BRPI0106646B1 - Anticorpo monoclonal de ser humano contra uma molécula de transdução de sinal coestimulador ailim e uso farmacêutico do mesmo - Google Patents

Anticorpo monoclonal de ser humano contra uma molécula de transdução de sinal coestimulador ailim e uso farmacêutico do mesmo Download PDF

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Tezuka Katsunari
Hori Nobuaki
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Abstract

"anticorpo monoclonal de ser humano contra uma molécula de transdução de sinal coestimulador ailim e uso farmacêutico do mesmo". a imunização de camundongos transgênicos produtores de anticorpos de seres humanos, os quais foram criados usando técnicas de engenharia genética, com a molécula ailim como um antígeno resultou em diversos anticorpos monocionais de seres humanos, capazes de ligarem-se a ailim e capazes de controlar uma variedade de reações biológicas (por exemplo, a proliferação de células, a produção de citocinas, a citólise imune, a morte celular, a indução de adcc, etc.), associadas com a transdução de sinal coestimulador mediada pela ailim (sinal secundário). ademais, foi revelado que o anticorpo monocional de ser humano é efetivo para tratar e prevenir as diversas doenças associadas com a transdução de sinal coestimulador mediada por ailim, sendo capaz de inibir o início e/ou o avanço das doenças.

Description

(54) Título: ANTICORPO MONOCLONAL DE SER HUMANO CONTRA UMA MOLÉCULA DE TRANSDUÇÃO DE SINAL COESTIMULADOR AILIM E USO FARMACÊUTICO DO MESMO (51) Int.CI.: C07K 16/00 (30) Prioridade Unionista: 18/05/2000 JP 2000-147116, 30/03/2001 JP 2001-99508 (73) Titular(es): JAPAN TOBACCO INC.
(72) Inventor(es): TAKASHI TSUJI; KATSUNARI TEZUKA; NOBUAKI HORI
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Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-AILIM, CONSTRUÇÕES DE DNA E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS.
Campo Técnico [001] A presente invenção refere-se aos anticorpos de seres humanos que se ligam a AILIM (molécula imunomodulatória de linfócito capaz de indução por ativação, também referida como ICOS (coestimuladora capaz de indução)); aos anticorpos monoclonais de seres humanos que se ligam a AILIM ou a uma porção do mesmo; ao DNA codificando o dito anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo, ou a uma porção do dito DNA; às células (incluindo as células recombinantes genéticas) que produzem o dito anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo; ao anticorpo monoclonal de ser humano, ou a uma porção do mesmo, produzido pelas ditas células recombinantes genéticas; à composição farmacêutica compreendendo o dito anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo; à composição farmacêutica compreendendo o anticorpo para a AILIM para tratar distúrbios relacionados à alergia tardia; ao método para identificar, quantificar ou testar substâncias que se ligam a AILIM ou ligando de AILIM; e ao kit usado para o dito método.
Técnica de Fundamento [002] Um corpo vivo de mamíferos tem sistemas de respostas imunológicas, que exclui os microorganismos patogênicos (vírus, bactérias, parasitas, etc.) ou os corpos estranhos (ambos são chamados antígenos no que se segue) que invadiram o corpo vivo. Um deles é chamado sistema de resposta imunológica natural, o outro de sistema de resposta imunológica adquirida. O primeiro é um mecanismo de exclusão compreendendo a fagocitose por fagócitos (leucócitos polimorfonucleares, monócitos, macrófagos, etc.), o ataque por células
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2/194 exterminadoras naturais (NK), e o reconhecimento não-específico, tal como a opsonização de antígeno por complementos. O último, o sistema de resposta imunológica adquirida, é um mecanismo de exclusão por linfócitos (principalmente, as células T e as células B) que adquiriram a especificidade para o antígeno (a saber, os linfócitos ativados). As células B que adquiriram especificidade para o antígeno atacam o antígeno que existe fora das células através da produção de anticorpos específicos para o antígeno. As células T que adquiriram especificidade para o antígeno (a saber, as células T ativadas) são classificadas em células T auxiliadoras e células T citotóxicas (linfócito citotóxico, CTL). As células T auxiliadoras regulam a diferenciação de células B e uma produção de anticorpos, e destroem o antígeno cooperando com os fagócitos. Estes, os CTLs, atacam as células infectadas com vírus e assim por diante por si próprios (Experimental Medicine: SUPPLEMENT, Bio Science Term Library, Immunity, Yodosha, p.p. 14-17 (1995)).
[003] Esta aquisição de especificidade para o antígeno pelas células T (a saber, a ativação das células T) é iniciada através do reconhecimento pelas células T do antígeno apresentado pelas células apresentadoras de antígenos (APC), tais como o macrófago, as células B, ou as células dendríticas. As células apresentadoras de antígenos processam os antígenos assim incorporados e apresentam estes antígenos processados através de ligação deles ao complexo de histocompatibilidade principal (MHC). As células T recebem o sinal primário para a ativação das células (ou aquisição de especificidade) por reconhecimento dos antígenos processados apresentados pelas células apresentadoras de antígenos através de um complexo entre o receptor para células T (TcR) e o antígeno CD3 existente sobre a superfície da membrana da célula (complexo de TcR/CD3).
[004] Entretanto, o sinal primário mediado pelo complexo de
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TcR/CD3, sozinho, não pode ativar as células T suficientemente e resulta na não-sensibilidade ou anergia clonal, de modo que as células não podem reagir com qualquer estimulação recebida após isso. O autócrino da interleucina 2 (IL-2) é necessário para as células T serem ativadas, serem diferenciadas em clones de células T específicos para o antígeno, e serem proliferadas. Na anergia clonal, as células T são desativadas devido a nenhuma produção de IL-2 e tal e nenhuma divisão celular. A saber, a ativação das células T acompanhada por produção de citocinas, tais como a IL-2, requer o sinal secundário seguindo o primeiro sinal através do complexo de TcR/CD3. Este sinal secundário é chamado sinal coestimulador.
[005] As células T recebem este sinal secundário e o transmitem para as células por interação (adesão das células) com moléculas diferentes do MHC sobre as células apresentadoras de antígenos, através de moléculas diferentes do complexo de TcR/CD3 sobre a superfície das células T. Este sinal secundário evita a anergia da célula (anergia clonal) e ativa as células.
[006] Embora alguma parte do mecanismo da transmissão do sinal secundário entre as células apresentadoras de antígenos e os linfócitos, tais como as células T, não tenha ainda sido elucidada em detalhe, os estudos até agora têm revelado que um fator importante para a transmissão do sinal secundário é a interação da CD28 (também chamada Tp44, T44, ou antígeno 9.3), que é uma molécula da superfície celular expressa principalmente sobre as células T e as células do timo, com a CD80 (também chamada B7-1, B7, BB1, ou B7/BB1), que é uma molécula da superfície celular expressa sobre células apresentadoras de antígenos (macrófagos, monócitos, células dendríticas, etc.) e com a CD86 (também chamada B7-2 ou B70), que é também uma molécula da superfície celular sobre as células apresentadoras de antígenos (a saber, a adesão da célula através da ligaPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 9/212
4/194 ção entre estas moléculas). Além disso, tem sido experimentalmente elucidado que a interação do antígeno associado ao linfócito T citolítico 4 (CTLA-4), cuja expressão é acreditada ser aumentada dependendo do sinal secundário, com a CD80 (B7-1) e a CD86 (B7-2) (a saber, a adesão da célula através da ligação entre estas moléculas), também desempenha uma função importante na regulação da ativação das células T pelo sinal secundário. Em outras palavras, a regulação da ativação das células T pela transmissão do sinal secundário envolve pelo menos a interação entre a CD28 e CD80/CD86, o aumento da expressão do CTLA-4, que é acreditado depender da interação, e a interação entre o CTLA-4 e CD80/CD86.
[007] A CD28 é sabida ser uma molécula coestimuladora que transmite o sinal secundário (sinal coestimulador) requerido para a ativação das células T e para evitar a anergia. O sinal secundário transmitido pela ligação desta molécula às moléculas coestimuladoras, CD80 (B7-1) e CD86 (B7-2), sobre as células apresentadoras de antígenos (adesão da célula através da ligação entre estas moléculas), estabiliza o mRNA das citocinas do tipo Th1 e conseqüentemente promove a produção pelas células T de uma grande quantidade de citocinas do tipo Th1, tais como a IL-2, o IFNg, e o TNFa. A expressão do CTLA-4 é induzida pelo sinal primário transmitido através de TcR/CD3, e a expressão é também aumentada pelo sinal secundário transmitido pela ligação entre a CD28 e a CD80. Está sendo revelado que o CTLA-4 recebe estes sinais para trabalhar para inibir a função das células T, que é contrário à ativação das células T pelo sinal secundário transmitido por CD28.
[008] A CD28 humana e o CTLA-4 são glicoproteínas do tipo I, cujos pesos moleculares são 44 kD e 41 a 43 kD, respectivamente. Ambos têm um domínio como a imunoglobulina, pertencem à superfamília da imunoglobulina, e têm tanto função como uma molécula de
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5/194 adesão de célula quanto função como uma molécula de transmissão de sinal.
[009] A CD28 humana forma um homodímero com uma ligação de dissulfeto, enquanto que o CTLA-4 existe como um monômero. Ambos os genes para CD28 e CTLA-4 estão localizados em 2q33 sobre o cromossomo humano e 1C sobre o cromossomo de camundongo, e são compostos de quatro (4) exons. A CD28 humana e o CTLA-4 são compostos de 220 e 223 aminoácidos, respectivamente, incluindo as seqüências de líder, e a homologia de aminoácidos entre eles é 20 a 30%.
[0010] Os ligandos para CD28 e CTLA-4 são a CD80 (B7-1) e a CD86 (B7-2) no ser humano e nos camundongos. O CTLA-4 tem cerca de 20 vezes tanta afinidade alta a ambos os ligandos quanto a CD28. Foi elucidado que as estruturas das seqüências de aminoácidos MYPPPY (Met-Tyr-Pro-Pro-Pro-Tyr) conservadas através das espécies animais são importantes para a ligação da CD28 e do CTLA-4 à CD80 (B7-1). Foi também descrito que, quando a CD28 é estimulada, a PI3 cinase (fosfoinositídeo 3 cinase, PI3K) associa-se com o resíduo de tirosina fosforilado em uma seqüência parcial YMNM (Tyr-Met-AsnMet) de CD28 e que a CD28 desempenha uma função importante na transmissão de sinal intracelular através desta estrutura YxxM. Além disso, foi descrito que o CTLA-4 também tem uma seqüência representada por YxxM, a saber YVKM (Tyr-Val-Lys-Met) em sua região citoplásmica e que, após ser estimulado, SYP associa-se com esta seqüência.
[0011] A CD28 é especificamente expressa em timócitos e células T sangüíneas periféricas, e o CTLA-4 é especificamente expresso em células T ativadas (Cell Engineering: SUPPLEMENT, Handbook of Adhesion Molecule, Shujunsha, p.p. 93-102 (1994); ibid. p.p. 120-136; Experimental Medicine: SUPPLEMENT, BIO SICIENCE Term Library,
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Immunity, Yodosha, p.p. 94-98 (1995); Experimental Medicine: SUPPLEMENT, BIO SCIENCE Term Library, Intracellular Signal Transduction, Yodosha, p.p. 58-59 (1997); Nihon Rinsho, Vol. 55, No 6, p.p. 215-220 (1997)).
[0012] Na regulação da função das células T (a ativação e a inibição da função das células T), a importância das interações entre as moléculas múltiplas, tais como as moléculas coestimuladoras (CD28, CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), etc.), e o CTLA-4, que coopera com elas, foi assim reconhecida, e isto chamou a atenção para a relação entre estas moléculas e as doenças, e o tratamento das doenças por regulação da função destas moléculas.
[0013] Conforme descrito, embora um corpo vivo ative o seu sistema de resposta imunológica adquirida contra os antígenos que são corpos estranhos para o corpo vivo (próprio), ele também tem tolerância imunológica de modo a não mostrar nenhuma resposta imunológica contra o seu próprio componente (auto-antígeno). Se a tolerância imunológica interrompe por alguma razão, ocorre a resposta imunológica ao auto-antígeno, as células T reativas com o auto-antígeno são induzidas pelo mesmo mecanismo como mencionado acima para cair no estado anormal de imunidade, e são causadas diversas doenças auto-imunes.
[0014] Em outras palavras, visto que as células apresentadoras de antígenos (APC) não-estimuladas, nos tecidos normais, não expressam as moléculas coestimuladoras quando o sistema imunológico de um corpo vivo estiver normal, as células T estão no estado de nãosensibilidade para manter a tolerância imunológica, mesmo se existirem células T reativas com os auto-antígenos, as quais reagem com o auto-antígeno. Foi sugerido que no estado anormal de imunidade, mais células T reativas com os auto-antígenos são ativadas devido à expressão em excesso e contínua, anormal, das moléculas coestimuPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 12/212
7/194 ladoras para, desse modo, causar doenças auto-imunes.
[0015] A partir de tais pontos de vista recentemente, são propostas muitas tentativas de tratar as diversas doenças auto-imunes por modulação da transmissão de sinais coestimuladores, por exemplo, a transmissão de sinal acima mencionada entre CD28/CTLA-4 e CD80/CD86.
[0016] Os resultados de tais tentativas não clarificaram ainda em detalhe o mecanismo da ativação das células T por interação entre as moléculas coestimuladoras e as moléculas relacionadas. Outras moléculas desconhecidas podem estar envolvidas neste mecanismo.
[0017] Recentemente, foi identificado uma nova molécula coestimuladora como a CD28 e o CTLA-4 acima descritos, a qual é acreditada efetuar a transdução de um segundo sinal (sinal coestimulador), essencial para a ativação dos linfócitos, tais como as células T, e a regulação funcional ligada com o dito sinal de linfócitos ativados, tais como as células T ativadas. Esta molécula foi designada como AILIM (molécula imunomodulatória de linfócito capaz de indução por ativação) (nos seres humanos, camundongos e ratos: Int. Immunol., Vol. 12, N2 1, p.p. 51-55, 2000), também referida como ICOS (coestimuladora capaz de indução) (nos seres humanos: Nature, Vol. 397, No 6716, p.p. 263-266, 1999)).
[0018] Por outro lado, novas moléculas chamadas B7h, B7RP-1, GL50 ou LICOS, as quais são ligandos (ligandos para AILIM) interagindo com esta molécula de transmissão coestimuladora AILIM (ICOS), foram identificadas muito recentemente (Nature. Vol. 402, No 6763, p.p. 827-832, 1999; Nature Medicine, Vol. 5, No 12, p.p. 13651369, 1999; J. Immunology, Vol. 164, p.p. 1653-1657, 2000; Curr. Biol., Vol. 10, No 6, p.p. 333-336, 2000).
[0019] A identificação destes dois tipos de novas moléculas, a saber a AILIM (ICOS) e a B7RP-1 (B7h, GL50, LICOS), como a via de
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8/194 transdução de sinal para o sinal coestimulador, essencial para a ativação acima mencionada dos linfócitos, tais como as células T, e o controle da função das células T ativadas, revelou que há a nova terceira via pela interação entre a AILIM (ICOS) e a B7RP-1 (B7h, GL50, LICOS), além da primeira e da segunda vias de sinais conhecidas, que são vias de transdução já conhecidas entre a CD28 e a CD80 (B71) /CD86 (B7-2), e aquela entre o CTLA4 e a CD80 (B7-1)/CD 86 (B72) .
[0020] Os estudos sobre as funções biológicas destas novas moléculas, o controle da função dos linfócitos, tais como as células T, através desta terceira transdução de sinal coestimulador pelas moléculas, e a relação entre a nova transdução de sinal e as doenças estão em progresso (J. Immunol., 166(1), p. 1, 2001; J. Immunol., 165(9), p. 5035, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun., 276(1), p. 335, 2000; Immunity, 13(1), p. 95, 2000; J. Exp. Med. 192(1), p. 53, 2000; Eur. J. Immunol., 30(4), p. 1040, 2000; WO 01/15732).
[0021 ] Divulgação da Invenção [0022] Especificamente, um objetivo da presente invenção é revelar as funções biológicas da nova molécula AILIM, considerada, como a CD28 e o CTLA-4, como uma molécula que transmite o sinal secundário (sinal coestimulador), essencial para a ativação dos linfócitos, tais como as células T, e que controla as funções dos linfócitos ativados, tais como as células T ativadas, por ação com o sinal; revelar as relações entre a expressão da AILIM e as doenças; e proporcionar um método e uma substância farmacêutica que inibam o desenvolvimento das diversas doenças dependentes do padrão de expressão da AILIM ou que tratem as doenças por controle das funções biológicas da AILIM usando os métodos médicos e farmacêuticos (por exemplo, uma droga, tal como um anticorpo monoclonal e um composto molecular baixo).
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9/194 [0023] Para atingir os propósitos acima descritos, os presentes inventores ativamente perseguiram estudos sobre os anticorpos de seres humanos (particularmente os anticorpos monoclonais de seres humanos) contra as AILIMs de mamíferos (particularmente a AILIM humana) e, como um resultado, por imunização de camundongos transgênicos preparados usando técnicas de recombinação genética de modo a produzir anticorpos de seres humanos com a AILIM (especificamente a fração da membrana celular de células expressando a AILIM humana), tiveram êxito em primeiro lugar no mundo na preparação de uma variedade de anticorpos monoclonais que se ligam a AILIM humana, particularmente aqueles que se ligam a AILIM humana que regulam a transdução de sinal mediada pela AILIM humana.
[0024] Uma vez que os anticorpos (particularmente os anticorpos monoclonais) desta invenção são derivados de seres humanos, eles não induzem nenhuma rejeição imunológica grave devida à imunogenicidade contra os seres humanos, a HAMA (antigenicidade humana anti-camundongo) no hospedeiro, absolutamente, a qual tem sido um grande problema (efeito colateral) na terapia usando as substâncias farmacêuticas de anticorpos compreendendo anticorpos derivados de mamíferos não-humanos, tais como os camundongos, e assim aumentando dramaticamente o valor do anticorpo como um medicamento. [0025] Portanto, os anticorpos de seres humanos (particularmente os anticorpos monoclonais de seres humanos), que se ligam às AILIMs de mamíferos (particularmente a AILIM humana) desta invenção, e as composições farmacêuticas compreendendo os ditos anticorpos de seres humanos (particularmente os anticorpos monoclonais de seres humanos) são úteis como drogas para controlar, sem nenhuma indução da rejeição imunológica devida à HAMA no hospedeiro, as diversas reações fisiológicas relacionadas à transdução de sinal coestimulador, para células que expressam a AILIM, mediada por AILIM
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10/194 (por exemplo, a proliferação de células que expressam a AILIM, a produção de citocina por células que expressam a AILIM, a citólise imune ou a apoptose de células que expressam a AILIM, e a atividade de induzir a citotoxicidade dependente de anticorpo para as células que expressam a AILIM, e assim por diante), e/ou são também úteis como drogas para suprimir e prevenir o desenvolvimento de sintomas e/ou o progresso de diversos distúrbios relacionados à transdução de sinal mediada pela dita AILIM, e como um medicamento para tratar ou prevenir o dito distúrbio.
[0026] Especificamente, as composições farmacêuticas de acordo com esta invenção são capazes de controlar (suprimir ou estimular) a proliferação de células que expressam a AILIM ou a produção de citocina (por exemplo, o interferon g ou a interleucina 4, etc.) por células que expressam a AILIM, desse modo capacitando a supressão de diversas condições patológicas e o tratamento ou a prevenção de diversos distúrbios causados por diversos fenômenos fisiológicos relacionados à transdução de sinal mediada pela AILIM.
[0027] O uso das composições farmacêuticas de acordo com esta invenção capacita a supressão, a prevenção e/ou o tratamento de, por exemplo, diversos distúrbios (por exemplo, a artrite reumatóide, a esclerose múltipla, a tiroidite auto-imune, a dermatite alérgica do tipo de contato, a dermatose inflamatória crônica, tal como o líquen plano, o lupo eritematoso sistêmico, o diabetes melito dependente de insulina, a psoríase, etc.) classificados em distúrbios auto-imunes ou alérgicos (particularmente as doenças auto-imunes e a alergia tardia causada por imunidade celular); a artropatia (por exemplo, a artrite reumatóide (RA) e a osteoartrite (OA)), a inflamação (por exemplo, a hepatite), a reação enxerto versus hospedeiro (reação GVH); a doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD); as rejeições imunológicas que acompanham a transplantação (homoplastia ou heteroplastia) de um tecido
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11/194 (tecidos tais como a pele, a córnea, o osso, etc.) ou órgão (fígado, coração, pulmão, rim, pâncreas, etc.); a resposta imunológica iniciada por um antígeno estranho ou auto-antígeno (por exemplo, a produção de anticorpos contra o dito antígeno, a proliferação celular, a produção de citocinas); e os distúrbios possivelmente causados pela imunidade intestinal anormal (especificamente os distúrbios intestinais inflamatórios (particularmente a doença do clone e a colite ulcerativa) e a alergia alimentar).
[0028] Além disso, no campo de supressão/tratamento de rejeição imunológica que acompanha a transplantação dos tecidos e órgãos acima descritos, é possível aumentar o efeito supressivo sobre a rejeição ao transplante de imunossupressores conhecidos por utilização da composição farmacêutica desta invenção, juntamente com as ditas drogas que tenham sido utilizadas para a supressão da rejeição imunológica em um tal tratamento de transplantação.
[0029] Ademais, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser aplicada para o tratamento ou a prevenção de quaisquer doenças inflamatórias para as quais os diversos esteróides sejam indicados como antiflogísticos.
[0030] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser aplicada à doença inflamatória, por exemplo, a inflamação que acompanha as diversas artrites (por exemplo a artrite reumatóide, a osteoartrite), a pneumonia, a hepatite (incluindo a hepatite viral), a inflamação que acompanha as doenças infecciosas, as doenças inflamatórias do intestino, a enterite intestinal, a nefrite (a inflamação que acompanha a nefrite glomerular, a nefrofibrose), a gastrite, a angiíte, a pancreatite, a peritonite, a bronquite, a miocardite, a cerebrite, a inflamação em lesão por reperfusão pós-isquêmica (lesão por reperfusão isquêmica miocárdica), a inflamação atribuída à rejeição imunológica após transplantação de tecido ou órgão, queimadura, as diversas inflamações da pePetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 17/212
12/194 le (psoríase, dermatite alérgica do tipo de contato, líquen planto, que é a doença da pele inflamatória crônica), a inflamação na insuficiência múltipla dos órgãos, a inflamação após operação de PTCA ou PTCR, e a inflamação que acompanha a arteriosclerose, e a tiroidite autoimune.
[0031] Além disso, por utilização de um método para identificar substâncias que se ligam a AILIM ou ao ligando para a AILIM, que é uma das presentes invenções, torna-se possível examinar para selecionar substâncias farmacêuticas (compostos sintéticos químicos ou anticorpos) com atividade potencial para tratar diversos distúrbios, por ligação a AILIM ou aos ligandos para a AILIM, para regular a transdução de sinal mediada por interação destes.
[0032] Especificamente, a presente invenção é a invenção descrita a partir de (1) até (108) que se seguem.
(1) Um anticorpo de ser humano que se liga a AILIM.
(2) O anticorpo de ser humano de (1), em que a dita AILIM é derivada de ser humano.
(3) Um anticorpo monoclonal de ser humano, o qual se liga a AILIM ou uma porção do mesmo.
(4) O anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de (3), em que a dita AILIM é derivada de ser humano.
(5) O anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de (3) ou (4), em que o dito anticorpo monoclonal de ser humano tem uma atividade de inibir uma transdução de sinal para uma célula mediada pela AILIM.
(6) O anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de (5), em que a dita atividade de inibir uma transdução de sinal é (a) ou (b) dos que se seguem:
(a) atividade de inibir a proliferação de células que expressam a AILIM, ou
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13/194 (b) atividade de inibir a produção de citocina a partir de células que expressam a AILIM.
(7) O anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de (6), em que a dita citocina é uma das citocinas produzidas pela célula T do tipo Th1 ou do tipo Th2.
(8) O anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de (7), em que a dita citocina é o interferon γ ou a interleucina 4.
(9) O anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de (5), em que o dito anticorpo monoclonal de ser humano tem uma atividade de prevenir a reação de linfócitos mistos.
(10) O anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de (3) ou (4), em que o dito anticorpo monoclonal de ser humano tem uma atividade de induzir a transdução de sinal para uma célula mediada pela AILIM.
(11) O anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de (10), em que a dita atividade de induzir a transdução de sinal é (a) ou (b) dos que seguem:
(a) atividade de induzir a proliferação de células que expressam a AILIM, ou (b) atividade de induzir a produção de citocina a partir de células que expressam a AILIM.
(12) O anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de (11), em que a dita citocina é uma das citocinas produzidas por célula T do tipo Th1 ou do tipo Th2.
(13) O anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de (12), em que a dita citocina é o interferon γ ou a interleucina 4.
(14) O anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de (3) ou (4), em que o dito anticorpo monoclonal de ser
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14/194 humano tem uma atividade de induzir a citotoxicidade dependente de anticorpo para as células que expressam a AILIM, e/ou a citólise imune ou a apoptose de células que expressam a AILIM.
(15) O anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de (3) ou (4), em que a constante de taxa de ligação (ka) entre o dito anticorpo monoclonal e a AILIM é 1,0 x 103 (1/M.Seg) ou mais.
(16) O anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de (15), em que a dita constante de taxa de ligação (ka) é 1,0 x 104 (1/M.Seg) ou mais.
(17) O anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de (16), em que a dita constante de taxa de ligação (ka) é 1,0 x 105 (1/M.Seg) ou mais.
(18) O anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de (3) ou (4), em que a constante de taxa de dissociação (kd) entre o dito anticorpo monoclonal e a AILIM é 1,0 x 10-3 (1/Seg) ou menos.
(19) O anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de (18), em que a dita constante de taxa de dissociação (kd) é 1,0 x 10-4 (1/Seg) ou menos.
(20) O anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de (19), em que a dita constante de taxa de dissociação (kd) é 1,0 x 10-5 (1/Seg) ou menos.
(21) O anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de (3) ou (4), em que a constante de dissociação (Kd) entre o dito anticorpo monoclonal e a AILIM é 1,0 x 10-6 (M) ou menos.
(22) O anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de (21), em que a dita constante de dissociação (Kd) é 1,0 x 10-7 (M) ou menos.
(23) O anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção
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15/194 do mesmo de (22), em que a dita constante de dissociação (Kd) é 1,0 x 10-8 (M) ou menos.
(24) O anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de (23), em que a dita constante de dissociação (Kd) é 1,0 x 10-9 (M) ou menos.
(25) O anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de (4), em que um DNA da região V codificando uma região variável de cadeia pesada do dito anticorpo monoclonal de ser humano é derivado do segmento de gene V de cadeia pesada da imunoglobulina humana 1-02 ou 3-13.
(26) O anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de (4), em que um DNA da região V codificando uma região variável de cadeia leve do dito anticorpo monoclonal de ser humano é derivado do segmento de gene V de cadeia leve da imunoglobulina humana L5 ou A27.
(27) O anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de (25) ou (26), em que um DNA da região V codificando uma região variável de cadeia pesada do dito anticorpo monoclonal de ser humano é derivado do segmento de gene V de cadeia pesada da imunoglobulina humana 1-02 ou 3-13, e em que um DNA da região V codificando uma região variável de cadeia leve do dito anticorpo monoclonal de ser humano é derivado do segmento de gene V de cadeia leve da imunoglobulina humana L5 ou A27.
(28) O anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de (27), em que o DNA da região V codificando uma região variável de cadeia pesada do dito anticorpo monoclonal de ser humano é derivado do segmento de gene V de cadeia pesada da imunoglobulina humana 1-02, e o DNA da região V codificando uma região variável de cadeia leve do dito anticorpo monoclonal de ser humano é derivado do segmento de gene V de cadeia leve da imunoglobulina
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16/194 humana L5.
(29) O anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de (27), em que o DNA da região V codificando uma região variável de cadeia pesada do dito anticorpo monoclonal de ser humano é derivado do segmento de gene V de cadeia pesada da imunoglobulina humana 3-13, e o DNA da região V codificando uma região variável de cadeia leve do dito anticorpo monoclonal de ser humano é derivado do segmento de gene V de cadeia leve da imunoglobulina humana A27.
(30) O anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de (4), em que uma região variável de cadeia pesada do dito anticorpo monoclonal de ser humano tem uma seqüência de aminoácidos definida em quaisquer dos seguintes (a) até (f):
(a) seqüência de aminoácidos compreendendo aminoácidos da posição 20 até 117 de SEQ ID NO: 28, (b) seqüência de aminoácidos compreendendo aminoácidos da posição 20 até 117 de SEQ ID NO: 28, na qual um ou mais resíduos de aminoácidos são removidos ou substituídos, ou à qual um ou mais resíduos de aminoácidos são inseridos ou adicionados.
(c) seqüência de aminoácidos compreendendo aminoácidos da posição 20 até 116 de SEQ ID NO: 32, (d) seqüência de aminoácidos compreendendo aminoácidos da posição 20 até 116 de SEQ ID NO: 32, na qual um ou mais resíduos de aminoácidos são removidos ou substituídos, ou à qual um ou mais resíduos de aminoácidos são inseridos ou adicionados.
(e) seqüência de aminoácidos compreendendo aminoácidos da posição 20 até 116 de SEQ ID NO: 36, ou (f) seqüência de aminoácidos compreendendo aminoácidos da posição 20 até 116 de SEQ ID NO: 36, na qual um ou mais resíduos de aminoácidos são removidos ou substituídos, ou à qual um ou
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17/194 mais resíduos de aminoácidos são inseridos ou adicionados.
(31) O anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de (4), em que um polipeptídeo de cadeia pesada do dito anticorpo monoclonal de ser humano tem uma seqüência de aminoácidos definida em quaisquer dos seguintes (a) até (f):
(a) seqüência de aminoácidos compreendendo aminoácidos da posição 20 até 470 de SEQ ID NO: 28, (b) seqüência de aminoácidos compreendendo aminoácidos da posição 20 até 470 de SEQ ID NO: 28, na qual um ou mais resíduos de aminoácidos são removidos ou substituídos, ou à qual um ou mais resíduos de aminoácidos são inseridos ou adicionados.
(c) seqüência de aminoácidos compreendendo aminoácidos da posição 20 até 470 de SEQ ID NO: 32, (d) seqüência de aminoácidos compreendendo aminoácidos da posição 20 até 470 de SEQ ID NO: 32, na qual um ou mais resíduos de aminoácidos são removidos ou substituídos, ou à qual um ou mais resíduos de aminoácidos são inseridos ou adicionados.
(e) seqüência de aminoácidos compreendendo aminoácidos da posição 20 até 470 de SEQ ID NO: 36, ou (f) seqüência de aminoácidos compreendendo aminoácidos da posição 20 até 470 de SEQ ID NO: 36, na qual um ou mais resíduos de aminoácidos são removidos ou substituídos, ou à qual um ou mais resíduos de aminoácidos são inseridos ou adicionados.
(32) O anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de (4), em que uma região variável de cadeia leve do dito anticorpo monoclonal de ser humano tem uma seqüência de aminoácidos definida em quaisquer dos seguintes (a) até (f):
(a) seqüência de aminoácidos compreendendo aminoácidos da posição 23 até 116 de SEQ ID NO: 30, (b) seqüência de aminoácidos compreendendo aminoáciPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 23/212
18/194 dos da posição 23 até 116 de SEQ ID NO: 30, na qual um ou mais resíduos de aminoácidos são removidos ou substituídos, ou à qual um ou mais resíduos de aminoácidos são inseridos ou adicionados.
(c) seqüência de aminoácidos compreendendo aminoácidos da posição 21 até 116 de SEQ ID NO: 34, (d) seqüência de aminoácidos compreendendo aminoácidos da posição 21 até 116 de SEQ ID NO: 34, na qual um ou mais resíduos de aminoácidos são removidos ou substituídos, ou à qual um ou mais resíduos de aminoácidos são inseridos ou adicionados.
(e) seqüência de aminoácidos compreendendo aminoácidos da posição 21 até 116 de SEQ ID NO: 38, ou (f) seqüência de aminoácidos compreendendo aminoácidos da posição 21 até 116 de SEQ ID NO: 38, na qual um ou mais resíduos de aminoácidos são removidos ou substituídos, ou à qual um ou mais resíduos de aminoácidos são inseridos ou adicionados.
(33) O anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de (4), em que um polipeptídeo de cadeia leve do dito anticorpo monoclonal de ser humano tem uma seqüência de aminoácidos definida em quaisquer dos seguintes (a) até (f):
(a) seqüência de aminoácidos compreendendo aminoácidos da posição 23 até 236 de SEQ ID NO: 30, (b) seqüência de aminoácidos compreendendo aminoácidos da posição 23 até 236 de SEQ ID NO: 30, na qual um ou mais resíduos de aminoácidos são removidos ou substituídos, ou à qual um ou mais resíduos de aminoácidos são inseridos ou adicionados.
(c) seqüência de aminoácidos compreendendo aminoácidos da posição 21 até 236 de SEQ ID NO: 34, (d) seqüência de aminoácidos compreendendo aminoácidos da posição 21 até 236 de SEQ ID NO: 34, na qual um ou mais resíduos de aminoácidos são removidos ou substituídos, ou à qual um
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19/194 ou mais resíduos de aminoácidos são inseridos ou adicionados.
(e) seqüência de aminoácidos compreendendo aminoácidos da posição 21 até 236 de SEQ ID NO: 38, ou (f) seqüência de aminoácidos compreendendo aminoácidos da posição 21 até 236 de SEQ ID NO: 38, na qual um ou mais resíduos de aminoácidos são removidos ou substituídos, ou à qual um ou mais resíduos de aminoácidos são inseridos ou adicionados.
(34) O anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de (4), em que o dito anticorpo monoclonal de ser humano tem as seguintes características (a) e (b):
(a) uma região variável de cadeia pesada tem uma seqüência de aminoácidos compreendendo a seqüência de aminoácidos do aminoácido 20 até 117 de acordo com SEQ ID NO: 28, e (b) uma região variável de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos compreendendo a seqüência de aminoácidos do aminoácido 23 até 116 de acordo com SEQ ID NO: 30.
(35) O anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de (4), em que o dito anticorpo monoclonal de ser humano tem as seguintes características (a) e (b):
(a) um polipeptídeo de cadeia pesada tem uma seqüência de aminoácidos do aminoácido 20 até 470 de acordo com SEQ ID NO: 28, e (b) um polipeptídeo de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos do aminoácido 23 até 236 de acordo com SEQ ID NO:
30.
(36) O anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de (4), em que o dito anticorpo monoclonal de ser humano tem as seguintes características (a) e (b):
(a) uma região variável de cadeia pesada tem uma seqüência de aminoácidos compreendendo a seqüência de aminoácidos do
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20/194 aminoácido 20 até 116 de acordo com SEQ ID NO: 32, e (b) uma região variável de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos compreendendo a seqüência de aminoácidos do aminoácido 21 até 116 de acordo com SEQ ID NO: 34.
(37) O anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de (4), em que o dito anticorpo monoclonal de ser humano tem as seguintes características (a) e (b):
(a) um polipeptídeo de cadeia pesada tem uma seqüência de aminoácidos compreendendo a seqüência de aminoácidos do aminoácido 20 até 470 de acordo com SEQ ID NO: 32, e (b) um polipeptídeo de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos compreendendo a seqüência de aminoácidos do aminoácido 21 até 236 de acordo com SEQ ID NO: 34.
(38) O anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de (4), em que o dito anticorpo monoclonal de ser humano tem as seguintes características (a) e (b):
(a) uma região variável de cadeia pesada tem uma seqüência de aminoácidos compreendendo a seqüência de aminoácidos do aminoácido 20 até 116 de acordo com SEQ ID NO: 36, e (b) uma região variável de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos compreendendo a seqüência de aminoácidos do aminoácido 21 até 116 de acordo com SEQ ID NO: 38.
(39) O anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de (4), em que o dito anticorpo monoclonal de ser humano tem as seguintes características (a) e (b):
(a) um polipeptídeo de cadeia pesada tem uma seqüência de aminoácidos compreendendo a seqüência de aminoácidos do aminoácido 20 até 470 de acordo com SEQ ID NO: 36, e (b) um polipeptídeo de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos compreendendo a seqüência de aminoácidos do aminoáPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 26/212
21/194 cido 21 até 236 de acordo com SEQ ID NO: 38.
(40) O anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de qualquer um de (3) até (29), em que o dito anticorpo monoclonal de ser humano é um anticorpo monoclonal derivado de um mamífero não-humano transgênico capaz de produzir anticorpos de seres humanos.
(41) O anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de (40), em que o dito anticorpo monoclonal de ser humano é obtido por imunização de mamífero não-humano transgênico capaz de produzir anticorpo de ser humano com células que expressam a AILIM, frações de membrana derivadas das ditas células, moléculas inteiras constituindo a AILIM ou uma porção das mesmas, ou genes codificando a AILIM ou uma porção dos mesmos.
(42) O anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de (40) ou (41), em que o dito mamífero não-humano transgênico é um camundongo transgênico.
(43) Um DNA ou uma porção do mesmo codificando um polipeptídeo selecionado do grupo consistindo em (a) até (f) abaixo:
(a) um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos do aminoácido 20 até 117 de acordo com SEQ ID NO: 28, (b) um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos do aminoácido 23 até 116 de acordo com SEQ ID NO: 30, (c) um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos do aminoácido 20 até 116 de acordo com SEQ ID NO: 32, (d) um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos do aminoácido 21 até 116 de acordo com SEQ ID NO: 34, (e) um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos do aminoácido 20 até 116 de acordo com SEQ ID NO: 36, e (f) um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos do aminoácido 21 até 116 de acordo com SEQ ID NO: 38.
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22/194 (44) Um DNA ou uma porção do mesmo codificando um polipeptídeo selecionado do grupo consistindo em (a) até (f) abaixo:
(a) um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos 20 até 470 de acordo com SEQ ID NO: 28, (b) um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos 23 até 236 de acordo com SEQ ID NO: 30, (c) um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos 20 até 470 de acordo com SEQ ID NO: 32, (d) um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos 21 até 236 de acordo com SEQ ID NO: 34, (e) um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos dos aminoácido 20 até 470 de acordo com SEQ ID NO: 36, e (f) um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos dos aminoácido 21 até 236 de acordo com SEQ ID NO: 38.
(45) Um DNA ou uma porção do mesmo selecionado do grupo consistindo em (a) até (f) abaixo:
(a) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 126 até 419 de acordo com SEQ ID NO: 27, (b) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 105 até 386 de acordo com SEQ ID NO: 29, (c) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 151 até 441 de acordo com SEQ ID NO: 31, (d) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 88 até 375 de acordo com SEQ ID NO: 33, (e) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 153 até 443 de acordo com SEQ ID NO: 35, e (f) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 93 até 380 de acordo com SEQ ID NO: 37.
(46) Um DNA ou uma porção do mesmo selecionado do grupo consistindo em (a) até (f) abaixo:
Petição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 28/212
23/194 (a) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 69 até 1481 de acordo com SEQ ID NO: 27, (b) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 39 até 749 de acordo com SEQ ID NO: 29, (c) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 94 até 1506 de acordo com SEQ ID NO: 31, (d) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 28 até 738 de acordo com SEQ ID NO: 33, (e) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 96 até 1508 de acordo com SEQ ID NO: 35, e (f) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 33 até 743 de acordo com SEQ ID NO: 37.
(47) Um vetor compreendendo o DNA de qualquer um de (43) até (46).
(48) O vetor de (47) compreendendo um DNA de acordo com quaisquer dos seguintes (a) até (c):
(a) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 126 até 419 de acordo com SEQ ID NO: 27, (b) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 151 até 441 de acordo com SEQ ID NO: 31, ou (c) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 153 até 443 de acordo com SEQ ID NO: 35.
(49) O vetor de (47) compreendendo um DNA de acordo com quaisquer dos seguintes (a) até (c):
(a) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 69 até 1481 de acordo com SEQ ID NO: 27, (b) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 94 até 1506 de acordo com SEQ ID NO: 31, ou (c) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 96 até 1508 de acordo com SEQ ID NO: 35.
Petição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 29/212
24/194 (50) O vetor de (47) compreendendo um DNA de acordo com quaisquer dos seguintes (a) até (c):
(a) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 105 até 386 de acordo com SEQ ID NO: 29, (b) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 88 até 375 de acordo com SEQ ID NO: 33, ou (c) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 93 até 380 de acordo com SEQ ID NO: 37.
(51) O vetor de (47) compreendendo um DNA de acordo com quaisquer dos seguintes (a) até (c):
(a) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 39 até 749 de acordo com SEQ ID NO: 29, (b) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 28 até 738 de acordo com SEQ ID NO: 33, ou (c) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 33 até 743 de acordo com SEQ ID NO: 37.
(52) O vetor de (47) compreendendo um DNA de acordo com os seguintes (a) e (b):
(a) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 126 até 419 de acordo com SEQ ID NO: 27, e (b) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 105 até 386 de acordo com SEQ ID NO: 29.
(53) O vetor de (47) compreendendo um DNA de acordo com os seguintes (a) e (b):
(a) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 69 até 1481 de acordo com SEQ ID NO: 27, e (b) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 39 até 749 de acordo com SEQ ID NO: 29.
(54) O vetor de (47) compreendendo um DNA de acordo com os seguintes (a) e (b):
Petição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 30/212
25/194 (a) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 151 até 441 de acordo com SEQ ID NO: 31, e (b) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 88 até 375 de acordo com SEQ ID NO: 33.
(55) O vetor de (47) compreendendo um DNA de acordo com os seguintes (a) e (b):
(a) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 94 até 1506 de acordo com SEQ ID NO: 31, e (b) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 28 até 738 de acordo com SEQ ID NO: 33.
(56) O vetor de (47) compreendendo um DNA de acordo com os seguintes (a) e (b):
(a) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 153 até 443 de acordo com SEQ ID NO: 35, e (b) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 93 até 380 de acordo com SEQ ID NO: 37.
(57) O vetor de (47) compreendendo um DNA de acordo com os seguintes (a) e (b):
(a) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 96 até 1508 de acordo com SEQ ID NO: 35, e (b) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 33 até 743 de acordo com SEQ ID NO: 37.
(58) Uma célula produzindo um anticorpo monoclonal de ser humano de qualquer um de (3) até (42).
(59) A célula de (58), em que a dita célula é uma célula fundida obtida por fusão de célula B, derivada de um mamífero capaz de produzir o dito anticorpo monoclonal de ser humano, e célula de mieloma derivada de um mamífero.
(60) Um hospedeiro recombinante genético, transformado por transferência de um DNA descrito abaixo em (a) ou um vetor comPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 31/212
26/194 preendendo o dito DNA, um DNA descrito abaixo em (b) ou um vetor compreendendo o dito DNA, ou ambos os DNAs descritos abaixo em (a) e (b) ou um vetor compreendendo ambos os ditos DNAs:
(a) um DNA codificando um polipeptídeo de cadeia pesada ou uma porção do mesmo de um anticorpo monoclonal que se liga a AILIM humana; ou (b) um DNA codificando um polipeptídeo de cadeia leve ou uma porção do mesmo de um anticorpo monoclonal que se liga a AILIM humana.
