JP3580948B2 - ヒト由来ｃｅｔｐに反応性を有するモノクローナル抗体及びヒト由来ｃｅｔｐの定量方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト由来コレステロールエステル転送タンパク（ＣＥＴＰ）に反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、ヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有するモノクローナル抗体及びその抗体フラグメント、固定化モノクローナル抗体及び固定化抗体フラグメント、標識モノクローナル抗体及び標識抗体フラグメント、ヒト由来ＣＥＴＰの検出、定量、分離または精製に用いられるキット、ヒト由来ＣＥＴＰを検出、定量、分離または精製する方法、該モノクローナル抗体または該抗体フラグメントを含んでなる医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体のあらゆる組織及び血漿中には、遊離型、長鎖脂肪酸型及びエステル型のコレステロールが存在し、前者の２つは細胞膜構成において重要な役割を果たしており、後者は生理的不活性であり貯蔵形態としての性質が強い。生体中のコレステロールは、食物摂取による小腸からの取込み、あるいは各組織、特に肝臓での生合成に由来するがその大半は肝臓等の組織での生合成に由来する。
肝臓で生合成され分泌された遊離コレステロールは、超低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ）に取り込まれ、血中でリポ蛋白リパーゼ（ＬＰＬ）及び肝性トリグリセリドリパーゼ（ＨＴＧＬ）の作用により、中間比重リポ蛋白（ＩＤＬ）を経た後、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）へと代謝される。ＬＤＬは、ＬＤＬ受容体を介して末梢細胞へと取り込まれ細胞に遊離コレステロールが供給される。
このような肝臓から末梢細胞への流れとは逆に、コレステロール逆転送系と呼ばれる末梢細胞から肝臓へ向かうコレステロールの流れが存在する。即ち、肝臓から末梢細胞に供給された余剰の遊離コレステロールが、血中の高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）に引き抜かれ、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）の作用によりコレステロールエステルに変換されて血中ＨＤＬ中に蓄えられる。ＨＤＬ中に蓄えられたコレステロールエステルは、コレステロールエステル転送蛋白（ＣＥＴＰ）の作用により血中のＶＬＤＬ、ＩＤＬやＬＤＬに転送される。コレステロールエステルを受け取ったＶＬＤＬ、ＩＤＬやＬＤＬは、肝臓のＬＤＬ受容体を介して間接的にコレステロールが肝臓に転送されることとなる。
【０００３】
このコレステロール逆転送系は、コレステロールの末梢細胞への蓄積を防御し動脈硬化を防御する機構として近年注目を浴びている。事実、このコレステロール逆転送系において重要な役割をなすＨＤＬに関し、血中ＨＤＬのコレステロールエステルの減少は、冠動脈疾患の危険因子の一つであることがこれまでに多数の疫学的調査によって示され、ＨＤＬは抗動脈硬化作用を有するリポ蛋白として広く認識されるようになった。
さらに、血中ＨＤＬの重要性とともに、ＨＤＬ中のコレステロールエステルの血中ＬＤＬへの転送を媒介するＣＥＴＰの重要性が認識されるようになり、ＣＥＴＰ欠損症、高脂血症、高ＨＤＬ血症、高コレステロール血症、低脂血症、動脈硬化症、糖尿病あるいはネフローゼ症候群等の各種疾患とＣＥＴＰとの係わりを解明することが急務となった。
例えば、高脂血症状態では、正常コントロールに比べ数倍のＣＥＴＰが血中に分泌されることが実験的に証明されている。また、動脈硬化症との関係においては、ＣＥＴＰ活性の低い場合には、動脈硬化が惹起されにくく、血漿ＨＤＬ−コレステロール値が高く、逆にＣＥＴＰ活性が高い場合には、動脈硬化が容易に誘発され、ＨＤＬ−コレステロール値が低いことが実験的に証明されている（カレントセラピー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｈｅｒａｐｙ）、第７巻、第９号、第３６〜第４５頁、１９８９年）。
上述のような各種疾患とＣＥＴＰとの係わりを解明するために、健常人及び上述のような各種疾患に罹患している患者の血漿等の体液中のＣＥＴＰを定量する方法、特にＣＥＴＰに対するモノクローナル抗体（抗ＣＥＴＰモノクローナル抗体）を用いたラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）あるいはエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）等のイムノアッセイによる定量方法の開発並びにそのような定量方法に使用するための抗ＣＥＴＰモノクローナル抗体の開発が試みられている。
【０００４】
抗ＣＥＴＰモノクローナル抗体を用いたＥＩＡ（ＥＬＩＳＡ）による定量法に関しては、例えば、今井ら（特開平６−１６９７９３号公報）、中野ら（動脈硬化、第１９巻、第１１号、第９５１頁、２２番、１９９１年）、高浜ら（動脈硬化、第２０巻、第１０号、第８３７頁、１３５番、１９９２年）、佐藤ら（動脈硬化、第２０巻、第１０号、第８３６頁、１３４番、１９９２年）、メツドール（Ｈ． Ｍｅｚｄｏｕｒ）ら（クリニカルケミストリー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第４０巻、第４号、第５９３〜第５９７頁、１９９４年）、及びクラーク（Ｃｌａｒｋ）ら（ジャーナルオブリピッドリサーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅｒｃｈ）、第３６巻、第８７６〜第８８９頁、１９９５年）が、２種類の抗ＣＥＴＰモノクローナル抗体またはＦａｂ’を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによる定量方法を報告している。しかしながら、これらの定量方法では、定量に際して血漿試料を９５〜１００℃での加熱処理及び／または界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００等）で前処理しなければならないという煩雑な操作が必要であった。とりわけ血漿試料の加熱処理は、試料中のＣＥＴＰを変性させてしまうため、定量されるＣＥＴＰは変性されたＣＥＴＰであり、血漿試料中のインタクトなＣＥＴＰを正確に定量することはできない。
【０００５】
また、クラーク（Ｒ． Ｃｌａｒｋ）ら（ＦＡＳＥＢジャーナル、第８巻、第７号、Ａ１３４３頁、４９５番、１９９４年）、高橋ら（動脈硬化、第２０巻、第１０号、第８３７頁、１３６番、１９９２年、及び動脈硬化、第２１巻、第３号、第２０９頁、９７番、１９９３年）、金光ら（動脈硬化、第２１巻、第３号、第２０９頁、９８番、１９９３年）及び脇ら（動脈硬化、第２２巻、第５号、第４４１頁、１９４番、１９９４年）も、血漿試料中のＣＥＴＰをＥＬＩＳＡ法により測定したと報告しているが、定量に用いた抗ＣＥＴＰ抗体も製造方法及び特性並びに定量の具体的な操作については何等報告していない。
【０００６】
抗ＣＥＴＰモノクローナル抗体を用いたＲＩＡによる定量法に関しては、深澤ら（脂質生化学研究、第３４巻、第１６３〜１６６頁、１９９２年）、マーセル（Ｙ． Ｍａｒｃｅｌ）ら（ジャーナルオブクリニカルインベスティゲイション（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．）、第８５巻、第１０〜第１７頁、１９９０年、及び（アドバンスインエクスペリメンタルメディシンアンドバイオロジー（Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ．）、第２４３巻、第２２５〜第２３０頁、１９８８年）、深澤ら（ジャーナルオブバイオケミストリー（Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第１１１巻、第６９６〜６９８頁、１９９２年）、コイズミ（Ｊ． Ｋｏｉｚｕｍｉ）ら（アテロスクレロシス（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、第９０巻、第１８９〜第１９６頁、１９９１年）、ブラウン（Ｍ． Ｂｒｏｗｎ）ら（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３４２巻、第４４８〜第４５１頁、１９８９年）及びダングレモント（Ｖ． Ｄａｎｇｒｅｍｏｎｔ）ら（クリニカキミカアクタ（Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ）、第２３１巻、第１４７〜第１６０頁、１９９４年）が報告している。
しかしながら、これらのＲＩＡによる定量方法においても、前述のＥＩＡ（ＥＬＩＳＡ）による定量方法と同様に、定量に際しての血漿試料の界面活性剤による前処理が必要という操作上の煩雑性及び／または定量感度の点で欠点を有していた。
上述のように、ＣＥＴＰの定量については多数の研究者が試みているが、何の前処理も必要とせず、インタクトなＣＥＴＰを簡易かつ高感度に定量することに成功したという報告は全くなされていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
動脈硬化症、高脂血症、高ＨＤＬ血症あるいは高コレステロール血症等の各種疾患とそのような疾患の発症に深く関与している可能性を有するコレステロール逆転送系と重要な役割を担うＣＥＴＰとの係わりを解明するために、健常人を含めあらゆる患者の血漿等の体液中に存在するＣＥＴＰを、インタクト（ｉｎｔａｃｔ）な状態で簡便かつ高感度で定量でき、臨床上で汎用可能な定量方法及び該定量方法に使用可能なモノクローナル抗体の開発が強く要望されているが、未だ確立されていない。本発明は、そのような臨床上で汎用可能な定量方法、並びに該定量法での使用のみならずＣＥＴＰの分離及び精製のための試薬として、また医薬品として極めて有用な抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体を提供するものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、そのような臨床上で汎用され得るヒト体液中のＣＥＴＰの定量方法及び該定量方法に用いられるヒト由来ＣＥＴＰに対するモノクローナル抗体に関して鋭意研究した結果、生物学的に活性である精製ヒト由来ＣＥＴＰを免疫抗原として用いることにより、ヒト由来ＣＥＴＰ、特にヒト体液中に存在するインタクトなＣＥＴＰに対して各々異なる高い結合特異性（ＣＥＴＰ阻害活性）を有する３つの抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体を作製することに成功した。
さらに、該３つの抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体が、ヒト由来ＣＥＴＰ、特にヒト体液中に存在するインタクトなＣＥＴＰに対して高い結合特異性（ＣＥＴＰ阻害活性）を有するが故に、本発明の抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体を用いたイムノアッセイにより、未だ確立されていないヒト体液（血漿等）中のＣＥＴＰをインタクトな状態で簡便かつ高感度で定量できることを見出し本発明を完成するに到った。
とりわけ、本発明の３つの抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体が、ヒト由来ＣＥＴＰ、特にヒト体液中に存在するインタクトなＣＥＴＰに対して各々異なる高い結合特異性（ＣＥＴＰ阻害活性）を有するという特徴を利用して、該３つのモノクローナル抗体の内のいずれか２つを組合わせたサンドイッチＥＬＩＳＡを採用することによりさらに簡便かつ高感度に定量でき臨床上汎用可能な定量方法を開発することに成功した。
【０００９】
本発明の抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体が、ヒト由来ＣＥＴＰ、特にヒト体液中に存在するインタクトなＣＥＴＰに対して高い結合特異性（ＣＥＴＰ阻害活性）を有するが故に、本発明のモノクローナル抗体を用いれば、血漿等の体液試料の定量に際し、試料を加熱処理あるいは界面活性剤処理等の何等の前処理をする必要なく、簡便かつ高感度で定量することが可能である。
また、本発明の抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体は、そのＣＥＴＰ阻害活性の高さ故に、ＣＥＴＰの動態異常に起因する動脈硬化症、高脂血症、高ＨＤＬ血症あるいは高コレステロール血症等の各種疾患の治療または予防のための医薬品として有用である。
【００１０】
即ち、本発明の第１は、少なくとも下記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の性質を有するモノクローナル抗体である。
（ａ）健常人、高脂血症患者、ＬＣＡＴ（レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ）欠損症患者または高ＨＤＬ（高比重リポ蛋白）血症患者の血漿中のＣＥＴＰ（コレステロールエステル転送蛋白）に反応性を有する。
（ｂ）３μｇ／ｍｌ以下の濃度においてウサギ由来ＣＥＴＰに反応しない。
（ｃ）変性したヒト由来ＣＥＴＰには特異的な反応性を示さない。
本発明の第２は、ヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマであり、具体的には、国際寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４９４４またはＦＥＲＭ ＢＰ−４９４５で識別されるハイブリドーマ＃７２−１または＃８６−２である。
本発明の第３は、ヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有するモノクローナル抗体であり、具体的には、国際寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４９４４またはＦＥＲＭ ＢＰ−４９４５で識別されるハイブリドーマ＃７２−１または＃８６−２から産生されるモノクローナル抗体＃７２−１または＃８６−２である。
本発明の第４は、可変領域が前記モノクローナル抗体由来の可変領域であり、かつ定常領域がヒトイムノグロブリン由来の定常領域であることを特徴とするヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有する組換キメラモノクローナル抗体である。
【００１１】
本発明の第５は、超可変領域の相補性決定領域の一部または全部が前記モノクローナル抗体由来の相補性決定領域であり、超可変領域の枠組領域がヒトイムノグロブリン由来の枠組領域であり、かつ定常領域がヒトイムノグロブリン由来の定常領域であることを特徴とするヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有する組換ヒト型モノクローナル抗体である。
本発明の第６は、前記モノクローナル抗体、またはそれらに由来する前記組換キメラモノクローナル抗体若しくは組換ヒト型モノクローナル抗体に由来する抗体フラグメントＦ（ａｂ’）２またはＦａｂ’である。
本発明の第７は、前記モノクローナル抗体、またはそれらに由来する前記組換キメラモノクローナル抗体若しくは組換ヒト型モノクローナル抗体を不溶性担体に固定化してなる固定化モノクローナル抗体、及び前記抗体フラグメントＦ（ａｂ’）２またはＦａｂ’を不溶性担体に固定化してなる固定化抗体フラグメントである。
具体的には、プレート、試験管、チューブ、ビーズ、ボール、フィルター、メンブレン、またはアフィニティーカラムクロマトグラフィーに用いられる不溶性担体に固定化されていることを特徴とする固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントである。
【００１２】
本発明の第８は、前記モノクローナル抗体、またはそれらに由来する前記組換キメラモノクローナル抗体若しくは組換ヒト型モノクローナル抗体を、単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識してなる標識モノクローナル抗体、及び前記抗体フラグメントＦ（ａｂ’）２またはＦａｂ’を、単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識してなる標識抗体フラグメントである。
具体的には、酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジン、または放射性同位体で標識された標識モノクローナル抗体または標識抗体フラグメントである。
本発明の第９は、前記モノクローナル抗体、それらに由来する前記組換キメラモノクローナル抗体若しくは組換ヒト型モノクローナル抗体、前記抗体フラグメントＦ（ａｂ’）２若しくはＦａｂ’、前記固定化モノクローナル抗体若しくは固定化抗体フラグメント、または前記標識モノクローナル抗体若しくは標識抗体フラグメントを少なくとも含んでなるヒト由来ＣＥＴＰの検出または定量に用いられるキットである。
具体的には、前記固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントと前記標識モノクローナル抗体若しくは標識抗体フラグメントを含んでなるヒト由来ＣＥＴＰの検出または定量に用いられるキットである。
本発明の第１０は、前記モノクローナル抗体、それらに由来する前記組換キメラモノクローナル抗体若しくは組換ヒト型モノクローナル抗体、前記抗体フラグメントＦ（ａｂ’）２若しくはＦａｂ’、前記固定化モノクローナル抗体若しくは固定化抗体フラグメント、または前記標識モノクローナル抗体若しくは標識抗体フラグメントを少なくとも用いることを特徴とするイムノアッセイによりヒト由来ＣＥＴＰを検出または定量する方法である。
具体的側面としての第１は、少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含むイムノアッセイによりヒト由来ＣＥＴＰを検出または定量する方法である。
（ａ）前記固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントに試料を反応せしめる工程。
（ｂ）該固定化モノクローナル抗体または該固定化抗体フラグメントと試料中に含まれるヒト由来ＣＥＴＰとの結合により形成される抗原抗体複合体に前記標識モノクローナル抗体または標識抗体フラグメントを反応せしめる工程。
【００１３】
具体的側面の第２は、少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含むイムノアッセイによりヒト由来ＣＥＴＰを検出または定量する方法である。
（ａ）前記標識モノクローナル抗体または標識抗体フラグメントに試料を反応せしめる工程。
（ｂ）該標識モノクローナル抗体または該標識抗体フラグメントと試料中に含まれるヒト由来ＣＥＴＰとの結合により形成される抗原抗体複合体に前記固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントを反応せしめる工程。
具体的側面としての第３は、少なくとも下記（ａ）の工程を含むイムノアッセイによりヒト由来ＣＥＴＰを検出または定量する方法である。
（ａ）前記固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメント、前記標識モノクローナル抗体もしくは標識抗体フラグメント、及び試料を含む混合物を反応せしめる工程。
【００１４】
具体的側面としての第４は、少なくとも下記（ａ）の工程を含むイムノアッセイによりヒト由来ＣＥＴＰを検出または定量する方法である。
（ａ）前記固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントに、試料及び単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識してなる標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質を反応せしめる工程。
具体的側面としての第５は、少なくとも下記（ａ）の工程または（ｂ）及び（ｃ）の工程を含むイムノアッセイによりヒト由来ＣＥＴＰを検出または定量する方法である。
（ａ）試料と単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識してなる標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質との混合物に前記モノクローナル抗体または抗体フラグメントを反応せしめる工程。
（ｂ）試料に前記モノクローナル抗体または抗体フラグメントを反応せしめる工程。
（ｃ）（ｂ）の工程を行った反応系に単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識してなる標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質を反応せしめる工程。
【００１５】
さらに具体的には、少なくとも下記（ａ）及び（ｄ）の工程または（ｂ）乃至（ｄ）の工程を含むイムノアッセイによりヒト由来ＣＥＴＰを検出または定量する方法である。
（ａ）試料と単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識してなる標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質との混合物に前記モノクローナル抗体または抗体フラグメントを反応せしめる工程。
（ｂ）試料に前記モノクローナル抗体または抗体フラグメントを反応せしめる工程。
（ｃ）（ｂ）の工程を行った反応系に単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識してなる標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質を反応せしめる工程。
（ｄ）該試料中のヒト由来ＣＥＴＰ若しくは該標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質と該モノクローナル抗体または該抗体フラグメントとの結合により形成される抗原抗体複合体に、該モノクローナル抗体または該抗体フラグメントに反応性を有する哺乳動物由来の抗血清を反応せしめる工程。
【００１６】
本発明の第１１は、前記固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントを含んでなるヒト由来ＣＥＴＰの分離または精製に用いられるキットである。
本発明の第１２は、前記固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いることを特徴とするヒト由来ＣＥＴＰを分離または精製する方法であり、具体的には、カラムクロマトグラフィーを用いることを特徴とするヒト由来ＣＥＴＰの精製方法である。
本発明の第１３は、ヒト由来ＣＥＴＰをコードするＤＮＡが導入されたマウスであって、該マウスは、外的または人為的な誘発を必要とすることなく恒常的に血中にヒト由来ＣＥＴＰを分泌していることを特徴とするマウスである。
本発明の第１４は、前記モノクローナル抗体、それらに由来する前記組換キメラモノクローナル抗体若しくは組換ヒト型モノクローナル抗体、または前記抗体フラグメントＦ（ａｂ’）２若しくはＦａｂ’及び薬学的に許容されうる担体とを含んでなる医薬組成物である。具体的には、高脂血症または動脈硬化症の予防または治療に用いられる医薬組成物である。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明で用いる語句の意味を明らかにすることにより、本発明を詳細に説明する。
本発明における「モノクロ−ナル抗体」は、ヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有するモンクローナル抗体であり、具体的には、少なくとも下記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の性質を有するモノクローナル抗体である。
（ａ）健常人、高脂血症患者、ＬＣＡＴ欠損症患者または高ＨＤＬ血症患者の血漿中のＣＥＴＰに反応性を有する。
（ｂ）３μｇ／ｍｌ以下の濃度においてウサギ由来ＣＥＴＰに反応しない。
（ｃ）変性したヒト由来ＣＥＴＰには特異的な反応性を示さない。
さらに、本発明のモノクローナル抗体は、ヒト体液中に存在するインタクトなＣＥＴＰ対して反応性を有するという特徴を有する。
ここで、「変性したヒト由来ＣＥＴＰ」とは、熱処理あるいは界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ−２０やＴｒｉｔｏｎ−Ｘ等）等による処理により、タンパク質の高次構造が崩されているか、さらには生物学的に不活性なヒト由来ＣＥＴＰを意味する。
さらに具体的には、国際寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４９４４及びＦＥＲＭ ＢＰ−４９４５で識別されるハイブリドーマ＃７２−１及び＃８６−２から各々産生されるモノクロ−ナル抗体＃７２−１及び＃８６−２、並びに後述の実施例で調製されるハイブリドーマ＃１７６−１から産生されるモノクローナル抗体＃１７６−１である。
さらに本発明においては、遺伝子組換技術を用いて製造され得る該モノクローナル抗体に由来する組換キメラモノクローナル抗体、組換ヒト型モノクローナル抗体及びヒト抗体も包含する。
【００１８】
本発明のモノクローナル抗体（例えば、＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１等）は、既存のモノクローナル抗体の一般的な製造方法によって製造することができる。例えば、いわゆる細胞融合によって製造されるハイブリドーマ（融合細胞）から製造することができる。即ち、抗原を哺乳動物に免疫することにより抗体産生細胞を取得し、該抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）からハイブリドーマを調製し、該ハイブリドーマをクローン化し、哺乳動物の免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって製造される。
具体的には、変性していないインタクトな生物学的に活性な精製ヒト由来ＣＥＴＰを抗原として、該抗原を哺乳動物（ヒト抗体を産生するように遺伝子工学的に作出されたヒト抗体産生マウスのようなトランスジェニック動物も含む。）、具体的には、マウス、ラット、ハムスター、モルモットあるいはウサギ、さらに具体的にはマウス、ラットあるいはハムスターの皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内あるいは腹腔内に１乃至数回注射することにより免疫感作を施す。
通常、初回免疫から約１乃至１４日毎に１乃至４回免疫を行って、最終免疫より約１乃至５日後に免疫感作された該哺乳動物から抗体産生細胞が取得される。
【００１９】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの調製は、ケーラー及びミルシュタインらの方法（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第２５６巻、第４９５〜第４９７頁、１９７５年）及びそれに準じる修飾方法に従って行うことができる。即ち、前述の如く免疫感作された哺乳動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラットまたはヒトに由来する自己抗体産生能のないミエローマ細胞とを細胞融合させることにより調製される。
細胞融合に用いられるミエローマ細胞としては、例えばマウス由来ミエローマＰ３／Ｘ６３−ＡＧ８．６５３（６５３）、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／Ｏ、Ｓｐ２）、ＰＡＩ、Ｆ０あるいはＢＷ５１４７、ラット由来ミエローマ２１０ＲＣＹ３−Ａｇ．２．３．、ヒト由来ミエローマＵ−２６６ＡＲ１、ＧＭ１５００−６ＴＧ−Ａ１−２、ＵＣ７２９−６、ＣＥＭ−ＡＧＲ、Ｄ１Ｒ１１あるいはＣＥＭ−Ｔ１５等を使用することができる。
【００２０】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の前述の哺乳動物の免疫感作で用いた精製ヒト由来ＣＥＴＰに対する反応性を、例えばＲＩＡやＥＬＩＳＡ等の酵素免疫測定法によって測定することにより行なうことができる。
ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の製造は、ハイブリドーマをインビトロ、またはマウス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等、好ましくはマウスまたはラット、より好ましくはマウスの腹水中等でのインビボで行い、得られた培養上清、または哺乳動物の腹水から単離することにより行うことができる。
インビトロで培養する場合には、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々条件に合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地あるいは既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。
基本培地としては、例えば、Ｈａｍ’Ｆ１２培地、ＭＣＤＢ１５３培地あるいは低カルシウムＭＥＭ培地等の低カルシウム培地及びＭＣＤＢ１０４培地、ＭＥＭ培地、Ｄ−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＡＳＦ１０４培地あるいはＲＤ培地等の高カルシウム培地等が挙げられ、該基本培地は、目的に応じて、例えば血清、ホルモン、サイトカイン及び／または種々無機あるいは有機物質等を含有することができる。
モノクローナル抗体の単離、精製は、上述の培養上清あるいは腹水を、飽和硫酸アンモニウム、ユーグロブリン沈澱法、カプロイン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたはＤＥ５２等）、抗イムノグロブリンカラムあるいはプロテインＡカラム等のアフィニティカラムクロマトグラフィーに供すること等により行うことができる。
【００２１】
本発明における「組換キメラモノクロ−ナル抗体」は、遺伝子工学的に作製されるモノクローナル抗体であって、具体的には、その可変領域が前記モノクロ−ナル抗体、例えばモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１等に由来する可変領域であり、かつその定常領域がヒトイムノグロブリン由来の定常領域であることを特徴とする組換マウス／ヒトキメラモノクローナル抗体等のキメラモノクローナル抗体を意味する。ヒトイムノグロブリン由来の定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ等のアイソタイプにより各々固有のアミノ酸配列を有するが、本発明の組換キメラモノクローナル抗体の定常領域はいずれのアイソタイプに属するヒトイムノグログリンの定常領域であってもよい。好ましくは、ヒトＩｇＧの定常領域である。
本発明のモノクローナル抗体に包含されるモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１等に由来する組換マウス／ヒトキメラモノクローナル抗体は、例えば以下のようにして製造することができる。しかしながら、そのような製造方法に限定されるものでないことは言うまでもない。
【００２２】
例えば、実験医学（臨時増刊号）、第１．６巻、第１０号、１９８８年及び特公平３−７３２８０号公報等を参照しながら作製することができる。即ち、本発明のハイブリドーマ＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１から単離したモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１をコードするＤＮＡから取得した活性なＶＨ遺伝子（Ｈ鎖可変領域をコードする再配列されたＶＤＪ遺伝子）の下流に、ヒトイムノグロムリンをコードするＤＮＡから取得したＣＨ遺伝子（Ｈ鎖定常領域をコードするＣ遺伝子）を、またハイブリドーマ＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１から単離したモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１をコードするＤＮＡから取得した活性なＶＬ 遺伝子（Ｌ鎖可変領域をコードする再配列されたＶＪ遺伝子）の下流にヒトイムノグロムリンをコードするＤＮＡから取得したＣＬ遺伝子（Ｌ鎖定常領域をコードするＣ遺伝子）を、各々発現可能なように配列して１つ又は別々の発現ベクターに挿入し、該発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、該形質転換細胞を培養することにより作製することができる。宿主細胞としては、原核細胞（例えば大腸菌）及び真核細胞（例えばＣＨＯ細胞）のいずれをも使用することができる。
【００２３】
具体的には、まず、ハイブリドーマ＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１から常法によりＤＮＡを抽出後、該ＤＮＡを適切な制限酵素（例えばＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ等）を用いて消化し、電気泳動に付して（例えば０．７％アガロースゲル使用）サザンブロット法を行う。泳動したゲルを例えばエチジウムブロマイド等で染色し、写真撮影後、マーカーの位置を付し、ゲルを２回水洗し、０．２５Ｍ ＨＣｌ溶液に１５分間浸す。次いで、０．４ＮのＮａＯＨ溶液に１０分間浸し、その間緩やかに振盪する。常法により、フィルターに移し、４時間後フィルターを回収して２×ＳＳＣで２回洗浄する。フィルターを十分乾燥した後、ベイキング（７５℃、３時間）を行う。ベイキング終了後に、該フィルターを０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液に入れ、６５℃で３０分間処理する。次いで、３×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液に浸す。得られたフィルターをプレハイブリダイゼーション液と共にビニール袋に入れ、６５℃で３〜４時間処理する。
【００２４】
次に、この中に３２Ｐ標識したプローブＤＮＡ及びハイブリダイゼーション液を入れ、６５℃で１２時間程度反応させる。ハイブリダイゼーション終了後、適切な塩濃度、反応温度および時間（例えば、２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ溶液、室温、１０分間）のもとで、フィルターを洗う。該フィルターをビニール袋に入れ、２×ＳＳＣを少量加え、密封し、オートラジオグラフィーを行う。
上記サザンブロット法により、モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１のＨ鎖及びＬ鎖を各々コードする再配列されたＶＤＪ遺伝子及びＶＪ遺伝子を同定する。同定したＤＮＡ断片を含む領域をショ糖密度勾配遠心にて分画し、ファージベクター（例えば、Ｃｈａｒｏｎ ４Ａ， Ｃｈａｒｏｎ ２８， λＥＭＢＬ３，λＥＭＢＬ４等）に組み込み、該ファージベクターで大腸菌（例えば、ＬＥ３９２， ＮＭ５３９等） を形質転換し、ゲノムライブラリーを作製する。そのゲノムライブラリーを適当なプローブ〔Ｈ鎖Ｊ遺伝子，Ｌ鎖（κ）Ｊ遺伝子等〕を用いて、例えばベントンデイビス法（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第１９６巻、第１８０〜第１８２頁、１９７７年）に従って、プラークハイブリダイゼーションを行い、再配列されたＶＤＪ遺伝子あるいはＶＪ遺伝子を各々含むポジティブクローンを得る。得られたクローンの制限酵素地図を作製し、塩基配列を決定し、目的とする再配列されたＶＨ （ＶＤＪ） 遺伝子あるいはＶＬ （ＶＪ）遺伝子を含む遺伝子が得られていることを確認する。
【００２５】
一方、キメラ化に用いるヒトＣＨ 遺伝子及びヒトＣＬ 遺伝子を別に単離する。例えば、ヒトＩｇＧ１ とのキメラ抗体を作製する場合には、ＣＨ 遺伝子であるＣγ１ 遺伝子とＣＬ 遺伝子であるＣκ遺伝子を単離する。これらの遺伝子はマウス免疫グロブリン遺伝子とヒト免疫グロブリン遺伝子の塩基配列の高い相同性を利用してヒトＣγ１ 遺伝子及びヒトＣκ遺伝子に相当するマウスＣγ１ 遺伝子及びマウスＣκ遺伝子をプローブとして用い、ヒトゲノムライブラリーから単離することによって得ることができる。
具体的には、例えば、クローンＩｇ１４６（プロシーディングスナショナルアカデミーオブサイエンス（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ）、第７５巻、第４７０９〜第４７１３頁、１９７８年）からの３ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片とクローンＭＥＰ１０（プロシーディングスナショナルアカデミーオブサイエンス（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ）、第７８巻、第４７４〜第４７８頁、１９８１年）からの６．８ｋｂのＥｃｏＲＩ断片をプローブとして用い、ヒトのラムダＣｈａｒｏｎ ４Ａ のＨａｅＩＩＩ−ＡｌｕＩゲノムライブラリー（セル（Ｃｅｌｌ）、第１５巻、第１１５７〜第１１７４頁、１９７８年）中から、ヒトＣκ遺伝子を含み、エンハンサー領域を保持しているＤＮＡ断片を単離する。また、ヒトＣγ１ 遺伝子は、例えばヒト胎児肝細胞ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、アガロースゲル電気泳動で分画した後、５．９ｋｂのバンドをλ７８８に挿入し、前記のプローブを用いて単離する。
