu, pozorovaná u aloštěpu.

Termín „farmaceutický prostředek“ zde znamená prostředek vhodný jako lék, který obsahuje jako účinnou složku protilátku (s výhodou lidskou protilátku) nebo její část, která se váže k AILIM (s výhodou k lidskému AILIM), nebo monoklonální protilátku (s výhodou lidskou monoklonální protilátku) nebo její část, a „farmakologicky přijatelný nosič“.

“Farmaceuticky přijatelný nosič“ zahrnuje excipient, ředidlo, činidlo zvětšující objem, rozkládací činidlo, stabilizátor, konzervační činidlo, pufr, emulgátor, aromatické činidlo, barvící činidlo, sladidlo, činidlo zvyšující viskozitu, příchutě, činidlo zvyšující rozpustnost a jiné přísady.

Za použití jednoho nebo více těchto nosičů může být farmaceutický prostředek formován do tablet, pilulek, prášků, granulí, injekcí, roztoků, kapslí, pastilek, výtažků, suspenzí, emulzí nebo sirupů.

Farmaceutický prostředek může být podáván orálně nebo parenterálně. Jiné formy parenterálního podávání zahrnují roztok pro zevní použití, čípek pro rektální podání a pesar, předepisované obvyklým způsobem, které obsahují jednu nebo více aktivních složek.

Dávka může varírovat v závislosti na věku, pohlaví, tělesné hmotnosti a příznaku u pacienta, účinku léčby, způsobu podání, periodě léčby nebo druhu účinné složky • « ·· ·· ·· ·· ·· ···· (polypeptid nebo protilátka, zmiňované výše), která je obsažena ve farmaceutickém prostředku. Obvykle může být farmaceutický prostředek podáván dospělému jedinci v dávce 10 pg až 1000 mg (nebo 10 pg až 500 mg) najedno podání. V závislosti na různých podmínkách mohou být v některých případech postačující i dávky nižší, než jsou výše uvedené, a v jiných případech může být nezbytná dávka vyšší, než jsou výše uvedené.

Injekce může být konkrétně připravena rozpuštěním nebo suspendováním protilátky v netoxickém, farmaceuticky přijatelném nosiči jako je fyziologický roztok nebo komerčně dostupná destilovaná voda pro injekce a úpravou koncentrace na 0,1 pg až 10 mg protilátky na mililitr nosiče.

Takto připravená injekce může být podána lidskému pacientovi, který léčení vyžaduje, v dávce od 1 pg do 100 mg/kg tělesné hmotnosti, s výhodou od 50 pg do 50 mg/kg tělesné hmotnosti, jednou nebo vícekrát za den. Příklady způsobu podání jsou lékařsky vhodné způsoby podání, jako jsou intravenózní injekce, podkožní injekce, intradermálni injekce, intramuskulární injekce nebo intraperitoneální injekce, s výhodou intraperitoneální injekce.

Injekce může být také připravena v nevodném rozpouštědle (například propylenglykol, polyethylenglykol, rostlinný olej jako je olivový olej, a alkohol jako je ethanol), suspenze nebo emulze.

Injekce může být sterilizována filtrací přes filtr nepropouštějící bakterie, smícháním s baktericidním činidlem nebo ozářením. Injekce může být připravena ve formě, kdy je připravena k použití. Je tedy lyofilizována, aby byla ve formě pevného sterilního prostředku, a může být před použitím rozpuštěna ve sterilní destilované vodě pro injekce nebo v jiném rozpouštědle.

Farmaceutické prostředky obsahující lidské protilátky, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jsou vhodné jako farmaceutické přípravky, které neindukují u hostitele imunologické odmítnutí způsobené HAMA (lidská protilátka proti myši), pro kontrolu řadu biologických reakcí (např. množení buněk exprimujících AILIM, produkci cytokinů buňkami exprimujícími AILIM, imunologická cytolýza nebo smrt (apoptoza) buněk exprimujících AILIM a jiné), které jsou spojeny s přenosem kostimulačního signálu zprostředkovaným AILIM (sekundární signál) buňkám exprimujícím AILIM, a/nebo jako farmaceutické přípravky pro léčení nebo prevenci různých nemocí tím, že potlačují • · • · · ·

..............

nebo inhibují objevení a/nebo vývoj nemocí, spojených s přenosem signálu, který je zprostředkován AILIM.

Termín „imunologická cytolýza“ zde označuje následující biologický jev.

Lýza buňky (cytolýza) může být indukována protilátkou (zvláště protilátkou, která lyžuje buňku) a rovněž vazbou s buňkami zabíječi. Protilátka lyžující buňku je cytotoxická protilátka, která má zejména schopnost lyžovat buňky, jako jsou imunitní buňky, buňky tkání nebo spermie. Když se protilátka váže na antigen na buněčném povrchu, způsobí u buňky cytotoxický efekt nebo v přítomnosti komplementu indukuje cytolýzu.

Tato imunitní cytolýza je indukována působením komplementu ve spojení se specifickou vazbou protilátky na antigen buněčného povrchu. Protilátka vázaná k povrchovému antigenu aktivuje komplement C1 (C1). Následkem toho se sérií komplement-fixačních reakcí s komplementy C2 až C9 (C2-C9) tvoří na buňce poškozená místa, a potom je buněčný obsah z buňky uvolněn, čímž je buňka lyžována.

Termín „buněčná cytotoxicita závislá na protilátkách“ zde označuje biologický jev, jehož název je také zkracován jako „ADCC“ a je to cytotoxické působení efektorových buněk, jako jsou lymfocyty, makrofágy nebo polymorfonukleární leukocyty, na cílové buňky, které vyžaduje při indukci cytotoxického jevu nikoli pouze efektorové a cílové buňky, ale také účast protilátek.

Termín „reakce smíšených lymfocytů“ zde znamená biologický jev, který je zkráceně označován jako „MLR“. Reakce je také označována jako reakce smíšených leu.kocytů.

Alogenní leukocyty nebo lymfocyty, pocházející z odlišných jedinců jsou vzájemně smíchány a kultivovány po dobu několika dnů, čímž je umožněna tvorba blastu z buněk a syntéza DNA v těchto buňkách (tj. buněčné množení). Tato reakce je označována jako MLR (alogenní MLR).

DNA syntéza (buněčné množení) může být analyzována tím, že je zastaveno množení jednotlivých druhů lymfocytů. Zastavení syntézy může být provedeno působením ozáření nebo mitomycinu. Analýza může být provedena měřením množství syntetizované DNA v jiném druhu lymfocytů.

Množství syntetizované DNA může být analyzováno měřením inkorporace tymidinu značeného radioaktivním izotopem, jako je tritium, do buněčného jádra.

• · • · · · « · · · • « · · · · ·· · · • · · · · · · 9 9 9 9 9 9 »· · · · · · · «

DNA kódující AILIM (zvláště výhodně lidský AILIM), která je předmětem tohoto vynálezu, může být získána pomocí postupů obecně používaných pro klonování cDNA z mRNA kódující AILIM; postupu pro izolaci genomové DNA a její sestřih; postupu pro přípravu DNA pomocí PCR za použití sekvence cDNA nebo mRNA jako matrice; nebo postupu pro chemickou syntézu DNA.

DNA kódující ligand AILIM, který je předmětem tohoto vynálezu, může být také získán stejným způsobem, jak je popsáno výše.

DNA kódující AILIM (zvláště výhodně lidský AILIM), která je předmětem tohoto vynálezu, může být připravena rozštěpením (trávením) DNA, která obsahuje DNA kódující AILIM, pomocí vhodných restrikčních enzymů, a pokud je to vyžadováno, je výsledný DNA fragment ligován pomocí vhodné DNA polymerázy s DNA kódující mezerník nebo s označující DNA, apod. DNA kódující ligand AILIM může také být připravena stejným způsobem.

Příklad metody bude dále ukázán při klonování cDNA, kódující AILIM (zvláště výhodný je lidský AILIM; protein je níže označován jako protein, o který se jedná), z mRNA.

DNA kódující ligand AILIM může také být klonována stejným způsobem.

Zaprvé, mediátorová RNA kódující protein, o který se jedná, je připravena z tkání nebo buněk exprimujících a produkujících protein, o který se jedná. mRNA může být připravena izolací celkové RNA pomocí známé metody, jako je metoda s guanidinthiokyanátem (Chirgwin, J.M. a kol., Biochemistry, sv. 18, str. 5294, 1979), metodou používající horký fenol nebo metodou AGPC, a jejím zpracováním pomocí afinitní chromatografie za použití oligo-dT celulózy nebo poly-U Sepharosy.

cDNA je tedy syntetizována například dobře známou metodou používající reverzní transkriptázu, přičemž jako matrice je použita takto získaná mRNA, podle metody Okayama a kol. (Mol. Cell. Biol. sv. 2, str. 161 (1982); tamtéž sv. 3, str. 280 (1983)) nebo podle metody Hoffman a kol. (Gene sv. 25, str. 263 (1983)), a převedena na dvouřetězcovou cDNA. Knihovna cDNA je připravena transformováním E. coli plazmidovými vektory, fágovými vektory nebo kosmidovými vektory, které tuto cDNA obsahují, nebo transfekováním E. coli po provedeném in vitro sbalení.

Plazmidové vektory použité v tomto vynálezu nejsou omezeny, pokud se replikují a udržují v hostitelích. Také mohou být použity jakékoli fágové vektory, které se mohou v hostitelích replikovat. Příklady obvykle používaných klonovacích vektorů jsou pUC19, • · · · · · » · · • · • · · ·

Agt10, Agt11, atd. Když je vektor podroben hromadnému imunologickému prohledávání jak je zmíněno dále, je s výhodou použit vektor obsahující promotor, který může exprimovat gen kódující v hostiteli polypeptid, který je předmětem tohoto vynálezu.

cDNA může být vložena do plazmidu například pomocí metody Maniatis a kol. (Molekulární klonování, Laboratorní příručka, 2. vyd., Cold Spring Harbor Laboratory, str. 1.53, 1989). cDNA může být vložena do fágového vektoru například pomocí metody Hyunh a kol. (DNA klonování, praktický přístup, sv. 1, str. 49 (1985)). Tyto metody mohou být jednoduše provedeny pomocí komerčně dostupné klonovací soupravy (například výrobek od Takara Shuzo). Takto získaný rekombinantní plazmid nebo fágový vektor je vnesen do vhodných hostitelských buněk, jako jsou prokaryota (například E. coli: XLIBIue MRF’, DH5a, HB101, MC1061/P3 atd.).

Příklady metody pro vnesení plazmidu do hostitele jsou metoda s chloridem vápenatým, metoda s chloridem vápenatým/chloridem rubidným popsaná v Molekulární klonování, Laboratorní příručka (druhé vydání, Cold Spring Harbor Laboratory, str. 1.74, 1989) a elektroporační metoda. Fágové vektory mohou být vneseny do hostitelských buněk například pomocí metody v níž jsou fágové DNA vneseny do rostoucích hostitelů po in vitro sbalení. In vitro sbalení může být snadno provedeno pomocí komerčně dostupné in vitro sbalovací soupravy (například výrobek od Stratagene nebo Amersham).

cDNA kódující polypeptid, který je předmětem tohoto vynálezu, může být izolována z cDNA knihovny, takto připravené pomocí výše zmíněné metody, kombinací běžných metod pro hromadné vyšetření cDNA.

Například klon obsahující požadovanou cDNA může být vyhledán pomocí známé metody hybridizace kolonií (Crunstein a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, sv. 72, str. 3961 (1975)) nebo pomocí metody hybridizace plaků (Molekulární klonování, Laboratorní příručka, druhé vydání, Cold Spring Harbor Laboratory, str. 2.108 (1989)) přičemž jako sondy jsou použity chemicky syntetizované oligonukleotidy značené ³²P, které odpovídají aminokyselinové sekvenci polypeptidů, který je předmětem tohoto vynálezu. Jinou možností je vyhledat klon, obsahující DNA fragment kódující specifickou oblast uvnitř polypeptidů, který je předmětem tohoto vynálezu, pomocí amplifikace oblasti PCR reakcí se syntetickými PCR primery.

Když je použita cDNA knihovna připravená pomocí cDNA expresního vektoru (například fágového vektoru AZAPII), požadovaný klon může být vyhledán pomocí « ♦ • * • « «· « « · · • · · · « « · • » « · · • * · · ···· ·»·

A* >· » · · · · » · · · · reakce antigen-protilátka za použití protilátky proti polypeptidu, který je předmětem tohoto vynálezu. Metoda vyhledávání za použití PCR metody je s výhodou používána tam, kde je prohledáváno velké množství klonů.

Takto získaná nukleotidová sekvence DNA může být určena pomocí metody Maxama-Gilberta (Maxam a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, sv. 74, str. 560 (1977)) nebo metodou terminace řetězce syntetickými dideoxynukleotidy, která využívá fága M13 (Sanger a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, sv. 74, str. 5463 až 5467 (1977)). Celý gen nebo část genu kódujícího polypeptid, který je předmětem tohoto vynálezu, může být získán vyštěpením z klonu, získaného výše popsaným způsobem, pomocí restrikčních enzymů atd.

DNA kódující polypeptid, který je předmětem tohoto vynálezu, může být izolována z genomové DNA, která pochází z buněk exprimujících polypeptid, který je předmětem tohoto vynálezu, pomocí následujících metod.

Takové buňky jsou s výhodou solubilizovány pomocí SDS nebo proteinázou K a DNA je zbavena proteinů opakovanou extrakcí fenolem. RNA jsou s výhodou rozštěpeny ribonukleázou. Získaná DNA je částečně štěpena vhodnými restrikčními enzymy a získané DNA fragmenty jsou namnoženy pomocí vhodného fága nebo kosmidu, a je tak připravena knihovna. Potom jsou detekovány klony obsahující požadovanou sekvenci, například pomocí radioaktivně značených DNA sond, a celý nebo část genu kódujícího polypeptid, který je předmětem tohoto vynálezu, je z klonů získán vyštěpením pomocí restrikčního enzymu atd.

Příprava DNA kódující protein o který se jedná, pomocí PCR, může být provedena běžnou metodou, kdy je jako matrice použita známá mRNA nebo cDNA, kódující protein o který se jedná („PCR techniky pro amplifikaci genu - základní a nové technologie“ KYORITSU SHUPPAN, 1992, atd ).

DNA kódující protein o který se jedná, může být také chemicky syntetizována běžnou metodou, založenou na nukleotidové sekvenci kódující protein o který se jedná.

AILIM, který je předmětem tohoto vynálezu, nebo jeho část (s výhodou extracelulámí oblast), může být připraven jako rekombinantní protein obvyklou metodou pomocí běžně používaných genově rekombinačních technik, za použití DNA získané štěpením DNA kódující AILIM (cDNA nebo genomová DNA obsahující intron), na základě metody uvedené výše, pomocí vhodných restrikčních enzymů, a získán tak DNA fragment kódující AILIM, a pokud je to dále vyžadováno, je výsledný DNA • » · * fr v · • · · · » • · í »* • * ·« ··« ·

A* ··

1 t 1 1 6 · • A A · · · · • » ·« A* ·**· fragment pomocí vhodné DNA polymerázy ligován s DNA spojovníku nebo značky nebo podobně.

Ligand AILIM (zvláště výhodný je ligand lidského AILIM) nebo jeho část (s výhodou extracelulární oblast), může být připraven stejným způsobem.

Specifický příklad je uveden dále. Totiž DNA připravená výše popsaným způsobem je vložena do vektoru, který bude podrobně popsán později, a vytvořen tak expresní vektor. Potom je expresní vektor použit pro transformaci hostitelské buňky, jak je popsáno dále, a je získán transformant. Transformant je kultivován a ponechán produkovat protein o který se jedná, do supernatantu kultury. Protein o který se jedná, nacházející se v supernatantu kultury může být snadno vyčištěn pomocí sloupcové chromatograf ie apod.

Není zvláštní omezení, pokud jde o typ expresního vektoru pro produkci rekombinantního AILIM (nebo jeho extracelulární oblasti), pokud je vektor replikován a udržován nebo produkován autonomně v jakémkoli z různých hostitelů, jako jsou prokaryotické buňky a/nebo eukaryotické buňky. Takové expresní vektory zahrnují plazmidové vektory a fágové vektory (Klonovací vektory: Laboratorní příručka, Elsevier, New York, 1985).

Expresní vektor může být snadno připraven běžnou metodou ligováním DNA kódující AILIM (nebo jeho extracelulární oblast) s vektorem pro rekombinaci, který je v oboru dostupný (DNA plazmidu a DNA bakteriofága). Příklady vektorů používaných pro rekombinaci jsou plazmidy pocházející z E. coli, jako jsou pBR322, pBR325, pUC12, pUC13 a pUC19, plazmidy pocházející z kvasinek, jako jsou pSH19 a pSH15, a plazmidy pocházející z Bacillus subtilis, jako jsou pUB110, pTP5 a pC194. Příklady fágů jsou bakteriofág, jako je λ fág, a živočišný nebo hmyzí virus (pVL1393, Invitrogen) jako jsou retrovirus, virus vakcinie a virus jaderné polyhedrosy.

Plazmidové vektory jsou vhodné, když je plánováno, že DNA kódující AILIM, který je předmětem tohoto vynálezu, (zvláště výhodný je lidský AILIM) nebo jeho rozpustná extracelulární oblast, bude exprimována v hostitelské buňce, tedy je plánována exprese AILIM na povrchu hostitelské buňky, nebo je případně plánováno, že bude produkována rozpustná extracelulární oblast AILIM (zvláště výhodný je lidský AILIM). Na takové plazmidové vektory není zvláštní omezení, pokud vektory mohou exprimovat gen kódující AILIM (zvláště výhodný je lidský AILIM) nebo jeho rozpustnou extracelulární oblast a produkovat kódovaný protein v různých hostitelských buňkách, • · • · • · · e : ... · · .· . ·· ... · ... · · .... .... ...

..............

jako jsou prokaryotické buňky a/nebo eukaryotické buňky. Takovými plazmidy jsou například pMAL C2, pcDNA3.1 (-), pEF-BOS (NucleicAcid Research, sv. 18, str. 5322, 1990; atd.), pME18S (“Příručka genového inženýrství,” Experimental Medicine, dodatek, 1992; atd.), atd.

Když jsou jako hostitelské buňky použity bakterie, zvláště E. coli, expresní vektor se obecně skládá alespoň z oblasti promotoru-operátoru, iniciačního kodonu, DNA kódující protein, který je předmětem tohoto vynálezu, terminačního kodonu, terminátorové oblasti a replikonu.

Když jsou jako hostitelské buňky použity kvasinky, živočišné buňky nebo hmyzí buňky, je výhodné když se expresní vektor skládá alespoň z oblasti promotoru, iniciačního kodonu, DNA kódující AILIM (zvláště výhodný je lidský AILIM), který je předmětem tohoto vynálezu, nebo jeho extracelulární oblast, a terminačního kodonu. Může také obsahovat DNA kódující signální peptid, sekvenci zesilovače transkripce, 5' a 3' netranslatované oblasti genu kódujícího AILIM, který je předmětem tohoto vynálezu, spojení sestřihu, polyadenylační místo, oblast selektovatelného markéru a replikon. Expresní vektor může také obsahovat, pokud je to požadováno, gen pro genovou amplifikaci (markér), který je běžně používán.

Oblast promotor-operátor pro expresi AILIM (zvláště výhodný je lidský AILIM), který je předmětem tohoto vynálezu, nebo jeho extracelulární oblasti v bakteriích, obsahuje promotor, operátor a Shine-Dalgarnovu sekvenci (SD) (například AAGG). Například když hostitelem je Escherichia, s výhodou obsahuje Trp promotor, lac promotor, rec promotor, APL promotor, Ipp promotor, tac promotor nebo podobné.

Příklady promotoru pro expresi AILIM (zvláště výhodný je lidský AILIM), který je předmětem tohoto vynálezu, nebo jeho extracelulární oblasti v kvasince jsou PH05 promotor, PGK promotor, GAP promotor, ADH promotor a jiné. Když je hostitelem Bacillus, jejich příkladem jsou SL01 promotor, SP02 promotor, penP promotor a jiné.

Když je hostitelem eukaryotické buňka, jako je savčí buňka, příkladem promotorů jsou promotor odvozený z SV40, promotor retroviru, promotor proteinů teplotního šoku, atd. Je samozřejmostí, že promotor není omezen na výše uvedené příklady. Dále je pro expresi účinné použití zesilovače transkripce.

Výhodným iniciačním kodonem je například kodon pro metionin (ATG).

Jako příklad terminačního kodonu je uveden obecně používaný terminační kodon (například TAG, TGA, TAA, atd ).

• · · ·

Jako oblast terminátoru jsou použity běžně užívané přirozené nebo syntetické terminátory.

Replikon znamená DNA schopnou replikovat celou DNA sekvenci v hostitelských buňkách a jedná se o přirozený plazmid, uměle modifikovaný plazmid (DNA fragment připravený z přirozeného plazmidu), syntetický plazmid, atd. Příklady výhodných plazmidů jsou pBR322 nebo jeho uměle připravené deriváty (DNA fragment získaný působením vhodných restrikčních enzymů na pBR322) pro E. coli, kvasinkový plazmid 2 μ nebo kvasinková chromozomální DNA pro kvasinky, a pRSVneo ATCC 37198, pSV2dhfr ATCC 37145, pdBPV-MMTneo ATCC 37224, pSV2neo ATCC 37149, pSV2bsr a jiné pro savčí buňky.

Mohou být také použity sekvence zesilovače transkripce, polyadenylační místo a spojení sestřihu, které jsou v oboru obvykle používány, jako například ty, které pocházejí z SV40.

Selektovatelný markér může být použit stejně, jako je používán v běžné metodě. Příklady selektovatelných markérů jsou geny pro rezistenci k antibiotikům, jako je tetracyklin, ampicilin nebo kanamycin a gen pro tymidinkinázu.

Příklady genů pro genovou amplifikaci jsou gen pro dihydrofolátreduktázu (DHFR), gen pro tymidinkinázu, gen pro rezistenci kneomycinu, gen pro syntetázu glutamátu, gen pro adenozindeaminázu, gen pro dekarboxylázu ornitinu, gen pro hygromycin-B-fosfotransferázu, gen pro transkarbamylázu aspartátu, atd.

Expresní vektor, který je předmětem tohoto vynálezu, může být připraven souvislým spojením do kruhu alespoň výše uvedeného promotoru, iniciačního kodonu, DNA kódující protein, který je předmětem tohoto vynálezu, terminačního kodonu a terminátorové oblasti do vhodného replikonu. Pokud je to žádoucí, mohou být vhodné DNA fragmenty (například spojovníky, restrikční místa vytvořená s jiným restrikčním enzymem) použity obvyklou metodou, jako je štěpení restrikčním enzymem nebo ligace pomocí T4 DNA ligázy.

Transformanty v předloženém vynálezu mohou být připraveny vnesením výše zmíněného expresního vektoru do hostitelských buněk.

Hostitelské buňky použité v předloženém vynálezu nejsou omezeny, pokud jsou slučitelné s výše uvedeným expresním vektorem a pokud mohou být transformovány. Jejich příklady jsou různé buňky, jako jsou přirozené buňky nebo uměle připravené rekombinantní buňky, které jsou obvykle používány v technické oblasti předloženého vynálezu, například bakterie (Escherichia a Bacillus), kvasinky Saccharomyces, Pichia atd.), živočišné buňky nebo hmyzí buňky.

S výhodou jsou používány E. coli nebo živočišné buňky. Specifickými příklady jsou E. coli (DH5a, DH10B, TB1, HB101, XL-2Blue, atd.), buňky pocházející z myší (COP, L, C127, Sp2/0, NS-1, NIH 3T3, atd.), buňky pocházející z krys, buňky pocházející z křečků (BHK, CHO, atd.), buňky pocházející z opic (COS1, COS3, COS7, CV1, Velo, atd.) a buňky pocházející z člověka (Hela, diploidní buňky pocházející z fibroblastů, myelomové buňky, Namalwa, atd.).

Expresní vektor může být vnesen (transformován (transdukován)) do hostitelských buněk pomocí známé metody.

Transformace může být provedena například metodou Cohen a kol. (Proč. Natí. Acad. Sci. USA, sv. 69, str. 2110 (1972)), metodou protoplastů (Mol. Gen. Genet., sv. 168, str. 111 (1979)) nebo kompetentní metodou (J. Mol. Biol., sv. 56, str. 209 (1971)), když jsou hostitelem bakterie (E. coli, Bacillus subtilis atd.), metodou Hinnen a kol. (Proč. Natí. Acad. Sci. USA, sv. 75, str. 1927 (1978)) nebo lithiovou metodou (J. Bacteriol., sv. 153, str. 163 (1983)), když je hostitelem Saccharomyces cerevisiae, metodou Grahama (Virology, sv. 52, str. 456 (1973)), když jsou hostiteli živočišné buňky, a metodou Summerse a kol. (Mol. Cell. Biol., sv. 3, str. 2156 až 2165 (1983)), když jsou hostitelem hmyzí buňky.

Extracelulární oblast AILIM (zvláště výhodný je lidský AILIM), který je předmětem tohoto vynálezu (rozpustný AILIM), může být produkován pomocí kultivace transformantů (tento termín v dalším zahrnuje i transduktanty), obsahujících expresní vektor, připravený jak bylo uvedeno výše, v živných médiích. Ligand AILIM může být produkován stejným způsobem.

Živná média s výhodou obsahují zdroj uhlíku, zdroj anorganického dusíku nebo zdroj organického dusíku, které jsou nezbytné pro růst hostitelských buněk (transformantů). Příklady zdroje uhlíku jsou glukóza, dextran, rozpustný škrob a sacharóza, příklady anorganického nebo organického zdroje dusíku jsou amonné soli, dusičnany, aminokyseliny, kukuřičný výluh, pepton, kasein, masový extrakt, sójový extrakt a bramborový extrakt. Pokud je to žádoucí, mohou obsahovat jiné živiny (například anorganickou sůl (například chlorid vápenatý, sekundární fosforečnan sodný a chlorid hořečnatý), vitamíny, antibiotika (například tetracyklin, neomycin, ampicilin, kanamycin, atd.).

• · · • ·

Kultivace je prováděna v oboru známou metodou. Podmínky kultivace, jako je teplota, pH média a doba kultivace, jsou vybrány vhodně tak, aby protein, který je předmětem tohoto vynálezu, byl produkován v nadbytku.

Použitá specifická média a podmínky kultivace, závisející na hostitelských buňkách, jsou ukázáno dále, ale vynález na ně není omezen.

Pokud jsou hostiteli bakterie, aktinomycety, kvasinky, vláknité houby, jsou vhodná tekutá média, která obsahují výše uvedený zdroj živin. S výhodou jsou používána média s pH 5 až 8.

Pokud je hostitelem E. coli, příklady výhodných médií jsou média LB, média M9 (Miller a kol., Exp. Mol. Genet., Cold Spring Harbor Laboratory, str. 431 (1972)), média YT, atd. Za použití těchto médií může být kultivace snadno provedena při teplotě obvykle 14 až 43 °C po dobu od 3 do 24 hodin, a pokud je to nezbytné, tak za vzduchování a míchání.

Pokud je hostitelem Bacillus, kultivace může být provedena obvykle při teplotě 30 až 40 °C po dobu od 16 do 96 hodin, a pokud je to nezbytné, tak za vzduchování a míchání.

Pokud je hostitelem kvasinka, příklady médií jsou Burkholderova minimální média (Bostian, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, sv. 77, str. 4505 (1980)). pH média je s výhodou 5 až 8. Kultivace může být provedena obvykle při teplotě 20 až 35 °C po dobu od 14 do 144 hodin, a pokud je to nezbytné, tak za vzduchování a míchání.

Pokud je hostitelem živočišná buňka, příklady médií jsou média MEM obsahující asi 5 až 20 % fetálního hovězího séra (Science, sv. 122, str. 501 (1952)), média DMEM (Virology, sv. 8, str. 396 (1959)), média RPMI1640 (J. Am. Med. Assoc., sv. 199, str. 519 (1967)), média 199 (Proč. Soc. Exp. Biol. Med., sv. 73, str. 1 (1950)), média HamF12 atd. pH médií je obvykle 6 až 8. Kultivace může být provedena obvykle při teplotě 30 až 40 °C po dobu od 15 do 72 hodin, a pokud je to nezbytné, tak za vzduchování a míchání.

Pokud je hostitelem hmyzí buňka, příkladem média je Graceovo médium obsahující fetální hovězí sérum (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, sv. 82, str. 8404 (1985)). Jeho pH je s výhodou 5 až 8. Kultivace může být provedena obvykle při teplotě 20 až 40 °C po dobu od 15 do 100 hodin, a pokud je to nezbytné, tak za vzduchování a míchání.

• · ·

Extracelulární oblast (rozpustný AILIM) z AILIM, která je předmětem tohoto vynálezu, (zvláště výhodný je lidský AILIM), může být připravena kultivováním výše uvedených transformovaných buněk (zvláště buněk živočišných nebo E. coli) a umožněním sekrece proteinu do supernatantu kultury. Metodou jako je filtrace nebo centrifugace je tedy z kultury získán filtrát (supernatant), a polypeptid nebo fragment polypeptidů, který je předmětem tohoto vynálezu, je čištěn a izolován z filtrátu kultury obvyklou metodou, která se používá pro čištění a izolaci přirozeného nebo syntetického proteinu.

Příklady izolační a purifikační metody jsou metoda využívající specifickou afinitu, jako je afinitní chromatografie, metoda využívající rozpustnost, jako je vysolovací metoda nebo metoda vysrážení rozpouštědla, metoda využívající rozdíl v molekulové hmotnosti, jako je dialýza, ultrafiltrace, gelová filtrace a elektroforéza v polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným, metoda využívající náboje, jako je iontovýměnná chromatografie a chromatografie na hydroxylapatitu, metoda využívající rozdílu v hydrofobnosti, jako je HPLC s reverzní fází, a metoda využívající rozdíly v izoelektrickém bodu, jako je izoelektrická fokusace.

