PT1158004E - Anticorpo monoclonal humano contra uma molécula co-estimuladora da transdução de sinal (ailim) e a sua utilização farmacêutica - Google Patents

Anticorpo monoclonal humano contra uma molécula co-estimuladora da transdução de sinal (ailim) e a sua utilização farmacêutica Download PDF

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Tezuka Katsunari
Hori Nobuaki
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Description

DESCRIÇÃO
ANTICORPO MONOCLONAL HUMANO CONTRA UMA MOLÉCULA CO-ESTIMULADORA DA TRANSDUÇÃO DE SINAL (AILIM) E A SUA UTILIZAÇÃO FARMACÊUTICA
DOMÍNIO DA INVENÇÃO A presente invenção tem por objecto anticorpos humanos que se ligam a AILIM (molécula imunomoduladora de linfócitos indutivel por activação, também conhecida como COEI (co-estimulador indutivel) (ICOS, na lingua inglesa); anticorpos monoclonais humanos que se ligam a AILIM ou uma parte dele; ADN que codifica o referido anticorpo monoclonal humano ou uma parte dele ou uma porção do referido ADN; células (incluindo células de recombinação genética), que produzem o referido anticorpo monoclonal humano ou parte dele; um anticorpo monoclonal humano ou uma parte dele produzido pelas referidas células de recombinação genética; uma composição farmacêutica que compreende o referido anticorpo monoclonal humano ou uma parte dele; uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo com a AILIM para tratar distúrbios relacionados com alergia tardia; processo para a identificação, quantificação ou ensaio das substâncias que se ligam a AILIM ou o ligando de AILIM; e um estojo utilizado para referido processo.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Os organismos vivos de mamíferos têm sistemas de respostas imunitárias que excluem microrganismos patogénicos (vírus, bactérias, parasitas, etc.) ou corpos estranhos (ambos designados a seguir por "antigénio") que 1 invadem o organismo vivo. Um deles é chamado de sistema de resposta imunitária natural, o outro é designado por sistema de resposta imunitária adguirida. 0 primeiro é um mecanismo de exclusão gue inclui a fagocitose por fagócitos (leucócitos polimorfonucleares, monócitos, macrófagos, etc.), ataque por células assassinas naturais (AN) e o reconhecimento não especifico tal como opsonização do antigénio por complementos. 0 último, o sistema de resposta imunitária adquirida é um mecanismo de exclusão por linfócitos (principalmente, células T e células B) , que adquiriu a especificidade para o antigénio (nomeadamente, linfócitos activados). As células B que adquirem especificidade para o antigénio atacam o antigénio existente fora das células, através da produção de anticorpos específicos para o antigénio. As células T que adquirem especificidade do antigénio (nomeadamente, as células T activadas) são classificadas em células T auxiliares e células T citotóxicas (linfócitos citotóxicos, LCT) . As células T auxiliares regulam a diferenciação das células B e a produção de anticorpos e destroem a cooperação do antigénio com os fagócitos. Por fim, os LCTs atacam as células infectadas por virus, por si mesmas (Experimental Medicine: Suplemento, "Bio Science Term Library, Immunity", Yodosha, pp.14-17 (1995)).
Esta aquisição de especificidade do antigénio pelas células T (nomeadamente, a activação das células T) é iniciada através do reconhecimento pelas células T do antigénio apresentado pelas células que comportam o antigénio (CCA), tais como macrófagos, células B ou células dendríticas. As células que comportam antigénios tratam os antigénios assim incorporados e apresentam estes antigénios tratados através da ligação deles ao complexo principal de histocompatibilidade (CPH). As células T recebem o sinal 2 primário para a activação das células (ou aquisição de especificidade) por meio do reconhecimento dos antigénios tratados e comportados pelas células que comportam antigénios através de um complexo entre o receptor da célula T (RcT) e o antigénio CD3 existente na superfície da membrana celular (complexo de RcT/CD3).
No entanto, o sinal primário mediado pelo complexo de RcT/CD3 por si só não pode activar suficientemente as células T e conduz a uma falta de resposta ou a uma anergia clonal, de modo que as células não podem reagir a qualquer estímulo recebido posteriormente. 0 factor autócrino da interleucina 2 (IL-2) é necessário para que as células T sejam activadas, sejam diferenciadas nos clones das células T específicas do antigénio e proliferem. Em anergia clonal, as células T estão inactivadas devido à não produção de IL-2 e portanto à não divisão celular. Nomeadamente, a activação das células T acompanhada pela produção de citocinas tal como a IL-2 requer o sinal secundário que se seue ao primeiro sinal através do complexo de RcT/CD3. Este sinal secundário é designado por sinal co-estimulador.
As células T recebem este sinal secundário e transmitem-no para dentro das células através da interacção (adesão celular) com moléculas diferentes de CPH, em células que comportam antigénios, através de moléculas diferentes do complexo de RcT/CD3 na superfície das células T. Este sinal secundário evita a anergia das células (anergia clonal) e activa as células.
Embora alguma parte do mecanismo de transmissão de sinal secundário entre as células portadoras de antigénio e os linfócitos T, tal como células T, ainda não tenha sido explicado com detalhe, os estudos feitos até o momento 3 revelam que um factor importante para a transmissão de sinal secundário é a interacção de CD28 (também designado por antigénio Τρ44, T44 ou 9,3), que é uma molécula da superfície celular expressa principalmente nas células T e nas células do timo, com CD80 (também designado por B7-1, B7, BB1 ou B7/BB1), que é uma molécula da superfície das células expressa em células portadoras de antigénios (macrófagos, monócitos, células dendríticas, etc.) e CD86 (também designado por B7-2 ou B70) , que também é uma molécula da superfície das células nas células portadoras de antigénios (nomeadamente, adesão celular através da ligação entre estas moléculas). Além disso, tem sido experimentalmente verificado que a interacção dos linfócitos T citolíticos associados com o antigénio 4 (LTCA-4), cuja expressão se pensa que é aumentada consoante o sinal secundário, com o CD80 (B7-1) e CD86 (B7-2) (nomeadamente, a adesão celular através da ligação entre estas moléculas) também desempenha um papel importante na regulação da activação de células T pelo sinal secundário. Por outras palavras, a regulação da activação das células T pela transmissão do sinal secundário envolve pelo menos a interacção entre CD28 e CD80/CD86, o aumento da expressão de LTCA-4, que se pensa que depende da interacção e a interacção entre LTCA-4 e CD80/CD86. CD28 é conhecida por ser uma molécula co-estimuladora que transmite o sinal secundário (sinal co-estimulador) necessário para a activação de células T e para evitar a anergia. 0 sinal secundário transmitido por meio da ligação desta molécula a moléculas co-estimuladoras, CD80 (B7-1) e CD86 (B7-2), em células portadoras de antigénios (adesão celular através da ligação entre estas moléculas) ; estabiliza o ARNm de citocinas de tipo Thl e, consequentemente, promove a produção, por meio de células 4 T, de uma grande quantidade de citocinas do tipo Thl, tal como IL-2, IFNy e FNTcx. A expressão de LTCA-4 é induzida pelo sinal primário transmitido através de RcT/CD3 e a expressão também é reforçada pelo sinal secundário transmitido pela ligação entre CD28 e CD80. Tem vindo a ser revelado que LTCA-4 recebe estes sinais para trabalhar para inibir a função das células T, que é contrária à activação de células T pelo sinal secundário transmitido por CD28. A CD28 e os LTCA-4 humanas são glicoproteínas do tipo I cujos pesos moleculares são de 44 kD e 41 a 43 kD, respectivamente. Ambos têm um domínio semelhante a imunoglobulina, pertencem à superfamília das imunoglobulinas e ambos funcionam como uma molécula de adesão celular e funcionam como uma molécula de transmissão do sinal. A CD28 humana forma um homodímero com uma ligação de dissulfureto, enquanto o LTCA-4 existe como um monómero. Ambos os genes de CD28 e de LTCA-4 estão localizados em "2q33" no cromossoma humano e em "1C" no cromossoma de murganho e são compostas por quatro (4) exões. A CD28 humana e LTCA-4 são compostos por 220 e 223 aminoácidos, respectivamente, incluindo as sequências líder e a homologia de aminoácidos entre elas é de 20 a 30 %.
Os ligantes para CD28 e LTCA-4 são CD80 (B7-1) e CD86 (B7-2) em seres humanos e murganhos. LTCA-4 tem uma afinidade para os ligandos 20 vezes mais alta que CD28. Já foi esclarecido que as estruturas das sequências de aminoácidos "MYPPPY (Met-Tir-Pro-Pro-Pro-Tir) " conservadas através das espécies animais são importantes para a ligação de CD28 e CTLA-4 a CD80 (B7-1). Também já foi relatado que, quando CD28 é estimulada, a cinase PI3 (fosfonoinositido-3- 5 cinase, PI3K) associa-se com o resíduo de tirosina fosforilada numa sequência parcial "YMNM (Tir-Met-Asn-Met)" de CD28 e que CD28 desempenha um papel importante na transmissão de sinais intracelulares através desta estrutura "YxxM". Além disso, foi relatado que LTCA-4 também possui uma sequência representada por "YxxM", nomeadamente "YVKM (Tir-Val-Met-Lis)" na sua região citoplásmica e que, depois de ser estimulada, SYP associa-se a esta sequência. CD28 é expressa especificamente em timócitos e células T de sangue periférico e LTCA-4 é expresso especificamente nas células T activadas (Cell Engineering: SUPLEMENTO, "Handbook of Adhesion Molecule", Shujunsha, pp. 93-102 (1994); ibid. pp.120-136; Experimental Medicine: SUPLEMENTO, "BIO SCIENCE Term Library, Immunity", Yodosha, pp. 94-98 (1995); Experimental Medicine: SUPLEMENTO, "BIO SCIENCE Term Library, Intracellular Signal Transduction", Yodosha, pp. 58-59 (1997); Nihon Rinsho, Vol. 55, No. 6, pp. 215-220 (1997)).
Na regulação da função das células T (a activação e a inibição da função das células T), a importância das interacções entre várias moléculas tal como as moléculas co-estimuladoras (CD28, CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), etc.) e CTLA-4, que coopera com elas, foi assim reconhecida e isso tem sido chamado à atenção para a relação entre estas moléculas e as doenças e o tratamento de doenças através da regulação da função destas moléculas.
Como se descreveu antes, embora um organismo vivo active o seu sistema de resposta imunitária adquirida contra os antigénios que são corpos estranhos para o organismo vivo (próprio) , também tem tolerância 6 imunológica, a fim de não dar respostas imunitárias contra os seus próprios componentes (autoantigénio). Se a tolerância imunológica se quebra por algum motivo, ocorre a resposta imunitária ao autoantigénio, as células T reactivas ao autoantigénio são induzidas pelo mesmo mecanismo que já foi mencionado antes, para cair num estado anormal de imunidade e causar assim várias doenças auto-imunes .
Por outras palavras, dado que as células portadoras de antigénio (CPA) não estimuladas, em tecidos normais, não expressam moléculas co-estimuladoras quando o sistema imunitário de um organismo vivo está normal, as células T estão num estado de não resposta para manter a tolerância imunológica mesmo se existirem células T reactivas aos autoantigénios, que reagem com os autoantigénios. Tem sido sugerido que, num estado anormal de imunidade, mais células T reactivas ao autoantigénio são activadas devido ao excesso anormal e à expressão continua de moléculas co-estimuladoras, causando assim doenças auto-imunes.
Destes recentes pontos de vista, propõem-se muitas tentativas para tratar várias doenças auto-imunes, modulando a transmissão de sinais de co-estimulação, por exemplo, o sinal de transmissão mencionado antes entre CD28/LTCA-4 e CD80/CD86.
Os resultados dessas tentativas ainda não esclareceram, em detalhe, o mecanismo de activação das células T por meio da interacção entre as moléculas de co-estimulação e as moléculas relacionadas. Outras moléculas, desconhecidas, podem estar envolvidas neste mecanismo. 7
Recentemente, foi identificada uma nova molécula co-estimuladora como a "CD28" e a "LTCA-4" descritas antes, que se pensa que comporta a transdução de um segundo sinal (sinal co-estimulador) que é essencial para a activação de linfócitos, tal como as células T e a regulação funcional associada ao referido sinal dos linfócitos activados, tal como as células T activadas. Esta molécula tem sido designada por AILIM (molécula imuno-moduladora de linfócitos indutiveis por activação) (em seres humanos, murganhos e ratos: Int. Immunol. vol. 12, No. 1, p.51-55, 2000), também conhecida como COEI (co-estimulador indutivel) (em seres humanos: Nature, vol. 397, No. 6716, p.263-266, 1999)) .
Por outro lado, muito recentemente, identificaram-se novas moléculas designadas por B7h, B7RP-1, GL50 ou LICOS que são ligandos (ligandos de AILIM), interagindo com esta molécula de transmissão co-estimuladora AILIM (COEI) (Nature. vol. 402, No. 6763, pp.827-832, 1999; Nature Medicine, Vol. 5, no.12, pp. 1365-1369, 1999; J. Immunology, Vol. 164, pp.1653-1657, 2000; Curr. Biol., vol.10, no.6, pp.333-336, 2000). A identificação destes dois tipos de novas moléculas, noemadamente, AILIM (COEI) e B7RP-1 (B7h, GL50, LICOS), como a via de transdução do sinal para o sinal de co-estimulação, essencial para a activação dos linfócitos anteriores, tal como as células T e o controlo da função das células T activadas, revelou que há uma nova terceira via pela interacção entre AILIM (COEI) e B7RP-1 (B7h, GL50, LICOS), para além das conhecidas primeira e segunda vias de sinalização, que já são vias de transdução conhecidas entre CD28 e CD80 (B7-1)/CD86 (B7-2) e entre LTCA4 e CD80 (B7-1) /CD 86 (B7-2). 8
Estão em curso estudos sobre as funções biológicas destas novas moléculas, o controlo da função dos linfócitos, tal como das células T, através desta terceira transdução de sinal co-estimulador por meio das moléculas e a relação entre a nova transdução do sinal e as doenças que estão em progresso (J. Immunol., 166 (1), pp. 1, 2001; J. Immunol., 165 (9), pp. 5035, 2000; Biochem . Biophys. Res. Commun., 276 (1), pp. 335, 2000; Immunity, 13 (1) , pp. 95, 2000; J. Exp. Med., 192 (1), pp. 53, 2 0 0 0; Eur. J.
Immunol., 30 (4), pp. 1040, 2000; WO 01/15732). A patente EP-A 0984023 descreve anticorpos de murganho anti-AILIM que inibem a aglutinação de células de linfócitos e a possibilidade de utilização dos referidos anticorpos para o tratamento de doenças auto-imunes e doenças alérgicas. FASEB J., vol. 14, 20 de Abril de 2000, A1169 descreve que a expressão de moléculas co-estimuladoras indutiveis (COEI) de murganhos é aumentada pela co-estimulação de CD28 e regula o desenvolvimento de células Th2.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Especificamente, um objectivo da presente invenção consiste em revelar as funções biológicas da nova molécula AILIM, considerada, tal como "CD28" e "LTCA-4", como uma molécula que transmite o sinal secundário (sinal de co-estimulação) essencial para a activação de linfócitos, tal como as células T e que controla as funções dos linfócitos activados, tais como células T activadas, trabalhando com o sinal; para revelar as relações entre a expressão da AILIM e doenças; e para providenciar um processo e um produto farmacêutico que inibem o desenvolvimento de várias doenças 9 dependentes do padrão de expressão de AILIM ou que tratam as doenças por meio do controlo das funções biológicas da AILIM, usando processos médicos e farmacêuticos (por exemplo, um fármaco tal como um anticorpo monoclonal e um composto de baixo peso molecular).
Para atingir os objectivos descritos antes, os requerentes realizaram activamente estudos sobre anticorpos humanos (particularmente os anticorpos monoclonais humanos) contra AILIMs de mamíferos (particularmente AILIM humana) e, como resultado, por imunização de murganhos transgénicos produzidos usando técnicas de recombinação genética de modo a produzir anticorpos humanos com AILIM (especificamente a fracção da membrana das células que expressam AILIM humana), conseguiu-se, pela primeira vez no mundo, preparar uma variedade de anticorpos monoclonais que se ligam a AILIM humana, particularmente aqueles que se ligam à AILIM humana que regula a transdução de sinal mediada por AILIM humana.
Dado que os anticorpos (particularmente os anticorpos monoclonais) da presente invenção são derivados de seres humanos, não provocam qualquer rejeição imunitária severa devido à imunogenicidade contra seres humanos, AHAM (antigenicidade humana anti-murganho) , em todos os hospedeiros, o que tem sido um grande problema (efeito colateral) em terapia que utilizam fármacos de anticorpos compreendendo anticorpos provenientes de mamíferos não humanos, tais como murganhos e assim aumentam drasticamente o valor dos anticorpos como medicamentos.
Portanto, os anticorpos humanos (particularmente os anticorpos monoclonais humanos) que se ligam a AILIMs de mamíferos (particularmente a AILIM humana da presente 10 invenção e as composições farmacêuticas que compreendem os referidos anticorpos humanos (particularmente os anticorpos monoclonais humanos) são úteis como fármacos para o controlo, sem indução de rejeição pelo sistema imunológico devido a AHAM no hospedeiro, várias reacções fisiológicas relacionadas com transdução do sinal co-estimulador para células que expressam AILIM mediada por AILIM (por exemplo, a proliferação de células que expressam AILIM, a produção de citocinas por células que expressam AILIM, a citólise imunitária ou a apoptose de células que expressam AILIM e a actividade para induzir citotoxicidade dependente de anticorpos nas células que expressam AILIM, etc.) e/ou também são úteis como fármacos para suprimir e prevenir o desenvolvimento de sintomas e/ou o progresso de vários distúrbios relacionados com a transdução do sinal mediada pela referida AILIM e como medicamento para tratar ou prevenir o referido distúrbio.
Especificamente, as composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção são capazes de controlar (suprimir ou estimular) a proliferação de células que expressam AILIM ou a produção de citocinas (por exemplo, interferão γ ou interleucina 4, etc.) por células que expressam AILIM, possibilitando assim a supressão de diversos estados clinicos patológicas e o tratamento ou a prevenção de várias doenças causadas por diversos fenómenos fisiológicos relacionados com a transdução de sinal mediada por AILIM. 0 uso de composições farmacêuticas, de acordo com a presente invenção, permite a supressão, a prevenção e/ou o tratamento de, por exemplo, vários distúrbios (por exemplo, artrite reumatóide, esclerose múltipla, tiroidite auto-imune, dermatite alérgica do tipo de contacto, dermatose 11 inflamatória crónica, tal como liquen plano, lúpus eritematoso sistémico, diabetes mellitus dependente de insulina, psoriase, etc.) classificam-se em distúrbios auto-imunes ou alérgicos (especialmente doenças auto-imunes e alergia tardia, causadas pela imunidade celular); artropatia (por exemplo, artrite reumatóide (AR) e osteoartrite (OA)), inflamação (por exemplo, hepatite); reacção do hospedeiro versus o enxerto (reacção HVE); doença do hospedeiro versus o enxerto (DHVE); rejeição imunológica que acompanha um transplante (homoplastia ou heteroplastia) de um tecido (tecidos tal como pele, córnea, ossos, etc.) ou de um órgão (figado, coração, pulmão, rim, pâncreas, etc.); resposta imunitária desencadeada por um antigénio estranho ou autoantigénio (por exemplo, produção de anticorpos contra o referido antigénio, proliferação celular, produção de citocinas) ; e distúrbios eventualmente causados pela imunidade anormal do intestino (especificamente distúrbios inflamatórios intestinais (particularmente doença de Crohn e colite ulcerosa) e alergia alimentar).
Além disso, no campo da supressão/tratamento da rejeição imunitária que acompanha o transplante de tecidos e de órgãos descrito antes, é possivel aumentar o efeito supressor sobre a rejeição de transplantes, de imunossupressores conhecidos, por meio da utilização da composição farmacêutica da presente invenção, em conjunto com os referidos fármacos, que têm sido utilizados para a supressão da rejeição imunitária, num desses tratamentos de transplante.
Além disso, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser aplicada para tratar ou prevenir qualquer 12 doença inflamatória para as quais são indicados vários esteróides como antiflogísticos. A composição farmacêutica da presente invenção pode ser aplicada a doenças inflamatórias, por exemplo, à inflamação que acompanha diversas artrites (por exemplo, artrite reumatóide, osteoartrite), pneumonia, hepatite (incluindo hepatite virai), à inflamação que acompanha as doenças infecciosas, às doenças inflamatórias do intestino, à enterite intestinal, à nefrite (inflamação que acompanha a nefrite glomerular e a nefrofibrose) , à gastrite, à vasculite, à pancreatite, à peritonite, à bronquite, à miocardite, à cerebrite, à inflamação na lesão de reperfusão pós-isquémica (reperfusão isquémica do miocárdio), à inflamação atribuída à rejeição imunológica após o transplante de tecidos e órgãos, às queimaduras, a várias inflamações da pele diferentes (psoríase, dermatite alérgica do tipo de contacto, líquen plano, que é uma doença inflamatória crónica da pele), à inflamação na falência de múltiplos órgãos, à inflamação após ACTP (angioplastia coronária transluminal percutânea) ou PRCT e à inflamação que acompanha a arteriosclerose e a tiróidite auto-imune.
Além disso, usando um processo para identificar substâncias que se ligam a AILIM ou ao ligando de AILIM, que é uma das presentes invenções, torna-se possível rastrear para seleccionar os produtos farmacêuticos (compostos químicos sintéticos ou anticorpos) com actividade potencial no tratamento de vários distúrbios através da ligação a AILIM ou a ligandos de AILIM para regular a de transdução de sinal mediada pela interacção deles. 13
Especificamente, a presente invenção é a invenção descrita a seguir de (1) a (31). (1) Um anticorpo monoclonal humano que se liga a AILIM humana, caracterizado pelo facto de uma região variável de cadeia pesada do referido anticorpo monoclonal humano ter uma sequência de aminoácidos correspondente a (a) ou (b) que se seguem: (a) sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos da posição 20 até à 117 da SEQ ID NO: 28 ou (b) sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos da posição 20 até à 117 de SEQ ID NO: 28 na qual um a dez residuos de aminoácidos foram eliminados ou substituidos ou na qual se insere ou adiciona um a dez residuos de aminoácidos desde que, quando a região variável de cadeia pesada tenha a sequência de aminoácidos da (b) anterior, o referido anticorpo tem qualquer uma das caracteristicas enunciadas a seguir de (i) a (iii): (i) uma actividade para impedir a reacção mista de linfócitos, (ii) uma actividade para induzir a transdução de sinal para induzir o interferão-γ ou (iii) uma actividade para induzir citotoxicidade celular dependente do anticorpo nas células que expressam AILIM. (2) Um anticorpo monoclonal humano que se liga a AILIM humana, caracterizado pelo facto de um polipéptido de cadeia pesada do referido anticorpo monoclonal humano 14 ter uma sequência de aminoácidos correspondente a (a) ou (b) que se sequem: (a) sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos da posição 20 até à 470 da SEQ ID NO: 28 ou (b) sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos da posição 20 até à 470 de SEQ ID NO: 28 na qual um a dez resíduos de aminoácidos foram eliminados ou substituídos ou na qual se insere ou adiciona um a dez resíduos de aminoácidos desde que, quando a reqião variável de cadeia pesada do polipéptido tiver a sequência de aminoácidos da (b) anterior, o referido anticorpo tem qualquer uma das características enunciadas a seguir de (i) a (iii): (i) uma actividade para impedir a reacção mista de linfócitos, (ii) uma actividade para induzir a transdução de sinal para induzir o interferão-γ ou (iii) uma actividade para induzir citotoxicidade celular dependente do anticorpo nas células que expressam AILIM. (3) Um anticorpo monoclonal humano que se liga a AILIM humana, caracterizado pelo facto de uma região variável de cadeia leve do referido anticorpo monoclonal humano ter uma sequência de aminoácidos correspondente a (a) ou (b) que se seguem: (a) sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos da posição 23 até à 116 da SEQ ID NO: 30 ou 15 (b) sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos da posição 23 até à 116 da SEQ ID NO: 30 na qual um a dez resíduos de aminoácidos foram eliminados ou substituídos ou na qual se insere ou se adiciona um a dez resíduos de aminoácidos desde que, quando a região variável de cadeia leve tem a sequência de aminoácidos da (b) anterior, o referido anticorpo compreende uma qualquer das caracteristicas enunciadas a seguir de (i) a (iii): (i) uma actividade para impedir a reacção mista de linfócitos, (ii) uma actividade para induzir a transdução de sinal para induzir o interferão γ ou (iii) uma actividade para induzir citotoxicidade celular dependente do anticorpo nas células que expressam AILIM. (4) Um anticorpo monoclonal humano que se liga a AILIM humana, caracterizado pelo facto de um polipéptido de cadeia leve do referido anticorpo monoclonal humano ter uma sequência de aminoácidos correspondente a (a) ou (b) que se seguem: (a) sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos da posição 23 até 236 da SEQ ID NO: 30 ou (b) sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos da posição 23 até 236 da SEQ ID NO: 30 na qual um a dez resíduos de aminoácidos foram eliminados ou substituídos ou na qual se inseriu ou adicionou um a dez resíduos de aminoácidos 16 desde que, quando o polipéptido de cadeia leve tiver a sequência de aminoácidos da (b) anterior, o referido anticorpo compreende uma qualquer das caracteristicas enunciadas a seguir de (i) a (iii): (i) uma actividade para impedir a reacção mista de linfócitos, (ii) uma actividade para induzir a transdução de sinal para induzir o interferão γ ou (iii) uma actividade para induzir citotoxicidade celular dependente do anticorpo nas células que expressam AILIM. (5) Um anticorpo monoclonal humano que se liga a AILIM humana, caracterizado pelo facto de compreender as seguintes caracteristicas (a) e (b): (a) uma região variável de cadeia pesada do anticorpo compreende um qualquer um das seguintes (I) ou (II): (I) uma sequência de aminoácidos que compreende a sequência de aminoácidos desde o aminoácido 20 até ao 117 da SEQ ID NO: 28 ou (II) uma sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos desde posição 20 até à 117 da SEQ ID NO: 28 na qual um a dez residuos de aminoácidos foram suprimidas ou substituídos ou nas quais se insere ou adiciona um a dez residuos de aminoácidos; e (b) uma região variável de cadeia leve do anticorpo que compreende uma qualquer das seguintes caracteristicas (I) ou (II): 17 (I) uma sequência de aminoácidos que compreende a sequência de aminoácidos desde o aminoácido 23 a 116 da SEQ ID NO: 30 ou (II) uma sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos da posição 23 a 116 da SEQ ID NO: 30 na qual um a dez resíduos de aminoácidos foram suprimidos ou substituídos ou nas quais se inseriu ou adicionou um a dez resíduos de aminoácidos, desde que, quando a região variável da cadeia pesada é a (II) de (a) anterior ou a região variável de cadeia leve é a (II) de (b) anterior, o referido anticorpo compreende uma qualquer das características seguintes (i) a (iii) : (i) uma actividade para impedir a reacção mista de linfócitos, (ii) uma actividade para induzir a transdução de sinal para induzir interferão γ ou (iii) uma actividade para induzir a citotoxicidade celular dependente do anticorpo nas células que expressam AILIM. (6) Um anticorpo monoclonal humano que se liga a AILIM humana, caracterizado pelo facto de compreender as características (a) e (b) que se seguem: (a) um polipéptido de cadeia pesada do anticorpo que compreende qualquer uma das seguintes (I) ou (II): (I) uma sequência de aminoácidos desde o aminoácido 20 ao 470 da SEQ ID NO: 28; ou (II) uma sequência de aminoácidos compreendendo aminoácidos da posição 20 até à 470 de SEQ ID NO: 18 28 na qual um a dez resíduos de aminoácidos foram suprimidos ou substituídos ou na qual se inseriu ou se adicionou um a dez resíduos de aminoácidos; e (b) um polipéptido de cadeia leve do anticorpo que compreende qualquer uma das seguintes (I) ou (II): (I) uma sequência de aminoácidos desde o aminoácido 23 a 236 da SEQ ID NO: 30; ou (II) uma sequência de aminoácidos que compreende os aminoácidos da posição 23 até à 236 da SEQ ID NO: 30 na qual um a dez resíduos de aminoácidos foram suprimidos ou substituídos ou na qual se inseriu ou se adicionou um a dez resíduos de aminoácidos, desde que, quando o polipéptido de cadeia pesada é o anterior (II) de (a) ou o polipéptido de cadeia leve é o anterior (II) de (b), o referido anticorpo compreende qualquer uma das características (i) a (iii) que se seguem: (i) uma actividade para prevenir a reacção de mistura de linfócitos; (ii) uma actividade para induzir a transdução de sinal para induzir o interferão γ ou (iii) uma actividade para induzir citotoxicidade celular dependente do anticorpo nas células que expressam AILIM. (7) Um ADN que codifica um polipéptido de uma região variável de cadeia pesada do anticorpo humano de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido polipéptido compreender a sequência de 19 aminoácidos desde o aminoácido 20 até 117 da SEQ ID NO: 28. (8) ADN que codifica um polipéptido de uma região variável de cadeia leve do anticorpo humano de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o referido polipéptido compreender a sequência de aminoácidos desde o aminoácido 23 a 116 da SEQ ID NO: 30. (9) Um ADN que codifica um polipéptido de cadeia pesada do anticorpo humano de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o referido polipéptido compreender a sequência de aminoácidos desde o aminoácido 20 até ao 470 da SEQ ID NO: 28. (10) Um ADN que codifica um polipéptido de cadeia leve do anticorpo humano, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de o referido polipéptido compreender a sequência de aminoácidos desde o aminoácido 23 a 236 da SEQ ID NO: 30. (11) Um ADN caracterizado pelo facto de seleccionar entre (a) ou (b) a seguir: (a) um ADN que compreende a sequência de nucleótidos desde o nucleótido 126 até 419 da SEQ ID NO: 27 ou (b) um ADN que compreende a sequência de nucleótidos desde o nucleótido 105 até 386 da SEQ ID NO: 29. (12) Um ADN caracterizado pelo facto de se seleccionar entre (a) ou (b) a seguir: 20 (a) um ADN que compreende a sequência de nucleótidos a partir do nucleótido 69 até 1481 da SEQ ID NO: 27 ou (b) um ADN que compreende a sequência de nucleótidos desde o nucleótido 39 até ao 749 da SEQ ID NO: 29. (13) Um vector caracterizado pelo facto de compreender o ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 7 a 12 . (14) Um vector de acordo com a reivindicação 13 caracterizado pelo facto de compreender um ADN que compreende a sequência de nucleótidos desde o nucleótido 126 até 419 da SEQ ID NO: 27. (15) Um vector, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de compreender um ADN que compreende a sequência de nucleótidos desde o nucleótido 69 até 1481 da SEQ ID NO: 27. (16) Um vector, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de compreender um ADN que compreende a sequência de nucleótidos desde o nucleótido 105 até ao 386 da SEQ ID NO: 29. (17) Um vector, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de compreender um ADN que compreende a sequência de nucleótidos desde o nucleótido 39 até 749 de SEQ ID NO: 29. (18) Um vector, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de compreender um ADN de acordo com o seguinte (a) e (b): 21 (a) um ADN que compreende uma sequência de nucleótidos desde o nucleótido 126 até ao 419 da SEQ ID NO: 27 e (b) um ADN que compreende uma sequência de nucleótidos desde o nucleótido 105 até ao 386 da SEQ ID NO: 29. (19) Um vector, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de compreender um ADN de acordo com o seguinte (a) e (b): (a) um ADN que compreende uma sequência de nucleótidos desde o nucleótido 69 até ao 1481 da SEQ ID NO: 27 e (b) um ADN que compreende uma sequência de nucleótidos desde o nucleótido 39 até ao 749 de SEQ ID NO: 29. (20) Uma célula que produz o anticorpo monoclonal humano, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo facto de a célula não ser uma célula embrionária humana. (21) Uma célula, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo facto de a referida célula ser uma célula fundida obtida pela fusão de células B, derivadas de um mamifero capaz de produzir o referido anticorpo monoclonal humano e células de mieloma derivadas de um mamifero. (22) Um hospedeiro genético não humano recombinante transformado pelo vector de acordo com uma qualquer das reivindicações 13 a 19, caracterizado pelo facto de o referido hospedeiro derivar de um mamifero seleccionado 22 no grupo que consiste em bovinos, caprinos, coelhos, murganhos, ratos, hamsters e porquinhos da índia. (23) Um hospedeiro genético recombinante, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo facto de o referido hospedeiro ser uma célula de mamíferos não humanos. (24) Um hospedeiro genético recombinante, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo facto de o referido hospedeiro ser um óvulo fertilizado de mamifero não humano. (25) Um anticorpo monoclonal humano ou parte dele, caracterizado pelo facto de se ligar a uma AILIM humana produzida por um hospedeiro de recombinação genética de acordo com as reivindicações 22 ou 23. (26) Uma composição farmacêutica caracterizada pelo facto de compreender o anticorpo humano de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6 e um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. (27) Uma composição farmacêutica caracterizada pelo facto de compreender um anticorpo monoclonal humano ou parte dele, de acordo com a reivindicação 25 e um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. (28) Utilização do anticorpo ou de parte dele, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6 e 25 caracterizada pelo facto de se destinar à preparação de uma composição farmacêutica para prevenir, tratar ou fazer a profilaxia de uma alergia do tipo tardia. 23 (29) Utilização do anticorpo ou de parte dele, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6 e 25 caracterizada pelo facto de se destinar à preparação de uma composição farmacêutica para prevenir, tratar ou fazer a profilaxia de artrite reumatóide. (30) Utilização do anticorpo ou de parte dele, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6 e 25 caracterizada pelo facto de se destinar à preparação de uma composição farmacêutica para prevenir, tratar ou fazer a profilaxia de lúpus eritematoso sistémico. (31) Utilização do anticorpo ou de parte dele, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6 e 25, caracterizada pelo facto de se destinar à preparação de uma composição farmacêutica para prevenir, tratar ou fazer a profilaxia de psoríase.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A fiqura 1 mostra as reactividades respectiva do anticorpo anti-humano de IgG, o anticorpo anti-humano de Igx e o anticorpo anti-humano de IgFc ao anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana, analisado pela análise por ELISA das células usando um citómetro de fluxo.
Os quadros (a) a (1) mostram os resultados dos respectivos ensaios indicados a seguir.
Quadro (a) : resultado do ensaio em que se adicionou o anticorpo anti-IgG humana marcado com biotina, como anticorpo secundário, na ausência do anticorpo primário nas microplacas onde estavam em cultura as células de tipo selvagem HPB- ALL. 24
Quadro (b) : resultado do ensaio em que se adicionou anticorpo anti-IgK humana, marcado com biotina, como anticorpo secundário, na ausência do anticorpo primário, às microplacas onde estavam em cultura as células de tipo selvagem HPB- ALL.
Quadro (c) : resultado do ensaio em que se adicionou anticorpo anti-IgFc humana, marcado com biotina, como anticorpo primário, às microplacas onde estavam em cultura as células de tipo selvagem HPB- ALL.
Quadro (d) : resultado do ensaio em que se utilizou anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana JMab-136, como anticorpo primário e se utilizou anticorpo anti-IgG humana, marcado com biotina, como anticorpo secundário.
Quadro (e) : resultado do ensaio em que se utilizou o anticorpo monoclonal humanos anti-AILIM humana, JMab-136, como anticorpo primário e anticorpo anti-IgK humana, marcado com biotina, como anticorpo secundário.
Quadro (f) : resultado do ensaio em que se utilizou o anticorpo monoclonal humanos anti-AILIM humana, JMab-136, como anticorpo primário e se utilizou anticorpo anti-IgFc humana, marcado com biotina como anticorpo secundário.
Quadro (g) : resultado do ensaio em que se utilizou o anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana, JMab-138, como anticorpo primário e se utilizou anticorpo anti-IgG humana marcado com biotinacomo anticorpo secundário.
Quadro (h) : resultado do ensaio em que se utilizou o anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana, JMab-138, 25 como anticorpo primário e se utilizou anticorpo anti-Igic humana, marcado com biotina como anticorpo secundário.
Quadro (i) : resultado do ensaio em que se utilizou o anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana, JMab-138, como anticorpo primário e se utilizou anticorpo anti-IgFc humana marcado com biotina como anticorpo secundário.
Quadro (j) : resultado do ensaio em que se utilizou o anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana, JMab-139, como anticorpo primário e se utilizou anticorpo anti-IgG humana marcado com biotina como anticorpo secundário.
Quadro (k) : resultado do ensaio em que se utilizou o anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana, JMab-139, como anticorpo primário e se utilizou anticorpo anti-IgK humana, marcado com biotina como anticorpo secundário.
Quadro (1) : resultado do ensaio em que se utilizou o anticorpo monoclonal humanos anti-AILIM humana, JMab-139, como anticorpo primário e se utilizou anticorpo anti-IgFc humana marcado com biotina como anticorpo secundário. A curva com simbolos abertos em cada quadro corresponde ao resultado do ensaio em que se utilizou o anticorpo monoclonal humano anti-HML como o anticorpo de controlo. A Figura 2 mostra uma curva de calibração relativa ao anticorpo monoclonal humano de IgG (material padrão) analisado por ELISA em sanduiche usando o anticorpo anti-IgG humana. 26 0 eixo vertical indica a intensidade de fluorescência e o eixo horizontal indica a concentração do material padrão. A figura 3 mostra as actividades de ligação dos vários anticorpos monoclonais de murganho anti-AILIM humana às células recombinantes de OHC ou a células de OHC de tipo selvagem. 0 eixo vertical indica a intensidade de fluorescência como um indice da actividade de ligação às células recombinantes e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo adicionado. 0 termo "OHC" na figura indica o resultado de um ensaio de ligação com a célula de OHC de tipo selvagem e "humana" indica o resultado de um ensaio de ligação com a célula recombinante de OHC que sobre-expressam a AILIM humana. A figura 4 mostra as actividades de ligação dos vários anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana ou anticorpos monoclonais humanos anti-HML como um controlo negativo com as células recombinantes de OHC ou células de OHC de tipo selvagem que sobre-expressam a AILIM humana. 0 eixo vertical indica a intensidade de fluorescência como um indice da actividade de ligação às células recombinantes e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo adicionado. 0 termo "OHC" na figura indica o resultado de um ensaio de ligação a células de OHC de tipo selvagem e "humano " indica o resultado de um ensaio de ligação a 27 célula recombinante de OHC que sobre-expressam AILIM humana. A figura 5 mostra as actividades de ligação de vários anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana a células recombinantes de OHC ou células de OHC de tipo selvagem que sobre-expressam a AILIM humana. 0 eixo vertical indica a intensidade de fluorescência como um indice da actividade de ligação às células recombinantes e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo adicionado. 0 termo "OHC" na figura indica o resultado de um ensaio de ligação com a célula de OHC de tipo selvagem e "humano" indica o resultado de um ensaio de ligação com a célula recombinante de OHC que sobre-expressa AILIM humana. A figura 6 mostra as actividades de ligação dos vários anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana a células recombinantes de OHC ou células de OHC de tipo selvagem que sobre-expressam a AILIM humana. 0 eixo vertical indica a intensidade de fluorescência como um indice da actividade de ligação às células recombinantes e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo adicionado. 0 termo "OHC" na figura indica o resultado de um ensaio de ligação com a célula de OHC de tipo selvagem e "humano" indica o resultado de um ensaio de ligação com a célula recombinante de OHC que sobre-expressa AILIM humana. 28 A figura 7 mostra as actividades de ligação dos vários anticorpos monoclonais de murganho anti-AILIM humana às células recombinantes de OHC ou células de OHC de tipo selvagem que sobre-expressam a AILIM humana. O eixo vertical indica a intensidade de fluorescência como um indice da actividade de ligação às células recombinantes e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo adicionado. 0 termo "OHC" na figura indica o resultado de um ensaio de ligação com a célula de OHC de tipo selvagem e "de murganho" indica o resultado de um ensaio de ligação com a célula recombinante de OHC que sobre-expressam a AILIM de murganho. A figura 8 mostra as actividades de ligação dos vários anticorpos monoclonais humanos de murganho anti-AILIM humana ou anticorpos monoclonais humanos anti-HML humano como um controlo negativo para as células recombinantes de OHC ou de tipo selvagem que sobre-expressam AILIM. 0 eixo vertical indica a intensidade de fluorescência como um indice da actividade de ligação às células recombinantes e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo adicionado. 0 termo "OHC" na figura indica o resultado de um ensaio de ligação com a célula de OHC de tipo selvagem e "de murganho" indica o resultado de um ensaio de ligação com a célula recombinante de OHC que sobre-expressam a AILIM de murganho. 29 A figura 9 mostra as actividades de ligação dos vários anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana a células recombinantes de OHC ou células de OHC de tipo selvagem que sobre-expressam a AILIM de murganho. 0 eixo vertical indica a intensidade de fluorescência como um indice da actividade de ligação às células recombinantes e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo adicionado. 0 termo "OHC" na figura indica o resultado de um ensaio de ligação com a célula de OHC de tipo selvagem e "de murganho" indica o resultado de um ensaio de ligação com a célula recombinante de OHC que sobre-expressa a AILIM de murganho. A figura 10 mostra as actividades de ligação dos vários anticorpos monoclonais humanos, anti-AILIM humana, a células recombinantes de OHC ou células de OHC de tipo selvagem que sobre-expressam AILIM de murganho. O eixo vertical indica a intensidade de fluorescência como um indice da actividade de ligação às células recombinantes e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo adicionado. O termo "OHC" na figura indica o resultado de um ensaio de ligação com a célula de OHC de tipo selvagem e "de murganho" indica o resultado de um ensaio de ligação com a célula recombinante de OHC que sobre-expressa AILIM de murganho. A figura 11 mostra as actividades de ligação de vários anticorpos monoclonais de murganho anti-AILIM de rato às 30 células recombinantes de OHC ou células de OHC de tipo selvagem que sobre-expressam a AILIM de rato. 0 eixo vertical indica a intensidade de fluorescência como um indice da actividade de ligação às células recombinantes e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo adicionado. 0 termo "OHC" na figura indica o resultado do ensaio de ligação com a célula de OHC de tipo selvagem e "de rato" indica o resultado do ensaio de ligação com a célula recombinante de OHC que sobre-expressa a AILIM de rato. A figura 12 mostra as actividades de ligação dos vários anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana ou anticorpos monoclonais humanos anti-HML como um controlo negativo para as células recombinantes de OHC ou OHC de tipo selvagem que sobre-expressam a AILIM de rato. 0 eixo vertical indica a intensidade de fluorescência como um indice da actividade de ligação às células recombinantes e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo adicionado. 0 termo "OHC" na figura indica o resultado de um ensaio de ligação com a célula de OHC de tipo selvagem e "de rato" indica o resultado de um ensaio de ligação com a célula recombinante de OHC que sobre-expressa a AILIM de rato. A figura 13 mostra as actividades de ligação dos vários anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana a células recombinantes de OHC ou células de OHC de tipo selvagem que sobre-expressam a AILIM de rato. 31 0 eixo vertical indica a intensidade de fluorescência como um indice da actividade de ligação às células recombinantes e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo adicionado. 0 termo "OHC" na figura indica o resultado de um ensaio de ligação com a célula de OHC de tipo selvagem e "de rato" indica o resultado de um ensaio de ligação com a célula recombinante de OHC que sobre-expressa a AILIM de rato. A figura 14 mostra as actividades de ligação dos vários anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana a células recombinantes de OHC ou células de OHC de tipo selvagem que sobre-expressam a AILIM de rato. 0 eixo vertical indica a intensidade de fluorescência como um indice da actividade de ligação às células recombinantes e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo adicionado. O termo "OHC", na figura, indica o resultado de um ensaio de ligação com a célula de OHC de tipo selvagem e "de rato" indica o resultado de um ensaio de ligação com a célula recombinante de OHC que sobre-expressa a AILIM de rato. A figura 15 mostra a actividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa normal e saudável, o "dador A" no ensaio para a actividade de transdução de sinal co-estimulador por meio de vários anticorpos monoclonais de murganho anti-AILIM humana utilizando uma uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 32 humana, em conjunto com anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana. 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H]timidina como um índice do grau de proliferação celular e, o eixo horizontal, indica a concentração de anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana. A figura 16 mostra a actividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa normal e saudável, o "dador A" no ensaio para a actividade de transdução de sinal co-estimulador por meio de vários anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana utilizando uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 humana, em conjunto com o anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana. 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H]timidina como um índice do grau de proliferação celular e, no eixo horizontal, indica a concentração de anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana. A figura 17 mostra a actividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa normal e saudável, o "dador B" no ensaio para a actividade de transdução de sinal co-estimulador por meio de vários anticorpos monoclonais de murganho anti-AILIM humana utilizando uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 humana, em conjunto com o anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana. 33 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H]timidina como um indice do grau de proliferação celular e, o eixo horizontal, indica a concentração de anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana.
