JPH07196699A - 抗ヒトホスホリパーゼエイツー活性化蛋白質抗体とこの抗体を産生するハイブリドーマ、並びにこの抗体を用いたヒトホスホリパーゼエイツー活性化蛋白質の測定用試薬及び測定方法 - Google Patents
抗ヒトホスホリパーゼエイツー活性化蛋白質抗体とこの抗体を産生するハイブリドーマ、並びにこの抗体を用いたヒトホスホリパーゼエイツー活性化蛋白質の測定用試薬及び測定方法Info
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- JPH07196699A JPH07196699A JP5353156A JP35315693A JPH07196699A JP H07196699 A JPH07196699 A JP H07196699A JP 5353156 A JP5353156 A JP 5353156A JP 35315693 A JP35315693 A JP 35315693A JP H07196699 A JPH07196699 A JP H07196699A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 簡便、短時間かつ正確にヒトホスホリパーゼ
エイツー活性化蛋白質を定量するための抗ヒトホスホリ
パーゼエイツー活性化酵素蛋白質抗体、抗ヒトホスホリ
パーゼエイツー活性化蛋白質抗体を産生するハイブリド
ーマ、ヒトホスホリパーゼエイツー活性化蛋白質の測定
用試薬及びこれを用いた測定方法を提供する。 【構成】 抗原がヒトホスホリパーゼエイツー活性化蛋
白質に特異的なアミノ酸配列部位を合成したペプチド
で、そのアミノ酸配列が、配列表に示されたアミノ酸配
列であることを特徴とする抗ヒトホスホリパーゼエイツ
ー活性化蛋白質抗体。
エイツー活性化蛋白質を定量するための抗ヒトホスホリ
パーゼエイツー活性化酵素蛋白質抗体、抗ヒトホスホリ
パーゼエイツー活性化蛋白質抗体を産生するハイブリド
ーマ、ヒトホスホリパーゼエイツー活性化蛋白質の測定
用試薬及びこれを用いた測定方法を提供する。 【構成】 抗原がヒトホスホリパーゼエイツー活性化蛋
白質に特異的なアミノ酸配列部位を合成したペプチド
で、そのアミノ酸配列が、配列表に示されたアミノ酸配
列であることを特徴とする抗ヒトホスホリパーゼエイツ
ー活性化蛋白質抗体。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトホスホリパーゼエ
イツー活性化蛋白質（以下、ＰＬＡＰと略す。）の免疫
学的測定に有用な抗ＰＬＡＰ抗体とこの抗体を産生する
ハイブリドーマ、並びにこの抗体を用いた免疫学的測定
試薬及び測定方法に関するものであり、さらに詳しく
は、慢性関節リウマチ（以下、ＲＡと略す。）の診断及
び治療に有用なＰＬＡＰの抗体とこの抗体を特異的に産
生するハイブリドーマ、並びにこの抗体を用いた測定用
試薬及び測定方法に関するものである。
イツー活性化蛋白質（以下、ＰＬＡＰと略す。）の免疫
学的測定に有用な抗ＰＬＡＰ抗体とこの抗体を産生する
ハイブリドーマ、並びにこの抗体を用いた免疫学的測定
試薬及び測定方法に関するものであり、さらに詳しく
は、慢性関節リウマチ（以下、ＲＡと略す。）の診断及
び治療に有用なＰＬＡＰの抗体とこの抗体を特異的に産
生するハイブリドーマ、並びにこの抗体を用いた測定用
試薬及び測定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】現在、ＲＡの診断は、アメリカリウマチ
協会の診断基準に基づき、リウマチ因子の検査が広く行
われている。しかし、リウマチ因子は、リウマチ患者血
漿中に１００％認められるものではなく、陽性率は７０
〜８０％程度である。また、肝疾患患者、癌患者、伝染
病、他の炎症関節症などのリウマチ以外の患者血漿中に
おいても高率に認められ、例えば肝硬変患者では、５０
％以上、癌患者は、３０％近くの陽性率が認められる。
また、健常者にも認められ、その陽性率は数％である
が、高齢者では、さらに陽性率が高くなる〔「臨床検査
ガイド」（臨時増刊号）、第６０４〜６０６頁、１９８
７年（分光堂）参照。〕。さらに、リウマチ因子の増減
は、リウマチ症状の悪化や軽減とあまり対応しない。こ
のように、リウマチ因子は、リウマチの診断や治療効果
を検査するためには、感度が良くないうえに特異的でな
いため、より感度が高く特異的なリウマチの検査方法が
嘱望されている。
協会の診断基準に基づき、リウマチ因子の検査が広く行
われている。しかし、リウマチ因子は、リウマチ患者血
漿中に１００％認められるものではなく、陽性率は７０
〜８０％程度である。また、肝疾患患者、癌患者、伝染
病、他の炎症関節症などのリウマチ以外の患者血漿中に
おいても高率に認められ、例えば肝硬変患者では、５０
％以上、癌患者は、３０％近くの陽性率が認められる。
また、健常者にも認められ、その陽性率は数％である
が、高齢者では、さらに陽性率が高くなる〔「臨床検査
ガイド」（臨時増刊号）、第６０４〜６０６頁、１９８
７年（分光堂）参照。〕。さらに、リウマチ因子の増減
は、リウマチ症状の悪化や軽減とあまり対応しない。こ
のように、リウマチ因子は、リウマチの診断や治療効果
を検査するためには、感度が良くないうえに特異的でな
いため、より感度が高く特異的なリウマチの検査方法が
嘱望されている。
【０００３】一方、ＲＡ患者の滑液中で最近発見された
ＰＬＡＰは、ＲＡ患者の滑液中に見られるＰＬＡＰの上
昇レベルと疾患の相関関係は８１％以上であり、さら
に、ＰＬＡＰの量はリウマチの症状と対応している。ま
た、肝疾患、癌、伝染病、他の炎症関節症などのリウマ
チ以外の疾患によってＰＬＡＰの量が変化するというこ
とはない。したがって、ＰＬＡＰに特異的な抗体を作製
し、この抗ＰＬＡＰ抗体を用いた診断薬によって、臨床
検査としてＰＬＡＰの検出を行うことは、リウマチの診
断の有力な手段となりうる〔ジャーナル オブ ラボラ
トリー クリニカル メヂスン（Journal of Laborator
y Clinical Medicine ）、116 、814 （1990。）参
照〕。これまで、抗ＰＬＡＰ抗体は、精製ＰＬＡＰ、あ
るいはβ−ガラクトシダーゼ−ＰＬＡＰ融合蛋白である
組換えＰＬＡＰ〔プロシーヂング オブ ナショナルア
カデミー サイエンス（proceeding of national acade
my science）、88、5418（1991）参照。〕又はその断片
を抗原として作製されている。
ＰＬＡＰは、ＲＡ患者の滑液中に見られるＰＬＡＰの上
昇レベルと疾患の相関関係は８１％以上であり、さら
に、ＰＬＡＰの量はリウマチの症状と対応している。ま
た、肝疾患、癌、伝染病、他の炎症関節症などのリウマ
チ以外の疾患によってＰＬＡＰの量が変化するというこ
とはない。したがって、ＰＬＡＰに特異的な抗体を作製
し、この抗ＰＬＡＰ抗体を用いた診断薬によって、臨床
検査としてＰＬＡＰの検出を行うことは、リウマチの診
断の有力な手段となりうる〔ジャーナル オブ ラボラ
トリー クリニカル メヂスン（Journal of Laborator
y Clinical Medicine ）、116 、814 （1990。）参
照〕。これまで、抗ＰＬＡＰ抗体は、精製ＰＬＡＰ、あ
るいはβ−ガラクトシダーゼ−ＰＬＡＰ融合蛋白である
組換えＰＬＡＰ〔プロシーヂング オブ ナショナルア
カデミー サイエンス（proceeding of national acade
my science）、88、5418（1991）参照。〕又はその断片
を抗原として作製されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかし、ＰＬＡＰは、
存在量が微量であるため、抗ＰＬＡＰ抗体の作製に必要
な量の抗原（ＰＬＡＰ）を精製することは困難であっ
た。また、β−ガラクトシダーゼ−ＰＬＡＰ融合蛋白で
ある組換えＰＬＡＰには、ヒトホスホリパーゼエイツー