Když se protein, o který se jedná, nachází v periplazmatickém prostoru nebo vcytoplazmě kultivovaných transformantů, jsou napřed plodnice hub nebo buňky odebrány běžnou metodou, jako je filtrace nebo centrifugace, a suspendovány ve vhodném pufru. Poté, co je buněčná stěna a/nebo buněčná membrána rozrušena metodou jako je lyžování pomocí sonikace, lysozymem a zmražováním a rozmražováním, metodami jako je centrifugace nebo filtrace je získána membránová frakce obsahující polypeptid, který je předmětem tohoto vynálezu. Membránová frakce je rozpuštěna detergentem jako je například Triton-X100, čímž je získán hrubý extrakt. Nakonec je polypeptid nebo fragment polypeptidů z hrubého extraktu izolován a čištěn běžnou metodou, jak bylo ukázáno výše.

V předloženém vynálezu termín „nerozpustný nosič“ znamená nosič, který je použit pro to, aby na nich byly, pomocí fyzikální adsorbce nebo chemického připojení, imobilizovány polypeptidy. Například nosičem může být (1) destička, zkumavka nebo podobné, které mají vnitřní prostor, zrna, kuličky, filtr, membránu nebo podobně, vyrobeny z materiálů nerozpustných ve vodě, například plastů, jako je polystyrénová pryskyřice, polykarbonátové pryskyřice, silikonová pryskyřice nebo nylonová pryskyřice, nebo sklo, a (2) nerozpustný nosič používaný v afinitní chromatografii, jako • · • · · · je celulózový nosič, agarózový nosič, polyakrylamidový nosič, dextranový nosič, polystyrénový nosič, polyvinylalkoholový nosič, polyaminokyselinový nosič, nosič z porézního kysličníku křemičitého atd.

Termín „značící látka, která je schopna vydávat detekovatelný signál“ podle předloženého vynálezu zahrnuje například enzym, fluorescenční látku, luminiscenční látku, biotin, avidin nebo radioaktivní izotop, přesněji enzymy jako je peroxidáza (např. křenová peroxidáza), alkalická fosfatáza, β-D-galaktozidáza, glukózooxidáza, glukózo6-fosfátdehydrogenáza, alkoholdehydrogenáza, malátdehydrogenáza, penicilináza, kataláza, apo-glukózooxidáza, ureáza, luciferáza, acetylcholinesteráza, atd.; fluorescenční látky jako je fluoresceinizothiokyanát, protein fykobilin, chelatační činidla prvků vzácných zemin, dansylchlorid, tetramethylrhodaminizothiokyanát, atd.; radioizotopy jako je ³H, ¹⁴C, ¹²⁵l, ¹³¹l atd.; biotin, avidin a luminiscenční látku.

Z těchto látek, radioaktivní izotop nebo fluorescenční látka mohou vydávat detekovatelný signál, i když jsou použity samostatně. Na druhé straně, když jsou použity samostatně enzym, luminiscenční látka, biotin nebo avidin, tyto neposkytují detekovatelný signál, ale když jsou ponechány reagovat s jednou nebo více látkami, mohou detekovatelný signál poskytnout. Například když je značkou enzym, pro detekci je nezbytný alespoň jeho substrát. Mohou být použity různé typy substrátů v závislosti na metodě pro měření aktivity enzymu (kolorimetrie, fluoroskopie, metoda používající bioluminiscenci nebo chemickou luminiscenci atd.). Například když je značkou peroxidáza, může být jako substrát použit peroxid vodíku. Nebo když je značkou biotin, je běžně používán avidin nebo enzymaticky modifikovaný avidin, ale metoda není na něj omezena. Pokud jsou vyžadovány, je možno užít rozmanité luminiscenční látky v závislosti na typu substrátu, který bude použit.

V předloženém vynálezu mohou být použity jakékoli z výše zmíněných značek. Avšak když je vzata v úvahu citlivost detekce nebo testu a rovněž vhodnost manipulace, přednost je dávána značení enzymem jako je peroxidáza nebo biotin.

„Metoda pro určování látky schopné vázat se k AILIM nebo k ligandu AILIM“ je v tomto vynálezu založena a konstruována na principu imunologického testu.

Mohou být aplikovány principy různých metod, jak jsou popsány v „Imunologický test (3. vydání, vyd. Eiji Ishikawa a kol., Igakushoin, 1987)“.

Příklady principů, které jsou s výhodou používány, zahrnují metodu jedné protilátky na pevné fázi, metodu dvou protilátek v tekuté fázi, metodu dvou protilátek na • ·

................

pevné fázi, sendvičovou metodu a metodu „one-pot“ popsanou v přezkoumané publikované japonské patentové přihlášce (JP-B) č. Hei 2-39 747. Dále jako příklad testovací metody, používající reakci antigen-protilátka je uvedena metoda EMIT (enzymaticky násobená technika imunologického testu), imunologický test typu „enzyme channelling“, enzymem modulátorem zprostředkovaný imunologický test (EMMIA), imunologický test inhibitoru enzymu, imunologický enzymometrický test, enzymem zesílený imunologický test a imunologický test proximální vazby.

V předloženém vynálezu může být vhodně vybrán jakýkoli z těchto principů, v závislosti na účelu testu. Avšak když je vzata v úvahu vhodnost postupu a/nebo ekonomická výhodnost a zvláště klinická mnohostrannost, je s výhodou používán princip sendvičové metody, metoda „one-pot“ nebo metoda jedné protilátky na pevné fázi, výhodnější je použití sendvičové metody nebo metody „one-poť. Zvláště výhodná je sendvičová metoda za použití mikrotitrační destičky s mnoha jamkami, jako je mikrotitrační destička s 96 jamkami, nebo metoda „one-pot“ používající zrnka na kterých je imobilizován polypeptid a také používající protějšek značený enzymem jako je peroxidáza, nebo biotinem.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 ukazuje reaktivitu protilátky proti lidskému IgG, protilátky proti lidskému Igx a protilátky proti lidskému fragmentu IgFc s lidskou monoklonální protilátkou proti lidskému AILIM, analyzováno pomocí buněčného testu ELISA za pomoci průtokového cytometru.

Panely (a) až (I) ukazují výsledky testů popsaných dále.

Panel (a): výsledek testu v němž byla na mikrotitrační destičku, na níž byly vysety standardní buňky HPB-ALL, jako sekundární protilátka přidána biotinem značená protilátka proti lidskému IgG, a to v nepřítomnosti primární protilátky.

Panel (b): výsledek testu v němž byla na mikrotitrační destičku, na níž byly vysety standardní buňky HPB-ALL, jako sekundární protilátka přidána biotinem značená protilátka proti lidskému Igx, a to v nepřítomnosti primární protilátky.

Panel (c); výsledek testu v němž byla na mikrotitrační destičku, na níž byly vysety standardní buňky HPB-ALL, jako sekundární protilátka přidána biotinem značená protilátka proti lidskému IgFc, a to v nepřítomnosti primární protilátky.

Panel (d): výsledek testu, v němž byla jako primární protilátka použita lidská monoklonální protilátka JMab-136 proti lidskému AILIM a jako sekundární protilátka byla použita protilátka proti lidskému IgG, značená biotinem.

Panel (e): výsledek testu, v němž byla jako primární protilátka použita lidská monoklonální protilátka JMab-136 proti lidskému AILIM a jako sekundární protilátka byla použita protilátka proti lidskému IgK, značená biotinem.

Panel (f): výsledek testu, v němž byla jako primární protilátka použita lidská monoklonální protilátka JMab-136 proti lidskému AILIM a jako sekundární protilátka byla použita protilátka proti lidskému IgFc, značená biotinem.

Panel (g): výsledek testu, v němž byla jako primární protilátka použita lidská monoklonální protilátka JMab-138 proti lidskému AILIM a jako sekundární protilátka byla použita protilátka proti lidskému IgG, značená biotinem.

Panel (h): výsledek testu, v němž byla jako primární protilátka použita lidská monoklonální protilátka JMab-138 proti lidskému AILIM a jako sekundární protilátka byla použita protilátka proti lidskému IgK, značená biotinem.

Panel (i): výsledek testu, v němž byla jako primární protilátka použita lidská monoklonální protilátka JMab-138 proti lidskému AILIM a jako sekundární protilátka byla použita protilátka proti lidskému IgFc, značená biotinem.

Panel (j): výsledek testu, v němž byla jako primární protilátka použita lidská monoklonální protilátka JMab-139 proti lidskému AILIM a jako sekundární protilátka byla použita protilátka proti lidskému IgG, značená biotinem.

Panel (k): výsledek testu, v němž byla jako primární protilátka použita lidská monoklonální protilátka JMab-139 proti lidskému AILIM a jako sekundární protilátka byla použita protilátka proti lidskému IgK, značená biotinem.

Panel (I): výsledek testu, v němž byla jako primární protilátka použita lidská monoklonální protilátka JMab-139 proti lidskému AILIM a jako sekundární protilátka byla použita protilátka proti lidskému IgFc, značená biotinem.

Křivka s prázdnými symboly odpovídá v každém panelu výsledku testu, v němž byla jako kontrolní protilátka použita lidská monoklonální protilátka proti KLH.

Obrázek 2 ukazuje kalibrační křivku vzhledem k lidské monoklonální IgG protilátce (standardní materiál), testované sendvičovým testem ELISA za použití protilátky proti lidskému IgG.

• · • · · ·

Svislá osa označuje intenzitu fluorescence a vodorovná osa ukazuje koncentraci standardní materiálu.

Obrázek 3 ukazuje vazebnou aktivitu různých myších monoklonálních protilátek proti lidskému AILIM k rekombinantním CHO buňkám, ve kterých probíhá nadprodukce lidského AILIM a k standardním CHO buňkám.

Svislá osa označuje intenzitu fluorescence jako míru vazebné aktivity k rekombinantním buňkám a vodorovná osa označuje koncentraci přidané protilátky.

Termín „CHO“ v obrázku označuje výsledek vazebného testu se standardními CHO buňkami, a „lidský“ v obrázku označuje výsledek vazebného testu s rekombinantními CHO buňkami, ve kterých probíhá nadprodukce lidského AILIM.

Obrázek 4 ukazuje vazebné aktivity různých lidských monoklonálních protilátek proti lidskému AILIM nebo různých lidských monoklonálních protilátek proti KLH, použitých jako negativní kontrola, k rekombinantním CHO buňkám, ve kterých probíhá nadprodukce lidského AILIM nebo k standardním CHO buňkám.

Obrázek 5 ukazuje vazebné aktivity různých lidských monoklonálních protilátek proti lidskému AILIM k rekombinantním CHO buňkám, ve kterých probíhá nadprodukce lidského AILIM nebo k standardním CHO buňkám.

Obrázek 6 ukazuje vazebné aktivity různých lidských monoklonálních protilátek proti lidskému AILIM k rekombinantním CHO buňkám, ve kterých probíhá nadprodukce lidského AILIM nebo k standardním CHO buňkám.

• ·

Obrázek 7 ukazuje vazebné aktivity krysích monoklonálních protilátek proti lidskému AILIM k rekombinantním CHO buňkám, ve kterých probíhá nadprodukce myšího AILIM nebo k standardním CHO buňkám.

Termín „CHO“ v obrázku označuje výsledek vazebného testu se standardními CHO buňkami, a „myší“ v obrázku označuje výsledek vazebného testu s rekombinantními CHO buňkami, ve kterých probíhá nadprodukce myšího AILIM.

Obrázek 8 ukazuje vazebné aktivity lidských monoklonálních protilátek proti lidskému AILIM nebo lidských monoklonálních protilátek proti KLH, které byly použity jako negativní kontrola, k rekombinantním CHO buňkám, ve kterých probíhá nadprodukce myšího AILIM nebo k standardním CHO buňkám.

Obrázek 9 ukazuje vazebné aktivity lidských monoklonálních protilátek proti lidskému AILIM k rekombinantním CHO buňkám, ve kterých probíhá nadprodukce myšího AILIM nebo k standardním CHO buňkám.

Obrázek 10 ukazuje vazebné aktivity lidských monoklonálních protilátek proti lidskému AILIM k rekombinantním CHO buňkám, ve kterých probíhá nadprodukce myšího AILIM nebo k standardním CHO buňkám.

• · * * « · · · • · · • · · • · · • · » · • » • · · • · · · · • * · · • · · · «· ··

Obrázek 11 ukazuje vazebné aktivity myších monoklonálních protilátek proti krysímu AILIM k rekombinantním CHO buňkám, ve kterých probíhá nadprodukce krysího AILIM nebo k standardním CHO buňkám.

Termín „CHO“ v obrázku označuje výsledek vazebného testu se standardními CHO buňkami, a „krysí“ v obrázku označuje výsledek vazebného testu s rekombinantními CHO buňkami, ve kterých probíhá nadprodukce krysího AILIM.

Obrázek 12 ukazuje vazebné aktivity lidských monoklonálních protilátek proti krysímu AILIM nebo lidských monoklonálních protilátek proti KLH, které byly použity jako negativní kontrola, k rekombinantním CHO buňkám, ve kterých probíhá nadprodukce krysího AILIM nebo k standardním CHO buňkám.

Obrázek 13 ukazuje vazebné aktivity lidských monoklonálních protilátek proti lidskému AILIM k rekombinantním CHO buňkám, ve kterých probíhá nadprodukce krysího AILIM nebo k standardním CHO buňkám.

Obrázek 14 ukazuje vazebné aktivity různých lidských monoklonálních protilátek proti lidskému AILIM k rekombinantním CHO buňkám, ve kterých probíhá nadprodukce krysího AILIM nebo k standardním CHO buňkám.

* 4 *

4 • · 4 · • » 4 4 • 4 I • · <

Obrázek 15 ukazuje proliferační aktivitu T buněk odvozených z normální zdravé osoby „dárce A“ v testu na aktivitu přenášení kostimulačního signálu různými myšími monoklonálními protilátkami proti lidskému AILIM, za použití mikrotitrační destičky potažených monoklonální protilátkou proti lidskému CD3 spolu s myší protilátkou proti lidskému AILIM.

Svislá osa označuje velikost inkorporace [³H]tymidinu do buněk jako míru množení buněk, a vodorovná osa označuje koncentraci myší monoklonální protilátky proti lidskému AILIM.

Obrázek 16 ukazuje proliferační aktivitu T buněk odvozených z normální zdravé osoby „dárce A“ v testu na aktivitu přenášení kostimulačního signálu různými myšími monoklonálními protilátkami proti lidskému AILIM, za použití mikrotitrační destičky potažených monoklonální protilátkou proti lidskému CD3 spolu s lidskou protilátkou proti lidskému AILIM.

Svislá osa označuje velikost inkorporace [³H]tymidinu do buněk jako míru množení buněk, a vodorovná osa označuje koncentraci lidské monoklonální protilátky proti lidskému AILIM.

Obrázek 17 ukazuje proliferační aktivitu T buněk odvozených z normální zdravé osoby „dárce B“ v testu na aktivitu přenášení kostimulačního signálu různými myšími monoklonálními protilátkami proti lidskému AILIM, za použití mikrotitrační destičky potažených monoklonální protilátkou proti lidskému CD3 spolu s myší monoklonální protilátkou proti lidskému AILIM.

V tomto obrázku termín „JHC1“ označuje výsledek testu, ve kterém byla jako negativní kontrola, namísto myší monoklonální protilátky proti lidskému AILIM, použita monoklonální protilátka proti lidskému CETP.

Obrázek 18 ukazuje proliferační aktivitu T buněk odvozených z normální zdravé osoby „dárce B“ v testu na aktivitu přenášení kostimulačního signálu různými lidskými monoklonálními protilátkami proti lidskému AILIM, za použití mikrotitrační destičky <·.♦ »··· potažených monoklonální protilátkou proti lidskému CD3 spolu s lidskou monoklonální protilátkou proti lidskému AILIM.

V tomto obrázku termín „proti KLH“ označuje výsledek testu, ve kterém byla jako negativní kontrola, namísto lidské monoklonální protilátky proti lidskému AILIM, použita lidská monoklonální protilátka proti KLH.

Obrázek 19 ukazuje proliferační aktivitu T buněk odvozených z normální zdravé osoby „dárce B“ v testu na aktivitu přenášení kostimulačního signálu různými lidskými monoklonálními protilátkami proti lidskému AILIM, za použití mikrotitrační destičky potažených monoklonální protilátkou proti lidskému CD3 spolu s lidskou monoklonální protilátkou proti lidskému AILIM.

Obrázek 20 ukazuje proliferační aktivitu T buněk odvozených z normální zdravé osoby „dárce C“ v testu na aktivitu přenášení kostimulačního signálu různými lidskými monoklonálními protilátkami proti lidskému AILIM, za použití mikrotitrační destičky potažených monoklonální protilátkou proti lidskému CD3 spolu s myší monoklonální protilátkou proti lidskému AILIM.

Obrázek 21 ukazuje proliferační aktivitu T buněk odvozených z normální zdravé osoby „dárce C“ v testu na aktivitu přenášení kostimulačního signálu různými lidskými monoklonálními protilátkami proti lidskému AILIM, za použití mikrotitrační destičky • · • · • · · · potažených monoklonální protilátkou proti lidskému CD3 spolu s lidskou monoklonální protilátkou proti lidskému AILIM.

Další označení jsou následující:

“124”: lidská monoklonální protilátka JMab124 proti lidskému AILIM.

“126”: lidská monoklonální protilátka JMab126 proti lidskému AILIM.

“127”: lidská monoklonální protilátka JMab127 proti lidskému AILIM.

Obrázek 22 ukazuje proliferační aktivitu T buněk odvozených z normální zdravé osoby „dárce C“ v testu na aktivitu přenášení kostimulačního signálu různými lidskými monoklonálními protilátkami proti lidskému AILIM, za použití mikrotitrační destičky potažených monoklonální protilátkou proti lidskému CD3 spolu s lidskou monoklonální protilátkou proti lidskému AILIM.

Další označení jsou následující:

“128”: lidská monoklonální protilátka JMab128 proti lidskému AILIM.

“135”: lidská monoklonální protilátka JMab135 proti lidskému AILIM.

“136”: lidská monoklonální protilátka JMab136 proti lidskému AILIM.

Obrázek 23 ukazuje proliferační aktivitu T buněk odvozených z normální zdravé osoby „dárce C“ v testu na aktivitu přenášení kostimulačního signálu různými lidskými monoklonálními protilátkami proti lidskému AILIM, za použití mikrotitrační destičky potažených monoklonální protilátkou proti lidskému CD3 spolu s lidskou monoklonální protilátkou proti lidskému AILIM.

Další označení jsou následující:

“137”: lidská monoklonální protilátka JMab137 proti lidskému AILIM.

“138”: lidská monoklonální protilátka JMab138 proti lidskému AILIM.

“139”: lidská monoklonální protilátka JMab139 proti lidskému AILIM.

Obrázek 24 ukazuje proliferační aktivitu T buněk odvozených z normální zdravé osoby „dárce C“ v testu na aktivitu přenášení kostimulačního signálu různými lidskými monoklonáiními protilátkami proti lidskému AILIM, za použití mikrotitrační destičky potažených monoklonální protilátkou proti lidskému CD3 spolu s lidskou monoklonální protilátkou proti lidskému AILIM.

Další označení jsou následující:

“140”: lidská monoklonální protilátka JMab140 proti lidskému AILIM.

“141”: lidská monoklonální protilátka JMab141 proti lidskému AILIM.

Obrázek 25 ukazuje proliferační aktivitu T buněk odvozených z normální zdravé osoby „dárce D“ v testu na aktivitu přenášení kostimulačního signálu různými myšími monoklonáiními protilátkami proti lidskému AILIM, za použití mikrotitrační destičky potažených monoklonální protilátkou proti lidskému CD3 spolu s myší monoklonální protilátkou proti lidskému AILIM.

• ·

V tomto obrázku termín „JHC1“ označuje výsledek testu, ve kterém byla jako negativní kontrola, namísto myší monoklonální protilátky proti lidskému AILIM, použita lidská monoklonální protilátka proti lidskému CETP.

Obrázek 26 ukazuje proliferační aktivitu T buněk odvozených z normální zdravé osoby „dárce D“ v testu na aktivitu přenášení kostimulačního signálu různými lidskými monoklonálními protilátkami proti lidskému AILIM, za použití mikrotitrační destičky potažených monoklonální protilátkou proti lidskému CD3 spolu s lidskou monoklonální protilátkou proti lidskému AILIM.

Další označení jsou následující:

“124”: lidská monoklonální protilátka JMab124 proti lidskému AILIM.

“126”: lidská monoklonální protilátka JMab126 proti lidskému AILIM.

“127”: lidská monoklonální protilátka JMab127 proti lidskému AILIM.

Obrázek 27 ukazuje proliferační aktivitu T buněk odvozených z normální zdravé osoby „dárce D“ v testu na aktivitu přenášení kostimulačního signálu různými lidskými monoklonálními protilátkami proti lidskému AILIM, za použití mikrotitrační destičky potažených monoklonální protilátkou proti lidskému CD3 spolu s lidskou monoklonální protilátkou proti lidskému AILIM.

Další označení jsou následující:

“128”: lidská monoklonální protilátka JMab128 proti lidskému AILIM.

“135”: lidská monoklonální protilátka JMab135 proti lidskému AILIM.

“136”: lidská monoklonální protilátka JMab136 proti lidskému AILIM.

• · · · • ·

Obrázek 28 ukazuje proliferační aktivitu T buněk odvozených z normální zdravé osoby „dárce D“ v testu na aktivitu přenášení kostimulačního signálu různými lidskými monoklonálními protilátkami proti lidskému AILIM, za použití mikrotitrační destičky potažených monoklonální protilátkou proti lidskému CD3 spolu s lidskou monoklonální protilátkou proti lidskému AILIM.

Další označení jsou následující:

“137”: lidská monoklonální protilátka JMab137 proti lidskému AILIM.

“138”: lidská monoklonální protilátka JMab138 proti lidskému AILIM.

“139”: lidská monoklonální protilátka JMab139 proti lidskému AILIM.

Obrázek 29 ukazuje proliferační aktivitu T buněk odvozených z normální zdravé osoby „dárce D“ v testu na aktivitu přenášení kostimulačního signálu různými lidskými monoklonálními protilátkami proti lidskému AILIM, za použití mikrotitrační destičky potažených monoklonální protilátkou proti lidskému CD3 spolu s lidskou monoklonální protilátkou proti lidskému AILIM.

V tomto obrázku termín „proti KLH označuje výsledek testu, ve kterém byla jako negativní kontrola, namísto lidské monoklonální protilátky proti lidskému AILIM, použita lidská monoklonální protilátka proti KLH.

Další označení jsou následující:

“140”: lidská monoklonální protilátka JMab140 proti lidskému AILIM.

“141”: lidská monoklonální protilátka JMab141 proti lidskému AILIM.

Obrázek 30 ukazuje proliferační aktivitu T buněk odvozených z normální zdravé osoby „dárce E“ v testu na aktivitu přenášení kostimulačního signálu různými myšími monoklonálními protilátkami proti lidskému AILIM, za použití mikrotitrační destičky « » * · • · · · • · · · potažených monoklonální protilátkou proti lidskému CD3 spolu s myší monoklonální protilátkou proti lidskému AILIM.

Obrázek 31 ukazuje proliferační aktivitu T buněk odvozených z normální zdravé osoby „dárce E“ v testu na aktivitu přenášení kostimulačního signálu různými lidskými monoklonálními protilátkami proti lidskému AILIM, za použití mikrotitrační destičky potažených monoklonální protilátkou proti lidskému CD3 spolu s lidskou monoklonální protilátkou proti lidskému AILIM.

Další označeni jsou následující:

“124”: lidská monoklonální protilátka JMab124 proti lidskému AILIM.

“126”: lidská monoklonální protilátka JMab126 proti lidskému AILIM.

“127”: lidská monoklonální protilátka JMab127 proti lidskému AILIM.

Obrázek 32 ukazuje proliferační aktivitu T buněk odvozených z normální zdravé osoby „dárce C“ v testu na aktivitu přenášení kostimulačního signálu různými lidskými monoklonálními protilátkami proti lidskému AILIM, za použití mikrotitrační destičky potažených monoklonální protilátkou proti lidskému CD3 spolu s lidskou monoklonální protilátkou proti lidskému AILIM.

• 0

0«

Další označení jsou následující:

“128”: lidská monoklonální protilátka JMab128 proti lidskému AILIM.

“135”: lidská monoklonální protilátka JMab135 proti lidskému AILIM.

“136”: lidská monoklonální protilátka JMab136 proti lidskému AILIM.

Obrázek 33 ukazuje proliferační aktivitu T buněk odvozených z normální zdravé osoby „dárce E“ v testu na aktivitu přenášení kostimulačního signálu různými lidskými monoklonálními protilátkami proti lidskému AILIM, za použití mikrotitrační destičky potažených monoklonální protilátkou proti lidskému CD3 spolu s lidskou monoklonální protilátkou proti lidskému AILIM.

Další označení jsou následující:

“137”: lidská monoklonální protilátka JMab137 proti lidskému AILIM.

“138”: lidská monoklonální protilátka JMab138 proti lidskému AILIM.

“139”: lidská monoklonální protilátka JMab139 proti lidskému AILIM.

Obrázek 34 ukazuje proliferační aktivitu T buněk odvozených z normální zdravé osoby „dárce E“ v testu na aktivitu přenášení kostimulačního signálu různými lidskými monoklonálními protilátkami proti lidskému AILIM, za použití mikrotitrační destičky potažených monoklonální protilátkou proti lidskému CD3 spolu s lidskou monoklonální protilátkou proti lidskému AILIM.

* * · · · · • · · ·

Další označení jsou tato následující:

“140”: lidská monoklonální protilátka JMab140 proti lidskému AILIM.

“141”: lidská monoklonální protilátka JMab141 proti lidskému AILIM.

Obrázek 35 ukazuje proliferační aktivitu T buněk odvozených z normální zdravé osoby „dárce D“ v testu na aktivitu přenášení kostimulačního signálu různými myšími monoklonálními protilátkami proti lidskému AILIM, když byl samotný roztok myší monoklonální protilátky proti lidskému AILIM (v tekuté fázi) přidán na mikrotitrační destičku potaženou monoklonální protilátkou proti lidskému CD3.

V tomto obrázku termín „JHCI“ označuje výsledek testu, ve kterém byla jako negativní kontrola, namísto myší monoklonální protilátky proti lidskému AILIM, použita monoklonální protilátka proti lidskému CETP.

Obrázek 36 ukazuje proliferační aktivitu T buněk odvozených z normální zdravé osoby „dárce D“ v testu na aktivitu přenášení kostimulačního signálu různými lidskými monoklonálními protilátkami proti lidskému AILIM, když byl samotný roztok lidské monoklonální protilátky proti lidskému AILIM (v tekuté fázi) přidán na mikrotitrační destičku potaženou monoklonální protilátkou proti lidskému CD3.

Další označení jsou následující:

“124”: lidská monoklonální protilátka JMab124 proti lidskému AILIM.

“125”: lidská monoklonální protilátka JMab125 proti lidskému AILIM.

“126”: lidská monoklonální protilátka JMab126 proti lidskému AILIM.

Obrázek 37 ukazuje proliferační aktivitu T buněk odvozených z normální zdravé osoby „dárce D“ v testu na aktivitu přenášení kostimulačního signálu různými lidskými monoklonálními protilátkami proti lidskému AILIM, když byl samotný roztok lidské • · • · « · monoklonální protilátky proti lidskému AILIM (v tekuté fázi) přidán na mikrotitrační destičku potaženou monoklonální protilátkou proti lidskému CD3.

Další označení jsou následující:

“128”: lidská monoklonální protilátka JMab128 proti lidskému AILIM.

“135”: lidská monoklonální protilátka JMab135 proti lidskému AILIM.

“136”: lidská monoklonální protilátka JMab136 proti lidskému AILIM.

Obrázek 38 ukazuje proliferační aktivitu T buněk odvozených z normální zdravé osoby „dárce D“ v testu na aktivitu přenášení kostimulačního signálu různými lidskými monoklonálními protilátkami proti lidskému AILIM, když byl samotný roztok lidské monoklonální protilátky proti lidskému AILIM (v tekuté fázi) přidán na mikrotitrační destičku potaženou monoklonální protilátkou proti lidskému CD3.

Další označení jsou následující:

“137”: lidská monoklonální protilátka JMab137 proti lidskému AILIM.

“138”: lidská monoklonální protilátka JMab138 proti lidskému AILIM.

“139”: lidská monoklonální protilátka JMab139 proti lidskému AILIM.

Obrázek 39 ukazuje proliferační aktivitu T buněk odvozených z normální zdravé osoby „dárce D“ v testu na aktivitu přenášení kostimulačního signálu různými lidskými monoklonálními protilátkami proti lidskému AILIM, když byl samotný roztok lidské monoklonální protilátky proti lidskému AILIM (v tekuté fázi) přidán na mikrotitrační destičku potaženou monoklonální protilátkou proti lidskému CD3.

Další označení jsou následující:

“140”: lidská monoklonální protilátka JMab140 proti lidskému AILIM.

“141”: lidská monoklonální protilátka JMab141 proti lidskému AILIM.

Obrázek 40 ukazuje množství IFN-γ produkovaného do supernatantu kultury T buněk odvozených z normální zdravé osoby „dárce B“, které byly kultivovány na mikrotitrační destičce potažené myší monoklonální protilátkou proti lidskému AILIM spolu s monoklonální protilátkou proti lidskému CD3.

Svislá osa označuje koncentraci IFN-γ, a vodorovná osa označuje koncentraci myší monoklonální protilátky proti lidskému AILIM.

Obrázek 41 ukazuje množství IFN-γ produkovaného do supernatantu kultury T buněk odvozených z normální zdravé osoby „dárce B“, které byly kultivovány na mikrotitrační destičce potažené lidskou monoklonální protilátkou proti lidskému AILIM spolu s monoklonální protilátkou proti lidskému CD3.

Obrázek 42 ukazuje množství IFN-γ produkovaného do supernatantu kultury T buněk odvozených z normální zdravé osoby „dárce B“, které byly kultivovány na mikrotitrační destičce potažené lidskou monoklonální protilátkou proti lidskému AILIM spolu s monoklonální protilátkou proti lidskému CD3.

« « • · • · · *

V tomto obrázku termín „proti KLÍT označuje výsledek testu, ve kterém byla jako negativní kontrola, namísto lidské monoklonální protilátky proti lidskému AILIM, použita lidská monoklonální protilátka proti KLH.

Obrázek 43 ukazuje množství IFN-γ produkovaného do supernatantu kultury T buněk odvozených z normální zdravé osoby „dárce C“, které byly kultivovány na mikrotitrační destičce potažené myší monoklonální protilátkou proti lidskému AILIM spolu s monoklonální protilátkou proti lidskému CD3.

