KR20050008858A - 부자극 신호 전달 분자 에이아이엘아이엠에 대한 인간모노클로날 항체 및 그의 약학적 용도 - Google Patents

부자극 신호 전달 분자 에이아이엘아이엠에 대한 인간모노클로날 항체 및 그의 약학적 용도 Download PDF

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Abstract

항원으로서 AILIM 분자를 사용하여, 유전 공학 기법으로 생산시킨 인간 항체-생산 트랜스제닉 마우스를 면역시켜, AILIM에 결합할 수 있고 AILIM-매개된 부자극 신호(2 차 신호) 전달과 관련된 다양한 생물학적 반응들(예를 들어, 세포 증식, 시토킨 생산, 면역 세포용해, 세포 사멸, ADCC의 유발 등)을 조절할 수 있는 다양한 인간 모노클로날 항체를 제조하였다. 더욱 또한, 상기 인간 모노클로날 항체는 AILIM-매개된 부자극 신호 전달과 관련된 다양한 질환들을 치료 및 예방하는데 효과적이며, 상기 질환의 개시 및/또는 진행을 억제할 수 있는 것으로 나타났다.

Description

부자극 신호 전달 분자 에이아이엘아이엠에 대한 인간 모노클로날 항체 및 그의 약학적 용도{HUMAN MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST A COSTIMULATORY SIGNAL TRANSDUCTION MOLECULE AILIM AND PHARMACEUTICAL USE THEREOF}
본 발명은 AILIM[활성화 유도 림프구 면역조절 분자, 또한 ICOS(유도 가능한 부자극 인자)라고도 칭함]에 결합하는 인간 항체; AILIM에 결합하는 인간 모노클로날 항체(monoclonal antibody) 또는 그의 일부; 상기 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부를 암호화하는 DNA, 또는 상기 DNA의 일부; 상기 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부를 생산하는 세포(유전자 재조합 세포 포함); 상기 유전자 재조합 세포에 의해 생산되는 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부; 상기 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부를 포함하는 약학 조성물; 지연성 알레르기와 관련된 질환의 치료를 위한 AILIM에 대한 항체를 포함하는 약학 조성물; AILIM 또는 AILIM 리간드에 결합하는 물질의 동정, 정량화 또는 분석 방법; 및 상기 방법에 사용되는 키트에 관한 것이다.
포유동물의 생체는 상기 생체에 침입한 병원성 미생물(바이러스, 세균, 기생충 등) 또는 이물(이들은 모두 이후에 “항원”이라 칭해진다)을 차단하는 면역 반응 시스템들을 갖는다. 이들 중 하나를 선천성 면역 반응 시스템이라 하고, 또 다른 것은 후천성 면역 반응 시스템이라 한다. 전자는 식세포(다형핵 백혈구, 단핵세포, 대식세포 등)에 의한 식작용, 자연 살(NK) 세포에 의한 공격, 및 보체에 의한 항원의 옵소닌 작용과 같은 비-특이적인 인식을 포함한 차단 기전이다. 후자인 후천성 면역 반응 시스템은 항원에 대한 특이성을 습득한 림프구(주로 T 세포 및 B 세포)(즉, 활성화된 림프구)에 의한 차단 기전이다. 항원 특이성을 습득한 B 세포는 상기 항원에 대해 특이적인 항체의 생산을 통해 세포의 밖에 존재하는 항원을 공격한다. 항원 특이성을 습득한 T 세포(즉, 활성화된 T 세포)는 보조 T 세포와 세포독성 T 세포(세포독성 림프구, CTL)로 분류된다. 상기 보조 T 세포는 B 세포의 분화와 항체의 생산을 조절하며, 식세포와 협력하는 항원을 파괴한다. 후자인 CTL은 단독으로 바이러스-감염된 세포 등을 공격한다(Experimental Medicine: SUPPLEMENT, "Bio Science Term Library, Immunity", Yodosha, pp. 14-17(1995)).
T 세포에 의한 이러한 항원 특이성의 습득(즉, T 세포의 활성화)은, 항원-제공 세포(APC), 예를 들어 대식세포, B 세포 또는 수지상 세포에 의해 제공되는 항원의 상기 T 세포에 의한 인식을 통해 개시된다. 항원-제공 세포는 상기와 같이 결합된 항원을 분석하고 이렇게 분석된 항원들을 주 조직 적합 복합체(MHC)에 결합시킴으로써 제공한다. T 세포는 세포막 표면에 존재하는 T 세포 수용체(TcR)와 CD3 항원간의 복합체(TcR/CD3 복합체)를 통해 항원-제공 세포에 의해 제공된 분석된 항원을 인식함으로써 세포의 활성화(또는 특이성의 습득)에 대한 1 차 신호를받는다.
그러나, 상기 TcR/CD3 복합체-매개된 1 차 신호는 단독으로 T 세포를 충분히 활성화시킬 수 없어 불응답 또는 클론 아네르기(clonal anergy)를 일으키며, 따라서 상기 세포는 그 후에 받은 어떠한 자극에도 반응할 수 없다. T 세포가 활성화되고, 항원 특이적인 T 세포 클론으로 분화하고 증식하는데 인터류킨 2(IL-2)의 자기활성화가 필요하다. 클론 아네르기에서, IL-2이 생산되지 않고 세포 분활이 없기 때문에 T세포가 불활성된다. 즉, IL-2와 같은 시토킨의 생산에 의해 수반되는 T 세포의 활성화는 TcR/CD3 복합체를 통한 상기 1 차 신호에 따른 2 차 신호를 요구한다. 이러한 2 차 신호를 부(부(副)자극(costimulatroy) 신호라 칭한다.
T 세포는, T 세포 표면상의 TcR/CD3 복합체 이외의 분자를 통해 항원-제공 세포 상의 MHC 이외의 분자와 상호 작용(세포 유착)함으로써, 이러한 2 차 신호를 받아 이를 상기 세포로 전달한다. 이러한 2 차 신호는 세포 아네르기(클론 아네르기)를 피하며 세포를 활성화시킨다.
상기 항원-제공 세포와 T 세포와 같은 림프구 간의 2 차 신호 전달 기전 중 일부 부분이 아직 상세히 밝혀지지 않았지만, 지금까지의 연구는 상기 2 차 신호 전달에 중요한 인자가 CD28(또한 Tp44, T44 또는 9.3 항원이라 명명되며, T 세포와 흉선 세포 상에서 주로 발현되는 세포 표면 분자이다)과 CD80[또한 B7-1, B7, BB1 또는 B7/BB1이라 명명되며, 항원-제공 세포(대식세포, 단핵세포, 수지상 세포 등) 상에서 발현되는 세포 표면 분자이다] 및 CD86(또한 B7-2 또는 B70이라 명명되며, 항원-제공 세포 상의 세포 표면 분자이다)과의 상호 작용(즉, 이들 분자들 간의 결합을 통한 세포 유착)임을 밝혀내었다. 더욱 또한, 세포용해성 T 림프구 관련 항원 4(CTLA-4)(그의 발현은 2 차 신호에 따라 향상되는 것으로 생각된다)와 CD80(B7-1) 및 CD86(B7-2)의 상호 작용(즉, 이들 분자들 간의 결합을 통한 세포 유착)이 또한 2 차 신호에 의한 T 세포 활성화의 조절에서 중요한 역할을 함이 실험적으로 밝혀졌다. 즉, 2 차 신호의 전달에 의한 T 세포 활성화의 조절은 최소한 CD28과 CD80/CD86간의 상호작용, CTLA-4 발현의 향상(상기 상호작용에 따라 변하는 것으로 생각된다), 및 CTLA-4와 CD80/CD86간의 상호작용을 포함한다.
CD28은 T 세포의 활성화 및 아네르기의 회피에 요구되는 2 차 신호(부자극 신호)를 전달하는 부자극 분자인 것으로 공지되어 있다. 상기 분자를 항원-제공 세포 상의 부자극 분자, CD80(B7-1) 및 CD86(B7-2)에 결합시킴으로써 전달되는 2 차 신호(이들 분자들간의 결합을 통한 세포 유착)는 Th1-유형 시토킨의 mRNA를 안정화시키며, 결과적으로 다량의 Th1-유형 시토킨, 예를 들어 IL-2, IFNγ 및 TNFα의 T 세포에 의한 생산을 촉진한다. CTLA-4의 발현은 TcR/CD3를 통해 전달되는 1 차 신호에 의해 유도되며, 상기 발현은 또한 CD28과 CD80간의 결합에 의해 전달되는 2 차 신호에 의해 향상된다. CTLA-4가 이들 신호를 받아 T 세포 기능을 억제하는 작용을 함이 밝혀지고 있으며, 이러한 작용은 CD28에 의해 전달되는 2 차 신호에 의한 T 세포의 활성화와 상반된다.
인간 CD28 및 CTLA-4는 분자량이 각각 44 kD 및 41 내지 43 kD인 I 형 당단백질이다. 이들은 모두 면역글로불린 슈퍼패밀리(superfamily)에 속하는 면역글로불린-형 도메인(immunoglobulin-like domain)을 가지며, 세포 유착 분자로서의기능과 신호 전달 분자로서의 기능을 모두 갖는다.
인간 CD28은 디설파이드 결합을 갖는 동형이량체를 형성하는 반면, CTLA-4는 단량체로서 존재한다. CD28과 CTLA-4 유전자는 모두 인간 염색체상의 "2q33"과 마우스 염색체 상의 "1C"에 위치하며, 4 개의 엑손으로 구성된다. 인간 CD28과 CTLA-4는 리더 서열을 포함하여 각각 220 및 223 개의 아미노산으로 구성되며, 이들간의 아미노산 상동성은 20 내지 30%이다.
CD28과 CTLA-4에 대한 리간드는 인간과 마우스에서 CD80(B7-1) 및 CD86(B7-2)이다. CTLA-4는 상기 두 리간드에 대해 CD28 보다 약 20 배 높은 친화성을 갖는다. 동물 종들을 통해 보존되는 아미노산 서열 구조 "MYPPPY(Met-Tyr-Pro-Pro-Pro-Tyr)"는 CD80(B7-1)에 대한 CD28 및 CTLA-4의 결합에 중요한 것으로 밝혀졌다. CD28이 자극되면, PI3 키나제(포스포이노시티드 3 키나제, PI3K)가 CD28의 부분 서열 "YMNM(Tyr-Met-Asn-Met)" 중의 인산화된 티로신 잔기와 회합하고, CD28은 이러한 "YxxM" 구조를 통한 세포 내 신호 전달에 중요한 역할을 함이 또한 보고되었다. 더욱 또한, CTLA-4가 그의 세포질 영역에 "YxxM", 즉 "YVKM(Tyr-Val-Lys-Met)"으로 나타내는 서열을 또한 가지며, 자극을 받은 후에 SYP가 상기 서열과 회합함이 보고되었다.
CD28은 흉선 세포와 말초 혈 T 세포에서 특이적으로 발현되며, CTLA-4는 활성화된 T 세포에서 특이적으로 발현된다(Cell Engineering: SUPPLEMENT, "Handbook of Adhesion Molecule", Shujunsha, pp. 93-102(1994); 동일 문헌 중, pp. 120-136; Experimental Medicine: SUPPLEMENT, "BIO SCIENCE Term Library, Immunity",Yodosha, pp. 94-98(1995); Experimental Medicine: SUPPLEMENT, "BIOSCIENCE Term Library, Intracellular Signal Transduction", Yodosha, pp. 58-59(1997); Nihon Rinsho, Vol.55, No. 6, pp. 215-220(1997)).
따라서 T 세포 기능의 조절(T 세포 기능의 활성화 및 억제)에서, 여러 분자들, 예를 들어 부자극 분자(CD28, CD80(B7-1), CD86(B7-2) 등) 및 CTLA-4(상기 분자들과 협력한다)간의 상호작용의 중요성이 인식되었으며, 이는 상기 분자들과 질병들간의 관계, 및 상기 분자들의 기능 조절에 의한 질병의 치료에 주목을 끌게 하였다.
상술한 바와 같이, 생체는 상기 생체(자신)에 이물인 항원에 대해 그의 후천성 면역 반응 시스템을 활성화시키지만, 또한 그 자신의 성분(자기항원)에 대해서는 면역 반응을 보이지 않기 위해서 면역 내성을 갖는다. 면역 내성이 어떤 이유로 인해 파괴되는 경우, 자기항원에 대한 면역 반응이 일어나며, 자기항원-반응성 T 세포가 상기 언급한 바와 동일한 기전에 의해 유도되어 비정상적인 상태의 면역성으로 되고, 각종 자기면역 질환들이 발생한다.
즉, 정상적인 조직에서 비-자극된 항원 제공 세포(APC)는 생체의 면역 시스템이 정상인 경우 부자극 분자를 발현시키지 않으므로, 자기항원과 반응하는 자기항원-반응성 T 세포가 존재하더라도 상기 T 세포는 불응답 상태로 면역 내성을 유지시킨다. 비정상적인 면역 상태에서, 비정상적으로 과잉이면서 연속적인 부자극 분자의 발현으로 인해 보다 많은 자기항원-반응성 T 세포가 활성화되어 자기면역 질환을 일으킴이 제시되었다.
최근의 상기와 같은 관점으로부터, 부자극 신호의 전달, 예를 들어 상기 언급한 CD28/CTLA-4와 CD80/CD86간의 신호 전달을 조절함으로써 각종 자기면역 질환들을 치료하고자 하는 시도들이 많이 제안되고 있다.
상기와 같은 시도를 한 결과, 아직 부자극 분자와 관련 분자들간의 상호작용에 의한 T 세포 활성화의 기전을 상세하게 명백히 설명하지는 못하고 있다. 다른 미지의 분자들이 이러한 기전에 연루될 수 있다.
최근에, 상술한 "CD28" 및 "CTLA-4"와 같은 신규의 부자극 분자가 동정되었으며, 상기 분자는 T 세포와 같은 림프구의 활성화에 필수적인 2차 신호(상호작용 신호)의 전달, 및 활성화된 T 세포와 같은 활성화된 림프구의 2 차 신호와 커플링되는 기능 조절을 수행하는 것으로 생각된다. 상기 분자를 AILIM(활성화 유도 림프구 면역조절 분자)(인간, 마우스 및 래트에서: Int. Immunol., Vol. 12, No. 1, p. 51-55, 2000)[또한 ICOS(유도 가능한 부자극 인자)라고도 칭함](인간에서: Nature, Vol. 397, No. 6716, p. 263-266, 1999)]으로 나타내었다.
다른 한편으로, 상기 부자극 전달 분자 AILIM(ICOS)과 상호작용하는 리간드(AILIM 리간드)인, B7h, B7RP-1, GL50 또는 LICOS라 칭하는 신규의 분자들이 매우 최근에 동정되었다(Nature. Vol. 402, No. 6763, pp. 827-832, 1999; Nature Medicine. vol. 5, No. 12, pp. 1365-1369, 1999; J. Immunology, Vol. 164, pp. 1653-1657, 2000; Curr. Biol., Vol. 10, No. 6, pp. 333-336, 2000).
T 세포와 같은 림프구의 상기 활성화 및 활성화된 T 세포 기능의 조절에 필수적인 부자극 신호의 신호 전달 경로로서, 이들 두 종류의 신규 분자, 즉AILIM(ICOS) 및 B7RP-1(B7h, GL50, LICOS)의 동정에 의해, CD28과 CD80(B7-1)/CD86(B7-2), 및 CTLA4와 CD80(B7-1)/CD86(B7-2)간의 이미 공지된 전달 경로들인 기지의 첫 번째 및 두 번째 신호 경로들 외에, AILIM(ICOS)과 B7RP-1(B7h, GL50, LICOS)간의 상호작용에 의한 신규의 세 번째 경로가 존재함이 밝혀졌다.
이들 신규 분자들의 생물학적 기능, 상기 분자들에 의한 세 번째 부자극 신호 전달을 통한 T 세포와 같은 림프구의 기능 조절, 및 상기 신규의 신호 전달과 질병들간의 관계에 대한 연구들이 진행중이다(J. Immunol., 166(1), pp. 1, 2001; J. Immunol., 165(9), pp. 5035, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun., 276(1), pp. 335, 2000; Immunity, 13(1), pp. 95, 2000; J. Exp. Med., 192(1), pp. 53, 2000; Eur. J. Immunol., 30(4), pp. 1040, 2000; WO 01/15732).
구체적으로, 본 발명의 목적은 T 세포와 같은 림프구의 활성화에 필수적인 2 차 신호[부(부(副)자극(costimulatory) 신호]를 전달하고, 상기 신호에 의해 작용함으로써 활성화된 T 세포와 같은 활성화된 림프구의 기능을 조절하는 분자로서 고려되는, "CD28" 및 "CTLA-4"와 같은 신규 분자 AILIM의 생물학적 기능을 밝히고; AILIM의 발현과 질병간의 관계를 밝히고; AILIM의 발현 패턴에 의존하는 각종 질환들의 발병을 억제하거나, 의학적 및 약학적 방법(예를 들어, 모노클로날 항체 및 저 분자 화합물과 같은 약물)을 사용하여 상기 AILIM의 생물학적 기능을 조절함으로써 상기 질환들을 치료하는 방법 및 약제를 제공하는 것이다.
도 1은 유식 세포 측정기를 사용하여 세포 ELISA에 의해 분석된, 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체에 대한 항-인간 IgG 항체, 항-인간 Igκ 항체 및 항-인간 IgFc 항체의 각각의 반응성을 나타낸다.
패널 (a) 내지 (l)은 하기 나타내는 분석에 대한 각각의 결과를 나타낸다.
패널 (a): 2 차 항체로서 비오틴-표지된 항-인간 IgG 항체를 1 차 항체의 부재 하에서 야생형 HPB-ALL 세포가 도말된 미세플레이트에 부가한 분석의 결과.
패널 (b): 2 차 항체로서 비오틴-표지된 항-인간 Igκ 항체를 1 차 항체의 부재 하에서 야생형 HPB-ALL 세포가 도말된 미세플레이트에 부가한 분석의 결과.
패널 (c): 2 차 항체로서 비오틴-표지된 항-인간 IgFc 항체를 1 차 항체의 부재 하에서 야생형 HPB-ALL 세포가 도말된 미세플레이트에 부가한 분석의 결과.
패널 (d): 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab-136을 1 차 항체로서 사용하고 비오틴-표지된 항-인간 IgG 항체를 2 차 항체로서 사용한 분석의 결과.
패널 (e): 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab-136을 1 차 항체로서 사용하고 비오틴-표지된 항-인간 Igκ 항체를 2 차 항체로서 사용한 분석의 결과.
패널 (f): 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab-136을 1 차 항체로서 사용하고 비오틴-표지된 항-인간 IgFc 항체를 2 차 항체로서 사용한 분석의 결과.
패널 (g): 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab-138을 1 차 항체로서 사용하고 비오틴-표지된 항-인간 IgG 항체를 2 차 항체로서 사용한 분석의 결과.
패널 (h): 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab-138을 1 차 항체로서 사용하고 비오틴-표지된 항-인간 Igκ 항체를 2 차 항체로서 사용한 분석의 결과.
패널 (i): 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab-138을 1 차 항체로서 사용하고 비오틴-표지된 항-인간 IgFc 항체를 2 차 항체로서 사용한 분석의 결과.
패널 (j): 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab-139를 1 차 항체로서 사용하고 비오틴-표지된 항-인간 IgG 항체를 2 차 항체로서 사용한 분석의 결과.
패널 (k): 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab-139를 1 차 항체로서 사용하고 비오틴-표지된 항-인간 Igκ 항체를 2 차 항체로서 사용한 분석의 결과.
패널 (l): 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab-139를 1 차 항체로서 사용하고 비오틴-표지된 항-인간 IgFc 항체를 2 차 항체로서 사용한 분석의 결과.
각 패널의 흰 곡선(curve with open symbol)은 인간 항-KLH 모노클로날 항체를 대조용 항체로서 사용한 분석의 결과에 해당한다.
도 2는 항-인간 IgG 항체를 사용한 샌드위치 ELISA에 의해 분석된, 인간 IgG 모노클로날 항체(표준 물질)에 대한 보정 곡선(calibration curve)을 나타낸다.
수직 축은 형광 강도를 가리키고, 수평 축은 표준 물질의 농도를 가리킨다.
도 3은 인간 AILIM-고발현(overexpressing) 재조합 CHO 세포 또는 야생형CHO 세포에 대한 다양한 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 결합 활성을 나타낸다.
수직 축은 재조합 세포에 대한 결합 활성 지수로서의 형광 강도를 가리키고, 수평 축은 부가된 항체의 농도를 가리킨다.