活性能がないため、抗組換えＰＬＡＰ抗体が、正確にＰ
ＬＡＰを認識しているかという疑問が残されていた。
存在量が微量であるため、抗ＰＬＡＰ抗体の作製に必要
な量の抗原（ＰＬＡＰ）を精製することは困難であっ
た。また、β−ガラクトシダーゼ−ＰＬＡＰ融合蛋白で
ある組換えＰＬＡＰには、ヒトホスホリパーゼエイツー
活性能がないため、抗組換えＰＬＡＰ抗体が、正確にＰ
ＬＡＰを認識しているかという疑問が残されていた。
【０００５】本発明は、抗原としてＰＬＡＰを大量に精
製することを必要とせず、かつ、ＰＬＡＰに対して特異
的に結合する抗ＰＬＡＰ抗体とこの抗体を産生するハイ
ブリドーマ、並びにこの抗体を用いたＰＬＡＰの測定用
試薬及び測定方法を提供することを目的とするものであ
る。
製することを必要とせず、かつ、ＰＬＡＰに対して特異
的に結合する抗ＰＬＡＰ抗体とこの抗体を産生するハイ
ブリドーマ、並びにこの抗体を用いたＰＬＡＰの測定用
試薬及び測定方法を提供することを目的とするものであ
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
な課題を解決するために鋭意研究の結果、抗原として配
列表に示されたアミノ酸配列を有する合成ペプチドを利
用すると、抗原としてのＰＬＡＰを精製する必要がな
く、さらに得られた抗体はＰＬＡＰに対して特異的に結
合するということを見い出し、本発明を完成するに至っ
た。
な課題を解決するために鋭意研究の結果、抗原として配
列表に示されたアミノ酸配列を有する合成ペプチドを利
用すると、抗原としてのＰＬＡＰを精製する必要がな
く、さらに得られた抗体はＰＬＡＰに対して特異的に結
合するということを見い出し、本発明を完成するに至っ
た。
【０００７】すなわち、第一の発明は、抗原がＰＬＡＰ
に特異的なアミノ酸配列部位を合成したペプチドで、そ
のアミノ酸配列が、配列表に示されたアミノ酸配列であ
ることを特徴とする抗ＰＬＡＰ抗体を要旨とするもので
ある。また、第二の発明は、抗体がモノクローナル抗体
である上記の抗ＰＬＡＰ抗体を要旨とするものである。
さらに、第三の発明は上記の抗体を産生するハイブリド
ーマを要旨とするものである。次に、第四の発明は、上
記の抗体を含有することを特徴とするＰＬＡＰの測定用
試薬を要旨とするものである。また、第五の発明は、上
記測定用試薬を使用することを特徴とするＰＬＡＰの測
定方法を要旨とするものである。
に特異的なアミノ酸配列部位を合成したペプチドで、そ
のアミノ酸配列が、配列表に示されたアミノ酸配列であ
ることを特徴とする抗ＰＬＡＰ抗体を要旨とするもので
ある。また、第二の発明は、抗体がモノクローナル抗体
である上記の抗ＰＬＡＰ抗体を要旨とするものである。
さらに、第三の発明は上記の抗体を産生するハイブリド
ーマを要旨とするものである。次に、第四の発明は、上
記の抗体を含有することを特徴とするＰＬＡＰの測定用
試薬を要旨とするものである。また、第五の発明は、上
記測定用試薬を使用することを特徴とするＰＬＡＰの測
定方法を要旨とするものである。
【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。本発明で
抗原として用いられる合成ペプチドは、配列表に示され
たアミノ酸配列を含んでいることが必要である。この配
列はＰＬＡＰに特異的なホスホリパーゼを活性化するハ
チ毒メリチンと相同性が高いため、ＰＬＡＰの活性中心
と考えられる。このような合成ペプチドは、自動ペプチ
ド合成装置を用いて合成すればよい。
抗原として用いられる合成ペプチドは、配列表に示され
たアミノ酸配列を含んでいることが必要である。この配
列はＰＬＡＰに特異的なホスホリパーゼを活性化するハ
チ毒メリチンと相同性が高いため、ＰＬＡＰの活性中心
と考えられる。このような合成ペプチドは、自動ペプチ
ド合成装置を用いて合成すればよい。
【０００９】本発明の抗体は、ポリクローナル、モノク
ローナルに関係なく使用できるが、望ましくはモノクロ
ーナル抗体が用いられる。また、ＩｇＧ，ＩｇＭ等のク
ラスの抗体でも用いることができるが、望ましくはＩｇ
Ｇが用いられる。本発明の抗体の反応特異性を以下に示
す。 （１）抗原抗体反応により、ＰＬＡＰと結合する。 （２）抗体の分子量など、理化学的性質は一般に知られ
ている性質〔例えば医科免疫学（医学書院）参照。〕と
同様である。すなわち、ＩｇＧの分子量は約１３０，０
００〜２１０，０００で、至適ｐＨは６〜９、安定ｐＨ
範囲は３〜１１、作用適温の範囲は０〜４０℃である。
ローナルに関係なく使用できるが、望ましくはモノクロ
ーナル抗体が用いられる。また、ＩｇＧ，ＩｇＭ等のク
ラスの抗体でも用いることができるが、望ましくはＩｇ
Ｇが用いられる。本発明の抗体の反応特異性を以下に示
す。 （１）抗原抗体反応により、ＰＬＡＰと結合する。 （２）抗体の分子量など、理化学的性質は一般に知られ
ている性質〔例えば医科免疫学（医学書院）参照。〕と
同様である。すなわち、ＩｇＧの分子量は約１３０，０
００〜２１０，０００で、至適ｐＨは６〜９、安定ｐＨ
範囲は３〜１１、作用適温の範囲は０〜４０℃である。
【００１０】このような性質のポリクローナル抗体を得
るには、例えば以下の方法で行えばよい。まず、抗原と
なる合成ペプチドのＣ末端にシステイン残基を付加し、
さらにカブトガニヘモシアニン（以下、ＫＬＨと略
す。）等のキャリア蛋白質をカルボジイミド法などで結
合したもの（以下、ＰＬＡＰ−キャリアと略す。）、又
は抗原となる合成ペプチドの多抗原性ペプチド（以下、
ＰＬＡＰ−ＭＡＰと略す。）を抗原としてウサギ、ヒツ
ジ、ヤギ、マウス、ラット、ウマ等の哺乳動物に免疫す
る。一般に、多抗原性ペプチドには、キャリアー蛋白質
と結合させる必要がなく、高い抗原性を有し、未変性な
元の蛋白質と反応する抗体を産生させることが多いとい
う利点がある〔ジャーナル エクスプレス オブ メヂ
スン（Journal Express of Medicine ）、166 、1591
（1987）参照。〕。このとき、フロイントの完全アジュ
バント（以下、ＦＣＡと略す。）等の免疫増強剤を用い
ると効果的である。
るには、例えば以下の方法で行えばよい。まず、抗原と
なる合成ペプチドのＣ末端にシステイン残基を付加し、
さらにカブトガニヘモシアニン（以下、ＫＬＨと略
す。）等のキャリア蛋白質をカルボジイミド法などで結
合したもの（以下、ＰＬＡＰ−キャリアと略す。）、又
は抗原となる合成ペプチドの多抗原性ペプチド（以下、
ＰＬＡＰ−ＭＡＰと略す。）を抗原としてウサギ、ヒツ
ジ、ヤギ、マウス、ラット、ウマ等の哺乳動物に免疫す
る。一般に、多抗原性ペプチドには、キャリアー蛋白質
と結合させる必要がなく、高い抗原性を有し、未変性な
元の蛋白質と反応する抗体を産生させることが多いとい
う利点がある〔ジャーナル エクスプレス オブ メヂ
スン（Journal Express of Medicine ）、166 、1591
（1987）参照。〕。このとき、フロイントの完全アジュ
バント（以下、ＦＣＡと略す。）等の免疫増強剤を用い
ると効果的である。
【００１１】抗原の使用量、投与部位、アジュバントの
使用等の免疫の方法は従来の抗血清を得る方法に準ずれ
ばよい。例えば、マウスを用いる場合、マウス１匹あた
り１回につき0.001 〜10mg、好ましくは0.01〜1mg のＰ
ＬＡＰ−キャリア又はＰＬＡＰ−ＭＡＰを、初回は、ア
ジュバント（例えば、フロイントの完全アジュバント）
とよく混合して、皮下、腹腔内等に投与する。さらに、
２週間以上経過後、ＰＬＡＰ−キャリア又はＰＬＡＰ−
ＭＡＰのみを静脈内、皮下、腹腔内等に投与して、十分
免疫する。
使用等の免疫の方法は従来の抗血清を得る方法に準ずれ
ばよい。例えば、マウスを用いる場合、マウス１匹あた
り１回につき0.001 〜10mg、好ましくは0.01〜1mg のＰ
ＬＡＰ−キャリア又はＰＬＡＰ−ＭＡＰを、初回は、ア
ジュバント（例えば、フロイントの完全アジュバント）