V tomto obrázku termín „JHC1“ označuje výsledek testu, ve kterém byla jako negativní kontrola, namísto myší monoklonální protilátky proti lidskému AILIM, použita monoklonální protilátka proti lidskému KLH.

Obrázek 44 ukazuje množství IFN-γ produkovaného do supernatantu kultury T buněk odvozených z normální zdravé osoby „dárce C“, které byly kultivovány na mikrotitrační destičce potažené lidskou monoklonální protilátkou proti lidskému AILIM spolu s monoklonální protilátkou proti lidskému CD3.

Další označení jsou následující:

“124”: lidská monoklonální protilátka JMab124 proti lidskému AILIM.

“125”: lidská monoklonální protilátka JMab125 proti lidskému AILIM.

“126”: lidská monoklonální protilátka JMab126 proti lidskému AILIM.

Obrázek 45 ukazuje množství IFN-γ produkovaného do supernatantu kultury T buněk odvozených z normální zdravé osoby „dárce C“, které byly kultivovány na mikrotitrační destičce potažené lidskou monoklonální protilátkou proti lidskému AILIM spolu s monoklonální protilátkou proti lidskému CD3.

• · • · · · • ·

Další označení jsou následující:

“128”: lidská monoklonální protilátka JMab128 proti lidskému AILIM.

“135”: lidská monoklonální protilátka JMab135 proti lidskému AILIM.

“136”: lidská monoklonální protilátka JMab136 proti lidskému AILIM.

Obrázek 46 ukazuje množství IFN-γ produkovaného do supernatantu kultury T buněk odvozených z normální zdravé osoby „dárce C“, které byly kultivovány na mikrotitrační destičce potažené lidskou monoklonální protilátkou proti lidskému AILIM spolu s monoklonální protilátkou proti lidskému CD3.

Další označení jsou následující:

“137”: lidská monoklonální protilátka JMab137 proti lidskému AILIM.

“138”: lidská monoklonální protilátka JMab138 proti lidskému AILIM.

“139”: lidská monoklonální protilátka JMab139 proti lidskému AILIM.

Obrázek 47 ukazuje množství IFN-γ produkovaného do supernatantu kultury T buněk odvozených z normální zdravé osoby „dárce C“, které byly kultivovány na mikrotitrační destičce potažené lidskou monoklonální protilátkou proti lidskému AILIM spolu s monoklonální protilátkou proti lidskému CD3.

Další označení jsou následující:

“140”: lidská monoklonální protilátka JMab140 proti lidskému AILIM.

“141”: lidská monoklonální protilátka JMab141 proti lidskému AILIM.

Obrázek 48 ukazuje inhibiční vliv různých testovaných vzorků na množení T buněk, v případě kultivace T buněk z normální zdravé osoby „dárce A“ s PBMC normální zdravé osoby „dárce D“, v proliferačních testech T buněk pomocí reakcí smíšených lymfocytů (MLR).

Svislá osa označuje velikost inkorporace [³H]tymidinu do buněk jako míru množení buněk, a vodorovná osa označuje koncentraci testovaných vzorků.

Jednotlivé popisy v obrázcích znamenají následující.

“CD80 + 86”: směs protilátky proti CD80 a protilátky proti CD86 “mlgG1”: myší monoklonální protilátka proti lidskému CD34/lgG1 “CTLA4-lg: lidská chimerní molekula CTLA4-lgFc “SA12”: myší monoklonální protilátka proti lidskému AILIM

Obrázek 49 ukazuje inhibiční vliv různých lidských monoklonálních protilátek proti lidskému AILIM na množení T buněk, v případě kultivace T buněk z normální zdravé osoby „dárce A“ s PBMC normální zdravé osoby „dárce D“, v proliferačních testech T buněk pomocí reakcí smíšených lymfocytů (MLR).

Další označení jsou následující:

“proti KLH”: lidská monoklonální protilátka proti KLH jako negativní kontrola. “JMab-124”: lidská monoklonální protilátka JMab124 proti lidskému AILIM.

“126”: lidská monoklonální protilátka JMab126 proti lidskému AILIM.

“127”: lidská monoklonální protilátka JMab127 proti lidskému AILIM.

“135”: lidská monoklonální protilátka JMab135 proti lidskému AILIM.

“136”: lidská monoklonální protilátka JMab136 proti lidskému AILIM.

“137”: lidská monoklonální protilátka JMab137 proti lidskému AILIM.

Obrázek 50 ukazuje inhibiční vliv různých testovaných vzorků na množeni T buněk, v případě kultivace T buněk z normální zdravé osoby „dárce D“ s PBMC normální zdravé osoby „dárce B“, v proliferačních testech T buněk pomocí reakcí smíšených lymfocytů (MLR).

Jednotlivé popisy v obrázcích znamenají následující.

“CD80 + 86”: směs protilátky proti CD80 a protilátky proti CD86

“mlgG1”: myší monoklonální protilátka proti lidskému CD34/lgG1 “CTLA4-lg”: lidská chimerní molekula CTLA4-lgFc “SA12”: myší monoklonální protilátka proti lidskému AILIM

Obrázek 51 ukazuje inhibiční vliv různých lidských monoklonálních protilátek proti lidskému AILIM na množení T buněk, v případě kultivace T buněk z normální zdravé osoby „dárce D“ s PBMC normální zdravé osoby „dárce B“, v proliferačních testech T buněk pomocí reakcí smíšených lymfocytů (MLR).

Další označení jsou následující:

“126”: lidská monoklonální protilátka JMab126 proti lidskému AILIM.

“127”: lidská monoklonální protilátka JMab127 proti lidskému AILIM.

“135”: lidská monoklonální protilátka JMab135 proti lidskému AILIM.

“136”: lidská monoklonální protilátka JMab136 proti lidskému AILIM.

“137”: lidská monoklonální protilátka JMab137 proti lidskému AILIM.

Obrázek 52 ukazuje inhibiční vliv různých testovaných vzorků na množení T buněk, v případě kultivace T buněk z normální zdravé osoby „dárce C“ s PBMC normální zdravé osoby „dárce A“, v proliferačních testech T buněk pomocí reakcí smíšených lymfocytů (MLR).

Jednotlivé popisy v obrázcích znamenají následující.

“CD80 + 86”: směs protilátky proti CD80 a protilátky proti CD86 “mlgG1”: myší monoklonální protilátka proti lidskému CD34/lgG1 “CTLA4-lg”: lidská chimerní molekula CTLA4-lgFc “SA12”: myší monoklonální protilátka proti lidskému AILIM

Obrázek 53 ukazuje inhibiční vliv různých lidských monoklonálních protilátek proti lidskému AILIM na množení T buněk, v případě kultivace T buněk z normální zdravé osoby „dárce C“ s PBMC normální zdravé osoby „dárce A“, v proliferačních testech T buněk pomocí reakcí smíšených lymfocytů (MLR).

Další označení jsou následující:

“126”: lidská monoklonální protilátka JMab126 proti lidskému AILIM.

“127”: lidská monoklonální protilátka JMab127 proti lidskému AILIM.

“135”: lidská monoklonální protilátka JMab135 proti lidskému AILIM.

“136”: lidská monoklonální protilátka JMab136 proti lidskému AILIM.

“137”: lidská monoklonální protilátka JMab137 proti lidskému AILIM.

Obrázek 54 ukazuje inhibiční vliv různých testovaných vzorků na množení T buněk, v případě kultivace T buněk z normální zdravé osoby „dárce E“ s PBMC normální zdravé osoby „dárce G“, v proliferačních testech T buněk pomocí reakcí smíšených lymfocytů (MLR).

Jednotlivé popisy v obrázcích znamenají následující.

“kontrolní mlgG”: myší monoklonální protilátka proti lidskému CD34/lgG1 “CD80 + 86 Ab”: směs protilátky proti CD80 a protilátky proti CD86 “SA12”: myší monoklonální protilátka proti lidskému AILIM “CTLA4-lg”: lidská chimerní molekula CTLA4-lgFc

Obrázek 55 ukazuje inhibiční vliv různých lidských monoklonálních protilátek proti lidskému AILIM na množení T buněk, v případě kultivace T buněk z normální zdravé osoby „dárce E“ s PBMC normální zdravé osoby „dárce G“, v proliferačních testech T buněk pomocí reakcí smíšených lymfocytů (MLR).

Další označení jsou následující:

“proti KLH”: lidská monoklonální protilátka proti KLH jako negativní kontrola. “JMab-136”: lidská monoklonální protilátka JMab136 proti lidskému AILIM.

“138”: lidská monoklonální protilátka JMab138 proti lidskému AILIM.

“139”: lidská monoklonální protilátka JMab139 proti lidskému AILIM.

“140”: lidská monoklonální protilátka JMab140 proti lidskému AILIM.

• · · · • · · · • ♦ · • · • · · · • · · “141”: lidská monoklonální protilátka JMab141 proti lidskému AILIM.

Obrázek 56 ukazuje inhibiční vliv různých testovaných vzorků na množení T buněk, v případě kultivace T buněk z normální zdravé osoby „dárce F“ s PBMC normální zdravé osoby „dárce E“, v proliferačních testech T buněk pomocí reakcí smíšených lymfocytů (MLR).

Jednotlivé popisy v obrázcích znamenají následující.

Obrázek 57 ukazuje inhibiční vliv různých lidských monoklonálních protilátek proti lidskému AILIM na množení T buněk, v případě kultivace T buněk z normální zdravé osoby „dárce F“ s PBMC normální zdravé osoby „dárce E“, v proliferačních testech T buněk pomocí reakcí smíšených lymfocytů (MLR).

Další označení jsou následující:

“138”: lidská monoklonální protilátka JMab138 proti lidskému AILIM.

“139”: lidská monoklonální protilátka JMab139 proti lidskému AILIM.

“140”: lidská monoklonální protilátka JMab140 proti lidskému AILIM.

“141”: lidská monoklonální protilátka JMab141 proti lidskému AILIM.

Obrázek 58 ukazuje inhibiční vliv různých testovaných vzorků na množení T buněk, v případě kultivace T buněk z normální zdravé osoby „dárce G“ s PBMC normální zdravé osoby „dárce F“, v proliferačních testech T buněk pomocí reakcí smíšených lymfocytů (MLR).

Jednotlivé popisy v obrázcích znamenají následující.

“kontrolní mlgG”: myší monoklonální protilátka proti lidskému CD34/lgG1 • · • · · · • · · · • · · · • · · • · · « · · • · · · · · “CD80 + 86 Ab”: směs protilátky proti CD80 a protilátky proti CD86 “SA12”: myší monoklonální protilátka proti lidskému AILIM “CTLA4-lg”: lidská chimerní molekula CTLA4-lgFc

Obrázek 59 ukazuje inhibiční vliv různých lidských monoklonálních protilátek proti lidskému AILIM na množení T buněk, v případě kultivace T buněk z normální zdravé osoby „dárce G“ s PBMC normální zdravé osoby „dárce F“, v proliferačních testech T buněk pomocí reakcí smíšených lymfocytů (MLR).

Další označení jsou následující:

“138”: lidská monoklonální protilátka JMab138 proti lidskému AILIM.

“139”: lidská monoklonální protilátka JMab139 proti lidskému AILIM.

“140”: lidská monoklonální protilátka JMab140 proti lidskému AILIM.

“141”: lidská monoklonální protilátka JMab141 proti lidskému AILIM.

Obrázek 60 ukazuje inhibiční vliv různých látek kontrolního testu na množení T buněk, v testu pomocí reakce smíšených lymfocytů (MLR). T buňky z normální zdravé osoby „dárce A“ byly kultivovány spolu s PBMC normální zdravé osoby „dárce D“, které byly předem kultivovány v přítomnosti lidské chimerní molekuly CTLA4-lg.

Svislá osa označuje velikost inkorporace [³H]tymidinu do buněk jako míru množení buněk, a vodorovná osa označuje koncentraci testovaných látek.

Jednotlivé popisy v obrázcích znamenají následující.

“CD80 + 86”: směs protilátky proti CD80 a protilátky proti CD86 “mlgG1”: myší monoklonální protilátka proti lidskému CD34/lgG1 “SA12”: myší monoklonální protilátka proti lidskému AILIM

Obrázek 61 ukazuje inhibiční vliv různých lidských monoklonálních protilátek proti AILIM na množení T buněk, v testu pomocí reakce smíšených lymfocytů (MLR). T buňky z normální zdravé osoby „dárce A“ byly kultivovány spolu s PBMC normální zdravé osoby „dárce D“, které byly předem kultivovány v přítomnosti lidské chimerní molekuly CTLA4-lg.

* ·

Další označení jsou následující:

“proti KLH”: lidská monoklonální protilátka proti KLH jako negativní kontrola.

“JMab-124”: lidská monoklonální protilátka JMab124 proti lidskému AILIM.

“126”: lidská monoklonální protilátka JMab126 proti lidskému AILIM.

“127”: lidská monoklonální protilátka JMab127 proti lidskému AILIM.

“135”: lidská monoklonální protilátka JMab135 proti lidskému AILIM.

“136”: lidská monoklonální protilátka JMab136 proti lidskému AILIM.

“137”: lidská monoklonální protilátka JMab137 proti lidskému AILIM.

Obrázek 62 ukazuje inhibiční vliv různých látek kontrolního testu na množení T buněk, v testu pomocí reakce smíšených lymfocytů (MLR). T buňky z normální zdravé osoby „dárce D“ byly kultivovány spolu s PBMC normální zdravé osoby „dárce B“, které byly předem kultivovány v přítomnosti lidské chimerní molekuly CTLA4-lg.

Jednotlivé popisy v obrázcích znamenají následující.

Obrázek 63 ukazuje inhibiční vliv různých lidských monoklonálních protilátek proti AILIM na množení T buněk, v testu pomocí reakce smíšených lymfocytů (MLR). T buňky z normální zdravé osoby „dárce D“ byly kultivovány spolu s PBMC normální zdravé osoby „dárce B“, které byly předem kultivovány v přítomnosti lidské chimerní molekuly CTLA4-lg.

Další označení jsou následující:

“126”: lidská monoklonální protilátka JMab126 proti lidskému AILIM.

“127”: lidská monoklonální protilátka JMab127 proti lidskému AILIM.

“135”: lidská monoklonální protilátka JMab135 proti lidskému AILIM.

“136”: lidská monoklonální protilátka JMab136 proti lidskému AILIM.

“137”: lidská monoklonální protilátka JMab137 proti lidskému AILIM.

• ·

Obrázek 64 ukazuje inhibiční vliv různých látek kontrolního testu na množení T buněk, v testu pomocí reakce smíšených lymfocytů (MLR). T buňky z normální zdravé osoby „dárce C“ byly kultivovány spolu s PBMC normální zdravé osoby „dárce A“, které byly předem kultivovány v přítomnosti lidské chimerní molekuly CTLA4-lg.

Jednotlivé popisy v obrázcích znamenají následující.

Obrázek 65 ukazuje inhibiční vliv různých lidských monoklonálních protilátek proti AILIM na množení T buněk, v testu pomocí reakce smíšených lymfocytů (MLR). T buňky z normální zdravé osoby „dárce C“ byly kultivovány spolu s PBMC normální zdravé osoby „dárce A“, které byly předem kultivovány v přítomnosti lidské chimerní molekuly CTLA4-lg.

Další označení jsou následující:

“126”: lidská monoklonální protilátka JMab126 proti lidskému AILIM.

“127”: lidská monoklonální protilátka JMab127 proti lidskému AILIM.

“135”: lidská monoklonální protilátka JMab135 proti lidskému AILIM.

“136”: lidská monoklonální protilátka JMab136 proti lidskému AILIM.

“137”: lidská monoklonální protilátka JMab137 proti lidskému AILIM.

Obrázek 66 ukazuje inhibiční vliv různých látek kontrolního testu na množení T buněk, v testu pomocí reakce smíšených lymfocytů (MLR). T buňky z normální zdravé osoby „dárce E“ byly kultivovány spolu s PBMC normální zdravé osoby „dárce G“, které byly předem kultivovány v přítomnosti lidské chimerní molekuly CTLA4-lg.

Jednotlivé popisy v obrázcích znamenají následující.

“kontrolní mlgG”: myší monoklonální protilátka proti lidskému CD34/lgG1 • · · · · · ···· ····· · · · · · * • ·· ··· · ··· · · «· *·· ·· ·· ·· ···· “CD80 + 86 Ab”: směs protilátky proti CD80 a protilátky proti CD86 “SA12”: myší monoklonální protilátka proti lidskému AILIM

Obrázek 67 ukazuje inhibiční vliv různých lidských monoklonálních protilátek proti AILIM na množení T buněk, v testu pomocí reakce smíšených lymfocytů (MLR). T buňky z normální zdravé osoby „dárce E“ byly kultivovány spolu s PBMC normální zdravé osoby „dárce G“, které byly předem kultivovány v přítomnosti lidské chimerní molekuly CTLA4-lg.

Další označení jsou následující:

“138”: lidská monoklonální protilátka JMab138 proti lidskému AILIM.

“139”: lidská monoklonální protilátka JMab139 proti lidskému AILIM.

“140”: lidská monoklonální protilátka JMab140 proti lidskému AILIM.

“141”: lidská monoklonální protilátka JMab141 proti lidskému AILIM.

Obrázek 68 ukazuje inhibiční vliv různých látek kontrolního testu na množení T buněk, v testu pomocí reakce smíšených lymfocytů (MLR). T buňky z normální zdravé osoby „dárce G“ byly kultivovány spolu s PBMC normální zdravé osoby „dárce F“, které byly předem kultivovány v přítomnosti lidské chimerní molekuly CTLA4-lg.

Jednotlivé popisy v obrázcích znamenají následující.

“kontrolní mlgG”: myší monoklonální protilátka proti lidskému CD34/lgG1 “CD80 + 86”: směs protilátky proti CD80 a protilátky proti CD86 “SA12: myší monoklonální protilátka proti lidskému AILIM

Obrázek 69 ukazuje inhibiční vliv různých lidských monoklonálních protilátek proti AILIM na množení T buněk, v testu pomocí reakce smíšených lymfocytů (MLR). T buňky z normální zdravé osoby „dárce G“ byly kultivovány spolu s PBMC normální zdravé osoby „dárce F“, které byly předem kultivovány v přítomnosti lidské chimerní molekuly CTLA4-lg.

· 4 Λ

4

4 4 4

Další označení jsou následující:

“JMab-136”: lidská monoklonální protilátka JMab136 proti lidskému AILIM.

“138”: lidská monoklonální protilátka JMab138 proti lidskému AILIM.

“139”: lidská monoklonální protilátka JMab139 proti lidskému AILIM.

“140”: lidská monoklonální protilátka JMab140 proti lidskému AILIM.

“141”: lidská monoklonální protilátka JMab141 proti lidskému AILIM.

Obrázek 70 ukazuje ADCC indukující aktivitu různých lidských monoklonálních protilátek proti lidskému AILIM a kontrolních protilátek, kdy byly jako cílové buňky použity standardní buňky CHO.

Svislá osa ukazuje rozsah cytotoxicity způsobené ADCC indukující aktivitou protilátky, a vodorovná osa ukazuje koncentraci protilátky.

Obrázek 71 ukazuje ADCC indukující aktivitu různých lidských monoklonálních protilátek proti lidskému AILIM a kontrolních protilátek, kdy byly jako cílové buňky použity rekombinantní buňky CHO, ve kterých probíhá nadprodukce lidského AILIM.

Svislá osa ukazuje frekvenci poškození buňky, způsobené ADCC indukující aktivitou protilátky, a vodorovná osa ukazuje koncentraci protilátky.

Obrázek 72 ukazuje inhibiční účinek monoklonální protilátky proti AILIM na opožděnou alergii.

Svislá osa ukazuje velikost zarudnutí jako míru objevení se opožděné alergie, a vodorovná osa ukazuje typ testovaného vzorku, který byl živočichovi podán.

Obrázek 73 ukazuje proliferační aktivitu T buněk v testu, který zjišťuje aktivitu různých lidských monoklonálních protilátek proti AILIM přenášet kostimulační signál, pomocí mikrotitrační destičky potažené lidskou monoklonální protilátkou proti AILIM spolu s monoklonální protilátkou proti lidskému CD3.

Svislá osa ukazuje velikost inkorporace [³H]tymidinu do buněk jako míru množení buněk, a vodorovná osa ukazuje koncentraci lidské monoklonální protilátky proti lidskému AILIM.

• * • · · ·

9 ·<

• · · • · · ♦ · • »9

9 9

9 · ·

Obrázek 74 ukazuje inhibiční aktivitu negativní kontrolní protilátky na vazbu mezi rozpustnými ligandy AILIM (hB7h-lgFc) a rozpustným AILIM (AlLIM-lgFc) při různých koncentracích.

Svislá osa ukazuje absorbanci jako ukazatel stupně inhibiční aktivity, a vodorovná osa ukazuje koncentraci rozpustného AILIM.

Obrázek 75 ukazuje inhibiční aktivitu protilátky proti AILIM na vazbu mezi rozpustnými ligandy AILIM (hB7h-lgFc) a rozpustným AILIM (AlLIM-lgFc) při různých koncentracích.

Obrázek 76 ukazuje inhibiční aktivitu protilátky proti AILIM při různých koncentracích na vazbu mezi rozpustnými ligandy AILIM (hB7h-lgFc) a rozpustným AILIM (AlLIM-lgFc).

Obrázek 77 ukazuje inhibiční aktivitu různých lidských monoklonálních protilátek proti lidskému AILIM na množení T buněk, v testu který zjišťuje schopnost přenosu kostimulačního signálu pomocí mikrotitrační destičky potažené rozpustným ligandem lidského AILIM (hB7h-lgFc) spolu s monoklonální protilátkou proti lidskému CD3.

Svislá osa ukazuje velikost inkorporace [³H]tymidinu do buněk jako míru množení buněk, a vodorovná osa ukazuje koncentraci protilátky.

Obrázek 78 ukazuje inhibiční aktivitu různých lidských monoklonálních protilátek proti lidskému AILIM na množení opičích T buněk, v testu který zjišťuje schopnost přenosu kostimulačního signálu pomocí mikrotitrační destičky potažené rozpustným ligandem lidského AILIM (hB7h-lgFc) spolu s monoklonální protilátkou proti lidskému CD3.

Příklady provedení vynálezu

Předložený vynález je dále podrobněji ilustrován odkazem na příklady, to však nesmí být interpretováno tak, že by byl mimo ně omezen.

• · « · » <

«· ·· • · · • · · « » • * · • » * • · » · *· «·< · · 4* • · · · · · • « · « ·

Příklad 1 Příprava imunogenu

1-1: Příprava rekombinantní buňky exprimující lidský AILIM

Pomocí metody popsané v dřívějších přihláškách (JP-Ač. Hei 11-29 599 a WO 98/38 216) a rovněž v dřívější zprávě (Int. Immunology, sv. 12, č. 1, str. 51 až 55, 2000) jedním z autorů předloženého vynálezu Tezukou, byly připraveny dva typy rekombinantních buněk (buňka CHO a buňka HPB-ALL), u kterých dochází k nadprodukci lidského AILIM. Přesněji řečeno, metoda je následující:

cDNA (GenBank přístupové číslo: AB 023 135 (cDNA); BAA 82 129 (aminokyselina )) obsahující celou délku OFR, kódující lidský AILIM, byla vložena do vektoru pEF-neo. Potom byl výsledný rekombinantní expresní vektor vnesen do buněk z vaječníku čínského křečka (buňka CHO) a buněk lidské linie z tymomu, HPB-ALL, pomocí běžně používané metody elektroporace (960 pF, 320 V), za použití přístroje Gene Pulser (BioRad). Buňky byly kultivovány v médiu RPMI1640, obsahujícím Geneticin (0,8 mg/ml; Gibco BRL) a 10% FCS, aby došlo k výběru transformovaných buněk rezistentních k léku.

1-2: Selekce rekombinantních buněk HPB-ALL, u kterých dochází k nadprodukci lidského AILIM.

Kultura buněk HPB-ALL rezistentních k léku a selektovaných v 1-1, jak bylo popsáno výše, byla centrifugována, aby byl získán sediment buněk. K buněčnému sedimentu byla přidána myší monoklonální protilátka proti lidskému AILIM, pojmenovaná “SA12” (myší monoklonální protilátka proti lidskému antigenu JTT-1), která byla připravena a popsána dříve (JP-A 11-29 599 (příklad 12) a WO 98/38 216 (příklad 12)) autory předloženého vynálezu (koncentrace: roztok protilátky (100 pg/ml) zředěný v EDTA-BSA/PBS byl přidán v poměru 100 pl/10⁵ buněk). Výsledné směsi byly inkubovány při 4 °C po dobu 30 minut. Buňky byly dvakrát promyty výše uvedeným EDTA-BSA/PBS (200μΙ), a potom k nim byl přidán streptavidin značený fykoerytrinem (SA-PE; 100 μΙ 500krát zředěného roztoku). Výsledné směsi byly inkubovány při 4 °C po dobu 30 minut. Po inkubaci byly buňky třikrát promyty EDTA-BSA/PBS a byly připraveny buněčné suspenze.

Aby byly vyselektovány rekombinantní buňky HPB-ALL, u kterých dochází k nadprodukci lidského AILIM, byly pomocí průtokového cytometru FACSort (BecktonDichinson) analyzovány hladiny exprese lidského AILIM v buněčných suspenzích »Φ *♦

Φ · Φ ·

Φ « ·

Λ · ·

Φ · · φφ «φ»·

Μ *♦ • ♦ · • Φ · 4 φ • · Φ · * • Φ · · • 4 · ·

Φ « «

Φ Φ «

Φ Φ · • « · · »« ΦΦ jednotlivých druhů buněk. Vybrané buňky byly kultivovány do souvislého nárůstu v médiu RPMI1640, obsahujícím 10% FCS a G418 (1 mg/ml).

1-3: Selekce rekombinantních buněk CHO, u kterých dochází knadprodukci lidského AILIM

Kultura buněk CHO, které jsou odolné kléku, vybrané v bodu 1-1 a popsané výše, byly centrifugovány, aby byl získán buněčný sediment. Ke každému buněčnému sedimentu byla přidána výše zmíněná myší monoklonální protilátka SA12 proti lidskému AILIM, která byla označena FITC (roztok protilátky (100 pg/ml) zředěná v EDTA-BSA/PBS). Výsledné směsi byly inkubovány při 4 °C po dobu 30 minut. Buňky byly promyty výše zmíněným EDTA-BSA/PBS a potom byly připraveny buněčné suspenze tak, že k buněčným sedimentům byl přidán EDTA-BSA/PBS (500 pl).

Aby byly vyselektovány rekombinantní buňky HPB-ALL, u kterých dochází k nadprodukci lidského AILIM, byly pomocí průtokového cytometru FACSort (BecktonDichinson) analyzovány hladiny exprese lidského AILIM v buněčných suspenzích jednotlivých druhů buněk. Vybrané buňky byly kultivovány do souvislého nárůstu v médiu RPMI1640, obsahujícím 10 % FCS a G418 (1 mg/ml).

1-4: Příprava imunogenu z buněk HPB-ALL, u kterých dochází knadprodukci lidského AILIM

Buňky HPB-ALL, u kterých dochází k nadprodukci lidského AILIM, které byly získány ve výše popsaném bodu 1-2, byly centrifugovány. Získaný buněčný sediment byl čtyřikrát promyt fosfátovým pufrem (PBS; Nikken Seibutsu) a potom resuspendován v pufru obsahujícím inhibitor proteázy (obsahující 25mM HEPES (pH 7,4), 10 mM MgCI₂, 0,25 M sacharózu a inhibitor proteázy (10 U/ml Aprotinine, 2 pg/ml Pepstatin, 50 pg/ml Leupeptin a 0,35 mg/ml PMSF)). Buněčná suspenze byla zpracována v homogenizátoru Potterova typu a centrifugována při nízkých otáčkách (při 1500 otáčkách za minutu při 4 °C po dobu 10 minut). Poté byl získaný supernatant ultracentrifugován (při 100 000 g při teplotě 4 °C po dobu 1 hodiny). Byla získána sražená frakce membrán a ta byla suspendována ve fosfátovém pufru (koncentrace membránové frakce byla upravena tak, že 1 ml PBS obsahoval membránovou frakci z 1*10⁷ buněk). Suspenze byla uložena při teplotě -80 °C. Suspenze obsahující frakci buněčných membrán byla použita jako antigen (imunogen) pro přípravu lidské protilátky, která je předmětem tohoto vynálezu, a která bude popsána dále.

• t ···· ·« ** • · * • · « ·« • * » * « • · · · • 4 ·9 • · · • · « • · · * • a · · ·· Α· ·· ·· • « · · • ί · « · · * · « ·· ··· ·

1-5: Příprava imunogenu z buněk CHO, u kterých dochází knadprodukci lidského AILIM

Buňky CHO, u kterých dochází k nadprodukci lidského AILIM, které byly získány ve výše popsaném bodu 1-3, byly centrifugovány. Získaný buněčný sediment byl čtyřikrát promyt fosfátovým pufrem (PBS; Nikken Seibutsu) a potom resuspendován v pufru obsahujícím inhibitor proteázy (obsahující 25 mM HEPES (pH 7,4), 10 mM MgCI₂, 0,25 M sacharózu a inhibitor proteázy (10 U/ml Aprotinine, 2 pg/ml Pepstatin, 50 pg/ml Leupeptin a 0,35 mg/ml PMSF)). Buněčná suspenze byla zpracována v homogenizátoru Potterova typu a centrifugována při nízkých otáčkách (při 1500 otáčkách za minutu při 4 °C po dobu 10 minut). Poté byl získaný supernatant ultracentrifugován (při 100 000 g při teplotě 4 °C po dobu 1 hodiny). Byla získána sražená frakce membrán a ta byla suspendována ve fosfátovém pufru (koncentrace membránové frakce byla upravena tak, že 1 ml PBS obsahoval membránovou frakci z 1χ10⁷ buněk). Suspenze byla uložena při teplotě -80 °C. Suspenze obsahující frakci buněčných membrán byla použita jako antigen (imunogen) pro přípravu lidské protilátky, která je předmětem tohoto vynálezu, a která bude popsána dále.