(61) O hospedeiro recombinante genético de (60), em que o dito anticorpo monoclonal é um anticorpo monoclonal de ser humano.
(62) O hospedeiro recombinante genético de (60) ou (61), em que o dito hospedeiro é uma célula de mamífero.
(63) O hospedeiro recombinante genético de (60) ou (61), em que o dito hospedeiro é um ovo fertilizado de mamífero.
(64) O hospedeiro recombinante genético de qualquer um de (60) até (63), em que o dito polipeptídeo de cadeia pesada é um dos polipeptídeos de cadeia pesada selecionados do grupo consistindo nos seguintes (a) até (c):
(a) um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos 20 até 117 de acordo com SEQ ID NO: 28, (b) um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos 20 até 116 de acordo com SEQ ID NO: 32, e (c) um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos 20 até 116 de acordo com SEQ ID NO: 36.
(65) O hospedeiro recombinante genético de qualquer um de (60) até (63), em que o dito polipeptídeo de cadeia pesada é um
Petição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 32/212
27/194 dos polipeptídeos de cadeia pesada selecionados do grupo consistindo nos seguintes (a) até (c):
(a) um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos 20 até 470 de acordo com SEQ ID NO: 28, (b) um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos 20 até 470 de acordo com SEQ ID NO: 32, e (c) um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos 20 até 470 de acordo com SEQ ID NO: 36.
(66) O hospedeiro recombinante genético de qualquer um de (60) até (63), em que o dito polipeptídeo de cadeia leve é um dos polipeptídeos de cadeia leve selecionados do grupo consistindo nos seguintes (a) até (c):
(a) um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos 23 até 116 de acordo com SEQ ID NO: 30, (b) um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos 21 até 116 de acordo com SEQ ID NO: 34, e (c) um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos 21 até 116 de acordo com SEQ ID NO: 38.
(67) O hospedeiro recombinante genético de qualquer um de (60) até (63), em que o dito polipeptídeo de cadeia leve é um dos polipeptídeos de cadeia leve selecionados do grupo consistindo nos seguintes (a) até (c):
(a) um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos 23 até 236 de acordo com
Petição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 33/212
28/194
SEQ ID NO: 30, (b) um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos 21 até 236 de acordo com SEQ ID NO: 34, e (c) um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos 21 até 236 de acordo com SEQ ID NO: 38.
(68) O hospedeiro recombinante genético de qualquer um de (60) até (63), em que os ditos polipeptídeos de cadeia pesada e de cadeia leve são aqueles definidos abaixo em (a) e (b), respectivamente:
(a) um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos 20 até 117 de acordo com SEQ ID NO: 28, e (b) um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos 23 até 116 de acordo com SEQ ID NO: 30.
(69) O hospedeiro recombinante genético de qualquer um de (60) até (63), em que os ditos polipeptídeos de cadeia pesada e de cadeia leve são aqueles definidos abaixo em (a) e (b), respectivamente:
(a) um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos 20 até 470 de acordo com SEQ ID NO: 28, e (b) um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos 23 até 236 de acordo com SEQ ID NO: 30.
(70) O hospedeiro recombinante genético de qualquer um de (60) até (63), em que os ditos polipeptídeos de cadeia pesada e de cadeia leve são aqueles definidos abaixo em (a) e (b), respectivamenPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 34/212
29/194 te:
(a) um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos 20 até 116 de acordo com SEQ ID NO: 32, e (b) um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos 21 até 116 de acordo com SEQ ID NO: 34.
(71) O hospedeiro recombinante genético de qualquer um de (60) até (63), em que os ditos polipeptídeos de cadeia pesada e de cadeia leve são aqueles definidos abaixo em (a) e (b), respectivamente:
(a) um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos 20 até 470 de acordo com SEQ ID NO: 32, e (b) um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos 21 até 236 de acordo com SEQ ID NO: 34.
(72) O hospedeiro recombinante genético de qualquer um de (60) até (63), em que os ditos polipeptídeos de cadeia pesada e de cadeia leve são aqueles definidos abaixo em (a) e (b), respectivamente:
(a) um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos 20 até 116 de acordo com SEQ ID NO: 36, e (b) um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos 21 até 116 de acordo com SEQ ID NO: 38.
(73) O hospedeiro recombinante genético de qualquer um de (60) até (63), em que os ditos polipeptídeos de cadeia pesada e de cadeia leve são aqueles definidos abaixo em (a) e (b), respectivamenPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 35/212
30/194 te:
(a) um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos 20 até 470 de acordo com SEQ ID NO: 36, e (b) um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos 21 até 236 de acordo com SEQ ID NO: 38.
(74) O hospedeiro recombinante genético de qualquer um de (60) até (63), em que o DNA codificando o dito polipeptídeo de cadeia pesada é um DNA definido em quaisquer dos seguintes (a) até (c):
(a) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 126 até 419 de acordo com SEQ ID NO: 27, (b) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 151 até 441 de acordo com SEQ ID NO: 31, e (c) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 153 até 443 de acordo com SEQ ID NO: 35.
(75) O hospedeiro recombinante genético de qualquer um de (60) até (63), em que o DNA codificando o dito polipeptídeo de cadeia pesada é um DNA definido em quaisquer dos seguintes (a) até (c):
(a) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 69 até 1481 de acordo com SEQ ID NO: 27, (b) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 94 até 1506 de acordo com SEQ ID NO: 31, e (c) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 96 até 1508 de acordo com SEQ ID NO: 35.
(76) O hospedeiro recombinante genético de qualquer um de (60) até (63), em que o DNA codificando o dito polipeptídeo de cadeia leve é um DNA definido em quaisquer dos seguintes (a) até (c):
Petição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 36/212
31/194 (a) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 105 até 386 de acordo com SEQ ID NO: 29, (b) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 88 até 375 de acordo com SEQ ID NO: 33, e (c) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 93 até 380 de acordo com SEQ ID NO: 37.
(77) O hospedeiro recombinante genético de qualquer um de (60) até (63), em que o DNA codificando o dito polipeptídeo de cadeia leve é um DNA definido em quaisquer dos seguintes (a) até (c):
(a) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 39 até 749 de acordo com SEQ ID NO: 29, (b) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 28 até 738 de acordo com SEQ ID NO: 33, e (c) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 33 até 743 de acordo com SEQ ID NO: 37.
(78) O hospedeiro recombinante genético de qualquer um de (60) até (63), em que o DNA codificando o dito polipeptídeo de cadeia pesada é um DNA descrito abaixo em (a), e o DNA codificando o dito polipeptídeo de cadeia leve é um DNA como descrito abaixo em (b):
(a) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 126 até 419 de acordo com SEQ ID NO: 27, e (b) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 105 até 386 de acordo com SEQ ID NO: 29.
(79) O hospedeiro recombinante genético de qualquer um de (60) até (63), em que o DNA codificando o dito polipeptídeo de cadeia pesada é o DNA descrito abaixo em (a), e o DNA codificando o dito polipeptídeo de cadeia leve é o DNA descrito abaixo em (b):
(a) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 69 até 1481 de acordo com SEQ ID NO: 27, e
Petição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 37/212
32/194 (b) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 39 até 749 de acordo com SEQ ID NO: 29.
(80) O hospedeiro recombinante genético de qualquer um de (60) até (63), em que o DNA codificando o dito polipeptídeo de cadeia pesada é o DNA descrito abaixo em (a), e o DNA codificando o dito polipeptídeo de cadeia leve é o DNA descrito abaixo em (b):
(a) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 151 até 441 de acordo com SEQ ID NO: 31, e (b) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 88 até 375 de acordo com SEQ ID NO: 33.
(81) O hospedeiro recombinante genético de qualquer um de (60) até (63), em que o DNA codificando o dito polipeptídeo de cadeia pesada é o DNA descrito abaixo em (a), e o DNA codificando o dito polipeptídeo de cadeia leve é o DNA descrito abaixo em (b):
(a) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 94 até 1506 de acordo com SEQ ID NO: 31, e (b) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 28 até 738 de acordo com SEQ ID NO: 33.
(82) O hospedeiro recombinante genético de qualquer um de (60) até (63), em que o DNA codificando o dito polipeptídeo de cadeia pesada é o DNA descrito abaixo em (a), e o DNA codificando o dito polipeptídeo de cadeia leve é o DNA descrito abaixo em (b):
(a) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 153 até 443 de acordo com SEQ ID NO: 35, e (b) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 93 até 380 de acordo com SEQ ID NO: 37.
(83) O hospedeiro recombinante genético de qualquer um de (60) até (63), em que o DNA codificando o dito polipeptídeo de cadeia pesada é o DNA descrito abaixo em (a), e o DNA codificando o dito polipeptídeo de cadeia leve é o DNA descrito abaixo em (b):
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33/194 (a) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 96 até 1508 de acordo com SEQ ID NO: 35, e (b) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 33 até 743 de acordo com SEQ ID NO: 37.
(84) Um anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo produzido por um hospedeiro recombinante genético (desde que excluindo o caso onde o dito hospedeiro é um ovo fertilizado) de qualquer um de (60) até (62), ou de qualquer um de (64) até (83) .
(85) Uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo de ser humano de (1) ou (2), e um veículo farmaceuticamente aceitável.
(86) Uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de qualquer um de (3) até (42), e um veículo farmaceuticamente aceitável.
(87) Uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo monoclonal de ser humano ou uma porção do mesmo de (84) , e um veículo farmaceuticamente aceitável.
(88) A composição farmacêutica de qualquer um de (85) até (87), em que a dita composição farmacêutica é usada para inibir a transdução de sinal para a célula mediada por AILIM.
(89) A composição farmacêutica de qualquer um de (85) até (87), em que a dita composição farmacêutica é usada para prevenir a proliferação de células que expressam a AILIM.
(90) A composição farmacêutica de qualquer um de (85) até (87), em que a dita composição farmacêutica é usada para prevenir a produção de uma citocina a partir de células que expressam a AILIM.
(91) A composição farmacêutica de qualquer um de (85) até (87), em que a dita composição farmacêutica é usada para induzir a transdução de sinal para uma célula mediada por AILIM.
Petição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 39/212
34/194 (92) A composição farmacêutica de qualquer um de (85) até (87), em que a dita composição farmacêutica é usada para induzir a proliferação de células que expressam a AILIM.
(93) A composição farmacêutica de qualquer um de (85) até (87), em que a dita composição farmacêutica é usada para induzir a produção de uma citocina a partir de células que expressam a AILIM.
(94) A composição farmacêutica de qualquer um de (85) até (87), em que a dita composição farmacêutica é usada para induzir a citotoxicidade dependente de anticorpo contra as células que expressam a AILIM, e/ou a citólise imune ou a apoptose de células que expressam a AILIM.
(95) Uma composição farmacêutica para a prevenção, o tratamento, ou a profilaxia de alergia do tipo tardia, compreendendo uma substância tendo uma atividade na modulação da transdução de sinal mediada por AILIM, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
(96) A composição farmacêutica de (95), em que a substância é uma substância protéica.
(97) A composição farmacêutica de (96), em que a substância protéica é selecionada do grupo consistindo em:
a) um anticorpo que se liga a AILIM ou uma porção do mesmo;
b) um polipeptídeo compreendendo a totalidade ou uma porção de uma região extracelular de AILIM;
c) um polipeptídeo de fusão compreendendo a totalidade ou uma porção de uma região extracelular de AILIM, e a totalidade ou uma porção de uma região constante de cadeia pesada da imunoglobulina; e
d) um polipeptídeo que se liga a AILIM.
(98) A composição farmacêutica de (97), em que o dito anticorpo que se liga a AILIM é o anticorpo de ser humano de (1) ou (2).
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35/194 (99) A composição farmacêutica de (97), em que o dito anticorpo que se liga a AILIM é o anticorpo monoclonal de ser humano de qualquer um de (3) até (42).
(100) A composição farmacêutica de (97), em que o dito anticorpo contra a AILIM é o anticorpo monoclonal de ser humano de (84).
(101) A composição farmacêutica de (95), em que a substância é uma substância não-protéica.
(102) A composição farmacêutica de (101), em que a substância não-protéica é o DNA, o RNA, ou um composto quimicamente sintetizado.
(103) Um método para identificar substâncias que se ligam a AILIM ou ao ligando para AILIM compreendendo os seguintes processos:
(a) preparar um veículo insolúvel sobre o qual é imobilizada a região extracelular inteira da AILIM ou uma porção da mesma;
(b) preparar um polipeptídeo compreendendo a região extracelular inteira do ligando para a AILIM ou uma porção da mesma marcada com um material marcador que emite um sinal detectável;
(c) reagir o veículo insolúvel no processo (a) com o polipeptídeo no processo (b);
(d) reagir o veículo insolúvel do processo (a), o polipeptídeo do processo (b) e a dita substância um com o outro em quaisquer ordens arbitrárias;
(e) detectar o sinal emitido do dito material marcador contido no complexo produzido no processo (c), e o sinal emitido do dito material marcador contido no complexo produzido no processo (d), respectivamente; e (f) comparar a magnitude de cada um dos sinais detectados no processo (e).
Petição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 41/212
36/194 (104) Um método para identificar substâncias que se ligam a AILIM ou ao ligando para AILIM compreendendo os seguintes processos:
(a) preparar um veículo insolúvel sobre o qual é imobilizada a região extracelular inteira do ligando para AILIM ou uma porção da mesma;
(b) preparar um polipeptídeo compreendendo a região extracelular inteira da AILIM ou uma porção da mesma marcada com um material marcador que emite um sinal detectável;
(c) reagir o veículo insolúvel no processo (a) com o polipeptídeo no processo (b);
(d) reagir o veículo insolúvel do processo (a), o polipeptídeo do processo (b) e a dita substância um com o outro em quaisquer ordens arbitrárias;
(e) detectar o sinal emitido do dito material marcador contido no complexo produzido no processo (c), e o sinal emitido do dito material marcador contido no complexo produzido no processo (d), respectivamente; e (f) comparar a magnitude de cada um dos sinais detectados no processo (e).
(105) O método de (103) ou (104), em que o dito polipeptídeo compreendendo a região extracelular inteira da AILIM ou uma porção da mesma é um polipeptídeo de fusão compreendendo um polipeptídeo, compreendendo a região extracelular inteira da AILIM ou uma porção da mesma, e a região constante inteira de cadeia pesada da imunoglobulina ou uma porção da mesma.
(106) O método de (103) ou (104), em que o dito polipeptídeo compreendendo a região extracelular inteira do ligando para AILIM ou uma porção da mesma é um polipeptídeo de fusão compreendendo um polipeptídeo, compreendendo a região extracelular inteira do liganPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 42/212
37/194 do para AILIM ou uma porção da mesma, e a região constante inteira de cadeia pesada da imunoglobulina ou uma porção da mesma.
(107) O método de qualquer um de (103) até (106), em que a dita AILIM é uma AILIM humana.
(108) O método de qualquer um de (103) até (107) em que o dito ligando para AILIM é um ligando para AILIM humana.
[0033] As presentes invenções são descritas em detalhe aqui abaixo por definição das terminologias da presente invenção.
[0034] Aqui, mamífero significa ser humano, bovino, cabra, coelho, camundongo, rato, hamster, e porquinho-da-índia; preferido é o ser humano, o coelho, o rato, o hamster, ou o camundongo, e particularmente preferido é o ser humano, o rato, o hamster, ou o camundongo.
[0035] Os termos mamíferos diferentes dos seres humanos e mamíferos não-humanos usados aqui, são sinônimos um ao outro, significando todos os mamíferos, diferentes dos seres humanos, definidos acima.
[0036] O termo aminoácidos usado aqui significa cada aminoácido existente na natureza, preferivelmente aqueles descritos de acordo com o sistema alfabético de três letras ou o sistema de uma única letra, como mostrado abaixo:
[0037] glicina (Gly/G), alanina (Ala/A), valina (Val/V), leucina (Leu/L), isoleucina (Ile/I), serina (Ser/S), treonina (Thr/T), ácido aspártico (Asp/D), ácido glutâmico (Glu/E), asparagina (Asn/N), glutamina (Gln/Q), lisina (Lys/K), arginina (Arg/R), cisteína (Cys/C), metionina (Met/M), fenilalanina (Phe/F), tirosina (Tyr/Y), triptofano (Trp/W), histidina (His/H), prolina (Pro/P).
[0038] O termo AILIM usado aqui é a abreviação para Molécula Imunomodulatória de Linfócito Capaz de Indução por Ativação, indicando uma molécula da superfície celular de mamífero tendo a estruPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 43/212
38/194 tura e a função como já descritas em uma descrição anterior, mais preferivelmente uma AILIM derivada de ser humano em particular (por exemplo, International Immunology, Vol. 12, No 1, p.p. 51-55; Número de Acesso do GenBank: BAA82129 (humana), BAA82128 (rato), BAA82127 (variante de rato), e BAA82126 (camundongo)).
[0039] Alternativamente, esta AILIM é também referida como ICOS (Pedido de Patente Japonês Publicado, Não-Examinado (JP-A) No Hei 11-29599, Pedido de Patente Internacional N2 WO98/38216), e estas abreviações indicam a mesma molécula.
[0040] O ligando para AILIM usado aqui significa uma molécula da superfície celular, a qual interage com a dita molécula coestimuladora AILIM (ICOS), e é referida como B7h, B7RP-1, GL50 ou LICOS (Nature, Vol. 402, No 6763, p.p. 827-832, 1999; Nature Medicine, Vol. 5, No 12, p.p. 1365-1369, 1999; J. Immunology, Vol. 164, p.p. 16531657, 2000; Curr. Biol. Vol. 10, No 6, p.p. 333-336, 2000).
[0041] Além disso, a AILIM usada aqui também inclui um polipeptídeo tendo substancialmente a mesma seqüência de aminoácidos que aquela da AILIM de cada mamífero descrito nas referências, e particular e preferivelmente, aquela da AILIM humana. Ademais, uma variante de AILIM humana, a qual é similar à variante de AILIM de rato já descrita (Número de Acesso do GenBank: BAA82127), é também incluída na AILIM desta invenção.
[0042] O ligando para AILIM usado aqui é também definido para ter um significante similar como acima mencionado.
[0043] Aqui, polipeptídeos tendo seqüência de aminoácidos essencialmente idêntica significa os polipeptídeos variantes como descritos abaixo.
[0044] Ou seja, desde que estes polipeptídeos variantes tenham propriedades biológicas essencialmente equivalentes a AILIM do tipo natural (particular e preferivelmente a AILIM derivada de ser humano),
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39/194 eles são os polipeptídeos desta invenção. Como aqueles tendo a seqüência de aminoácidos da AILIM do tipo natural, na qual uma pluralidade de resíduos de aminoácidos, preferivelmente 1 a 10 resíduos de aminoácidos, mais preferivelmente 1 a 5 resíduos de aminoácidos são removidos e/ou modificados, e à qual uma pluralidade de resíduos de aminoácidos, preferivelmente 1 a 10 resíduos de aminoácidos, mais preferivelmente 1 a 5 resíduos de aminoácidos são adicionados.
[0045] Além disso, eles podem ser polipeptídeos variantes tendo uma pluralidade destas substituições, remoções, modificações e adições de resíduos de aminoácidos na molécula.
[0046] O ligando para AILIM nesta invenção é também definido para ter um significado similar como acima mencionado.
[0047] A AILIM (particularmente a AILIM humana) e o ligando para AILIM (particularmente o ligando para AILIM humana) nesta invenção podem ser preparados por, além da técnica recombinante de gene, utilização apropriada de métodos bastante conhecidos nesta campo técnico, tais como o método de síntese química, o método de cultura de células, etc., ou estes métodos com modificações.
[0048] Tais substituições, remoções, ou inserções de aminoácidos podem ser obtidas de acordo com o método usual (Experimental Medicine: SUPPLEMENT, Handbook of Genetic Engineering (1992); e assim por diante).
[0049] Os exemplos de métodos para produzir polipeptídeos mutantes, como mencionados acima, são a mutagênese orientada para o sítio de oligonucleotídeo sintético (método do duplo descontinuado), mutagênese pontual, pela qual uma mutação pontual é introduzida ao acaso por tratamento com nitrito ou sulfito, o método pelo qual um mutante por deleção é preparado com a enzima Bal31 e similares, a mutagênese em cassete, o método de varredura de ligador, o método da incorporação por erro, o método de iniciador de união inadequada, o
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40/194 método de síntese de segmento de DNA, etc.
[0050] A mutagênese orientada para o sítio de oligonucleotídeo sintético (método do duplo descontinuado) pode ser, por exemplo, efetuada como se segue. A região desejada a ser mutagenizada é clonada no vetor de fago M13 tendo a mutação de âmbar para preparar o DNA de fago de fita simples. Após o DNA RF I do vetor M13 sem a mutação de âmbar ser linearizado por tratamento com enzima de restrição, o DNA é misturado com o DNA de fago de fita simples mencionado acima, desnaturado, e anelado, desse modo formando o DNA duplo descontinuado. Um oligonucleotídeo sintético, no qual as mutações são introduzidas, é hibridizado com o DNA duplo descontinuado e os DNAs de fitas duplas circulares fechados são preparados pelas reações com a DNA polimerase e a DNA ligase. As células mutS de E. coli, deficientes na atividade de reparação de união inadequada, são transfectadas com este DNA. As células de E. coli sem a atividade supressora são infectadas com os fagos desenvolvidos, e somente os fagos sem a mutação de âmbar são examinados.
[0051] O método pelo qual uma mutação pontual é introduzida com nitrito utiliza, por exemplo, o princípio como mencionado abaixo. Se o DNA for tratado com o nitrito, as bases são desaminadas para alterar a adenina para hipoxantina, a citosina para uracil, e a guanina para xantina. Se o DNA desaminado for introduzido nas células, A:T e G:C são substituídos por G:C e A:T, respectivamente, porque a hipoxantina, o uracil, e a xantina formam um par de bases com a citosina, a adenina, e a timina, respectivamente, na replicação de DNA. De fato, os fragmentos de DNA de fita dupla tratados com o nitrito são hibridizados com o DNA duplo descontinuado, e, após isso, as cepas mutantes são separadas por manipulação no mesmo modo que a mutagênese orientada para o sítio de oligonucleotídeo sintético (método do duplo descontinuado).
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41/194 [0052] Ademais, a AILIM aqui também inclui uma porção da dita AILIM. Aqui, uma porção significa um polipeptídeo compreendendo qualquer seqüência parcial da seqüência de aminoácidos da AILIM acima definida.
[0053] De preferência, a dita porção indica a região extracelular da AILIM acima definida (particular e preferivelmente uma AILIM humana) ou qualquer porção da mesma.
[0054] O ligando para AILIM nesta invenção é também definido para ter um significado similar como acima mencionado.
[0055] A porção da dita AILIM (preferivelmente a região extracelular da AILIM ou qualquer porção da mesma) pode ser preparada de acordo com métodos bastante conhecidos neste campo técnico, como descritos abaixo, ou de acordo com seus métodos modificados por técnica de recombinação genética ou método de síntese química, ou clivando-se adequadamente a AILIM (particular e preferivelmente uma AILIM humana) isolada por método de cultura de células, usando enzimas proteolíticas, etc.
[0056] A porção de ligando para AILIM pode ser também preparada por métodos similares, como descritos acima.
[0057] O anticorpo de ser humano desta invenção é um anticorpo de ser humano que se liga a AILIM acima definida ou uma porção da mesma (particular e preferivelmente uma AILIM derivada de ser humano ou uma porção da mesma). Especificamente, significa um anticorpo policlonal derivado de ser humano (anticorpo policlonal humano, anti-soro humano) ou anticorpo monoclonal derivado de ser humano (anticorpo monoclonal de ser humano).
[0058] O anticorpo monoclonal de ser humano desta invenção é um anticorpo monoclonal de ser humano que se liga a AILIM acima definida ou uma porção da mesma (particular e preferivelmente uma AILIM derivada de ser humano ou uma porção da mesma).
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42/194 [0059] Mais especificamente, todas as regiões compreendendo as regiões variáveis e constantes da cadeia pesada (cadeia H), e as regiões variáveis e constantes da cadeia leve (cadeia L) consistem em imunoglobulina humana derivada de gene codificando a dita imunoglobulina humana. A cadeia L é exemplificada pela cadeia κ humana ou a cadeia λ humana.
[0060] O anticorpo monoclonal de ser humano que se liga a AILIM (particular e preferivelmente uma AILIM derivada de ser humano) desta invenção ou uma porção da mesma é um anticorpo monoclonal de ser humano tendo as características definidas em quaisquer de (5) até (42) ou (84) antes mencionados.
[0061] Mais especificamente, ele inclui diversos anticorpos monoclonais de seres humanos tendo diversas características e aplicabilidade industrial como descritas nos exemplos e desenhos abaixo.
[0062] Uma modalidade preferida do anticorpo monoclonal de ser humano desta invenção é um anticorpo monoclonal de ser humano que se liga a AILIM ou uma porção da mesma definido em quaisquer de (5) até (42) ou (84) antes mencionados.
[0063] A modalidade mais preferível é um anticorpo monoclonal de ser humano que se liga a AILIM humana como descrito em (30) ou (39).
[0064] O anticorpo monoclonal de ser humano desta invenção pode ser preparado por imunização dos mamíferos não-humanos transgênicos que se seguem, produzindo o anticorpo de ser humano, com quaisquer dos imunógenos (antígenos) descritos abaixo.
(a) uma linha de célula natural ou de célula artificialmente estabelecida expressando a AILIM antes mencionada (particular e preferivelmente uma AILIM derivada de ser humano) sobre a superfície da célula;
(b) uma célula recombinante genética preparada usando as
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43/194 técnicas de recombinação genética, de modo a expressar a AILIM acima definida (particular e preferivelmente uma AILIM derivada de ser humano) sobre a superfície da célula;
(c) um lisado de células obtido por solubilização das células antes mencionadas em (a) ou (b), ou um fragmento de polipeptídeo da AILIM (particular e preferivelmente uma AILIM derivada de ser humano) purificado a partir do dito lisado de células;
(d) uma célula recombinante genética preparada usando as técnicas de recombinação genética, de modo a expressar uma porção (particular e preferivelmente a região extracelular ou qualquer peptídeo preferível da mesma) da AILIM acima definida (particular e preferivelmente uma AILIM derivada de ser humano) como um polipeptídeo solúvel;
(e) um sobrenadante de cultura obtido por cultivo da célula recombinante genética antes mencionada em (d) ou um polipeptídeo de região extracelular (AILIM solúvel) de AILIM (particular e preferivelmente uma AILIM derivada de ser humano) purificado do dito sobrenadante de cultura; ou (f) uma porção (particular e preferivelmente a região extracelular ou qualquer peptídeo preferível da mesma) de AILIM quimicamente sintetizada (particular e preferivelmente uma AILIM derivada de ser humano).
[0065] Além disso, o anticorpo monoclonal desta invenção pode ser também obtido de sobrenadante de cultura por cultivo de um hospedeiro recombinante genético [aqui, o dito hospedeiro é uma célula eucariótica diferente dos ovos fertilizados (preferivelmente as células de mamíferos, tais como CHO, linfócitos, e células de mieloma)], o qual pode ser preparado por transformação de um hospedeiro com cDNAs (preferivelmente um vetor contendo os ditos cDNAs) codificando cada uma das cadeias pesadas e leves de um tal anticorpo monoPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 49/212
44/194 clonal de ser humano desta invenção, usando técnicas de recombinação genética, e que produz o anticorpo monoclonal de ser humano recombinante, genético.
[0066] Especificamente, o anticorpo monoclonal desta invenção pode ser obtido por cultivo do hospedeiro recombinante genético descrito em quaisquer de (60) até (62) ou (64) até (80) antes mencionados desta invenção (aqui, o dito hospedeiro é uma célula eucariótica diferente de um ovo fertilizado (preferivelmente as células de mamíferos, tais como CHO, linfócitos, e células de mieloma)).
[0067] Além disso, o anticorpo monoclonal de ser humano desta invenção pode ser um anticorpo monoclonal de ser humano tendo qualquer isótipo pertencendo à IgG (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), IgH, IgA (IgA1 e IgA2), IgD ou IgE. De preferência, o dito anticorpo monoclonal pertence à IgG (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), mais preferivelmente IgG1, IgG2 ou IgG4.
[0068] O anticorpo monoclonal de ser humano desta invenção pode ser preparado por imunização de mamífero não-humano transgênico, produzindo anticorpo de ser humano, tal como o camundongo transgênico produtor de anticorpo de ser humano descrito abaixo, com quaisquer dos imunógenos (antígenos) antes mencionados em (a) até (f), de acordo com método de manufatura comumente usado, conhecido.
[0069] Ou seja, por exemplo, o dito mamífero não-humano transgênico, produzindo o anticorpo de ser humano, é imunizado com o dito antígeno em combinação com o adjuvante de Freund, conforme a ocasião demandar. O anticorpo policlonal pode ser obtido a partir de soros coletados do dito animal imunizado. O anticorpo monoclonal pode ser manufaturado por preparação de células de fusão (hibridomas) a partir das ditas células produtoras de anticorpos, isoladas do dito animal imunizado, e células de mieloma sem nenhuma capacidade
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45/194 produtora de anticorpos próprios, e clonagem dos ditos hibridomas para selecionar um clone produzindo o anticorpo monoclonal com uma afinidade específica para o antígeno usado para imunizar o mamífero. [0070] Mais especificamente, o anticorpo monoclonal pode ser preparado como descrito abaixo. Ou seja, o dito mamífero nãohumano transgênico, produtor de anticorpos de seres humanos (particular e preferivelmente o camundongo transgênico produtor de anticorpos de seres humanos), é imunizado por injeção de quaisquer dos imunógenos antes mencionados em (a) até (c), de forma intradérmica, intramuscular, intravenosa, na pata, ou de forma intraperitoneal, uma até diversas vezes, ou por transplante do dito imunógeno no dito mamífero. Usualmente, as imunizações são efetuadas uma a quatro vezes a cada um a quatorze dias após a primeira imunização. As células produtoras de anticorpos são obtidas a partir do mamífero assim imunizado em torno de um a cinco dias após a última imunização. A freqüência e o intervalo das imunizações podem ser apropriadamente arranjados, dependendo, por exemplo, da propriedade do imunógeno usado.
[0071] Os hibridomas que secretam um anticorpo monoclonal de ser humano podem ser preparados pelo método de Kohler e Milstein (Nature, Vol. 256, p.p. 495-497 (1975) e por seu método modificado. A saber, os hibridomas são preparados fundindo-se células produtoras de anticorpos contidas em um baço, linfonodo, medula óssea, ou tonsila, obtidas do mamífero não-humano transgênico produtor de anticorpos de seres humanos, imunizado como mencionado acima, preferivelmente um baço, com mielomas sem capacidade produtora de anticorpos próprios, que são derivados, preferivelmente, de um mamífero, tal como um camundongo, rato, porquinho-da-índia, hamster, coelho, ou ser humano, ou mais preferivelmente, um camundongo, rato, ou ser humano.
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46/194 [0072] Por exemplo, o mieloma derivado de camundongo P3/X63AG8.653 (ATCC No CRL-1580), P3/NSI/1-Ag4-1 (NS-1), P3/X63Ag8.U1 (P3U1), SP2/0-Ag14 (Sp2/0, Sp2), NSO, PAI, F0, ou BW5147, o mieloma derivado de rato 210RCY3-Ag.2.3., ou o mieloma derivado de ser humano U-266AR1, GM1500-6TG-A1-2, UC729-6, CEM-AGR, D1R11, ou CEM-T15 pode ser usado como um mieloma utilizado para a fusão da célula.
[0073] As células produtoras de anticorpos monoclonais (por exemplo, os hibridomas) podem ser examinadas por cultivo das células, por exemplo, em placas de microtítulo e por medição da reatividade do sobrenadante da cultura, na cavidade na qual o desenvolvimento do hibridoma é observado, ao imunógeno usado para a imunização mencionada acima, por exemplo, através de imunoensaio com enzima, tal como o radioimunoensaio (RIA) e o ensaio imunológico por ligação com enzima (ELISA).
[0074] Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos a partir de hibridomas, por cultivo dos hibridomas in vitro ou in vivo, tal como no fluido de ascite de um camundongo, rato, porquinho-da-índia, hamster, ou coelho, preferivelmente um camundongo ou rato, mais preferivelmente o camundongo, e isolamento dos anticorpos do sobrenadante da cultura resultante ou fluido de ascite de um mamífero. [0075] Os anticorpos monoclonais desta invenção podem ser manufaturados, em uma grande escala, pelo seguinte método:
(1) os genes (cDNAs, etc.) codificando cada uma das cadeias pesadas e leves do dito anticorpo monoclonal são clonados dos ditos hibridomas;
(2) os genes clonados codificando cada uma das cadeias pesadas e leves são inseridos em vetores separados ou em um vetor único, para preparar o vetor de expressão;
(3) o dito vetor de expressão é transferido para um ovo fertiPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 52/212
47/194 lizado de um mamífero não-humano desejado (tal como uma cabra);
(4) o dito ovo fertilizado transferido com o gene é transplantado no útero de uma mãe adotiva, para obter um animal não-humano quimérico;
(5) por cruzamento adicional da dita cabra quimérica com um outro mamífero não-humano, é produzido um mamífero nãohumano transgênico (gado, cabra, ovelha ou porco) com genes codificando cada uma das cadeias pesadas e leves incorporadas no gene endógeno; e (6) a partir do leite do dito mamífero não-humano transgênico, é obtido o anticorpo monoclonal derivado do dito gene de anticorpo monoclonal de ser humano em uma grande escala (Nikkei Science, abril de 1997, p.p. 78-84).
[0076] O cultivo in vitro das células que produzem os anticorpos monoclonais pode ser efetuado dependendo, por exemplo, da propriedade das células a serem cultivadas, do objeto de um estudo de teste, e das diversas condições de um método de cultivo, utilizando-se meios de nutrientes conhecidos ou quaisquer meios de nutrientes derivados de meios basais conhecidos para o desenvolvimento, a conservação, e a armazenagem dos hibridomas para produzir os anticorpos monoclonais no sobrenadante da cultura.
[0077] Os exemplos de meios basais são os meios de baixa concentração de cálcio, tais como o meio F12 de Ham, o meio MCDB153, ou o meio MEM de baixa concentração de cálcio, e os meios de alta concentração de cálcio, tais como o meio MCDB104, o meio MEM, o meio D-MEM, o meio RPMI1640, o meio ASF104, ou o meio RD. Os meios basais podem conter, por exemplo, soros, hormônios, citocinas, e/ou diversas substâncias inorgânicas ou orgânicas, dependendo do objetivo.
[0078] Os anticorpos monoclonais podem ser isolados e purificaPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 53/212
48/194 dos do sobrenadante da cultura ou do fluido de ascite mencionado acima por precipitação com sulfato de amônio saturado, pelo método da precipitação com euglobulina, pelo método do ácido capróico, pelo método do ácido caprílico, por cromatografia de troca iônica (DEAE ou DE52), por cromatografia de afinidade usando a coluna de antiimunoglobulina ou a coluna de proteína A.
[0079] O anticorpo monoclonal de ser humano desta invenção inclui os anticorpos monoclonais de seres humanos consistindo na cadeia pesada e/ou na cadeia leve, cuja seqüência de aminoácidos para cada cadeia tem um ou mais resíduos de aminoácidos removidos, substituídos ou adicionados.
[0080] Aqui, mais resíduos de aminoácidos significa uma pluralidade de aminoácidos, especificamente 1 a 10 resíduos de aminoácidos, preferivelmente 1 a 5 resíduos de aminoácidos.
[0081] Uma modificação parcial (remoção, substituição, inserção ou adição), como descrito acima, pode ser introduzida na seqüência de aminoácidos do anticorpo monoclonal de ser humano desta invenção por alteração parcial da seqüência de bases codificando a dita seqüência de aminoácidos. Esta alteração parcial da seqüência de bases pode ser introduzida por método padrão, usando a técnica conhecida de mutagênese específica para o sítio (Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, Vol. 81, p.p. 5662-5666, 1984).
[0082] O mamífero não-humano transgênico produtor de anticorpos de seres humanos, particularmente o camundongo transgênico produtor de anticorpos de seres humanos, o qual é uma modalidade preferida, pode ser preparado de acordo com a literatura publicada (Nature Genetics, Vol. 7, p.p. 13-21, 1994; Nature Genetics, Vol. 15, p.p. 146-156, 1997; Tradução Japonesa Publicada da Publicação Internacional No Hei 4-504365; Tradução Japonesa Publicada da Publicação No Hei 7-509137; Nikkei Science, junho, p.p. 40-50, 1995; PubliPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 54/212
49/194 cação de Patente Internacional No WO94/25585; Nature, Vol. 368, p.p. 856-859, 1994; e Tradução Japonesa Publicada da Publicação No Hei 6-500233, etc.).
[0083] Especificamente, os ditos camundongos transgênicos produtores de anticorpos de seres humanos podem ser preparados, por exemplo, usando técnicas consistindo nos seguintes processos:
(1) preparar um camundongo knockout, cujo gene da cadeia pesada da imunoglobulina endógena está funcionalmente desativado por substituição de pelo menos uma porção do local do gene da cadeia pesada da imunoglobulina endógena do camundongo por um gene marcador para tolerância à droga (tal como o gene para tolerância à neomicina) por recombinação homóloga;
(2) preparar um camundongo knockout, cujo gene da cadeia leve da imunoglobulina endógena (particularmente o gene da cadeia k) está funcionalmente desativado por substituição de pelo menos uma porção do local do gene da cadeia leve da imunoglobulina endógena do camundongo por um gene marcador para tolerância à droga (tal como o gene para tolerância à neomicina) por recombinação homóloga;
(3) preparar um camundongo transgênico, cuja região desejada do local do gene da cadeia pesada da imunoglobulina humana é incorporada no cromossomo do camundongo, usando um vetor representado pelo cromossomo artificial de levedura (YAC), capaz de carregar um gene gigante;
(4) preparar um camundongo transgênico, cuja região desejada do local do gene da cadeia leve da imunoglobulina humana (particularmente o gene da cadeia k) é incorporada no cromossomo do camundongo, usando um vetor representado pelo cromossomo artificial de levedura (YAC), capaz de carregar um gene gigante; e (5) preparar um camundongo transgênico, cujos locais dos
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50/194 genes das cadeias pesada e leve da imunoglobulina endógena são ambos funcionalmente desativados e cujo cromossomo é incorporado com as regiões de ambos os locais dos genes das cadeias pesada e leve da imunoglobulina humano por cruzamento dos camundongos knockout e transgênico antes mencionados em (1) até (4) em ordens arbitrárias.
[0084] O camundongo knockout acima descrito pode ser preparado por substituição da região adequada do local do gene da imunoglobulina endógena do camundongo por um gene marcador exógeno (tal como o gene para a tolerância à neomicina), com base na recombinação homóloga, para desativar o dito local do gene de modo a não ser rearranjado. Para a inativação usando a dita recombinação homóloga, por exemplo, pode ser usado um método referido como seleção positiva negativa (PNS) (Nikkei Science, maio, p.p. 52-62, 1994).
[0085] A inativação funcional do local do gene da cadeia pesada da imunoglobulina pode ser obtida, por exemplo, introduzindo-se uma lesão em uma parte da região J ou C (por exemplo, a região Cm). E a inativação funcional da cadeia leve da imunoglobulina (por exemplo, a cadeia k) pode ser obtida, por exemplo, introduzindo-se uma lesão em uma parte da região J ou C, ou uma região estendendo-se sobre as regiões J e C.
[0086] Um camundongo transgênico pode ser preparado de acordo com o método conforme normalmente usado para produzir um animal transgênico (por exemplo, ver Newest Manual of Animal Cell Experiment, LIC press, Capítulo 7, p.p. 361-408, (1990)). Especificamente, por exemplo, a célula ES (célula-tronco embriônica) negativa de HPRT (deficiente de gene para hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase), derivada de um blastocisto de camundongo normal, é fundida com a levedura contendo o vetor YAC inserido com o gene codificando o dito local do gene da cadeia pesada ou local do gene da cadeia leve
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51/194 da imunoglobulina humana ou uma porção do mesmo e o gene para HPRT, usando o método de fusão do esferoplasto. As células ES, cujo gene endógeno de camundongo é integrado com o dito gene exógeno, são selecionadas por método de seleção de HAT. Então, as células ES examinadas são microinjetadas em um ovo fertilizado, obtido de um outro camundongo normal (blastocisto) (Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, Vol. 77, No 12, p.p. 7380-7384 (1980); Pat. U.S. No 4.873.191). O blastocisto é transplantado no útero de um outro camundongo normal como a mãe adotiva. Então, os camundongos transgênicos quiméricos nascem do camundongo mãe adotiva. Por cruzamento dos camundongos transgênicos quiméricos com os camundongos normais, são obtidos camundongos transgênicos heterogênicos. Por cruzamento dos camundongos transgênicos heterogênicos um com o outro, são obtidos camundongos transgênicos homogênicos, de acordo com as leis de Mendel.
[0087] A porção de um anticorpo monoclonal usada na presente invenção significa uma região parcial do anticorpo monoclonal de ser humano acima mencionado da presente invenção, e especificamente, inclui o F(ab')2, o Fab', o Fab, o Fv (fragmento variável de anticorpo), o sFv, o dsFv (Fv estabilizado com dissulfeto), ou o dAb (anticorpo de domínio único) (Exp. Opin. Ther. Patents, Vol. 6, N2 5, p.p. 441-456 (1996)).
[0088] O F(ab')2 e o Fab' podem ser produzidos por tratamento da imunoglobulina (anticorpo monoclonal) com uma protease, tal como a pepsina ou a papaína, e significa um fragmento de anticorpo gerado por digestão da imunoglobulina próxima das ligações de dissulfeto nas regiões de articulação existentes entre cada uma das duas cadeias H. Por exemplo, a papaína cliva a IgG a montante das ligações de dissulfeto nas regiões de articulação existentes entre cada uma das duas cadeias H, para gerar dois fragmentos de anticorpos homólogos, nos
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52/194 quais uma cadeia L composta de VL (região variável de cadeia L) e CL (região constante de cadeia L), e um fragmento de cadeia H composto de VH (região variável de cadeia H) e CHg1 (região γ1 na região constante de cadeia H) são conectados nas suas regiões terminais C através de uma ligação de dissulfeto. Cada um de tais dois fragmentos de anticorpos homólogos é chamado Fab'. A pepsina também cliva a IgG a jusante das ligações de dissulfeto nas regiões de articulação existentes entre cada uma das duas cadeias H, para gerar um fragmento de anticorpo ligeiramente maior do que o fragmento no qual os dois Fab' acima mencionados são conectados na região de articulação. Este fragmento de anticorpo é chamado F(ab')2.