【００２６】
このようにして単離されたマウスＶＨ 遺伝子とマウスＶＬ 遺伝子、及びヒトＣＨ 遺伝子とヒトＣＬ 遺伝子を用いて、プロモーター領域及びエンハンサー領域などを考慮しながらマウスＶＨ 遺伝子の下流にヒトＣＨ 遺伝子を、またマウスＶＬ 遺伝子の下流にヒトＣＬ 遺伝子を、適切な制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いて、
例えばｐＳＶ２ｇｐｔあるいはｐＳＶ２ｎｅｏ等の発現ベクターに常法に従って組み込む。この際、マウスＶＨ 遺伝子／ヒトＣＨ 遺伝子とマウスＶＬ 遺伝子／ヒトＣＬ 遺伝子のキメラ遺伝子は、一つの発現ベクターに同時に配置されてもよいし、各々別個の発現ベクターに配置することもできる。
このようにして作製したキメラ遺伝子挿入発現ベクターを、例えばＰ３Ｘ６３・Ａｇ８・６５３ 細胞あるいは ＳＰ２１０細胞といった前述のような自らは抗体を産生していない骨髄腫細胞に、プロトプラスト融合法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リン酸カルシウム法あるいは電気穿孔法等により導入する。形質転換細胞は、発現ベクターに導入された薬物耐性遺伝子に対応する薬物含有培地中での培養により選別し、目的とするキメラモノクローナル抗体産生細胞を取得する。
このようにして選別された抗体産生細胞の培養上清中から目的のキメラモノクローナル抗体を取得する。
【００２７】
本発明における「組換ヒト型モノクロ−ナル抗体」は、遺伝子工学的に作製されるモノクローナル抗体であって、具体的には、その超可変領域の相補性決定領域の一部または全部が前記本発明のモノクロ−ナル抗体、例えば、モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１等に由来する可変領域の相補性決定領域であり、その超可変領域の枠組領域がヒトイムノグロブリン由来の超可変領域の枠組領域であり、かつその定常領域がヒトイムノグロブリン由来の定常領域であることを特徴とする組換モノクローナル抗体を意味する。
ここで、超可変領域の相補性決定領域とは、抗体の可変領域中の超可変領域に存在し、抗原と相補的に直接結合する部位である３つの領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｓｉｄｕｅ；ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を指し、また超可変領域の枠組領域とは、該３つ相補性決定領域の前後に介在する比較的保存された４つの領域（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ；ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）を指す。
【００２８】
換言すれば、本発明のモノクロ−ナル抗体の超可変領域の相補性決定領域の一部または全部以外の全ての領域が、ヒトイムノグロブリンの対応領域と置き代わったモノクローナル抗体を意味する。
ヒトイムノグロブリン由来の定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ等のアイソタイプにより各々固有のアミノ酸配列を有するが、本発明の組換ヒト型モノクローナル抗体の定常領域はいずれのアイソタイプに属するヒトイムノグログリンの定常領域であってもよい。好ましくは、ヒトＩｇＧの定常領域である。また、ヒトイムノグロブリン由来の超可変領域の枠組領域についても限定されるものではない。
本発明のモノクローナル抗体に包含されるモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１等に由来する組換ヒト型モノクローナル抗体は、例えば以下のようにして製造することができる。しかしながら、そのような製造方法に限定されるものでないことは言うまでもない。
【００２９】
例えば、特表平４−５０６４５８号公報及び特開昭６２−２９６８９０号公報等を参照して、遺伝子工学的に作製することができる。即ち、本発明のハイブリドーマ＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１から、少なくとも１つのマウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子と該マウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子に対応する少なくとも１つのマウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子を単離し、またヒトイムノグロブリン遺伝子から前記マウスＨ鎖ＣＤＲに対応するヒトＨ鎖ＣＤＲ以外の全領域をコードするヒトＨ鎖遺伝子と、前マウスＬ鎖ＣＤＲに対応するヒトＬ鎖ＣＤＲ以外の全領域をコードするヒトＬ鎖遺伝子を単離する。単離した該マウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子と該ヒトＨ鎖遺伝子を発現可能なように適当な発現ベクターに導入し、同様に該マウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子と該ヒトＬ鎖遺伝子を発現可能なように適当なもう１つの発現ベクターに導入する。または、該マウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子／ヒトＨ鎖遺伝子とマウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子／ヒトＬ鎖遺伝子を同一の発現ベクターに発現可能なように導入することもできる。このようにして作製された発現ベクターで宿主細胞を形質転換することによりヒト型モノクローナル抗体産生形質転換細胞を得、該形質転換細胞を培養することにより培養上清中から目的のヒト型モノクローナル抗体を得る。宿主細胞としては、原核細胞（例えば大腸菌）及び真核細胞（例えばＣＨＯ細胞）のいずれをも使用することができる
本発明における「ヒト抗体」とは、イムノグロブリンを構成するＨ鎖の可変領域及びＨ鎖の定常領域並びにＬ鎖の可変領域及びＬ鎖の定常領域を含む全ての領域がヒトイムノグロブリンをコードする遺伝子に由来するイムノグロブリンである。
ヒト抗体は、常法に従って、例えば、少なくともヒトイムノグロブリン遺伝子をマウス等のヒト以外の哺乳動物の遺伝子座中に組み込むことにより作製されたトランスジェニック動物を、抗原で免疫感作することにより、前述したポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体の作製法と同様にして製造することができる。例えば、ヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスは、ネイチャジェネティックス（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、第７巻、第１３〜第２１頁、１９９４年；特表平４−５０４３６５号公報；国際出願公開ＷＯ９４／２５５８５号公報；日経サイエンス、６月号、第４０〜第５０頁、１９９５年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３６８巻、第８５６〜８５９頁、１９９４年；及び特表平６−５００２３３号公報等に記載の方法に従って製作することができる。
【００３０】
本発明における「Ｆ（ａｂ’）２」及び「Ｆａｂ’」とは、イムノグロブリン（モノクローナル抗体）を、蛋白分解酵素であるペプシンあるいはパパイン等で処理することにより製造され、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の前後で消化されて生成される抗体フラグメントを意味する。例えば、ＩｇＧ１をパパインで処理すると、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の上流で切断されてＶＬ（Ｌ鎖可変領域）とＣＬ（Ｌ鎖定常領域）からなるＬ鎖、及びＶＨ（Ｈ鎖可変領域）とＣＨγ１（Ｈ鎖定常領域中のγ１領域）とからなるＨ鎖フラグメントがＣ末端領域でジスルフィド結合により結合した相同な２つの抗体フラグメントを製造することができる。これら２つの相同な抗体フラグメントを各々Ｆａｂ’という。またＩｇＧをペプシンで処理すると、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の下流で切断されて前記２つのＦａｂ’がヒンジ領域でつながったものよりやや大きい抗体フラグメントを製造することができる。この抗体フラグメントをＦ（ａｂ’）２という。
【００３１】
本発明における「哺乳動物由来の抗血清」とは、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ブタあるいはウシ等の哺乳動物、好ましくはラット、モルモット、ウサギあるいはヤギに、前記本発明のモノクローナル抗体あるいは前記本発明の抗体フラグメントを、前述モノクローナル抗体の製造方法で述べたような方法で免疫して製造される該本発明のモノクローナル抗体または抗体フラグメントに反応性を有する抗体を含む血清を意味する。具体的には、前記本発明のモノクローナル抗体（例えば、モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２若しくは＃１７６−１等）またはそれらの抗体フラグメントＦ（ａｂ’）２若しくはＦａｂ’を前記哺乳動物に免疫して得られる該哺乳動物由来の抗血清である。
【００３２】
本発明における「不溶性担体」とは、前記モノクローナル抗体若しくは抗体フラグメント、または試料（例えば、血漿等の体液試料、培養上清あるいは遠心上清等）中に含まれるヒト由来ＣＥＴＰを物理学的吸着あるいは化学的結合等によって坦持させるための支持体を意味する。例えば、（１）ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコン樹脂あるいはナイロン樹脂等からなるプラスチックや、ガラス等に代表されるような水に不溶性の物質からなるプレート、試験管若しくはチューブ等の内容積を有するもの、ビーズ、ボール、フィルター、あるいはメンブレン等、並びに（２）セルロース系担体、アガロース系担体、ポリアクリルアミド系担体、デキストラン系担体、ポリスチレン系担体、ポリビニルアルコール系担体、ポリアミノ酸系担体あるいは多孔性シリカ系担体等のようなアフィニティークロマトグラフィーに用いられる不溶性担体を挙げることができる。
【００３３】
「固定化モノクローナル抗体」及び「固定化抗体フラグメント」とは、該「不溶性担体」に物理的吸着あるいは化学的結合等によって坦持された状態にあるモノクローナル抗体及び抗体フラグメントを各々意味する。これらの固定化モノクローナル抗体及び固定化抗体フラグメントは、試料（例えば、血漿等の体液試料、培養上清あるいは遠心上清等）中に含まれるヒト由来ＣＥＴＰを検出、定量、分離または精製するために用いることができる。該検出または定量の目的においては、前記（１）に挙げた不溶性担体に固定化された固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントを用いることができ、とりわけ定量に用いる不溶性担体としては、操作の簡便性及び多数検体の同時処理の観点を考慮すると、例えば９６穴マイクロタイタープレート等の多数のウェル（Ｗｅｌｌ、穴）を有するプラスチックプレートを用いるのが好ましい。また、該分離または精製の目的においては、前記（１）に挙げたフィルター若しくはメンブレンまたは前記（２）に挙げた不溶性担体に固定化された固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントを用いることができる。
【００３４】
本発明における「単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質」とは、前記モノクローナル抗体、抗体フラグメントあるいはヒト由来ＣＥＴＰ標準物質に物理化学的結合等により結合させることによりそれらの存在を検出可能にするために用いられる物質を意味し、具体的には、酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジンあるいは放射性同位体等であり、さらに具体的には、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ−ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質、３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、アビジン、または化学発光物質が挙げられる。
【００３５】
ここで、放射性同位体及び蛍光物質は単独で検出可能なシグナルをもたらすことができる。一方、酵素、化学発光物質、ビオチン及びアビジンは、単独では検出可能なシグナルをもたらすことができないため、さらに１種以上の他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらす。例えば、酵素の場合には少なくとも基質が必要であり、酵素活性を測定する方法（比色法、蛍光法、生物発光法あるいは化学発光法等）に依存して種々の基質が用いられる。また、ビオチンの場合には少なくともアビジンあるいは酵素修飾アビジンを反応させるのが一般的であるが、この限りではない。必要に応じてさらに該基質に依存する種々の発色物質が用いられる。
【００３６】
「標識モノクローナル抗体」、「標識抗体フラグメント」及び「標識ヒト由来標準物質」とは、各々該標識物質で標識されたモノクローナル抗体、抗体フラグメント及びヒト由来ＣＥＴＰ標準物質を意味する。これらの標識モノクローナル抗体、標識抗体フラグメント及び標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質は、試料（例えば、血漿等の体液試料、培養上清あるいは遠心上清等）中に含まれるヒト由来ＣＥＴＰを検出または定量するために用いることができる。本発明においては、上記のいずれの標識物質をも使用可能であるが、検出感度あるいは定量感度の高さ及び操作の利便性の点を考慮すると、ビオチンで標識するのが好ましい。
ここで「ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質」とは、前述のような試料中に含まれるヒト由来ＣＥＴＰの検出または定量において使用される標品（スタンダード）としてのヒト由来ＣＥＴＰを意味する。
【００３７】
本発明における「イムノアッセイ」とは、抗原抗体反応の原理に基づき、試料（例えば、血漿等の体液試料、培養上清あるいは遠心上清等）中に含まれる抗原の検出あるいは定量を行う方法を意味し、本発明においては、該抗原抗体反応における抗体が、本発明のヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有する前記モノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメント、前記固定化モノクローナル抗体若しくは固定化抗体フラグメント、または前記標識モノクローナル抗体若しくは標識抗体フラグメントから選ばれる一つ以上の該モノクローナル抗体または抗体フラグメントをであること、及び抗原がヒト由来ＣＥＴＰであること以外は、これまでに知られているイムノアッセイをも適用することができる。
【００３８】
具体的には、酵素免疫測定法（第３版、石川榮治ら編集、医学書院発行、１９８７年）に記載されているような、例えば、一抗体固相法、二抗体液相法、二抗体固相法、サンドイッチ法、ＥＭＩＴ法（Ｅｎｚｙｍｅ ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）、エンザイムチャネリングアッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、酵素活性修飾物質標識イムノアッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＥＭＭＩＡ）、酵素阻害物質標識イムノアッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、イムノエンザイムメトリックアッセイ（Ｉｍｍｕｎｏｅｎｚｙｍｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ）、酵素活性増強イムノアッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）あるいはプロキシマールリンケージイムノアッセイ（Ｐｒｏｘｉｍａｌ ｌｉｎｋａｇｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）等、さらには、特公平２−３９７４７号公報に記載されているようなワンポット法を挙げることができる。
【００３９】
本発明においては、このようなイムノアッセイを、目的に応じて適宜選択して用いることができるが、操作上の簡便性及び／または経済的な利便性、とりわけ臨床上での汎用性の点を考慮すると、サンドイッチ法、ワンポット法、一抗体固相法または二抗体液相法を用いるのが好ましく、より好ましくは、サンドイッチ法またはワンポット法である。特に好ましくは、９６穴マイクロプレートに代表されるような多数のウェルを有するマイクロプレートに固定化された固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントと、酵素あるいはビオチンにより標識された標識モノクローナル抗体または標識抗体フラグメントとを用いるサンドイッチ法、あるいはビーズまたはボールに固定化された固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントと、酵素あるいはビオチンにより標識された標識モノクローナル抗体または標識抗体フラグメントとを用いるワンポット法である。
【００４０】
この特に好ましい態様において具体的な一例を挙げるならば、モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２若しくは＃１７６−１またはそれらのＦ（ａｂ’）２若しくはＦａｂ’をマイクロプレートに固定化した固定化モノクローナル抗体または固定化Ｆ（ａｂ’）２若しくは固定化Ｆａｂ’とモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２若しくは＃１７６−１またはそのＦ（ａｂ’）２若しくはＦａｂ’を酵素またはビオチンで標識した標識モノクローナル抗体また標識Ｆ（ａｂ’）２若しくはＦａｂ’との組合わせによるサンドイッチ法またはワンポット法である。モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１は、各々固定化モノクローナル抗体としても、また標識モノクローナル抗体としても使用でき得るが、モノクローナル抗体＃７２−１を固定化モノクローナル抗体として、また＃８６−２または＃１７６−１を標識モノクローナル抗体として用いるのが好ましい。特に好ましくは、モノクローナル抗体＃７２−１（ＦＥＲＭ ＢＰ４９４４で識別されるハイブリドーマに由来するモノクローナル抗体）を固定化モノクローナル抗体として、また、モノクローナル抗体＃８６−２（ＦＥＲＭＢＰ４９４５で識別されるハイブリドーマに由来するモノクローナル抗体）を標識モノクローナル抗体として用いることができる。
【００４１】
以下に、サンドイッチ法、ワンポット法、一抗体固相法及び二抗体液相法について詳述する。
サンドイッチ法は、前述の本発明の第１０の具体的側面の第１で述べた方法、即ち、少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含むイムノアッセイ法である。
（ａ）本発明の固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントに試料を反応せしめる工程。
（ｂ）該固定化モノクローナル抗体または該固定化抗体フラグメントと試料中に含まれるヒト由来ＣＥＴＰとの結合により形成される抗原抗体複合体に本発明の標識モノクローナル抗体または標識抗体フラグメントを反応せしめる工程。
本発明に即して、特に一般的である酵素あるいはビオチンを標識物質として用いる方法について具体的に説明すると、例えば下記のような工程により構成されるが、該具体例のみに限定されるものではない。なお、以下で使用する「固定化モノクローナル抗体」と「モノクローナル抗体固定化マイクロプレート」は、同一物を意味する。
【００４２】
（工程１）ヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有する本発明のモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１をマイクロプレートに固定化し、固定化モノクローナル抗体（モノクローナル抗体固定化マイクロプレート）を作製する工程；
（工程２）モノクローナル抗体固定化マイクロプレートにヒト血漿等の試料を加え、固定化モノクローナル抗体と試料を反応させる工程；
（工程３）モノクローナル抗体固定化マイクロプレートを洗浄し未反応の試料を固定化モノクローナル抗体から取り除く工程；
（工程４）ヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有する本発明のモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１をビオチンあるいはペルオキシダーゼ等の酵素により標識し、標識モノクローナル抗体を作製する工程；
（工程５）工程３で洗浄されたモノクローナル抗体固定化マイクロプレートに、標識モノクローナル抗体を加え、固定化モノクローナル抗体と試料中に含まれるヒト由来ＣＥＴＰが反応して形成される抗原抗体複合体に標識モノクローナル抗体を反応させる工程；
【００４３】
（工程６）モノクローナル抗体固定化マイクロプレートを洗浄し、未反応の標識モノクローナル抗体を抗原抗体複合体から取り除く工程；
（工程７）工程６で洗浄されたモノクローナル抗体固定化マイクロプレートに、工程４でビオチン標識モノクローナル抗体を用いた場合にはアビジンあるいは酵素修飾アビジンを、また工程４でペルオキシダーゼ等の酵素で標識した酵素標識モノクローナル抗体を用いた場合には酵素活性を測定する方法に依存して種々の基質を、必要に応じて発色物質とともに加え、標識モノクローナル抗体上の標識物質と反応させる工程；
（工程８）工程７で酵素修飾アビジンを加えた場合には、酵素活性を測定する方法に依存して種々の基質を加え、アビジンに結合した酵素と基質を反応させる工程；
（工程９）モノクローナル抗体固定化マイクロプレートに反応停止液を加え、酵素反応及び発色反応を停止させる工程；及び
（工程１０）比色強度、蛍光強度あるいは発光強度を測定する工程。
モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１は、固定化モノクローナル抗体としても標識モノクローナル抗体としても使用でき得るが、モノクローナル抗体＃７２−１を固定化モノクローナル抗体として、またモノクローナル抗体＃８６−２または＃１７６−１（特に好ましくはモノクローナル抗体＃８６−２）を標識モノクローナル抗体として用いるのが好ましい。
【００４４】
ワンポット法は、前述の本発明の第１０の具体的側面の第１、第２または第３で各々述べた方法、即ち、第１は、少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含むイムノアッセイ法である。
（ａ）本発明の固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントに試料を反応せしめる工程。
（ｂ）該固定化モノクローナル抗体または該固定化抗体フラグメントと試料中に含まれるヒト由来ＣＥＴＰとの結合により形成される抗原抗体複合体に本発明の標識モノクローナル抗体または標識抗体フラグメントを反応せしめる工程。
第２は、少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含むイムノアッセイ法である。
（ａ）本発明の標識モノクローナル抗体または標識抗体フラグメントに試料を反応せしめる工程。
（ｂ）該標識モノクローナル抗体または該標識抗体フラグメントと試料中に含まれるヒト由来ＣＥＴＰとの結合により形成される抗原抗体複合体に本発明の固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントを反応せしめる工程。
【００４５】
第３は、少なくとも下記（ａ）の工程を含むイムノアッセイ法である。
（ａ）本発明の固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメント、本発明の標識モノクローナル抗体もしくは標識抗体フラグメント、及び試料を含む混合物を反応せしめる工程。
上記第１乃至第３の方法を、本発明に即して、特に一般的である酵素あるいはビオチンを標識物質として用いる方法について具体的に説明すると、例えば下記のような工程により構成されるが、該具体例のみに限定されるものではない。なお、以下で使用する「固定化モノクローナル抗体」と「モノクローナル抗体固定化ビーズ」は、同一物を意味する。
【００４６】
第１の方法は、下記のような工程から構成される。
（工程１）ヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有する本発明のモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１をビーズに固定化し、固定化モノクローナル抗体（モノクローナル抗体固定化ビーズ）を作製する工程；
（工程２）試験管、プレートあるいはチューブ等のような内容積を有する容器に緩衝液とともにモノクローナル抗体固定化ビーズとヒト血漿等の試料を加え、固定化モノクローナル抗体と試料を反応させる工程；
（工程３）容器中の内溶液の除去及びモノクローナル抗体固定化ビーズを洗浄する工程；
（工程４）ヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有する本発明のモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１をビオチンあるいはペルオキシダーゼ等の酵素により標識し、標識モノクローナル抗体を作製する工程；
（工程５）工程３で洗浄されたモノクローナル抗体固定化ビーズを含有する容器に、標識モノクローナル抗体を加え、固定化モノクローナル抗体と試料中に含まれるヒト由来ＣＥＴＰが反応して形成される抗原抗体複合体に標識モノクローナル抗体を反応させる工程；
【００４７】
（工程６）容器中の内溶液の除去及びモノクローナル抗体固定化ビーズを洗浄し、未反応の標識モノクローナル抗体を抗原抗体複合体から取り除く工程；
（工程７）工程６で洗浄されたモノクローナル抗体固定化ビーズを含む容器に、工程４でビオチン標識モノクローナル抗体を用いた場合にはアビジンあるいは酵素修飾アビジンを、また工程４でペルオキシダーゼ等の酵素で標識した酵素標識モノクローナル抗体を用いた場合には酵素活性を測定する方法に依存して種々の基質を、必要に応じて発色物質とともに加え、標識モノクローナル抗体上の標識物質と反応させる工程；
（工程８）工程７で酵素修飾アビジンを加えた場合には、酵素活性を測定する方法に依存して種々の基質を加え、アビジンに結合した酵素と基質を反応させる工程；
（工程９）工程７または工程８の反応系に反応停止液を加え、酵素反応及び発色反応を停止させる工程；及び
（工程１０）比色強度、蛍光強度あるいは発光強度を測定する工程。
【００４８】
第２の方法は、下記のような工程から構成される。
（工程１）ヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有する本発明のモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１をビオチンあるいはペルオキシダーゼ等の酵素により標識し、標識モノクローナル抗体を作製する工程；
（工程２）試験管、プレートあるいはチューブ等のような内容積を有する容器に緩衝液とともに標識モノクローナル抗体とヒト血漿等の試料を加え、標識モノクローナル抗体と試料を反応させる工程；
（工程３）ヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有する本発明のモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１をビーズに固定化し、固定化モノクローナル抗体（モノクローナル抗体固定化ビーズ）を作製する工程；
（工程４）工程２の反応系に、モノクローナル抗体固定化ビーズを加え、標識モノクローナル抗体と試料中に含まれるヒト由来ＣＥＴＰが反応して形成される抗原抗体複合体に固定化モノクローナル抗体を反応させる工程；
（工程５）容器中の内溶液の除去及びモノクローナル抗体固定化ビーズを洗浄し、未反応の標識モノクローナル抗体を取り除く工程；
（工程６）工程５で洗浄されたモノクローナル抗体固定化ビーズを含む容器に、工程１でビオチン標識モノクローナル抗体を用いた場合にはアビジンあるいは酵素修飾アビジンを、また工程１でペルオキシダーゼ等の酵素で標識した酵素標識モノクローナル抗体を用いた場合には酵素活性を測定する方法に依存して種々の基質を、必要に応じて発色物質とともに加え、標識モノクローナル抗体上の標識物質と反応させる工程；
（工程７）工程６で酵素修飾アビジンを加えた場合には、酵素活性を測定する方法に依存して種々の基質を加え、アビジンに結合した酵素と基質を反応させる工程；
（工程８）工程６または工程７の反応系に反応停止液を加え、酵素反応及び発色反応を停止させる工程；及び
（工程９）比色強度、蛍光強度あるいは発光強度を測定する工程。
【００４９】
第３の方法は、下記のような工程から構成される。
（工程１）ヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有する本発明のモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１をビーズに固定化し、固定化モノクローナル抗体（モノクローナル抗体固定化ビーズ）を作製する工程；
（工程２）ヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有する本発明のモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１をビオチンあるいはペルオキシダーゼ等の酵素により標識し、標識モノクローナル抗体を作製する工程；
（工程３）試験管、プレートあるいはチューブ等のような内容積を有する容器に緩衝液とともに、工程１で作製されたモノクローナル抗体固定化ビーズ、工程２で作製された標識モノクローナル抗体、及びヒト血漿等の試料を加え、固定化モノクローナル抗体、標識モノクローナル抗体、及び試料を同時に反応させる工程；
（工程４）容器中の内溶液の除去及びモノクローナル抗体固定化ビーズを洗浄し、未反応の標識モノクローナル抗体を取り除く工程；
（工程５）工程４で洗浄されたモノクローナル抗体固定化ビーズを含む容器に、工程２でビオチン標識モノクローナル抗体を用いた場合にはアビジンあるいは酵素修飾アビジンを、また工程２でペルオキシダーゼ等の酵素で標識した酵素標識モノクローナル抗体を用いた場合には酵素活性を測定する方法に依存して種々の基質を、必要に応じて発色物質とともに加え、標識モノクローナル抗体上の標識物質と反応させる工程；
【００５０】
（工程６）工程５で酵素修飾アビジンを加えた場合には、酵素活性を測定する方法に依存して種々の基質を加え、アビジンに結合した酵素と基質を反応させる工程；
（工程７）工程５または工程６の反応系に反応停止液を加え、酵素反応及び発色反応を停止させる工程；及び
（工程８）比色強度、蛍光強度あるいは発光強度を測定する工程。
上述の第１乃至第３の方法の具体例において、モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１は、固定化モノクローナル抗体としても標識モノクローナル抗体としても使用でき得るが、モノクローナル抗体＃７２−１を固定化モノクローナル抗体として、また＃８６−２または＃１７６−１（好ましくは、モノクローナル抗体＃８６−２）を標識モノクローナル抗体として用いるのが好ましい。
【００５１】
一抗体固相法は、前述の本発明の第１０の具体的側面の第４で述べた方法、即ち、少なくとも下記（ａ）の工程を含むイムノアッセイ法である。
（ａ）本発明の固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントに、試料及び単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識してなる標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質を反応せしめる工程。
本発明に即して、特に一般的である酵素あるいはビオチンを標識物質として用いる方法について具体的に説明すると、例えば下記のような工程により構成されるが、該具体例のみに限定されるものではない。なお、以下で使用する「固定化モノクローナル抗体」と「モノクローナル抗体固定化マイクロプレート」は、同一物を意味する。
【００５２】
（工程１）ヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有する本発明のモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１をマイクロプレートに固定化し、固定化モノクローナル抗体（モノクローナル抗体固定化マイクロプレート）を作製する工程；
（工程２）ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質をビオチンあるいはペルオキシダーゼ等の酵素により標識し、標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質を作製する工程；
（工程３）モノクローナル抗体固定化マイクロプレートにヒト血漿等の試料及び標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質を加え、試料と標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質とを競合的に固定化モノクローナル抗体と反応させる工程；
（工程４）モノクローナル抗体固定化マイクロプレートを洗浄し、未反応の標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質を固定化モノクローナル抗体から取り除く工程；
（工程５）工程４で洗浄されたモノクローナル抗体固定化マイクロプレートに、工程２でビオチン標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質を用いた場合にはアビジンあるいは酵素修飾アビジンを、また工程２でペルオキシダーゼ等の酵素で標識した酵素標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質を用いた場合には酵素活性を測定する方法に依存して種々の基質を、必要に応じて発色物質とともに加え、標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質上の標識物質と反応させる工程；
【００５３】
（工程６）工程５で酵素修飾アビジンを加えた場合には、酵素活性を測定する方法に依存して種々の基質を加え、アビジンに結合した酵素と基質を反応させる工程；
（工程７）モノクローナル抗体固定化マイクロプレートに反応停止液を加え、酵素反応及び発色反応を停止させる工程；及び
（工程８）比色強度、蛍光強度あるいは発光強度を測定する工程。
固定化モノクローナル抗体としては、モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１のいずれをも使用でき得るが、モノクローナル抗体＃７２−１を固定化モノクローナル抗体として用いるのが好ましい。
【００５４】
二抗体液相法は、前述の本発明の第１０の具体的側面の第５で述べた方法、即ち、少なくとも下記（ａ）の工程または（ｂ）及び（ｃ）の工程を含むイムノアッセイ法である。
（ａ）試料と単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識してなる標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質との混合物に本発明のモノクローナル抗体または抗体フラグメントを反応せしめる工程。
（ｂ）試料に本発明のモノクローナル抗体または抗体フラグメントを反応せしめる工程。
（ｃ）（ｂ）の工程を行った反応系に単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識してなる標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質を反応せしめる工程。
【００５５】
さらに具体的には、少なくとも下記（ａ）及び（ｄ）の工程または（ｂ）乃至（ｄ）の工程を含むイムノアッセイ法である。
（ａ）試料と単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識してなる標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質との混合物に本発明のモノクローナル抗体または抗体フラグメントを反応せしめる工程。
（ｂ）試料に本発明のモノクローナル抗体または抗体フラグメントを反応せしめる工程。
（ｃ）（ｂ）の工程を行った反応系に単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識してなる標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質を反応せしめる工程。
（ｄ）該試料中のヒト由来ＣＥＴＰ若しくは該標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質と該モノクローナル抗体または該抗体フラグメントとの結合により形成される抗原抗体複合体に、該モノクローナル抗体または該抗体フラグメントに反応性を有する哺乳動物由来の抗血清を反応せしめる工程。