Příklad 2: Příprava hybridomu produkujícího lidskou monoklonální protilátku proti lidskému AILIM

V tomto příkladu byla příprava monoklonální protilátky provedena podle typické metody popsané v „Experimentální lékařství (doplněk), Příručka buněčné technologie“ (vyd. T. Kuroki a kol., Yodosha, str. 66 až 74, 1992) a „Experimentální příručka pro monoklonální protilátky“ (T. Ando a kol., Kodansha, 1991).

Frakce buněčných membrán připravená z rekombinantních buněk, u kterých dochází k nadprodukci lidského AILIM, získaných v příkladu 1, byla použita jako imunogen představující lidský AILIM.

Zvířata, u kterých byla provedena imunizace, byly transgenní myši, vytvářející lidské protilátky, které byly připraveny výše popsanou metodou ((Nátuře Genetics, sv. 7, str. 13 až 21, 1994; Nátuře Genetics, sv. 15, str. 146 až 156, 1997; publikovaný japonský překlad mezinárodní přihlášky č. Hei 4-504 365; publikovaný japonský překlad mezinárodní přihlášky č. Hei 7-509 137; Nikkei Science, červen, str. 40 až 50, 1995; atd.).

Pro buněčnou kulturu byly mikrotitrační destičky s mnoha jamkami.

• · • · » ♦ • · · ♦ • · · · · · • · · · · · • · · · · ·

2-1: Imunizace a příprava hybridomů

Každý z imunogenů (100 μΙ/myš/podání), připravených v bodu 1-4 (odvozený z HPB-ALL) a v bodu 1-5 (odvozený z CHO), jak bylo popsáno výše, byl podán výše uvedené transgenní myši, která produkuje lidské protilátky. Imunogen byl podán injekčně spolu s Freudovým kompletním adjuvans (ICN/CAPPEL) do tlapky jako primární imunizace (den 0).

Po primární imunizaci byl každý z obou imunogenů dále podáván injekčně do tlapky v jednotýdenních intervalech jako sekundární a/nebo terciální imunizace. Stejným způsobem byla dále provedena závěrečná imunizace dva dny před přípravou lymfocytů, která je popsána dále.

Dva dny po závěrečné imunizaci byly připraveny lymfocyty z lymfatických uzlin (tříselné a podkolenní) a slezin jednotlivých transgenních myší, u kterých byla provedena imunizace. Lymfocyty a myší myeloidní buňky P3/X63-AG8.653 (ATCC č. CRL-1580) byly smíchány v poměru 5:1 a jako fúzní činidlo byl ke směsi přidán polyethylenglykol 1500 (Boehringer Mannheim). Potom byla směs zředěna 10 objemy základního média EX-CELL301 bez séra (JRH Bioscience). Dále byly smíchané buňky promyty základním médiem a suspendovány v médiu HAT (1 litr základního média obsahoval 13,61 mg hypoxantinu, 176 ěg aminopterinu a 3,88 mg tymidinu). Buňky byly vysety na mikrotitrační destičky s 96 jamkami a kultivovány po dobu 10 až 14 dní, aby byla dokončena buněčná fúze. Výsledkem této buněčné fúze bylo mnoho hybridomů.

2-2: Vyhledávání hybridomů produkujícího lidskou monoklonální protilátku

Množství hybridomů připravených v bodu 2-1, popsaném výše, bylo prohledáváno pomocí buněčného testu ELISA, popsaného dále, aby byly vybrány hybridomy produkující lidskou monoklonální protilátku proti lidskému AILIM.

Příslušné rekombinantní buňky HPB-ALL a rekombinantní buňky CHO produkující nadbytek lidského AILIM, které byly popsány výše, byly vysety do každé jamky ELISA mikrotitrační destičky s96 jamkami (1x10⁵ buněk/jamku). Inkubace byla provedena při teplotě 37 °C po dobu 2 dní.

Poté, co byl z každé jamky odstraněn supernatant, byly k nim přidány vzorky supernatantu z každé hybridomové kultury (50 μΙ/jamku) a směs byla inkubována po dobu 1 hodiny. Poté co byla reakce ukončena, vzorky smíšených roztoků byly odstraněny a každá jamka byla třikrát promyta PBS, který obsahoval 1 % BSA (Sigma).

• « • · · ·

Poté byla ke každé jamce přidána kozí protilátka proti lidskému imunoglobulinu (Fc), konjugované s křenovou peroxidázou (na jamku 50 pl 2000krát zředěné protilátky; Ameircan Corex; 1% BSA/PBS), aby byl detekován těžký řetězec lidského imunoglobulinu (lidská monoklonální protilátka) v supernatantu hybridomu. Směs byla ínkubována pří teplotě místnosti po dobu 1 hodiny.

Na druhé straně byla ke každé jamce přidána kozí protilátka proti řetězci κ lidského imunoglobulinu, konjugované s peroxidázou (na jamku 50 μΙ 2000krát zředěné protilátky; Ameircan Corex; 1% BSA/PBS), aby byl detekován lehký řetězec lidského imunoglobulinu (lidská monoklonální protilátka) v supernatantu hybridomu. Směs byla inkubována při teplotě místnosti po dobu 15 minut.

Protilátka proti lidskému IgFc nebo protilátka proti lidskému IgFx byla z každé jamky mikrotitrační destičky odebrána a potom byly destičky třikrát promyty PBS, obsahujícím 1% BSA. Ke každé jamce byl přidán tetramethylbenzidin (3,3’,5,5’tetramethylbenzidin (TMB), 100 μΙ/jamku, BIO-RAD), a výsledná směs byla inkubována při teplotě místnosti po dobu 15 minut.

Potom byla přidána do každé jamky 1N H₂SO₄ (50 μΙ/jamku), aby byla reakce zastavena. Průběh reakce byl sledován pomocí absorbance při vlnové délce 450 nm na přístroji pro odečítání mikrotitračních destiček (model 3550 Microplate Reader, BIORAD).

Kontrolní ELISA pokus byl proveden stejným způsobem, jak bylo popsáno výše, za použití následujících položek:

(1) standardní buňky HPB-ALL namísto rekombinantních buněk HPB-ALL, exprimujících lidský AILIM;

(2) standardní buňky CHO namísto rekombinantních buněk CHO, exprimujících lidský AILIM;

(3) myší monoklonální protilátky proti lidskému AILIM (SA12 nebo SG430; JP-A 11-29599 (příklad 12) a WO 98/38 216 (příklad 12)) namísto supernatantu hybridomu;

(4) lidská monoklonální protilátka proti KLH (keyhole limpet hemokyanin, PIERCE) namísto supernatantu hybridomu.

Lidská monoklonální protilátka proti KLH byla připravena stejným způsobem, jak bylo popsáno výše v bodu 2-1, a to imunizací výše zmíněných transgenních myší produkujících lidskou protilátku, pomocí KLH (keyhole limpet hemocyanin, PIERCE).

Pomocí výše uvedeného prohledávání bylo vybráno mnoho hybridomů • · · · • · produkujících lidskou monoklonální protilátku, schopnou vázat se k lidskému AILIM.

2-3: Primární klonování hybridomů

Z různých hybridomů, produkujících lidskou monoklonální protilátku proti lidskému AILIM, které byly vybrány v bodu 2-2, bylo pomocí následující metody založeno mnoho typů hybridomových klonů (rodičovské buněčné linie),

Příslušné hybridomy vybrané v bodu 2-2, byly vysety do mikrotitračních destiček s 24 jamkami. Počet buněk hybridomů v každé jamce byl určen pomocí pipetování. Poté bylo k médiu EX-CELL301 (JRH Bioscience), obsahujícímu 4,0 mM L-glutamin a lipid, přidáno 10 % fetálního telecího séra (FCS; Trace Bioscience PTY), 1% penicilín/streptomycin (Sigma), 1% HT Supplement (Gibco BRL) a 2,5% T-STIM Culture Supplement (Collaborative Biomedical Products). Výsledné modifikované médium bylo použito pro zředění hybridomů na koncentraci 1*10⁴ buněk/ml, a buňky byly suspendovány v každé jamce.

Buněčná suspenze (300 pl nebo 600 μΙ) v každé jamce byla spojena a dobře promíchána s modifikovaným médiem (150 ml nebo 300 ml), a do každé jamky mikrotitrační destičky s 96 jamkami byl přidán 200 μΙ podíl buněčné suspenze tak, že každá jamka obsahovala 4 hybridomové buňky. Ke zbývající buněčné suspenzi bylo čerstvě přidáno výše zmíněné modifikované médium (50 ml nebo 100 ml), dobře promícháno a potom byla výsledná buněčná suspenze přidána do každé jamky jiných čerstvě připravených mikrotitračních destiček s 96 jamkami tak, že každá jamka obsahovala 2 hybridomové buňky.

Kultivace pokračovala po dobu 1 až 2 týdnů. Po kultivaci byly v mnoha jamkách nalezeny jednotlivé kolonie, pocházející z jednotlivých hybridomů.

Buněčným ELISA testem bylo ověřeno, že do supernatantu kultury v každé jamce, obsahující kolonii, je produkována lidská monoklonální protilátka proti lidskému AILIM.

2-4: Sekundární klonování hybridomů

Subklonování (sekundární klonování) každého klonu z různých hybridomových klonů, získaných v bodu 2-3, bylo provedeno pomocí téže metody, která byla popsána výše v bodu 2-3.

V tomto pokusu byla hustota buněk v každé jamce mikrotitrační destičky s 96 jamkami upravena na hodnotu 1 buňka/jamku.

• · • · • · · ·

Prohledávání poskytlo mnoho hybridomových klonů, produkujících lidskou monoklonální protilátku proti lidskému AILIM. Část zahrnutých klonů byly ty, které jsou uvedeny níže:

(Jméno klonu)

AIF34 (JMab124), AIF182 (JMab-126), AIF348 (JMab-127),

AIF620 (JMab-128), AIF1052 (JMab-135), AIH5D3 (JMab-136),

AIH386 (JMab-137), AII289 (JMab-138), AII394 (JMab-139),

AII488 (JMab-140), AIJ40 (JMab-141),

Jména uvedená výše jsou použita v předložené přihlášce, a to ve všech příkladech popsaných dále, včetně tohoto, a v obrázkách a tabulkách, obsahujících výsledky testu, získané v tomto příkladu.

Příklad 3: Analýza vlastností monoklonální protilátky

3-1: Analýza těžkého a lehkého řetězce

Pomocí testu ELISA a průtokové cytometrie, které jsou popsány dále, bylo ověřeno, že monoklonální protilátka proti lidskému AILIM, produkovaná každým hybridomovým klonem, který byl klonován výše v bodu 2-4, je opravdu lidská monoklonální protilátka.

Rekombinantní buňky HPB-ALL, u kterých dochází k nadprodukci lidského AILIM, které byly připraveny v příkladu 1, byly vysety do každé jamky mikrotitrační destičky s jamkami tvaru V, v koncentraci (3x10⁴ buněk/jamku). Buňky byly kultivovány při 37 °C v médiu RPMI1640, které obsahovalo 10 % FCS.

Když byly kultury narostlé, byla destička centrifugována (při 1800 otáčkách za minutu po dobu 2 minut), aby došlo k sedimentaci buněk a výsledný supernatant byl odstraněn. Potom byl do každé jamky přidán vzorek supernatantu (50 μΙ/jamku) z kultury každého hybridomu, klonovaného ve výše popsaném bodu 2-4, nebo myší monoklonální protilátky SA12 proti lidskému AILIM (2 pg/50 μΙ) nebo případně lidské monoklonální protilátky proti KLH (50 μΙ/jamku), jakožto protilátky kontrolní. Směs byla ponechána reagovat po dobu 30 minut v ledničce. Po reakci byl roztok z vzorku odstraněn a každá jamka byla promyta fosfátovým pufrem (0,5% BSA-PBS obsahující 5 mM EDTA).

Potom byla do každé jamky přidána některá ze sekundárních protilátek uvedených níže (zředěné 1000krát výše uvedeným fosfátovým pufrem a přidány • · • ·

v množství 50 μΙ/jamku) a buňky v ní byly suspendovány. Suspenze byla ponechána reagovat po dobu 30 minut v ledničce.

(Sekundární protilátka)

Biotinem značená protilátka proti lidskému IgG (Zymed);

Biotinem značená protilátka proti lidskému IgG (Protos);

Biotinem značená protilátka proti lidskému IgFc (EY Laboratories); nebo Biotinem značená protilátka proti lidskému IgK (Vector).

Po skončení reakce byla sekundární protilátka odstraněna a každá jamka destičky byla promyta výše uvedeným fosfátovým pufrem. Potom byl do každé jamky přidán fykoerytrinem značený streptavidin (Streptavidin-PE; Pharmingen; 500krát zředěný výše uvedeným fosfátovým pufrem a přidán v množství 50 μΙ/jamku). Směs byla ponechána reagovat po dobu 30 minut v ledničce. Po reakci byla každá jamka byla promyta výše uvedeným fosfátovým pufrem. Potom byl do každé jamky přidán výše uvedený fosfátový pufr (200 μΙ/jamku) a buňky v něm suspendovány.

V každé jamce byla provedena analýza, aby byla zjištěna reaktivita monoklonální protilátky proti lidskému AILIM, která se nachází v supernatantu kultury každého hybridomového klonu, s buňkami HPB-ALL, u kterých dochází k nadprodukci lidského AILIM.

Kontrolní test byl proveden stejným způsobem, jak je popsáno výše, za použití následujících položek:

(2) lidská monoklonální protilátka proti KLH (keyhole limpet hemokyanin, PIERCE) namísto supernatantu hybridomu.

Lidská monoklonální protilátka proti KLH byla připravena stejným způsobem jak je popsáno výše v bodu 2-1, imunizací transgenních myší, produkujících lidskou protilátku, s KLH (keyhole limpet hemocyanin, PIERCE).

U všech hybridomových klonů popsaných výše v bodu 2-4 bylo potvrzeno, že produkují lidské monoklonální protilátky, skládající se z těžkého řetězce lidského původu, a z lehkého κ řetězce lidského původu.

Příklad výsledku je ukázán na obrázku 1, kde je uveden výsledek testu pro hybridomové klony AIH5D3 (JMab-136), AII289 (JMab-138) a AII394 (JMab-139).

3-2: Zjišťování isotypu lidské monoklonální protilátky « · · • · · · » • · « · ·

Isotyp byl určen u každé lidské monoklonální protilátky proti lidskému AILIM, produkované hybridomy, které byly klonovány v bodu 2-4 a analyzovány v bodu 3-1. Určení bylo provedeno pomocí soupravy Human Monoclonal Antibody Isotyping Kit (American Qualex), podle protokolu připojeného k soupravě.

Bylo zjištěno, že všechny lidské monoklonální protilátky proti lidskému AILIM jsou lgG2/K.

Příklad 4: Příprava lidské monoklonální protilátky proti lidskému AILIM (lidská monoklonální protilátka proti lidskému AILIM) ve velkém měřítku a její čištění

4-1: Metoda 1

Buňky z každého hybridomového klonu, produkujícího lidskou monoklonální protilátku proti lidskému AILIM, který byl připraven ve výše popsaném bodu 2-4, byly přidány do láhví pro pěstování tkáňových kultur (50 ml, FALCON) a kultivovány v atmosféře 5% CO₂ při teplotě 37 °C v médiu ASF104 (Ajinomoto), obsahujícím 10 % FBS s ultranízkým obsahem hovězího IgG (GIBCO-BRL), dokud nedosáhly souvislého nárůstu.

Potom byl celý roztok kultury přenesen do nové láhve pro pěstování tkáňových kultur (750 ml, FALCON) a kultivovány v atmosféře 5% CO₂ při teplotě 37 °C v médiu ASF104 (Ajinomoto), obsahujícím 10 % FBS s ultranízkým obsahem hovězího IgG (GIBCO-BRL), dokud nedosáhly souvislého nárůstu.

Deset až dvacet dní po kultivaci byl supernatant z kultury každého hybridomu odebrán a přenesen do polypropylenové kónické zkumavky o objemu 50 ml (FALCON). Zkumavka byla centrifugována po dobu 5 minut při 500 g.

Potom byl výsledný supernatant po centrifugaci filtrován přes sterilizační filtrační jednotku (NALGEN) a filtrát byl odebrán.

Filtrát byl nanesen na sloupec Hi Trap Protein G (afinitní sloupec HiTrap s proteinem G; Amersham Pharmacia), který byl předem ekvilibrován fosfátovým pufrem (30 ml) při rychlosti průtoku 3 ml/minutu.

Potom byl sloupec promyt fosfátovým pufrem (20 ml) a protilátka, o kterou se jedná, byla vymyta tím, že na sloupec bylo naneseno 100 mM citrátového pufru (pH 2,0) při rychlosti průtoku 1 ml/minutu. Potom byl eluční roztok neutralizován roztokem 750 mM Tris-HCl (pH 9,0), a pak filtrován přes filtr (Millipore), aby byla odstraněna bílá sraženina. Výsledný filtrát byl dialyzován proti fosfátovému pufru (přes noc) a filtrován • · ····» * · · · • ·· · · · · ··· ···· ···· · • · ·· · » * · · · přes filtr (Millipore). Takto purifikovaná lidská monoklonální protilátka proti lidskému AILIM byla získána z každé hybridomové linie.

Koncentrace proteinu byla určována zabsorbance při A₂₈o, měřené pomocí spektrofotometru (1A₂₈o=1,41 mg/ml).

4- 2: Metoda 2

Buňky z každého hybridomového klonu, který byl připraven v bodu 2-4, byly uvedeny do patřičného stavu v médiu ASF104 (Ajinomoto), obsahujícím 10 % FBS s ultranízkým obsahem hovězího IgG (GIBCO-BRL) (1-2x10⁶ bunék/ml z každého klonu), a byly vysety a kultivovány v zařízení Integra Cell Line 1000 (INTEGRA CL1000, INTEGRA BIOSCIENCE). Sedm až deset dní po kultivaci, když hustota buněk dosáhla 1 x10⁸ buněk/ml, byl supernatant z každé hybridomové kultury odebrán.

Supernatant z každé kultury byl nanesen na sloupec Hi Trap Protein G (afinitní sloupec HiTrap s proteinem G; Amersham Pharmacia), který byl předem ekvilibrován fosfátovým pufrem (30 ml) při rychlosti průtoku 3 ml/minutu.

Potom byl sloupec promyt fosfátovým pufrem (20 ml) a na sloupec bylo naneseno 100 mM citrátového pufru (pH 2,0) při rychlosti průtoku 1 ml/minutu, aby došlo k vymývání protilátky. Potom byl kvůli neutralizaci přidán roztok 750 mM Tris-HCI (pH 9,0) a výsledný roztok byl filtrován přes filtr (Millipore), aby byla odstraněna bílá sraženina. Výsledný filtrát byl dialyzován proti fosfátovému pufru (přes noc) a filtrován přes filtr (Millipore). Takto purifikovaná lidská monoklonální protilátka proti lidskému AILIM byla získána z každé hybridomové linie.

Příklad 5: Reaktivita lidské monoklonální protilátky s lidským AILIM a její zkřížená reaktivita s myším AILIM a krysím AILIM

U různých purifikovaných lidských monoklonálních protilátek proti lidskému AILIM, uvedených výše, byla pomocí buněčného ELISA testu analyzována jejich reaktivita s lidským AILIM a rovněž zkřížená reaktivita s myším AILIM a krysím AILIM.

5- 1: Zavedení systému ELISA pro určování koncentrace IgG protilátky a příprava kalibračních křivek.

Protože všechny výše zmíněné purifikované lidské monoklonální protilátky proti lidskému AILIM byly IgG (lgG2) protilátky, byl zaveden ELISA systém pro určování koncentrace IgG protilátky.

Kozí protilátka proti lidskému IgG (Fc) (1,2 pg/ml v PBS; 100 pl/jamku; Organon • · • · • » • «

Teknika) byla přidána do každé jamky ELISA mikrotitrační destičky s96 jamkami (Nunc). Destička byla inkubována při teplotě místnosti po dobu 2 hodin, aby se protilátka proti IgG (Fc) na mikrotitrační destičku adsorbovala. Potom byl supernatant odstraněn a destička byla promyta 3krát fosfátovým pufrem (PBS) obsahujícím 0,05 % Tween 20. Do každé jamky bylo přidáno blokující reakční činidlo (PBS obsahující 0,5% hovězí sérumalbumin (BSA) a 0,1% Tween 20) (200 μΙ/jamku) a destička byla inkubována při teplotě místnosti po dobu 2 hodin, aby se na destičce zablokovala volná místa pro protilátku proti lidskému IgG (Fc). Potom bylo blokující reakční činidlo odstraněno a každá jamka byla dvakrát promyta PBS.

lgG2 protilátka lidského původu (50 μΙ/jamku, The Binding Site), která byla použita jako standardní protilátka, byla přidána v různých koncentracích (0 až 100 ng/ml) do příslušných jamek destičky a ta byla potom inkubována při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Přebytek roztoků standardní protilátky byl odstraněn a každá jamka byla 3krát promyta fosfátovým pufrem obsahujícím 0,05% Tween20.

Potom byla ke každé jamce přidána kozí protilátka proti lidskému lgG/κ konjugovaná s peroxidázou (zředěná 4000krát, 100 μΙ/jamku, Protos), a destička byla inkubována při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny.

Supernatant byl odebrán a mikrotitrační destička byla 3krát promyta fosfátovým pufrem obsahujícím 0,05% Tween20. Do každé jamky byl přidán pufr obsahující substrát (složení: ortofenylendiamin (O-fenylendiamin, OPD; 20 mg)/citrát-fosfátový pufr (pH 5,0, 50 ml)/vodný roztok 30% peroxidu vodíku (15 μΙ)) (100 μΙ/jamku), a destička byla inkubována při teplotě místnosti po dobu 7 minut.

Potom byla do každé jamky přidána 2 M kyselina sírová (50 μΙ/jamku), aby byla reakce zastavena. Na základě hodnot absorbance, měřené při vlnové délce 490 nm na přístroji pro odečítání mikrotitračních destiček, byly vytvořeny kalibrační křivky (obrázek 2).

Kontrolní test byl proveden stejným způsobem, jak je popsáno výše, se samotným kultivačním médiem nebo se samotným roztokem BSA jako testovanými látkami.

5-2: Analýzy reaktivity různých purifikovaných lidských monoklonálních protilátek proti lidskému AILIM s lidským AILIM a rovněž zkřížená reaktivita s myším AILIM a krysím AILIM.

5-2-1: Příprava reakčních látek a aaa

Reakční látky pro použití v tomto buněčném ELISA testu byly připraveny následovně:

5-2-1-1: Příprava rekombinantní buňky CHO, u které dochází knadprodukci myšího AILIM.

Rekombinantní buňky CHO, u kterých dochází k nadprodukci myšího AILIM, byly připraveny a získány stejným způsobem, který byl popsán výše v bodu 1-1 a 1-3.

cDNA (GenBank přístupové číslo: AB 023 132 (cDNA); BAA 82 126 (aminokyselina)), obsahující celou délku otevřeného čtecího rámce kódujícího myší AILIM, byla vložena do vektoru pEF-neo, a potom byl výsledný rekombinantní expresní vektor vnesen do buněk zvaječníku čínského křečka (buňka CHO), pomocí běžně používané metody pro elektroporaci (960 pF, 320 V) za použití přístroje Gene Pulser (BioRad). Buňky byly kultivovány v médiu RPMI1640 obsahujícím Geneticin (0,8 mg/ml; Gibco BRL) a 10 % FCS, aby došlo k výběru transformovaných buněk rezistentních k léku, čímž byly získány rekombinantní buňky CHO, u kterých dochází k nadprodukci myšího AILIM.

5-2-1-2: Příprava rekombinantní buňky CHO, u které dochází knadprodukci krysího AILIM.

Rekombinantní buňky CHO, u kterých dochází k nadprodukci krysího AILIM byly připraveny a získány stejným způsobem, který je popsán výše v bodu 1-1 a 1-3.

cDNA (GenBank přístupové číslo: AB 023 134 (cDNA); BAA 82 128 (aminokyselina)), obsahující celou délku otevřeného čtecího rámce kódujícího krysí AILIM, byla vložena do vektoru pEF-neo, a potom byl výsledný rekombinantní expresní vektor vnesen do buněk z vaječníku čínského křečka (buňka CHO), pomocí běžně používané metody pro elektroporaci (960 pF, 320 V) za použití přístroje Gene Pulser (BioRad). Buňky byly kultivovány v médiu RPMI1640 obsahujícím Geneticin (0,8 mg/ml; Gibco BRL) a 10 % FCS, aby došlo k výběru transformovaných buněk rezistentních k léku, čímž byly získány rekombinantní buňky CHO, u kterých dochází k nadprodukci krysího AILIM.

5-2-1-3: Příprava monoklonální protilátky proti myšímu AILIM

Rekombinantní buňky CHO, u kterých dochází knadprodukci myšího AILIM, které byly připraveny v bodu 5-2-1-1, jak bylo popsáno výše, byly homogenizovány a ultracentrifugovány (100 000 g). Výsledný sediment obsahující frakci buněčných membrán byl odebrán a suspendován v PBS. Výsledná frakce buněčných membrán « ·

byla podána injekčně spolu s kompletním Freudovým adjuvans do tlapek krysám kmene Wistar, jakožto primární imunizace (den 0). Antigen frakce buněčných membrán byl dále krysám podáván do tlapek 7. den, 14. den a 28. den po primární imunizaci. Buňky lymfatických uzlin z nich byly odebrány 2 dny po konečné imunizaci.

Buňky lymfatických uzlin a myší myelomové buňky PAI (JCR No.B0113; Res. Disclosure, sv. 217, str. 155, 1982) byly smíchány v poměru 5:1. Buňky vzájemně fúzovaly za pomoci polyethylenglykolu 4000 (Boehringer Mannheim) jako fúzního činidla, a tak byly připraveny hybridomy produkující monoklonální protilátky. Selekce hybridomů byla dosažena jejich kultivací v médiu ASF104 (Ajinomoto), obsahujícím HAT, 10 % fetálního telecího séra a aminopterin.

Reaktivita krysí monoklonální protilátky v supernatantu kultur každého hybridomů s krysím AILIM byla určována reakcí supernatantu kultur s výše zmíněnými buňkami CHO, u kterých dochází k nadprodukci myšího AILIM, a potom měřením intenzity fluorescence buněk barvených pomocí protikrysího IgG, označeného FITC (Cappel), v průtokovém cytometru EPICS-ELITE. Prohledáváním bylo získáno mnoho hybridomů produkujících monoklonální protilátky, které reagovaly s myším AILIM.

Mezi nimi byla jedna hybridomová linie pojmenována “B 10,5”. Buňky tohoto hybridomů byly podány injekčně intraperitoneálně (10⁶ až 10⁷ buněk/0,5 ml/myš) myším kmene ICR nu/nu (samice, 7 až 8 týdnů staré). Deset až dvacet dní po injekci byly z každé myši za anestezie pomocí laparotomie, pomocí běžně používané metody, odebrány ascity. Krysí monoklonální protilátka B 10,5 (lgG1) proti myšímu AILIM byla z ascitů připravena ve velkém měřítku.

5-2-2: Reaktivita protilátky s lidským, myším a krysím AILIM

Koncentrace lidské monoklonální protilátky proti lidskému AILIM a kontrolní protilátky, které budou použity v testech ELISA, popsaných dále, byly určeny na základě ELISA a kalibračních křivek, získaných v bodu 5-1, popsaném výše.

Všechny druhy buněk, tedy rekombinantní buňky CHO, u kterých dochází k nadprodukci lidského AILIM, připravené v příkladu 1, rekombinantní buňky CHO, u kterých dochází k nadprodukci myšího AILIM, připravené v bodu 5-2-1-1, a rekombinantní buňky CHO, u kterých dochází k nadprodukci krysího AILIM, připravené v bodu 5-2-1-2, byly vysety do jamek mikrotitrační destičky s 96 jamkami a kultivovány při teplotě 37 °C do souvislého nárůstu.

100 ........

Potom byl supernatant odstraněn a byla do každé jamky přidána některá z různých purifikovaných lidských monoklonálních protilátek proti lidskému AILIM nebo výše připravená kontrolní protilátka (koncentrace protilátek: protilátka 200 pg/ml byla zředěna PBS obsahujícím 1% BSA 3krát, 3²krát, 3³krát, 3⁴krát, 3⁵krát, 3⁶krát, 3⁷krát, 3⁸krát, 3⁹krát, 3¹⁰krát, 3¹¹krát a 31¹²krát) v množství 50 μΙ/jamku, a destičky byly ponechány reagovat při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Roztoky monoklonálních protilátek byly odstraněny a každá jamka byla 3krát promyta fosfátovým pufrem obsahujícím 1% BSA (Sigma).

Poté byla ke každé jamce přidána protilátka proti lidskému imunoglobulinu (Fc), konjugované s křenovou peroxidázou (zředěna 1000krát, 50 μΙ/jamku; American Qualex), a destičky byly inkubovány při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny.

Přebytek roztoku značené protilátky byl odstraněn a destičky byly 3krát promyty fosfátovým pufrem obsahujícím 1% BSA. Do každé jamky byl přidán pufr obsahující substrát (složení, ortofenylendiamin (O-fenylendiamin, OPD; 20 mg)/citrát-fosfátový pufr (pH 5,0, 50 ml)/vodný roztok 30% peroxidu vodíku (15 pl)) (100 pl/jamku), a destičky byly inkubovány při teplotě místnosti po dobu 7 minut.

Potom byla do každé jamky přidána 2 M kyselina sírová (50 pl/jamku), aby byla reakce zastavena. Absorbance byla měřena při vlnové délce 490 nm na přístroji pro odečítání mikrotitračních destiček (Bio-Rad).

Aby byly zhodnoceny výše uvedené protilátky, byl stejným způsobem, jak je popsáno výše, proveden kontrolní ELISA test, a to s následujícími kontrolními protilátkami:

(1) Myší monoklonální protilátka SA12 nebo SG430 proti lidskému AILIM (JP-A 1129 599 (příklad 12) a WO 98/38 216 (příklad 12));

(2) Krysí monoklonální protilátka B 10,5 proti myšímu AILIM (popsáno výše v bodu 5-2-1-3);

(3) Myší monoklonální protilátka JTT2 proti krysímu AILIM (monoklonální protilátka produkovaná hybridomem, která byla uložena pro mezinárodní použití 11.10.1996 pod mezinárodním přístupovým číslem FERM BP-5708 v Národním ústavu biologických věd a lidské technologie, Agentura průmyslové vědy a technologie, Ministerstvo mezinárodního obchodu a průmyslu)), který je mezinárodním úřadem pro uložení podle budapešťské smlouvy; JP-A 11-29 599 (příklady 1 a 2) a WO 98/38 216 (příklady 1 a 2))· • · ··· ·· · » · · ····· ·· · ·· • ·· ··· · · · · ·

101 *..* *··* ·· ·· ·· · (4) Výše připravená lidská monoklonální protilátka proti KLH (keyhole limpet hemokyanin, PIERCE), namísto supernatantu hybridomu.