도면에서 "CHO"란 용어는 야생형 CHO 세포에 대한 결합 분석의 결과를 가리키고, "인간"은 인간 AILIM-고발현 재조합 CHO 세포에 대한 결합 분석의 결과를 가리킨다.
도 4는 음성 대조군으로서 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 또는 인간 항-KLH 모노클로날 항체의 인간 AILIM-고발현 재조합 CHO 세포 또는 야생형 CHO 세포에 대한 결합 활성을 나타낸다.
수직 축은 재조합 세포에 대한 결합 활성 지수로서의 형광 강도를 가리키고, 수평 축은 부가된 항체의 농도를 가리킨다.
도면에서 "CHO"란 용어는 야생형 CHO 세포에 대한 결합 분석의 결과를 가리키고, "인간"은 인간 AILIM-고발현 재조합 CHO 세포에 대한 결합 분석의 결과를 가리킨다.
도 5는 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 인간 AILIM-고발현 재조합 CHO 세포 또는 야생형 CHO 세포에 대한 결합 활성을 나타낸다.
수직 축은 재조합 세포에 대한 결합 활성 지수로서의 형광 강도를 가리키고, 수평 축은 부가된 항체의 농도를 가리킨다.
도면에서 "CHO"란 용어는 야생형 CHO 세포에 대한 결합 분석의 결과를 가리키고, "인간"은 인간 AILIM-고발현 재조합 CHO 세포에 대한 결합 분석의 결과를 가리킨다.
도 6은 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 인간 AILIM-고발현 재조합 CHO 세포 또는 야생형 CHO 세포에 대한 결합 활성을 나타낸다.
수직 축은 재조합 세포에 대한 결합 활성 지수로서의 형광 강도를 가리키고, 수평 축은 부가된 항체의 농도를 가리킨다.
도면에서 "CHO"란 용어는 야생형 CHO 세포에 대한 결합 분석의 결과를 가리키고, "인간"은 인간 AILIM-고발현 재조합 CHO 세포에 대한 결합 분석의 결과를 가리킨다.
도 7은 래트 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 마우스 AILIM-고발현 재조합 CHO 세포 또는 야생형 CHO 세포에 대한 결합 활성을 나타낸다.
수직 축은 재조합 세포에 대한 결합 활성 지수로서의 형광 강도를 가리키고, 수평 축은 부가된 항체의 농도를 가리킨다.
도면에서 "CHO"란 용어는 야생형 CHO 세포에 대한 결합 분석의 결과를 가리키고, "마우스"는 마우스 AILIM-고발현 재조합 CHO 세포에 대한 결합 분석의 결과를 가리킨다.
도 8은 음성 대조군으로서 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 또는 인간 항-KLH 모노클로날 항체의 마우스 AILIM-고발현 재조합 CHO 세포 또는 야생형 CHO 세포에 대한 결합 활성을 나타낸다.
수직 축은 재조합 세포에 대한 결합 활성 지수로서의 형광 강도를 가리키고,수평 축은 부가된 항체의 농도를 가리킨다.
도면에서 "CHO"란 용어는 야생형 CHO 세포에 대한 결합 분석의 결과를 가리키고, "마우스"는 마우스 AILIM-고발현 재조합 CHO 세포에 대한 결합 분석의 결과를 가리킨다.
도 9는 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 마우스 AILIM-고발현 재조합 CHO 세포 또는 야생형 CHO 세포에 대한 결합 활성을 나타낸다.
수직 축은 재조합 세포에 대한 결합 활성 지수로서의 형광 강도를 가리키고, 수평 축은 부가된 항체의 농도를 가리킨다.
도면에서 "CHO"란 용어는 야생형 CHO 세포에 대한 결합 분석의 결과를 가리키고, "마우스"는 마우스 AILIM-고발현 재조합 CHO 세포에 대한 결합 분석의 결과를 가리킨다.
도 10은 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 마우스 AILIM-고발현 재조합 CHO 세포 또는 야생형 CHO 세포에 대한 결합 활성을 나타낸다.
수직 축은 재조합 세포에 대한 결합 활성 지수로서의 형광 강도를 가리키고, 수평 축은 부가된 항체의 농도를 가리킨다.
도면에서 "CHO"란 용어는 야생형 CHO 세포에 대한 결합 분석의 결과를 가리키고, "마우스"는 마우스 AILIM-고발현 재조합 CHO 세포에 대한 결합 분석의 결과를 가리킨다.
도 11은 다양한 마우스 항-래트 AILIM 모노클로날 항체의 래트 AILIM-고발현 재조합 CHO 세포 또는 야생형 CHO 세포에 대한 결합 활성을 나타낸다.
수직 축은 재조합 세포에 대한 결합 활성 지수로서의 형광 강도를 가리키고, 수평 축은 부가된 항체의 농도를 가리킨다.
도면에서 "CHO"란 용어는 야생형 CHO 세포에 대한 결합 분석의 결과를 가리키고, "래트"는 래트 AILIM-고발현 재조합 CHO 세포에 대한 결합 분석의 결과를 가리킨다.
도 12는 음성 대조군으로서 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 또는 인간 항-KLH 모노클로날 항체의 래트 AILIM-고발현 재조합 CHO 세포 또는 야생형 CHO 세포에 대한 결합 활성을 나타낸다.
수직 축은 재조합 세포에 대한 결합 활성 지수로서의 형광 강도를 가리키고, 수평 축은 부가된 항체의 농도를 가리킨다.
도면에서 "CHO"란 용어는 야생형 CHO 세포에 대한 결합 분석의 결과를 가리키고, "래트"는 래트 AILIM-고발현 재조합 CHO 세포에 대한 결합 분석의 결과를 가리킨다.
도 13은 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 래트 AILIM-고발현 재조합 CHO 세포 또는 야생형 CHO 세포에 대한 결합 활성을 나타낸다.
수직 축은 재조합 세포에 대한 결합 활성 지수로서의 형광 강도를 가리키고, 수평 축은 부가된 항체의 농도를 가리킨다.
도면에서 "CHO"란 용어는 야생형 CHO 세포에 대한 결합 분석의 결과를 가리키고, "래트"는 래트 AILIM-고발현 재조합 CHO 세포에 대한 결합 분석의 결과를 가리킨다.
도 14는 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 래트 AILIM-고발현 재조합 CHO 세포 또는 야생형 CHO 세포에 대한 결합 활성을 나타낸다.
수직 축은 재조합 세포에 대한 결합 활성 지수로서의 형광 강도를 가리키고, 수평 축은 부가된 항체의 농도를 가리킨다.
도면에서 "CHO"란 용어는 야생형 CHO 세포에 대한 결합 분석의 결과를 가리키고, "래트"는 래트 AILIM-고발현 재조합 CHO 세포에 대한 결합 분석의 결과를 가리킨다.
도 15는 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체와 함께 항-인간 CD3 모노클로날 항체로 코팅된 미세플레이트를 사용하는 다양한 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체에 의한 부자극 신호 전달 활성에 대한 분석에서 보통의 건강한 사람인 "공여자 A"로부터의 T 세포의 증식 활성을 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 정도의 지수로서 [3H]티미딘의 세포 삽입량을 가리키고, 수평 축은 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 농도를 가리킨다.
도 16은 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체와 함께 항-인간 CD3 모노클로날 항체로 코팅된 미세플레이트를 사용하는 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체에 의한 부자극 신호 전달 활성에 대한 분석에서 보통의 건강한 사람인 "공여자 A"로부터의 T 세포의 증식 활성을 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 정도의 지수로서 [3H]티미딘의 세포 삽입량을 가리키고, 수평 축은 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 농도를 가리킨다.
도 17은 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체와 함께 항-인간 CD3 모노클로날 항체로 코팅된 미세플레이트를 사용하는 다양한 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체에 의한 부자극 신호 전달 활성에 대한 분석에서, 보통의 건강한 사람인 "공여자 B"로부터의 T 세포의 증식 활성을 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 정도의 지수로서 [3H]티미딘의 세포 삽입량을 가리키고, 수평 축은 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 농도를 가리킨다.
상기 도면에서, "JHC1"은 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 대신에 항-인간 CETP 모노클로날 항체를 음성 대조용으로 사용한 분석의 결과를 가리킨다.
도 18은 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체와 함께 항-인간 CD3 모노클로날 항체로 코팅된 미세플레이트를 사용하는 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체에 의한 부자극 신호 전달 활성에 대한 분석에서 보통의 건강한 사람인 "공여자 B"로부터의 T 세포의 증식 활성을 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 정도의 지수로서 [3H]티미딘의 세포 삽입량을 가리키고, 수평 축은 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 농도를 가리킨다.
상기 도면에서, "항-KLH"는 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 대신에 인간 항-KLH 모노클로날 항체를 음성 대조용으로 사용한 분석의 결과를 가리킨다.
도 19는 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체와 함께 항-인간 CD3 모노클로날 항체로 코팅된 미세플레이트를 사용하는 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체에 의한 부자극 신호 전달 활성에 대한 분석에서, 보통의 건강한 사람인 "공여자 B"로부터의 T 세포의 증식 활성을 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 정도의 지수로서 [3H]티미딘의 세포 삽입량을 가리키고, 수평 축은 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 농도를 가리킨다.
상기 도면에서, "항-KLH"는 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 대신에 인간 항-KLH 모노클로날 항체를 음성 대조용으로 사용한 분석의 결과를 가리킨다.
도 20은 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체와 함께 항-인간 CD3 모노클로날 항체로 코팅된 미세플레이트를 사용하는 다양한 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체에 의한 부자극 신호 전달 활성에 대한 분석에서, 보통의 건강한 사람인 "공여자 C"로부터의 T 세포의 증식 활성을 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 정도의 지수로서 [3H]티미딘의 세포 삽입량을 가리키고, 수평 축은 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 농도를 가리킨다.
상기 도면에서, "JHC1"은 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 대신에 항-인간 CETP 모노클로날 항체를 음성 대조용으로 사용한 분석의 결과를 가리킨다.
도 21은 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체와 함께 항-인간 CD3 모노클로날 항체로 코팅된 미세플레이트를 사용하는 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체에 의한 부자극 신호 전달 활성에 대한 분석에서, 보통의 건강한 사람인 "공여자 C"로부터의 T 세포의 증식 활성을 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 정도의 지수로서 [3H]티미딘의 세포 삽입량을 가리키고, 수평 축은 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 농도를 가리킨다.
상기 도면에서, "항-KLH"는 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 대신에 인간 항-KLH 모노클로날 항체를 음성 대조용으로 사용한 분석의 결과를 가리킨다.
다른 표시들은 하기와 같다:
"124": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab124.
"126": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab126.
"127": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab127.
도 22는 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체와 함께 항-인간 CD3 모노클로날 항체로 코팅된 미세플레이트를 사용하는 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체에 의한 부자극 신호 전달 활성에 대한 분석에서, 보통의 건강한 사람인 "공여자 C"로부터의 T 세포의 증식 활성을 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 정도의 지수로서 [3H]티미딘의 세포 삽입량을 가리키고, 수평 축은 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 농도를 가리킨다.
상기 도면에서, "항-KLH"는 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 대신에 인간 항-KLH 모노클로날 항체를 음성 대조용으로 사용한 분석의 결과를 가리킨다.
다른 표시들은 하기와 같다:
"128": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab128.
"135": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab135.
"136": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab136.
도 23은 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체와 함께 항-인간 CD3 모노클로날 항체로 코팅된 미세플레이트를 사용하는 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체에 의한 부자극 신호 전달 활성에 대한 분석에서, 보통의 건강한 사람인 "공여자 C"로부터의 T 세포의 증식 활성을 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 정도의 지수로서 [3H]티미딘의 세포 삽입량을 가리키고, 수평 축은 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 농도를 가리킨다.
상기 도면에서, "항-KLH"는 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 대신에 인간 항-KLH 모노클로날 항체를 음성 대조용으로 사용한 분석의 결과를 가리킨다.
다른 표시들은 하기와 같다:
"137": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab137.
"138": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab138.
"139": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab139.
도 24는 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체와 함께 항-인간 CD3 모노클로날 항체로 코팅된 미세플레이트를 사용하는 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체에 의한 부자극 신호 전달 활성에 대한 분석에서, 보통의 건강한 사람인 "공여자 C"로부터의 T 세포의 증식 활성을 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 정도의 지수로서 [3H]티미딘의 세포 삽입량을 가리키고, 수평 축은 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 농도를 가리킨다.
상기 도면에서, "항-KLH"는 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 대신에 인간 항-KLH 모노클로날 항체를 음성 대조용으로 사용한 분석의 결과를 가리킨다.
다른 표시들은 하기와 같다:
"140": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab140.
"141": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab141.
도 25는 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체와 함께 항-인간 CD3 모노클로날 항체로 코팅된 미세플레이트를 사용하는 다양한 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체에 의한 부자극 신호 전달 활성에 대한 분석에서, 보통의 건강한 사람인 "공여자 D"로부터의 T 세포의 증식 활성을 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 정도의 지수로서 [3H]티미딘의 세포 삽입량을 가리키고, 수평 축은 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 농도를 가리킨다.
상기 도면에서, "JHC1"은 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 대신에 항-인간 CETP 모노클로날 항체를 음성 대조용으로 사용한 분석의 결과를 가리킨다.
도 26은 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체와 함께 항-인간 CD3 모노클로날 항체로 코팅된 미세플레이트를 사용하는 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체에 의한 부자극 신호 전달 활성에 대한 분석에서, 보통의 건강한 사람인 "공여자 D"로부터의 T 세포의 증식 활성을 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 정도의 지수로서 [3H]티미딘의 세포 삽입량을 가리키고, 수평 축은 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 농도를 가리킨다.
상기 도면에서, "항-KLH"는 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 대신에 인간 항-KLH 모노클로날 항체를 음성 대조용으로 사용한 분석의 결과를 가리킨다.
다른 표시들은 하기와 같다:
"124": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab124.
"126": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab126.
"127": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab127.
도 27은 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체와 함께 항-인간 CD3 모노클로날 항체로 코팅된 미세플레이트를 사용하는 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체에 의한 부자극 신호 전달 활성에 대한 분석에서, 보통의 건강한 사람인 "공여자 D"로부터의 T 세포의 증식 활성을 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 정도의 지수로서 [3H]티미딘의 세포 삽입량을 가리키고, 수평 축은 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 농도를 가리킨다.
상기 도면에서, "항-KLH"는 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 대신에 인간 항-KLH 모노클로날 항체를 음성 대조용으로 사용한 분석의 결과를 가리킨다.
다른 표시들은 하기와 같다:
"128": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab128.
"135": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab135.
"136": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab136.
도 28은 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체와 함께 항-인간 CD3 모노클로날 항체로 코팅된 미세플레이트를 사용하는 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체에 의한 부자극 신호 전달 활성에 대한 분석에서, 보통의 건강한 사람인 "공여자 D"로부터의 T 세포의 증식 활성을 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 정도의 지수로서 [3H]티미딘의 세포 삽입량을 가리키고, 수평 축은 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 농도를 가리킨다.
상기 도면에서, "항-KLH"는 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 대신에 인간 항-KLH 모노클로날 항체를 음성 대조용으로 사용한 분석의 결과를 가리킨다.
다른 표시들은 하기와 같다:
"137": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab137.
"138": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab138.
"139": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab139.
도 29는 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체와 함께 항-인간 CD3 모노클로날 항체로 코팅된 미세플레이트를 사용하는 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체에 의한 부자극 신호 전달 활성에 대한 분석에서, 보통의 건강한 사람인 "공여자 D"로부터의 T 세포의 증식 활성을 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 정도의 지수로서 [3H]티미딘의 세포 삽입량을 가리키고, 수평 축은 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 농도를 가리킨다.
상기 도면에서, "항-KLH"는 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 대신에 인간 항-KLH 모노클로날 항체를 음성 대조용으로 사용한 분석의 결과를 가리킨다.
다른 표시들은 하기와 같다:
"140": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab140.
"141": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab141.
도 30은 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체와 함께 항-인간 CD3 모노클로날 항체로 코팅된 미세플레이트를 사용하는 다양한 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체에 의한 부자극 신호 전달 활성에 대한 분석에서, 보통의 건강한 사람인 "공여자 E"로부터의 T 세포의 증식 활성을 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 정도의 지수로서 [3H]티미딘의 세포 삽입량을 가리키고, 수평 축은 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 농도를 가리킨다.
상기 도면에서, "JHC1"은 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 대신에 항-인간 CETP 모노클로날 항체를 음성 대조용으로 사용한 분석의 결과를 가리킨다.
도 31은 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체와 함께 항-인간 CD3 모노클로날 항체로 코팅된 미세플레이트를 사용하는 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체에 의한 부자극 신호 전달 활성에 대한 분석에서, 보통의 건강한 사람인 "공여자 E"로부터의 T 세포의 증식 활성을 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 정도의 지수로서 [3H]티미딘의 세포 삽입량을 가리키고, 수평 축은 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 농도를 가리킨다.
상기 도면에서, "항-KLH"는 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 대신에 인간 항-KLH 모노클로날 항체를 음성 대조용으로 사용한 분석의 결과를 가리킨다.
다른 표시들은 하기와 같다:
"124": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab124.
"126": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab126.
"127": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab127.
도 32는 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체와 함께 항-인간 CD3 모노클로날 항체로 코팅된 미세플레이트를 사용하는 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체에 의한 부자극 신호 전달 활성에 대한 분석에서, 보통의 건강한 사람인 "공여자 E"로부터의 T 세포의 증식 활성을 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 정도의 지수로서 [3H]티미딘의 세포 삽입량을 가리키고, 수평 축은 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 농도를 가리킨다.
상기 도면에서, "항-KLH"는 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 대신에 인간 항-KLH 모노클로날 항체를 음성 대조용으로 사용한 분석의 결과를 가리킨다.
다른 표시들은 하기와 같다:
"128": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab128.
"135": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab135.
"136": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab136.
도 33은 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체와 함께 항-인간 CD3 모노클로날 항체로 코팅된 미세플레이트를 사용하는 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체에 의한 부자극 신호 전달 활성에 대한 분석에서, 보통의 건강한 사람인 "공여자 E"로부터의 T 세포의 증식 활성을 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 정도의 지수로서 [3H]티미딘의 세포 삽입량을 가리키고, 수평 축은 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 농도를 가리킨다.
상기 도면에서, "항-KLH"는 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 대신에 인간 항-KLH 모노클로날 항체를 음성 대조용으로 사용한 분석의 결과를 가리킨다.
다른 표시들은 하기와 같다:
"137": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab137.
"138": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab138.
"139": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab139.
도 34는 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체와 함께 항-인간 CD3 모노클로날 항체로 코팅된 미세플레이트를 사용하는 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체에 의한 부자극 신호 전달 활성에 대한 분석에서, 보통의 건강한 사람인 "공여자 E"로부터의 T 세포의 증식 활성을 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 정도의 지수로서 [3H]티미딘의 세포 삽입량을 가리키고, 수평 축은 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 농도를 가리킨다.
상기 도면에서, "항-KLH"는 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 대신에 인간 항-KLH 모노클로날 항체를 음성 대조용으로 사용한 분석의 결과를 가리킨다.
다른 표시들은 하기와 같다:
"140": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab140.
"141": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab141.
도 35는 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 용액(액체 상에서)을 항-인간 CD3 모노클로날 항체로 코팅된 미세플레이트에 단독으로 가한 경우의, 다양한 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 부자극 신호 전달 활성에 대한 분석에서, 보통의 건강한 사람인 "공여자 D"로부터의 T 세포의 증식 활성을 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 정도의 지수로서 [3H]티미딘의 세포 삽입량을 가리키고, 수평 축은 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 농도를 가리킨다.
상기 도면에서, "JHC1"은 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 대신에 항-인간 CETP 모노클로날 항체를 음성 대조용으로 사용한 분석의 결과를 가리킨다.
도 36은 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 용액(액체 상에서)을 항-인간 CD3 모노클로날 항체로 코팅된 미세플레이트에 단독으로 가한 경우의, 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 부자극 신호 전달 활성에 대한 분석에서, 보통의 건강한 사람인 "공여자 D"로부터의 T 세포의 증식 활성을 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 정도의 지수로서 [3H]티미딘의 세포 삽입량을 가리키고, 수평 축은 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 농도를 가리킨다.
상기 도면에서, "항-KLH"는 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 대신에 인간 항-KLH 모노클로날 항체를 음성 대조용으로 사용한 분석의 결과를 가리킨다.