【００５６】
本発明に即して、特に一般的である酵素あるいはビオチンを標識物質として用いる方法について具体的に説明すると、例えば下記のような工程により構成されるが、該具体例のみに限定されるものではない。
（工程１）ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質をビオチンあるいはペルオキシダーゼ等の酵素により標識し、標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質を作製する工程；
（工程２）▲１▼ 試験管、プレートあるいはチューブ等のような内容積を有する容器にヒト血漿等の試料と工程１で作製された標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質との混合物を加え、次いでヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有する本発明のモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１を加え、試料と標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質とを競合的に該本発明のモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１とを反応させる工程；または、
▲２▼ 試験管、プレートあるいはチューブ等のような内容積を有する容器にヒト血漿等の試料を加え、次いでヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有する本発明のモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１を加え、該試料と該本発明のモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１とを反応させる工程；
【００５７】
（工程３）工程２において標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質を同時に加えない場合（▲２▼）には、標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質を加え、標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質とを該本発明のモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１と反応させる工程；
（工程４）ヤギ抗マウスγグロブリン血清等のようなマウス由来のモノクローナル抗体に反応性を有するマウス以外の動物由来の抗血清を加え、工程２乃至工程３において形成されるモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２若しくは＃１７６−１と試料中に含まれるヒト由来ＣＥＴＰ若しくは標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質との抗原抗体複合体に反応させ、モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２若しくは＃１７６−１、試料中に含まれるヒト由来ＣＥＴＰ若しくは標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質、及び該マウス以外の動物由来の抗血清との３つからなる複合体を凝集沈殿させる工程；
（工程５）工程４の反応系を遠心分離して凝集沈殿した複合体を分離する工程；
【００５８】
（工程６）工程５で分離された複合体凝集物に、工程１でビオチン標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質を用いた場合にはアビジンあるいは酵素修飾アビジンを、また工程１でペルオキシダーゼ等の酵素で標識した酵素標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質を用いた場合には酵素活性を測定する方法に依存して種々の基質を、必要に応じて発色物質とともに加え、標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質上の標識物質と反応させる工程；
（工程７）工程６で酵素修飾アビジンを加えた場合には、酵素活性を測定する方法に依存して種々の基質を加え、アビジンに結合した酵素と基質を反応させる工程；
（工程８）工程６乃至工程７の反応系に反応停止液を加え、酵素反応及び発色反応を停止させる工程；及び
（工程９）比色強度、蛍光強度あるいは発光強度を測定する工程。
上述の具体例において用いられるモノクローナル抗体としては、モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１のいずれをも使用でき得るが、モノクローナル抗体＃７２−１を用いるのが好ましい。
【００５９】
本発明における「アフィニティークロマトグラフィー」とは、抗原抗体反応を利用することにより試料（例えば、血漿等の体液試料、培養上清あるいは遠心上清等）中に含まれるヒト由来ＣＥＴＰを分離または精製する方法を意味する。具体的には、（１）前述のような不溶性担体であるフィルターあるいはメンブレン等に本発明のヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有するモノクローナル抗体あるいは抗体フラグメントを固定化した後、該フィルターあるいはメンブレンと試料を接触させることにより該試料中に含まれるヒト由来ＣＥＴＰを分離する方法、及び（２）前述のようなセルロース系担体、アガロース系担体、ポリアクリルアミド系担体、デキストラン系担体、ポリスチレン系担体、ポリビニルアルコール系担体、ポリアミノ酸系担体あるいは多孔性シリカ系担体等のような不溶性担体上に本発明のヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有するモノクローナル抗体あるいは抗体フラグメントを常法により固定化（物理的吸着、架橋による高分子化、マトリックス中への封印あるいは非共有結合等による固定化）し、該不溶性担体をガラス製、プラスチック製あるいはステンレス製等のカラムに充填し、該カラム（例えば、円柱状カラム）に、試料（例えば、血漿等の体液試料、培養上清あるいは遠心上清等）を通じて溶出させることにより、該試料中に含まれるヒト由来ＣＥＴＰを分離あるいは精製する方法である。後者（２）の方法を特にアフィニティーカラムクロマトグラフィーという。
【００６０】
該アフィニティーカラムクロマトグラフィーに用いられる前記不溶性担体としては、本発明のモノクローナル抗体あるいは抗体フラグメントを固定化でき得るものであればどのような不溶性担体でも使用できるが、例えば、市販品である、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社（製）のＳｅｐｈａｒｏｓｅ ２Ｂ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ、ＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ、ＡＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ、ＣＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ、Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＣＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ、Ｅｐｏｘｙ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ、Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｔｈｉｏｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ、ＥＣＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ、ＥＡＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ、ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＳｅｐｈａｒｏｓｅあるいはＴｈｉｏｐｒｏｐｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ等、バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社（製）のＢｉｏ−Ｇｅｌ Ａ、Ｃｅｌｌｅｘ、Ｃｅｌｌｅｘ ＡＥ、Ｃｅｌｌｅｘ−ＣＭ、Ｃｅｌｌｅｘ ＰＡＢ、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ、Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ、Ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ ＣＭ、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ １０、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ １５、Ａｆｆｉ−Ｐｒｅｐ １０、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ Ｈｚ、Ａｆｆｉ−Ｐｒｅｐ Ｈｚ、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ １０２、ＣＭ Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ａ、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ ｈｅｐａｒｉｎ、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ ５０１あるいはＡｆｆｉ−Ｇｅｌ ６０１等、和光純薬工業社（製）のクロマゲルＡ、クロマゲルＰ、エンザフィックス Ｐ−ＨＺ、エンザフィックス Ｐ−ＳＨあるいはエンザフィックス Ｐ−ＡＢ等、セルバ（Ｓｅｒｖａ）社（製）のＡＥ−Ｃｅｌｌｕｒｏｓｅ、ＣＭ−ＣｅｌｌｕｒｏｓｅあるいはＰＡＢ Ｃｅｌｌｕｒｏｓｅ等を挙げることができる。
本発明における「ヒト由来ＣＥＴＰをコードするＤＮＡが導入されたマウス」は、トランスジェニックマウスの製造において通常使用されるような常法（最新動物細胞実験マニュアル、エル・アイ・シー発行、第７章、第３６１〜第４０８頁、１９９０年）に従って作成することが可能である。
ヒトＣＥＴＰ遺伝子が導入されたトランスジェニックマウスとしては、トール（Ｔａｌｌ）らが作成したマウスが報告されているが、当該マウスは例えば亜鉛を混ぜた食餌を摂取させるなどの外的あるいは人為的な誘発を受けないと、血中にヒトＣＥＴＰを分泌しないマウスである。
本発明のトランスジェニックマウスは、そのような何らの人為的誘発を必要とすることなく、血中に恒常的にヒト由来ＣＥＴＰを分泌するものであり、このようなトランスジェニックマウスはこれまで報告されていない。
【００６１】
本発明における「医薬組成物」は、本発明のモノクローナル抗体あるいは抗体フラグメントを有効成分として、薬学的に許容され得る担体、即ち、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等の一つ以上とともに医薬組成物とし、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、注射剤、液剤、カプセル剤、トロー剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態により経口あるいは非経口的に投与することができる。
【００６２】
とりわけ注射剤の場合には、例えば生理食塩水あるいは市販の注射用蒸留水等の非毒性の薬学的に許容され得る担体中に０．１μｇ抗体／ｍｌ担体〜１０ｍｇ抗体／ｍｌ担体の濃度となるように溶解または懸濁することにより製造することができる。このようにして製造された注射剤は、処置を必要とするヒト患者に対し、１回の投与において１ｋｇ体重あたり、１μｇ〜１００ｍｇの割合で、好ましくは５０μｇ〜５０ｍｇの割合で、１日あたり１回〜数回投与することができる。投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注射のような医療上適当な投与形態が例示できる。好ましくは静脈内注射である。
また、本発明の該医薬組成物は、高脂血症の予防及び治療への適用のみならず、ＣＥＴＰの動態異常に起因する動脈硬化症、高ＨＤＬ血症あるいは高コレステロール血症等の各種疾患の治療または予防への適用が可能である。
【００６３】
【実施例】
以下、実施例を以て本発明をさらに詳細に説明するが、本発明が該実施例に記載される態様のみに限定されるものではないことは言うまでもない。
実施例１ ＣＥＴＰ活性測定系の構築
特に断りのない限り本実施例で用いたＣＥＴＰ活性（コレステロールエステル（ＣＥ）転送活性）の測定は、以下のようにして構築した測定系を用いた。また、該測定系は、アルバーツ（Ａｌｂｅｒｔｓ）らの方法（アルテリオスクレロシス（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、第４巻、第４９〜第５８頁、第１９８４年）の改変法である。
即ち、本測定法は、まず、放射性標識されたコレステロールエステル（ＣＥ）を取り込んだ高比重リポ蛋白（ＨＤＬ３）からなるドナーリポ蛋白、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）からなるアクセプターリポ蛋白、並びにＣＥＴＰを含有する測定試料を混合し生理学的に反応させる。次いで、標識ＣＥのドナーリポ蛋白からアクセプターリポ蛋白への転送量を、ドナーリポ蛋白の放射活性の減少あるいはアクセプターリポ蛋白の放射活性の増加を測定することにより試料中のＣＥＴＰのＣＥ転送活性を測定するものである。
【００６４】
＜１−１＞ ドナーリポ蛋白の調製
健常人血漿（２０ｍｌ）に臭化カリウム（ＫＢｒ）を加え、比重ｄ＝１．１２５ｇ／ｍｌに調節し、密度勾配遠心分離（２２７，０００×ｇ、４℃、１７時間）して、比重ｄ＞１．１２５ｇ／ｍｌの分画（ＨＤＬ３分画）を採取した。得られた分画を、ＴＢＳ（０．１５ＭのＮａＣｌ／１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４））で透析した。次いで、１０ｎＭのトリチウム標識コレステロール（［３Ｈ］Ｃ、５０．３Ｃｉ／ｍＭ）を、９５％エタノールで溶解し、攪拌しながら徐々に添加し、３７℃で１８時間インキュベートした（この操作により、ＨＤＬ３表面のトリチウム標識コレステロール（［３Ｈ］Ｃ）は、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）の作用によりエステル化され、トリチウム標識コレステロールエステル（［３Ｈ］ＣＥ）となりＨＤＬ３内部に取り込まれる。）。
臭化カリウムを加え、比重ｄ＝１．２１ｇ／ｍｌに調節し、密度勾配遠心分離（２２７，０００×ｇ、４℃、２０時間）して、比重ｄ＜１．２１ｇ／ｍｌの分画を採取した。得られた分画を前記ＴＢＳで透析し、［３Ｈ］ＣＥを取り込んだＨＤＬ３（［３Ｈ］ＣＥ−ＨＤＬ３、比重：１．１２５＜ｄ＜１．２１、比活性：１０１，０００ｄｐｍ／ｎＭ）を得、ドナーリポ蛋白とした。
【００６５】
＜１−２＞ アクセプターリポ蛋白の調製
健常人血漿（１００ｍｌ）に臭化カリウム（ＫＢｒ）を加え、比重ｄ＝１．０１９ｇ／ｍｌに調節し、密度勾配遠心分離（２２７，０００×ｇ、４℃、２０時間）して、比重ｄ＞１．０１９ｇ／ｍｌの分画を採取した。得られた分画を、前記ＴＢＳで透析した。次いで、臭化カリウムを加え、比重ｄ＝１．０６３ｇ／ｍｌに調節し、密度勾配遠心分離（２２７，０００×ｇ、４℃、２０時間）して、比重ｄ＜１．６０６３ｇ／ｍｌの分画を採取した。得られた分画を前記ＴＢＳで透析し、ＬＤＬからなる分画（比重：１．０１９＜ｄ＜１．０６３）を得、アクセプターリポ蛋白とした。
【００６６】
＜１−３＞ ＣＥＴＰ活性の測定
実施例＜１−１＞で得たドナーリポ蛋白（［３Ｈ］ＣＥ−ＨＤＬ３、０．２１μｇのコレステロール含有）、実施例＜１−２＞で得たアクセプターリポ蛋白（ＬＤＬ、２１μｇのコレステロール含有）、及び測定試料を、ドナーリポ蛋白中のコレステロールとアクセプターリポ蛋白中のコレステロールとの比が１：１００、また、測定試料中のＨＤＬ中のコレステロールとドナーリポ蛋白中のコレステロールとの比が最低でも１：１０となるように、さらに前記ＴＢＳをマイクロチューブに加えて総量６００μｌ／チューブに調製し、該マイクロチューブを３７℃湯浴中で１５時間インキュベートした。次いで、マイクロチューブを氷上で１５分間冷却した後、氷冷ＴＢＳ（４００μｌ）及び０．５Ｍの二塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）を含有する１％のデキストランサルフェイトを含む溶液（４０μｌ）を加えて激しく攪拌した。マイクロチューブを、氷上で３０分間インキュベートした後、遠心分離（８，０００×ｇ、４℃、１０分）して、ＨＤＬに富む遠心上清を回収した。得られた遠心上清の放射活性を、シンチレーションカウンターを用いて測定した。
測定試料中に含まれるＣＥＴＰのＣＥＴＰ活性は、得られた測定値と測定試料を加えないで上記と同様にして操作した対照（コントロール）の測定値との比較に基づく放射活性の減少から決定し、単位時間あたりに１ｎＭのコレステロールエステル（ＣＥ）を転送するＣＥＴＰ活性を１ユニット（Ｕ）とした。
【００６７】
実施例２ 精製ヒト由来ＣＥＴＰの調製
以下の操作は、常法に従い全て４℃あるいは氷浴上で行った。
＜２−１＞ デキストランサルフェイト処理
複数の健常人から採取した末梢血を、常法に従い遠心分離により血球系細胞を除去し、ヒト血漿（１Ｌ（リットル））を取得した。得られた血漿（１Ｌ）に、蒸留水（２Ｌ）、１０％のデキストランサルフェイト（Ｄｅｘｔｒａｎ Ｓｕｌｆａｔｅ、分子量５０万、１００ｍｌ）、及び４Ｍの二塩化カルシウム（ＣａＣｌ２、８０ｍｌ）を加え、氷浴上で緩やかに１５分間攪拌した。該混合液を、遠心分離（１５，２００×ｇ、１時間）し、不溶性のデキストランサルフェイト／リポ蛋白複合体を沈殿分画した。遠心上清を回収し、２７．２％の二塩化バリウム（ＢａＣｌ２）を加え、最終濃度１．３６％に調整した。該混合液を２０分間攪拌した後、遠心分離（１５，２００×ｇ、１時間）により沈殿物を除去し、遠心上清を回収した。
【００６８】
＜２−２＞ フェニルセファロースカラムクロマトグラフィーによる精製
実施例＜２−１＞で得た遠心上清に、３Ｍの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、０．０１％のアジ化ナトリウム（ＮａＮ３）、ゲンタマイシンサルフェイト（Ｇｅｎｔａｍｙｓｉｎ Ｓｕｌｆａｔｅ、５０μｇ／ｍｌ）、及び０．０５％のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を加え、ｐＨ７．４に調整した。該混合溶液を、０．０１％のアジ化ナトリウム、ゲンタマイシンサルフェイト（５０μｇ／ｍｌ）、及び０．０５％のＥＤＴＡを含む３ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）で平衡化したフェニルセファロースＨＰカラム（Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ Ｃｏｌｕｍｎ、１０×１２．５ｃｍ、ファルマシアバイオテク社（製））に加えた。カラムを、０．１５ＭのＮａＣｌ溶液（３Ｌ、ｐＨ７．４）を加えて洗い、さらにＮａＣｌ非含有溶液（３Ｌ、ｐＨ７．４）で洗った後、２０％のエタノール溶液で溶出させた。溶出パターンを、波長２８０ｎｍでの吸光度により測定した。
結果を図１に示す。該溶出パターンに従い、ヒト由来ＣＥＴＰを含む活性な分画を回収した。
【００６９】
＜２−３＞ リソースＱカラムクロマトグラフィーによる精製
実施例＜２−２＞で回収した得た活性な分画を、２５ｍＭのＮａＣｌ及び１０ｍＭのトリス塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）からなる緩衝液（ｐＨ７．４）で透析した。次いで、前記緩衝液で平衡化したリソースＱカラム（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｑ Ｃｏｌｕｍｎ、３．５×１０ｃｍ、ファルマシアバイオテク社（製））に加えた。カラムを、前記緩衝液（３００ｍｌ）を加えて洗い、２５〜２５０ｍＭのＮａＣｌ（２Ｌ、ｐＨ７．４）で濃度勾配溶出させた。溶出パターンを、波長２８０ｎｍでの吸光度により測定した。
結果を図２に示す。該溶出パターンに従い、ヒト由来ＣＥＴＰを含む活性な分画を回収し、精製ヒト由来ＣＥＴＰを取得した。
【００７０】
実施例３ 抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体の調製
実験医学（別冊）細胞工学ハンドブック（黒木登志夫ら編集、羊土社発行、第６６〜第７４頁、１９９２年）及び単クローン抗体実験操作入門（安東民衛ら著作、講談社発行、１９９１年）等に記載されるような一般的方法に従って、抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体を調製した。
【００７１】
＜３−１＞ 免疫感作、細胞融合、及びクローニング
ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、４〜５週齢、静岡研究動物センター（製））に、実施例２で調製した精製ヒト由来ＣＥＴＰを完全フロインドアジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）とともにフッドパッド内注射することにより初回（０日）免疫した。初回免疫から５日目、１０日目及び１５日目に同精製ヒト由来ＣＥＴＰをフッドパッド内注射により追加免疫し、さらに以下に述べるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ調製の前々日及び前日にも同様にして最終免疫した。
該免疫感作マウスの膝窩リンパ節細胞を常法に従って外科手術により採取した。融合剤としてポリエチレングリコール４０００（Ｐｏｌｙｅｔｈｉｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ ４０００）を用いて、該リンパ節細胞とマウスミエローマ細胞ＰＡＩとを３：１で混合して細胞融合させることによりハイブリドーマを作製した。次いで、１０％のウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ、ＦＣＳ）とアミノプテリンを含有するＨＡＴ含有ＡＳＦ１０４培地（味の素（製））中で培養した。次いで、培地をアミノプテリンを含有しないＨＴ培地に交換し培養することにより該リンパ節と該ミエローマ細胞とのハイブリドーマ選択し、１６９個のクローンを得た。
【００７２】
＜３−２＞ ハイブリドーマのスクリーニング
抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングは、実施例１で構築したＣＥＴＰ活性測定系を用いて行った。
実施例２で得た精製ヒト由来ＣＥＴＰと得られたハイブリドーマの各々の培養上清（６０μｌ）とを、実施例＜１−１＞で得たドナーリポ蛋白（［３Ｈ］ＣＥ−ＨＤＬ３、０．２１μｇのコレステロール含有）と実施例＜１−２＞で得たアクセプターリポ蛋白（ＬＤＬ、２１μｇのコレステロール含有）の混合溶液中加え、さらにＴＢＳを加え、総量６００μｌ／チューブに調製した。
以下、実施例＜１−３＞と同様にして操作し、各々のサンプルのＣＥＴＰ活性を測定し、ハイブリドーマの培養上清を加えない場合の値との比較から、各々のハイブリドーマ培養上清のＣＥＴＰ阻害活性（ＣＥＴＰのＣＥ転送活性の阻害活性）を求めた。本スクリーニングにより、各々異なるＣＥＴＰ阻害活性を有する３つのポジティブクローン（＃７２−１、＃８６−２、及び＃１７６−１）を得た。
ハイブリド−マ＃７２−１及び＃８６−２を、１９９４年１２月２０日付けにて通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に、各々国際寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４９４４及びＦＥＲＭ ＢＰ−４９４５を以て寄託した。
【００７３】
＜３−３＞ モノクローナル抗体の大量調製
ＩＣＲヌードマウス（雌、７〜８週齢、１５匹、チャールズリバー社（製））に、ハイブリド−マ＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１（各々１０６〜１０７個／０．５ｍｌ／マウス）の各々を腹腔内注射した。１０日後、マウスを麻酔下で開腹し、常法により採取した腹水からモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１を大量に調製した。
【００７４】
＜３−４＞ アイソタイプの決定
マウスモノクロ−ナル抗体アイソタイプ決定用キット（アマシャム社製）を用い、該キットに添付の実験操作プロトコールに従って操作を行い、モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１各々のアイソタイプを決定した。＃７２−１と＃８６−２がＩｇＧ１であり、＃１７６−１がＩｇＧ２ｂであることが確認された。
【００７５】
＜３−５＞ モノクローナル抗体の精製
前記＜３−３＞で取得したモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１各々の遠心上清（各々５ｍｌ）を、０．０６Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で３倍に希釈し、１Ｎの塩酸を加えｐＨを４．８に調整した。次いで、１６．５μｌのカプリル酸（Ｃａｐｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ、和光純薬（製））を、室温下で攪拌しながら少しずつ加え、攪拌しながら３０分間反応させた。次いで、遠心分離（１，０００ｒｐｍ、２０分間）し、抗体以外の蛋白を沈殿させた。遠心上清を回収し、フィルター（ミリポア社（製））で濾過し、白沈を除いた。得られた濾液を、リン酸緩衝液で透析（２時間）した。
透析後、硫酸アンモニウム（２６．２ｇ／１００ｍｌ）を攪拌しながら少しずつ加え、攪拌しながら４℃で１２０分間反応させた。次いで、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、２０分間）して、沈殿物を回収した。回収した沈殿物に、リン酸緩衝液を加え、リン酸緩衝液で透析（４℃、２４時間）し、精製モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１を得た。
【００７６】
実施例４ アフィニティークロマトグラフィーによるヒト由来ＣＥＴＰの精製
実施例２で調製した精製ヒト由来ＣＥＴＰを、実施例３で調製した精製モノクローナル抗体＃７２−１を用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーによりさらに高純度で精製し、さらにその性状を解析した。
＜４−１＞ 固定化モノクローナル抗体（カラム充填用吸着体）の調製
ＮＨＳ活性化ハイトラップカラム（ＨｉＴｒａｐ−ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、１ｍｌ、ファルマシアバイオテク社（製））を用い、添付のプロトコールに従って操作を行い、０．５ＭのＮａＣｌを含有する０．２Ｍの炭酸水素ナトリウム溶液（ｐＨ８．３）中に溶解したモノクローナル抗体＃７２−１（５ｍｇ／ｍｌセファロース）を注入した。２０℃で４５分間反応させ、モノクローナル抗体＃７２−１をＮＨＳ活性化セファロースに固定化し、固定化モノクローナル抗体＃７２−１を調製した。
【００７７】
＜４−２＞ アフィニティークロマトグラフィーによる精製
実施例２で調製した精製ヒトＣＥＴＰを含む溶液を、＜４−１＞で調製したアフィニティーカラムに加えた後、カラムを５００ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．６）緩衝液（５ｍｌ）を加えて洗い、２ｍＭのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．８）で溶出させた。溶出分画を、２Ｍのトリス塩酸（ｐＨ８．８）で中和させた。溶出パターンを、波長２８０ｎｍでの吸光度により測定した。
結果を図３に示す。該溶出パターンに従い、ヒト由来ＣＥＴＰを含む活性な分画を集め、０．１５ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）で透析し、極めて高純度の精製ヒト由来ＣＥＴＰを調製した。
【００７８】
＜４−３＞ 精製ヒト由来ＣＥＴＰの性状解析
前記図３に示したとおり、本実施例で得られた精製ヒト由来ＣＥＴＰの酵素活性（比活性）は、１１００Ｕ（ユニット）／ｍｇであった。
さらに該精製ヒト由来ＣＥＴＰの分子量を、常法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）により解析した。
結果を図４に示す。
本実施例で得られた精製ヒト由来ＣＥＴＰは、分子量約６，３０００と約６，１０００の２種類からなることが確認された。ヒト由来ＣＥＴＰの精製はこれまで多くの研究者により試みられ、その分子量が報告されている。報告された値は、精製方法、精製度あるいは分子量分析方法等の問題から完全に一致しないが、いずれも約６，４０００〜約６，６０００である。これらの値と比較から、本実施例で得られたヒト由来ＣＥＴＰは、極めて高い純度であることが確認された。
【００７９】
実施例５ 抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体の性状解析
＜５−１＞ ヒト由来ＣＥＴＰに対する反応性
実施例３で調製した精製モノクローナル抗体の＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１のヒト由来ＣＥＴＰに対する反応性は、実施例１で構築したＣＥＴＰ活性測定系を用いて、実施例＜３−２＞と同様にして、ヒト由来ＣＥＴＰのＣＥ転送活性の阻害活性（ＣＥＴＰ阻害活性）を測定することにより確認した。
実施例４で得た精製ヒト由来ＣＥＴＰと０．１５ＭのＮａＣｌを含有するトリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液（ｐＨ７．４）で種々濃度に希釈した精製モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１（各々２０μｌ）を、実施例＜１−１＞で得たドナーリポ蛋白（［３Ｈ］ＣＥ−ＨＤＬ３、０．２１μｇのコレステロール含有）と実施例＜１−２＞で得たアクセプターリポ蛋白（ＬＤＬ、２１μｇのコレステロール含有）の混合溶液中加え、さらにＴＢＳを加え、総量６００μｌ／チューブに調製した。
【００８０】
以下、実施例＜１−３＞と同様にして操作し、各々のサンプルのＣＥＴＰ活性を測定し、モノクローナル抗体を加えない場合の値から、各々のモノクローナル抗体のＣＥＴＰ阻害活性を求めた。なお、対照としてマウスＩｇＧ（シグマ社（製））を用いた。結果を図５に示す。
モノクローナル抗体＃７２−１は、濃度依存的にヒト由来ＣＥＴＰのＣＥ転送活性（ＣＥＴＰ活性）を阻害し、１０μｇ／ｍｌ以上の濃度でＣＥＴＰ活性を１００％阻害した。一方、モノクローナル抗体＃８６−２は、濃度依存的なＣＥＴＰ阻害活性は示さず、約０．５μｇ／ｍｌの濃度で最大阻害活性（５８％）を示し、１７μｇ／ｍｌ以上の濃度では阻害活性を示さなかった。また、モノクローナル抗体＃１７６−１もモノクローナル抗体＃８６−２と同様に、濃度依存的なＣＥＴＰ阻害活性は示さず、約１．０μｇ／ｍｌの濃度で最大阻害活性（５０％）を示した。
このことから、モノクローナル抗体＃７２−１が認識するヒト由来ＣＥＴＰ上のエピトープは、モノクローナル抗体＃８６−２及びモノクローナル抗体＃１７６−１のそれとは異なる可能性が極めて高い。
【００８１】
＜５−２＞ ウサギ由来ＣＥＴＰに対する反応性
実施例３で調製した精製モノクローナル抗体の＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１のウサギ由来ＣＥＴＰに対する反応性を、下記のようにして調製した精製ウサギＣＥＴＰ、ドナーリポ蛋白及びアクセプターリポ蛋白を用いた実施例１と同様のＣＥＴＰ活性測定系を用いて、前記実施例＜５−１＞と同様にして確認した。
【００８２】
＜５−２−１＞ 精製ウサギＣＥＴＰの調製
以下の操作は、常法に従い全て４℃あるいは氷浴上で行った。
▲１▼ デキストランサルフェイト処理
複数のウサギ（日本白色、北山ラベス（製））から採取した末梢血を、常法に従い遠心分離により血球系細胞を除去し、ウサギ血漿（１００ｍｌ）を取得した。得られた血漿（１００ｍｌ）に、蒸留水（２００ｍｌ）、１０％のデキストランサルフェイト（Ｄｅｘｔｒａｎ Ｓｕｌｆａｔｅ、分子量５０万、１０ｍｌ）、及び４Ｍの二塩化カルシウム（ＣａＣｌ２、７．９ｍｌ）を加え、氷浴上で緩やかに１５分間攪拌した。該混合液を、遠心分離（２０，０００×ｇ、２０時間）し、不溶性のデキストランサルフェイト／リポ蛋白複合体を沈殿分画して遠心上清を回収した。
【００８３】
▲２▼ フェニルセファロースカラムクロマトグラフィーによる精製
前記▲１▼で得た遠心上清に、３Ｍの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、０．０１％のアジ化ナトリウム（ＮａＮ３）、ゲンタマイシンサルフェイト（Ｇｅｎｔａｍｙｓｉｎ Ｓｕｌｆａｔｅ、５０μｇ／ｍｌ）、及び０．０５％のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を加え、ｐＨ７．４に調整した。該混合溶液を、０．０１％のアジ化ナトリウム、ゲンタマイシンサルフェイト（５０μｇ／ｍｌ）、及び０．０５％のＥＤＴＡを含む３ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）で平衡化したフェニルセファロースカラム（ＨｉＬｏａｄ ２６／１０、ファルマシアバイオテク社（製））に加えた。カラムを、０．０１％のアジ化ナトリウム、ゲンタマイシンサルフェイト（５０μｇ／ｍｌ）、及び０．０５％のＥＤＴＡを含む０．１５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）溶液を加えて洗い、ＮａＣｌ非含有溶液及び２０％のエタノール溶液で溶出させた。溶出パターンを、波長２８０ｎｍでの吸光度により測定した。
結果を図６に示す。該溶出パターンに従い、ウサギ由来ＣＥＴＰを含む活性な分画を回収した。
【００８４】
▲３▼ ブルーセファロースカラムクロマトグラフィーによる精製
前記▲２▼得た活性な分画を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した。次いで、前記緩衝液で平衡化したブルーセファロースカラム（ＣＬ−６Ｂ、１．５×８．５ｃｍ、ファルマシアバイオテク社（製））に加えた。カラムを、前記緩衝液を加えて洗い、１．５ＭのＮａＣｌと前記緩衝液からなる溶液（ｐＨ７．０）で溶出させた。溶出パターンを、波長２８０ｎｍでの吸光度により測定した。
結果を図７に示す。該溶出パターンに従い、ウサギ由来ＣＥＴＰを含む活性な分画を回収した。
【００８５】
▲４▼スクシニル化ＬＤＬセファロースカラムクロマトグラフィーによる精製
前記▲３▼得た活性な分画を、０．０２５％のＥＤＴＡを含む６０ｍＭのＮａＣｌ及び５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）からなる溶液で透析した。次いで、スクシニル化ＬＤＬをＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂカラム（ＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−４Ｂ、１．５×８．５ｃｍ、ファルマシアバイオテク社（製））に加えて作製したスクシニル化ＬＤＬセファロースカラムを、０．０２５％のＥＤＴＡを含む６０ｍＭのＮａＣｌ及び３９ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化し、透析して得られた溶液を加えた。カラムを、０．０２５％のＥＤＴＡを含む６０ｍＭのＮａＣｌ及び３９ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗い、０．０１％ＥＤＴＡを含む溶液（ｐＨ７．４）で溶出させた。溶出パターンを、波長２８０ｎｍでの吸光度により測定した。結果を図８に示す。
該溶出パターンに従い、ウサギ由来ＣＥＴＰを含む活性な分画を回収し、精製ウサギ由来ＣＥＴＰを調製した。
【００８６】
＜５−２−２＞ ドナーリポ蛋白及びアクセプターリポ蛋白
ウサギ血漿を用いて、実施例＜１−１＞及び実施例＜１−２＞と同様にして、ドナーリポ蛋白（［３Ｈ］ＣＥ−ＨＤＬ３、０．２１μｇのコレステロール含有）及びアクセプターリポ蛋白（ＬＤＬ、２１μｇのコレステロール含有）の各々を調製した。
＜５−２−３＞ ウサギ由来ＣＥＴＰに対する反応性確認
前記＜５−２−１＞で調製した精製ウサギ由来ＣＥＴＰ及び＜５−２−２＞で調製したドナーリポ蛋白及びアクセプターリポ蛋白を用いたＣＥＴＰ活性測定系により、精製モノクローナル抗体の＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１各々のＣＥＴＰ阻害活性を、実施例＜５−１＞と同様にして測定した。
結果を図９に示す。モノクローナル抗体＃８６−２及び＃１７６−１は、濃度の高低に拘らず、ウサギ由来ＣＥＴＰのＣＥ転送活性を全く阻害せず、ウサギ由来ＣＥＴＰには特異的な反応性を示さないことが確認された。また、モノクローナル抗体＃７２−１も、約３μｇ／ｍｌ以下の濃度では、ウサギ由来ＣＥＴＰには検出できる反応性を示さなかった。