とよく混合して、皮下、腹腔内等に投与する。さらに、
２週間以上経過後、ＰＬＡＰ−キャリア又はＰＬＡＰ−
ＭＡＰのみを静脈内、皮下、腹腔内等に投与して、十分
免疫する。
【００１２】最終免疫から１〜１４日後、望ましくは３
〜７日後に免疫した動物から血清を採取する。この血清
を、例えば、ＰＬＡＰを固定化した担体（例えば、セフ
ァロース等）を充填したカラムに吸着させ、溶出させる
ことにより、ＰＬＡＰに特異的に結合する抗体を得るこ
とができる。
〜７日後に免疫した動物から血清を採取する。この血清
を、例えば、ＰＬＡＰを固定化した担体（例えば、セフ
ァロース等）を充填したカラムに吸着させ、溶出させる
ことにより、ＰＬＡＰに特異的に結合する抗体を得るこ
とができる。
【００１３】また、ＰＬＡＰに特異的に結合するモノク
ローナル抗体は、例えば、以下の方法により得ることが
できる。まず、抗ＰＬＡＰ抗体を産生するハイブリドー
マを取得する。そのためには、例えば、以下の方法によ
り得ることができる。すなわち、上記方法で免疫した哺
乳動物のリンパ球と、これを融合させるミエローマを用
意する。このうち、上記リンパ球を採取するためには、
哺乳動物、好ましくはマウス又はラットに上記方法で免
疫する。免疫された動物を、好ましくは最終免疫から２
〜４日後に殺し、リンパ球を採取する。リンパ球調整に
は、脾臓、リンパ節、末梢血等が用いられる。このリン
パ球を培養液に懸濁状態にほぐしておく。
ローナル抗体は、例えば、以下の方法により得ることが
できる。まず、抗ＰＬＡＰ抗体を産生するハイブリドー
マを取得する。そのためには、例えば、以下の方法によ
り得ることができる。すなわち、上記方法で免疫した哺
乳動物のリンパ球と、これを融合させるミエローマを用
意する。このうち、上記リンパ球を採取するためには、
哺乳動物、好ましくはマウス又はラットに上記方法で免
疫する。免疫された動物を、好ましくは最終免疫から２
〜４日後に殺し、リンパ球を採取する。リンパ球調整に
は、脾臓、リンパ節、末梢血等が用いられる。このリン
パ球を培養液に懸濁状態にほぐしておく。
【００１４】一方、ミエローマは、被免疫動物と同じ種
由来のものを使用することが好ましい。さらに、そのミ
エローマは薬剤抵抗性の変異株であることが好ましく、
未融合のミエローマがハイブリドーマ選択培地で生育し
ないものが好ましい。最も一般には８−アザグアニン抵
抗性の細胞ラインが用いられる。これは、ヒポキサンチ
ン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Hy
poxantin guanine phosphoribosyl transferase ）が欠
損しており、選択培地の一種ヒポキサンチン−アミノプ
テリン−チミジン（ＨＡＴ）培地に生育できない。ま
た、使用するミエローマ自身が抗体を分泌しないものが
望ましい。以上の点から、例えば、市販のマウスミエロ
ーマＰ３・Ｘ６３・Ａｇ８・６・５・３・（Ｘ６３・６
・５・３）；Ｐ３・Ｘ６３・Ａｇ８・Ｕ１（Ｐ３Ｕ
１）、ラットミエローマ210・ＲＣＹ３・Ａｇ１・２・
３等を用いるのが好ましい。このミエローマを血清、好
ましくは牛胎児血清を含有するイーグル最少培地（ＭＥ
Ｍ）やＲＰＭＩ１６４０培地等の培地中で培養してお
く。
由来のものを使用することが好ましい。さらに、そのミ
エローマは薬剤抵抗性の変異株であることが好ましく、
未融合のミエローマがハイブリドーマ選択培地で生育し
ないものが好ましい。最も一般には８−アザグアニン抵
抗性の細胞ラインが用いられる。これは、ヒポキサンチ
ン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Hy
poxantin guanine phosphoribosyl transferase ）が欠
損しており、選択培地の一種ヒポキサンチン−アミノプ
テリン−チミジン（ＨＡＴ）培地に生育できない。ま
た、使用するミエローマ自身が抗体を分泌しないものが
望ましい。以上の点から、例えば、市販のマウスミエロ
ーマＰ３・Ｘ６３・Ａｇ８・６・５・３・（Ｘ６３・６
・５・３）；Ｐ３・Ｘ６３・Ａｇ８・Ｕ１（Ｐ３Ｕ
１）、ラットミエローマ210・ＲＣＹ３・Ａｇ１・２・
３等を用いるのが好ましい。このミエローマを血清、好
ましくは牛胎児血清を含有するイーグル最少培地（ＭＥ
Ｍ）やＲＰＭＩ１６４０培地等の培地中で培養してお
く。
【００１５】次に、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０等の培地
に上記で得たリンパ球及びミエローマを各々懸濁し、混
合する。このときの混合比は特に限定されるものではな
いが、好ましくはリンパ球：ミエローマが細胞数で１：
１〜２０：１、さらに好ましくは５：１〜１０：１の比
率で混合すればよい。混合した細胞は、融合促進剤を用
いて融合を行う。融合方法としては、例えば、イムノロ
ジカルメソッズ 第２巻 285 〔1981（アカデミックプ
レス）〕に従って行えばよい。融合促進剤としては、種
々の高分子物質やウイルス等を用いることができるが、
好ましくはポリエチエレングリコール（ＰＥＧ）やセン
ダイウイルスを用いればよい。ＰＥＧとしては、平均分
子量400 〜20,000のものが使用できるが、好ましくは、
1,000 〜7,500 のものを用いればよい。その使用濃度と
しては、４０〜６０重量％が好ましい。
に上記で得たリンパ球及びミエローマを各々懸濁し、混
合する。このときの混合比は特に限定されるものではな
いが、好ましくはリンパ球：ミエローマが細胞数で１：
１〜２０：１、さらに好ましくは５：１〜１０：１の比
率で混合すればよい。混合した細胞は、融合促進剤を用
いて融合を行う。融合方法としては、例えば、イムノロ
ジカルメソッズ 第２巻 285 〔1981（アカデミックプ
レス）〕に従って行えばよい。融合促進剤としては、種
々の高分子物質やウイルス等を用いることができるが、
好ましくはポリエチエレングリコール（ＰＥＧ）やセン
ダイウイルスを用いればよい。ＰＥＧとしては、平均分
子量400 〜20,000のものが使用できるが、好ましくは、
1,000 〜7,500 のものを用いればよい。その使用濃度と
しては、４０〜６０重量％が好ましい。
【００１６】融合させた細胞は、洗浄して融合促進剤を
除去した後、５〜１５容量％の血清を含むＭＥＭ又はＲ
ＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、９６穴培養皿等に0.5 〜
５×１０6 ／穴の割合で分注する。さらに、各穴に選択
培地（例えば、ＨＡＴ培地）を加え、適宜選択培地を交
換すれば、１０〜１４日後には未融合のミエローマは死
滅し、ハイブリドーマのみが生育する。ちなみに、リン
パ球は長時間生体外（インビトロ）では生育できず、や
はり１０〜１４日後には死滅する。
除去した後、５〜１５容量％の血清を含むＭＥＭ又はＲ
ＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、９６穴培養皿等に0.5 〜
５×１０6 ／穴の割合で分注する。さらに、各穴に選択
培地（例えば、ＨＡＴ培地）を加え、適宜選択培地を交
換すれば、１０〜１４日後には未融合のミエローマは死
滅し、ハイブリドーマのみが生育する。ちなみに、リン
パ球は長時間生体外（インビトロ）では生育できず、や
はり１０〜１４日後には死滅する。
【００１７】ＰＬＡＰ−キャリアを抗原とした場合、Ｐ
ＬＡＰ合成ペプチドに対する抗体を産生するもののほ
か、キャリア蛋白質に対する抗体を産生するものも存在
する。そこで、ＰＬＡＰに対する抗体を産生するハイブ
リドーマのみを選択するには、免疫の時に用いたのとは
別のキャリア蛋白質に結合させた抗原や、ＰＬＡＰ−Ｍ
ＡＰを９６穴のマイクロタイタープレートに固定化し、
そのプレートにハイブリドーマの培養上清を加え、常法
通り酵素免疫測定法やラジオイムノアッセイ等でＰＬＡ