[0089] A constante de taxa de ligação (ka) aqui significa um valor indicando a força (grau) de ligação do dito anticorpo monoclonal ao antígeno-alvo, calculado com base na cinética de reação entre anticorpo antígeno. A constante de taxa de dissociação (kd) significa um valor indicando a força (grau) de dissociação do dito anticorpo monoclonal do antígeno-alvo. A constante de dissociação (Kd) é um valor obtido por divisão da dita constante de taxa de dissociação (kd) pelo dito valor da constante de taxa de ligação (ka). Estas constantes são usadas para representar a afinidade do dito anticorpo monoclonal pelo antígeno e a sua atividade de neutralizar o antígeno.
[0090] As ditas constantes podem ser analisadas de acordo com diversos métodos, e podem ser facilmente analisadas usando um kit de ensaio comercial BiacoreX (Amersham Pharmacia) ou um kit similar, de acordo com o manual e o método experimental anexados ao dito kit. Os valores de ka, kd e Kd obtidos usando o dito kit são expressos em unidades de 1/M.Seg, 1/Seg e M (mol), respectivamente. Os maiores valores de ka indicam uma atividade mais forte de ligação do anticorpo monoclonal testado ao antígeno, e os menores valores de Kd mostram uma atividade mais forte do anticorpo de neutralização do
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53/194 antígeno.
[0091] O anticorpo monoclonal de ser humano desta invenção inclui aqueles tendo o valor de ka, kd ou Kd como mostrado em (1) até (3) que se seguem:
(1) anticorpo monoclonal de ser humano, o qual se liga a AILIM humana ou uma porção da mesma, com a constante de taxa de ligação (ka) de 1,0 x 104 (1/M.Seg) ou mais, preferivelmente 1,0 x 105 (1/M.Seg) ou mais.
(2) anticorpo monoclonal de ser humano, o qual se liga a AILIM humana ou uma porção da mesma, com a constante de taxa de dissociação (kd) de 1,0 x 10-4 (1/Seg) ou menos, preferivelmente 1,0 x 10-5 (1/Seg) ou menos.
(3) anticorpo monoclonal de ser humano, o qual tem uma reatividade a AILIM humana ou uma porção da mesma, com a constante de dissociação (Kd) de 1,0 x 10-7 (M) ou menos, preferivelmente 1,0 x 10-8 (M) ou menos, e mais preferivelmente 1,0 x 10-9 (M) ou menos.
[0092] Neste caso, cada valor de ka, kd e Kd descrito acima é esperado flutuar ligeiramente, dependendo de diversas condições na hora da medição com uma margem de erro, porém sem praticamente nenhuma flutuação nos índices em geral.
[0093] A célula produtora de anticorpo monoclonal ou o hospedeiro recombinante genético produtor de anticorpo monoclonal de ser humano desta invenção (aqui, o dito hospedeiro é uma célula, excluindo o ovo fertilizado) significa qualquer célula produzindo o anticorpo monoclonal de ser humano antes mencionado desta invenção.
[0094] Especificamente, por exemplo, ela inclui as células descritas em quaisquer dos seguintes (1) até (3), porém não está limitada a elas:
(1) a célula B produtora de anticorpos monoclonais de sePetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 59/212
54/194 res humanos, obtida por imunização do mamífero não-humano transgênico produtor de anticorpos de seres humanos, antes mencionado, com o imunógeno (antígeno) acima definido e por coleta da célula do dito animal imunizado.
(2) a célula de fusão antes mencionada (hibridoma) resultante por fusão da célula B produtora de anticorpos monoclonais de seres humanos assim obtida com uma célula de mieloma derivada do mamífero.
(3) a célula recombinante genética produtora de anticorpos monoclonais de seres humanos recombinantes genéticos, obtida por transformação de uma célula, excluindo a dita célula B e o hibridoma (por exemplo, a célula CHO (do ovário de hamster chinês), a célula BHK (do rim de hamster bebê), o linfócito, tal como o mieloma), com o gene codificando o dito anticorpo monoclonal de ser humano (gene codificando a cadeia pesada ou aquele codificando a cadeia leve, ou ambos os genes) isolado da dita célula B produtora de anticorpos monoclonais de seres humanos ou da célula de fusão produtora de anticorpos monoclonais de seres humanos (hibridoma).
[0095] Aqui, a célula recombinante genética produtora de anticorpos monoclonais de seres humanos recombinantes genéticos, antes mencionada em (3), a saber significa uma célula recombinante genética produzindo o recombinante genético do anticorpo monoclonal de ser humano gerado pela célula B descrita acima em (1) ou pelo hibridoma antes mencionado em (2).
[0096] E, hospedeiro no hospedeiro recombinante genético desta invenção inclui, além das diversas células de mamíferos como descritas acima, os ovos fertilizados de quaisquer mamíferos nãohumanos (cabra, porca, ovelha, gado, etc.). Por transferência de um gene (gene codificando a cadeia pesada ou aquele codificando a cadeia leve, ou ambos os genes) codificando qualquer anticorpo monoPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 60/212
55/194 clonal (preferivelmente o anticorpo monoclonal de ser humano) para a AILIM humana desta invenção para este ovo fertilizado, pode ser obtido um ovo fertilizado recombinante genético desta invenção. Este ovo fertilizado recombinante genético é usado para preparar os animais transgênicos para a manufatura da proteína antes mencionada a partir do leite em uma grande escala (Nikkei Science, abril, 1997, p.p. 7884).
[0097] Uma substância compondo a presente invenção, especificamente uma substância tendo uma atividade na modulação da transdução de sinal mediada por AILIM, e mais especificamente uma substância tendo uma atividade na inibição da proliferação das células que expressam a AILIM, ou na inibição da produção de uma citocina por células que expressam a AILIM significa uma substância natural presente na natureza, ou uma substância arbitrária artificialmente preparada.
[0098] A substância relacionada à substância que se liga a AILIM e à substância que se liga ao ligando para AILIM aqui também significa qualquer substância natural na natureza ou qualquer substância artificialmente preparada.
[0099] Aqui, a transdução de sinal mediada por AILIM significa a transdução de sinal através da AILIM, resultando em uma alteração de um fenótipo arbitrário nas células que expressam a AILIM (proliferação das células, ativação das células, inativação das células, apoptose, e/ou uma alteração de uma capacidade para produzir uma citocina arbitrária a partir de células que expressam a AILIM).
[00100] A substância pode ser principalmente classificada em uma substância protéica e uma substância não-protéica.
[00101] Os exemplos das substâncias protéicas são os que seguem polipeptídeo, anticorpo (um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, ou uma porção de um anticorpo monoclonal, e particular e
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56/194 preferivelmente o anticorpo de ser humano mencionado acima).
[00102] Quando a substância for um anticorpo, a substância é preferivelmente um anticorpo monoclonal. Quando a substância for um anticorpo monoclonal, a substância inclui não somente um anticorpo monoclonal derivado de mamífero não-humano, como também um anticorpo monoclonal quimérico recombinante, um anticorpo monoclonal humanizado recombinante e anticorpo monoclonal de ser humano. [00103] Aqui, o anticorpo monoclonal quimérico recombinante é um anticorpo monoclonal preparado por engenharia genética, e especificamente significa um anticorpo quimérico, tal como o anticorpo monoclonal quimérico de camundongo/ser humano, cujas regiões variáveis são derivadas a partir da imunoglobulina de um mamífero nãohumano (camundongo, rato, hamster, etc.), e cujas regiões constantes são derivadas a partir da imunoglobulina humana.
[00104] O anticorpo monoclonal humanizado (anticorpo enxertado com CDR) da presente invenção é um anticorpo monoclonal preparado por engenharia genética e especificamente significa um anticorpo monoclonal humanizado, em que uma porção ou a totalidade das regiões determinantes de complementaridade da região hipervariável é derivada a partir das regiões determinantes de complementaridade da região hipervariável a partir de um anticorpo monoclonal de um mamífero não-humano (camundongo, rato, hamster, etc.), as regiões de estrutura da região variável são derivadas a partir das regiões de estrutura da região variável da imunoglobulina humana, e a região constante é derivada a partir da região constante da imunoglobulina humana. [00105] As regiões determinantes de complementaridade da região hipervariável existem na região hipervariável na região variável de um anticorpo e significam três regiões que diretamente e complementares se ligam a um antígeno (resíduos determinantes de complementaridade, CDR1, CDR2, e CDR3). As regiões de estrutura da região variável
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57/194 significam quatro regiões comparativamente conservadas situando-se a montante, a jusante ou entre as três regiões determinantes de complementaridade (região de estrutura, FR1, FR2, FR3, e FR4).
[00106] Em outras palavras, um anticorpo monoclonal humanizado significa que no qual todas as regiões, exceto uma porção ou a totalidade das regiões determinantes de complementaridade da região hipervariável de um anticorpo monoclonal derivado de mamífero nãohumano, foram substituídas por suas regiões correspondentes derivadas de uma imunoglobulina humana.
[00107] A região constante derivada de imunoglobulina humana tem a seqüência de aminoácidos inerente em cada isótipo, tal como IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD, e IgE. A região constante de um anticorpo monoclonal humanizado na presente invenção pode ser aquela a partir de imunoglobulina humana pertencendo a qualquer isótipo. De preferência, ela é a região constante da IgG humana. As regiões de estrutura da região variável derivadas da imunoglobulina humana não estão particularmente limitadas.
[00108] Quando a substância da presente invenção for um polipeptídeo, a substância inclui os que seguem polipeptídeo, um fragmento do polipeptídeo (um oligopeptídeo), um polipeptídeo de fusão, um quimicamente modificado do mesmo. Os exemplos de um oligopeptídeo são um peptídeo compreendendo 5 a 30 aminoácidos, preferivelmente 5 a 20 aminoácidos. A modificação química pode ser projetada dependendo de diversos propósitos, por exemplo, a meia-vida aumentada no sangue no caso de administrar in vivo, ou a tolerância aumentada contra a degradação ou a absorção aumentada no trato digestivo na administração oral.
[00109] Os exemplos do polipeptídeo são como se segue:
(1) Um polipeptídeo compreendendo a totalidade ou uma porção de uma região extracelular de AILIM;
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58/194 (2) Um polipeptídeo de fusão compreendendo a totalidade ou uma porção de uma região extracelular de AILIM e a totalidade ou uma porção de uma região constante de cadeia pesada da imunoglobulina; ou (3) Um polipeptídeo que se liga a AILIM.
[00110] Os exemplos da não-protéica são o DNA, o RNA, e um composto quimicamente sintetizado.
[00111] Aqui, DNA significa DNA compreendendo uma seqüência parcial de nucleotídeos do DNA ou seu DNA quimicamente modificado, útil como uma substância farmacêutica de DNA sem sentido, projetada com base em uma seqüência de nucleotídeos de DNA (incluindo o cDNA e o DNA genômico) codificando a AILIM acima mencionada (preferivelmente a AILIM humana). Especificamente, o DNA sem sentido pode inibir a transcrição de DNA codificando a AILIM em mRNA, ou a tradução do mRNA em uma proteína por hibridização do DNA ou RNA codificando a AILIM.
[00112] A seqüência parcial de nucleotídeos, como referida aqui, indica uma seqüência parcial de nucleotídeos compreendendo um número arbitrário de nucleotídeos em uma região arbitrária. A seqüência parcial de nucleotídeos consiste em 5 a 100 nucleotídeos consecutivos, preferivelmente 5 a 70 nucleotídeos consecutivos, mais preferivelmente 5 a 50 nucleotídeos consecutivos, e ainda mais preferivelmente 5 a 30 nucleotídeos consecutivos.
[00113] Quando o DNA for usado como uma substância farmacêutica de DNA sem sentido, a seqüência de DNA pode ser modificada quimicamente em parte para estender a meia-vida (estabilidade) da concentração sangüínea do DNA administrado aos pacientes, para aumentar a permeabilidade da membrana intracitoplásmica do DNA, ou para aumentar a resistência à degradação ou a absorção do DNA oralmente administrado nos órgãos digestivos. A modificação química
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59/194 inclui, por exemplo, a modificação das ligações de fosfato, das riboses, das bases de nucleotídeos, da porção de açúcar, da extremidade 3' e/ou da extremidade 5' na estrutura do DNA de oligonucleotídeo. [00114] A modificação da ligação de fosfato inclui, por exemplo, a conversão de uma ou mais das ligações em ligações de fosfodiéster (D-oligo), ligações de fosforotioato, ligações de fosforoditioato (Soligo), fosfonato de metila (MP-oligo), ligações de fosforoamidato, ligações que não sejam fosfato ou ligações de fosfonotioato de metila, ou suas combinações. A modificação da ribose inclui, por exemplo, a conversão em 2'-fluorribose ou 2'-O-metilribose. A modificação da base de nucleotídeo inclui, por exemplo, a conversão em 5-propiniluracil ou 2-aminoadenina.
[00115] Aqui, RNA significa RNA compreendendo uma seqüência parcial de nucleotídeos do RNA ou seu RNA quimicamente modificado, útil como uma substância farmacêutica de RNA sem sentido, projetada com base em uma seqüência de nucleotídeos do RNA codificando a AILIM acima mencionada (preferivelmente a AILIM humana). O RNA sem sentido pode inibir a transcrição de DNA codificando a AILIM em mRNA, ou a tradução do mRNA em uma proteína por hibridização do DNA ou RNA codificando a AILIM.
[00116] A seqüência parcial de nucleotídeos, como referida aqui, indica uma seqüência parcial de nucleotídeos compreendendo um número arbitrário de nucleotídeos em uma região arbitrária. A seqüência parcial de nucleotídeos consiste em 5 a 100 nucleotídeos consecutivos, preferivelmente 5 a 70 nucleotídeos consecutivos, mais preferivelmente 5 a 50 nucleotídeos consecutivos, e ainda mais preferivelmente 5 a 30 nucleotídeos consecutivos.
[00117] A seqüência de RNA sem sentido pode ser modificada quimicamente em parte para estender a meia-vida (estabilidade) da concentração sangüínea do RNA administrado aos pacientes, para auPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 65/212
60/194 mentar a permeabilidade da membrana intracitoplásmica do RNA, ou para aumentar a resistência à degradação ou a absorção do RNA oralmente administrado no órgão digestivo. Um exemplo de modificação química é a modificação química aplicada ao DNA sem sentido acima mencionado.
[00118] Os exemplos de um composto quimicamente sintetizado são um composto arbitrário, exceto pelo DNA, pelo RNA e pelas substâncias protéicas acima mencionados, tendo o peso molecular de cerca de 100 a cerca de 1000, preferivelmente um composto tendo o peso molecular de cerca de 100 a cerca de 800, e mais preferivelmente o peso molecular de cerca de 100 a cerca de 600.
[00119] Um polipeptídeo incluído na definição da substância acima mencionada significa uma porção (um fragmento) de uma cadeia de polipeptídeo constituindo a AILIM (preferivelmente a AILIM humana), de preferência a totalidade ou uma porção de uma região extracelular do polipeptídeo constituindo a AILIM (1 a 5 aminoácidos podem ser opcionalmente adicionados na extremidade de N e/ou na extremidade de C da região).
[00120] A AILIM envolvendo na presente invenção é uma molécula de transmembrana penetrando a membrana celular, compreendendo 1 ou 2 cadeias de polipeptídeos.
[00121] Aqui, uma proteína de transmembrana significa uma proteína que se une com a membrana através da região peptídica hidrofóbica, penetrando na bicamada de lipídio da membrana uma ou diversas vezes e cuja estrutura é, como um todo, composta de três regiões principais, ou seja, a região extracelular, a região de transmembrana, e a região citoplásmica, como visto em muitos receptores ou moléculas da superfície celular. Uma tal proteína de transmembrana constitui cada receptor ou molécula da superfície celular na forma de um monômero, homodímero, heterodímero ou oligômero com outra(s) cadeia(s)
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61/194 tendo uma seqüência de aminoácidos igual ou diferente.
[00122] Aqui, uma região extracelular significa a totalidade ou uma porção da estrutura parcial (região parcial) a partir da estrutura inteira da proteína de transmembrana acima mencionada, onde a estrutura parcial existe fora da membrana. Em outras palavras, significa a totalidade ou uma porção da região da proteína de transmembrana, exceto a região incorporada na membrana (região de transmembrana) e a região existente no citoplasma seguindo a região de transmembrana (região citoplásmica).
[00123] Um polipeptídeo de fusão incluído na substância protéica acima descrita significa um polipeptídeo de fusão compreendendo a totalidade ou uma porção de uma região extracelular de um polipeptídeo constituindo a AILIM (preferivelmente a AILIM humana), e a totalidade ou uma porção de uma região constante de cadeia pesada da imunoglobulina (Ig, preferivelmente a Ig humana). De preferência, o polipeptídeo de fusão é um polipeptídeo de fusão com uma região extracelular de AILIM e uma porção de uma região constante de cadeia pesada da IgG humana, e particular e preferivelmente, um polipeptídeo de fusão de uma região extracelular de AILIM e uma região (Fc) de cadeia pesada da IgG humana compreendendo uma região de articulação, o domínio CH2 e o domínio CH3. Como IgG, a IgG1 é preferível, e como AILIM, a AILIM humana, de camundongo, ou de rato é preferível (preferivelmente a humana).
[00124] A totalidade ou uma porção de uma região constante de cadeia pesada da imunoglobulina (Ig) humana usado aqui significa a região constante ou a região Fc de cadeia pesada (cadeia H) da imunoglobulina derivada de ser humano, como descrita, ou uma porção da mesma. A imunoglobulina pode ser qualquer imunoglobulina pertencendo a qualquer classe e qualquer subclasse. Especificamente, os exemplos da imunoglobulina são IgG (IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4), IgM,
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IgA (IgA1 e IgA2), IgD, e IgE. De preferência, a imunoglobulina é IgG (IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4), ou IgM. Os exemplos de imunoglobulina particularmente preferível da presente invenção são aquelas pertencendo à IgG derivada de ser humano (IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4). [00125] A imunoglobulina tem uma unidade estrutural no formato de Y, na qual quatro cadeias compostas de duas cadeias leves (cadeias L) homólogas e duas cadeias pesadas (cadeias H) homólogas são conectadas através de ligações de dissulfeto (ligações S-S). A cadeia leve é composta da região variável de cadeia leve (VL) e da região constante de cadeia leve (CL). A cadeia pesada é composta da região variável de cadeia pesada (VH) e da região constante de cadeia pesada (CH).
[00126] A região constante de cadeia pesada é composta de alguns domínios tendo as seqüências de aminoácidos inerentes em cada classe (IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE) e em cada subclasse (IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4, IgA1, e IgA2).
[00127] A cadeia pesada da IgG (IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4) é composta de VH, domínio CH1, região de articulação, domínio CH2, e domínio CH3 nesta ordem, a partir da extremidade de N.
[00128] Similarmente, a cadeia pesada da IgG1 é composta de VH, domínio Cg11, região de articulação, domínio Cg12, e domínio Cg13 nesta ordem, a partir da extremidade de N. A cadeia pesada da IgG2 é composta de VH, domínio Cg21, região de articulação, domínio Cg22, e domínio Cg23 nesta ordem, a partir da extremidade de N. A cadeia pesada da IgG3 é composta de VH, domínio Cg31, região de articulação, domínio Cg32, e domínio Cg33 nesta ordem, a partir da extremidade de N. A cadeia pesada da IgG4 é composta de VH, domínio Cg41, região de articulação, domínio Cg42, e domínio Cg43 nesta ordem, a partir da extremidade de N.
[00129] A cadeia pesada da IgA é composta de VH, domínio Ca1,
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63/194 região de articulação, domínio Ca2, e domínio Ca3 nesta ordem, a partir da extremidade de N.
[00130] Similarmente, a cadeia pesada da IgA1 é composta de VH, domínio de Ca11, região de articulação, domínio Ca12, e domínio Ca13 nesta ordem, a partir da extremidade de N. A cadeia pesada da IgA2 é composta de VH, domínio de Ca21, região de articulação, domínio Ca22, e domínio Ca23 nesta ordem, a partir da extremidade de N. [00131] A cadeia pesada da IgD é composta de VH, domínio C51, região de articulação, domínio C52, e domínio C53 nesta ordem, a partir da extremidade de N.
[00132] A cadeia pesada da IgM é composta de VH, domínio Cp1, domínio Cp2, domínio Cp3, e domínio Cu4 nesta ordem, a partir da extremidade de N, e não tem nenhuma região de articulação como vista em IgG, IgA, e IgD.
[00133] A cadeia pesada da IgE é composta de VH, domínio Ce1, domínio Ce2, domínio Ce3, e domínio Ce4 nesta ordem, a partir da extremidade de N, e não tem nenhuma região de articulação como vista em IgG, IgA, e IgD.
[00134] Se, por exemplo, a IgG for tratada com a papaína, ela é clivada no lado ligeiramente N terminal, além das ligações de dissulfeto existentes na região de articulação onde as ligações de dissulfeto conectam as duas cadeias pesadas para gerar dois Fab homólogos, em que um fragmento de cadeia pesada composto de VH e CH1 é conectado com uma cadeia leve através de uma ligação de dissulfeto, e uma Fc, em que dois fragmentos de cadeia pesada homólogos compostos da região de articulação, domínio CH2, e domínio CH3 são conectados através de ligações de dissulfeto (Ver Immunology Illustrated, 2a ed. original, Nankodo, p.p. 65-75 (1992); e Focus of Newest Medical Science 'Recognition Mechanism of Immune System', Nankodo, p.p. 4-7 (1991); e assim por diante).
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64/194 [00135] A saber, uma porção de uma região constante de cadeia pesada da imunoglobulina mencionada acima significa uma porção de uma região constante de uma cadeia pesada da imunoglobulina tendo as características estruturais conforme mencionadas acima, e preferivelmente, é a região constante sem o domínio C1, ou a região Fc. Especificamente, o seu exemplo é a região composta de região de articulação, domínio C2, e domínio C3 de cada uma de IgG, IgA, e IgD, e é a região composta de domínio C2, domínio C3, e domínio C4 a partir de cada uma de IgM e IgE. O seu exemplo particularmente preferível é a região Fc da IgG1 derivada de ser humano.
[00136] O polipeptídeo de fusão mencionado acima tem a vantagem de que o polipeptídeo de fusão pode ser purificado de forma extremamente fácil, por utilização de cromatografia de coluna por afinidade, usando a propriedade da proteína A, que se liga especificamente ao fragmento de imunoglobulina porque o polipeptídeo de fusão da presente invenção tem uma porção de uma região constante (por exemplo Fc) de uma imunoglobulina, tal como a IgG, conforme mencionado acima, como um par de fusão. Além disso, uma vez que os diversos anticorpos contra a Fc de diversas imunoglobulinas estão disponíveis, um imunoensaio para os polipeptídeos de fusão pode ser facilmente efetuado com os anticorpos contra a Fc.
[00137] Um polipeptídeo que se liga a AILIM é incluído em um polipeptídeo incluído na definição da substância acima mencionada. [00138] Os exemplos específicos de um polipeptídeo que se liga a AILIM são a totalidade ou uma porção de um polipeptídeo constituindo a B7h, a B7RP-1, e a GL50 conhecidas ou uma molécula chamada LICOS, as quais são ligandos interagindo com a AILIM (Nature, Vol. 402, No 6763, p.p. 827-832, 1999; Nature Medicine, Vol. 5, N2 12, p.p. 1365-1369, 1999; J. Immunology, Vol. 164, p.p. 1653-1657, 2000; Curr. Biol., Vol. 10, No 6, p.p. 333-336, 2000).
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65/194 [00139] De preferência, o polipeptídeo é um polipeptídeo compreendendo a totalidade ou uma porção de uma região extracelular dos ligandos acima mencionados (B7h, B7RP-1, GL50, LICOS), ou um polipeptídeo de fusão compreendendo o polipeptídeo, e a totalidade ou uma porção de uma região constante de cadeia pesada da imunoglobulina (preferivelmente a imunoglobulina humana). Aqui, os termos uma região extracelular e uma região constante de cadeia pesada da imunoglobulina têm o mesmo significado que o acima mencionado. [00140] O polipeptídeo, uma porção do polipeptídeo (fragmento), e o polipeptídeo de fusão mencionados acima podem ser produzidos não somente por tecnologia de DNA recombinante, conforme mencionada abaixo, como também por um método bastante conhecido na técnica, tal como um método sintético químico e um método de cultura de células, ou um método modificado dos mesmos.
[00141] O anticorpo da presente invenção pode ser um anticorpo policlonal (anti-soro) ou um anticorpo monoclonal contra a AILIM de mamífero (particular e preferivelmente a AILIM humana) definida acima, e preferivelmente um anticorpo monoclonal.
[00142] Especificamente, o anticorpo é um anticorpo tendo uma atividade na inibição da proliferação de células que expressam a AILIM, por ligação a AILIM, ou na inibição da produção de interferon g ou interleucina 4 por células que expressam a AILIM, através da ligação a AILIM.
[00143] A alergia do tipo tardia aqui contida é a alergia mediada por imunidade celular (particularmente mediada por célula T do tipo Th1), ou seja, a alergia é mediada por célula T sensibilizada com antígeno (célula T com memória, memorizando o antígeno) e é referida a qualquer alergia que leve aproximadamente 24 a 48 horas para exibir reação alérgica acompanhada com inflamação causada pela dita célula T com memória quando o organismo vivo, sensibilizado com um anPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 71/212
66/194 tígeno, for contatado novamente com o mesmo antígeno.
[00144] Esta alergia do tipo tardia inclui a alergia a um antígeno patogênico infeccioso, tal como a alergia à tuberculina derivada da Mycobacterium tuberculosis, uma alergia do tipo tardia de Jones-Mote transiente a uma quantidade diminuta de proteína, a alergia de contato a substâncias químicas, tais como o cloreto de picrila ou a toxina da planta, tal como a laca, ou a alergia relacionada à rejeição ao enxerto ao enxerto observado no aloenxerto.
[00145] A composição farmacêutica aqui contida significa uma composição útil como uma droga compreendendo, como os ingredientes eficazes, o anticorpo (preferivelmente o anticorpo de ser humano), o qual se liga a AILIM (preferivelmente a AILIM humana), ou uma porção do mesmo, ou o anticorpo monoclonal (preferivelmente o anticorpo monoclonal de ser humano) ou uma porção do mesmo e um veículo farmacologicamente aceitável.
[00146] O veículo farmaceuticamente aceitável inclui um excipiente, um diluente, um expansor, um agente de decomposição, um estabilizador, um conservante, um tampão, um emulsificante, um aromático, um colorante, um adoçante, um agente de aumento da viscosidade, uma essência, um agente de aumento da solubilidade, ou outros aditivos.
[00147] Usando um ou mais de tais veículos, uma composição farmacêutica pode ser formulada em comprimidos, pílulas, pós, grânulos, injeções, soluções, cápsulas, trociscos, elixires, suspensões, emulsões, ou xaropes.
[00148] A composição farmacêutica pode ser administrada de forma oral ou parenteral. As outras formas para a administração parenteral incluem uma solução para aplicação externa, supositório para administração retal, e pessário, prescritos pelo método usual, que compreende um ou mais ingredientes ativos.
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67/194 [00149] A dosagem pode variar dependendo da idade, sexo, peso, e sintoma de um paciente, efeito do tratamento, rota de administração, período de tratamento, ou do tipo de ingrediente ativo (polipeptídeo ou anticorpo mencionado acima) contido na composição farmacêutica. Normalmente, a composição farmacêutica pode ser administrada a um adulto em uma dose de 10 mg a 1000 mg (ou 10 mg a 500 mg) por uma administração. Dependendo de diversas condições, uma dosagem menor do que aquela acima mencionada pode ser suficiente em alguns casos, e a dosagem mais do que aquela mencionada acima pode ser necessária em outros casos.
[00150] Em particular, a injeção pode ser produzida por dissolução ou suspensão do anticorpo em um veículo farmaceuticamente aceitável, não-tóxico, tal como a salina fisiológica ou a água destilada comercialmente disponível, para a injeção com ajuste de uma concentração para 0,1 mg de anticorpo/ml de veículo até 10 mg de anticorpo/ml de veículo.
[00151] A injeção assim produzida pode ser administrada a um paciente humano, estando necessitado de tratamento, em uma dose de 1 mg a 100 mg/kg de peso do corpo, preferivelmente 50 mg a 50 mg/kg de peso do corpo, uma ou mais vezes ao dia. Os exemplos de rota de administração são as rotas de administração apropriadas de uma forma médica, tais como a injeção intravenosa, a injeção subcutânea, a injeção intradérmica, a injeção intramuscular, ou a injeção intraperitoneal, preferivelmente a injeção intravenosa.
[00152] A injeção pode também ser preparada em um diluente nãoaquoso (por exemplo, o propileno glicol, o polietileno glicol, o óleo vegetal, tal como o azeite de oliva, e o álcool, tal como o etanol), suspensão, ou emulsão.
[00153] A injeção pode ser esterilizada por filtração com um filtro não penetrado por bactérias, por mistura de bactericida, ou por irradiaPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 73/212
68/194 ção. A injeção pode ser produzida na forma que é preparada com o uso. A saber, ela é seca por congelamento para ser uma composição sólida estéril, e pode ser dissolvida em água destilada estéril para a injeção, ou um outro solvente, antes do uso.
[00154] As composições farmacêuticas compreendendo os anticorpos de seres humanos desta invenção são úteis como preparações farmacêuticas, sem induzir a imunorrejeição no hospedeiro devida à HAMA (anticorpo de ser humano anti-camundongo), para controlar uma variedade de reações biológicas (por exemplo, a proliferação de células que expressam a AILIM, a produção de citocinas por células que expressam a AILIM, a citólise imune ou a morte (apoptose) de células expressando a AILIM e outras) que estão associadas com a transdução de sinal coestimulador (sinal secundário) mediada por AILIM para as células que expressam a AILIM, e/ou como preparações farmacêuticas para tratar ou prevenir as diversas doenças por supressão e inibição do início e/ou do progresso das doenças associadas com a transdução de sinal mediada por AILIM.
[00155] O termo citólise imune aqui contido indica um fenômeno biológico como se segue.
[00156] A lise da célula (citólise) pode ser induzida por um anticorpo (particularmente o anticorpo de lise de célula), bem como por ligação com células exterminadoras. O anticorpo de lise de célula é um anticorpo citotóxico, o qual particularmente tem atividade de lise sobre as células, tais como as células imunes, a célula do tecido ou os espermas. Quando o anticorpo se liga ao antígeno da superfície da célula, ele causa um efeito citotóxico sobre a célula ou induz a citólise na presença do complemento.
[00157] Esta citólise imune é induzida pela ação do complemento em conjunção com a ligação específica do anticorpo ao antígeno da superfície da célula. O anticorpo ligado ao antígeno da superfície ativa
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69/194 o complemento C1 (C1). Subseqüentemente são formados sítios de dano às células através de uma série de reações de fixação de complemento com os complementos C2 a C9 (C2-C9), e então os conteúdos celulares são liberados das células, desse modo lisando as células.
[00158] O termo citotoxicidade celular dependente de anticorpo aqui contido indica um evento biológico que é também abreviado como ADCC e é uma ação citotóxica sobre as células-alvo por células efetoras, tais como os linfócitos, os macrófagos ou os leucócitos polimorfonucleares, que requer não somente as células efetoras e as célulasalvo, como também um anticorpo participando na indução do evento citotóxico.
[00159] O termo reação de linfócitos mistos aqui contido significa um fenômeno biológico abreviado como MLR. A reação é também referida como reação de leucócitos mistos.
[00160] Os leucócitos ou os linfócitos alogênicos, derivados de indivíduos distintos, são misturados um com o outro e cultivados por diversos dias, desse modo permitindo a formação de blastos das células e a síntese de DNA nas células (i.e., a proliferação das células). Esta reação é referida como MLR (MLR alogênicos).
[00161] A síntese de DNA (proliferação de células) pode ser analisada interrompendo a proliferação de cada um dos linfócitos. A interrupção pode ser efetuada por tratamento com irradiação ou mitomicina. A análise pode ser realizada por medição da quantidade de DNA sintetizado no outro linfócito.
[00162] A quantidade de DNA sintetizado pode ser analisada por medição da incorporação de timidina, marcada com radioisótopo, tal como o trítio, no núcleo da célula.
[00163] O DNA codificando a AILIM (particular e preferivelmente a AILIM humana) da presente invenção pode ser obtido de acordo com
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70/194 um método comumente usado, por utilização de procedimentos para a clonagem de cDNA a partir de mRNA codificando a AILIM; de procedimento para o isolamento de DNA genômico e remoção deles; de procedimento para a preparação do DNA por PCR usando uma seqüência de cDNA ou seqüência de mRNA como um molde; ou de procedimento para sintetizar quimicamente o DNA.
[00164] O DNA codificando o ligando para AILIM de acordo com a presente invenção pode também ser obtido no mesmo modo como descrito acima.
[00165] O DNA codificando a AILIM (particular e preferivelmente a AILIM humana) da presente invenção pode ser preparado por corte (digestão) do DNA compreendendo o DNA codificando a AILIM, preparado como tal, com enzimas de restrição apropriadas, e conforme requerido, ligação do fragmento de DNA resultante com um DNA ligador ou marca por utilização de um DNA polimerase apropriada ou similar. O DNA codificando o ligando para AILIM pode também ser preparado no mesmo modo.
[00166] Um método ilustrativo será mostrado abaixo para clonar o cDNA codificando a AILIM (particular e preferivelmente a AILIM humana; a proteína é daqui por diante referida como a proteína de interesse) do mRNA.
[00167] Um DNA codificando um ligando para AILIM pode também ser clonado no mesmo modo.
[00168] Primeiramente, o RNA mensageiro codificando a proteína de interesse é preparado a partir de tecidos ou células expressando e produzindo a proteína de interesse. O mRNA pode ser preparado isolando o RNA total por um método conhecido, tal como o método de tiocianato de guanidina (Chirgwin, J.M. et al, Biochemistry, Vol. 18, p. 5294, 1979), o método de fenol quente, ou o método de AGPC, e submetendo-o à cromatografia por afinidade usando a oligo-dT celuloPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 76/212
71/194 se ou a poli-U Sepharose.
[00169] Então, com o mRNA obtido como um molde, o cDNA é sintetizado, por exemplo, por um método bastante conhecido usando a transcritase reversa, tal como o método de Okayama et al (Mol. Cell. Biol. Vol. 2, p. 161 (1982); ibid. Vol. 3, p. 280 (1983)) ou o método de Hoffman et al (Gene Vol. 25, p. 263 (1983)), e convertido em cDNA de fita dupla. Uma biblioteca de cDNA é preparada por transformação de E. coli com os vetores de plasmídeos, os vetores de fagos, ou os vetores de cosmídeos tendo este cDNA, ou por transfecção da E. coli após o acondicionamento in vitro.
[00170] Os vetores de plasmídeos usados nesta invenção não estão limitados, desde que eles sejam replicados e mantidos nos hospedeiros. Quaisquer vetores de fagos que possam ser replicados nos hospedeiros podem também ser usados. Os exemplos de vetores de clonagem normalmente usados são pUC19, lgt10, lgt11, e assim por diante. Quando o vetor for aplicado ao exame imunológico conforme mencionado abaixo, é preferivelmente usado o vetor tendo um promotor que possa expressar um gene codificando o polipeptídeo da presente invenção em um hospedeiro.
[00171] O cDNA pode ser inserido em um plasmídeo, por exemplo, através do método de Maniatis et al (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 1.53, 1989). O cDNA pode ser inserido em um vetor de fago, por exemplo, através do método de Hyunh et al (DNA cloning, a practical approach, Vol. 1, p. 49 (1985)). Estes métodos podem ser simplesmente efetuados por utilização de um kit de clonagem comercialmente disponível (por exemplo, um produto da Takara Shuzo). O vetor de plasmídeo ou de fago recombinante assim obtido é introduzido nas células hospedeiras apropriadas, tais como um procarioto (por exemplo, E. coli: XL1Blue MRF', DH5a, HB101, MC1061/P3, etc.).
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72/194 [00172] Os exemplos de um método para a introdução de um plasmídeo em um hospedeiro são o método de cloreto de cálcio, o método de cloreto de cálcio/cloreto de rubídio descrito em Molecular Cloning, A Laboratory Manual (segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 1.74 (1989)), e o método de eletroporação. Os vetores de fagos podem ser introduzidos em células hospedeiras, por exemplo, através de um método no qual os DNAs de fagos são introduzidos em hospedeiros desenvolvidos após o acondicionamento in vitro. O acondicionamento in vitro pode ser facilmente efetuado com um kit de acondicionamento in vitro comercialmente disponível (por exemplo, um produto da Stratagene ou da Amersham).
[00173] O cDNA codificando o polipeptídeo da presente invenção pode ser isolado da biblioteca de cDNA assim preparada de acordo com o método mencionado acima, por combinação de métodos gerais de exame de cDNA.
[00174] Por exemplo, um clone compreendendo o cDNA desejado pode ser examinado por um método conhecido de hibridização de colônias (Crunstein et al Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, Vol. 72, p. 3961 (1975)) ou método de hibridização em placas (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 2.108 (1989)) usando os oligonucleotídeos sintetizados quimicamente, marcados com 32P, como sondas, que estão correspondendo à seqüência de aminoácidos do polipeptídeo da presente invenção. Alternativamente, um clone tendo um fragmento de DNA codificando uma região específica dentro do polipeptídeo da presente invenção pode ser examinado por amplificação da região por PCR com iniciadores sintéticos de PCR.
[00175] Quando uma biblioteca de cDNA preparada usando um vetor de expressão de cDNA (por exemplo, o vetor de fago IZAPII) for usada, o clone desejado pode ser examinado pela reação entre antíPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 78/212
73/194 geno-anticorpo usando um anticorpo contra o polipeptídeo da presente invenção. Um método de exame usando o método de PCR é preferivelmente usado quando muitos clones forem submetidos ao exame. [00176] A seqüência de nucleotídeos do DNA assim obtido pode ser determinada pelo método de Maxam-Gilbert (Maxam et al Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, Vol. 74, p. 560 (1977)) ou pelo método da terminação da cadeia sintética de didesoxinucleotídeo usando o fago M13 (Sanger et al Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, Vol. 74, p.p. 5463-5467 (1977)). A totalidade ou uma porção do gene codificando o polipeptídeo da presente invenção pode ser obtida por excisão do clone obtido, como mencionado acima, com enzimas de restrição e assim por diante.
[00177] O DNA codificando o polipeptídeo da presente invenção pode ser isolado do DNA genômico derivado das células expressando o polipeptídeo da presente invenção, conforme mencionado acima, pelos métodos que se seguem.
[00178] Tais células são solubilizadas preferivelmente por SDS ou proteinase K, e os DNAs são desproteinizados por extração repetida com fenol. Os RNAs são digeridos preferivelmente com a ribonuclease. Os DNAs obtidos são parcialmente digeridos com enzimas de restrição apropriadas, e os fragmentos de DNA obtidos são amplificados com fago ou cosmídeo apropriado para gerar uma biblioteca. Então, os clones tendo a seqüência desejada são detectados, por exemplo, através de utilização de sondas de DNA marcadas de forma radioativa, e a totalidade ou uma porção do gene codificando o polipeptídeo da presente invenção é obtida a partir dos clones, por excisão com enzima de restrição e assim por diante.
[00179] A preparação de DNA codificando a proteína de interesse por PCR pode ser realizada por utilização de mRNA ou cDNA conhecido, codificando a proteína de interesse, como o molde de acordo com um método usual (PCR techniques for gene amplification - funPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 79/212
74/194 damental and new technologies KYORITSU SHUPPAN, 1992, etc.). [00180] O DNA codificando a proteína de interesse pode também ser quimicamente sintetizado pelo método usual, com base na seqüência de nucleotídeos codificando a proteína de interesse.
[00181] A AILIM da invenção (particular e preferivelmente a AILIM humana) ou uma porção da mesma (de preferência, a região extracelular) pode ser preparada como uma proteína recombinante, de acordo com um método usual, com técnicas de recombinação genética comumente usadas, utilizando o DNA obtido, cortando-se o DNA codificando a AILIM (cDNA ou DNA genômico contendo intron), com base no método ilustrado acima, com enzimas de restrição apropriadas, para dar um fragmento de DNA codificando a AILIM, e então, conforme requerido, ligando-se o fragmento de DNA resultante com um DNA ligador ou marca, por utilização de uma DNA polimerase apropriada ou similar.
[00182] O ligando para AILIM (particular e preferivelmente o ligando para AILIM humana), ou uma porção do mesmo (de preferência, a região extracelular), pode ser preparado no mesmo modo.
[00183] Um exemplo específico é ilustrado abaixo. A saber, o DNA preparado conforme descrito acima é inserido em um vetor, o qual será descrito posteriormente em detalhe, para produzir um vetor de expressão. Então, o vetor de expressão é usado para transformar uma célula hospedeira, conforme descrito abaixo, para obter um transformante. O transformante é cultivado e deixado produzir a proteína de interesse no sobrenadante da cultura. A proteína de interesse no sobrenadante da cultura pode facilmente ser purificada por utilização de cromatografia de coluna e tal.
[00184] Não há nenhuma limitação particular sobre o tipo de vetor de expressão para a produção da AILIM recombinante (ou sua região extracelular), na medida que o vetor seja replicado e mantido ou proPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 80/212
75/194 duzido de forma autônoma em quaisquer dos diversos hospedeiros, tais como as células procarióticas e/ou as células eucarióticas. Tais vetores de expressão incluem os vetores de plasmídeos e os vetores de fagos (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nova York, 1985).
[00185] O vetor de expressão pode facilmente ser preparado por ligação do DNA codificando a AILIM (ou sua região extracelular) com um vetor para a recombinação disponível na técnica (DNA de plasmídeo e DNA de bacteriófago) pelo método usual. Os exemplos específicos dos vetores para a recombinação usada são os plasmídeos derivados de E. coli, tais como pBR322, pBR325, pUC12, pUC13, e pUC19, os plasmídeos derivados de leveduras, tais como pSH19 e pSH15, e os plasmídeos derivados de Bacillus subtilis, tais como pUB110, pTP5, e pC194. Os exemplos de fagos são um bacteriófago tal como o fago l, e um vírus de animal ou de inseto (pVL1393, Invitrogen), tal como um retrovírus, o vírus da vacínia, e o vírus da poliedrose nuclear.
[00186] Os vetores de plasmídeos são úteis, quando um DNA codificando a AILIM da invenção (particular e preferivelmente a AILIM humana) ou a sua região extracelular solúvel for pretendido ser expresso em uma célula hospedeira e, desse modo, expressando a AILIM sobre a superfície da célula hospedeira, ou alternativamente a região extracelular solúvel da AILIM (particularmente preferível a AILIM humana) for pretendida ser produzida. Não há nenhuma limitação particular sobre tais vetores de plasmídeos, na medida que os vetores possam expressar o gene codificando a AILIM (particular e preferivelmente a AILIM humana) ou a sua região extracelular solúvel e produzam a proteína codificada em diversas células hospedeiras, tais como as células procarióticas e/ou as células eucarióticas. Por exemplo, tais plasmídeos incluem o pMAL C2, o pcDNA3.1 (-), o pEF-BOS (Nucleic Acid
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Research, Vol. 18, p. 5322, 1990, etc.), o pME18S (Handbook for genetic engineering, Experimental Medicine, suplemento, 1992; etc.), etc.