【００８７】
実施例６ 抗体フラグメントＦ（ａｂ’）２及びＦａｂの調製
実施例３で調製した精製モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１各々のＦ（ａｂ’）２及びＦａｂを下記のようにして調製した。
モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１の各々（各々５ｍｇ／ｍｌ）を、２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）に加え、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、不溶化ペプシン（１ｍｌ、ピアス社（製））を加え、ローテーターで回転させながら３７℃で１２時間インキュベートした。反応液を回収し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）し、上清を回収した。
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを、プロテインＡカラムキット（アマシャム社（製））のプロトコールに従って以下のようにして行った。遠心沈殿物に結合緩衝液を加え、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）し、上清を回収した。２回の遠心分離で回収した上清を集め、等量の結合緩衝液を加え、さらに１Ｎの水酸化ナトリウムを加えてｐＨ８．９に調製した。該混合溶液を、該結合緩衝液で平衡化した該プロテインＡカラムに添加した後、該結合緩衝液（５ｍｌ）で２回洗浄し、溶出分画を回収した。得られた溶出分画を、５ｍＭのリン酸緩衝液（２Ｌ、ｐＨ６．８）で透析（４℃、２４時間）した。
さらなる精製のためヒドロキシアパタイトカラム（バイオラッド社（製））を用いて、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行った。透析により得られた溶液を、該ヒドロキシアパタイトカラムに添加し、５ｍＭのリン酸緩衝液を１５分間流した後、５ｍＭ〜０．４Ｍのリン酸緩衝液で直線濃度勾配溶出させた。溶出液をフラクションコレクターで分取し、２８０ｎｍでの吸光度を測定し、Ｆ（ａｂ’）２を含む分画を回収した。得られた分画をリン酸緩衝液（２Ｌ）で透析（４℃、２４時間）し、モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１各々の精製Ｆ（ａｂ’）２を得た。
【００８８】
実施例７ サンドイッチＥＬＩＳＡによるヒト由来ＣＥＴＰの定量法の確立
＜７−１＞ 固相化モノクローナル抗体の作製
実施例３で調製した精製モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１を、リン酸緩衝液で希釈（１０ｎｇ／ウェル〜１μｇ／ウェル、ｐＨ７．４）し、該各々の抗体溶液（５０μｌ）を、ＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレート（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）社（製））の各ウェルに加え、４℃で２４時間インキュベートし、各々のモノクローナル抗体をマイクロプレートに吸着させた。次いで、各ウェルを、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝液３００μｌで４回洗浄した。洗浄溶液を捨て、各ウェルに、ブロッキング試薬（３００μｌ、ブロックエース（Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ）、大日本製薬社（製））を加え室温で２時間インキュベートし、抗体が結合していない部位をブロックした。各ウェルを、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝液３００μｌで４回洗浄した。
【００８９】
＜７−２＞ 標識モノクローナル抗体の作製
実施例３で調製した精製モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１の各々（１ｍｇ／ｍｌを１ｍｌ）を、０．１ＭのＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．２〜８．３）溶液で、透析（４℃、２４時間）した。次いで、ＮＨＳ−ビオチン（２ｍｇ／ｍｌを１００μｌ、フナコシ社（製））を加え、激しく攪拌した後、室温下で４時間インキュベートした。次いで、リン酸緩衝液で透析（４℃、２４時間）した。
【００９０】
＜７−３＞ サンドイッチＥＬＩＳＡによる定量法の確立
本発明で確立されたサンドイッチＥＬＩＳＡによるヒト由来ＣＥＴＰの定量法は以下の通りである。
前記＜７−１＞で作製した固定化モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１（１０ｎｇ／ウェル〜１μｇ／ウェルの濃度で固定化。以下、「固定化マイクロプレート」と同義。）の各々を、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝液で３回洗浄した。固定化マイクロプレートの各ウェルに１０％ブロックエース（大日本製薬社（製））を含有するリン酸緩衝液で希釈した測定試料（１００μｌ、実施例＜４−２＞で調製した精製ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質、実施例＜２−１＞で調製したリポ蛋白を除去した健常人血漿、または実施例＜２−１＞と同様にして調製した各種患者の血漿）を加え、室温で１時間インキュベートした。固定化マイクロプレートを、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝液で３回洗浄後、各ウェルに１０％ブロックエースを含有するリン酸緩衝液で希釈したビオチン標識モノクローナル抗体（３ｎｇ／ウェル〜１μｇ／ウェルを５０μｌ、前記＜７−２＞で作製したビオチン標識モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１）を加え、室温下で１時間インキュベートした。固定化マイクロプレートを、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝液で３回洗浄後、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、１ｍｇ／ｍｌ）を含有する０．５ＭのＮａＣｌと２０ｍＭのＨＥＰＥＳからなる溶液（ｐＨ７．０）で１０００倍に希釈したストレプトアビジン−β−ガラクトシダーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏａｖｉｄｉｎ−β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ、５０μｌ、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）社（製））を各ウェルに加え、室温下で１時間インキュベートした。
【００９１】
固定化マイクロプレートを、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝液で３回洗浄後、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有する１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２及び１０ｍＭのリン酸緩衝液からなる溶液（ｐＨ７．０）で希釈した０．０１５％または０．０１％の４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド（４−Ｍｅｔｈｙｌ−ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ、５０μｌ、シグマ（Ｓｉｇｍａ）社（製））を各ウェルに加え、室温下で１０または２０分間インキュベートした。各ウェルに、Ｎａ２ＣＯ３（１００μｌ）を加え、反応を止めた。波長４６０ｎｍ（励起：３５５ｎｍ）での蛍光強度をフルオロスキャンＩＩマイクロプレートフルオロメーター（Ｆｌｕｏｒｏｓｃａｎ ＩＩ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ、フロー研究所（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）（製））で測定した。測定中のＣＥＴＰ量は、下記実施例で作成した検量線から求めた。
固定化モノクローナル抗体（＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１）と標識モノクローナル抗体（＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１）との種々の組合わせによる定量結果を、図１０乃至図１２に示す。この結果、＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１の内、異なるモノクローナル抗体の組合わせ（＃７２ー１と＃８６−２、＃７２−１と＃１７６−１）により定量できることが確認された。
また、固定化モノクローナル抗体と標識モノクローナル抗体の最適濃度決定の例として、（１）固定化モノクローナル抗体として＃７２−１（１０ｎｇ／ウェル〜１μｇ／ウェル）を、また標識モノクローナル抗体として＃８６−２または＃１７６−１（１０ｎｇ／ウェル〜１μｇ／ウェル）を使用した場合（４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド（基質）の濃度：０．０１％、反応時間：１０分間）、及び（２）固定化モノクローナル抗体として＃７２−１（１μｇ／ウェル）を、また標識モノクローナル抗体として＃８６−２（１〜３ｎｇ／ウェル）を使用した場合（該基質の濃度：０．０１５％、反応時間：２０分間）の、実施例＜２−１＞で調製したリポ蛋白を除去した健常人血漿の定量結果を、各々図１３乃至図１６、並びに図１７に示す。
【００９２】
その結果、固定化モノクローナル抗体＃７２−１の最適濃度は、１μｇ／ウェル（２０μｇ／ｍｌ）であった。一方、また標識モノクローナル抗体＃８６−２の最適濃度は、基質との反応時間が１０分間の時は１００ｎｇ／ウェル（２μｇ／ｍｌ）であり、２０分間の時は、３ｎｇ／ウェル（６０ｎｇ／ｍｌ）であることが確認された。このように、標識モノクローナル抗体の最適濃度は、基質との反応時間に依存するため最適濃度は、該反応時間により適宜設定することが可能である。
以下にのべる実施例では、固定化モノクローナル抗体＃７２−１（１μｇ／ウェル（２０μｇ／ｍｌ））、標識モノクローナル抗体＃８６−２（３ｎｇ／ウェル（６０ｎｇ／ｍｌ）、及び基質との反応時間（２０分間）の条件によるサンドイッチＥＬＩＳＡを用いた。
【００９３】
＜７−４＞ 検量線の作成及び本定量法の精密性の確認
＜７−４−１＞ 検量線の作成
実施例＜４−２＞で調製した精製ヒト由来ＣＥＴＰを標準物質（スタンダード）として、固定化モノクローナル抗体として＃７２−１（１μｇ／ウェル）を、及び標識モノクローナル抗体として＃８６−２（３ｎｇ／ウェル）を使用し、前記＜７−３＞で確立したサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて検量線を作成した。結果を図１８に示す。
極めて低濃度である０．４ｎｇ／ｍｌ〜１．２５ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で直線的検量線が得られた（相関係数：ｒ＝０．９９５）。また、本発明のサンドイッチＥＬＩＳＡを用いた定量法のヒト由来ＣＥＴＰの定量感度（検出感度）は、最大０．４ｎｇ／ｍｌであり、従来の定量法に比べ極めて高い定量感度（検出感度）であることが確認された。
【００９４】
＜７−４−２＞ 変動係数の算出
また、本発明の定量法の精密性を確認するため同一プレート内（９６ウェルのうちの４８ウェル）での変動係数及び複数プレート内（６枚）での変動係数を算出した。前者の変動係数は、７．０６％、また後者の変動係数は、６．１３％であり、本発明で確立したサンドイッチＥＬＩＳＡによる定量系が極めて精密な測定系であることが確認された。
【００９５】
＜７−５＞ ヒト由来ＣＥＴＰの定量系確立のための予備実験
＜７−５−１＞ ヒト血漿成分による定量性への影響の確認
ヒト由来ＣＥＴＰの定量性に影響を与える血漿成分の有無を確認するために下記のような試験を行った。
実施例＜４−２＞で調製した、精製ヒト由来ＣＥＴＰ（各々０．７３５μｇ／ｍｌまたは１．４６９μｇ／ｍｌ）を、実施例＜２−１＞と同様にして得た０．５６μｇ／ｍｌのＣＥＴＰを含有する健常人血漿中に加えた。次いで、前記＜７−３＞で確立した定量法を用いてＣＥＴＰ量を測定した。
０．７３５μｇ／ｍｌ及び１．４６９μｇ／ｍｌを加えた各々の試料の定量値は、インキュベート前の計算上予測され得るＣＥＴＰ総量（各々１．２９４μｇ／ｍｌ及び２．０２９μｇ／ｍｌ）に対し、各々１．４４０μｇ／ｍｌ及び２．１８９μｇ／ｍｌであり、各々１１１％及び１０８％のＣＥＴＰが回収された。
この結果から、ヒト血漿中には、本法によるＣＥＴＰの定量性に影響を与える物質（成分）が何等存在しないことが確認され、本発明の定量法を用いればヒト血漿中のＣＥＴＰを正確に定量できることが示された。
【００９６】
＜７−５−２＞ ヒト血漿中のリポ蛋白による影響の確認
ヒト血漿中のＣＥＴＰの定量において、血漿中に含まれるリポ蛋白等のＣＥＴＰ以外の物質が定量感度に与える影響について検討するため、異なる精製度のヒト由来ＣＥＴＰを試料として、前記＜７−３＞で確立した定量系を用いて検討した。
測定試料には、（１）実施例＜２−１＞で遠心分離により血球系細胞のみを除去した血漿、（２）実施例＜２−１＞で最終的に得られたリポ蛋白を除去した血漿、（３）実施例＜２−２＞でフェニルセファロースカラムクロマトグラフィーで精製されたＣＥＴＰ、及び（４）実施例＜４−２＞で調製した精製ヒト由来ＣＥＴＰを用いた。結果を図１９に示す。
前記（１）、（２）及び（３）の各々の試料の定量曲線（希釈曲線）は、（４）の精製ヒト由来ＣＥＴＰのそれと平行であり、本発明の定量法は、測定試料であるヒト血漿中のリポ蛋白等の影響を何等受けることなく、即ち、血漿試料の精製度に無関係に適用可能なことが確認された。
【００９７】
＜７−５−３＞ ＣＥＴＰ含量とＣＥＴＰ活性の相関性確認
本発明の定量法の精密性を確認するため、ヒト血漿試料中のＣＥＴＰの定量値と該血漿試料自体のＣＥＴＰ活性値との相関性を検討した。
ＣＥＴＰ含量の定量は、試料として実施例＜２−１＞で得たリポ蛋白を除去した血漿を用いて行い、またＣＥＴＰ活性の測定は、該定量に用いた血漿試料の同量を用い、実施例１のＣＥＴＰ活性測定系により測定した。結果を図２０に示す。
相関係数（ｒ）は、０．９５３であり、本発明の定量方法によるＣＥＴＰ定量値と定量に用いた試料のＣＥＴＰ活性値は、極めて高い相関性を示した。この結果から、本発明の定量法が、極めて高い精密性を有していることが確認された。
【００９８】
実施例８ ヒト血漿中ヒト由来ＣＥＴＰの定量
実施例＜７−３＞で確立されたサンドイッチＥＬＩＳＡによる定量法を用いて、健常人及び各種患者の血漿中ＣＥＴＰを定量した。
なお、該血漿のＣＥＴＰ活性は、実施例＜１−１＞と同様にして得たドナーリポ蛋白（［３Ｈ］ＣＥ−ＨＤＬ３、６μｇのＣＥ含有と実施例＜１−２＞と同様にして得たアクセプターリポ蛋白（ＬＤＬ、６００μｇのＣＥ含有）を用い、実施例＜１−３＞で述べたＣＥＴＰ活性測定系を用いて測定した。
本試験で用いたヒト血漿は、健常人（１３人）、ＩＩａ型高脂血症（５人）、ＩＩｂ型高脂血症（５人）、ＣＥＴＰ欠損症（２人）、ＬＣＡＴ欠損症（２人）及び高ＨＤＬ血症（１人）の血漿である。結果を図２１に示す。
健常人血漿及び各種患者血漿ともに、ＣＥＴＰ定量値と血漿ＣＥＴＰ活性の間に高い相関性が確認された。また、推察されたとおり、ＣＥＴＰ欠損症患者の血漿中にはＣＥＴＰが検出されなかった。さらに、本発明の定量法は、健常人血漿のみならず種々の疾患患者の血漿についても適用できることが確認された。
【００９９】
実施例９ 従来の定量法との比較
従来のサンドイッチＥＬＩＳＡを用いたヒト由来ＣＥＴＰの定量法との比較における本発明の定量法の有用性を確認するために下記のような試験を行った。
従来の方法では、蛋白−蛋白間及び／または蛋白−リポ蛋白間の相互作用によって塞がっている抗原決定基（エピトープ）を露出させるために、定量に際し血漿試料をＴｒｉｔｏｎＸ−１００等の界面活性剤及び／または加熱によって前処理を行っていた。しかしながら、このような処理を施すと試料中の蛋白（ＣＥＴＰ等）は変性してしまう（タンパクの高次構造が崩され、あるいはさらに生物学的に不活性となる。）ため、該方法により検出／定量されるＣＥＴＰはインタクトなＣＥＴＰではなく変性されたＣＥＴＰのみであり、血漿中の正確なＣＥＴＰ量を測定することは不可能であった。
そこで本試験では、（１）実施例＜２−１＞と同様にして得たリポ蛋白を除去した健常人血漿（１０％ブロックエースを含むリン酸緩衝液による希釈物）、（２）リポ蛋白を除去した後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（界面活性剤）とともにインキュベートした健常人血漿、（３）リポ蛋白を除去した後、熱処理（９５℃、５分）した健常人血漿、及び（４）リポ蛋白を除去した後、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００とともにインキュベートした健常人血漿について検討した。結果を図２２に示す。
１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００処理した血漿、及び熱処理した血漿では、本法により本来定量されるべきＣＥＴＰが定量されなかった。とりわけ、熱処理した血漿では全くＣＥＴＰが検出できなかった。また、低濃度のＴｗｅｅｎ２０処理した血漿でも定量性が著しく（３０％以上）低減した。即ち、本発明のモノクローナル抗体が、ヒト血漿中のインタクトなＣＥＴＰに特異的に反応性を有することに依存して、本発明の定量法を用いれば従来の方法（界面活性剤処理、熱処理等）では不可能であったヒト血漿中に存在するインタクトなＣＥＴＰ量を正確に定量可能なことが確認された。また、これまでに知られているヒト由来ＣＥＴＰに対するモノクローナル抗体が、変性したヒト由来ＣＥＴＰに特異的に反応するものであることが明らかとなった。
【０１００】
実施例１０ 医薬組成物の調製及びＣＥＴＰ阻害活性
実施例３で調製した精製モノクローナル抗体の＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１（５０〜１５０μｇ／ｍｌ）を注射用蒸留水（１０ｍｌ）に加え注射剤とした。
また、実施例＜５−２−１＞で調製した精製ウサギ由来ＣＥＴＰを免疫原として、実施例３と同様にして抗ウサギ由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体を調製した。即ち、ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、４〜５週齢、静岡研究動物センター（製））に該精製ウサギ由来ＣＥＴＰを免疫し抗ウサギ由来モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ＃２−６４及び＃９−１を得た。該ハイブリドーマ各々をＩＣＲヌードマウス（雌、チャールズリバー社（製））に移植して、腹水中から抗ウサギ由来モノクローナル抗体＃２−６４（ＩｇＧ１）及び＃９−１（ＩｇＧ１）を調製した。注射用蒸留水に、モノクローナル抗体＃２−６４（０．１３ｍｇ／ｍｌ）とモノクローナル抗体＃９−１（５．５３ｍｇ／ｍｌ）とを溶解し注射剤とした。この注射剤を１．８ｍｇ／ｋｇの濃度でウサギに静脈内投与（初回投与、０時間）し、引き続き２４時間おきに同濃度で投与した。各投与後、１、４及び２４時間後に血漿を取得した。
該２つの抗ウサギ由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体＃２−６４及び＃９−１を用いて実施例１と同様にして確立したサンドイッチＥＬＩＳＡによるウサギ由来ＣＥＴＰの活性測定法を用いて、該血漿中のＣＥＴＰ活性を測定した。結果を図２３に示す。
抗ウサギ由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体＃２−６４及び＃９−１は、ウサギ血漿中のＣＥＴＰを有意に阻害することが確認された。
【０１０１】
実施例１１ ヒト由来ＣＥＴＰ高発現トランスジェニックマウスの作製
ヒト肝臓由来の５’−ｓｔｒｅｃｈ ｃＤＮＡライブラリー（クローンテック（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）製）を鋳型として、ＰＣＲを行った。ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片を常法によりアガロースゲル電気泳動により分離し、目的断片のみを切出した後、ＱＩＡＥＸ（キアゲン（ＱＵＩＡＧＥＮ）製）によりゲルを溶かし、目的ＤＮＡ断片を得た。得られた断片を、ＤＮＡ末端平滑化キット（タカラ製）を用いて、ｐＣＲＩＩベクター（インビトロゲン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）製）に挿入した。次いでｐＣＲＩＩベクターを大腸菌由来ＤＨ５コンピテント細胞に導入した後、プラスミドのシークエンス解析を行い、目的のヒト由来ＣＥＴＰをコードするｃＤＮＡを得た。
上述で得たヒト由来ＣＥＴＰをコードするｃＤＮＡを、ヒトβアクチンプローモーターを有する発現ベクター（モレキュラーセルウラールイムノロギー（Ｍｏｌ． Ｃｅｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、第４巻、第１９６１〜第１９６９頁、１９８４年；及び、同、第５巻、第２７２０〜第２７３２頁、１９８５年）に、ＤＮＡ末端平滑化キット（タカラ製）を用いて挿入し、プラスミドｐＣＥＴＰ−１を得た。エレクトロポレーション法により、ｐＣＥＴＰ−１をＣＯＳ細胞に導入し、培養後、形質転換ＣＯＳ細胞から、常法によりＲＮＡを取得した。得られたＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、ｐＣＥＴＰ−１を導入したＣＯＳ細胞でのヒトＣＥＴＰの特異的な転写発現を確認した。また同様にして、発現ベクターｐＭＥ１８Ｓを用いて得た形質転換体からのヒトＣＥＴＰの発現を実施例７で確立したサンドイッチＥＬＩＳＡにより確認した。トランスジェニックマウス作製のために、ｐＣＥＴＰ−１を制限酵素処理して直鎖状にした。
仮親マウスには、白色ＩＣＲマウス（雌、日本クレア製）を、精管結紮した白色ＩＣＲマウス（雄、日本クレア製）と交配して得られたプラグ（または腟栓）を有する雌ＩＣＲマウスを用いた。また、ヒト由来ＣＥＴＰ遺伝子を導入するため受精卵を得るための採卵用マウスは、黒色Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雌、日本クレア製）に、ＰＥＡＭＥＸ（５ユニット、三共製）及びＰＵＢＥＲＯＧＥＮ（５ユニット、三共製）を投与することにより過剰排卵させ、黒色Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄、日本クレア製）を交配させて作製した。交配後、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雌）から卵管部を摘出し、ヒアルロニダーゼ処理により受精卵のみを得、培地中で保存した。
受精卵へのヒト由来ＣＥＴＰ遺伝子の導入は、顕微鏡下でマニピュレーターを用いて常法により行った。受精卵を保定針で固定し、３７℃条件下、トリスＥＤＴＡ緩衝液で希釈したヒト由来ＣＥＴＰの前記直鎖状遺伝子を含有する溶液を、ＤＮＡ導入針を用いて受精卵の雄性前核内に注入した。
遺伝子導入後、正常な状態を保持する受精卵のみを選別し、仮親マウス（白色ＩＣＲマウス）の卵巣内にある卵管采に、ヒト由来ＣＥＴＰ遺伝子導入受精卵を挿入した。
仮親から生まれた子マウス（ヘテロマウス）の尾を切取りゲノム遺伝子を回収し、ＰＣＲによりマウスゲノム内にヒト由来ＣＥＴＰが導入されていることを確認した。また、血漿中のヒト由来ＣＥＴＰの発現を、実施例７で確立したサンドイッチＥＬＩＳＡにより確認した。
このヘテロマウス同士を掛け合わせることにより、ホモマウスであるヒト由来ＣＥＴＰ高発現トランスジェニックマウスを作製した。
【０１０２】
実施例１２ 抗ＣＥＴＰモノクローナル抗体のインビボにおけるＣＥＴＰ活性阻害効果
実施例３で作製した精製抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体＃７２−１及び＃８６−２の２種類を、濃度が２９：１の割合で注射用蒸留水に混合し注射剤とした。
実施例１１で作製したヒトＣＥＴＰ高発現トランスジェニックマウス（雌、３匹、食餌制限なしに繁殖用固形飼料を自由に与えた４カ月齢、３匹）に、前記混合注射剤（１００ ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に単回投与した。
抗体投与直前を０時間とし、投与後１、３、６及び２４時間目に眼底採血を行い、遠心分離して血漿を回収した。回収した血漿中のＣＥＴＰ活性（抗ヒト由来ＣＥＴＰ抗体によるＣＥＴＰ阻害活性）の測定は、実施例１で構築したＣＥＴＰ活性測定系を用いてＨＤＬからＬＤＬへのＣＥ（コレステロールエステル）転送量を測定することにより行った。結果を図２４に示す。
本発明の抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体は、インビボにおいてもヒトＣＥＴＰ活性を完全に阻害することが確認された。さらに、抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体によるヒト由来ＣＥＴＰ活性のインビボでの阻害効果は、本発明において初めて開示されるものである。
【０１０３】
実施例１３ 抗ＣＥＴＰモノクローナル抗体による動脈硬化症予防効果
実施例３で作製した精製抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体＃７２−１及び＃８６−２の２種類を、濃度が２９：１の割合で注射用蒸留水に混合し注射剤とした。
実施例１１で作製したヒトＣＥＴＰ高発現トランスジェニックマウス（雌、３匹、食餌制限なしに繁殖用固形飼料を自由に与えた６週齢）に、前記混合注射剤（７５ ｍｇ／ｋｇ）を、１日１回づつ計４日間にわたり腹腔内投与した。なお、対照にはＰＢＳ（リン酸緩衝液）を用いた。
抗体投与直前を０日とし、投与３日前、投与後２、４、８及び１１日目に眼底採血を行い、遠心分離して血漿を回収した。回収した血漿中のＨＤＬコレステロールの量を、脂質測定キット（リキテックＴＣ１／ＴＣ２、ベーリンガーマンハイム製）を用いて測定した。なお、ＨＤＬの分画には、ＨＤＬコレステロール分離用試薬（ベーリンガーマンハイム製）を用いた。結果を図２５に示す。
本発明の抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体のインビボ投与により、血中のＨＤＬコレステロール量が有意に上昇することが確認された。ＨＤＬは、抗動脈硬化作用を有する重要なリポタンパクであると考えられており、事実、血中でのＨＤＬの上昇により、動脈硬化巣の進展を抑制及び退縮させることが明らかにされている（ジャーナルオブクリニカルインベスティゲイション（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．）、第８５巻、第１２３４〜第１２４１頁、１９９０年）。
抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体のインビボへの投与により、血中ＨＤＬコレステロールを上昇させることができるという知見は、本発明において初めて開示されるものであり、本試験結果は、本発明のモノクローナル抗体が、動脈硬化症の予防乃至治療に極めて有用であることを明らかにするものである。
上述の実施例１０乃至１３で得られた結果及び実施例＜５−１＞に示した本発明のモノクローナル抗体のヒト由来ＣＥＴＰの高い阻害活性から、本発明のモノクローナル抗体が、高脂血症や動脈硬化症などのＣＥＴＰの体内動態の異常に起因する種々の疾患の治療及び予防に有用であることが明らかにされた。
【０１０４】
【発明の効果】
本発明の抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体は、ヒト由来ＣＥＴＰ、特にヒト体液中に存在するインタクトなＣＥＴＰに対して高い結合特異性（ＣＥＴＰ阻害活性）を有するという特徴を有するが故に、本発明の抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体を用いたイムノアッセイにより、未だ確立されていないヒト体液（血漿等）中のＣＥＴＰをインタクトな状態で簡便かつ高感度で定量することができる。
とりわけ、本発明の３つの抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体が、ヒト由来ＣＥＴＰ、特にヒト体液中に存在するインタクトなＣＥＴＰに対して各々異なる高い結合特異性（ＣＥＴＰ阻害活性）を有するという特徴を利用して、該３つの内のいずれか２つのモノクローナル抗体を組合わせたサンドイッチＥＬＩＳＡを採用することによりさらに簡便かつ高感度の定量できる。
【０１０５】
本発明のモノクローナル抗体を用いた定量方法においては、血漿等の体液試料の定量に際し、試料を加熱処理あるいは界面活性剤処理等の何等の前処理をする必要ななく、極めて簡便かつ高感度で定量することができる。
また、本発明の抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体は、そのＣＥＴＰ阻害活性の高さ故に、ＣＥＴＰの動態異常に起因する動脈硬化症、高脂血症、高ＨＤＬ血症あるいは高コレステロール血症等の各種疾患の治療または予防のための医薬品として有用である。
【０１０６】
【図面の簡単な説明】
【図１】フェニルセファロースカラムクロマトグラフィーによるヒト由来ＣＥＴＰのクロマトグラムを示す図。
【図２】リソースＱカラムクロマトグラフィーによるヒト由来ＣＥＴＰのクロマトグラムを示す図。
【図３】モノクローナル抗体＃７２−１を用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーによるヒト由来ＣＥＴＰのクロマトグラムを示す図。
【図４】モノクローナル抗体＃７２−１を用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより精製されたヒト由来ＣＥＴＰの分子量を示す電気泳動図。
【図５】モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１の精製ヒト由来ＣＥＴＰに対する反応性を示す図。
【図６】フェニルセファロースカラムクロマトグラフィーによるウサギ由来ＣＥＴＰのクロマトグラムを示す図。
【図７】ブルーセファロースカラムクロマトグラフィーによるウサギ由来ＣＥＴＰのクロマトグラムを示す図。
【図８】スクシニル化ＬＤＬセファロースカラムクロマトグラフィーによるウサギ由来ＣＥＴＰのクロマトグラムを示す図。
【図９】モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１の精製ウサギ由来ＣＥＴＰに対する反応性を示す図。
【図１０】標識モノクローナル抗体＃８６−２と各種固定化モノクローナル抗体との組合せによる定量性を示す図。
【図１１】標識モノクローナル抗体＃１７６−１と各種固定化モノクローナル抗体との組合せによる定量性を示す図。
【図１２】標識モノクローナル抗体＃７２−１と各種固定化モノクローナル抗体との組合せによる定量性を示す図。
【図１３】標識モノクローナル抗体＃８６−２と各種濃度の固定化モノクローナル抗体＃７２−１との組合せによる定量性を示す図。
【図１４】固定化モノクローナル抗体＃７２−１と各種濃度の標識モノクローナル抗体＃８６−２との組合せによる定量性を示す図。
【図１５】標識モノクローナル抗体＃１７６−１と各種濃度の固定化モノクローナル抗体＃７２−１との組合せによる定量性を示す図。
【図１６】固定化モノクローナル抗体＃７２−１と各種濃度の標識モノクローナル抗体＃１７６−１との組合せによる定量性を示す図。
【図１７】固定化モノクローナル抗体＃７２−１（１μｇ／ｍｌ）と標識モノクローナル抗体＃８６−２（１ｎｇ／ウェルまたは３ｎｇ／ウェル）との組合せによる定量性を示す図。
【図１８】本発明の定量法による精製ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質の検量線を示す図。
【図１９】本発明の定量法による精製度の異なるヒト血漿のＣＥＴＰの定量性を示す図。
【図２０】本発明の定量法によるＣＥＴＰ定量値と試料のＣＥＴＰ活性値との相関性を示す図。
【図２１】本発明の定量法による健常人及び各種患者に由来する血漿のＣＥＴＰ量及びＣＥＴＰ活性を示す図。
【図２２】変性したヒト由来ＣＥＴＰに対するモノクローナル抗体＃７２−１及び＃８６−２の反応性並びに本発明の定量法と従来の定量法の差異を示す図。
【図２３】ウサギを用いたインビボ試験における抗ＣＥＴＰモノクローナル抗体のＣＥＴＰ活性阻害効果を示す図。
【図２４】ヒトＣＥＴＰ高発現トランスジェニックマウスを用いたインビボ試験における抗ヒトＣＥＴＰ抗体のＣＥＴＰ阻害活性を示す図。
【図２５】インビボ試験における抗ヒトＣＥＴＰ抗体の血中ＨＤＬコレステロール量に対する影響を示す図。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト由来コレステロールエステル転送タンパク（ＣＥＴＰ）に反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、ヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有するモノクローナル抗体及びその抗体フラグメント、固定化モノクローナル抗体及び固定化抗体フラグメント、標識モノクローナル抗体及び標識抗体フラグメント、ヒト由来ＣＥＴＰの検出、定量、分離または精製に用いられるキット、ヒト由来ＣＥＴＰを検出、定量、分離または精製する方法、該モノクローナル抗体または該抗体フラグメントを含んでなる医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体のあらゆる組織及び血漿中には、遊離型、長鎖脂肪酸型及びエステル型のコレステロールが存在し、前者の２つは細胞膜構成において重要な役割を果たしており、後者は生理的不活性であり貯蔵形態としての性質が強い。生体中のコレステロールは、食物摂取による小腸からの取込み、あるいは各組織、特に肝臓での生合成に由来するがその大半は肝臓等の組織での生合成に由来する。
肝臓で生合成され分泌された遊離コレステロールは、超低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ）に取り込まれ、血中でリポ蛋白リパーゼ（ＬＰＬ）及び肝性トリグリセリドリパーゼ（ＨＴＧＬ）の作用により、中間比重リポ蛋白（ＩＤＬ）を経た後、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）へと代謝される。ＬＤＬは、ＬＤＬ受容体を介して末梢細胞へと取り込まれ細胞に遊離コレステロールが供給される。
このような肝臓から末梢細胞への流れとは逆に、コレステロール逆転送系と呼ばれる末梢細胞から肝臓へ向かうコレステロールの流れが存在する。即ち、肝臓から末梢細胞に供給された余剰の遊離コレステロールが、血中の高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）に引き抜かれ、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）の作用によりコレステロールエステルに変換されて血中ＨＤＬ中に蓄えられる。ＨＤＬ中に蓄えられたコレステロールエステルは、コレステロールエステル転送蛋白（ＣＥＴＰ）の作用により血中のＶＬＤＬ、ＩＤＬやＬＤＬに転送される。コレステロールエステルを受け取ったＶＬＤＬ、ＩＤＬやＬＤＬは、肝臓のＬＤＬ受容体を介して間接的にコレステロールが肝臓に転送されることとなる。
【０００３】
このコレステロール逆転送系は、コレステロールの末梢細胞への蓄積を防御し動脈硬化を防御する機構として近年注目を浴びている。事実、このコレステロール逆転送系において重要な役割をなすＨＤＬに関し、血中ＨＤＬのコレステロールエステルの減少は、冠動脈疾患の危険因子の一つであることがこれまでに多数の疫学的調査によって示され、ＨＤＬは抗動脈硬化作用を有するリポ蛋白として広く認識されるようになった。
さらに、血中ＨＤＬの重要性とともに、ＨＤＬ中のコレステロールエステルの血中ＬＤＬへの転送を媒介するＣＥＴＰの重要性が認識されるようになり、ＣＥＴＰ欠損症、高脂血症、高ＨＤＬ血症、高コレステロール血症、低脂血症、動脈硬化症、糖尿病あるいはネフローゼ症候群等の各種疾患とＣＥＴＰとの係わりを解明することが急務となった。
例えば、高脂血症状態では、正常コントロールに比べ数倍のＣＥＴＰが血中に分泌されることが実験的に証明されている。また、動脈硬化症との関係においては、ＣＥＴＰ活性の低い場合には、動脈硬化が惹起されにくく、血漿ＨＤＬ−コレステロール値が高く、逆にＣＥＴＰ活性が高い場合には、動脈硬化が容易に誘発され、ＨＤＬ−コレステロール値が低いことが実験的に証明されている（カレントセラピー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｈｅｒａｐｙ）、第７巻、第９号、第３６〜第４５頁、１９８９年）。