Ｐと結合するモノクローナル抗体を産生しているハイブ
リドーマを選択すればよい。このようにして選択された
ハイブリドーマは限界希釈法等によりクローニングすれ
ばよい。
ＬＡＰ合成ペプチドに対する抗体を産生するもののほ
か、キャリア蛋白質に対する抗体を産生するものも存在
する。そこで、ＰＬＡＰに対する抗体を産生するハイブ
リドーマのみを選択するには、免疫の時に用いたのとは
別のキャリア蛋白質に結合させた抗原や、ＰＬＡＰ−Ｍ
ＡＰを９６穴のマイクロタイタープレートに固定化し、
そのプレートにハイブリドーマの培養上清を加え、常法
通り酵素免疫測定法やラジオイムノアッセイ等でＰＬＡ
Ｐと結合するモノクローナル抗体を産生しているハイブ
リドーマを選択すればよい。このようにして選択された
ハイブリドーマは限界希釈法等によりクローニングすれ
ばよい。
【００１８】このようにして得られた抗ＰＬＡＰモノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマを「ＡＰＡ−２１」と
命名し、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
に寄託の手続を行い、平成５年８月１８日に受託され
た。この受託番号は、生命研条寄第４３８６号（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−４３８６）である。
ローナル抗体産生ハイブリドーマを「ＡＰＡ−２１」と
命名し、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
に寄託の手続を行い、平成５年８月１８日に受託され
た。この受託番号は、生命研条寄第４３８６号（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−４３８６）である。
【００１９】次に、抗ＰＬＡＰモノクローナル抗体を得
るには、クローニングされた抗ＰＬＡＰモノクローナル
抗体産生ハイブリドーマをフラスコ、ホローファイバ
ー、攪拌培養槽等を用いて培養し、その培養上清を硫安
分画や、イオン交換やプロテインＡセファロース等のク
ロマトグラフィーで分離精製すればよい。
るには、クローニングされた抗ＰＬＡＰモノクローナル
抗体産生ハイブリドーマをフラスコ、ホローファイバ
ー、攪拌培養槽等を用いて培養し、その培養上清を硫安
分画や、イオン交換やプロテインＡセファロース等のク
ロマトグラフィーで分離精製すればよい。
【００２０】本発明のＰＬＡＰ測定用試薬及び測定方法
について説明すると、まず本発明のＰＬＡＰ測定用試薬
は、抗ＰＬＡＰ抗体、酵素、ＲＩ及び蛍光物質等を標識
した標識抗原を含有しており、この試薬を用いてＰＬＡ
Ｐを測定するには、例えば、抗ＰＬＡＰ抗体を支持体に
固相化しておき、これに酵素、ＲＩ、蛍光物質等を標識
した標識抗原、及び非標識抗原である標準又は被検体の
ＰＬＡＰを加え、標識抗原と非標識抗原とを競合させる
ことによってその非標識抗原量すなわちＰＬＡＰ量を定
量すればよい。次いで、数種のＰＬＡＰ濃度既知の標準
抗原と競合する標識抗原に対するシグナルを各々測定し
て検量線を作成し、ＰＬＡＰ濃度未知の検体と競合する
標識抗原から得られるシグナルをこの検量線に当ては
め、そのＰＬＡＰ濃度を定量すればよい。
について説明すると、まず本発明のＰＬＡＰ測定用試薬
は、抗ＰＬＡＰ抗体、酵素、ＲＩ及び蛍光物質等を標識
した標識抗原を含有しており、この試薬を用いてＰＬＡ
Ｐを測定するには、例えば、抗ＰＬＡＰ抗体を支持体に
固相化しておき、これに酵素、ＲＩ、蛍光物質等を標識
した標識抗原、及び非標識抗原である標準又は被検体の
ＰＬＡＰを加え、標識抗原と非標識抗原とを競合させる
ことによってその非標識抗原量すなわちＰＬＡＰ量を定
量すればよい。次いで、数種のＰＬＡＰ濃度既知の標準
抗原と競合する標識抗原に対するシグナルを各々測定し
て検量線を作成し、ＰＬＡＰ濃度未知の検体と競合する
標識抗原から得られるシグナルをこの検量線に当ては
め、そのＰＬＡＰ濃度を定量すればよい。
【００２１】標準及び標識抗原に用いられるＰＬＡＰ
は、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー
（Jouranal of Biological Chemistry）、262 、4402
（1987）に記載の方法に従って、ヒトリウマチ患者の滑
液から、免疫親和性クロマトグラフィーにて精製すれば
よい。また、上記の酵素としては、ＨＲＰ、ウシ小腸ア
ルカリホスファターゼ等を用いることができる。また、
ＲＩとしては、１２５Ｉを、蛍光物質としては、フルオ
レセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミン
イソシアネート等を用いることができる。
は、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー
（Jouranal of Biological Chemistry）、262 、4402
（1987）に記載の方法に従って、ヒトリウマチ患者の滑
液から、免疫親和性クロマトグラフィーにて精製すれば
よい。また、上記の酵素としては、ＨＲＰ、ウシ小腸ア
ルカリホスファターゼ等を用いることができる。また、
ＲＩとしては、１２５Ｉを、蛍光物質としては、フルオ
レセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミン
イソシアネート等を用いることができる。
【００２２】
【実施例】次に、本発明を実施例により具体的に説明す
る。 参考例１（抗原の調製） １０ｍｇのＫＬＨ又は２０ｍｇのＢＳＡを０．１Ｍのリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２．５ミリリット
ルに溶解し、これに０．２５ミリリットルのＮ，Ｎ−ジ
メチルホルムアミドにＮ−サクシニミジル４−（Ｎ−マ
レイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレ
イト２．５ｍｇを溶解したものを添加して、３０℃で３
０分間反応させ、ＫＬＨ又はＢＳＡにマレイミド基を導
入した。次いで、これらの溶液と、配列表に示されたア
ミノ酸配列のＣ末端にシステイン残基を付加したＰＬＡ
Ｐ合成ペプチド４ｍｇを１ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１
Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）３ミリリッ
トルに混合し、４℃で反応させてＰＬＡＰ−ＫＬＨ又は
ＰＬＡＰ−ＢＳＡを作成した。合成ペプチドは、４３１
Ａペプチドシンセサイザー（アプライドバイオシステム
ズジャパン社製）を用いて、合成した。ＫＬＨ又はＢＳ
Ａに導入されたマレイミド基を測定したところ〔酵素免
疫測定法（医学書院）第90頁参照。〕、これらのマレイ
ミド基と合成ペプチドのチオール基が全て結合したと考
えられることから、ＫＬＨ１分子に結合したＰＬＡＰ合
成ペプチドは約２０分子、またＢＳＡ１分子に結合した
ＰＬＡＰ合成ペプチドは約７分子と求められた。
る。 参考例１（抗原の調製） １０ｍｇのＫＬＨ又は２０ｍｇのＢＳＡを０．１Ｍのリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２．５ミリリット
ルに溶解し、これに０．２５ミリリットルのＮ，Ｎ−ジ
メチルホルムアミドにＮ−サクシニミジル４−（Ｎ−マ
レイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレ
イト２．５ｍｇを溶解したものを添加して、３０℃で３
０分間反応させ、ＫＬＨ又はＢＳＡにマレイミド基を導
入した。次いで、これらの溶液と、配列表に示されたア
ミノ酸配列のＣ末端にシステイン残基を付加したＰＬＡ