다른 표시들은 하기와 같다:
"124": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab124.
"125": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab125.
"126": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab126.
도 37은 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 용액(액체 상에서)을 항-인간 CD3 모노클로날 항체로 코팅된 미세플레이트에 단독으로 가한 경우의, 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 부자극 신호 전달 활성에 대한 분석에서, 보통의 건강한 사람인 "공여자 D"로부터의 T 세포의 증식 활성을 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 정도의 지수로서 [3H]티미딘의 세포 삽입량을 가리키고, 수평 축은 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 농도를 가리킨다.
상기 도면에서, "항-KLH"는 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 대신에 인간 항-KLH 모노클로날 항체를 음성 대조용으로 사용한 분석의 결과를 가리킨다.
다른 표시들은 하기와 같다:
"128": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab128.
"135": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab135.
"136": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab136.
도 38은 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 용액(액체 상에서)을 항-인간 CD3 모노클로날 항체로 코팅된 미세플레이트에 단독으로 가한 경우의, 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 부자극 신호 전달 활성에 대한 분석에서, 보통의 건강한 사람인 "공여자 D"로부터의 T 세포의 증식 활성을 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 정도의 지수로서 [3H]티미딘의 세포 삽입량을 가리키고, 수평 축은 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 농도를 가리킨다.
상기 도면에서, "항-KLH"는 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 대신에 인간 항-KLH 모노클로날 항체를 음성 대조용으로 사용한 분석의 결과를 가리킨다.
다른 표시들은 하기와 같다:
"137": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab137.
"138": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab138.
"139": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab139.
도 39는 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 용액(액체 상에서)을 항-인간 CD3 모노클로날 항체로 코팅된 미세플레이트에 단독으로 가한 경우의, 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 부자극 신호 전달 활성에 대한 분석에서, 보통의 건강한 사람인 "공여자 D"로부터의 T 세포의 증식 활성을 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 정도의 지수로서 [3H]티미딘의 세포 삽입량을 가리키고, 수평 축은 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 농도를 가리킨다.
상기 도면에서, "항-KLH"는 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 대신에 인간 항-KLH 모노클로날 항체를 음성 대조용으로 사용한 분석의 결과를 가리킨다.
다른 표시들은 하기와 같다:
"140": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab140.
"141": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab141.
도 40은 항-인간 CD3 모노클로날 항체와 함께 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체로 코팅된 미세플레이트에서 배양된, 보통의 건강한 사람인 "공여자 B"로부터의 T 세포의 배양 상청액 중에 생성된 IFN-γ의 양을 나타낸다.
수직 축은 IFN-γ의 농도를 가리키고, 수평 축은 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 농도를 가리킨다.
상기 도면에서, "JHC1"은 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 대신에 항-인간 CETP 모노클로날 항체를 음성 대조용으로 사용한 분석의 결과를 가리킨다.
도 41은 항-인간 CD3 모노클로날 항체와 함께 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체로 코팅된 미세플레이트에서 배양된, 보통의 건강한 사람인 "공여자 B"로부터의 T 세포의 배양 상청액 중에 생성된 IFN-γ의 양을 나타낸다.
수직 축은 IFN-γ의 농도를 가리키고, 수평 축은 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 농도를 가리킨다.
상기 도면에서, "항-KLH"는 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 대신에 인간 항-KLH 모노클로날 항체를 음성 대조용으로 사용한 분석의 결과를 가리킨다.
도 42는 항-인간 CD3 모노클로날 항체와 함께 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체로 코팅된 미세플레이트에서 배양된, 보통의 건강한 사람인 "공여자 B"로부터의 T 세포의 배양 상청액 중에 생성된 IFN-γ의 양을 나타낸다.
수직 축은 IFN-γ의 농도를 가리키고, 수평 축은 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 농도를 가리킨다.
상기 도면에서, "항-KLH"는 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 대신에 인간 항-KLH 모노클로날 항체를 음성 대조용으로 사용한 분석의 결과를 가리킨다.
도 43은 항-인간 CD3 모노클로날 항체와 함께 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체로 코팅된 미세플레이트에서 배양된, 보통의 건강한 사람인 "공여자 C"로부터의 T 세포의 배양 상청액 중에 생성된 IFN-γ의 양을 나타낸다.
수직 축은 IFN-γ의 농도를 가리키고, 수평 축은 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 농도를 가리킨다.
상기 도면에서, "JHC1"은 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 대신에 항-인간 CETP 모노클로날 항체를 음성 대조용으로 사용한 분석의 결과를 가리킨다.
도 44는 항-인간 CD3 모노클로날 항체와 함께 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체로 코팅된 미세플레이트에서 배양된, 보통의 건강한 사람인 "공여자 C"로부터의 T 세포의 배양 상청액 중에 생성된 IFN-γ의 양을 나타낸다.
수직 축은 IFN-γ의 농도를 가리키고, 수평 축은 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 농도를 가리킨다.
상기 도면에서, "항-KLH"는 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 대신에 인간 항-KLH 모노클로날 항체를 음성 대조용으로 사용한 분석의 결과를 가리킨다.
다른 표시들은 하기와 같다:
"124": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab124.
"125": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab125.
"126": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab126.
도 45는 항-인간 CD3 모노클로날 항체와 함께 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체로 코팅된 미세플레이트에서 배양된, 보통의 건강한 사람인 "공여자 C"로부터의 T 세포의 배양 상청액 중에 생성된 IFN-γ의 양을 나타낸다.
수직 축은 IFN-γ의 농도를 가리키고, 수평 축은 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 농도를 가리킨다.
상기 도면에서, "항-KLH"는 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 대신에 인간 항-KLH 모노클로날 항체를 음성 대조용으로 사용한 분석의 결과를 가리킨다.
다른 표시들은 하기와 같다:
"128": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab128.
"135": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab135.
"136": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab136.
도 46은 항-인간 CD3 모노클로날 항체와 함께 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체로 코팅된 미세플레이트에서 배양된, 보통의 건강한 사람인 "공여자 C"로부터의 T 세포의 배양 상청액 중에 생성된 IFN-γ의 양을 나타낸다.
수직 축은 IFN-γ의 농도를 가리키고, 수평 축은 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 농도를 가리킨다.
상기 도면에서, "항-KLH"는 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 대신에 인간 항-KLH 모노클로날 항체를 음성 대조용으로 사용한 분석의 결과를 가리킨다.
다른 표시들은 하기와 같다:
"137": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab137.
"138": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab138.
"139": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab139.
도 47은 항-인간 CD3 모노클로날 항체와 함께 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체로 코팅된 미세플레이트에서 배양된, 보통의 건강한 사람인 "공여자 C"로부터의 T 세포의 배양 상청액 중에 생성된 IFN-γ의 양을 나타낸다.
수직 축은 IFN-γ의 농도를 가리키고, 수평 축은 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 농도를 가리킨다.
상기 도면에서, "항-KLH"는 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 대신에 인간 항-KLH 모노클로날 항체를 음성 대조용으로 사용한 분석의 결과를 가리킨다.
다른 표시들은 하기와 같다:
"140": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab140.
"141": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab141.
도 48은 보통의 건강한 사람인 "공여자 A"의 T 세포를 보통의 건강한 사람인 "공여자 D"의 PBMC와 배양한 경우의, 혼합된 림프구 반응(MLR)을 통한 T 세포의 증식 시험에서 다양한 시험 샘플에 의한 상기 T 세포 증식에 대한 억제 효과를 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 수준을 나타내는 지수로서 [3H] 티미딘의 삽입량을 가리키고, 수평 축은 시험 샘플의 농도를 나타낸다.
도면들에서 각각의 설명은 하기와 같다:
"CD80+86": 항-CD80 항체와 항-CD86 항체의 혼합물
"mIgG1": 항-인간 CD34/IgG1 마우스 모노클로날 항체
"CTLA4-Ig": 인간 CTLA4-IgFc 키메라 분자
"SA12": 항-인간 AILIM 마우스 모노클로날 항체.
도 49는 보통의 건강한 사람인 "공여자 A"의 T 세포를 보통의 건강한 사람인 "공여자 D"의 PBMC와 배양한 경우의, 혼합된 림프구 반응(MLR)을 통한 T 세포의 증식 시험에서 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체에 의한 상기 T 세포 증식에 대한 억제 효과를 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 수준을 나타내는 지수로서 [3H] 티미딘의 삽입량을 가리키고, 수평 축은 시험 샘플의 농도를 나타낸다.
다른 표시들은 하기와 같다:
"항-KLH": 음성 대조군으로서 인간 항-KLH 모노클로날 항체.
"JMab-124": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab124.
"126": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab126.
"127": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab127.
"128": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab128.
"135": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab135.
"136": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab136.
"137": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab137.
도 50은 보통의 건강한 사람인 "공여자 D"의 T 세포를 보통의 건강한 사람인 "공여자 B"의 PBMC와 배양한 경우의, 혼합된 림프구 반응(MLR)을 통한 T 세포의 증식 시험에서 다양한 시험 샘플에 의한 상기 T 세포 증식에 대한 억제 효과를 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 수준을 나타내는 지수로서 [3H] 티미딘의 삽입량을 가리키고, 수평 축은 시험 샘플의 농도를 나타낸다.
도면들에서 각각의 설명은 하기와 같다:
"CD80+86": 항-CD80 항체와 항-CD86 항체의 혼합물
"mIgG1": 항-인간 CD34/IgG1 마우스 모노클로날 항체
"CTLA4-Ig": 인간 CTLA4-IgFc 키메라 분자
"SA12": 항-인간 AILIM 마우스 모노클로날 항체.
도 51은 보통의 건강한 사람인 "공여자 D"의 T 세포를 보통의 건강한 사람인 "공여자 B"의 PBMC와 배양한 경우의, 혼합된 림프구 반응(MLR)을 통한 T 세포의 증식 시험에서 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체에 의한 상기 T 세포 증식에 대한 억제 효과를 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 수준을 나타내는 지수로서 [3H] 티미딘의 삽입량을 가리키고, 수평 축은 시험 샘플의 농도를 나타낸다.
다른 표시들은 하기와 같다:
"항-KLH": 음성 대조군으로서 인간 항-KLH 모노클로날 항체.
"JMab-124": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab124.
"126": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab126.
"127": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab127.
"128": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab128.
"135": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab135.
"136": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab136.
"137": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab137.
도 52는 보통의 건강한 사람인 "공여자 C"의 T 세포를 보통의 건강한 사람인 "공여자 A"의 PBMC와 배양한 경우의, 혼합된 림프구 반응(MLR)을 통한 T 세포의 증식 시험에서 다양한 시험 샘플에 의한 상기 T 세포 증식에 대한 억제 효과를 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 수준을 나타내는 지수로서 [3H] 티미딘의 삽입량을 가리키고, 수평 축은 시험 샘플의 농도를 나타낸다.
도면들에서 각각의 설명은 하기와 같다:
"CD80+86": 항-CD80 항체와 항-CD86 항체의 혼합물
"mIgG1": 항-인간 CD34/IgG1 마우스 모노클로날 항체
"CTLA4-Ig": 인간 CTLA4-IgFc 키메라 분자
"SA12": 항-인간 AILIM 마우스 모노클로날 항체.
도 53은 보통의 건강한 사람인 "공여자 C"의 T 세포를 보통의 건강한 사람인 "공여자 A"의 PBMC와 배양한 경우의, 혼합된 림프구 반응(MLR)을 통한 T 세포의 증식 시험에서 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체에 의한 상기 T 세포 증식에 대한 억제 효과를 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 수준을 나타내는 지수로서 [3H] 티미딘의 삽입량을 가리키고, 수평 축은 시험 샘플의 농도를 나타낸다.
다른 표시들은 하기와 같다:
"항-KLH": 음성 대조군으로서 인간 항-KLH 모노클로날 항체.
"JMab-124": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab124.
"126": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab126.
"127": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab127.
"128": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab128.
"135": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab135.
"136": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab136.
"137": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab137.
도 54는 보통의 건강한 사람인 "공여자 E"의 T 세포를 보통의 건강한 사람인 "공여자 G"의 PBMC와 배양한 경우의, 혼합된 림프구 반응(MLR)을 통한 T 세포의 증식 시험에서 다양한 시험 샘플에 의한 상기 T 세포 증식에 대한 억제 효과를 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 수준을 나타내는 지수로서 [3H] 티미딘의 삽입량을 가리키고, 수평 축은 시험 샘플의 농도를 나타낸다.
도면들에서 각각의 설명은 하기와 같다:
"대조용 mIgG": 항-인간 CD34/IgG1 마우스 모노클로날 항체
"CD80+86 Ab": 항-CD80 항체와 항-CD86 항체의 혼합물
"SA12": 항-인간 AILIM 마우스 모노클로날 항체
"CTLA4-Ig": 인간 CTLA4-IgFc 키메라 분자.
도 55는 보통의 건강한 사람인 "공여자 E"의 T 세포를 보통의 건강한 사람인 "공여자 G"의 PBMC와 배양한 경우의, 혼합된 림프구 반응(MLR)을 통한 T 세포의 증식 시험에서 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체에 의한 상기 T 세포 증식에 대한 억제 효과를 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 수준을 나타내는 지수로서 [3H] 티미딘의 삽입량을 가리키고, 수평 축은 시험 샘플의 농도를 나타낸다.
다른 표시들은 하기와 같다:
"항-KLH": 음성 대조군으로서 인간 항-KLH 모노클로날 항체.
"JMab-136": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab136.
"138": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab138.
"139": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab139.
"140": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab140.
"141": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab141.
도 56은 보통의 건강한 사람인 "공여자 F"의 T 세포를 보통의 건강한 사람인 "공여자 E"의 PBMC와 배양한 경우에 혼합된 림프구 반응(MLR)을 통한 T 세포의 증식 시험에서 다양한 시험 샘플에 의한 상기 T 세포 증식에 대한 억제 효과를 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 수준을 나타내는 지수로서 [3H] 티미딘의 삽입량을 가리키고, 수평 축은 시험 샘플의 농도를 나타낸다.
도면들에서 각각의 설명은 하기와 같다:
"대조용 mIgG": 항-인간 CD34/IgG1 마우스 모노클로날 항체
"CD80+86 Ab": 항-CD80 항체와 항-CD86 항체의 혼합물
"SA12": 항-인간 AILIM 마우스 모노클로날 항체
"CTLA4-Ig": 인간 CTLA4-IgFc 키메라 분자.
도 57은 보통의 건강한 사람인 "공여자 F"의 T 세포를 보통의 건강한 사람인 "공여자 E"의 PBMC와 배양한 경우의, 혼합된 림프구 반응(MLR)을 통한 T 세포의 증식 시험에서 다양한 시험 샘플에 의한 상기 T 세포 증식에 대한 억제 효과를 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 수준을 나타내는 지수로서 [3H] 티미딘의 삽입량을 가리키고, 수평 축은 시험 샘플의 농도를 나타낸다.
다른 표시들은 하기와 같다:
"항-KLH": 음성 대조군으로서 인간 항-KLH 모노클로날 항체.
"JMab-136": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab136.
"138": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab138.
"139": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab139.
"140": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab140.
"141": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab141.
도 58은 보통의 건강한 사람인 "공여자 G"의 T 세포를 보통의 건강한 사람인 "공여자 F"의 PBMC와 배양한 경우의, 혼합된 림프구 반응(MLR)을 통한 T 세포의 증식 시험에서 다양한 시험 샘플에 의한 상기 T 세포 증식에 대한 억제 효과를 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 수준을 나타내는 지수로서 [3H] 티미딘의 삽입량을 가리키고, 수평 축은 시험 샘플의 농도를 나타낸다.
도면들에서 각각의 설명은 하기와 같다:
"대조용 mIgG": 항-인간 CD34/IgG1 마우스 모노클로날 항체
"CD80+86 Ab": 항-CD80 항체와 항-CD86 항체의 혼합물
"SA12": 항-인간 AILIM 마우스 모노클로날 항체
"CTLA4-Ig": 인간 CTLA4-IgFc 키메라 분자.
도 59는 보통의 건강한 사람인 "공여자 G"의 T 세포를 보통의 건강한 사람인 "공여자 F"의 PBMC와 배양한 경우의, 혼합된 림프구 반응(MLR)을 통한 T 세포의 증식 시험에서 다양한 시험 샘플에 의한 상기 T 세포 증식에 대한 억제 효과를 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 수준을 나타내는 지수로서 [3H] 티미딘의 삽입량을 가리키고, 수평 축은 시험 샘플의 농도를 나타낸다.
다른 표시들은 하기와 같다:
"항-KLH": 음성 대조군으로서 인간 항-KLH 모노클로날 항체.
"JMab-136": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab136.
"138": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab138.
"139": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab139.
"140": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab140.
"141": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab141.
도 60은 혼합된 림프구 반응(MLR)을 사용하는 분석에서 T 세포의 증식에 대한 다양한 대조용 시험 물질들의 억제 효과를 나타낸다. 보통의 건강한 사람인 "공여자 A"로부터의 T 세포를 인간 CTLA4-Ig 키메라 분자의 존재 하에서 예비-배양시킨 보통의 건강한 사람인 "공여자 D"로부터의 PBMC와 공동-배양시켰다.
수직 축은 세포 증식 정도의 지수로서 [3H] 티미딘의 세포 삽입량을 가리키고, 수평 축은 시험 물질들의 농도를 가리킨다.
도면들에서 각각의 설명은 하기와 같다:
"CD80+86": 항-CD80 항체와 항-CD86 항체의 혼합물
"mIgG1": 항-인간 CD34/IgG1 마우스 모노클로날 항체
"SA12": 항-인간 AILIM 마우스 모노클로날 항체.
도 61은 혼합된 림프구 반응(MLR)을 사용하는 분석에서 T 세포의 증식에 대한 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 억제 효과를 나타낸다. 보통의 건강한 사람인 "공여자 A"로부터의 T 세포를 인간 CTLA4-Ig 키메라 분자의 존재 하에서 예비-배양시킨 보통의 건강한 사람인 "공여자 D"로부터의 PBMC와 공동-배양시켰다.
수직 축은 세포 증식 정도의 지수로서 [3H] 티미딘의 세포 삽입량을 가리키고, 수평 축은 시험 물질들의 농도를 가리킨다.
다른 표시들은 하기와 같다:
"항-KLH": 음성 대조군으로서 인간 항-KLH 모노클로날 항체.
"JMab-124": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab124.
"126": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab126.
"127": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab127.
"128": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab128.
"135": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab135.
"136": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab136.
"137": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab137.
도 62는 혼합된 림프구 반응(MLR)을 사용하는 분석에서 T 세포의 증식에 대한 다양한 대조용 시험 물질들의 억제 효과를 나타낸다. 보통의 건강한 사람인 "공여자 D"로부터의 T 세포를 인간 CTLA4-Ig 키메라 분자의 존재 하에서 예비-배양시킨 보통의 건강한 사람인 "공여자 B"로부터의 PBMC와 공동-배양시켰다.
수직 축은 세포 증식 정도의 지수로서 [3H] 티미딘의 세포 삽입량을 가리키고, 수평 축은 시험 물질들의 농도를 가리킨다.
도면들에서 각각의 설명은 하기와 같다:
"CD80+86": 항-CD80 항체와 항-CD86 항체의 혼합물
"mIgG1": 항-인간 CD34/IgG1 마우스 모노클로날 항체
"SA12": 항-인간 AILIM 마우스 모노클로날 항체.
도 63은 혼합된 림프구 반응(MLR)을 사용하는 분석에서 T 세포의 증식에 대한 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 억제 효과를 나타낸다. 보통의 건강한 사람인 "공여자 D"로부터의 T 세포를 인간 CTLA4-Ig 키메라 분자의 존재 하에서 예비-배양시킨 보통의 건강한 사람인 "공여자 B"로부터의 PBMC와 공동-배양시켰다.
수직 축은 세포 증식 정도의 지수로서 [3H] 티미딘의 세포 삽입량을 가리키고, 수평 축은 시험 물질들의 농도를 가리킨다.
다른 표시들은 하기와 같다:
"항-KLH": 음성 대조군으로서 인간 항-KLH 모노클로날 항체.
"JMab-124": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab124.
"126": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab126.
"127": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab127.
"128": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab128.
"135": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab135.
"136": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab136.
"137": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab137.