[00187] Quando as bactérias, particularmente a E. coli, forem usadas como células hospedeiras, um vetor de expressão é geralmente compreendido de, pelo menos, uma região de promotor-operador, um códon de iniciação, DNA codificando a proteína da presente invenção, códon de terminação, região de terminador, e replicon.
[00188] Quando a levedura, as células de animais, ou as células de insetos forem usadas como hospedeiros, um vetor de expressão é preferivelmente compreendido de, pelo menos, um promotor, um códon de iniciação, do DNA codificando a AILIM (particular e preferivelmente a AILIM humana) da presente invenção ou sua região extracelular, e um códon de terminação. Ele pode também compreender o DNA codificando um peptídeo de sinal, seqüência de intensificador, região não traduzida em 5' e 3' do gene codificando a AILIM da presente invenção, junções de emenda, sítio de poliadenilação, região de marcador selecionável, e replicon. O vetor de expressão pode também conter, se requerido, um gene para a amplificação do gene (marcador) que é normalmente usada.
[00189] Uma região de promotor-operador para expressar a AILIM (particular e preferivelmente a AILIM humana) da presente invenção, ou sua região extracelular, em bactérias compreende um promotor, um operador, e uma seqüência de Shine-Dagarno (SD) (por exemplo, AAGG). Por exemplo, quando o hospedeiro for a Escherichia, ele preferivelmente compreende o promotor Trp, o promotor lac, o promotor recA, o promotor lPL, o promotor lpp, o promotor tac, ou similares. [00190] Os exemplos de um promotor para expressar a AILIM (particular e preferivelmente a AILIM humana) da presente invenção, ou sua região extracelular, em levedura são o promotor PH05, o promotor
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PGK, o promotor GAP, o promotor ADH, e assim por diante. Quando o hospedeiro for o Bacillus, os seus exemplos são o promotor SL01, o promotor SP02, o promotor penP e assim por diante.
[00191] Quando o hospedeiro for uma célula eucariótica, tal como uma célula de mamífero, os seus exemplos são o promotor derivado de SV40, o promotor de retrovírus, o promotor de choque térmico, e assim por diante. Normalmente, o promotor não está limitado aos exemplos acima mencionados. Ademais, usar um intensificador é eficaz para a expressão.
[00192] Um códon de iniciação preferível é, por exemplo, um códon de metionina (ATG).
[00193] O códon de terminação comumente usado (por exemplo, TAG, TGA, TAA, e assim por diante) é ilustrado como um códon de terminação.
[00194] Os terminadores naturais ou sintéticos normalmente usados são utilizados como uma região de terminador.
[00195] Um replicon significa um DNA capaz de replicar a seqüência inteira de DNA em células hospedeiras, e inclui um plasmídeo natural, um plasmídeo artificialmente modificado (fragmento de DNA preparado a partir de um plasmídeo natural), um plasmídeo sintético, e assim por diante. Os exemplos de plasmídeos preferíveis são o pBR322 ou os seus derivados artificiais (fragmento de DNA obtido por tratamento do pBR322 com enzimas de restrição apropriadas) para a E. coli, o plasmídeo 2μ de levedura ou o DNA cromossômico de levedura para levedura, e o pRSVneo ATCC 37198, o pSV2dhfr ATCC 37145, o pdBPV-MMTneo ATCC 37224, o pSV2neo ATCC 37149, o pSV2bsr, etc. para células de mamíferos.
[00196] Uma seqüência de intensificador, sítio de poliadenilação, e junção de emenda, que são normalmente usados na técnica, tais como aqueles derivados de SV40, podem ser também usados.
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78/194 [00197] Um marcador selecionável normalmente usado pode ser utilizado de acordo com o método usual. Os seus exemplos são os genes de resistência para antibióticos, tais como a tetraciclina, a ampicilina, ou a canamicina, e o gene para timidina cinase.
[00198] Os exemplos de um gene para a amplificação de gene são o gene para a diidrofolato redutase (DHFR), o gene para timidina cinase, o gene para a resistência à neomicina, o gene para glutamato de sintase, o gene para adenosina desaminase, o gene para ornitina descarboxilase, o gene para higromicina-B-fosfotransferase, o gene para aspartato transcarbamilase, etc.
[00199] O vetor de expressão da presente invenção pode ser preparado ligando-se contínua e circularmente pelo menos o promotor, o códon de iniciação, o DNA codificando a proteína da presente invenção, o códon de terminação, e a região de terminador, acima mencionados, a um replicon apropriado. Se desejado, os fragmentos de DNA apropriados (por exemplo, os ligantes, os sítios de restrição gerados com outra enzima de restrição) podem ser usados pelos métodos usuais, tais como a digestão com uma enzima de restrição ou a ligação usando a T4 DNA ligase.
[00200] Os transformantes da presente invenção podem ser preparados por introdução do vetor de expressão mencionado acima em células hospedeiras.
[00201] As células hospedeiras usadas na presente invenção não estão limitadas, desde que elas sejam compatíveis com um vetor de expressão mencionado acima e possam ser transformadas. Os seus exemplos são as diversas células, tais como as células naturais ou as células recombinantes artificialmente estabelecidas, normalmente usadas no campo técnico da presente invenção (por exemplo, as bactérias (Escherichia e Bacillus), a levedura (Saccharomyces, Pichia, etc.), as células de animais, ou as células de insetos).
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79/194 [00202] A E. coli ou as células de animais são preferivelmente usadas. Os exemplos específicos são a E. coli (DH5a, DH10B, TB1, HB101, XL-2Blue, etc.), as células derivadas de camundongos (COP, L, C127, Sp2/0, NS-1, NIH 3T3, etc.), as células derivadas de ratos, as células derivadas de hamster (BHK, CHO, etc.), as células derivadas de macacos (COS1, COS3, COS7, CV1, Velo, etc.), e as células derivadas de seres humanos (Hela, células derivadas de fibroblastos diplóides, mieloma, Namalwa, etc.).
[00203] Um vetor de expressão pode ser introduzido (transformado (transduzido)) em células hospedeiras por método conhecido.
[00204] A transformação pode ser efetuada, por exemplo, de acordo com o método de Cohen et al (Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, Vol. 69, p. 2110 (1972)), o método do protoplasto (Mol. Gen. Genet., Vol. 168, p.p. 111 (1979)), ou método adequado (J. Mol. Biol., Vol. 56, p. 209 (1971)) quando os hospedeiros forem as bactérias (E. coli, Bacillus subtilis, etc.), o método de Hinnen et al (Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, Vol. 75, p. 1927 (1978)), ou o método de lítio (J. Bacteriol., Vol. 153, p. 163 (1983)) quando o hospedeiro for a Saccharomyces cerevisiae, o método de Graham (Virology, Vol. 52, p. 456 (1973)) quando os hospedeiros forem as células de animais, e o método de Summers et al (Mol. Cell. Biol., Vol. 3, p.p. 2156-2165 (1983)) quando os hospedeiros forem as células de insetos.
[00205] A região extracelular da AILIM (particular e preferivelmente a AILIM humana) da presente invenção (AILIM solúvel) pode ser produzida por cultivo de transformantes (no que se segue este termo inclui os transducentes) compreendendo um vetor de expressão preparado conforme mencionado acima em meios de nutrientes. O ligando para AILIM pode ser produzido no mesmo modo.
[00206] Os meios de nutrientes preferivelmente compreendem uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio inorgânico, ou uma fonte de
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80/194 nitrogênio orgânico, necessários para o desenvolvimento das células hospedeiras (transformantes). Os exemplos da fonte de carbono são a glicose, a dextrana, o amido solúvel, e a sacarose, e os exemplos da fonte de nitrogênio inorgânico ou orgânico são os sais de amônio, os nitratos, os aminoácidos, o líquido de infusão de milho, a peptona, a caseína, o extrato de carne, a torta de soja, e o extrato de batatas. Se desejado, eles podem compreender outros nutrientes (por exemplo, um sal inorgânico (por exemplo, o cloreto de cálcio, o diidrogenofosfato de sódio, e o cloreto de magnésio), as vitaminas, os antibióticos (por exemplo, a tetraciclina, a neomicina, a ampicilina, a canamicina, etc.). [00207] O cultivo é efetuado por um método conhecido na técnica. As condições de cultivo, tais como a temperatura, o pH do meio, e o tempo de cultivo, são selecionados apropriadamente de modo que a proteína da presente invenção seja superproduzida.
[00208] Os meios específicos e as condições de cultivo usados dependendo das células hospedeiras são ilustrados abaixo, porém não estão limitados aos mesmos.
[00209] Quando os hospedeiros forem as bactérias, os actinomicetos, as leveduras, os fungos filamentosos, são apropriados os meios líquidos compreendendo a fonte de nutrientes mencionada acima. Os meios com pH 5 a 8 são preferivelmente usados.
[00210] Quando o hospedeiro for a E. coli, os exemplos de meios preferíveis são os meios LB, os meios M9 (Miller et al Exp. Mol. Genet., Cold Spring Harbor Laboratory, p. 431 (1972)), os meios YT, etc. Usando estes meios, o cultivo pode ser efetuado normalmente de 14 a 43 °C, por cerca de 3 a 24 horas, com aeração e agitação, se necessário.
[00211] Quando o hospedeiro for o Bacillus, o cultivo pode ser efetuado normalmente de 30 a 40 °C, por cerca de 16 a 96 horas, com aeração e agitação, se necessário.
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81/194 [00212] Quando o hospedeiro for a levedura, os exemplos de meios são os meios mínimos de Burkholder (Bostian, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, Vol. 77, p. 4505 (1980)). O pH dos meios é preferivelmente 5 a
8. O cultivo pode ser efetuado normalmente de 20 a 35°C, por cerca de 14 a 144 horas, com aeração e agitação, se necessário.
[00213] Quando o hospedeiro for uma célula de animal, os exemplos de meios são os meios MEM contendo cerca de 5 a 20% de soro bovino fetal (Science, Vol. 122, p. 501 (1952)), os meios DMEM (Virology, Vol. 8, p. 396 (1959)), os meios RPMI1640 (J. Am. Med. Assoc., Vol. 199, p. 519 (1967)), os meios 199 (Proc. Soc. Exp. Biol. Med., Vol. 73, p. 1 (1950)), os meios HamF12, etc. O pH dos meios é preferivelmente cerca de 6 a 8. O cultivo pode ser efetuado normalmente em torno de 30 a 40°C, por cerca de 15 a 72 horas, com aeração e agitação, se necessário.
[00214] Quando o hospedeiro for uma célula de inseto, um exemplo de meio é o meio de Grace contendo soro bovino fetal (Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, Vol. 82, p. 8404 (1985)). O seu pH é preferivelmente cerca de 5 a 8. O cultivo pode ser efetuado normalmente em torno de 20 a 40°C, por 15 a 100 horas, com aeração e agitação, se necessário.
[00215] A região extracelular (AILIM solúvel) da AILIM da invenção (particular e preferivelmente a AILIM humana) pode ser produzida cultivando-se as células transformadas acima mencionadas (particularmente, a célula de animal ou a E. coli) e permitindo-se a secreção da proteína no sobrenadante da cultura. A saber, um filtrado da cultura (sobrenadante) é obtido pelo método tal como a filtração ou a centrifugação da cultura obtida, e o polipeptídeo ou o fragmento de polipeptídeo da presente invenção é purificado e isolado do filtrado da cultura pelo método usual, comumente usado a fim de purificar e isolar uma proteína natural ou sintética.
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82/194 [00216] Os exemplos do método de isolamento e de purificação são um método utilizando a afinidade específica, tal como a cromatografia por afinidade, um método utilizando a solubilidade, tal como o método de precipitação salina e de precipitação com solvente, um método utilizando a diferença no peso molecular, tal como a diálise, a ultrafiltração, a filtração em gel, e a eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida, um método utilizando cargas, tal como a cromatografia de troca iônica e a cromatografia de hidroxilapatita, um método utilizando a diferença na hidrofobicidade, tal como a cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa, e um método utilizando a diferença no ponto isoelétrico, tal como a focalização isoelétrica. [00217] Quando a proteína de interesse existir no periplasma ou citoplasma de transformantes cultivados, primeiramente, os corpos de fungos ou as células são coletadas pelo método usual, tal como a filtração ou a centrifugação, e suspensas em tampão apropriado. Após a parede celular e/ou a membrana celular das células e assim por diante serem rompidas pelo método, tal como a lise com sonicação, a lisozima, e congelamento-descongelamento, a fração de membrana compreendendo o polipeptídeo da presente invenção é obtida pelo método, tal como a centrifugação ou a filtração. A fração de membrana é solubilizada com um detergente, tal como o Triton-X100, para obter o extrato bruto. Finalmente, o polipeptídeo ou o fragmento de polipeptídeo é isolado e purificado do extrato bruto pelo método usual, conforme ilustrado acima.
[00218] Na presente invenção, o termo veículo insolúvel significa um veículo que é usado para imobilizar os polipeptídeos sobre ele por adsorção física ou ligação química. Por exemplo, o veículo pode ser (1) placa, tubo de teste, tubo, ou similar, tendo espaço interno, conta, bola, filtro, membrana, ou similar, feitos de materiais insolúveis em água, incluindo os plásticos, tais como a resina de poliestireno, a resiPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 88/212
83/194 na de policarbonato, a resina de silicone ou a resina de náilon, ou o vidro, e (2) veículo insolúvel usado em cromatografia por afinidade, tal como o veículo de celulose, o veículo de agarose, o veículo de poliacrilamida, o veículo de dextrana, o veículo de poliestireno, o veículo de álcool polivinílico, o veículo de poliaminoácido, o veículo de sílica porosa, etc.
[00219] A substância de marcação capaz de dar sinal detectável de acordo com a presente invenção inclui, por exemplo, a enzima, o material fluorescente, o material luminescente, a biotina, a avidina ou o radioisótopo, mais especificamente, as enzimas, tais como a peroxidase (por exemplo, a peroxidase da raiz forte), a fosfatase alcalina, a βD-galactosidase, a glicoseoxidase, a glicose-6-fosfato desidrogenase, a álcool desidrogenase, a malato desidrogenase, a penicilinase, a catalase, a apo-glicose oxidase, a urease, a luciferase, a acetilcolina esterase, etc.; os materiais fluorescentes, tais como o isotiocianato de fluoresceína, a proteína ficobilina, os agentes quelantes de metais de terras-raras, o cloreto de dansila, o rodamina isotiocianato de tetrametila, etc.; os radioisótopos, tais como 3H, 14C, 125I, 131I, etc.; a biotina, a avidina, e o material luminescente.
[00220] Entre eles, o radioisótopo ou o material fluorescente pode dar sinal detectável, mesmo quando usado sozinho. Por outro lado, quando usados sozinhos, a enzima, o material luminescente, a biotina ou a avidina não proporcionam nenhum sinal detectável, porém, quando deixados reagir com uma ou mais substâncias, podem proporcionar sinal detectável. Por exemplo, quando a marca for uma enzima, pelo menos um substrato é necessário para a detecção. Diversos tipos de substratos podem ser usados, dependendo do tipo de método para medir a atividade da enzima (colorimetria, fluoroscopia, método usando bioluminescência ou luminescência química, etc.). Por exemplo, quando a marca for a peroxidase, o peróxido de hidrogênio pode ser
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84/194 usado como um substrato. Alternativamente, quando a marca for a biotina, a avidina ou a avidina modificada com enzima é comumente usada, porém não está limitada às mesmas. Conforme requerido, uma variedade de substâncias luminescentes pode ser utilizada, dependendo do tipo de substrato a ser usado.
[00221] Quaisquer das marcas acima mencionadas podem ser utilizadas na presente invenção. Entretanto, a marca preferida é uma enzima, tal como a peroxidase, ou a biotina, com consideração dada à sensibilidade de detecção ou ensaio, bem como à conveniência da manipulação.
[00222] Um método para identificar uma substância capaz de ligarse a AILIM ou ao ligando para AILIM, de acordo com a invenção, é interpretado com base no princípio de imunoensaio.
[00223] Especificamente, os princípios de diversos métodos, como descritos em Immunoassay (3a Edição, eds., Eiji Ishikawa et al, Igakushoin, 1987), podem ser aplicados.
[00224] Os exemplos de princípios preferivelmente usados incluem o método de um anticorpo em fase sólida, o método de dois anticorpos em fase líquida, o método de dois anticorpos em fase sólida, o método do sanduíche, e o método de um recipiente, conforme descrito no Pedido de Patente Japonêsa Publicada Não-Examinada (JP-B) No Hei 239747. Ademais, o método de ensaio empregando a reação entre antígeno-anticorpo é exemplificado pelo método de EMIT (técnica de imunoensaio multiplicado por enzima), imunoensaio de canalização por enzima, imunoensaio com enzima mediado por modulador de enzima (EMMIA), imunoensaio de inibidor de enzima, ensaio imunoenzimométrico, imunoensaio intensificado por enzima e imunoensaio de ligação proximal.
[00225] Na presente invenção, quaisquer de tais princípios de imunoensaio podem ser selecionados adequadamente de acordo com o
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85/194 propósito. Entretanto, com consideração dada à conveniência do procedimento e/ou à vantagem econômica, e particularmente à versatilidade clínica, é preferivelmente utilizado o princípio do método do sanduíche, do método de um recipiente, ou do método de um anticorpo em fase sólida, mais preferivelmente do método do sanduíche ou do método de um recipiente. Particularmente preferido é o método do sanduíche usando placa de microtítulo de múltiplas cavidades, tendo muitas cavidades, tal como a placa com 96 cavidades, ou o método de um recipiente usando contas sobre as quais o polipeptídeo é imobilizado e também usando um complemento marcado com enzima, tal como a peroxidase, ou com biotina.
Breve Descrição dos Desenhos [00226] A Figura 1 mostra as reatividades respectivas do anticorpo anti-IgG humana, do anticorpo anti-Igk humana e do anticorpo antiIgFc humana ao anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana, analisadas por ELISA das células usando um citômetro de fluxo.
[00227] Os painéis (a) até (l) mostram os resultados respectivos dos ensaios indicados abaixo.
[00228] Painel (a): resultado do ensaio no qual o anticorpo anti-IgG humana marcado com biotina, como um anticorpo secundário, foi adicionado, na ausência de anticorpo primário, à microplaca onde as células HPB-ALL do tipo selvagem tinham sido preparadas.
[00229] Painel (b): resultado do ensaio no qual o anticorpo anti-Igk humana marcado com biotina, como um anticorpo secundário, foi adicionado, na ausência de anticorpo primário, à microplaca onde as células HPB-ALL do tipo selvagem tinham sido preparadas.
[00230] Painel (c): resultado do ensaio no qual o anticorpo anti-IgFc humana marcado com biotina, como um anticorpo secundário, foi adicionado, na ausência de anticorpo primário, à microplaca onde as céPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 91/212
86/194 lulas HPB-ALL do tipo selvagem tinham sido preparadas.
[00231] Painel (d): resultado do ensaio no qual o anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab-136 foi usado como um anticorpo primário e o anticorpo anti-IgG humana marcado com biotina foi usado como um anticorpo secundário.
[00232] Painel (e): resultado do ensaio no qual o anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab-136 foi usado como um anticorpo primário e o anticorpo anti-Igk humana marcado com biotina foi usado como um anticorpo secundário.
[00233] Painel (f): resultado do ensaio no qual o anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab-136 foi usado como um anticorpo primário e o anticorpo anti-IgFc humana marcado com biotina foi usado como um anticorpo secundário.
[00234] Painel (g): resultado do ensaio no qual o anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab-138 foi usado como um anticorpo primário e o anticorpo anti-IgG humana marcado com biotina foi usado como um anticorpo secundário.
[00235] Painel (h): resultado do ensaio no qual o anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab-138 foi usado como um anticorpo primário e o anticorpo anti-Igk humana marcado com biotina foi usado como um anticorpo secundário.
[00236] Painel (i): resultado do ensaio no qual o anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab-138 foi usado como um anticorpo primário e o anticorpo anti-IgFc humana marcado com biotina foi usado como um anticorpo secundário.
[00237] Painel (j): resultado do ensaio no qual o anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab-139 foi usado como um anticorpo primário e o anticorpo anti-IgG humana marcado com biotina foi usado como um anticorpo secundário.
[00238] Painel (k): resultado do ensaio no qual o anticorpo monoPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 92/212
87/194 clonal de ser humano anti-AILIM humana JMab-139 foi usado como um anticorpo primário e o anticorpo anti-Igk humana marcado com biotina foi usado como um anticorpo secundário.
[00239] Painel (l): resultado do ensaio no qual o anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab-139 foi usado como um anticorpo primário e o anticorpo anti-IgFc humana marcado com biotina foi usado como um anticorpo secundário.
[00240] A curva com símbolos abertos em cada painel corresponde ao resultado do ensaio no qual o anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH foi usado como o anticorpo de controle.
[00241] A Figura 2 mostra uma curva de calibragem com relação ao anticorpo monoclonal de IgG humana (material padrão), testado por ELISA em sanduíche usando o anticorpo anti-IgG humana.
[00242] O eixo vertical indica a intensidade da fluorescência, e o eixo horizontal indica a concentração do material padrão.
[00243] A Figura 3 mostra as atividades de ligação dos diversos anticorpos monoclonais de camundongos anti-AILIM humana às células CHO recombinantes superexpressando a AILIM humana ou às células CHO do tipo selvagem.
[00244] O eixo vertical indica a intensidade da fluorescência como um índice da atividade de ligação às células recombinantes, e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo adicionado.
[00245] O termo CHO na figura indica o resultado de um ensaio de ligação à célula CHO do tipo selvagem, e humano indica o resultado de um ensaio de ligação à célula CHO recombinante superexpressando a AILIM humana.
[00246] A Figura 4 mostra as atividades de ligação dos diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana ou anticorpos monoclonais de seres humanos anti-KLH como um controle negativo às células CHO recombinantes superexpressando a AILIM
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88/194 humana ou às células CHO do tipo selvagem.
[00247] O eixo vertical indica a intensidade da fluorescência como um índice da atividade de ligação às células recombinantes, e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo adicionado.
[00248] O termo CHO na figura indica o resultado de um ensaio de ligação à célula CHO do tipo selvagem, e humano indica o resultado de um ensaio de ligação à célula CHO recombinante superexpressando a AILIM humana.
[00249] A Figura 5 mostra as atividades de ligação dos diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana às células CHO recombinantes superexpressando a AILIM humana ou às células CHO do tipo selvagem.
[00250] O eixo vertical indica a intensidade da fluorescência como um índice da atividade de ligação às células recombinantes, e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo adicionado.
[00251] O termo CHO na figura indica o resultado de um ensaio de ligação à célula CHO do tipo selvagem, e humano indica o resultado de um ensaio de ligação à célula CHO recombinante superexpressando a AILIM humana.
[00252] A Figura 6 mostra as atividades de ligação dos diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana às células CHO recombinantes superexpressando a AILIM humana ou às células CHO do tipo selvagem.
[00253] O eixo vertical indica a intensidade da fluorescência como um índice da atividade de ligação às células recombinantes, e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo adicionado.
[00254] O termo CHO na figura indica o resultado de um ensaio de ligação à célula CHO do tipo selvagem, e humano indica o resultado de um ensaio de ligação à célula CHO recombinante superexpressando a AILIM humana.
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89/194 [00255] A Figura 7 mostra as atividades de ligação dos anticorpos monoclonais de ratos anti-AILIM humana às células CHO recombinantes superexpressando a AILIM de camundongo ou às células CHO do tipo selvagem.
[00256] O eixo vertical indica a intensidade da fluorescência como um índice da atividade de ligação às células recombinantes, e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo adicionado.
[00257] O termo CHO na figura indica o resultado de um ensaio de ligação à célula CHO do tipo selvagem, e camundongo indica o resultado de um ensaio de ligação à célula CHO recombinante superexpressando a AILIM de camundongo.
[00258] A Figura 8 mostra as atividades de ligação dos diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana ou anticorpos monoclonais de seres humanos anti-KLH como um controle negativo às células CHO recombinantes superexpressando a AILIM de camundongo ou às células CHO do tipo selvagem.
[00259] O eixo vertical indica a intensidade da fluorescência como um índice da atividade de ligação às células recombinantes, e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo adicionado.
[00260] O termo CHO na figura indica o resultado de um ensaio de ligação à célula CHO do tipo selvagem, e camundongo indica o resultado de um ensaio de ligação à célula CHO recombinante superexpressando a AILIM de camundongo.
[00261] A Figura 9 mostra as atividades de ligação dos diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana às células CHO recombinantes superexpressando a AILIM de camundongo ou às células CHO do tipo selvagem.
[00262] O eixo vertical indica a intensidade da fluorescência como um índice da atividade de ligação às células recombinantes, e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo adicionado.
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90/194 [00263] O termo CHO na figura indica o resultado de um ensaio de ligação à célula CHO do tipo selvagem, e camundongo indica o resultado de um ensaio de ligação à célula CHO recombinante superexpressando a AILIM de camundongo.
[00264] A Figura 10 mostra as atividades de ligação dos diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana às células CHO recombinantes superexpressando a AILIM de camundongo ou às células CHO do tipo selvagem.
[00265] O eixo vertical indica a intensidade da fluorescência como um índice da atividade de ligação às células recombinantes, e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo adicionado.
[00266] O termo CHO na figura indica o resultado de um ensaio de ligação à célula CHO do tipo selvagem, e camundongo indica o resultado de um ensaio de ligação à célula CHO recombinante superexpressando a AILIM de camundongo.
[00267] A Figura 11 mostra as atividades de ligação dos diversos anticorpos monoclonais de camundongos anti-AILIM de rato às células CHO recombinantes superexpressando a AILIM de rato ou às células CHO do tipo selvagem.
[00268] O eixo vertical indica a intensidade da fluorescência como um índice da atividade de ligação às células recombinantes, e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo adicionado.
[00269] O termo CHO na figura indica o resultado de um ensaio de ligação à célula CHO do tipo selvagem, e rato indica o resultado de um ensaio de ligação à célula CHO recombinante superexpressando a AILIM de rato.
[00270] A Figura 12 mostra as atividades de ligação dos diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana ou anticorpos monoclonais de seres humanos anti-KLH como um controle negativo às células CHO recombinantes superexpressando a AILIM de
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91/194 rato ou às células CHO do tipo selvagem.
[00271] O eixo vertical indica a intensidade da fluorescência como um índice da atividade de ligação às células recombinantes, e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo adicionado.
[00272] O termo CHO na figura indica o resultado de um ensaio de ligação à célula CHO do tipo selvagem, e rato indica o resultado de um ensaio de ligação à célula CHO recombinante superexpressando a AILIM de rato.
[00273] A Figura 13 mostra as atividades de ligação dos diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana às células CHO recombinantes superexpressando a AILIM de rato ou às células CHO do tipo selvagem.
[00274] O eixo vertical indica a intensidade da fluorescência como um índice da atividade de ligação às células recombinantes, e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo adicionado.
[00275] O termo CHO na figura indica o resultado de um ensaio de ligação à célula CHO do tipo selvagem, e rato indica o resultado de um ensaio de ligação à célula CHO recombinante superexpressando a AILIM de rato.
[00276] A Figura 14 mostra as atividades de ligação dos diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana às células CHO recombinantes superexpressando a AILIM de rato ou às células CHO do tipo selvagem.
[00277] O eixo vertical indica a intensidade da fluorescência como um índice da atividade de ligação às células recombinantes, e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo adicionado.
[00278] O termo CHO na figura indica o resultado de um ensaio de ligação à célula CHO do tipo selvagem, e rato indica o resultado de um ensaio de ligação à célula CHO recombinante superexpressando a AILIM de rato.
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92/194 [00279] A Figura 15 mostra a atividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa saudável normal, doador A, no ensaio quanto à atividade de transdução de sinal coestimulador por diversos anticorpos monoclonais de camundongos anti-AILIM humana, usando uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano, juntamente com anticorpo monoclonal de camundongo antiAILIM humana.
[00280] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H] timidina como um índice do grau de proliferação das células, e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana.
[00281] A Figura 16 mostra a atividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa saudável normal, doador A, no ensaio quanto à atividade de transdução de sinal coestimulador por diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana, usando uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano, juntamente com anticorpo monoclonal de ser humano antiAILIM humana.
[00282] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H] timidina como um índice do grau de proliferação das células, e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00283] A Figura 17 mostra a atividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa saudável normal, doador B, no ensaio quanto à atividade de transdução de sinal coestimulador por diversos anticorpos monoclonais de camundongos anti-AILIM humana, usando uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano, juntamente com anticorpo monoclonal de camundongo antiAILIM humana.
[00284] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular
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93/194 de [3H] timidina como um índice do grau de proliferação das células, e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana.
[00285] Nesta figura, JHC1 indicou o resultado do ensaio no qual o anticorpo monoclonal anti-CETP humana foi usado como o controle negativo, em vez do anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana.
[00286] A Figura 18 mostra a atividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa saudável normal, doador B, no ensaio quanto à atividade de transdução de sinal coestimulador por diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana, usando uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano, juntamente com anticorpo monoclonal de ser humano antiAILIM humana.
[00287] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H] timidina como um índice do grau de proliferação das células, e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00288] Nesta figura, anti-KLH indica o resultado do ensaio no qual o anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH foi usado como o controle negativo, em vez do anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00289] A Figura 19 mostra a atividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa saudável normal, doador B, no ensaio quanto à atividade de transdução de sinal coestimulador por diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana, usando uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano, juntamente com anticorpo monoclonal de ser humano antiAILIM humana.
[00290] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular
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94/194 de [3H] timidina como um índice do grau de proliferação das células, e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00291] Nesta figura, anti-KLH indica o resultado do ensaio no qual o anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH foi usado como o controle negativo, em vez do anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00292] A Figura 20 mostra a atividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa saudável normal, doador C, no ensaio quanto à atividade de transdução de sinal coestimulador por diversos anticorpos monoclonais de camundongos anti-AILIM humana, usando uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano, juntamente com anticorpo monoclonal de camundongo antiAILIM humana.
[00293] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H] timidina como um índice do grau de proliferação das células, e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana.
[00294] Nesta figura, JHC1 indica o resultado do ensaio no qual o anticorpo monoclonal anti-CETP humana foi usado como o controle negativo, em vez do anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana.
[00295] A Figura 21 mostra a atividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa saudável normal, doador C, no ensaio quanto à atividade de transdução de sinal coestimulador por diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana, usando uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano, juntamente com anticorpo monoclonal de ser humano antiAILIM humana.
[00296] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular
Petição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 100/212
95/194 de [3H] timidina como um índice do grau de proliferação das células, e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00297] Nesta figura, anti-KLH indica o resultado do ensaio no qual o anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH foi usado como o controle negativo, em vez do anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00298] As outras notações são como se segue:
124: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab124.
126: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab126.
127: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab127.
[00299] A Figura 22 mostra a atividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa saudável normal, doador C, no ensaio quanto à atividade de transdução de sinal coestimulador por diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana, usando uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano, juntamente com anticorpo monoclonal de ser humano antiAILIM humana.
[00300] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H] timidina como um índice do grau de proliferação das células, e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00301] Nesta figura, anti-KLH indica o resultado do ensaio no qual o anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH foi usado como o controle negativo, em vez do anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00302] As outras notações são como se segue:
Petição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 101/212
96/194
128: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab128.
135: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab135.
136: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab136.
[00303] A Figura 23 mostra a atividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa saudável normal, doador C, no ensaio quanto à atividade de transdução de sinal coestimulador por diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana, usando uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano, juntamente com anticorpo monoclonal de ser humano antiAILIM humana.
[00304] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H] timidina como um índice do grau de proliferação das células, e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00305] Nesta figura, anti-KLH indica o resultado do ensaio no qual o anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH foi usado como o controle negativo, em vez do anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00306] As outras notações são como se segue:
137: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab137.
138: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab138.
139: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab139.
[00307] A Figura 24 mostra a atividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa saudável normal, doador C, no ensaio
Petição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 102/212
97/194 quanto à atividade de transdução de sinal coestimulador por diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana, usando uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano, juntamente com anticorpo monoclonal de ser humano antiAILIM humana.
[00308] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H] timidina como um índice do grau de proliferação das células, e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00309] Nesta figura, anti-KLH indica o resultado do ensaio no qual o anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH foi usado como o controle negativo, em vez do anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00310] As outras notações são como se segue:
140: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab140.
141: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab141.
[00311] A Figura 25 mostra a atividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa saudável normal, doador D, no ensaio quanto à atividade de transdução de sinal coestimulador por diversos anticorpos monoclonais de camundongos anti-AILIM humana, usando uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano, juntamente com anticorpo monoclonal de camundongo antiAILIM humana.
[00312] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H] timidina como um índice do grau de proliferação das células, e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana.
[00313] Nesta figura, JHC1 indica o resultado do ensaio no qual o
Petição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 103/212
98/194 anticorpo monoclonal anti-CETP humana foi usado como o controle negativo, em vez do anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana.
[00314] A Figura 26 mostra a atividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa saudável normal, doador D, no ensaio quanto à atividade de transdução de sinal coestimulador por diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana, usando uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano, juntamente com anticorpo monoclonal de ser humano antiAILIM humana.
[00315] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H] timidina como um índice do grau de proliferação das células, e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00316] Nesta figura, anti-KLH indica o resultado do ensaio no qual o anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH foi usado como o controle negativo, em vez do anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00317] As outras notações são como se segue:
124: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab124.
126: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab126.
127: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab127.
[00318] A Figura 27 mostra a atividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa saudável normal, doador D, no ensaio quanto à atividade de transdução de sinal coestimulador por diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana, usando uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser
Petição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 104/212
99/194 humano, juntamente com anticorpo monoclonal de ser humano antiAILIM humana.
[00319] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H] timidina como um índice do grau de proliferação das células, e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana.
[00320] Nesta figura, anti-KLH indica o resultado do ensaio no qual o anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH foi usado como o controle negativo, em vez do anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00321] As outras notações são como se segue:
128: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab128.
135: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab135.
136: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab136.
[00322] A Figura 28 mostra a atividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa saudável normal, doador D, no ensaio quanto à atividade de transdução de sinal coestimulador por diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana, usando uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano, juntamente com anticorpo monoclonal de ser humano antiAILIM humana.
[00323] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H] timidina como um índice do grau de proliferação das células, e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00324] Nesta figura, anti-KLH indica o resultado do ensaio no qual o anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH foi usado como o
Petição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 105/212
100/194 controle negativo, em vez do anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00325] As outras notações são como se segue:
137: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab137.
138: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab138.
139: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab139.
[00326] A Figura 29 mostra a atividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa saudável normal, doador D, no ensaio quanto à atividade de transdução de sinal coestimulador por diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana, usando uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano, juntamente com anticorpo monoclonal de ser humano antiAILIM humana.
[00327] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H] timidina como um índice do grau de proliferação das células, e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00328] Nesta figura, anti-KLH indica o resultado do ensaio no qual o anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH foi usado como o controle negativo, em vez do anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00329] As outras notações são como se segue:
140: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab140.
141: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab141.
[00330] A Figura 30 mostra a atividade de proliferação de células T
Petição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 106/212
101/194 derivadas de uma pessoa saudável normal, doador E, no ensaio quanto à atividade de transdução de sinal coestimulador por diversos anticorpos monoclonais de camundongos anti-AILIM humana, usando uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano, juntamente com anticorpo monoclonal de camundongo antiAILIM humana.
[00331] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H] timidina como um índice do grau de proliferação das células, e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana.
[00332] Nesta figura, JHC1 indica o resultado do ensaio no qual o anticorpo monoclonal anti-CETP humana foi usado como o controle negativo, em vez do anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana.
[00333] A Figura 31 mostra a atividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa saudável normal, doador E, no ensaio quanto à atividade de transdução de sinal coestimulador por diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana, usando uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano, juntamente com anticorpo monoclonal de ser humano antiAILIM humana.
[00334] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H] timidina como um índice do grau de proliferação das células, e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00335] Nesta figura, anti-KLH indica o resultado do ensaio no qual o anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH foi usado como o controle negativo, em vez do anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00336] As outras notações são como se segue:
Petição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 107/212
102/194
124: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab124.
126: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab126.
127: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab127.
[00337] A Figura 32 mostra a atividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa saudável normal, doador E, no ensaio quanto à atividade de transdução de sinal coestimulador por diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana, usando uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano, juntamente com anticorpo monoclonal de ser humano antiAILIM humana.
[00338] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H] timidina como um índice do grau de proliferação das células, e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00339] Nesta figura, anti-KLH indica o resultado do ensaio no qual o anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH foi usado como o controle negativo, em vez do anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00340] As outras notações são como se segue:
128: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab128.
135: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab135.
136: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab136.
[00341] A Figura 33 mostra a atividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa saudável normal, doador E, no ensaio
Petição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 108/212
103/194 quanto à atividade de transdução de sinal coestimulador por diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana, usando uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano, juntamente com anticorpo monoclonal de ser humano antiAILIM humana.
[00342] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H] timidina como um índice do grau de proliferação das células, e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00343] Nesta figura, anti-KLH indica o resultado do ensaio no qual o anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH foi usado como o controle negativo, em vez do anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00344] As outras notações são como se segue:
137: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab137.
138: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab138.
139: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab139.
[00345] A Figura 34 mostra a atividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa saudável normal, doador E, no ensaio quanto à atividade de transdução de sinal coestimulador por diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana, usando uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano, juntamente com anticorpo monoclonal de ser humano antiAILIM humana.
[00346] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H] timidina como um índice do grau de proliferação das células, e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal de ser
Petição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 109/212
104/194 humano anti-AILIM humana.
[00347] Nesta figura, anti-KLH indica o resultado do ensaio no qual o anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH foi usado como o controle negativo, em vez do anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00348] As outras notações são como se segue:
140: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab140.
141: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab141.
[00349] A Figura 35 mostra a atividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa saudável normal, doador D, no ensaio quanto à atividade de diversos anticorpos monoclonais de camundongos anti-AILIM humana de transdução do sinal coestimulador, quando uma solução de anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana (em fase líquida) foi adicionada sozinha a uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano.
[00350] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H] timidina como um índice do grau de proliferação das células, e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana.
[00351] Nesta figura, JHC1 indica o resultado do ensaio no qual o anticorpo monoclonal anti-CETP humana foi usado como o controle negativo, em vez do anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana.
[00352] A Figura 36 mostra a atividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa saudável normal, doador D, no ensaio quanto à atividade de diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana de transdução do sinal coestimulador, quando uma solução de anticorpo monoclonal de ser humano antiPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 110/212
105/194
AILIM humana (em fase líquida) foi adicionada sozinha a uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano. [00353] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H] timidina como um índice do grau de proliferação das células, e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00354] Nesta figura, anti-KLH indica o resultado do ensaio no qual o anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH foi usado como o controle negativo, em vez do anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00355] As outras notações são como se segue:
124: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab124.
125: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab125.
126: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab126.
[00356] A Figura 37 mostra a atividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa saudável normal, doador D, no ensaio quanto à atividade de diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana de transdução do sinal coestimulador, quando uma solução de anticorpo monoclonal de ser humano antiAILIM humana (em fase líquida) foi adicionada sozinha a uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano. [00357] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H] timidina como um índice do grau de proliferação das células, e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00358] Nesta figura, anti-KLH indica o resultado do ensaio no qual o anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH foi usado como o
Petição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 111/212
106/194 controle negativo, em vez do anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00359] As outras notações são como se segue:
128: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab128.
135: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab135.
136: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab136.
[00360] A Figura 38 mostra a atividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa saudável normal, doador D, no ensaio quanto à atividade de diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana de transdução do sinal coestimulador, quando uma solução de anticorpo monoclonal de ser humano antiAILIM humana (em fase líquida) foi adicionada sozinha a uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano. [00361] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H] timidina como um índice do grau de proliferação das células, e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00362] Nesta figura, anti-KLH indica o resultado do ensaio no qual o anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH foi usado como o controle negativo, em vez do anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00363] As outras notações são como se segue:
137: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab137.
138: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab138.
139: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM huPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 112/212
107/194 mana JMab139.
[00364] A Figura 39 mostra a atividade de proliferação de células T derivadas de uma pessoa saudável normal, doador D, no ensaio quanto à atividade de diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana de transdução do sinal coestimulador, quando uma solução de anticorpo monoclonal de ser humano antiAILIM humana (em fase líquida) foi adicionada sozinha a uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano. [00365] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H] timidina como um índice do grau de proliferação das células, e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00366] Nesta figura, anti-KLH indica o resultado do ensaio no qual o anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH foi usado como o controle negativo, em vez do anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00367] As outras notações são como se segue:
140: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab140.
141: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab141.
[00368] A Figura 40 mostra a quantidade de IFN-γ produzido no sobrenadante da cultura de células T derivadas de uma pessoa saudável normal, doador B, que foram cultivadas em uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana, juntamente com anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano.
[00369] O eixo vertical indica a concentração de IFN-γ, e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana.
[00370] Nesta figura, JHC1 indica o resultado do ensaio no qual o
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108/194 anticorpo monoclonal anti-CETP humana foi usado como o controle negativo, em vez do anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana.
[00371] A Figura 41 mostra a quantidade de IFN-γ produzido no sobrenadante da cultura de células T derivadas de uma pessoa saudável normal, doador B, que foram cultivadas em uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana, juntamente com anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano.
[00372] O eixo vertical indica a concentração de IFN-γ, e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana.
[00373] Nesta figura, anti-KLH indica o resultado do ensaio no qual o anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH foi usado como o controle negativo, em vez do anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00374] A Figura 42 mostra a quantidade de IFN-γ produzido no sobrenadante da cultura de células T derivadas de uma pessoa saudável normal, doador B, que foram cultivadas em uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana, juntamente com anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano.
[00375] O eixo vertical indica a concentração de IFN-γ, e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana.
[00376] Nesta figura, anti-KLH indica o resultado do ensaio no qual o anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH foi usado como o controle negativo, em vez do anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00377] A Figura 43 mostra a quantidade de IFN-γ produzido no sobrenadante da cultura de células T derivadas de uma pessoa saudável normal, doador C, que foram cultivadas em uma microplaca revestida
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109/194 com anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana, juntamente com anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano.
[00378] O eixo vertical indica a concentração de IFN-γ, e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana.
[00379] Nesta figura, JHC1 indica o resultado do ensaio no qual o anticorpo monoclonal anti-CETP humana foi usado como o controle negativo, em vez do anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana.
[00380] A Figura 44 mostra a quantidade de IFN-γ produzido no sobrenadante da cultura de células T derivadas de uma pessoa saudável normal, doador C, que foram cultivadas em uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana, juntamente com anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano.
[00381] O eixo vertical indica a concentração de IFN-γ, e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana.
[00382] Nesta figura, anti-KLH indica o resultado do ensaio no qual o anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH foi usado como o controle negativo, em vez do anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00383] As outras notações são como se segue:
124: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab124.
125: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab125.
126: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab126.