Kontrolní ELISA pokus byl proveden stejným způsobem jak je popsáno výše, za použití standardních buněk CHO, uvedených dále, namísto rekombinantních buněk CHO, které exprimují AILIM.

Výsledek je ukázán na obrázcích 3 až 14.

Na základě získaného výsledku byla vypočtena 50% účinná koncentrace (ED50: ng/ml) jako míra reaktivity každé lidské monoklonální protilátky proti lidskému AILIM s lidským AILIM (rekombinantní buňky CHO, u kterých dochází k nadprodukci lidského AILIM), s myším AILIM (rekombinantní buňky CHO, u kterých dochází k nadprodukci myšího AILIM) nebo s krysím AILIM (rekombinantní buňky CHO, u kterých dochází k nadprodukci krysího AILIM). Výsledky získané výpočty jsou ukázány dále.

(A) ED50 pro CHO, u kterých dochází k nadprodukci lidského AILIM

AIF 34 (JMab-124): 5,3 ng/ml

AIF182 (JMab-126): 3,6 ng/ml

AIF348 (JMab-127): 9,1 ng/ml

AIF620 (JMab-128): 10,1 ng/ml

AIF1052 (JMab-135): 2,0 ng/ml

AIH5D3 (JMab-136): 7,5 ng/ml

AIH386 (JMab-137): 9,6 ng/ml

AII289 (JMab-138): 10,5 ng/ml

AII394 (JMab-139): 10,6 ng/ml

AII488 (JMab-140): 11,0 ng/ml

AU 40 (JMab-141): 3,7 ng/ml

SA 12: 1,8 ng/ml

SG430: 1,2 ng/ml (B) ED50 pro CHO, u kterých dochází k nadprodukci myšího AILIM

AIF 34 (JMab-124): 42 ng/ml

AIF348 (JMab-127): 81 ng/ml

AIF620 (JMab-128): 100 ng/ml

AII289 (JMab-138): 53 ng/ml

AII394 (JMab-139): 60 ng/ml

AII488 (JMab-140): 70 ng/ml • · ····· · · * «· • · · ··· · ··· ·

102 (C) ED50 pro CHO, u kterých dochází k nadprodukci krysího AILIM

AIF 34 (JMab-124): 45 ng/ml

AIF348 (JMab-127): 62 ng/ml

AIF620 (JMab-128): 97 ng/ml

AII289 (JMab-138): 57 ng/ml

AII394 (JMab-139): 90 ng/ml

AII488 (JMab-140): 90 ng/ml

Výsledek ukázal, že lidské monoklonální protilátky proti lidskému AILIM, které jsou předmětem tohoto vynálezu, vykazují výrazné vysoké specificity pro lidský AILIM.

Dále bylo zjištěno, že 6 typů lidských monoklonálních protilátek proti lidskému AILIM (uvedené výše v bodech (B) a (C)) reagují jak s myším AILIM, tak s krysím AILIM (schopnost vazby, zkřížená reaktivita).

Příklad 6: Určování afinity a neutralizační aktivity lidské monoklonální protilátky proti lidskému AILIM k antigenu (lidskému AILIM)

Konstanta rychlosti vazby (ka), konstanta rychlosti disociace (kd) a disociační konstanta (Kd), týkající se reakce mezi jednotlivými purifikovanými lidskými monoklonálními protilátkami proti lidskému AILIM, připravenými výše, a lidským AILIM, byly určovány pomocí komerčně dostupné soupravy BiacoreX (Amersham Pharmacia).

6-1: Příprava antigenu pro imobilizaci na senzorovém čipu

Antigen, který bude imobilizován na senzorovém čipu soupravy, byl připraven jako rekombinantní chimerní antigen (zde označovaný jako „lidský AlLIM-lgFc“), skládající se z extracelulární oblasti lidského AILIM a konstantní oblasti (Fc) lidského lgG1.

Lidský AlLIM-lgFc byl připraven dalším čištěním antigenu získaného metodou popsanou v předcházejících přihláškách (JP-A 11-29 599 (příklad 16 (2)) a WO 98/38 216 (příklad 16 (2)) jedním z autorů předloženého vynálezu, Tezukou.

Supernatant z kultury rekombinantních buněk, produkujících lidský AlLIM-lgFc byl nanesen na sloupec Hi Trap Protein G (afinitní sloupec HiTrap s proteinem G; Amersham Pharmacia), který byl předem ekvilibrován fosfátovým pufrem (30 ml) při rychlosti průtoku 3 ml/minutu, aby došlo k adsorbci lidského AlLIM-lgFc ze supernatantu kultury na sloupec.

Potom byl sloupec promyt fosfátovým pufrem (20 ml) a poté byl na sloupec • 4 • · · · · · · · • · 4 4 · ·· · ·· • ·· 4·· 4 4·· · _Λ *·· *· ·· *· *·

103 nanesen 100 mM citrátový pufr (pH 2,0) rychlostí průtoku 1 ml/minutu, aby došlo k eluci lidského AlLIM-lgFc. Potom byl eluovaný roztok neutralizován roztokem 750 mM TrisHCI (pH 9,0), a dialyzován proti fosfátovému pufru (přes noc). Dialyzovaný roztok byl filtrován přes filtr (Millipore). Takto byl získán purifikovaný IgFc proti lidskému AILIM.

Koncentrace proteinu byla určována z absorbance při A₂₈₀, měřené pomocí spektrofotometru (1A₂₈o=1 mg/ml). Bylo určeno, že koncentrace lidského AlLIM-lgFc je 0,28 mg/ml.

Purifikovaný chimerní protein skládající se z extracelulární oblasti krysího AILIM a konstantní oblasti (Fc) lidského lgG1 (krysí AlLIM-lgFc; JP-A 11-29 599 (příklad 16 (2)) a WO 98/38 216 (příklad 16 (2)) byl také připraven stejným způsobem, jak bylo popsáno výše. Bylo určeno, že koncentrace získaného krysího AlLIM-lgFc je 0,45 mg/ml.

6-2: Určování afinity a neutralizační aktivity

Experimentální postupy, kromě imobilizace antigenu (lidský AILIM-Fc) na senzorovém čipu, který je popsán dále, byly založeny na návodu a protokolech pokusů, které jsou připojeny ke komerčně dostupné testovací soupravě Biacore X (AmershamPharmacia).

Pufr HBS (obsahující 0,01 M HEPES, 0,15 M NaCI, 3 mM EDTA a 0,005% detergent P20, (pH 7,0)) byl ponechán protékat průtokovou buňkou Flow Cell-1, která je součástí soupravy, průtokovou rychlostí 5 μΙ/min. Potom byl přidán roztok (15 μΙ) obsahující 0,005 M NHS (N-hydroxysukcinimid) a 0,2 M EDC (N-ethyl-N'(dimethylaminopropyl)karbodiimid), aby byly aktivovány karboxylové skupiny v CM, který je potažen na povrchu senzorového čipu.

Potom bylo k senzorovému čipu přidáno 23 μΙ roztoku lidského AlLIM-lgFc (10 gg/ml; rozpuštěn v pufru 10 mM octanu sodného (pH 5.0)), aby došlo kjeho imobilizaci na senzorovém čipu. Poté byly nezreagované aktivované karboxylové skupiny blokovány přidáním 35 μΙ 1 M hydrochloridu ethanolaminu. Množství lidského AlLIMlgFc i mobilizovaného tímto imobilizačním postupem, který byl proveden dvakrát, bylo 2 444 RU (rezonančních jednotek), respektive 2 213 RU. Jednotka RU odpovídá hmotě na jednotku plochy; 1RU=1pg/mm².

Průtoková buňka Flow Cell-2, která je referenční průtokovou buňkou, byla podrobena úpravě povrchu stejným způsobem, jak bylo popsáno výše, ale v nepřítomnosti lidského AlLIM-lgFc.

• · · «

Q4 ·· ·· ·· ·* ··«

Fosfátový pufr byl ponechán protékat průtokovou buňkou (senzorový čip) rychlostí průtoku 20 μΙ/minutu a byla do něho přidána každá z purifikovaných lidských monoklonálních protilátek proti lidskému AILIM (10 až 50 pg/ml, 60 pl), které byly připraveny v příkladu,, uvedeném výše.

Standardní podmínky pro měření byly tyto: vazebná fáze po dobu 3 minut, disociační fáze po dobu 10 minut. Příslušná množství protilátky navázané k antigenu a uvolněné z antigenu byly v průběhu času sledovány, aby byl získán senzorgram. Disociace protilátky od antigenu bylo dosaženo při průtoku PBS přes senzorický čip rychlostí 20 pl/min.

Na základě výsledných údajů sensorgramu byly pomocí analytického software (BIAevaluation 3.0), připojeného k soupravě, spočítány konstanta rychlosti vazby (ka), konstanta rychlosti disociace (kd) a disociační konstanta (Kd; Kd=kd/ka).

Afinitní a neutralizační aktivita myších monoklonálních protilátek SA12 a SA430,

připravených ve výše popsaném příkladě, pro	lidský AILIM,	byly také analyzovány
stejným způsobem, jak bylo popsáno výše.
Příslušné získané hodnoty jsou ukázány dále.
označení klonu	ka (1/M.s)	kd [1/s]	Kd(M)
AIF34 (JMab-124)	1,6x10⁴	1,0χ1 θ'⁴	6,3χ10’⁹
AIF182 (JMab-126)	3,2χ10⁴	2,8x10'⁵	8,8x10’¹⁰
AIF348 (JMab-127)	1,9x10⁴	6,4x10’⁵	3,4χ10’⁹
AIF620 (JMab-128)	1,1χ10⁴	IJxW⁴	1,0x10·®
AIF1052 (JMab-135)	1,6x10⁴	6,3χ10·⁵	3,9x10'⁹
AIH5D3 (JMab-136)	2,8χ10⁴	4,9x1ο·⁶	1,8x10¹⁰
AIH386 (JMab-137)	1,2χ10⁵	3,1 xW⁴	2,6x10‘⁹
AII289 (JMab-138)	3,7x10⁴	4,2x10'⁵	1,1x10‘⁹
AII394 (JMab-139)	3,1x10⁴	2,4x10’⁵	7,7x10'¹°
AII488 (JMab-140)	2,3x10⁴	3,5x10'⁵	1,5x10'⁹
AIJ40 (JMab-141)	1,9x10⁴	1,9x10’⁵	1,0x10’⁹
SA 12	7,8x10³	7,9x10'⁵	1,0x10·®
SG430	2,2x10⁴	1,5x1ο·⁴	6,8x10‘⁹

Výsledek ukazuje, že všechny lidské monoklonální protilátky proti lidskému AILIM a myší monoklonální protilátky proti lidskému AILIM, vykazují zřetelnou vysokou vazebnou afinitu a neutralizační aktivitu pro lidský AILIM.

• ·

105

Příklad 7: Schopnost lidské monoklonální protilátky proti lidskému AILIM přenášet kostimulační signál do lidské T buňky.

Bylo analyzováno, zda ano či nikoli lidská monoklonální protilátky proti lidskému AILIM, která je předmětem tohoto vynálezu, má schopnost kontrolovat (zesilování a/nebo inhibování) odpovědi T buněk (produkci cytokinů, jako jsou IFN-γ a IL-4, množení buněk atd.), jinými slovy, zda ano či nikoli vykazují tyto protilátky regulační aktivitu na buněčný přenos kostimulačního signálu, zprostředkovaného AILIM. Provedení analýzy bylo založeno na množství cytokinů (IFN-γ a IL-4), produkovaných v T buňkách, a rovněž tak byl ukazatelem stupeň množení T buněk.

7-1: Ředění protilátky

Monoklonální protilátka OKT3 proti lidskému CD3 (ATCC CRL-8001) byla zředěna fosfátovým pufrem (PBS) na konečnou koncentraci 8 pg/ml.

Každá z řady lidských monoklonálních protilátek proti lidskému AILIM, připravených výše, byla zředěna PBS na konečnou koncentraci 40 pg/ml. Roztoky protilátek byly dále ředěny PBS, a tak byly připraveny různé koncentrace protilátek (40 pg/ml až 0,0049 pg/ml).

7-2: Potažení mikrotitrační destičky protilátkou

Každá jamka mikrotitrační destičky s 96 jamkami byla potažena (1) monoklonální protilátkou OKT3 proti lidskému CD3 (8 pg/ml; 25 pl na každou jamku) a některou z různých lidských monoklonálních protilátek proti lidskému AILIM (40 pg/ml až 0,0049 pg/ml; 25 pl na každou jamku), nebo (2) samotnou monoklonální protilátkou 0KT3 proti lidskému CD3 (8 pg/ml; 25 pl na každou jamku). Destičky byly inkubovány při teplotě 37 °C po dobu 2 hodin. Potom byly roztoky protilátek odstraněny a každá jamka byla 3krát promyta PBS. Po promytí bylo ke každé jamce přidáno médium RPMI1640 (100 pl/jamku), obsahující 10 % FCS a destičky byly inkubovány při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny. Takto byly příslušné jamky destičky potaženy protilátkami, zmíněnými v bodech (1) nebo (2).

Kontrolní pokusy byly provedeny stejným způsobem při použití destiček potažených jakožto kontrolními protilátkami, namísto lidských monoklonálních protilátek proti AILIM, následujícími jednotlivými monoklonálními protilátkami.

106 ......

(2) Myší monoklonální protilátka JHC1 proti lidskému CETP (také označovaná jako JMab109; JP-A 9-20 800); a (3) Lidská monoklonální protilátka proti KLH (také označovaná jako JMab23; výše zmíněný příklad).

Mikrodestičky potažené protilátkami byly použity v následujících testech.

7-3: Příprava suspenze lidských T buněk

Periferní byla odebírána od každé z normálních zdravých osob (5 osob; dárci A, B, C, D a E). Frakce obsahující mononukleární buňky byla připravena centrifugací v hustotním gradientu za použití LymphoPrep (Nycomed). Lidské T buňky byly odděleny od frakce lidských mononukleárních buněk podle návodu pro postup za pomoci soupravy Pan-T cell Isolation Kit (Miltenyi) a magnetického třídícího zařízení Magnetic Sorter. Počet T buněk byl určován pomocí počítače krvinek. Pro přípravu suspenze lidských T buněk (1x10⁶ buněk/ml) byly tyto suspendovány v médiu RPMI1640 obsahujícím 10% FCS.

7-4: Buněčná kultura (1) Kultivace za použití mikrodestičky potažené protilátkou proti lidskému CD3 a protilátkou proti lidskému AILIM

Do každé jamky mikrodestičky potažené výše uvedenou protilátkou byla přidána suspenze lidských T buněk (dárce A, B, C, D nebo E; 100 μΙ/jamku; 1χ10⁵buněk/jamku) a destička byla inkubována při teplotě 37 °C po dobu 3 dní v CO₂inkubátoru.

Po kultivaci byly podíly supernatantú výsledných kultur (50 μΙ) uloženy při -20 °C a potom použity v testu popsaném dále (test na IFNy). Po rozplnění podílů supernatantú kultur, byly patřičné mikrotitrační destičky použity pro následující test:

(2) Kultivace za použití mikrodestičky potažené samotnou protilátkou proti lidskému CD3

Do každé jamky mikrotitračních destiček, potažených výše zmíněnou protilátkou, byla dána suspenze lidských T buněk (dárce D; 100 μΙ/jamku; 1*10⁵ buněk/jamku) a potom k nim byla přidána některá z různých lidských monoklonálních protilátek proti lidskému AILIM (25 μΙ protilátky v koncentraci 40 pg/ml až 0,0049 pg/ml). Destičky byly inkubovány při teplotě 37 °C po dobu 3 dnů v CO₂ inkubátoru.

7-5: Zjišťování proliferační aktivity T buněk ··

Po inkubaci byl do každé jamky destičky přidán methyl[³H]tymidin (0,5 pCi/jamku; Amersham-Pharmacia), a destičky byly inkubovány při teplotě 37 °C po dobu 6 hodin v CO₂ inkubátoru. Po inkubaci byly buňky zachyceny na filtrech GF/C (Packard) v zařízení Cell Harvester. Poté byly filtry vysušeny při teplotě 40 °C po dobu 3 hodin nebo déle, a byl knim přidán Microscinti 0 (20 μΙ/jamku; Packard). Radioaktivita ³H inkorporovaná do buněk a zachycená na filtrech byla měřena měřičem β-radioaktivity (TOP COUNT), čímž byl zjišťován stupeň množení T buněk při kultivaci.

Výsledky jsou ukázány na obrázcích 15 až 39.

Výsledek tohoto testu ukázal, že lidské T buňky se množily výrazně v závislosti na koncentraci buněk, když byly mikrodestičky potaženy monoklonální protilátkou proti lidskému AILIM (lidskou monoklonální protilátkou nebo myší monoklonální protilátkou) spolu s protilátkou proti lidskému CD3. Dále byly zjištěny nějaké rozdíly mezi dárci ve stupni množení buněk.

Na druhé straně lidské T buňky významně nerostou, když byly destičky potaženy samotnou protilátkou proti lidskému CD3 a v průběhu kultivace buněk byla v roztoku použita monoklonální protilátka proti lidskému AILIM (lidská monoklonální protilátka nebo myší monoklonální protilátka) (tekutá fáze).

7-6: Kvantifikace IFNy v supernatantu kultur T buněk

Množství IFNy v supernatantu bylo u příslušných kultur T buněk (dárci B a C), popsaných v odstavci (1) v bodu 7-4, určováno pomocí komerčně dostupné soupravy ELISA pro lidský IFNy (Amersham-Pharmacia; Endogen).

Výsledky jsou ukázány na obrázcích 40 až 47.

Výsledky v tomto testu ukázaly, že produkce IFNy se výrazně zvyšovala v závislosti na koncentraci monoklonální protilátky proti lidskému AILIM (lidské monoklonální protilátky nebo myší monoklonální protilátky).

Příklad 8: Regulační aktivita lidské monoklonální protilátky proti lidskému AILIM, ovlivňující reakci smíšených lymfocytů (MLR)

Bylo testováno, zda ano či nikoli lidské monoklonální protilátky proti lidskému AILIM, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jsou schopny kontroly (zesilující a/nebo inhibující) odpovědi T buněk (produkci cytokinů, jako jsou IFN-γ a IL-4, množení buněk, atd.), jinými slovy, zda jsou či nejsou schopny regulace přenosu kostimulačního signálu, zprostředkovaného AILIM, do buněk, a jako ukazatel byla analyzována

9 *·* · *« f · « · • · »·· *

4 · » · ·

108 « « 4« »» »4 schopnost kontroly množení T buněk (totiž syntézy DNA v buňkách), spojených s alogenní reakci smíšených lymfocytů (alogenní MLR).

8-1: Příprava lidských PBMC buněk a T buněk

Periferní krev (200 ml), odebraná od jednotlivých normálních zdravých osob (7 osob; dárce A, B, C, D, E, F a G) byla rozdělena na vrstvy v Lymphoprep (15 ml; Nycomed) v mikrozkumavkách (50 ml; Falcon). Po centrifugaci (při 1600 ot./min. po dobu 10 minut) byly odebrány prostřední vrstvy. Odebrané buňky byly 2krát nebo vícekrát zředěny fosfátovým pufrem a potom centrifugovány (při 1800 ot./min. po dobu 10 minut). Tak byly připraveny PBMC (mononukleární buňky periferní krve; 2x10⁸ až 5χ10⁸ buněk). Počet buněk byl určován pomocí počítače krvinek. Byl odebrán podíl buněk, které budou použity v MLR testu (1,08x10® buněk/9 mikrodestiček), a ten byl udržován na ledu. Zbývající buňky byly použity pro oddělení T buněk, jak je popsáno dále.

Pro oddělení T buněk od PBMC byla použita souprava Pan T Isolation kit (Miltenyi Biotech). Podle návodu přiloženého k soupravě byly zbývající buňky PBMC přidány k roztoku ze soupravy a roztok byl inkubován. Poté byly buňky promyty PBS, obsahujícím 5 mM EDTA a 0,5 % BSA, a pak resuspendovány v PBS. Potom byla buněčná suspenze nanesena na sloupec Positive Selection Column VS+ (Miltenyi Biotech), která byl nasáknut PBS, a neadsorbovaná frakce byla odebrána. Dále byl na sloupec nanesen PBS a byl odebrán promývací roztok. Tento postup byl ještě jednou opakován. Odebrané roztoky byly spojeny a představovaly frakci T buněk. Po centrifugaci frakce T buněk byly tyto resuspendovány v PBS. Počet výsledných T buněk byl určován pomocí počítače krvinek. Buňky byly použity v následujícím testu.

8-2: Reakce smíchaných lymfocytů (MLR)

Jak bylo popsáno výše, jsou známy dvě signální cesty, které jsou cestami kostimulačního signálu, vyžadované pro aktivaci lymfocytů, jako jsou T buňky, atd., a to jedna mezi CD28 a CD80(B7-1 )/CD86 (B7-2) a druhá mezi CTLA4 a CD80(B71 )/CD86(B7-2), pro něž byly dříve provedeny podrobné porovnávací analýzy.

Totiž množení T buněk, jakožto odpověď na reakci smíchaných lymfocytů (MLR), může být indukováno přenosem signálu každou z obou známých cest.

Tedy za použití látek ukázaných dále byl proveden test, který analyzoval (1) inhibici MLR blokováním signální cesty zprostředkované CTLA4; (2) inhibici MLR blokováním signální cesty zprostředkované CD80 (B7-1)/CD86 (B7-2); (3) inhibici MLR ·» »« ·*··

109 *· ►· • · * φ 9 9 99 » *

9 9 • A 9 9

9 9 * * » » • · · Φ • A ·· blokováním jak signální cesty zprostředkované CTLA4, tak signální cesty zprostředkované CD80 (B7-1)/CD86 (B7-2); (4) inhibici MLR blokováním třetí signální cesty spojené s AILIM; a (5) inhibici MLR blokováním jak signální cesty zprostředkované CTLA4, tak signální cesty zprostředkované AILIM.

Byly použity následující testované látky.

(1) Lidská monoklonální protilátka proti lidskému AILIM (připravená v příkladu popsaném výše);

(2) Myší monoklonální protilátka SA12 proti lidskému AILIM (stejná jako v příkladu popsaném výše);

(3) Lidská monoklonální protilátka proti KLH (negativní kontrola; (stejná jako v příkladu popsaném výše);

(4) Myší IgG protilátka (proti lidskému CD34; negativní kontrola; Immunotech);

(5) Směs monoklonální protilátky proti lidskému CD80 (Pharmingen) a monoklonální protilátky proti lidskému CD86 (Pharmingen); a (6) Lidská chimérní molekula CTLA4-lgFc (Ancell).

Reakce smíchaných lymfocytů (MLR) byla provedena s následujícími 6 kombinacemi za použití buněk PBMC a T buněk připravených od dárců, popsaných výše v bodu 8-1.

(i) T buňka (dárce A) /PBMC (dárce D) (ii) T buňka (dárce D) /PBMC (dárce B) (iii) T buňka (dárce C) /PBMC (dárce A) (iv) T buňka (dárce E) /PBMC (dárce G) (v) T buňka (dárce F) /PBMC (dárce E) (vi) T buňka (dárce G) /PBMC (dárce F)

Koncentrace buněk PBMC a T buněk, které byly použity v testu, byly upraveny tak, jak je popsáno dále.

PBMC byly resuspendovány v PBS a potom přeneseny do misek pro pěstování buněčných kultur (60 mm). Buňky byly ozářeny X paprsky (50 Gy) na ozařovači (Hitachi MEDICO). Buňky byly odebrány, centrifugovány a potom přidány do média PRMI1640 obsahujícím 10 % FCS. Počet buněk byl upraven na 2*10⁵ buněk/50 pl.

Výsledné T buňky od každého dárce byly také přidány do média PRMI1640 obsahujícím 10 % FCS a počet buněk byl upraven na 1 χ10⁵ buněk/50 μΙ.

8-2-1: Inhibice MLR lidskou monoklonální protilátkou proti lidskému AILIM

Do každé jamky mikrotitrační destičky s 96 jamkami, které mají tvar U, bylo dáno médium PRMI1640 obsahující 10 % FCS. Roztok lidské monoklonální protilátky proti lidskému AILIM nebo myší monoklonální protilátky SA12 proti lidskému AILIM byl zředěn médiem PRMI1640 obsahujícím 10 % FCS tak, že byly připraveny roztoky protilátky s různými koncentracemi. Roztoky ředěných protilátek byly přidány do jamek (konečná koncentrace: 0, 0,31, 1,25, 5 a 20 pg/ml). Potom byly do jamek přidány T buňky (50 pl). Destičky byly inkubovány při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny v CO₂inkubátoru (NAPCO). Po ukončení reakce byly do jamek přidány PBMC (50 pl) pocházející od různých dárců, aby došlo k zahájení MLR.

Když byla prováděna MLR tak, že jako testovaná látka byla použita protilátka jiná, než je lidská protilátka proti lidskému AILIM (popsaná výše v bodech (3) až (6), PBMC po inkubaci s testovanou látkou byly ponechány reagovat s T buňkami, pocházejícími od jiného dárce.

Pátý den kultivace byl do každé jamky přidán tymidin značený tritiem (³Htymidin; 20 pl; 1 pCi/jamku), ředěný médiem PRMI1640 obsahujícím 10 % FCS. Kultivace pokračovala jeden den. Když byla kultura kompletní, buňky byly odebrány pomocí zařízení Cell Harvester (Packard). Aby byla analyzována rychlost množení T buněk během kultivace, byla na měřiči β-záření (TOP COUNT; Packard) měřena radioaktivita ³H inkorporovaného do buněk.

Výsledky jsou ukázány na obrázcích 48 až 59.

8-2-2: Inhibice MLR lidskou monoklonální protilátkou proti lidskému AILIM v MLR systému, kde signální cesta zprostředkovaná CTLA4, byla předem blokována

Do každé jamky mikrotitrační destičky s 96 jamkami, které mají tvar U, bylo dáno médium PRMI1640 obsahující 10 % FCS. Roztok lidské monoklonální protilátky proti lidskému AILIM nebo myší monoklonální protilátky. SA12 proti lidskému AILIM byl zředěn médiem PRMI1640 obsahujícím 10 % FCS tak, že byly připraveny roztoky protilátky s různými koncentracemi. Roztoky ředěných protilátek byly přidány do jamek (konečná koncentrace: 0, 0,31, 1,25, 5 a 20 pg/ml). Potom byly do jamek přidány T buňky (50 pl). Destičky byly inkubovány při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny v CO₂inkubátoru (NAPCO).

Vedle kultury T buněk byly PBMC (v médiu RPMI1640 obsahujícím 10 % FCS), pocházející z jiných dárců, kultivovány nezávisle po přidání lidského CTLA4-lgFc k • · • · • · • · · · • · ·

111

PBMC. Kultivace byla provedena při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny v CO₂ inkubátoru (NAPCO). Koncentrace CTLA4-lgFc byla na počátku MLR upravena na 20 pg/ml.

Potom byly ke kultuře T buněk přidány PBMC (50 μΙ), aby došlo k zahájení MLR.

Když byla prováděna MLR tak, že jako testovaná látka byla použita protilátka jiná, než je lidská protilátka proti lidskému AILIM (popsaná výše v bodech (3) až (5), PBMC kultivované v přítomnosti CTLA4-lgFc s testovanou látkou byly ponechány reagovat s T buňkami, pocházejícími od jiného dárce.

Pátý den kultivace byl do každé jamky přidán tymidin značený tritiem (³Htymidin; 20 μΙ; 1 μΦήθΓη^), ředěný médiem PRMI1640 obsahujícím 10 % FCS. Kultivace pokračovala jeden den. Když byla kultura kompletní, buňky byly získány pomocí zařízení Cell Harvester. Aby byla analyzována rychlost množení T buněk během kultivace, byla na měřiči β-záření (TOP COUNT; Packard) měřena radioaktivita ³H inkorporovaného do buněk.

Výsledky jsou ukázány na obrázcích 60 až 69.

Výsledky získané ze dvou testů popsaných výše je možno souhrnně popsat následujícím způsobem:

(1) CTLA4-lgFc blokuje přenos signálu zprostředkovaný CTLA-4, a tak inhibuje množení T buněk indukované allogenní MLR.

(2) Protilátka proti CD80 a protilátka proti CD86 inhibují přenos signálu zprostředkovaný CD80/CD86, který je ligandem pro CTLA4 a CD28, a tak inhibuje množení T buněk indukované allogenní MLR.

(3) Monoklonální protilátka proti lidskému AILIM, stejně jako CTLA4-lgFc, protilátka proti CD80 a protilátka proti CD86, výrazně inhibuje množení T buněk indukované allogenní MLR, spojené s přenosem signálu zprostředkovaným AILIM způsobem, který závisí na koncentraci protilátky.

Jinými slovy, tyto výsledky ukazují, že třetí cesta zprostředkovaná AILIM a jeho ligandem, vedle známých cest přenosu zprostředkovaných CTLA4/CD80/CD86 a zprostředkovaných CD28/CD80/CD86, existují jako cesty kostimulačního signálu, vyžadované pro aktivaci T buněk, a rovněž že signální cesta zprostředkovaná AILIM je inhibována protilátkou proti AILIM.

Dále vzniká možnost, že příspěvek cesty zprostředkované AILIM k přenosu signálu může být srovnatelný s cestami, které jsou zprostředkované CTLA4/CD80/CD86 a CD28/CD80/CD86.

• ·

112

Příklad 9: Schopnost lidské monoklonální protilátky proti lidskému AILIM indukovat buněčnou cytotoxicitu závislou na protilátkách (ADCC)

Biologické aktivity, jejichž příčinou jsou protilátky, zahrnují i indukci buněčné cytotoxicity závislé na protilátkách (ADCC). ADCC je cytotoxické působení, které vyžaduje vedle efektorových a cílových buněk i přítomnost protilátky, která indukuje poškození cílových buněk navozené efektorovými buňkami jako je lymfocyt, makrofág nebo polymorfonukleární leukocyt.