도 64는 혼합된 림프구 반응(MLR)을 사용하는 분석에서 T 세포의 증식에 대한 다양한 대조용 시험 물질들의 억제 효과를 나타낸다. 보통의 건강한 사람인 "공여자 C"로부터의 T 세포를 인간 CTLA4-Ig 키메라 분자의 존재 하에서 예비-배양시킨 보통의 건강한 사람인 "공여자 A"로부터의 PBMC와 공동-배양시켰다.
수직 축은 세포 증식 정도의 지수로서 [3H] 티미딘의 세포 삽입량을 가리키고, 수평 축은 시험 물질들의 농도를 가리킨다.
도면들에서 각각의 설명은 하기와 같다:
"CD80+86": 항-CD80 항체와 항-CD86 항체의 혼합물
"mIgG1": 항-인간 CD34/IgG1 마우스 모노클로날 항체
"SA12": 항-인간 AILIM 마우스 모노클로날 항체.
도 65는 혼합된 림프구 반응(MLR)을 사용하는 분석에서 T 세포의 증식에 대한 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 억제 효과를 나타낸다. 보통의 건강한 사람인 "공여자 C"로부터의 T 세포를 인간 CTLA4-Ig 키메라 분자의 존재 하에서 예비-배양시킨 보통의 건강한 사람인 "공여자 A"로부터의 PBMC와 공동-배양시켰다.
수직 축은 세포 증식 정도의 지수로서 [3H] 티미딘의 세포 삽입량을 가리키고, 수평 축은 시험 물질들의 농도를 가리킨다.
다른 표시들은 하기와 같다:
"항-KLH": 음성 대조군으로서 인간 항-KLH 모노클로날 항체.
"JMab-124": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab124.
"126": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab126.
"127": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab127.
"128": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab128.
"135": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab135.
"136": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab136.
"137": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab137.
도 66은 혼합된 림프구 반응(MLR)을 사용하는 분석에서 T 세포의 증식에 대한 다양한 대조용 시험 물질들의 억제 효과를 나타낸다. 보통의 건강한 사람인 "공여자 E"로부터의 T 세포를 인간 CTLA4-Ig 키메라 분자의 존재 하에서 예비-배양시킨 보통의 건강한 사람인 "공여자 G"로부터의 PBMC와 공동-배양시켰다.
수직 축은 세포 증식 정도의 지수로서 [3H] 티미딘의 세포 삽입량을 가리키고, 수평 축은 시험 물질들의 농도를 가리킨다.
도면들에서 각각의 설명은 하기와 같다:
"대조용 mIgG": 항-인간 CD34/IgG1 마우스 모노클로날 항체
"CD80+86Ab": 항-CD80 항체와 항-CD86 항체의 혼합물
"SA12": 항-인간 AILIM 마우스 모노클로날 항체.
도 67은 혼합된 림프구 반응(MLR)을 사용하는 분석에서 T 세포의 증식에 대한 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 억제 효과를 나타낸다. 보통의 건강한 사람인 "공여자 E"로부터의 T 세포를 인간 CTLA4-Ig 키메라 분자의 존재 하에서 예비-배양시킨 보통의 건강한 사람인 "공여자 G"로부터의 PBMC와 공동-배양시켰다.
수직 축은 세포 증식 정도의 지수로서 [3H] 티미딘의 세포 삽입량을 가리키고, 수평 축은 시험 물질들의 농도를 가리킨다.
다른 표시들은 하기와 같다:
"항-KLH": 음성 대조군으로서 인간 항-KLH 모노클로날 항체.
"JMab-136": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab136.
"138": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab138.
"139": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab139.
"140": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab140.
"141": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab141.
도 68은 혼합된 림프구 반응(MLR)을 사용하는 분석에서 T 세포의 증식에 대한 다양한 대조용 시험 물질들의 억제 효과를 나타낸다. 보통의 건강한 사람인 "공여자 G"로부터의 T 세포를 인간 CTLA4-Ig 키메라 분자의 존재 하에서 예비-배양시킨 보통의 건강한 사람인 "공여자 F"로부터의 PBMC와 공동-배양시켰다.
수직 축은 세포 증식 정도의 지수로서 [3H] 티미딘의 세포 삽입량을 가리키고, 수평 축은 시험 물질들의 농도를 가리킨다.
도면들에서 각각의 설명은 하기와 같다:
"대조용 mIgG": 항-인간 CD34/IgG1 마우스 모노클로날 항체
"CD80+86Ab": 항-CD80 항체와 항-CD86 항체의 혼합물
"SA12": 항-인간 AILIM 마우스 모노클로날 항체.
도 69는 혼합된 림프구 반응(MLR)을 사용하는 분석에서 T 세포의 증식에 대한 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 억제 효과를 나타낸다. 보통의 건강한 사람인 "공여자 G"로부터의 T 세포를 인간 CTLA4-Ig 키메라 분자의 존재 하에서 예비-배양시킨 보통의 건강한 사람인 "공여자 F"로부터의 PBMC와 공동-배양시켰다.
수직 축은 세포 증식 정도의 지수로서 [3H] 티미딘의 세포 삽입량을 가리키고, 수평 축은 시험 물질들의 농도를 가리킨다.
다른 표시들은 하기와 같다:
"항-KLH": 음성 대조군으로서 인간 항-KLH 모노클로날 항체.
"JMab-136": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab136.
"138": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab138.
"139": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab139.
"140": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab140.
"141": 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab141.
도 70은 야생형 CHO 세포를 표적 세포로서 사용한 경우의, 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 및 대조용 항체의 ADCC-유도 활성을 나타낸다.
수직 축은 항체의 ADCC-유도 활성에 의해 야기된 세포 독성율을 가리키고, 수평 축은 항체의 농도를 가리킨다.
도 71은 인간 AILIM-고발현 재조합 CHO 세포를 표적 세포로서 사용한 경우의, 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 및 대조용 항체의 ADCC-유도 활성을 나타낸다.
수직 축은 항체의 ADCC-유도 활성으로부터 발생한 세포 손상의 빈도수를 가리키고, 수평 축은 항체의 농도를 가리킨다.
도 72는 지연성 알레르기에 대한 항-AILIM 항체의 억제 효과를 나타낸다.
수직 축은 지연성 알레르기 발증 지수로서 측정된 홍반(redness) 크기를 가리키고, 수평 축은 동물 시험 대상자에게 제공된 시험 샘플의 유형을 가리킨다.
도 73은 항-인간 CD3 모노클로날 항체와 함께 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체로 코팅된 미세플레이트를 사용하는 부자극 신호를 전달하는 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 활성을 측정하기 위한 분석에서, 원숭이 T 세포의 증식 활성을 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 정도의 지수로서 [3H]티미딘의 세포 삽입량을 가리키고, 수평 축은 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 농도를 가리킨다.
상기 도면에서, "항-KLH"는 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 대신에 인간 항-KLH 모노클로날 항체를 음성 대조군으로서 사용한 분석의 결과를 가리킨다.
도 74는 다양한 농도의 가용성 AILIM 리간드(hB7h-IgFc)와 가용성 AILIM(AILIM-IgFc) 간의 결합에 대한 음성 대조용 항체의 억제 활성을 나타낸다.
수직 축은 억제 활성 지수로서의 흡광도를 가리키고, 수평 축은 가용성 AILIM의 농도를 가리킨다.
도 75는 다양한 농도의 가용성 AILIM 리간드(hB7h-IgFc)와 가용성 AILIM(AILIM-IgFc) 간의 결합에 대한 항 AILIM 항체의 억제 활성을 나타낸다.
수직 축은 억제 활성 지수로서의 흡광도를 가리키고, 수평 축은 가용성 AILIM의 농도를 가리킨다.
도 76은 가용성 AILIM 리간드(hB7h-IgFc)와 가용성 AILIM(AILIM-IgFc) 간의 결합에 대한 다양한 농도에서의 항 AILIM 항체의 억제 활성을 나타낸다.
수직 축은 억제 활성 지수로서의 흡광도를 가리키고, 수평 축은 가용성 AILIM의 농도를 가리킨다.
도 77은 항-인간 CD3 모노클로날 항체와 함께 가용성 인간 AILIM 리간드(hB7h-IgFc)로 코팅된 미세플레이트를 사용하는 부자극 신호 전달 활성을 측정하기 위한 분석에서, 인간 T 세포 증식에 대한 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 억제 활성을 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 정도의 지수로서 [3H]티미딘의 세포 삽입량을 가리키고, 수평 축은 항체의 농도를 가리킨다.
도 78은 항-인간 CD3 모노클로날 항체와 함께 가용성 인간 AILIM 리간드(hB7h-IgFc)로 코팅된 미세플레이트를 사용하는, 부자극 신호 전달 활성을 측정하기 위한 분석에서 원숭이 T 세포 증식에 대한 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 억제 활성을 나타낸다.
수직 축은 세포 증식 정도의 지수로서 [3H]티미딘의 세포 삽입량을 가리키고, 수평 축은 항체의 농도를 가리킨다.
상술한 목적들을 성취하기 위해서, 본 발명자들은 포유동물 AILIM(특히 인간 AILIM)에 대한 인간 항체(특히 인간 모노클로날 항체)에 대해 활발한 연구를 수행하였으며, 그 결과 AILIM을 갖는 인간 항체(구체적으로 인간 AILIM을 발현하는 세포의 세포막 분획)를 제조하기 위해서 유전자 재조합 기법을 사용하여 제조된 트랜스제닉 마우스를 면역시킴으로써, 세계에서 처음으로 인간 AILIM에 결합하는 다양한 모노클로날 항체, 특히 인간 AILIM에 의해 매개되는 신호 전달을 조절하는 인간 AILIM에 결합하는 모노클로날 항체의 제조에 성공하였다.
본 발명의 항체(특히 모노클로날 항체)는 인간으로부터 유래되므로, 마우스와 같은 비-인간 포유동물로부터 유래되는 항체를 포함하여 항체 약제를 사용하는 요법에서 큰 문제(부작용)였던, 숙주에서 인간에 대한 면역원성인 HAMA(인간 항-마우스 항원성)로 인한 어떠한 심각한 면역 거부반응도 유발시키지 않기 때문에, 의약품으로서의 항체의 가치를 극적으로 향상시킨다.
따라서, 본 발명의 포유동물 AILIM(특히 인간 AILIM)에 결합하는 인간 항체(특히 인간 모노클로날 항체) 및 상기 인간 항체(특히 인간 모노클로날 항체)를 포함하는 약학 조성물은, 숙주에서 HAMA로 인한 면역 거부반응의 유발 없이, AILIM에 의해 매개되는 AILIM-발현 세포로의 부자극 신호의 전달과 관련된 다양한 생리 반응들(예를 들어, AILIM-발현 세포의 증식, AILIM-발현 세포에 의한 시토킨 생산, AILIM-발현 세포의 면역 세포용해 또는 세포사멸(apoptosis), 및 AILIM-발현 세포에 대한 항체-의존성 세포독성을 유발하는 활성 등)을 조절하는 약물로서, 및/또는 상기 AILIM에 의해 매개된 신호 전달과 관련된 다양한 질환들의 증상 발생 및/또는진행을 억제하고 예방하는 약물 및 상기 질환의 치료 또는 예방을 위한 의약품으로서 또한 유용하다.
구체적으로, 본 발명에 따른 약학 조성물은 AILIM-발현 세포의 증식 또는 AILIM-발현 세포에 의한 시토킨(예를 들어, 인터페론 γ 또는 인터류킨 4 등)의 생산을 조절(억제 또는 자극)함으로써, AILIM에 의해 매개된 신호 전달과 관련된 다양한 생리 현상에 의해 야기되는 각종 병리 상태의 억제 및 각종 질환의 치료 또는 예방을 가능하게 한다.
본 발명에 따른 약학 조성물을 사용하여, 예를 들어 자기면역 또는 알레르기성 질환(특히 세포 면역성에 의해 야기되는 자기면역 질병 및 지연성 알레르기)으로 분류되는 각종 질환들(예를 들어, 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 자기면역 갑상선염, 알레르기성 접촉 피부염, 만성 염증성 피부병, 예를 들어 편평 태선, 전신 홍반성 루프스, 인슐린-의존성 당뇨병, 건선 등); 관절병증(예를 들어, 류마티스성 관절염(RA) 및 골관절염(OA)), 염증(예를 들어, 간염); 이식편 대 숙주 반응(GVH 반응); 이식편 대 숙주 병(GVHD); 조직(피부, 각막, 골 등의 조직) 또는 기관(간, 심장, 폐, 신장, 췌장 등)의 이식(동종이식 또는 이종이식)에 동반되는 면역 거부반응; 외래 항원 또는 자기항원에 의해 촉발되는 면역 반응(예를 들어 상기 항원에 대한 항체의 생산, 세포 증식, 시토킨의 생산); 및 비정상적인 장 면역성에 의해 발병이 가능한 질환(구체적으로 염증성 장 질환(특히 클론 병 및 궤양성 대장염) 및 식사성 알레르기)을 억제, 예방 및/또는 치료할 수 있다.
더욱 또한, 상술한 조직 및 기관의 이식에 동반되는 면역 거부반응의 억제/치료의 분야에서, 본 발명의 약학 조성물을 상기와 같은 이식 치료에서 면역 거부반응을 억제시키는데 사용되었던 공지된 면역 억제제를 함께 사용함으로써 상기 약물의 이식 거부반응에 대한 억제 효과를 증대시킬 수 있다.
더욱이, 본 발명의 약학 조성물을 소염제로서 각종 스테로이드의 사용이 지시되는 임의의 염증성 질병을 치료 또는 예방하는데 적용할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물을 염증성 질병, 예를 들어 각종 관절염(예를 들어, 류마티스성 관절염, 골 관절염)에 동반하는 염증, 폐렴, 간염(바이러스성 간염 포함), 감염증에 동반하는 염증, 염증성 장 질병, 장염, 신장염(사구체 신염, 신섬유증에 동반하는 염증), 위염, 맥관염, 췌장염, 복막염, 기관지염, 심근염, 뇌염, 허혈 후 재관류 손상(심근 허혈성 재관류 손상)에 있어서의 염증, 조직 및 기관 이식 후 면역 거부반응에 기인한 염증, 화상, 각종 피부 염증(건선, 알레르기성 접촉 피부염, 만성 염증성 피부병인 편평 태선), 다발성 기관 기능 장애에서의 염증, PTCA 또는 PTCR 수술 후의 염증, 및 동맥경화증에 동반하는 염증, 및 자기면역 갑상선염에 적용할 수 있다.
또한, 본 발명들 중 하나인, AILIM 또는 AILIM 리간드에 결합하는 물질을 동정하는 방법을 사용함으로써, AILIM 또는 AILIM 리간드에 결합하여 이들의 상호작용에 의해 매개되는 신호 전달을 조절함으로써 다양한 질환들을 치료하는 잠재적인 활성을 갖는 약제(화학 합성 화합물 또는 항체)를 스크리닝하여 선택할 수 있게 된다.
구체적으로, 본 발명은 하기 (1) 내지 (108)에 개시된 발명이다:
(1) AILIM에 결합하는 인간 항체.
(2) AILIM이 인간으로부터 유래되는, 상기 (1)의 인간 항체.
(3) AILIM에 결합하는 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부.
(4) AILIM이 인간으로부터 유래되는, 상기 (3)의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부.
(5) 인간 모노클로날 항체가 AILIM에 의해 매개되는 세포 내로의 신호 전달을 억제하는 활성을 갖는, 상기 (3) 또는 (4)의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부.
(6) 신호 전달을 억제하는 활성이 하기 (a) 또는 (b)인, 상기 (5)의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부:
(a) AILIM-발현 세포의 증식을 억제하는 활성, 또는
(b) AILIM-발현 세포로부터의 시토킨 생산을 억제하는 활성.
(7) 시토킨이 Th1-유형 또는 Th2-유형 T 세포에 의해 생산되는 시토킨들 중 하나인, 상기 (6)의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부.
(8) 시토킨이 인터페론 γ 또는 인터류킨 4인 상기 (7)의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부.
(9) 인간 모노클로날 항체가 혼합된 림프구 반응을 방지하는 활성을 갖는, 상기 (5)의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부.
(10) 인간 모노클로날 항체가 AILIM에 의해 매개되는 세포 내로의 신호 전달을 유도하는 활성을 갖는, 상기 (3) 또는 (4)의 인간 모노클로날 항체 또는 그의일부.
(11) 신호 전달을 유도하는 활성이 하기 하기 (a) 또는 (b)인, 상기 (10)의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부:
(a) AILIM-발현 세포의 증식을 유도하는 활성, 또는
(b) AILIM-발현 세포로부터의 시토킨 생산을 유도하는 활성.
(12) 시토킨이 Th1-유형 또는 Th2-유형 T 세포에 의해 생산되는 시토킨들 중 하나인, 상기 (11)의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부.
(13) 시토킨이 인터페론 γ 또는 인터류킨 4인 상기 (12)의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부.
(14) 인간 모노클로날 항체가 AILIM-발현 세포에 대한 항체-의존성 세포독성 및/또는 AILIM-발현 세포의 면역 세포용해 또는 세포사멸을 유도하는 활성을 갖는, 상기 (3) 또는 (4)의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부.
(15) 모노클로날 항체와 AILIM간의 결합 속도 상수(ka)가 1.0 x 103(1/M.sec) 이상인, 상기 (3) 또는 (4)의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부.
(16) 결합 속도 상수(ka)가 1.0 x 104(1/M.sec) 이상인, 상기 (15)의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부.
(17) 결합 속도 상수(ka)가 1.0 x 105(1/M.sec) 이상인, 상기 (16)의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부.
(18) 모노클로날 항체와 AILIM간의 해리 속도 상수(kd)가 1.0 x 10-3(1/sec) 이하인, 상기 (3) 또는 (4)의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부.
(19) 해리 속도 상수(kd)가 1.0 x 10-4(1/sec) 이하인, 상기 (18)의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부.
(20) 해리 속도 상수(kd)가 1.0 x 10-5(1/sec) 이하인, 상기 (19)의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부.
(21) 모노클로날 항체와 AILIM간의 해리 상수(Kd)가 1.0 x 10-6(M) 이하인, 상기 (3) 또는 (4)의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부.
(22) 해리 상수(Kd)가 1.0 x 10-7(M) 이하인, 상기 (21)의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부.
(23) 해리 상수(Kd)가 1.0 x 10-8(M) 이하인, 상기 (22)의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부.
(24) 해리 상수(Kd)가 1.0 x 10-9(M) 이하인, 상기 (23)의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부.
(25) 인간 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역을 암호화하는 V 영역 DNA가 인간 면역글로불린 중쇄 V 유전자 분절 1-02 또는 3-13으로부터 유래되는, 상기 (4)의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부.
(26) 인간 모노클로날 항체의 경쇄 가변 영역을 암호화하는 V 영역 DNA가 인간 면역글로불린 경쇄 V 유전자 분절 L5 또는 A27로부터 유래되는, 상기 (4)의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부.
(27) 인간 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역을 암호화하는 V 영역 DNA가 인간 면역글로불린 중쇄 V 유전자 분절 1-02 또는 3-13으로부터 유래되고, 인간 모노클로날 항체의 경쇄 가변 영역을 암호화하는 V 영역 DNA가 인간 면역글로불린 경쇄 V 유전자 분절 L5 또는 A27로부터 유래되는, 상기 (25) 또는 (26)의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부.
(28) 인간 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역을 암호화하는 V 영역 DNA가 인간 면역글로불린 중쇄 V 유전자 분절 1-02로부터 유래되고, 인간 모노클로날 항체의 경쇄 가변 영역을 암호화하는 V 영역 DNA가 인간 면역글로불린 경쇄 V 유전자 분절 L5로부터 유래되는, 상기 (27)의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부.
(29) 인간 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역을 암호화하는 V 영역 DNA가 인간 면역글로불린 중쇄 V 유전자 분절 3-13으로부터 유래되고, 인간 모노클로날 항체의 경쇄 가변 영역을 암호화하는 V 영역 DNA가 인간 면역글로불린 경쇄 V 유전자 분절 A27로부터 유래되는, 상기 (27)의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부.