[00384] A Figura 45 mostra a quantidade de IFN-γ produzido no sobrenadante da cultura de células T derivadas de uma pessoa saudável
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110/194 normal, doador C, que foram cultivadas em uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana, juntamente com anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano.
[00385] O eixo vertical indica a concentração de IFN-γ, e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana.
[00386] Nesta figura, anti-KLH indica o resultado do ensaio no qual o anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH foi usado como o controle negativo, em vez do anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00387] As outras notações são como se segue:
128: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab128.
135: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab135.
136: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab136.
[00388] A Figura 46 mostra a quantidade de IFN-γ produzido no sobrenadante da cultura de células T derivadas de uma pessoa saudável normal, doador C, que foram cultivadas em uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana, juntamente com anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano.
[00389] O eixo vertical indica a concentração de IFN-γ, e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana.
[00390] Nesta figura, anti-KLH indica o resultado do ensaio no qual o anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH foi usado como o controle negativo, em vez do anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00391] As outras notações são como se segue:
Petição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 116/212
111/194
137: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab137.
138: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab138.
139: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab139.
[00392] A Figura 47 mostra a quantidade de IFN-γ produzido no sobrenadante da cultura de células T derivadas de uma pessoa saudável normal, doador C, que foram cultivadas em uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana, juntamente com anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano.
[00393] O eixo vertical indica a concentração de IFN-γ, e o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana.
[00394] Nesta figura, anti-KLH indica o resultado do ensaio no qual o anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH foi usado como o controle negativo, em vez do anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00395] As outras notações são como se segue:
140: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab140.
141: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab141.
[00396] A Figura 48 mostra o efeito inibitório sobre a proliferação de células T no caso do cultivo das células T a partir de uma pessoa saudável normal, doador A, com PBMC de uma pessoa saudável normal, doador D, por diversas amostras de teste no teste de proliferação das células T através das reações de linfócitos mistos (MLR). [00397] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação de [3H] timidina como um índice mostrando um nível de proliferação das céluPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 117/212
112/194 las, e o eixo horizontal mostra a concentração das amostras de teste.
[00398] Cada descrição nas figuras mostra o que se segue.
CD80 + 86: A mistura de anticorpo anti-CD80 e anticorpo anti-CD86 mIgG1: Anticorpo monoclonal de camundongo anti-CD34/IgG1 humana
CTLA4-Ig: Molécula quimérica de CTLA4-IgFc humana
SA12: Anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana [00399] A Figura 49 mostra o efeito inibitório sobre a proliferação de células T no caso do cultivo das células T a partir de uma pessoa saudável normal, doador A, com PBMC de uma pessoa saudável normal, doador D, por diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana no teste de proliferação das células T através das reações de linfócitos mistos (MLR).
[00400] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação de [3H] timidina como um índice mostrando um nível de proliferação das células, e o eixo horizontal mostra a concentração das amostras de teste. [00401] As outras notações são como se segue:
anti-KLH: anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH como um controle negativo.
JMab-124: anticorpo monoclonal de ser humano antiAILIM humana JMab124.
126: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab126.
127: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab127.
128: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab128.
135: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab135.
136: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM huPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 118/212
113/194 mana JMab136.
137: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab137.
[00402] A Figura 50 mostra o efeito inibitório sobre a proliferação de células T no caso do cultivo das células T a partir de uma pessoa saudável normal, doador D, com PBMC de uma pessoa saudável normal, doador B, por diversas amostras de teste no teste de proliferação das células T através das reações de linfócitos mistos (MLR). [00403] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação de [3H] timidina como um índice mostrando um nível de proliferação das células, e o eixo horizontal mostra a concentração das amostras de teste. [00404] Cada descrição nas figuras mostra o que se segue.
CD80 + 86: A mistura de anticorpo anti-CD80 e anticorpo anti-CD86 mIgG1: Anticorpo monoclonal de camundongo anti-CD34/IgG1 humana
CTLA4-Ig: Molécula quimérica de CTLA4-IgFc humana
SA12: Anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana [00405] A Figura 51 mostra o efeito inibitório sobre a proliferação de células T no caso do cultivo das células T a partir de uma pessoa saudável normal, doador D, com PBMC de uma pessoa saudável normal, doador B, por diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana no teste de proliferação das células T através das reações de linfócitos mistos (MLR).
[00406] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação de [3H] timidina como um índice mostrando um nível de proliferação das células, e o eixo horizontal mostra a concentração das amostras de teste. [00407] As outras notações são como se segue:
anti-KLH: anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH como um controle negativo.
JMab-124: anticorpo monoclonal de ser humano antiPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 119/212
114/194
AILIM humana JMab124.
126: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab126.
127: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab127.
128: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab128.
135: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab135.
136: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab136.
137: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab137.
[00408] A Figura 52 mostra o efeito inibitório sobre a proliferação de células T no caso do cultivo das células T a partir de uma pessoa saudável normal, doador C, com PBMC de uma pessoa saudável normal, doador A, por diversas amostras de teste no teste de proliferação das células T através das reações de linfócitos mistos (MLR). [00409] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação de [3H] timidina como um índice mostrando um nível de proliferação das células, e o eixo horizontal mostra a concentração das amostras de teste. [00410] Cada descrição nas figuras mostra o que se segue.
CD80 + 86: A mistura de anticorpo anti-CD80 e anticorpo anti-CD86 mIgG1: Anticorpo monoclonal de camundongo anti-CD34/IgG1 humana
CTLA4-Ig: Molécula quimérica de CTLA4-IgFc humana
SA12: Anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana [00411] A Figura 53 mostra o efeito inibitório sobre a proliferação de células T no caso do cultivo das células T a partir de uma pessoa saudável normal, doador C, com PBMC de uma pessoa saudável norPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 120/212
115/194 mal, doador A, por diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana no teste de proliferação das células T através das reações de linfócitos mistos (MLR).
[00412] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação de [3H] timidina como um índice mostrando um nível de proliferação das células, e o eixo horizontal mostra a concentração das amostras de teste. [00413] As outras notações são como se segue:
anti-KLH: anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH como um controle negativo.
JMab-124: anticorpo monoclonal de ser humano antiAILIM humana JMab124.
126: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab126.
127: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab127.
128: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab128.
135: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab135.
136: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab136.
137: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab137.
[00414] A Figura 54 mostra o efeito inibitório sobre a proliferação de células T no caso do cultivo das células T a partir de uma pessoa saudável normal, doador E, com PBMC de uma pessoa saudável normal, doador G, por diversas amostras de teste no teste de proliferação das células T através das reações de linfócitos mistos (MLR). [00415] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação de [3H] timidina como um índice mostrando um nível de proliferação das céluPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 121/212
116/194 las, e o eixo horizontal mostra a concentração das amostras de teste.
[00416] Cada descrição nas figuras mostra o que se segue.
mIgG de controle: Anticorpo monoclonal de camundongo antiCD34/IgG1 humana
CD80 + 86 Ab: A mistura de anticorpo anti-CD80 e anticorpo antiCD86
SA12: Anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana CTLA4-Ig: Molécula quimérica de CTLA4-IgFc humana [00417] A Figura 55 mostra o efeito inibitório sobre a proliferação de células T no caso do cultivo das células T a partir de uma pessoa saudável normal, doador E, com PBMC de uma pessoa saudável normal, doador G, por diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana no teste de proliferação das células T através das reações de linfócitos mistos (MLR).
[00418] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação de [3H] timidina como um índice mostrando um nível de proliferação das células, e o eixo horizontal mostra a concentração das amostras de teste. [00419] As outras notações são como se segue:
anti-KLH: anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH como um controle negativo.
JMab-136: anticorpo monoclonal de ser humano antiAILIM humana JMab136.
138: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab138.
139: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab139.
140: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab140.
141: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab141.
Petição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 122/212
117/194 [00420] A Figura 56 mostra o efeito inibitório sobre a proliferação de células T no caso do cultivo das células T a partir de uma pessoa saudável normal, doador F, com PBMC de uma pessoa saudável normal, doador E, por diversas amostras de teste no teste de proliferação das células T através das reações de linfócitos mistos (MLR).
[00421] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação de [3H] timidina como um índice mostrando um nível de proliferação das células, e o eixo horizontal mostra a concentração das amostras de teste. [00422] Cada descrição nas figuras mostra o que se segue.
mIgG de controle: Anticorpo monoclonal de camundongo antiCD34/IgG1 humana
CD80 + 86 Ab: A mistura de anticorpo anti-CD80 e anticorpo antiCD86
SA12: Anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana CTLA4-Ig: Molécula quimérica de CTLA4-IgFc humana [00423] A Figura 57 mostra o efeito inibitório sobre a proliferação de células T no caso do cultivo das células T a partir de uma pessoa saudável normal, doador F, com PBMC de uma pessoa saudável normal, doador E, por diversas amostras de teste no teste de proliferação das células T através das reações de linfócitos mistos (MLR).
[00424] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação de [3H] timidina como um índice mostrando um nível de proliferação das células, e o eixo horizontal mostra a concentração das amostras de teste. [00425] Cada descrição nas figuras mostra o que se segue.
anti-KLH: anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH como um controle negativo.
JMab-136: anticorpo monoclonal de ser humano antiAILIM humana JMab136.
138: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab138.
Petição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 123/212
118/194
139: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab139.
140: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab140.
141: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab141.
[00426] A Figura 58 mostra o efeito inibitório sobre a proliferação de células T no caso do cultivo das células T a partir de uma pessoa saudável normal, doador G, com PBMC de uma pessoa saudável normal, doador F, por diversas amostras de teste no teste de proliferação das células T através das reações de linfócitos mistos (MLR). [00427] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação de [3H] timidina como um índice mostrando um nível de proliferação das células, e o eixo horizontal mostra a concentração das amostras de teste. [00428] Cada descrição nas figuras mostra o que se segue.
mIgG de controle: Anticorpo monoclonal de camundongo antiCD34/IgG1 humana
CD80 + 86 Ab: A mistura de anticorpo anti-CD80 e anticorpo antiCD86
SA12: Anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana CTLA4-Ig: Molécula quimérica de CTLA4-IgFc humana [00429] A Figura 59 mostra o efeito inibitório sobre a proliferação de células T no caso do cultivo das células T a partir de uma pessoa saudável normal, doador G, com PBMC de uma pessoa saudável normal, doador F, por diversas amostras de teste no teste de proliferação das células T através das reações de linfócitos mistos (MLR). [00430] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação de [3H] timidina como um índice mostrando um nível de proliferação das células, e o eixo horizontal mostra a concentração das amostras de teste. [00431] Cada descrição nas figuras mostra o que se segue.
Petição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 124/212
119/194 anti-KLH: anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH como um controle negativo.
JMab-136: anticorpo monoclonal de ser humano antiAILIM humana JMab136.
138: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab138.
139: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab139.
140: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab140.
141: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab141.
[00432] A Figura 60 mostra o efeito inibitório de diversas substâncias de teste de controle sobre a proliferação de células T no ensaio usando a reação de linfócitos mistos (MLR). As células T a partir de uma pessoa saudável normal, doador A, foram cultivadas em conjunto com as PBMCs de uma pessoa saudável normal, doador D, précultivadas na presença de molécula quimérica de CTLA4-Ig humana. [00433] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H] timidina como um índice do grau de proliferação das células, e o eixo horizontal indica as concentrações das substâncias de teste. [00434] Cada descrição nas figuras mostra o que se segue.
[00435] CD80 + 86: A mistura de anticorpo anti-CD80 e anticorpo anti-CD86 [00436] mIgG1: Anticorpo monoclonal de camundongo antiCD34/IgG1 humana [00437] SA12: Anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana [00438] A Figura 61 mostra o efeito inibitório dos diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana sobre a proliPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 125/212
120/194 feração de células T no ensaio usando a reação de linfócitos mistos (MLR). As células T a partir de uma pessoa saudável normal, doador
A, foram cultivadas em conjunto com as PBMCs de uma pessoa saudável normal, doador D, pré-cultivadas na presença de molécula quimérica de CTLA4-Ig humana.
[00439] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H] timidina como um índice do grau de proliferação das células, e o eixo horizontal indica as concentrações das substâncias de teste. [00440] As outras notações são como se segue:
anti-KLH: anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH como um controle negativo.
JMab-124: anticorpo monoclonal de ser humano antiAILIM humana JMab124.
126: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab126.
127: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab127.
128: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab128.
135: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab135.
136: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab136.
137: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab137.
[00441] A Figura 62 mostra o efeito inibitório de diversas substâncias de teste de controle sobre a proliferação de células T no ensaio usando a reação de linfócitos mistos (MLR). As células T a partir de uma pessoa saudável normal, doador D, foram cultivadas em conjunto com as PBMCs de uma pessoa saudável normal, doador B, préPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 126/212
121/194 cultivadas na presença de molécula quimérica de CTLA4-Ig humana.
[00442] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H] timidina como um índice do grau de proliferação das células, e o eixo horizontal indica as concentrações das substâncias de teste.
[00443] Cada descrição nas figuras mostra o que se segue.
CD80 + 86: A mistura de anticorpo anti-CD80 e anticorpo anti-CD86 mIgG1: Anticorpo monoclonal de camundongo anti-CD34/IgG1 humana
SA12: Anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana [00444] A Figura 63 mostra o efeito inibitório dos diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana sobre a proliferação de células T no ensaio usando a reação de linfócitos mistos (MLR). As células T a partir de uma pessoa saudável normal, doador D, foram cultivadas em conjunto com as PBMCs de uma pessoa saudável normal, doador B, pré-cultivadas na presença de molécula quimérica de CTLA4-Ig humana.
[00445] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H] timidina como um índice do grau de proliferação das células, e o eixo horizontal indica as concentrações das substâncias de teste. [00446] As outras notações são como se segue:
anti-KLH: anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH como um controle negativo.
JMab-124: anticorpo monoclonal de ser humano antiAILIM humana JMab124.
126: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab126.
127: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab127.
128: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab128.
Petição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 127/212
122/194
135: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab135.
136: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab136.
137: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab137.
[00447] A Figura 64 mostra o efeito inibitório de diversas substâncias de teste de controle sobre a proliferação de células T no ensaio usando a reação de linfócitos mistos (MLR). As células T a partir de uma pessoa saudável normal, doador C, foram cultivadas em conjunto com as PBMCs de uma pessoa saudável normal, doador A, précultivadas na presença de molécula quimérica de CTLA4-Ig humana. [00448] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H] timidina como um índice do grau de proliferação das células, e o eixo horizontal indica as concentrações das substâncias de teste. [00449] Cada descrição nas figuras mostra o que se segue.
CD80 + 86: A mistura de anticorpo anti-CD80 e anticorpo anti-CD86 mIgG1: Anticorpo monoclonal de camundongo anti-CD34/IgG1 humana
SA12: Anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana [00450] A Figura 65 mostra o efeito inibitório dos diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana sobre a proliferação de células T no ensaio usando a reação de linfócitos mistos (MLR). As células T a partir de uma pessoa saudável normal, doador C, foram cultivadas em conjunto com as PBMCs de uma pessoa saudável normal, doador A, pré-cultivadas na presença de molécula quimérica de CTLA4-Ig humana.
[00451] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H] timidina como um índice do grau de proliferação das células, e o eixo horizontal indica as concentrações das substâncias de teste.
Petição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 128/212
123/194 [00452] As outras notações são como se segue:
anti-KLH: anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH como um controle negativo.
JMab-124: anticorpo monoclonal de ser humano antiAILIM humana JMab124.
126: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab126.
127: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab127.
128: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab128.
135: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab135.
136: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab136.
137: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab137.
[00453] A Figura 66 mostra o efeito inibitório de diversas substâncias de teste de controle sobre a proliferação de células T no ensaio usando a reação de linfócitos mistos (MLR). As células T a partir de uma pessoa saudável normal, doador E, foram cultivadas em conjunto com as PBMCs de uma pessoa saudável normal, doador G, précultivadas na presença de molécula quimérica de CTLA4-Ig humana. [00454] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H] timidina como um índice do grau de proliferação das células, e o eixo horizontal indica as concentrações das substâncias de teste. [00455] Cada descrição nas figuras mostra o que se segue.
mIgG de controle: Anticorpo monoclonal de camundongo antiCD34/IgG1 humana
CD80 + 86 Ab: A mistura de anticorpo anti-CD80 e anticorpo antiPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 129/212
124/194
CD86
SA12: Anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana [00456] A Figura 67 mostra o efeito inibitório dos diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana sobre a proliferação de células T no ensaio usando a reação de linfócitos mistos (MLR). As células T a partir de uma pessoa saudável normal, doador E, foram cultivadas em conjunto com as PBMCs de uma pessoa saudável normal, doador G, pré-cultivadas na presença de molécula quimérica de CTLA4-Ig humana.
[00457] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H] timidina como um índice do grau de proliferação das células, e o eixo horizontal indica as concentrações das substâncias de teste. [00458] As outras notações são como se segue:
anti-KLH: anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH como um controle negativo.
JMab-136: anticorpo monoclonal de ser humano antiAILIM humana JMab136.
138: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab138.
139: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab139.
140: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab140.
141: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab141.
[00459] A Figura 68 mostra o efeito inibitório de diversas substâncias de teste de controle sobre a proliferação de células T no ensaio usando a reação de linfócitos mistos (MLR). As células T a partir de uma pessoa saudável normal, doador G, foram cultivadas em conjunto com as PBMCs de uma pessoa saudável normal, doador F, préPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 130/212
125/194 cultivadas na presença de molécula quimérica de CTLA4-Ig humana.
[00460] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H] timidina como um índice do grau de proliferação das células, e o eixo horizontal indica as concentrações das substâncias de teste.
[00461] Cada descrição nas figuras mostra o que se segue.
mIgG de controle: Anticorpo monoclonal de camundongo antiCD34/IgG1 humana
CD80 + 86 Ab: A mistura de anticorpo anti-CD80 e anticorpo antiCD86
SA12: Anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana [00462] A Figura 69 mostra o efeito inibitório dos diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana sobre a proliferação de células T no ensaio usando a reação de linfócitos mistos (MLR). As células T a partir de uma pessoa saudável normal, doador G, foram cultivadas em conjunto com as PBMCs de uma pessoa saudável normal, doador F, pré-cultivadas na presença de molécula quimérica de CTLA4-Ig humana.
[00463] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H] timidina como um índice do grau de proliferação das células, e o eixo horizontal indica as concentrações das substâncias de teste. [00464] As outras notações são como se segue:
anti-KLH: anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH como um controle negativo.
JMab-136: anticorpo monoclonal de ser humano antiAILIM humana JMab136.
138: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab138.
139: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab139.
140: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM huPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 131/212
126/194 mana JMab140.
141: anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab141.
[00465] A Figura 70 mostra a atividade indutora de ADCC de diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana e anticorpos de controle, onde as células CHO do tipo selvagem foram usadas como as células-alvo.
[00466] O eixo vertical indica a taxa de citotoxicidade causada pela atividade indutora de ADCC do anticorpo, e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo.
[00467] A Figura 71 mostra a atividade indutora de ADCC de diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana e anticorpo de controle, onde as células CHO recombinantes superexpressando a AILIM humana foram usadas como as células-alvo. [00468] O eixo vertical indica a freqüência de dano à célula que resultou da atividade indutora de ADCC do anticorpo, e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo.
[00469] A Figura 72 mostra o efeito inibitório do anticorpo anti-AILIM sobre a alergia tardia.
[00470] O eixo vertical indica o local do vermelhidão medido como um índice do início da alergia tardia, e o eixo horizontal indica o tipo de amostra de teste dada aos pacientes animais.
[00471] A Figura 73 mostra a atividade de proliferação das células T de macacos no ensaio para determinar a atividade de diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana de transdução do sinal coestimulador, usando uma microplaca revestida com anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana, juntamente com anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano.
[00472] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H] timidina como um índice do grau de proliferação das células, e
Petição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 132/212
127/194 o eixo horizontal indica a concentração do anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00473] Nesta figura, anti-KLH indica o resultado do ensaio no qual o anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH foi usado como o controle negativo, em vez do anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana.
[00474] A Figura 74 mostra a atividade inibitória do anticorpo de controle negativo contra a ligação entre os ligandos para AILIM solúvel (hB7h-IgFc) e a AILIM solúvel (AILIM-IgFc) de diversas concentrações. [00475] O eixo vertical indica a absorbância como um índice para a atividade inibitória, e o eixo horizontal indica a concentração de AILIM solúvel.
[00476] A Figura 75 mostra a atividade inibitória do anticorpo anti AILIM contra a ligação entre os ligandos para AILIM solúvel (hB7hIgFc) e a AILIM solúvel (AILIM-IgFc) de diversas concentrações.
[00477] O eixo vertical indica a absorbância como um índice para a atividade inibitória, e o eixo horizontal indica a concentração de AILIM solúvel.
[00478] A Figura 76 mostra a atividade inibitória do anticorpo anti AILIM em diversas concentrações contra a ligação entre os ligandos para AILIM solúvel (hB7h-IgFc) e a AILIM solúvel (AILIM-IgFc).
[00479] O eixo vertical indica a absorbância como um índice para a atividade inibitória, e o eixo horizontal indica a concentração de AILIM solúvel.
[00480] A Figura 77 mostra a atividade inibitória de diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana à proliferação de células T humanas no ensaio para determinar a atividade de transdução de sinal coestimulador usando uma microplaca revestida com ligando para AILIM humana solúvel (hB7h-IgFc), juntamente com anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano.
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128/194 [00481] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H] timidina como um índice do grau de proliferação das células, e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo.
[00482] A Figura 78 mostra a atividade inibitória de diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana à proliferação de células T de macacos no ensaio para determinar a atividade de transdução de sinal coestimulador usando uma microplaca revestida com ligando para AILIM humana solúvel (hB7h-IgFc), juntamente com anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano.
[00483] O eixo vertical indica a quantidade de incorporação celular de [3H] timidina como um índice do grau de proliferação das células, e o eixo horizontal indica a concentração de anticorpo.
Melhor Modo de Realizar a Invenção [00484] A presente invenção é ilustrada em mais detalhe abaixo com referência aos Exemplos, porém não é para ser interpretada como estando limitada aos mesmos.
Exemplo 1 Preparação de imunógeno <1 - 1> Preparação de célula recombinante expressando a AILIM humana [00485] Dois tipos de células recombinantes (célula CHO e célula HPB-ALL) superexpressando a AILIM humana foram preparadas de acordo com o método como descrito em pedidos anteriores (JP-A No Hei 11-29599 e WO98/38216), bem como em um relatório anterior (Int. Immunology, Vol. 12, N2 1, p.p. 51-55, 2000) de um dos presentes inventores, Tezuka. Especificamente, o método é como se segue: [00486] Um cDNA (Número de Acesso do GenBank: AB023135 (cDNA); BAA82129 (aminoácido)), contendo o ORF de tamanho natural codificando a AILIM humana, foi inserido em um vetor pEF-neo. Então, o vetor de expressão recombinante resultante foi introduzido nas células do ovário de hamster chinês (célula CHO) e nas células de
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129/194 uma linha de timoma humana, HPB-ALL, de acordo com um método comumente usado, utilizando eletroporação (960mF, 320V) com um Gene Pulser (BioRad). As células respectivas foram cultivadas em meio RPMI1640 contendo Geneticina (0,8 mg/ml; Gibco BRL) e 10% de FCS para selecionar as células transformadas resistentes a drogas. <1 - 2> Seleção das células HPB-ALL recombinantes superexpressando a AILIM humana [00487] A cultura das células HPB-ALL resistentes a drogas, selecionadas em <1 - 1> descrito acima, foi centrifugada para dar os péletes de células. Um anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana, chamado SA12 (anticorpo monoclonal de antígeno de camundongo anti-JTT-1 humana), que tinha sido estabelecido e descrito anteriormente (JP-A 11-29599 (Exemplo 12) e WO98/38216 (Exemplo 12)) pelos presentes inventores, foi adicionado ao pélete de células (concentração: a solução de anticorpo (10 mg/ml), diluída com EDTABSA/PBS, foi adicionada em uma taxa de 100 ml/105 células). As misturas resultantes foram incubadas à 4°C por 30 minu tos. As células foram lavadas duas vezes com o EDTA-BSA/PBS acima mencionado (200 ml), e então a estreptavidina marcada com ficoeritrina (SA-PE; 100 ml de solução diluída 500 vezes) foi adicionada às mesmas. As misturas resultantes foram incubadas a 4°C por 30 m inutos. Após a incubação, as células foram lavadas 3 vezes com EDTA-BSA/PBS, e as suspensões de células foram preparadas.
[00488] Os níveis de expressão de AILIM humana das células respectivas nas suspensões de células foram analisados em um citômetro de fluxo, FACSort (Beckton-Dichinson), para selecionar as células HPB-ALL recombinantes superexpressando a AILIM humana. As células selecionadas foram cultivadas até a confluência em meio RPMI1640 contendo 10% de FCS e G418 (1 mg/ml).
<1 - 3> Seleção de células CHO recombinantes superexpressando a
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AILIM humana [00489] A cultura das células CHO resistentes a drogas, selecionadas em <1 - 1> descrito acima, foi centrifugada para dar os péletes de células. O anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana SA12 acima mencionado, que tinha sido marcado com FITC, foi adicionado à cado pélete de células (solução de anticorpo (100 mg/ml) diluída com EDTA-BSA/PBS). As misturas resultantes foram incubadas à 4°C por 30 minutos. As células foram lavadas com o EDTA-BSA/PBS acima mencionado, e então as suspensões de células foram preparadas por adição de EDTA-BSA/PBS (500 ml) aos péletes de células. [00490] Os níveis de expressão de AILIM humana das células respectivas nas suspensões de células foram analisados em um citômetro de fluxo, FACSort (Beckton-Dichinson), para selecionar as células HPB-ALL recombinantes superexpressando a AILIM humana. As células selecionadas foram cultivadas até a confluência em meio RPMI1640 contendo 10% de FCS e G418 (1 mg/ml).
<1 - 4> Preparação de imunógeno a partir das células HPB-ALL superexpressando a AILIM humana [00491] As células HPB-ALL superexpressando a AILIM humana, que tinham sido obtidas em <1 - 2> descrito acima, foram centrifugadas. O pélete de células recuperado foi lavado 4 vezes com tampão fosfato (PBS; Nikken Seibutsu) e então suspensa novamente em um tampão contendo inibidor de protease (contendo 25 mM de HEPES (pH 7,4), 10 mM de MgCl2, 0,25 M de Sacarose, e inibidor de protease (10 U/ml de Aprotinina, 2 mg/ml de Pepstatina, 50 mg/ml de Leupeptina, e 0,35 mg/ml de PMSF)). A suspensão de células foi tratada em um homogeneizador do tipo Potter, e centrifugada em uma baixa velocidade (em 1.500 rpm, a 4°C, por 10 minutos). Subseqü entemente, o sobrenadante resultante foi submetido à ultracentrifugação (sob 100.000g à 4°C, por 1 hora). A fração de membrana p recipitada foi rePetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 136/212
131/194 cuperada, e suspensa em tampão fosfato (a concentração da fração de membrana foi ajustada de modo que 1 ml de PBS contivesse fração de membrana derivada de 1x107 células). A suspensão foi armazenada a -80°C. A suspensão contendo a fração de membra na celular foi usada como o antígeno (imunógeno) para preparar o anticorpo de ser humano da presente invenção, que será descrito posteriormente.
<1 - 5> Preparação de imunógeno a partir das células CHO superexpressando a AILIM humana [00492] As células CHO superexpressando a AILIM humana, que tinham sido obtidas em <1 - 3> descrito acima, foram dispersas com um raspador e foram centrifugadas. O pélete de células recuperado foi lavado 4 vezes com tampão fosfato (PBS; Nikken Seibutsu) e então suspenso novamente em um tampão contendo inibidor de protease (contendo 25 mM de HEPES (pH 7,4), 10 mM de MgCl2, 0,25 M de Sacarose, e inibidor de protease (10 U/ml de Aprotinina, 2 mg/ml de Pepstatina, 50 mg/ml de Leupeptina, e 0,35 mg/ml de PMSF)). A suspensão de células foi tratada em um homogeneizador do tipo Potter, e centrifugada em uma baixa velocidade (em 1.500 rpm, a 4°C, por 10 minutos). Subseqüentemente, o sobrenadante resultante foi submetido à ultracentrifugação (sob 100.000g à 4°C, por 1 hora). A fração de membrana precipitada foi recuperada, e suspensa em tampão fosfato (a concentração da fração de membrana foi ajustada de modo que 1 ml de PBS contivesse fração de membrana derivada de 1x107 células). A suspensão foi armazenada a -80°C. A suspensão con tendo a fração de membrana celular foi usada como o antígeno (imunógeno) para preparar o anticorpo de ser humano da presente invenção, que será descrito posteriormente.
Exemplo 2 Preparação de hibridoma produzindo anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana [00493] No presente Exemplo, a preparação do anticorpo monocloPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 137/212
132/194 nal foi realizada de acordo com um método típico como descrito em
Experimental Medicine (supplement), Handbook for Cell Technology (eds., T. Kuroki et al, Yodosha, p.p. 66-74, 1992) e Experimental Manual for Monoclonal Antibody (T. Ando et al, Kodansha, 1991).
[00494] A fração de membrana celular, preparada a partir das células recombinantes superexpressando a AILIM humana proporcionadas no Exemplo 1, foi usada como o imunógeno da AILIM humana.
[00495] Os animais submetidos à imunização eram camundongos transgênicos produtores de anticorpos de seres humanos, criados pelo método acima descrito (Nature Genetics, Vol. 7, p.p. 13-21, 1994; Nature Genetics, Vol. 15, p.p. 146-156, 1997; Tradução Japonesa Publicada do Pedido Internacional N2 Hei 4-504365; Tradução Japonesa Publicada do Pedido Internacional No Hei 7-509137; Nikkei Science, junho, p.p. 40-50, 1995; etc.).
[00496] As microplacas com múltiplas cavidades foram usadas para a cultura das células <2 - 1> Imunização e preparação do hibridoma [00497] Cada um dos imunógenos (100 ml/camundongo/administração) preparados em <1 - 4> (derivados de HPB-ALL) e em <1 - 5> (derivados de CHO) descrito acima foi dado ao camundongo transgênico produtor de anticorpos de seres humanos acima mencionado. O imunógeno foi injetado juntamente com o adjuvante completo de Freund (ICN/CAPPEL), na pata, como a imunização primária (dia 0).
[00498] Após a imunização primária, cada um dos dois imunógenos foi adicionalmente injetado na pata, em intervalo de 1 semana, como a imunização secundária e/ou terciária. Do mesmo modo, a injeção foi adicionalmente efetuada para a imunização final dois dias antes da preparação dos linfócitos, que é descrita abaixo.
[00499] Dois dias após a imunização final, os linfócitos foram prepaPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 138/212
133/194 rados a partir de linfonodos (subinguinal e subgenual) e baços dos respectivos camundongos transgênicos submetidos à imunização. Os linfócitos e as células de mieloma de camundongo P3/X63-AG8.653 (ATCC N2 CRL-1580) foram misturados em uma razão de 5:1, e o polietileno glicol 1500 (Boehringer Mannheim) foi adicionado aos mesmos como um agente de fusão. Então, a mistura foi diluída com 10 volumes de meio basal sem soro EX-CELL301 (JRH Bioscience). Subseqüentemente, as células mistas foram lavadas com o meio basal e então suspensas em meio HAT (1 l de meio basal continha 13,61 mg de hipoxantina, 176 mg de aminopterina, e 3,88 mg de timidina). As células foram preparadas sobre microplacas com 96 cavidades e cultivadas por 10-14 dias até completar a fusão das células. O tratamento de fusão das células produziu muitos hibridomas.
<2 - 2> Exame do hibridoma produtor de anticorpos monoclonais de seres humanos [00500] Diversos hibridomas preparados em <2 - 1> descrito acima foram examinados com o ELISA das células, como descrito abaixo, para selecionar os hibridomas que produzem anticorpo monoclonal de ser humano contra a AILIM humana.
[00501] As células HPB-ALL recombinantes e as células CHO recombinantes respectivas, superexpressando a AILIM humana, as quais são descritas acima, foram preparadas em cada cavidade de microplacas com 96 cavidades para ELISA (1x105 células/cavidade). A incubação foi efetuada a 37°C por 2 dias.
[00502] Subseqüentemente, o sobrenadante de cada cavidade foi descartado, as amostras de sobrenadante de cada cultura de hibridoma foram adicionadas à mesma (50 ml/cavidade), e a mistura foi incubada por 1 hora. Após a reação estar completada, a solução de amostras mistas foi descartada e cada cavidade foi lavada 3 vezes com PBS contendo 1% de BSA (Sigma).
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134/194 [00503] Subseqüentemente, o anticorpo de cabra antiimunoglobulina (Fc) humana conjugado com peroxidase (50 μ! da diluição de 2000 vezes por cavidade; American Corex; 1% de BSA/PBS) foi adicionado a cada cavidade, a fim de detectar a cadeia pesada da imunoglobulina humana (anticorpo monoclonal de ser humano) no sobrenadante de hibridoma. A mistura foi incubada à temperatura ambiente, por 1 hora.
[00504] Por outro lado, o anticorpo de cabra anti-cadeia κ de imunoglobulina humana conjugado com peroxidase (50 ml da diluição de 2000 vezes por cavidade) foi adicionado a cada cavidade, a fim de detectar a cadeia leve da imunoglobulina humana (anticorpo monoclonal de ser humano) no sobrenadante de hibridoma. A mistura foi incubada à temperatura ambiente, por 15 minutos.
[00505] O anticorpo anti-IgFc humana ou o anticorpo anti-Igk humana foi removido de cada cavidade das microplacas, e então as placas foram lavadas 3 vezes com PBS contendo 1% de BSA. A tetrametilbenzidina (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB), 100 ml/cavidade, BIORAD) foi adicionada a cada cavidade, e a mistura resultante foi incubada à temperatura ambiente, por 15 minutos.
[00506] Subseqüentemente, o H2SO4 a 1N foi adicionado a cada cavidade (50 ml/cavidade) para resfriar rapidamente a reação. A reação foi monitorada quanto à absorbância, em um comprimento de ondas de 450 nm, por uma leitora de microplacas (Leitora de Microplacas Modelo 3550, BIO-RAD).
[00507] A experiência de controle por ELISA foi efetuada no mesmo modo como descrito acima, por utilização dos seguintes itens:
(1) Células HPB-ALL do tipo selvagem, em vez das células HPB-ALL recombinantes expressando a AILIM humana;
(2) Células CHO do tipo selvagem, em vez das células CHO recombinantes expressando a AILIM humana;
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135/194 (3) Anticorpos monoclonais de camundongos contra a AILIM humana (SA12 ou SG430; JP-A 11-29599 (Exemplo 12) e WO98/38216 (Exemplo 12)), em vez do sobrenadante de hibridoma;
(4) Anticorpo monoclonal de ser humano contra a KLH (hemocianina de lapa de buraco de fechadura, PIERCE), em vez do sobrenadante de hibridoma.
[00508] O anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH foi preparado de acordo com o mesmo modo como descrito acima em <2 - 1>, por imunização dos camundongos transgênicos produtores de anticorpos de seres humanos acima mencionados com a KLH (hemocianina de lapa de buraco de fechadura, PIERCE).
[00509] Muitos hibridomas produzindo anticorpo monoclonal de ser humano, capazes de ligarem-se a AILIM humana, foram selecionados pelo dito exame.
<2 - 3> Clonagem primária do hibridoma [00510] Muitos tipos de monoclones de hibridoma foram estabelecidos a partir dos diversos hibridomas (linhas de células parentais), os quais tinham sido selecionados em <2 - 2> descrito acima, produzindo anticorpo monoclonal de ser humano contra a AILIM humana pelo seguinte procedimento de ensaio.
[00511] Os hibridomas respectivos, selecionados em <2 - 2> descrito acima, foram preparados em microplacas com 24 cavidades. A contagem celular de hibridoma em cada cavidade foi determinada por pipetagem. Subseqüentemente, 10% de soro de bezerro fetal (FCS; Trace Bioscience PTY), 1% de penicilina/estreptomicina (Sigma), 1% de Suplemento HT (Gibco BRL) e 2,5% de Suplemento de Cultura TSTIM (Collaborative Biomedical Products) foram adicionados ao meio EX-CELL301 (JRH Bioscience) contendo 4,0 mM de L-glutamina e lipídio. O meio modificado resultante foi usado para diluir os hibridomas até 1x104 células/ml e as células foram suspensas em cada cavidade.
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136/194 [00512] A suspensão de células (300 μΙ ou 600 μΙ) de cada cavidade foi combinada e misturada bem com o meio modificado (150 ml ou 300 ml), e então uma alíquota de 200 ml da suspensão de células foi adicionada a cada cavidade de microplacas múltiplas com 96 cavidades, de modo tal que cada cavidade contivesse 4 células do hibridoma. O meio modificado acima mencionado (50 ml ou 100 ml) foi recentemente adicionado à suspensão de células restante, a qual foi misturada bem, e então a suspensão de células resultante foi adicionada a cada cavidade de outras microplacas múltiplas com 96 cavidades, recentemente preparadas, de modo tal que cada cavidade contivesse 2 células do hibridoma.
[00513] O cultivo foi continuado por 1 a 2 semanas. Após o cultivo, colônias individuais derivadas de um único hibridoma foram encontradas em muitas cavidades.
[00514] Com o ELISA de células conforme descrito acima em <2 2>, foi verificado que o anticorpo monoclonal de ser humano contra a AILIM humana foi produzido no sobrenadante da cultura em cada cavidade contendo a colônia.
<2 - 4> Clonagem secundária do hibridoma [00515] A subclonagem (clonagem secundária) de cada clone a partir dos diversos clones de hibridoma obtidos em <2 - 3> descrito acima foi efetuada de acordo com o mesmo método como descrito acima em <2 - 3>.
[00516] A densidade da célula em cada cavidade, em uma microplaca com 96 cavidades, foi ajustada para 1 célula/cavidade na presente experiência.
[00517] O exame produziu muitos monoclones de hibridoma produzindo anticorpo monoclonal de ser humano contra a AILIM humana.
Parte dos clones incluídos era como abaixo descrito:
(Nome do Clone)
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AIF34 (JMab124), AIF182 (JMab-126), AIF348 (JMab-127), AIF620 (JMab-128), AIF1052 (JMab-135), AIH5D3 (JMab-136), AIH386 (JMab137), AII289 (JMab-138), AII394 (JMab-139), AII488 (JMab-140),
AIJ40 (JMab-141), [00518] Os nomes mostrados acima são usados por todo o presente pedido, a saber, em todos os Exemplos descritos abaixo, incluindo o presente Exemplo, e nas Figuras e Tabelas contendo o resultado do ensaio obtido neste Exemplo.
Exemplo 3 Análise das propriedades do anticorpo monoclonal <3 - 1> Análises da cadeia pesada e da cadeia leve [00519] Por utilização de ELISA e citometria de fluxo descritos abaixo, foi verificado que o anticorpo monoclonal contra a AILIM humana, produzido por cada clone de hibridoma, o qual tinha sido clonado em <2 - 4> descrito acima, era de fato um anticorpo monoclonal de ser humano.
[00520] As células HPB-ALL recombinantes, superexpressando a AILIM humana, as quais foram preparadas no Exemplo 1, foram preparadas em cada cavidade no formato de v da microplaca (3x104 células/cavidade). As células foram cultivadas a 37°C em meio RPMI1640 contendo 10% de FCS.
[00521] Após a cultura estar completa, a placa foi centrifugada (a 1.800 rpm, por 2 minutos) até precipitar as células, e então o sobrenadante resultante foi descartado. Subseqüentemente, a amostra de sobrenadante (50 ml/cavidade) da cultura de cada hibridoma clonado em <2 - 4> descrito acima, ou o anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana SA12 (2 mg/50 ml) ou alternativamente o anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH (50 ml/cavidade) como um anticorpo de controle foi adicionado a cada cavidade. A mistura foi reagida por 30 minutos em um refrigerador. Após a reação, a solução de amostra foi descartada e cada cavidade foi lavada com tampão fosfato
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138/194 (0,5% de BSA-PBS contendo 5 mM de EDTA).
[00522] Subseqüentemente, qualquer um dos anticorpos secundários abaixo descritos foi adicionado a cada cavidade (diluído 1000 vezes com o tampão fosfato acima mencionado e adicionado em uma quantidade de 50 ml/cavidade) a fim de suspender as células. A suspensão foi reagida por 30 minutos em um refrigerador.
(Anticorpo secundário)
Anticorpo anti-IgG humana marcado com biotina (Zymed);
Anticorpo anti-IgG humana marcado com biotina (Protos);
Anticorpo anti-IgFc humana marcado com biotina (EY Laboratories); ou
Anticorpo anti-Igk humana marcado com biotina (Vector).
[00523] Após a reação, o anticorpo secundário foi descartado e cada cavidade da placa foi lavada com o tampão fosfato acima mencionado. Subseqüentemente, a estreptavidina marcada com ficoeritrina (Estreptavidina-PE; Pharmingen; diluída 500 vezes com o tampão fosfato acima mencionado e adicionada em uma quantidade de 50 ml/cavidade) foi adicionada a cada cavidade. A mistura foi reagida por 30 minutos em um refrigerador. Após a reação, cada cavidade foi lavada com o tampão fosfato acima mencionado. Então, o tampão fosfato acima mencionado foi adicionado a cada cavidade (200 ml/cavidade) a fim de suspender as células.
[00524] A análise foi efetuada para determinar a reatividade do anticorpo monoclonal anti-AILIM humana, no sobrenadante da cultura de cada clone de hibridoma, às células HPB-ALL superexpressando a AILIM humana em cada cavidade.
[00525] O ensaio de controle foi efetuado no mesmo modo como descrito acima, por utilização dos seguintes itens:
(1) Células HBP-ALL do tipo selvagem, em vez das células
HPB-ALL recombinantes expressando a AILIM humana;
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139/194 (2) Anticorpo monoclonal de ser humano contra a KLH (hemocianina de lapa de buraco de fechadura, PIERCE), em vez do sobrenadante de hibridoma.
[00526] O anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH foi preparado de acordo com o mesmo modo como descrito acima em <2 - 1>, por imunização dos camundongos transgênicos produtores de anticorpos de seres humanos acima mencionados com a KLH (hemocianina de lapa de buraco de fechadura, PIERCE).
[00527] Com base no resultado, todos os clones de hibridomas descritos acima em <2 - 4> foram verificados ser anticorpos monoclonais de seres humanos consistindo em cadeia pesada derivada de ser humano e cadeia leve κ derivada de ser humano.
[00528] Um exemplo do resultado é ilustrado na Figura 1, que envolve o resultado do ensaio para os clones de hibridomas AIH5D3 (JMab-136), AII289 (JMab-138), e AII394 (JMab-139).
<3 - 2> Determinação do isótipo (isotyping) de anticorpo monoclonal de ser humano.