Aktivita monoklonální protilátky proti lidskému AILIM, která je předmětem tohoto vynálezu, indukovat ADCC, byla analyzována následujícím způsobem:

Ke kultuře lidských rekombinantních buněk HPB-ALL, produkujících nadbytek lidského AILIM, a připravených výše v příkladu 2, byl přidán ⁵¹Cr (0,1 mCi/10⁶ buněk; Amersham-Pharmacia), a směs byla inkubována při teplotě 37 °C po dobu 2 hodin. Buňky byly 8krát promyty médiem RPMI1640. Získané buňky značené izotopem byly použity jako cílové buňky.

Kontrolní pokusy byly provedeny stejným způsobem, jak bylo popsáno výše, přičemž jako kontrolní buňky byly použity standardní lidské buňky HPB-ALL, značené izotopem.

Pomocí zařízení Lymphosepar I (IBL) byly z periferní krve, odebrané od normálních zdravých osob, odděleny frakce PBMC. Tyto získané lidské PBMC byly použity jako efektorové buňky.

Do každé jamky mikrotitrační destičky s 96 jamkami (Nunc), které mají tvar U, byly vysety cílové buňky (1 *10⁴ buněk/jamku; 25 μΙ/jamku). Potom byly do každé jamky přidány některé z různých koncentrací lidských monoklonálních protilátek proti lidskému AILIM, zředěných médiem RPMI1640 obsahujícím 5 % FBS (0,0001 až 1,0 pg/ml; 25 μΙ/jamku), médium samotné (25 μΙ/jamku) nebo Nonidet P-40 (25 μΙ/jamku; detergent, který má schopnost lyžovat buňky) a destička byla inkubována při teplotě místnosti po dobu 20 minut.

Kultivace byla provedena stejným způsobem, jak bylo popsáno výše, za použití monoklonální protilátky OKT3 proti lidskému CD3 (ATCC CRL-8001) jako pozitivní kontrolní protilátky, namísto protilátky proti lidskému AILIM.

• · · ·

Poté byly ke každé jamce přidány efektorové buňky (poměr E/T = 50; 1x10⁵buněk/jamku; 50 μΙ/jamku) a destička byla inkubována při teplotě 37 °C po dobu 16 hodin v atmosféře 5% CO₂ v inkubátoru.

Po kultivaci byly vzorky centrifugovány (10 minut při 1500 ot. /min. při teplotě 4 °C). Výsledný supernatant byl odebrán. Radioaktivita v supernatantu po centrifugaci byla zjišťována měřičem β-radioaktivity. Radioaktivita představuje množství ⁵¹ Cr, uvolněného z buněk v kultuře do supernatantu kultury tím, že je vlivem ADCC poškozena buněčná membrána.

Procento poškození buněčné membrány (procento lyžovaných buněk), které bylo způsobeno ADCC, indukované protilátkami proti AILIM nebo protilátkami proti CD3, bylo zjišťováno za předpokladu, že radioaktivita pozorovaná u samotného média odpovídá, pokud jde o poškození buněčné membrány, 0 % poškození (0), a radioaktivita pozorovaná u Nonidetu odpovídá, pokud jde o poškození buněčné membrány, 100 % poškození.

Výsledky jsou ukázány na obrázcích 70 a 71.

Výsledek testu ukázal, že lidská monoklonální protilátka proti lidskému AILIM, která je předmětem tohoto vynálezu, vykazovala schopnost indukovat ADCC způsobem, který je závislý na koncentraci.

Příklad 10: Určení genu a aminokyselinových sekvencí lidské monoklonální protilátky proti lidskému AILIM a jejich analýza

Sekvence cDNA kódující těžké řetězce a rovněž cDNA kódující lehké řetězce různých lidských monoklonálních protilátek proti lidskému AILIM, které byly připraveny v příkladu popsaném výše, byly určeny tak, jak je popsáno dále. Byly také analyzovány strukturní rysy těchto genů.

Pomocí soupravy Quick Prep mRNA Purification Kit (Amersham-Pharmacia) byly z každého hybridomu, který produkuje lidskou monoklonální protilátku proti lidskému AILIM, připraveného v příkladu uvedeném výše (klony: AIH5D3 (JMab-136), AII289 (JMab-138) a AII394 (JMab-139)), extrahovány a purifikovány polyA⁺ RNA.

Buňky hybridomu byly suspendovány v pufru pro buněčnou lýzu (lyzovací pufr) a lyžovány pomocí injekční stříkačky, aby došlo k jejich solubilizaci. K solubilizovanému materiálu byla přidána pryskyřice s oligo (dT) a směs byla jemně míchána. Potom byla pryskyřice s oligo (dT) promyta a polyA* RNA byla eluována pomocí elučního pufru.

• · · · . . . · · · : .

····· ...· · • ...........

• · ·..· .. .· ......

114 .....

Eluovaná polyA⁺ RNA byla vysrážena ethanolem a pak rozpuštěna v pufru Tris-EDTA. Koncentrace získané polyA⁺ RNA byla určována pomocí absorbance při vlnové délce 260 nm.

Dvojřetězcová cDNA byla syntetizována za použití polyA⁺ RNA jako matrice, pomocí metody využívající reverzní transkriptázu M-MLV komerčně dostupnou soupravou pro syntézu cDNA (GIBCO BRL) a syntetického DNA oligonukleotidu Notl-T (SEQ ID NO: 1) jako primerů.

Podrobněji řečeno, jednořetězcová cDNA byla syntetizována v roztoku (50 μΙ), který obsahoval jako matrici polyA⁺ RNA purifikovanou z hybridomů (5 pg), primer (400 pmol) a reverzní transkriptázu M-MLV při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny. Potom byly k reakční směsi přidány dNTP, DNA polymeráza I, RNázaH, DNA ligáza, pufr a destilovaná voda (4 pl), a směs byla inkubována při teplotě 16 °C po dobu 2 hodin, aby došlo k syntéze dvojřetězcové cDNA. Výsledná dvojřetězcová cDNA byla extrahována směsí fenol/chloroform a pak vysrážena ethanolem.

Potom byly k roztoku obsahujícímu dvojřetězcovou cDNA v TE pufru (50 pl) přidány DNA spojovníku EcoRI (300 pmol) a DNA ligáza (Ligation High; 33 pl; TOYOBO) a směs byla inkubována při teplotě 16 °C po dobu 80 minut, aby byla k cDNA připojena DNA spojovníku. Použitý DNA spojovník byla dvojřetězcová DNA, skládající se z DNA oligonukleotidu (20adp; SEQ ID NO: 2) a DNA oligonukleotidu (24adp; SEQ ID NO: 3), které byly na 5' konci fosforylovány a teplotně spolu hybridizovány pomocí běžně používaného postupu.

Ligovaná DNA byla extrahována směsí fenol/chloroform a potom vysrážena ethanolem. Poté byla DNA štěpena komerčně dostupným restrikčním enzymem Notl (TOYOBO), a pak inkubována s komerčně dostupným roztokem ATP (GIBCO BRL) a T4 kinázou (TOYOBO) při teplotě 37 °C po dobu 30 minut, aby došlo k fosforylaci jejích konců.

Výsledná DNA byla vysrážena ethanolem a pak frakcionována pomocí elektroforézy v polyakrylamidovém gelu. Byla vyříznuta část gelu, obsahující DNA dlouhé asi 500 až 2000 párů bází. Vyříznutí gelu bylo provedeno, když byla DNA obarvena ethidiumbromidem, a tím byla zviditelněna při osvětlení UV světlem ve fotografickém zařízení.

Vyříznutý kus gelu byl rozdrcen a suspendován v TE pufru. Suspenze byla centrifugována a získaný supernatant byl odebrán.

• · · · • · • ·

115

Získaná DNA byla ligována do komerčně dostupného lambda fágového vektoru AEXcell (0,25 pg; Amersham Pharmacia) v přítomnosti komerčně dostupné DNA ligázy (Ligation High; TOYOBO) (při teplotě 16 °C po dobu 30 minut). V dalším kroku byla ligovaná DNA sbalena do lambda fága pomocí komerčně dostupné lambda fágové sbalovací soupravy Gigapack III Gold (STRATAGENE) a výslednými fágovými částicemi byly infikovány hostitelské bakterie E. coli NM522, aby došlo k vytvoření cDNA knihovny. Všechny manipulace byly provedeny podle návodů, které byly k soupravě připojeny.

Dále byla cDNA knihovna prohledávána pomocí plakové hybridizační metody (Maniatis a kol., Molekulární klonování: Laboratorní příručka, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) takto:

cDNA knihovna (1x10⁴ plaků) byla vyseta na agarové plotny a za použití nylonových membrán Hybond-N (Amersham Pharmacia) byly připraveny jejich otisky na filtrech. S otisky na filtrech byla provedena, podle postupu plakové hybridizační metody, hybridizace za použití sond značených γ³²Ρ-ΑΤΡ, přítomných v hybridizačním pufru. Použité sondy byly HIGLC (SEQ ID NO: 4) pro lehký řetězec protilátky a NHCc2 (SEQ ID NO: 5) pro těžký řetězec protilátky. Z pozitivních klonů, získaných z primárního a sekundárního prohledávání byla provedena izolace jednotlivých plaků.

Každý těžký řetězec a lehký řetězec protilátky byl amplifikován pomocí PCR za použití PCR primerů, Taq PCR soupravy (TAKARA) a fágové suspenze ze všech jednotlivých pozitivních klonů, které byly použity jako DNA matrice. Párem primerů, použitých pro lehký řetězec protilátky, byly ExcellE (SEQ ID NO: 6) a ck117 (SEQ ID NO: 7), a párem primerů, použitých pro těžký řetězec protilátky, byly ExcellE (SEQ ID NO: 6) a NHCc2 (SEQ ID NO: 5). Výsledné produkty PCR byly frakcionovány běžnou metodou za použití elektroforézy v agarózovém gelu. Kousky gelu, obsahující DNA dlouhou asi 600 párů bází, odpovídající těžkému řetězci a lehkému řetězci, byly vyříznuty. Nukleotidové sekvence DNA, vyčištěných z těchto gelů, byly analyzovány pomocí DNA sekvenátoru (373A; PE-Applied Biosystems), ABI PRISM sekvenačního programového vybavení (PE-Applied Biosystems) a ABI PRISM autoasembleru (PEApplied Biosystems). DNA z každého pozitivního klonu byla ověřována, zda obsahuje dostatečně dlouhou nukleotidovou sekvenci.

λ fágem z plaku každého pozitivního klonu byly infikovány bakterie E. coli NP66, kvůli in-vivo vyštěpení plazmidové DNA, o kterou se jedná, a získané vláknité fágy byly • ·

116

vysety na plotny obsahující ampicilin, aby poskytly kolonie. Poté byly z kolonií získány a puntíkovány plazmidové DNA pomocí běžně používané metody a těmito plazmidy byl transformován kmen E. coli JM109. Pak byly transformované buňky vysety na plotny s živným agarem, obsahujícím ampicillin, aby došlo k vytvoření kolonií.

Potom byly bakteriální suspenze, pocházející z každé kolonie, v médiu LB obsahujícím ampicillin, přeneseny do tekutého živného média, a bakterie byly kultivovány při teplotě 37 °C po dobu 24 hodin. Bakterie byly z kultury získány a plazmidová DNA byla purifikována pomocí soupravy pro čištění plazmidu (Quiagen). Všechny plazmidové DNA byly štěpeny restrikčními enzymy EcoRI/Notl, aby byla ověřena přítomnost DNA vektoru a DNA inzertu (cDNA těžkého řetězce nebo cDNA lehkého řetězce).

Každá nukleotidová sekvence cDNA, kódující těžký řetězec protilátky a lehký řetězec protilátky, které byly vloženy v každém z purifikovaných plazmidů, byly analyzovány běžně používanou metodou pomocí DNA sekvenátoru (377A; PE-Applied Biosystems), ABI PRISM sekvenačního programového vybavení (PE-Applied Biosystems) a ABI PRISM autoasembleru (PE-Applied Biosystems).

Primery použité pro určování sekvence byly následující:

Primery použité pro určování sekvence cDNA těžkého řetězce:

M13R primer (SEQ ID NO: 8; STRATAGENE), ExcellE (SEQ ID NO: 6), 136H (SEQ ID NO: 9), 138/9H (SEQ ID NO: 10), AILIMHC1 (SEQ ID NO: 11), HCc1 (SEQ ID NO. 12), NHCc2 (SEQ ID NO: 5), HCc7 (SEQ ID NO: 13), HCc8 (SEQ ID NO: 14), HCc3 (SEQ ID NO. 15), HCc4 (SEQ ID NO: 16), HCc6 (SEQ ID NO: 17), HIGHC (SEQ ID NO: 18), HCc9 (SEQ ID NO. 19), HCc5 (SEQ ID NO: 20) a polyA(SEQ ID NO: 21). Primery použité pro určování sekvence cDNA lehkého řetězce:

M13R primer (SEQ ID NO: 8; STRATAGENE), ExcellE (SEQ ID NO: 6), AILIMLC1 (SEQ ID NO: 22), AILIMLC2 (SEQ ID NO: 23), LCc1 (SEQ ID NO: 24), ck117 (SEQ ID NO: 7), HIGLC (SEQ ID NO: 4), LCc2 (SEQ ID NO: 25), HIK (SEQ ID NO: 26), apolyA(SEQ ID NO: 21).

Seznam sekvencí uvedený dále obsahuje cDNA sekvenci kódující těžký řetězec a cDNA sekvenci kódující lehký řetězec lidské monoklonální protilátky proti lidskému AILIM, které jsou produkovány jednotlivými hybridomy, zmíněnými výše, a rovněž aminokyselinové sekvence, odvozené z cDNA sekvencí.

Klon AIH5D3 (JMab-136) * 0 • · * ·

117 ·..··..· ..........

Těžký řetězec

DNA sekvence: SEQ ID NO: 27 (signální sekvence: nukleotid číslo 69 až 125,

V oblast: nukleotid číslo 126 až 419)

Aminokyselinová sekvence: SEQ ID NO: 28 (obsažená signální sekvence: aminokyselina číslo 1 až 19, variabilní oblast: aminokyselina číslo 20 až 118)

Lehký řetězec

DNA sekvence: SEQ ID NO: 29 (signální sekvence: nukleotid číslo 39 až 104,

V oblast: nukleotid číslo 105 až 386)

Aminokyselinová sekvence: SEQ ID NO: 30 (obsažená signální sekvence: aminokyselina číslo 1 až 22, variabilní oblast: aminokyselina číslo 23 až 116)

Klon AII289 (JMab-138)

Těžký řetězec

DNA sekvence: SEQ ID NO: 31 (obsažená signální sekvence: nukleotid číslo 94 až 150, V oblast: nukleotid číslo 151 až 441)

Aminokyselinová sekvence: SEQ ID NO: 32 (obsažená signální sekvence: aminokyselina číslo 1 až 19, variabilní oblast: aminokyselina číslo 20 až 116)

Lehký řetězec

DNA sekvence: SEQ ID NO: 33 (obsažená signální sekvence: nukleotid číslo 28 až 87, V oblast: nukleotid číslo 88 až 375)

Aminokyselinová sekvence: SEQ ID NO: 34 (obsažená signální sekvence: aminokyselina číslo 1 až 20, variabilní oblast: aminokyselina číslo 21 až 116)

KlonAII394 (JMab-139)

Těžký řetězec

DNA sekvence: SEQ ID NO: 35 (signální sekvence: nukleotid číslo 96 až 152,

V oblast: nukleotid číslo 153 až 443)

Aminokyselinová sekvence: SEQ ID NO: 36 (obsažená signální sekvence: aminokyselina číslo 1 až 19, variabilní oblast: aminokyselina číslo 20 až 116)

Lehký řetězec

DNA sekvence: SEQ ID NO: 37 (signální sekvence: nukleotid číslo 33 až 92,

V oblast: nukleotid číslo 93 až 380)

Aminokyselinová sekvence: SEQ ID NO: 38 (obsažená signální sekvence: aminokyselina číslo 1 až 20, variabilní oblast: aminokyselina číslo 21 až 116)

Pomocí analytického programového vybavení pro sekvence genů, byla knihovna • · · ·

118 ·’ ”

V BASE sekvence genů variabilní oblasti lidského imunoglobulinu, zkonstruovaná Tomlinsonem a kol., (Immunol. Today, sv. 16, č. 5, str. 237 až 242, 1995), prohledána pro všechny zde zjištěné DNA sekvence.

Výsledky ukázaly, že geny V oblasti příslušného těžkého řetězce a lehkého řetězce výše zmíněných lidských monoklonálních protilátek, se skládaly z následujících segmentů.

Gen V oblasti těžkého řetězce klonAIH5D3 (JMab-136): 1-02 klon AII289 (JMab-138): 3-13 klon AII394 (JMab-139): 3-13 Gen V oblasti lehkého řetězce klon AIH5D3 (JMab-136): L5 klon AII289 (JMab-138): A27 klon AII394 (JMab-139): A27

Příklad 11: Inhibiční účinek lidské monoklonální protilátky proti lidskému AILIM na hypersenzitivitu opožděného typu (DTH)

Biologický systém imunitní odpovědi, jejíž funkcí je eliminovat antigeny škodlivé živým organizmům (patogenní mikroorganizmy jako je virus, bakterie a parazit, tělu cizí látka, atd.), může být obecně rozdělen na vrozenou imunitu a získanou imunitu.

První z nich je systém eliminace založený na nespecifickém rozpoznávání, zahrnující fagocytózu prováděnou fagocyty (polymorfonukleární leukocyt, monocyt, makrofág ,atd.), napadání buňkami přirozených zabíječů (NK) a opsonizace antigenu komplementem, atd.

Druhý z nich, získaná imunitní odpověď, je systém eliminace prováděný lymfocyty (hlavně T buňkou a B buňkou), která získala specificitu (aktivace) pro antigen.

Dále, získaná imunitní odpověď může být obecně rozdělena na buněčnou imunitu a humorální imunitu.

Na rozdíl od humorální imunity závislé na protilátkách, buněčná imunita je imunitní odpověď vyjádřená obecně formou přímého působení T buňky na antigen, jakožto na cíl. Je známo, že buněčná imunita se účastní imunitní odpovědi k viru nebo nádoru, imunitní odpovědi indukované po transplantaci tkáně nebo orgánu,

119 přecitlivělosti na některé léky a některých autoimunních chorob.

Nejtypičtějším jevem, spadajícím do buněčné imunity, je dobře známá alergie na tuberkulin (téměř totožná s přecitlivělostí na tuberkulin). Alergie na tuberkulin je opožděná alergie, spuštěná infekcí bacilem tuberkulózy. Alergie je způsobená infekcí bacilem tuberkulózy a může být indukována navozením imunitní odpovědi injekcí proteinu tuberkulinu, produkovaného do supernatantu kultury bacilu tuberkulózy, do kůže živočicha.

Opožděná alergie je alergie zprostředkovaná T buňkou (paměťová T buňka, která si pamatuje antigen), senzibilizovanou antigenem. Alergie se nazývá „opožděného typu“, protože živočichu senzibilizovanému antigenem trvá, když vejde znovu do kontaktu s antigenem, 24 až 48 hodin než projeví alergickou odpověď zánětem, indukovaným paměťovou T buňkou.

Jev tuberkulinové alergie, jež je představitelem opožděných alergií, byl všeobecně používán v „tuberkulinovém testu“ při diagnóze, zda se již u živočicha ustavila senzitivita po infekci bacilem tuberkulózy, nebo nikoli. Test je prováděn následujícím způsobem: purifikovaný tuberkulin (purifikovaný proteinový derivát; PPD; 0,1 ml derivátu 0,05 pg/0,1 ml (2,5 TU) pro obecné diagnostické použití), což je tuberkulinový protein, vyčištěný z kultury bacilu tuberkulózy, je podán živočichovi do kůže, a za 48 hodin po injekci je změřen delší rozměr zarudnutí na kůži, které se vyvinulo na místě injekce; a přítomnost infekce bacilem tuberkulózy může být diagnostikována na základě delšího rozměru zarudnutí. Pokud je delší rozměr zarudnutí kratší než 4 mm, potom je jedinec negativní, pokud je délka skvrny v rozmezí 4 až 9 mm, je jedinec falešně pozitivní a pokud je délka skvrny 10 mm a více, pak je jedinec považován za pozitivního.

Opožděné alergie, spojené s buněčnou imunitou, zahrnují například JonesMoteův typ přecitlivělosti, přechodně indukovaný nepatrným množstvím proteinu nebo podobně, kontaktní přecitlivělost k chemikáliím jako je chlorid kyseliny pikrové nebo rostlinné toxiny, jako je japonský lak, nebo přecitlivělost týkající se odmítnutí štěpu (např. alogenní štěp) a rovněž i výše zmíněná alergie na antigen, pocházející z infekčního patogenu, jako je tuberkulinová alergie způsobená bacilem tuberkulózy.

V tomto testu byl hodnocen inhibiční účinek protilátky proti AILIM na přecitlivělost opožděného typu (opožděná alergie) a to za použití tuberkulinového testu. Test byl proveden následovně:

·

120

Každá z opic cynomolgus (samci, tělesná hmotnost 6,0 až 8,5 kg, Environmental Biological Life Science Research Center lne.; 3 jedinci v každé skupině), které byly senzibilizovány BCG (Bacille de Calmette et Guerin), což je oslabená živá bakterie hovězího typu bacilu tuberkulózy, byla znecitlivěna hydrochloridem ketaminu (10 mg/kg, nitrosvalová injekce) a potom jí byl do kůže podán některý z testovaných vzorků uvedených dále, a to v objemu 0,1 ml na každé injekční místo na hrudi (6 injekčních míst/jedince). Vzdálenosti mezi injekčními místy vzorků byly 3 cm nebo delší.

(1) 1:1 směs roztoků lidské monoklonální protilátky proti lidskému AILIM (JMab-136; 0,2 mg; 10 pg na každé injekční místo) a tuberkulinu (4 pg/1 ml fyziologického roztoku);

(2) 1:1 směs roztoků lidské monoklonální protilátky proti lidskému AILIM (JMab-136; 2 mg; 100 pg na každé injekční místo) a tuberkulinu (4 pg/1 ml fyziologického roztoku);

(3) fosfátový pufr (PBS (-)) jako kontrola;

(4) 1:1 směs roztoků komerčně dostupného steroidního protizánětlivého činidla, Prednisolone (0,2 mg; 10 pg na každé injekční místo) a tuberkulinu (4 pg/1 ml fyziologického roztoku) jako pozitivní kontrola;

(5) 1:1 směs roztoků lidské monoklonální protilátky proti KLH (příklad 2-2; 0,2 mg; 10 pg na každé injekční místo) a tuberkulinu (4 pg/1 ml fyziologického roztoku) jako negativní kontrola.

hodin po injekci každého vzorku, byly změřeny delší a kratší rozměr zarudnutí na místě každé injekce, aby byla určena plocha zarudnutí.

Výsledek je ukázán na obrázku 72.

Výsledek ukázal, že zarudnutí způsobené opožděnou alergií bylo ve srovnání s kontrolními a negativně kontrolními skupinami, výrazně inhibováno ve kterékoli skupině, která obdržela injekci protilátek proti AILIM. Inhibiční účinek byl srovnatelný se steroidním protizánětlivým lékem, který byl použit jako pozitivní kontrola.

Příklad 12: Analýza exprese AILIM v různých tkáních pacientů, postižených nemocí reakce štěpu proti hostiteli (GVHD)

Běžně používanou metodou byla analyzována exprese AILIM v různých tkáních, získaných z biopsií pacientů, kteří byli příjemci transplantace alogenního štěpu od dárce, a u kterých bylo klinicky diagnostikováno, že jsou po transplantaci postiženi akutní nebo chronickou nemocí reakce štěpu proti hostiteli (GVHD). Tkáně byly • · · • · · ·

121 obarveny HE a lidskou monoklonální protilátkou proti lidskému AILIM (JMab-136), připravenou v příkladě popsaném výše.

Analýza byla provedena za použití 33 vzorků z různých tkání odebraných z akutních GVHD pacientů (28 případů) a rovněž 5 vzorků z chronických GVHD pacientů (5 případů).

Výsledky byly následující: pozitivní reakce na AILIM byla nalezena v 15 z 29 vzorků kožní tkáně; v 1 ze 3 vzorků tkáně žaludku a v 1 z 1 vzorku tkáně tlustého střeva; které byly všechny získány od pacientů s akutní GVHD. Pozitivní reakce na AILIM byla nalezena v 1 ze 3 vzorků kožní tkáně a ve 2 ze 2 vzorků tkáně tlustého střeva, které byly všechny získány od pacientů s chronickou GVHD. Dále byla pozitivní reakce na AILIM nalezena v 10 z 13 vzorků, u kterých byla pozorována výrazná infiltrace lymfocytů.

Příklad 13: Schopnost lidské monoklonální protilátky proti lidskému AILIM přenášet kostimulační signál do myší T buňky.

Test provedený v příkladu 7 ukázal, že lidské monoklonální protilátky proti lidskému AILIM, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jsou schopny zvýšit proliferaci lidských T buněk prostřednictvím kontrolování odpovědí lidské T buňky, přesněji kontrolováním přenosu kostimulačního signálu zprostředkovaného AILIM, do buňky. V tomto testu bylo stejnou metodou, jaká byla popsána v příkladu 7, analyzováno zda lidské monoklonální protilátky vykazují schopnost zvýšení proliferace opičích T buněk.

13-1: Ředění protilátky

Monoklonální protilátka SP34 proti lidskému CD3 (BD-Pharmingen) byla ředěna ve fosfátovém pufru (PBS) na konečnou koncentraci 1 pg/ml.

Výše připravená monoklonální protilátka JMAb136 proti lidskému AILIM byla ředěna v PBS na konečnou koncentraci 40 pg/ml. Roztoky protilátek byly dále ředěny PBS, a byly tak připraveny různé koncentrace protilátek (40 pg/ml až 0,064 pg/ml).

13-2: Potažení mikrotitrační destičky protilátkou

Každá jamka mikrotitrační destičky s 96 jamkami byla potažena monoklonální protilátkou SP34 proti lidskému CD3 (1 pg/ml; 25 pl v každé jamce) a lidskou monoklonální protilátkou JMAb136 proti lidskému AILIM (40 pg/ml až 0,064 pg/ml; 25 pl v každé jamce). Destičky byly inkubovány při teplotě 37 °C po dobu 2 hodin. Potom byly roztoky protilátek odstraněny a každá jamka byla 3krát promyta PBS. Po promytí

9

122 bylo ke každé jamce přidáno médium RPMI1640 (100 μΙ/jamku) obsahující 10 % FCS a destičky byly inkubovány při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny. Takto byly příslušné jamky destičky potaženy výše uvedenými protilátkami.

Kontrolní pokusy byly provedeny stejným způsobem při použití destiček potažených jakožto kontrolní protilátkou, namísto lidských monoklonálních protilátek proti AILIM, monoklonální protilátkou proti KLH (JMab23; viz předchozí příklady).

13-3: Příprava suspenze opičích T buněk

Periferní krev byla odebírána od opic cynomolgus a mononukleární buňky byly frakcionovány centrifugací v hustotním gradientu za použití NycoPrepl 077A (Nycomed). Podle přiloženého návodu byly opičí T buňky odděleny od mononukleámích buněk opic cynomolgus pomoci protilátky M-T477 proti lidskému CD4 (BD-Pharmingen), protilátky RPA-T8 proti lidskému CD8 (BD-Pharmingen), mikrozrnek s protimyším IgG (Miltenyi) a magnetického třídícího zařízení Magnetic Sorter. Počet T buněk byl určován pomocí počítače krvinek. Opičí T buňky byly suspendovány v médiu RPMI1640, obsahujícím 10% FCS. Tak byla připravena suspenze opičích T buněk (1x10⁶ buněk/ml).

13-4: Buněčná kultura (1) Kultivace za použití mikrodestičky potažené protilátkou proti lidskému CD3 a protilátkou proti lidskému AILIM

Do každé jamky mikrodestičky potažené výše zmíněnou protilátkou byla přidána suspenze opičích T buněk a destička byla inkubována při teplotě 37 °C po dobu 2 dní v CO₂ inkubátoru.

Po ukončení kultivace byly příslušné mikrotitrační destičky použity v následujících testech:

13-5: Zjišťování proliferační aktivity T buněk

Po inkubaci byl do každé jamky destičky přidán methyl[³H]tymidin (0,5 pCi/jamku; Amersham-Pharmacia), a destičky byly inkubovány při teplotě 37 °C po dobu 6 hodin v CO₂ inkubátoru. Po inkubaci byly buňky zachyceny na filtrech GF/C (Packard) v zařízení Cell Harvester. Poté byly filtry vysušeny při teplotě 40 °C po dobu 3 hodin nebo déle, a byl knim přidán Microscinti 0 (20 μΙ/jamku; Packard). Radioaktivita ³H, inkorporovaná do buněk zachycených na filtrech, byla měřena • · · · * · měřičem β-radioaktivity (TOP COUNT), čímž byl zjišťován stupeň množení T buněk v průběhu kultivace.

Výsledek je ukázán na obrázku 73.

Výsledek tohoto testu ukázal, že množení opičích T buněk bylo výrazně závislé na koncentraci buněk, když byly mikrodestičky potaženy monoklonální protilátkou proti lidskému AILIM (lidskou monoklonální protilátkou nebo myší monoklonální protilátkou) spolu s protilátkou proti lidskému CD3.

Výsledek také naznačuje, že lidské monoklonální protilátky proti lidskému AILIM, které jsou předmětem tohoto vynálezu, se mohou vázat na opičí AILIM a mají schopnost regulovat funkci opičího AILIM.

Příklad 14: Zavedení metody pro určování a kvantifikování látek schopných se vázat k AILIM nebo k ligandu AILIM

Byla zavedena metoda ELISA (imunologický test svázaným enzymem) pro určení a kvantifikování látky schopné se vázat k AILIM (ICOS) nebo k ligandu AILIM (B7h/B7RP1/GL50/LICOS).