Nesta figura, "JHC1" indica o resultado do ensaio em que o anticorpo monoclonal anti-CETP humana foi utilizado como controlo negativo, em vez do anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana. A figura 18 mostra a actividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa normal e saudável, o "dador B" no ensaio para a actividade de transdução de sinal co-estimulador por meio de vários anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana utilizando uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 humana, em conjunto com o anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana. 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H]timidina como um indice do grau de proliferação celular e, o eixo horizontal, indica a concentração de anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Nesta figura, "anti-HML" indica o resultado do ensaio em que o anticorpo monoclonal anti-HML humana foi utilizado como controlo negativo, em vez do anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana. A figura 19 mostra a actividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa normal e saudável, o "dador B" no ensaio para a actividade de transdução de 34 sinal co-estimulador por meio de vários anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana utilizando uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 humana, em conjunto com o anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana. 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H]timidina como um indice do grau de proliferação celular e, o eixo horizontal, indica a concentração de anticorpo monoclonal humano anti-AILIM - humana.
Nesta figura, "anti-HML" indica o resultado do ensaio em que o anticorpo monoclonal anti-HML humana foi utilizado como controlo negativo, em vez do anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana. A figura 20 mostra a actividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa normal e saudável, o "dador C" no ensaio para a actividade de transdução de sinal co-estimulador por meio de vários anticorpos monoclonais de murganho anti-AILIM humana utilizando uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 humana, em conjunto com anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana. O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H]timidina como um indice do grau de proliferação celular e, o eixo horizontal, indica a concentração de anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana.
Nesta figura, "JHC1" indica o resultado do ensaio em que o anticorpo monoclonal anti-CETP humana foi utilizado 35 como controlo negativo, em vez do anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana. A figura 21 mostra a actividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa normal e saudável, o "dador C" no ensaio para a actividade de transdução de sinal co-estimulador por meio de vários anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana utilizando uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal NTI-CD3 humana, em conjunto com o anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H]timidina como um indice do grau de proliferação celular e, o eixo horizontal, indica a concentração de anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Nesta figura, "anti-HML" indica o resultado do ensaio em que o anticorpo monoclonal anti-HML humana foi utilizado como controlo negativo, em vez do anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Outras notações são as seguintes: "124": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl24. "126": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab126. "127": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab127. A figura 22 mostra a actividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa normal e saudável, o 36 "dador C" no ensaio para a actividade de transdução de sinal co-estimulador por meio de vários anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana utilizando uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 humana, em conjunto com o anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana. 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H]timidina como um indice do grau de proliferação celular e, o eixo horizontal, indica a concentração de anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Nesta figura, "anti-HML" indica o resultado do ensaio em que o anticorpo monoclonal anti-HML humana foi utilizado como controlo negativo, em vez do anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Outras notações são as seguintes: "128": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl2 8. "135": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl35. "136": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl36. A figura 23 mostra a actividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa normal e saudável, o "dador C" no ensaio para a actividade de transdução de sinal co-estimulador por meio de vários anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana utilizando uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 37 humana, em conjunto com o anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana. 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação de [3H]timidina como um indice do grau de proliferação celular e, o eixo horizontal, indica a concentração de anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Nesta figura, "anti-HML" indica o resultado do ensaio em que o anticorpo monoclonal anti-HML humana foi utilizado como controlo negativo, em vez do anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Outras notações são as seguintes: "137": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl37. "138": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl38. "139": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl3 9. A figura 24 mostra a actividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa normal e saudável, o "dador C" no ensaio para a actividade de transdução de sinal co-estimulador por meio de vários anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana utilizando uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 humana, em conjunto com o anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana. 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H]timidina como um indice do grau de proliferação celular e o eixo horizontal indica a 38 concentração de anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Nesta figura, "anti-HML" indica o resultado do ensaio em que o anticorpo monoclonal anti-HML humana foi utilizado como controlo negativo, em vez do anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Outras notações são as seguintes: "140": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl40. "141": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl40. A figura 25 mostra a actividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa normal e saudável, o "dador D" no ensaio para a actividade de transdução de sinal co-estimulador por meio de vários anticorpos monoclonais de murganho anti-AILIM humana utilizando uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 humana, em conjunto com anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana. O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H]timidina como um indice do grau de proliferação celular e, o eixo horizontal, indica a concentração de anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana.
Nesta figura, "JHC1" indica o resultado do ensaio em que o anticorpo monoclonal anti-CETP humana foi utilizado como controlo negativo, em vez do anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana. 39 A figura 26 mostra a actividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa normal e saudável, o "dador D" no ensaio para a actividade de transdução de sinal co-estimulador por meio de vários anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana utilizando uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 humana, em conjunto com o anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana. 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H]timidina como um indice do grau de proliferação celular e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Nesta figura, "anti-HML" indica o resultado do ensaio em que o anticorpo monoclonal anti-HML humana foi utilizado como controlo negativo, em vez do anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Outras notações são as seguintes: "124": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl24. "126": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl2 6. "127": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl27. A figura 27 mostra a actividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa normal e saudável, o "dador D" no ensaio para a actividade de transdução de sinal co-estimulador por meio de vários anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana utilizando uma 40 microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 humana, em conjunto com o anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana. 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H]timidina como um indice do grau de
proliferação celular e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana.
Nesta figura, "anti-HML" indica o resultado do ensaio em que o anticorpo monoclonal anti-HML humana foi utilizado como controlo negativo, em vez do anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Outras notações são as seguintes: "128": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl2 8. "135": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl35. "136": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl36. A figura 28 mostra a actividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa normal e saudável, o "dador D" no ensaio para a actividade de transdução de sinal co-estimulador por meio de vários anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana utilizando uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 humana, em conjunto com o anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana. 41 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [ H] timidina como um indice do grau de
proliferação celular e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Nesta figura, "anti-HML" indica o resultado do ensaio em que o anticorpo monoclonal anti-HML humana foi utilizado como controlo negativo, em vez do anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Outras notações são as seguintes: "137": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl37. "138": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl38. "139": Anticorpo monoclonal humano de anti-AILIM humana JMabl39. A figura 29 mostra a actividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa normal e saudável, o "dador D" no ensaio para a actividade de transdução de sinal co-estimulador por meio de vários anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana utilizando uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 humana, em conjunto com o anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana. 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H] timidina como um indice do grau de proliferação celular e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana. 42
Nesta figura, "anti-HML" indica o resultado do ensaio em que o anticorpo monoclonal anti-HML humana foi utilizado como controlo negativo, em vez do anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Outras notações são as seguintes: "140": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl40. "141": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl40. A figura 30 mostra a actividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa normal e saudável, o "dador E" no ensaio para a actividade de transdução de sinal co-estimulador por meio de vários anticorpos monoclonais de murganho anti-AILIM humana utilizando uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 humana, em conjunto com anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana. O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H]timidina como um indice do grau de
proliferação celular e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana.
Nesta figura, "JHC1" indica o resultado do ensaio em que o anticorpo monoclonal anti-CETP humana foi utilizado como controlo negativo, em vez do anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana. A figura 31 mostra a actividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa normal e saudável, o 43 "dador E" no ensaio para a actividade de transdução de sinal co-estimulador por meio de vários anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana utilizando uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 humana, em conjunto com o anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana. 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H]timidina como um indice do grau de proliferação celular e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Nesta figura, "anti-HML" indica o resultado do ensaio em que o anticorpo monoclonal anti-HML humana foi utilizado como controlo negativo, em vez do anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Outras notações são as seguintes: "124": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl24. "126": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl2 6. "127": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl27. A figura 32 mostra a actividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa normal e saudável, o "dador E" no ensaio para a actividade de transdução de sinal co-estimulador por meio de vários anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana utilizando uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 44 humana, em conjunto com o anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana. 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H]timidina como um indice do grau de proliferação celular e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Nesta figura, "anti-HML" indica o resultado do ensaio em que o anticorpo monoclonal anti-HML humana foi utilizado como controlo negativo, em vez do anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Outras notações são as seguintes: "128": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl2 8. "135": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl35. "136": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl36. A figura 33 mostra a actividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa normal e saudável, o "dador E" no ensaio para a actividade de transdução de sinal co-estimulador por meio de vários anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana utilizando uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 humana, em conjunto com o anticorpo monoclonal humano anti-AILIM. 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [ H] timidina como um indice do grau de 45 proliferação celular e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Nesta figura, "anti-HML" indica o resultado do ensaio em que o anticorpo monoclonal anti-HML humana foi utilizado como controlo negativo, em vez do anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Outras notações são as seguintes: "137": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab137. "138": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab138. "139": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl39. A figura 34 mostra a actividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa normal e saudável, o "dador E" no ensaio para a actividade de transdução de sinal co-estimulador por meio de vários anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana utilizando uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 humana, em conjunto com o anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana. 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [ H] timidina como um indice do grau de proliferação celular e n eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Nesta figura, "anti-HML" indica o resultado do ensaio em que o anticorpo monoclonal anti-HML humana foi utilizado 46 como controlo negativo, em vez do anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Outras notações são as seguintes: "140": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl40. "141": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab140. A figura 35 mostra a actividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa normal e saudável, o "dador D" no ensaio para a actividade de vários anticorpos monoclonais de murganho anti-AILIM humana para a transdução do sinal co-estimulador, quando se adiciona apenas uma solução de anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana (em fase liquida) numa microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 humana. O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H]timidina como um indice do grau de proliferação celular e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana.
Nesta figura, "JHC1" indica o resultado do ensaio em que o anticorpo monoclonal anti-CETP humana foi utilizado como controlo negativo, em vez do anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana. A figura 36 mostra a actividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa normal e saudável, o "dador D" no ensaio para a actividade de vários anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana para a transdução do 47 sinal co-estimulador, quando se adiciona apenas uma solução de anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana (em fase liquida) a uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 humana. 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H]timidina como um indice do grau de proliferação celular e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Nesta figura, "anti-HML" indica o resultado do ensaio em que o anticorpo monoclonal anti-HML humana foi utilizado como controlo negativo, em vez do anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Outras notações são as seguintes: "124": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl24. "125": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl25. "126": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl2 6. A figura 37 mostra a actividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa normal e saudável, o "dador D" no ensaio para a actividade de vários anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana para a transdução do sinal co-estimulador, quando se adiciona apenas uma solução de anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana (em fase liquida) a uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 humana. 48 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [ H] timidina como um indice do grau de proliferação celular e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Nesta figura, "anti-HML" indica o resultado do ensaio em que o anticorpo monoclonal anti-HML humana foi utilizado como controlo negativo, em vez do anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Outras notações são as seguintes: "128": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl2 8. "135": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl35. "136": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl36. A figura 38 mostra a actividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa normal e saudável, o "dador D" no ensaio para a actividade de vários anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana para a transdução do sinal co-estimulador, quando se adiciona apenas uma solução de anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana (em fase liquida) a uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 humana. 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação o celular de [ H] timidina como um indice do grau de proliferação celular e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana. 49
Nesta figura, "anti-HML" indica o resultado do ensaio em que o anticorpo monoclonal anti-HML humana foi utilizado como controlo negativo, em vez do anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Outras notações são as seguintes: "137": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl37. "138": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl38. "139": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl39. A figura 39 mostra a actividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa normal e saudável, o "dador D" no ensaio para a actividade de vários anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana para a transdução do sinal co-estimulador, quando se adiciona apenas uma solução de anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana (em fase liquida) a uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 humana. 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação o celular de [ H] timidina como um indice do grau de proliferação celular e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Nesta figura, "anti-HML" indica o resultado do ensaio em que o anticorpo monoclonal anti-HML humana foi utilizado como controlo negativo, em vez do anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana. 50
Outras notações são as seguintes: "140": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl40. "141": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab140. A figura 40 mostra a quantidade de IFN γ produzida no sobrenadante da cultura de células T derivadas de uma pessoa normal e saudável "dador B", que foram cultivadas em microplacas revestidas com anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana em conjunto com o anticorpo monoclonal anti-CD3 humana. O eixo vertical indica a concentração de IFN γ e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana.
Nesta figura, "JHC1" indica o resultado do ensaio em que o anticorpo monoclonal anti-CETP humana foi utilizado como controlo negativo, em vez do anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana. A figura 41 mostra a quantidade de IFN γ produzida no sobrenadante da cultura de células T derivadas de uma pessoa normal e saudável "dador B", que foram cultivadas em microplacas revestidas com anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana em conjunto com o anticorpo monoclonal anti-CD3 humana. O eixo vertical indica a concentração de IFN γ e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana. 51
Nesta figura, "anti-HML" indica o resultado do ensaio em que o anticorpo monoclonal anti-HML humana foi utilizado como controlo negativo, em vez do anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana. A figura 42 mostra a quantidade de IFN γ produzida no sobrenadante da cultura de células T derivadas de uma pessoa normal e saudável "dador B", que foram cultivadas em microplacas revestidas com anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana em conjunto com o anticorpo monoclonal anti-CD3 humana. 0 eixo vertical indica a concentração de IFN γ e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana.
Nesta figura, "anti-HML" indica o resultado do ensaio em que o anticorpo monoclonal anti-HML humana foi utilizado como controlo negativo, em vez do anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana. A figura 43 mostra a quantidade de IFN γ produzida no sobrenadante da cultura de células T derivadas de uma pessoa normal e saudável "dador C", que foram cultivadas em microplacas revestidas com anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana em conjunto com o anticorpo monoclonal anti-CD3 humana. 0 eixo vertical indica a concentração de IFN γ e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana.
Nesta figura, "JHC1" indica o resultado do ensaio em que o anticorpo monoclonal anti-CETP humana foi utilizado 52 como controlo negativo, em vez do anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana. A figura 44 mostra a quantidade de IFN γ produzida no sobrenadante da cultura de células T derivadas de uma pessoa normal e saudável "dador C", que foram cultivadas em microplacas revestidas com anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana em conjunto com o anticorpo monoclonal anti-CD3 humana. 0 eixo vertical indica a concentração de IFN γ e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana.
Nesta figura, "anti-HML" indica o resultado do ensaio em que o anticorpo monoclonal anti-HML humana foi utilizado como o controlo negativo, em vez do anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Outras notações são as seguintes: "124": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl24. "125": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl25. "126": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl2 6. A figura 45 mostra a quantidade de IFN γ produzida no sobrenadante da cultura de células T derivadas de uma pessoa normal e saudável "dador C", que foram cultivadas em microplacas revestidas com anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana em conjunto com o anticorpo monoclonal anti-CD3 humana. 53 0 eixo vertical indica a concentração de IFN γ e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana.
Nesta figura, "anti-HML" indica o resultado do ensaio em gue o anticorpo monoclonal anti-HML humana foi utilizado como controlo negativo, em vez do anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Outras notações são as seguintes: "128": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl28. "135": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl35. "136": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl36. A figura 46 mostra a guantidade de IFN γ produzida no sobrenadante da cultura de células T derivadas de uma pessoa normal e saudável "dador C", que foram cultivadas em microplacas revestidas com anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana em conjunto com o anticorpo monoclonal anti-CD3 humana. 0 eixo vertical indica a concentração de IFN γ e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana.
Nesta figura, "anti-HML" indica o resultado do ensaio em que o anticorpo monoclonal anti-HML humana foi utilizado como controlo negativo, em vez do anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana. 54
Outras notações são as seguintes: "137": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl37. "138": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl38. "139": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl39. A figura 47 mostra a quantidade de IFN γ produzida no sobrenadante da cultura de células T derivadas de uma pessoa normal e saudável "dador C", que foram cultivadas em microplacas revestidas com anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana de murganho em conjunto com o anticorpo monoclonal anti-CD3 humana. 0 eixo vertical indica a concentração de IFN γ e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana.
Nesta figura, "anti-HML" indica o resultado do ensaio em que o anticorpo monoclonal anti-HML humana foi utilizado como controlo negativo, em vez do anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Outras notações são as seguintes: "140": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl40. "141": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl40. A figura 48 mostra o efeito inibidor na proliferação de células T no caso de culturas de células T de uma pessoa 55 normal e saudável, "dador A", com CMSP de uma pessoa normal e saudável "dador D" por meio de várias amostras de ensaio no ensaio de proliferação de células T através das reacções mistas de linfócitos (RML). 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H]timidina como um indice que mostra o nivel de proliferação de células e o eixo horizontal mostra a concentração das amostras do ensaio.
Cada descrição, nas figures, mostra o seguinte. "CD80 + 86": A mistura de anticorpo anti-CD80 e do anticorpo anti-CD86 "mlgGl": Anticorpo monoclonal de murganho antiCD34/IgGl humana. "LTCA4-Ig": Molécula quimérica humana de LTCA4-IgFc "SA12": anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana. A figura 49 mostra o efeito inibidor na proliferação de células T no caso de culturas de células T de uma pessoa normal e saudável "dador A", com CMSP de uma pessoa normal e saudável "dador D" por meio de vários anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM no ensaio de proliferação das células T, através das reacções mistas de linfócitos (RML). 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H]timidina como um indice que mostra o nivel de Proliferação de células e o eixo horizontal mostra a concentração das amostras do ensaio.
Outras notações são as seguintes: "Anti-HML": anticorpo monoclonal humano anti-HML como controlo negativo. 56 "JMab-124" :
Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl24. "126": JMabl2 6. Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana "127": JMabl27. Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana "128": JMabl2 8. Anticorpo monoclonal humano danti-AILIM humana "135" : JMabl35. Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana "136": JMabl36. Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana "137": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl37. A figura 50 mostra o efeito inibidor na proliferação de células T no caso de culturas de células T de uma pessoa normal e saudável, "dador D", com CMSP de uma pessoa normal e saudável, "dador B", por meio de várias amostras de ensaio no ensaio de proliferação de células T através das reacções mistas de linfócitos (MLR). O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [ H] timidina como um indice que mostra o nivel de Proliferação de células e o eixo horizontal mostra a concentração das amostras do ensaio.
Cada descrição, nas figures, mostra o seguinte. "CD80 + 86": Mistura de anticorpo anti-CD80 e anticorpo anti-CD8 6 "mlgGl": Anticorpo monoclonal de murganho antide CD34/IgGl humana. "LTCA4-Ig": Molécula quimérica humana de LTCA4-IgFc 57
"SA12": anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana. A figura 51 mostra o efeito inibidor na proliferação de células T no caso de culturas de células T de uma pessoa normal e saudável, "dador D", com CMSP de uma pessoa normal e saudável, "dador B", por meio de vários anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM no ensaio de proliferação das células T através das reacções mistas de linfócitos (RML). 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [ H] timidina como um indice que mostra o nivel de proliferação de células e o eixo horizontal mostra a concentração das amostras do ensaio.
Outras notações são as seguintes: "Anti-HML": anticorpo monoclonal humano anti-HML como controlo negativo.
"JMab-124": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl24. "126": JMabl2 6. Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana "12 7" JMabl27. anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana "128": JMabl28. Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana "135": JMabl35. Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana "136": JMabl36. Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana "137": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab137. 58 A figura 52 mostra o efeito inibidor na proliferação de células T no caso de culturas de células T de uma pessoa normal e saudável, "dador C", com CMSP de uma pessoa normal e saudável, "dador A", por meio de várias amostras de ensaio no ensaio de proliferação de células T através das reacções mistas de linfócitos (MLR). 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H]timidina como um indice que mostra o nivel de proliferação de células e o eixo horizontal mostra a concentração das amostras do ensaio.
Cada descrição, nas figures, mostra o seguinte. "CD80 + 86": Mistura de anticorpo anti-CD80 e anticorpo anti-CD8 6 "mlgGl": Anticorpo monoclonal de murganho anti CD34/IgGl humana. "LTCA4-Ig": Molécula quimérica humana de LTCA4-IgFc
"SA12": anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana. A figura 53 mostra o efeito inibidor na proliferação de células T no caso de culturas de células T de uma pessoa normal e saudável, "dador C", com CMSP de uma pessoa normal e saudável, "dador A", por meio de vários anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM no ensaio de proliferação das células T através das reacções mistas de linfócitos (RML). 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [ H] timidina como um indice que mostra o nível de proliferação de células e o eixo horizontal mostra a concentração das amostras do ensaio. 59
Outras notações são as seguintes: "anti-HML": anticorpo monoclonal humano anti-HML como controlo negativo.
"JMab-124": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl24. "126": JMabl2 6. Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana "127": JMabl27. Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana "128": JMabl2 8. Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana "135": JMabl35. Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana "136": JMabl36. Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana "137": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl37. A figura 54 mostra o efeito inibidor na proliferação de células T no caso de culturas de células T de uma pessoa normal e saudável, "dador E", com CMSP de uma pessoa normal e saudável, "dador G", por meio de várias amostras de ensaio, no ensaio de proliferação de células T através das reacções mistas de linfócitos (RML). 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H]timidina como um índice que mostra o nível de proliferação de células e o eixo horizontal mostra a concentração das amostras do ensaio.
Cada descrição, nas figures, mostra o seguinte. "mlgG de controlo": Anticorpo monoclonal de murganho anti-CD34/IgGl humano. "CD80 + 86": A mistura do anticorpo anti- 60 CD80 e do anticorpo anti-CD86 "SA12": Anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana "LTCA4-Ig": Molécula quimérica de LTCA4-IgFc humana. A figura 55 mostra o efeito inibidor, na proliferação de células T, no caso de culturas de células T de uma pessoa normal e saudável, "dador E", com CMSP de uma pessoa normal e saudável, "dador G", por meio de vários anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana, no ensaio de proliferação das células T através das reacções mistas de linfócitos (RML). 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H]timidina como um indice que mostra o nível de proliferação de células e o eixo horizontal mostra a concentração das amostras do ensaio.
Outras notações são as seguintes: "Anti-HML": anticorpo monoclonal humano anti-HML como controlo negativo.
"JMab-136": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl36. "138": Anticorpo monoclonal humano danti-AILIM humana JMabl38. "139": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl39. "140": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl40. "141": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl40. A figura 56 mostra o efeito inibidor na proliferação de células T, no caso de culturas de células T de uma 61 pessoa normal e saudável, "dador F", com CMSP de uma pessoa normal e saudável, "dador E", por meio de várias amostras de ensaio, no ensaio de proliferação de células T através das reacções mistas de linfócitos (RML). 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H]timidina como um indice que mostra o nivel de proliferação de células e o eixo horizontal mostra a concentração das amostras do ensaio.
Cada descrição, nas figures, mostra o seguinte. "mlgG de controlo": Anticorpo monoclonal de murganho anti-CD34/IgGl humano. "CD80 + 86 Ac": A mistura do anticorpo anti-CD80 e do anticorpo anti-CD86 "SA12": Anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana "LTCA4-Ig": Molécula quimérica humana de LTCA4-IgFc A figura 57 mostra o efeito inibidor na proliferação de células T, no caso de culturas de células T de uma pessoa normal e saudável, "dador F", com CMSP de uma pessoa normal e saudável, "dador E", por meio de várias amostras de ensaio, no ensaio de proliferação de células T através das reacções mistas de linfócitos (RML). 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H]timidina como um indice que mostra o nivel de proliferação de células e o eixo horizontal mostra a concentração das amostras do ensaio.
Cada descrição, nas figures, mostra o seguinte. "Anti-HML": anticorpo monoclonal humano anti-HML como controlo negativo. 62
"JMab-136": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl36. "138": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl38. "139": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl39. "140": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl40. "141": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl40. A figura 58 mostra o efeito inibidor, na proliferação de células T, no caso de culturas de células T de uma pessoa normal e saudável, "dador G", com CMSP de uma pessoa normal e saudável, "dador F", por meio de várias amostras de ensaio, no ensaio de proliferação de células T através das reacções mistas de linfócitos (RML). O eixo vertical indica a quantidade de incorporação de [3H]timidina como um indice que mostra o nivel de proliferação celular e o eixo horizontal mostra a concentração das amostras de ensaio.
Cada descrição, nas figures, mostra o seguinte. "IgGm de controlo": Anticorpo monoclonal de murganho anti-CD34/IgGl humano "Ac CD80 + 86": A mistura de anticorpo anti-CD80 e anticorpo anti-CD86 "SA12": Anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana "LTCA4-Ig": Molécula quimérica de LTCA4-IgFc humana 63 A figura 59 mostra o efeito inibidor, na proliferação de células T, no caso de cultura de células T de uma pessoa normal e saudável, o "dador G", com CMSP de uma pessoa normal e saudável, "dador F", por meio de várias amostras de ensaio, no ensaio de proliferação das células T, através da reacção mista de linfócitos (RML). 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação de [3H]timidina como um índice que mostra o nível de proliferação celular e o eixo horizontal mostra a concentração das amostras de ensaio.
Cada descrição, nas figures, mostra o seguinte. "Anti-HML": Anticorpo monoclonal anti-HML humano como controlo negativo. "AcJM-136": Anticorpo monoclonal anti-AILIM humana acJMl36. "138": Anticorpo monoclonal anti-AILIM humana acJM138. "139": Anticorpo monoclonal anti-AILIM humana acJM139. "140": Anticorpo monoclonal anti-AILIM humana acJM140. "141": Anticorpo monoclonal anti-AILIM humana acJM141. A figura 60 mostra o efeito inibidor de diferentes substâncias de controlo do ensaio na proliferação de células T no ensaio utilizando a reacção mista de linfócitos (RML). Fez-se uma co-cultura de células T de uma pessoa normal e saudável. "Dador A", com CMSPs de uma pessoa normal e saudável, "dador D", submetidos a uma pré-cultura na presença de moléculas quiméricas de LTCA4-Ig humana. O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [ H] timidina como um índice do grau de 64 proliferação celular e o eixo horizontal indica as concentrações das substâncias do ensaio.
Cada descrição, nas figures, mostra o seguinte. "CD80 + 86": A mistura de anticorpo anti-CD80 e anticorpo anti-CD86 "mlgGl": Anticorpo monoclonal de murganho anti- CD34/IgGl humana "SA12": Anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana. A figura 61 mostra o efeito inibidor de diferentes anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana na proliferação de células T, no ensaio utilizando a reacção mista de linfócitos (RML) . As células T de uma pessoa normal e saudável, "dador A" foram co-cultivadas com CMSPs de uma pessoa normal e saudável, "dador D", pré-cultivadas na presença de moléculas quiméricas de LTCA4-Ig humanos. 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H]timidina como um indice do grau de proliferação celular e o eixo horizontal indica as concentrações das substâncias de ensaio.
Outras notações são as seguintes: "anti-HML": Anticorpo monoclonal anti-HML humano como controlo negativo.
"AcJM-124": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana acJMl24. "126": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana acJM12 6. 65 "127":
Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana acJM127. "128": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana acJM12 8. "135": Anticorpo monoclonal anti-AILIM humana acJM135. "136": Anticorpo monoclonal anti-AILIM humana acJM136. "137": Anticorpo monoclonal anti-AILIM humana acJM137. A figura 62 mostra o efeito inibidor de diferentes substâncias de controlo do ensaio na proliferação de células T, no ensaio utilizando a reacção mista de linfócitos (RML). Fez-se uma co-cultura de células T de uma pessoa normal e saudável "dador D", com CMSPs de uma pessoa normal e saudável, "dador B" submetidos a uma pré-cultura na presença de moléculas quiméricas de LTCA4-Ig humana. 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [ H] timidina como um índice do grau de proliferação celular e o eixo horizontal indica as concentrações das substâncias do ensaio.
Cada descrição, nas figuras, mostra o seguinte. "CD80 + 86": A mistura de anticorpo anti-CD80 e anticorpo anti-CD86 "mlgGl": Anticorpo monoclonal de murganho anti- CD34/IgGl humana "SA12": Anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana. A figura 63 mostra o efeito inibidor de diferentes anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana na proliferação de células T, num ensaio utilizando a reacção mista de linfócitos (RML) . As células T de uma pessoa 66 normal e saudável, "dador D", foram co-cultivadas com CMSPs de uma pessoa normal e saudável, "dador B", pré-cultivadas na presença de moléculas quiméricas de LTCA4-Ig humanas. 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H]timidina como um indice do grau de proliferação celular e o eixo horizontal indica as concentrações das substâncias de ensaio.
Outras notações são as seguintes: "Anti-HML": Anticorpo monoclonal anti-HML humano como ontrolo negativo.
"AcJM-124": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana acJM124. "126": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana acJM12 6. "127": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana acJM127. "128": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana acJM128. "135": Anticorpo monoclonal anti-AILIM humana acJM135. "136": Anticorpo monoclonal anti-AILIM humana acJM136. "137": Anticorpo monoclonal anti-AILIM humana acJM137. A figura 64 mostra o efeito inibidor de diferentes substâncias de controlo do ensaio na proliferação de células T, no ensaio utilizando a reacção mista de linfócitos (RML). Fez-se uma co-cultura de células T de uma pessoa normal e saudável, "dador C", com CMSPs de uma pessoa normal e saudável, "dador A", submetidas a uma pré-cultura, na presença de moléculas quiméricas de LTCA4-Ig humana. 67 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H] timidina como um indice do grau de proliferação celular e o eixo horizontal indica as concentrações das substâncias do ensaio.
Cada descrição, nas figures, mostra o seguinte. "CD80 + 86": A mistura de anticorpo anti-CD80 e anticorpo anti-CD86 "mlgGl": Anticorpo monoclonal de murganho anti- CD34/IgGl humana "SA12": Anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana A figura 65 mostra o efeito inibidor de diferentes anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana na proliferação de células T, no ensaio utilizando a reacção mista de linfócitos (RML) . As células T de uma pessoa normal e saudável, "dador C" foram co-cultivadas com CMSPs de uma pessoa normal e saudável, "dador A", pré-cultivadas na presença de moléculas quiméricas de LTCA4-Ig humanas. 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H] timidina como um indice do grau de proliferação celular e o eixo horizontal indica as concentrações das substâncias do ensaio.
Outras notações são as seguintes: "Anti-HML": Anticorpo monoclonal anti-HML humano como controlo negativo.
"AcJM-124": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana acJM124. 68 "126":
Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana acJM12 6. "127": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana acJM127. "128": Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana acJM128. "135": Anticorpo monoclonal anti-AILIM humana acJM135. "136": Anticorpo monoclonal anti-AILIM humana acJM136. "137": Anticorpo monoclonal anti-AILIM humana acJM137. A figura 66 mostra o efeito inibidor de diferentes substâncias de controlo do ensaio na proliferação de células T, num ensaio utilizando a reacção mista de linfócitos (RML). Fez-se uma co-cultura de células T de uma pessoa normal e saudável, "dador E", com CMSPs de uma pessoa normal e saudável, "dador G", submetidas a uma pré-cultura, na presença de moléculas quiméricas de LTCA4-Ig humana. 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H]timidina como um índice do grau de proliferação celular e o eixo horizontal indica as concentrações das substâncias de ensaio.
Cada descrição, nas figures, mostra o seguinte. "IgGm de controlo": Anticorpo monoclonal de murganho anti-CD34/IgGl humana "Ac CD80 + 86": A mistura de anticorpo anti-CD80 e anticorpo anti-CD86 "SA12": Anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana 69 A figura 67 mostra o efeito inibidor de diferentes anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana na proliferação de células T, no ensaio utilizando a reacção mista de linfócitos (RML) . As células T de uma pessoa normal e saudável, "dador E", foram co-cultivadas com CMSPs de uma pessoa normal e saudável, "dador G", pré-cultivadas, na presença de moléculas quiméricas de LTCA4-Ig humanas. 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [ H] trmidina como um indice do grau de proliferação celular e o eixo horizontal indica as concentrações das substâncias de ensaio.
Outras notações são as seguintes: "Anti-HML": Anticorpo monoclonal anti-HML humano como controlo negativo. "AcJM-136": Anticorpo monoclonal anti-AILIM humana acJM136. "138": Anticorpo monoclonal anti-AILIM humana acJM138. "139": Anticorpo monoclonal anti-AILIM humana acJM139. "140": Anticorpo monoclonal anti-AILIM humana acJM140. "141": Anticorpo monoclonal anti-AILIM humana acJM141. A figura 68 mostra o efeito inibidor de diferentes substâncias de controlo do ensaio na proliferação de células T no ensaio utilizando a reacção mista de linfócitos (RML). As células T de uma pessoa normal e saudável, "dador G" foram co-cultivadas com CMSPs de uma pessoa normal e saudável, "dador F", pré-cultivadas na presença de moléculas quiméricas de LTCA4-Ig humanas. O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [ H] timidina como um indice do grau de 70 proliferação celular e o eixo horizontal indica as concentrações das substâncias de ensaio.
Cada descrição, nas figures, mostra o seguinte. "IgGm de controlo": Anticorpo monoclonal de murganho anti-CD34/IgGl humana "Ac CD80 + 86": A mistura de anticorpo anti-CD80 e anticorpo anti-CD86 "SA12": Anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana A figura 69 mostra o efeito inibidor de diferentes anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana na proliferação de células T, no ensaio utilizando a reacção mista de linfócitos (RML) . As células T de uma pessoa normal e saudável, "dador G" foram co-cultivadas com CMSPs de uma pessoa normal e saudável, "dador F", pré-cultivadas na presença de moléculas quiméricas de LTCA4-Ig humanas. 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [ H] timidina como um indice do grau de proliferação celular e o eixo horizontal indica as concentrações das substâncias de ensaio.
Outras notações são as seguintes: "Anti-HML": Anticorpo monoclonal anti-HML humano como controlo negativo. "AcJM-136": Anticorpo monoclonal anti-AILIM humana acJM136. "138": Anticorpo monoclonal anti-AILIM humana acJM138. "139": Anticorpo monoclonal anti-AILIM humana acJM139. "140": Anticorpo monoclonal anti-AILIM humana acJM140. 71 "141": anticorpo monoclonal anti-AILIM humana acJM141. A figura 70 mostra a actividade que induz ADCC de vários anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana e anticorpos de controlo em que se utilizaram células de OHC de tipo selvagem como células-alvo. O eixo vertical indica a taxa de citotoxicidade causada pela actividade que induz ADCC do anticorpo e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo. A figura 71 mostra a actividade que induz ADCC, de vários anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana e o anticorpo de controlo em que se utilizaram, como células-alvo, células recombinantes de OHC que sobre-expressam AILIM. O eixo vertical indica a frequência de danos nas células resultantes da actividade do anticorpo que induz ADCC e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo. A figura 72 mostra o efeito inibidor do anticorpo anti-AILIM na alergia tardia. O eixo vertical indica a dimensão da vermelhidão medida como um indice de aparecimento de alergia tardia e o eixo horizontal indica o tipo de amostra de ensaio dada a indivíduos animais. A figura 73 mostra a actividade de proliferação de células T de macaco num ensaio para determinar a actividade de vários anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana para a transdução co-estimuladora de sinal, utilizando uma 72 microplaca revestida com anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana em conjunto com o anticorpo monoclonal anti-CD3 humana. 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H]timidina como um indice do grau de proliferação celular e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Nesta figura, "anti-HML" indica o resultado do ensaio em que se utilizou o anticorpo monoclonal humano anti-HML como controlo negativo, em vez do anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana. A figura 74 mostra a actividade inibidrora do anticorpo do controlo negativo contra a ligação entre ligandos solúveis de AILIM (hB7h - IgFc) e AILIM solúvel (AILIM - IgFc) em várias concentrações. 0 eixo vertical indica a densiade óptica como um indice para a actividade inibidora e o eixo horizontal indica a concentração de AILIM solúvel. A figura 75 mostra a actividade inibidora do anticorpo anti-AILIM contra a ligação entre ligandos solúveis de AILIM (hB7h - IgFc) e AILIM solúvel (AILIM - IgFc) em várias concentrações. 0 eixo vertical indica absorvência como um indice para a actividade inibidora e o eixo horizontal indica a concentração de AILIM solúvel. A figura 76 mostra a actividade inibidora de anticorpos anti-AILIM, em diferentes concentrações, contra 73 a ligação entre ligandos solúveis de AILIM (hB7h-IgFc) e AILIM solúvel (AILIM-IgFc). 0 eixo vertical indica a densidade óptica como um indice para a actividade inibidora e o eixo horizontal indica a concentração de AILIM solúvel. A figura 77 mostra a actividade inibidora de vários anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana em relação à proliferação de células T humanas no ensaio para determinar a actividade de transdução coestimuladora de sinal utilizando uma microplaca revestida com ligante de AILIM humana solúvel (hB7h - IgFc), juntamente com anticorpo monoclonal humano anti-CD3. 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H]timidina como um indicador do grau de proliferação celular e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpos. A figura 78 mostra a actividade inibidora de vários anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana, em relação à proliferação de células T de macaco, no ensaio para determinar a actividade de transdução de sinal co-estimulador utilizando uma microplaca revestida com ligando DE AILIM humana solúvel (hB7h - IgFc), em conjunto com o anticorpo monoclonal humano anti-CD3. 0 eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H]timidina como um indicador do grau de proliferação celular e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpos. 74
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção está descrita em detalhe a seguir, definindo-se as terminologias da presente invenção.
Aqui, "mamífero" significa ser humano, bovino, caprino, coelho, murganho, rato, hamster e porquinho-da-índia; preferido é ser humano, coelho, rato, hamster ou murganho e, particularmente preferido é ser humano, rato, hamster ou murganho.
As expressões "mamíferos diferentes de seres humanos" e "mamíferos não humanos" aqui utilizadas são sinónimas uma da outra, significando todos os outros mamíferos que não os seres humanos definidos antes. 0 termo "aminoácidos" aqui utilizado significa todos os aminoácidos existentes na natureza, de preferência aqueles descritos de acordo com o sistema alfabético de três letras ou o sistema de letra única conforme se mostra a seguir: glicina (Gli/G), alanina (Ala/A), valina (Val/V), leucina (Leu/L), isoleucina (Ile/I), serina (Ser/S), treonina (Tre/T), ácido aspártico (Asp/D), ácido glutâmico (Glu/E), asparagina (Asn/N) , glutamina (Gln/Q), lisina (Lis/K), arginina (Arg/R), cistena (Cis/C), metionina (Met/M), fenilalanina (Fen/F), tirosina (Tir/I), triptofano (Trp/W), histidina (His/H), prolina (Pro/P). 0 termo "AILIM" aqui utilizado é a abreviatura para molécula imunomoduladora de linfócitos indutíveis por activação, indicando uma molécula da superfície das células de mamíferos com a estrutura e a função já descritas num 75 relatório anterior, de preferência uma AILIM derivada de um ser humano, em particular (por exemplo, International Immunology, vol. 12, No. 1, p.51-55; número de acesso no GenBank: BAA82129 (humano), BAA82128 (rato), BAA82127 (variante do rato) e BAA82126 (murganho)).
Em alternativa, esta AILIM também é referida como COEI (pedido de patente japonesa publicada e não examinada (JP-A) n°. Hei 11-29599, pedido de patente internacional n° W098/38216) e estas abreviaturas indicam a mesma molécula. "Ligando de AILIM" utilizado aqui significa uma molécula da superfície celular que interage com a referida molécula co-estimuladora AILIM (COEI) e é referida como B7h, B7RP-1, GL50 ou LICOS (Nature, vol. 402, No. 6763, p.827 -832, 1999; Nature Medicine, vol. 5, n. 12, p.1365-1369, 1999; J. Immunology, vol. 164, p.1653-1657, 2000; Curr. Biol. Vol. 10, No. 6, p.333-336, 2000).