[00529] O isótipo foi determinado para cada um dos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana, produzidos pelos hibridomas que tinham sido clonados em <2 - 4> e analisados em <3 1> descritos acima. A determinação foi realizada usando um Kit de Determinação de Isótipos de Anticorpos Monoclonais de seres humanos (American Qualex), de acordo com o protocolo experimental anexado ao kit.
[00530] Todos os anticorpos monoclonais de seres humanos antiAILIM humana foram determinados ser IgG2/k.
Exemplo 4 Preparação de anticorpo monoclonal de ser humano contra a AILIM humana (anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana) em grande escala e sua purificação <4 - 1> Método 1
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140/194 [00531] As células de cada clone de hibridoma produzindo anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana, o qual tinha sido preparado em <2 - 4> descrito acima, foram adicionadas a um frasco de cultura de tecido (50 ml, FALCON), e cultivadas em meio ASF104 (Ajinomoto) contendo 10% de FBS com Teor de IgG Bovina Ultra Baixo (GIBCO-BRL) até estarem confluentes, sob uma atmosfera de 5% de CO2 a 37°C.
[00532] Subseqüentemente, o líquido inteiro da cultura foi transferido para um novo frasco de cultura de tecido (750 ml, FALCON), e as células foram cultivadas em meio ASF104 (Ajinomoto) contendo 10% de FBS com Teor de IgG Bovina Ultra Baixo (GIBCO-BRL) até estarem confluentes, sob uma atmosfera de 5% de CO2 a 37°C.
[00533] 10 a 20 dias após a cultura, o sobrenadante da cultura de cada hibridoma foi recuperado e transferido para um tubo cônico de polipropileno de 50 ml (FALCON). O tubo foi centrifugado sob 500xg por 5 minutos.
[00534] Subseqüentemente, o sobrenadante centrífugo resultante foi filtrado através de uma Unidade de Filtro de Esterilização (NALGEN), e o filtrado foi recuperado.
[00535] O filtrado foi carregado para uma coluna HiTrap de Proteína G (Coluna por afinidade HiTrap Proteína G; Amersham Pharmacia), pré-equilibrada com tampão fosfato (30 ml), em uma vazão de 3 ml/min.
[00536] Subseqüentemente, a coluna foi lavada com tampão fosfato (20 ml), e então o anticorpo de interesse foi eluído carregando-se o tampão de 100 mM de citrato (pH 2,0) para a coluna, em uma taxa baixa de cerca 1 ml/min. Subseqüentemente, a solução eluída foi neutralizada com uma solução (pH 9,0) de 750 mM de Tris-HCl, e então filtrada através de um filtro (Millipore) para remover o precipitado branco. O filtrado resultante foi dialisado contra o tampão fosfato (durante a
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141/194 noite) e filtrado através de um filtro (Millipore). O anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM assim purificado foi obtido a partir de cada linha de hibridoma.
[00537] A concentração de proteína foi determinada a partir da absorbância a A280, medida por utilização de um fotoespectrômetro (1 A280 = 1,41 mg/ml).
<4 - 2> Método 2 [00538] As células de cada clone de hibridoma, o qual tinha sido preparado em <2 - 4> descrito acima, foram condicionadas em meio ASF104 (Ajinomoto) contendo 10% de FBS com Teor de IgG Bovina Ultra Baixo (GIBCO-BRL) (1-2x106 Células/ml cada), e foram preparadas em placas e cultivadas em Linha de Célula Integra 1000 (INTEGRA CL1000, INTEGRA BIOSCIENCE). 7 a 10 dias após o cultivo, quando a densidade de células atingiu 1x108 células/ml, o sobrenadante de cada cultura de hibridoma foi recuperado.
[00539] Cada sobrenadante da cultura foi carregado para uma coluna HiTrap de Proteína G (coluna por afinidade HiTrap Proteína G; Amersham Pharmacia), pré-equilibrada com tampão fosfato (30 ml), em uma vazão de 3 ml/min.
[00540] Subseqüentemente, a coluna foi lavada com tampão fosfato (20 ml), e então o tampão de 100 mM de citrato (pH 2,0) foi carregado para a coluna, em uma vazão de cerca de 1 ml/min, para eluir o anticorpo. Então, uma solução (pH 9,0) de 750 mM de Tris-HCl foi adicionada para neutralizar a solução eluída, e a solução resultante foi filtrada através de um filtro (Millipore) para remover o precipitado branco. O filtrado resultante foi dialisado contra o tampão fosfato (durante a noite) e então filtrado através de um filtro (Millipore). O anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM assim purificado foi obtido a partir de cada linha de hibridoma.
Exemplo 5 Reatividade do anticorpo monoclonal de ser humano antiPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 147/212
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AILIM humana a AILIM humana, e reatividade cruzada dele a AILIM de camundongo e a AILIM de rato [00541] Os diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana purificados, acima descritos, foram analisados quanto à sua reatividade a AILIM humana, bem como à sua reatividade cruzada a AILIM de camundongo e AILIM de rato, por utilização do método de ELISA de células.
<5 - 1> Estabelecimento do sistema de ELISA para determinar a concentração de anticorpo de IgG e preparação de curvas de calibragem [00542] Porque todos os anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana purificados, acima mencionados, eram anticorpo de IgG (IgG2), o sistema de ELISA foi estabelecido para determinar a concentração de anticorpo de IgG.
[00543] O anticorpo de cabra anti-IgG (Fc) humana (1,2 mg/ml em PBS; 100 ml/cavidade; Organon Teknika) foi adicionado a cada cavidade de uma microplaca de ELISA com 96 cavidades (Nunc). A placa foi incubada à temperatura ambiente, por 2 horas, para adsorver o anticorpo anti-IgG (Fc) sobre a microplaca. Subseqüentemente, o sobrenadante foi descartado, e a placa foi lavada 3 vezes com tampão fosfato (PBS) contendo 0,05% de Tween20. Um reagente de bloqueio (PBS contendo 0,5% de soro albumina bovina (BSA) e 0,1% de Tween20) foi adicionado a cada cavidade (200 ml/cavidade) e a placa foi incubada à temperatura ambiente, por 2 horas, para bloquear os locais sem anticorpo anti-IgG (Fc) sobre a placa. Então, o reagente de bloqueio foi descartado, e cada cavidade foi lavada duas vezes com PBS.
[00544] O anticorpo de IgG2 derivado de ser humano (50 ml/cavidade; The Binding Site), o qual foi usado como um anticorpo padrão, foi adicionado, em diversas concentrações (0 a 100 ng/ml), às cavidades respectivas da placa e a placa foi incubada à temperatura
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143/194 ambiente, por 2 horas. As soluções excedentes do anticorpo padrão foram removidas e cada cavidade foi lavada 3 vezes com tampão fosfato contendo 0,05% de Tween20.
[00545] Subseqüentemente, o anticorpo de cabra anti-IgG/κ humana conjugado com peroxidase foi adicionado a cada cavidade (diluído 4.000 vezes, 100 ml/cavidade, Protos), e a placa foi incubada à temperatura ambiente por 1 hora.
[00546] O sobrenadante foi descartado e a microplaca foi lavada 3 vezes com tampão fosfato contendo 0,05% de Tween20. Um tampão contendo substrato (composição: orto-fenilenodiamina (Ofenilenodiamina, OPD; 20 mg)/tampão de citrato-fosfato (pH 5,0, 50 ml)/solução aquosa de 30% de peróxido de hidrogênio (15 ml)) foi adicionado a cada cavidade (100 ml/cavidade) e a placa foi incubada à temperatura ambiente, por cerca de 7 minutos.
[00547] Subseqüentemente, o ácido sulfúrico a 2M foi adicionado a cada cavidade (50 ml/cavidade) para interromper a reação. As curvas de calibragem foram feitas (Figura 2) com base nos valores da absorbância medida em um comprimento de onda de 490 nm, por utilização de uma leitora de microplacas.
[00548] Os ensaios de controle foram efetuados com o meio de cultura sozinho ou a solução de BSA sozinha, como uma substância de teste, no mesmo modo como descrito acima.
<5 - 2> Análises quanto à reatividade dos diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana, purificados, a AILIM humana, bem como quanto à reatividade cruzada dele a AILIM de camundongo e a AILIM de rato <5 - 2 - 1> Preparação dos reagentes [00549] Os reagentes a serem usados neste ELISA de células foram preparados como se segue:
<5 - 2 - 1 - 1> Preparação de célula CHO recombinante superexpresPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 149/212
144/194 sando a AILIM de camundongo [00550] As células CHO recombinantes superexpressando a AILIM de camundongo foram preparadas e obtidas no mesmo modo como descrito acima em <1 - 1> e <1 - 3>.
[00551] Um cDNA (Número de Acesso do GenBank: AB023132 (cDNA); BAA82126 (aminoácido)), contendo o ORF de tamanho natural de AILIM de camundongo, foi inserido em um vetor pEF-neo, e então o vetor de expressão recombinante resultante foi introduzido nas células do ovário de hamster chinês (célula CHO) por um método comumente usado para a eletroporação (960 pF, 320 V), usando um Gene Pulser (BioRad). As células foram cultivadas em meio RPMI1640 contendo Geneticina (0,8 mg/ml; Gibco BRL) e 10% de FCS, para selecionar as células transformadas resistentes a drogas, desse modo obtendo as células CHO recombinantes superexpressando a AILIM de camundongo.
<5 - 2 - 1 - 2> Preparação de célula CHO recombinante superexpressando a AILIM de rato [00552] As células CHO recombinantes superexpressando a AILIM de rato foram preparadas e obtidas no mesmo modo como descrito acima em <1 - 1> e <1 - 3>.
[00553] Um cDNA (Número de Acesso do GenBank: AB023134 (cDNA); BAA82128 (aminoácido)), contendo o ORF de tamanho natural de AILIM de rato, foi inserido em um vetor pEF-neo, e então o vetor de expressão recombinante resultante foi introduzido nas células do ovário de hamster chinês (célula CHO) por um método comumente usado para a eletroporação (960 pF, 320 V), usando um Gene Pulser (BioRad). As células foram cultivadas em meio RPMI1640 contendo Geneticina (0,8 mg/ml; Gibco BRL) e 10% de FCS, para selecionar as células transformadas resistentes a drogas, desse modo obtendo as células CHO recombinantes superexpressando a AILIM de rato.
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145/194 <5 - 2 - 1 - 3> Preparação de anticorpo monoclonal contra AILIM de camundongo [00554] As células CHO recombinantes, superexpressando a AILIM de camundongo, as quais foram preparadas em <5 - 2 - 1 - 1> descrito acima, foram homogeneizadas, e submetidas à ultracentrifugação (100.000x g). O pélete resultante contendo fração de membrana celular foi recuperado e então suspenso em PBS. A fração de membrana celular resultante foi injetada, juntamente com o adjuvante completo de Freund, em ratos Wistar, na pata, para a imunização primária (dia 0). O antígeno da fração de membrana celular foi adicionalmente dado aos ratos, na pata, no 7o dia, 14o dia e 28o dia após a imunização primária. As células de linfonodos foram coletadas deles 2 dias após a imunização final.
[00555] As células de linfonodos e a célula de mieloma de camundongo PAI (JCR N2 B0113; Res. Disclosure, Vol. 217, p. 155, 1982) foram combinadas em uma razão de 5:1. As células foram fundidas umas às outras por utilização de polietileno glicol 4000 (Boehringer Mannheim) como um agente de fusão, para preparar os hibridomas produtores de anticorpos monoclonais. A seleção dos hibridomas foi obtida por cultivo deles em meio ASF104 (Ajinomoto) contendo HAT, 10% de soro de bezerro fetal e aminopterina.
[00556] A reatividade do anticorpo monoclonal de rato, no sobrenadante da cultura de cada hibridoma, a AILIM de camundongo foi determinada por reação do sobrenadante da cultura com as células CHO expressando a AILIM de camundongo acima mencionadas, e então medição da intensidade da fluorescência das células tingidas com antiIgG de rato marcada com FITC (Cappel) em um citômetro de fluxo EPICS-ELITE. O exame produziu hibridomas múltiplos produzindo anticorpo monoclonal tendo reatividade contra a AILIM de camundongo. [00557] Entre eles, uma linha de hibridoma foi chamada B10.5. As
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146/194 células deste hibridoma foram injetadas de forma intraperitoneal (106 a 107 células/0,5 ml/camundongo) em camundongos ICR nu/nu (fêmeas, 7 a 8 semanas de idade). 10 a 20 dias após a injeção, a ascite foi coletada de cada camundongo por laparotomia, sob anestesia, de acordo com um método comumente usado. O anticorpo monoclonal de rato anti-AILIM de camundongo B10.5 (IgG1) foi preparado a partir da ascite em uma grande escala.
<5 - 2 - 2> A reatividade do anticorpo às AILIMs humana, de camundongo e de rato [00558] As concentrações de anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana e de anticorpo de controle, a serem usadas no ELISA descrito abaixo, foram determinadas com base no ELISA e nas curvas de calibragem em <5 - 1> descrito acima.
[00559] Cada uma das células (7x103 células/cavidade) da célula CHO recombinante superexpressando a AILIM humana preparada no Exemplo 1, da célula CHO recombinante superexpressando a AILIM de camundongo preparada em <5 - 2 - 1 - 1> descrito acima, e da célula CHO recombinante superexpressando a AILIM de rato preparada em <5 - 2 - 1 - 2> descrito acima foi preparada em cavidades de microplacas de ELISA com 96 cavidades e cultivada até estar confluente, a 37°C.
[00560] Subseqüentemente, o sobrenadante foi descartado, e então qualquer um dos diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana, purificados, ou anticorpo de controle, preparados acima foi adicionado a cada cavidade (concentrações dos anticorpos: o anticorpo de 200 mg/ml foi diluído, com PBS contendo 1% de BSA, 3 vezes, 32 vezes, 33 vezes, 34 vezes, 35 vezes, 36 vezes, 37 vezes, 38 vezes, 39 vezes, 310 vezes, 311 vezes, e 312 vezes), em uma quantidade de 50 ml/cavidade, e as placas foram reagidas, à temperatura ambiente, por 2 horas. As soluções dos anticorpos monoclonais foram desPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 152/212
147/194 cartadas, e cada cavidade foi lavada 3 vezes com tampão fosfato contendo 1% de BSA (Sigma).
[00561] Subseqüentemente, o anticorpo anti-IgG (Fc) humana conjugado com peroxidase do rábano silvestre foi adicionado a cada cavidade (diluído 1.000 vezes, 50 ml/cavidade; American Qualex), e as placas foram incubadas à temperatura ambiente, por 1 hora.
[00562] A solução excedente do anticorpo marcado foi descartada e as microplacas foram lavadas 3 vezes com tampão fosfato contendo 1% de BSA. O tampão contendo substrato (composição: ortofenilenodiamina (O-fenilenodiamina, OPD; 20 mg)/tampão de citratofosfato (pH 5,0, 50 ml)/solução aquosa de 30% de peróxido de hidrogênio (15 ml)) foi adicionado a cada cavidade (100 ml/cavidade) e as placas foram incubadas à temperatura ambiente, por cerca de 7 minutos.
[00563] Subseqüentemente, o ácido sulfúrico a 2M foi adicionado a cada cavidade (50 ml/cavidade) para interromper a reação. A absorbância foi medida em um comprimento de onda de 490 nm, por utilização de uma leitora de microplacas (Bio-Rad).
[00564] O ensaio de controle de ELISA foi efetuado com os anticorpos de controle que se seguem, para avaliar os anticorpos acima mencionados no mesmo modo como descrito acima:
(1) Anticorpo monoclonal de camundongo SA12 ou SG430 contra a AILIM humana (JP-A 11-29599 (Exemplo 12) e WO98/38216 (Exemplo 12));
(2) Anticorpo monoclonal de rato B10.5 contra a AILIM de camundongo (<5 - 2 - 1 - 3> descrito acima);
(3) Anticorpo monoclonal de camundongo JTT2 contra a AILIM de rato (anticorpo monoclonal produzido por um hibridoma, o qual foi depositado internacionalmente em 11 de outubro de 1996, sob o número de acesso internacional FERM BP-5708, no The National
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Institute of Bioscience and Human-Technology, The Agency of Industrial Science and Technology, The Ministry of International Trade and
Industry), que é uma autoridade depositária internacional sob o Tratado de Budapeste; JP-A 11-29599 (Exemplos 1 e 2) e WO98/38216 (Exemplos 1 e 2)).
(4) O anticorpo monoclonal de ser humano acima preparado contra a KLH (hemocianina de lapa de buraco de fechadura, PIERCE), em vez do sobrenadante de hibridoma.
[00565] A experiência de controle por ELISA foi efetuada no mesmo modo como descrito acima, usando a célula CHO do tipo selvagem mostrada abaixo, em vez da célula CHO recombinante expressando a AILIM.
[00566] O resultado é mostrado nas Figuras 3 a 14.
[00567] Com base no resultado obtido, a concentração eficaz de 50% (ED50:ng/ml) foi calculada como um índice para a reatividade de cada anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana a AILIM humana (célula CHO recombinante superexpressando a AILIM humana), a AILIM de camundongo (células CHO recombinantes superexpressando a AILIM de camundongo), ou a AILIM de rato (célula CHO recombinante superexpressando a AILIM de rato). Os resultados obtidos pelo cálculo são mostrados abaixo.
(A) ED50 para CHO superexpressando a AILIM humana
AIF 34 (JMab-124) : 5,3 ng/ml
AIF182 (JMab-126) : 3,6 ng/ml
AIF348 (JMab-127) : 9,1 ng/ml
AIF620 (JMab-128) : : 10,1 ng/ml
AIF1052 (JMab-135) : 2,0 ng/ml
AIH5D3 (JMab-136) : 7,5 ng/ml
AIH386 (JMab-137) : 9,6 ng/ml
AII289 (JMab-138) : : 10,5 ng/ml
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AII394 (JMab-139) : 10,6 ng/ml
AII488 (JMab-140) : 11,0 ng/ml
AIJ 40 (JMab-141) : 3,7 ng/ml
SA 12: 1,8 ng/ml
SG430: 1,2 ng/ml (B) ED50 para CHO superexpressando a AILIM de camundongo
AIF 34 (JMab-124) : 42 ng/ml
AIF348 (JMab-127) : 81 ng/ml
AIF620 (JMab-128) : : 100 ng/ml
AII289 (JMab-138) : 53 ng/ml
AII394 (JMab-139) : 60 ng/ml
AII488 (JMab-140) : 70 ng/ml
(C) ED50 para CHO superexpressando a AILIM de rato AIF 34 (JMab-124) : 45 ng/ml
AIF348 (JMab-127) : 62 ng/ml
AIF620 (JMab-128) : 97 ng/ml
AII289 (JMab-138) : 57 ng/ml
AII394 (JMab-139) : 90 ng/ml
AII488 (JMab-140) : 90 ng/ml [00568] O resultado mostrou que os anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana da presente invenção exibiram especificidades significativamente altas para a AILIM humana.
[00569] Ademais, foi revelado que 6 tipos de anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana (mostrados acima em (B) e (C)) são reativos tanto a AILIM de camundongo quanto a AILIM de rato (capacidade de ligação, reatividade cruzada).
Exemplo 6 Determinação da afinidade e da atividade de neutralização do anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana contra o antígeno (AILIM humana)
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150/194 [00570] A constante de taxa de associação (ka), a constante de taxa de dissociação (kd) e a constante de dissociação (Kd) com relação à reação entre cada um dos diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana, purificados, preparados acima, e a AILIM humana foram determinadas usando um kit comercialmente disponível Biacore X (Amersham Pharmacia).
<6 - 1> Preparação do antígeno a ser imobilizado sobre chip sensor [00571] O antígeno a ser imobilizado sobre o chip sensor, no kit, foi preparado como um antígeno quimérico recombinante (daqui por diante referido como AILIM humana-IgFc), consistindo na região extracelular da AILIM humana e na região constante (Fc) da IgG1 humana. [00572] O AILIM humana-IgFc foi preparado por purificação adicional do antígeno obtido de acordo com o método descrito em pedidos anteriores (JP-A 11-29599 (Exemplo 16 (2)) e WO98/38216 (Exemplo 16 (2)) por um dos presentes inventores, Tezuka.
[00573] O sobrenadante da cultura de células recombinantes produzindo o AILIM humana-IgFc foi carregado para uma coluna HiTrap de Proteína G (coluna por afinidade HiTrap Proteína G; AmershamPharmacia), pré-equilibrada com tampão fosfato (30 ml), em uma vazão de 3 ml/min, para adsorver o AILIM humana-IgFc no sobrenadante da cultura sobre a coluna.
[00574] Subseqüentemente, a coluna foi lavada com tampão fosfato (20 ml), e então o tampão de 100 mM de citrato (pH 2,0) foi carregado para a coluna, em uma vazão de cerca de 1 ml/min, para eluir o AILIM humana-IgFc. Subseqüentemente, a solução eluída foi neutralizada com uma solução (pH 9,0) de 750 mM de Tris-HCl, e então dialisada contra tampão fosfato (durante a noite). Então, a solução dialisada foi filtrada através de um filtro (Millipore). O anti-AILIM humana-IgFc assim purificado foi obtido.
[00575] A concentração de proteína foi determinada a partir da abPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 156/212
151/194 sorbância a A280, medida por utilização de um fotoespectrômetro (1
A280 = 1 mg/ml). A concentração de AILIM humana-IgFc foi determinada ser 0,28 mg/ml.
[00576] A proteína quimérica purificada, consistindo na região extracelular de AILIM de rato e na região constante (Fc) da IgG1 humana (AILIM de rato-IgFc; JP-A 11-29599 (Exemplo 16 (2)) e WO98/38216 (Exemplo 16 (2)), foi também preparada de acordo com o mesmo modo como descrito acima. A concentração da AILIM de rato-IgFc obtida foi determinada ser 0,45 mg/ml.
<6 - 2> Determinação da afinidade e da atividade de neutralização [00577] Os procedimentos experimentais, exceto pela imobilização do antígeno (AILIM humana-IgFc) sobre o chip sensor, que é descrita abaixo, foram baseados no manual de instrução e no protocolo experimental anexados ao kit de ensaio comercialmente disponível Biacore X (Amersham-Pharmacia).
[00578] O tampão de HBS (contendo 0,01M de HEPES, 0,15M de NaCl, 3mM de EDTA e 0,005% de detergente P20, (pH 7,0)) foi deixado fluir através de uma Flow Cell-1 anexada ao kit, em uma vazão de 5 ml/min. Subseqüentemente, uma solução (15 ml) contendo 0,005M de NHS (N-hidroxissuccinimida) e 0,2M de EDC (N-etil-N'(dimetilaminopropil) carbodiimida) foi adicionada para ativar os grupos carboxila de CM revestida sobre a superfície do chip sensor.
[00579] Subseqüentemente, 23 ml de solução de AILIM humanaIgFc (10 mg/ml; dissolvida em tampão de 10 mM de acetato de sódio (pH 5,0)) foram adicionados para imobilizar o AILIM humana-IgFc sobre o chip sensor. Subseqüentemente, os grupos carboxila ativados não-reagidos foram bloqueados por adição de 35 ml de cloridrato de etanolamina a 1M. As quantidades de AILIM humana-IgFc imobilizado pelo tratamento de imobilização efetuado duas vezes foram 2.444 RU (unidade de ressonância) e 2.213 RU, respectivamente. A unidade,
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RU, corresponde à massa por área da unidade; 1 RU = 1 pg/mm2.
[00580] A Flow Cell-2, que é uma célula de fluxo de referência, foi submetida ao tratamento de capeamento, na ausência de AILIM humana-IgFc, no mesmo modo como descrito acima.
[00581] O tampão fosfato foi deixado fluir através da célula de fluxo (chip sensor), em uma vazão de 20 ml/min, e cada um dos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana purificados, os quais foram preparados no Exemplo acima descrito, foi adicionado ao mesmo (10 a 50 mg/ml, 60 ml).
[00582] A condição padrão para a medição foi: fase de associação por 3 minutos e fase de dissociação por 10 minutos. As quantidades respectivas de anticorpo ligado ao, e liberado do, antígeno foram monitoradas com o tempo, para obter um sensorgrama. A dissociação do anticorpo do antígeno foi obtida correndo-se o PBS através do chip sensor em uma vazão de 20 ml/min.
[00583] Com base nos dados resultantes do sensorgrama, a constante de taxa de associação (ka), a constante de taxa de dissociação (kd) e a constante de dissociação (Kd; Kd = kd/ka) foram computadas por utilização do software analítico (BIAevaluation 3.0) anexado ao kit. [00584] A afinidade e a atividade de neutralização dos anticorpos monoclonais de camundongos SA12 e SG430 a AILIM humana preparada no Exemplo descrito acima foram também analisadas no mesmo modo como descrito acima.
[00585] Os valores respectivos obtidos são mostrados abaixo.
<nome do clone> <ka (1/M.Seg)> <kd[1/Seg]> <Kd (M)>
AIF 34 (JMab-124) 1,6x104 1,0x10-4 6,3x10-9
AIF182 (JMab-126) 3,2x104 2,8x10-5 8,8x10-10
AIF348 (JMab-127) 1,9x104 6,4x10-5 3,4x10-9
AIF620 (JMab-128) 1,1x104 1,1x10-4 1,0x10-8
AIF1052 (JMab-135) 1,6x104 6,3x10-5 3,9x10-9
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AIH5D3 (JMab-136) 2,8x104 4,9x10-6 1,8x10-10
AIH386 (JMab-137) 1,2x105 3,1x10-4 2,6x10-9
AII289 (JMab-138) 3,7x104 4,2x10-5 1,1x10-9
AII394 (JMab-139) 3,1x104 2,4x10-5 7,7x10-10
AII488 (JMab-140) 2,3x104 3,5x10-5 1,5x10-9
AIJ 40 (JMab-141) 1,9x104 1,9x10-5 1,0x10-9
SA 12 7,8x103 7,9x10-5 1,0x10-8
SG430 2,2x104 1,5x10-4 6,8x10-9
[00586] O resultado mostra que todos os anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana e os anticorpos monoclonais de camundongo anti-AILIM humana exibem uma afinidade de ligação e uma atividade de neutralização marcadamente altas a AILIM humana. Exemplo 7 Atividade do anticorpo monoclonal de ser humano antiAILIM humana de transdução de sinal coestimulador em célula T humana [00587] Foi analisado se os anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana, de acordo com a presente invenção, tinham ou não a capacidade de controlar (aumentar e/ou inibir) as respostas de células T humanas (produção de citocinas, tais como o IFN-γ e a IL-4, proliferação de células, etc.), em outras palavras, se os anticorpos exibiam ou não atividade reguladora sobre a transdução celular de sinal coestimulador mediado por AILIM. A análise foi efetuada com base na quantidade de citocinas (IFN-γ e IL-4) produzidas em células T humanas, bem como no grau de proliferação de células T humanas como um índice.
<7 - 1> Diluição do anticorpo [00588] O anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano OKT3 (ATCC CRL-8001) foi diluído com tampão fosfato (PBS) até uma concentração final de 8 mg/ml.
[00589] Cada um dos diversos anticorpos monoclonais de seres
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154/194 humanos anti-AILIM humana, preparados acima, foi diluído com PBS até uma concentração final de 40 mg/ml. As soluções de anticorpos foram adicionalmente diluídas com PBS, para preparar diversas concentrações de anticorpos (40 mg/ml - 0,0049 mg/ml).
<7 - 2> Revestimento da microplaca com anticorpo [00590] Cada cavidade de microplacas com 96 cavidades foi revestida com (1) anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano OKT3 (8 mg/ml; 25 ml para cada cavidade) e qualquer um dos diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana (40 mg/ml 0,0049 mg/ml; 25 ml para cada cavidade), ou (2) anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano OKT3 (8 mg/ml; 25 ml para cada cavidade) sozinho. As placas foram incubadas a 37°C, por 2 hora s. Subseqüentemente, as soluções de anticorpos foram descartadas, e cada cavidade foi lavada 3 vezes com PBS. Após a lavagem, o meio RPMI1640 contendo 10% de FCS foi adicionado a cada cavidade (100 ml/cavidade), e as placas foram incubadas a 37°C, por 1 hora. Desse modo, as cavidades respectivas das placas foram revestidas com os anticorpos mencionados acima em (1) ou (2).
[00591] As experiências de controle foram realizadas no mesmo modo, por utilização de placas revestidas com os anticorpos monoclonais respectivos que se seguem como os anticorpos de controle, em vez dos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana.
(1) Anticorpo monoclonal de camundongo SA12 ou SG430 contra a AILIM humana (JP-A 11-29599 (Exemplo 12) e WO98/38216 (Exemplo 12));
(2) Anticorpo monoclonal de camundongo anti-CETP humana JHC1 (também referido como JMab109; JP-A 9-20800); e (3) Anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH (também referido como JMab23; o Exemplo acima mencionado).
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155/194 [00592] As microplacas revestidas com os anticorpos foram usadas nos ensaios que se seguem.
<7 - 3> Preparação da suspensão de células T humanas [00593] O sangue periférico foi coletado de cada uma das pessoas saudáveis normais (5 pessoas; doadores A, B, C, D e E). A fração contendo células mononucleares foi preparada por centrifugação com gradiente de densidade usando o LymphoPrep (Nycomed). As células T humanas foram separadas da fração de células mononucleares humanas de acordo com o manual para o procedimento experimental, por utilização de um Kit de Isolamento de células Pan-T (Miltenyi) e Classificador Magnético. A contagem de células T foi determinada usando um hemocitômetro. As células T humanas foram suspensas em meio RPMI1640 contendo 10% de FCS, para preparar a suspensão de células T humanas (1x106 células/ml).
<7 - 4> Cultura de células (1) Cultura usando microplaca revestida com anticorpo anti-CD3 humano e anticorpo anti-AILIM humana [00594] A suspensão de células T humanas (doador A, B, C, D ou E; 100 ml/cavidade; 1x105 células/cavidade) foi adicionada a cada cavidade da microplaca revestida com o anticorpo mencionado acima e a placa foi incubada a 37°C, por 3 dias, em uma incub adora de CO2. [00595] Após o cultivo, as alíquotas dos sobrenadantes resultantes da cultura (50 ml) foram armazenadas a -20°C e então usadas no ensaio descrito posteriormente (ensaio para o IFNg). Após a amostragem das alíquotas dos sobrenadantes da cultura, as microplacas respectivas foram usadas para o ensaio que se segue:
(2) Cultura usando microplaca revestida com anticorpo anti-CD3 humano sozinho [00596] A suspensão de células T humanas (doador D; 100 ml/cavidade; 1x105 células/cavidade) foi adicionada a cada cavidade
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156/194 das microplacas revestidas com o anticorpo acima mencionado, e então qualquer um dos diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana foi adicionado à mesma (25 ml do anticorpo de mg/ml - 0,0049 mg/ml). As placas foram incubadas a 37°C, por 3 dias, em uma incubadora de CO2.
<7 - 5> Determinação da atividade de proliferação da célula T [00597] A metil [3H] timidina (0,5 mCi/cavidade; AmershamPharmacia) foi adicionada a cada cavidade das placas após a incubação, e as placas foram incubadas a 37°C, por 6 hora s, em uma incubadora de CO2. Após a incubação, as células foram capturadas sobre filtros GF/C (Packard), usando o Coletor de Células. Subseqüentemente, os filtros foram secos a 40°C, por 3 horas ou m ais, e então o Microscinti 0 (20 ml/cavidade; Packard) foi adicionado aos mesmos. A radioatividade do 3H incorporado das células capturadas sobre os filtros foi medida por um contador β (TOP COUNT) para analisar o grau de proliferação de células T após o cultivo.
[00598] Os resultados são mostrados nas Figuras 15 a 39.
[00599] O resultado deste ensaio mostrou que as células T humanas foram significativamente proliferadas, dependendo da concentração das células, quando as microplacas foram revestidas com o anticorpo monoclonal anti-AILIM humana (anticorpo monoclonal de ser humano ou anticorpo monoclonal de camundongo) juntamente com o anticorpo anti-CD3 humano. Ademais, houve algumas diferenças no grau de proliferação celular entre os doadores.
[00600] Por outro lado, as células T humanas não se desenvolveram significativamente quando as placas foram revestidas com o anticorpo anti-CD3 humano sozinho e o anticorpo monoclonal anti-AILIM humana (anticorpo monoclonal de ser humano ou anticorpo monoclonal de camundongo), em solução (fase líquida), foi usado durante o cultivo das células.
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157/194 <7 - 6> Quantificação do IFNg em sobrenadante da cultura de célula T [00601] Para as culturas respectivas de células T (doadores B e C) descritas em (1) de <7 - 4>, as quantidades de IFNg nos sobrenadantes das culturas foram determinadas por um KIT de ELISA de IFNg humano comercialmente disponível (Amersham-Pharmacia; Endogen). [00602] Os resultados são mostrados nas Figuras 40 a 47.
[00603] O resultado deste ensaio mostrou que a produção de IFNg aumentou significativamente, dependendo da concentração de anticorpo monoclonal anti-AILIM humana (anticorpo monoclonal de ser humano ou anticorpo monoclonal de camundongo).
Exemplo 8 Atividade reguladora do anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana sobre a reação de linfócitos mistos (MLR) [00604] Foi testado se os anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana da presente invenção eram capazes ou não de controlar (aumentar e/ou inibir) as respostas das células T (produção de citocinas, tais como o IFN-γ e a IL-4, proliferação das células, etc.), em outras palavras, capazes de regular a transdução de sinal coestimulador mediado por AILIM para as células, por análise da atividade (a saber, a síntese de DNA nas células) de controlar a proliferação de células T associada com a reação de linfócitos mistos alogênicos (MLR alogênicos) como um índice.
<8 - 1> Preparação de PBMC e célula T humanas [00605] O sangue periférico (200 ml) coletado de cada uma das pessoas saudáveis normais (7 pessoas; doadores A, B, C, D, E, F e G) foi distribuído sobre as camadas de Lymphoprep (15 ml; Nycomed) em microtubos (50 ml; Falcon). Após a centrifugação (a 1600 rpm, por 10 minutos), as camadas intermediárias foram recuperadas. As células recuperadas foram diluídas 2 vezes ou mais com o tampão fosfato, e então centrifugadas (a 1.800 rpm, por 10 minutos). Assim, a PBMC (célula mononuclear sangüínea periférica; 2x108 - 5x108 células) foi
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158/194 preparada. A contagem de células foi determinada por utilização de um hemocitômetro. Uma alíquota das células a serem usadas no ensaio de MLR (1,08 x 108 células /9 microplacas) foi tirada e mantida sobre gelo. As células restantes foram usadas para a separação das células T descrita abaixo.
[00606] O kit de Isolamento PanT (Miltenyi Biotech) foi usado para a separação das células T da PBMC. De acordo com o manual anexado ao kit, as PBMCs restantes foram adicionadas à solução anexada ao kit, e a solução foi incubada. Subseqüentemente, as células foram lavadas com PBS contendo 5 mM de EDTA e 0,5% de BSA e então suspensas novamente em PBS. Subseqüentemente, a suspensão de células foi adicionada a uma Coluna de Seleção Positiva VS+ (Miltenyi Biotech) intumescida com PBS, e a fração não-adsorvida foi recuperada. Ademais, o PBS foi carregado para a coluna, e a solução de lavagem foi recuperada. O mesmo tratamento foi repetido uma vez. As soluções recuperadas foram combinadas juntas para dar uma fração de células T. Após a centrifugação da fração de células T, as células foram suspensas novamente em PBS. A contagem celular das células T resultantes foi determinada por utilização de um hemocitômetro. As células foram usadas no ensaio seguinte.
<8 - 2> Reação de linfócitos mistos (MLR) [00607] Conforme descrito acima, duas vias de sinalização, uma entre CD28 e CD80 (B7-1)/CD86 (B7-2) e a outra entre CTLA4 e CD80 (B7-1)/CD86 (B7-2), para as quais foi feita anteriormente uma análise comparativamente detalhada, são conhecidas como vias de sinalização coestimuladoras, requeridas para a ativação dos linfócitos, tais como a célula T, etc.
[00608] A saber, a proliferação da célula T em resposta à reação de linfócitos mistos (MLR) pode ser induzida pela transdução de sinal através de cada uma das duas vias conhecidas.
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159/194 [00609] Assim, por utilização das substâncias indicadas abaixo, o teste desta invenção foi conduzido para analisar (1) a inibição da MLR por bloqueio da via de sinalização mediada por CTLA4; (2) a inibição da MLR por bloqueio da via de sinalização mediada por CD80 (B71)/CD86 (B7-2); (3) a inibição da MLR por bloqueio tanto da via mediada por CTLA4 quanto da via de sinalização mediada por CD80 (B71)/CD86 (B7-2); (4) a inibição da MLR por bloqueio da via de sinalização terciária associada com a AILIM; e (5) a inibição da MLR por bloqueio tanto da via mediada por CTLA4 quanto da via mediada por AILIM.
[00610] As seguintes substâncias de teste foram usadas.
(1) Anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana (preparado no Exemplo descrito acima);
(2) Anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana SA12 (o mesmo como no Exemplo acima descrito);
(3) Anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH (controle negativo; o mesmo como no Exemplo acima descrito);
(4) Anticorpo IgG de camundongo (anti-CD34 humana; controle negativo; Immunotech);
(5) Uma mistura de anticorpo monoclonal anti-CD80 humana (Pharmingen) e anticorpo monoclonal anti-CD86 humana (Pharmingen); e (6) Molécula de quimera CTLA4-IgFC humana (Ancell). [00611] A reação de linfócitos mistos (MLR) foi conduzida nas seguintes 6 combinações, usando as PBMCs e as células T preparadas a partir dos doadores descritos acima em <8 - 1>.
(i) célula T (doador A) /PBMC (doador D) (ii) célula T (doador D) /PBMC (doador B) (iii) célula T (doador C) /PBMC (doador A) (iv) célula T (doador E) /PBMC (doador G)
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160/194 (v) célula T (doador F) /PBMC (doador E) (vi) célula T (doador G) /PBMC (doador F) [00612] As concentrações de PBMCs e células T a serem usadas no teste foram ajustadas conforme descrito abaixo.
[00613] As PBMCs foram suspensas em PBS, e então transferidas para placas de cultura (60 mm). As células foram submetidas à irradiação por raios X (50 Gy) com um irradiador (Hitachi MEDICO). As células foram recuperadas, centrifugadas e então adicionadas ao meio PRMI1640 contendo 10% de FCS. A contagem celular foi ajustada para 2x105 células/50 ml.
[00614] As células T resultantes de cada doador foram também adicionadas ao meio PRMI1640 contendo 10% de FCS e a contagem celular foi ajustada para 1x105 células/50 ml.
<8 - 2 - 1> Inibição da MLR pelo anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana [00615] O meio PRMI1640 contendo 10% de FCS foi adicionado a cada cavidade de uma microplaca com 96 cavidades tendo cavidades no formato de U. Uma solução de anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana ou de anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana SA12 foi diluída com meio PRMI1640 contendo 10% de FCS, para preparar soluções com concentrações diversas do anticorpo. As soluções diluídas de anticorpos foram adicionadas às cavidades (concentração final: 0, 0,31, 1,25, 5 e 20 mg/ml). Subseqüentemente, as células T (50 ml) foram adicionadas às cavidades. A placa foi incubada a 37°C, por 1 hora, em uma incubadora de CO2 (NAPCO). Após a reação estar completada, as PBMCs (50 ml) derivadas de um doador diferente foram adicionadas às cavidades para iniciar a MLR.
[00616] Quando a MLR foi conduzida usando um anticorpo diferente do anticorpo de ser humano anti-AILIM humana (descrito acima em
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161/194 (3) a (6)) como a substância de teste, as células T derivadas de um doador diferente foram deixadas reagir após a incubação das PBMCs com a substância de teste.
[00617] No quinto dia da cultura, a timidina marcada com trítio (3HTimidina; 20 ml; 1 mCi/cavidade), diluída com meio PRMI1640 contendo 10% de FCS, foi adicionada a cada cavidade. O cultivo foi continuado por um dia. Após a cultura estar completa, as células foram coletadas usando um Coletor de Células (Packard). A radioatividade de 3H incorporado das células foi medida em um contador β (TOP COUNT; Packard) para analisar a taxa de proliferação de células T após a cultura.
[00618] Os resultados são mostrados nas Figuras 48 a 59.
<8 - 2 - 2> Inibição da MLR pelo anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana no sistema de MLR, onde a via de sinalização mediada por CTLA4 tinha sido bloqueada previamente [00619] O meio PRMI1640 contendo 10% de FCS foi adicionado a cada cavidade de uma microplaca com 96 cavidades, tendo cavidades no formato de U. Uma solução de anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana ou de anticorpo monoclonal de camundongo anti-AILIM humana SA12 foi diluída com o meio PRMI1640 contendo 10% de FCS, para preparar soluções com concentrações variadas do anticorpo. As soluções diluídas de anticorpos foram adicionadas às cavidades (concentração final: 0, 0,31, 1,25, 5 e 20 mg/ml). Subseqüentemente, as células T (50 ml) foram adicionadas às cavidades. A placa foi incubada a 37°C, por 1 hora, em uma incub adora de CO2 (NAPCO).
[00620] Além da cultura das células T, as PBMCs (em meio
RPMI1640 contendo 10% de FCS) derivadas de outros doadores foram cultivadas independentemente após a adição de CTLA4-IgFc humana às PBMCs. O cultivo foi efetuado a 37°C, por 1 hora, em uma
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162/194 incubadora de CO2 (NAPCO). A concentração de CTLA4-IgFc foi ajustada para 20 mg/ml no início da MLR.
[00621] Subseqüentemente, as PBMCs (50 ml) foram adicionadas à cultura de células T descrita acima, para iniciar a MLR.
[00622] Quando a MLR foi conduzida usando um anticorpo diferente do anticorpo de ser humano anti-AILIM humana (descrito acima em (3) a (5)) como a substância de teste, as células T derivadas de um doador diferente foram deixadas reagir após a incubação das PBMCs, as quais tinham sido cultivadas na presença de CTLA4-IgFc, com a substância de teste.
[00623] No quinto dia da cultura, a timidina marcada com trítio (3HTimidina; 20 ml; 1 mCi/cavidade), diluída com meio PRMI1640 contendo 10% de FCS, foi adicionada a cada cavidade. O cultivo foi continuado por um dia. Após a cultura estar completa, as células foram coletadas por utilização de um Coletor de Células (Packard). A radioatividade de 3H incorporado das células foi medida em um contador β (TOP COUNT; Packard) para analisar a taxa de proliferação de células T após a cultura.
[00624] Os resultados são mostrados nas Figuras 60 a 69.
[00625] Os resultados obtidos dos dois testes descritos acima são resumidos como se segue:
(1) A CTLA4-IgFc bloqueia a transdução de sinal mediada por CTLA-4, e desse modo inibindo a proliferação de célula T induzida por MLR alogênicos.
(2) O anticorpo anti-CD80 e o anticorpo anti-CD86 inibem a transdução de sinal mediada por CD80/CD86, que é um ligando para CTLA4 e CD28, e desse modo inibindo a proliferação de célula T induzida por MLR alogênicos.