Princip metody popsané jako příklad podrobné dále, je založen na ohodnocení (pomocí testu ELISA) rozsahu inhibice vazby mezi rozpustným lidským AILIM (hAILIMIgFc) a rozpustným lidským ligandem AILIM (hB7h-lgFc), který je dotyčnou látkou způsobeny.

14-1: Vzorek

Byly použity následující vzorky:

(1) Streptavidin-HRP (Southern Biotechnology Associates, lne.);

(2) Rozpustný ligand lidského AILIM (fúzní protein mezi extracelulární oblastí lidského B7h a konstantní oblastí lidského lgG1);

Protein byl připraven pomocí metody popsané dále v bodu 14-2;

(3) Biotinem značený rozpustný AlLIM-lgFc;

AlLIM-lgFc byl připraven dalším čištěním antigenu získaného pomocí stejné metody, která byla popsána v předchozích přihláškách (JP-A 11-29 599 (příklad 16 (2)) a WO 98/38 216 (příklad 16 (2))) jednoho z autorů předloženého vynálezu, Tezukou.

(4) Lidská monoklonální protilátka proti lidskému AILIM (JMab-136; popsaná výše);

(5) Lidská monoklonální protilátka proti KLH (negativní kontrolní protilátka; JMab23; popsaná výše);

• * · · • 9

124 (6) Fosfátový pufr (PBS (-); Nikken Seibutsu);

(7) Médium PRMI1640 (Nikken Seibutsu);

(8) Fetální telecí sérum (FCS; JRH-Bioscience);

(9) 30% hovězí sérumalbumin (BSA; Sigma);

(10) Tween 20 (BioRad);

(11) TMB⁺ chromogenový substrát (Dako).

14-2: Příprava rozpustného ligandu lidského AILIM (fúzní protein (hB7h-lgFc) mezi extracelulární oblastí lidského B7h a konstantní oblastí lidského lgG1)

Celková RNA byla připravena z mononukleárních buněk lidské periferní krve stejným způsobem, jak bylo popsáno v příkladu výše.

cDNA byla syntetizována ze získané celkové RNA jako matrice (5 pg), za použití soupravy Superscript Preamplification System pro syntézu prvního řetězce cDNA (GIBCO-BRL).

Potom byly navrženy a syntetizovány primery pro amplifikaci cDNA kódující extracelulární oblast lidského ligandu AILIM (hB7h), a to 5' primer (5'GAGGTCTCCGCCCTCGAGATGCGGCTGGGCAGTCC-3', SEQ ID NO: 39), obsahující na svém konci restrikční místo Xhol a 3' primer (5'-CACAGGACAGCCAGGGGATCCCACGTGGCCGCG-3', SEQ ID NO: 40), obsahující na svém konci restrikční místo BamHI. Za použití cDNA jako matrice a páru primerů byla provedena PCR a pomocí ní připravena DNA, která má na svých příslušných koncích Xhol a BamHI, a obsahuje cDNA, kódující extracelulární oblast lidského B7h. Výsledné produkty PCR byly štěpeny Xhol a BamHI, a frakcionovány elektroforézou na agarózovém gelu, aby byl izolována zóna odpovídající asi 720 párů bází dlouhé cDNA, o které bylo předpovězeno, že kóduje extracelulární oblast, o kterou se jedná. Izolovaný fragment cDNA byl klonován do plazmidu pBluescript II SK (+) (Stratagene), který byl předem štěpen Xhol a BamHI. Sekvenční analýzou za použití automatického fluorometrického sekvenátoru DNA (Applied Biosystems) bylo ověřeno, že fragment cDNA obsahoval část kódující extracelulární oblast lidského B7h.

Na druhé straně, DNA kódující Fc lidského lgG1 jako součást fúzního proteinu, byla připravena jakožto DNA fragment BamHl-Xbal (dlouhý 1300 párů bází) štěpením plazmidu (viz Cell, sv. 61, str. 1303 až 1313, 1990; připraveného Dr. Seedem a kol. v Massachusettské všeobecné nemocnici) pomocí BamHI a Xbal. Tento fragment obsahoval exony kódující pantové oblasti Cy12 a Cy13 lidského lgG1.

• · φ · • · ** • · · • · * » »·

125

Fragment Xhol-BamHI, kódující extracelulární oblast lidského B7h (hB7h) a fragment BamHl-Xbal obsahující exony kódující Fc (zkráceně označovaný jako “IgFc”) lidského lgG1, připravené jak bylo popsáno výše, byly klonovány do plazmidu pBluescript II SK (+) (Stratagene), který byl předem štěpen Xhol a Xbal.

Poté byl plazmid štěpen Xhol a Xbal, a tak připraven DNA fragment dlouhý asi 1800 párů bází, obsahující fúzovanou DNA mezi extracelulární oblastí lidského B7h a lidským IgFc. Pomocí T4 DNA ligázy byl tento fúzní DNA fragment vložen do expresního vektoru pME18S (Medical Immunology, sv. 20, č. 1, str. 27 až 32, 1990, a Příručka genového inženýrství, Experimental Medicine, dodatek, Yodosha, str. 101 až 107, 1992) mezi místy Xhol a Xbal, čímž byl zkonstruován plazmid phB7h-lgFc.

Jednovrstevná kultura buněk COS7 (ATCC CRL-1651), pěstovaná do neúplného nárůstu v médiu DMEM, obsahujícím 10 % fetálního telecího séra a ampicilin, byla pomocí elektroporace transformována plazmidem phB7h-lgFc, a výsledkem byly transformované buňky.

Transformované buňky byly ponechány exprimovat hB7h-lgFc při kultivaci v médiu ASF104 bez séra, po dobu 72 hodin.

HB7h-lgFc byl čištěn pomocí afinitního sloupce Protein G Sepharose (Amersham Pharmacia) následujícím způsobem:

Supernatant výše zmíněných kultur byl centrifugován a byl tak získán supernatant po centrifugaci. Tento supernatant byl nanesen na afinitní sloupec Protein G Sepharose, který byl předem ekvilibrován pufrem umožňujícím vazbu. Sloupec promyt pufrem umožňujícím vazbu a poté byla provedena eluce pomocí pufru elučního. Eluovaný roztok byl odebrán a dialyzován proti fosfátovému pufru. Vnější dialyzační pufr byl dvakrát nebo vícekrát měněn. Takto byl získán purifikovaný hB7h-lgFc.

14-3: Ředění protilátky a rozpustného lidského AILIM (h AlLIM-lgFc) a jejich reakce

Původní roztoky (20 pg/ml) monoklonální protilátky proti lidskému AILIM (JMab136) a lidské monoklonální protilátky proti KLH (JMab-23), použité jako negativní kontrolní protilátka, byly zředěny v sériích s 11 úrovněmi, a každý vzorek (200 pl) byl spojen a dobře promíchán s 200 pl média RPMI1640, obsahujícího 10 % FCS. Byly tak připraveny roztoky protilátek o různých koncentracích. Ke každému z připravených roztoků o různých koncentracích byl přidán hAILIM-lgFc značený biotinem (2 pl/jamku; konečná koncentrace 1 pg(ml). Výsledné roztoky byly dobře promíchány a inkubovány při teplotě místnosti po dobu 30 minut.

• 44* • 4

126

14-4: Test schopnosti monoklonální protilátky proti AILIM inhibovat vazbu mezi hAILIMIgFc a hB7h-lgFc

Do každé jamky mikrotitrační destičky s 96 jamkami byl přidán hB7h-lgFc (50 μΙ/jamku (800 ng/jamku)). Destička byla utěsněna a potom inkubována při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny. Po inkubaci byl roztok odstraněn a jamky byly 3krát promyty PBS (120 μΙ). Pak byly do jamek přidány jednotlivé vzorky (50 μΙ/jamku), připravené v bodu

14-3. Destička byla utěsněna a potom inkubována při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny. Ze všech jamek byl odstraněn roztok. Jamky byly 3krát promyty médiem RPMI1640, obsahujícím 10 % FCS (120 μΙ), předem zahřátým na 37 °C. Pak byl do každé jamky přidán PBS obsahující 3,7 % formalínu (100 μΙ/jamku) a destička byla inkubována na ledu po dobu 5 minut. Roztok byl z každé jamky odstraněn a jamky byly 3krát promyty 0,1% Tween 20 (120 μΙ). Pak byl do každé jamky přidán Streptavidin-HRP (50 μΙ/jamku). Destička byla utěsněna a inkubována při teplotě místnosti po dobu 30 minut. Roztok byl z každé jamky odstraněn a destička byla 3krát promyty PBS obsahujícím 0,1 % Tweenu 20 (120 μΙ). Potom byl do každé jamky přidán chromogenový substrát TMB⁺(50 μΙ/jamku) a destička byla inkubována při teplotě místnosti po dobu 20 minut. Poté byla do každé jamky přidána 2 N kyselina sírová (50 μΙ/jamku), aby byla reakce zastavena. Absorbance v každé jamce byla měřena při vlnové délce 450 nm na zařízení THERMO max (Molecular Devices).

Výsledky jsou ukázány na obrázcích 74 až 76.

Výsledky ukázaly, že protilátka proti AILIM má schopnost inhibovat vazbu mezi hAILIM-lgFc a hB7h-lgFc způsobem, který závisí na dávce.

Proto tento příklad ukazuje, že testovací systém vysvětlený na předložené metodě, může být použit pro vyhledávání a určování látek schopných vázat se k AILIM nebo k ligandu AILIM (například protilátka nebo sloučenina s nízkou molekulární hmotností).

Příklad 15: Schopnost lidské monoklonální protilátky proti lidskému AILIM inhibovat proliferaci lidských T buněk, spojených s přenosem kostimulačního signálu zprostředkovaného mezi AILIM a ligandem AILIM

Bylo analyzováno, zda monoklonální protilátky proti lidskému AILIM, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mají nebo nemají schopnost regulovat přenos signálu zprostředkovaného AILIM na povrchu lidské T buňky, a to na základě měření • · · · ·· ·· ·· ·· ·· ····

127 inhibičního účinku lidské monoklonální protilátky proti lidskému AILIM na množení buněk, indukované kontaktem lidské T buňky s ligandem AILIM (B7h/B7RP1/GL50/ LICOS).

15-1: Ředění protilátky

Monoklonální protilátka OKT3 (ATCC CRL-8001) proti lidskému CD3 byla ředěna ve fosfátovém pufru (PBS) na konečnou koncentraci 8 pg/ml.

Rozpustný ligand lidského AILIM (hB7h-lgFc), připravený výše, byl ředěn v PBS na konečnou koncentraci 40 pg/ml. Roztoky protilátek byly dále ředěny PBS, a byly tak připraveny různé koncentrace protilátek (40 pg/ml až 0,064 pg/ml).

15-2: Potažení mikrotitrační destičky protilátkou

Každá jamka mikrotitrační destičky s 96 jamkami byla potažena (1) monoklonální protilátkou 0KT3 proti lidskému CD3 (8 pg/ml; 25 pl v každé jamce) a hB7h-lgFc (40 pg/ml až 0,064 pg/ml; 25 pl v každé jamce). Destičky byly inkubovány při teplotě 37 °C po dobu 2 hodin. Potom byly roztoky protilátek odstraněny a každá jamka byla 3krát promyta PBS. Po promytí bylo do každé jamky přidáno médium RPMI1640 (100 μΙ/jamku), obsahující 10 % FCS a destičky byly inkubovány při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny. Takto byly potaženy příslušné jamky destiček.

15-3: Příprava suspenze lidských T buněk

Periferní byla odebírána od normálních zdravých lidí a mononukleární buňky byly frakcionovány centrifugací v hustotním gradientu za použití LymphoPrep (Nycomed). Podle přiloženého návodu byly lidské T buňky odděleny od lidských mononukleárních buněk pomocí soupravy pro izolaci T buněk, Pan-T cell Isolation Kit (Miltenyi) a magnetického třídícího zařízení Magnetic Sorter. Počet T buněk byl určován pomocí počítače krvinek. Lidské T buňky byly suspendovány v médiu RPMI1640 obsahujícím 10 % FCS a doplněné lidskou monoklonální protilátkou JMab136 proti lidskému AILIM (20 pg/ml). Připravená suspenze lidských T buněk (1 χ10^θ buněk/ml) byla inkubována při teplotě místnosti po dobu 30 minut.

Jako negativní kontrolní protilátka byla použita lidská monoklonální protilátka JMAb 23 proti KLH (20 pg/ml).

15-4: Buněčná kultura

Stejným způsobem, jako byl popsán výše, byla do každé jamky mikrotitrační destičky, potažené protilátkou proti lidskému CD3 a hB7h-lgFc, přidána suspenze • · · · • · · ·· ·· · · ·· ·· ····

128 lidských T buněk (100 μΙ/jamku; 1χ10⁵ buněk/jamku), a destička byla inkubována při teplotě 37 °C po dobu 3 dní v CO₂ inkubátoru.

15-5: Zjišťování proliferační aktivity T buněk

Po kultivaci byl do každé jamky destičky přidán methyl[³H]tymidin (0,5 pCi/jamku; Amersham-Pharmacia), a destičky byly inkubovány při teplotě 37 °C po dobu 6 hodin v CO₂ inkubátoru. Po inkubaci byly buňky zachyceny na filtrech GF/C (Packard) v zařízení Cell Harvester. Poté byly filtry vysušeny při teplotě 40 °C po dobu 3 hodin nebo déle, a pak k nim byl přidán Microscinti 0 (20 μΙ/jamku; Packard). Radioaktivita ³H inkorporovaná do buněk zachycených na filtrech byla měřena měřičem β-radioaktivity (TOP COUNT), čímž byl zjišťován rozsah množení T buněk v průběhu kultivace.

Výsledek je ukázán na obrázku 77.

Výsledek získaný v tomto testu ukázal, že lidské T buňky rostly s výraznou závislostí na koncentraci lidského B7h-lgFc (v testu používajícím negativní kontrolní protilátku). Dále se ukázalo, že monoklonální protilátka proti lidskému AILIM výrazně inhibovala množení lidských T buněk.

Příklad 16: Schopnost lidské monoklonální protilátky proti lidskému AILIM inhibovat proliferaci opičích T buněk, spojených s přenosem kostimulačního signálu zprostředkovaného mezi AILIM a ligandem AILIM

Tentýž test byl proveden za použití opičích T buněk namísto lidských T buněk, použitých ve výše popsaném příkladu 15.

16-1: Ředění protilátky a ostatních složek

Monoklonální protilátka SP34 proti lidskému CD3 (BD-Pharmingen) byla ředěna ve fosfátovém pufru (PBS) na konečnou koncentraci 1 ěg/ml.

Lidský B7h-lgFc, připravený výše, byl ředěn v PBS na konečnou koncentraci 40 pg/ml. Roztok protilátky byl dále ředěn PBS, a byly tak připraveny různé koncentrace protilátky (40 pg/ml až 0,064 pg/ml).

16-2: Potažení mikrotitrační destičky protilátkou

Každá jamka mikrotitrační destičky s 96 jamkami byla potažena (1) monoklonální protilátkou SP34 proti lidskému CD3 (BD-Pharmingen) (1 pg/ml; 25 μΙ v každé jamce) a lidským B7h-lgFc (40 pg/ml až 0,064 pg/ml; 25 μΙ v každé jamce). Destičky byly inkubovány při teplotě 37 °C po dobu 2 hodin. Potom byly roztoky protilátek odstraněny a každá jamka byla 3krát promyta PBS. Po promytí bylo ke každé jamce přidáno φφφφ ·· · · · · ·· φ φ φφφφ

129 médium RPMI1640 (100 μΙ/jamku), obsahující 10 % FCS a destičky byly inkubovány při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny. Takto byly příslušné jamky destiček potaženy protilátkou.

16-3: Příprava suspenze opičích T buněk

Periferní krev byla odebírána od opic cynomolgus. Frakce obsahující mononukleární buňky byla připravena centrifugaci v hustotním gradientu za použití NycoPrepl .077A (Nycomed). Podle přiloženého návodu byly opičí T buňky odděleny od mononukleárních buněk opic cynomolgus pomoci protilátky M-T477 proti lidskému CD4 (BD-Pharmingen), protilátky RPA-T8 proti lidskému CD8 (BD-Pharmingen), mikrozrnek s protimyším IgG (Miltenyi) a magnetického třídícího zařízení Magnetic Sorter. Počet T buněk byl určován pomocí počítače krvinek. Opičí T buňky byly suspendovány v médiu RPMI1640, obsahujícím lidskou monoklonální protilátku JMab136 proti lidskému AILIM (20 pg/ml) a 10% FCS, čímž byla připravena suspenze opičích T buněk (1*10⁶ buněk/ml). Suspenze byla inkubována při teplotě místnosti po dobu 30 minut.

Jako negativní kontrolní protilátka byla použita lidská monoklonální protilátka JMab-23 proti KLH (20 pg/ml).

16-4: Buněčná kultura

Stejným způsobem, jak byl popsán výše, byla suspenze opičích T buněk (1*10⁵buněk/ml) přidána do každé jamky mikrotitrační destičky potažené protilátkou proti lidskému CD3 a hB7h-lgFc, a destička byla inkubována při teplotě 37 °C po dobu 3 dní v CO₂ inkubátoru.

16-5: Zjišťování proliferační aktivity T buněk

Po inkubaci byl do každé jamky destičky přidán methyl[³H]tymidin (0,5 pCi/jamku; Amersham-Pharmacia), a destičky byly inkubovány při teplotě 37 °C po dobu 6 hodin v CO₂ inkubátoru. Po inkubaci byly buňky zachyceny na filtrech GF/C (Packard) v zařízení Cell Harvester. Poté byly filtry vysušeny při teplotě 40 °C po dobu 3 hodin nebo déle, a byl k nim přidán Microscinti 0 (20 μΙ/jamku; Packard). Radioaktivita ³H inkorporovaná do buněk zachycených na filtrech byla měřena měřičem β-radioaktivity (TOP COUNT), čímž byl zjišťován stupeň množení T buněk v průběhu kultivace.

Výsledek je ukázán na obrázku 78.

• · · · · · ··· ····· · · · ·· ·

Výsledek získaný v tomto testu ukázal, že růst opičích T buněk byl výrazně závislý na koncentraci lidského B7h-lgFc (v testu používajícím negativní kontrolní protilátku). Dále monoklonální protilátka proti lidskému AILIM výrazně inhibovala množení opičích T buněk.

Průmyslová využitelnost

Lidské monoklonální protilátky, které jsou předmětem tohoto vynálezu, schopné se vázat k lidskému AILIM, jsou lidského původu a proto tyto protilátky neindukují žádné vážné imunologické odmítnutí, které by bylo způsobené antigenicitou pro člověka, tj. HAMA (antigenicita myších antigenů pro člověka) u hostitele, což bylo vážným terapeutickým problémem (vedlejší účinek) u protilátkových farmaceutických přípravků, obsahujících protilátky pocházející od savců jiných než je člověk, jako jsou např. protilátky myšího původu. Protilátka, která je předmětem tohoto vynálezu, má tedy vysokou cenu jakožto farmaceutická protilátka.

Tedy lidská monoklonální protilátka proti AILIM (zvláště proti lidskému AILIM) a farmaceutické prostředky, obsahující lidské monoklonální protilátky, které jsou předmětem tohoto vynálezu, neindukují vůbec u hostitele imunologické odmítnutí způsobené HAMA; a tak mohou být použity jako farmaceutické přípravky schopné kontrolovat různé biologické reakce (např. množení buněk exprimujících AILIM, produkci cytokinů buňkami exprimujícími AILIM, imunní cytolýzu nebo smrt buňky (apoptóza) u buněk exprimujících AILIM, a schopnost indukovat na protilátkách závislé poškození buněk exprimujících AILIM), spojené s přenosem kostimulačního signálu zprostředkovaného AILIM (sekundární signál) buňkám exprimujícím AILIM; a/nebo mohou být použity pro léčení nebo prevenci různých nemocí spojených s přenosem signálu zprostředkovaného AILIM, či pro kontrolu a potlačení vzniku nebo rozvoje těchto nemocí.

Přesněji řečeno, poskytnutím farmaceutických přípravků obsahujících jako svou aktivní složku lidskou monoklonální protilátku proti AILIM, která je předmětem tohoto vynálezu, nebo její část, je možno potlačit, léčit nebo předejít například různým nemocem (např. revmatická artritida, roztroušená skleróza, autoimunitní zánět štítné žlázy, alergická dermatitida kontaktního typu, chronická zánětlivá dermatóza jako je kožní lišej, systémový lupus erythematodes, diabetes mellitus závislý na insulinu, • ·

131 lupénka, atd.) klasifikované jako autoimunní nebo alergické poruchy (zvláště autoimunitní nemoc a opožděná alergie způsobené buněčnou imunitou); artropatie (například revmatická artritida (RA) a osteoartritida (OA)), zánět (např. hepatitida); reakce štěpu proti hostiteli (GVH reakce); nemoc v důsledku reakce štěpu proti hostiteli (GVHD); imunitní odmítnutí doprovázející transplantaci (homoplasty nebo heteroplasty) tkáně (tkáně jako je kůže, rohovka, kost, atd.) nebo orgánu (játra, srdce, plíce, ledviny, slinivka, atd.); imunitní odpověď vyvolaná cizím antigenem nebo autoantigenem (například produkce protilátek proti uvedenému antigenu, množení buněk, produkce cytokinů); a poruchy, které jsou možná způsobeny abnormální intestinální imunitou (přesněji zánětlivé intestinální poruchy (zvláště nemoc štěpu a vředová kolitida)), potravní alergie, atd.

Farmaceutické prostředky podle tohoto vynálezu umožní léčení nebo předcházení některých zánětů, proti kterým jsou používány jako protizánětlivé léky různé steriodní léky, například zánět provázející různé artritidy (například revmatická artritida, osteoartritida, atd.), zápal plic, hepatitida (včetně virové hepatitidy), zánět provázející infekční nemoci, zánětlivé střevní nemoci, střevní katar, nefritida (zánět provázející glomerulonefritidu, fibrózu ledvin, gastritidu, zánět cévy, zánět slinivky, zánět pobřišnice, bronchitidu, zánět myokardu, zánět mozku, zánět při poranění při ischemické chorobě (ischemické poranění myokardu, atd.)), zánět způsobený imunitním odmítnutím po transplantaci tkáně či orgánu, popálením, různé záněty kůže (lupénka, kontaktní alergická dermatitida, kožní lišej který je chronickou zánětlivou chorobou kůže), zánět při mnohočetných poruchách orgánů, zánět po operaci PTCA nebo PTCR, zánět provázející arteriosklerózu, autoimunitní zánět štítné žlázy, atd.

Dále vzhledem k výše zmíněnému potlačení nebo léčení imunitního odmítnutí, spojeného s transplantací tkání nebo orgánů, jak je popsáno výše, farmaceutické prostředky mohou být podle předloženého vynálezu použity ve spolupráci se známými imunosupresními činidly pro potlačení imunitního odmítnutí při transplantační léčbě, čímž zvyšují účinek známých léků při potlačení odmítnutí štěpu.

Dále při použití metody zjišťování sloučenin schopných vázat se k AILIM nebo k ligandu AILIM, která patří do rámce předloženého vynálezu, je možno kontrolovat přenos signálu, který je spojen s interakcí mezi AILIM a ligandem AILIM tak, že dochází k vazbě k AILIM nebo k ligandu AILIM, a tak dosáhnout vyhledávání a výběru

132 • · · ·

farmaceutických činidel (syntetická chemická sloučenina a protilátka), které mají potenciální schopnost léčit různé výše zmíněné nemoci.

Seznam sekvencí - popis

SEQ ID NO: 1

Další informace: Popis umělé sekvence: Sekvence uměle syntetizovaného primeru Notl-T.

SEQ ID NO: 2

Další informace: Popis umělé sekvence: Sekvence uměle syntetizovaného spojovníku 20adp SEQ ID NO: 3

Další informace: Popis umělé sekvence: Sekvence uměle syntetizovaného spojovníku 24adp.

SEQ ID NO: 4

Další informace: Popis umělé sekvence: Sekvence uměle syntetizovaného primeru HIGLC.

SEQ ID NO: 5

Další informace: Popis umělé sekvence: Sekvence uměle syntetizovaného primeru NHCc2.

SEQ ID NO: 6

Další informace: Popis umělé sekvence: Sekvence uměle syntetizovaného primeru ExcellE.

SEQ ID NO: 7

Další informace: Popis umělé sekvence: Sekvence uměle syntetizovaného primeru ck117.

SEQ ID NO: 8

Další informace: Popis umělé sekvence: Sekvence uměle syntetizovaného primeru M13R.

SEQ ID NO: 9

Další informace: Popis umělé sekvence: Sekvence uměle syntetizovaného primeru 136H.

SEQ ID NO: 10

Další informace: Popis umělé sekvence: Sekvence uměle syntetizovaného primeru

138/9H.

• · · · • · · • · · • · Λ • · · ·

Popis umělé sekvence: Sekvence uměle syntetizovaného primerů

133

SEQ ID NO: 11 Další informace:

AILIMHC1.

SEQ ID NO: 12

Další informace: HCc1.

SEQ ID NO: 13 Další informace:

HCc7.

SEQ ID NO: 14 Další informace:

HCc8.

SEQ ID NO: 15 Další informace:

HCc3.

SEQ ID NO: 16 Další informace:

HCc4.

SEQ ID NO: 17 Další informace:

HCc6.

SEQ ID NO: 18 Další informace:

HIGHC.

SEQ ID NO: 19 Další informace:

HCc9.

SEQ ID NO: 20 Další informace:

HCc5.

SEQ ID NO: 21 Další informace:

Popis umělé sekvence: Sekvence uměle syntetizovaného primerů

Popis umělé sekvence: Sekvence uměle syntetizovaného primerů polyA.

• 1 • · • · · · • ·

134

SEQ ID NO: 22

Další informace: Popis umělé sekvence: Sekvence uměle syntetizovaného primeru AILIMLC1.

SEQ ID NO: 23

Další informace: Popis umělé sekvence: Sekvence uměle syntetizovaného primeru AILIMLC2.

SEQ ID NO: 24

Další informace: Popis umělé sekvence: Sekvence uměle syntetizovaného primeru LCc1.

SEQ ID NO: 25

Další informace: Popis umělé sekvence: Sekvence uměle syntetizovaného primeru LCc2.

SEQ ID NO: 26

Další informace: Popis umělé sekvence: Sekvence uměle syntetizovaného primeru HIK.

SEQ ID NO: 39

Další informace: Popis umělé sekvence: Sekvence uměle syntetizovaného primeru SEQ ID NO: 40

Další informace: Popis umělé sekvence: Sekvence uměle syntetizovaného primeru » · · ·

Claims

NÁROKY

135

PATENTOVÉ

1. Lidská protilátka, která se váže k AILIM.

2. Lidská protilátka podle nároku 1, přičemž AILIM je lidského původu.

3. Lidská monoklonální protilátka, která se váže k AILIM nebo kjeho části.

4. Lidská monoklonální protilátka podle nároku 3 nebo její část, přičemž AILIM je lidského původu.

5. Lidská monoklonální protilátka podle nároků 3 nebo 4 nebo její část, která má schopnost potlačovat přenos signálu do buňky, který je zprostředkován AILIM.

6. Lidská monoklonální protilátka podle nároku 5 nebo její část, jejíž schopnost potlačovat přenos signálu je buď a. nebo b. z následujících bodů.

a) schopnost potlačovat množení buněk exprimujících AILIM, nebo

b) schopnost potlačovat produkci cytokinu v buňkách exprimujících AILIM.

7. Lidská monoklonální protilátka podle nároku 6 nebo její část, přičemž cytokin je jedním z cytokinů produkovaných T buňkou typu Th1 nebo Th2.

8. Lidská monoklonální protilátka podle nároku 7 nebo její část, kdy cytokinem je interferon γ nebo interleukin 4.

9. Lidská monoklonální protilátka podle nároku 5 nebo její část, která má schopnost zabránit reakci smíšených lymfocytů.

10. Lidská monoklonální protilátka podle nároků 3 nebo 4 nebo její část, která má schopnost indukovat přenos signálu do buňky, který je zprostředkován AILIM.

11. Lidská monoklonální protilátka podle nároku 10 nebo její část, jejíž schopnost indukovat přenos signálu je a. nebo b. z následujících bodů:

• ·

I · · »· * « · » ·« «· • · · · · · · * · * · · ·

136

a. schopnost indukovat množení buněk exprimujících AILIM, nebo

b. schopnost indukovat produkci cytokinů v buňkách exprimujících AILIM.

12. Lidská monoklonální protilátka podle nároku 11 nebo její část, přičemž cytokin je jedním z cytokinů produkovaných T buňkou typu Th1 nebo Th2.

13. Lidská monoklonální protilátka podle nároku 12 nebo její část, kdy cytokinem je interferon γ nebo interleukin 4.

14. Lidská monoklonální protilátka podle nároků 3 nebo 4 nebo její část, která má schopnost indukovat cytotoxicitu proti buňkám exprimujícím AILIM, která je závislá na protilátkách, a/nebo imunitní cytolýzu nebo apoptózu buněk exprimujících AILIM.

15. Lidská monoklonální protilátka podle nároků 3 nebo 4 nebo její část, přičemž konstanta rychlosti vazby (ka) mezi monoklonální protilátkou a AILIM je 1,0 χ 10³(1/M.s) nebo více.

16. Lidská monoklonální protilátka podle nároku 15 nebo její část, přičemž konstanta rychlosti vazby (ka) je 1,0 χ 10⁴ (1/M.s) nebo více.

17. Lidská monoklonální protilátka podle nároku 16 nebo její část, přičemž konstanta rychlosti vazby (ka) je 1,0 χ 10⁵ (1/M.s) nebo více.

18. Lidská monoklonální protilátka podle nároků 3 nebo 4 nebo její část, přičemž konstanta rychlosti disociace (kd) mezi monoklonální protilátkou a AILIM je 1,0 x 10'³ (1/s) nebo méně.

19. Lidská monoklonální protilátka podle nároku 18 nebo její část, přičemž konstanta rychlosti disociace (kd) je 1,0 x 10'⁴ (1/s) nebo méně.

20. Lidská monoklonální protilátka podle nároku 19 nebo její část, přičemž konstanta rychlosti disociace (kd) je 1,0 χ 10'⁵ (1/s) nebo méně.

• ·

137 »· ·« * · »« · ·

21. Lidská monoklonální protilátka podle nároků 3 nebo 4 nebo její část, přičemž disociační konstanta (Kd) mezi monoklonální protilátkou a AILIM je 1,0 x 1 θ'⁶ (M) nebo méně.