Além disso, "AILIM", aqui utilizada, também inclui um polipéptido tendo praticamente £ i mesma sequência de aminoácidos que a AILIM de cada mamífero descrito nas referências e, em particular, de preferência, a AILIM humana. Além disso, uma variante da AILIM humana que é semelhante à variante de AILIM de rato, já referida (número de acesso no GenBan: BAA82127) também está incluída na "AILIM" da presente invenção. "Ligando de AILIM", aqui utilizado, é também definido com o mesmo significado citado antes.
Aqui, "polipéptidos tendo uma sequência de aminoácidos praticamente idêntica" significa variantes de polipéptidos tal como se descrevem a seguir. 76
Ou seja, desde que estas variantes de polipéptidos tenham propriedades biológicas praticamente equivalentes à AILIM do tipo natural (preferencialmente e particularmente a AILIM de origem humana), os polipéptidos fazem parte da presente invenção. Como os que têm sequências de aminoácidos como AILIM do tipo natural, na qual vários resíduos de aminoácidos, de preferência 1-10 resíduos de aminoácidos, mais preferivelmente 1 a 5 resíduos de aminoácidos foram eliminados e/ou modificados e às quais se adicionam vários resíduo de aminoácidos, de preferência 1 a 10 resíduos de aminoácidos, mais preferivelmente 1 a 5 resíduos de aminoácidos.
Além disso, podem ser variantes de polipéptidos com várias destas substituições, eliminações, alterações e adições de resíduos de aminoácidos na molécula. "Ligante de AILIM", na presente invenção, também é definido como tendo um significado semelhante ao citado antes. A AILIM (especialmente AILIM humana) e o ligante de AILIM (sobretudo ligante de AILIM humana), na presente invenção, podem ser preparados, para além da técnica de recombinação genética, pela utilização apropriada de processos conhecidos neste domínio técnico, como processo de síntese química, processo de cultura celular, etc. ou estes processos com modificações.
Essa substituição, eliminação ou inserção de aminoácidos pode ser feita de acordo com o método usual (Experimental Medicine: suplemento " Handbook of Genetic Engineering" (1992); etc.). 77
Exemplos de processos utilizados para a produção de polipéptidos mutantes, como mencionado antes, são a mutagénese dirigida ao sitio de oligonucleótidos sintéticos (processo duplamente aberto), mutagénese pontual em que se introduz uma mutação num ponto, aleatoriamente, por meio do tratamento com nitrito ou sulfito, processo por meio do qual se prepara um mutante de eliminação com uma enzima Bal31 e similares, mutagénese por cassete, processo de rastreio do ligante, processo por falta de incorporação, processo de iniciador desemparelhado, processo de sintese de segmentos de ADN, etc. A mutagénese dirigida ao sitio de oligonucleótidos sintéticos (processo duplamente aberto) pode ser realizada, por exemplo, como se segue. A região que se deseja mutagenizada é clonada no vector de fago M13 com uma mutação de âmbar para preparar o ADN do fago de hélice simples. Depois de se linearizar o ADN de RF I do vector M13 sem a mutação de âmbar, por meio do tratamento com enzimas de restrição, mistura-se o ADN com o ADN do fago de hélice simples mencionado antes, desnatura-se e hibrida-se, formando-se assim "ADN de hélice dupla com intervalos" Um oligonucleótido sintético em que as mutações são introduzidas é hibridado com o ADN de hélice dupla com intervalos e preparam-se os ADNs de hélice dupla fechados em circulo por meio da reacção com ADN polimerase e ADN ligase. Com este ADN transfectam-se células MutS de E. coli, deficientes na actividade de reparação do desemparelhamento. As células de E. coli sem actividade supressora são infectadas com os fagos crescidos, e só os fagos sem mutação de âmbar são rastreados. 0 processo pelo qual se introduz uma mutação pontual com nitrito utiliza, por exemplo, o principio mencionado a 78 seguir. Se o ADN é tratado com nitrito, as bases são desaminadas para mudar adenina para hipoxantina, citosina para uracilo e guanina para xantina. Se se introduz o ADN desaminado nas células, "A:T" e "G:C" são substituídos por "G:C" e "A:T", respectivamente, porque hipoxantina, uracilo e xantina formam um par de bases com citosina, adenina e timina, respectivamente, na replicação do ADN. Nesse momento, os fragmentos de ADN de hélice simples tratados com nitrito hibridam com o "ADN duplamente aberto" e, posteriormente, as estirpes mutantes são separadas por manipulação, da mesma forma que na mutagénese dirigida ao sítio dos oligonucleótidos sintéticos (processo duplamente aberto).
Além disso, "AILIM" também inclui aqui "uma porção" da referida AILIM. Aqui, "uma porção" significa um polipéptido compreendendo qualquer sequência parcial da sequência de aminoácidos de AILIM definida antes.
Preferivelmente, a referida porção indica a região extracelular da AILIM definida antes (de preferência, particularmente uma AILIM humana) ou qualquer parte dela. "Ligante de AILIM", na presente invenção também é definido de modo a ter um significado semelhante ao citado.
Uma "porção" da referida AILIM (de preferência a região extracelular da AILIM ou qualquer parte dela) pode ser preparada de acordo com processos bem conhecidos neste campo técnico, conforme se descreve a seguir ou de acordo com processos modificados pela técnica de recombinação genética ou processos de síntese química ou por clivagem adequada da AILIM (de preferência, particularmente uma 79 AILIM humana) isolada pelo processo de cultura celular utilizando enzimas proteolíticas, etc.
Uma "porção do ligando de AILIM" também pode ser preparada através de processos semelhantes aos descritos antes. "Anticorpo humano" da presente invenção é um anticorpo humano que se liga à AILIM definida antes ou a uma parte dela (de preferência, particularmente uma AILIM de origem humana ou uma parte dela). Especificamente, isso significa um anticorpo policlonal de origem humana (anticorpo policlonal humano, anti-soro humano) ou um anticorpo monoclonal de origem humana (anticorpo monoclonal humano). "Anticorpo monoclonal humano" da presente invenção é um anticorpo monoclonal humano que se liga à AILIM definida antes ou a uma parte dela (de preferência, particularmente uma AILIM de origem humana ou uma parte dela).
Mais especificamente, todas as regiões que abrangem as regiões variável e constante da cadeia pesada (cadeia P) e as regiões variável e constante de cadeia leve (cadeia L) consistem em imunoglobulina humana derivada do gene que codifica a referida imunoglobulina humana. A cadeia L é exemplificada pela cadeia humana κ ou pela cadeia humana λ. 0 anticorpo monoclonal humano que se liga a AILIM (de preferência, particularmente a uma AILIM de origem humana) da presente invenção ou a uma parte dela é um anticorpo monoclonal humano com caracteristicas definidas em qualquer um de (1) a (6) ou (25) mencionados antes. 80
Mais especificamente, inclui vários anticorpos monoclonais humanos com várias caracteristicas e aplicabilidade industrial, conforme descrito nos desenhos e nos exemplos a seguir. A modalidade preferida do anticorpo monoclonal humano da presente invenção é um anticorpo monoclonal humano que se liga a AILIM ou a parte dela, definido em qualquer um dos (1) a (6) ou (25) mencionados antes. A modalidade mais preferida é um anticorpo monoclonal humano que se liga a AILIM humana, conforme descrito em (1) ou (6) .
Um "anticorpo monoclonal humano", da presente invenção, pode ser preparado por imunização dos mamíferos transgénicos não humanos que se seguem, que produzem anticorpos humanos com qualquer um dos imunógenios (antigénios), descritos a seguir. (a) uma célula natural ou uma linha de células criada artificialmente que expressam as AILIM mencionadas antes (em especial, de preferência uma AILIM de origem humana) na superfície da célula; (b) uma célula recombinante genética preparada usando técnicas de recombinação genética, de modo a expressar a AILIM definida antes (de preferência, particularmente uma AILIM de origem humana) na superfície da célula; (c) um lisado de célula obtido por solubilização das células mencionadas antes em (a) ou (b) ou um fragmento de um polipéptido de AILIM (de preferência, particularmente uma AILIM de origem humana) purificado a partir do referido lisado celular; 81 (d) uma célula de recombinação genética preparada usando técnicas de recombinação genética de modo a expressar uma porção (em especial, de preferência na região extracelular ou qualquer um dos seus péptidos preferíveis) da AILIM definida antes (de preferência, particularmente uma AILIM de origem humana) como um polipéptido solúvel; (e) um sobrenadante de cultura obtido através da cultura das células de recombinação genética mencionadas antes em (d) ou um polipéptido da região extracelular (AILIM solúvel) de AILIM (de preferência, particularmente uma AILIM de origem humana) purificada a partir do referido sobrenadante da cultura; ou (f) uma porção (de preferência, particularmente a região extracelular ou qualquer um dos seus péptidos preferidos) de AILIM sintetizada quimicamente (em especial, de preferência uma AILIM de origem humana).
Além disso, os anticorpos monoclonais da presente invenção também podem ser obtidos a partir do sobrenadante da cultura por meio da cultura de um "hospedeiro de recombinação genética" [aqui, o referido hospedeiro é uma célula eucariótica, diferente dos óvulos fertilizados (de preferência células de mamíferos, tais como OHC, linfócitos e células de mieloma)], que pode ser preparada pela transformação de um hospedeiro com ADNcs (de preferência um vector contendo os referidos ADNcs) que codificam cada uma das cadeias pesadas e leves desse anticorpo monoclonal humano da presente invenção utilizando técnicas de recombinação genética e que produzem o anticorpo monoclonal humano recombinante.
Especificamente, o anticorpo monoclonal da presente invenção pode ser obtido através da cultura de um 82 hospedeiro de recombinação genética descrito num qualquer dos (22) a (24) mencionados antes, da presente invenção (aqui, o referido hospedeiro é uma célula eucariótica diferente de um óvulo fertilizado (de preferência células de mamíferos, tais como OHC, linfócitos e células de mieloma)).
Além disso, o anticorpo monoclonal humano da presente invenção pode ser um anticorpo monoclonal humano com qualquer isotipo pertencentes a IgG (IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4), IgH, IgA (IgAl e IgA2) , IgD ou IgE. Preferencialmente, o referido anticorpo monoclonal pertence a IgG (IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4), mais preferencialmente IgGl, IgG2 ou IgG4.
Um "anticorpo monoclonal humano" da presente invenção pode ser preparado imunizando os seguintes mamíferos transgénicos não humanos que produzem anticorpos humanos tal como o murganho transgénico que produz anticorpos humanos descritos a seguir, com qualquer um dos imunogénios (antigénios) mencionados antes em (a) até (f) de acordo com um processo de preparação utilizado vulgarmente.
Isto é, por exemplo, os referidos mamíferos transgénicos não humanos que produzem anticorpos humanos são imunizados com o referido antigénio em combinação com o adjuvante de Freund, conforme a exigência. Os anticorpos policlonais podem ser obtidos a partir de soros recolhidos dos referidos animais imunizados. 0 anticorpo monoclonal pode ser produzido através da preparação de células de fusão (hibridomas) a partir das referidas células produtoras de anticorpos, isoladas dos referidos animais imunizados e de células de mieloma sem capacidade de auto-produção de anticorpos e clonagem dos referidos hibridomas 83 para seleccionar um clone que produz o anticorpo monoclonal com uma afinidade especifica para o antigénio usado para imunizar o mamífero.
Mais especificamente, o anticorpo monoclonal pode ser preparado como se descreve a seguir. Ou seja, o referido mamífero transgénico não humano que produz anticorpos humanos (em especial, de preferência "murganhos transgénicos que produzem anticorpos humanos") é imunizado por meio de uma injecção de qualquer um dos imunógenios mencionados antes em (a) a (c) , por via intradérmica, intramuscular, intravenosa, na pata ou por via intraperitoneal, uma vez ou várias vezes ou transplantando o referido imunógenio para os referidos mamíferos. Normalmente, as imunizações são realizadas uma a quatro vezes todos os dias ou de catorze em catorze dias após a primeira imunização. As células produtoras dos anticorpos são obtidas a partir dos mamíferos assim imunizados, em cerca de 1 a 5 dias após a última imunização. A frequência e o intervalo das imunizações podem ser adequadamente arranjados, dependendo, por exemplo, das propriedades do imunogénio utilizado.
Os hibridomas que segregam um anticorpo monoclonal humano podem ser preparados pelo método de Kõhler e Milstein (Nature, Vol.256, pp.495-497 (1975)) e pelo seu método modificado. Nomeadamente, os hibridomas são preparados pela fusão de células produtoras de anticorpos contidas em baços, nódulos linfáticos, medula óssea ou amígdalas, obtidas a partir de mamíferos transgénico não humanos que produzem anticorpos humanos, imunizados conforme mencionado antes, de preferência um baço, com mielomas sem capacidade de produzir auto-anticorpos, que derivaram, de preferência, de um mamífero tal como 84 murganhos, ratos, cobaias, hamster, coelhos ou seres humanos ou, mais preferencialmente, um murganho, um rato ou um ser humano.
Por exemplo, pode-se utilizar mieloma derivado de murganho P3/X63-AG8.653 (ATCC n ° CRL-1580), P3/NSI/l-Ag4-l(NS-l), P3/X63-Ag8Ul(P3U1), SP2/0-AG14(Sp2/0,SP2), NSO, PAI, FO ou BW5147, mieloma derivado de rato 210RCY3-Ag.2.3. ou mieloma de origem humana U-266AR1, GM1500-6TG-A1-2, UC729-6, CEM-AGR, D1R11 ou CEM-T15 como o mieloma utilizado para a fusão celular.
As células produtoras de anticorpos monoclonais (por exemplo, hibridomas) podem ser rastreadas através da cultura de células, por exemplo, em placas microtituladoras, medindo a reactividade do sobrenadante da cultura no poço em que se observar o crescimento do hibridoma, com o imunogénio utilizado para a imunização mencionada antes, por exemplo, por imunoensaio enzimático como radioimunoensaio (RIA) e ensaio com imunodissolventes ligados a enzimas (ELISA).
Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos a partir de hibridomas através da cultura de hibridomas in vitro ou in vivo, como no fluido de ascite de murganho, rato, cobaia, hamster ou coelho, de preferência um murganho ou um rato, mais preferencialmente murganho e isolando os anticorpos a partir do sobrenadante da cultura resultante ou do fluido de ascite de um mamifero.
Os anticorpos monoclonais da presente invenção podem ser produzidos, em larga escala, através do seguinte processo: 85 (1) genes (ADNcs, etc) que codificam cada uma das cadeias pesadas e leves do referido anticorpo monoclonal são clonados a partir dos referidos hibridomas; (2) os genes clonados que codificam cada uma das cadeias pesadas e leves são inseridos em vectores separados ou num vector único para preparar o vector de expressão; (3) o referido vector de expressão é transferido para um óvulo fertilizado de um desejado mamífero não humano (tal como cabra); (4) o referido óvulo fertilizado transferido com o gene é transplantado para o útero de uma mãe adoptiva para se obter um animal quimérico não humano; (5) por meio de outro cruzamento da referida cabra quimérica com outro mamífero não humano, produz-se um mamífero transgénico não humano (bovinos, caprinos, ovinos e suínos) com genes que codificam cada uma das referidas cadeias pesadas e leves incorporadas no gene endógeno; e (6) a partir de leite do referido mamífero transgénico não humano, obtém-se, em larga escala, o anticorpo monoclonal derivado do referido gene do anticorpo monoclonal humano (Nikkei Science, Abril, 1997, p.78-84) . A cultura in vitro de células que produzem os anticorpos monoclonais pode ser realizada consoante, por exemplo, as propriedades das células a serem postas em cultura, o objecto de um estudo de ensaio e as diversas condições de um método de cultura, usando meios nutrientes de cultura conhecidos ou qualquer outro meio de nutrientes derivados de meios básicos conhecidos para o crescimento, 86 manutenção e armazenagem dos hibridomas para produzir anticorpos monoclonais no sobrenadante da cultura.
Exemplos de meios básicos são os meios com uma baixa concentração de cálcio, tais como meio Ham'F12, meio MCDB153 ou meio MEM com baixa concentração de cálcio e meios com alta concentração de cálcio, tais como meio MCDB104, meio MEM, meio D-MEM, meio RPMI1640, meio ASF104 ou meio RD. 0 meio básico pode conter, por exemplo, soros, hormonas, citocinas e/ou diversas substâncias orgânicas ou inorgânicas, consoante o objectivo.
Os anticorpos monoclonais podem ser isolados e purificados a partir do sobrenadante da cultura ou de fluido de ascites antes mencionados por precipitação com sulfato de amónio saturado, método de precipitação com euglobulina, processo do ácido capróico, processo do ácido caprilico, cromatografia de permuta iónica (DEAE ou DE52), cromatografia de afinidade utilizando a coluna de anti-imunoglobulina ou a coluna de proteina A. 0 anticorpo monoclonal da presente invenção inclui anticorpos monoclonais humanos que consistem na cadeia pesada e/ou na cadeia leve cuja sequência de aminoácidos, para cada cadeia, tem um ou mais resíduos de aminoácidos eliminados, substituídos ou adicionados.
Aqui, "mais resíduos de aminoácidos" significa uma pluralidade de aminoácidos, especificamente 1 a 10 resíduos de aminoácidos, de preferência 1 a 5 resíduos de aminoácidos.
Uma alteração parcial (eliminação, substituição, inserção ou adição), como descrito antes, pode ser 87 introduzida na sequência de aminoácidos do anticorpo monoclonal humano da presente invenção por alteração parcial da sequência de bases que codifica a referida sequência de aminoácidos. Esta alteração parcial da sequência de bases pode ser introduzida através de processos normalizados utilizando a técnica conhecida de mutagénese especifica do sitio (Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, Vol. 81, p.5662-5666, 1984).
Os "mamíferos não humanos transgénicos que produzem anticorpos humanos", particularmente murganhos transgénicos que produzem anticorpos humanos, que é uma modalidade preferida, podem ser preparados de acordo com a literatura (Nature Genetics, vol. 7, p.13-21, 1994; Nature Genetics, vol. 15, p.146-156, 1997; tradução japonesa publicada da publicação internacional No. Hei 4-504365; publicação da tradução japonesa publicada n ° Hei 7-509137; Nikkei Science, Junho, p.40-50, 1995; publicação da patente internacional No. W094/25585; Nature, vol. 368, p.856-859, 1994; e tradução japonesa publicada da publicação No. Hei 6-500233, etc.).
Especificamente, os referidos murganhos transgénicos que produzem os anticorpos humanos podem ser preparados, por exemplo, usando técnicas que consistem nos seguintes processos: (1) preparar um murganho nocaute cujo gene da cadeia pesada da imunoglobulina endógena está funcionalmente inactivado, por meio da substituição de pelo menos uma porção do locus do gene da cadeia pesada da imunoglobulina endógena de murganho com um gene marcador de tolerância a fármacos (como o gene de tolerância à neomicina) por recombinação homóloga; 88 (2) preparar um murganho nocaute cujo gene da cadeia leve da imunoglobulina endógena (particularmente o gene da cadeia k) está funcionalmente inactivado, por meio da substituição de pelo menos uma porção do locus do gene da cadeia leve da imunoglobulina endógena de murganho com um gene marcador de tolerância a fármacos (como o gene de tolerância à neomicina) por recombinação homóloga; (3) preparar um murganho transgénico cuja região desejada do locus do gene de cadeia pesada da imunoglobulina humana está incorporada no cromossoma do murganho usando um vector representado pelo cromossoma artificial de levedura (CAL), capaz de transportar um gene gigante; (4) preparar um murganho transgénico cuja região desejada do locus do gene de cadeia leve da imunoglobulina humana (em particular o gene da cadeia k) está incorporada no cromossoma do murganho usando um vector representado pelo cromossoma artificial de levedura (CAL), capaz de transportar um gene gigante; e (5) preparar um murganho transgénico cujos locus dos genes de cadeias pesadas e leves da imunoglobulina endógena estão funcionalmente inactivados e cujo cromossoma está incorporado nas regiões desejadas tanto dos locus dos genes de cadeias pesadas como dos de cadeias leves da imunoglobulina humana por nocaute e acasalamento dos murganhos transgénico referidos antes de (1) a (4) numa ordem arbitrária. 0 murganho de nocaute descrito antes pode ser preparado substituindo a região apropriada do locus do gene da imunoglobulina endógena do murganho com um gene marcador exógeno (como o gene de tolerância à neomicina ), com base na recombinação homóloga para inactivar o referido locus do 89 gene de modo a não ser reorganizado. Para a inactivação, utilizando a referida recombinação homóloga, pode-se utilizar, por exemplo, um processo referido como selecção positiva-negativa (SPN) (Nikkei Science, Maio, p.52-62, 1994). A inactivação funcional do locus do gene de cadeia pesada da imunoglobulina pode ser conseguida, por exemplo, pela introdução de uma lesão numa parte da região J ou C (por exemplo, a região Cp) . E a inactivação funcional da cadeia leve da imunoglobulina (por exemplo, a cadeia k) pode ser conseguida, por exemplo, pela introdução de uma lesão numa parte da região J ou C ou numa região que se estende da região J à região C.
Um rato transgénico pode ser preparado de acordo com o processo normalmente usado para produzir um animal transgénico (por exemplo, ver "Newest Manual of Animal Cell Experiment", LIC press, capitulo 7, pp.361-408, (1990)).
Especificamente, por exemplo, as células EE (células estaminais embrionárias) negativas para HPRT (deficiência do gene de hipoxantina-guanina-fosforibosiltransferase) derivadas de um blastócito normal de murganho fundem-se com levedura que contém o vector CAL inserido com o gene que codifica o referido locus do gene de cadeia pesada ou o locus do gene da cadeia leve de imunoglobulina humana ou uma parte dele e o gene de HPRT utilizando o processo de fusão de esferoplastos. As células EE cujo gene endógeno de murganho está integrado com o referido gene exógeno são seleccionadas pelo processo de selecção HAT. Em seguida, as células EE rastreadas são microinjectadas num óvulo fertilizado obtido a partir de outro murganho normal (blastocisto) (Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A., Vol.77,
No.12, pp.7380-7384 (1980); patente U. S. No. 4.873.191) O 90 blastocisto é transplantado para o útero de um outro murganho normal como a mãe adoptiva. Em seguida, os murganhos transgénicos quiméricos nascem da mãe adoptiva. Por meio de cruzamentos de murganhos transgénicos quiméricos com murganhos normais, obtêm-se murganhos transgénicos heterogénicos. Por meio de cruzamentos de murganhos transgénicos heterogénicos uns com os outros, obtêm-se murganhos transgénicos homogénicos, de acordo com as leis de Mendel. A parte "de um anticorpo monoclonal" utilizada na presente invenção significa uma região parcial do anticorpo monoclonal humano da presente invenção mencionado antes e inclui, especificamente, F(ab')2/ Fab', Fab, Fv (fragmento variável de anticorpo) , sFv , dsFv (Fv estabilizado com dissulfureto) ou Acd (anticorpo de domínio único) (Exp. Opine Ther. Patents, Vol.6, No.5, pp.441-456 (1996)). "F(ab')2" e "Fab'" podem ser produzidos pelo tratamento da imunoglobulina (anticorpo monoclonal) com uma protease tal como pepsina e papaína e significa um fragmento de anticorpo gerado pela digestão da imunoglobulina perto das ligações de dissulfureto das regiões charneira existentes entre cada uma das duas cadeias P. Por exemplo, a papaína cliva a IgG a montante das ligações de dissulfureto nas regiões charneira existentes entre cada uma das duas cadeias P para gerar dois fragmentos de anticorpos homólogos em que uma cadeia L composta por VL (região variável da cadeia L) e CL (região constante da cadeia L) e um fragmento da cadeia P composto por VP (região variável da cadeia P) e 0Ργ1 (região γΐ na região constante da cadeia P) estão ligados às suas regiões terminais C através de uma ligação de dissulfureto. Cada um desses dois fragmentos homólogos de anticorpos é designado 91 por Fab'. A pepsina também cliva a IgG a jusante das pontes de dissulfureto nas regiões charneira existentes entre cada uma das duas cadeias P para gerar um fragmento de anticorpo ligeiramente maior do que o fragmento em que os dois Fab' mencionados antes estão ligados na região charneira. Este fragmento de anticorpo é designado por F(ab')2. "A constante da taxa de ligação (ka) " significa aqui um valor que indica a força de ligação (grau) do referido anticorpo monoclonal ao antigénio-alvo, calculada com base na cinética da reacção de antigénio-anticorpo. A "constante da taxa de dissociação (kd)" significa um valor que indica a força de dissociação (grau) do referido anticorpo monoclonal do antigénio-alvo". A "constante de dissociação (KD)" é um valor que se obtém dividindo a referida "constante da taxa de dissociação (kd)" pelo referido valor da "constante da taxa de ligação (ka)". Estas constantes são usadas para representar a afinidade do referido anticorpo monoclonal para o antigénio e a sua actividade para neutralizar o antigénio.
As referidas constantes podem ser analisadas de acordo com vários métodos e podem ser facilmente analisadas utilizando um estojo comercial de ensaio BiacoreX (Amersham Pharmacia) ou um estojo semelhante, de acordo com o processo manual e experimental ligado ao referido estojo. Os valores de ka, kd e Kd obtidos utilizando o referido estojo são expressos nas seguintes unidades 1/M.Seg, 1/segundo e M (mole), respectivamente. Os valores mais elevados de ka indicam uma actividade mais forte de ligação ao antigénio por parte do anticorpo monoclonal ensaiado e valores menores de Kd mostram uma actividade mais forte de neutralização do anticorpo. 92 0 anticorpo monoclonal da presente invenção inclui os que têm um valor de ka, kd ou Kd como se mostra a seguir de (1) a (3) : (1) anticorpo monoclonal humano que se liga a AILIM humana ou a parte dela com a constante da taxa de ligação (ka) de 1,0 x 104 (1/M.seg) ou mais, de preferência 1,0 x 105 (1/M.seg) ou mais. (2) anticorpo monoclonal humano que se liga a AILIM humana ou a parte dela com a constante da taxa de dissociação (kd) de 1,0 x 10~4 (1/seg) ou menos, de preferência 1,0 x 10~5 (1/seg) ou menos. (3) anticorpo monoclonal humano que tem uma reactividade com a AILIM humana ou parte dela com a constante de dissociação (Kd) de 1,0χ10~7 (M) ou menos, de preferência l.OxlO-8 (M) ou menos e mais preferencialmente 1,0 x 10”9 (M) ou menos.
Neste caso, cada valor de ka, kd e Kd antes descrito deverá oscilar ligeiramente consoante as várias condições no momento da medição com uma margem de erro, mas praticamente sem nenhuma variação nos índices em geral. "Células produtoras de anticorpos monoclonais" ou "hospedeiro de recombinação genética" que produz anticorpos monoclonais humanos de recombinação genética, da presente invenção (aqui, o referido hospedeiro é uma célula, excluindo óvulos fertilizados), significa qualquer célula produtora dos anticorpos monoclonais humanos mencionados antes da presente invenção.
Especificamente, por exemplo, inclui as células descritas em qualquer uma das alíneas (1) a (3) que se seguem, mas não se limita a elas: 93 (1) células B produtoras de anticorpos monoclonais humanos obtidas por imunização de mamíferos transgénicos não humanos que produzem os anticorpos humanos mencionados antes com o imunogénio (antigénio) definido antes e recolha das células dos referidos animais imunizados. (2) as células de fusão mencionadas antes (hibridoma) resultaram da fusão de células B produtoras dos anticorpos monoclonais humanos assim obtidos com uma célula de mieloma derivada de mamíferos. (3) células de recombinação genética que produzem anticorpos monoclonais humanos de recombinação genética obtidas por transformação de uma célula excluindo as referidas células B e hibridomas (por exemplo, OHC (célula de ovário de hamster chinês), RHB (célula de rim de hamster bébé), linfócitos tal como mieloma), com o gene a codificar o referido anticorpo monoclonal humano (gene que codifica a cadeia pesada ou que codifica a cadeia leve ou ambos os genes) isolado das referidas células B que produzem anticorpos monoclonais humanos ou células de fusão produtoras de anticorpos monoclonais humanos (hibridoma).
Aqui, as células de recombinação genética produtoras de anticorpos monoclonais humanos de recombinação genética mencionadas antes em (3) significam, nomeadamente, uma célula de recombinação genética produzindo o anticorpo monoclonal humano de recombinação genética gerado pela célula B descrita antes em (1) ou o hibridoma referido antes em (2). E, "hospedeiro" em "hospedeiro de recombinação genética" da presente invenção inclui, para além de várias células de mamíferos como descrito antes, os óvulos 94 fertilizados de qualquer mamifero não humano (caprinos, suinos, ovinos, bovinos, etc.)· Ao transferir um gene (gene que codifica a cadeia pesada ou que codifica a cadeia leve ou ambos os genes) que codifica qualquer anticorpo monoclonal (de preferência anticorpo monoclonal humano) com a AILIM humana da presente invenção neste óvulo fertilizado, pode obter-se um óvulo fertilizado de recombinação genética da presente invenção. Este óvulo fertilizado de recombinação genética é usado para preparar os animais transgénicos para a produção, em grande escala, da proteina do leite mencionada antes (Nikkei Science, Abril, 1997, p.78-84). "Uma substância" que compõe a presente invenção, mais especificamente "uma substância que tem uma actividade na regulação da transdução de sinal mediada por AILIM" e, mais especificamente, "uma substância que tem uma actividade na inibição da proliferação de células que expressam AILIM ou na inibição da produção de uma citocina por meio de células que expressam AILIM", significa uma substância natural, presente na natureza ou uma substância arbitrária preparada artificialmente.
Uma "substância" relacionada com a "substância que se liga a AILIM" e a "substância de ligação ao ligando de AILIM" também significa aqui qualquer substância natural, na natureza ou qualquer substância preparada artificialmente.
Aqui, "a transdução de sinal mediada por AILIM" significa a transdução de sinal através de AILIM, levando a uma mudança de um fenótipo arbitrário nas células que expressam AILIM (proliferação celular, activação de células, inactivação de células, apoptose e/ou mudança de 95 uma capacidade de produção de uma citocina arbitrária a partir de células que expressam AILIM). "A substância" pode ser classificada principalmente em "uma substância proteica" e "uma substância não proteica".
Exemplos de "substâncias proteicas" são as seguintes: polipéptido, anticorpo (um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal ou uma parte de um anticorpo monoclonal e, particularmente preferidos os anticorpos humanos mencionados antes).
Quando a substância é um anticorpo, a substância é preferivelmente um anticorpo monoclonal. Quando a substância é um anticorpo monoclonal, a substância inclui não somente o anticorpo monoclonal não humano derivado de mamíferos não humanos, mas também um anticorpo monoclonal quimérico recombinante, um anticorpo monoclonal humanizado recombinante e um anticorpo monoclonal humano.
Aqui, o "anticorpo monoclonal quimérico recombinante" é um anticorpo monoclonal preparado por engenharia genética e, especificamente, significa um anticorpo quimérico tal como um anticorpo monoclonal quimérico de murganho/ser humano cujas regiões variáveis derivam de imunoglobulina de um mamífero não humano (murganho, rato, hamster, etc.) e cujas regiões constantes derivam de imunoglobulina humana. 0 "anticorpo monoclonal humanizado (anticorpos enxertado numa RDC)" da presente invenção é um anticorpo monoclonal preparado por engenharia genética e, especificamente, significa um anticorpo monoclonal humanizado em que uma parte ou a totalidade das regiões de determinação de complementaridade da região hipervariável 96 derivam das regiões de determinação de complementaridade da região hipervariável de um anticorpo monoclonal de um mamífero não humano (murganho, rato, hamster, etc.), as regiões estruturais da região variável são provenientes das regiões estruturais da região variável de imunoglobulina humana e a região constante deriva de uma região constante da imunoglobulina humana.
As regiões de determinação de complementaridade da região hipervariável existem na região hipervariável da região variável de um anticorpo e significa três regiões que, directa e complementarmente se ligam a um antigénio (resíduos de determinação de complementaridade, RDC1, RDC2 e RDC3). As regiões estruturais, da região variável, significam quatro regiões conservadas comparativamente situadas a montante, a jusante ou entre as três regiões de determinação de complementaridade (região estrutural, REI, RE 2 , RE 3 e RE 4 ) .
Por outras palavras, um anticorpo monoclonal humanizado significa que, em todas as regiões, excepto numa parte ou na totalidade das regiões de determinação da complementaridade da região hipervariável de um anticorpo monoclonal derivado de um mamífero não humano, foram substituídas pelas suas regiões correspondentes derivadas de uma imunoglobulina humana. A região constante derivada de imunoglobulina humana tem a sequência de aminoácidos inerente a cada isotipo, tal como IgG (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD e IgE. A região constante de um anticorpo monoclonal humanizado, na presente invenção, pode ser a que tem origem em imunoglobulina humana pertencente a qualquer isotipo. De preferência, é a região constante da IgG humana. As regiões 97 estruturais da região constante derivada de imunoglobulina humana não estão particularmente limitadas.
Quando a substância da presente invenção é um polipéptido, a substância inclui o polipéptido que se segue, um fragmento do polipéptido (um oligopéptido), um polipéptido de fusão, um péptido quimicamente modificado. Exemplos de oligopéptidos incluem um péptido compreendendo 5 a 30 aminoácidos, de preferência 5 a 20 aminoácidos. A modificação quimica pode ser concebida de acordo com diversas finalidades, por exemplo, o aumento do semi-período de vida no sangue no caso da administração in vivo ou o aumento da tolerância contra a degradação ou o aumento da absorção no tracto digestivo no caso de administração oral.
Seguem-se exemplos de polipéptidos: (1) Um polipéptido que compreende a totalidade ou uma parte da região extracelular da AILIM; (2) um polipéptido de fusão que compreende a totalidade ou uma parte da região extracelular de AILIM e a totalidade ou uma parte de uma região constante da cadeia pesada da imunoglobulina ou (3) um polipéptido que se liga a AILIM.
Exemplos de "não proteinas" incluem ADN, ARN e um composto quimicamente sintetizado.
Aqui, "ADN" significa "ADN que compreende uma sequência parcial de nucleótidos do ADN ou do seu ADN quimicamente modificado" útil como um produto farmacêutico de ADN anti-paralelo concebido com base numa sequência de nucleótidos de ADN (incluindo ADNc e ADN genómico) que 98 codificam a AILIM anterior (de preferência AILIM humana). Especificamente, o ADN anti-paralelo pode inibir a transcrição do ADN que codifica a AILIM em ARNm ou a tradução do ARNm numa proteína por hibridação de ADN ou de ARN que codificam AILIM. A "sequência parcial de nucleótidos", como referido aqui, indica uma sequência parcial de nucleótidos que inclui um número arbitrário de nucleótidos numa região arbitrária. A sequência parcial de nucleótidos consiste em 5 a 100 nucleótidos consecutivos, de preferência 5 a 70 nucleótidos consecutivos, mais preferencialmente 5 a 50 nucleótidos consecutivos e ainda mais preferencialmente 5 a 30 nucleótidos consecutivos.
Quando o ADN é usado como um produto farmacêutico de ADN anti-paralelo, a sequência de ADN pode ser modificada quimicamente, em parte, para aumentar o semi-periodo de vida (estabilidade) da concentração no sangue do ADN administrado ao paciente, para aumentar a permeabilidade da membrana intracitoplásmica do ADN ou para aumentar a resistência à degradação ou a absorção nos órgãos digestivos, do ADN administrado por via oral. A modificação química inclui, por exemplo, a modificação das ligações de fosfato, das riboses, das bases de nucleótidos, da parte de açúcar, da extremidade 3' e/ou da extremidade 5' da estrutura do ADN dos oligonucleótidos. A modificação da ligação de fosfato inclui, por exemplo, a conversão de uma ou mais das ligações em ligações de fosfodiéster (D-oligo), ligações de fosforotioato, ligações de fosforoditioato (S-oligo) , fosfonato metílico (MP-oligo), ligações de fosforoamidato, ligações que não são de fosfato ou ligações de 99 fosfonotioato metílico ou combinações das mesmas. A modificação da ribose inclui, por exemplo, a conversão em 2'-fluororibose ou 2'-O-metilribose. A modificação da base de nucleótido inclui, por exemplo, a conversão em 5-propiniluracilo ou 2-aminoadenina.
Aqui, "ARN" significa "ARN que compreende uma sequência parcial de nucleótidos do ARN ou do seu ARN quimicamente modificado" útil como um produto farmacêutico de ADN anti-paralelo concebido com base numa sequência de nucleótidos de ARN que codificam a AILIM anterior (de preferência AILIM humana). 0 ARN anti-paralelo pode inibir a transcrição do ADN que codifica a AILIM em ARNm ou a tradução do ARNm numa proteina por hibridação de ADN ou de ARN que codificam AILIM. A "sequência parcial de nucleótidos", como referido aqui, indica uma sequência parcial de nucleótidos, que inclui um número arbitrário de nucleótidos numa região arbitrária. A sequência parcial de nucleótidos consiste em 5 a 100 nucleótidos consecutivos, de preferência 5 a 70 nucleótidos consecutivos, mais preferencialmente 5 a 50 nucleótidos consecutivos e ainda mais preferencialmente 5 a 30 nucleótidos consecutivos. A sequência de ARN anti-paralela pode ser modificada quimicamente, em parte para aumentar o semi-periodo de vida (estabilidade) da concentração no sangue do ARN administrado aos pacientes, para aumentar a permeabilidade da membrana intracitoplásmica do ARN ou para aumentar a resistência à degradação ou a absorção nos órgãos digestivos do ARN administrado por via oral. Um exemplo da modificação química consiste na modificação quimica aplicada ao ADN anti-paralelo anterior. 100
Exemplos de "um composto quimicamente sintetizado" é um composto arbitrário, excepto para o ADN, o ARN e as substâncias proteicas anteriores, tendo o peso molecular de cerca de 100 a cerca de 1000, de preferência, um composto com o peso molecular de cerca de 100 a cerca de 800 e mais preferencialmente, o peso molecular de cerca de 100 a cerca de 600.
Um "polipéptido" incluido na definição anterior de "substância" significa uma parte (um fragmento) de uma cadeia polipeptidica que constitui a AILIM (preferencialmente AILIM humana), de preferência a totalidade ou uma parte de uma região extracelular do polipéptido constituindo a AILIM (1 a 5 aminoácidos podem ser opcionalmente adicionados ao terminal N e/ou ao terminal C da região). A AILIM envolvida na presente invenção é uma molécula da transmembrana que penetra na membrana celular, que compreende 1 ou 2 cadeias polipeptidicas.
Aqui, uma "proteina de transmembrana", significa uma proteina que se liga à membrana através da região do péptido hidrofóbico que penetra na camada lipidica dupla da membrana, uma ou várias vezes e cuja estrutura é, na totalidade, composta por três regiões principais, ou seja, uma região extracelular, uma região de transmembrana e uma região citoplasmática, como se vê em muitos receptores ou moléculas da superfície celular. Essa proteina de transmembrana constitui cada receptor ou cada molécula da superfície celular sob a forma de um monómero, homodímero, heterodímero ou oligómero com outras cadeias com a mesma sequência de aminoácidos ou uma sequência de aminoácidos diferente. 101
Aqui, uma "região extracelular" significa a totalidade ou uma parte da estrutura parcial (região parcial) de toda a estrutura da proteína da transmembrana mencionada antes em que a estrutura parcial existe fora da membrana. Por outras palavras, isso significa a totalidade ou uma parte da região da proteína de transmembrana, excepto na região incorporada na membrana (região da transmembrana) e a região existente no citoplasma após a região transmembrana (região citoplasmática). "Um polipéptido de fusão", incluído na "substância proteica" anterior, significa um polipéptido de fusão que compreende a totalidade ou uma parte da região extracelular de um polipéptido constituindo a AILIM (preferencialmente AILIM humana) e "o todo ou uma parte de uma região constante da cadeia pesada da imunoglobulina (Ig, de preferência Ig humana)". Preferencialmente, o polipéptido de fusão é um polipéptido de fusão com uma região extracelular de AILIM e uma porção de uma região constante da cadeia pesada de IgG humana e, particularmente, de preferência, um polipéptido de fusão de uma região extracelular de AILIM e uma região (Fc) da cadeia pesada de IgG humana compreendendo uma região charneira, do domínio CH2 e do domínio CH3. Como IgG, é preferível a IgGl e como AILIM é preferível a AILIM humana, de murganho ou de rato (preferencialmente humana). "A totalidade ou uma parte de uma região constante da cadeia pesada da imunoglobulina (Ig) humana", utilizada aqui significa a região constante ou a região Fc da cadeia pesada (cadeia P) de imunoglobulina de origem humana como descrito ou uma parte dela. A imunoglobulina pode ser qualquer imunoglobulina pertencente a qualquer classe e a qualquer subclasse. Especificamente, exemplos da 102 imunoglobulina incluem IgG (IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4), IgM, IgA (IgAl e IgA2), IgD e IgE. Preferencialmente, a imunoglobulina é IgG (IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4) ou IgM. Exemplos de imunoglobulinas particularmente preferidas da presente invenção são as pertencentes a IgG de origem humana (IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4). A imunoglobulina tem uma unidade estrutural em forma de Y em que quatro cadeias compostas por duas cadeias leves homólogas (cadeias L) e duas cadeias pesadas homólogas (cadeias P) estão ligadas através de pontes de dissulfureto (ligações S-S). A cadeia leve é composta pela região variável (VL) de cadeia leve e a região constante (CL) da cadeia leve. A cadeia pesada é composta pela região variável de cadeia pesada (VP) e pela região constante de cadeia pesada (VP) . A região constante de cadeia pesada é composta por alguns dominios com as sequências de aminoácidos inerentes a cada classe (IgG, IgM, IgA, IgD e IgE) e a cada subclasse (IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4, IgAl e IgA2). A cadeia pesada de IgG (IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4) é composta por VP, o domínio CHI, a região charneira, o domínio CH2 e o domínio CH3, por esta ordem, a partir do terminal N.