Ｐ合成ペプチド４ｍｇを１ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１
Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）３ミリリッ
トルに混合し、４℃で反応させてＰＬＡＰ−ＫＬＨ又は
ＰＬＡＰ−ＢＳＡを作成した。合成ペプチドは、４３１
Ａペプチドシンセサイザー（アプライドバイオシステム
ズジャパン社製）を用いて、合成した。ＫＬＨ又はＢＳ
Ａに導入されたマレイミド基を測定したところ〔酵素免
疫測定法（医学書院）第90頁参照。〕、これらのマレイ
ミド基と合成ペプチドのチオール基が全て結合したと考
えられることから、ＫＬＨ１分子に結合したＰＬＡＰ合
成ペプチドは約２０分子、またＢＳＡ１分子に結合した
ＰＬＡＰ合成ペプチドは約７分子と求められた。
【００２３】実施例１（ポリクローナル抗体の調製） 参考例１で調整したＰＬＡＰ−ＫＬＨ１ｍｇを生理食塩
水リン酸緩衝液（以下、ＰＢＳと略す。）１ミリリット
ルに溶解した後、等量のＦＣＡ（ナカライテスク社製）
と混合してエマルジョンを作製し、ウサギに皮下注射し
て免疫した。３週間後に同量のＰＬＡＰ−ＫＬＨを不完
全アジュバンド〔以下、ＦＩＡと略す。（ナカライテス
ク社製）〕とエマルジョン化し、同様に追加免疫した。
さらに、３週間後ＰＬＡＰ−ＫＬＨ単独で最終免疫を行
い、その５日後に採血して、血清４９ミリリットルを分
離した。この血清から５０重量％飽和硫安分画し、得ら
れた沈澱を１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７. ３）に透
析後、同じ緩衝液で平衡化したジエチルアミノエチル
（ＤＥＡＥ）セファロース（ファルマシア社製）に吸着
させ、食塩の濃度勾配により溶出し、精製した。これを
ＰＬＡＰ固定化セファロース（ファルマシア社製）カラ
ムに通液した。通過した成分を限外濾過で濃縮してウサ
ギ抗ＰＬＡＰ抗体を１５ｍｇ得た。
水リン酸緩衝液（以下、ＰＢＳと略す。）１ミリリット
ルに溶解した後、等量のＦＣＡ（ナカライテスク社製）
と混合してエマルジョンを作製し、ウサギに皮下注射し
て免疫した。３週間後に同量のＰＬＡＰ−ＫＬＨを不完
全アジュバンド〔以下、ＦＩＡと略す。（ナカライテス
ク社製）〕とエマルジョン化し、同様に追加免疫した。
さらに、３週間後ＰＬＡＰ−ＫＬＨ単独で最終免疫を行
い、その５日後に採血して、血清４９ミリリットルを分
離した。この血清から５０重量％飽和硫安分画し、得ら
れた沈澱を１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７. ３）に透
析後、同じ緩衝液で平衡化したジエチルアミノエチル
（ＤＥＡＥ）セファロース（ファルマシア社製）に吸着
させ、食塩の濃度勾配により溶出し、精製した。これを
ＰＬＡＰ固定化セファロース（ファルマシア社製）カラ
ムに通液した。通過した成分を限外濾過で濃縮してウサ
ギ抗ＰＬＡＰ抗体を１５ｍｇ得た。
【００２４】実施例２（モノクローナル抗体の調製） 参考例１で調整したＰＬＡＰ−ＫＬＨ１ｍｇを１ミリリ
ットルのＰＢＳに溶解した後、等量のＦＣＡ（ナカライ
テスク社製）と混合してエマルジョンを作製し、これを
一回の注射において１００μｇの蛋白量となるようにマ
ウス（ＢＡＬＢ／ｃ，日本クレア社製）２匹に腹腔内投
与により免疫した。３週間後に同量のＰＬＡＰ−ＫＬＨ
をＦＩＡ（ナカライテスク社製）とエマルジョン化し、
同様に追加免疫した。さらに３週間後、ＰＬＡＰ−ＫＬ
Ｈで最終免疫を行った。その３日後に脾臓を摘出し、そ
の細胞をＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ社製）に懸濁し
てあらかじめ培養しておいたミエローマＰ３・Ｕ１（４
×１０7 ）と混合し、これを５０重量％ポリエチレング
リコール（ＰＥＧ）４０００（シグマ社製）を用いて融
合した。融合後、ＨＡＴ選択培地で２週間培養し、生育
しているハイブリドーマを選択し、選択したハイブリド
ーマの培養上清を参考例１で得られたＰＬＡＰ−ＢＳＡ
結合物を吸着させた９６穴マイクロタイタープレートに
加え、洗浄後パーオキシダーゼ標識ヤギマウスＩｇＧ抗
体を加えた。これを数時間放置した後、洗浄し、基質溶
液を添加して対照のものより発色している上清のハイブ
リドーマをスクリーニングした。これらの高いシグナル
を示した上清について、同様にＰＬＡＰ固定化プレート
を作成し、同様の操作により吸光度を測定したところ、
やはり対照のものより高く発色していた。これらのハイ
ブリドーマを選択し、限界希釈法にてクローニングし
た。
ットルのＰＢＳに溶解した後、等量のＦＣＡ（ナカライ
テスク社製）と混合してエマルジョンを作製し、これを
一回の注射において１００μｇの蛋白量となるようにマ
ウス（ＢＡＬＢ／ｃ，日本クレア社製）２匹に腹腔内投
与により免疫した。３週間後に同量のＰＬＡＰ−ＫＬＨ
をＦＩＡ（ナカライテスク社製）とエマルジョン化し、
同様に追加免疫した。さらに３週間後、ＰＬＡＰ−ＫＬ
Ｈで最終免疫を行った。その３日後に脾臓を摘出し、そ
の細胞をＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ社製）に懸濁し
てあらかじめ培養しておいたミエローマＰ３・Ｕ１（４
×１０7 ）と混合し、これを５０重量％ポリエチレング
リコール（ＰＥＧ）４０００（シグマ社製）を用いて融
合した。融合後、ＨＡＴ選択培地で２週間培養し、生育
しているハイブリドーマを選択し、選択したハイブリド
ーマの培養上清を参考例１で得られたＰＬＡＰ−ＢＳＡ
結合物を吸着させた９６穴マイクロタイタープレートに
加え、洗浄後パーオキシダーゼ標識ヤギマウスＩｇＧ抗
体を加えた。これを数時間放置した後、洗浄し、基質溶
液を添加して対照のものより発色している上清のハイブ
リドーマをスクリーニングした。これらの高いシグナル
を示した上清について、同様にＰＬＡＰ固定化プレート
を作成し、同様の操作により吸光度を測定したところ、
やはり対照のものより高く発色していた。これらのハイ
ブリドーマを選択し、限界希釈法にてクローニングし
た。
【００２５】このようにして得られたハイブリドーマの
うちの１株を「ＡＰＡ−２１」と命名し、通商産業省工
業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した〔生命研条
寄第４３８６号（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３８６）〕。
うちの１株を「ＡＰＡ−２１」と命名し、通商産業省工
業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した〔生命研条
寄第４３８６号（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３８６）〕。
【００２６】上記で得られたハイブリドーマの細胞数６
×１０8 をギット培地（和光純薬工業社製）６００ミリ
リットルに植え込み、５容量％の炭酸ガス存在下３７℃
で４日間培養した。培養後、遠心分離により細胞を除
き、得られた培養上清を水酸化ナトリウム溶液でｐＨを
９．０に調整した後、プロテインＡセファロースカラム
に通液した。このカラムを、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８．６）で洗浄した後、グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．
３）で溶出した抗体画分を集めてＰＢＳに透析し、１．
１ｍｇの抗ＰＬＡＰモノクローナル抗体を得た。
×１０8 をギット培地（和光純薬工業社製）６００ミリ
リットルに植え込み、５容量％の炭酸ガス存在下３７℃
で４日間培養した。培養後、遠心分離により細胞を除
き、得られた培養上清を水酸化ナトリウム溶液でｐＨを