上述のような各種疾患とＣＥＴＰとの係わりを解明するために、健常人及び上述のような各種疾患に罹患している患者の血漿等の体液中のＣＥＴＰを定量する方法、特にＣＥＴＰに対するモノクローナル抗体（抗ＣＥＴＰモノクローナル抗体）を用いたラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）あるいはエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）等のイムノアッセイによる定量方法の開発並びにそのような定量方法に使用するための抗ＣＥＴＰモノクローナル抗体の開発が試みられている。
【０００４】
抗ＣＥＴＰモノクローナル抗体を用いたＥＩＡ（ＥＬＩＳＡ）による定量法に関しては、例えば、今井ら（特開平６−１６９７９３号公報）、中野ら（動脈硬化、第１９巻、第１１号、第９５１頁、２２番、１９９１年）、高浜ら（動脈硬化、第２０巻、第１０号、第８３７頁、１３５番、１９９２年）、佐藤ら（動脈硬化、第２０巻、第１０号、第８３６頁、１３４番、１９９２年）、メツドール（Ｈ． Ｍｅｚｄｏｕｒ）ら（クリニカルケミストリー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第４０巻、第４号、第５９３〜第５９７頁、１９９４年）、及びクラーク（Ｃｌａｒｋ）ら（ジャーナルオブリピッドリサーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅｒｃｈ）、第３６巻、第８７６〜第８８９頁、１９９５年）が、２種類の抗ＣＥＴＰモノクローナル抗体またはＦａｂ’を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによる定量方法を報告している。しかしながら、これらの定量方法では、定量に際して血漿試料を９５〜１００℃での加熱処理及び／または界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００等）で前処理しなければならないという煩雑な操作が必要であった。とりわけ血漿試料の加熱処理は、試料中のＣＥＴＰを変性させてしまうため、定量されるＣＥＴＰは変性されたＣＥＴＰであり、血漿試料中のインタクトなＣＥＴＰを正確に定量することはできない。
【０００５】
また、クラーク（Ｒ． Ｃｌａｒｋ）ら（ＦＡＳＥＢジャーナル、第８巻、第７号、Ａ１３４３頁、４９５番、１９９４年）、高橋ら（動脈硬化、第２０巻、第１０号、第８３７頁、１３６番、１９９２年、及び動脈硬化、第２１巻、第３号、第２０９頁、９７番、１９９３年）、金光ら（動脈硬化、第２１巻、第３号、第２０９頁、９８番、１９９３年）及び脇ら（動脈硬化、第２２巻、第５号、第４４１頁、１９４番、１９９４年）も、血漿試料中のＣＥＴＰをＥＬＩＳＡ法により測定したと報告しているが、定量に用いた抗ＣＥＴＰ抗体も製造方法及び特性並びに定量の具体的な操作については何等報告していない。
【０００６】
抗ＣＥＴＰモノクローナル抗体を用いたＲＩＡによる定量法に関しては、深澤ら（脂質生化学研究、第３４巻、第１６３〜１６６頁、１９９２年）、マーセル（Ｙ． Ｍａｒｃｅｌ）ら（ジャーナルオブクリニカルインベスティゲイション（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．）、第８５巻、第１０〜第１７頁、１９９０年、及び（アドバンスインエクスペリメンタルメディシンアンドバイオロジー（Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ．）、第２４３巻、第２２５〜第２３０頁、１９８８年）、深澤ら（ジャーナルオブバイオケミストリー（Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第１１１巻、第６９６〜６９８頁、１９９２年）、コイズミ（Ｊ． Ｋｏｉｚｕｍｉ）ら（アテロスクレロシス（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、第９０巻、第１８９〜第１９６頁、１９９１年）、ブラウン（Ｍ． Ｂｒｏｗｎ）ら（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３４２巻、第４４８〜第４５１頁、１９８９年）及びダングレモント（Ｖ． Ｄａｎｇｒｅｍｏｎｔ）ら（クリニカキミカアクタ（Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ）、第２３１巻、第１４７〜第１６０頁、１９９４年）が報告している。
しかしながら、これらのＲＩＡによる定量方法においても、前述のＥＩＡ（ＥＬＩＳＡ）による定量方法と同様に、定量に際しての血漿試料の界面活性剤による前処理が必要という操作上の煩雑性及び／または定量感度の点で欠点を有していた。
上述のように、ＣＥＴＰの定量については多数の研究者が試みているが、何の前処理も必要とせず、インタクトなＣＥＴＰを簡易かつ高感度に定量することに成功したという報告は全くなされていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
動脈硬化症、高脂血症、高ＨＤＬ血症あるいは高コレステロール血症等の各種疾患とそのような疾患の発症に深く関与している可能性を有するコレステロール逆転送系と重要な役割を担うＣＥＴＰとの係わりを解明するために、健常人を含めあらゆる患者の血漿等の体液中に存在するＣＥＴＰを、インタクト（ｉｎｔａｃｔ）な状態で簡便かつ高感度で定量でき、臨床上で汎用可能な定量方法及び該定量方法に使用可能なモノクローナル抗体の開発が強く要望されているが、未だ確立されていない。本発明は、そのような臨床上で汎用可能な定量方法、並びに該定量法での使用のみならずＣＥＴＰの分離及び精製のための試薬として、また医薬品として極めて有用な抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体を提供するものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、そのような臨床上で汎用され得るヒト体液中のＣＥＴＰの定量方法及び該定量方法に用いられるヒト由来ＣＥＴＰに対するモノクローナル抗体に関して鋭意研究した結果、生物学的に活性である精製ヒト由来ＣＥＴＰを免疫抗原として用いることにより、ヒト由来ＣＥＴＰ、特にヒト体液中に存在するインタクトなＣＥＴＰに対して各々異なる高い結合特異性（ＣＥＴＰ阻害活性）を有する３つの抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体を作製することに成功した。
さらに、該３つの抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体が、ヒト由来ＣＥＴＰ、特にヒト体液中に存在するインタクトなＣＥＴＰに対して高い結合特異性（ＣＥＴＰ阻害活性）を有するが故に、本発明の抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体を用いたイムノアッセイにより、未だ確立されていないヒト体液（血漿等）中のＣＥＴＰをインタクトな状態で簡便かつ高感度で定量できることを見出し本発明を完成するに到った。
とりわけ、本発明の３つの抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体が、ヒト由来ＣＥＴＰ、特にヒト体液中に存在するインタクトなＣＥＴＰに対して各々異なる高い結合特異性（ＣＥＴＰ阻害活性）を有するという特徴を利用して、該３つのモノクローナル抗体の内のいずれか２つを組合わせたサンドイッチＥＬＩＳＡを採用することによりさらに簡便かつ高感度に定量でき臨床上汎用可能な定量方法を開発することに成功した。
【０００９】
本発明の抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体が、ヒト由来ＣＥＴＰ、特にヒト体液中に存在するインタクトなＣＥＴＰに対して高い結合特異性（ＣＥＴＰ阻害活性）を有するが故に、本発明のモノクローナル抗体を用いれば、血漿等の体液試料の定量に際し、試料を加熱処理あるいは界面活性剤処理等の何等の前処理をする必要なく、簡便かつ高感度で定量することが可能である。
また、本発明の抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体は、そのＣＥＴＰ阻害活性の高さ故に、ＣＥＴＰの動態異常に起因する動脈硬化症、高脂血症、高ＨＤＬ血症あるいは高コレステロール血症等の各種疾患の治療または予防のための医薬品として有用である。
【００１０】
即ち、本発明の第１は、少なくとも下記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の性質を有するモノクローナル抗体である。
（ａ）健常人、高脂血症患者、ＬＣＡＴ（レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ）欠損症患者または高ＨＤＬ（高比重リポ蛋白）血症患者の血漿中のＣＥＴＰ（コレステロールエステル転送蛋白）に反応性を有する。
（ｂ）３μｇ／ｍｌ以下の濃度においてウサギ由来ＣＥＴＰに反応しない。
（ｃ）変性したヒト由来ＣＥＴＰには特異的な反応性を示さない。
本発明の第２は、ヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマであり、具体的には、国際寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４９４４またはＦＥＲＭ ＢＰ−４９４５で識別されるハイブリドーマ＃７２−１または＃８６−２である。
本発明の第３は、ヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有するモノクローナル抗体であり、具体的には、国際寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４９４４またはＦＥＲＭ ＢＰ−４９４５で識別されるハイブリドーマ＃７２−１または＃８６−２から産生されるモノクローナル抗体＃７２−１または＃８６−２である。
本発明の第４は、可変領域が前記モノクローナル抗体由来の可変領域であり、かつ定常領域がヒトイムノグロブリン由来の定常領域であることを特徴とするヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有する組換キメラモノクローナル抗体である。
【００１１】
本発明の第５は、超可変領域の相補性決定領域の一部または全部が前記モノクローナル抗体由来の相補性決定領域であり、超可変領域の枠組領域がヒトイムノグロブリン由来の枠組領域であり、かつ定常領域がヒトイムノグロブリン由来の定常領域であることを特徴とするヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有する組換ヒト型モノクローナル抗体である。
本発明の第６は、前記モノクローナル抗体、またはそれらに由来する前記組換キメラモノクローナル抗体若しくは組換ヒト型モノクローナル抗体に由来する抗体フラグメントＦ（ａｂ’）２またはＦａｂ’である。
本発明の第７は、前記モノクローナル抗体、またはそれらに由来する前記組換キメラモノクローナル抗体若しくは組換ヒト型モノクローナル抗体を不溶性担体に固定化してなる固定化モノクローナル抗体、及び前記抗体フラグメントＦ（ａｂ’）２またはＦａｂ’を不溶性担体に固定化してなる固定化抗体フラグメントである。
具体的には、プレート、試験管、チューブ、ビーズ、ボール、フィルター、メンブレン、またはアフィニティーカラムクロマトグラフィーに用いられる不溶性担体に固定化されていることを特徴とする固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントである。
【００１２】
本発明の第８は、前記モノクローナル抗体、またはそれらに由来する前記組換キメラモノクローナル抗体若しくは組換ヒト型モノクローナル抗体を、単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識してなる標識モノクローナル抗体、及び前記抗体フラグメントＦ（ａｂ’）２またはＦａｂ’を、単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識してなる標識抗体フラグメントである。
具体的には、酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジン、または放射性同位体で標識された標識モノクローナル抗体または標識抗体フラグメントである。
本発明の第９は、前記モノクローナル抗体、それらに由来する前記組換キメラモノクローナル抗体若しくは組換ヒト型モノクローナル抗体、前記抗体フラグメントＦ（ａｂ’）２若しくはＦａｂ’、前記固定化モノクローナル抗体若しくは固定化抗体フラグメント、または前記標識モノクローナル抗体若しくは標識抗体フラグメントを少なくとも含んでなるヒト由来ＣＥＴＰの検出または定量に用いられるキットである。
具体的には、前記固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントと前記標識モノクローナル抗体若しくは標識抗体フラグメントを含んでなるヒト由来ＣＥＴＰの検出または定量に用いられるキットである。
本発明の第１０は、前記モノクローナル抗体、それらに由来する前記組換キメラモノクローナル抗体若しくは組換ヒト型モノクローナル抗体、前記抗体フラグメントＦ（ａｂ’）２若しくはＦａｂ’、前記固定化モノクローナル抗体若しくは固定化抗体フラグメント、または前記標識モノクローナル抗体若しくは標識抗体フラグメントを少なくとも用いることを特徴とするイムノアッセイによりヒト由来ＣＥＴＰを検出または定量する方法である。
具体的側面としての第１は、少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含むイムノアッセイによりヒト由来ＣＥＴＰを検出または定量する方法である。
（ａ）前記固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントに試料を反応せしめる工程。
（ｂ）該固定化モノクローナル抗体または該固定化抗体フラグメントと試料中に含まれるヒト由来ＣＥＴＰとの結合により形成される抗原抗体複合体に前記標識モノクローナル抗体または標識抗体フラグメントを反応せしめる工程。
【００１３】
具体的側面の第２は、少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含むイムノアッセイによりヒト由来ＣＥＴＰを検出または定量する方法である。
（ａ）前記標識モノクローナル抗体または標識抗体フラグメントに試料を反応せしめる工程。
（ｂ）該標識モノクローナル抗体または該標識抗体フラグメントと試料中に含まれるヒト由来ＣＥＴＰとの結合により形成される抗原抗体複合体に前記固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントを反応せしめる工程。
具体的側面としての第３は、少なくとも下記（ａ）の工程を含むイムノアッセイによりヒト由来ＣＥＴＰを検出または定量する方法である。
（ａ）前記固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメント、前記標識モノクローナル抗体もしくは標識抗体フラグメント、及び試料を含む混合物を反応せしめる工程。
【００１４】
具体的側面としての第４は、少なくとも下記（ａ）の工程を含むイムノアッセイによりヒト由来ＣＥＴＰを検出または定量する方法である。
（ａ）前記固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントに、試料及び単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識してなる標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質を反応せしめる工程。
具体的側面としての第５は、少なくとも下記（ａ）の工程または（ｂ）及び（ｃ）の工程を含むイムノアッセイによりヒト由来ＣＥＴＰを検出または定量する方法である。
（ａ）試料と単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識してなる標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質との混合物に前記モノクローナル抗体または抗体フラグメントを反応せしめる工程。
（ｂ）試料に前記モノクローナル抗体または抗体フラグメントを反応せしめる工程。
（ｃ）（ｂ）の工程を行った反応系に単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識してなる標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質を反応せしめる工程。
【００１５】
さらに具体的には、少なくとも下記（ａ）及び（ｄ）の工程または（ｂ）乃至（ｄ）の工程を含むイムノアッセイによりヒト由来ＣＥＴＰを検出または定量する方法である。
（ａ）試料と単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識してなる標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質との混合物に前記モノクローナル抗体または抗体フラグメントを反応せしめる工程。
（ｂ）試料に前記モノクローナル抗体または抗体フラグメントを反応せしめる工程。
（ｃ）（ｂ）の工程を行った反応系に単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識してなる標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質を反応せしめる工程。
（ｄ）該試料中のヒト由来ＣＥＴＰ若しくは該標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質と該モノクローナル抗体または該抗体フラグメントとの結合により形成される抗原抗体複合体に、該モノクローナル抗体または該抗体フラグメントに反応性を有する哺乳動物由来の抗血清を反応せしめる工程。
【００１６】
本発明の第１１は、前記固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントを含んでなるヒト由来ＣＥＴＰの分離または精製に用いられるキットである。
本発明の第１２は、前記固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いることを特徴とするヒト由来ＣＥＴＰを分離または精製する方法であり、具体的には、カラムクロマトグラフィーを用いることを特徴とするヒト由来ＣＥＴＰの精製方法である。
本発明の第１３は、ヒト由来ＣＥＴＰをコードするＤＮＡが導入されたマウスであって、該マウスは、外的または人為的な誘発を必要とすることなく恒常的に血中にヒト由来ＣＥＴＰを分泌していることを特徴とするマウスである。
本発明の第１４は、前記モノクローナル抗体、それらに由来する前記組換キメラモノクローナル抗体若しくは組換ヒト型モノクローナル抗体、または前記抗体フラグメントＦ（ａｂ’）２若しくはＦａｂ’及び薬学的に許容されうる担体とを含んでなる医薬組成物である。具体的には、高脂血症または動脈硬化症の予防または治療に用いられる医薬組成物である。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明で用いる語句の意味を明らかにすることにより、本発明を詳細に説明する。
本発明における「モノクロ−ナル抗体」は、ヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有するモンクローナル抗体であり、具体的には、少なくとも下記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の性質を有するモノクローナル抗体である。
（ａ）健常人、高脂血症患者、ＬＣＡＴ欠損症患者または高ＨＤＬ血症患者の血漿中のＣＥＴＰに反応性を有する。
（ｂ）３μｇ／ｍｌ以下の濃度においてウサギ由来ＣＥＴＰに反応しない。
（ｃ）変性したヒト由来ＣＥＴＰには特異的な反応性を示さない。
さらに、本発明のモノクローナル抗体は、ヒト体液中に存在するインタクトなＣＥＴＰ対して反応性を有するという特徴を有する。
ここで、「変性したヒト由来ＣＥＴＰ」とは、熱処理あるいは界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ−２０やＴｒｉｔｏｎ−Ｘ等）等による処理により、タンパク質の高次構造が崩されているか、さらには生物学的に不活性なヒト由来ＣＥＴＰを意味する。
さらに具体的には、国際寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４９４４及びＦＥＲＭ ＢＰ−４９４５で識別されるハイブリドーマ＃７２−１及び＃８６−２から各々産生されるモノクロ−ナル抗体＃７２−１及び＃８６−２、並びに後述の実施例で調製されるハイブリドーマ＃１７６−１から産生されるモノクローナル抗体＃１７６−１である。
さらに本発明においては、遺伝子組換技術を用いて製造され得る該モノクローナル抗体に由来する組換キメラモノクローナル抗体、組換ヒト型モノクローナル抗体及びヒト抗体も包含する。
【００１８】
本発明のモノクローナル抗体（例えば、＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１等）は、既存のモノクローナル抗体の一般的な製造方法によって製造することができる。例えば、いわゆる細胞融合によって製造されるハイブリドーマ（融合細胞）から製造することができる。即ち、抗原を哺乳動物に免疫することにより抗体産生細胞を取得し、該抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）からハイブリドーマを調製し、該ハイブリドーマをクローン化し、哺乳動物の免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって製造される。
具体的には、変性していないインタクトな生物学的に活性な精製ヒト由来ＣＥＴＰを抗原として、該抗原を哺乳動物（ヒト抗体を産生するように遺伝子工学的に作出されたヒト抗体産生マウスのようなトランスジェニック動物も含む。）、具体的には、マウス、ラット、ハムスター、モルモットあるいはウサギ、さらに具体的にはマウス、ラットあるいはハムスターの皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内あるいは腹腔内に１乃至数回注射することにより免疫感作を施す。
通常、初回免疫から約１乃至１４日毎に１乃至４回免疫を行って、最終免疫より約１乃至５日後に免疫感作された該哺乳動物から抗体産生細胞が取得される。
【００１９】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの調製は、ケーラー及びミルシュタインらの方法（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第２５６巻、第４９５〜第４９７頁、１９７５年）及びそれに準じる修飾方法に従って行うことができる。即ち、前述の如く免疫感作された哺乳動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラットまたはヒトに由来する自己抗体産生能のないミエローマ細胞とを細胞融合させることにより調製される。
細胞融合に用いられるミエローマ細胞としては、例えばマウス由来ミエローマＰ３／Ｘ６３−ＡＧ８．６５３（６５３）、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／Ｏ、Ｓｐ２）、ＰＡＩ、Ｆ０あるいはＢＷ５１４７、ラット由来ミエローマ２１０ＲＣＹ３−Ａｇ．２．３．、ヒト由来ミエローマＵ−２６６ＡＲ１、ＧＭ１５００−６ＴＧ−Ａ１−２、ＵＣ７２９−６、ＣＥＭ−ＡＧＲ、Ｄ１Ｒ１１あるいはＣＥＭ−Ｔ１５等を使用することができる。
【００２０】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の前述の哺乳動物の免疫感作で用いた精製ヒト由来ＣＥＴＰに対する反応性を、例えばＲＩＡやＥＬＩＳＡ等の酵素免疫測定法によって測定することにより行なうことができる。
ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の製造は、ハイブリドーマをインビトロ、またはマウス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等、好ましくはマウスまたはラット、より好ましくはマウスの腹水中等でのインビボで行い、得られた培養上清、または哺乳動物の腹水から単離することにより行うことができる。
インビトロで培養する場合には、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々条件に合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地あるいは既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。
基本培地としては、例えば、Ｈａｍ’Ｆ１２培地、ＭＣＤＢ１５３培地あるいは低カルシウムＭＥＭ培地等の低カルシウム培地及びＭＣＤＢ１０４培地、ＭＥＭ培地、Ｄ−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＡＳＦ１０４培地あるいはＲＤ培地等の高カルシウム培地等が挙げられ、該基本培地は、目的に応じて、例えば血清、ホルモン、サイトカイン及び／または種々無機あるいは有機物質等を含有することができる。
モノクローナル抗体の単離、精製は、上述の培養上清あるいは腹水を、飽和硫酸アンモニウム、ユーグロブリン沈澱法、カプロイン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたはＤＥ５２等）、抗イムノグロブリンカラムあるいはプロテインＡカラム等のアフィニティカラムクロマトグラフィーに供すること等により行うことができる。
【００２１】
本発明における「組換キメラモノクロ−ナル抗体」は、遺伝子工学的に作製されるモノクローナル抗体であって、具体的には、その可変領域が前記モノクロ−ナル抗体、例えばモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１等に由来する可変領域であり、かつその定常領域がヒトイムノグロブリン由来の定常領域であることを特徴とする組換マウス／ヒトキメラモノクローナル抗体等のキメラモノクローナル抗体を意味する。ヒトイムノグロブリン由来の定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ等のアイソタイプにより各々固有のアミノ酸配列を有するが、本発明の組換キメラモノクローナル抗体の定常領域はいずれのアイソタイプに属するヒトイムノグログリンの定常領域であってもよい。好ましくは、ヒトＩｇＧの定常領域である。
本発明のモノクローナル抗体に包含されるモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１等に由来する組換マウス／ヒトキメラモノクローナル抗体は、例えば以下のようにして製造することができる。しかしながら、そのような製造方法に限定されるものでないことは言うまでもない。
【００２２】
例えば、実験医学（臨時増刊号）、第１．６巻、第１０号、１９８８年及び特公平３−７３２８０号公報等を参照しながら作製することができる。即ち、本発明のハイブリドーマ＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１から単離したモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１をコードするＤＮＡから取得した活性なＶＨ遺伝子（Ｈ鎖可変領域をコードする再配列されたＶＤＪ遺伝子）の下流に、ヒトイムノグロムリンをコードするＤＮＡから取得したＣＨ遺伝子（Ｈ鎖定常領域をコードするＣ遺伝子）を、またハイブリドーマ＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１から単離したモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１をコードするＤＮＡから取得した活性なＶＬ 遺伝子（Ｌ鎖可変領域をコードする再配列されたＶＪ遺伝子）の下流にヒトイムノグロムリンをコードするＤＮＡから取得したＣＬ遺伝子（Ｌ鎖定常領域をコードするＣ遺伝子）を、各々発現可能なように配列して１つ又は別々の発現ベクターに挿入し、該発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、該形質転換細胞を培養することにより作製することができる。宿主細胞としては、原核細胞（例えば大腸菌）及び真核細胞（例えばＣＨＯ細胞）のいずれをも使用することができる。
【００２３】
具体的には、まず、ハイブリドーマ＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１から常法によりＤＮＡを抽出後、該ＤＮＡを適切な制限酵素（例えばＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ等）を用いて消化し、電気泳動に付して（例えば０．７％アガロースゲル使用）サザンブロット法を行う。泳動したゲルを例えばエチジウムブロマイド等で染色し、写真撮影後、マーカーの位置を付し、ゲルを２回水洗し、０．２５Ｍ ＨＣｌ溶液に１５分間浸す。次いで、０．４ＮのＮａＯＨ溶液に１０分間浸し、その間緩やかに振盪する。常法により、フィルターに移し、４時間後フィルターを回収して２×ＳＳＣで２回洗浄する。フィルターを十分乾燥した後、ベイキング（７５℃、３時間）を行う。ベイキング終了後に、該フィルターを０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液に入れ、６５℃で３０分間処理する。次いで、３×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液に浸す。得られたフィルターをプレハイブリダイゼーション液と共にビニール袋に入れ、６５℃で３〜４時間処理する。
【００２４】
次に、この中に３２Ｐ標識したプローブＤＮＡ及びハイブリダイゼーション液を入れ、６５℃で１２時間程度反応させる。ハイブリダイゼーション終了後、適切な塩濃度、反応温度および時間（例えば、２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ溶液、室温、１０分間）のもとで、フィルターを洗う。該フィルターをビニール袋に入れ、２×ＳＳＣを少量加え、密封し、オートラジオグラフィーを行う。
上記サザンブロット法により、モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１のＨ鎖及びＬ鎖を各々コードする再配列されたＶＤＪ遺伝子及びＶＪ遺伝子を同定する。同定したＤＮＡ断片を含む領域をショ糖密度勾配遠心にて分画し、ファージベクター（例えば、Ｃｈａｒｏｎ ４Ａ， Ｃｈａｒｏｎ ２８， λＥＭＢＬ３，λＥＭＢＬ４等）に組み込み、該ファージベクターで大腸菌（例えば、ＬＥ３９２， ＮＭ５３９等） を形質転換し、ゲノムライブラリーを作製する。そのゲノムライブラリーを適当なプローブ〔Ｈ鎖Ｊ遺伝子，Ｌ鎖（κ）Ｊ遺伝子等〕を用いて、例えばベントンデイビス法（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第１９６巻、第１８０〜第１８２頁、１９７７年）に従って、プラークハイブリダイゼーションを行い、再配列されたＶＤＪ遺伝子あるいはＶＪ遺伝子を各々含むポジティブクローンを得る。得られたクローンの制限酵素地図を作製し、塩基配列を決定し、目的とする再配列されたＶＨ （ＶＤＪ） 遺伝子あるいはＶＬ （ＶＪ）遺伝子を含む遺伝子が得られていることを確認する。
【００２５】
一方、キメラ化に用いるヒトＣＨ 遺伝子及びヒトＣＬ 遺伝子を別に単離する。例えば、ヒトＩｇＧ１ とのキメラ抗体を作製する場合には、ＣＨ 遺伝子であるＣγ１ 遺伝子とＣＬ 遺伝子であるＣκ遺伝子を単離する。これらの遺伝子はマウス免疫グロブリン遺伝子とヒト免疫グロブリン遺伝子の塩基配列の高い相同性を利用してヒトＣγ１ 遺伝子及びヒトＣκ遺伝子に相当するマウスＣγ１ 遺伝子及びマウスＣκ遺伝子をプローブとして用い、ヒトゲノムライブラリーから単離することによって得ることができる。
具体的には、例えば、クローンＩｇ１４６（プロシーディングスナショナルアカデミーオブサイエンス（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ）、第７５巻、第４７０９〜第４７１３頁、１９７８年）からの３ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片とクローンＭＥＰ１０（プロシーディングスナショナルアカデミーオブサイエンス（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ）、第７８巻、第４７４〜第４７８頁、１９８１年）からの６．８ｋｂのＥｃｏＲＩ断片をプローブとして用い、ヒトのラムダＣｈａｒｏｎ ４Ａ のＨａｅＩＩＩ−ＡｌｕＩゲノムライブラリー（セル（Ｃｅｌｌ）、第１５巻、第１１５７〜第１１７４頁、１９７８年）中から、ヒトＣκ遺伝子を含み、エンハンサー領域を保持しているＤＮＡ断片を単離する。また、ヒトＣγ１ 遺伝子は、例えばヒト胎児肝細胞ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、アガロースゲル電気泳動で分画した後、５．９ｋｂのバンドをλ７８８に挿入し、前記のプローブを用いて単離する。
【００２６】
このようにして単離されたマウスＶＨ 遺伝子とマウスＶＬ 遺伝子、及びヒトＣＨ 遺伝子とヒトＣＬ 遺伝子を用いて、プロモーター領域及びエンハンサー領域などを考慮しながらマウスＶＨ 遺伝子の下流にヒトＣＨ 遺伝子を、またマウスＶＬ 遺伝子の下流にヒトＣＬ 遺伝子を、適切な制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いて、
例えばｐＳＶ２ｇｐｔあるいはｐＳＶ２ｎｅｏ等の発現ベクターに常法に従って組み込む。この際、マウスＶＨ 遺伝子／ヒトＣＨ 遺伝子とマウスＶＬ 遺伝子／ヒトＣＬ 遺伝子のキメラ遺伝子は、一つの発現ベクターに同時に配置されてもよいし、各々別個の発現ベクターに配置することもできる。
このようにして作製したキメラ遺伝子挿入発現ベクターを、例えばＰ３Ｘ６３・Ａｇ８・６５３ 細胞あるいは ＳＰ２１０細胞といった前述のような自らは抗体を産生していない骨髄腫細胞に、プロトプラスト融合法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リン酸カルシウム法あるいは電気穿孔法等により導入する。形質転換細胞は、発現ベクターに導入された薬物耐性遺伝子に対応する薬物含有培地中での培養により選別し、目的とするキメラモノクローナル抗体産生細胞を取得する。
このようにして選別された抗体産生細胞の培養上清中から目的のキメラモノクローナル抗体を取得する。
【００２７】
本発明における「組換ヒト型モノクロ−ナル抗体」は、遺伝子工学的に作製されるモノクローナル抗体であって、具体的には、その超可変領域の相補性決定領域の一部または全部が前記本発明のモノクロ−ナル抗体、例えば、モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１等に由来する可変領域の相補性決定領域であり、その超可変領域の枠組領域がヒトイムノグロブリン由来の超可変領域の枠組領域であり、かつその定常領域がヒトイムノグロブリン由来の定常領域であることを特徴とする組換モノクローナル抗体を意味する。
ここで、超可変領域の相補性決定領域とは、抗体の可変領域中の超可変領域に存在し、抗原と相補的に直接結合する部位である３つの領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｓｉｄｕｅ；ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を指し、また超可変領域の枠組領域とは、該３つ相補性決定領域の前後に介在する比較的保存された４つの領域（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ；ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）を指す。
【００２８】
換言すれば、本発明のモノクロ−ナル抗体の超可変領域の相補性決定領域の一部または全部以外の全ての領域が、ヒトイムノグロブリンの対応領域と置き代わったモノクローナル抗体を意味する。
ヒトイムノグロブリン由来の定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ等のアイソタイプにより各々固有のアミノ酸配列を有するが、本発明の組換ヒト型モノクローナル抗体の定常領域はいずれのアイソタイプに属するヒトイムノグログリンの定常領域であってもよい。好ましくは、ヒトＩｇＧの定常領域である。また、ヒトイムノグロブリン由来の超可変領域の枠組領域についても限定されるものではない。
本発明のモノクローナル抗体に包含されるモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１等に由来する組換ヒト型モノクローナル抗体は、例えば以下のようにして製造することができる。しかしながら、そのような製造方法に限定されるものでないことは言うまでもない。
【００２９】