Da mesma forma, a cadeia pesada da IgGl é composta por VP, o domínio CyiI, a região charneira, o domínio Cyp2 e o domínio Cyp3, por esta ordem, a partir do terminal N. Da mesma forma, a cadeia pesada de IgG2 é composta por VP, o domínio CY2I, a região charneira, o domínio Cy22 e o
domínio CY23, por esta ordem, a partir do terminal N. A cadeia pesada de IgG3 é composta por VP, o domínio CY3I, a 103 região charneira, o domínio Cys2 e o domínio Cy33, por esta ordem, a partir do terminal N. A cadeia pesada de IgG4 é composta por VP, o domínio CY4I, a região charneira, o domínio Ογ42 e o domínio Ογ43, por esta ordem, a partir do terminal N. A cadeia pesada de IgA é composta por VP, o domínio Cal, a região charneira, o domínio Ca2 e o domínio Ca3, por esta ordem, a partir do terminal N.
Da mesma forma, a cadeia pesada da IgAl é composta por VP, o domínio Capl, a região charneira, o domínio Cap2 e o domínio Cai3, por esta ordem, a partir do terminal N. A cadeia pesada de IgA2 é composta por VP, o domínio Ca2l, a região charneira, o domínio Ca22 e o domínio Cap3, por esta ordem, a partir do terminal N. A cadeia pesada de IgD é composta por VP, o domínio Cõl, a região charneira, o domínio C52 e o domínio C53, por esta ordem, a partir do terminal N. A cadeia pesada de IgM é composta por VP, o domínio Cpl, o domínio Cp2, o domínio Cp3 e o domínio Cp4, por esta ordem, a partir do terminal N e não tem região charneira, como se vê em IgG, IgA e IgD. A cadeia pesada de IgE é composta por VP, o domínio Csl, o domínio Cs2, o domínio Cs3 e o domínio Cs4, por esta ordem, a partir do terminal N e não tem região charneira como se vê em IgG, IgA e IgD.
Se, por exemplo, se trata IgG com papaína, ela cliva ligeiramente no lado do terminal N, um pouco a frente das pontes de dissulfureto existentes na região charneira, onde 104 as ligações de dissulfureto ligam as duas cadeias pesadas para gerar dois homólogos Fab, em que um fragmento de cadeia pesada composto por VP e CHI está ligado a uma cadeia leve através de uma ligação de dissulfureto e uma Fc, em que dois fragmentos homólogos de cadeia pesada compostos pela região charneira, dominio CH2 e dominio CH3 estão ligados através de pontes de dissulfureto (Ver "Immunology Illustrated", segunda edição original, Nankodo, pp.65-75 (1992) e "Focus of Newest Medicai Science Recognition Mechanism of Immune System", Nankodo, pp.4-7 (1991) etc.).
Nomeadamente, "uma parte de uma região constante da cadeia pesada da imunoglobulina" mencionada antes significa uma parte de uma região constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina com as caracteristicas estruturais mencionadas antes e, de preferência, é a região constante sem o dominio Cl ou a região Fc. Especif icamente, exemplo disso é a região composta pela região charneira, o dominio C2 e o dominio C3 de cada uma das IgG, IgA e IgD e é a região composta pelo dominio C2, o dominio C3 e o dominio C4 de cada uma das IgM e IgE. Um exemplo particularmente preferido é o da região Fc da IgGl de origem humana. 0 polipéptido de fusão mencionado antes tem a vantagem de o polipéptido de fusão poder ser purificado com extrema facilidade utilizando uma cromatografia em coluna de afinidade usando a propriedade da proteína A, que se liga especificamente ao fragmento de imunoglobulina porque o polipéptido de fusão da presente invenção tem uma porção de uma região constante (por exemplo Fc) de uma imunoglobulina tal como a IgG, como mencionado antes, como parceiro de fusão. Além disso, uma vez que vários anticorpos contra o Fc de várias imunoglobulinas estão disponíveis, pode-se 105 realizar facilmente um imunoensaio para os polipéptidos de fusão com anticorpos contra a Fc. "Um polipéptido que se liga a AILIM" está incluído num "polipéptido" incluído na definição anterior de "substância".
Exemplos específicos de "um polipéptido que se liga a AILIM" são a totalidade ou uma parte de um polipéptido constituindo os conhecidos B7h, B7RP-1, GL50 ou uma molécula chamada LICOS que são ligantes que interagem com a AILIM (Nature, Vol. 402, No. 6763, pp.827-832, 1999; Nature Medicine, Vol.5, No.12, pp. 1365-1369, 1999; J. Immunology, Vol. 164, pp. 1653-1657, 2000; Curr. Biol., Vol. 10 No 6, pp. 333-336, 2000) .
Preferencialmente, o polipéptido é um polipéptido que compreende a totalidade ou uma parte da região extracelular dos ligantes anteriores (B7h, B7RP-1, GL50, LICOS) ou um polipéptido de fusão compreendendo o polipéptido e a totalidade ou parte de uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina (de preferência imunoglobulina humana). Aqui, as expressões "uma região extracelular" e "uma região constante da cadeia pesada da imunoglobulina" têm o mesmo significado atribuído antes. 0 polipéptido, uma porção do polipéptido (fragmento) e o polipéptido de fusão mencionados antes podem ser produzidos não só pela tecnologia do ADN recombinante, tal como referido a seguir, mas também por um processo bem conhecido na técnica tal como um processo de síntese química e um processo de cultura celular ou um processo modificado da mesma. 106 0 "anticorpo" da presente invenção pode ser um anticorpo policlonal (anti-soro) ou um anticorpo monoclonal contra a AILIM de mamíferos (especialmente, de preferência AILIM humana), definidos antes e, de preferência, um anticorpo monoclonal.
Especificamente, o anticorpo é um anticorpo com uma actividade na inibição da proliferação de células que expressam AILIM por meio da sua ligação a AILIM ou inibindo a produção de interferão γ ou da interleucina 4 por meio de células que expressam AILIM através da ligação a AILIM. "Alergia do tipo tardio", aqui, é uma alergia mediada pela imunidade celular (particularmente mediada por células T do tipo Thl) ou seja, a alergia é mediada por células T sensibilizadas com antigénio (antigénio de memorização das células T da memória) e refere-se a qualquer alergia, que leva aproximadamente 24 a 48 horas para apresentar reacção alérgica acompanhada de inflamação causada pela referida célula T da memória quando o organismo vivo, sensibilizado com o antigénio é novamente contactado pelo mesmo antigénio.
Este tipo de alergia tardia inclui alergia a um antigénio infeccioso patogénico, tal como alergia tuberculínica derivada de Mycobacterium tuberculosis, a uma alergia passageira, tardia, do tipo de Jones-Mote com uma quantidade diminuta de proteína, alergia de contacto com substâncias químicas tal como o cloreto de picrilo ou toxinas de plantas, tais como laca ou alergia relacionada com a rejeição de um enxerto observada no alo-enxerto. "Composição farmacêutica" significa aqui uma composição útil como fármaco que compreende anticorpos como 107 ingredientes eficazes (de preferência anticorpos humanos) , que se ligam a AILIM (preferencialmente AILIM humana) ou uma parte dela ou anticorpos monoclonais (de preferência anticorpo monoclonal humano) ou uma parte dele e um "veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico". 0 "veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico" inclui um excipiente, um diluente, um expansor, um agente de decomposição, um estabilizador, um conservante, um tampão, um emulsionante, um aromático, um corante, um adoçante, um agente de aumento de viscosidade, um aromatizante, um agente para aumentar a solubilidade ou outros aditivos.
Usando um ou mais destes veiculos, pode-se formular uma composição farmacêutica sob a forma de comprimidos, pílulas, pós, grânulos, injecções, soluções, cápsulas, pastilhas, elixires, suspensões, emulsões ou xaropes. A composição farmacêutica pode ser administrada por via oral ou parentérica. Outras formas de administração parentérica incluem uma solução para aplicação externa, supositório para a administração rectal e pessários, prescritos pelo método usual, que compreende um ou mais ingredientes activos. A dosagem pode variar consoante a idade, sexo, peso e sintomas do paciente, o efeito do tratamento, a via de administração, o período de tratamento ou o tipo de ingrediente activo (polipéptido ou anticorpo mencionados antes) contidos na composição farmacêutica. Normalmente, a composição farmacêutica pode ser administrada a um adulto numa dose de 10 yg a 1.000 mg (ou 10 yg a 500 mg) por uma administração. Consoante as várias condições, a dosagem 108 inferior à mencionada antes pode ser suficiente nalguns casos e a dose superior à mencionada antes pode ser necessária noutros casos.
Em particular, a injecção pode ser produzida pela dissolução ou a suspensão do anticorpo num veiculo não tóxico, aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, tal como soro fisiológico ou água destilada comercialmente disponíveis para injecção com o ajustamento para uma concentração de 0,1 yg de anticorpos/ml de veículo até 10 mg de anticorpo/ml de veículo. A injecção assim produzida pode ser administrada a um paciente humano que necessite de tratamento numa dose de 1 yg a 100 mg/kg de peso corporal, de preferência 50 yg a 50 mg/kg de peso corporal, uma ou mais vezes por dia. Exemplos de vias de administração são as vias de administração medicamente adequadas, tais como injecção intravenosa, injecção subcutânea, injecção intradérmica, injecção intramuscular ou injecção intraperitoneal, de preferência injecção intravenosa. A injecção também pode ser preparada num diluente não aquoso (por exemplo, propileno-glicol, polietileno-glicol, óleo vegetal tal como azeite e álcool tal como etanol) , numa suspensão ou numa emulsão. A injecção pode ser esterilizada por filtração com um filtro não penetrável por bactérias, por mistura bactericida ou por irradiação. A injecção pode ser produzida sob uma forma em que esteja preparada para ser utilizada. Nomeadamente, é liofilizada para ser uma composição sólida esterilizada e pode ser dissolvida em 109 água destilada esterilizada para injecção ou num outro dissolvente antes da sua utilização.
As composições farmacêuticas que compreendem os anticorpos humanos da presente invenção são úteis como preparações farmacêuticas, sem induzir imunorejeição do hospedeiro devida ao AHAM (anticorpo humano anti-murganho), para controlar uma variedade de reacções biológicas (por exemplo, a proliferação de células que expressam AILIM, produção de citocinas por células que expressam AILIM, citólise imunitária ou morte programada (apoptose) das células que expressam AILIM e outras) que estão associadas com a transdução do sinal co-estimulador (sinal secundário) mediada pela AILIM para células que expressam AILIM e/ou como preparações farmacêuticas para tratar ou prevenir diversas doenças através da supressão e da inibição do aparecimento e/ou o progresso de doenças associadas com a transdução de sinal mediada AILIM. A expressão "citólise imune" indica aqui um fenómeno biológico, como se segue. A lise da célula (citólise) pode ser induzida por um anticorpo (particularmente um anticorpo de lise celular), bem como pela ligação com as células assassinas. 0 anticorpo da lise celular é um anticorpo citotóxico, que particularmente tem uma actividade de lise de células, tal como células do sistema imunológico, células de tecidos ou esperma. Quando o anticorpo se liga ao antigénio da superficie celular, provoca um efeito citotóxico na célula ou induz citólise na presença do complemento.
Esta citólise imunitária é induzida pela acção do complemento em conjunto com a ligação especifica do 110 anticorpo ao antigénio da superfície da célula. 0 anticorpo ligado ao antigénio da superfície activa o complemento Cl (Cl). Subsequentemente, os sítios danificados das células formam-se através de uma série de reacções de fixação do complemento com os complementos C2 a C9 (C2-C9) e, em seguida, liberta-se o conteúdo das células, fazendo assim a lise das células. A expressão "citotoxicidade celular dependente do anticorpo" indica aqui um evento biológico que também é designado abreviadamente por "CCDA" e é uma acção citotóxica sobre as células-alvo, por meio de células efectoras, tais como linfócitos, macrófagos ou leucócitos polimorfonucleares, que exige não apenas células efectoras e células-alvo, mas também um anticorpo que participa na indução do evento citotóxico. A expressão "reacção mista de linfócitos" significa aqui um fenómeno biológico abreviado como "RML". A reacção é também referida como reacção mista de leucócitos.
Misturam-se uns com os outros leucócitos ou linfócitos alogénicos provenientes de indivíduos diferentes e faz-se a respectiva cultura, durante vários dias, permitindo assim a formação explosiva das células e a síntese de ADN nas células (ou seja, a proliferação celular). Esta reacção é referida como RML (RML alogénica). A síntese do ADN (proliferação celular) pode ser analisada parando a proliferação de qualquer um dos linfócitos. A paragem pode ser realizada através de tratamento, com radiação ou mitomicina. A análise pode ser realizada através da medição da quantidade de ADN sintetizada no outro linfócito. 111 A quantidade de ADN sintetizado pode ser analisada através da medição da incorporação de timidina, marcada com radioisótopos, como tritio, no núcleo da célula. 0 ADN que codifica a AILIM (particularmente e preferencialmente a AILIM humana) da presente invenção pode ser obtido de acordo com um processo normalmente usado através de procedimentos de clonagem do ADNc a partir de ARNm que codifica a AILIM; procedimento para isolar o ADN genómico e excisão-reparação; procedimento de preparação do ADN por RCP usando uma sequência de ADNc ou uma sequência de ARNm como matriz; ou um processo de síntese química do ADN. 0 ADN que codifica o ligante de AILIM, em conformidade com a presente invenção, também pode ser obtido da mesma maneira que foi descrito antes. 0 ADN que codifica AILIM (especialmente e de preferência AILIM humana) da presente invenção pode ser preparado pelo corte (digestão) do ADN que compreende o ADN que codifica a AILIM preparada como tal com enzimas de restrição apropriadas e, sempre que necessário, a ligação do fragmento de ADN resultante com um ADN ligante ou um marcador usando uma ADN polimerase adequada ou similar. 0 ADN que codifica o ligando de AILIM também pode ser preparado da mesma maneira.
Um exemplo do processo será ilustrado a seguir para clonar o ADNc que codifica a AILIM (particularmente e de preferência a AILIM humana; a proteína é designada aqui como a proteína de interesse) a partir do ARNm. 112 0 ADN que codifica o ligando de AILIM também pode ser clonado da mesma maneira.
Em primeiro lugar, prepara-se o ARN mensageiro, que codifica a proteína de interesse, a partir de tecidos ou de células que expressam e produzem a proteína de interesse. 0 ARNm pode ser preparado isolando o ARN total por um processo conhecido tal como o processo de guanidina-tiocianato (Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry, Vol. 18, p 5294, 1979), o processo do fenol quente ou o processo de AGPC e submetendo a cromatografia de afinidade usando celulose oligo-dT ou poli-U Sefarose.
Depois, com o ARNm obtido como matriz, sintetiza-se o ADNc, por exemplo, por um processo bem conhecido utilizando a transcriptase inversa, tal como o processo de Okayama et al. (Mol. Cell. Biol. Vol. 2, p. 161 (1982); ibid. Vol. 3, p. 280 (1983)) ou o processo de Hoffman et al. (Gene Vol. 25, p.263 (1983)) e converte-se em ADNc de hélice dupla. Prepara-se a biblioteca de ADNc por transformação de E. coli com vectores de plasmido, vectores de fagos ou vectores de cosmidos com este ADNc ou por transfecção de E. coli depois da embalagem in vitro.
Os vectores de plasmidos utilizados na presente invenção não estão limitados desde que sejam replicados e mantidos nos hospedeiros. Pode-se utilizar também quaisquer vectores de fagos que possam ser replicados nos hospedeiros. Exemplos de vectores de clonagem geralmente utilizados incluem puck9, XgtlO, Xgtll, etc. Quando se aplica o vector à triagem imunológica mencionada a seguir, utiliza-se preferencialmente o vector com um promotor que pode expressar um gene que codifica o polipéptido da presente invenção num hospedeiro. 113 0 ADNc pode ser inserido num plasmido, por exemplo, por meio do processo de Maniatis et al (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory, p.1.53, 1989). 0 ADNc pode ser inserido num vector de fago, por exemplo, pelo processo de Hyunh et al. (DNA cloning, a practical approach, Vol.l, p.49 (1985)). Estes processos podem ser simplesmente realizados usando um estojo de clonagem comercialmente disponível (por exemplo, um produto da Takara-Shuzo). 0 plasmido recombinante ou o vector de fago assim obtido é introduzido nas células hospedeiras adequadas, tais como um procarioto (por exemplo, E. coli: XLIBlue MRF', DH5oí, HB101, MC1061/P3, etc.).
Exemplos de um processo para a introdução de um plasmido num hospedeiro são o processo do cloreto de cálcio, o processo do cloreto de cálcio/cloreto de rubídio descrito em Molecular Cloning, A Laboratory Manual (segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory, p.1.74 (1989)) e o processo de electroporação. Os vectores de fago podem ser introduzidos nas células do hospedeiro, por exemplo, por um processo em que os ADNs dos fagos são introduzidos em hospedeiros em crescimento depois da embalagem in vitro. A embalagem in vitro pode ser facilmente realizada com um estojo de embalagem comercialmente disponível (por exemplo, um produto da Stratagene ou da Amersham). 0 ADNc que codifica o polipéptido da presente invenção pode ser isolado da biblioteca de ADNc assim preparada de acordo com o processo mencionado antes, combinando processos de rastreio geral de ADNc.
Por exemplo, um clone que contenha o ADNc desejado pode ser rastreado por um processo conhecido de hibridação 114 de colónias (Crunstein et al. Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A., Vol. 72, p.3961 (1975)) ou pelo processo de hibridação em placa (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory, p.2.108 (1989)), utilizando como sondas oligonucleótidos quimicamente sintetizados marcados com 32P, que correspondem à sequência de aminoácidos do polipéptido da presente invenção. Alternativamente, pode-se rastrear um clone com um fragmento de ADN que codifica uma região especifica dentro do polipéptido da presente invenção, por meio da amplificação da região por RCP com iniciadores sintéticos.
Quando se usa uma biblioteca de ADNc preparada usando um vector de expressão de ADNc (por exemplo, vectores do fago λΖΑΡΙΙ), o clone desejado pode ser rastreado por meio da reacção antigénio-anticorpo usando um anticorpo contra o polipéptido da presente invenção. Utiliza-se preferencialmente um processo de rastreio usando o processo de RCP quando muitos clones são submetidos a rastreio. A sequência de nucleótidos do ADN assim obtido pode ser determinada pelo processo de Maxam-Gilbert (Maxam et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol.74, p.560 (1977)) ou pelo processo de terminação da cadeia sintética de didesoxinucleótido usando o fago M13 (Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 74, pp.5463-5467 (1977)). A totalidade ou uma parte do gene que codifica o polipéptido da presente invenção pode ser obtida por excisão do clone obtido tal como mencionado antes, com enzimas de restrição, etc. 0 ADN que codifica o polipéptido da presente invenção pode ser isolado a partir do ADN genómico derivado das 115 células que expressam o polipéptido da presente invenção, tal como mencionado antes, por meio dos processos que se seguem.
Essas células são dissolvidas, de preferência por SDS ou proteinase K e os ADNs são desproteinizados por meio da repetição da extracção com fenol. Os ARNs são digeridos, de preferência com ribonuclease. Os ADNs obtidos são parcialmente digeridos com as enzimas de restrição apropriadas e os fragmentos de ADN obtidos são amplificados com os fagos ou cosmidos adequados para gerar uma biblioteca. Depois, detectam-se os clones que têm a sequência desejada, por exemplo, utilizando sondas de ADN marcadas radioactivamente e obtém-se a totalidade ou uma parte do gene que codifica o polipéptido da presente invenção, a partir dos clones, por excisão com enzimas de restrição, etc. A preparação de ADN que codifica a proteína de interesse, por RCP, pode ser realizada utilizando ARNm ou ADNc conhecidos que codificam a proteína de interesse, como matriz, de acordo com um processo usual ("PCR techniques for gene amplification -fundamental and new technologies" KYORITSU SHUPPAN, 1992, etc.). 0 ADN que codifica a proteína de interesse pode ser sintetizado quimicamente pelo processo usual, com base na sequência de nucleótidos que codifica a proteína de interesse. A AILIM da presente invenção (em especial, de preferência a AILIM humana) ou uma parte dela (de preferência, a região extracelular) pode ser preparada como uma proteína recombinante, de acordo com um processo 116 vulgarmente usado, com técnicas de recombinação genética utilizadas normalmente, usando o ADN obtido por corte da AILIM que codifica o ADN (ADNc ou ADN genómico contendo um intrão), com base no processo ilustrado antes com enzimas de restrição adequadas para originar um fragmento de ADN que codifica a AILIM e, em seguida, conforme necessário, ligando o fragmento de ADN resultante com um ADN ligante ou um marcador, usando uma polimerase de ADN adequada ou similar. 0 ligante de AILIM (particularmente, de preferência o ligante de AILIM humana) ou uma parte dele (de preferência a região extracelular) pode ser preparado da mesma maneira. A seguir dá-se um exemplo ilustrativo e especifico. Nomeadamente, insere-se o ADN, preparado como se descreveu antes, num vector, que será descrito em detalhe mais tarde, para produzir um vector de expressão. Em seguida, o vector de expressão é usado para transformar uma célula hospedeira, tal como se descreve a seguir, para se obter um transformante. Faz-se uma cultura do transformante e deixa-se a produzir a proteina de interesse no sobrenadante da cultura. A proteina de interesse, no sobrenadante da cultura, pode ser facilmente purificada, por cromatografia em coluna e similares. Não há nenhuma limitação especifica sobre o tipo de vector de expressão para a produção da AILIM recombinante (ou a sua região extracelular), desde que o vector seja replicado e mantido ou produzido de forma autónoma em qualquer um dos vários hospedeiros, tal como células procarióticas e/ou eucarióticas. Esses vectores de expressão incluem vectores de plasmidos e vectores de fagos 117 (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985). 0 vector de expressão pode ser facilmente preparado pela ligação do ADN de codificação da AILIM (ou sua região extracelular) com um vector de recombinação disponível na técnica (ADN de plasmido e ADN do bacteriófago) pelo processo usual. Exemplos específicos dos vectores para a recombinação utilizados são plasmidos derivados de E. coli tal como pBR322, p8R325, pUC12, pUC13 e pUC19, plasmidos derivados de levedura tal como pSH19 e pSH15 e plasmidos derivados do Bacillus subtilis tal como pUBUO, pTP5 e pC194. Exemplos de fagos são um bacteriófago tal como fago λ e um vírus de animal ou de insecto (pVL1393, Invitrogen), tal como um retrovirus, o virus vaccínia e o virus da poliedrose nuclear.
Os vectores de plasmido são úteis, quando um ADN de codificação de AILIM da presente invenção (em especial, de preferência a AILIM humana) ou a sua região solúvel extracelular se destinam a ser expressos numa célula hospedeira e, assim, a expressar a AILIM na superfície da célula do hospedeiro ou, alternativamente, a região extracelular solúvel da AILIM (especialmente, de preferência a AILIM humana) que se destina a ser produzida. Não há nenhuma limitação particular de tais vectores de plasmido, desde que os vectores possam expressar o gene que codifica AILIM (particularmente e de preferência a AILIM humana) ou a sua região extracelular solúvel e produzir a proteína codificada em várias células hospedeiras, tais como células procarióticas e/ou células eucarióticas. Por exemplo, esses plasmidos incluem pMAL C2, pcADN3.1 (-), pEF-BOS (Nucleic Acid Research, Vol. 18, p.5322, 1990; 118 etc.), pME18S ("Handbook for genetic engineering," Experimental Medicine, suplemento, 1992; etc.), etc.
Quando se usam bactérias, particularmente E. coli, como células hospedeiras, o vector de expressão é geralmente composto por pelo menos uma região de promotor-operador, um codão de iniciação, o ADN que codifica a proteina da presente invenção, o codão de terminação, a região do terminador e o replicão.
Quando se utilizam como hospedeiros células de levedura, células de animais ou células de insectos, o vector de expressão é composto, de preferência, por pelo menos um promotor, um codão de iniciação, o ADN que codifica a AILIM (particularmente e preferencialmente a AILIM humana) da presente invenção ou a sua região extracelular e um codão de terminação. Pode também incluir o ADN que codifica um péptido sinal, a sequência amplificadora, a região 5' e 3' não traduzida do gene que codifica a AILIM da presente invenção, junções de processamento, sitio de poliadenilação, região de marcador seleccionável e replicão. 0 vector de expressão também pode conter, se necessário, um gene para a amplificação do gene (marcador) que é normalmente usado. A região do promotor-operador para expressar a AILIM (particularmente e preferencialmente a AILIM humana) da presente invenção ou sua região extracelular, em bactérias, compreende um promotor, um operador e uma sequência de Shine-Dalgarno (SD) (por exemplo, AAGG). Por exemplo, quando o hospedeiro é Escherichia, é preferível que compreenda o promotor Trp, o promotor lac, o promotor recA, o promotor ÀPL, o promotor lpp, o promotor tac ou similar. 119
Exemplos de um promotor para expressar a AILIM (particularmente e preferencialmente a AILIM humana) da presente invenção ou a sua região extracelular, na levedura, são o promotor PH05, o promotor PGK, o promotor GAP, o promotor ADH e similares. Quando o hospedeiro é Bacillus, são exemplos desse promotor o SL01, o promotor SP02, o promotor penP e similares.
Quando o hospedeiro é uma célula eucariótica, tal como uma célula de mamíferos, são exemplos desse promotor os derivados de SV40, o promotor de retrovirus, o promotor de choque térmico e similares. É óbvio que o promotor não se limita aos exemplos anteriores. Além disso, usar um amplificador é eficaz para a expressão.
Um codão de iniciação preferido é, por exemplo, um codão de metionina (ATG). 0 codão de terminação normalmente utilizado (por exemplo, TAG, TGA, TAA, etc.) é ilustrado como um codão de terminação.
Os terminadores naturais ou sintéticos normalmente utilizados são usados como uma região de terminação.
Um replicão significa um ADN capaz de replicar toda a sequência de ADN nas células hospedeiras e inclui um plasmido natural, um plasmido modificado artificialmente (fragmento de ADN preparado a partir de um plasmido natural), um plasmido sintético, etc. Exemplos de plasmidos preferidos são pBR322 ou os seus derivados artificiais (fragmento de ADN obtido por tratamento de pBR322 com enzimas de restrição adequadas) para E. coli, plasmido de levedura de 2μ ou ADN cromossómico de leveduras para 120 leveduras e pRSVneo ATCC 37198, pSV2dhfr ATCC 37145, pdBPV-MMTneo ATCC 37224, pSV2bsr ATCC 37149, pSV2neo, etc para células de mamíferos.
Também se pode utilizar uma sequência amplificadora, um sítio de poliadenilação e a junção de união que são normalmente utilizados na técnica, tal como os derivados de SV4 0 .
Pode-se utilizar um marcador selecionável, geralmente utilizado de acordo com o processo usual. São exemplos os genes de resistência a antibióticos, tal como os genes da tetraciclina, ampicilina ou canamicina e o gene da timidina-cinase.
Exemplos de um gene para a amplificação de genes são o gene do di-hidrofolato-redutase (DHFR), o gene da timidina-cinase, o gene de resistência a neomicina, o gene de glutamato-sintase, o gene de adenosina-desaminase, o gene de ornitina-descarboxilase, o gene de higromicina-B-fosfotransferase, o gene de aspartato-transcarbamilase, etc. 0 vector de expressão da presente invenção pode ser preparado por meio da ligação contínua e circular de pelo menos o promotor mencionado antes, o codão de iniciação, o ADN que codifica a proteína da presente invenção, o codão de terminação e a região de terminação, com um replicão adequado. Se desejado, os fragmentos de ADN adequados (por exemplo, ligantes, sítios de restrição gerados com outras enzimas de restrição), podem ser usados pelos processos usuais tais como digestão com uma enzima de restrição ou ligação usando ligase do ADN de T4. 121
Os transformantes da presente invenção podem ser preparados pela introdução do vector de expressão, mencionado antes, nas células hospedeiras.
As células hospedeiras utilizadas na presente invenção não estão limitadas, desde que sejam compatíveis com um vector de expressão mencionado antes e podem ser transformadas. Exemplos dessas células são vários tal como células naturais ou células recombinantes artificialmente criadas geralmente utilizadas no campo técnico da presente invenção (por exemplo, bactérias (Escherichia e Bacillus) , levedura, (Saccharomyces, Pichia, etc.), células de animais ou células de insectos.
Utilizam-se preferencialmente células de E. coli ou de animais. Exemplos específicos são E. coli (DH5cx, DH10B, TBl, HB101, XL-2Blue, etc.), células derivadas de murganho (COP, L, C127, Sp2/0, NS-1, NIH 3T3, etc.), células derivadas de ratos, células derivadas de hamster (BHK, OHC, etc.), células derivadas de macaco (COSI, C0S3, C0S7, CV1, Velo, etc.) e células de origem humana (Hela, células derivadas de fibroblastos diplóides, mieloma, Namalwa, etc.).
Um vector de expressão pode ser introduzido (transformado (transduzido)) em células de hospedeiro através de processos conhecidos. A transformação pode ser feita, por exemplo, de acordo com o processo de Cohen et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 69, p.2110 (1972)), o processo dos protoplastos (Mol. Gen. Genet., Vol. 168, p.lll (1979)) ou um processo concorrrente (J. Mol. Biol., Vol. 56, p.209 (1971)) quando os hospedeiros são bactérias (E. coli, Bacillus subtilis, 122 etc.)/ o processo de Hinnen et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 75, p.1927 (1978)) ou o processo de lítio (J. Bacteriol., Vol. 153, p. 163 (1983)) quando o hospedeiro é Saccharomyces cerevisiae, o processo de Graham (Virology, Vol. 52, p. 456 (1973)) quando os hospedeiros são células de animais e o processo de Summers et al. (Mol. Cell. Biol., Vol. 3, pp. 2156-2165 (1983)) quando os hospedeiros são células de insecto. A região extracelular da AILIM (particularmente e preferencialmente a AILIM humana) da presente invenção (AILIM solúvel) pode ser produzida pela cultura de transformantes (a seguir este termo inclui transductantes) que compreendem um vector de expressão preparado como já mencionado, num meio nutriente. 0 ligante de AILIM pode ser produzido da mesma forma. 0 meio nutriente compreende, preferencialmente, uma fonte de carbono, uma fonte de azoto inorgânico ou uma fonte de azoto orgânico necessárias para o crescimento das células hospedeiras (transformantes). Exemplos de fontes de carbono são glicose, dextrano, amido solúvel e sacarose e exemplos de fontes de azoto orgânico ou inorgânico são sais de amónio, nitratos, aminoácidos, água de maceração de milho, peptona, caseina, extracto de carne, bolo de soja e extracto de batata. Se se desejar, podem conter outros nutrientes (por exemplo, um sal inorgânico (por exemplo, cloreto de cálcio, di-hidrogenofosfato de sódio e cloreto de magnésio), vitaminas, antibióticos (por exemplo, tetraciclina, neomicina, ampicilina, canamicina, etc.). A cultura realiza-se por um processo conhecido na técnica. As condições de cultura, tal como a temperatura, o pH dos meios e o tempo de cultura seleccionam-se, de forma 123 apropriada, para que a proteína da presente invenção seja superproduzida.
Os meios e as condições específicos da cultura utilizados dependem das células hospedeiras e estão ilustrados a seguir, mas não se limitam a eles.
Quando os hospedeiros são bactérias, actinomicetos, leveduras, fungos filamentosos, o meio líquido compreendendo a fonte de nutrientes mencionada antes é adequado. Os meios com pH de 5 a 8 são utilizadas preferencialmente.
Quando o hospedeiro é E. coli, os exemplos de meios preferidos são meio LB, meio M9 (Miller et al. Exp. Mol. Genet., Cold Spring Harbor Laboratory, p.431 (1972)), meio YT, etc. Usando estes meios, a cultura pode ser realizada normalmente a 14 até 43 °C durante cerca de 3 a24 horas, com aeração e agitação, se necessário.
Quando o hospedeiro é Bacillus, a cultura pode ser realizada normalmente a 30 a 40 °C durante cerca de 16 a 96 horas, com arejamento e agitação, se necessário.
Quando o hospedeiro é levedura, exemplos de meios são o meio mínimo de Burkholder (Bostian, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 77, p. 4505 (1980)). O pH do meio é preferencialmente de 5 a 8. A cultura pode ser realizada normalmente desde 20 a 35 °C durante cerca de 14 a 144 horas com arejamento e agitação, se necessário.
Quando o hospedeiro é uma célula de animal, os exemplos de meios são meios MEM contendo cerca de 5 a 20 % de soro bovino fetal (Science, Vol. 122, p. 501 (1952)), 124 meio DMEM (Virology, vol. 8, p. 396 (1959)), meio RPMI1640 (J. Am. Med. Assoe., Vol. 199, p. 519 (1967)), meio 199 (Proc. Soc. Exp. Biol. Med., Vol. 73, p. 1 (1950)), meio HamF12, etc. O pH dos meios é, de preferência de cerca de 6 a 8. A cultura pode ser realizada normalmente a cerca de 30 a 40 °C durante aproximadamente 15 a 72 horas, com arejamento e agitação, se necessário.
Quando o hospedeiro é uma célula de insecto, um exemplo de meios é o meio de Grace contendo soro bovino fetal (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 82, p. 8404 (1985)) . O pH do meio é preferencialmente de cerca de 5 a 8. A cultura pode ser realizada normalmente a cerca de 20 a 40 °C durante cerca de 15 a 100 horas com arejamento e agitação, se necessário. A região extracelular (AILIM solúvel) da AILIM da presente invenção (em especial, de preferência a AILIM humana) pode ser produzida através da cultura das células dos transformantes mencionadas antes (em particular, células de animais ou E. coli) e permitindo a secreção da proteína no sobrenadante da cultura. Nomeadamente, obtém-se um filtrado da cultura (sobrenadante) por processos tais como filtração ou centrifugação da cultura obtida e o polipéptido ou o fragmento de polipéptido da presente invenção é purificado e isolado a partir do filtrado da cultura pelo processo usual normalmente utilizado para purificar e isolar uma proteína natural ou sintética. 125
Exemplos de processos de isolamento e de purificação são um processo que utiliza a afinidade especifica, tal como cromatografia de afinidade, um processo que utiliza a solubilidade, tal como um processo de precipitação por salificação e um processo de precipitação num dissolvente, um processo que utiliza a diferença de peso molecular, tal como diálise, ultrafiltração, filtração em gel e electroforese em gel de sulfato de dodecilo e sódio-poliacrilamida, um processo que utiliza cargas, tais como cromatografia de permuta iónica e cromatografia em hidroxilapatite, um processo que utiliza a diferença de hidrofobicidade, como cromatografia liquida de alta resolução de fase inversa e um processo que utiliza a diferença de ponto isoeléctrico, tal como a focalização isoeléctrica.
Quando a proteína de interesse existe no periplasma ou no citoplasma dos transformantes da cultura, em primeiro lugar, recolhem-se os órgãos ou as células dos fungos pelo processo usual, tal como filtração ou centrifugação e suspendem-se no tampão apropriado. Depois da parede celular e/ou da membrana celular das células, etc. serem desorganizadas por processos, tais como lise com ultra-sons, lisozima e congelamento e descongelamento, a fração da membrana que compreende o polipéptido da presente invenção é obtida através de um processo tal como centrifugação ou filtração. A fracçao de membrana é solubilizada com um detergente, tal como Triton-X100 para se obter o extracto impuro. Finalmente, o polipéptido ou o fragmento polipeptídico é isolado e purificado a partir do extracto impuro pelo processo usual, como ilustrado antes.
Na presente invenção, a expressão "veículo insolúvel", significa um veículo que é utilizado para nele imobilizar 126 os polipéptidos por adsorção física ou ligação química. Por exemplo, o veículo pode ser (1) uma placa, um tubo de ensaio, um tubo ou similar tendo um espaço interno, pérolas, bolas, filtro, membrana ou similar feito de materiais insolúveis em água, incluindo plásticos, tais como resina de poliestireno, resina de policarbonato, resina de silicone ou resina de nylon ou vidro e (2) um veículo insolúvel utilizado em cromatografia de afinidade tal como um veículo de celulose, um veículo de agarose, um veículo de poliacrilamida, um veículo de dextrano, um veículo de poliestireno, um veículo de álcool de polivinilo, um veículo de poliaminoácido, um veículo de sílica porosa, etc. A "substância de marcação capaz de dar um sinal detectável", de acordo com a presente invenção, inclui, por exemplo, enzimas, material fluorescente, material luminescente, biotina, avidina ou um radioisótopo, mais especificamente, enzimas tal como peroxidase (por exemplo, peroxidase de rábano), fosfatase alcalina, β-D-galactosidase, glicoseoxidase, desidrogenase de glicose-6-fosfato, desidrogenase de álcool, malato-desidrogenase, penicilinase, catalase, apo-glicose-oxidase, ureiase, luciferase, acetilcolina-esterase, etc.; materiais fluorescentes tais como isotiocianato de fluoresceína, proteína de ficobilina, agentes quelantes de metais de terras raras, cloreto de dansilo, tetrametil-isotiocianato de rodamina, etc.; radioisótopos tais como 3H, 14C, 125I, 131I, etc., biotina, avidina e material luminescente.
Entre eles, os radioisótopos ou o material fluorescente pode dar um sinal detectável, mesmo quando usados isoladamente. Por outro lado, quando utilizados sozinhos, as enzimas, o material luminescente, a biotina ou 127 a avidina não providenciam qualquer sinal detectável, mas quando reagem com uma ou mais substâncias podem providenciar sinais detectáveis. Por exemplo, quando o marcador é uma enzima, é necessário pelo menos um substrato para a detecção. Vários tipos de substratos podem ser utilizados consoante o tipo de processo para medir a actividade enzimática (colorimetria, fluoroscopia, processo utilizando a bioluminescência ou a luminescência quimica, etc.) . Por exemplo, quando o marcador é a peroxidase, pode-se usar o peróxido de hidrogénio como substrato. Alternativamente, quando o marcador é a biotina, normalmente utiliza-se avidina ou avidina modificada por uma enzima, mas não é limitativo. Conforme a necessidade, uma variedade de substâncias luminescentes podem ser utilizadas consoante o tipo de substrato a ser utilizado.
Qualquer um dos marcadores mencionados antes pode ser utilizado na presente invenção. No entanto, o marcador preferido é uma enzima tal como peroxidase ou biotina considerando a sensibilidade de detecção ou a análise, bem como a facilidade de manipulação.
Um "processo para identificar uma substância capaz de se ligar a AILIM ou a um ligando de AILIM", de acordo com a presente invenção, implementa-se com base no principio do imunoensaio.
Especificamente, podem aplicar-se os princípios de vários processos, conforme descrito em "Immunoassay (3a edição, eds. Eiji Ishikawa et al, Igakushoin, 1987)".
Exemplos dos princípios utilizados incluem, preferencialmente, o processo de um anticorpo em fase sólida, um processo de dois anticorpos em fase líquida, um 128 processo de dois anticorpos em fase sólida, um processo em sanduíche e um processo "one-pot", conforme descrito no pedido de patente japonesa examinado e publicado (JP-B) No. Hei 2-39747. Além disso, o processo de ensaio que utiliza uma reacção de antigénio-anticorpo é exemplificado pelo processo TIEM (técnica de imunoensaio enzimático de multiplicação), imunoensaio de reacção enzimática em cadeia, imunoensaio enzimático mediado por um modulador de enzima (IEMME), imunoensaio inibidor de enzimas, ensaio imunoenzimométrico, imunoensaio de reforço de enzimas e imunoensaio de ligação proximal.
Na presente invenção, pode-se seleccionar correctamente qualquer um desses princípios de imunoensaio, de acordo com a respective finalidade. No entanto, tendo em consideração a conveniência do processo e/ou a vantagem económica e particularmente a versatilidade clínica, o princípio do processo de sanduíche, o processo one-pot ou o processo de um anticorpo em fase sólida, de preferência utiliza-se o processo de sanduíche e o processo one-pot. Particularmente preferido é o processo de sanduíche utilizando uma placa microtituladora com vários poços, tal como uma placa microtituladora de 96 poços ou um processo one-pot utilizando pérolas em que o polipéptido está imobilizado e também uma contraparte marcada com uma enzima, tal como peroxidase ou com biotina.
Os anticorpos monoclonais humanos da presente invenção capazes de se ligarem a AILIM humana são de origem humana e, portanto, esses anticorpos não induzem uma imunorejeição grave, devido à antigenicidade para o ser humano, ou seja, AHAR (antigenicidade humana anti-rato) num hospedeiro, que tem sido um grave problema terapêutico (efeitos colaterais) em preparações farmacêuticas de anticorpos compreendendo 129 anticorpos não-humanos derivados de mamíferos, tal como o anticorpo derivado de murganho. 0 anticorpo da presente invenção é, portanto, de grande valor como um anticorpo farmacêutico.
Assim, o anticorpo monoclonal humano da presente invenção contra AILIM (especialmente AILIM humana) e composições farmacêuticas compreendendo o anticorpo monoclonal humano não provocam nenhuma immunorejeição do hospedeiro causada por AHAR; e assim pode ser usado como preparações farmacêuticos capazes de controlarem uma variedade de factores de reacções biológicas (por exemplo, proliferação de células que expressam AILIM, produção de citocinas por células que expressam AILIM, citólise imunitária ou morte celular (apoptose) de células que expressam AILIM e a actividade de indução de danos dependente de anticorpos de células que expressam AILIM) associados à transdução de sinal co-estimulador estimulado por AILIM (sinal secundário) para as células que expressam AILIM; e/ou pode ser usado para tratar ou prevenir várias doenças associadas à transdução do sinal mediada por AILIM, controlando e inibindo o aparecimento e/ou o progresso das doenças.