(3) Um anticorpo monoclonal contra a AILIM humana, como a CTLA4-IgFc, o anticorpo anti-CD80 e o anticorpo anti-CD86, signifiPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 168/212
163/194 cativamente inibe a proliferação de célula T induzida por MLR alogênicos, associada com a transdução de sinal mediada por AILIM, em um modo dependente da concentração do anticorpo.
[00626] Em outras palavras, estes resultados mostram que uma via terciária mediada por AILIM e o seu ligando, além das vias conhecidas mediadas por CTLA4/CD80/CD86 e mediadas por CD28/CD80/CD86, existe como uma via de sinalização coestimuladora, requerida para a ativação da célula T, bem como que a via de sinalização mediada por AILIM é inibida pelo anticorpo contra a AILIM.
[00627] Além disso, faz surgir a possibilidade de que a contribuição da via mediada por AILIM para a transdução de sinal pode ser comparável àquelas da via mediada por CTLA4/CD80/CD86 e da via mediada por CD28/CD80/CD86.
Exemplo 9 Atividade do anticorpo monoclonal de ser humano antiAILIM humana de induzir a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) [00628] As atividades biológicas causadas pelos anticorpos incluem a indução de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). A ADCC é uma ação citotóxica que requer o anticorpo, além das células efetoras e das células-alvo, que induz o dano sobre as células-alvo induzidas pelas células efetoras, tais como o linfócito, o macrófago ou a leucócito polimorfonuclear.
[00629] A atividade do anticorpo monoclonal anti-AILIM humana da presente invenção de induzir a ADCC foi analisada como se segue: [00630] O 51Cr (0,1 mCi/106 células; Amersham-Pharmacia) foi adicionado à cultura de células HPB-ALL recombinantes superexpressando a AILIM humana, preparadas no Exemplo descrito acima, e a mistura foi incubada a 37°C, por 2 horas. As células foram lavadas 8 vezes com meio RPMI1640. As células marcadas com o isótopo obtidas foram usadas como as células-alvo.
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164/194 [00631] As experiências de controle foram efetuadas usando as células HPB-ALL humanas do tipo selvagem, marcadas com o isótopo, como as células de controle no mesmo modo como descrito acima. [00632] Por utilização de Lymphosepar I (IBL), as frações de PBMC foram separadas do sangue periférico coletado de pessoas saudáveis normais. As PBMCs humanas resultantes foram usadas como células efetoras.
[00633] As células-alvo (1x104 células/cavidade; 25 ml/cavidade) foram preparadas sobre cada cavidade de uma microplaca com 96 cavidades (Nunc) tendo cavidades no formato de U. Subseqüentemente, qualquer uma de diversas concentrações de anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana, diluídos com meio RPMI1640 contendo 5% de FBS (0,0001-1,0 mg/ml; 25 ml/cavidade), do meio sozinho (25 ml/cavidade) ou de 1% de Nonidet P-40 (25 ml/cavidade; detergente tendo atividade de lise de célula) foi adicionada a cada cavidade e a placa foi incubada à temperatura ambiente, por 20 minutos.
[00634] O cultivo foi realizado usando o anticorpo monoclonal antiCD3 de ser humano OKT3 (ATCC CRL-8001) como um anticorpo de controle positivo, em vez do anticorpo anti-AILIM humana, no mesmo modo como descrito acima.
[00635] Subseqüentemente, as células efetoras (razão de E/T = 50; 1x105 células/cavidade; 50 ml/cavidade) foram adicionadas a cada cavidade e a placa foi incubada a 37°C, por 16 horas, sob uma atmosfera de 5% de CO2, em uma incubadora.
[00636] Após o cultivo, as amostras foram centrifugadas (em 1.500 rpm, a 4 °C, por 10 minutos). O sobrenadante resultante foi recuperado. A radioatividade no sobrenadante centrífugo foi medida por um contador g. A radioatividade representa a quantidade de 51Cr liberado das células para o sobrenadante da cultura pelo dano da membrana celular pela ADCC.
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165/194 [00637] A porcentagem de dano da membrana celular (porcentagem de lise da célula), o qual foi causado por ADCC induzida por anticorpo anti-AILIM ou anticorpo anti-CD3, foi determinada sob uma pressuposição de que a radioatividade observada com o meio sozinho corresponde a 0% com relação ao dano da membrana celular (0) e de que com o Nonidet corresponde a 100% com relação ao dano da membrana celular.
[00638] Os resultados são mostrados nas Figuras 70 e 71.
[00639] O resultado do teste mostrou que o anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana da presente invenção exibiu uma atividade indutora de ADCC em um modo dependente da concentração.
Exemplo 10 Determinação do gene e das seqüências de aminoácidos do anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana e análise dos mesmos [00640] As seqüências de cDNAs codificando as cadeias pesadas, bem como de cDNAs codificando as cadeias leves de diversos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana, os quais foram preparados no Exemplo descrito acima, foram determinadas como descrito abaixo. As características estruturais dos genes foram também analisadas.
[00641] Por utilização do Kit de Purificação de mRNA Quick Prep (Amersham-Pharmacia), os PoliA+RNAs foram extraídos e purificados de cada um dos hibridomas (clones: AIH5D3 (JMab-136), AII289 (JMab-138) e AII394 (JMab-139)), que produzem o anticorpo monoclonal de ser humano contra a AILIM humana preparado no Exemplo descrito acima.
[00642] As células de hibridomas foram suspensas em um tampão de lise de célula (Tampão de Lise), e lisadas por utilização de uma seringa para solubilizá-las. A resina de Oligo (dT) foi adicionada ao matePetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 171/212
166/194 rial solubilizado e a mistura foi agitada suavemente. Subseqüentemente, a resina de Oligo (dT) foi lavada, e então o PoliA+RNA foi eluído com o Tampão de Eluição. O PoliA+RNA eluído foi precipitado com etanol, e então dissolvido em tampão de Tris-EDTA. A concentração de PoliA+RNA obtido foi determinada por absorbância em um comprimento de ondas de 260 nm.
[00643] O cDNA de fita dupla foi sintetizado por utilização de PoliA+RNA como um molde, de acordo com o método de Transcritase Reversa M-MLV, usando um kit de síntese de cDNA comercialmente disponível (GIBCOBRL) e oligo DNA NotI-T sintético (SEQ ID NO: 1) como um iniciador.
[00644] Especificamente, o cDNA de fita simples foi sintetizado em uma solução (cerca de 50 ml) contendo PoliA+RNA (cerca de 5 mg) purificado dos hibridomas como um molde, o iniciador (cerca de 400 pmoles) e a Transcritase Reversa M-MLV, a 37°C, por 1 hora. Subseqüentemente, o dNTP, a DNA polimerase I, a RNaseH, a DNA ligase, o tampão e a água destilada foram adicionados à solução de reação (4 ml), e a mistura foi incubada a 16°C, por 2 horas, para sintetizar o cDNA de fita dupla. O cDNA de fita dupla resultante foi extraído com fenol/clorofórmio e então precipitado com etanol.
[00645] Subseqüentemente, o DNA ligador de EcoRI (cerca de 300 pmoles) e a DNA ligase (Alta Ligação; 33 ml; TOYOBO) foram adicionados à solução contendo o cDNA de fita dupla em tampão de TE (cerca de 50 ml) e a mistura foi incubada a 16°C, por cerca de 80 minutos, para ligar o cDNA com o DNA ligador. O DNA ligador usado era um DNA de fita dupla consistindo em oligo DNA (20adp; SEQ ID NO: 2) e oligo DNA (24adp; SEQ ID NO: 3), os quais tinham sido fosforilados em 5' e anelados um ao outro por um método comumente usado. [00646] O ligado de DNA foi extraído com fenol/clorofórmio, e então precipitado com etanol. Subseqüentemente, o reagente de DNA foi
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167/194 digerido com uma enzima de restrição comercialmente disponível Notl (TOYOBO), e então incubado com uma solução de ATP comercialmente disponível (GIBCO BRL) e a T4 cinase (TOYOBO), a 37°C, por minutos, para fosforilar a sua extremidade 5'.
[00647] O DNA resultante foi precipitado com etanol, e então fracionado por eletroforese em gel de poliacrilamida. Um pedaço de gel contendo DNA de cerca de 500 bp a 2000 bp foi cortado fora. O corte do gel foi realizado ao mesmo tempo que o DNA tingido com o brometo de etídio estava sendo visualizado por irradiação de luz UV em um dispositivo fotográfico.
[00648] O corte de gel foi triturado e então suspenso em tampão de TE. A suspensão foi centrifugada e o sobrenadante resultante foi recuperado.
[00649] O DNA recuperado foi ligado a um vetor de fago lambda comercialmente disponível lEXcell (0,25 mg; Amersham Pharmacia), na presença de DNA Ligase comercialmente disponível (Alta Ligação; TOYOBO) (a 16°C, por 30 minutos). Na etapa seguinte , o ligado de DNA foi acondicionado no fago lambda usando um kit de acondicionamento de fago lambda comercialmente disponível Gigapack III Gold (STRATAGENE) e as partículas resultantes de fago foram infectadas à E. coli NM522 como um hospedeiro, para preparar uma biblioteca de cDNA. Todas as manipulações foram realizadas de acordo com o protocolo experimental anexado ao kit.
[00650] Subseqüentemente, a biblioteca de cDNA foi examinada por um método de hibridização em placa (Maniatis et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova York) como se segue.
[00651] A biblioteca de cDNA (1x104 placas) foi preparada sobre placas de ágar e os seus filtros em réplica foram preparados usando as membranas de náilon Hybond-N (Amersham Pharmacia). Estes filPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 173/212
168/194 tros em réplica foram submetidos ao tratamento de hibridização usando sondas marcadas por utilização de g32P-ATP em um tampão de hibridização, de acordo com o método de hibridização em placa. As sondas usadas eram HIGLC (SEQ ID NO: 4) para a cadeia leve do anticorpo e NHCc2 (SEQ ID NO: 5) para a cadeia pesada do anticorpo. O isolamento em placa única foi realizado a partir dos clones positivos obtidos no exame primário e no exame secundário.
[00652] Cada uma da cadeia pesada e da cadeia leve do anticorpo foi amplificada por PCR, usando um iniciador único de PCR e o kit de PCR Taq (TAKARA), por utilização de suspensão de fago a partir de cada clone positivo como um DNA de molde. Um par de iniciadores usado para a cadeia leve do anticorpo foi o ExcellE (SEQ ID NO: 6) e o ck117 (SEQ ID NO: 7), e um par de iniciadores usados para a cadeia pesada do anticorpo foi o ExcellE (SEQ ID NO: 6) e o NHCc2 (SEQ ID NO: 5). Os produtos resultantes da PCR foram fracionados de acordo com um método usual, utilizando a eletroforese em gel de agarose. Os pedaços de gel contendo os DNAs de cerca de 600 bp correspondendo à cadeia pesada e à cadeia leve foram cortados fora. As seqüências de nucleotídeos dos DNAs purificados do gel foram analisadas por utilização de um Seqüenciador de DNA (373A; PE-Applied Biosystems), o Software de Seqüenciamento ABI PRISM (PE-Applied Biosystems) e o Auto Agrupador ABI PRISM (PE-Applied Biosystems). O DNA de cada clone positivo foi verificado ter comprimento suficiente de seqüência de nucleotídeos.
[00653] O fago λ da placa de cada clone positivo foi infectado à E. coli NP66 para a excisão in vivo do DNA de plasmídeo de interesse, e os fagos filamentosos resultantes foram preparados sobre placas contendo ampicilina para dar as colônias. Subseqüentemente, os DNAs de plasmídeos foram recuperados e purificados das colônias por um método comumente usado, e a E. coli JM109 foi transformada com os
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169/194 plasmídeos. Subseqüentemente, as células transformadas foram preparadas sobre placas de ágar de nutrientes contendo ampicilina para formar as colônias.
[00654] Subseqüentemente, a suspensão bacteriana, em meio LB contendo ampicilina derivado de cada colônia, foi transferida para um meio líquido de nutrientes e as bactérias foram cultivadas a 37°C, por 24 horas. As bactérias foram coletadas da cultura, e então o DNA de plasmídeo foi purificado por um kit de purificação de plasmídeo (Quiagen). Cada um dos DNAs de plasmídeos foi digerido com as enzimas de restrição EcoRI/NotI, para verificar a presença de DNA de vetor e DNA de inserto (cDNA de cadeia pesada ou cDNA de cadeia leve). [00655] Cada seqüência de nucleotídeos de cDNA codificando a cadeia pesada e a cadeia leve do anticorpo, que foi inserido em cada plasmídeo purificado, foi determinada por um método comumente usado, utilizando o Seqüenciador de DNA (37/A; PE-Applied Biosystems), o Software de Seqüenciamento ABI PRISM (PE-Applied Biosystems) e o Auto Agrupador ABI PRISM (PE-Applied Biosystems).
[00656] Os iniciadores usados para a determinação da seqüência eram como se seguem:
<Iniciadores usados para a determinação do cDNA de cadeia pesada> [00657] Iniciador M13R (SEQ ID NO: 8; STRATAGENE), ExcellE (SEQ ID NO: 6), 136 H (SEQ ID NO: 9), 138/9H (SEQ ID NO: 10), AILIMHC1 (SEQ ID NO: 11), HCc1 (SEQ ID NO: 12), NHCc2 (SEQ ID NO: 5), HCc7 (SEQ ID NO: 13), HCc8 (SEQ ID NO: 14), HCc3 (SEQ ID NO: 15), HCc4 (SEQ ID NO: 16), HCc6 (SEQ ID NO: 17), HIGHC (SEQ ID NO: 18), HCc9 (SEQ ID NO: 19), HCc5 (SEQ ID NO: 20) e poliA (SEQ ID NO: 21).
<Iniciadores usados para a determinação do cDNA de cadeia leve>
[00658] Iniciador M13R (SEQ ID NO: 8; STRATAGENE), ExcellE (SEQ ID NO: 6), AILIMLC1 (SEQ ID NO: 22), AILIMLC2 (SEQ ID NO:
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170/194
23), LCc1 (SEQ ID NO: 24), ck117 (SEQ ID NO: 7), HIGLC (SEQ ID
NO: 4), LCc2 (SEQ ID NO: 25), HIK (SEQ ID NO: 26), e poliA (SEQ ID
NO: 21).
[00659] A Listagem de Seqüência mostrada abaixo contém a seqüência de cDNA codificando a cadeia pesada e a seqüência de cDNA codificando a cadeia leve do anticorpo monoclonal contra a AILIM humana, que são produzidas por cada hibridoma mencionado acima, bem como as seqüências de aminoácidos deduzidas a partir das seqüências de cDNA.
Clone AIH5D3 (JMab-136) <Cadeia Pesada>
[00660] Seqüência de DNA: SEQ ID NO: 27 (seqüência de sinal: nucleotídeo número 69 a 125, região V: nucleotídeo número 126 a 419) <Cadeia Leve>
[00661] Seqüência de DNA: SEQ ID NO: 29 (seqüência de sinal: nucleotídeo número 39 a 104, região V: nucleotídeo número 105 a 386) [00662] Seqüência de aminoácidos: SEQ ID NO: 30 (compreendendo a seqüência de sinal: aminoácido número 1 a 22, a região variável: aminoácido número 23 a 116)
Clone AII289 (JMab-138) <Cadeia Pesada>
[00663] Seqüência de DNA: SEQ ID NO: 31 (compreendendo a seqüência de sinal: nucleotídeo número 94 a 150, a região V: nucleotídeo número 151 a 441) [00664] Seqüência de aminoácidos: SEQ ID NO: 32 (compreendendo a seqüência de sinal: aminoácido número 1 a 19, a região variável:
aminoácido número 20 a 116) <Cadeia Leve>
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171/194 [00665] Seqüência de DNA: SEQ ID NO: 33 (compreendendo a seqüência de sinal: nucleotídeo número 28 a 87, região V: nucleotídeo número 88 a 375) [00666] Seqüência de aminoácidos: SEQ ID NO: 34 (compreendendo a seqüência de sinal: aminoácido número 1 a 20, a região variável: aminoácido número 21 a 116)
Clone AII394 (JMab-139) <Cadeia Pesada>
[00667] Seqüência de DNA: SEQ ID NO: 35 (seqüência de sinal: nucleotídeo número 96 a 152, região V: nucleotídeo número 153 a 443) [00668] Seqüência de aminoácidos: SEQ ID NO: 36 (compreendendo a seqüência de sinal: aminoácido número 1 a 19, a região variável: aminoácido número 20 a 116) <Cadeia Leve>
[00669] Seqüência de DNA: SEQ ID NO: 37 (seqüência de sinal: nucleotídeo número 33 a 92, região V: nucleotídeo número 93 a 380) [00670] Utilizando-se o software analítico para a seqüência de gene, a biblioteca V BASE Sequence para os genes da região variável da imunoglobulina humana, construída por Tomlinson et al (Immunol. Today, Vol. 16, N2 5, p.p. 237-242, 1995), foi pesquisada para cada uma das seqüências de DNA determinadas aqui.
[00671] O resultado mostrou que os genes da região V da cadeia pesada e da cadeia leve, respectivas, dos anticorpos monoclonais de seres humanos acima mencionados consistiam nos seguintes segmentos.
<Gene da região V da cadeia pesada>
clone AIH5D3 (JMab-136) : 1-02 clone AII289 (JMab-138) : 3-13 clone AII394 (JMab-139) : 3-13
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172/194 <Gene da região V da cadeia leve>
clone AIH5D3 (JMab-136) : L5 clone AII289 (JMab-138) : A27 clone AII394 (JMab-139) : A27
Exemplo 11 Efeito inibitório do anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana sobre a hipersensibilidade do tipo tardia (DTH) [00672] O sistema biológico de resposta imunológica, cuja função é eliminar os antígenos nocivos (microorganismos patogênicos, tais como o vírus, a bactéria e o parasita, o corpo estranho, etc.) para os corpos vivos, pode ser amplamente dividido em imunidade congênita e imunidade adquirida.
[00673] O primeiro é um sistema de eliminação com base em reconhecimento não-específico, incluindo a fagocitose por fagócitos (leucócito polimorfonuclear, monócito, macrófago, etc.), o ataque por células exterminadoras naturais (NK), e a opsonização de antígeno por complemento, etc.
[00674] O último, a resposta imunológica adquirida, é um sistema de eliminação de linfócitos (principalmente, a célula T e a célula B), os quais adquiriram especificidade (ativação) para o antígeno.
[00675] Ademais, a resposta imunológica adquirida pode amplamente ser dividida em imunidade celular e imunidade humoral.
[00676] Ao contrário da imunidade humoral dependente de anticorpo, a imunidade celular é uma resposta imunológica expressa, em geral, pela ação direta de célula T sobre um antígeno como o alvo. A imunidade celular é sabida estar envolvida na resposta imunológica ao vírus ou ao tumor, na resposta imunológica induzida após a transplantação de tecido ou órgão, na hipersensibilidade a algumas drogas, e em algumas das doenças auto-imunes.
[00677] O fenômeno mais típico que pertence à imunidade celular é a bem conhecida alergia à tuberculina (quase sinônimo com a hiperPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 178/212
173/194 sensibilidade à tuberculina). A alergia à tuberculina é uma alergia tardia iniciada pela infecção por bacilo de tubérculo. A alergia é devida à infecção por bacilo de tubérculo e pode ser induzida, causando resposta imunológica, injetando-se de forma intracutânea, a um corpo vivo, a proteína tuberculina produzida em sobrenadante de cultura de bacilo de tubérculo.
[00678] A alergia tardia é uma alergia mediada por célula T (célula T de memória, memorizando o antígeno) sensibilizada com um antígeno. A alergia é chamada tipo tardia porque leva 24 a 48 horas para um corpo vivo, sensibilizado com o antígeno, expressar a resposta alérgica com inflamação induzida pela célula T de memória quando contatada novamente com o antígeno.
[00679] O fenômeno de alergia à tuberculina, que é um representativo de alergias tardias, tem sido geralmente utilizado no teste da tuberculina para diagnosticar se a sensibilização pela infecção de bacilo de tubérculo já tinha sido estabelecida ou não em um animal. Especificamente, o teste é conduzido como se segue: a tuberculina purificada (derivado protéico purificado; PPD; 0,1 ml do derivado de 0,05 mg/0,1 ml (2,5 TU) para uso diagnóstico geral), a qual é a proteína tuberculina purificada da cultura de bacilo de tubérculo, é dada de forma intracutânea a um animal; o eixo principal do vermelhidão da pele no local da injeção é medido 48 horas após a injeção; e a presença de infecção de bacilo de tubérculo pode ser diagnosticada com base no eixo principal medido. Se o eixo principal do vermelhidão for mais curto do que 4 mm, então o paciente é negativo; se ele estiver dentro da faixa de 4-9 mm, então o paciente é falso positivo; e se ele for 10 mm ou mais, então o paciente é positivo indiscutível.
[00680] As alergias tardias associadas com a imunidade celular incluem, por exemplo, a hipersensibilidade do tipo Jones-Mote induzida de forma transiente por uma pequena quantidade de proteína ou simiPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 179/212
174/194 lar, a alergia de contato a drogas, tais como o cloreto de picrila ou as toxinas das plantas, tais como a laca japonesa, ou a alergia associada com a rejeição ao enxerto (por exemplo, o enxerto alogênico), bem como a alergia ao antígeno acima mencionada a partir de patógeno infeccioso, tal como a alergia à tuberculina causada por bacilo de tubérculo, descrito acima.
[00681] Neste teste, o efeito inibitório do anticorpo anti-AILIM sobre a hipersensibilidade do tipo tardia (alergia tardia) foi avaliado por utilização do teste da tuberculina acima mencionado. O teste foi conduzido como se segue:
[00682] Cada um dos macacos cynomolgus (macho, peso do corpo: 6,0-8,5 kg, Environmental Biological Life Science Research Center Inc.; 3 indivíduos em cada grupo), os quais tinham sido sensibilizados com BCG (Bacille de Calmette et Guerin), que é uma bactéria viva atenuada de bacilo de tubérculo do tipo bovino, foi anestesiado com cloridrato de cetamina (10 mg/kg, injeção intramuscular), e então qualquer uma das amostras de teste indicadas abaixo foi dada de forma intracutânea, com uma quantidade de 0,1 ml, a cada local da injeção (6 locais de injeção/indivíduo) no tórax. As distâncias entre os locais da injeção da amostra eram 3 cm ou mais.
(1) solução mista a 1:1 de anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana (JMab-136; 0,2 mg; 10 mg em cada local da injeção) e tuberculina (4 mg/1 ml de salina fisiológica);
(2) solução mista a 1:1 de anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana (JMab-136; 2 mg; 100 mg em cada local da injeção) e tuberculina (4 mg/1 ml de salina fisiológica);
(3) tampão fosfato (PBS (-)) como um controle;
(4) solução mista a 1:1 de um agente antiinflamatório esteroidal comercialmente disponível, Prednisolona (0,2 mg; 10 mg em cada local da injeção), e tuberculina (4 mg/1 ml de salina fisiológica) coPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 180/212
175/194 mo um controle positivo;
(5) solução mista a 1:1 de anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH (Exemplo <2 - 2>; 0,2 mg; 10 mg em cada local da injeção) e tuberculina (4 mg/1 ml de salina fisiológica) como um controle negativo.
[00683] 24 horas após a injeção de cada amostra, o eixo principal e o eixo secundário de vermelhidão em cada local da injeção foram medidos, para determinar a área do vermelhidão.
[00684] O resultado é mostrado na Figura 72.
[00685] O resultado mostrou que o vermelhidão devido à alergia tardia foi significativamente inibido em quaisquer grupos submetidos à injeção dos anticorpos anti-AILIM, em comparação com os grupos de controle e de controle negativo. O efeito inibitório era comparável àquele da droga antiinflamatória esteroidal usada como um controle positivo.
Exemplo 12 Análise para a expressão de AILIM em diversos tecidos de pacientes com doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD) [00686] A expressão de AILIM em uma variedade de tecidos obtidos da biópsia de pacientes, que eram receptores submetidos à transplantação de enxerto alogênico de doadores e tinham sido diagnosticados clinicamente estarem afetados com a doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD) aguda ou crônica após a transplantação, foi analisada por um método comumente usado. Os tecidos foram tingidos com HE e anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana (JMab-36) preparado no Exemplo descrito acima.
[00687] A análise foi realizada usando 33 amostras de diversos tecidos coletados dos pacientes com GVHD aguda (28 casos), bem como 5 amostras de paciente com GVHD crônica (5 casos).
[00688] Os resultados foram como se seguem: a reação positiva para AILIM foi verificada em 15 de 29 amostras de tecido da pele; em
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176/194 de 3 amostras de tecido do estômago; e em 1 de 1 amostra de tecido do cólon; que foram todas obtidas de pacientes com GVHD aguda. A reação positiva para AILIM foi verificada em 1 de 3 amostras de tecido da pele; em 2 de 2 amostras de tecido do cólon; que foram todas obtidas de pacientes com GVHD crônica. Ademais, a reação positiva para AILIM foi verificada em 10 de 13 amostras nas quais tinha sido observada a infiltração significativa de linfócitos.
Exemplo 13 Atividade do anticorpo monoclonal de ser humano antiAILIM humana de transdução de sinal coestimulador em célula T de macaco [00689] A experiência conduzida no Exemplo 7 demonstrou que os anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana da presente invenção são capazes de aumentar a proliferação de célula T humana via controle da resposta da célula T humana, especificamente, controle da transdução de sinal coestimulador mediado por AILIM para a célula. Neste teste, foi analisado se os anticorpos monoclonais de seres humanos exibem ou não atividade de aumentar a proliferação celular de célula T de macaco, pelo mesmo método como descrito no Exemplo 7.
<13 - 1> Diluição do anticorpo [00690] O anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano SP34 (BD-Pharmingen) foi diluído com tampão fosfato (PBS) até uma concentração final de 1 mg/ml.
[00691] O anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab136 preparado acima foi diluído com PBS até uma concentração final de 40 mg/ml. As soluções de anticorpos foram adicionalmente diluídas com PBS, para preparar as diversas concentrações de anticorpos (40 mg/ml - 0,064 mg/ml).
<13 - 2> Revestimento da microplaca com anticorpo [00692] Cada cavidade de microplacas com 96 cavidades foi revesPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 182/212
177/194 tida com o anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano SP34 (1 mg/ml; 25 ml para cada cavidade) e o anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab136 (40 mg/ml - 0,064 mg/ml; 25 ml para cada cavidade). As placas foram incubadas a 37°C, p or 2 horas. Subseqüentemente, as soluções de anticorpos foram descartadas, e cada cavidade foi lavada 3 vezes com PBS. Após a lavagem, o meio RPMI1640 contendo 10% de FCS foi adicionado a cada cavidade (100 ml/cavidade), e as placas foram incubadas a 37°C, po r 1 hora. Desse modo, as cavidades respectivas das placas foram revestidas com os anticorpos mencionados acima.
[00693] As experiências de controle foram realizadas no mesmo modo, por utilização de placas revestidas com o anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH (JMab23; ver os Exemplos anteriores) como os anticorpos de controle, em vez dos anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana.
[00694] As microplacas revestidas com os anticorpos foram usadas nos ensaios que se seguem.
<13 - 3> Preparação de suspensão de células T de macacos [00695] O sangue periférico foi coletado de macacos cynomolgus e as células mononucleares foram fracionadas por centrifugação com gradiente de densidade, usando o NycoPrep1.077A (Nycomed). De acordo com o manual experimental, as células T dos macacos foram separadas das células mononucleares dos macacos cynomolgus por utilização de anticorpo anti-CD4 humano M-T477 (BD-Pharmingen), anticorpo anti-CD8 humano RPA-T8 (BD-Pharmingen), microconta anti-IgG de camundongo (Miltenyi) e um Classificador Magnético. A contagem de células T foi determinada usando um hemocitômetro. As células T dos macacos foram suspensas em meio RPMI1640 contendo 10% de FCS. Desse modo, a suspensão de células T de macacos (1x106 células/ml) foi preparada.
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178/194 <13 - 4> Cultura de células (1) Cultura usando microplaca revestida com anticorpo anti-CD3 humano e anticorpo anti-AILIM humana [00696] A suspensão de células T de macacos foi adicionada a cada cavidade de uma microplaca revestida com o anticorpo mencionado acima e a placa foi incubada a 37°C, por 2 dias, em uma incubadora de CO2.
[00697] Após o cultivo estar completado, as microplacas respectivas foram usadas nos ensaios que se seguem:
[00698] <13 - 5> Determinação da atividade de proliferação da célula T [00699] A metil [3H] timidina (0,5 mCi/cavidade; AmershamPharmacia) foi adicionada a cada cavidade das placas após a incubação, e as placas foram incubadas a 37°C, por 6 hora s, em uma incubadora de CO2. Após a incubação, as células foram capturadas sobre filtros GF/C (Packard), usando o Coletor de Células. Subseqüentemente, os filtros foram secos à 40°C, por 3 horas ou m ais, e então o Microscinti 0 (20 ml/cavidade; Packard) foi adicionado aos mesmos. A radioatividade do 3H incorporado das células capturadas sobre os filtros foi medida por um contador β (TOP COUNT) para analisar o grau de proliferação de células T após o cultivo.
[00700] O resultado é mostrado na Figura 73.
[00701] O resultado deste ensaio mostrou que as células T de macacos foram significativamente proliferadas, dependendo da concentração das células, quando as microplacas foram revestidas com o anticorpo monoclonal anti-AILIM humana (anticorpo monoclonal de ser humano ou anticorpo monoclonal de camundongo) juntamente com o anticorpo anti-CD3 humano.
[00702] O resultado também sugere que os anticorpos monoclonais de seres humanos anti-AILIM humana da presente invenção podem
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179/194 ligar-se a AILIM de macaco e ter a atividade de regular a função da
AILIM de macaco.
Exemplo 14 Estabelecimento de método para identificar e quantificar as substâncias capazes de ligarem-se a AILIM ou ao ligando para AILIM [00703] Um método de ELISA (Ensaio imunológico por ligação com enzima) foi estabelecido para identificar ou quantificar uma substância capaz de ligar-se a AILIM (ICOS) ou ao ligando para AILIM (B7h/B7RP1/GL50/LICOS).
[00704] O princípio do método, descrito abaixo em detalhe como um exemplo, é baseado em estimar, por ELISA, o grau de inibição sobre a ligação entre a AILIM humana solúvel (hAILIM-IgFc) e o ligando para AILIM humana solúvel (hB7h-IgFc) causada pela substância.
<14 - 1> Amostra [00705] As seguintes amostras foram usadas:
(1) Estreptavidina-HRP (Southern Biotechnology Associates, Inc.);
(2) Ligando para AILIM humana solúvel (proteína de fusão entre a região extracelular de B7h humana e a região constante de IgG1 humana);
A proteína foi preparada pelo método descrito abaixo em <14 - 2>;
(3) AILIM-IgFc solúvel marcada com biotina;
A AILIM-IgFc foi preparada por purificação adicional do antígeno obtido de acordo com o mesmo método como descrito em pedidos anteriores (JP-A 11-29599 (Exemplo 16 (2)) e WO98/38216 (Exemplo 16 (2))) de um dos presentes inventores, Tezuka;
(4) Anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana (JMab-136; descrito acima), (5) Anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH (anticorPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 185/212
180/194 po de controle negativo, JMab-23; descrito acima);
(6) Tampão fosfato (PBS (-); Nikken Seibutsu);
(7) Meio PRMI1640 (Nikken Seibutsu);
(8) Soro de bezerro fetal (FCS; JRH-Bioscience);
(9) 30% de Soro albumina bovina (BSA; Sigma);
(10) Tween20 (BioRad);
(11) Cromógeno de substrato TMB+ (Dako).
<14 - 2> Preparação de ligando para AILIM humana solúvel (proteína de fusão (hB7h-IgFc) da região extracelular de B7h humana e a região constante de IgG1 humana) [00706] O RNA total foi preparado a partir de células mononucleares derivadas de sangue periférico humano no mesmo modo como descrito no Exemplo acima. O cDNA foi sintetizado a partir do RNA total obtido (5 mg) como um molde e por utilização do Sistema de Préamplificação para a Síntese de cDNA de Fita Primária Superscript (GIBCO-BRL).
[00707] Subseqüentemente, o iniciador em 5' (5'GAGGTCTCCGCCCTCGAGATGCGGCTGGGCAGTCC-3', SEQ ID NO: 39), tendo o sítio de restrição XhoI e o iniciador em 3' (5'CACAGGACAGCCAGGGGATCCCACGTGGCCGCG-3', SEQ ID NO: 40) tendo o sítio de restrição BamHI nas suas extremidades respectivas foram projetados e sintetizados para amplificar o cDNA codificando a região extracelular do ligando para AILIM humana (hB7h) por PCR. Por utilização do cDNA como um molde e o par de iniciadores, a PCR foi conduzida para preparar um DNA tendo XhoI e BamHI nas suas extremidades respectivas contendo cDNA codificando a região extracelular de B7h humana. Os produtos resultantes da PCR foram digeridos com XhoI e BamHI, e fracionados por eletroforese em gel de agarose para isolar uma banda correspondendo a um fragmento de cDNA de cerca de 720 bp, que foi predito codificar a região extraceluPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 186/212
181/194 lar de interesse. O fragmento de cDNA isolado foi subclonado no plasmídeo pBluescript II SK (+) (Stratagene), pré-digerido com XhoI e BamHI. Foi verificado que o fragmento de cDNA continha a porção codificando a região extracelular de B7h humana através de análise por seqüenciamento usando um seqüenciador de DNA fluorométrico automatizado (Applied Biosystems).
[00708] Por outro lado, o DNA codificando a Fc da IgG1 humana como um par de fusão foi preparado como um fragmento de DNA de BamHI-XbaI (cerca de 1,3 kb), por digestão de um plasmídeo (ver, Cell, Vol. 61, p.p. 1303-1313, 1990; preparado pelo Dr. Seed et al, no Hospital Geral de Massachusetts) com BamHI e XbaI. Este fragmento continha exons codificando as regiões de articulação da IgG1 humana, Cg12, e Cg13.
[00709] O fragmento de XhoI-BamHI codificando a região extracelular da B7h humana (h B7h), e o fragmento de BamHI-XbaI contendo exons codificando Fc (abreviada como IgFc) da IgG1 humana, preparados conforme descrito acima, foram subclonados em um plasmídeo pBluescript II SK (+) (Stratagene), pré-digerido com XhoI e XbaI. [00710] Subseqüentemente, o plasmídeo foi digerido com XhoI e XbaI para preparar o fragmento de DNA cerca de 1,8 kb contendo o DNA de fusão entre a região extracelular da B7h humana e a IgFc humana. Por utilização de T4 DNA ligase, este fragmento de DNA de fusão foi inserido em um vetor de expressão pME18S (Medical Immunology, Vol. 20, N2 1, p.p. 27-32, 1990, e Handbook for Genetic Engineering, Experimental Medicine, suplemento, Yodosha, p.p. 101-107, 1992) entre os sítios XhoI e XbaI, para construir um plasmídeo phB7hIgFc.
[00711] As células COS7 de monocamada (ATCC CRL-1651), cultivadas para serem subconfluentes em meio DMEM contendo 10% de soro de bezerro fetal e ampicilina, foram transformadas com o plasmíPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 187/212
182/194 deo phB7h-IgFc por eletroporação, para produzir as células transformadas.
[00712] As células transformadas foram deixadas expressar a hB7h-IgFc por cultivo delas em meio ASF104 sem soro, por 72 horas. [00713] A hB7h-IgFc foi purificada usando uma coluna por afinidade de Proteína G Sepharose (Amersham Pharmacia) como se segue: [00714] O sobrenadante da cultura acima mencionado foi centrifugado para obter um sobrenadante centrífugo. O sobrenadante resultante foi carregado para uma coluna por afinidade de Proteína G Sepharose, pré-equilibrada com um tampão de ligação. Subseqüentemente, a coluna foi lavada com o tampão de ligação, e então a eluição foi efetuada com um tampão de eluição. A solução eluída foi recuperada e então dialisada contra o tampão fosfato. O tampão de diálise externo foi trocado duas vezes ou mais. Assim a hB7h-IgFc purificada foi obtida.
<14 - 3> Diluição do anticorpo e AILIM humana solúvel (hAILIM-IgFc) e sua reação [00715] As soluções originais (20 mg/ml) de anticorpo monoclonal anti-AILIM humana (JMab-136) e anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH (JMab-23) como um anticorpo de controle negativo foram diluídas em uma série de 11 níveis, e cada amostra (200 ml) foi combinada e misturada bem com 200 ml de meio RPMI1640 contendo 10% de FCS. Assim, as diversas concentrações de soluções de anticorpos foram preparadas. A hAILIM-IgFc marcada com biotina (2 ml/tubo; concentração final de 1 mg/ml) foi adicionada a cada uma das soluções preparadas com diversas concentrações. As soluções resultantes foram misturadas bem e incubadas à temperatura ambiente, por 30 minutos.
<14 - 4> Ensaio quanto à atividade do anticorpo monoclonal anti-AILIM de inibir a ligação entre hAILIM-IgFc e hB7h-IgFc
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183/194 [00716] A hB7h-IgFc foi adicionada a cada cavidade de uma microplaca com 96 cavidades (50 ml/cavidade (800 ng/cavidade)). A placa foi vedada e então incubada a 37°C, por 1 hora. A solução foi removida de cada placa, e as cavidades foram lavadas 3 vezes com PBS (120 ml). Subseqüentemente, o PBS contendo 0,5% de BSA (100 ml/cavidade) foi adicionado a cada cavidade para bloquear os locais não-reagidos. A placa foi vedada e incubada a 37°C, por 1 hora. Após a incubação, a solução foi removida, e então as cavidades foram lavadas 3 vezes com PBS (120 ml). Subseqüentemente, cada amostra (50 ml/cavidade) preparada em <14 - 3> foi adicionada às cavidades. A placa foi vedada e incubada a 37°C por 1 hora. A so lução foi removida de cada cavidade. As cavidades foram lavadas 3 vezes com meio RPMI1640 contendo 10% de FCS (120 ml), pré-aquecido a 37°C. Subseqüentemente, o PBS contendo 3,7% de formalina (100 ml/cavidade) foi adicionado a cada cavidade, e a placa foi incubada sobre gelo por 5 minutos. A solução foi removida de cada cavidade, e as cavidades foram lavadas 3 vezes com 0,1% de Tween20 (120 ml). Subseqüentemente, a Estreptavidina-HRP (50 ml/cavidade) foi adicionada a cada cavidade. A placa foi vedada e incubada à temperatura ambiente, por 30 minutos. A solução foi removida de cada cavidade, e a placa foi lavada 3 vezes com PBS contendo 0,1% de Tween20 (120 ml). Subseqüentemente, o cromógeno de substrato TMB+ (50 ml/cavidade) foi adicionado a cada cavidade e a placa foi incubada à temperatura ambiente, por 20 minutos. Subseqüentemente, o ácido sulfúrico a 2N (50 ml/cavidade) foi adicionado a cada cavidade para interromper a reação. A absorbância de cada cavidade foi medida em um comprimento de ondas de 450 nm, por um THERMO max (Molecular Devices).
[00717] Os resultados são mostrados nas Figuras 74 a 76.
[00718] Os resultados mostraram que o anticorpo anti-AILIM tinha a atividade de inibir a ligação entre hAILIM-IgFc e hB7h-IgFc em um
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184/194 modo dependente da dosagem.
[00719] Desse modo, este Exemplo indica que um sistema de ensaio ilustrado pelo presente método pode ser utilizado para examinar e identificar substâncias capazes de ligarem-se a AILIM ou ao ligando para AILIM (por exemplo, o anticorpo ou o composto sintético de baixo peso molecular).
Exemplo 15 Atividade do anticorpo monoclonal de ser humano antiAILIM humana de inibir a proliferação de célula T humana associada com a transdução de sinal coestimulador mediado por AILIM-ligando para AILIM [00720] Foi analisado se os anticorpos monoclonais anti-AILIM humana da presente invenção tinham ou não atividade de regulação sobre a transdução de sinal mediada por AILIM sobre a superfície da célula T humana, com base na medição do efeito inibitório do anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana sobre a proliferação de células induzida por contato da célula T humana com o ligando para AILIM (B7h/B7RP1/GL50/LICOS).
<15 - 1> Diluição do anticorpo [00721] O anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano OKT3 (ATCC CRL-8001) foi diluído com tampão fosfato (PBS) até uma concentração final de 8 mg/ml.
[00722] O ligando para AILIM humana solúvel (hB7h-IgFc) preparado acima foi diluído com PBS até uma concentração final de 40 mg/ml. As soluções de anticorpos foram adicionalmente diluídas com PBS, para preparar as diversas concentrações de anticorpos (40 mg/ml 0,064 mg/ml).
<15 - 2> Revestimento da microplaca com anticorpo [00723] Cada cavidade de microplacas com 96 cavidades foi revestida com (1) o anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano OKT3 (8 mg/ml; 25 ml em cada cavidade) e a hB7h-IgFc (40 mg/ml - 0,064 mg/ml;
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185/194 μΙ em cada cavidade). As placas foram incubadas a 37°C, por 2 horas. Subseqüentemente, as soluções de anticorpos foram descartadas, e cada cavidade foi lavada 3 vezes com PBS. Após a lavagem, o meio RPMI1640 contendo 10% de FCS foi adicionado a cada cavidade (100 ml/cavidade), e as placas foram incubadas a 37°C, po r 1 hora. Desse modo, as cavidades respectivas das placas foram revestidas.
<15 - 3> Preparação de suspensão de células T humanas [00724] O sangue periférico foi coletado de pessoas saudáveis normais e as células mononucleares foram fracionadas por centrifugação com gradiente de densidade, usando o LymphoPrep (Nycomed). De acordo com o manual experimental, as células T humanas foram separadas das células mononucleares humanas por utilização de um Kit de Isolamento de Células T Pan (Miltenyi) e um Classificador Magnético. A contagem de células T foi determinada usando um hemocitômetro. As células T humanas foram suspensas em meio RPMI1640 contendo 10% de FCS, suprido com o anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab136 (20 mg/ml). A suspensão de células T humanas (1x106 células/ml) preparada foi incubada à temperatura ambiente, por 30 minutos.
[00725] O anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH JMA b 23 (20 ml/ml) foi usado como um anticorpo de controle negativo.
<15 - 4> Cultura de células [00726] No mesmo modo como descrito acima, a suspensão de células T humanas (100 ml/cavidade; 1x105 células/cavidade) foi adicionada a cada cavidade de uma microplaca revestida com o anticorpo anti-CD3 humano e a hB7h-IgFc, e a placa foi incubada a 37°C, por 3 dias, em uma incubadora de CO2.
<15 - 5> Determinação da atividade de proliferação da célula T [00727] A metil [3H] timidina (0,5 mCi/cavidade; AmershamPharmacia) foi adicionada a cada cavidade das placas após o cultivo,
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186/194 e as placas foram incubadas a 37°C, por 6 horas, em uma incubadora de CO2. Após a incubação, as células foram capturadas sobre filtros GF/C (Packard), por utilização de um Coletor de Células. Subseqüentemente, os filtros foram secos à 40°C, por 3 horas ou mais, e então o Microscinti 0 (20 ml/cavidade; Packard) foi adicionado aos mesmos. A radioatividade do 3H incorporado nas células capturadas sobre os filtros foi medida por um contador β (TOP COUNT) para analisar o grau de proliferação de células T após o cultivo.