９．０に調整した後、プロテインＡセファロースカラム
に通液した。このカラムを、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８．６）で洗浄した後、グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．
３）で溶出した抗体画分を集めてＰＢＳに透析し、１．
１ｍｇの抗ＰＬＡＰモノクローナル抗体を得た。
【００２７】上記で得られた抗ＰＬＡＰモノクローナル
抗体のＰＬＡＰに対する特異性をビアコア（ＢＩＡＣＯ
ＲＥ）バイオセンサー（ファルマシア社製）を用いて測
定した〔蛋白質 核酸 酵素 ３７、２９７７（１９９
２）参照。〕。すなわち、上記で得られた抗ＰＬＡＰモ
ノクローナル抗体を５０μｇ／ミリリットルとなるよう
に１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に溶
解し、これをセンサーチップ（ファルマシア社製）に固
定化した。固定化後、０．０５重量％のトウイーン２
０、０．１５Ｍの塩化ナトリウム及び３．４ｍＭのＥＤ
ＴＡを含む１０ｍＭのヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）でセ
ンサーチップ表面を洗浄した後、サンプルとしてスタン
ダート血清〔健常成人混合蛋白（バインディングサイト
社製）〕及びＰＬＡＰを３０００Ｕ／ミリリットル（Ｐ
ＬＡＰ刺激活性１Ｕは、１ｍｇのヒト単球細胞Ｕ９３７
の総蛋白においてホスホリパーゼＡ２の活性を２倍に増
加させる量である。）となるようにスタンダート血清に
混合した溶液をそれぞれ注入し、共鳴シグナル〔Resona
nce unit（以下、ＲＵと略す。）〕の変化をビアコアバ
イオセンサーを用いて測定した。共鳴シグナルはその値
が高いほどセンサーチップ表面の濃度が高いことを示
し、１０００ＲＵの変化はセンサーチップ表面の濃度１
ｎｍ／ｍｍ2 の変化に相当する。得られた結果を図１及
び図２に示す。なお、図１は、サンプルとしてＰＬＡＰ
を３０００Ｕ／ミリリットルとなるようにスタンダート
血清に混合した溶液を用いた場合のＲＵの変化を示す図
であり、図２はサンプルとしてスタンダード血清を用い
た場合のＲＵの変化を示す図である。両図とも、縦軸に
ＲＵを、横軸に測定時間を示す。
抗体のＰＬＡＰに対する特異性をビアコア（ＢＩＡＣＯ
ＲＥ）バイオセンサー（ファルマシア社製）を用いて測
定した〔蛋白質 核酸 酵素 ３７、２９７７（１９９
２）参照。〕。すなわち、上記で得られた抗ＰＬＡＰモ
ノクローナル抗体を５０μｇ／ミリリットルとなるよう
に１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に溶
解し、これをセンサーチップ（ファルマシア社製）に固
定化した。固定化後、０．０５重量％のトウイーン２
０、０．１５Ｍの塩化ナトリウム及び３．４ｍＭのＥＤ
ＴＡを含む１０ｍＭのヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）でセ
ンサーチップ表面を洗浄した後、サンプルとしてスタン
ダート血清〔健常成人混合蛋白（バインディングサイト
社製）〕及びＰＬＡＰを３０００Ｕ／ミリリットル（Ｐ
ＬＡＰ刺激活性１Ｕは、１ｍｇのヒト単球細胞Ｕ９３７
の総蛋白においてホスホリパーゼＡ２の活性を２倍に増
加させる量である。）となるようにスタンダート血清に
混合した溶液をそれぞれ注入し、共鳴シグナル〔Resona
nce unit（以下、ＲＵと略す。）〕の変化をビアコアバ
イオセンサーを用いて測定した。共鳴シグナルはその値
が高いほどセンサーチップ表面の濃度が高いことを示
し、１０００ＲＵの変化はセンサーチップ表面の濃度１
ｎｍ／ｍｍ2 の変化に相当する。得られた結果を図１及
び図２に示す。なお、図１は、サンプルとしてＰＬＡＰ
を３０００Ｕ／ミリリットルとなるようにスタンダート
血清に混合した溶液を用いた場合のＲＵの変化を示す図
であり、図２はサンプルとしてスタンダード血清を用い
た場合のＲＵの変化を示す図である。両図とも、縦軸に
ＲＵを、横軸に測定時間を示す。
【００２８】図１及び図２に示すように、本発明の抗Ｐ
ＬＡＰ抗体はＰＬＡＰにのみ結合し（図１）、スタンダ
ード血清とは結合しない（図２）ため、ＰＬＡＰに特異
的であることがわかる。
ＬＡＰ抗体はＰＬＡＰにのみ結合し（図１）、スタンダ
ード血清とは結合しない（図２）ため、ＰＬＡＰに特異
的であることがわかる。
【００２９】比較例１（抗β−ガラクトシダーゼ−ＰＬ
ＡＰ融合蛋白抗体の調製） プロシージング オブ ナショナル アカデミー サイ
エンス(proceeding ofnational academy science)、8
8、5418 (1991) 記載の方法に従って、抗β−ガラクト
シダーゼ−ＰＬＡＰ融合蛋白抗体を調製した。まず、β
−ガラクトシダーゼ−ＰＬＡＰ融合蛋白を作製した。す
なわち、マウス滑筋細胞ＢＣ３Ｈ１〔アメリカン タイ
プ カルチャー コレクション(American Type Culture
Collection)より入手した。〕を１μＭのロイコトリエ
ンＤ4で２分間刺激した後、グアニジン イソシアネー
トを用いて細胞内のトータルＲＮＡを抽出した。ジーン
(Gene)、25、263 (1983)記載の方法に従って、ｃＤＮＡ
ライブラリーを作製し、作製したｃＤＮＡの両端にＥｃ
ｏＲＩリンカーを付けて、ラムダージーティー１１（λ
ｇｔ１１）ベクター〔ストラタジーン クローニング
システムズ(Stratagene Cloning Systems)社製〕に導入
し、ベクター ラボラトリーズより入手した抽出物を用
いてパッケイシングした。大腸菌Ｙ１０８９（ストラダ
ジーン クローニング システムズ社製）にこのＰＬＡ
ＰｃＤＮＡを含むラムダクローンを挿入し、３０℃で波
長６００ｎｍの吸光度が０．４になるまで培養を続け、
さらに、３７℃で１時間イソプロピル−β−Ｄ−チオ
ガラクトシド〔以下、ＩＰＴＧと略す。（１００μｇ／
ミリリットル）〕存在下で培養し、β−ガラクトシダー
ゼ−ＰＬＡＰ融合蛋白を誘導した。この培養液を遠心分
離して菌体を回収し、ＳＤＳサンプルバッファー〔ネイ
チャー（Nature) 、227 、680 、(1970)参照。〕に添加
して、凍結保存した。融合蛋白は、６重量％ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動によって分離した。融合蛋白を含
むバンドはＩＰＴＧの添加によって増加のみられること
及び抗メリチン抗体を用いたウエスタンブロッティング
法によって同定した。次に、同定されたバンドを切り出
してつぶし、実施例１と同様にしてメスのニュージーラ
ンド白ウサギに一回につき１００μｇずつ皮下注射し
た。最終免疫から５日後に採血し、血清５１ミリリット
ルを分離した。この血清を実施例１と同様にして、１６
ｍｇの抗組換えＰＬＡＰ抗体を得た。この抗体のＰＬＡ
Ｐに対する特異性を実施例２と同様にして測定した。得
られた結果を図３及び図４に示す。なお、図３は、サン
プルとしてＰＬＡＰを３０００Ｕ／ミリリットルとなる
ようにスタンダート血清に混合した溶液を用いた場合の
ＲＵの変化を示す図であり、図４はサンプルとしてスタ
ンダード血清を用いた場合のＲＵの変化を示す図であ
る。両図とも、縦軸にＲＵを、横軸に測定時間を示す。
ＡＰ融合蛋白抗体の調製） プロシージング オブ ナショナル アカデミー サイ
エンス(proceeding ofnational academy science)、8
8、5418 (1991) 記載の方法に従って、抗β−ガラクト
シダーゼ−ＰＬＡＰ融合蛋白抗体を調製した。まず、β
−ガラクトシダーゼ−ＰＬＡＰ融合蛋白を作製した。す
なわち、マウス滑筋細胞ＢＣ３Ｈ１〔アメリカン タイ
プ カルチャー コレクション(American Type Culture