Especificamente, através do fornecimento de preparações farmacêuticas contendo o anticorpo monoclonal humano anti-AILIM da presente invenção ou uma parte dele, como ingrediente activo é possível inibir ou tratar e prevenir, por exemplo, uma variedade de doenças (por exemplo, artrite reumatóide, esclerose múltipla, tiroidite auto-imune, dermatite alérgica de contacto, líquen plano como uma doença inflamatória crónica da pele, lupus eritematoso sistémico, diabetes mellitus dependente de insulina, psoríase, etc.) classificam-se em doenças auto-imunes ou doenças alérgicas (nomeadamente, doenças auto- 130 imunes e alergias retardadas pela imunidade celular); artropatias (por exemplo, artrite reumatóide (AR) , osteoartrose (OA)), inflamação (por exemplo, hepatite); reacção do hospedeiro versus o enxerto (reacção de HVE); doença do hospedeiro versus o enxerto (doença do hospedeiro versus o enxerto; DHVE); immunorejeição associada ao transplante (enxerto alogénico ou enxerto heterogéneo) de tecidos (tecidos tais como a pele, a córnea e os ossos) ou órgãos (figado, coração, pulmão, rim, pâncreas, etc.); resposta imunitária ao antigénio estranho ou ao auto-antigénio (por exemplo, a produção de anticorpos contra o antigénio, a proliferação celular, a produção de citocinas, etc.); e doenças que são potencialmente causada por uma anomalia na imunidade do intestino (especificamente, doença inflamatória intestinal (em particular, a doença de Crohn e a colite ulcerosa); e alergia alimentar, etc.
As composições farmacêuticas, de acordo com a presente invenção tornam possivel tratar ou prevenir algumas inflamações para as quais se utilizam vários fármacos esteróides como fármacos anti-inflamatórios, por exemplo, a inflamação associada a várias artrites (artrite reumatóide, osteoartrite, etc.), pneumonia, hepatite (incluindo hepatite virai), a inflamação associada a doenças infecciosas, doença inflamatória intestinal, enterite, nefrite (nefrite glomerular, inflamação associada com fibrose renal), gastrite, vasculite, pancreatite, peritonite, bronquite, miocardite, encefalite, inflamação associada a ferida de reperfusão isquémica (ferida de reperfusão isquémica do miocárdio, etc.), a inflamação associada com immunorejeição após o transplante de tecidos ou órgãos, escaldadura, inflamações cutâneas diversas (psoriase, dermatite alérgica de contacto, líquen plano como uma doença inflamatória crónica da pele), a inflamação 131 associada com múltiplos falhas de um órgão, a inflamação após a operação de ATPC (angioplastia transluminal percutânea coronária) ou PTCR e inflamação associada à aterosclerose, tiroidite auto-imune, etc.
Além disso, no que diz respeito à inibição mencionada antes e ao tratamento da immunorejeição associada ao transplante de tecidos ou órgãos, como descrito antes, as composições farmacêuticas, de acordo com a presente invenção podem ser usadas em conjunto com imunossupressores conhecidos usados para inibir a immunorejeição em terapia de transplante, aumentando assim o efeito do fármaco conhecido para inibir a rejeição do enxerto.
Além disso, através da utilização do processo de identificação de substâncias capazes de se ligarem a AILIM ou a ligandos de AILIM, que está dentro do âmbito da presente invenção, é possivel controlar a transdução de sinal associada com a interacção entre AILIM e o ligando de AILIM através da ligação a AILIM ou ao ligando de AILIM e assim conseguir a triagem e a selecção de agentes farmacêuticos (compostos quimico sintético e anticorpo) com actividade potencial para tratar as várias doença referidas antes. A presente invenção é ilustrada com mais detalhe a seguir, com referência aos exemplos, mas que não devem ser interpretados como sendo limitativos.
Exemplo 1 Preparação do imunogénio <1—1> Preparação da célula recombinante que expressa AILIM humana 132
Prepararam-se dois tipos de células recombinantes (células OHC e células HPB-ALL) que sobre-expressam AILIM humana, de acordo com o processo descrito em pedidos de patentes anteriores (JP-A No. Hei 11-29599 e W098/38216) , bem como num relatório anterior (Int. Immunology, Vol.12, No.l, p.51-55, 2000) de um dos presentes inventores, Tezuka. Especificamente, o processo é o seguinte:
Inseriu-se um ADNc (número de acesso no GenBank: AB023135 (ADNc); BAA82129 (aminoácido) contendo o ORF de comprimento completo que codifica a AILIM humana num vector pEF-neo. Em seguida, o vector de expressão recombinante resultante foi introduzido em células de ovário de hamster chinês (células OHC) e as células de uma linha de timoma humano, HPB-ALL, de acordo com um processo utilizado normalmente e que utiliza a electroporação a 320 V) com um Gene Pulser (BioRad). Fez-se a cultura das respectivas células em meio RPMI 1640 contendo geneticina (0,8 mg/ml; Gibco BRL) e 10% de SBF para seleccionar células transformadas resistentes a fármacos. <l-2> Selecção de células HPB-ALL recombinantes que sobre-expresam AILIMs humanas
Centrifugou-se a cultura de células HPB-ALL, resistentes a fármacos, seleccionadas em <1-1> descrito antes para se obter péletes de células. Adicionou-se um anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana, designado por "SA12" (anticorpo monoclonal de murganho do antigénio anti-JTT humano) , que tinha sido criado e relatado anteriormente (JP-A 11-29599 (exemplo 12) e W098/38216 (exemplo 12)) pelos presentes inventores, aos péletes de células (concentração: adicionou-se uma solução de anticorpo (10 pg/ml) diluído com EDTA-ASB/STF na 133 proporção de 100 μ1/105 células). As misturas resultantes foram incubadas a 4 °C durante 30 minutos. As células foram lavadas duas vezes com EDTA-ASB/STF mencionado antes (200 μΐ) e, em seguida, adicionou-se estreptavidina marcada com ficoeritrina (SA-PE; Pipete 100 μΐ de uma solução diluida 500 vezes). As misturas resultantes foram incubadas a 4 °C durante 30 minutos. Após a incubação, as células foram lavadas 3 vezes com EDTA-ASB/STF e prepararam-se as suspensões celulares.
Os niveis de expressão de AILIM humana das respectivas células, nas suspensões de células, foram analisados num citómetro de fluxo, FACSort (Beckton-Dichinson), para seleccionar as células recombinantes HPB-ALL que sobre-expressam AILIM humana. As células seleccionadas foram cultivadas em meio RPMI 1640 contendo 10 % de SBF e G418 (1 mg/ml) até à confluência. <l-2> Selecção de células recombinantes de OHC que sobre- expresam AILIMs humanas
Centrifugou-se a cultura de células OHC, resistentes a fármacos, seleccionadas em <1-1> descrito antes para se obter péletes de células. Adicionou-se o anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana referido antes, SA12, que tinha sido marcado com ITCF (isotiocianato de fluoresceina), a cada pélete celular (solução de anticorpo (100 pg/ml) diluida com EDTA-ASB/STF). As misturas resultantes foram incubadas a 4 °C durante 30 minutos. As células foram lavadas com a solução de EDTA-BSA/STF mencionada antes e, em seguida, prepararam-se as suspensões celulares adicionando EDTA-ASB/STF (500 μΐ) aos péletes de células. 134
Os niveis de expressão de AILIM humana das respectivas células nas suspensões de células foram analisados num citómetro de fluxo, FACSort (Beckton-Dichinson), para seleccionar as células recombinantes de HPB-ALL que sobre-expressam AILIM humana. As células seleccionadas foram cultivadas em meio RPMI 1640 contendo 10 % de SBF e G418 (1 mg/ml) até à confluência. <l-2> Preparação do imunogénio a partir de células HPB-ALL que sobre-expresam AILIMs humanas
Centrifugaram-se as células HPB-ALL que sobre-expresam AILIMs humanas, que tinham sido obtidas antes em <l-2> descrito antes. Lavaram-se os péletes celulares recuperados, 4 vezes, com tampão de fosfato (STF; Nikken Seibutsu) e depois fez-se novamente uma suspensão em tampão contendo inibidor de protease (contendo HEPES 25mM (pH 7,4), MgCl2 10 mM, sacarose 0,25 M e inibidor de protease (10 U/ml de aprotinina, 2 pg/ml de pepistatina, 50 pg/ml de leupeptina e 0,35 mg/ml de PMSF)). A suspensão celular foi tratada num homogeneizador do tipo Potter e centrifugada a uma velocidade baixa (a 1, 500 rpm a 4 °C durante 10 minutos) . Posteriormente, o sobrenadante resultante foi submetido a ultracentrifugação (abaixo de 100.000 g a 4 °C durante 1 hora). Recuperou-se a fracção de membrana precipitada e suspendeu-se em tampão de fosfato (a concentração da fracção de membrana foi ajustada de modo a que 1 ml de STF contivesse a fracção de membrana derivada de 1 x 107 células). A suspensão foi armazenada a -8 °C. A suspensão contendo a fracção de membrana de células foi utilizada como antigénio (imunogénio) para preparar os anticorpos humanos da presente invenção, que será descrita mais tarde. 135 <l-5> Preparação do imunogénio a partir de células de OHC que sobre-expresam AILIMs humanas
As células de OHC que sobre-expressam AILIMs humanas, que tinham sido obtidas em <l-3>, conforme descrito antes, foram dispersas com um raspador e foram centrifugadas. Lavaram-se os péletes celulares recuperados, 4 vezes, com tampão de fosfato (STF; Nikken Seibutsu) e depois fez-se novamente uma suspensão em tampão contendo inibidor de protease (contendo HEPES 25mM (pH 7,4), MgCl2 10 mM, sacarose 0,25 M e inibidor de protease (10 U/ml de aprotinina, 2 pg/ml de pepistatina, 50 pg/ml de leupeptina e 0,35 mg/ml de PMSF)). A suspensão celular foi tratada num homogeneizador do tipo Potter e centrifugada a uma velocidade baixa (a 1, 500 rpm a 4 °C durante 10 minutos). Posteriormente, o sobrenadante resultante foi submetido a ultracentrifugação (abaixo de 100.000 g a 4 °C durante 1 hora) . Recuperou-se a fracção de membrana precipitada e suspendeu-se em tampão de fosfato (a concentração da fracção de membrana foi ajustada de modo a que 1 ml de STF contivesse a fracção da membrana derivada de 1 χ 107 células). A suspensão foi armazenada a -80 °C. A suspensão contendo a fracção da membrana de células foi utilizada como antigénio (imunogénio) para preparar os anticorpos humanos da presente invenção, que será descrita mais tarde.
Exemplo 2 Preparação de hibridomas produtores de anticorpos monoclonais humanos anti-AILIMs humanas 136
No presente exemplo, a preparação de anticorpos monoclonais foi realizada de acordo com um processo típico, conforme descrito em "Experimental Medicine (suplemento) , Handbook for Cell Technology" (eds., T. Kuroki et al., Yodosha, pp. 66-74, 1992) e "Experimental Manual for
Monoclonal Antibody" (T. Ando et al., Kodansha, 1991). A fracção da membrana de células preparada a partir de células recombinantes que sobre-expressam AILIM humana, prevista no exemplo 1, foi usada como imunogénio de AILIM humana.
Os animais que foram submetidos a imunização foram ratos transgénicos que produzem anticorpos humanos criados pelo processo descrito antes (Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994; Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997; tradução japonesa publicada do pedido de patente internacional No. Hei 4-504365; tradução japonesa publicada do pedido de patente internacional No. Hei 7-509137; Nikkei Science, Junho, pp. 40-50, 1995; etc.).
Utilizaram-se microplacas, com vários poços, para a cultura de células. <2-l> Imunização e preparação de hibridomas
Qualquer um dos imunogénios (100 pl/murganho/ administração) preparado em <l-4> (derivado de HPB-ALL) e em <l-5> (derivado de OHC) , descrito antes foi dado ao rato transgénico mencionado antes, que produz anticorpos humanos. Injectou-se o imunogénio, em conjunto com adjuvante de Freund completo (ICN/CAPPEL), na pata, como imunização primária (dia 0). 137
Após a imunização primária, cada um dos dois imunogénios foi injectado adicionalmente na pata, com uma semana de intervalo, como imunização secundária e/ou imunização terciária. Da mesma maneira, deu-se a injecção para a imunização final dois dias antes da preparação de linfócitos, que está descrita a seguir.
Dois dias após a imunização final, prepararam-se os linfócitos a partir de nódulos linfáticos (subinguinal e subgenual) e baços dos respectivos ratos transgénicos submetidos à imunização. Misturaram-se os linfócitos e as células de mieloma de rato P3/X63-AG8. 653 (ATCC No. CRL- 1580) na proporção de 5:1 e adicionou-se, como agente de fusão, polietileno-glicol 1500 (Boehringer Mannheim). Em seguida, diluiu-se a mistura com 10 volumes de meio básico isento de soro EX-CELL301 (JRH Bioscience). Posteriormente, as células em mistura foram lavadas com o meio basal e, em seguida, suspenderam-se em meio HAT (1 L de meio basal continha 13,61 mg de hipoxantina, 176 yg de aminopterina e 3,88 mg de timidina). As células foram semeadas em microplacas de 96 poços e cultivadas durante 10-14 dias para completar a fusão celular. O tratamento de fusão celular originou muitos hibridomas. <2-2> Triagem de hibridomas que produzem anticorpos monoclonais humanos
Um certo número de hibridomas preparado em <2-l>, descrito antes, foi rastreado por meio de ELISA das células, conforme descrito a seguir, para seleccionar os hibridomas produtores de anticorpos monoclonais humanos contra AILIM humana. 138
As respectivas células recombinantes HPB-ALL e as células OHC recombinantes sobre-expressam AILIMs humanas, que estão descritas antes, foram semeadas em cada poço da microplaca de ELISA de 96 poços (1 χ 105 células/poço) . A incubação foi realizada a 37 °C durante 2 dias.
Posteriormente, o sobrenadante de cada poço foi descartado, as amostras de sobrenadante de cada cultura de hibridomas foram adicionadas (50 μΐ/poço) e a mistura foi incubada durante 1 hora. Após a reacção estar completa, a solução da mistura de amostras é descartada e lava-se cada poço 3 vezes com STF contendo ASB a 1 % (Sigma).
Posteriormente, adicionou-se o anticorpo (Fc) da imunoglobulina de cabra anti-humana conjugada com peroxidase (50 μΐ de uma diluição de 2.000 vezes por poço; Ameircan Corex; ASB/STF a 1%) a cada poço, a fim de detectar a cadeia pesada da imunoglobulina humana (anticorpo monoclonal humano) no sobrenadante do hibridoma. A mistura foi incubada à temperatura ambiente durante uma hora.
Por outro lado, adicionou-se o anticorpo de cadeia κ de cabra anti-imunoglobulina humana, conjugado com peroxidase (50 μΐ de uma diluição de 2.000 vezes por poço) a cada poço, a fim de detectar a cadeia leve da imunoglobulina humana (anticorpo monoclonal humano) no sobrenadante do hibridoma. A mistura foi incubada à temperatura ambiente durante 15 minutos. O anticorpo anti-IgFc humano ou o anticorpo anti-IgFx humano foi retirado de cada poço da microplaca e, em seguida, as placas foram lavadas 3 vezes com STF contendo ASB a 1 %. Adicionou-se tetrametilbenzidina (3,3'5,5'- 139 tetrametilbenzidina (TMB), 100 μΐ/poço, BIO-RAD) a cada poço e incubou-se a mistura resultante à temperatura ambiente durante 15 minutos.
Posteriormente, adicionou-se H2S04 IN a cada poço (50 μΐ/poço), para extinguir a reacção. A reacção foi monitorizada por densidade óptica a um comprimento de onda de 450 nm através de um leitor de microplacas (leitor de microplacas do modelo 3550, BIO-RAD). O controlo das experiências por ELISA foi realizado da mesma forma que se descreveu antes, utilizando os seguintes itens: (1) Células HPB-ALL de tipo selvagem, em vez de células HPB-ALL recombinantes que expressam AILIMs humanas; (2) Células de OHC de tipo selvagem, em vez de células de OHC recombinantes que expressam AILIMs humanas; (3) Anticorpos monoclonais de murganho contra AILIM humana (SA12 ou SG430; JP-A 11-29599 (exemplo 12) e W098/38216 (exemplo 12)) em vez do sobrenadante de hibridoma; (4) Anticorpo monoclonal humano contra HML (hemocianina de molusco semelhante à lapa; em inglês HML (keyhole limpet hemocianina, PIERCE) em vez de sobrenadante do hibridoma. O anticorpo monoclonal humano anti-HML foi preparado de acordo com a maneira descrita antes em <2-l>, por meio da imunização dos ratos transgénicos mencionados antes, que produzem anticorpos humanos, com HML (hemocianina de molusco semelhante à lapa, PIERCE). 140
Seleccionaram-se muitos hibridomas produtores de anticorpos monoclonais humanos capazes de se ligarem a AILIMs humanas pela referida triagem. <2-3> Clonagem primária de hibridomas
Estabeleceram-se muitos tipos de monoclones de hibridomas a partir da hibridomas diferentes (linhagens de células parentais), que tinham sido seleccionados em <2-2> descrito antes, produzindo anticorpos monoclonais humanos contra AILIMs humanas, pelo procedimento de ensaio que se segue.
Os respectivos hibridomas, seleccionados em <2-2>, descritos antes, foram semeados em microplacas de 24 poços. A contagem de células de hibridoma, em cada poço, foi determinada por pipetagem. Posteriormente, adicionou-se soro bovino fetal a 10 % (STF; Trace Bioscience PTY) , penicilina/estreptomicina a 1 % (Sigma), suplemento de HT a 1 % (Gibco BRL) e suplemento de cultura T-STIM a 2,5 % (Collaborative Biomedical Produtos) ao meio EX-CELL301 (JRH Bioscience), contendo L-glutamina 4,0 mM e lipidos. O meio modificado resultante foi usado para diluir os hibridomas para 1 χ 104 células/ml e as células foram suspensas em cada poço.
Combinaram-se as suspensões de células (300 μΐ ou 600 μΐ) de cada poço com o meio modificado (150 ml ou 300 ml) e, em seguida, adicionou-se uma alíquota de 200 μΐ da suspensão de células a cada poço da microplaca de 96 poços, de tal forma que cada poço contivesse 4 células de hibridoma. O meio modificado mencionado antes (50 ml ou 100 ml) foi adicionado ainda fresco à suspensão de células remanescente, que foi bem misturada e, em seguida, 141 adicionou-se a suspensão celular resultante a cada poço de outras microplacas de 96 poços preparada recentemente, de tal forma que cada poço contivesse 2 células de hibridoma.
Continuou-se a cultura durante 1 a 2 semanas. Após a cultura, encontraram-se, em muitos poços, colónias únicas derivadas de um único hibridoma.
Com o ensaio por ELISA das células, conforme descrito antes em <2-2>, verificou-se que os anticorpos monoclonais humanos contra AILIMs humanas foram produzidos no sobrenadante da cultura em cada poço contendo a colónia. <2-3> Clonagem secundária de hibridomas A subclonagem (clonagem secundária) de cada clone dos vários clones de hibridoma obtidos antes em <2-3> foi realizada de acordo com o mesmo processo descrito em <2-3>.
Na presente experiência, ajustou-se a densidade das células de cada poço numa microplaca de 96 poços para 1 célula/poço. A triagem originou muitos monoclones de hibridoma produtores de anticorpos monoclonais humanos contra AILIMs humanas. Parte dos clones incluídos eram os seguintes: (Nome do clone) AIF34 (JMabl24), AIF182 (JMab-126), AIF348 (JMab-127), AIF620 (JMab-128), AIF1052 (JMab-135), AIH5D3 (JMab- 136) , AIH386 (JMab-137), AII289 (JMab-138), AII394 (JMab- 142 139) , AI 1488 (JMab-140), AIJ40 (JMab-141).
Os nomes indicados antes são usados ao longo do presente pedido de patente, nomeadamente em todos os exemplos descritos a seguir, incluindo o presente exemplo e nas figuras e quadros contendo o resultado do ensaio obtido neste exemplo.
Exemplo 3 Análise das propriedades dos anticorpos monoclonais <3-l> Análises da cadeia pesada e da cadeia leve
Usando o ensaio por ELISA e a citometria de fluxo descritos a seguir, verificou-se que o anticorpo monoclonal contra AILIM humana, produzido por cada clone de hibridoma que tinha sido clonado em <2-4>, descrito antes, era efectivamente um anticorpo monoclonal humano.
As células recombinantes HPB-ALL que sobre-expressam AILIMs humanas, que tinham sido preparadas no exemplo 1, foram semeadas em cada poço em forma de v da microplaca (3 x 104 células/poço). As células foram cultivadas a 37 °C em meio RPMI 1640 contendo SBF a 10 %.
Depois de a cultura estar concluída, a placa foi centrifugada (a 1.800 rpm durante 2 minutos) para precipitar as células e, em seguida o sobrenadante resultante foi descartado. Posteriormente, adicionou-se, a cada poço, a amostra de sobrenadante (50 μΐ/poço) a partir da cultura de cada hibridoma clonado em <2-4> descrito antes ou o anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana, SA12 (2 pg/50 μΐ) ou, alternativamente, o anticorpo 143 monoclonal humano anti-HML (50 μΐ/poço) como um anticorpo de controlo. A mistura reagiu durante 30 minutos num frigorifico. Após a reacção, a solução da amostra foi descartada e lavou-se cada poço com tampão de fosfato (ASBa 0,5 %-STF contendo EDTA 5 mM) .
Posteriormente, adicionou-se qualquer um dos anticorpos secundários que se seguem, a cada poço, (diluído 1000 vezes com o tampão de fosfato anterior e adicionou-se numa quantidade de 50 μΐ/poço) , a fim de suspender as células. A suspensão reagiu durante 30 minutos num frigorífico. (Anticorpo secundário)
Anticorpo anti-IgG humana, marcado com biotina (Zymed);
Anticorpo anti-IgG humana, marcado com biotina (Protos);
Anticorpo anti-IgFcG humana, marcado com biotina (EY
Laboratories); ou
Anticorpo anti-IgK humana, marcado com biotina (Vector);
Após a reacção, o anticorpo secundário foi descartado e lavou-se cada poço da placa com o tampão de fosfato referido antes. Em seguida, adicionou-se, a cada poço, estreptavidina marcada com ficoeritrina (estreptavidina-PE; Pharmingen, diluída 500 vezes com o tampão de fosfato referido antes e adicionou-se numa quantidade de 50 μΐ/poço). A mistura reagiu durante 30 minutos num frigorífico. Após a reacção, lavou-se cada poço com o tampão fosfato mencionado antes. Em seguida, adicionou-se a cada poço (200 μΐ/poço) o tampão de fosfato mencionado antes, a fim de suspender as células. 144 A análise foi realizada para determinar a reactividade do anticorpo monoclonal anti-AILIM humana no sobrenadante da cultura de cada clone de hibridoma com as células HPB-ALL que sobre-expressam AILIMs humanas em cada poço. 0 ensaio de controlo foi realizado da mesma forma que se descreveu antes, utilizando os seguintes itens: (1) Células HPB-ALL de tipo selvagem em vez de células HPB-ALL recombinantes que expressam AILIMs humanas; (2) Anticorpo monoclonal humano contra HML (hemocianina de molusco semelhante à lapa; em inglês HML (keyhole limpet hemocianina, PIERCE) em vez de sobrenadante hibridoma. 0 anticorpo monoclonal humano anti-HML foi preparado de acordo com a maneira descrita antes em <2-l>, por meio da imunização dos ratos transgénicos mencionados antes, que produzem anticorpos humanos, com HML (hemocianina de molusco semelhante à lapa, PIERCE).
Verificou-se, com base no resultado, que todos os clones de hibridomas descritos antes em <2-4> eram anticorpos monoclonais humanos que consistiam em cadeias pesadas de origem humana e cadeias leves κ de origem humana.
Um exemplo do resultado está ilustrado na figura 1, que envolve o resultado do ensaio para os clones de hibridomas AIH5D3 (JMab-136), AII289 (JMab-138) e AII394 (JMab-139). <3-2> Genotipagem de anticorpo monoclonal humano 145
Determinou-se o isotipo para cada um dos anticorpos monoclonais humanos anti-AILIMs humanas, produzidos pelos hibridomas que tinham sido clonados em <2-4> e analisados em <3-l> descritos antes. A determinação foi feita usando um estojo de genotipagem de anticorpos monoclonais humanos (American Qualex), de acordo com o protocolo experimental anexo ao estojo.
Determinou-se que todos os anticorpos monoclonais humanos anti-AILIMs humanas eram IgG2/K.
Exemplo 4 Preparação de anticorpos monoclonais humanos contra AILIMs humanas (anticorpo monoclonal humano anti-AILIMs humanas) em grande escala e a sua purificação <4-l> Processo 1
As células de cada clone de hibridoma produtoras de anticorpos monoclonais humanos anti-AILIMs humanas, que tinham sido preparadas em <2-4>, como descrito antes, foram adicionadas a um frasco de cultura de tecido (50 ml, FALCON) e deixadas em cultura em meio ASF104 (Ajinomoto) contendo STF de IgG de bovino ultra reduzido a 10 % (GIBCO-BRL) , até à confluência, numa atmosfera de CO2 a 5 %, a 37 °C.
Posteriormente, transferiu-se todo o liquido da cultura para um novo frasco de cultura de tecidos (750 ml, FALCON) e fez-se a cultura das células em meio ASF104 (Ajinomoto), contendo STF de IgG de bovino ultra reduzido a 10 % (GIBCO-BRL) , até à confluência, numa atmosfera de CO2 a 5 %, a 37 °C. 10 a 20 dias após a cultura, o sobrenadante da cultura de cada hibridoma foi recuperado e transferido para um tubo 146 cónico de polipropileno de 50 ml (FALCON) . O tubo foi centrifugado a 500xg durante 5 minutos.
Posteriormente, o sobrenadante resultante, centrifugado foi filtrado através de uma unidade de filtro de esterilização (NALGEN) e recuperou-se o filtrado.
Carregou-se o filtrado numa coluna de proteína G da HiTrap (coluna de afinidade de proteína G da HiTrap; Amersham Pharmacia) pré-equilibrada com tampão de fosfato (30 ml) a uma velocidade de fluxo de 3 ml/min.
Posteriormente, lavou-se a coluna com tampão de fosfato (20 ml) e, em seguida, o anticorpo de interesse foi eluído por meio de um carregamento com tampão de citrato 100 mM (pH 2,0) numa coluna, a uma velocidade baixa de cerca de 1 ml/min. Posteriormente, a solução eluída foi neutralizado com uma solução (pH 9,0) de Tris-HCl 750 mM e, em seguida, filtrou-se através de um filtro (Millipore) para eliminar o precipitado branco. O filtrado resultante foi dialisado contra tampão de fosfato (durante a noite) e filtrou-se através de um filtro (Millipore). Obteve-se assim o anticorpo monoclonal humano anti-AILIM, purificado, a partir de cada linha de hibridoma.
Determinou-se a concentração de proteínas a partir da densidade óptica a A28o, utilizando um f otoespectrómetro (1A280 =1,41 mg/ml) . <4-2> Processo 2
As células de cada clone de hibridoma, que tinham sido preparadas em <2-4>, descrito antes, foram acondicionadas em meio ASF104 (Ajinomoto) contendo STF de IgG de bovino ultra reduzido a 10 % (Gibco-BRL) (cada com 1-2 χ 106 147 células/ml) e foram semeadas e cultivadas numa linha de células Integra 1000 (INTEGRA CL1000, INTEGRA BIOSCIENCE). 7 a 10 dias após a cultura, quando a densidade celular atingiu 1 χ 108 células/ml, recuperou-se o sobrenadante de cada cultura de hibridoma.
Carregou-se o sobrenadante de cada cultura numa coluna de proteína G da HiTrap (coluna de afinidade de proteina G HiTrap; Amersham Pharmacia) pré-equilibrada com tampão de fosfato (30 ml), a uma velocidade de fluxo de 3 ml/min.
Posteriormente, lavou-se a coluna com tampão de fosfato (20 ml) e, em seguida carregou-se a coluna com tampão de citrato 100 mM (pH 2,0) a uma velocidade de fluxo de cerca de 1 ml/min para eluir o anticorpo. Depois adicionou-se uma solução (pH 9,0) de Tris-HCl 750 mM para neutralizar a solução eluída; e a solução resultante foi filtrada através de um filtro (Millipore) para eliminar o precipitado branco. O filtrado resultante foi dialisado contra tampão de fosfato (durante a noite) e depois filtrou-se através de um filtro (Millipore). Obteve-se assim o anticorpo monoclonal humano, anti-AILIM, purificado, a partir de cada linha de hibridoma.
Exemplo 5 Reactividade de anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana em relação a AILIM humana e a respectiva reactividade cruzada em relação a AILIM de murganho e AILIM de rato
Analisaram-se vários anticorpos monoclonais humanos ant-AILIM humama quanto à sua reactividade em relação a AILIM humanas, bem como a reactividade cruzada com AILIM de murganho e AILIM de rato utilizando o processo ELISA nas células. 148 <5-l> Estabelecimento do sistema ELISA para determinar a concentração de anticorpos de IgG e a preparação das curvas de calibração
Como todos os anticorpos monoclonais humanos purificados, anti-AILIMs humanas, mencionados antes, eram anticorpos de IgG (IgG2), estabeleceu-se o sistema ELISA para determinar a concentração de anticorpos de IgG.
Adicionou-se o anticorpo caprino anti-IgG humana (Fc) (1,2 yg/ml em STF; 100 μΐ/poço; Organon Teknika) a cada poço de uma microplaca de ELISA de 96 poços (Nunc). A placa foi incubada à temperatura ambiente durante 2 horas para adsorver o anticorpo anti-IgG (Fc) na microplaca. Posteriormente, o sobrenadante foi descartado e a placa foi lavada 3 vezes com tampão de fosfato (STF) contendo Tween 20 a 0,05 %. Adicionou-se um reagente de bloqueio (STF contendo albumina de soro bovino (ASB) a 0,5 % e Tween 20 a 0,1 %) a cada poço (200 μΐ/poço) e a placa foi incubada à temperatura ambiente durante 2 horas para bloquear os lugares isentos de anticorpo anti-IgG (Fc) na placa. Em seguida, o reagente de bloqueio foi descartado e cada poço foi lavado duas vezes com STF.
Os anticorpos de IgG2 de origem humana (50 μΐ/poço; The Binding Site), que foram usados como anticorpo padrão, foram adicionados, em diferentes concentrações (0 a 100 ng/ml), aos respectivos poços da placa e a placa foi incubada à temperatura ambiente durante 2 horas. As soluções excedentárias de anticorpo padrão foram eliminadas e lavou-se cada poço 3 vezes com tampão de fosfato contendo Tween 20 a 0,05 %. 149
Posteriormente, adicionou-se, a cada poço, anticorpos de cabra anti-IgG/κ humana, conjugados com peroxidase (diluido 4.000 vezes, 100 μΐ/poço, Protos) e a placa foi incubada à temperatura ambiente durante 1 hora. O sobrenadante foi descartado e a microplaca foi lavada 3 vezes com tampão de fosfato contendo Tween 20 a 0,05 %. Um tampão contendo substrato (composição: orto-fenilenodiamina (O-fenilenodiamina, OPD; 20mg)/tampão de citrato-fosfato (pH 5,0, 50 ml)/solução aquosa de peróxido de hidrogénio a 30 % (15 μΐ) foi adicionado a cada poço (100 μΐ/poço) e a placa foi incubada à temperatura ambiente durante cerca de 7 minutos.
Posteriormente, adicionou-se ácido sulfúrico 2M a cada poço (50 μΐ/poço) para extinguir a reacção. Fizeram-se as curvas de calibração (figura 2) com base nos valores da densidade óptica a um comprimento de onda de 490 nm utilizando um leitor de microplacas.
Realizaram-se ensaios de controlo apenas com meio de cultura ou apenas uma solução de ASB como uma substância de ensaio, da mesma forma que se descreveu antes. <5-2> Análises sobre a reactividade de vários anticorpos monoclonais humanos purificados anti-AILIM humana com AILIM humana, bem como sobre a reactividade cruzada dessa AILIM de murganho e AILIM de rato <5-2-l> Preparação dos reagentes
Os reagentes para serem usados neste ensaio de ELISA das células foram preparados como se segue: 150 <5-2-l-l> Preparação de células de OHC recombinantes que sobre-expressam a AILIM de murganhos
Prepararam-se as células de OHC recombinantes que sobre-expressam AILIM de murganho e obtiveram-se da mesma forma que foi descrita antes em <1-1> e <l-3>. 0 ADNc (número de acesso no GenBank: Ο AB023132 (ADNc); BAA82126 (aminoácido) ) contendo o ORF de comprimento completo de AILIM de murganho foi inserido num vector pEF-neo e em seguida o vector de expressão recombinante resultante foi introduzido em células de ovário de hamster chinês (células de OHC) através de um processo normalmente utilizado para electroporação (960 pF, 320 V), utilizando um gerador de impulsos de genes (BioRad). Fez-se a cultura das respectivas células em meio RPMI 1640 contendo geneticina (0,8 mg/ml; Gibco BRL) e 10% de SBF para seleccionar células transformadas resistentes a fármacos, obtendo-se assim células de OHC recombinantes que sobre-expressam AILIM de murganho. <5-2-l-2> Preparação de células de OHC recombinantes que sobre-expressam a AILIM de rato
Prepararam-se as células de OHC recombinantes que sobre-expressam AILIM de rato e obtiveram-se da mesma forma que foi descrita antes em <1-1> e <l-3>.
Um ADNc (número de acesso no GenBank: Ο AB023134 (ADNc); BAA82128 (aminoácido)) contendo o ORF de comprimento completo de AILIM de rato foi inserido num vector pEF-neo e em seguida o vector de expressão recombinante resultante foi introduzido em células de ovário de hamster chinês (células de OHC) através de um 151 processo normalmente utilizado para electroporação (960 pF, 320 V), utilizando um gerador de impulsos de genes (BioRad)· Fez-se a cultura das respectivas células em meio RPMI 1640 contendo geneticina (0,8 mg/ml; Gibco BRL) e 10% de SBF para seleccionar células transformadas resistentes a fármacos, obtendo-se assim células de OHC recombinantes que sobre-expressam AILIM de rato. <5-2-l-3> Preparação de anticorpos monoclonais contra AILIM de murganho
As células de OHC recombinante que sobre-expressam AILIM de murganho, que tinham sido preparadas em <5-2-l-l>, descritas antes, foram homogeneizadas e submetidas a ultracentrifugação (100.000 χ g). Recuperou-se a fracção da membrana das células contendo péletes e em seguida fez-se uma suspensão em STF. A fracção de membrana de células resultante foi injectada juntamente com adjuvante completo de Freund em ratos Wistar, na pata, para uma imunização primária (dia 0). O antigénio da fracção da membrana celular foi ainda dado a ratos na pata no 7o dia, 14° e 28° dias após a imunização primária. As células dos nódulos linfáticos foram recolhidas dois dias após a imunização final.
Combinaram-se as células dos nódulos linfáticos e as células de mieloma de murganho PAI (JCR No.B0113; Res. Disclosure, Vol. 217, p.155, 1982) à razão de 5:1. As células fundiram-se umas com as outras usando polietileno-glicol 4000 (Boehringer Mannheim) como agente de fusão para preparar hibridomas produtores de anticorpos monoclonais. A selecção dos hibridomas foi conseguida através da sua cultura em meio ASF104 (Ajinomoto) contendo HAT, soro bovino fetal a 10 % e aminopterina. 152
Determinou-se a reactividade de anticorpos monoclonais de rato no sobrenadante da cultura de cada hibridoma em relação a AILIM de murganho por meio da reacção do sobrenadante da cultura com as células de OHC, mencionadas antes, que expressam AILIM de murganho e em seguida mediu-se a intensidade da fluorescência das células coradas com anti-IgG de rato marcadas com ITCF (Cappel) num citómetro de fluxo de EPICS-ELITE. A triagem originou vários hibridomas que produzem anticorpos monoclonais, com reactividade contra AILIM de murganho.
Entre eles, uma das linhas de hibridoma foi designada por "B10.5". As células deste hibridoma foram injectadas intraperitonealmente (106 a 107 células/0,5 ml/murganho) em murganhos ICR nu/nu (fêmea, 7 a 8 semanas de idade) . 10 a 20 dias após a injecção, recolheu-se a ascite de cada murganho por laparotomia, sob anestesia, de acordo com um processo utilizado normalmente. O anticorpo monoclonal de rato anti-AILIM de murganho B10.5 (IgGl) foi preparado a partir das ascites, em grande escala. <5-2-2> A reactividade do anticorpo em relação a AILIM humana, de murganho e de rato
As concentrações dos anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana e o anticorpo de controlo, a serem utilizados no ensaio ELISA, descritos a seguir, foram determinadas com base no ensaio ELISA e nas curvas de calibração descritas antes em <5-l>.
Cada uma das células (7 χ 103 células/poço) das células recombinantes de OHC que sobre-expressam AILIM humana preparadas no exemplo 1, as células recombinantes de 153 OHC que sobre-expressam AILIM de murganho, preparadas em <5-2-l-l> descritas antes e as células recombinantes de OHC que sobre-expressam AILIM de rato preparadas em <5-2-l-2> descritas antes foram semeadas em poços de microplacas de ELISA de 96 poços e permaneceram em cultura até estarem confluentes a 37 °C.
Posteriormente, o sobrenadante foi descartado e então qualquer um dos vários anticorpos monoclonados humanos anti-AILIM humana ou o anticorpo de controlo preparado antes foram adicionados a cada poço (concentrações dos anticorpos: diluiu-se o anticorpo de 200 pg/ml com STF contendo ASB a 1 %, 3 vezes, 32 vezes r 33 vezes, 34 vezes , 35 vezes, 36 vezes, 37 vezes, 38 vezes, 39 vezes, 310 vezes, 311 vezes e 312 vezes) numa quantidade de 50 μΐ/poço e as placas reagiram à temperatura ambiente durante 2 horas. As soluções de anticorpos monoclonais foram eliminadas e lavou-se cada poço 3 vezes com tampão de fosfato contendo ASB a 1 % (Sigma).
Posteriormente, adicionou-se, a cada poço, anticorpos anti-IgG (Fc) humana, conjugados com peroxidase de rábano (diluiu-se 1.000 vezes, 50 μΐ/poço; American Qualex) e incubaram-se as placas à temperatura ambiente durante 1 hora. A solução excedentária do anticorpo marcado foi descartada e as microplacas foram lavadas 3 vezes com tampão de fosfato contendo ASB a 1 %. Adicionou-se um tampão contendo substrato (composição: orto-fenilenodiamina (O-fenilenodiamina, OPD; 20 mg)/tampão de citrato-fosfato (pH 5,0, 50 ml)/solução aquosa de peróxido de hidrogénio a 30 % (15 μΐ) a cada poço (100 μΐ/poço) e incubaram-se as placa à temperatura ambiente durante cerca de 7 minutos. 154
Posteriormente, adicionou-se ácido sulfúrico 2M a cada poço (50 μΐ/poço) para extinguir a reacção. Mediu-se a densidade óptica a um comprimento de onda de 490 nm através de um leitor de microplacas (Bio-Rad). O ensaio de controlo por ELISA foi realizado com os anticorpos de controlo que se seguem, para avaliar os anticorpos mencionados antes, da mesma forma que foi descrita antes: (1) Anticorpo monoclonal de murganho, SA12 ou SG430, contra AILIM humana (JP-A 11-29599 (exemplo 12) e W098/3821 (exemplo 12)); (2) Anticorpo monoclonal de rato B10.5 contra AILIM de murganho (<5 — 2 — 1 — 3> descrito antes); (3) Anticorpo monoclonal de murganho, JTT2, contra AILIM de rato (anticorpo monoclonal produzido por um hibridoma que tinha sido depositado internacionalmente em 11 de Outubro de 1996, com o número de acesso internacional FERM BP-5708 no Bioscience and Human-Technology, The Agency of Industrial Science and Technology, The Ministry of International Trade and Industry)), que é uma autoridade internacional de depósito no âmbito do Tratado de Budapeste; JP-A 11-29599 (exemplos 1 e 2) e W098/38216 (exemplos 1 e 2 ). (4) O anticorpo monoclonal humano produzido antes contra HML (hemocianina de molusco semelhante à lapa; PIERCE) em vez de sobrenadante de hibridoma. A experiência de controlo por meio de ELISA foi realizada da mesma forma que foi descrita antes utilizando células de OHC de tipo selvagem que se indicam a seguir, em vez de células recombinantes de OHC que expressam AILIM. 155 0 resultado está ilustrado nas figuras3 a 14.
Com base nos resultados obtidos, calculou-se a concentração efectiva a 50 % (DE50: ng/ml) como um índice para a reactividade de cada anticorpo monoclonal humano anti-AILIMs humanas em relação a AILIMs humanas (células recombinantes de OHC que sobre-expressam AILIMs humanas), AILIMs de murganho (células recombinantes de OHC que sobre-expressam AILIMs de murganho) ou AILIMs de rato (células recombinantes de OHC que sobre-expressam AILIMs de rato) . Os resultados obtidos pelo cálculo estão ilustrados a seguir. (A) DE50 para OHC sobre-expressando AILIMs humanas AIF 34 (JMab-124): 5,3ng/ml AIF182 (JMab-12 6) : 3,6ng/ml AIF348 (JMab-127): 9,lng/m AIF620 (JMab-128): 10,lng/ml AIF1052 (JMab-135) : 2,Ong/ml AIH5D3 (JMab-136): 7,5ng/ml AIH386 (JMab-137) : 9,6ng/ml AII289 (JMab-138): 10,5ng/ml AI13 94 (JMab-139): 10,6ng/ml AII488 (JMab-140): 11,Ong/ml AIJ 40 (JMab-141): 3,7ng/ml SA 12: 1,8ng/ml SG430: 1,2 ng/ml (B) DE50 para OHC sobre-expressando AILIMs de murganho AIF 34 (JMab-124): 42 ng/ml AIF348 (JMab-127): 81 ng/ml AIF620 (JMab-128): 100 ng/ml 156 AI 12 8 9 (JMab-138) : 53 ng/ml AI13 94 (JMab-13 9) : 60 ng/ml AII488 (JMab-140): 70 ng/ml (C) DE50 para OHC sobre- expressando AILIMs de rato AIF 34 (JMab-124): 45 ng/ml AIF348 (JMab-127): 62 ng/ml AIF620 (JMab-12 8) : 97 ng/ml AII289 (JMab-138): 57 ng/ml AI13 94 (JMab-139): 90 ng/ml AI14 8 8 (JMab-140): 90 ng/ml 0 resultado mostrou que os anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana da presente invenção apresentaram especificidades altamente significativas em relação às AILIMs humanas.