(30) 인간 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역이 하기 (a) 내지 (f) 중 어느 하나에 정의된 아미노산 서열을 갖는, 상기 (4)의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부:
(a) 서열번호: 28의 20 번 내지 117 번에 위치한 아미노산을 포함하는 아미노산 서열,
(b) 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실 또는 치환되거나, 또는 하나 이상의 아미노산 잔기가 삽입 또는 부가된, 서열번호: 28의 20 번 내지 117 번에 위치한 아미노산을 포함하는 아미노산 서열,
(c) 서열번호: 32의 20 번 내지 116 번에 위치한 아미노산을 포함하는 아미노산 서열,
(d) 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실 또는 치환되거나, 또는 하나 이상의 아미노산 잔기가 삽입 또는 부가된, 서열번호: 32의 20 번 내지 116 번에 위치한 아미노산을 포함하는 아미노산 서열,
(e) 서열번호: 36의 20 번 내지 116 번에 위치한 아미노산을 포함하는 아미노산 서열, 또는
(f) 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실 또는 치환되거나, 또는 하나 이상의 아미노산 잔기가 삽입 또는 부가된, 서열번호: 36의 20 번 내지 116 번에 위치한 아미노산을 포함하는 아미노산 서열.
(31) 인간 모노클로날 항체의 중쇄 폴리펩티드가 하기 (a) 내지 (f) 중 어느 하나에 정의된 아미노산 서열을 갖는, 상기 (4)의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부:
(a) 서열번호: 28의 20 번 내지 470 번에 위치한 아미노산을 포함하는 아미노산 서열,
(b) 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실 또는 치환되거나, 또는 하나 이상의아미노산 잔기가 삽입 또는 부가된, 서열번호: 28의 20 번 내지 470 번에 위치한 아미노산을 포함하는 아미노산 서열,
(c) 서열번호: 32의 20 번 내지 470 번에 위치한 아미노산을 포함하는 아미노산 서열,
(d) 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실 또는 치환되거나, 또는 하나 이상의 아미노산 잔기가 삽입 또는 부가된, 서열번호: 32의 20 번 내지 470 번에 위치한 아미노산을 포함하는 아미노산 서열,
(e) 서열번호: 36의 20 번 내지 470 번에 위치한 아미노산을 포함하는 아미노산 서열, 또는
(f) 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실 또는 치환되거나, 또는 하나 이상의 아미노산 잔기가 삽입 또는 부가된, 서열번호: 36의 20 번 내지 470 번에 위치한 아미노산을 포함하는 아미노산 서열.
(32) 인간 모노클로날 항체의 경쇄 가변 영역이 하기 (a) 내지 (f) 중 어느 하나에 정의된 아미노산 서열을 갖는, 상기 (4)의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부:
(a) 서열번호: 30의 23 번 내지 116 번에 위치한 아미노산을 포함하는 아미노산 서열,
(b) 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실 또는 치환되거나, 또는 하나 이상의 아미노산 잔기가 삽입 또는 부가된, 서열번호: 30의 23 번 내지 116 번에 위치한 아미노산을 포함하는 아미노산 서열,
(c) 서열번호: 34의 21 번 내지 116 번에 위치한 아미노산을 포함하는 아미노산 서열,
(d) 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실 또는 치환되거나, 또는 하나 이상의 아미노산 잔기가 삽입 또는 부가된, 서열번호: 34의 21 번 내지 116 번에 위치한 아미노산을 포함하는 아미노산 서열,
(e) 서열번호: 38의 21 번 내지 116 번에 위치한 아미노산을 포함하는 아미노산 서열, 또는
(f) 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실 또는 치환되거나, 또는 하나 이상의 아미노산 잔기가 삽입 또는 부가된, 서열번호: 38의 21 번 내지 116 번에 위치한 아미노산을 포함하는 아미노산 서열.
(33) 인간 모노클로날 항체의 경쇄 폴리펩티드가 하기 (a) 내지 (f) 중 어느 하나에 정의된 아미노산 서열을 갖는, 상기 (4)의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부:
(a) 서열번호: 30의 23 번 내지 236 번에 위치한 아미노산을 포함하는 아미노산 서열,
(b) 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실 또는 치환되거나, 또는 하나 이상의 아미노산 잔기가 삽입 또는 부가된, 서열번호: 30의 23 번 내지 236 번에 위치한 아미노산을 포함하는 아미노산 서열,
(c) 서열번호: 34의 21 번 내지 236 번에 위치한 아미노산을 포함하는 아미노산 서열,
(d) 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실 또는 치환되거나, 또는 하나 이상의 아미노산 잔기가 삽입 또는 부가된, 서열번호: 34의 21 번 내지 236 번에 위치한 아미노산을 포함하는 아미노산 서열,
(e) 서열번호: 38의 21 번 내지 236 번에 위치한 아미노산을 포함하는 아미노산 서열, 또는
(f) 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실 또는 치환되거나, 또는 하나 이상의 아미노산 잔기가 삽입 또는 부가된, 서열번호: 38의 21 번 내지 236 번에 위치한 아미노산을 포함하는 아미노산 서열.
(34) 인간 모노클로날 항체가 하기 특징 (a) 및 (b)를 갖는, 상기 (4)의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부:
(a) 중쇄 가변 영역이 서열번호: 28의 아미노산 20 번 내지 117 번의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖고; 또한
(b) 경쇄 가변 영역이 서열번호: 30의 아미노산 23 번 내지 116 번의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다.
(35) 인간 모노클로날 항체가 하기 특징 (a) 및 (b)를 갖는, 상기 (4)의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부:
(a) 중쇄 폴리펩티드가 서열번호: 28의 아미노산 20 번 내지 470 번의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖고; 또한
(b) 경쇄 폴리펩티드가 서열번호: 30의 아미노산 23 번 내지 236 번의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다.
(36) 인간 모노클로날 항체가 하기 특징 (a) 및 (b)를 갖는, 상기 (4)의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부:
(a) 중쇄 가변 영역이 서열번호: 32의 아미노산 20 번 내지 116 번의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖고; 또한
(b) 경쇄 가변 영역이 서열번호: 34의 아미노산 21 번 내지 116 번의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다.
(37) 인간 모노클로날 항체가 하기 특징 (a) 및 (b)를 갖는, 상기 (4)의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부:
(a) 중쇄 폴리펩티드가 서열번호: 32의 아미노산 20 번 내지 470 번의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖고; 또한
(b) 경쇄 폴리펩티드가 서열번호: 34의 아미노산 21 번 내지 236 번의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다.
(38) 인간 모노클로날 항체가 하기 특징 (a) 및 (b)를 갖는, 상기 (4)의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부:
(a) 중쇄 가변 영역이 서열번호: 36의 아미노산 20 번 내지 116 번의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖고; 또한
(b) 경쇄 가변 영역이 서열번호: 38의 아미노산 21 번 내지 116 번의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다.
(39) 인간 모노클로날 항체가 하기 특징 (a) 및 (b)를 갖는, 상기 (4)의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부:
(a) 중쇄 폴리펩티드가 서열번호: 36의 아미노산 20 번 내지 470 번의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖고; 또한
(b) 경쇄 폴리펩티드가 서열번호: 38의 아미노산 21 번 내지 236 번의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다.
(40) 인간 모노클로날 항체가 인간 항체를 생산할 수 있는 트랜스제닉 비-인간 포유동물로부터 유래된 모노클로날 항체인, 상기 (3) 내지 (29) 중 어느 하나의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부.
(41) 인간 모노클로날 항체가, 인간 항체를 생산할 수 있는 트랜스제닉 비-인간 포유동물을, AILIM-발현 세포, 상기 세포로부터 유래된 막 분획, AILIM을 구성하는 전체 분자 또는 그의 일부, 또는 AILIM을 암호화하는 유전자 또는 그의 일부로 면역시킴으로써 수득되는, 상기 (40)의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부.
(42) 트랜스제닉 비-인간 포유동물이 트랜스제닉 마우스인, 상기 (40) 또는 (41)의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부.
(43) 하기 (a) 내지 (f)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 또는 그의 일부:
(a) 서열번호: 28의 아미노산 20 번 내지 117 번의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
(b) 서열번호: 30의 아미노산 23 번 내지 116 번의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
(c) 서열번호: 32의 아미노산 20 번 내지 116 번의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
(d) 서열번호: 34의 아미노산 21 번 내지 116 번의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
(e) 서열번호: 36의 아미노산 20 번 내지 116 번의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및
(f) 서열번호: 38의 아미노산 21 번 내지 116 번의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
(44) 하기 (a) 내지 (f)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 또는 그의 일부:
(a) 서열번호: 28의 아미노산 20 번 내지 470 번의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
(b) 서열번호: 30의 아미노산 23 번 내지 236 번의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
(c) 서열번호: 32의 아미노산 20 번 내지 470 번의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
(d) 서열번호: 34의 아미노산 21 번 내지 236 번의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
(e) 서열번호: 36의 아미노산 20 번 내지 470 번의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및
(f) 서열번호: 38의 아미노산 21 번 내지 236 번의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
(45) 하기 (a) 내지 (f)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 DNA 또는 그의 일부:
(a) 서열번호: 27의 뉴클레오티드 126 번 내지 419 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA,
(b) 서열번호: 29의 뉴클레오티드 105 번 내지 386 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA,
(c) 서열번호: 31의 뉴클레오티드 151 번 내지 441 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA,
(d) 서열번호: 33의 뉴클레오티드 88 번 내지 375 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA,
(e) 서열번호: 35의 뉴클레오티드 153 번 내지 443 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 및
(f) 서열번호: 37의 뉴클레오티드 93 번 내지 380 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA.
(46) 하기 (a) 내지 (f)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 DNA 또는 그의 일부:
(a) 서열번호: 27의 뉴클레오티드 69 번 내지 1481 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA,
(b) 서열번호: 29의 뉴클레오티드 39 번 내지 749 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA,
(c) 서열번호: 31의 뉴클레오티드 94 번 내지 1506 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA,
(d) 서열번호: 33의 뉴클레오티드 28 번 내지 738 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA,
(e) 서열번호: 35의 뉴클레오티드 96 번 내지 1508 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 및
(f) 서열번호: 37의 뉴클레오티드 33 번 내지 743 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA.
(47) 상기 (43) 내지 (46) 중 어느 하나의 DNA를 포함하는 벡터.
(48) 하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 DNA를 포함하는 상기 (47)의 벡터:
(a) 서열번호: 27의 뉴클레오티드 126 번 내지 419 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA,
(b) 서열번호: 31의 뉴클레오티드 151 번 내지 441 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 또는
(c) 서열번호: 35의 뉴클레오티드 153 번 내지 443 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA.
(49) 하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 DNA를 포함하는 상기 (47)의 벡터:
(a) 서열번호: 27의 뉴클레오티드 69 번 내지 1481 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA,
(b) 서열번호: 31의 뉴클레오티드 94 번 내지 1506 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 또는
(c) 서열번호: 35의 뉴클레오티드 96 번 내지 1508 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA.
(50) 하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 DNA를 포함하는 상기 (47)의 벡터:
(a) 서열번호: 29의 뉴클레오티드 105 번 내지 386 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA,
(b) 서열번호: 33의 뉴클레오티드 88 번 내지 375 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 또는
(c) 서열번호: 37의 뉴클레오티드 93 번 내지 380 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA.
(51) 하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 DNA를 포함하는 상기 (47)의 벡터:
(a) 서열번호: 29의 뉴클레오티드 39 번 내지 749 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA,
(b) 서열번호: 33의 뉴클레오티드 28 번 내지 738 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 또는
(c) 서열번호: 37의 뉴클레오티드 33 번 내지 743 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA.
(52) 하기 (a) 및 (b)의 DNA를 포함하는 상기 (47)의 벡터:
(a) 서열번호: 27의 뉴클레오티드 126 번 내지 419 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 및
(b) 서열번호: 29의 뉴클레오티드 105 번 내지 386 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA.
(53) 하기 (a) 및 (b)의 DNA를 포함하는 상기 (47)의 벡터:
(a) 서열번호: 27의 뉴클레오티드 69 번 내지 1481 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 및
(b) 서열번호: 29의 뉴클레오티드 39 번 내지 749 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA.
(54) 하기 (a) 및 (b)의 DNA를 포함하는 상기 (47)의 벡터:
(a) 서열번호: 31의 뉴클레오티드 151 번 내지 441 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 및
(b) 서열번호: 33의 뉴클레오티드 88 번 내지 375 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA.
(55) 하기 (a) 및 (b)의 DNA를 포함하는 상기 (47)의 벡터:
(a) 서열번호: 31의 뉴클레오티드 94 번 내지 1506 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 및
(b) 서열번호: 33의 뉴클레오티드 28 번 내지 738 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA.
(56) 하기 (a) 및 (b)의 DNA를 포함하는 상기 (47)의 벡터:
(a) 서열번호: 35의 뉴클레오티드 153 번 내지 443 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 및
(b) 서열번호: 37의 뉴클레오티드 93 번 내지 380 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA.
(57) 하기 (a) 및 (b)의 DNA를 포함하는 상기 (47)의 벡터:
(a) 서열번호: 35의 뉴클레오티드 96 번 내지 1508 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 및
(b) 서열번호: 37의 뉴클레오티드 33 번 내지 743 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA.
(58) 상기 (3) 내지 (42) 중 어느 하나의 인간 모노클로날 항체를 생산하는 세포.
(59) 인간 모노클로날 항체를 생산할 수 있는 포유동물로부터 유래된 B 세포와 포유동물로부터 유래된 골수종 세포를 융합시켜 수득한 융합된 세포인 상기 (58)의 세포.
(60) 하기 (a)에 개시된 DNA 또는 상기 DNA를 포함하는 벡터, 하기 (b)에 개시된 DNA 또는 상기 DNA를 포함하는 벡터, 또는 하기 (a) 및 (b)에 개시된 DNA 모두 또는 상기 DNA들 모두를 포함하는 벡터를 전달함으로써 형질전환시킨 유전자 재조합 숙주:
(a) 인간 AILIM에 결합하는 모노클로날 항체의 중쇄 폴리펩티드 또는 그의 일부를 암호화하는 DNA, 또는
(b) 인간 AILIM에 결합하는 모노클로날 항체의 경쇄 폴리펩티드 또는 그의 일부를 암호화하는 DNA.
(61) 모노클로날 항체가 인간 모노클로날 항체인, 상기 (60)의 유전자 재조합 숙주.
(62) 포유동물 세포인, 상기 (60) 또는 (61)의 유전자 재조합 숙주.
(63) 포유동물 수정란인, 상기 (60) 또는 (61)의 유전자 재조합 숙주.
(64) 중쇄 폴리펩티드가 하기 (a) 내지 (c)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 중쇄 폴리펩티드들 중 하나인, 상기 (60) 내지 (63) 중 어느 하나의 유전자 재조합 숙주:
(a) 서열번호: 28의 아미노산 20 번 내지 117 번의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드,
(b) 서열번호: 32의 아미노산 20 번 내지 116 번의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드,
(c) 서열번호: 36의 아미노산 20 번 내지 116 번의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드.
(65) 중쇄 폴리펩티드가 하기 (a) 내지 (c)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 중쇄 폴리펩티드들 중 하나인, 상기 (60) 내지 (63) 중 어느 하나의 유전자 재조합 숙주:
(a) 서열번호: 28의 아미노산 20 번 내지 470 번의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드,
(b) 서열번호: 32의 아미노산 20 번 내지 470 번의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드, 및
(c) 서열번호: 36의 아미노산 20 번 내지 470 번의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드.
(66) 경쇄 폴리펩티드가 하기 (a) 내지 (c)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 경쇄 폴리펩티드들 중 하나인, 상기 (60) 내지 (63) 중 어느 하나의 유전자 재조합 숙주:
(a) 서열번호: 30의 아미노산 23 번 내지 116 번의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드,
(b) 서열번호: 34의 아미노산 21 번 내지 116 번의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드,
(c) 서열번호: 38의 아미노산 21 번 내지 116 번의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드.
(67) 경쇄 폴리펩티드가 하기 (a) 내지 (c)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 경쇄 폴리펩티드들 중 하나인, 상기 (60) 내지 (63) 중 어느 하나의 유전자 재조합 숙주:
(a) 서열번호: 30의 아미노산 23 번 내지 236 번의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드,
(b) 서열번호: 34의 아미노산 21 번 내지 236 번의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드, 및
(c) 서열번호: 38의 아미노산 21 번 내지 236 번의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드.
(68) 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드가 각각 하기 (a) 및 (b)에 정의된 것들인, 상기 (60) 내지 (63) 중 어느 하나의 유전자 재조합 숙주:
(a) 서열번호: 28의 아미노산 20 번 내지 117 번의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드, 및
(b) 서열번호: 30의 아미노산 23 번 내지 116 번의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드.
(69) 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드가 각각 하기 (a) 및 (b)에 정의된 것들인, 상기 (60) 내지 (63) 중 어느 하나의 유전자 재조합 숙주:
(a) 서열번호: 28의 아미노산 20 번 내지 470 번의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드, 및
(b) 서열번호: 30의 아미노산 23 번 내지 236 번의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드.
(70) 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드가 각각 하기 (a) 및 (b)에 정의된 것들인, 상기 (60) 내지 (63) 중 어느 하나의 유전자 재조합 숙주:
(a) 서열번호: 32의 아미노산 20 번 내지 116 번의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드, 및
(b) 서열번호: 34의 아미노산 21 번 내지 116 번의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드.
(71) 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드가 각각 하기 (a) 및 (b)에 정의된 것들인, 상기 (60) 내지 (63) 중 어느 하나의 유전자 재조합 숙주:
(a) 서열번호: 32의 아미노산 20 번 내지 470 번의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드, 및
(b) 서열번호: 34의 아미노산 21 번 내지 236 번의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드.
(72) 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드가 각각 하기 (a) 및 (b)에 정의된 것들인, 상기 (60) 내지 (63) 중 어느 하나의 유전자 재조합 숙주:
(a) 서열번호: 36의 아미노산 20 번 내지 116 번의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드, 및
(b) 서열번호: 38의 아미노산 21 번 내지 116 번의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드.
(73) 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드가 각각 하기 (a) 및 (b)에 정의된 것들인, 상기 (60) 내지 (63) 중 어느 하나의 유전자 재조합 숙주:
(a) 서열번호: 36의 아미노산 20 번 내지 470 번의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드, 및
(b) 서열번호: 38의 아미노산 21 번 내지 236 번의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드.
(74) 중쇄 폴리펩티드를 암호화하는 DNA가 하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 정의된 DNA인, 상기 (60) 내지 (63) 중 어느 하나의 유전자 재조합 숙주:
(a) 서열번호: 27의 뉴클레오티드 126 번 내지 419 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA,
(b) 서열번호: 31의 뉴클레오티드 151 번 내지 441 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 및
(c) 서열번호: 35의 뉴클레오티드 153 번 내지 443 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA.
(75) 중쇄 폴리펩티드를 암호화하는 DNA가 하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 정의된 DNA인, 상기 (60) 내지 (63) 중 어느 하나의 유전자 재조합 숙주:
(a) 서열번호: 27의 뉴클레오티드 69 번 내지 1481 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA,
(b) 서열번호: 31의 뉴클레오티드 94 번 내지 1506 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 및
(c) 서열번호: 35의 뉴클레오티드 96 번 내지 1508 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA.
(76) 경쇄 폴리펩티드를 암호화하는 DNA가 하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 정의된 DNA인, 상기 (60) 내지 (63) 중 어느 하나의 유전자 재조합 숙주:
(a) 서열번호: 29의 뉴클레오티드 105 번 내지 386 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA,
(b) 서열번호: 33의 뉴클레오티드 88 번 내지 375 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 및
(c) 서열번호: 37의 뉴클레오티드 93 번 내지 380 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA.
(77) 경쇄 폴리펩티드를 암호화하는 DNA가 하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 정의된 DNA인, 상기 (60) 내지 (63) 중 어느 하나의 유전자 재조합 숙주:
(a) 서열번호: 29의 뉴클레오티드 39 번 내지 749 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA,
(b) 서열번호: 33의 뉴클레오티드 28 번 내지 738 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 및
(c) 서열번호: 37의 뉴클레오티드 33 번 내지 743 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA.
(78) 중쇄 폴리펩티드를 암호화하는 DNA가 하기 (a)에 개시된 DNA이고, 경쇄 폴리펩티드를 암호화하는 DNA가 하기 (b)에 개시된 DNA인, 상기 (60) 내지 (63) 중 어느 하나의 유전자 재조합 숙주:
(a) 서열번호: 27의 뉴클레오티드 126 번 내지 419 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 및
(b) 서열번호: 29의 뉴클레오티드 105 번 내지 386 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA.
(79) 중쇄 폴리펩티드를 암호화하는 DNA가 하기 (a)에 개시된 DNA이고, 경쇄 폴리펩티드를 암호화하는 DNA가 하기 (b)에 개시된 DNA인, 상기 (60) 내지 (63) 중 어느 하나의 유전자 재조합 숙주:
(a) 서열번호: 27의 뉴클레오티드 69 번 내지 1481 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 및
(b) 서열번호: 29의 뉴클레오티드 39 번 내지 749 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA.