例えば、特表平４−５０６４５８号公報及び特開昭６２−２９６８９０号公報等を参照して、遺伝子工学的に作製することができる。即ち、本発明のハイブリドーマ＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１から、少なくとも１つのマウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子と該マウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子に対応する少なくとも１つのマウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子を単離し、またヒトイムノグロブリン遺伝子から前記マウスＨ鎖ＣＤＲに対応するヒトＨ鎖ＣＤＲ以外の全領域をコードするヒトＨ鎖遺伝子と、前マウスＬ鎖ＣＤＲに対応するヒトＬ鎖ＣＤＲ以外の全領域をコードするヒトＬ鎖遺伝子を単離する。単離した該マウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子と該ヒトＨ鎖遺伝子を発現可能なように適当な発現ベクターに導入し、同様に該マウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子と該ヒトＬ鎖遺伝子を発現可能なように適当なもう１つの発現ベクターに導入する。または、該マウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子／ヒトＨ鎖遺伝子とマウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子／ヒトＬ鎖遺伝子を同一の発現ベクターに発現可能なように導入することもできる。このようにして作製された発現ベクターで宿主細胞を形質転換することによりヒト型モノクローナル抗体産生形質転換細胞を得、該形質転換細胞を培養することにより培養上清中から目的のヒト型モノクローナル抗体を得る。宿主細胞としては、原核細胞（例えば大腸菌）及び真核細胞（例えばＣＨＯ細胞）のいずれをも使用することができる
本発明における「ヒト抗体」とは、イムノグロブリンを構成するＨ鎖の可変領域及びＨ鎖の定常領域並びにＬ鎖の可変領域及びＬ鎖の定常領域を含む全ての領域がヒトイムノグロブリンをコードする遺伝子に由来するイムノグロブリンである。
ヒト抗体は、常法に従って、例えば、少なくともヒトイムノグロブリン遺伝子をマウス等のヒト以外の哺乳動物の遺伝子座中に組み込むことにより作製されたトランスジェニック動物を、抗原で免疫感作することにより、前述したポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体の作製法と同様にして製造することができる。例えば、ヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスは、ネイチャジェネティックス（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、第７巻、第１３〜第２１頁、１９９４年；特表平４−５０４３６５号公報；国際出願公開ＷＯ９４／２５５８５号公報；日経サイエンス、６月号、第４０〜第５０頁、１９９５年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３６８巻、第８５６〜８５９頁、１９９４年；及び特表平６−５００２３３号公報等に記載の方法に従って製作することができる。
【００３０】
本発明における「Ｆ（ａｂ’）２」及び「Ｆａｂ’」とは、イムノグロブリン（モノクローナル抗体）を、蛋白分解酵素であるペプシンあるいはパパイン等で処理することにより製造され、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の前後で消化されて生成される抗体フラグメントを意味する。例えば、ＩｇＧ１をパパインで処理すると、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の上流で切断されてＶＬ（Ｌ鎖可変領域）とＣＬ（Ｌ鎖定常領域）からなるＬ鎖、及びＶＨ（Ｈ鎖可変領域）とＣＨγ１（Ｈ鎖定常領域中のγ１領域）とからなるＨ鎖フラグメントがＣ末端領域でジスルフィド結合により結合した相同な２つの抗体フラグメントを製造することができる。これら２つの相同な抗体フラグメントを各々Ｆａｂ’という。またＩｇＧをペプシンで処理すると、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の下流で切断されて前記２つのＦａｂ’がヒンジ領域でつながったものよりやや大きい抗体フラグメントを製造することができる。この抗体フラグメントをＦ（ａｂ’）２という。
【００３１】
本発明における「哺乳動物由来の抗血清」とは、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ブタあるいはウシ等の哺乳動物、好ましくはラット、モルモット、ウサギあるいはヤギに、前記本発明のモノクローナル抗体あるいは前記本発明の抗体フラグメントを、前述モノクローナル抗体の製造方法で述べたような方法で免疫して製造される該本発明のモノクローナル抗体または抗体フラグメントに反応性を有する抗体を含む血清を意味する。具体的には、前記本発明のモノクローナル抗体（例えば、モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２若しくは＃１７６−１等）またはそれらの抗体フラグメントＦ（ａｂ’）２若しくはＦａｂ’を前記哺乳動物に免疫して得られる該哺乳動物由来の抗血清である。
【００３２】
本発明における「不溶性担体」とは、前記モノクローナル抗体若しくは抗体フラグメント、または試料（例えば、血漿等の体液試料、培養上清あるいは遠心上清等）中に含まれるヒト由来ＣＥＴＰを物理学的吸着あるいは化学的結合等によって坦持させるための支持体を意味する。例えば、（１）ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコン樹脂あるいはナイロン樹脂等からなるプラスチックや、ガラス等に代表されるような水に不溶性の物質からなるプレート、試験管若しくはチューブ等の内容積を有するもの、ビーズ、ボール、フィルター、あるいはメンブレン等、並びに（２）セルロース系担体、アガロース系担体、ポリアクリルアミド系担体、デキストラン系担体、ポリスチレン系担体、ポリビニルアルコール系担体、ポリアミノ酸系担体あるいは多孔性シリカ系担体等のようなアフィニティークロマトグラフィーに用いられる不溶性担体を挙げることができる。
【００３３】
「固定化モノクローナル抗体」及び「固定化抗体フラグメント」とは、該「不溶性担体」に物理的吸着あるいは化学的結合等によって坦持された状態にあるモノクローナル抗体及び抗体フラグメントを各々意味する。これらの固定化モノクローナル抗体及び固定化抗体フラグメントは、試料（例えば、血漿等の体液試料、培養上清あるいは遠心上清等）中に含まれるヒト由来ＣＥＴＰを検出、定量、分離または精製するために用いることができる。該検出または定量の目的においては、前記（１）に挙げた不溶性担体に固定化された固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントを用いることができ、とりわけ定量に用いる不溶性担体としては、操作の簡便性及び多数検体の同時処理の観点を考慮すると、例えば９６穴マイクロタイタープレート等の多数のウェル（Ｗｅｌｌ、穴）を有するプラスチックプレートを用いるのが好ましい。また、該分離または精製の目的においては、前記（１）に挙げたフィルター若しくはメンブレンまたは前記（２）に挙げた不溶性担体に固定化された固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントを用いることができる。
【００３４】
本発明における「単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質」とは、前記モノクローナル抗体、抗体フラグメントあるいはヒト由来ＣＥＴＰ標準物質に物理化学的結合等により結合させることによりそれらの存在を検出可能にするために用いられる物質を意味し、具体的には、酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジンあるいは放射性同位体等であり、さらに具体的には、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ−ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質、３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、アビジン、または化学発光物質が挙げられる。
【００３５】
ここで、放射性同位体及び蛍光物質は単独で検出可能なシグナルをもたらすことができる。一方、酵素、化学発光物質、ビオチン及びアビジンは、単独では検出可能なシグナルをもたらすことができないため、さらに１種以上の他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらす。例えば、酵素の場合には少なくとも基質が必要であり、酵素活性を測定する方法（比色法、蛍光法、生物発光法あるいは化学発光法等）に依存して種々の基質が用いられる。また、ビオチンの場合には少なくともアビジンあるいは酵素修飾アビジンを反応させるのが一般的であるが、この限りではない。必要に応じてさらに該基質に依存する種々の発色物質が用いられる。
【００３６】
「標識モノクローナル抗体」、「標識抗体フラグメント」及び「標識ヒト由来標準物質」とは、各々該標識物質で標識されたモノクローナル抗体、抗体フラグメント及びヒト由来ＣＥＴＰ標準物質を意味する。これらの標識モノクローナル抗体、標識抗体フラグメント及び標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質は、試料（例えば、血漿等の体液試料、培養上清あるいは遠心上清等）中に含まれるヒト由来ＣＥＴＰを検出または定量するために用いることができる。本発明においては、上記のいずれの標識物質をも使用可能であるが、検出感度あるいは定量感度の高さ及び操作の利便性の点を考慮すると、ビオチンで標識するのが好ましい。
ここで「ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質」とは、前述のような試料中に含まれるヒト由来ＣＥＴＰの検出または定量において使用される標品（スタンダード）としてのヒト由来ＣＥＴＰを意味する。
【００３７】
本発明における「イムノアッセイ」とは、抗原抗体反応の原理に基づき、試料（例えば、血漿等の体液試料、培養上清あるいは遠心上清等）中に含まれる抗原の検出あるいは定量を行う方法を意味し、本発明においては、該抗原抗体反応における抗体が、本発明のヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有する前記モノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメント、前記固定化モノクローナル抗体若しくは固定化抗体フラグメント、または前記標識モノクローナル抗体若しくは標識抗体フラグメントから選ばれる一つ以上の該モノクローナル抗体または抗体フラグメントをであること、及び抗原がヒト由来ＣＥＴＰであること以外は、これまでに知られているイムノアッセイをも適用することができる。
【００３８】
具体的には、酵素免疫測定法（第３版、石川榮治ら編集、医学書院発行、１９８７年）に記載されているような、例えば、一抗体固相法、二抗体液相法、二抗体固相法、サンドイッチ法、ＥＭＩＴ法（Ｅｎｚｙｍｅ ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）、エンザイムチャネリングアッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、酵素活性修飾物質標識イムノアッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＥＭＭＩＡ）、酵素阻害物質標識イムノアッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、イムノエンザイムメトリックアッセイ（Ｉｍｍｕｎｏｅｎｚｙｍｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ）、酵素活性増強イムノアッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）あるいはプロキシマールリンケージイムノアッセイ（Ｐｒｏｘｉｍａｌ ｌｉｎｋａｇｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）等、さらには、特公平２−３９７４７号公報に記載されているようなワンポット法を挙げることができる。
【００３９】
本発明においては、このようなイムノアッセイを、目的に応じて適宜選択して用いることができるが、操作上の簡便性及び／または経済的な利便性、とりわけ臨床上での汎用性の点を考慮すると、サンドイッチ法、ワンポット法、一抗体固相法または二抗体液相法を用いるのが好ましく、より好ましくは、サンドイッチ法またはワンポット法である。特に好ましくは、９６穴マイクロプレートに代表されるような多数のウェルを有するマイクロプレートに固定化された固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントと、酵素あるいはビオチンにより標識された標識モノクローナル抗体または標識抗体フラグメントとを用いるサンドイッチ法、あるいはビーズまたはボールに固定化された固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントと、酵素あるいはビオチンにより標識された標識モノクローナル抗体または標識抗体フラグメントとを用いるワンポット法である。
【００４０】
この特に好ましい態様において具体的な一例を挙げるならば、モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２若しくは＃１７６−１またはそれらのＦ（ａｂ’）２若しくはＦａｂ’をマイクロプレートに固定化した固定化モノクローナル抗体または固定化Ｆ（ａｂ’）２若しくは固定化Ｆａｂ’とモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２若しくは＃１７６−１またはそのＦ（ａｂ’）２若しくはＦａｂ’を酵素またはビオチンで標識した標識モノクローナル抗体また標識Ｆ（ａｂ’）２若しくはＦａｂ’との組合わせによるサンドイッチ法またはワンポット法である。モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１は、各々固定化モノクローナル抗体としても、また標識モノクローナル抗体としても使用でき得るが、モノクローナル抗体＃７２−１を固定化モノクローナル抗体として、また＃８６−２または＃１７６−１を標識モノクローナル抗体として用いるのが好ましい。特に好ましくは、モノクローナル抗体＃７２−１（ＦＥＲＭ ＢＰ４９４４で識別されるハイブリドーマに由来するモノクローナル抗体）を固定化モノクローナル抗体として、また、モノクローナル抗体＃８６−２（ＦＥＲＭＢＰ４９４５で識別されるハイブリドーマに由来するモノクローナル抗体）を標識モノクローナル抗体として用いることができる。
【００４１】
以下に、サンドイッチ法、ワンポット法、一抗体固相法及び二抗体液相法について詳述する。
サンドイッチ法は、前述の本発明の第１０の具体的側面の第１で述べた方法、即ち、少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含むイムノアッセイ法である。
（ａ）本発明の固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントに試料を反応せしめる工程。
（ｂ）該固定化モノクローナル抗体または該固定化抗体フラグメントと試料中に含まれるヒト由来ＣＥＴＰとの結合により形成される抗原抗体複合体に本発明の標識モノクローナル抗体または標識抗体フラグメントを反応せしめる工程。
本発明に即して、特に一般的である酵素あるいはビオチンを標識物質として用いる方法について具体的に説明すると、例えば下記のような工程により構成されるが、該具体例のみに限定されるものではない。なお、以下で使用する「固定化モノクローナル抗体」と「モノクローナル抗体固定化マイクロプレート」は、同一物を意味する。
【００４２】
（工程１）ヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有する本発明のモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１をマイクロプレートに固定化し、固定化モノクローナル抗体（モノクローナル抗体固定化マイクロプレート）を作製する工程；
（工程２）モノクローナル抗体固定化マイクロプレートにヒト血漿等の試料を加え、固定化モノクローナル抗体と試料を反応させる工程；
（工程３）モノクローナル抗体固定化マイクロプレートを洗浄し未反応の試料を固定化モノクローナル抗体から取り除く工程；
（工程４）ヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有する本発明のモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１をビオチンあるいはペルオキシダーゼ等の酵素により標識し、標識モノクローナル抗体を作製する工程；
（工程５）工程３で洗浄されたモノクローナル抗体固定化マイクロプレートに、標識モノクローナル抗体を加え、固定化モノクローナル抗体と試料中に含まれるヒト由来ＣＥＴＰが反応して形成される抗原抗体複合体に標識モノクローナル抗体を反応させる工程；
【００４３】
（工程６）モノクローナル抗体固定化マイクロプレートを洗浄し、未反応の標識モノクローナル抗体を抗原抗体複合体から取り除く工程；
（工程７）工程６で洗浄されたモノクローナル抗体固定化マイクロプレートに、工程４でビオチン標識モノクローナル抗体を用いた場合にはアビジンあるいは酵素修飾アビジンを、また工程４でペルオキシダーゼ等の酵素で標識した酵素標識モノクローナル抗体を用いた場合には酵素活性を測定する方法に依存して種々の基質を、必要に応じて発色物質とともに加え、標識モノクローナル抗体上の標識物質と反応させる工程；
（工程８）工程７で酵素修飾アビジンを加えた場合には、酵素活性を測定する方法に依存して種々の基質を加え、アビジンに結合した酵素と基質を反応させる工程；
（工程９）モノクローナル抗体固定化マイクロプレートに反応停止液を加え、酵素反応及び発色反応を停止させる工程；及び
（工程１０）比色強度、蛍光強度あるいは発光強度を測定する工程。
モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１は、固定化モノクローナル抗体としても標識モノクローナル抗体としても使用でき得るが、モノクローナル抗体＃７２−１を固定化モノクローナル抗体として、またモノクローナル抗体＃８６−２または＃１７６−１（特に好ましくはモノクローナル抗体＃８６−２）を標識モノクローナル抗体として用いるのが好ましい。
【００４４】
ワンポット法は、前述の本発明の第１０の具体的側面の第１、第２または第３で各々述べた方法、即ち、第１は、少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含むイムノアッセイ法である。
（ａ）本発明の固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントに試料を反応せしめる工程。
（ｂ）該固定化モノクローナル抗体または該固定化抗体フラグメントと試料中に含まれるヒト由来ＣＥＴＰとの結合により形成される抗原抗体複合体に本発明の標識モノクローナル抗体または標識抗体フラグメントを反応せしめる工程。
第２は、少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含むイムノアッセイ法である。
（ａ）本発明の標識モノクローナル抗体または標識抗体フラグメントに試料を反応せしめる工程。
（ｂ）該標識モノクローナル抗体または該標識抗体フラグメントと試料中に含まれるヒト由来ＣＥＴＰとの結合により形成される抗原抗体複合体に本発明の固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントを反応せしめる工程。
【００４５】
第３は、少なくとも下記（ａ）の工程を含むイムノアッセイ法である。
（ａ）本発明の固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメント、本発明の標識モノクローナル抗体もしくは標識抗体フラグメント、及び試料を含む混合物を反応せしめる工程。
上記第１乃至第３の方法を、本発明に即して、特に一般的である酵素あるいはビオチンを標識物質として用いる方法について具体的に説明すると、例えば下記のような工程により構成されるが、該具体例のみに限定されるものではない。なお、以下で使用する「固定化モノクローナル抗体」と「モノクローナル抗体固定化ビーズ」は、同一物を意味する。
【００４６】
第１の方法は、下記のような工程から構成される。
（工程１）ヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有する本発明のモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１をビーズに固定化し、固定化モノクローナル抗体（モノクローナル抗体固定化ビーズ）を作製する工程；
（工程２）試験管、プレートあるいはチューブ等のような内容積を有する容器に緩衝液とともにモノクローナル抗体固定化ビーズとヒト血漿等の試料を加え、固定化モノクローナル抗体と試料を反応させる工程；
（工程３）容器中の内溶液の除去及びモノクローナル抗体固定化ビーズを洗浄する工程；
（工程４）ヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有する本発明のモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１をビオチンあるいはペルオキシダーゼ等の酵素により標識し、標識モノクローナル抗体を作製する工程；
（工程５）工程３で洗浄されたモノクローナル抗体固定化ビーズを含有する容器に、標識モノクローナル抗体を加え、固定化モノクローナル抗体と試料中に含まれるヒト由来ＣＥＴＰが反応して形成される抗原抗体複合体に標識モノクローナル抗体を反応させる工程；
【００４７】
（工程６）容器中の内溶液の除去及びモノクローナル抗体固定化ビーズを洗浄し、未反応の標識モノクローナル抗体を抗原抗体複合体から取り除く工程；
（工程７）工程６で洗浄されたモノクローナル抗体固定化ビーズを含む容器に、工程４でビオチン標識モノクローナル抗体を用いた場合にはアビジンあるいは酵素修飾アビジンを、また工程４でペルオキシダーゼ等の酵素で標識した酵素標識モノクローナル抗体を用いた場合には酵素活性を測定する方法に依存して種々の基質を、必要に応じて発色物質とともに加え、標識モノクローナル抗体上の標識物質と反応させる工程；
（工程８）工程７で酵素修飾アビジンを加えた場合には、酵素活性を測定する方法に依存して種々の基質を加え、アビジンに結合した酵素と基質を反応させる工程；
（工程９）工程７または工程８の反応系に反応停止液を加え、酵素反応及び発色反応を停止させる工程；及び
（工程１０）比色強度、蛍光強度あるいは発光強度を測定する工程。
【００４８】
第２の方法は、下記のような工程から構成される。
（工程１）ヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有する本発明のモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１をビオチンあるいはペルオキシダーゼ等の酵素により標識し、標識モノクローナル抗体を作製する工程；
（工程２）試験管、プレートあるいはチューブ等のような内容積を有する容器に緩衝液とともに標識モノクローナル抗体とヒト血漿等の試料を加え、標識モノクローナル抗体と試料を反応させる工程；
（工程３）ヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有する本発明のモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１をビーズに固定化し、固定化モノクローナル抗体（モノクローナル抗体固定化ビーズ）を作製する工程；
（工程４）工程２の反応系に、モノクローナル抗体固定化ビーズを加え、標識モノクローナル抗体と試料中に含まれるヒト由来ＣＥＴＰが反応して形成される抗原抗体複合体に固定化モノクローナル抗体を反応させる工程；
（工程５）容器中の内溶液の除去及びモノクローナル抗体固定化ビーズを洗浄し、未反応の標識モノクローナル抗体を取り除く工程；
（工程６）工程５で洗浄されたモノクローナル抗体固定化ビーズを含む容器に、工程１でビオチン標識モノクローナル抗体を用いた場合にはアビジンあるいは酵素修飾アビジンを、また工程１でペルオキシダーゼ等の酵素で標識した酵素標識モノクローナル抗体を用いた場合には酵素活性を測定する方法に依存して種々の基質を、必要に応じて発色物質とともに加え、標識モノクローナル抗体上の標識物質と反応させる工程；
（工程７）工程６で酵素修飾アビジンを加えた場合には、酵素活性を測定する方法に依存して種々の基質を加え、アビジンに結合した酵素と基質を反応させる工程；
（工程８）工程６または工程７の反応系に反応停止液を加え、酵素反応及び発色反応を停止させる工程；及び
（工程９）比色強度、蛍光強度あるいは発光強度を測定する工程。
【００４９】
第３の方法は、下記のような工程から構成される。
（工程１）ヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有する本発明のモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１をビーズに固定化し、固定化モノクローナル抗体（モノクローナル抗体固定化ビーズ）を作製する工程；
（工程２）ヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有する本発明のモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１をビオチンあるいはペルオキシダーゼ等の酵素により標識し、標識モノクローナル抗体を作製する工程；
（工程３）試験管、プレートあるいはチューブ等のような内容積を有する容器に緩衝液とともに、工程１で作製されたモノクローナル抗体固定化ビーズ、工程２で作製された標識モノクローナル抗体、及びヒト血漿等の試料を加え、固定化モノクローナル抗体、標識モノクローナル抗体、及び試料を同時に反応させる工程；
（工程４）容器中の内溶液の除去及びモノクローナル抗体固定化ビーズを洗浄し、未反応の標識モノクローナル抗体を取り除く工程；
（工程５）工程４で洗浄されたモノクローナル抗体固定化ビーズを含む容器に、工程２でビオチン標識モノクローナル抗体を用いた場合にはアビジンあるいは酵素修飾アビジンを、また工程２でペルオキシダーゼ等の酵素で標識した酵素標識モノクローナル抗体を用いた場合には酵素活性を測定する方法に依存して種々の基質を、必要に応じて発色物質とともに加え、標識モノクローナル抗体上の標識物質と反応させる工程；
【００５０】
（工程６）工程５で酵素修飾アビジンを加えた場合には、酵素活性を測定する方法に依存して種々の基質を加え、アビジンに結合した酵素と基質を反応させる工程；
（工程７）工程５または工程６の反応系に反応停止液を加え、酵素反応及び発色反応を停止させる工程；及び
（工程８）比色強度、蛍光強度あるいは発光強度を測定する工程。
上述の第１乃至第３の方法の具体例において、モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１は、固定化モノクローナル抗体としても標識モノクローナル抗体としても使用でき得るが、モノクローナル抗体＃７２−１を固定化モノクローナル抗体として、また＃８６−２または＃１７６−１（好ましくは、モノクローナル抗体＃８６−２）を標識モノクローナル抗体として用いるのが好ましい。
【００５１】
一抗体固相法は、前述の本発明の第１０の具体的側面の第４で述べた方法、即ち、少なくとも下記（ａ）の工程を含むイムノアッセイ法である。
（ａ）本発明の固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントに、試料及び単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識してなる標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質を反応せしめる工程。
本発明に即して、特に一般的である酵素あるいはビオチンを標識物質として用いる方法について具体的に説明すると、例えば下記のような工程により構成されるが、該具体例のみに限定されるものではない。なお、以下で使用する「固定化モノクローナル抗体」と「モノクローナル抗体固定化マイクロプレート」は、同一物を意味する。
【００５２】
（工程１）ヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有する本発明のモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１をマイクロプレートに固定化し、固定化モノクローナル抗体（モノクローナル抗体固定化マイクロプレート）を作製する工程；
（工程２）ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質をビオチンあるいはペルオキシダーゼ等の酵素により標識し、標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質を作製する工程；
（工程３）モノクローナル抗体固定化マイクロプレートにヒト血漿等の試料及び標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質を加え、試料と標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質とを競合的に固定化モノクローナル抗体と反応させる工程；
（工程４）モノクローナル抗体固定化マイクロプレートを洗浄し、未反応の標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質を固定化モノクローナル抗体から取り除く工程；
（工程５）工程４で洗浄されたモノクローナル抗体固定化マイクロプレートに、工程２でビオチン標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質を用いた場合にはアビジンあるいは酵素修飾アビジンを、また工程２でペルオキシダーゼ等の酵素で標識した酵素標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質を用いた場合には酵素活性を測定する方法に依存して種々の基質を、必要に応じて発色物質とともに加え、標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質上の標識物質と反応させる工程；
【００５３】
（工程６）工程５で酵素修飾アビジンを加えた場合には、酵素活性を測定する方法に依存して種々の基質を加え、アビジンに結合した酵素と基質を反応させる工程；
（工程７）モノクローナル抗体固定化マイクロプレートに反応停止液を加え、酵素反応及び発色反応を停止させる工程；及び
（工程８）比色強度、蛍光強度あるいは発光強度を測定する工程。
固定化モノクローナル抗体としては、モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１のいずれをも使用でき得るが、モノクローナル抗体＃７２−１を固定化モノクローナル抗体として用いるのが好ましい。
【００５４】
二抗体液相法は、前述の本発明の第１０の具体的側面の第５で述べた方法、即ち、少なくとも下記（ａ）の工程または（ｂ）及び（ｃ）の工程を含むイムノアッセイ法である。
（ａ）試料と単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識してなる標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質との混合物に本発明のモノクローナル抗体または抗体フラグメントを反応せしめる工程。
（ｂ）試料に本発明のモノクローナル抗体または抗体フラグメントを反応せしめる工程。
（ｃ）（ｂ）の工程を行った反応系に単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識してなる標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質を反応せしめる工程。
【００５５】
さらに具体的には、少なくとも下記（ａ）及び（ｄ）の工程または（ｂ）乃至（ｄ）の工程を含むイムノアッセイ法である。
（ａ）試料と単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識してなる標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質との混合物に本発明のモノクローナル抗体または抗体フラグメントを反応せしめる工程。
（ｂ）試料に本発明のモノクローナル抗体または抗体フラグメントを反応せしめる工程。
（ｃ）（ｂ）の工程を行った反応系に単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識してなる標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質を反応せしめる工程。
（ｄ）該試料中のヒト由来ＣＥＴＰ若しくは該標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質と該モノクローナル抗体または該抗体フラグメントとの結合により形成される抗原抗体複合体に、該モノクローナル抗体または該抗体フラグメントに反応性を有する哺乳動物由来の抗血清を反応せしめる工程。
【００５６】
本発明に即して、特に一般的である酵素あるいはビオチンを標識物質として用いる方法について具体的に説明すると、例えば下記のような工程により構成されるが、該具体例のみに限定されるものではない。
（工程１）ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質をビオチンあるいはペルオキシダーゼ等の酵素により標識し、標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質を作製する工程；
（工程２）▲１▼ 試験管、プレートあるいはチューブ等のような内容積を有する容器にヒト血漿等の試料と工程１で作製された標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質との混合物を加え、次いでヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有する本発明のモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１を加え、試料と標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質とを競合的に該本発明のモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１とを反応させる工程；または、
▲２▼ 試験管、プレートあるいはチューブ等のような内容積を有する容器にヒト血漿等の試料を加え、次いでヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有する本発明のモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１を加え、該試料と該本発明のモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１とを反応させる工程；
【００５７】
（工程３）工程２において標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質を同時に加えない場合（▲２▼）には、標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質を加え、標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質とを該本発明のモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１と反応させる工程；
（工程４）ヤギ抗マウスγグロブリン血清等のようなマウス由来のモノクローナル抗体に反応性を有するマウス以外の動物由来の抗血清を加え、工程２乃至工程３において形成されるモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２若しくは＃１７６−１と試料中に含まれるヒト由来ＣＥＴＰ若しくは標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質との抗原抗体複合体に反応させ、モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２若しくは＃１７６−１、試料中に含まれるヒト由来ＣＥＴＰ若しくは標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質、及び該マウス以外の動物由来の抗血清との３つからなる複合体を凝集沈殿させる工程；
（工程５）工程４の反応系を遠心分離して凝集沈殿した複合体を分離する工程；
【００５８】
（工程６）工程５で分離された複合体凝集物に、工程１でビオチン標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質を用いた場合にはアビジンあるいは酵素修飾アビジンを、また工程１でペルオキシダーゼ等の酵素で標識した酵素標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質を用いた場合には酵素活性を測定する方法に依存して種々の基質を、必要に応じて発色物質とともに加え、標識ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質上の標識物質と反応させる工程；
（工程７）工程６で酵素修飾アビジンを加えた場合には、酵素活性を測定する方法に依存して種々の基質を加え、アビジンに結合した酵素と基質を反応させる工程；
（工程８）工程６乃至工程７の反応系に反応停止液を加え、酵素反応及び発色反応を停止させる工程；及び