Além disso, foi revelado que 6 tipos de anticorpos monoclonais humanos anti-AILIMs humanas (ilustrado antes em (B) e (C) ) são reactivos tanto para as AILIMs de murganho como as AILIMs de rato (capacidade de ligação, reactividade cruzada).
Exemplo 6 Determinação da afinidade e da actividade de neutralização de anticorpos monoclonais humanos anti-AILIMs humanas contra o antigénio (AILIM humana)
Determinaram-se a constante da taxa de associação (ka), a constante da taxa de dissociação (kd) e a constante de dissociação (Kd) em relação à reacção entre cada um dos vários anticorpos monoclonais humanos purificados anti-AILIMs humanas, preparados antes e determinaram-se as 157 AILIMs humanas utilizando um estojo X da Biacore comercialmente disponível (Amersham Pharmacia). <6-l> Preparação do antigénio para ser imobilizado num chip sensor 0 antigénio a ser imobilizado num chip sensor do kit foi preparado como um antigénio recombinante quimérico (doravante referido como "AILIM-IgFc humana") consistindo numa região extracelular de AILIM humana e a região constante (Fc) da IgGl humana.
Preparou-se AILIM-IgFc humana através de uma maior purificação do antigénio obtido de acordo com o processo descrito em pedidos de patentes anteriores (JP-A 11-29599 (exemplo 16 (2)) e W098/3821 (exemplo 16 (2)) de um dos presentes inventores, Tezuka.
Carregou-se o sobrenadante da cultura de células recombinantes que produzem AILIM-IgFc humana numa coluna de proteina G da HiTrap (HiTrap coluna de afinidade de proteina G; Amersham-Pharmacia) pré-equilibrada com tampão de fosfato (30 ml) a uma velocidade de fluxo de 3 ml/min para adsorver a AILIM-IgFc humana no sobrenadante da cultura na coluna.
Posteriormente, lavou-se a coluna com tampão de fosfato (20 ml) e, em seguida, carregou-se a coluna com tampão de citrato 100 mM (pH 2,0) a uma velocidade de fluxo de cerca de 1 ml/min para eluir AILIM-IgFc humana. Posteriormente, a solução eluida foi neutralizada com uma solução (pH 9,0) de Tris-HCl 750 mM e, em seguida, dialisou-se contra tampão de fosfato (durante a noite). Depois, filtrou-se a solução dialisada, através de um 158 filtro (Millipore). Obteve-se assim AILIM-IgFc humana purificada.
Determinou-se a concentração de proteínas a partir da densidade óptica a A28o, utilizando um f otoespectrómetro (1A280 =1 mg/ml). Determinou-se a concentração de AILIM-
IgFc humana como sendo de 0,28 mg/ml. A proteína quimérica purificada consistia numa região extracelular de AILIM de rato e na região constante (Fc) da IgGl humana (AILIM-IgFc de rato; JP-A 11-29599 (exemplo 16) (2) e W098/382 (exemplo 16) (2) e também foi preparada da mesma forma descrita antes. Determinou-se que a concentração de AILIM-IgFc de rato obtida era de 0,45 mg/ml. <6-2> Determinação da afinidade e da actividade de neutralização
Os procedimentos experimentais, excepto para a imobilização do antigénio (AILIM-IgFc humana) no chip sensor, que está descrito a seguir, foram baseados no manual de instruções e no protocolo experimental anexo ao estojo de ensaio X da Biacore, comercialmente disponível (Amersham-Pharmacia).
Deixou-se o tampão de HBS (contendo HEPES 0,01 M, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM e detergente P20 a 0,005 % (pH 7,0)) fluir através de uma célula-1 de fluxo pertencente ao estojo, a um caudal de 5 μΐ/min. Posteriormente, adicionou-se uma solução (15 μΐ) contendo NHS (N-hidroxisuccinimida) 0,005 M e EDC (N-etil-N'-(dimetilaminopropil)carbodi-imida) 0,2 M para activar os grupos carboxilo de CM revestidos na superfície do chip sensor. 159
Posteriormente, adicionou-se 23 μΐ de uma solução de AILIM-IgFc humana (10 pg/ml, dissolvida em tampão de acetato de sódio 10 mM (pH 5,0)) para imobilizar AILIM-IgFc humana no chip sensor. Posteriormente, os grupos carboxilicos activados, que não reagiram, foram bloqueados pela adição de 35 μΐ de cloridrato de etanol-amina 1 M. As quantidades de AILIM-IgFc humana imobilizadas pelo tratamento de imobilização, realizado duas vezes, foi de 2.444 UR (unidade de ressonância) e 2.213 UR, respectivamente. A unidade, UR, corresponde à massa por unidade de área; 1UR = 1 pg/mm2. A célula 2 do fluxo, que é uma célula de fluxo de referência, foi submetida ao tratamento de isolamento na ausência de AILIM-IgFc humana, da mesma forma que se descreveu antes.
Deixou-se o tampão de fosfato fluir através da célula de fluxo (chip sensor) a uma velocidade de fluxo de 20 μΐ/min e adicionou-se (10 a 50 pg/ml, 60μ1) a cada um dos anticorpos monoclonais humanos purificados anti-AILIM humana, que tinham sido preparados no exemplo anterior. A condição padrão para a medição foi: fase de associação durante 3 minutos e fase de dissociação durante 10 minutos. As respectivas quantidades de anticorpo ligado e libertado a partir do antigénio foram monitorizadas ao longo do tempo para se obter um sensorgrama. A dissociação do anticorpo do antigénio foi conseguida fazendo passar STF através do chip sensor a uma velocidade de fluxo de 20 gl/min. 160
Com base nos resultados do sensorgrama, a constante da taxa de associação (ka), a constante da taxa de dissociação (kd) e a constante de dissociação (Kd, Kd = kd/ka) foram calculadas em computador usando o programa informático de análise (BIAevaluation 3.0) anexo ao estojo. A afinidade e a actividade neutralizante dos anticorpos monoclonais de murganho SA12 e SG430 em relação a AILIM humana, preparados no exemplo descrito antes, também foram analisados da mesma forma que se descreveu antes.
Os valores obtidos são apresentados a seguir. <nome do clone> <ka (l/M.Sec)> <kd [ 1/Sec] > <Kd (M)> FIA 34 ( JMab-124) 1,6 X 104 1,0 X 10"4 6, 3 X 10'9 AIF182 (JMab-12 6) 3,2 X 104 2,8 X 10"5 8,8 X 10"10 AIF348 (JMab-127) 1,9 X 104 6,4 X 10'5 3,4 X 10'9 AIF620 (JMab-128) 1,1 X 104 1,1 X 10-4 1,0 X 10-8 AIF1052 (JMab-135) 1,6 X 104 6, 3 X 10-5 3,9 X 10-9 AIH5D3 (JMab-136) 2,8 X 104 4,9 X IO-6 1.8 X o i—1 1 o í—1 AIH386 (JMab-137) 1,2 X 105 3,1 X 10-4 2, 6 X 10‘9 AI12 8 9 (JMab-138) 3,7 X 104 4,2 X 10-5 1,1 X 10‘9 AII394 (JMab-139) 3,1 X 104 2,4 X 10"5 7,7 X o i—1 1 o \—1 AI1488 (JMab-140) 2,3 X 104 3, 5 X 10-5 1,5 X 10-9 AIJ 40 (JMab-141) 1,9 X 104 1,9 X IO-5 1,0 X 10‘9 SA 12 7,8 X 103 7,9 X 10~5 1,0 X 10'8 SG430 2,2 X 104 1,5 X 10‘4 6, 8 X 10“9 O resultado mostra que todos os anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana e os anticorpos monoclonais de murganho anti-AILIM humana apresentam, marcadamente, uma 161 elevada afinidade de ligação e uma elevada actividade neutralizante em relação à AILIM humana.
Exemplo 7 Actividade de anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana para transduzir o sinal co-estimulador em células T humanas
Analisou-se se os anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana, de acordo com a presente invenção, têm ou não a capacidade de controlar (aumentar e/ou inibir) respostas de células T humanas (produção de citocinas tal como IFN-γ e IL-4, proliferação celular, etc.), por outras palavras, se os anticorpos apresentavam ou não actividade reguladora na transdução celular do sinal cosestimulador mediado por AILIM. A análise foi feita com base na quantidade de citocinas (IFN-γ e IL-4) produzidas em células T humanas, bem como o grau de proliferação de células T humanas como um indice. <7-l> Diluição de anticorpos
Diluiu-se o anticorpo monoclonal anti-CD3 humano, 0KT3, (ATCC CRL-8001) com tampão de fosfato (STF) até a uma concentração final de 8 pg/ml.
Cada um dos vários anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana, preparado antes foi diluído com tampão de fosfato até a uma concentração final de 40 pg/ml. As soluções de anticorpos foram ainda diluídas com STF para preparar diferentes concentrações de anticorpos (40 pg/ml-0,0049 pg/ml). <7-2> Revestimento da microplaca com o anticorpo 162
Cada poço das microplacas de 96 poços foi revestido com (1) anticorpo monoclonal anti-CD3 humano, 0KT3 (8 pg/ml; 25μ1 para cada poço) e qualquer um dos vários anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana (40 pg/ml-0,0049 pg/ml; 25μ1 para cada poço) ou (2) apenas anticorpos monoclonais anti-CD3 humano, OKT3 (8 pg/ml; 25 μΐ para cada poço). As placas foram incubadas a 37 °C durante 2 horas. Posteriormente, as soluções de anticorpos foram descartadas e cada poço foi lavado, 3 vezes, com STF. Após a lavagem, adicionou-se meio RPMI 1640 contendo SFB a 10 % a cada poço (100 μΐ/poço) e as placas foram incubadas a 37 °C durante 1 hora. Assim, os respectivos poços das placas foram revestidos com os anticorpos mencionados antes em (1) ou (2) .
Realizaram-se experiências de controlo da mesma forma, utilizando placas revestidas com os respectivos anticorpos monoclonais que se seguem, como anticorpos de controlo, em vez dos anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana. (1) Anticorpo monoclonal de murganho, SA12 ou SG430, contra AILIM humana (JP-A 11-29599 (exemplo 12) e W098/38216 (exemplo 12)); (2) Anticorpo monoclonal de murganho anti-CETP humano, JHC1 (também referido como JMabl09; JP -A 9-20800) e (3) Anticorpos monoclonais humanos anti-HML (também referida como JMab23; exemplo mencionado antes).
As microplacas revestidas com os anticorpos foram utilizadas nos ensaios seguintes. <7-3> Preparação de uma suspensão de células T humanas 163
Recolheu-se o sangue periférico, de cada pessoa normal e saudável (5 pessoas; dador A, B, C, D e E) . A fracção contendo células mononucleares foi preparada por centrifugação de gradiente de densidade usando LymphoPrep (Nycomed). Separaram-se as células T humanas da fracção de células mononucleares humanas, de acordo com o manual de procedimento experimental, usando um estojo de isolamento de células Pan-T (Miltenyi) e um separador magnético. A contagem de células T foi determinada utilizando um hemacitómetro. Fez-se uma suspensão das células T humanas em meio RPMI 1640 contendo 10% de SFB para preparar a suspensão de células T humanas (1 χ 106 célula/ml). <7-4> Cultura de células (1) Cultura utilizando microplacas revestidas com um anticorpo anti-CD3 humano e um anticorpo anti-AILIM humana
Adicionou-se uma suspensão de células T humanas (dador A, B, C, D ou E; 100 μΐ/poço; 1 χ 105 células/poço) a cada poço da microplaca revestida com o anticorpo mencionado antes e a placa foi incubada a 37 °C durante 3 dias numa incubadora deC02.
Após a cultura, armazenaram-se alíquotas dos sobrenadantes resultantes da cultura (50 μΐ) a -20 °C e em seguida foram utilizados no ensaio descrito mais tarde (ensaio para o IFNy) . Após a amostragem das alíquotas dos sobrenadantes da cultura, utilizaram-se as respectivas microplacas para o ensaio que se segue: (2) Cultura utilizando microplacas revestidas apenas com o anticorpo anti-CD3 humano 164
Adicionou-se a suspensão de células T humanas (dador D; 100 μΐ/poço; lxlO5 células/poço) a cada poço da microplaca revestida com o anticorpo mencionado antes e depois adicionou-se qualquer um dos vários anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana (25μ1 do anticorpo de 40 pg/ml-0,0049 pg/ml). As placas foram incubadas a 37 °C durante 3 dias numa incubadora de C02
<7-5> Determinação da actividade de proliferação das células T
Adicionou-se metil [3H]timidina (0,5 pCi/poço; Amersham-Pharmacia) a cada poço das placas, após incubação e as placas foram incubadas a 37 °C durante 6 horas numa incubadora com C02. Após a incubação, as células foram retidas em filtros de FV/C (Packard), utilizando colectores de células. Posteriormente, secaram-se os filtros a 40 °C durante 3 horas ou mais e depois adicionou-se Microscinti 0 (20 μΐ/poço; Packard). A radioactividade de 3H incorporada, nas células retidas nos filtros, foi medida por meio de um contador β (COUNT TOP) para analisar o grau de proliferação de células T após a cultura.
Os resultados estão ilustrados nas figuras 15-39. O resultado deste ensaio demonstrou que as células T humanas proliferaram significativamente em função da concentração das células quando as microplacas foram revestidas com anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana (anticorpo monoclonal humano ou anticorpo monoclonal de murganho), em conjunto com o anticorpo anti-CD3 humano. Além disso, existiam algumas diferenças no grau de proliferação celular entre os dadores. 165
Por outro lado, utilizou-se durante a cultura, em solução (fase liquida), as células T humanas que não cresceram significativamente quando as placas foram revestidas apenas com anticorpo anti-CD3 humano e anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana (anticorpo monoclonal humano ou anticorpo monoclonal de murganho).
<7-6> Quantificação do IFNy no sobrenadante da cultura de células T
Para as respectivas culturas de células T (dadores B e C) descritas em (1) de <7-4>, determinaram-se as quantidades de IFNy nos sobrenadantes das culturas por meio de um estojo de ELISA para IFNy humanos, comercialmente disponível (Amersham-Pharmacia; Endogen).
Os resultados estão ilustrados nas figuras 40 a 47. O resultado deste teste mostrou que a produção de IFNy aumentou significativamente em função da concentração de anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana (anticorpo monoclonal humano ou anticorpo monoclonal de murganho).
Exemplo 8 Actividade reguladora de anticorpo monoclonal anti-AILIM humana na reacção mista de linfócitos (RML)
Fez-se um ensaio para saber se os anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana da presente invenção eram ou não capazes de controlar (aumentar e/ou inibir) as respostas das células T (produção de citocinas tal como IFN-γ e IL-4, proliferação celular, etc.), por outras palavras, capaz de regular a transdução de sinal coestimulador mediada por AILIM em células, analisando a actividade (nomeadamente a sintese de ADN em células) de 166 controlo da proliferação das células T associada com a reacção alogénica mista de linfócitos (RML alogénica) como um índice. <8-l> Preparação de CMSP (células mononucleares de sangue periférico) e de células T humanas 0 sangue periférico (200 ml) recolhido de cada pessoa normal e saudável (7 pessoas; dador A, B, C, D, E, F e G) foi distribuído em camadas de Lymphoprep (15 ml; Nycomed) em microtubos (50 ml; Falcon). Após a centrifugação (a 1600 rpm durante 10 minutos), recuperaram-se as camadas intermédias. Diluíram-se as células recuperadas, 2 vezes ou mais, com tampão de fosfato e em seguida centrifugou-se (a 1.800 rpm durante 10 minutos). Assim, prepararam-se CMSP (células mononucleares de sangue periférico; 2 χ 108 - 5 χ 108 células) . A contagem de células T foi determinada utilizando um hemacitómetro. Recolheu-se uma alíquota das células a utilizar no ensaio da RML (1,08 χ 108 células/microplaca) e manteve-se em gelo. As células remanescentes foram usadas para a separação das células T descritas a seguir.
Utilizou-se o estojo de isolamento PanT (Miltenyi Biotech) para a separação das células T das CMSP. De acordo com o manual anexo ao estojo, adicionaram-se as CMSPs remanescentes à solução pertencente ao estojo e incubou-se a solução. Posteriormente, lavaram-se as células com STF contendo EDTA 5mM e ASB a 0,5 % e, em seguida, fez-se uma nova suspensão em tampão de fosfato. Posteriormente, adicionou-se a suspensão de células a uma coluna de selecção positiva VS+ (Miltenyi Biotech) que aumentou de volume com STF e recuperou-se a fracção não adsorvida. Depois, carregou-se a coluna com STF e recuperou-se a 167 solução de lavagem. Repetiu-se o mesmo tratamento uma vez. Combinaram-se as soluções recuperadas para se obter uma fracção de células T. Após a centrifugação da fracção de células T, suspenderam-se novamente as células em STF. A contagem das células T resultantes foi determinada usando um hemacitómetro. As células foram usadas no ensaio seguinte. <8-2> Reacção mista de linfócitos (RML)
Tal como descrito antes, conhecem-se dois circuitos de sinalização, como circuitos de sinalização co-estimuladora, um entre CD28 e CD80 (B7-1)/CD86 (B7-2) e outro entre LTCA4 e CD80 (B7-1)/CD86 (B7-2), para os quais se tinha feito antes uma análise comparativa detalhada, circuitos esses necessários para a activação de linfócitos tal como células T, etc.
Ou seja, a proliferação de células T, em resposta à reacção mista de linfócitos (RML), pode ser induzida pela transdução de sinal através de cada um dos dois circuitos conhecidos.
Assim, usando as substâncias indicadas a seguir, realizou-se o ensaio da presente invenção para analisar (1) a inibição da RML, bloqueando o circuito de sinalização mediado por LTCA4; (2) a inibição da RML bloqueando o circuito de sinalização mediado por CD80 (B7-1)/CD86 (B7-2); (3) a inibição da RML bloqueando tanto o circuito de sinalização mediado por LTCA4 como o mediado por CD80 (B7-1)/CD86 (B7-2); (4) a inibição da RML bloqueando o circuito de sinalização terciário associado a AILIM; e (5) a inibição da RML bloqueando tanto o circuito de sinalização mediado por LTCA4 como o circuito mediado por AILIM. 168
Utilizaram-se substâncias de ensaio que se seguem. (1) Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana (preparado no exemplo descrito antes); (2) Anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana, SA12 (tal como no exemplo descrito antes); (3) Anticorpo monoclonal humano anti-HML (controlo negativo; o mesmo que no exemplo descrito antes); (4) Anticorpos de IgG de murganho (anti-CD34 humano; controlo negativo; Immunotech); (5) Uma mistura de anticorpo monoclonal anti-CD80 humano (PharMingen) e anticorpo monoclonal anti-D86 humano (Pharmingen); e (6) Molécula quimérica humana de LTCA4-IgFc (Ancell).
Realizou-se a reacção mista de linfócitos (RML) nas 6 combinações seguintes usando CMSPs e células T preparadas a partir dos dadores descritos antes em <8-l>. (i) Célula T (dador A) /CMSP (dador D) (ii) Célula T (dador D) /CMSP (dador B) (iii) Célula T (dador C) /CMSP (dador A) (iv) Célula T (dador E) /CMSP (dador G) (v) Célula T (dador F) /CMSP (dador E) (vi) Célula T (dador G) /CMSP (dador F)
As concentrações das CMSPs e das células T, a serem utilizadas no ensaio, foram corrigidas conforme descrito a seguir.
As CMSPs foram suspensas em STF e, em seguida, foram transferidas para pratos de cultura (60 mm). As células foram submetidas a radiação por raios X (50 Gy) com um 169 equipamento de radiação (Hitachi MEDICO). As células foram recuperadas, centrifugaram-se e depois adicionaram-se a meio PRMI 1640 contendo SFB a 10 %. A contagem de células foi ajustada para 2 χ 105 células/50 μΐ.
As células T resultantes de cada dador também foram adicionadas ao meio PRMI 1640 contendo SFB a 10% e ajustou-se a contagem de células para 1 χ 105 células/50 μΐ. <8-2-l> Inibição de RML por meio de anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana
Adicionou-se meio PRMI 1640, contendo SFB a 10 %, a cada poço de uma microplaca de 96 poços com cavidades em forma de U. Diluiu-se uma solução de anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana ou anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana, SA12, com meio PRMI 1640 contendo SFB a 10 %, para preparar soluções com diferentes concentrações de anticorpo. Adicionou-se aos poços soluções diluidas de anticorpo (concentração final: 0, 0,31, 1,25, 5 e 20 pg/ml). Posteriormente, adicionaram-se células T (50 μΐ) aos poços. A placas foram incubadas a 37 °C durante 1 hora numa incubadora com CO2. (NAPCO) . Após a reacção estar concluída, adicionou-se, aos poços, as CMSPs (50 μΐ), proveniente de dadores diferentes, para iniciar a RML.
Quando se realizou a RML utilizando um anticorpo diferente do anticorpo humano anti-AILIM humana (descrito antes em (3) a (6)) como substância de ensaio, deixou-se as células T, derivadas de um dador diferente, reagirem, após a incubação das CMSPs, com a substância de ensaio.
No quinto dia da cultura, adicionou-se, a cada poço, timidina marcada com tritio (3H-timidina; 20μ1; 1 pCi/poço) 170
Manteve-se a diluída em meio PRMI 1640 contendo SFB a 10 %. cultura durante um dia. Depois da cultura estar concluída, colheram-se as células com um equipamento de recolha de células (Packard). A radioactividade de 3H, incorporada nas células, foi medida por meio de um contador β (TOP COUNT; Packard) para analisar o grau de proliferação de células T após a cultura.
Os resultados estão ilustrados nas figuras 48 a 59. <8-2-2> Inibição da RML pelo anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana num sistema de RML em que o circuito de sinalização mediado por LTCA4 tinha sido previamente bloqueado
Adicionou-se meio PRMI 1640, contendo SFB a 10 %, a cada poço de uma microplaca de 96 poços com cavidades em forma de U. Diluiu-se uma solução de anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana ou anticorpo monoclonal de murganho anti-AILIM humana, SA12, com meio PRMI 1640 contendo SFB a 10 %, para preparar soluções com diferentes concentrações de anticorpo. Adicionou-se aos poços soluções diluídas de anticorpo (concentração final: 0, 0,31, 1,25, 5 e 20 pg/ml). Posteriormente, adicionou-se células T (50 μΐ) aos poços. As placas foram incubadas a 37 °C durante 1 hora numa incubadora com CO2 (NAPCO) .
Para além da cultura das células T, fez-se, independentemente, a cultura de CMSPs (em meio RPMI 164 0 contendo SFB a 10 %) derivadas de outros dadores, após a adição de LTCA4-IgFc humana às CMSPs. Realizou-se a cultura a 37 °C durante 1 hora numa incubadora com CO2. (NAPCO) . A concentração de LTCA4-IgFc foi ajustada para 20 pg/ml, no início da RML. 171
Posteriormente, adicionaram-se as CMSPs (50 μΐ) à cultura de células T descrita antes para iniciar a RML.
Quando se realizou a RML utilizando um anticorpo diferente do anticorpo humano anti-AILIM humana (descrito antes em (3) a (5)) como substância de ensaio, deixou-se as células T, derivadas de um dador diferente, reagirem, após a incubação das CMSPs, que tinham estado em cultura na presença de LTCA4-IgFc, com a substância de ensaio.
No quinto dia da cultura, adicionou-se, a cada poço, timidina marcada com tritio (1 2 3H-timidina; 20 μΐ; 1 μCi/poço) diluída em meio PRMI 1640 contendo SFB a 10 %. Manteve-se a cultura durante um dia. Depois da cultura estar concluída, colheram-se as células com um equipamento de recolha de células (Packard). A radioactividade de 3H, incorporada nas células, foi medida por meio de um contador β (TOP COUNT; Packard) para analisar o grau de proliferação de células T após a cultura.
Os resultados estão ilustrados nas figuras 60 a 69.
Os resultados obtidos dos dois ensaios descritos antes podem ser resumidos da seguinte forma: 172 1 LTCA4-IgFc bloqueia a transdução de sinal mediada por CTLA-4 e assim inibe a proliferação alogénica de células T induzida pela RML. 2 O anticorpo anti-CD80 e o anticorpo anti-CD86 3 inibem a transdução de sinal mediada por CD80/CD86, que é um ligante para LTCA4 e CD28 e assim inibem a proliferação alogénica de células T induzida por RML. (3) Um anticorpo monoclonal contra AILIM humana, como LTCA4-IgFc, um anticorpo anti-CD80 e um anticorpo anti-CD86 inibem significativamente a proliferação celular alogénica de células T induzida pela RML associada à transdução de sinal mediada por AILIM de uma forma dependente da concentração de anticorpos.
Por outras palavras, estes resultados mostram que um caminho terciário mediado por AILIM e o seu ligando, para além dos caminhos conhecidos mediados por LTCA4/CD80/CD86 e mediados por CD28/CD80/CD86 existem como circuitos de sinalização co-estimuladora necessária para a activação de células T, bem como que o circuito de sinalização mediado por AILIM é inibido por anticorpos contra AILIM.
Além disso, levanta a possibilidade de a contribuição da via, mediada por AILIM para a transdução de sinal, poder ser comparável às vias mediadas por LTCA4/CD80/CD86 e às vias mediadas por CD28/CD80/CD86.
Exemplo 9 Actividade de anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana para induzir citotoxicidade celular dependente de anticorpos (CCDA)
As actividades biológicas causadas por anticorpos incluem a indução de citotoxicidade celular dependente de anticorpos (CCDA). A CCDA é uma acção citotóxica que requer o anticorpo para além de células efectoras e células-alvo, que provoca danos nas células-alvo, induzida pelas células efectoras, tais como linfócitos, macrófagos e leucócitos polimorfonucleares. 173
Analisou-se, como se segue, a actividade do anticorpo monoclonal anti-AILIM humana da presente invenção para induzir a CCDA:
Adicionou-se 51Cr (0,1 mCi/106 células, Amersham-Pharmacia) à cultura de células HPB-ALL recombinantes que sobre-expressam AILIM humana, preparadas no exemplo descrito antes e a mistura foi incubada a 37 °C durante 2 horas. Lavaram-se as células, 8 vezes, com meio RPMI 1640. As células obtidas, marcadas com isótopos, foram usadas como células-alvo.
As experiências de controlo foram realizadas utilizando células HPB-ALL humanas, de tipo selvagem, marcadas com o isótopo, como células de controlo, da mesma forma que foi descrita antes.
Utilizando um Lymphosepar I (IBL), separaram-se fracções de CMSP do sangue periférico, colhido de pessoas normais saudáveis. As CMSPs humanas resultantes foram usadas como células efectoras.
As células-alvo (1 χ 104 células/poço; 25 μΐ/poço) foram semeadas em cada poço de uma microplaca de 96 poços (Nunc), com poços em forma de U. Posteriormente, adicionou-se a cada poço qualquer uma das várias concentrações de anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana, diluída com meio RPMI 1640 contendo FBS a 5 % (0,0001-1,0 pg/ml; 25 μΐ/poço), apenas o meio (25 μΐ/poço) ou Nonidet P-40 a 1 % (25 μΐ/poço; detergente tendo actividade de lise celular) e a placa foi incubada à temperatura ambiente durante 20 minutos. A cultura foi realizada utilizando anticorpo monoclonal anti-CD3 humano, OKT3 (ATCC CRL-8001), como um 174 anticorpo de controlo positivo, em vez de um anticorpo anti-AILIM humana, da mesma forma que foi descrito antes.
Posteriormente, adicionaram-se as células efectoras (relação E/T = 50; 1 χ 105 células/poço; 50 μΐ/poço) a cada poço e a placa foi incubada a 37 °C durante 16 horas numa atmosfera de C02 a 5 % numa incubadora.
Após a cultura, as amostras foram centrifugadas (a 1.500 rpm a 4 °C durante 10 minutos) . Recuperou-se o sobrenadante resultante. A radioactividade no sobrenadante da centrifugação foi medida por meio de um contador γ. A radioactividade representa a quantidade de 51Cr libertada das células, no sobrenadante da cultura, pelo dano da membrana celular por CCDA. A percentagem de danos da membrana celular (percentagem de lise celular) , que foi causado por CCDA induzida por anticorpos anti-AILIM ou anticorpos anti-CD3, foi determinada no pressuposto de que a radioactividade observada apenas com o meio corresponde a 0 % em relação ao dano da membrana celular (0) e que, com Nonidet corresponde a 100 % em relação ao dano da membrana celular.
Os resultados estão ilustrados nas figuras 70 e 71. O resultado do ensaio mostrou que o anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana, da presente invenção, exibiu actividade que induz CCDA de uma maneira dependente da concentração.
Exemplo 10 Determinação do gene e das sequências de aminoácidos de anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana e respectiva análise 175
As sequências de ADNcs que codificam as cadeias pesadas, bem como os ADNcs que codificam as cadeias leves de vários anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana, que tinham sido preparadas no exemplo descrito antes, foram determinadas como se descreve a seguir. As caracteristicas estruturais dos genes foram também analisadas.
Ao usar o estojo de purificação do ARNm Quick Prep (Amersham-Pharmacia), PolyA+ARNs extraiu-se e purificou-se de cada um dos hibridomas (clones: AIH5D3 (JMab-136), AII289 (JMab-138) e AII394 (JMab-139)) , que produzem anticorpos monoclonais humanos contra AILIM humana, preparados no exemplo descrito antes.
As células de hibridoma foram suspensas, num tampão de lise celular (tampão de lise) e foram lisadas usando uma seringa para solubilizá-las. Adicionou-se a resina Oligo (dT) ao material solubilizado e a mistura foi agitada suavemente. Posteriormente, a resina Oligo (dT) foi lavada e, em seguida, eluiu-se PolyA+ARN com tampão de eluição. 0 PolyA+ARN precipitou com etanol e, em seguida, foi dissolvido em tampão de Tris-EDTA. A concentração de PolyA+ARN obtida foi determinada por densidade óptica a um comprimento de onda de 260 nm.
Sintetizou-se o ADNc de dupla hélice usando PolyA+ARN como matriz, de acordo com o processo de transcriptase inversa de M-MLV usando um estojo de síntese de ADNc disponível comercialmente (GibcoBRL) e utilizando oligo ADN NotI-T (SEQ ID NO: 1) como iniciador.
Especificamente, o ADNc de hélice simples foi sintetizado numa solução (cerca de 50 μΐ) , contendo PolyA+ARN (cerca de 5 pg) purificada do hibridoma como 176 matriz, o iniciador (cerca de 400 pmole) e transcriptase inversa de M-MLV, a 37 °C durante 1 hora. Posteriormente, adicionou-se à solução de reacção (4 μΐ) dNTP, ADN polimerase I, RNaseH, ADN ligase, tampão e água destilada e a mistura foi incubada a 16 °C durante 2 horas para sintetizar ADN de dupla hélice. O ADN , de dupla hélice, resultante foi extraído com fenol/clorofórmio e depois precipitou em etanol.
Posteriormente, adicionou-se o ADN ligante de EcoRI (cerca de 300 pmole) e ADN ligase (elevada ligação; 33 μΐ; TOYOBO) à solução contendo o ADNc de dupla hélice em tampão de TE (cerca de 50 μΐ) e a mistura foi incubada a 16 °C durante cerca de 80 minutos para ligar o ADNc com o ADN ligante. O ADN ligante utilizado foi um ADN de dupla hélice que consiste em oligonucleótidos de ADN (20adp; SEQ ID NO: 2) e os oligonucleótidos de ADN (24adp; SEQ ID NO: 2) e os oligonucleótidos de ADN (24adp; SEQ ID NO: 3), que tinham sido fosforilados em 5' e hibridados entre si por um processo normalmente usado. A ADN ligase foi extraída com fenol/clorofórmio e depois precipitou em etanol. Posteriormente, o reagente de ADN foi digerido com uma enzima de restrição comercialmente disponível Notl (TOYOBO) e em seguida incubou-se com uma solução de ATP disponível comercialmente (GIBCO BRL) e T4 cinase (TOYOBO) a 37 °C durante 30 minutos para fosforilar a sua extremidade 5'. O ADN obtido precipitou com etanol e, em seguida, foi fraccionado, por meio de electrof orese em gel de poliacrilamida. Cortou-se pedaços de ADN, contendo gel, de aproximadamente 500 pb a 2000 pb. Realizou-se o corte do gel enquanto o ADN corou com brometo de etídio e foi 177 visualizado por irradiação de luz UV num aparelho fotográfico.
Esmagou-se o gel cortado e, em seguida, fez-se uma suspensão em tampão de TE. Centrifugou-se a suspensão e recuperou-se o sobrenadante resultante. 0 ADN recuperado foi ligado a um vector de fago lambda XEXcell (0,25 pg; Amersham Pharmacia) na presença de ADN Ligase comercialmente disponível (ligação forte; TOYOBO) (a 16 °C durante 30 minutos). Na etapa seguinte, o ADN ligase foi acondicionado em fago lambda utilizando um estojo de acondicionamento de fago lambda disponível comercialmente Gigapack III Gold (STRATAGENE) e as partículas de fago resultantes foram infectados com NM522 de E. coli como hospedeiro para preparar uma biblioteca de ADNc. Todas as manipulações foram realizadas de acordo com o protocolo experimental anexo ao estojo.
Posteriormente, a biblioteca de ADNc foi rastreada por um processo de hibridação de placa (Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Labolatory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) como se segue: A biblioteca de ADNc (1 χ 104 placas) foi semeada em placas de ágar e prepararam-se réplicas dos seus filtros usando membranas de nylon Hybond-N (Amersham Pharmacia). Estas réplicas de filtros foram submetidas a um tratamento de hibridação com sondas marcadas utilizando γ32Ρ-ΑΤΡ num tampão de hibridação de acordo com o processo de hibridação em placas. As sondas utilizadas foram HIGLC (SEQ ID NO: 4) para a cadeia leve de anticorpo e NHCc2 (SEQ ID NO: 5) para uma cadeia pesada de anticorpo. Realizou-se o isolamento da 178 placa única a partir dos clones positivos obtidos na triagem primária e na triagem secundária.
Cada uma das cadeias pesadas e cadeias leves do anticorpo foram amplificadas por RCP utilizando um único iniciador de PCR e um estojo Taq de RCP (TAKARA) utilizando uma suspensão de fagos de cada clone positivo como uma matriz de ADN. 0 par de iniciadores utilizado para a cadeia leve do anticorpo foi ExcellE (SEQ ID NO: 6); e ckll7 (SEQ ID NO: 7) e um par de iniciadores utilizado para a cadeia pesada do anticorpo foi ExcellE (SEQ ID NO: 6); e NHCc2 (SEQ ID NO: 5) . Os produtos de RCP resultantes foram fraccionados de acordo com um processo usual utilizando electroforese em gel de agarose. Cortaram-se os pedaços de ADN contendo gel, de cerca de 600 pb correspondentes à cadeia pesada e à cadeia leve. As sequências de nucleótidos dos ADNs purificados a partir do gel foram analisadas usando um sequenciador de ADN (373A; PE-Applied Biosystems), um programa informático de sequenciação ABI Prism (PE-Applied Biosystems) e um auto-assemblador ABI PRISM (PE-Applied Biosystems). Verificou-se que o ADN de cada clone positivo tinha um comprimento suficiente da sequência de nucleótidos. O fago λ da placa de cada clone positivo foi infectado com NP66 de E. coli para a excisão, in vivo, do ADN de plasmido de interesse e os fagos filamentosos resultantes foram semeados em placas contendo ampicilina para dar origem a colónias. Posteriormente, os ADNs de plasmidos foram recuperados e purificados a partir das colónias através de um processo vulgarmente usado e transformou-se JM109 de E. coli com os plasmidos. Posteriormente, as células transformadas foram semeadas em placas com o nutriente agar e contendo ampicilina para formar colónias. 179
Posteriormente, a suspensão bacteriana no meio LB contendo ampicilina, derivada de cada colónia foi transferida para um meio nutriente liquido e as bactérias foram cultivadas a 37 °C durante 24 horas. As bactérias foram colhidas a partir da cultura e, em seguida, o ADN do plasmido foi purificado por meio de um estojo de purificação de plasmidos (Quiagen) . Cada um dos ADNs dos plasmidos foi digerido com enzimas de restrição EcoRI/Notl para verificar a presença de ADN do vector e inserir o ADN (ADNc da cadeia pesada ou ADNc de cadeia leve).
Cada sequência de nucleótidos do ADNc que codifica a cadeia pesada e a cadeia leve do anticorpo, que foi inserida em cada plasmido purificado, foi determinada por um processo normalmente utilizado usando um sequenciador de ADN (377A; PE-Applied Biosystems), um programa informático de sequenciação ABI Prism (PE-Applied Biosystems) e um auto-assemblador ABI Prism (PE-Applied Biosystems).
Os iniciadores utilizados para a determinação da sequência foram os seguintes: <Iniciadores utilizados para a determinação do ADNc de cadeia pesada>
Iniciador M13R (SEQ ID NO: 8); STRATAGENE) , ExcellE (SEQ ID NO: 6), 136H (SEQ ID NO: 9), 138/9H (SEQ ID NO: 10), AILIMHC1 (SEQ ID NO: 11), HCcl (SEQ ID NO: 12), NHCc2 (SEQ ID NO: 5), HCc7 (SEQ ID NO: 13), HCc8 (SEQ ID NO: 14), HCc3 (SEQ ID NO: 15), HCc4 (SEQ ID NO: 16), HCc6 (SEQ ID NO: 17), HIGHC (SEQ ID NO: 18), HCc9 (SEQ ID NO: 19), HCc5 (SEQ ID NO: 20) e poliA (SEQ ID NO: 21). 180 ciniciadores utilizados para a determinação do ADNc de cadeia leve>
Iniciador M13R (SEQ ID NO: 8; STRATAGENE), ExcellE (SEQ ID NO: 6), AILIMLC1 (SEQ ID NO: 22), AILIMLC2 (SEQ ID NO: 23), LCcl (SEQ ID NO: 24), ckll7 (SEQ ID NO: 7), HIGLC (SEQ ID NO: 4), LCc2 (SEQ ID NO: 25), HIK (SEQ ID NO: 26), e poliA (SEQ ID NO: 21). A listagem de sequências que se mostra a seguir contém a sequência de ADNc que codifica a cadeia pesada e a sequência de ADNc que codifica a cadeia leve do anticorpo monoclonal humano contra AILIM humana, que são produzidos por cada hibridoma mencionado antes, assim como as sequências de aminoácidos deduzidas a partir das sequências do ADNc.
Clone AIH5D3 (JMab-136) cCadeia pesada>
Sequência de ADN: SEQ ID NO: 27 (sequência de sinal: número de nucleótidos 69 a 125, região V: número de nucleótidos 126 a 419)
Sequência de aminoácidos: SEQ ID NO: 28 (compreendendo a sequência de sinal: número de aminoácidos 1 a 19, região variável: número de aminoácidos 20 a 118) <Cadeia leve>
Sequência de ADN: SEQ ID NO: 29 (sequência de sinal: número de nucleótidos 39 a 104, região V: número de nucleótidos 105 a 386) 181
Sequência de aminoácidos: SEQ ID NO: 30 (compreendendo a sequência de sinal: número de aminoácidos 1 a 22, região variável: número de aminoácidos 23 a 116)
Clone AIH5D3 (JMab-138) <Cadeia pesada>
Sequência de ADN: SEQ ID NO: 31 (compreendendo a sequência de sinal: número de nucleótidos 94 a 150, região V: número de nucleótidos 151 a 441)
Sequência de aminoácidos: SEQ ID NO: 32 (compreendendo a sequência de sinal: número de aminoácidos 1 a 19, região variável: número de aminoácidos 20 a 116) <Cadeia leve>
Sequência de ADN: SEQ ID NO: 33 (compreendendo a sequência de sinal: número de nucleótidos 28 a 87, região V: número de nucleótidos 88 a 375)
Sequência de aminoácidos: SEQ ID NO: 34 (compreendendo a sequência de sinal: número de aminoácidos 1 a 20, região variável: número de aminoácidos 21 a 116)
Clone AIH5D3 (JMab-139) <Cadeia pesada>
Sequência de ADN: SEQ ID NO: 35 (sequência de sinal: número de nucleótidos 96 a 152, região V: número de nucleótidos 153 a 443) 182
Sequência de aminoácidos: SEQ ID NO: 36 (compreendendo a sequência de sinal: número de aminoácidos 1 a 19, região variável: número de aminoácidos 20 a 116) <Cadeia leve>
Sequência de ADN: SEQ ID NO: 37 (sequência de sinal: número de nucleótidos 33 a 92, região V: número de nucleótidos 93 a 380)
Sequência de aminoácidos: SEQ ID NO: 38 (compreendendo a sequência de sinal: número de aminoácidos 1 a 20, região variável: número de aminoácidos 21 a 116)
Ao usar o programa informático de análise para a sequência de genes, a biblioteca de sequências V BASE para genes da região variável de imunoglobulina humana construída por Tomlinson et al. (Immunol. Today, Vol. 16, No.5, p. 237-242, 1995) foi pesquisada para cada uma das sequências de ADN determinada aqui.
Os resultados mostraram que os genes da região V das respectivas cadeia pesada e cadeia leve dos anticorpos monoclonais humanos mencionados antes consistiam nos seguintes segmentos. <Gene da região V de cadeia pesada>
Clone AIH5D3 (JMab-136) 1-02 Clone AIH5D3 (JMab-138) 3-13 Clone AI1394 (JMab-139) 3-13 <Gene da região V de cadeia leve> 183 clone AIH5D3 (JMab-136): L5 clone AI1289 (JMab-138) : A27 clone AII394 (JMab-139): A27
Exemplo 11 Efeito inibidor de anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana na hipersensibilidade do tipo retardada (HTR) 0 sistema biológico de resposta imunitária, cuja função é eliminar antigénios nocivos (microrganismos patogénicos, tais como virus, bactérias e parasitas, corpos estranhos, etc.) para os organismos vivos e pode ser genericamente dividido em imunidade congénita e imunidade adquirida. 0 primeiro é um sistema de eliminação com base no reconhecimento não específico, incluindo a fagocitose por fagócitos (leucócitos polimorfonucleares, monócitos, macrófagos, etc.), ataque por células assassinas naturais (AN) e opsonização do antigénio por complemento, etc. 0 último, resposta imunitária adquirida, é um sistema de eliminação por meio de linfócitos (principalmente células T e células B) , que adquiriu a especificidade (activação) em relação ao antigénio.