(80) 중쇄 폴리펩티드를 암호화하는 DNA가 하기 (a)에 개시된 DNA이고, 경쇄 폴리펩티드를 암호화하는 DNA가 하기 (b)에 개시된 DNA인, 상기 (60) 내지 (63) 중 어느 하나의 유전자 재조합 숙주:
(a) 서열번호: 31의 뉴클레오티드 151 번 내지 441 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 및
(b) 서열번호: 33의 뉴클레오티드 88 번 내지 375 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA.
(81) 중쇄 폴리펩티드를 암호화하는 DNA가 하기 (a)에 개시된 DNA이고, 경쇄 폴리펩티드를 암호화하는 DNA가 하기 (b)에 개시된 DNA인, 상기 (60) 내지 (63) 중 어느 하나의 유전자 재조합 숙주:
(a) 서열번호: 31의 뉴클레오티드 94 번 내지 1506 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 및
(b) 서열번호: 33의 뉴클레오티드 28 번 내지 738 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA.
(82) 중쇄 폴리펩티드를 암호화하는 DNA가 하기 (a)에 개시된 DNA이고, 경쇄 폴리펩티드를 암호화하는 DNA가 하기 (b)에 개시된 DNA인, 상기 (60) 내지 (63) 중어느 하나의 유전자 재조합 숙주:
(a) 서열번호: 35의 뉴클레오티드 153 번 내지 443 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 및
(b) 서열번호: 37의 뉴클레오티드 93 번 내지 380 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA.
(83) 중쇄 폴리펩티드를 암호화하는 DNA가 하기 (a)에 개시된 DNA이고, 경쇄 폴리펩티드를 암호화하는 DNA가 하기 (b)에 개시된 DNA인, 상기 (60) 내지 (63) 중 어느 하나의 유전자 재조합 숙주:
(a) 서열번호: 35의 뉴클레오티드 96 번 내지 1508 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 및
(b) 서열번호: 37의 뉴클레오티드 33 번 내지 743 번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA.
(84) 상기 (60) 내지 (62) 중 어느 하나, 또는 상기 (64) 내지 (83) 중 어느 하나의 유전자 재조합 숙주(단, 숙주가 수정란인 경우는 제외)에 의해 생산되는 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부.
(85) 상기 (1) 또는 (2)의 인간 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
(86) 상기 (3) 내지 (42) 중 어느 하나의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
(87) 상기 (84)의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 일부 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
(88) AILIM에 의해 매개되는 세포 내로의 신호 전달을 억제하는데 사용되는, 상기 (85) 내지 (87) 중 어느 하나의 약학 조성물.
(89) AILIM-발현 세포의 증식을 방지하는데 사용되는, 상기 (85) 내지 (87) 중 어느 하나의 약학 조성물.
(90) AILIM-발현 세포로부터의 시토킨의 생산을 방지하는데 사용되는, 상기 (85) 내지 (87) 중 어느 하나의 약학 조성물.
(91) AILIM에 의해 매개되는 세포 내로의 신호 전달을 유도하는데 사용되는, 상기 (85) 내지 (87) 중 어느 하나의 약학 조성물.
(92) AILIM-발현 세포의 증식을 유도하는데 사용되는, 상기 (85) 내지 (87) 중 어느 하나의 약학 조성물.
(93) AILIM-발현 세포로부터의 시토킨의 생산을 유도하는데 사용되는, 상기 (85) 내지 (87) 중 어느 하나의 약학 조성물.
(94) AILIM-발현 세포에 대한 항체-의존성 세포독성 및/또는 AILIM-발현 세포의 면역 세포용해 또는 세포사멸을 유도하는데 사용되는, 상기 (85) 내지 (87) 중 어느 하나의 약학 조성물.
(95) AILIM에 의해 매개되는 신호 전달의 조절 활성을 갖는 물질, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 지연성 알레르기의 방지, 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
(96) 물질이 단백질 물질인, 상기 (95)의 약학 조성물.
(97) 단백질 물질이
a) AILIM에 결합하는 항체 또는 그의 일부;
b) AILIM의 세포 외 영역 전체 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드;
c) AILIM의 세포 외 영역 전체 또는 그의 일부, 및 면역글로불린 중쇄의 불변 영역(constant region) 전체 또는 그의 일부를 포함하는 융합 폴리펩티드; 및
d) AILIM에 결합하는 폴리펩티드
로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 상기 (96)의 약학 조성물.
(98) AILIM에 결합하는 항체가 상기 (1) 또는 (2)의 인간 항체인, 상기 (97)의 약학 조성물.
(99) AILIM에 결합하는 항체가 상기 (3) 내지 (42) 중 어느 하나의 인간 모노클로날 항체인, 상기 (97)의 약학 조성물.
(100) AILIM에 대한 항체가 상기 (84)의 인간 모노클로날 항체인, 상기 (97)의 약학 조성물.
(101) 물질이 비-단백질 물질인, 상기 (95)의 약학 조성물.
(102) 비-단백질 물질이 DNA, RNA, 또는 화학 합성된 화합물인, 상기 (101)의 약학 조성물.
(103) (a) AILIM의 세포 외 영역 전체 또는 그의 일부가 고정화된 불용성 담체를 제조하고;
(b) 탐지 가능한 신호를 방출하는 표지 물질로 표지된 AILIM 리간드의 세포 외 영역 전체 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드를 제조하고;
(c) 상기 과정 (b)의 폴리펩티드를 상기 과정 (a)의 불용성 담체와 반응시키고;
(d) 상기 과정 (a)의 불용성 담체, 상기 과정 (b)의 폴리펩티드, 및 상기 물질을 서로 임의적인 순서로 반응시키고;
(e) 상기 과정 (c)에서 제조된 복합체 중에 함유된 상기 표지 물질로부터 방출되는 신호, 및 상기 과정 (d)에서 제조된 복합체 중에 함유된 상기 표지 물질로부터 방출되는 신호를 각각 탐지하고;
(f) 상기 과정 (e)에서 탐지된 각 신호들의 크기를 비교함
을 포함하는, AILIM 또는 AILIM 리간드에 결합하는 물질의 동정 방법.
(104) (a) AILIM 리간드의 세포 외 영역 전체 또는 그의 일부가 고정화된 불용성 담체를 제조하고;
(b) 탐지 가능한 신호를 방출하는 표지 물질로 표지된 AILIM의 세포 외 영역 전체 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드를 제조하고;
(c) 상기 과정 (b)의 폴리펩티드를 상기 과정 (a)의 불용성 담체와 반응시키고;
(d) 상기 과정 (a)의 불용성 담체, 상기 과정 (b)의 폴리펩티드, 및 상기 물질을 서로 임의적인 순서로 반응시키고;
(e) 상기 과정 (c)에서 제조된 복합체 중에 함유된 상기 표지 물질로부터 방출되는 신호, 및 상기 과정 (d)에서 제조된 복합체 중에 함유된 상기 표지 물질로부터 방출되는 신호를 각각 탐지하고;
(f) 상기 과정 (e)에서 탐지된 각 신호들의 크기를 비교함
을 포함하는, AILIM 또는 AILIM 리간드에 결합하는 물질의 동정 방법.
(105) AILIM의 세포 외 영역 전체 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드가, AILIM의 세포 외 영역 전체 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드, 및 면역글로불린 중쇄의 불변 영역 전체 또는 그의 일부를 포함하는 융합 폴리펩티드인, 상기 (103) 또는 (104)의 방법.
(106) AILIM 리간드의 세포 외 영역 전체 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드가, AILIM 리간드의 세포 외 영역 전체 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드, 및 면역글로불린 중쇄의 불변 영역 전체 또는 그의 일부를 포함하는 융합 폴리펩티드인, 상기 (103) 또는 (104)의 방법.
(107) AILIM이 인간 AILIM인, 상기 (103) 내지 (106) 중 어느 하나의 방법.
(108) AILIM 리간드가 인간 AILIM 리간드인, 상기 (103) 내지 (107) 중 어느 하나의 방법.
본 발명을 그의 용어를 정의함으로써 하기에 상세히 개시한다.
본 원에서 "포유동물"이란 인간, 소, 염소, 토끼, 마우스, 래트, 햄스터 및 기니 피그를 의미하며; 바람직하게는 인간, 토끼, 래트, 햄스터 또는 마우스, 특히 바람직하게는 인간, 래트, 햄스터 또는 마우스이다.
본 원에 사용된 "인간 이외의 포유동물" 및 "비-인간 포유동물"이란 용어는 동의어로, 상기 정의된 인간 이외의 모든 포유동물을 의미한다.
본 원에 사용된 "아미노산"이란 용어는 자연에 존재하는 모든 아미노산, 바람직하게는 하기 나타낸 바와 같은 알파벳의 3문자 표기법 또는 1문자 표기법에 따라 개시된 것들을 의미한다:
글리신(Gly/G), 알라닌(Ala/A), 발린(Val/V), 류신(Leu/L), 이소류신(Ile/I), 세린(Ser/S), 트레오닌(Thr/T), 아스파르트산(Asp/D), 글루탐산(Glu/E), 아스파라긴(Asn/N), 글루타민(Gln/Q), 리신(Lys/K), 아르기닌(Arg/R), 시스테인(Cys/C), 메티오닌(Met/M), 페닐알라닌(Phe/F), 티로신(Tyr/Y), 트립토판(Trp/W), 히스티딘(His/H), 프롤린(Pro/P).
본 원에 사용된 "AILIM"이란 용어는 활성화 유도 림프구 면역 조절 분자의 약어로, 선행 보고서에서 이미 개시한 바와 같은 구조와 기능을 갖는 포유동물 세포 표면 분자, 보다 바람직하게는 특히 인간-유래된 AILIM(예를 들어, International Immunolgy, Vol. 12, No. 1, p. 51-55; GenBank Accession Number: BAA82129(인간), BAA82128(래트), BAA82127(래트 변종), 및 BAA82126(마우스))을 가리킨다.
한편으로, 상기 AILIM을 또한 ICOS로도 칭하며(일본 특허 출원 공개 공보(JP-A) 제 평 11-29599 호, 국제 특허 출원 제 WO98/38216 호), 이들 약어는 동일한 분자를 가리킨다.
본 원에 사용된 "AILIM 리간드"란 상기 부자극 분자 AILIM(ICOS)과 상호작용하고, B7h, B7RP-1, GL50 또는 LICOS라 칭하는 세포 표면 분자를 의미한다(Nature, Vol. 402, No. 6763, p. 827-832, 1999; Nature Medicine, Vol. 5, No. 12, p.1365-1369, 1999; J. Immunology, Vol. 164, p. 1653-1657, 2000; Curr. Biol. Vol. 10, No. 6, p. 333-336, 2000).
더욱이, 본 원에 사용된 "AILIM"은 또한 참고문헌에 개시된 각 포유동물의 AILIM의 아미노산 서열, 및 특히 바람직하게는 인간 AILIM의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 더욱 또한, 이미 보고된 래트 AILIM 변종(GenBank Accession Number: BAA82127)과 유사한 인간 AILIM 변종이 또한 본 발명의 "AILIM"에 포함된다.
본 원에 사용된 "AILIM 리간드"는 또한 상기와 유사한 의미를 갖는 것으로 정의된다.
본 원에서, "필수적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드"란 하기 개시되는 변형 폴리펩티드를 의미한다.
즉, 상기 변형 폴리펩티드가 천연형 AILIM(특히 바람직하게는 인간-유래된 AILIM)과 필수적으로 동등한 생물학적 성질을 갖는 한, 본 발명의 폴리펩티드이다. 천연형 AILIM의 아미노산 서열을 갖는 것들처럼, 여기에는 다수개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 1 내지 10 개의 아미노산 잔기, 가장 바람직하게는 1 내지 5 개의 아미노산 잔기가 결실 및/또는 변형되고, 여기에 다수개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 1 내지 10 개의 아미노산 잔기, 가장 바람직하게는 1 내지 5 개의 아미노산 잔기가 부가된다.
더욱 또한, 상기는 분자 중의 아미노산 잔기가 다수 치환, 결실, 변형 및 부가된 변형 폴리펩티드일 수도 있다.
본 발명의 "AILIM 리간드"는 또한 상기와 유사한 의미를 갖는 것으로 정의된다.
본 발명의 AILIM(특히 인간 AILIM) 및 AILIM 리간드(특히 인간 AILIM 리간드)를 유전자 재조합 기법 이외에 당해 기술 분야에 널리 공지된 방법들, 예를 들어 화학 합성법, 세포 배양법 등, 또는 이들 방법들을 변형시켜 적절히 사용함으로써 제조할 수 있다.
상기와 같은 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입은 통상적인 방법에 따라 이루어질 수 있다(Experimental Medicine: SUPPLEMENT, "Handbook of Genetic Engineering"(1992); 등).
상기 언급한 바와 같은 변이 폴리펩티드의 제조 방법의 예로는 합성 올리고뉴클레오티드 위치 지정 돌연변이(간극 중복 방법), 니트라이트 또는 설파이트 처리에 의해 점 변이를 무작위로 도입시키는 점 돌연변이, Bal31 효소 등에 의해 결실 변이체를 제조하는 방법, 카세트 돌연변이, 링커 스캐닝 법, 미스 인코포레이션법, 미스 매치 프라이머 법, 불일치 프라이머 법, DNA 분절 합성 방법 등이 있다.
합성 올리고뉴클레오티드 위치 지정 돌연변이(간극 중복 방법)를 예를 들어 하기와 같이 수행할 수 있다. 돌연변이를 목적하는 영역을 앰버 변이를 갖는 M13 파아지 벡터 내에 클로닝시켜 단일-가닥 파아지 DNA를 제조한다. 앰버 변이가 없는 M13 벡터의 RFI DNA를 제한 효소 처리에 의해 선형화시키고, DNA를 상기 언급한 단일-가닥 파아지 DNA와 혼합하고, 변성시키고, 어닐링시켜 "간극 중복 DNA"를 제조한다. 변이가 도입된 합성 올리고뉴클레오티드를 상기 간극 중복 DNA와 하이브리드다이즈시켜, 폐쇄 환상 이중-가닥 DNA를 DNA 폴리머라제 및 DNA 리가제와의 반응에 의해 제조한다. 미스 매치 보수 능력이 결핍된 대장균 mutS 세포를 상기 DNA로 트랜스펙션시킨다. 억제 활성이 없는 대장균 세포를 상기 증식된 파아지로 감염시키고, 앰버 변이가 없는 파아지만을 스크리닝한다.
니트라이트에 의해 점 돌연변이를 도입시키는 방법은 예를 들어 하기 언급하는 바와 같은 원리를 이용한다. DNA를 니트라이트로 처리하는 경우, 염기들이 탈아민화되어 아데닌이 하이포크산틴으로, 시토신이 우라실로, 구아닌이 크산틴으로 변한다. 탈아민화된 DNA를 세포 내에 도입시키면, "A:T" 및 "G:C"가 각각 "G:C" 및 "A:T"로 치환되는데, 그 이유는 하이포크산틴, 우라실 및 크산틴이 각각 DNA 복제에서 시토신, 아데닌 및 티민과 염기 쌍을 형성하기 때문이다. 실제로, 니트라이트로 처리한 단일-가닥 DNA 단편을 "간극 중복 DNA"와 하이브리드 형성시키고, 그 후에 변이체 균주를 합성 올리고뉴클레오티드 위치 지정 돌연변이(간극 중복 방법)와 동일한 방식으로 조작하여 분리시킨다.
또한, 본 원의 "AILIM"은 상기 AILIM의 "일부"를 또한 포함한다. 본 원에서, "일부"란 상기 정의된 AILIM 아미노산 서열의 임의의 부분 서열을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다.
바람직하게는, 상기 일부는 상기 정의된 AILIM(특히 바람직하게는 인간 AILIM)의 세포 외 영역 또는 그의 임의의 일부를 가리킨다.
본 발명에서 "AILIM 리간드"는 또한 상기와 유사한 의미를 갖는 것으로 정의된다.
상기 AILIM의 "일부"(바람직하게는 AILIM의 세포 외 영역 또는 그의 임의의 일부)를 하기 개시하는 당해 기술 분야에 잘 공지된 방법 또는 그의 변형 방법에 따라서, 유전자 재조합 기법 또는 화학 합성법에 의해 제조할 수 있고, 또는 세포 배양 방법에 의해 단리시킨 AILIM(특히 바람직하게는 인간 AILIM)을 단백질 분해 효소 등을 사용하여 적절하게 절단시킴으로써 제조할 수 있다.
"AILIM 리간드의 일부"를 또한 상술한 바와 유사한 방법에 의해 제조할 수 있다.
본 발명의 "인간 항체"는 상기 정의된 AILIM 또는 그의 일부(특히 바람직하게는 인간-유래된 AILIM 또는 그의 일부)에 결합하는 인간 항체이다. 구체적으로, 상기는 인간-유래된 폴리클로날(polyclonal) 항체(인간 폴리클로날 항체, 인간 항혈청) 또는 인간-유래된 모노클로날 항체(인간 모노클로날 항체)를 의미한다.
본 발명의 "인간 모노클로날 항체"는 상기 정의된 AILIM 또는 그의 일부(특히 바람직하게는 인간-유래된 AILIM 또는 그의 일부)에 결합하는 인간 모노클로날 항체이다.
보다 구체적으로, 중쇄(H-사슬)의 가변 및 불변 영역, 및 경쇄(L-사슬)의 가변 및 불변 영역을 포함하는 모든 영역들은 상기 인간 면역글로불린을 암호화하는 유전자로부터 유래된 인간 면역글로불린으로 이루어진다. L-사슬의 예로는 인간 κ 사슬 또는 인간 λ 사슬이 있다.
본 발명의 AILIM(특히 바람직하게는 인간-유래된 AILIM) 또는 그의 일부에 결합하는 인간 모노클로날 항체는 상기 언급한 (5) 내지 (42) 또는 (84) 중 어느하나에 정의된 특징을 갖는 인간 모노클로날 항체이다.
보다 구체적으로, 하기 실시예 및 도면에 개시되는 다양한 특징과 산업상 이용가능성을 갖는 다양한 인간 모노클로날 항체를 포함한다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체의 바람직한 실시태양은 상기 언급한 (5) 내지 (42) 또는 (84) 중 어느 하나에 정의된 AILIM 또는 그의 일부에 결합하는 인간 모노클로날 항체이다.
가장 바람직한 실시태양은 상기 (30) 또는 (39)에 개시된 인간 AILIM에 결합하는 인간 모노클로날 항체이다.
본 발명의 "인간 모노클로날 항체"를, 하기 개시되는 면역원들(항원들) 중 임의의 것으로 인간 항체를 생산하는 하기의 트랜스제닉 비-인간 포유동물을 면역시킴으로써 제조할 수 있다.
(a) 세포 표면 상에서 상기 언급한 AILIM(특히 바람직하게는 인간-유래된 AILIM)을 발현하는 인공 수립 세포주 또는 천연 세포(artificially established cell line or natural cell);
(b) 세포 표면상에서 상기 정의된 AILIM(특히 바람직하게는 인간-유래된 AILIM)을 발현하도록 유전자 재조합 기법을 사용하여 제조한 유전자 재조합 세포;
(c) 상기 언급한 (a) 또는 (b)의 세포를 용해시켜 수득한 세포 용해물, 또는 상기 세포 용해물로부터 정제된 AILIM(특히 바람직하게는 인간-유래된 AILIM)의 폴리펩티드 단편;
(d) 가용성 폴리펩티드로서 상기 정의된 AILIM(특히 바람직하게는 인간-유래된 AILIM)의 일부(특히 바람직하게는 세포 외 영역 또는 그의 임의의 바람직한 펩티드)를 발현하도록 유전자 재조합 기법을 사용하여 제조한 유전자 재조합 세포;
(e) 상기 언급한 (d)의 유전자 재조합 세포를 배양하여 수득한 배양 상청액, 또는 상기 배양 상청액으로부터 정제된 AILIM(특히 바람직하게는 인간-유래된 AILIM)의 세포 외 영역 폴리펩티드(가용성 AILIM); 또는
(f) 화학 합성된 AILIM(특히 바람직하게는 인간-유래된 AILIM)의 일부(특히 바람직하게는 세포 외 영역 또는 그의 임의의 바람직한 펩티드).