Collection)より入手した。〕を１μＭのロイコトリエ
ンＤ4で２分間刺激した後、グアニジン イソシアネー
トを用いて細胞内のトータルＲＮＡを抽出した。ジーン
(Gene)、25、263 (1983)記載の方法に従って、ｃＤＮＡ
ライブラリーを作製し、作製したｃＤＮＡの両端にＥｃ
ｏＲＩリンカーを付けて、ラムダージーティー１１（λ
ｇｔ１１）ベクター〔ストラタジーン クローニング
システムズ(Stratagene Cloning Systems)社製〕に導入
し、ベクター ラボラトリーズより入手した抽出物を用
いてパッケイシングした。大腸菌Ｙ１０８９（ストラダ
ジーン クローニング システムズ社製）にこのＰＬＡ
ＰｃＤＮＡを含むラムダクローンを挿入し、３０℃で波
長６００ｎｍの吸光度が０．４になるまで培養を続け、
さらに、３７℃で１時間イソプロピル−β−Ｄ−チオ
ガラクトシド〔以下、ＩＰＴＧと略す。（１００μｇ／
ミリリットル）〕存在下で培養し、β−ガラクトシダー
ゼ−ＰＬＡＰ融合蛋白を誘導した。この培養液を遠心分
離して菌体を回収し、ＳＤＳサンプルバッファー〔ネイ
チャー（Nature) 、227 、680 、(1970)参照。〕に添加
して、凍結保存した。融合蛋白は、６重量％ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動によって分離した。融合蛋白を含
むバンドはＩＰＴＧの添加によって増加のみられること
及び抗メリチン抗体を用いたウエスタンブロッティング
法によって同定した。次に、同定されたバンドを切り出
してつぶし、実施例１と同様にしてメスのニュージーラ
ンド白ウサギに一回につき１００μｇずつ皮下注射し
た。最終免疫から５日後に採血し、血清５１ミリリット
ルを分離した。この血清を実施例１と同様にして、１６
ｍｇの抗組換えＰＬＡＰ抗体を得た。この抗体のＰＬＡ
Ｐに対する特異性を実施例２と同様にして測定した。得
られた結果を図３及び図４に示す。なお、図３は、サン
プルとしてＰＬＡＰを３０００Ｕ／ミリリットルとなる
ようにスタンダート血清に混合した溶液を用いた場合の
ＲＵの変化を示す図であり、図４はサンプルとしてスタ
ンダード血清を用いた場合のＲＵの変化を示す図であ
る。両図とも、縦軸にＲＵを、横軸に測定時間を示す。
【００３０】図３及び図４に示すように、従来の抗ＰＬ
ＡＰ抗体はＰＬＡＰとも結合する（図３）が、スタンダ
ート血清とも結合するため、ＰＬＡＰに特異的でないこ
とがわかる。
ＡＰ抗体はＰＬＡＰとも結合する（図３）が、スタンダ
ート血清とも結合するため、ＰＬＡＰに特異的でないこ
とがわかる。
【００３１】参考例２（抗ＰＬＡＰ抗体固定化プレート
の調製） ５０ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）に実施
例２で得られた抗ＰＬＡＰモノクローナル抗体を溶解
し、ＥＬＩＳＡプレート（コーイング社製）の各穴につ
き５０マイクロリットルずつ分注して２５℃で２時間放
置した。この液を除去した後、各穴に１．０重量％のＢ
ＳＡ及び０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭの
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を充満させ、２
５℃で１時間放置した。さらにこの液を除去し、０．２
重量％のトウイーン２０、０．２重量％のＢＳＡ及び
０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７．２）からなる洗浄液で各穴を
よく洗浄して抗ＰＬＡＰ抗体固定化プレートを作成し
た。
の調製） ５０ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）に実施
例２で得られた抗ＰＬＡＰモノクローナル抗体を溶解
し、ＥＬＩＳＡプレート（コーイング社製）の各穴につ
き５０マイクロリットルずつ分注して２５℃で２時間放
置した。この液を除去した後、各穴に１．０重量％のＢ
ＳＡ及び０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭの
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を充満させ、２
５℃で１時間放置した。さらにこの液を除去し、０．２
重量％のトウイーン２０、０．２重量％のＢＳＡ及び
０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７．２）からなる洗浄液で各穴を
よく洗浄して抗ＰＬＡＰ抗体固定化プレートを作成し
た。
【００３２】参考例３（ＨＲＰ標識ＰＬＡＰの調製） ＨＲＰ（ベーリンガーマンハイム社製）１０ｍｇを１．
２５重量％のグルタルアルデヒド０．２ミリリットルに
溶かし、室温（２６℃）で一晩反応させた後、０．１４
ＭのＮａＣｌに対して透析してＨＲＰに結合していない
グルタルアルデヒドを除いた。透析内液を取り出し、
０．１４ＭのＮａＣｌを加えて１ミリリットルにし、こ
れに、配列表に示されたアミノ酸配列のＰＬＡＰ合成ペ
プチド５ｍｇを１ミリリットルの０．１４ＭのＮａＣｌ
に溶解した溶液を加え、直ちに１Ｍの炭酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ９．５）を０．２ミリリットリル加えてよく
攪拌し、４℃で一晩反応させた。これに、１Ｍのリジン
を０．１Ｍになるように加えた後、４℃で２時間反応さ
せて、グルタルアルデヒドの未反応のアルデヒド基をブ
ロックした。この溶液をＰＢＳに透析してＨＲＰ標識Ｐ
ＬＡＰを調製した。
２５重量％のグルタルアルデヒド０．２ミリリットルに
溶かし、室温（２６℃）で一晩反応させた後、０．１４
ＭのＮａＣｌに対して透析してＨＲＰに結合していない
グルタルアルデヒドを除いた。透析内液を取り出し、
０．１４ＭのＮａＣｌを加えて１ミリリットルにし、こ
れに、配列表に示されたアミノ酸配列のＰＬＡＰ合成ペ
プチド５ｍｇを１ミリリットルの０．１４ＭのＮａＣｌ
に溶解した溶液を加え、直ちに１Ｍの炭酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ９．５）を０．２ミリリットリル加えてよく
攪拌し、４℃で一晩反応させた。これに、１Ｍのリジン
を０．１Ｍになるように加えた後、４℃で２時間反応さ
せて、グルタルアルデヒドの未反応のアルデヒド基をブ
ロックした。この溶液をＰＢＳに透析してＨＲＰ標識Ｐ
ＬＡＰを調製した。
【００３３】実施例３（ＰＬＡＰ測定用試薬の調製） 参考例２で作製した抗ＰＬＡＰ抗体を固定化したＥＬＩ
ＳＡプレートに、標準として精製したＰＬＡＰ１００，
０００Ｕ／ミリリットルを１０倍ずつ１０5 倍まで希釈
した溶液を５０マイクロリットル加え、参考例３で作製
した１μｇ／ミリリットルのＨＲＰ標識ＰＬＡＰ５０マ
イクロリットルを添加して、２５℃で１時間反応させた
後、よく洗浄し、ＨＲＰ発色試薬〔ケーピーエル（ＫＰ
Ｌ）社製〕５０マイクロリットルを加えて、さらに２０
分間反応させた後、１０重量％のＳＤＳ５０マイクロリ
ットルを添加して反応を停止させ、４１５ｎｍにおける
吸光度を測定して、検量線を作成した。この測定結果を
図５に示す。図５は、本発明のハイブリドーマ「ＡＰＡ
−２１」（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３８６）が産生した抗Ｐ
ＬＡＰ抗体を含有する試薬を使用したときの検量線を示
す図であり、縦軸に４１５ｎｍにおける吸光度を、横軸
にＰＬＡＰの量を示している。
ＳＡプレートに、標準として精製したＰＬＡＰ１００，
０００Ｕ／ミリリットルを１０倍ずつ１０5 倍まで希釈
した溶液を５０マイクロリットル加え、参考例３で作製
した１μｇ／ミリリットルのＨＲＰ標識ＰＬＡＰ５０マ
イクロリットルを添加して、２５℃で１時間反応させた