[00728] O resultado é mostrado na Figura 77.
[00729] O resultado obtido neste teste mostrou que as células T humanas desenvolveram-se significativamente, dependendo da concentração de B7h-IgFc humana (no ensaio usando o anticorpo de controle negativo). Ademais, o anticorpo monoclonal anti-AILIM humana significativamente inibiu a proliferação de células T humanas.
Exemplo 16 Atividade do anticorpo monoclonal de ser humano antiAILIM humana de inibir a proliferação de célula T de macaco associada com a transdução de sinal coestimulador mediado por AILIMligando para AILIM [00730] O mesmo teste foi conduzido por utilização de células T de macacos, em vez das células T humanas usadas no Exemplo 15 descrito acima.
<16 - 1> Diluição do anticorpo e outros [00731] O anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano SP34 (BD-Pharmingen) foi diluído com tampão fosfato (PBS) até uma concentração final de 1 mg/ml.
[00732] A B7h-IgFc humana preparada acima foi diluída com PBS até uma concentração final de 40 mg/ml. A solução de anticorpo foi adicionalmente diluída com PBS, para preparar as diversas concentrações do anticorpos (40 mg/ml - 0,064 mg/ml).
<16 - 2> Revestimento da microplaca com anticorpo
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187/194 [00733] Cada cavidade de microplacas com 96 cavidades foi revestida com (1) o anticorpo monoclonal anti-CD3 de ser humano SP34 (1 mg/ml; 25 ml em cada cavidade) e a B7h-IgFc humana (40 mg/ml - 0,064 mg/ml; 25 ml em cada cavidade). As placas foram incubadas a 37°C, por 2 horas. Subseqüentemente, a solução de anticorpo foi descartada, e cada cavidade foi lavada 3 vezes com PBS. Após a lavagem, o meio RPMI1640 contendo 10% de FCS foi adicionado a cada cavidade (100 ml/cavidade), e as placas foram incubadas a 37°C, por 1 hora. Desse modo, as cavidades respectivas das placas foram revestidas com o anticorpo.
<16 - 3> Preparação de suspensão de células T de macacos [00734] O sangue periférico foi coletado de macacos cynomolgus. Uma fração contendo as células mononucleares foi preparada por centrifugação com gradiente de densidade, usando o NycoPrep1.077A (Nycomed). De acordo com o manual experimental, as células T dos macacos foram separadas das células mononucleares dos macacos cynomolgus por utilização do anticorpo anti-CD4 humano M-T477 (BDPharmingen), do anticorpo anti-CD8 humano RPA-T8 (BDPharmingen), da microconta anti-IgG de camundongo (Miltenyi) e de um Classificador Magnético. A contagem de células T foi determinada por utilização de um hemocitômetro. As células T dos macacos foram suspensas em meio RPMI1640 contendo anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM humana JMab-136 e 10% de FCS, para preparar a suspensão de células T de macacos (1x106 células/ml). A suspensão foi incubada à temperatura ambiente, por 30 minutos.
[00735] O anticorpo monoclonal de ser humano anti-KLH JMab-23 (20 ml/ml) foi usado como um anticorpo de controle negativo.
<16 - 4> Cultura de células [00736] No mesmo modo como descrito acima, a suspensão de células T de macacos (100 ml/cavidade; 1x105 células/cavidade) foi adiciPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 193/212
188/194 onada a cada cavidade de uma microplaca revestida com o anticorpo anti-CD3 humano e a hB7h-IgFc, e a placa foi incubada a 37°C, por 3 dias, em uma incubadora de CO2.
[00737] <16 - 5> Determinação da atividade de proliferação de células T [00738] A metil [3H] timidina (0,5 mCi/cavidade; AmershamPharmacia) foi adicionada a cada cavidade das placas após o cultivo, e as placas foram incubadas a 37°C, por 6 horas, em uma incubadora de CO2. Após a incubação, as células foram capturadas sobre filtros GF/C (Packard), por utilização de um Coletor de Células. Subseqüentemente, os filtros foram secos a 40°C, por 3 horas ou mais, e então o Microscinti 0 (20 ml/cavidade; Packard) foi adicionado aos mesmos. A radioatividade do 3H incorporado nas células capturadas sobre os filtros foi medida por um contador β (TOP COUNT) para analisar o grau de proliferação de células T após o cultivo.
[00739] O resultado é mostrado na Figura 78.
[00740] O resultado obtido neste teste mostrou que as células T de macacos desenvolveram-se significativamente, dependendo da concentração de B7h-IgFc humana (no ensaio usando o anticorpo de controle negativo). Ademais, o anticorpo monoclonal anti-AILIM humana significativamente inibiu a proliferação de células T de macacos. Aplicabilidade Industrial [00741] Os anticorpos monoclonais de seres humanos da invenção, capazes de ligarem-se a AILIM humana, são de origem humana, e, portanto, estes anticorpos não induzem nenhuma rejeição imunológica séria devida à antigenicidade para o ser humano, i.e., a HAMA (Antigenicidade humana anti-camundongo) em um hospedeiro, que tem sido um problema terapêutico sério (efeito colateral) em preparações farmacêuticas de anticorpos compreendendo anticorpo derivado de mamífero não-humano, tal como o anticorpo derivado de camundongo.
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O anticorpo da invenção é, desse modo, de grande valor como uma substância farmacêutica de anticorpo.
[00742] Assim, o anticorpo monoclonal de ser humano da invenção contra a AILIM (particularmente a AILIM humana) e as composições farmacêuticas compreendendo o anticorpo monoclonal de ser humano não induzem a rejeição imunológica em um hospedeiro, causada pela HAMA, absolutamente; e, desse modo, podem ser usados como preparações farmacêuticas capazes de controlar uma variedade de reações biológicas (por exemplo, a proliferação de células que expressam a AILIM, a produção de citocinas por células que expressam a AILIM, a citólise imune ou a morte celular (apoptose) das células que expressam a AILIM, e a atividade de induzir o dano dependente de anticorpo das células que expressam a AILIM) associadas com a transdução de sinal coestimulador mediado pela AILIM (sinal secundário) para expressão de células AILIM; e/ou podem ser usados para tratar ou prevenir diversas doenças associadas com a transdução do sinal mediado por AILIM, controlando e inibindo o início e/ou o progresso das doenças.
[00743] Especificamente, proporcionando-se preparações farmacêuticas contendo o anticorpo monoclonal de ser humano anti-AILIM da invenção ou uma porção do mesmo como um ingrediente ativo, é possível inibir ou tratar e prevenir, por exemplo, uma variedade de doenças (por exemplo, a artrite reumatóide, a esclerose múltipla, a tiroidite auto-imune, a dermatite alérgica de contato, o líquen plano como uma doença da pele inflamatória crônica, o lupo eritematoso sistêmico, o diabetes melito dependente de insulina e a psoríase, etc.) classificada em doenças auto-imunes ou doenças alérgicas (particularmente, as doenças auto-imunes e as alergias tardias por imunidade celular); as artropatias (por exemplo, a artrite reumatóide (RA), a osteoartrite (OA)), a inflamação (por exemplo, a hepatite), a reação enxerto versus
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190/194 hospedeiro (reação GVH); a doença do enxerto versus hospedeiro (doença do enxerto versus hospedeiro; GVHD); as rejeições imunológicas associadas com a transplantação (enxerto alogênico ou enxerto heterogêneo) de tecidos (tecidos tais como a pele, a córnea e o osso) ou órgãos (fígado, coração, pulmão, rim, pâncreas, etc.); a resposta imunológica ao antígeno estranho ou auto-antígeno (por exemplo, a produção de anticorpo contra o antígeno, a proliferação de células, a produção de citocinas, etc.); e as doenças que são potencialmente causadas por anormalidade na imunidade do intestino (especificamente, a doença inflamatória do intestino (particularmente a doença de Crohn e a colite ulcerativa); e a alergia alimentar, etc.
[00744] As composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção tornam possível tratar ou prevenir algumas inflamações para as quais as diversas drogas esteroidais são usadas como drogas antiinflamatórias, por exemplo, a inflamação associada com diversas artrites (artrite reumatóide, osteoartrite, etc.), a pneumonia, a hepatite (incluindo a hepatite viral), a inflamação associada com doenças infecciosas, a doença inflamatória do intestino, a enterite, a nefrite (a nefrite glomerular, a inflamação associada com a fibrose dos rins, a gastrite, a vasculite, a pancreatite, a peritonite, a bronquite, a miocardite, a encefalite, a inflamação associada com lesão por reperfusão de isquemia (lesão por reperfusão de isquemia miocárdica, etc.), a inflamação associada com a rejeição imunológica após transplantação de tecidos ou órgãos, a escaldadura, as diversas inflamações da pele (psoríase, dermatite alérgica de contato, líquen planto como uma doença da pele inflamatória crônica), a inflamação associada com a insuficiência múltipla dos órgãos, a inflamação após operação de PTCA ou PTCR, e a inflamação associada com a arteriosclerose, a tiroidite auto-imune, etc. [00745] Além disso, com relação à inibição e ao tratamento acima mencionados da rejeição imunológica associada com a transplantação
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191/194 de tecidos ou órgãos, conforme descrito acima, as composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção podem ser usadas em conjunção com imunossupressores conhecidos, usados para inibir a rejeição imunológica na terapia da transplantação, desse modo aumentando o efeito da droga conhecida de inibir a rejeição ao enxerto. [00746] Ademais, pelo uso do método de identificar as substâncias capazes de ligarem-se a AILIM ou ao ligando para AILIM, que está dentro do escopo da presente invenção, é possível controlar a transdução de sinal associada com a interação entre a AILIM e o ligando para AILIM, através da ligação a AILIM ou ao ligando para AILIM, e desse modo obtendo o exame e a seleção de agentes farmacêuticos (composto químico sintético e anticorpo) tendo atividade potencial para tratar as diversas doenças acima mencionadas.
Texto Livre de Listagem de Seqüências
SEQ ID NO: 1
Outra Informação: Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência de iniciador artificialmente sintetizada, NotI-T.
SEQ ID NO: 2
Outra Informação: Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência de ligador artificialmente sintetizada, 20adp.
SEQ ID NO: 3
Outra Informação: Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência de ligador artificialmente sintetizada, 24adp.
SEQ ID NO: 4
Outra Informação: Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência de iniciador artificialmente sintetizada, HIGLC.
SEQ ID NO: 5
Outra Informação: Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência de iniciador artificialmente sintetizada, NHCc2.
SEQ ID NO: 6
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192/194
Outra Informação: Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência de iniciador artificialmente sintetizada, ExcellE.
SEQ ID NO: 7
Outra Informação: Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência de iniciador artificialmente sintetizada, ck117.
SEQ ID NO: 8
Outra Informação: Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência de iniciador artificialmente sintetizada, M13R.
SEQ ID NO: 9
Outra Informação: Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência de iniciador artificialmente sintetizada, 136H.
SEQ ID NO: 10
Outra Informação: Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência de iniciador artificialmente sintetizada, 138/9H.
SEQ ID NO: 11
Outra Informação: Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência de iniciador artificialmente sintetizada, AILIMHC1.
SEQ ID NO: 12
Outra Informação: Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência de iniciador artificialmente sintetizada, HCc1.
SEQ ID NO: 13
Outra Informação: Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência de iniciador artificialmente sintetizada, HCc7.
SEQ ID NO: 14
Outra Informação: Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência de iniciador artificialmente sintetizada, HCc8.
SEQ ID NO: 15
Outra Informação: Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência de iniciador artificialmente sintetizada, HCc3.
SEQ ID NO: 16
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193/194
Outra Informação: Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência de iniciador artificialmente sintetizada, HCc4.
SEQ ID NO: 17
Outra Informação: Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência de iniciador artificialmente sintetizada, HCc6.
SEQ ID NO: 18
Outra Informação: Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência de iniciador artificialmente sintetizada, HIGHC.
SEQ ID NO: 19
Outra Informação: Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência de iniciador artificialmente sintetizada, HCc9.
SEQ ID NO: 20
Outra Informação: Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência de iniciador artificialmente sintetizada, HCc5.
SEQ ID NO: 21
Outra Informação: Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência de iniciador artificialmente sintetizada, poliA.
SEQ ID NO: 22
Outra Informação: Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência de iniciador artificialmente sintetizada, AILIMLC1.
SEQ ID NO: 23
Outra Informação: Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência de iniciador artificialmente sintetizada, AILIMLC2.
SEQ ID NO: 24
Outra Informação: Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência de iniciador artificialmente sintetizada, LCc1.
SEQ ID NO: 25
Outra Informação: Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência de iniciador artificialmente sintetizada, LCc2.
SEQ ID NO: 26
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194/194
Outra Informação: Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência de iniciador artificialmente sintetizada, HIK.
SEQ ID NO: 39
Outra Informação: Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência de iniciador artificialmente sintetizada.
SEQ ID NO: 40
Outra Informação: Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência de iniciador artificialmente sintetizada.
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Claims (19)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM ou uma porção do mesmo, caracterizado pelo fato de que um polipeptídeo de cadeia pesada do dito anticorpo monoclonal ser humano anti-AILIM tem uma sequência de aminoácidos definida em quaisquer dos seguintes (a) a (c):
    (a) sequência de aminoácidos consistindo em aminoácidos da posição 20 até 470 de SEQ ID NO: 28, (b) sequência de aminoácidos consistindo em aminoácidos da posição 20 até 470 de SEQ ID NO: 32, ou (c) sequência de aminoácidos consistindo em aminoácidos da posição 20 até 470 de SEQ ID NO: 36, e um polipeptídeo de cadeia leve do dito anticorpo monoclonal humano tem uma sequência de aminoácidos definida em quaisquer dos seguintes (d) a (f):
    (d) sequência de aminoácidos consistindo em aminoácidos da posição 23 até 236 de SEQ ID NO: 30, (e) sequência de aminoácidos consistindo em aminoácidos da posição 21 até 236 de SEQ ID NO: 34, (f) sequência de aminoácidos consistindo em aminoácidos da posição 21 até 236 de SEQ ID NO: 38, e em que a porção do anticorpo monoclonal é F(ab')2, Fab', Fab, Fv (fragmento variável de anticorpo), sFv, dsFv (Fv estabilizado com dissulfeto), ou dAb (anticorpo de domínio único).
  2. 2. Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM ou a porção do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma região variável de cadeia pesada do dito anticorpo monoclonal humano anti-AILIM tem uma sequência de aminoácidos definida em quaisquer dos seguintes (a) a (c):
    Petição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 201/212
    2/7 (a) sequência de aminoácidos consistindo em aminoácidos da posição 20 até 117 de SEQ ID NO: 28, (b) sequência de aminoácidos consistindo em aminoácidos da posição 20 até 116 de SEQ ID NO: 32, ou (c) sequência de aminoácidos consistindo em aminoácidos da posição 20 até 116 de SEQ ID NO: 36, e uma região variável de cadeia leve do dito anticorpo monoclonal humano tem uma sequência de aminoácidos definida em quaisquer dos seguintes (d) a (f):
    (d) sequência de aminoácidos consistindo em aminoácidos da posição 23 até 116 de SEQ ID NO: 30, (e) sequência de aminoácidos consistindo em aminoácidos da posição 21 até 116 de SEQ ID NO: 34, (f) sequência de aminoácidos consistindo em aminoácidos da posição 21 até 116 de SEQ ID NO: 38.
  3. 3. Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM ou a porção do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que o dito anticorpo monoclonal humano anti-AILIM tem as seguintes características (a) e (b):
    (a) um polipeptídeo de cadeia pesada tem uma sequência de aminoácidos consistindo na sequência de aminoácido 20 até 470 de acordo com SEQ ID NO: 28, e (b) um polipeptídeo de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos consistindo na sequência de aminoácido 23 até 236 de acordo com SEQ ID NO: 30.
  4. 4. Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM ou a porção do mesmo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo monoclonal humano anti-AILIM tem as seguintes características (a) e (b):
    (a) uma região variável de cadeia pesada tem uma sequência
    Petição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 202/212
    3/7 de aminoácidos consistindo na sequência de aminoácidos do aminoácido 20 até 117 de acordo com SEQ ID NO: 28, e (b) uma região variável de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos consistindo na sequência de aminoácidos do aminoácido 23 até 116 de acordo com SEQ ID NO: 30.
  5. 5. Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM ou a porção do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo monoclonal humano anti-AILIM tem as seguintes características (a) e (b):
    (a) um polipeptídeo de cadeia pesada tem uma sequência de aminoácidos consistindo na sequência de aminoácidos do aminoácido 20 até 470 de acordo com SEQ ID NO: 32, e (b) um polipeptídeo de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos consistindo na sequência de aminoácidos do aminoácido 21 até 236 de acordo com SEQ ID NO: 34.
  6. 6. Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM ou a porção do mesmo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo monoclonal humano anti-AILIM tem as seguintes características (a) e (b):
    (a) uma região variável de cadeia pesada tem uma sequência de aminoácidos consistindo na sequência de aminoácidos do aminoácido 20 até 116 de acordo com SEQ ID NO: 32, e (b) uma região variável de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos consistindo na sequência de aminoácidos do aminoácido 21 até 116 de acordo com SEQ ID NO: 34.
  7. 7. Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM ou a porção do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo monoclonal humano anti-AILIM tem as seguintes características (a) e (b):
    (a) um polipeptídeo de cadeia pesada tem uma sequência de
    Petição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 203/212
    4/7 aminoácidos consistindo na sequência de aminoácidos do aminoácido 20 até 470 de acordo com SEQ ID NO: 36, e (b) um polipeptídeo de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos consistindo na sequência de aminoácidos do aminoácido 21 até 236 de acordo com SEQ ID NO: 38.
  8. 8. Anticorpo monoclonal humano anti-AILIM ou a porção do mesmo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo monoclonal humano anti-AILIM tem as seguintes características (a) e (b):
    (a) uma região variável de cadeia pesada tem uma sequência de aminoácidos consistindo na sequência de aminoácidos do aminoácido 20 até 116 de acordo com SEQ ID NO: 36, e (b) uma região variável de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos consistindo na sequência de aminoácidos do aminoácido 21 até 116 de acordo com SEQ ID NO: 38.
  9. 9. Construção de DNA, caracterizada pelo fato de que codifica o anticorpo monoclonal humano anti-AILIM, em que um DNA que codifica um polipeptídeo de cadeia pesada do dito anticorpo monoclonal humano anti-AILIM tem uma sequência de nucleotídeos definida em quaisquer dentre (a) a (c) abaixo:
    (a) um DNA consistindo na sequência de nucleotídeos dos nucleotídeos 69 até 1481 de acordo com SEQ ID NO: 27, (b) um DNA consistindo na sequência de nucleotídeos dos nucleotídeos 94 até 1506 de acordo com SEQ ID NO: 31, ou (c) um DNA consistindo na sequência de nucleotídeos dos nucleotídeos 96 até 1508 de acordo com SEQ ID NO: 35, e um DNA que codifica um polipeptídeo de cadeia leve do dito anticorpo monoclonal humano anti-AILIM tem uma sequência de nucleotídeos definida em quaisquer dentre (d) a (f) abaixo:
    (d) um DNA consistindo na sequência de nucleotídeos dos nuPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 204/212
    5/7 cleotídeos 39 até 749 de acordo com SEQ ID NO: 29, (e) um DNA consistindo na sequência de nucleotídeos dos nucleotídeos 28 até 738 de acordo com SEQ ID NO: 33, ou (f) um DNA consistindo na sequência de nucleotídeos dos nucleotídeos 33 até 743 de acordo com SEQ ID NO: 37.
  10. 10. Construção de DNA, caracterizada pelo fato de que um DNA que codifica uma região variável de cadeia pesada do dito anticorpo monoclonal humano anti-AILIM tem uma sequência de nucleotídeos definida em quaisquer dentre (a) a (c) abaixo:
    (a) um DNA consistindo na sequência de nucleotídeos dos nucleotídeos 126 até 419 de acordo com SEQ ID NO: 27, (b) um DNA consistindo na sequência de nucleotídeos dos nucleotídeos 151 até 441 de acordo com SEQ ID NO: 31, ou (c) um DNA consistindo na sequência de nucleotídeos dos nucleotídeos 153 até 443 de acordo com SEQ ID NO: 35, e um DNA que codifica uma região variável de cadeia leve do dito anticorpo monoclonal humano anti-AILIM tem uma sequência de nucleotídeos definida em quaisquer dentre (d) a (f) abaixo:
    (b) um DNA consistindo na sequência de nucleotídeos dos nucleotídeos 105 até 386 de acordo com SEQ ID NO: 29, (d) um DNA consistindo na sequência de nucleotídeos dos nucleotídeos 88 até 375 de acordo com SEQ ID NO: 33, (f) um DNA consistindo na sequência de nucleotídeos dos nucleotídeos 93 até 380 de acordo com SEQ ID NO: 37.
  11. 11. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende anticorpo monoclonal humano anti-AILIM ou a porção do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, e um veículo farmaceuticamente aceitável, em que a concentração do anticorpo monoclonal humano anti-AILIM ou a porção do mesmo varia de 0,1 mg de anticorpo/ml de veículo a 10 mg de anticorpo/ml de veícuPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 205/212
    6/7 lo.
  12. 12. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a dita composição farmacêutica é usada para inibir a transdução de sinal para célula mediada por AILIM.
  13. 13. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a dita composição farmacêutica é usada para prevenir a proliferação de células que expressam AILIM.
  14. 14. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a dita composição farmacêutica é usada para prevenir a produção de uma citocina a partir de células que expressam AILIM.
  15. 15. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a dita composição farmacêutica é usada para induzir a transdução de sinal para uma célula mediada por AILIM.
  16. 16. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a dita composição farmacêutica é usada para induzir a proliferação de células que expressam AILIM.
  17. 17. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação11, caracterizada pelo fato de que a dita composição farmacêutica é usada para induzir a produção de uma citocina a partir de células que expressam AILIM.
  18. 18. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a dita composição farmacêutica é usada para induzir a citotoxicidade dependente de anticorpo contra as células que expressam a AILIM, e/ou a citólise imune ou a apoptose de células que expressam AILIM.
  19. 19. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que é para a prevenção, o tratamenPetição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 206/212
    7/7 to, ou a profilaxia de alergia do tipo tardia.
    Petição 870170082059, de 26/10/2017, pág. 207/212
    1/78
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    FIG 2
    IgG HUMANA (ng/ml)
    3/78
    OD490
    00001
    CONCENTRAÇÃO DE ANTICORPO (ng/ml)
    SAI 2 CHO
    SA12 HUMANA
    SG430 CHO
    SG430 HUMANA
    4/78
    OD490
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Families Citing this family (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3521382B2 (ja) 1997-02-27 2004-04-19 日本たばこ産業株式会社 細胞間接着及びシグナル伝達を媒介する細胞表面分子
US7112655B1 (en) 1997-02-27 2006-09-26 Japan Tobacco, Inc. JTT-1 protein and methods of inhibiting lymphocyte activation
DE19821060A1 (de) * 1997-09-23 1999-04-15 Bundesrepublik Deutschland Let Ko-stimulierendes Polypeptid von T-Zellen, monoklonale Antikörper sowie die Herstellung und deren Verwendung
JP3871503B2 (ja) 1999-08-30 2007-01-24 日本たばこ産業株式会社 免疫性疾患治療剤
JP4210454B2 (ja) * 2001-03-27 2009-01-21 日本たばこ産業株式会社 炎症性腸疾患治療剤
US7718644B2 (en) 2004-01-22 2010-05-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Anti-arrhythmic and heart failure drugs that target the leak in the ryanodine receptor (RyR2) and uses thereof
US7393652B2 (en) 2000-05-10 2008-07-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for identifying a chemical compound that directly enhances binding of FKBP12.6 to PKA-phosphorylated type 2 ryanodine receptor (RyR2)
US7879840B2 (en) 2005-08-25 2011-02-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Agents for preventing and treating disorders involving modulation of the RyR receptors
US8022058B2 (en) 2000-05-10 2011-09-20 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Agents for preventing and treating disorders involving modulation of the RyR receptors
JP3597140B2 (ja) * 2000-05-18 2004-12-02 日本たばこ産業株式会社 副刺激伝達分子ａｉｌｉｍに対するヒトモノクローナル抗体及びその医薬用途
JP4212278B2 (ja) 2001-03-01 2009-01-21 日本たばこ産業株式会社 移植片拒絶反応抑制剤
US20040001831A1 (en) * 2002-06-26 2004-01-01 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the diagnosis and treatment of demyelinating inflammatory disorders
EP1603450A4 (en) 2003-03-07 2009-07-29 Univ Columbia METHODS USING TYPE 1 RYANODINE RECEPTOR
CN103880955A (zh) * 2003-07-18 2014-06-25 安姆根有限公司 肝细胞生长因子的特异性结合物
HN2004000285A (es) * 2003-08-04 2006-04-27 Pfizer Prod Inc ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET
US7435799B2 (en) * 2004-01-08 2008-10-14 Applied Molecular Evolution TNF-α binding molecules
US8710045B2 (en) 2004-01-22 2014-04-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Agents for preventing and treating disorders involving modulation of the ryanodine receptors
WO2005103086A1 (en) * 2004-04-23 2005-11-03 Bundesrepublik Deutschland letztvertreten durch das Robert-Koch-Institut vertreten durch seinen Präsidenten Method for the treatment of t cell mediated conditions by depletion of icos-positive cells in vivo
US7397250B2 (en) * 2004-11-12 2008-07-08 Baker Hughes Incorporated High resolution resistivity earth imager
US7385401B2 (en) 2005-07-08 2008-06-10 Baker Hughes Incorporated High resolution resistivity earth imager
US7704990B2 (en) 2005-08-25 2010-04-27 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Agents for preventing and treating disorders involving modulation of the RyR receptors
US7365545B2 (en) 2005-12-29 2008-04-29 Baker Hughes Incorporated Two-axial pad formation resistivity imager
JP2009530391A (ja) * 2006-03-22 2009-08-27 インペリアル・イノベ−ションズ・リミテッド 免疫系の因子の調節に関連する組成物および方法
TWI395754B (zh) 2006-04-24 2013-05-11 Amgen Inc 人類化之ｃ-ｋｉｔ抗體
US9244059B2 (en) 2007-04-30 2016-01-26 Immutep Parc Club Orsay Cytotoxic anti-LAG-3 monoclonal antibody and its use in the treatment or prevention of organ transplant rejection and autoimmune disease
RU2549701C2 (ru) * 2007-05-07 2015-04-27 Медиммун, Ллк Анти-icos антитела и их применение в лечении онкологических, связанных с трансплантацией и аутоиммунных заболеваний
WO2009009114A2 (en) * 2007-07-12 2009-01-15 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
PL2259774T3 (pl) 2008-02-27 2013-04-30 Biomet Biologics Llc Sposoby i kompozycje dla wprowadzania antagonisty receptora interleukiny-1
US8753690B2 (en) 2008-02-27 2014-06-17 Biomet Biologics, Llc Methods and compositions for delivering interleukin-1 receptor antagonist
US8390294B2 (en) * 2008-07-23 2013-03-05 Baker Hughes Incorporated Multi-resolution borehole resistivity imaging
US8174266B2 (en) * 2008-07-23 2012-05-08 Baker Hughes Incorporated Multi-resolution borehole resistivity imaging
BRPI0921845A2 (pt) * 2008-11-12 2019-09-17 Medimmune Llc formulação aquosa estéril estável, forma de dosagem unitária farmacêutica, seringa pré-carregada, e, métodos para tratar uma doença ou distúrbio, para tratar ou prevenir rejeição, para esgotar células t que expressam icos em um paciente humano, e para interromper arquitetura central germinal em um órgão linfóide secundário de um primata
WO2010138184A2 (en) * 2009-05-27 2010-12-02 Synageva Biopharma Corp. Avian derived antibodies
US8840889B2 (en) * 2009-08-13 2014-09-23 The Johns Hopkins University Methods of modulating immune function
CN102573790B (zh) 2009-08-27 2017-03-22 拜欧米特生物制剂有限责任公司 用于产生白介素‑1受体拮抗剂的可植入装置
WO2011097477A1 (en) 2010-02-04 2011-08-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Icos critically regulates the expansion and function of inflammatory human th17 cells
BR112013025045B1 (pt) * 2011-03-31 2020-10-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) anticorpos direcionados contra icos e usos dos mesmos
KR102096224B1 (ko) 2011-10-28 2020-04-03 테바 파마슈티컬즈 오스트레일리아 피티와이 엘티디 폴리펩티드 구축물 및 이의 용도
US20150322119A1 (en) 2012-12-03 2015-11-12 Bristol-Myers Squibb Company Enhancing anti-cancer activity of immunomodulatory fc fusion proteins
US9758806B2 (en) 2013-03-15 2017-09-12 Biomet Biologics, Llc Acellular compositions for treating inflammatory disorders
US9895418B2 (en) 2013-03-15 2018-02-20 Biomet Biologics, Llc Treatment of peripheral vascular disease using protein solutions
US10208095B2 (en) 2013-03-15 2019-02-19 Biomet Manufacturing, Llc Methods for making cytokine compositions from tissues using non-centrifugal methods
US9878011B2 (en) 2013-03-15 2018-01-30 Biomet Biologics, Llc Treatment of inflammatory respiratory disease using biological solutions
US20140271589A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Biomet Biologics, Llc Treatment of collagen defects using protein solutions
US10143725B2 (en) 2013-03-15 2018-12-04 Biomet Biologics, Llc Treatment of pain using protein solutions
US9950035B2 (en) * 2013-03-15 2018-04-24 Biomet Biologics, Llc Methods and non-immunogenic compositions for treating inflammatory disorders
JP6224739B2 (ja) 2013-03-15 2017-11-01 グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッドＧｌａｘｏｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｌｉｍｉｔｅｄ 抗ｌａｇ−３結合タンパク質
WO2015081253A1 (en) 2013-11-26 2015-06-04 Biomet Biologics, Llc Methods of mediating macrophage phenotypes
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
US20160145344A1 (en) * 2014-10-20 2016-05-26 University Of Southern California Murine and human innate lymphoid cells and lung inflammation
US10441635B2 (en) 2014-11-10 2019-10-15 Biomet Biologics, Llc Methods of treating pain using protein solutions
MA41414A (fr) 2015-01-28 2017-12-05 Centre Nat Rech Scient Protéines de liaison agonistes d' icos
US9763800B2 (en) 2015-03-18 2017-09-19 Biomet C. V. Implant configured for hammertoe and small bone fixation
EA037621B1 (ru) * 2015-03-23 2021-04-22 Джаунс Терапьютикс, Инк. Антитела к icos
EP3744340A3 (en) 2015-07-16 2021-03-03 Biokine Therapeutics Ltd. Compositions and methods for treating cancer
US20190040150A1 (en) 2015-07-31 2019-02-07 Vascular Biogenics Ltd. Motile Sperm Domain Containing Protein 2 and Cancer
AU2016303472B2 (en) * 2015-07-31 2020-08-27 Immunewalk Therapeutics, Inc. Motile sperm domain containing protein 2 and inflammation
PT3344654T (pt) 2015-09-02 2021-01-26 Immutep Sas Anticorpos anti-lag-3
KR102379464B1 (ko) 2016-06-20 2022-03-29 키맵 리미티드 항-pd-l1 항체
WO2018029474A2 (en) 2016-08-09 2018-02-15 Kymab Limited Anti-icos antibodies
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
TWI760352B (zh) 2016-08-09 2022-04-11 英商克馬伯有限公司 抗ｉｃｏｓ抗體
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
EP3534947A1 (en) 2016-11-03 2019-09-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
TWI788340B (zh) 2017-04-07 2023-01-01 美商必治妥美雅史谷比公司 抗icos促效劑抗體及其用途
JP6886854B2 (ja) * 2017-04-13 2021-06-16 シスメックス株式会社 被検物質の情報取得方法
GB201709808D0 (en) 2017-06-20 2017-08-02 Kymab Ltd Antibodies
US10981992B2 (en) * 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
GB201721338D0 (en) 2017-12-19 2018-01-31 Kymab Ltd Anti-icos Antibodies
US11629189B2 (en) 2017-12-19 2023-04-18 Kymab Limited Bispecific antibody for ICOS and PD-L1
EP3502140A1 (en) 2017-12-21 2019-06-26 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of tumor targeted icos agonists with t-cell bispecific molecules
JP7328243B2 (ja) * 2018-03-26 2023-08-16 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 治療薬を試験するためのヒト化げっ歯類
AU2019287765A1 (en) 2018-06-15 2021-01-07 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Increasing immune activity through modulation of postcellular signaling factors
MA55805A (fr) 2019-05-03 2022-03-09 Flagship Pioneering Innovations V Inc Métodes de modulation de l'activité immunitaire
WO2020260326A1 (en) 2019-06-27 2020-12-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel icos antibodies and tumor-targeted antigen binding molecules comprising them
WO2021127217A1 (en) 2019-12-17 2021-06-24 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Combination anti-cancer therapies with inducers of iron-dependent cellular disassembly
JP2023525053A (ja) 2020-05-12 2023-06-14 インサーム（インスティテュ ナシオナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシェ メディカル） 皮膚ｔ細胞リンパ腫及びｔｆｈ由来リンパ腫を処置する新しい方法
GB202007099D0 (en) 2020-05-14 2020-07-01 Kymab Ltd Tumour biomarkers for immunotherapy
JP2023532339A (ja) 2020-06-29 2023-07-27 フラグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ，インコーポレーテッド サノトランスミッションを促進するためにエンジニアリングされたウイルス及び癌の処置におけるそれらの使用
AU2021341888A1 (en) 2020-09-10 2023-05-11 Immunewalk Therapeutics, Inc. Motile sperm domain containing protein 2 antibodies and methods of use thereof
WO2022212784A1 (en) 2021-03-31 2022-10-06 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer
WO2022243378A1 (en) 2021-05-18 2022-11-24 Kymab Limited Uses of anti-icos antibodies
GB202107994D0 (en) 2021-06-04 2021-07-21 Kymab Ltd Treatment of cancer
EP4363059A1 (en) 2021-06-29 2024-05-08 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Immune cells engineered to promote thanotransmission and uses thereof
WO2023222854A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Kymab Limited Uses of anti-icos antibodies
WO2024040195A1 (en) 2022-08-17 2024-02-22 Capstan Therapeutics, Inc. Conditioning for in vivo immune cell engineering
WO2024077191A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additionalpolypeptides and their use in treating cancer

Family Cites Families (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH642458A5 (en) 1980-04-25 1984-04-13 Hoffmann La Roche Immunological method
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
JP2615456B2 (ja) 1987-11-13 1997-05-28 松下電器産業株式会社 スピーカシステム
DE122006000007I1 (de) 1987-12-31 2006-04-27 Tanox Biosystems Inc Antigene epitope, die sich ausschlisslich auf ige-tragenden B-Lymphocyten befinden.
US5506126A (en) 1988-02-25 1996-04-09 The General Hospital Corporation Rapid immunoselection cloning method
US6075181A (en) * 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
DE69133566T2 (de) 1990-01-12 2007-12-06 Amgen Fremont Inc. Bildung von xenogenen Antikörpern
US5580756A (en) 1990-03-26 1996-12-03 Bristol-Myers Squibb Co. B7Ig fusion protein
KR100272077B1 (ko) 1990-08-29 2000-11-15 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물
US5770197A (en) 1991-06-27 1998-06-23 Bristol-Myers Squibb Company Methods for regulating the immune response using B7 binding molecules and IL4-binding molecules
JP3162438B2 (ja) 1991-09-12 2001-04-25 住友製薬株式会社 高感度特異的抗体測定法
JPH07509137A (ja) 1992-07-24 1995-10-12 セル　ジェネシス，インク． 異種抗体の生産
CN1701814A (zh) 1992-11-13 2005-11-30 马克斯普朗克科学促进协会 作为血管内皮生长因子受体的f1k－1
EP0754225A4 (en) 1993-04-26 2001-01-31 Genpharm Int HETEROLOGIC ANTIBODY-PRODUCING TRANSGENIC NON-HUMAN ANIMALS
US5484892A (en) 1993-05-21 1996-01-16 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Monoclonal antibodies that block ligand binding to the CD22 receptor in mature B cells
CA2185027A1 (en) * 1994-03-08 1995-09-14 Vassiliki A. Boussiotis Methods for modulating t cell unresponsiveness
US6719972B1 (en) 1994-06-03 2004-04-13 Repligen Corporation Methods of inhibiting T cell proliferation or IL-2 accumulation with CTLA4- specific antibodies
US5747461A (en) 1994-07-26 1998-05-05 Markov; Angel K. Synergistic administration of cyclosporine and fructose diphosphate
JP3580948B2 (ja) 1995-05-02 2004-10-27 日本たばこ産業株式会社 ヒト由来ｃｅｔｐに反応性を有するモノクローナル抗体及びヒト由来ｃｅｔｐの定量方法
ES2183131T3 (es) 1996-01-23 2003-03-16 Genentech Inc Anticuerpos anti-cd18 utilizados contra el ictus cerebral.
US5914112A (en) 1996-01-23 1999-06-22 Genentech, Inc. Anti-CD18 antibodies in stroke
DK0928197T3 (da) 1996-09-18 2003-06-23 Zetesis Spa Anvendelse af proteiner som midler mod autoimmune sygdomme
ID21676A (id) 1996-11-08 1999-07-08 Idec Pharma Corp Identifikasi interaksi-interaksi ikatan yang khas antara antibodi-antibodi dan antigen-antigen pembantu rangsangan b7.1 dan b7.2 manusia tertentu
AU4145597A (en) 1997-02-20 1998-09-09 Cedars-Sinai Medical Center Ulcerative colitis panca secretory vesicle antigen and methods of using sa me
US7112655B1 (en) * 1997-02-27 2006-09-26 Japan Tobacco, Inc. JTT-1 protein and methods of inhibiting lymphocyte activation
JP3521382B2 (ja) * 1997-02-27 2004-04-19 日本たばこ産業株式会社 細胞間接着及びシグナル伝達を媒介する細胞表面分子
GB9704174D0 (en) 1997-02-28 1997-04-16 Univ Birmingham Agent for medical treatment
ES2273415T3 (es) 1997-04-07 2007-05-01 Genentech, Inc. Anticuerpos anti-vegf.
ATE264688T1 (de) 1997-06-12 2004-05-15 Applied Research Systems Cd28/ctla-4 inhibierende peptidomimetika und diese enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen
DE19821060A1 (de) * 1997-09-23 1999-04-15 Bundesrepublik Deutschland Let Ko-stimulierendes Polypeptid von T-Zellen, monoklonale Antikörper sowie die Herstellung und deren Verwendung
CA2305350C (en) * 1997-09-23 2015-04-07 Bundesrepublik Deutschland Letztvertreten Durch Den Direktor Des Robert-Koch-Instituts Costimulating polypeptide of t cells, monoclonal antibodies, and the preparation and use thereof
US6297022B1 (en) * 1997-10-08 2001-10-02 Smithkline Beecham Corporation Method of identifying agonists and antagonists for tumor necrosis related receptor TR1
JPH11228442A (ja) 1998-02-09 1999-08-24 Cypros Pharmaceut Corp 臓器移植後のシクロスポリン投与量を低減するためのフルクトース二リン酸の使用
AU767241B2 (en) 1998-09-14 2003-11-06 Qiang Xu Immunosuppressive agents
JP2000154151A (ja) 1998-09-14 2000-06-06 Kyo Jo 免疫抑制剤
JP2003532370A (ja) 1998-10-07 2003-11-05 ミレニアム・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 新規なＴｈ２特異的分子およびその使用方法
DK2332976T3 (da) * 1999-02-03 2014-06-23 Amgen Inc Nye polypeptider, der er involveret ved et immunrespons
AU4825700A (en) 1999-05-06 2000-11-21 Genetics Institute Inc. Use of soluble costimulatory molecules to enhance immune responses
AU6615500A (en) 1999-07-28 2001-02-19 Genetics Institute Inc. Preventing immune-mediated abortion by inhibiting costimulation
AU6458400A (en) 1999-08-11 2001-03-13 Isis Innovation Limited Nucleic acid, polypeptides, assays, therapeutic methods and means
JP4210454B2 (ja) 2001-03-27 2009-01-21 日本たばこ産業株式会社 炎症性腸疾患治療剤
JP3871503B2 (ja) * 1999-08-30 2007-01-24 日本たばこ産業株式会社 免疫性疾患治療剤
AU7099200A (en) 1999-09-03 2001-04-10 Human Genome Sciences, Inc. 52 human secreted proteins
US6521749B1 (en) 1999-09-21 2003-02-18 Genetics Institute, Inc. GL50 nucleic acids and uses therefor
AU1342501A (en) 1999-10-29 2001-05-14 Human Genome Sciences, Inc. 32 human secreted proteins
AU2001245396A1 (en) 2000-03-02 2001-09-12 Mayo Foundation For Medical Education And Research Hb7-h2, a novel co-stimulatory molecule
JP3597140B2 (ja) * 2000-05-18 2004-12-02 日本たばこ産業株式会社 副刺激伝達分子ａｉｌｉｍに対するヒトモノクローナル抗体及びその医薬用途
CN101498731A (zh) * 2000-05-18 2009-08-05 日本烟草产业株式会社 抗协同刺激信号转导分子ailim的人单克隆抗体及其药物用途
JP4236925B2 (ja) 2000-11-28 2009-03-11 アムジエン・インコーポレーテツド 免疫応答に関与する新規ポリペプチド
JP4212278B2 (ja) * 2001-03-01 2009-01-21 日本たばこ産業株式会社 移植片拒絶反応抑制剤

Also Published As

Publication number Publication date
SG153626A1 (en) 2009-07-29
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DK1158004T3 (da) 2010-08-16
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US7166283B2 (en) 2007-01-23
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TW200825171A (en) 2008-06-16
CA2722134A1 (en) 2001-11-18
AU2004201697A1 (en) 2004-05-20
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AU773625B2 (en) 2004-05-27
US7988965B2 (en) 2011-08-02
IL207060A (en) 2017-02-28
NO333921B1 (no) 2013-10-21
TR200202735T1 (tr) 2005-04-21
NZ533324A (en) 2005-07-29
CA2344086C (en) 2009-02-10
EP1158004A2 (en) 2001-11-28
EP2295467A1 (en) 2011-03-16
AR058366A2 (es) 2008-01-30
TWI316546B (en) 2009-11-01
HU230770B1 (hu) 2018-03-28
CN1439022A (zh) 2003-08-27
US20020102658A1 (en) 2002-08-01
EP2216343A1 (en) 2010-08-11
AU5674701A (en) 2001-11-26
WO2001087981A2 (en) 2001-11-22
HK1043371B (zh) 2010-10-08
KR100609442B1 (ko) 2006-08-03
NZ516411A (en) 2004-08-27
NO20020263L (no) 2002-03-18
CY1110816T1 (el) 2015-06-10
SG135917A1 (en) 2007-10-29
CZ302902B6 (cs) 2012-01-11

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