Além disso, a resposta imunitária adquirida pode ser genericamente dividida em imunidade celular e imunidade humoral.
Ao contrário da imunidade humoral dependente do anticorpo, a imunidade celular é uma resposta imunitária, expressa, em geral, pela acção directa das células T num antigénio, como alvo. A imunidade celular é conhecida por 184 estar envolvida na resposta imunitária ao virus ou ao tumor, a resposta imune induzida após o transplante de tecido ou órgão, a hipersensibilidade a alguns fármacos e nalgumas doenças auto-imunes. 0 fenómeno mais típico pertencente à imunidade celular é a alergia tuberculínica bem conhecida (quase sinónimo de hipersensibilidade à tuberculina) . A alergia à tuberculina é uma alergia retardada causada pela infecção pelo bacilo da tuberculose. A alergia é devida à infecção pelo bacilo da tuberculose e pode ser induzida causando uma resposta imunitária por meio de uma injecção intercutânea, a um organismo vivo, a proteína da tuberculina produzida no sobrenadante da cultura do bacilo da tuberculose. A alergia retardada é uma alergia mediada por células T (memória de células T que memorizam o antigénio) sensibilizadas com um antigénio. A alergia é designada por "do tipo retardada", porque leva 24 a 48 horas para que um organismo vivo, sensibilizado com o antigénio para expressar a resposta alérgica com inflamação induzida pelas células T da memória quando contactam novamente com o antigénio. 0 fenómeno da alergia tuberculínica, que é representativo de alergias retardadas, geralmente tem sido utilizado em "ensaios de tuberculina" para diagnosticar se já se estabeleceu ou não num animal uma sensibilização pela infecção do bacilo da tuberculose. Especificamente, o ensaio é realizado da seguinte forma: a tuberculina purificada (derivado proteico purificado; PPD; 0,1 ml do derivado de 0,05 pg/0,l ml (2,5 TU) para uso em diagnóstico geral), que é a proteína tuberculínica purificada a partir da cultura do bacilo da tuberculose, é dada 185 intracutaneamente a um animal; o eixo principal de vermelhidão da pele no local da injecção é medido 48 horas após a injecção; e a presença de infecção do bacilo da tuberculose pode ser diagnosticada com base no maior eixo medido. Se o eixo principal da vermelhidão é inferior a 4 mm, então o indivíduo é negativo; se ele está dentro do intervalo de 4 - 9 mm, então o indivíduo é um falso positivo e se é de 10 mm ou mais, então o indivíduo é decididamente positivo.
As alergias retardadas associadas à imunidade celular incluem, por exemplo, a hipersensibilidade do tipo Jones-Mote induzida transientemente por uma pequena quantidade de proteina ou similar, a alergia de contacto a fármacos, tal como cloreto de picrilo ou toxinas de plantas, tais como a laca japonesa ou alergia associada à rejeição de um enxerto (por exemplo, enxerto alogénico) , bem como a alergia mencionada antes para o antigénio de patogénios infecciosos, como a alergia tuberculinica causada pelo bacilo da tuberculose antes descrita.
Neste ensaio, o efeito inibidor de anticorpos anti-AILIM na hipersensibilidade do tipo retardada (alergia tardia) foi avaliada utilizando o ensaio tuberculinico mencionado antes. O ensaio foi realizado da seguinte forma:
Cada um dos macacos cynomolgus (do sexo masculino, peso do corpo: 6,0-8,5kg, Environmental Biological Life Science Research Center Inc.; 3 indivíduos em cada grupo), que tinha sido sensibilizado com BCG (Bacilo Calmette de al Guerin) , que é uma bactéria viva atenuada do bacilo da tuberculose do tipo bovino foi anestesiado com cloridrato de cetamina (10 mg/kg, injecção intramuscular) e depois de qualquer uma das amostras de ensaio indicada a seguir ter 186 sido dada intracutaneamente, numa quantidade de 0,1 ml para cada local da injecção (6 sitios de injecção/indivíduo) no peito. As distâncias, entre os locais de injecção da amostra, foram de 3 cm ou mais. (1) solução mista a 1:1 de anticorpos humanos anti-AILIM humana (JMab-136, 0,2; 10 pg em cada local da injecção) e de tuberculina (4 pg/lml de soro fisiológico); (2) solução mista a 1:1 de anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana (JMab-136; 2mg; 100 pg em cada local da injecção) e de tuberculina (4m /lml de soro fisiológico); (3) tampão de fosfato (STF (-)) como controlo; (4) solução mista a 1:1 de um agente esteróide anti-inflamatório disponível comercialmente, prednisolona (0,2 mg; 10 pg em cada local da injecção) e tuberculina (4 pg/lml de soro fisiológico) como controlo positivo; (5) solução mista a 1:1 de anticorpo monoclonal humano anti-HML (exemplo <2-2>; 0,2 mg; 10 pg em cada local de injecção) e tuberculina (4 pg/lml de soro fisiológico) como controlo negativo); 24 horas após a injecção de cada amostra, mediu-se o eixo maior e o eixo menor de vermelhidão, em cada local da injecção, para determinar a área da vermelhidão. O resultado está ilustrado na figura 72. O resultado mostrou que a vermelhidão devida à alergia retardada foi significativamente inibida em todos os grupos submetidos à injecção de anticorpos anti-AILIM, em comparação com os grupos controlo e os grupos controlo negativos. O efeito inibidor foi comparável ao do fármaco 187 esteróide anti-inflamatório positivo. utilizado como controlo
Exemplo 12 Análise para a expressão de AILIM em vários tecidos de pacientes com doença do hospedeiro versus o enxerto (DHVE)
Analisou-se a expressão de AILIM numa variedade de tecidos obtidos de biópsias de pacientes, que foram receptores submetidos a transplante de enxerto alogénico de dadores e a quem tinha sido diagnosticado estarem clinicamente afectadas com doença do hospedeiro versus o enxerto (DHVE) aguda ou crónica, após o transplante, por meio de um processo normalmente utilizado. Os tecidos foram corados com HE e o anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana (JMab-36), preparado no exemplo descrito antes. A análise foi realizada utilizando 33 amostras de vários tecidos recolhidos de pacientes com GVHD aguda (28 casos) , bem como 5 amostras de pacientes com GVHD crónica (5 casos).
Os resultados foram os seguintes: verificou-se reacção positiva a AILIM em 15 das 29 amostras de tecido da pele; em 1 de 3 amostras de tecido do estômago e em 1 de 1 amostra de tecido do cólon; que foram todas obtidas de pacientes com DHVE aguda. Verificou-se reacção positiva a AILIM em 1 de 3 amostras de tecido da pele; em 2 de 2 amostras de tecido do cólon; que foram todas obtidas de pacientes com DHVE crónica. Além disso, verificou- se reacção positiva a AILIM em 10 de 13 amostras em que se observou infiltração significativa de linfócitos. 188
Exemplo 13 Actividade de anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana para transduzir o sinal co-estimulador em células T de macaco A experiência realizada no exemplo 7 demonstrou que os anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana da presente invenção são capazes de aumentar a proliferação de células T humanas por via do controlo da resposta de células T humanas, especificamente, controlando a transdução do sinal coestimulador mediada por AILIM para a célula. Neste ensaio, analisou-se se os anticorpos monoclonais humanos exibiam ou não actividade de aumento de proliferação celular de células T de macaco, pelo mesmo processo descrito no exemplo 7. <13-1> Diluição de anticorpos
Diluiu-se o anticorpo monoclonal anti-CD3 humano, SP34 (BD-Pharmingen) com tampão de fosfato (STF) até a uma concentração final de 1 yg/ml.
Diluiu-se o anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMAbl36 com SBF até a uma concentração final de 40 yg/ml. As soluções de anticorpos foram ainda diluidas com SBF para preparar diferentes concentrações de anticorpos (40 yg/ml-0,064 yg/ml). <13-2> Revestimento da microplaca com o anticorpo
Cada poço das microplacas, de 96 poços, foi revestido com anticorpo monoclonal anti-CD3 humano, SP34 (1 pg/ml; 25 μΐ em cada poço) e o anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana, JMAbl36 (40 pg/ml-0,064 pg/ml; 25μ1 em cada poço). As placas foram incubadas a 37 °C durante 2 horas. 189
Posteriormente, as soluções de anticorpos foram descartadas e cada poço foi lavado, 3 vezes, com tampão de fosfato. Após a lavagem, adicionou-se meio RPMI 1640 contendo SFB a 10 % a cada poço (100 μΐ/poço) e as placas foram incubadas a 37 °C durante 1 hora. Assim, os respectivos poços das placas foram revestidos com os anticorpos mencionados antes.
As experiências de controlo foram realizados da mesma forma, utilizando placas revestidas com anticorpo monoclonal humano anti-HML (JMab23, ver os exemplos anteriores) , como anticorpos de controlo em vez dos anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana.
As microplacas, revestidas com os anticorpos, foram utilizadas nos ensaios seguintes. <13-3> Preparação de uma suspensão de células T de macaco
Recolheu-se o sangue periférico de macacos cynomolgus e as células mononucleares foram fraccionadas por centrifugação em gradiente de densidade usando
NycoPrepl.077A (Nycomed). De acordo com o manual experimental, as células T de macaco foram separadas das células mononucleares de macaco cynomolgus usando o anticorpo anti-CD4 humano, M-T477 (BD-Pharmingen), o anticorpo anti-CD8 humano, RPA-T8 (BD-Pharmingen), micropérolas anti-IgG de rato (Miltenyi) e um classificador magnético. A contagem de células T foi determinada utilizando um hemacitómetro. As células T de macaco foram suspensas em meio RPMI 1640 contendo SBF a 10 %. Assim, preparou-se uma suspensão de células T de macaco (1 χ 106 células/ml). 190 <13-4> Cultura de células (1) Cultura utilizando microplacas revestidas com um anticorpo anti-CD3 humano e um anticorpo anti-AILIM humana
Adicionou-se uma suspensão de células T de simio a cada poço de uma microplaca revestida com o anticorpo mencionado antes e a placa foi incubada a 37 °C durante dois dias numa incubadora com CO2 ·
Depois da cultura estar completa, utilizaram-se as respectivas microplacas nos ensaios seguintes:
<13-5> Determinação da actividade de proliferação de células T
Adicionou-se metil [3H]timidina (0,5 pCi/poço; Amersham-Pharmacia) a cada poço das placas após incubação e as placas foram incubadas a 37 °C durante 6 horas numa incubadora com CO2. Após a incubação, as células foram retidas em filtros de FV/C (Packard), utilizando colectores de células. Posteriormente, secaram-se os filtros a 40 °C durante 3 horas ou mais e depois adicionou-se Microscinti 0 (20 μΐ/poço; Packard). A radioactividade de 3H, incorporada nas células retidas no filtro, foi medida por meio de um contador β (COUNT TOP) para analisar o grau de proliferação de células T após a cultura. O resultado está ilustrado na figura 73.
O resultado deste ensaio demonstrou que as células T de símio proliferaram significativamente em função da concentração das células quando as microplacas foram revestidas com anticorpo monoclonal humano anti-AILIM 191 humana (anticorpo monoclonal humano ou anticorpo monoclonal de murganho), em conjunto com o anticorpo anti-CD3 humano. 0 resultado também sugere que os anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana da presente invenção podem ligar-se a AILIM de macaco e têm actividade para regular a função de AILIM de macaco.
Exemplo 14 Estabelecimento de um processo de identificação e quantificação de substâncias capazes de se ligarem a AILIM ou a um ligando de AILIM
Estabeleceu-se um processo de ELISA (do inglês, enzyme-linked imune solvent assay [ensaio de imunoabsorção enzimática]) para identificar ou quantificar uma substância capaz de ligar a AILIM (COEI) ou a um ligando de AILIM (B7h/B7RP1/GL50/COEI). 0 principio do processo descrito a seguir em detalhe, como exemplo, baseia-se na estimativa, por ELISA, do grau de inibição na ligação entre AILIM humana solúvel (AILIMh-IgFc) e um ligando de AILIM humana solúvel (hB7h-IgFc) causado pela substância. <14-1> Amostra
As amostras utilizadas foram as seguintes: (Fc) (1) HRP-estreptoavidina (Southern Biotechnology Associates, Inc.); (2) Ligante de AILIM humana solúvel (proteína de fusão entre a região extracelular de B7h humana e a região constante da IgGl humana); A proteína foi preparada pelo processo descrito a seguir em <14-2>; 192 (3) AILIM-IgFc solúvel marcada com biotina; Preparou-se a AILIM-IgFc através de uma purificação posterior do antigénio obtido de acordo com o processo já descrito em pedidos de patentes anteriores (JP-A 11-29599 (exemplo 16 (2)) e W098/38216 (exemplo 16 (2))) de um dos presentes inventores, Tezuka; (4) Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana (JMab-136; descrito antes); (5) Anticorpo monoclonal humano anti-HML (anticorpo de controlo negativo; JMab-23; descrito antes); (6) Tampão de fosfato (STF (-); Nikken Seibutsu); (7) meio PRMI 1640 (Nikken Seibutsu); (8) Soro bovino fetal (SBF; JRH-Bioscience); (9) Albumina de soro bovino a 30 % (ASB; Sigma); (10) Tween 20 (BioRad); (11) Cromogénio com substrato de TMB+ (Dako). <14-2> Preparação do ligante de AILIM humana solúvel (proteina de fusão (hB7h-IgFc) da região extracelular de B7h humano e da região constante da IgGl humana) O ARN total foi preparado a partir de células mononucleares humanas de sangue periférico da mesma maneira que foi descrito no exemplo anterior. Sintetizou-se o ADNc a partir do ARN total obtido (5 pg) como uma matriz e usando o sistema de pré-amplificação Superscript para a sintese do ADNc da primeira hélice (GIBCO-BRL).
Em seguida, conceberam-se e sintetizaram-se o iniciador de 5' (5'-GAGGTCTCCGCCCTCGAGATGCGGCTGGGCAGTCC-3', SEQ ID NO: 39) com o sitio de restrição Xhol e o iniciador de 3' (5'-CACAGGACAGCCAGGGGATCCCACGTGGCCGCG-3' , SEQ ID NO: 40) com um sitio de restrição BamHI nas suas respectivas extremidades, para amplificar o ADNc que codifica a região 193 extracelular do ligante de AILIM humana (hB7h) por RCP. Usando o ADNc como uma matriz e o par de iniciadores, realizou-se a RCP para preparar um ADN tendo Xhol e BamHI nas respectivas extremidades contendo ADNc que codifica a região extracelular de B7h humana. Os produtos de RCP resultantes foram digeridos com BamHI e Xhol e fraccionados por electroforese em gel de agarose para isolar uma banda que corresponde a um fragmento de ADNc com cerca de 720 pb, que foi previsto para codificar a região extracelular de interesse. 0 fragmento de ADNc isolado foi clonado no plasmido pBLUESCRIPT II SK (+) (Stratagene), pré-digerido com BamHI e Xhol. Verificou-se que o fragmento de ADNc continha a porção que codifica a região extracelular de B7h humano, por análise de sequenciamento, usando um sequenciador automático fluorométrico de ADN (Applied Biosystems).
Por outro lado, o ADN que codifica a Fc da IgGl humana como um parceiro de fusão foi preparado como um fragmento do ADN de BamHI-Xbal (aproximadamente 1,3 kb) por digestão de um plasmido (ver, Cell, Vol.61, p.1303-1313, 1990; preparado pelo Dr. Seed et al., no Massachusetts General Hospital) com BamHI e Xbal. Este fragmento continha exões que codificam as regiões de charneira da IgGl humana, Ογ12 e 0γ13. O fragmento de BamHI-Xhol que codifica a região extracelular de B7h humano (hB7h) e o fragmento de BamHI-Xbal contendo exões que codificam Fc (abreviado como "IgFc") da IgGl humana, preparado como descrito antes, foram subclonados num plasmido pBLUESCRIPT II SK (+) (Stratagene), pré-digerido com Xhol e Xbal. 194
Posteriormente, o plasmido foi digerido com Xbal e Xhol para preparar um fragmento de ADN de cerca de 1,8 kb contendo o ADN de fusão entre a região extracelular de B7h humano e IgFc humana. Usando ADN ligase de T4, este fragmento de ADN de fusão foi inserido num vector de expressão pME18S (Medicai Immunology, Vol. 20, No.l, p.27-32, 1990, e " Handbook for Genetic Engineering", Experimental Medicine, suplemento, Yodosha, pp. 101-107, 1992) entre os sitios Xhol e Xbal para construir um plasmido phB7h-IgFc.
As células em mono-camadas COS7 (ATCCCRL-1651) postas em cultura para serem sub-confluentes em meio DMEM contendo 10 % de soro bovino fetal e ampicilina, foram transformadas com o plasmido phB7h-IgFc por electroporação para produzir células transformadas.
Deixou-se as células transformadas expressarem hB7h-IgFc cultivando-as em meio ASF104 isento de soro durante 72 horas.
Purificou-se HB7h-IgFc usando uma coluna de afinidade de proteína G e Sefarose (Amersham Pharmacia) como se segue: O sobrenadante da cultura mencionado antes foi centrifugado para se obter o sobrenadante de centrifugação. O sobrenadante resultante foi carregado numa coluna de afinidade de proteína G e Sefarose previamente equilibrada com tampão de ligação. Posteriormente, a coluna foi lavada com o tampão de ligação e, em seguida, realizou-se a eluição com um tampão de eluição. A solução eluída foi recuperada e em seguida dialisada contra tampão de fosfato. 195 0 tampão de diálise exterior foi alterado duas vezes ou mais. Assim, obteve-se hB7h-IgFc purificada. <14-3> Diluição do anticorpo da AILIM humana solúvel (AILIMh-IgFc) e a respectiva reacção
Diluiram-se soluções originais (20 pg/ml) do anticorpo humano anti-AILIM humana (JMab-136) e anticorpo monoclonal anti-HML humano (JMab-23) como um anticorpo de controlo negativo numa série de 11 niveis e combinou-se cada amostra (200 μΐ) e misturou-se bem com 200 μΐ de meio RPMI 1640 contendo SFB a 10 %. Assim, preparam-se diferentes concentrações de soluções de anticorpos. Adicionou-se AILIMh-IgFc marcada com biotina (2 μΐ/tubo; concentração final de 1 pg/ml) a cada uma das soluções preparadas com diferentes concentrações. As soluções resultantes foram bem misturadas e incubadas à temperatura ambiente durante 30 minutos. <14-4> Ensaio para a actividade do anticorpo monoclonal anti-AILIM para inibir a ligação entre AILIMh-IgFc e hB7h-IgFc
Adicionou-se hB7h-IgFc a cada poço de uma microplaca de 96 poços (50 μΐ/poço (800 ng/poço)). A placa foi selada e, em seguida, incubada a 37 °C durante 1 hora. A solução foi retirada de cada poço e os poços foram lavados 3 vezes com STF (120 μΐ). Posteriormente, adicionou-se SBF contendo 0,5 % de ASB (100 μΐ/poço) a cada poço para bloquear os sitios que não tenham reagido. A placa foi selada e incubada a 37 °C durante 1 hora. Após a incubação, a solução foi removida e, em seguida, os poços foram lavados 3 vezes com STF (120 μΐ). Posteriormente, adicionou-se aos poços cada uma das amostras (50 μΐ/poço) preparada em <14- 196 3>. A placa foi selada e incubada a 37 °C durante 1 hora. Eliminou-se a solução de cada poço. Os poços foram lavados, 3 vezes, em meio RPMI 1640 contendo SBF a 10 % (120 μΐ) pré-aquecido a 37 °C. Posteriormente, adicionou-se a cada poço STF contendo 3,7 % de formalina (100 μΐ/poço) e a placa foi incubada em gelo durante 5 minutos. A solução foi retirada de cada poço e os poços foram lavados 3 vezes com Tween 20 a 0,1 % (120 μΐ). Posteriormente, adicionou-se a cada poço estreptavidina-HRP (50 μΐ/poço). Selou-se a placa e incubou-se à temperatura ambiente durante 30 minutos. A solução foi retirada de cada poço e a placa foi lavada 3 vezes com STF contendo Tween 20 a 0,1 % (120 μΐ) . Posteriormente, adicionou-se a cada poço cromogénio num substrato de TMB+ (50 μΐ/poço) e a placa foi incubada à temperatura ambiente durante 20 minutos. Posteriormente, adicionou-se, a cada poço, ácido sulfúrico 2N (50 μΐ/poço) para parar a reacção. Mediu-se a densidade óptica de cada poço a um comprimento de onda de 450 nm por meio de THERMO max (Molecular Devices).
Os resultados estão ilustrados nas figuras 74 a 76.
Os resultados mostraram que o anticorpo anti-AILIM tinha a actividade de inibir a ligação entre AILIMh-IgFc e hB7h-IgFc de uma forma dependente da dose.
De acordo com isto, este exemplo indica que um sistema de ensaio ilustrado pelo presente processo pode ser utilizado para seleccionar e identificar substâncias capazes de se ligarem a AILIM ou a um ligando de AILIM (por exemplo, um anticorpo ou um composto sintético de baixo peso molecular). 197
Exemplo 15 Actividade de anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana para inibir a proliferação de células T humanas associadas com a transdução de sinal co-estimulador mediado por AILIM-ligando de AILIM
Analisou-se se os anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana da presente invenção tinham ou não actividade reguladora da transdução de sinal mediada por AILIM na superfície de células T humanas, com base na medição do efeito inibidor do anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana na proliferação celular induzida pelo contacto de células T humanas com o ligando de AILIM (B7h/B7RP1/GL50/COEI). <15-1> Diluição de anticorpos
Diluiu-se o anticorpo monoclonal anti-CD3 humano, 0KT3 (ATCC CRL-8001) com tampão de fosfato (SBF) até a uma concentração final de 8yg/ml.
Diluiu-se o ligando de AILIM humana solúvel (hB7h-lgFc), preparado antes, com STF até a uma concentração final de 40 yg/ml. As soluções de anticorpos foram ainda diluídas com SBF para preparar diferentes concentrações de anticorpos (40 pg/ml-0,064 yg/ml). <15-2> Revestimento da microplaca com o anticorpo
Cada poço das microplacas de 96 poços foi revestido com (1) anticorpo monoclonal anti-CD3 humano, OKT3 (8 pg/ml; 25 μΐ em cada poço) e hB7h-lgFc (40 pg/ml-0,064 pg/ml; 25μ1 em cada poço) . As placas foram incubadas a 37 °C durante 2 horas. Posteriormente, as soluções de anticorpos foram descartados e cada poço foi lavado 3 vezes 198 com STF. Após a lavagem, adicionou-se meio RPMI 1640 contendo SFB a 10 % a cada poço (100 μΐ/poço) e as placas foram incubadas a 37 °C durante 1 hora. Assim se revestiram os respectivos poços das placas. <15-3> Preparação de uma suspensão de células T humanas
Recolheu-se o sangue periférico de pessoas normais saudáveis e as células mononucleares foram fraccionadas por centrifugação em gradiente de densidade usando LymphoPrep (Nycomed). De acordo com o manual de procedimentos experimentais, separaram-se as células T humanas a partir de células mononucleares humanas usando um estojo de isolamento de células Pan-T (Miltenyi) e um separador magnético. A contagem de células T foi determinada utilizando um hemacitómetro. As células T humanas foram suspensas em meio RPMI 1640 contendo SBF a 10 %, fornecido com o anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMabl36 (20 yg/ml) . A suspensão de células T humanas (1 χ 106 células/ml) foi incubada à temperatura ambiente durante 30 minutos.
Utilizou-se o anticorpo monoclonal humano anti-HML, JMAb23 (20 pg/ml) como um anticorpo de controlo negativo. <15-4> Cultura de células
Da mesma forma que se descreveu antes, adicionou-se uma suspensão de células T humanas (100 μΐ/poço; 1 x 105 células/poço) a cada poço de uma microplaca revestida com anticorpo anti-CD3 humano e hB7h-IgFc e a placa foi incubada a 37 °C durante 3 dias numa incubadora com CO2. 199 <15-5> Determinação da actividade de proliferação de
células T
Adicionou-se metil [3H]timidina (0,5 pCi/poço; Amersham-Pharmacia) a cada poço das placas após a cultura e as placas foram incubadas a 37 °C durante 6 horas numa incubadora com CO2. Após a incubação, as células foram retidas em filtros de FV/C (Packard), utilizando colectores de células. Posteriormente, secaram-se os filtros a 40 °C durante 3 horas ou mais e depois adicionou-se Microscinti 0 (20 μΐ/poço; Packard). A radioactividade de 3H incorporada nas células retidas no filtro foi medida por meio de um contador β (COUNT TOP) para analisar o grau de proliferação de células T após a cultura. O resultado está ilustrado na figura 77. 0 resultado obtido neste ensaio mostrou que as células T humanas cresceram significativamente consoante a concentração de B7h-IgFc humana (no ensaio usando o anticorpo de controlo negativo). Além disso, o anticorpo monoclonal anti-AILIM humana inibiu significativamente a proliferação de células T humanas.
Exemplo 16 Actividade de anticorpos monoclonais humanos anti-AILIM humana para inibir a proliferação de células T de macaco associadas com a transdução de sinal co- estimulador mediado por AILIM-ligando de AILIM
Realizou-se o mesmo ensaio usando células T de macaco em vez das células T humanas usadas no exemplo 15 antes descrito. <16-1> Diluição de anticorpos e outros 200
Diluíu-se o anticorpo monoclonal anti-CD3 humano, SP34 (BD-Pharmingen) com tampão de fosfato (SBF) até a uma concentração final de 1 pg/ml.
Diluiu-se B7h-IgFc humano preparado antes com STF até a uma concentração final de 40 yg/ml. As soluções de anticorpos foram ainda diluídas com STF para preparar diferentes concentrações de anticorpos (40 yg/ml-0,0064 yg/ml). <16-2> Revestimento da microplaca com o anticorpo
Cada poço da microplaca, de 96 poços, foi revestido com (1) anticorpo monoclonal anti-CD3 humano, SP34 (BD-Pharmingen) (1 pg/ml; 25 μΐ em cada poço) e B7h-IgFc humana (40 pg/ml-0,064 pg/ml; 25μ1 em cada poço). As placas foram incubadas a 37 °C durante 2 horas. Posteriormente, as soluções de anticorpos foram descartadas e cada poço foi lavado 3 vezes com STF. Após a lavagem, adicionou-se meio RPMI 1640 contendo SFB a 10 % a cada poço (100 μΐ/poço) e as placas foram incubadas a 37 °C durante 1 hora. Assim, os respectivos poços, das placas, foram revestidos com o anticorpo. <16-3> Preparação de uma suspensão de células T de macaco
Recolheu-se o sangue periférico de macacos cynomolgus. A fracção, contendo células mononucleares, foi preparada por centrifugação de gradiente de densidade usando NycoPrepl.077A (Nycomed). De acordo com o manual experimental, as células T de macaco foram separadas das células mononucleares de macaco cynomolgus usando o anticorpo anti-CD4 humano, M-T477 (BD-Pharmingen), o anticorpo anti-CD8 humano, RPA-T8 (BD-Pharmingen) , 201 micropérolas anti-IgG de rato (Miltenyi) e um classificador magnético. A contagem de células T foi determinada utilizando um hemacitómetro. As células T de macaco foram suspensas, em meio RPMI 1640, contendo anticorpo monoclonal humano anti-AILIM humana, JMab-136 (20 pg/ml) e SBF a 10 % para preparar uma suspensão de células T de macaco (lxlO6 células/ml). A suspensão foi incubada à temperatura ambiente durante 30 minutos.
Utilizou-se o anticorpo monoclonal humano anti-HML, JMAb-23 (20 pg/ml) como um anticorpo de controlo negativo. <16-4> Cultura de células
Da mesma forma que se descreveu antes, adicionou-se uma suspensão de células T de macaco (100 μΐ/poço; 1 χ 105 células/poço) a cada poço de uma microplaca revestida com anticorpo anti-CD3 humano e hB7h-IgFc e a placa foi incubada a 37 °C durante 3 dias numa incubadora com CO2.
<16-5> Determinação da actividade de proliferação de células T
Adicionou-se metil [3H]timidina (0,5 pCi/poço; Amersham-Pharmacia) a cada poço das placas após a cultura e as placas foram incubadas a 37 °C durante 6 horas numa incubadora com CO2. Após a incubação, as células foram retidas em filtros de FV/C (Packard) , utilizando colectores de células. Posteriormente, secaram-se os filtros a 40 °C durante 3 horas ou mais e depois adicionou-se Microscinti 0 (20 μΐ/poço; Packard). A radioactividade de 3H, incorporada nas células retidas no filtro, foi medida por meio de um contador β (COUNT TOP) para analisar o grau de proliferação de células T após a cultura. 202 0 resultado está ilustrado na figura 78. 0 resultado obtido neste ensaio mostrou que as células T de macaco cresceram significativamente consoante a concentração de B7h-IgFc humana (no ensaio usando o anticorpo de controlo negativo). Além disso, o anticorpo monoclonal anti-AILIM humana inibiu, significativamente, a proliferação de células T de macaco.
TEXTO LIVRE DA LISTA DE SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: 1 Outra informação: Descrição da sequência artificial: Sequência do iniciador sintetizada artificialmente, NotI-T. SEQ ID NO: 2 Outra informação: Descrição da sequência artificial: Sequência do ligante sintetizada artificialmente, 20adp SEQ ID NO: 3 Outra informação: Descrição da sequência artificial: Sequência do ligante sintetizada artificialmente, 24adp SEQ ID NO: 4 Outra informação: Descrição da sequência artificial: Sequência do iniciador sintetizada artificialmente, HIGLC SEQ ID NO: 5 Outra informação: Descrição da sequência artificial: Sequência do iniciador sintetizada artificialmente, NHCc2 SEQ ID NO: 6 Outra informação: Descrição da sequência artificial: Sequência do iniciador sintetizada artificialmente, ExcellE SEQ ID NO: 7 Outra informação: Descrição da sequência artificial: Sequência do iniciador sintetizada artificialmente, ckll7 203 SEQ arti arti SEQ arti arti SEQ arti arti SEQ arti arti SEQ arti arti SEQ arti arti SEQ arti arti SEQ arti arti SEQ arti arti SEQ arti arti SEQ arti arti ID NO: 8 Outra informação: ficial: Sequência do ficialmente, M13R ID NO: 9 Outra informação: ficial: Sequência do ficialmente, 136H ID NO: 10 Outra informação: ficial: Sequência do ficialmente, 138/9H. ID NO: 11 Outra informação: ficial: Sequência do ficialmente, AILIMHC1. ID NO: 12 Outra informação: ficial: Sequência do ficialmente, HCcl. ID NO: 13 Outra informação: ficial: Sequência do ficialmente, HCc7. ID NO: 14 Outra informação: ficial: Sequência do ficialmente, HCc8. ID NO: 15 Outra informação: ficial: Sequência do ficialmente, HCc3. ID NO: 16 Outra informação: ficial: Sequência do ficialmente, HCc4. ID NO: 17 Outra informação: ficial: Sequência do ficialmente, HCc6. ID NO: 18 Outra informação: ficial: Sequência do ficialmente, HIGHC.
Descrição iniciador Descrição iniciador Descrição iniciador Descrição iniciador Descrição iniciador Descrição iniciador Descrição iniciador Descrição iniciador Descrição iniciador Descrição iniciador Descrição iniciador da sequência sintetizada da sequência sintetizada da sequência sintetizada da sequência sintetizada da sequência sintetizada da sequência sintetizada da sequência sintetizada da sequência sintetizada da sequência sintetizada da sequência sintetizada da sequência sintetizada 204 SEQ ID NO: 19 Outra informação: artificial: Sequência do artificialmente, HCc9. SEQ ID NO: 20 Outra informação: artificial: Sequência do artificialmente, HCc5. SEQ ID NO: 21 Outra informação: artificial: Sequência do artificialmente, poliA. SEQ ID NO: 22 Outra informação: artificial: Sequência do artificialmente, AILIMHC1. SEQ ID NO: 23 Outra informação: artificial: Sequência do artificialmente, AILIMHC2. SEQ ID NO: 24 Outra informação: artificial: Sequência do artificialmente, LCcl. SEQ ID NO: 25 Outra informação: artificial: Sequência do artificialmente, LCc2. SEQ ID NO: 26 Outra informação: artificial: Sequência do artificialmente, HIK. SEQ ID NO: 39 Outra informação: artificial: Sequência do artificialmente SEQ ID NO: 40 Outra informação: artificial: Sequência do artificialmente
Descrição iniciador Descrição iniciador Descrição iniciador Descrição iniciador Descrição iniciador Descrição iniciador Descrição iniciador Descrição iniciador Descrição iniciador Descrição iniciador da sequência sintetizada da sequência sintetizada da sequência sintetizada da sequência sintetizada da sequência sintetizada da sequência sintetizada da sequência sintetizada da sequência sintetizada da sequência sintetizada da sequência sintetizada 205
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Japan Tobacco, Inc. <120> Anticorpo monoclonal humano contra uma molécula AILIM de transdução de sinal coestimulador e as respectivas utilizações farmacêuticas
<130> J1-A0101Y1P <140> <141> <150> JP P2000-147116 <151> 2000-05-18 <160> 40 <170> Patent In Ver. 2.1
<210> 1 <211> 45 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência de iniciador sintetizada artificialmente, NotI-T. <22 0> <221> ligação do iniciador <222> (1).. (45) <400> 1 206 aactggaagc ttcagcggcc gcagagattt tttttttttt ttttt 45.