（工程９）比色強度、蛍光強度あるいは発光強度を測定する工程。
上述の具体例において用いられるモノクローナル抗体としては、モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１のいずれをも使用でき得るが、モノクローナル抗体＃７２−１を用いるのが好ましい。
【００５９】
本発明における「アフィニティークロマトグラフィー」とは、抗原抗体反応を利用することにより試料（例えば、血漿等の体液試料、培養上清あるいは遠心上清等）中に含まれるヒト由来ＣＥＴＰを分離または精製する方法を意味する。具体的には、（１）前述のような不溶性担体であるフィルターあるいはメンブレン等に本発明のヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有するモノクローナル抗体あるいは抗体フラグメントを固定化した後、該フィルターあるいはメンブレンと試料を接触させることにより該試料中に含まれるヒト由来ＣＥＴＰを分離する方法、及び（２）前述のようなセルロース系担体、アガロース系担体、ポリアクリルアミド系担体、デキストラン系担体、ポリスチレン系担体、ポリビニルアルコール系担体、ポリアミノ酸系担体あるいは多孔性シリカ系担体等のような不溶性担体上に本発明のヒト由来ＣＥＴＰに反応性を有するモノクローナル抗体あるいは抗体フラグメントを常法により固定化（物理的吸着、架橋による高分子化、マトリックス中への封印あるいは非共有結合等による固定化）し、該不溶性担体をガラス製、プラスチック製あるいはステンレス製等のカラムに充填し、該カラム（例えば、円柱状カラム）に、試料（例えば、血漿等の体液試料、培養上清あるいは遠心上清等）を通じて溶出させることにより、該試料中に含まれるヒト由来ＣＥＴＰを分離あるいは精製する方法である。後者（２）の方法を特にアフィニティーカラムクロマトグラフィーという。
【００６０】
該アフィニティーカラムクロマトグラフィーに用いられる前記不溶性担体としては、本発明のモノクローナル抗体あるいは抗体フラグメントを固定化でき得るものであればどのような不溶性担体でも使用できるが、例えば、市販品である、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社（製）のＳｅｐｈａｒｏｓｅ ２Ｂ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ、ＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ、ＡＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ、ＣＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ、Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＣＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ、Ｅｐｏｘｙ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ、Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｔｈｉｏｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ、ＥＣＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ、ＥＡＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ、ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＳｅｐｈａｒｏｓｅあるいはＴｈｉｏｐｒｏｐｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ等、バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社（製）のＢｉｏ−Ｇｅｌ Ａ、Ｃｅｌｌｅｘ、Ｃｅｌｌｅｘ ＡＥ、Ｃｅｌｌｅｘ−ＣＭ、Ｃｅｌｌｅｘ ＰＡＢ、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ、Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ、Ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ ＣＭ、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ １０、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ １５、Ａｆｆｉ−Ｐｒｅｐ １０、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ Ｈｚ、Ａｆｆｉ−Ｐｒｅｐ Ｈｚ、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ １０２、ＣＭ Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ａ、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ ｈｅｐａｒｉｎ、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ ５０１あるいはＡｆｆｉ−Ｇｅｌ ６０１等、和光純薬工業社（製）のクロマゲルＡ、クロマゲルＰ、エンザフィックス Ｐ−ＨＺ、エンザフィックス Ｐ−ＳＨあるいはエンザフィックス Ｐ−ＡＢ等、セルバ（Ｓｅｒｖａ）社（製）のＡＥ−Ｃｅｌｌｕｒｏｓｅ、ＣＭ−ＣｅｌｌｕｒｏｓｅあるいはＰＡＢ Ｃｅｌｌｕｒｏｓｅ等を挙げることができる。
本発明における「ヒト由来ＣＥＴＰをコードするＤＮＡが導入されたマウス」は、トランスジェニックマウスの製造において通常使用されるような常法（最新動物細胞実験マニュアル、エル・アイ・シー発行、第７章、第３６１〜第４０８頁、１９９０年）に従って作成することが可能である。
ヒトＣＥＴＰ遺伝子が導入されたトランスジェニックマウスとしては、トール（Ｔａｌｌ）らが作成したマウスが報告されているが、当該マウスは例えば亜鉛を混ぜた食餌を摂取させるなどの外的あるいは人為的な誘発を受けないと、血中にヒトＣＥＴＰを分泌しないマウスである。
本発明のトランスジェニックマウスは、そのような何らの人為的誘発を必要とすることなく、血中に恒常的にヒト由来ＣＥＴＰを分泌するものであり、このようなトランスジェニックマウスはこれまで報告されていない。
【００６１】
本発明における「医薬組成物」は、本発明のモノクローナル抗体あるいは抗体フラグメントを有効成分として、薬学的に許容され得る担体、即ち、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等の一つ以上とともに医薬組成物とし、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、注射剤、液剤、カプセル剤、トロー剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態により経口あるいは非経口的に投与することができる。
【００６２】
とりわけ注射剤の場合には、例えば生理食塩水あるいは市販の注射用蒸留水等の非毒性の薬学的に許容され得る担体中に０．１μｇ抗体／ｍｌ担体〜１０ｍｇ抗体／ｍｌ担体の濃度となるように溶解または懸濁することにより製造することができる。このようにして製造された注射剤は、処置を必要とするヒト患者に対し、１回の投与において１ｋｇ体重あたり、１μｇ〜１００ｍｇの割合で、好ましくは５０μｇ〜５０ｍｇの割合で、１日あたり１回〜数回投与することができる。投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注射のような医療上適当な投与形態が例示できる。好ましくは静脈内注射である。
また、本発明の該医薬組成物は、高脂血症の予防及び治療への適用のみならず、ＣＥＴＰの動態異常に起因する動脈硬化症、高ＨＤＬ血症あるいは高コレステロール血症等の各種疾患の治療または予防への適用が可能である。
【００６３】
【実施例】
以下、実施例を以て本発明をさらに詳細に説明するが、本発明が該実施例に記載される態様のみに限定されるものではないことは言うまでもない。
実施例１ ＣＥＴＰ活性測定系の構築
特に断りのない限り本実施例で用いたＣＥＴＰ活性（コレステロールエステル（ＣＥ）転送活性）の測定は、以下のようにして構築した測定系を用いた。また、該測定系は、アルバーツ（Ａｌｂｅｒｔｓ）らの方法（アルテリオスクレロシス（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、第４巻、第４９〜第５８頁、第１９８４年）の改変法である。
即ち、本測定法は、まず、放射性標識されたコレステロールエステル（ＣＥ）を取り込んだ高比重リポ蛋白（ＨＤＬ３）からなるドナーリポ蛋白、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）からなるアクセプターリポ蛋白、並びにＣＥＴＰを含有する測定試料を混合し生理学的に反応させる。次いで、標識ＣＥのドナーリポ蛋白からアクセプターリポ蛋白への転送量を、ドナーリポ蛋白の放射活性の減少あるいはアクセプターリポ蛋白の放射活性の増加を測定することにより試料中のＣＥＴＰのＣＥ転送活性を測定するものである。
【００６４】
＜１−１＞ ドナーリポ蛋白の調製
健常人血漿（２０ｍｌ）に臭化カリウム（ＫＢｒ）を加え、比重ｄ＝１．１２５ｇ／ｍｌに調節し、密度勾配遠心分離（２２７，０００×ｇ、４℃、１７時間）して、比重ｄ＞１．１２５ｇ／ｍｌの分画（ＨＤＬ３分画）を採取した。得られた分画を、ＴＢＳ（０．１５ＭのＮａＣｌ／１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４））で透析した。次いで、１０ｎＭのトリチウム標識コレステロール（［３Ｈ］Ｃ、５０．３Ｃｉ／ｍＭ）を、９５％エタノールで溶解し、攪拌しながら徐々に添加し、３７℃で１８時間インキュベートした（この操作により、ＨＤＬ３表面のトリチウム標識コレステロール（［３Ｈ］Ｃ）は、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）の作用によりエステル化され、トリチウム標識コレステロールエステル（［３Ｈ］ＣＥ）となりＨＤＬ３内部に取り込まれる。）。
臭化カリウムを加え、比重ｄ＝１．２１ｇ／ｍｌに調節し、密度勾配遠心分離（２２７，０００×ｇ、４℃、２０時間）して、比重ｄ＜１．２１ｇ／ｍｌの分画を採取した。得られた分画を前記ＴＢＳで透析し、［３Ｈ］ＣＥを取り込んだＨＤＬ３（［３Ｈ］ＣＥ−ＨＤＬ３、比重：１．１２５＜ｄ＜１．２１、比活性：１０１，０００ｄｐｍ／ｎＭ）を得、ドナーリポ蛋白とした。
【００６５】
＜１−２＞ アクセプターリポ蛋白の調製
健常人血漿（１００ｍｌ）に臭化カリウム（ＫＢｒ）を加え、比重ｄ＝１．０１９ｇ／ｍｌに調節し、密度勾配遠心分離（２２７，０００×ｇ、４℃、２０時間）して、比重ｄ＞１．０１９ｇ／ｍｌの分画を採取した。得られた分画を、前記ＴＢＳで透析した。次いで、臭化カリウムを加え、比重ｄ＝１．０６３ｇ／ｍｌに調節し、密度勾配遠心分離（２２７，０００×ｇ、４℃、２０時間）して、比重ｄ＜１．６０６３ｇ／ｍｌの分画を採取した。得られた分画を前記ＴＢＳで透析し、ＬＤＬからなる分画（比重：１．０１９＜ｄ＜１．０６３）を得、アクセプターリポ蛋白とした。
【００６６】
＜１−３＞ ＣＥＴＰ活性の測定
実施例＜１−１＞で得たドナーリポ蛋白（［３Ｈ］ＣＥ−ＨＤＬ３、０．２１μｇのコレステロール含有）、実施例＜１−２＞で得たアクセプターリポ蛋白（ＬＤＬ、２１μｇのコレステロール含有）、及び測定試料を、ドナーリポ蛋白中のコレステロールとアクセプターリポ蛋白中のコレステロールとの比が１：１００、また、測定試料中のＨＤＬ中のコレステロールとドナーリポ蛋白中のコレステロールとの比が最低でも１：１０となるように、さらに前記ＴＢＳをマイクロチューブに加えて総量６００μｌ／チューブに調製し、該マイクロチューブを３７℃湯浴中で１５時間インキュベートした。次いで、マイクロチューブを氷上で１５分間冷却した後、氷冷ＴＢＳ（４００μｌ）及び０．５Ｍの二塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）を含有する１％のデキストランサルフェイトを含む溶液（４０μｌ）を加えて激しく攪拌した。マイクロチューブを、氷上で３０分間インキュベートした後、遠心分離（８，０００×ｇ、４℃、１０分）して、ＨＤＬに富む遠心上清を回収した。得られた遠心上清の放射活性を、シンチレーションカウンターを用いて測定した。
測定試料中に含まれるＣＥＴＰのＣＥＴＰ活性は、得られた測定値と測定試料を加えないで上記と同様にして操作した対照（コントロール）の測定値との比較に基づく放射活性の減少から決定し、単位時間あたりに１ｎＭのコレステロールエステル（ＣＥ）を転送するＣＥＴＰ活性を１ユニット（Ｕ）とした。
【００６７】
実施例２ 精製ヒト由来ＣＥＴＰの調製
以下の操作は、常法に従い全て４℃あるいは氷浴上で行った。
＜２−１＞ デキストランサルフェイト処理
複数の健常人から採取した末梢血を、常法に従い遠心分離により血球系細胞を除去し、ヒト血漿（１Ｌ（リットル））を取得した。得られた血漿（１Ｌ）に、蒸留水（２Ｌ）、１０％のデキストランサルフェイト（Ｄｅｘｔｒａｎ Ｓｕｌｆａｔｅ、分子量５０万、１００ｍｌ）、及び４Ｍの二塩化カルシウム（ＣａＣｌ２、８０ｍｌ）を加え、氷浴上で緩やかに１５分間攪拌した。該混合液を、遠心分離（１５，２００×ｇ、１時間）し、不溶性のデキストランサルフェイト／リポ蛋白複合体を沈殿分画した。遠心上清を回収し、２７．２％の二塩化バリウム（ＢａＣｌ２）を加え、最終濃度１．３６％に調整した。該混合液を２０分間攪拌した後、遠心分離（１５，２００×ｇ、１時間）により沈殿物を除去し、遠心上清を回収した。
【００６８】
＜２−２＞ フェニルセファロースカラムクロマトグラフィーによる精製
実施例＜２−１＞で得た遠心上清に、３Ｍの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、０．０１％のアジ化ナトリウム（ＮａＮ３）、ゲンタマイシンサルフェイト（Ｇｅｎｔａｍｙｓｉｎ Ｓｕｌｆａｔｅ、５０μｇ／ｍｌ）、及び０．０５％のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を加え、ｐＨ７．４に調整した。該混合溶液を、０．０１％のアジ化ナトリウム、ゲンタマイシンサルフェイト（５０μｇ／ｍｌ）、及び０．０５％のＥＤＴＡを含む３ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）で平衡化したフェニルセファロースＨＰカラム（Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ Ｃｏｌｕｍｎ、１０×１２．５ｃｍ、ファルマシアバイオテク社（製））に加えた。カラムを、０．１５ＭのＮａＣｌ溶液（３Ｌ、ｐＨ７．４）を加えて洗い、さらにＮａＣｌ非含有溶液（３Ｌ、ｐＨ７．４）で洗った後、２０％のエタノール溶液で溶出させた。溶出パターンを、波長２８０ｎｍでの吸光度により測定した。
結果を図１に示す。該溶出パターンに従い、ヒト由来ＣＥＴＰを含む活性な分画を回収した。
【００６９】
＜２−３＞ リソースＱカラムクロマトグラフィーによる精製
実施例＜２−２＞で回収した得た活性な分画を、２５ｍＭのＮａＣｌ及び１０ｍＭのトリス塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）からなる緩衝液（ｐＨ７．４）で透析した。次いで、前記緩衝液で平衡化したリソースＱカラム（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｑ Ｃｏｌｕｍｎ、３．５×１０ｃｍ、ファルマシアバイオテク社（製））に加えた。カラムを、前記緩衝液（３００ｍｌ）を加えて洗い、２５〜２５０ｍＭのＮａＣｌ（２Ｌ、ｐＨ７．４）で濃度勾配溶出させた。溶出パターンを、波長２８０ｎｍでの吸光度により測定した。
結果を図２に示す。該溶出パターンに従い、ヒト由来ＣＥＴＰを含む活性な分画を回収し、精製ヒト由来ＣＥＴＰを取得した。
【００７０】
実施例３ 抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体の調製
実験医学（別冊）細胞工学ハンドブック（黒木登志夫ら編集、羊土社発行、第６６〜第７４頁、１９９２年）及び単クローン抗体実験操作入門（安東民衛ら著作、講談社発行、１９９１年）等に記載されるような一般的方法に従って、抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体を調製した。
【００７１】
＜３−１＞ 免疫感作、細胞融合、及びクローニング
ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、４〜５週齢、静岡研究動物センター（製））に、実施例２で調製した精製ヒト由来ＣＥＴＰを完全フロインドアジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）とともにフッドパッド内注射することにより初回（０日）免疫した。初回免疫から５日目、１０日目及び１５日目に同精製ヒト由来ＣＥＴＰをフッドパッド内注射により追加免疫し、さらに以下に述べるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ調製の前々日及び前日にも同様にして最終免疫した。
該免疫感作マウスの膝窩リンパ節細胞を常法に従って外科手術により採取した。融合剤としてポリエチレングリコール４０００（Ｐｏｌｙｅｔｈｉｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ ４０００）を用いて、該リンパ節細胞とマウスミエローマ細胞ＰＡＩとを３：１で混合して細胞融合させることによりハイブリドーマを作製した。次いで、１０％のウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ、ＦＣＳ）とアミノプテリンを含有するＨＡＴ含有ＡＳＦ１０４培地（味の素（製））中で培養した。次いで、培地をアミノプテリンを含有しないＨＴ培地に交換し培養することにより該リンパ節と該ミエローマ細胞とのハイブリドーマ選択し、１６９個のクローンを得た。
【００７２】
＜３−２＞ ハイブリドーマのスクリーニング
抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングは、実施例１で構築したＣＥＴＰ活性測定系を用いて行った。
実施例２で得た精製ヒト由来ＣＥＴＰと得られたハイブリドーマの各々の培養上清（６０μｌ）とを、実施例＜１−１＞で得たドナーリポ蛋白（［３Ｈ］ＣＥ−ＨＤＬ３、０．２１μｇのコレステロール含有）と実施例＜１−２＞で得たアクセプターリポ蛋白（ＬＤＬ、２１μｇのコレステロール含有）の混合溶液中加え、さらにＴＢＳを加え、総量６００μｌ／チューブに調製した。
以下、実施例＜１−３＞と同様にして操作し、各々のサンプルのＣＥＴＰ活性を測定し、ハイブリドーマの培養上清を加えない場合の値との比較から、各々のハイブリドーマ培養上清のＣＥＴＰ阻害活性（ＣＥＴＰのＣＥ転送活性の阻害活性）を求めた。本スクリーニングにより、各々異なるＣＥＴＰ阻害活性を有する３つのポジティブクローン（＃７２−１、＃８６−２、及び＃１７６−１）を得た。
ハイブリド−マ＃７２−１及び＃８６−２を、１９９４年１２月２０日付けにて通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に、各々国際寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４９４４及びＦＥＲＭ ＢＰ−４９４５を以て寄託した。
【００７３】
＜３−３＞ モノクローナル抗体の大量調製
ＩＣＲヌードマウス（雌、７〜８週齢、１５匹、チャールズリバー社（製））に、ハイブリド−マ＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１（各々１０６〜１０７個／０．５ｍｌ／マウス）の各々を腹腔内注射した。１０日後、マウスを麻酔下で開腹し、常法により採取した腹水からモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１を大量に調製した。
【００７４】
＜３−４＞ アイソタイプの決定
マウスモノクロ−ナル抗体アイソタイプ決定用キット（アマシャム社製）を用い、該キットに添付の実験操作プロトコールに従って操作を行い、モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１各々のアイソタイプを決定した。＃７２−１と＃８６−２がＩｇＧ１であり、＃１７６−１がＩｇＧ２ｂであることが確認された。
【００７５】
＜３−５＞ モノクローナル抗体の精製
前記＜３−３＞で取得したモノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１各々の遠心上清（各々５ｍｌ）を、０．０６Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で３倍に希釈し、１Ｎの塩酸を加えｐＨを４．８に調整した。次いで、１６．５μｌのカプリル酸（Ｃａｐｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ、和光純薬（製））を、室温下で攪拌しながら少しずつ加え、攪拌しながら３０分間反応させた。次いで、遠心分離（１，０００ｒｐｍ、２０分間）し、抗体以外の蛋白を沈殿させた。遠心上清を回収し、フィルター（ミリポア社（製））で濾過し、白沈を除いた。得られた濾液を、リン酸緩衝液で透析（２時間）した。
透析後、硫酸アンモニウム（２６．２ｇ／１００ｍｌ）を攪拌しながら少しずつ加え、攪拌しながら４℃で１２０分間反応させた。次いで、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、２０分間）して、沈殿物を回収した。回収した沈殿物に、リン酸緩衝液を加え、リン酸緩衝液で透析（４℃、２４時間）し、精製モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１を得た。
【００７６】
実施例４ アフィニティークロマトグラフィーによるヒト由来ＣＥＴＰの精製
実施例２で調製した精製ヒト由来ＣＥＴＰを、実施例３で調製した精製モノクローナル抗体＃７２−１を用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーによりさらに高純度で精製し、さらにその性状を解析した。
＜４−１＞ 固定化モノクローナル抗体（カラム充填用吸着体）の調製
ＮＨＳ活性化ハイトラップカラム（ＨｉＴｒａｐ−ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、１ｍｌ、ファルマシアバイオテク社（製））を用い、添付のプロトコールに従って操作を行い、０．５ＭのＮａＣｌを含有する０．２Ｍの炭酸水素ナトリウム溶液（ｐＨ８．３）中に溶解したモノクローナル抗体＃７２−１（５ｍｇ／ｍｌセファロース）を注入した。２０℃で４５分間反応させ、モノクローナル抗体＃７２−１をＮＨＳ活性化セファロースに固定化し、固定化モノクローナル抗体＃７２−１を調製した。
【００７７】
＜４−２＞ アフィニティークロマトグラフィーによる精製
実施例２で調製した精製ヒトＣＥＴＰを含む溶液を、＜４−１＞で調製したアフィニティーカラムに加えた後、カラムを５００ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．６）緩衝液（５ｍｌ）を加えて洗い、２ｍＭのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．８）で溶出させた。溶出分画を、２Ｍのトリス塩酸（ｐＨ８．８）で中和させた。溶出パターンを、波長２８０ｎｍでの吸光度により測定した。
結果を図３に示す。該溶出パターンに従い、ヒト由来ＣＥＴＰを含む活性な分画を集め、０．１５ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）で透析し、極めて高純度の精製ヒト由来ＣＥＴＰを調製した。
【００７８】
＜４−３＞ 精製ヒト由来ＣＥＴＰの性状解析
前記図３に示したとおり、本実施例で得られた精製ヒト由来ＣＥＴＰの酵素活性（比活性）は、１１００Ｕ（ユニット）／ｍｇであった。
さらに該精製ヒト由来ＣＥＴＰの分子量を、常法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）により解析した。
結果を図４に示す。
本実施例で得られた精製ヒト由来ＣＥＴＰは、分子量約６，３０００と約６，１０００の２種類からなることが確認された。ヒト由来ＣＥＴＰの精製はこれまで多くの研究者により試みられ、その分子量が報告されている。報告された値は、精製方法、精製度あるいは分子量分析方法等の問題から完全に一致しないが、いずれも約６，４０００〜約６，６０００である。これらの値と比較から、本実施例で得られたヒト由来ＣＥＴＰは、極めて高い純度であることが確認された。
【００７９】
実施例５ 抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体の性状解析
＜５−１＞ ヒト由来ＣＥＴＰに対する反応性
実施例３で調製した精製モノクローナル抗体の＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１のヒト由来ＣＥＴＰに対する反応性は、実施例１で構築したＣＥＴＰ活性測定系を用いて、実施例＜３−２＞と同様にして、ヒト由来ＣＥＴＰのＣＥ転送活性の阻害活性（ＣＥＴＰ阻害活性）を測定することにより確認した。
実施例４で得た精製ヒト由来ＣＥＴＰと０．１５ＭのＮａＣｌを含有するトリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液（ｐＨ７．４）で種々濃度に希釈した精製モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１（各々２０μｌ）を、実施例＜１−１＞で得たドナーリポ蛋白（［３Ｈ］ＣＥ−ＨＤＬ３、０．２１μｇのコレステロール含有）と実施例＜１−２＞で得たアクセプターリポ蛋白（ＬＤＬ、２１μｇのコレステロール含有）の混合溶液中加え、さらにＴＢＳを加え、総量６００μｌ／チューブに調製した。
【００８０】
以下、実施例＜１−３＞と同様にして操作し、各々のサンプルのＣＥＴＰ活性を測定し、モノクローナル抗体を加えない場合の値から、各々のモノクローナル抗体のＣＥＴＰ阻害活性を求めた。なお、対照としてマウスＩｇＧ（シグマ社（製））を用いた。結果を図５に示す。
モノクローナル抗体＃７２−１は、濃度依存的にヒト由来ＣＥＴＰのＣＥ転送活性（ＣＥＴＰ活性）を阻害し、１０μｇ／ｍｌ以上の濃度でＣＥＴＰ活性を１００％阻害した。一方、モノクローナル抗体＃８６−２は、濃度依存的なＣＥＴＰ阻害活性は示さず、約０．５μｇ／ｍｌの濃度で最大阻害活性（５８％）を示し、１７μｇ／ｍｌ以上の濃度では阻害活性を示さなかった。また、モノクローナル抗体＃１７６−１もモノクローナル抗体＃８６−２と同様に、濃度依存的なＣＥＴＰ阻害活性は示さず、約１．０μｇ／ｍｌの濃度で最大阻害活性（５０％）を示した。
このことから、モノクローナル抗体＃７２−１が認識するヒト由来ＣＥＴＰ上のエピトープは、モノクローナル抗体＃８６−２及びモノクローナル抗体＃１７６−１のそれとは異なる可能性が極めて高い。
【００８１】
＜５−２＞ ウサギ由来ＣＥＴＰに対する反応性
実施例３で調製した精製モノクローナル抗体の＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１のウサギ由来ＣＥＴＰに対する反応性を、下記のようにして調製した精製ウサギＣＥＴＰ、ドナーリポ蛋白及びアクセプターリポ蛋白を用いた実施例１と同様のＣＥＴＰ活性測定系を用いて、前記実施例＜５−１＞と同様にして確認した。
【００８２】
＜５−２−１＞ 精製ウサギＣＥＴＰの調製
以下の操作は、常法に従い全て４℃あるいは氷浴上で行った。
▲１▼ デキストランサルフェイト処理
複数のウサギ（日本白色、北山ラベス（製））から採取した末梢血を、常法に従い遠心分離により血球系細胞を除去し、ウサギ血漿（１００ｍｌ）を取得した。得られた血漿（１００ｍｌ）に、蒸留水（２００ｍｌ）、１０％のデキストランサルフェイト（Ｄｅｘｔｒａｎ Ｓｕｌｆａｔｅ、分子量５０万、１０ｍｌ）、及び４Ｍの二塩化カルシウム（ＣａＣｌ２、７．９ｍｌ）を加え、氷浴上で緩やかに１５分間攪拌した。該混合液を、遠心分離（２０，０００×ｇ、２０時間）し、不溶性のデキストランサルフェイト／リポ蛋白複合体を沈殿分画して遠心上清を回収した。
【００８３】
▲２▼ フェニルセファロースカラムクロマトグラフィーによる精製
前記▲１▼で得た遠心上清に、３Ｍの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、０．０１％のアジ化ナトリウム（ＮａＮ３）、ゲンタマイシンサルフェイト（Ｇｅｎｔａｍｙｓｉｎ Ｓｕｌｆａｔｅ、５０μｇ／ｍｌ）、及び０．０５％のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を加え、ｐＨ７．４に調整した。該混合溶液を、０．０１％のアジ化ナトリウム、ゲンタマイシンサルフェイト（５０μｇ／ｍｌ）、及び０．０５％のＥＤＴＡを含む３ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）で平衡化したフェニルセファロースカラム（ＨｉＬｏａｄ ２６／１０、ファルマシアバイオテク社（製））に加えた。カラムを、０．０１％のアジ化ナトリウム、ゲンタマイシンサルフェイト（５０μｇ／ｍｌ）、及び０．０５％のＥＤＴＡを含む０．１５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）溶液を加えて洗い、ＮａＣｌ非含有溶液及び２０％のエタノール溶液で溶出させた。溶出パターンを、波長２８０ｎｍでの吸光度により測定した。
結果を図６に示す。該溶出パターンに従い、ウサギ由来ＣＥＴＰを含む活性な分画を回収した。
【００８４】
▲３▼ ブルーセファロースカラムクロマトグラフィーによる精製
前記▲２▼得た活性な分画を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した。次いで、前記緩衝液で平衡化したブルーセファロースカラム（ＣＬ−６Ｂ、１．５×８．５ｃｍ、ファルマシアバイオテク社（製））に加えた。カラムを、前記緩衝液を加えて洗い、１．５ＭのＮａＣｌと前記緩衝液からなる溶液（ｐＨ７．０）で溶出させた。溶出パターンを、波長２８０ｎｍでの吸光度により測定した。
結果を図７に示す。該溶出パターンに従い、ウサギ由来ＣＥＴＰを含む活性な分画を回収した。
【００８５】
▲４▼スクシニル化ＬＤＬセファロースカラムクロマトグラフィーによる精製
前記▲３▼得た活性な分画を、０．０２５％のＥＤＴＡを含む６０ｍＭのＮａＣｌ及び５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）からなる溶液で透析した。次いで、スクシニル化ＬＤＬをＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂカラム（ＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−４Ｂ、１．５×８．５ｃｍ、ファルマシアバイオテク社（製））に加えて作製したスクシニル化ＬＤＬセファロースカラムを、０．０２５％のＥＤＴＡを含む６０ｍＭのＮａＣｌ及び３９ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化し、透析して得られた溶液を加えた。カラムを、０．０２５％のＥＤＴＡを含む６０ｍＭのＮａＣｌ及び３９ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗い、０．０１％ＥＤＴＡを含む溶液（ｐＨ７．４）で溶出させた。溶出パターンを、波長２８０ｎｍでの吸光度により測定した。結果を図８に示す。
該溶出パターンに従い、ウサギ由来ＣＥＴＰを含む活性な分画を回収し、精製ウサギ由来ＣＥＴＰを調製した。
【００８６】
＜５−２−２＞ ドナーリポ蛋白及びアクセプターリポ蛋白
ウサギ血漿を用いて、実施例＜１−１＞及び実施例＜１−２＞と同様にして、ドナーリポ蛋白（［３Ｈ］ＣＥ−ＨＤＬ３、０．２１μｇのコレステロール含有）及びアクセプターリポ蛋白（ＬＤＬ、２１μｇのコレステロール含有）の各々を調製した。
＜５−２−３＞ ウサギ由来ＣＥＴＰに対する反応性確認
前記＜５−２−１＞で調製した精製ウサギ由来ＣＥＴＰ及び＜５−２−２＞で調製したドナーリポ蛋白及びアクセプターリポ蛋白を用いたＣＥＴＰ活性測定系により、精製モノクローナル抗体の＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１各々のＣＥＴＰ阻害活性を、実施例＜５−１＞と同様にして測定した。
結果を図９に示す。モノクローナル抗体＃８６−２及び＃１７６−１は、濃度の高低に拘らず、ウサギ由来ＣＥＴＰのＣＥ転送活性を全く阻害せず、ウサギ由来ＣＥＴＰには特異的な反応性を示さないことが確認された。また、モノクローナル抗体＃７２−１も、約３μｇ／ｍｌ以下の濃度では、ウサギ由来ＣＥＴＰには検出できる反応性を示さなかった。
【００８７】
実施例６ 抗体フラグメントＦ（ａｂ’）２及びＦａｂの調製
実施例３で調製した精製モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１各々のＦ（ａｂ’）２及びＦａｂを下記のようにして調製した。
モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１の各々（各々５ｍｇ／ｍｌ）を、２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）に加え、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、不溶化ペプシン（１ｍｌ、ピアス社（製））を加え、ローテーターで回転させながら３７℃で１２時間インキュベートした。反応液を回収し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）し、上清を回収した。
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを、プロテインＡカラムキット（アマシャム社（製））のプロトコールに従って以下のようにして行った。遠心沈殿物に結合緩衝液を加え、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）し、上清を回収した。２回の遠心分離で回収した上清を集め、等量の結合緩衝液を加え、さらに１Ｎの水酸化ナトリウムを加えてｐＨ８．９に調製した。該混合溶液を、該結合緩衝液で平衡化した該プロテインＡカラムに添加した後、該結合緩衝液（５ｍｌ）で２回洗浄し、溶出分画を回収した。得られた溶出分画を、５ｍＭのリン酸緩衝液（２Ｌ、ｐＨ６．８）で透析（４℃、２４時間）した。
さらなる精製のためヒドロキシアパタイトカラム（バイオラッド社（製））を用いて、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行った。透析により得られた溶液を、該ヒドロキシアパタイトカラムに添加し、５ｍＭのリン酸緩衝液を１５分間流した後、５ｍＭ〜０．４Ｍのリン酸緩衝液で直線濃度勾配溶出させた。溶出液をフラクションコレクターで分取し、２８０ｎｍでの吸光度を測定し、Ｆ（ａｂ’）２を含む分画を回収した。得られた分画をリン酸緩衝液（２Ｌ）で透析（４℃、２４時間）し、モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１各々の精製Ｆ（ａｂ’）２を得た。
【００８８】
実施例７ サンドイッチＥＬＩＳＡによるヒト由来ＣＥＴＰの定量法の確立
＜７−１＞ 固相化モノクローナル抗体の作製
実施例３で調製した精製モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１を、リン酸緩衝液で希釈（１０ｎｇ／ウェル〜１μｇ／ウェル、ｐＨ７．４）し、該各々の抗体溶液（５０μｌ）を、ＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレート（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）社（製））の各ウェルに加え、４℃で２４時間インキュベートし、各々のモノクローナル抗体をマイクロプレートに吸着させた。次いで、各ウェルを、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝液３００μｌで４回洗浄した。洗浄溶液を捨て、各ウェルに、ブロッキング試薬（３００μｌ、ブロックエース（Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ）、大日本製薬社（製））を加え室温で２時間インキュベートし、抗体が結合していない部位をブロックした。各ウェルを、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝液３００μｌで４回洗浄した。
【００８９】
＜７−２＞ 標識モノクローナル抗体の作製
実施例３で調製した精製モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１の各々（１ｍｇ／ｍｌを１ｍｌ）を、０．１ＭのＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．２〜８．３）溶液で、透析（４℃、２４時間）した。次いで、ＮＨＳ−ビオチン（２ｍｇ／ｍｌを１００μｌ、フナコシ社（製））を加え、激しく攪拌した後、室温下で４時間インキュベートした。次いで、リン酸緩衝液で透析（４℃、２４時間）した。