더욱 또한, 본 발명의 모노클로날 항체는, 또한 "유전자 재조합 숙주"[본 원에서, 상기 숙주는 수정란 이외의 진핵 세포(바람직하게는 포유동물 세포, 예를 들어 CHO, 림프구 및 골수종 세포)로서, 유전자 재조합 기법을 사용하여 본 발명의 상기와 같은 인간 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄 각각을 암호화하는 cDNA(바람직하게는 상기 cDNA를 함유하는 벡터)로 숙주를 형질전환시킴으로써 제조될 수 있고, 유전자 재조합 인간 모노클로날 항체를 생산한다]를 배양함으로써 배양 상청액으로부터 수득할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 모노클로날 항체를, 본 발명의 상기 언급한 (60) 내지 (62) 또는 (64) 내지 (80) 중 어느 하나에 개시된 유전자 재조합 숙주(본 원에서 상기 숙주는 수정란 이외의 진핵 세포(바람직하게는 포유동물 세포, 예를 들어 CHO, 림프구 및 골수종 세포)이다)를 배양함으로써 수득할 수 있다.
또한, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 IgG(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4), IgH, IgA(IgA1 및 IgA2), IgD 또는 IgE에 속하는 임의의 아이소타입(isotype)을 갖는 인간 모노클로날 항체일 수 있다. 바람직하게는, 상기 모노클로날 항체는 IgG(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4), 보다 바람직하게는 IgG1, IgG2 또는 IgG4에 속한다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체를, 하기 개시되는 인간 항체-생산 트랜스제닉 마우스와 같은 인간 항체를 생산하는 트랜스제닉 비-인간 포유동물을 통상적으로 사용되는 공지된 제작 방법에 따라 상기 언급한 (a) 내지 (f)의 면역원들(항원들) 중 임의의 것으로 면역시킴으로써 제조할 수 있다.
즉, 예를 들어, 인간 항체를 생산하는 상기 트랜스제닉 비-인간 포유동물을, 경우에 따라 프로인트 아주반트와 함께 상기 항원으로 면역시킨다. 폴리클로날 항체를, 상기 면역된 동물로부터 수거한 혈청으로부터 수득할 수 있다. 모노클로날 항체를, 상기 면역된 동물로부터 단리된 상기 항체-생산 세포 및 자기항체-생산 능력이 없는 골수종 세포로부터 융합 세포(하이브리도마)를 제조하고, 상기 하이브리도마를 클로닝하여 상기 동물의 면역에 사용되는 항원에 대해 특이적인 친화성을 갖는 모노클로날 항체를 생산하는 클론을 선택함으로써 제조할 수 있다.
보다 구체적으로, 모노클로날 항체를 하기 개시하는 바와 같이 제조할 수 있다. 즉, 상기 인간 항체-생산 트랜스제닉 비-인간 포유동물(특히 바람직하게는 "인간 항체-생산 트랜스제닉 마우스")을, 상기 언급한 (a) 내지 (c)의 면역원들 중 임의의 것을 피하내, 근육내, 정맥내로 족저에 주입하거나, 또는 복강 내로 1 회 내지 수 회 주입하거나, 또는 상기 면역원을 상기 포유동물에 이식함으로써 면역시킨다. 대개는, 처음 면역화 후 1 내지 14일 마다 1 회 내지 4 회 면역화를 수행한다. 최종 면역 후 약 하루 내지 5 일 이내에 상기와 같이 면역시킨 포유동물로부터, 항체-생산 세포가 수득된다. 면역의 회수 및 간격은 예를 들어 사용되는 면역원의 성질에 따라 적절하게 조정될 수 있다.
인간 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를, 쾰러 및 밀슈타인(Kohler and Milstein)의 방법[Nature, Vol.256, pp. 495-497(1975)] 및 그의 변형 방법에 의해 제조할 수 있다. 즉, 상기 언급한 바와 같이 면역시킨 인간 항체-생산 트랜스제닉 비-인간 포유동물로부터 수득된 비장, 림프절, 골수 또는 편도선, 바람직하게는 비장에 함유된 항체-생산 세포를 자기항체-생산 능력이 없는 골수종(바람직하게는 포유동물, 예를 들어 마우스, 래트, 기니 피그, 햄스터, 토끼 또는 인간, 보다 바람직하게는 마우스, 래트 또는 인간으로부터 유래된 것)과 융합시킴으로써, 하이브리도마를 제조한다.
상기 세포 융합에 사용되는 골수종으로서 예를 들어 마우스-유래된 골수종 P3/X63-AG8.653(ATCC No. CRL-1580), P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1), P3/X63-Ag8.U1(P3U1), SP2/0-Ag14(Sp2/0, Sp2), NSO, PAI, F0, 또는 BW5147, 래트-유래된 골수종 210RCY3-Ag.2.3., 또는 인간-유래된 골수종 U-266AR1, GM1500-6TG-A1-2, UC729-6, CEM-AGR, D1R11, 또는 CEM-T15를 사용할 수 있다.
모노클로날 항체 생산 세포(예를 들어 하이브리도마)는, 상기 세포를 예를 들어 미세적정 플레이트에서 배양하고 하이브리도마 증식이 관찰되는 웰 중의 배양 상청액의 상기 언급한 면역화에 사용되는 면역원에 대한 반응성을 예를 들어 방사능 면역분석(RIA) 및 효소-결합된 면역 용매 분석(ELISA)과 같은 효소 분석에 의해측정함으로써 스크리닝될 수 있다.
하이브리도마를 생체 외, 또는 예를 들어 마우스, 래트, 기니 피그, 햄스터 도는 토끼, 바람직하게는 마우스 또는 래트, 보다 바람직하게는 마우스의 복수액에서와 같은 생체 내에서 배양하고, 생성된 배양 상청액 또는 포유동물의 복수액으로부터 항체를 단리시킴으로써, 상기 하이브리도마로부터 모노클로날 항체를 생성시킬 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체를 하기의 방법에 의해 대규모로 제조할 수 있다:
(1) 상기 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 각각 암호화하는 유전자(cDNA 등)를 상기 하이브리도마로부터 클로닝시키고;
(2) 상기 중쇄 및 경쇄를 각각 암호화하는 클로닝된 유전자를 별도의 벡터들 또는 단일 벡터 내에 삽입하여 발현 벡터를 제조하고;
(3) 상기 발현 벡터를 목적하는 비-인간 포유동물(예를 들어, 염소)의 수정란으로 전달하고;
(4) 상기 유전자가 전달된 수정란을 양모의 자궁에 이식시켜 키메라 비-인간 동물을 수득하고;
(5) 상기 키메라 염소를 또 다른 비-인간 동물과 추가로 교미시킴으로써, 상기 내생 유전자에 결합된 각각의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자를 갖는 트랜스제닉 비-인간 포유동물(소, 염소, 양 또는 돼지)을 생산시키고;
(6) 상기 트랜스제닉 비-인간 포유동물의 젖으로부터, 상기 인간 모노클로날 항체 유전자로부터 유래된 모노클로날 항체를 대규모로 수득한다(Nikkei Science,April, 1997, p. 78-84).
모노클로날 항체 생산 세포의 생체 외 배양은, 예를 들어 배양할 세포의 성질, 시험 연구의 목적 및 다양한 배양 방법 조건에 따라, 하이브리도마를 증식, 유지 및 보존시켜 배양 상청액 중의 모노클로날 항체의 생산을 위해, 공지된 영양 배지 또는 공지된 기본 배지로부터 유래된 임의의 영양 배지를 사용하여 수행할 수 있다.
기본 배지의 예로는 저 칼슘 농도 배지, 예를 들어 Ham'F12 배지, MCDB153 배지, 또는 저 칼슘 농도 MEM 배지, 및 고 칼슘 농도 배지, 예를 들어 MCDB104 배지, MEM 배지, D-MEM 배지, RPMI1640 배지, ASF104 배지, 또는 RD 배지가 있다. 상기 기본 배지는 목적에 따라 예를 들어 혈청, 호르몬, 시토킨 및/또는 다양한 무기 또는 유기 물질을 함유할 수 있다.
포화 황산 암모늄 침전, 진성글로불린 침전법, 카프로산 방법, 카프릴산 방법, 이온 교환 크로마토그래피(DEAE 또는 DE52), 항-면역글로불린 컬럼 또는 단백질 A 컬럼을 사용하는 친화성 크로마토그래피에 의해, 상기 언급한 배양 상청액 또는 복수액으로부터 모노클로날 항체를 단리 및 정제할 수 있다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체에는 각 사슬의 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환 또는 부가된 중쇄 및/또는 경쇄로 이루어진 인간 모노클로날 항체가 포함된다.
본 원에서, "하나 이상의 아미노산 잔기"는 다수개의 아미노산, 특히 1 내지 10 개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 1 내지 5 개의 아미노산 잔기를 의미한다.
상기 개시된 바와 같은 부분 변형(결실, 치환, 삽입 또는 부가)은, 본 발명의 인간 모노클로날 항체의 아미노산 서열을 암호화하는 기본 서열의 부분적인 변경에 의해 상기 아미노산 서열에 도입될 수 있다. 이러한 기본 서열의 부분적인 변경은, 공지된 부위-특이적 돌연변이 기법을 사용하여 표준 방법에 의해 도입될 수 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 81, p. 5662-5666, 1984).
"트랜스제닉 인간 항체-생산 비-인간 포유동물", 특히 바람직한 실시태양인 인간 항체-생산 트랜스제닉 마우스를 공개된 문헌에 따라 제조할 수 있다(Nature Genetics, Vol. 7, p. 13-21, 1994; Nature Genetics, Vol. 15, p. 146-156, 1997; 공개된 국제 공보의 일본어 번역문 제 평 4-504365 호; 공개된 공보의 일본어 번역문 제 평 7-509137 호; Nikkei Science, June, p. 40-50, 1995; 국제 특허 공보 제 WO94/25585 호; Nature, Vol. 368, p. 856-859, 1994; 및 공개된 공보의 일본어 번역문 제 평 6-500233 호 등).
구체적으로, 상기 인간 항체-생산 트랜스제닉 마우스를 예를 들어 하기의 방법들로 이루어진 기법을 사용하여 제조할 수 있다:
(1) 마우스 내생 면역 글로불린 중쇄의 유전자 좌의 적어도 일부를 상동 재조합에 의해 약물 내성 마커 유전자(예를 들어 네오마이신 내성 유전자)로 치환시킴으로써 상기 내생 면역글로불린 중쇄 유전자를 기능적으로 불활성화시킨 녹아웃 마우스의 제조;
(2) 마우스 내생 면역 글로불린 경쇄의 유전자 좌의 적어도 일부를 상동 재조합에 의해 약물 내성 마커 유전자(예를 들어 네오마이신 내성 유전자)로 치환시킴으로써 상기 내생 면역글로불린 경쇄 유전자(특히 κ 사슬 유전자)를 기능적으로 불활성화시킨 녹아웃 마우스의 제조;
(3) 거대 유전자를 운반할 수 있는 효모 인공 염색체(YAC)로 대표되는 벡터를 사용하여, 인간 면역 글로불린 중쇄 유전자 좌의 목적하는 영역을 마우스 염색체에 사입시킨 트랜스제닉 마우스의 제조;
(4) 거대 유전자를 운반할 수 있는 효모 인공 염색체(YAC)로 대표되는 벡터를 사용하여, 인간 면역 글로불린 경쇄 유전자 좌(특히 κ 사슬 유전자)의 목적하는 영역을 마우스 염색체에 결합시킨 트랜스제닉 마우스의 제조; 및
(5) 상기 언급한 (1) 내지 (4)의 녹아웃 및 트랜스제닉 마우스들을 임의의 순서로 교미시킴으로써, 내생 면역 글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자 좌들을 모두 기능적으로 불활성화시키고, 인간 면역 글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자 좌들 모두의 목적하는 영역들을 염색체에 삽입시킨 트랜스제닉 마우스의 제조.
상술한 녹아웃 마우스는 마우스 내생 면역 글로불린 유전자 좌의 적당한 영역을 상동 재조합을 기초로 외래 마커 유전자(예를 들어 네오마이신 내성 유전자)로 치환시켜 상기 유전자 좌를 재배열되지 않도록 불활성화시킴으로써 제조할 수 있다. 상기 상동 재조합을 사용하는 불활성화를 위해서, 예를 들어 포지티브 네가티브 선택(PNS)이라 칭하는 방법을 사용할 수 있다(Nikkei Science, May, p. 52-62, 1994).
면역 글로불린 중쇄 유전자 좌의 기능적 불활성화는 예를 들어 J- 또는 C-영역(예를 들어 Cμ 영역)의 일부에 장애를 도입시킴으로써 이루어질 수 있다. 또,면역 글로불린 경쇄(예를 들어 κ 사슬)의 기능적 불활성화는 예를 들어 J- 또는 C-영역의 일부, 또는 J- 및 C-영역 상에 연장되는 영역에 장애를 도입시킴으로써 이루어질 수 있다.
트랜스제닉 마우스를, 대개 트랜스제닉 동물의 제조에 통상적으로 사용되는 방법(예를 들어 문헌[Newest Manual of Animal Cell Experiment, LIC press, Chapter 7, pp. 361-408, (1990)] 참조)에 따라 제조할 수 있다. 구체적으로, 예를 들어 보통의 마우스 배반포(blastocyst)로부터 유래된 HPRT-네가티브(하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 유전자 결핍) ES 세포(embryonic stem cell)를, 상기 인간 면역 글로불린 중쇄 유전자 좌 또는 경쇄 유전자 좌를 암호화하는 유전자 또는 그의 일부 및 HPRT 유전자가 삽입된 YAC 벡터를 함유하는 효모와 스페로플라스트 융합 방법을 사용하여 융합시킨다. 마우스 내생 유전자가 상기 외래 유전자와 통합된 ES 세포를 HAT 선별 방법에 의해 선별한다. 이어서, 상기 스크리닝된 ES 세포를 또 다른 보통의 마우스(배반포)로부터 수득한 수정란에 미세 주입한다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 77, No. 12, pp. 7380-7384(1980); 미국 특허 제 4,873,191 호). 상기 배반포를 양모로서 또 다른 보통의 마우스의 자궁에 이식한다. 이어서 키메라 트랜스제닉 마우스가 상기 양모 마우스로부터 태어난다. 상기 키메라 트랜스제닉 마우스를 보통의 마우스와 교미시킴으로써, 이형 트랜스제닉 마우스를 얻는다. 상기 이형 트랜스제닉 마우스들을 서로 교미시킴으로써 멘델의 법칙에 따라 동형 트랜스제닉 마우스를 얻는다.
본 발명에 사용된 "모노클로날 항체의 일부"는 본 발명의 상기 언급한 인간모노클로날 항체의 부분 영역을 의미하며, 구체적으로, F(ab')2, Fab', Fab, Fv(항체의 가변 단편), sFv, dsFv(디설파이드 안정화된 Fv), 또는 dAb(단일 도메인 항체)가 포함된다(Exp. Opin. Ther. Patents, Vol.6, No.5, pp. 441-456(1996)).
"F(ab')2" 및 "Fab'"는 면역글로불린(모노클로날 항체)을 펩신 및 파파인과 같은 프로테아제로 처리함으로써 제조될 수 있으며, 경첩 영역 중의 각 2 가닥의 H 사슬 사이에 존재하는 디설파이드 결합 부근에서 면역글로불린을 소화(digest)시킴으로써 생성되는 항체 단편을 의미한다. 예를 들어 파파인은 각 2 개의 H 사슬 사이에 존재하는 경첩 영역 중의 디설파이드 결합의 IgG 상류를 절단하여, VL(L 사슬 가변 영역)과 CL(L 사슬 불변 영역)로 구성된 L 사슬과 VH(H 사슬 가변 영역) 및 CHγ1(H 사슬의 불변 영역 중의 γ1 영역)로 구성된 H 사슬 단편이 디설파이드 결합을 통해 그들의 C 말단 영역에서 연결된 2 개의 상동 항체 단편을 생성시킨다. 상기와 같은 2 개의 상동 항체 단편들 각각을 Fab'라 칭한다. 펩신은 또한 경첩 영역 중의 각 2 가닥의 H 사슬 사이에 존재하는 디설파이드 결합의 IgG 하류를 절단하여, 상기 언급한 2 개의 Fab'가 상기 경첩 영역에서 연결된 단편보다 약간 큰 항체 단편을 생성시킨다. 이 항체 단편을 F(ab')2라 칭한다.
본 원에서 "결합 속도 상수(ka)"란 항체 항원 반응 동력학을 토대로 산출된 표적 항원에 대한 상기 모노클로날 항체의 결합 강도(정도)를 가리키는 값을 의미한다. "해리 속도 상수(kd)"란 표적 항원으로부터 상기 모노클로날 항체가 해리되는 강도(정도)를 가리키는 값을 의미한다. "해리 상수(Kd)"는 상기 "해리 속도 상수(kd)"를 상기 "결합 속도 상수(ka)" 값으로 나누어 얻은 값이다. 이러한 상수들을 사용하여 항원에 대한 상기 모노클로날 항체의 친화성과 항원을 중화시키는 그의 활성을 나타낸다.
상기 상수들을 다양한 방법에 따라 분석할 수 있으며, 상업적인 분석 키트인 BiacoreX(Amersham Pharmacia) 또는 유사 키트를 사용하여 상기 키트에 첨부된 사용설명서 및 실험 방법에 따라 쉽게 분석할 수 있다. 상기 키트를 사용하여 얻은 ka, kd 및 Kd 값을 각각 1/M.Sec, 1/Sec 및 M(몰) 단위로 나타낸다. 보다 큰 ka 값은 시험된 모노클로날 항체의 보다 강한 항원 결합 활성을 나타내며, 보다 작은 Kd 값은 항체의 보다 강한 항원 중화 활성을 나타낸다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체는 하기 (1) 내지 (3)에 나타낸 ka, kd 또는 Kd 값을 갖는 것들을 포함한다:
(1) 인간 AILIM 또는 그의 일부에 1.0x104(1/M.Sec) 이상, 바람직하게는 1.0x105(1/M.Sec) 이상의 결합 속도 상수(ka)로 결합하는 인간 모노클로날 항체.
(2) 인간 AILIM 또는 그의 일부에 1.0x10-4(1/Sec) 이하, 바람직하게는 1.0x10-5(1/Sec) 이하의 해리 속도 상수(kd)로 결합하는 인간 모노클로날 항체.
(3) 인간 AILIM 또는 그의 일부에 1.0x10-7(M) 이하, 바람직하게는 1.0x10-8(M) 이하, 보다 바람직하게는 1.0x10-9(M) 이하의 해리 상수(Kd)로 반응하는 인간 모노클로날 항체.
이 경우에, 각각의 상술한 ka, kd 및 Kd 값은 측정 시간에서 다양한 조건들에 따라 오차 한계로 약간 변동될 것이 예상되나, 일반적으로는 실제적인 지수들의 변동은 없다.
본 발명의 "모노클로날 항체-생산 세포" 또는 유전자 재조합 인간 모노클로날 항체-생산 "유전자 재조합 숙주"(본 원에서 상기 숙주는 수정란을 제외한 세포이다)는 본 발명의 상기 언급한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 임의의 세포를 의미한다.
구체적으로, 예를 들어 하기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 개시된 세포를 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다:
(1) 상기 언급한 인간 항체-생산 트랜스제닉 비-인간 포유동물을 상기 정의한 면역원(항원)으로 면역시키고 상기 면역된 동물로부터 세포를 수거함으로써 수득된 인간 모노클로날 항체-생산 B 세포.
(2) 상기와 같이 수득된 인간 모노클로날 항체-생산 B 세포를 포유동물로부터 유래된 골수종 세포와 융합시킴으로써 생성된 상기 언급한 융합 세포(하이브리도마).
(3) 상기 B 세포 및 하이브리도마를 제외한 세포(예를 들어, CHO(중국 햄스터 난소) 세포, BHK(아기 햄스터 신장) 세포, 림프구, 예를 들어 골수종)를 상기인간 모노클로날 항체-생산 B 세포 또는 인간 모노클로날 항체-생산 융합 세포(하이브리도마)로부터 단리된 상기 인간 모노클로날 항체를 암호화하는 유전자(중쇄를 암호화하는 유전자 또는 경쇄를 암호화하는 유전자, 또는 이들 두 유전자 모두)로 형질전환시킴으로써 수득된 유전자 재조합 인간 모노클로날 항체-생산 유전자 재조합 세포.
본 원에서, 상기 (3)에 언급한 유전자 재조합 인간 모노클로날 항체-생산 유전자 재조합 세포는, 즉 상기 (1)에 개시된 B 세포 또는 상기 (2)에서 언급한 하이브리도마에 의해 생성된 인간 모노클로날 항체의 유전자 재조합체를 생산하는 유전자 재조합 세포를 의미한다.