後、よく洗浄し、ＨＲＰ発色試薬〔ケーピーエル（ＫＰ
Ｌ）社製〕５０マイクロリットルを加えて、さらに２０
分間反応させた後、１０重量％のＳＤＳ５０マイクロリ
ットルを添加して反応を停止させ、４１５ｎｍにおける
吸光度を測定して、検量線を作成した。この測定結果を
図５に示す。図５は、本発明のハイブリドーマ「ＡＰＡ
−２１」（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３８６）が産生した抗Ｐ
ＬＡＰ抗体を含有する試薬を使用したときの検量線を示
す図であり、縦軸に４１５ｎｍにおける吸光度を、横軸
にＰＬＡＰの量を示している。
【００３４】この図より、本発明の抗体を用いると、Ｐ
ＬＡＰを正確に定量できることがわかる。
ＬＡＰを正確に定量できることがわかる。
【００３５】
【発明の効果】本発明の抗ＰＬＡＰ抗体は、ヒトの滑液
中からＰＬＡＰを多量に採取することを必要とせず、か
つ、ＰＬＡＰに特異性に結合するため、ＰＬＡＰを正確
に定量することができる。また、本発明のハイブリドー
マは、ＰＬＡＰに特異的に結合する抗ＰＬＡＰモノクロ
ーナル抗体を産生することができる。さらに、本発明の
抗ＰＬＡＰ抗体を含有する測定用試薬及び測定方法は、
ＰＬＡＰに特異的に結合する抗ＰＬＡＰ抗体を用いるた
め、ＰＬＡＰを簡便、短時間かつ正確に定量し、リウマ
チの診断や病態把握を正確に行うことができる。
中からＰＬＡＰを多量に採取することを必要とせず、か
つ、ＰＬＡＰに特異性に結合するため、ＰＬＡＰを正確
に定量することができる。また、本発明のハイブリドー
マは、ＰＬＡＰに特異的に結合する抗ＰＬＡＰモノクロ
ーナル抗体を産生することができる。さらに、本発明の
抗ＰＬＡＰ抗体を含有する測定用試薬及び測定方法は、
ＰＬＡＰに特異的に結合する抗ＰＬＡＰ抗体を用いるた
め、ＰＬＡＰを簡便、短時間かつ正確に定量し、リウマ
チの診断や病態把握を正確に行うことができる。
配列の長さ：２１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Glu Ser Pro Leu Ile Ala Lys Val Leu Thr Thr Glu Pro Pro Ile Ile Thr Pro 1 5 10 15 Val Arg Arg 20
【図１】本発明のハイブリドーマ「ＡＰＡ−２１」（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−４３８６）が産生した抗ＰＬＡＰ抗体と
ＰＬＡＰの結合による共鳴シグナルの変化を示す図であ
る。
ＥＲＭ ＢＰ−４３８６）が産生した抗ＰＬＡＰ抗体と
ＰＬＡＰの結合による共鳴シグナルの変化を示す図であ
る。
【図２】本発明のハイブリドーマ「ＡＰＡ−２１」（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−４３８６）が産生した抗ＰＬＡＰ抗体と
スタンダード血清の結合による共鳴シグナルの変化を示
す図である。
ＥＲＭ ＢＰ−４３８６）が産生した抗ＰＬＡＰ抗体と
スタンダード血清の結合による共鳴シグナルの変化を示
す図である。
【図３】従来の抗ＰＬＡＰ抗体とＰＬＡＰの結合による
共鳴シグナルの変化を示す図である。
共鳴シグナルの変化を示す図である。
【図４】従来の抗ＰＬＡＰ抗体とスタンダード血清の結
合による共鳴シグナルの変化を示す図である。
合による共鳴シグナルの変化を示す図である。
【図５】本発明のハイブリドーマ「ＡＰＡ−２１」（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−４３８６）が産生した抗ＰＬＡＰ抗体を
含有する試薬を使用したときの検量線を示す図である。
ＥＲＭ ＢＰ−４３８６）が産生した抗ＰＬＡＰ抗体を
含有する試薬を使用したときの検量線を示す図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/573 Ｚ 33/577 Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＢＧ Ｎ Ｃ１２Ｎ 15/02 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 鈴木 直生 京都府宇治市宇治小桜23番地 ユニチカ株 式会社中央研究所内
Claims (5)
- 【請求項１】 抗原がヒトホスホリパーゼエイツー活性
化蛋白質に特異的なアミノ酸配列部位を合成したペプチ
ドで、そのアミノ酸配列が、配列表に示されたアミノ酸
配列であることを特徴とする抗ヒトホスホリパーゼエイ
ツー活性化蛋白質抗体。 - 【請求項２】 抗体がモノクローナル抗体である請求項
１記載の抗体。 - 【請求項３】 請求項２記載の抗体を産生するハイブリ
ドーマ。 - 【請求項４】 請求項１記載の抗体を含有することを特
徴とするヒトホスホリパーゼエイツー活性化蛋白質の測
定用試薬。 - 【請求項５】 請求項４記載の試薬を使用することを特
徴とするヒトホスホリパーゼエイツー活性化蛋白質の測
定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5353156A JPH07196699A (ja) | 1993-12-28 | 1993-12-28 | 抗ヒトホスホリパーゼエイツー活性化蛋白質抗体とこの抗体を産生するハイブリドーマ、並びにこの抗体を用いたヒトホスホリパーゼエイツー活性化蛋白質の測定用試薬及び測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5353156A JPH07196699A (ja) | 1993-12-28 | 1993-12-28 | 抗ヒトホスホリパーゼエイツー活性化蛋白質抗体とこの抗体を産生するハイブリドーマ、並びにこの抗体を用いたヒトホスホリパーゼエイツー活性化蛋白質の測定用試薬及び測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07196699A true JPH07196699A (ja) | 1995-08-01 |
Family
ID=18428947
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5353156A Pending JPH07196699A (ja) | 1993-12-28 | 1993-12-28 | 抗ヒトホスホリパーゼエイツー活性化蛋白質抗体とこの抗体を産生するハイブリドーマ、並びにこの抗体を用いたヒトホスホリパーゼエイツー活性化蛋白質の測定用試薬及び測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07196699A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5786154A (en) * | 1990-12-06 | 1998-07-28 | Bomalaski; John S. | Human phospholipase activating protein and methods for diagnosis of rheumatoid arthritis |
-
1993
- 1993-12-28 JP JP5353156A patent/JPH07196699A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5786154A (en) * | 1990-12-06 | 1998-07-28 | Bomalaski; John S. | Human phospholipase activating protein and methods for diagnosis of rheumatoid arthritis |
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