【００９０】
＜７−３＞ サンドイッチＥＬＩＳＡによる定量法の確立
本発明で確立されたサンドイッチＥＬＩＳＡによるヒト由来ＣＥＴＰの定量法は以下の通りである。
前記＜７−１＞で作製した固定化モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１（１０ｎｇ／ウェル〜１μｇ／ウェルの濃度で固定化。以下、「固定化マイクロプレート」と同義。）の各々を、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝液で３回洗浄した。固定化マイクロプレートの各ウェルに１０％ブロックエース（大日本製薬社（製））を含有するリン酸緩衝液で希釈した測定試料（１００μｌ、実施例＜４−２＞で調製した精製ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質、実施例＜２−１＞で調製したリポ蛋白を除去した健常人血漿、または実施例＜２−１＞と同様にして調製した各種患者の血漿）を加え、室温で１時間インキュベートした。固定化マイクロプレートを、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝液で３回洗浄後、各ウェルに１０％ブロックエースを含有するリン酸緩衝液で希釈したビオチン標識モノクローナル抗体（３ｎｇ／ウェル〜１μｇ／ウェルを５０μｌ、前記＜７−２＞で作製したビオチン標識モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１）を加え、室温下で１時間インキュベートした。固定化マイクロプレートを、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝液で３回洗浄後、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、１ｍｇ／ｍｌ）を含有する０．５ＭのＮａＣｌと２０ｍＭのＨＥＰＥＳからなる溶液（ｐＨ７．０）で１０００倍に希釈したストレプトアビジン−β−ガラクトシダーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏａｖｉｄｉｎ−β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ、５０μｌ、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）社（製））を各ウェルに加え、室温下で１時間インキュベートした。
【００９１】
固定化マイクロプレートを、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝液で３回洗浄後、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有する１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２及び１０ｍＭのリン酸緩衝液からなる溶液（ｐＨ７．０）で希釈した０．０１５％または０．０１％の４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド（４−Ｍｅｔｈｙｌ−ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ、５０μｌ、シグマ（Ｓｉｇｍａ）社（製））を各ウェルに加え、室温下で１０または２０分間インキュベートした。各ウェルに、Ｎａ２ＣＯ３（１００μｌ）を加え、反応を止めた。波長４６０ｎｍ（励起：３５５ｎｍ）での蛍光強度をフルオロスキャンＩＩマイクロプレートフルオロメーター（Ｆｌｕｏｒｏｓｃａｎ ＩＩ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ、フロー研究所（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）（製））で測定した。測定中のＣＥＴＰ量は、下記実施例で作成した検量線から求めた。
固定化モノクローナル抗体（＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１）と標識モノクローナル抗体（＃７２−１、＃８６−２または＃１７６−１）との種々の組合わせによる定量結果を、図１０乃至図１２に示す。この結果、＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１の内、異なるモノクローナル抗体の組合わせ（＃７２ー１と＃８６−２、＃７２−１と＃１７６−１）により定量できることが確認された。
また、固定化モノクローナル抗体と標識モノクローナル抗体の最適濃度決定の例として、（１）固定化モノクローナル抗体として＃７２−１（１０ｎｇ／ウェル〜１μｇ／ウェル）を、また標識モノクローナル抗体として＃８６−２または＃１７６−１（１０ｎｇ／ウェル〜１μｇ／ウェル）を使用した場合（４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド（基質）の濃度：０．０１％、反応時間：１０分間）、及び（２）固定化モノクローナル抗体として＃７２−１（１μｇ／ウェル）を、また標識モノクローナル抗体として＃８６−２（１〜３ｎｇ／ウェル）を使用した場合（該基質の濃度：０．０１５％、反応時間：２０分間）の、実施例＜２−１＞で調製したリポ蛋白を除去した健常人血漿の定量結果を、各々図１３乃至図１６、並びに図１７に示す。
【００９２】
その結果、固定化モノクローナル抗体＃７２−１の最適濃度は、１μｇ／ウェル（２０μｇ／ｍｌ）であった。一方、また標識モノクローナル抗体＃８６−２の最適濃度は、基質との反応時間が１０分間の時は１００ｎｇ／ウェル（２μｇ／ｍｌ）であり、２０分間の時は、３ｎｇ／ウェル（６０ｎｇ／ｍｌ）であることが確認された。このように、標識モノクローナル抗体の最適濃度は、基質との反応時間に依存するため最適濃度は、該反応時間により適宜設定することが可能である。
以下にのべる実施例では、固定化モノクローナル抗体＃７２−１（１μｇ／ウェル（２０μｇ／ｍｌ））、標識モノクローナル抗体＃８６−２（３ｎｇ／ウェル（６０ｎｇ／ｍｌ）、及び基質との反応時間（２０分間）の条件によるサンドイッチＥＬＩＳＡを用いた。
【００９３】
＜７−４＞ 検量線の作成及び本定量法の精密性の確認
＜７−４−１＞ 検量線の作成
実施例＜４−２＞で調製した精製ヒト由来ＣＥＴＰを標準物質（スタンダード）として、固定化モノクローナル抗体として＃７２−１（１μｇ／ウェル）を、及び標識モノクローナル抗体として＃８６−２（３ｎｇ／ウェル）を使用し、前記＜７−３＞で確立したサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて検量線を作成した。結果を図１８に示す。
極めて低濃度である０．４ｎｇ／ｍｌ〜１．２５ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で直線的検量線が得られた（相関係数：ｒ＝０．９９５）。また、本発明のサンドイッチＥＬＩＳＡを用いた定量法のヒト由来ＣＥＴＰの定量感度（検出感度）は、最大０．４ｎｇ／ｍｌであり、従来の定量法に比べ極めて高い定量感度（検出感度）であることが確認された。
【００９４】
＜７−４−２＞ 変動係数の算出
また、本発明の定量法の精密性を確認するため同一プレート内（９６ウェルのうちの４８ウェル）での変動係数及び複数プレート内（６枚）での変動係数を算出した。前者の変動係数は、７．０６％、また後者の変動係数は、６．１３％であり、本発明で確立したサンドイッチＥＬＩＳＡによる定量系が極めて精密な測定系であることが確認された。
【００９５】
＜７−５＞ ヒト由来ＣＥＴＰの定量系確立のための予備実験
＜７−５−１＞ ヒト血漿成分による定量性への影響の確認
ヒト由来ＣＥＴＰの定量性に影響を与える血漿成分の有無を確認するために下記のような試験を行った。
実施例＜４−２＞で調製した、精製ヒト由来ＣＥＴＰ（各々０．７３５μｇ／ｍｌまたは１．４６９μｇ／ｍｌ）を、実施例＜２−１＞と同様にして得た０．５６μｇ／ｍｌのＣＥＴＰを含有する健常人血漿中に加えた。次いで、前記＜７−３＞で確立した定量法を用いてＣＥＴＰ量を測定した。
０．７３５μｇ／ｍｌ及び１．４６９μｇ／ｍｌを加えた各々の試料の定量値は、インキュベート前の計算上予測され得るＣＥＴＰ総量（各々１．２９４μｇ／ｍｌ及び２．０２９μｇ／ｍｌ）に対し、各々１．４４０μｇ／ｍｌ及び２．１８９μｇ／ｍｌであり、各々１１１％及び１０８％のＣＥＴＰが回収された。
この結果から、ヒト血漿中には、本法によるＣＥＴＰの定量性に影響を与える物質（成分）が何等存在しないことが確認され、本発明の定量法を用いればヒト血漿中のＣＥＴＰを正確に定量できることが示された。
【００９６】
＜７−５−２＞ ヒト血漿中のリポ蛋白による影響の確認
ヒト血漿中のＣＥＴＰの定量において、血漿中に含まれるリポ蛋白等のＣＥＴＰ以外の物質が定量感度に与える影響について検討するため、異なる精製度のヒト由来ＣＥＴＰを試料として、前記＜７−３＞で確立した定量系を用いて検討した。
測定試料には、（１）実施例＜２−１＞で遠心分離により血球系細胞のみを除去した血漿、（２）実施例＜２−１＞で最終的に得られたリポ蛋白を除去した血漿、（３）実施例＜２−２＞でフェニルセファロースカラムクロマトグラフィーで精製されたＣＥＴＰ、及び（４）実施例＜４−２＞で調製した精製ヒト由来ＣＥＴＰを用いた。結果を図１９に示す。
前記（１）、（２）及び（３）の各々の試料の定量曲線（希釈曲線）は、（４）の精製ヒト由来ＣＥＴＰのそれと平行であり、本発明の定量法は、測定試料であるヒト血漿中のリポ蛋白等の影響を何等受けることなく、即ち、血漿試料の精製度に無関係に適用可能なことが確認された。
【００９７】
＜７−５−３＞ ＣＥＴＰ含量とＣＥＴＰ活性の相関性確認
本発明の定量法の精密性を確認するため、ヒト血漿試料中のＣＥＴＰの定量値と該血漿試料自体のＣＥＴＰ活性値との相関性を検討した。
ＣＥＴＰ含量の定量は、試料として実施例＜２−１＞で得たリポ蛋白を除去した血漿を用いて行い、またＣＥＴＰ活性の測定は、該定量に用いた血漿試料の同量を用い、実施例１のＣＥＴＰ活性測定系により測定した。結果を図２０に示す。
相関係数（ｒ）は、０．９５３であり、本発明の定量方法によるＣＥＴＰ定量値と定量に用いた試料のＣＥＴＰ活性値は、極めて高い相関性を示した。この結果から、本発明の定量法が、極めて高い精密性を有していることが確認された。
【００９８】
実施例８ ヒト血漿中ヒト由来ＣＥＴＰの定量
実施例＜７−３＞で確立されたサンドイッチＥＬＩＳＡによる定量法を用いて、健常人及び各種患者の血漿中ＣＥＴＰを定量した。
なお、該血漿のＣＥＴＰ活性は、実施例＜１−１＞と同様にして得たドナーリポ蛋白（［３Ｈ］ＣＥ−ＨＤＬ３、６μｇのＣＥ含有と実施例＜１−２＞と同様にして得たアクセプターリポ蛋白（ＬＤＬ、６００μｇのＣＥ含有）を用い、実施例＜１−３＞で述べたＣＥＴＰ活性測定系を用いて測定した。
本試験で用いたヒト血漿は、健常人（１３人）、ＩＩａ型高脂血症（５人）、ＩＩｂ型高脂血症（５人）、ＣＥＴＰ欠損症（２人）、ＬＣＡＴ欠損症（２人）及び高ＨＤＬ血症（１人）の血漿である。結果を図２１に示す。
健常人血漿及び各種患者血漿ともに、ＣＥＴＰ定量値と血漿ＣＥＴＰ活性の間に高い相関性が確認された。また、推察されたとおり、ＣＥＴＰ欠損症患者の血漿中にはＣＥＴＰが検出されなかった。さらに、本発明の定量法は、健常人血漿のみならず種々の疾患患者の血漿についても適用できることが確認された。
【００９９】
実施例９ 従来の定量法との比較
従来のサンドイッチＥＬＩＳＡを用いたヒト由来ＣＥＴＰの定量法との比較における本発明の定量法の有用性を確認するために下記のような試験を行った。
従来の方法では、蛋白−蛋白間及び／または蛋白−リポ蛋白間の相互作用によって塞がっている抗原決定基（エピトープ）を露出させるために、定量に際し血漿試料をＴｒｉｔｏｎＸ−１００等の界面活性剤及び／または加熱によって前処理を行っていた。しかしながら、このような処理を施すと試料中の蛋白（ＣＥＴＰ等）は変性してしまう（タンパクの高次構造が崩され、あるいはさらに生物学的に不活性となる。）ため、該方法により検出／定量されるＣＥＴＰはインタクトなＣＥＴＰではなく変性されたＣＥＴＰのみであり、血漿中の正確なＣＥＴＰ量を測定することは不可能であった。
そこで本試験では、（１）実施例＜２−１＞と同様にして得たリポ蛋白を除去した健常人血漿（１０％ブロックエースを含むリン酸緩衝液による希釈物）、（２）リポ蛋白を除去した後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（界面活性剤）とともにインキュベートした健常人血漿、（３）リポ蛋白を除去した後、熱処理（９５℃、５分）した健常人血漿、及び（４）リポ蛋白を除去した後、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００とともにインキュベートした健常人血漿について検討した。結果を図２２に示す。
１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００処理した血漿、及び熱処理した血漿では、本法により本来定量されるべきＣＥＴＰが定量されなかった。とりわけ、熱処理した血漿では全くＣＥＴＰが検出できなかった。また、低濃度のＴｗｅｅｎ２０処理した血漿でも定量性が著しく（３０％以上）低減した。即ち、本発明のモノクローナル抗体が、ヒト血漿中のインタクトなＣＥＴＰに特異的に反応性を有することに依存して、本発明の定量法を用いれば従来の方法（界面活性剤処理、熱処理等）では不可能であったヒト血漿中に存在するインタクトなＣＥＴＰ量を正確に定量可能なことが確認された。また、これまでに知られているヒト由来ＣＥＴＰに対するモノクローナル抗体が、変性したヒト由来ＣＥＴＰに特異的に反応するものであることが明らかとなった。
【０１００】
実施例１０ 医薬組成物の調製及びＣＥＴＰ阻害活性
実施例３で調製した精製モノクローナル抗体の＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１（５０〜１５０μｇ／ｍｌ）を注射用蒸留水（１０ｍｌ）に加え注射剤とした。
また、実施例＜５−２−１＞で調製した精製ウサギ由来ＣＥＴＰを免疫原として、実施例３と同様にして抗ウサギ由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体を調製した。即ち、ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、４〜５週齢、静岡研究動物センター（製））に該精製ウサギ由来ＣＥＴＰを免疫し抗ウサギ由来モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ＃２−６４及び＃９−１を得た。該ハイブリドーマ各々をＩＣＲヌードマウス（雌、チャールズリバー社（製））に移植して、腹水中から抗ウサギ由来モノクローナル抗体＃２−６４（ＩｇＧ１）及び＃９−１（ＩｇＧ１）を調製した。注射用蒸留水に、モノクローナル抗体＃２−６４（０．１３ｍｇ／ｍｌ）とモノクローナル抗体＃９−１（５．５３ｍｇ／ｍｌ）とを溶解し注射剤とした。この注射剤を１．８ｍｇ／ｋｇの濃度でウサギに静脈内投与（初回投与、０時間）し、引き続き２４時間おきに同濃度で投与した。各投与後、１、４及び２４時間後に血漿を取得した。
該２つの抗ウサギ由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体＃２−６４及び＃９−１を用いて実施例１と同様にして確立したサンドイッチＥＬＩＳＡによるウサギ由来ＣＥＴＰの活性測定法を用いて、該血漿中のＣＥＴＰ活性を測定した。結果を図２３に示す。
抗ウサギ由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体＃２−６４及び＃９−１は、ウサギ血漿中のＣＥＴＰを有意に阻害することが確認された。
【０１０１】
実施例１１ ヒト由来ＣＥＴＰ高発現トランスジェニックマウスの作製
ヒト肝臓由来の５’−ｓｔｒｅｃｈ ｃＤＮＡライブラリー（クローンテック（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）製）を鋳型として、ＰＣＲを行った。ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片を常法によりアガロースゲル電気泳動により分離し、目的断片のみを切出した後、ＱＩＡＥＸ（キアゲン（ＱＵＩＡＧＥＮ）製）によりゲルを溶かし、目的ＤＮＡ断片を得た。得られた断片を、ＤＮＡ末端平滑化キット（タカラ製）を用いて、ｐＣＲＩＩベクター（インビトロゲン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）製）に挿入した。次いでｐＣＲＩＩベクターを大腸菌由来ＤＨ５コンピテント細胞に導入した後、プラスミドのシークエンス解析を行い、目的のヒト由来ＣＥＴＰをコードするｃＤＮＡを得た。
上述で得たヒト由来ＣＥＴＰをコードするｃＤＮＡを、ヒトβアクチンプローモーターを有する発現ベクター（モレキュラーセルウラールイムノロギー（Ｍｏｌ． Ｃｅｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、第４巻、第１９６１〜第１９６９頁、１９８４年；及び、同、第５巻、第２７２０〜第２７３２頁、１９８５年）に、ＤＮＡ末端平滑化キット（タカラ製）を用いて挿入し、プラスミドｐＣＥＴＰ−１を得た。エレクトロポレーション法により、ｐＣＥＴＰ−１をＣＯＳ細胞に導入し、培養後、形質転換ＣＯＳ細胞から、常法によりＲＮＡを取得した。得られたＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、ｐＣＥＴＰ−１を導入したＣＯＳ細胞でのヒトＣＥＴＰの特異的な転写発現を確認した。また同様にして、発現ベクターｐＭＥ１８Ｓを用いて得た形質転換体からのヒトＣＥＴＰの発現を実施例７で確立したサンドイッチＥＬＩＳＡにより確認した。トランスジェニックマウス作製のために、ｐＣＥＴＰ−１を制限酵素処理して直鎖状にした。
仮親マウスには、白色ＩＣＲマウス（雌、日本クレア製）を、精管結紮した白色ＩＣＲマウス（雄、日本クレア製）と交配して得られたプラグ（または腟栓）を有する雌ＩＣＲマウスを用いた。また、ヒト由来ＣＥＴＰ遺伝子を導入するため受精卵を得るための採卵用マウスは、黒色Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雌、日本クレア製）に、ＰＥＡＭＥＸ（５ユニット、三共製）及びＰＵＢＥＲＯＧＥＮ（５ユニット、三共製）を投与することにより過剰排卵させ、黒色Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄、日本クレア製）を交配させて作製した。交配後、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雌）から卵管部を摘出し、ヒアルロニダーゼ処理により受精卵のみを得、培地中で保存した。
受精卵へのヒト由来ＣＥＴＰ遺伝子の導入は、顕微鏡下でマニピュレーターを用いて常法により行った。受精卵を保定針で固定し、３７℃条件下、トリスＥＤＴＡ緩衝液で希釈したヒト由来ＣＥＴＰの前記直鎖状遺伝子を含有する溶液を、ＤＮＡ導入針を用いて受精卵の雄性前核内に注入した。
遺伝子導入後、正常な状態を保持する受精卵のみを選別し、仮親マウス（白色ＩＣＲマウス）の卵巣内にある卵管采に、ヒト由来ＣＥＴＰ遺伝子導入受精卵を挿入した。
仮親から生まれた子マウス（ヘテロマウス）の尾を切取りゲノム遺伝子を回収し、ＰＣＲによりマウスゲノム内にヒト由来ＣＥＴＰが導入されていることを確認した。また、血漿中のヒト由来ＣＥＴＰの発現を、実施例７で確立したサンドイッチＥＬＩＳＡにより確認した。
このヘテロマウス同士を掛け合わせることにより、ホモマウスであるヒト由来ＣＥＴＰ高発現トランスジェニックマウスを作製した。
【０１０２】
実施例１２ 抗ＣＥＴＰモノクローナル抗体のインビボにおけるＣＥＴＰ活性阻害効果
実施例３で作製した精製抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体＃７２−１及び＃８６−２の２種類を、濃度が２９：１の割合で注射用蒸留水に混合し注射剤とした。
実施例１１で作製したヒトＣＥＴＰ高発現トランスジェニックマウス（雌、３匹、食餌制限なしに繁殖用固形飼料を自由に与えた４カ月齢、３匹）に、前記混合注射剤（１００ ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に単回投与した。
抗体投与直前を０時間とし、投与後１、３、６及び２４時間目に眼底採血を行い、遠心分離して血漿を回収した。回収した血漿中のＣＥＴＰ活性（抗ヒト由来ＣＥＴＰ抗体によるＣＥＴＰ阻害活性）の測定は、実施例１で構築したＣＥＴＰ活性測定系を用いてＨＤＬからＬＤＬへのＣＥ（コレステロールエステル）転送量を測定することにより行った。結果を図２４に示す。
本発明の抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体は、インビボにおいてもヒトＣＥＴＰ活性を完全に阻害することが確認された。さらに、抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体によるヒト由来ＣＥＴＰ活性のインビボでの阻害効果は、本発明において初めて開示されるものである。
【０１０３】
実施例１３ 抗ＣＥＴＰモノクローナル抗体による動脈硬化症予防効果
実施例３で作製した精製抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体＃７２−１及び＃８６−２の２種類を、濃度が２９：１の割合で注射用蒸留水に混合し注射剤とした。
実施例１１で作製したヒトＣＥＴＰ高発現トランスジェニックマウス（雌、３匹、食餌制限なしに繁殖用固形飼料を自由に与えた６週齢）に、前記混合注射剤（７５ ｍｇ／ｋｇ）を、１日１回づつ計４日間にわたり腹腔内投与した。なお、対照にはＰＢＳ（リン酸緩衝液）を用いた。
抗体投与直前を０日とし、投与３日前、投与後２、４、８及び１１日目に眼底採血を行い、遠心分離して血漿を回収した。回収した血漿中のＨＤＬコレステロールの量を、脂質測定キット（リキテックＴＣ１／ＴＣ２、ベーリンガーマンハイム製）を用いて測定した。なお、ＨＤＬの分画には、ＨＤＬコレステロール分離用試薬（ベーリンガーマンハイム製）を用いた。結果を図２５に示す。
本発明の抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体のインビボ投与により、血中のＨＤＬコレステロール量が有意に上昇することが確認された。ＨＤＬは、抗動脈硬化作用を有する重要なリポタンパクであると考えられており、事実、血中でのＨＤＬの上昇により、動脈硬化巣の進展を抑制及び退縮させることが明らかにされている（ジャーナルオブクリニカルインベスティゲイション（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．）、第８５巻、第１２３４〜第１２４１頁、１９９０年）。
抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体のインビボへの投与により、血中ＨＤＬコレステロールを上昇させることができるという知見は、本発明において初めて開示されるものであり、本試験結果は、本発明のモノクローナル抗体が、動脈硬化症の予防乃至治療に極めて有用であることを明らかにするものである。
上述の実施例１０乃至１３で得られた結果及び実施例＜５−１＞に示した本発明のモノクローナル抗体のヒト由来ＣＥＴＰの高い阻害活性から、本発明のモノクローナル抗体が、高脂血症や動脈硬化症などのＣＥＴＰの体内動態の異常に起因する種々の疾患の治療及び予防に有用であることが明らかにされた。
【０１０４】
【発明の効果】
本発明の抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体は、ヒト由来ＣＥＴＰ、特にヒト体液中に存在するインタクトなＣＥＴＰに対して高い結合特異性（ＣＥＴＰ阻害活性）を有するという特徴を有するが故に、本発明の抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体を用いたイムノアッセイにより、未だ確立されていないヒト体液（血漿等）中のＣＥＴＰをインタクトな状態で簡便かつ高感度で定量することができる。
とりわけ、本発明の３つの抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体が、ヒト由来ＣＥＴＰ、特にヒト体液中に存在するインタクトなＣＥＴＰに対して各々異なる高い結合特異性（ＣＥＴＰ阻害活性）を有するという特徴を利用して、該３つの内のいずれか２つのモノクローナル抗体を組合わせたサンドイッチＥＬＩＳＡを採用することによりさらに簡便かつ高感度の定量できる。
【０１０５】
本発明のモノクローナル抗体を用いた定量方法においては、血漿等の体液試料の定量に際し、試料を加熱処理あるいは界面活性剤処理等の何等の前処理をする必要ななく、極めて簡便かつ高感度で定量することができる。
また、本発明の抗ヒト由来ＣＥＴＰモノクローナル抗体は、そのＣＥＴＰ阻害活性の高さ故に、ＣＥＴＰの動態異常に起因する動脈硬化症、高脂血症、高ＨＤＬ血症あるいは高コレステロール血症等の各種疾患の治療または予防のための医薬品として有用である。
【０１０６】
【図面の簡単な説明】
【図１】フェニルセファロースカラムクロマトグラフィーによるヒト由来ＣＥＴＰのクロマトグラムを示す図。
【図２】リソースＱカラムクロマトグラフィーによるヒト由来ＣＥＴＰのクロマトグラムを示す図。
【図３】モノクローナル抗体＃７２−１を用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーによるヒト由来ＣＥＴＰのクロマトグラムを示す図。
【図４】モノクローナル抗体＃７２−１を用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより精製されたヒト由来ＣＥＴＰの分子量を示す電気泳動図。
【図５】モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１の精製ヒト由来ＣＥＴＰに対する反応性を示す図。
【図６】フェニルセファロースカラムクロマトグラフィーによるウサギ由来ＣＥＴＰのクロマトグラムを示す図。
【図７】ブルーセファロースカラムクロマトグラフィーによるウサギ由来ＣＥＴＰのクロマトグラムを示す図。
【図８】スクシニル化ＬＤＬセファロースカラムクロマトグラフィーによるウサギ由来ＣＥＴＰのクロマトグラムを示す図。
【図９】モノクローナル抗体＃７２−１、＃８６−２及び＃１７６−１の精製ウサギ由来ＣＥＴＰに対する反応性を示す図。
【図１０】標識モノクローナル抗体＃８６−２と各種固定化モノクローナル抗体との組合せによる定量性を示す図。
【図１１】標識モノクローナル抗体＃１７６−１と各種固定化モノクローナル抗体との組合せによる定量性を示す図。
【図１２】標識モノクローナル抗体＃７２−１と各種固定化モノクローナル抗体との組合せによる定量性を示す図。
【図１３】標識モノクローナル抗体＃８６−２と各種濃度の固定化モノクローナル抗体＃７２−１との組合せによる定量性を示す図。
【図１４】固定化モノクローナル抗体＃７２−１と各種濃度の標識モノクローナル抗体＃８６−２との組合せによる定量性を示す図。
【図１５】標識モノクローナル抗体＃１７６−１と各種濃度の固定化モノクローナル抗体＃７２−１との組合せによる定量性を示す図。
【図１６】固定化モノクローナル抗体＃７２−１と各種濃度の標識モノクローナル抗体＃１７６−１との組合せによる定量性を示す図。
【図１７】固定化モノクローナル抗体＃７２−１（１μｇ／ｍｌ）と標識モノクローナル抗体＃８６−２（１ｎｇ／ウェルまたは３ｎｇ／ウェル）との組合せによる定量性を示す図。
【図１８】本発明の定量法による精製ヒト由来ＣＥＴＰ標準物質の検量線を示す図。
【図１９】本発明の定量法による精製度の異なるヒト血漿のＣＥＴＰの定量性を示す図。
【図２０】本発明の定量法によるＣＥＴＰ定量値と試料のＣＥＴＰ活性値との相関性を示す図。
【図２１】本発明の定量法による健常人及び各種患者に由来する血漿のＣＥＴＰ量及びＣＥＴＰ活性を示す図。
【図２２】変性したヒト由来ＣＥＴＰに対するモノクローナル抗体＃７２−１及び＃８６−２の反応性並びに本発明の定量法と従来の定量法の差異を示す図。
【図２３】ウサギを用いたインビボ試験における抗ＣＥＴＰモノクローナル抗体のＣＥＴＰ活性阻害効果を示す図。
【図２４】ヒトＣＥＴＰ高発現トランスジェニックマウスを用いたインビボ試験における抗ヒトＣＥＴＰ抗体のＣＥＴＰ阻害活性を示す図。
【図２５】インビボ試験における抗ヒトＣＥＴＰ抗体の血中ＨＤＬコレステロール量に対する影響を示す図。
Claims (22)
- ヒト由来 CETP に反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマであって、国際寄託番号 FERM BP-4944 または FERM BP-4945 で識別されるハイブリドーマ。
- ヒト由来 CETP に反応性を有するモノクローナル抗体であって、国際寄託番号 FERM BP-4944 または FERM BP-4945 で識別されるハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体。
- 可変領域が請求項２記載のモノクローナル抗体由来の可変領域であり、かつ定常領域がヒトイムノグロブリン由来の定常領域であることを特徴とするヒト由来CETPに反応性を有する組換キメラモノクローナル抗体。
- 超可変領域の相補性決定領域の一部または全部が請求項２記載のモノクローナル抗体由来の相補性決定領域であり、超可変領域の枠組領域がヒトイムノグロブリン由来の枠組領域であり、かつ定常領域がヒトイムノグロブリン由来の定常領域であることを特徴とするヒト由来CETPに反応性を有する組換ヒト型モノクローナル抗体。
- F(ab’)2またはFab’で表される請求項２乃至請求項４記載のモノクローナル抗体由来の抗体フラグメント。
- 請求項２乃至請求項４記載のモノクローナル抗体または請求項５記載の抗体フラグメントを不溶性担体に固定化してなる固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメント。
- 固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントが、プレート、試験管、チューブ、ビーズ、ボール、フィルター及びメンブレンからなる群から選ばれる不溶性担体に固定化されていることを特徴とする請求項６記載の固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメント。
- 固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントが、フィルター若しくはメンブレン、またはアフィニティーカラムクロマトグラフィーに用いられる不溶性担体に固定化されていることを特徴とする請求項６記載の固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメント。
- 請求項２乃至請求項４記載のモノクローナル抗体または請求項５記載の抗体フラグメントを、単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識してなる標識モノクローナル抗体または標識抗体フラグメント。
- 標識物質が、酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジン、または放射性同位体であることを特徴とする請求項９記載の標識モノクローナル抗体または標識抗体フラグメント。
- 請求項２乃至請求項４記載のモノクローナル抗体、請求項５記載の抗体フラグメント、請求項６または請求項７記載の固定化モノクローナル抗体、請求項６または請求項７記載の固定化抗体フラグメント、請求項９または請求項１０記載の標識モノクローナル抗体、及び請求項９または請求項１０記載の標識抗体フラグメントからなる群から選ばれる少なくともいずれか１つのモノクローナル抗体、抗体フラグメント、固定化モノクローナル抗体、固定化抗体フラグメント、標識モノクローナル抗体または標識抗体フラグメントを含んでなるヒト由来CETPの検出または定量に用いられるキット。
- 請求項６若しくは請求項７記載の固定化モノクローナル抗体または請求項６若しくは請求項７記載の固定化抗体フラグメントと請求項９若しくは請求項１０記載の標識モノクローナル抗体または請求項９若しくは請求項１０記載の標識抗体フラグメントを含んでなる請求項１１記載のヒト由来CETPの検出または定量に用いられるキット。
- 請求項２乃至請求項４記載のモノクローナル抗体、請求項５記載の抗体フラグメント、請求項６または請求項７記載の固定化モノクローナル抗体、請求項６または請求項７記載の固定化抗体フラグメント、請求項９または請求項１０記載の標識モノクローナル抗体、及び請求項９または請求項１０記載の標識抗体フラグメントからなる群から選ばれる少なくともいずれか１つのモノクローナル抗体、抗体フラグメント、固定化モノクローナル抗体、固定化抗体フラグメント、標識モノクローナル抗体または標識抗体フラグメントを用いることを特徴とするイムノアッセイによりヒト由来CETPを検出または定量する方法。
- 少なくとも下記(a)及び(b)の工程を含むイムノアッセイによりヒト由来CETPを検出または定量する請求項１３記載の方法：
(a)請求項６または請求項７記載の固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントに試料を反応せしめる工程；及び
(b)該固定化モノクローナル抗体または該固定化抗体フラグメントと試料中に含まれるヒト由来CETPとの結合により形成される抗原抗体複合体に請求項９若しくは請求項１０記載の標識モノクローナル抗体または標識抗体フラグメントを反応せしめる工程。 - 少なくとも下記(a)及び(b)の工程を含むイムノアッセイによりヒト由来CETPを検出または定量する請求項１３記載の方法：
(a)請求項９若しくは請求項１０記載の標識モノクローナル抗体または標識抗体フラグメントに試料を反応せしめる工程；及び
(b)該標識モノクローナル抗体または該標識抗体フラグメントと試料中に含まれるヒト由来CETPとの結合により形成される抗原抗体複合体に請求項６または請求項７記載の固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントを反応せしめる工程。 - 少なくとも下記(a)の工程を含むイムノアッセイによりヒト由来CETPを検出または定量する請求項１３記載の方法：
(a)請求項６若しくは請求項７記載の固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメント、請求項９若しくは請求項１０記載の標識モノクローナル抗体または標識抗体フラグメント、及び試料を含む混合物を反応せしめる工程。 - 少なくとも下記(a)の工程を含むイムノアッセイによりヒト由来CETPを検出または定量する請求項１３記載の方法：
(a)請求項６若しくは請求項７記載の固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントに、試料及び単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識してなる標識ヒト由来CETP標準物質を反応せしめる工程。 - 少なくとも下記(a)の工程または(b)及び(c)の工程を含むイムノアッセイによりヒト由来CETPを検出または定量する請求項１３記載の方法：
(a)試料と単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識してなる標識ヒト由来CETP標準物質との混合物に請求項２乃至請求項４記載のモノクローナル抗体または請求項５記載の抗体フラグメントを反応せしめる工程；
(b)試料に請求項２乃至請求項４記載のモノクローナル抗体または請求項５記載の抗体フラグメントを反応せしめる工程；
(c)(b)の工程を行った反応系に単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識してなる標識ヒト由来CETP標準物質を反応せしめる工程。 - 少なくとも下記(a)及び(d)の工程または(b)乃至(d)の工程を含むイムノアッセイによりヒト由来CETPを検出または定量する請求項１３または請求項１８の方法：
(a)試料と単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識してなる標識ヒト由来CETP標準物質との混合物に請求項２乃至請求項４記載のモノクローナル抗体または請求項５記載の抗体フラグメントを反応せしめる工程；
(b)試料に請求項２乃至請求項４記載のモノクローナル抗体または請求項５記載の抗体フラグメントを反応せしめる工程；
(c)(b)の工程を行った反応系に単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質で標識してなる標識ヒト由来CETP標準物質を反応せしめる工程；
(d)該試料中のヒト由来CETP若しくは該標識ヒト由来CETP標準物質と該モノクローナル抗体または該抗体フラグメントとの結合により形成される抗原抗体複合体に、該モノクローナル抗体または該抗体フラグメントに反応性を有する哺乳動物由来の抗血清を反応せしめる工程。 - 少なくとも請求項６または請求項８記載の固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントを含んでなるヒト由来CETPの分離または精製に用いられるキット。
- 請求項６または請求項８記載の固定化モノクローナル抗体または固定化抗体フラグメントを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いることを特徴とするヒト由来CETPを分離または精製する方法。
- アフィニティークロマトグラフィーがアフィニティーカラムクロマトグラフィーである請求項２１記載のヒト由来CETPの精製方法。
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