22. Lidská monoklonální protilátka podle nároku 21 nebo její část, přičemž disociační konstanta (Kd) je 1,0 χ 10'⁷ (M) nebo méně.

23. Lidská monoklonální protilátka podle nároku 22 nebo její část, přičemž disociační konstanta (Kd) je 1,0 x W⁸ (M) nebo méně.

24. Lidská monoklonální protilátka podle nároku 23 nebo její část, přičemž disociační konstanta (Kd) je 1,0 χ 10'⁹ (M) nebo méně.

25. Lidská monoklonální protilátka podle nároku 4 nebo její část, přičemž DNA kódující

V oblast těžkého řetězce je odvozena buď ze segmentu 1 -02 nebo 3-13 V genu těžkého řetězce lidského imunoglobulínu.

26. Lidská monoklonální protilátka podle nároku 4 nebo její část, přičemž DNA kódující

V oblast lehkého řetězce je odvozena buď ze segmentu L5 nebo A27 V genu lehkého řetězce lidského imunoglobulínu.

27. Lidská monoklonální protilátka podle nároků 25 nebo 26 nebo její část, přičemž DNA kódující V oblast těžkého řetězce je odvozena buď ze segmentu 1-02 nebo 313 V genu těžkého řetězce lidského imunoglobulínu, a DNA kódující V oblast lehkého řetězce je odvozena buď ze segmentu L5 nebo A27 V genu lehkého řetězce lidského imunoglobulínu.

28. Lidská monoklonální protilátka podle nároku 27 nebo její část, přičemž DNA kódující V oblast těžkého řetězce je odvozena ze segmentu 1-02 V genu těžkého řetězce lidského imunoglobulínu, a DNA kódující V oblast lehkého řetězce je odvozena ze segmentu L5 V genu lehkého řetězce lidského imunoglobulínu.

• · • · · • · • »

138

29. Lidská monoklonální protilátka podle nároku 27 nebo její část, přičemž DNA kódující V oblast těžkého řetězce je odvozena ze segmentu 3-13 V genu těžkého řetězce lidského imunoglobulinu, a DNA kódující V oblast lehkého řetězce je odvozena ze segmentu A27 V genu lehkého řetězce lidského imunoglobulinu.

30. Lidská monoklonální protilátka podle nároku 4 nebo její část, jejíž variabilní oblast těžkého řetězce má aminokyselinovou sekvenci, definovanou podle kteréhokoli z následujících bodů a. až f.:

a. aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 20 do 117 ze SEQ ID NO: 28,

b. aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 20 do 117 SEQ ID NO: 28, v níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků deletován nebo substituován, nebo do níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků vložen nebo přidán.

c. aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 20 do 116 ze SEQ ID NO: 32,

d. aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 20 do 116 ze SEQ ID NO: 32, v níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků deletován nebo substituován, nebo do níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků vložen nebo přidán.

e. aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 20 do 116 ze SEQ ID NO: 36, nebo

f. aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 20 do 116 ze SEQ ID NO: 36, v níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků deletován nebo substituován, nebo do níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků vložen nebo přidán.

31. Lidská monoklonální protilátka podle nároku 4 nebo její část, jejíž polypeptid těžkého řetězce má aminokyselinovou sekvenci, definovanou podle kteréhokoli z následujících bodů a. ažf.:

a. aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 20 do 470 ze SEQ ID NO: 28, • · · · • · · · · · • · · · • · · · · · • · · · · ·

139

b. aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 20 do 470 ze SEQ ID NO: 28, v níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků deletován nebo substituován, nebo do níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků vložen nebo přidán.

c. aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 20 do 470 ze SEQ ID NO: 32,

d. aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 20 do 470 ze SEQ ID NO: 32, v níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků deletován nebo substituován, nebo do níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků vložen nebo přidán.

e. aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 20 do 470 ze SEQ ID NO: 36, nebo

f. aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 20 do 470 ze SEQ ID NO: 36, v níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků deletován nebo substituován, nebo do níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků vložen nebo přidán.

32. Lidská monoklonální protilátka podle nároku 4 nebo její část, jejíž polypeptid lehkého řetězce má aminokyselinovou sekvenci, definovanou podle kteréhokoli z následujících bodů a. ažf.:

a. aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 23 do 116 ze SEQ ID NO: 30,

b. aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 23 do 116 ze SEQ ID NO: 30, v níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků deletován nebo substituován, nebo do níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků vložen nebo přidán.

c. aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 21 do 116 ze SEQ ID NO. 34,

d. aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 21 do 116 ze SEQ ID NO: 34, v níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků deletován nebo substituován, nebo do níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků vložen nebo přidán.

• · • · · · • · ·

140

e. aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 21 do 116 ze SEQ ID NO: 38, nebo

f. aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 21 do 116 ze SEQ ID NO: 38, v níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků deletován nebo substituován, nebo do níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků vložen nebo přidán.

33. Lidská monoklonální protilátka podle nároku 4 nebo její část, jejíž polypeptid lehkého řetězce má aminokyselinovou sekvenci, definovanou podle kteréhokoli z následujících bodů a. až f.:

a. aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 23 do 236 ze SEQ ID NO: 30,

b. aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 23 do 236 ze SEQ ID NO: 30, v níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků deletován nebo substituován, nebo do níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků vložen nebo přidán.

c. aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 21 do 236 ze SEQ ID NO: 34,

d. aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 21 do 236 ze SEQ ID NO: 34, v níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků deletován nebo substituován, nebo do níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků vložen nebo přidán.

e. aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 21 do 236 ze SEQ ID NO: 38, nebo

f. aminokyselinová sekvence obsahující aminokyseliny od pozice 21 do 236 ze SEQ ID NO. 38, v níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků deletován nebo substituován, nebo do níž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků vložen nebo přidán.

34. Lidská monoklonální protilátka podle nároku 4 nebo její část, která má následující charakteristiky, uvedené v bodech a. a b.:

a. variabilní oblast těžkého řetězce má aminokyselinovou sekvenci, která obsahuje sekvenci aminokyselin od 20 do 117 ze SEQ ID NO. 28, a • · » · · · · I

141

b. variabilní oblast lehkého řetězce má aminokyselinovou sekvenci, která obsahuje sekvenci aminokyselin od 23 do 116 ze SEQ ID NO: 30.

35. Lidská monoklonální protilátka podle nároku 4 nebo její část, která má následující charakteristiky, uvedené v bodech a. a b.:

a. variabilní oblast těžkého řetězce má aminokyselinovou sekvenci, která obsahuje aminokyseliny od pozice 20 do 470 ze SEQ ID NO: 28, a

b. variabilní oblast lehkého řetězce má aminokyselinovou sekvenci, která obsahuje aminokyseliny od pozice 23 do 236 ze SEQ ID NO: 30.

36. Lidská monoklonální protilátka podle nároku 4 nebo její část, která má následující charakteristiky, uvedené v bodech a. a b.:

a. variabilní oblast těžkého řetězce má aminokyselinovou sekvenci, která obsahuje sekvenci aminokyselin od 20 do 116 ze SEQ ID NO: 32, a

b. variabilní oblast lehkého řetězce má aminokyselinovou sekvenci, která obsahuje sekvenci aminokyselin od 21 do 116 ze SEQ ID NO: 34.

37. Lidská monoklonální protilátka podle nároku 4 nebo její část, která má následující charakteristiky, uvedené v bodech a. a b.:

a. polypeptid těžkého řetězce má aminokyselinovou sekvenci, která obsahuje sekvenci aminokyselin od 20 do 470 ze SEQ ID NO: 32, a

b. polypeptid lehkého řetězce má aminokyselinovou sekvenci, která obsahuje sekvenci aminokyselin od 21 do 236 ze SEQ ID NO: 34.

38. Lidská monoklonální protilátka podle nároku 4 nebo její část, která má následující charakteristiky, uvedené v bodech a. a b.:

a. variabilní oblast těžkého řetězce má aminokyselinovou sekvenci, která obsahuje sekvenci aminokyselin od 20 do 116 ze SEQ ID NO: 36, a

b. variabilní oblast lehkého řetězce má aminokyselinovou sekvenci, která obsahuje sekvenci aminokyselin od 21 do 116 ze SEQ ID NO: 38.

39. Lidská monoklonální protilátka podle nároku 4 nebo její část, která má následující charakteristiky, uvedené v bodech a. a b.:

• · · ·

142

a. polypeptid těžkého řetězce má aminokyselinovou sekvenci, která obsahuje sekvenci aminokyselin od 20 do 470 ze SEQ ID NO: 36, a

b. polypeptid lehkého řetězce má aminokyselinovou sekvenci, která obsahuje sekvenci aminokyselin od 21 do 236 ze SEQ ID NO: 38.

40. Lidská monoklonální protilátka podle kteréhokoliv z nároků 3 až 29 nebo její část, která je původem z transgenního savce, ne však člověka, schopného produkovat lidské protilátky.

41. Lidská monoklonální protilátka podle nároku 40 nebo její část, která je získána imunizací transgenního savce, jiného než člověka, schopného produkovat lidské protilátky, buňkami exprimujícími AILIM, frakcí membrán, odvozenou z uvedených buněk, celými molekulami, ze kterých sestává AILIM nebo jejich částmi, nebo geny kódující AILIM nebo jeho část.

42. Lidská monoklonální protilátka podle nároků 40 nebo 41 nebo její část, kdy transgenní savec, jiný než člověk, je transgenní myš.

43. DNA nebo její část, kódující polypeptid vybraný ze skupiny zahrnující a. až f., uvedené dále:

a. polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 20 do 117 ze SEQ ID NO: 28,

b. polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 23 do 116 ze SEQ ID NO: 30,

c. polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 20 do 116 ze SEQ ID NO. 32,

d. polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 21 do 116 ze SEQ ID NO: 34,

e. polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 20 do 116 ze SEQ ID NO: 36, a

f. polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 21 do 116 ze SEQ ID NO: 38.

• · · • « ·

143

44. DNA nebo její část, kódující polypeptid vybraný ze skupiny zahrnující a. až f., uvedené dále:

a. polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 20 do 470 ze SEQ ID NO: 28,

b. polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 23 do 236 ze SEQ ID NO. 30,

c. c. polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 20 do 470 ze SEQ ID NO: 32,

d. d. polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 21 do 236 ze SEQ ID NO: 34,

e. polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 20 do 470 ze SEQ ID NO: 36, a

f. polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 21 do 236 ze SEQ ID NO: 38.

45. DNA nebo její část, vybranou ze skupiny zahrnující a. až f., uvedené dále:

a. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 126 do 419 ze SEQ ID NO: 27,

b. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 105 do 386 ze SEQ ID NO: 29,

c. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 151 do 441 ze SEQ ID NO: 31,

d. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 88 do 375 ze SEQ ID NO: 33,

e. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 153 do 443 ze SEQ ID NO: 35, a

f. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 93 do 380 ze SEQ ID NO: 37.

46. DNA nebo její část, vybranou ze skupiny zahrnující a. až f., uvedené dále:

a. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 69 do 1481 ze SEQ ID NO: 27.

• ·

144

b. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 39 do 749 ze SEQ ID NO: 29,

c. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 94 do 1506 definované v SEQ ID NO: 31,

d. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 28 do 738 ze SEQ ID NO: 33,

e. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 96 do 1508 ze SEQ ID NO: 35, a

f. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 33 do 743 ze SEQ ID NO: 37.

47. Vektor obsahující DNA podle kteréhokoli z nároků 43 až 46.

48. Vektor podle nároku 47, který obsahuje DNA uvedenou v kterémkoli z následujících bodů a. až c.:

a. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 126 do 419 ze SEQ ID NO: 27,

b. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 151 do 441 ze SEQ ID NO: 31, nebo

c. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 153 do 443 ze SEQ ID NO: 35.

49. Vektor podle nároku 47, který obsahuje DNA uvedenou v kterémkoli z následujících bodů a. až c.:

a. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 69 do 1481 ze SEQ ID NO: 27,

b. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 94 do 1506 ze SEQ ID NO: 31, nebo

c. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 96 do 1508 ze SEQ ID NO. 35.

50. Vektor podle nároku 47, který obsahuje DNA uvedenou v kterémkoli z následujících bodů a. až c.:

145

a. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 105 do 386 ze SEQ ID NO: 29,

b. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 88 do 375 ze SEQ ID NO: 33, nebo

c. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 93 do 380 ze SEQ ID NO: 37.

51. Vektor podle nároku 47, který obsahuje DNA uvedenou v kterémkoli z následujících bodů a. až c.:

a. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 39 do 749 ze SEQ ID NO: 29,

b. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 28 do 738 ze SEQ ID NO: 33, nebo

c. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 33 do 743 ze SEQ ID NO: 37.

52. Vektor podle nároku 47, který obsahuje DNA uvedenou v následujících bodech a. a b.:

a. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 126 do 419 ze SEQ ID NO: 27, a

b. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 105 do 386 ze SEQ ID NO: 29.

53. Vektor podle nároku 47, který obsahuje DNA uvedenou v následujících bodech a. a b.:

a. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 69 do 1481 ze SEQ ID NO: 27, a

b. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 39 do 749 ze SEQ ID NO: 29.

54. Vektor podle nároku 47, který obsahuje DNA uvedenou v následujících bodech a. a b.:

• · • · • ·

146

a. DNA obsahující nukleotídovou sekvenci od nukleotidu 151 do 441 ze SEQ ID NO. 31, a

b. DNA obsahující nukleotídovou sekvenci od nukleotidu 88 do 375 ze SEQ ID NO: 33.

55. Vektor podle nároku 47, který obsahuje DNA uvedenou v následujících bodech a. a

b.:

a. DNA obsahující nukleotídovou sekvenci od nukleotidu 94 do 1506 ze SEQ ID NO: 31, a

b. DNA obsahující nukleotídovou sekvenci od nukleotidu 28 do 738 ze SEQ ID NO: 33.

56. Vektor podle nároku 47, který obsahuje DNA uvedenou v následujících bodech a. a b.:

a. DNA obsahující nukleotídovou sekvenci od nukleotidu 153 do 443 ze SEQ ID NO: 35, a

b. DNA obsahující nukleotídovou sekvenci od nukleotidu 93 do 380 ze SEQ ID NO: 37.

57. Vektor podle nároku 47, který obsahuje DNA uvedenou v následujících bodech a. a b.:

a. DNA obsahující nukleotídovou sekvenci od nukleotidu 96 do 1508 ze SEQ ID NO: 35, a

b. DNA obsahující nukleotídovou sekvenci od nukleotidu 33 do 743 ze SEQ ID NO: 37.

58. Buňka která produkuje lidskou monoklonální protilátku podle kteréhokoli z vároků 3 až 42.

59. Buňka podle nároku 58, která je fúzovanou buňkou, získaná fúzí B buňky, pocházející od savce schopného produkovat lidskou monoklonální protilátku, a myelomové buňky, pocházející ze savce.

• · « ·

147

60. Genově rekombinantní hostitel, vyznačující se tím, že je transformovaný přenesením DNA popsané dále v bodě a. nebo vektorem obsahujícím uvedenou DNA, DNA popsané dále v bodě b. nebo vektorem obsahujícím uvedenou DNA, nebo obojími DNA popsanými dále v bodech a. a b. nebo vektorem obsahujícím obojí uvedené DNA:

a. DNA kódující polypeptid těžkého řetězce nebo jeho část, z monoklonální protilátky, která se váže k lidskému AILIM; nebo

b. DNA kódující polypeptid lehkého řetězce nebo jeho část, z monoklonální protilátky, která se váže k lidskému AILIM.

61. Genově rekombinantní hostitel podle nároku 60, vyznačující setím, že monoklonální protilátkou je lidská monoklonální protilátka.

62. Genově rekombinantní hostitel podle nároku 60 nebo 61, vyznačující se t í m, ž e hostitelem je savčí buňka.

63. Genově rekombinantní hostitel podle nároku 60 nebo 61, vyznačující se t í m, ž e hostitelem je oplodněné savčí vajíčko.

64. Genově rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z nároků 60 až 63, vyznačující se tím, že polypeptid těžkého řetězce je vybrán ze skupiny sestávající z následujících a. až c.:

a. polypeptid těžkého řetězce obsahující aminokyseliny 20 do 117 ze SEQ ID NO: 28, aminokyselinovou sekvenci od b. polypeptid těžkého řetězce obsahující aminokyseliny 20 do 116 ze SEQ ID NO: 32, aminokyselinovou a sekvenci od c. polypeptid těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od

aminokyseliny 20 do 116 ze SEQ ID NO: 36.

65. Genově rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z nároků 60 až 63, vyznačující se tím, že polypeptid těžkého řetězce je vybrán ze skupiny sestávající z následujících a. až c.:

• · · ·

148

a. polypeptid těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 20 do 470 ze SEQ ID NO: 28,

b. polypeptid těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 20 do 470 ze SEQ ID NO: 32, a

c. polypeptid těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 20 do 470 ze SEQ ID NO: 36.

66. Genově rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z nároků 60 až 63, vyznačující se tím, že polypeptid lehkého řetězce je vybrán ze skupiny sestávající z následujících a. až c.:

a. polypeptid těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 23 do 116 ze SEQ ID NO: 30,

b. polypeptid těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 21 do 116 ze SEQ ID NO: 34, a

c. a polypeptid těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 21 do 116 ze SEQ ID NO: 38.

67. Genově rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z nároků 60 až 63, vyznačující se tím, že polypeptid lehkého řetězce je vybrán ze skupiny sestávající z následujících a. až c.:

a. polypeptid lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 23 do 236 ze SEQ ID NO: 30,

b. polypeptid lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 21 do 236 ze SEQ ID NO: 34, a

c. polypeptid lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 21 do 236 ze SEQ ID NO: 38.

68. Genově rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z nároků 60 až 63, vyznačující se tím, že polypeptidy těžkého, respektive lehkého řetězce jsou definovány dále v bodech a., respektive b.:

a. polypeptid těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 20 do 117 ze SEQ ID NO: 28, a • » · ·

149

b. polypeptid lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 23 do 116 ze SEQ ID NO: 30.

69. Genově rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z nároků 60 až 63, vyznačující se tím, že polypeptidy těžkého, respektive lehkého řetězce jsou definovány dále v bodech a., respektive b.:

a. polypeptid těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 20 do 470 ze SEQ ID NO: 28, a

b. polypeptid lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 23 do 236 ze SEQ ID NO: 30.

70. Genově rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z nároků 60 až 63, vyznačující se tím, že polypeptidy těžkého, respektive lehkého řetězce jsou definovány dále v bodech a., respektive b.:

a. polypeptid těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 20 do 116 ze SEQ ID NO: 32, a

b. polypeptid lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 21 do 116 ze SEQ ID NO: 34.

71. Genově rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z nároků 60 až 63, vyznačující se tím, že polypeptidy těžkého, respektive lehkého řetězce jsou definovány dále v bodech a., respektive b.:

a. polypeptid těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 20 do 470 ze SEQ ID NO: 32, a

b. polypeptid lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 21 do 236 ze SEQ ID NO: 34.

72. Genově rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z nároků 60 až 63, vyznačující se tím, že polypeptidy těžkého, respektive lehkého řetězce jsou definovány dále v bodech a., respektive b.:

a. polypeptid těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 20 do 116 ze SEQ ID NO: 36, a • ·· ·

b. polypeptid lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 21 do 116 ze SEQ ID NO: 38.

73. Genově rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z nároků 60 až 63, vyznačující se tím, že polypeptidy těžkého, respektive lehkého řetězce jsou definovány dále v bodech a., respektive b.:

a. polypeptid těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 20 do 470 ze SEQ ID NO: 36, a

b. polypeptid lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 21 do 236 ze SEQ ID NO: 38.

74. Genově rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z nároků 60 až 63, vyznačující se tím, že DNA kódující polypeptid těžkého řetězce je definovaná v kterémkoli z následujících bodů a. až c.:

DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 126 do 419 ze SEQ ID NO: 27, DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 151 do 441 ze SEQ ID NO: 31, a DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 153 do 443 ze SEQ ID NO: 35.

75. Genově rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z nároků 60 až 63, vyznačující se tím, že DNA kódující polypeptid těžkého řetězce je definovaná v kterémkoli z následujících bodů a. až c.:

a. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 69 do 1481 ze SEQ ID NO: 27,

b. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 94 do 1506 ze SEQ ID NO: 31, a

c. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 96 do 1508 ze SEQ ID NO. 35.

• · ► 0 ·· 0 ·· ·· • 0 0 0 · · 0 0 0 0 ·

151

76. Genově rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z nároků 60 až 63, vyznačující se tím, že DNA kódující polypeptid lehkého řetězce je definovaná v kterémkoli z následujících bodů a. až c.:

a. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 105 do 386 ze SEQ ID NO: 29,

b. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 88 do 375 ze SEQ ID NO: 33, a

c. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 93 do 380 ze SEQ ID NO: 37.

77. Genově rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z nároků 60 až 63, vyznačující se tím, že DNA kódující polypeptid lehkého řetězce je definovaná v kterémkoli z následujících bodů a. až c.:

a. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 39 do 749 ze SEQ ID NO: 29,

b. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 28 do 738 ze SEQ ID NO: 33, a

c. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 33 do 743 ze SEQ ID NO: 37.

78. Genově rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z nároků 60 až 63, vyznačuj ící se tím, že DNA kódující polypeptid těžkého řetězce je DNA popsána dále v bodu a., a DNA kódující polypeptid lehkého řetězce je DNA popsána dále v bodu b.:

a. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 126 do 419 ze SEQ ID NO: 27,

b. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 105 do 386 ze SEQ ID NO. 29.

79. Genově rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z nároků 60 až 63, vyznačující se tím, že DNA kódující polypeptid těžkého řetězce je DNA popsána dále v bodu a., a DNA kódující polypeptid lehkého řetězce je DNA popsána dále v bodu b.:

152

a. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 69 do 1481 ze SEQ ID NO: 27, a

b. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 39 do 749 ze SEQ ID NO: 29.

80. Genově rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z nároků 60 až 63, vyznačující se tím, že DNA kódující polypeptid těžkého řetězce je DNA popsána dále v bodu a., a DNA kódující polypeptid lehkého řetězce je DNA popsána dále v bodu b.:

a. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 151 do 441 ze SEQ ID NO. 31, a

b. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 88 do 375 ze SEQ ID NO: 33.

81. Genově rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z nároků 60 až 63, vyznačuj ící se tím, že DNA kódující polypeptid těžkého řetězce je DNA popsána dále v bodu a., a DNA kódující polypeptid lehkého řetězce je DNA popsána dále v bodu b.:

a. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 94 do 1506 ze SEQ ID NO: 31, a

b. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 28 do 738 ze SEQ ID NO: 33.

82. Genově rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z nároků 60 až 63, vyznačující se tím, že DNA kódující polypeptid těžkého řetězce je DNA popsána dále v bodu a., a DNA kódující polypeptid lehkého řetězce je DNA popsána dále v bodu b.:

a. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 153 do 443 ze SEQ ID NO: 35, a

b. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 93 do 380 ze SEQ ID NO: 37.

• ·· ·

153

83. Genově rekombinantní hostitel podle kteréhokoli z nároků 60 až 63, vyznačující se tím, že DNA kódující polypeptid těžkého řetězce je DNA popsána dále v bodu a., a DNA kódující polypeptid lehkého řetězce je DNA popsána dále v bodu b.:

a. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 96 do 1508 ze SEQ ID NO: 35, a

b. DNA obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 33 do 743 ze SEQ ID NO: 37.

84. Lidská monoklonální protilátka nebo její část, která je produkovaná genově rekombinantním hostitelem (za předpokladu, že je vyloučen případ, kdy je uvedeným hostitelem oplozené vajíčko) podle kteréhokoli z nároků 60 až 62, nebo podle kteréhokoli z nároků 64 až 83.

85. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje lidskou protilátku podle nároku 1 nebo 2, a farmaceuticky přijatelný nosič.

86. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje lidskou monoklonální protilátku podle kteréhokoli z nároků 3 až 42 nebo její část, a farmaceuticky přijatelný nosič.

87. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje lidskou monoklonální protilátku podle nároku 84 nebo její část, a farmaceuticky přijatelný nosič

88. Farmaceutický prostředek podle kteréhokoli z nároků 85 až 87, vyznačující se tím, že je používán pro potlačení přenosu signálu do buňky, který je zprostředkován AILIM.

89. Farmaceutický prostředek podle kteréhokoli z nároků 85 až 87, vyznačující s e 11 m, ž e je používán pro zabránění množení buněk exprimujících AILIM.

·· ·· • · · · • · « • * · • · · • « · » » · • · ♦ · ·· • · · • · · · · • · β • · · ·· ··

154

90. Farmaceutický prostředek podie kteréhokoli z nároků 85 až 87, vyznačující se tím, že je používán pro zabránění produkce cytokinů v buňkách exprimujících AILIM.

91. Farmaceutický prostředek podle kteréhokoli z nároků 85 až 87, vyznačující se tím, že je používán pro indukci přenosu signálu zprostředkovaného AILIM do buňky.

92. Farmaceutický prostředek podie kteréhokoli z nároků 85 až 87, vyznačující s e t i m, ž e je používán pro indukci množení buněk exprimujících AILIM.

93. Farmaceutický prostředek podle kteréhokoli z nároků 85 až 87, vyznačující se tím, ž e je používán pro indukci produkce cytokinů v buňkách exprimujících AILIM.

94. Farmaceutický prostředek podle kteréhokoli z nároků 85 až 87, vyznačující se tím, že je používán pro indukci cytotoxicity závislé na protilátkách proti buňkám exprimujících AILIM, a/nebo imunitní cytolýzy nebo apoptózy buněk exprimujících AILIM.

95. Farmaceutický prostředek pro prevenci, léčení nebo ochranu proti alergii opožděného typu, vyznačující se tím, že obsahuje látku, která má schopnost modulovat přenos signálu zprostředkovaného AILIM, a farmaceuticky přijatelný nosič.

96. Farmaceutický prostředek podie nároku 95, vyznačující se tím, že látkou je protein.

97. Farmaceutický prostředek podie nároku 96, vyznačující se tím, že protein je vybrán ze skupiny zahrnující:

a. protilátku, která se váže k AILIM nebo k jeho části;

b. polypeptid obsahující celou extracelulární oblast AILIM nebo její část;

• ·· 4

155 * ·· · 9 · • »444 · • · · to 4 a

c. fúzní polypeptid obsahující celou extracelulární oblast AILIM nebo její část, a celou konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu nebo její část; a

d. polypeptid, který se váže k AILIM.

98. Farmaceutický prostředek podle nároku 97, vyznačující se tím, že protilátka, která se váže k AILIM, je lidská protilátka podle nároku 1 nebo 2.

99. Farmaceutický prostředek podle nároku 97, vyznačující se tím, že protilátka, která se váže k AILIM, je lidská monoklonální protilátka podle kteréhokoli z nároků 3 až 42.

100. Farmaceutický prostředek podle nároku 97, vyznačující se tím, že protilátka proti AILIM je lidská monoklonální protilátka podle nároku 84.

101. Farmaceutický prostředek podle nároku 97, vyznačující se tím, že látkou je neproteinová látka.

102. Farmaceutický prostředek podle nároku 101, vyznačující se tím, že neproteinovou látkou je DNA, RNA nebo chemicky syntetizovaná sloučenina.

103. Způsob určování látek, které se vážou k AILIM nebo k ligandům AILIM, vyzná čující se tím, že se skládá z kroků:

a. příprava nerozpustného nosiče, na kterém je imobilizována celá extracelulární oblast AILIM nebo její část;

b. příprava polypeptidu obsahujícího celou extracelulární oblast ligandu AILIM nebo její část, označenou značící látkou, která vydává detekovatelný signál;

c. reagování nerozpustného nosiče v kroku a. s polypeptidem v kroku b.;

d. reagování nerozpustného nosiče v kroku a., polypeptidu v kroku b. a uvedené látky v jakémkoli zvoleném pořadí;

e. detekování signálu vydávaného uvedenou značící látkou obsaženou v komplexu, který vzniká v kroku c., respektive signálu vydávaného uvedenou značící látkou obsaženou v komplexu, který vzniká v kroku d.; a

f. porovnání velikosti obou signálů, detekovaných v kroku e.

·· ·» «

156

104. Způsob určování látek, které se vážou k AILIM nebo k ligandúm AILIM, vyznačující se tím, že se skládá z kroků:

a. příprava nerozpustného nosiče, na kterém je imobiíizována celá extracelulární oblast ligandu AILIM nebo její část;

b. příprava polypeptidu obsahujícího celou extracelulární oblast AILIM nebo její část, označenou značící látkou, která vydává detekovatelný signál;

c. reagování nerozpustného nosiče z kroku a. s polypeptidem z kroku b.;

d. reagování nerozpustného nosiče z kroku a., polypeptidu z kroku b. a uvedené látky v jakémkoli zvoleném pořadí;

e. detekování signálu vydávaného uvedenou značící látkou obsaženou v komplexu, který vzniká v kroku c., respektive signálu vydávaného uvedenou značící látkou obsaženou v komplexu, který vzniká v kroku d.; a

f. porovnání velikosti obou signálů, detekovaných v kroku e.

105. Způsob podle nároků 103 nebo 104, vyznačující se tím, že polypeptid, obsahující celou extracelulární oblast AILIM nebo její část, je fúzní polypeptid, který obsahuje polypeptid, obsahující celou extracelulární oblast AILIM nebo její část, a celou konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu nebo její část.

106. Způsob podle nároků 103 nebo 104, vyznačující se tím, že polypeptid, obsahující celou extracelulární oblast ligandu AILIM nebo její část, je fúzní polypeptid, který obsahuje polypeptid, obsahující celou extracelulární oblast ligandu AILIM nebo její část, a celou konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu nebo její část.

107. Způsob podle kteréhokoli z nároků 103 až 106, vyznačující se tím, že AILIM je lidský AILIM.

108. Způsob podle kteréhokoli z nároků 103 až 107, v y z n a č u j i c i se tím, že ligand AILIM je ligand lidského AILIM.

• · · · • · · • · • · · · · « « · • · · ·

1/7 8 // <ΖϋΡ& -