<210> 2 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência do ligante sintetizada artificialmente, 20adp. <400> 2 cgtggtgtca tggcactgcg 20
<210> 3 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial:sequência do ligante sintetizada artificialmente, 24adp. <400> 3 aattcgcagt gccatgacac cacg 24
<210> 4 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial:sequência do iniciador sintetizada artificialmente, HIGLC. 207 <22 0> <221> ligação do iniciador <222> d).. (23) <4 0 0> 4 gtctgctttg ctcagcgtca ggg 23 <210> 5 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial:sequência do iniciador sintetizada artificialmente, NHCc2. <22 0> <221> ligação do iniciador <222> (D .· (21) <4 0 0> 5 caccggttcg gggaagtagt c 21 <210> 6 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial:sequência do iniciador sintetizada artificialmente, ExcellE. <22 0> <221> ligação do iniciador 208 <222> (1).. (21) <4Ο0> 6 ggtgacacta tagaatacag g 21 <210> 7 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial:sequência do iniciador sintetizada artificialmente, ckll7. <22 0> <221> ligação do iniciador <222> (D .· (25) <4 0 0> 7 gcaggcacac aacagaggca gttcc 25 <210> 8 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial:sequência do iniciador sintetizada artificialmente, M13R. <22 0> <221> ligação do iniciador <222> (D·. (20) <4 0 0> 8 209 cacaggaaac agctatgacc 20 <210> 9 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial:sequência do iniciador sintetizada artificialmente, 136H. <22 0> <221> ligação do iniciador <222> d).. (21) <4 0 0> 9 cctggacaag ggcttgagtg g 21 <210> 10 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial:sequência do iniciador sintetizada artificialmente, 138/9H. <22 0> <221> ligação do iniciador <222> d).. (21) <4 0 0> 10 acaggaaaag gtctggagtg g 21 210 <210> 11 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial:sequência do iniciador sintetizada artificialmente, AILIMHC1. <22 0> <221> ligação do iniciador <222> d).. (21) <4 0 0> 11 acagtaatac acggccgtgt c 21 <210> 12 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial:sequência do iniciador sintetizada artificialmente, NCcl. <22 0> <221> ligação do iniciador <222> d).. (21) <4 0 0> 12 gactacttcc ccgaaccggt g 21 <210> 13 <211> 22 211
<212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial:sequência do iniciador sintetizada artificialmente, HCc7. <22 0> <221> ligação do iniciador <222> d).. (22) <4 0 0> 13 gtggcaggac cgtcagtctt cc 22 <210> 14 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial:sequência do iniciador sintetizada artificialmente, HCc8. <22 0> <221> ligação do iniciador <222> d).. (24) <4 0 0> 14 aagaggaaga ctgacggtcc tgcc 24 <210> 15 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência artificial 212 <22 0> <223> Descrição da sequência artificial:sequência do iniciador sintetizada artificialmente, HCc3. <22 0> <221> ligação do iniciador <222> d).. (23) <4 0 0> 15 ccgttgtgca ccaggactgg ctg 23 <210> 16 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência do iniciador sintetizada artificialmente, HCc4. <22 0> <221> ligação do iniciador <222> d).. (23) <4 0 0> 16 tgcacttgta ctccttgccg ttc 23 <210> 17 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência artificial 213 <22 0> <223> Descrição da sequência artificial:sequência do iniciador sintetizada artificialmente, HCc6. <22 0> <221> ligação do iniciador <222> (D .· (23) <4 0 0> 17 cagccggaga acaactacaa gac 23 <210> 18 <211> 22 ... <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial:sequência do iniciador sintetizada artificialmente, HIGHC. <22 0> <221> ligação do iniciador <222> d).. (22) <4 0 0> 18 tcttgtagtt gttctccggc tg 22 <210> 19 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial 214 <22 0> <223> Descrição da sequência artificial:sequência do iniciador sintetizada artificialmente, HCc9. <22 0> <221> ligação do iniciador <222> d).. (22) <4 0 0> 19 tacttcccag gcacccagca tg 22 <210> 20 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial:sequência do iniciador sintetizada artificialmente, HCc5. <22 0> <221> ligação do iniciador <222> d).. (23) <4 0 0> 20 atgctgggtg cctgggaagt atg 23 <210> 21 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial 215 <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência do iniciador sintetizada artificialmente, poliA. <22 0> <221> ligação do iniciador <222> d).. (21) <4 0 0> 21 tcaaactatc ggccttgctg g 21 <210> 22 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência do iniciador sintetizada artificialmente, AILIMLC1. <22 0> <221> ligação do iniciador <222> d).. (21) <4 0 0> 22 tagcctggta tcagcagaaa c 21 <210> 23 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial 216 <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência do iniciador sintetizada artificialmente, AILIMLC2. <22 0> <221> ligação do iniciador <222> d).. (21) <4 0 0> 23 gtttctgctg ataccaggct a 21 <210> 24 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência do iniciador sintetizada artificialmente, LCcl. <22 0> <221> ligação do iniciador <222> d).. (22) <4 0 0> 24 gcaccatctg tcttcatctt cc 22 <210> 25 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial 217 <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência do iniciador sintetizada artificialmente, LCc2. <22 0> <221> ligação do iniciador <222> d).. (21) <4 0 0> 25 caaagagctt caacagggga g 21 <210> 26 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência do iniciador sintetizada artificialmente, HIK. <22 0> <221> ligação do iniciador <222> d).. (20) <4 0 0> 26 aggctggaac tgaggagcag 20 <210> 27 <211> 1616 <212> ADN <213> Homo sapiens 218 <22 0> <221> 5 ' UTR <222> (1). (68) <22 0> <221> CDS <222> (69). (1481) <22 0>
<221> 3'UTR <222> (1482) . (1616), <22 0> <221> sig_péptido <222> (69). (125) <4Ο0> 27 219 gaattcgcag tgccatgaca ecacgcatct gtectctaga gaatcccctg agagctccgt 60 tcctcacc aíg gac tgg acc tgg agg ate otc ttc ttg gtg gca gea gcc 110 Met Asp Trp Thr Trp Arg lie Leu Phe Leu Vai Ala Ala Ala 1 5 10 aca gga gcc cac tcc cag gtg cag ctg gtg <i^g tct ggg gct m gtg Thr Gljr Ala His Sar Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Sly Ala Glu Vai 15 20 25 30 aag aag cct m gcc tca gtg aag gtc tcc tge aag gct tct gga tac Ljrs Lys Pro oir Ala Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 acc ttc acc Sgc tac tat atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa Thr Pha Thr Cl* Tyr Tyr Met Hís Trp Vai Arg Gin Ala Pro Oly Gin 220 SQ §5 60 ggg ett gag ígg atg gga tgg ate aac eet cae agt ggt ggc aca aac 302
Gly Leu Cio Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro His Ser Gly Gly Thr Asn 65 ?0 75 tst gca cag aag ttt cag ggc agg gtc acc atg acc agg gac acg tcc 350
Tyr Ala Gin Lys Phe Gin Gly Arg Vai Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser 80 85 90 ate age aca gcc tac atg gag ctg age agg ctg aga tcc gac gac acg 398
Ile Ser Thr Ala Tyr Hat Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr
95 100 105 UO gcc gtg tat tac tgt gcg agg acg tat tac tat gat agt agt ggt tat 446
Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Π5 120 125 tac cat gat gct ttt gat ate tgg ggc caa ggg aca atg gtc acc gtc 494
Tyr Bis Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gin Gly Thr Set Vai Thr Vai 130 135 140 tct toa gcc tcc acc aag ggc cea teg gtc ttc eec ctg gcg ccc tgc 642
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys 145 150 155 221 tcc agg age acc tce gag age aca gçg gee ctg ggc tgc ctg gtc aag 59Õ
Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys 160 165 170 gac tae ttc ccc gaa ceg gtg acg gtg teg tgg aac tea ggc get ctg 638
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 175 180 185 190 acc age ggc gtg eae acc ttc cca gct gtc cta cag tcc tea gga etc 686
Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Glu Ser Ser Gly Leu 195 300 805 tac tce etc age age gtg gtg acc gtg ccc tcc age aac ttc ggc acc 734
Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr 210 215 220 cag aec tac acc tgc aac gta gat eae aag ccc age aac acc aag gtg 782
Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Vai Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai 225 230 235 gac aag aca gtt gag ege aaa tgt tgt gtc gag tgc cca ceg tgc cca 830
Asp Lys Thr Vai Glu Arg Lys Cys Cys Vai Glu Cys Pro Pro Cys Pro 240 245 250 gea cca cct gtg gea gga ceg tea gtc ttc etc ttc ccc cca aaa ccc 878
Ala Pro Pro Vai Ala Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 222 926 255 260 265 270 aag gac acc ctc atg ate tcc cgg acc cct gag gtc acg tgc gtg gtg
Lys Asp Thr teu Met Xle Ser Arg Thr Pro 51« Vai Bar Cys Vai Vai 27S 280 285 974 gtg gac gtg age cac gaa gac ccc gag gtc cag ttc aac tgg tac gtg
Vai Asp Vai Ser Bis 01« Asp Pro Glu Vai Gin Phe Asn Trp Tyr Vai 290 295 300 1022 gac ggc gtg gag gtg cat aat gee aag aca aag cca cgg gag gag cag
Asp Gly Vai Glu Vai Ris Asa Ala Lys Thr Lys Pro Arg 01« 61« 01a 305 310 315 1070 ttc aac age acg tio cgt gtg gtc age gtc ctc acc gtt gtg cac cag
Phe As» Ser Thr Phe Arg Vai Vai Ser Vai teu Thr Vai Vai Bis Gin 320 325 330 1118 gac tgg ctg aac ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa ggc
Asp Trp te« Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asa lys Gly 335 340 345 350 1166 ctc cca gee ccc ate gag aaa acc ate tcc aaa acc aaa ggg cag ccc
Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro 35S 360 365 223 cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg atg acc 1214
Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Sfet Thr 370 375 380 aag aac cag gte age ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tac ccc age Lys As» Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 385 390 395 gac ate gee gtg gag tgg gag age aat ggg cag ccg gag aac aac tac Asp íle Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asa Gly Gin Pro Glu Asa Asa Tyr 400 405 410 aag acc aca cct ccc atg ctg gae tcc gac ggc tcc ttc ttc etc tac Lys Thr Thr Pro Pro Set Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 415 420 425 430 age aag etc acc gtg gac aag age agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gl» Gin Gly Asn Vai Phe 435 440 445 tea tgc tcc gtg atg eat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys 450 455 460 age etc tcc ctg tet ccg ggt aaa tga gtgccacggc cggcaagccc Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 1252 1310 1358 1406 1454 1501 224 470 465 cegctcccca ggctctcggg gtcgcgtgag gatgcttggc acgtaccccg tgtaeatact 1561 tcccaggcae ceageatgga aataaagcac ccagcgctgc ectggaaaaa aaaaa 1616
<210> 28 <211> 470 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 «et Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Vai Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala «is Ser Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys 20 2$ 30 Pro Gly Ala Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Gly Tyr Tyr «et Kís Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 50 55 60 Clu Trp Met Gly Trp Ile Asa Pro His Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala 65 78 75 80 Gin Lys Phe Gin Gly Arg Vai Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser lie Ser 85 00 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp thr Ala Vai 225 loo 105 no
Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr His 115 120 125
Asp Ala Phe Asp lie Trp Gly Gin Gly Thr Met Vai Thr Vai Ser Ser 130 135 140
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 145 150 155 160
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr 165 170 175
Phe Pra Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser ISO 185 190
Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 19S 200 205
Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr 210 215 220
Tyr Thr Cys Asn Vai Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys 225 230 235 240
Thr Vai Glu Arg Lys Cys Cys Vai Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
245 250 25S
Pro Vai Ala Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 260 265 270
Thr Leu Met Ue Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp 275 280 285
Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Gin Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly 290 295 300
Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn 226 305 310
Ser Thr Phe Arg Vai Vai Ser Vai 325 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 340 Ãla Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 355 360 Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro 370 375 Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai 386 390 Ala Vai 0iu Trp Glu Ser Asn Gly 405 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp 420 Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp 435 440 Ser Vai Met His Glu Ala Leu His 450 455 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 315 320
Leu Thr Vai Vai His Gin Asp Trp 330 335 Lys Vai Ser Asn Lys Gly Leu Pro 345 350 Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu 365 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 380 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 395 400 Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 410 415 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 426 430 Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys 445 Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 460
<210> 29 <211> 974 <212> ADN <213> Homo sapiens 227 <22 0> <221> 5'UTR <222> (1). (38) <22 0> <221> CDS <222> (39). (749) <22 0> <221> 3'UTR <222> (750). (974) <22 0> <221> sig_péptido <222> (39). (104) <400> 29 gaattcgcag tgccatgaca ccacggtcag gacacagc atg gac atg agg gtc ccc 56
Met Asp Met Arg Vai Pro 1 5 gct cag ctc ctg ggg ctc ctg ctg etc tgg ttc eca ggt tcc aga tgc 104
Ala 6ln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Phe Pro Gly Ser Arg Cys 228 10 15 20 gae ate cag atg acc cag tet eca tet tcc gtg tet gea tet gta gga 152
Asp He Gin Het Thr Gin Ser Pro Ser Ser Vai Ser Ala Ser Vai Gly 25 30 35 gae aga gtc acc ate act tgt cgg gcg agt cag ggt att age agg ttg 209
Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly Ile Ser Arg Leu 40 45 50 tta gee tgg tet cag cag aaa cea ggg aaa gee eet as» etc ctg ate 248
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 11«
55 60 65 TO tat gtt gea tcc agt ttg caa agt ggg gtc cea tea agg tto age ggc 206
Tyr Vai Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 75 80 85 agt gga tet ggg aca gat ttc act etc acc ate age age ctg cag eet 344
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 90 95 100 gaa gat ttt gea act tac tat tgt caa cag get aac agt ttc ccg tgg 392
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ala Asn Ser Phe Pro Trp
10$ 110 US 229 acg ttc gge caa ggg acc aag gtg gaa ate aaa ega act gtg gct gea 440
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile lys Arg Thr Vai Ala Ala 120 125 130 cea tet gtc tte ate ttc ceg cea tet gat gag cag ttg aaa tet gga 438
Pro Ser Vai Phe Πβ Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin leu lys Ser Gly 135 140 145 150 act gee tet gtt gtg tgc ctg ctg aat aac tte tat ccc aga gag gee 535
Thr Ala Ser Vai Vai Cys leu leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ma 150 160 155 aaa gta cag tgg sag gtg gat aac gee etc caa teg ggt aac tce cag 534 lys Vai Gin Trp lys Vai Asp Asn Ala leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 170 175 180 gag agt gtc aca gag cag gae age aag gac age aee tac age cte age 632
Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 185 190 195 age aee ctg acg ctg age aaa gea gac tac gag aaa cac aaa gtc tac 680
Ser Thr leu Thr leu Ser lys Ala Asp Tyr Glu lys His Lys Vai Tyr 200 205 210 gee tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg age teg ccc gtc aca aag age 728
Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Vai Thr lys Ser 230 215 220 225 230 ttc aac agg gga gag tgt tag agggagaagt gcccceacct gctcctcagt 779 Phô Asn Arg Gly Glu Cys 235 tccagcctga ccccctccca tcctttggcc tctgaccctt tttecacagg ggacctaccc 839 ctattgcggt cotccagctc atctttcacc tcacccccct cctcctcctt ggctttaatt 899 atgctaatgt tggaggagaa tgaataaata aagtgaatct ttgcaaaaaa aaaaaaaaaa 959 aatctctgcg gccgc 974 <210> 30 <211> 236 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Met Asp Met Arg Vai Pro AU Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp l 5 10 IS Phe Pro Gly Ser Arg Cys Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Vai Ser Ala Ser Vai Gi Ϋ Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 231 35 40 45
Gin Gly lie Ser Arg Leu Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pio Gly Lys 50 §5 60 Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Vai Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Vai 65 70 75 80 Pro Ser Arg í%e Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 lia Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 100 105 110 Ala Asn Ser Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile 115 120 125 Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140 Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 15$ 160 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp lys Vai Asp Asn Ala Leu 165 170 175 Gin Ser Gly Asn Ser Gls Glu Ser Vai Thr Glu Gls Asp Ser Lys Asp ISO 185 190 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205 Glu Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser 210 215 220 Ser Pro Vai THr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 232 <210> 31 <211> 1708 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> 5 'UTR <222> d). (93) <22 0> <221> CDS <222> (94). (1506) <22 0> <221> 3 'UTR <222> (1507) . . (1708) . <22 0> <221> sig péptido <222> (94). (150) <4 0 0> 31 gsattcgcag taccatgaca ccacgggagc cccagccttg ggatteccaa gtgtttgtaa 60 233
tcagtgatca ggactgagca cacaggaete acc atg gag ttg ggg agc t8S HA
Hat Glu Leu Gly Ser Trp 1 § gtt ttc ctt gtt gct ata tta gaa ggt gtc cag tgt gag gtg csg ctg 162
Vai Phe Leu Vai Ala Ile Le» Glu Gly Vai Glu Cys Glu Vai Gin Leu 10 1$ 20 gtg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg ggg tcc ctg aga ctç 210
Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu 25 30 35 teu tgt gca gec tct gga ttc acc ttc agt age tac gac atg cac tgg 258
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asp 8et His Trp
40 45 50 SS gtc ege caa gct aca gga aaa ggt ctg gag tgg gtc tea gct att ggt 306
Vai Arg Gin Ala Thr Gly Lys Gly Le» 01« Trp Vai Ser Ala Ile Gly 60 65 ?0 act gct ggt gac aca tac tat cea ggc tcc gtg aag gge cga ttc acc 354
Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr 75 80 85 ate tcc aga gaa aat gee aag aac tcc ttg tat ctt caa atg aac age 402
Ile Ser Arg Glu Asa Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gin Hat Asn Ser 234 95 100 ctg aga gec ggg gae acg gct gtg tat tac tgt gta aga gat aat agg 450 teu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Vai Arg Asp Asn Arg 105 11Ô 115 aag gtg acc cac gag eac tac tac tac tac ggt atg gae gte tgg ggc 498
Lys Vai Thr His 61« His Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Vai Trp Gly 120 125 130 135 caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca gec tcc acc aag ggc cca tcg 546
Gla Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 140 145 150 gtc ttc ccc ctg gcg ccc tgc tcc agg age acc tcc gag age aca gcg 594
Vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 155 160 165 gec ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg 642
Ala Leu Gly Cys teu Vai tys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai 17Ô 175 180 tcg tgg aae tca ggc gct ctg acc age ggc gtg cac acc ttc cca gct 690
Ser Trp Asn Ser Gly Aia teu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala 185 ISO 195 235 738 gtc eta cag tcc tca gga etc tac tcc etc age age gtg gtg acc gtg
Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr ¥al 200 205 210 215 788 ccc tcc age aac ttc ggc aee cag acc tac acc tgc aac gta gat cac
Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Vai Asp Hia 220 225 230 834 aag ccc age aac acc aag gtg gac aag aca gtt gag ege aaa tgt tgt lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp lys Thr Vai Glu Arg Lys Cys Cys 235 240 245 882 gtc gag tgc cca ccg tgc cca gea cca cct gtg gea gga ccg tca gtc
Vai Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Vai Ala Gly Pro Ser Vai 250 255 260 930 ttc cte ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc etc atg ate tcc cag acc
Phe Leu Fh© Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met II© Ser Arg Thr 265 270 275 978 cct gag gtc acg tgc gtg gtg gtg gac gtg age eae gaa gac ccc gag
Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu 280 285 290 295 1028 gtc cag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gee aag
Vai Gín Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly vai Glu Vai His Asn Ala Lys 236 1074 300 305 310 aca aag cca cgg gag gag cag ttc aac age acg ttc cgt gtg gtc age Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asa Ser Thr Phe Arg Vai Vai Ser 31S 320 325 gtc cte acc gtt gtg cac cag gac tgg ctg aac ggc aag gag tac aag Vai Leu thr Vai Vai Hia Gin Asp Txp Uu Asn GXy Lys Glu Tyr Lys 330 335 MQ tgo aag gtc tce aac aaa ggc cte cca gee ccc ate gag aaa acc ate Cys Lys Vai Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro lia Glu Lys thr Ile 345 350 355 tcc aaa acc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr thr Leíi Pro 360 365 370 375 ceâ tcc cgf gag gag atg acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Glu Vai Ser Leu thr Cys Leu 380 385 390 gtc aaa ggc ttc tac ccc age gac ate gee gtg gag tgg gag age eat Vai lys Gly Phe tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn 395 400 405 1122 1170 1218 1266 1314 237 ggg cag ceg gag aac aac tac aag acc aca ect ccc atg ctg gac tcc 1362
Gly Gin Pro GIu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met teu Àsp Ser 410 415 420 gac ggc tcc ttc ttc ctc tac age aag etc acc gtg gac aag age agg 1410
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg 425 430 436 tgg cag cag ggg aac gtc ttc tea tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg 1468
Trp 61a Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu 440 446 450 465 cac aac cac tac acg cag aag age ctc tcc ctg tet ccg ggt aaa tga 1506
His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 460 465 470 gtgccacggc cggcaagccc ccgctcccca ggctetcggg gtcgcgtgag gatgcttggc 1566 acgtâccccg tgtacatact tcccaggcac ccagcatgga aataaagcac ccagcgctgc 1626 cctgggcccc tgcnaaasaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1686 aaaaaaaaat ctctgcggcc gc 1T08
<211> 470 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 238
Het Glu teu Gly Leu Ser Trp Vai Phe teu Vai Ala He teu Glu Gly 1 5 10 15 Vai Glu Cys Glu Vai Glu teu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Glu 20 25 30 Pro Gly Gly Ser teu Arg teu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Asp Hat His Trp Vai Arg Glu Ala Thr Gly Lys Gly teu 50 55 60 Glu Trp Vai ser aí a iie Gly Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly 65 70 75 80 Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Xle Ser Arg Glu Asn Ala tys Asn Ser 8$ 90 95 Leu Tyr teu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Vai Tyr 100 105 110 Tyr Cys Vai Arg Asp Asn Arg Lys Vai Thr His Glu His Tyr Tyr Tyr 115 120 125 Tyr Gly Met Asp Vai Trp Gly Glu Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 130 135 140 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro leu Ala Pro Cys Ser Árg 145 ISO 1SS 160 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ale Ala teu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr 239
16S 170 175
Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 130 185 190 Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 195 200 205 Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr 210 215 220 Tyr Thr Cys Asn Vai Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys 225 230 235 240 Thr Vai Glu Arg Lys Cys Cys Vai Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 Pro Vai Ala Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 260 265 270 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp 275 230 2S5 Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Gin Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly 290 295 300 Vai ôlu Vai His ÂStt Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn 305 310 315 320 Ser Thr Phe Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Vai His Gin Asp trp 325 330 335 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Gly Leu Pro 340 345 350 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu 355 360 365 Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 240 380 370
37S
Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 385 390 395 400
Ala Vai Giu Trp Glu Ser Asm Gly Gin Pro Glu Asa Asa tyr Lys Thr 405 410 415
Thr Pro Pro Hat Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 420 425 430
Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys 435 440 445
Ser Vai Hat Hís Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470
<210> 33 <211> 948 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> 5'UTR <222> (1). (27) <22 0> <221> CDS <222> (28). (738) <22 0> <221> 3'UTR <222> (739). (948) 241 <220> <221> sig_péptido <222> (28) (87) . <400> 33 gaattcgcag tgccatgaea ccacgcc atg gaa acc eea gcg cag ctt etc ttc §4
Set Glu Thr Pro Ala Gin teu leu Phe 1 S ctc ctg cta ctc tgg ctc cca gat acc acc gga gaa att gtg ttg acg 102 leu leu Leu Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu lie Vai Leu Thr 10 15 20 25 cag tct cca gga acc ctg tct ttg tct cca ggg gaa aga gec acc ctc 150
Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser leu Ser Pro Giy Glu Arg Ala Thr Leu 30 35 40 tcc tgc agg gcc agt cag aat att aga age age tac tta gec tgg tac 198
Ser Cys Arg Ala Ser Gin Asn Ile Arg Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyx 242 45
SO 55 cag cag aaa cct ggc cag gct ccc ggg ctc ctc ate tat ggt gea tcc 246
Oln Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Gly teu teu lie Tyr Gly Ala Ser 60 65 70 age agg gee act ggc ate cca gac agg ttc agt ggc agt ggg tet ggg 294
Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 75 60 85 aca gac ttc act ctc acc ate age aga ctg gag ect gsa gat ttt gea 342
Thr Asp Phe liar teu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala 90 95 100 m gtg tat tac tgt cag cag ttt ggt age tea cct ate tge agt ttt ggc 390
Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Gly Ser Ser Pro Set Cys Ser Phe Gly 110 115 120 cag ggg acc aag ctg gag ate aaa cga act gtg gct gea cca tet gtc 43$
Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai
125 130 13S ttc ate ttc ccg cca tet gat gag cag ttg aaa tet gga act gee tet 486
Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Cia Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser 140 145 150 243 gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag S34
Vai Vai Cys Leu leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala lys Vai Gin 155 160 1β5 tgg aag gtg gat aac gcc etc caa teg ggt aac tce cag gag agt gte 662
Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Gin Ser Vai
170 I7S 180 18S aca gag cag gac age aag gac age acc tac age etc age age acc ctg 630
Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu 190 195 200 acg ctg age aaa gea gac tac gag aaa cac aaa gte tac gcc tgc gaa 678
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Gin Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu 205 210 215 gte ace cat cag ggc ctg age teg ccc gte aca aag age ttc aac agg 726
Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg 220 225 230 gga gag tgt tag agggagaant gcceecacct gctcctcagt tccagcctga 778 Gly Glu Cys 235 ecccctccca tcctttggcc tctgaccctt tttceacagg ggacctaccc ctattgcggt 838 cctccagctc atctttcacc tcaeccccct cctcetcctt ggctttaatt atgctaatgt 898 tggaggagaa tgaataaata aagtgaatct ttgcacctgt gaaaaaaaaa 948 244
<210> 34 <211> 236 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34
Sfet Glu Thr Pro Ala Gin Leu Leu Phe Léu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser 20 25 30 teu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Asn 35 40 45 Ile Arg Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala 50 55 60 Pro Gly Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro 65 70 75 80 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Arg leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe 100 105 110 Gly Ser Ser Pro Met Cys Ser Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu íle 245 115 125
Lys Arg Thr Vai Ala Ala Fro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140 Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn 145 ISO 155 160 Phe Tyr Fro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu 165 170 175 Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp ISO 185 190 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lye Ale Asp Tyr 195 200 205 Glu Lys Bis Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser 210 215 220 Ser Fro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 333
<210> 35 <211> 1673 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> 5'UTR <222> (1). (95) <220>
<221> CDS <222> (96). (1508) 246 <22 0>
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Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asp Met His 40 45 50 tgg gtc ege caa gct sea gga aaa ggt ctg gag tgg gte tea get att 305
Trp Vai Arg Gin Ala Thr Gly lys Gly Leu Gla Trp Vai Ser Ala íie 55 60 65 70 ggt act get ggt gae aca tac tat cca ggc tcc gtg aag ggc cga ttc 353
Gly Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Vai Lys Gly Arg Phe 75 80 m acc ate tcc aga gaa aat gee aag aae tcc ttg tat ctt caa atg aac 401
Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser leu Tyr Leu Gla Met Asa 90 95 100 age ctg aga gee ggg gae acg gct gtg tat tac tgt gta aga gat aag 449
Ser Lee Arg Ala Gly Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Vai Arg Asp Lys 105 110 Πδ agg acg gtg aec eac gag cac tac tac tac tac ggt atg gae gtc tgg 497
Arg Thr Vai Thr His Glu His Tyr Tyr Tyr Tyr Gly A*P Vai Trp 120 125 130 248
ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tea gcc tcc acc aag ggc cca S4S
Gly 61a Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 138 140 145 150 tcg gtc ttc ccc ctg gçg ccc tgc tcc agg age acc tcc gag age aca S93
Ser Vai Phe Pro teu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr
185 160 16S gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ecg gtg acc 641
Ala Ala teu Gly Cys teu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr 170 175 180 gtg tcg tgg aac tea ggc gct ctg acc age ggc gtg cac acc ttc cca 689
Vai Ser Txp Asn Ser Gly Ala teu Thr Ser Gly Vai Bis Thr Phe Pro 185 190 195 gct gtc cta cag tcc tea gga etc tac tcc ctc age age gtg gtg acc 737
Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly teu Tyr Ser teu Ser Ser Vai Vai Thr 200 205 210 gtg ccc tcc age aac ttc ggc acc cag acc tac acc tgc aac gta gat 785
Vai Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Vai Asp 215 220 225 230 cac aag ccc age aac acc aag gtg gac aag aca gtt gag ege aaa tgt 833
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Thr Vai Glu Arg Lys Cys 249 240 235 245 tgt gtc gag tgc cca ccg tgc cca gca cca cct gtg gca gga ccg tca 881
Cys Vai Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Vai ála Gly Pro Ser 250 255 260 gtc tte etc tte ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg ate tcc cgg 929
Vai Pha Leu Pha Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Lee Set Ile Ser Arg 265 270 275 acc cct gag gtc acg tgc gtg gtg gtg gac gtg age eac gaa gac ccc 977
Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser Ris Glu Asp Pro 280 285 290 gag gtc cag tte aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gee 1026
Glu Vai Gin Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Aan Ala 295 300 305 310 aag aca aag cca cgg gag gag cag tte aac age acg tte cgt gtg gtc 1073
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Pha Arg Vai Vai 315 320 325 age gtc ctc acc gtt gtg cac cag gac tgg ctg aac ggc aag gag tac Π21
Ser Vai teu Thr Vai Vai His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 330 335 340 250 aag tgc aag gtc tcc aac aaa ggc ctc Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Gly leu 345 350 ato tcc aaa acc aaa ggg cag ccc cga 11a Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg 360 355 ccc cca tec ©IS gag gag atg acc aag Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 375 380 etg gtc asa gge ttc tac ccc age gac
Leu Vai Lys Gly Phe fyr Pro Ser Asp 395 aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 410 415 tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac age Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 425 430 agg tgg esg cag ggg aac gtc ttc tea Árg Trp Gin Gin Gly Asn Yal Phe Ser cca goc ccc ate gag aaa acc U69 Pro Ala Pro lie Glu Lys Tfar 355 gaa cca cag gtg tac acc ctg 1217 Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu 370 aac cag gtc age ctg acc tgc 1265 Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys 385 390 ate gee gtg gag tgg gag age 1313 íle Ala Vai Glu Trp Glu Ser 400 405 acc aca cct ccc atg ctg gac 1361 Thr Thr Pro Pro Slet Leu Asp 420 aag ctc ac© gtg gac aag age 1409 Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser 435 tgc tcc gtg atg cat gag gct 1457 Cys Ser Vai Met His Glu Ala 251 440
44S 450
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<210> 36 <211> 470 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 llet Glu Leu Giy Leu Ser Trp Vai Phe Leu Vai Ala Ile Leu Glu Giy 1 S 10 15 Vai Gin Cys Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Giy Giy Giy Leu Vai Gin 20 25 30 Pro Giy Giy Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Giy Phe Thr Phe 3$ 40 45 Sor Sor Tyr Âsp Met His Trp Vai Arg Gin Ala Thr Giy Lys Giy Leu 252 50 60 55
Glu Trp Vai Ser Ala Ile Gly Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly 65 70 75 80 Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser 85 90 95 Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser teu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Vai Tyr 100 105 110 Tyr Cys Vai Arg Asp Lys Arg Thr Vai Thr His Glu His Tyr Tyr Tyr 115 120 125 Tyr Gly Met Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Thr ¥al Thr Vai Ser Ser 130 135 140 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 145 150 155 160 Ser Tbr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr 165 170 175 Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser ISO 185 190 Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 195 200 205 Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr 210 215 220 Tyr Thr Cys Asn Vel Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys 225 230 235 240 Thr Vai Glu Arg Lys Cys Cys Vai Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 Pro Vai Ala Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 253 260 266 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp 276 280 285 Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Gin Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly 290 235 300 Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn 305 310 315 320 Ser Thr Phe Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Vai His Gin Asp Trp 325 330 335 Leu Asa Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Gly Leu Pro 340 345 350 Ala Pro Ile Glu Lys Thr ile Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu 365 360 365 Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 370 375 380 Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie 385 390 395 400 Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asa Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 405 410 415 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 420 425 430 Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys 435 440 445 Ser Vai Met Bis Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 450 455 460 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 254 37 <210> <211> <212> <213> <22 0> <221> <222> <220> <221> <222> <22 0> <221> <222> <22 0> <221> <222> <400> 970 ADN Homo sapiens 5 'UTR (D · (32) CDS (33) . (743) 3 'UTR (744) . (970) sig_péptido (33). (92) 37 255 gaattegeag tgccatgaca ccacggggaa cc atg gaa acc cca gcg cag ctt 53
Met Glu Thr Pro Ala Gin Leu 1 5 etc ttc ctc ctg cta ctc tgg ctc cca gat acc acc gga gaa att gtg 102 leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Vai 10 15 20 ttg acg cag tet cca ggc acc ctg tet ttg tet cca ggg gaa aga gee 149 Leu Thr Glu Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala 25 30 35 acc ctc tcc tgc agg gee agt cag agt att age age age tcc tta gee 197 Hir Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Ser Ser Ser Ser Leu Ala 40 45 50 55 tgg tac cag cag aaa cct ggc cag gct cec ggg ctc ctc ate ttt ggt 245 Trp Tyr Gin Gla iys Pro Gly Gin Ala Pro Gly Leu Leu Ile Phe Gly 60 6S 70 gea tcc age agg gee aet ggc ate cca gac agg ttc agt ggc agt ggg 293 Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly 11a Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly 75 S0 85 tet ggg oca gac ttc act ctc ace ate age aga ctg gag cct gaa gat 342 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp 256
90 95 1ÔQ ttt gca gtg tat tac tgt cag eag ttt ggt age tea cet atg tgc agt 389
Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Gly Ser Ser Pro tíet Cys Ser
10S 110 US ttt ggc eag ggg acc aag ctg gag ate aaa cga act gtg gct gca eca 437
Phe Gly Gin Gly Thr Lys leu Glu Ile Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro ISO 125 130 135 tet gtc ttc ate tte ccg eca tet gat gag eag ttg aaa tet gga act 485
Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly thr 140 145 150 gee tet gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat cce aga gag gee aaa 533
Ala Ser Vai Vai Cya Leu Leu Àsn Asn Phe Tyr Pro Arg *»lu Ala Lys 155 160 165 gta cag tgg aag gtg gat aac gee cte caa teg ggt aac tcc cag gag SS1
Vai Gla Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu 170 175 180 agt gtc aca gag cag gae age aag gac age acc tac sgc ctc age age 629
Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser teu Ser Ser 185 190 195 257 677 ace ctg acg ctg age aaa gea gac tac gag aaa CSC aaa gtc tac gee Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai Tyr Ala 200 295 210 215 tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg age teg ccc gtc aca aag age ttc Cys Glu Vai Thr His Gin Glf Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe 229 225 230 aac agg gga gag tgt tag agggagaagt gceeccacet gctccteagt Asn Arg Giy Glu Cys 235 tccagcctga ccccctccca tcctttggcc tctgaccctt tttccacagg ggacctaccc 333 ctattgcggt cctccagcte atetttcace tcacccccct cctcctcctt ggctttaatt 893 atgctaatgt tggaggagaa tgaataaata aagtgaatct ttgcaaaaaa aaaaaaaaaa 953 aaaatetctg cggccgc 970 <210> 38 <211> 236 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 258 Mêt Glu Thr Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu lie Vai Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser 35 40 45 Ile Ser Ser Ser Ser Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala 50 55 60 Pro Gly Leu Leu Ile Phe Gly Ala Ser Ser Arg Âla Thr Gly Ile Pro 65 70 75 80 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Âla Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe 100 105 110 Gly Ser Ser Pro Met Cys Ser Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie 115 120 125 Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile PHe Pto Pro Ser Asp 130 136 140 Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asa Âsn 145 150 XS5 160 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asa Ala Leu 165 170 175 Glu Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp 180 185 190 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 259 195 200 205
Glu Lys His tys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser 210 215 220
Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 39 <211> 35 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência do iniciador sintetizada artificialmente. <22 0> <221> ligação do iniciador <222> d).. (35) <4 0 0> 39 gaggtctccg ccctcgagat gcggctgggc agtcc 35 <210> 40 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência do iniciador sintetizada artificialmente. 260 <22 0> <221> ligação do iniciador <222> (1)..(33) <400> 40 cacaggacag ccaggggatc ccacgtggcc gcg 33
Lisboa, 27 de Setembro de 2010. 261

Claims (37)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo monoclonal humano que se liga a AILIM humana, caracterizado pelo facto de uma região variável de cadeia pesada do referido anticorpo monoclonal humano ter uma sequência de aminoácidos correspondente a (a) ou (b) que se seguem: (a) sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos da posição 20 até à 117 da SEQ ID NO: 28 ou (b) sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos da posição 20 até à 117 de SEQ ID NO: 28 na qual um a dez residuos de aminoácidos foram eliminados ou substituídos ou na qual se inseriu ou se adicionou um a dez resíduos de aminoácidos desde que, quando a região variável de cadeia pesada tiver a sequência de aminoácidos da (b) anterior, o referido anticorpo tem qualquer uma das características enunciadas a seguir de (i) a (iii): (i) uma actividade para impedir a reacção mista de linfócitos, (ii) uma actividade para induzir a transdução de sinal para induzir o interferão-γ; ou (iii) uma actividade para induzir citotoxicidade celular dependente do anticorpo nas células que expressam AILIM.
  2. 2. Anticorpo monoclonal humano que se liga a AILIM humana, caracterizado pelo facto de um polipéptido de cadeia pesada do referido anticorpo monoclonal humano ter uma 1 sequência de aminoácidos correspondente a (a) ou (b) que se seguem: (a) sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos da posição 20 até à 470 da SEQ ID NO: 28 ou (b) sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos da posição 20 até à 470 de SEQ ID NO: 28 na qual um a dez resíduos de aminoácidos foram eliminados ou substituídos ou na qual se inseriu ou se adicionou um a dez resíduos de aminoácidos desde que, quando a região variável de cadeia pesada do polipéptido tiver a sequência de aminoácidos da (b) anterior, o referido anticorpo tem qualquer uma das características enunciadas a seguir de (i) a (iii) : (i) uma actividade para impedir a reacção mista de linfócitos, (ii) uma actividade para induzir a transdução de sinal para induzir o interferão-γ ou (iii) uma actividade para induzir citotoxicidade celular dependente do anticorpo nas células que expressam AILIM.
  3. 3. Anticorpo monoclonal humano que se liga a AILIM humana, caracterizado pelo facto de uma região variável de cadeia leve do referido anticorpo monoclonal humano ter uma sequência de aminoácidos correspondente a (a) ou (b) que se seguem: (a) sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos da posição 23 até à 116 da SEQ ID NO: 30 ou 2 (b) sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos da posição 23 até à 116 da SEQ ID NO: 30 na qual um a dez residuos de aminoácidos foram eliminados ou substituídos ou na qual se inseriu ou se adicionou um a dez residuos de aminoácidos desde que, quando a região variável de cadeia leve tem a sequência de aminoácidos da (b) anterior, o referido anticorpo compreende uma qualquer das caracteristicas enunciadas a seguir de (i) a (iii): (i) uma actividade para impedir a reacção mista de linfócitos, (ii) uma actividade para induzir a transdução de sinal para induzir o interferão γ ou (iii) uma actividade para induzir citotoxicidade celular dependente do anticorpo nas células que expressam AILIM.
  4. 4. Anticorpo monoclonal humano que se liga a AILIM humana, caracterizado pelo facto de um polipéptido de cadeia leve do referido anticorpo monoclonal humano ter uma sequência de aminoácidos correspondente a (a) ou (b) que se seguem: compreendendo os da SEQ ID NO: 30 ou compreendendo os da SEQ ID NO: 30 na aminoácidos foram qual se inseriu ou aminoácidos (a) sequência de aminoácidos aminoácidos da posição 23 até 236 (b) sequência de aminoácidos aminoácidos da posição 23 até 236 qual um a dez residuos de eliminados ou substituídos ou na se adicionou um a dez resíduos de 3 desde que, quando o polipéptido de cadeia leve tiver a sequência de aminoácidos da (b) anterior, o referido anticorpo compreende uma qualquer das caracteristicas enunciadas a sequir de (i) a (iii) : (i) uma actividade para impedir a reacção mista de linfócitos, (ii) uma actividade para induzir a transdução de sinal para induzir o interferão γ ou (iii) uma actividade para induzir citotoxicidade celular dependente do anticorpo nas células que expressam AILIM.
  5. 5. Anticorpo monoclonal humano que se liga a AILIM humana, caracterizado pelo facto de compreender as seguintes caracteristicas (a) e (b): (a) uma região variável de cadeia pesada do anticorpo compreende uma qualquer das seguintes (I) ou (II): (I) uma sequência de aminoácidos que compreende a sequência de aminoácidos desde o aminoácido 20 até ao 117 da SEQ ID NO: 28 ou (II) uma sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos desde posição 20 até à 117 da SEQ ID NO: 28 na qual um a dez residuos de aminoácidos foram suprimidos ou substituídos ou nas quais se inseriu ou se adicionou um a dez resíduos de aminoácidos; e (b) uma região variável de cadeia leve do anticorpo que compreende uma qualquer das seguintes caracteristicas (I) ou (II): 4 (I) uma sequência de aminoácidos que compreende a sequência de aminoácidos desde o aminoácido 23 a 116 da SEQ ID NO: 30; ou (II) uma sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos da posição 23 a 116 da SEQ ID NO: 30 na qual um a dez resíduos de aminoácidos foram suprimidos ou substituídos ou nas quais se inseriu ou se adicionou um a dez resíduos de aminoácidos, desde que, quando a região variável da cadeia pesada é a (II) de (a) anterior ou a região variável de cadeia leve é a (II) de (b) anterior, o referido anticorpo compreende uma qualquer das características seguintes de (i) a (iii): (i) uma actividade para impedir a reacção mista de linfócitos, (ii) uma actividade para induzir a transdução de sinal para induzir interferão γ ou (iii) uma actividade para induzir a citotoxicidade celular dependente do anticorpo nas células que expressam AILIM.
  6. 6. Anticorpo monoclonal humano que se liga a AILIM humana, caracterizado pelo facto de compreender as características (a) e (b) que se seguem: (a) um polipéptido de cadeia pesada do anticorpo que compreende qualquer uma das seguintes (I) ou (II) : (I) uma sequência de aminoácidos desde o aminoácido 20 ao 470 da SEQ ID NO: 28; ou (II) uma sequência de aminoácidos compreendendo aminoácidos da posição 20 até à 470 de SEQ ID NO: 5 28 na qual um a dez resíduos de aminoácidos foram suprimidos ou substituídos ou na qual se inseriu ou se adicionou um a dez resíduos de aminoácidos; e (b) um polipéptido de cadeia leve do anticorpo compreende qualquer uma das seguintes (I) ou (II): (I) uma sequência de aminoácidos desde o aminoácido 23 a 236 da SEQ ID NO: 30; ou (II) uma sequência de aminoácidos que compreende os aminoácidos da posição 23 até à 236 da SEQ ID NO: 30 na qual um a dez resíduos de aminoácidos foram suprimidos ou substituídos ou na qual se inseriu ou se adicionou um a dez resíduos de aminoácidos, desde que, quando o polipéptido de cadeia pesada é o anterior (II) de (a) ou o polipéptido de cadeia leve é o anterior (II) de (b), o referido anticorpo compreende qualquer uma das características (i) a (iii) que se seguem: (i) uma actividade para prevenir a reacção mista de linfócitos; (ii) uma actividade para induzir a transdução de sinal para induzir o interferão γ ou (iii) uma actividade para induzir citotoxicidade celular dependente do anticorpo nas células que expressam AILIM.
  7. 7. ADN que codifica um polipéptido de uma região variável de cadeia pesada do anticorpo humano, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido polipéptido compreender a sequência de aminoácidos desde o aminoácido 20 até 117 da SEQ ID NO: 28. 6
  8. 8. ADN que codifica um polipéptido de uma região variável de cadeia leve do anticorpo humano de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o referido polipéptido compreender a sequência de aminoácidos desde o aminoácido 23 a 116 da SEQ ID NO: 30.
  9. 9. ADN que codifica um polipéptido de cadeia pesada do anticorpo humano de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o referido polipéptido compreender a sequência de aminoácidos desde o aminoácido 20 até ao 470 da SEQ ID NO: 28.
  10. 10. ADN que codifica um polipéptido de cadeia leve do anticorpo humano, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de o referido polipéptido compreender a sequência de aminoácidos desde o aminoácido 23 a 236 da SEQ ID NO: 30.
  11. 11. ADN caracterizado pelo facto de seleccionar entre (a) ou (b) a seguir: (a) um ADN que compreende a sequência de nucleótidos desde o nucleótido 126 até 419 da SEQ ID NO: 27 ou (b) um ADN que compreende a sequência de nucleótidos desde o nucleótido 105 até 386 da SEQ ID NO: 29.
  12. 12. ADN caracterizado pelo facto de se seleccionar entre (a) ou (b) a seguir: (a) um ADN que compreende a sequência de nucleótidos a partir do nucleótido 69 até 1481 da SEQ ID NO: 27 ou (b) um ADN que compreende a sequência de nucleótidos desde o nucleótido 39 até ao 749 da SEQ ID NO: 29. 7
  13. 13. Vector caracterizado pelo facto de compreender o ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 7 a 12.
  14. 14. Vector de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de compreender um ADN que compreende a sequência de nucleótidos desde o nucleótido 126 até 419 da SEQ ID NO: 27.
  15. 15. Vector, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de compreender um ADN que compreende a sequência de nucleótidos desde o nucleótido 69 até 1481 da SEQ ID NO: 27.
  16. 16. Vector, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de compreender um ADN que compreende a sequência de nucleótidos desde o nucleótido 105 até ao 386 da SEQ ID NO: 29.
  17. 17. Vector, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de compreender um ADN que compreende a sequência de nucleótidos desde o nucleótido 39 até 749 de SEQ ID NO: 29.
  18. 18. Vector, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de compreender um ADN de acordo com o seguinte (a) e (b): (a) um ADN que compreende uma sequência de nucleótidos desde o nucleótido 126 até ao 419 da SEQ ID NO: 27 e (b) um ADN que compreende uma sequência de nucleótidos desde o nucleótido 105 até ao 386 da SEQ ID NO: 29. 8
  19. 19. Vector, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de compreender um ADN de acordo com o seguinte (a) e (b): (a) um ADN que compreende uma sequência de nucleótidos desde o nucleótido 69 até ao 1481 da SEQ ID NO: 27 e (b) um ADN que compreende uma sequência de nucleótidos desde o nucleótido 39 até ao 749 de SEQ ID NO: 29.
  20. 20. Célula que produz o anticorpo monoclonal humano de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo facto de a célula não ser uma célula embrionária humana.
  21. 21. Célula, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo facto de a referida célula ser uma célula fundida obtida pela fusão de células B, derivadas de um mamifero capaz de produzir o referido anticorpo monoclonal humano e células de mieloma derivadas de um mamifero.
  22. 22. Hospedeiro genético não humano recombinante transformado pelo vector de acordo com uma qualquer das reivindicações 13 a 19, caracterizado pelo facto de o referido hospedeiro derivar de um mamifero seleccionado no grupo que consiste em bovinos, caprinos, coelhos, murganhos, ratos, hamsters e porquinhos-da-índia.
  23. 23. Hospedeiro genético recombinante, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo facto de o referido hospedeiro ser uma célula de mamíferos não humanos. 9
  24. 24. Hospedeiro genético recombinante, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo facto de o referido hospedeiro ser um óvulo fertilizado de mamífero não humano.
  25. 25. Anticorpo monoclonal humano ou parte dele, caracterizado pelo facto de se ligar a uma AILIM humana produzida por um hospedeiro de recombinação genética de acordo com as reivindicações 22 ou 23.
  26. 26. Composição farmacêutica caracterizada pelo facto de compreender o anticorpo humano de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6 e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
  27. 27. Composição farmacêutica caracterizada pelo facto de compreender um anticorpo monoclonal humano ou parte dele, de acordo com a reivindicação 25 e um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
  28. 28. Utilização do anticorpo ou de parte dele, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6 e 25, caracterizada pelo facto de se destinar à preparação de uma composição farmacêutica para prevenir, tratar ou fazer a profilaxia de uma alergia do tipo retardada.
  29. 29. Utilização do anticorpo ou de parte dele, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6 e 25, caracterizada pelo facto de se destinar à preparação de uma composição farmacêutica para prevenir, tratar ou fazer a profilaxia de artrite reumatóide.
  30. 30. Utilização do anticorpo ou de parte dele, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6 e 25, 10 caracterizada pelo facto de se destinar à preparação de uma composição farmacêutica para prevenir, tratar ou fazer a profilaxia de lúpus eritematoso sistémico.
  31. 31. Utilização do anticorpo ou de parte dele, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6 e 25, caracterizada pelo facto de se destinar à preparação de uma composição farmacêutica para prevenir, tratar ou fazer a profilaxia de psoriase.
  32. 32. Utilização do anticorpo ou de parte dele, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6 e 25, caracterizada pelo facto de se destinar à preparação de uma composição farmacêutica para prevenir, tratar ou fazer a profilaxia de doenças inflamatórias.
  33. 33. Anticorpo ou parte dele, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6 e 25, caracterizado pelo facto de se utilizar na prevenção, tratamento ou na profilaxia de uma alergia do tipo retardada.
  34. 34. Anticorpo ou parte dele, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6 e 25, caracterizado pelo facto de se utilizar na prevenção, tratamento ou na profilaxia de artrite reumatóide.
  35. 35. Anticorpo ou parte dele, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6 e 25 caracterizado pelo facto de se utilizar na prevenção, tratamento ou na profilaxia de lúpus eritematoso sistémico.
  36. 36. Anticorpo ou parte dele, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6 e 25, caracterizado pelo facto de 11 se utilizar na prevenção, tratamento ou na profilaxia de psoríase.
  37. 37. Anticorpo ou parte dele, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6 e 25, caracterizado pelo facto de se utilizar na prevenção, tratamento ou na profilaxia de doenças inflamatórias. Lisboa, 27 de Setembro de 2010. 12
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