또, 본 발명의 "유전자 재조합 숙주"에서 "숙주"는, 상술한 다양한 포유동물 세포 이외에, 임의의 비-인간 포유동물(염소, 돼지, 양, 소 등)의 수정란을 포함한다. 본 발명의 인간 AILIM에 대한 임의의 모노클로날 항체(바람직하게는 인간 모노클로날 항체)를 암호화하는 유전자(중쇄를 암호화하는 유전자 또는 경쇄를 암호화하는 유전자, 또는 이들 두 유전자 모두)를 상기 수정란으로 전달함으로써, 본 발명의 유전자 재조합 수정란을 얻을 수 있다. 이러한 유전자 재조합 수정란을 사용하여, 젖으로부터 상기 언급한 단백질을 대규모로 생산하기 위한 트랜스제닉 동물을 제조한다(Nikkei Science, April, 1997, p. 78-84).
본 발명을 구성하는 "물질", 구체적으로 "AILIM에 의해 매개되는 신호 전달을 조절하는 활성을 갖는 물질", 보다 구체적으로 "AILIM-발현 세포의 증식 억제 또는 AILIM-발현 세포에 의한 시토킨 생산의 억제 활성을 갖는 물질"은 자연에 존재하는 천연 물질, 또는 인공적으로 제조된 임의의 물질을 의미한다.
본 원의 "AILIM에 결합하는 물질" 및 "AILIM 리간드에 결합하는 물질"과 관련된 "물질"도 또한 자연에 존재하는 천연 물질, 또는 인공적으로 제조된 임의의 물질을 의미한다.
본 원에서, "AILIM에 의해 매개되는 신호 전달"이란 AILIM-발현 세포에서 임의의 표현형의 변화(세포 증식, 세포의 활성화, 세포의 불활성화, 세포사멸 및/또는 AILIM-발현 세포로부터 임의의 시토킨을 생산하는 능력의 변화)를 일으키는, AILIM을 통한 신호 전달을 의미한다.
"물질"은 주로 "단백질 물질"과 "비-단백질 물질"로 분류될 수 있다.
"단백질 물질"의 예로는 하기의 폴리펩티드, 항체(폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 모노클로날 항체의 일부, 및 특히 바람직하게는 상기 언급한 인간 항체)가 있다.
물질이 항체인 경우, 상기 물질은 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 물질이 모노클로날 항체인 경우, 상기 물질은 비-인간 포유동물 유래의 모노클로날 항체뿐만 아니라, 재조합 키메라 모노클로날 항체, 재조합 인간화된 모노클로날 항체 및 인간 모노클로날 항체를 포함한다.
본 원에서, "재조합 키메라 모노클로날 항체"는 유전 공학에 의해 제조된 모노클로날 항체이며, 가변 영역이 비-인간 포유동물(마우스, 래트, 햄스터 등)의 면역 글로불린으로부터 유래되거나, 불변 영역이 인간 면역글로불린으로부터 유래된 마우스/인간 키메라 모노클로날 항체와 같은 키메라 항체를 의미한다.
본 발명의 "인간화된 모노클로날 항체(CDR-이식된 항체)"는 유전 공학에 의해 제조된 모노클로날 항체이며, 구체적으로 고도가변(hypervariable) 영역의 상보성 결정 영역 전체 또는 그의 일부가 비-인간 포유동물(마우스, 래트, 햄스터 등)의 모노클로날 항체로부터의 고도가변 영역의 상보성 결정 영역으로부터 유래되고, 상기 가변 영역의 프레임워크(framework) 영역이 인간 면역글로불린으로부터의 가변 영역의 프레임워크 영역으로부터 유도되며, 불변 영역이 인간 면역글로불린으로부터의 불변 영역으로부터 유래된 인간화된 모노클로날 항체를 의미한다.
상기 고도가변 영역의 상보성 결정 영역은, 항체의 가변 영역 중의 고도가변 영역에 존재하며, 항원에 직접 상보적으로 결합하는 3 개의 영역(상보성-결정 잔기, CDR1, CDR2 및 CDR3)을 의미한다. 상기 가변 영역의 프레임워크 영역은 상기 3 개의 상보성 결정 영역들의 상류, 하류 또는 이들 사이에 놓인 4 개의 상당히 보존된 영역들(프레임워크 영역, FR1, FR2, FR3 및 FR4)을 의미한다.
즉, 인간화된 모노클로날 항체는, 비-인간 포유동물-유래된 모노클로날 항체의 고도가변 영역의 상보성 결정 영역 전체 또는 그의 일부를 제외한 모든 영역들이 인간 면역글로불린으로부터 유래된 상응 영역들도 치환된 것을 의미한다.
인간 면역글로불린으로부터 유래된 불변 영역은 IgG(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD 및 IgE와 같은 각각의 아이소타입에 고유한 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명의 인간화된 모노클로날 항체의 불변 영역은 임의의 아이소타입에 속하는 인간 면역 글로불린으로부터의 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기는 인간 IgG의 불변 영역이다. 인간 면역글로불린으로부터 유래된 불변 영역의 프레임워크 영역들은 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 물질이 폴리펩티드인 경우, 상기 물질은 하기의 폴리펩티드, 폴리펩티드의 단편(올리고펩티드), 융합 폴리펩티드, 그의 화학적으로 변형된 폴리펩티드를 포함한다. 올리고펩티드의 예는 5 내지 30 개의 아미노산, 바람직하게는 5 내지 20 개의 아미노산을 포함하는 펩티드이다. 화학적 변형은, 예를 들어 생체 내 투여의 경우 증가된 혈 중 반감기, 또는 경구 투여 시 소화관에서의 분해에 대한 증가된 내성 또는 증가된 흡수 등의 다양한 목적들에 따라 설계될 수 있다.
폴리펩티드의 예는 하기와 같다:
(1) AILIM의 세포 외 영역 전체 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드;
(2) AILIM의 세포 외 영역 전체 또는 그의 일부 및 면역글로불린 중쇄의 불변 영역 전체 또는 그의 일부를 포함하는 융합 폴리펩티드; 또는
(3) AILIM에 결합하는 폴리펩티드.
"비-단백질"의 예는 DNA, RNA 및 화학 합성된 화합물이다.
본 원에서, "DNA"는, 상기 AILIM(바람직하게는 인간 AILIM)을 암호화하는 DNA(cDNA 및 게놈 DNA 포함)의 뉴클레오티드 서열을 기초로 설계되는 안티센스 DNA 약제로서 유용한 "DNA의 부분적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 또는 그의 화학적으로 변형된 DNA"를 의미한다. 구체적으로, 상기 안티센스 DNA는, AILIM을 암호화하는 DNA 또는 RNA를 하이브리드화함으로써, AILIM을 암호화하는 DNA를 mRNA로 전사하거나 상기 mRNA를 단백질로 번역하는 것을 억제할 수 있다.
본 원에서 지칭된 "부분적인 뉴클레오티드 서열"은 임의의 영역 중의 임의의수의 뉴클레오티드를 포함하는 부분적인 뉴클레오티드 서열을 가리킨다. 상기 부분적인 뉴클레오티드 서열은 5 내지 100 개의 연속적인 뉴클레오티드, 바람직하게는 5 내지 70 개의 연속적인 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 5 내지 50 개의 연속적인 뉴클레오티드, 훨씬 더 바람직하게는 5 내지 30 개의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어진다.
DNA가 안티센스 DNA 약제로서 사용되는 경우, 환자에게 투여되는 DNA의 혈중 농도의 반감기(안정성)를 연장시키거나, DNA의 세포질내-막 투과성을 증가시키거나, 또는 소화 기관에 경구 투여된 DNA의 분해 내성 또는 흡수성을 증가시키기 위해서, 상기 DNA 서열을 화학적으로 부분 변형시킬 수 있다. 상기 화학적 변형에는 예를 들어 올리고뉴클레오티드 DNA 구조에서의 포스페이트 결합, 리보오스, 뉴클레오티드 염기, 당 잔기, 3' 단부 및/또는 5' 단부의 변형이 포함된다.
포스페이트 결합의 변형은, 예를 들어 하나 이상의 상기 결합의 포스포디에스테르 결합(D-올리고), 포스포로티오에이트 결합, 포스포로디티오에이트 결합(S-올리고), 메틸 포스포네이트(MP-올리고), 포스포로아미데이트 결합, 비-포스페이트 결합 또는 메틸 포스포노티오에이트 결합, 또는 이들의 조합으로의 변경을 포함한다. 리보오스의 변형은, 예를 들어 2'-플루오로리보오스 또는 2'-O-메틸리보오스로의 전환을 포함한다. 뉴클레오티드 염기의 변형은 예를 들어 5-프로피닐우라실 또는 2-아미노아데닌으로의 변경을 포함한다.
본 원에서, "RNA"는, 상기 AILIM(바람직하게는 인간 AILIM)을 암호화하는 RNA의 뉴클레오티드 서열을 기초로 설계된 안티센스 RNA 약제로서 유용한 "RNA의부분적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA 또는 그의 화학 변형된 RNA"를 의미한다. 상기 안티센스 RNA는 AILIM을 암호화하는 DNA 또는 RNA를 하이브리드화함으로써 AILIM을 암호화하는 DNA를 mRNA로 전사하거나 또는 상기 mRNA를 단백질로 번역하는 것을 억제할 수 있다.
본 원에 지칭된 "부분적인 뉴클레오티드 서열"은 임의의 영역 중의 임의의 수의 뉴클레오티드를 포함하는 부분적인 뉴클레오티드 서열을 가리킨다. 상기 부분적인 뉴클레오티드 서열은 5 내지 100 개의 연속적인 뉴클레오티드, 바람직하게는 5 내지 70 개의 연속적인 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 5 내지 50 개의 연속적인 뉴클레오티드, 훨씬 더 바람직하게는 5 내지 30 개의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어진다.
환자에게 투여되는 RNA의 혈중 농도의 반감기(안정성)를 연장시키거나, RNA의 세포질내-막 투과성을 증가시키거나, 또는 소화 기관에 경구 투여된 RNA의 분해 내성 또는 흡수성을 증가시키기 위해서, 안티센스 RNA의 서열을 화학적으로 부분 변형시킬 수 있다. 상기 화학적 변형의 예는 상기 안티센스 DNA에 적용되는 화학 변형이다.
"화학 합성된 화합물"의 예로는 분자량 약 100 내지 약 1000, 바람직하게는 약 100 내지 약 800, 보다 바람직하게는 약 100 내지 약 600의, 상기 DNA, RNA 및 단백질 물질을 제외한 임의의 화합물이다.
상기 "물질"의 정의에 포함된 "폴리펩티드"는 AILIM(바람직하게는 인간 AILIM)을 구성하는 폴리펩티드 사슬의 일부(단편), 바람직하게는 AILIM을 구성하는폴리펩티드의 세포 외 영역 전체 또는 그의 일부를 의미한다(1 내지 5 개의 아미노산이 상기 영역의 N-말단 및/또는 C-말단에 임의로 부가될 수 있다).
본 발명에 관련된 AILIM은 하나 또는 2 개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는, 세포막을 투과하는 막 통과 분자이다.
본 원에서, "막 통과 단백질"은, 많은 수용체 또는 세포 표면 분자에서 보이는 바와 같이, 소수성 펩티드 영역을 통해 막의 지질 이중 층을 1 회 또는 수 회 통과하는 상기 막과 연결된 단백질을 의미하며, 그의 구조는 전체로서 3 개의 주요 영역, 즉 세포 외 영역, 막 통과 영역, 및 세포질 영역으로 구성된다. 상기와 같은 막 통과 단백질은 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 갖는 또 다른 사슬(들)과 함께 모노머, 호모다이머, 헤테로다이머 또는 올리고머의 형태로 각 수용체 또는 세포 표면 분자를 구성한다.
본 원에서, "세포 외 영역"은, 일부 구조가 막의 외부에 존재하는 상기 언급한 막 통과 단백질의 전체 구조중 부분적인 구조(부분적인 영역) 전체 또는 그의 일부를 의미한다. 즉, 막 내에 삽입되어 있는 영역(막 통과 영역) 및 상기 막 통과 영역 뒤에 오는 세포질에 존재하는 영역(세포질 영역)을 제외한 상기 막 통과 단백질 영역 전체 또는 그의 일부를 의미한다.
상기 "단백질 물질"에 포함된 "융합 폴리펩티드"는 AILIM(바람직하게는 인간 AILIM)을 구성하는 폴리펩티드의 세포 외 영역 전체 또는 그의 일부, 및 "면역글로불린 중쇄(Ig, 바람직하게는 인간 Ig)의 불변 영역 전체 또는 그의 일부"를 포함하는 융합 폴리펩티드를 의미한다. 바람직하게는, 상기 융합 폴리펩티드는 AILIM의세포 외 영역과 인간 IgG 중쇄의 불변 영역의 일부와의 융합 폴리펩티드, 및 특히 바람직하게는 AILIM의 세포 외 영역과 경첩 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한 인간 IgG 중쇄 영역(Fc)과의 융합 폴리펩티드이다. IgG로서, IgG1이 바람직하며, AILIM으로서, 인간, 마우스 또는 래트 AILIM이 바람직하다(인간 AILIM이 바람직하다).
본 원에 사용된 "인간 면역글로불린(Ig) 중쇄의 불변 영역 전체 또는 그의 일부"란 개시된 바와 같은 인간-유래된 면역글로불린 중쇄(H 사슬)의 불변 영역 또는 Fc 영역, 또는 그의 일부를 의미한다. 상기 면역글로불린은 임의의 클래스 및 임의의 서브클래스에 속하는 임의의 면역글로불린일 수 있다. 구체적으로, 상기 면역글로불린의 예는 IgG(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4), IgM, IgA(IgA1 및 IgA2), IgD 및 IgE이다. 바람직하게는, 상기 면역글로불린은 IgG(IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4) 또는 IgM이다. 본 발명의 특히 바람직한 면역글로불린의 예는 인간-유래된 IgG(IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)에 속하는 것들이다.
면역글로불린은, 2 개의 상동한 경쇄(L 사슬)와 2 개의 상동한 중쇄(H 사슬)로 구성된 4 개의 사슬이 디설파이드 결합(S-S 결합)을 통해 연결된 Y-형상의 구조단위를 갖는다. 상기 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역(CH)으로 구성된다.
상기 중쇄 불변 영역은 각 클래스(IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE) 및 각 서브클래스(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, IgA1 및 IgA2) 고유의 아미노산 서열을 갖는 일부도메인들로 구성된다.
IgG(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)의 중쇄는 N 말단으로부터 VH, CH1 도메인, 경첩 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인 순으로 구성된다.
유사하게, IgG1의 중쇄는 N 말단으로부터 VH, Cγ11 도메인, 경첩 영역, Cγ12 도메인 및 Cγ13 도메인 순으로 구성된다. IgG2의 중쇄는 N 말단으로부터 VH, Cγ21 도메인, 경첩 영역, Cγ22 도메인 및 Cγ23 도메인 순으로 구성된다. IgG3의 중쇄는 N 말단으로부터 VH, Cγ31 도메인, 경첩 영역, Cγ32 도메인 및 Cγ33 도메인 순으로 구성된다. IgG4의 중쇄는 N 말단으로부터 VH, Cγ41 도메인, 경첩 영역, Cγ42 도메인 및 Cγ43 도메인 순으로 구성된다.
IgA의 중쇄는 N 말단으로부터 VH, Cα1 도메인, 경첩 영역, Cα2 도메인 및 Cα3 도메인 순으로 구성된다.
유사하게, IgA1의 중쇄는 N 말단으로부터 VH, Cα11 도메인, 경첩 영역, Cα12 도메인 및 Cα13 도메인 순으로 구성된다. IgA2의 중쇄는 N 말단으로부터 VH, Cα21 도메인, 경첩 영역, Cα22 도메인 및 Cα23 도메인 순으로 구성된다.
IgD의 중쇄는 N 말단으로부터 VH, Cδ1 도메인, 경첩 영역, Cδ2 도메인 및 Cδ3 도메인 순으로 구성된다.
IgM의 중쇄는 N 말단으로부터 VH, Cμ1 도메인, Cμ2 도메인, Cμ3 도메인 및 Cμ4 도메인 순으로 구성되며 IgG, IgA 및 IgD에서 보이는 바와 같은 경첩 영역이 없다.
IgE의 중쇄는 N 말단으로부터 VH, Cε1 도메인, Cε2 도메인, Cε3 도메인 및 Cε4 도메인 순으로 구성되며 IgG, IgA 및 IgD에서 보이는 바와 같은 경첩 영역이 없다.
예를 들어 IgG를 파파인으로 처리하는 경우, 디설파이드 결합이 2 개의 중쇄를 연결시키는 경첩 영역에 존재하는 상기 디설파이드 결합의 약간 N 말단 쪽에서 절단되어, 2 개의 상동 Fab(여기에서 VH및 CH1으로 구성된 중쇄 단편은 디설파이드 결합을 통해 하나의 경쇄와 연결된다)와 하나의 Fc(여기에서 경첩 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인으로 구성된 2 개의 상동 중쇄 단편들은 디설파이드 결합을 통해 연결된다)를 생성시킨다(문헌[Immunology Illustrated, original 2nd ed., Nankodo, pp. 65-75(1992); 및 Focus of Newest Medical Science 'Recognition Mechanism of Immune System', Nankodo, pp. 4-7(1991)] 등 참조).
즉, 상기 언급된 "면역글로불린 중쇄의 불변 영역의 일부"는 상기 언급한 구조적 특징들을 갖는 면역글로불린 중쇄의 불변 영역의 일부를 의미하며, 바람직하게는 C1 도메인이 없는 불변 영역 또는 Fc 영역이다. 구체적으로, 그의 예는 IgG, IgA 및 IgD 각각으로부터의 경첩 영역, C2 도메인 및 C3 도메인으로 구성되는 영역이며, IgM 및 IgE 각각으로부터의 C2 도메인, C3 도메인 및 C4 도메인으로 구성되는 영역이다. 특히 바람직한 그의 예는 인간-유래된 IgG1의 Fc 영역이다.
상기 언급한 융합 폴리펩티드는, 본 발명의 융합 폴리펩티드가 융합 짝으로서 상기 언급한 IgG와 같은 면역글로불린의 불변 영역의 일부(예를 들어 Fc)를 가지므로, 상기 면역글로불린 단편에 특이적으로 결합하는 단백질 A의 성질을 이용하는 친화성 컬럼 크로마토그래피를 사용함으로써, 상기 융합 폴리펩티드를 대단히 쉽게 정제할 수 있다는 이점을 갖는다. 더욱이, 다양한 면역글로불린의 Fc에 대한 다양한 항체들을 입수할 수 있으므로, 상기 Fc에 대한 항체를 사용하여 상기 융합 폴리펩티드에 대한 면역분석을 쉽게 수행할 수 있다.
"AILIM에 결합하는 폴리펩티드"는 상기 "물질"의 정의에 포함된 "폴리펩티드"에 포함된다.
"AILIM에 결합하는 폴리펩티드"의 구체적인 예는, AILIM과 상호작용하는 리간드들인 공지된 B7h, B7RP-1, GL50 또는 LICOS라 칭하는 분자(Nature, Vol. 402, No. 6763, pp. 827-832, Nature Medicine, Vol. 5, No. 12, pp. 1365-1369, 1999; J. Immunlolgy, Vol. 164, pp. 1653-1657, 2000; Curr. Biol., Vol. 10 No 6, pp. 333-336, 2000)를 구성하는 폴리펩티드 전체 또는 그의 일부이다.
바람직하게는, 상기 폴리펩티드는 상기 리간드(B7h, B7RP-1, GL50, LICOS)의 세포 외 영역 전체 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드 및 면역글로불린 중쇄(바람직하게는 인간 면역글로불린)의 불변 영역 전체 또는 그의 일부를 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 본 원에서, "세포 외 영역" 및 "면역글로불린 중쇄의 불변 영역"이란 용어는 상기와 동일한 의미를 갖는다.
상기 언급한 폴리펩티드, 폴리펩티드의 일부(단편) 및 융합 폴리펩티드는, 하기에 언급하는 재조합 DNA 기법뿐만 아니라 당해 분야에 널리 공지된 방법, 예를 들어 화합 합성법 및 세포 배양법, 또는 이들의 변형 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 "항체"는 상기 정의된 포유동물 AILIM(특히 바람직하게는 인간 AILIM)에 대한 폴리클로날 항체(항혈청) 또는 모노클로날 항체일 수 있으며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다.
구체적으로 상기 항체는 AILIM에 결합함으로써 AILIM-발현 세포의 증식을 억제하거나, 또는 AILIM에의 결합을 통해 AILIM-발현 세포에 의한 인터페론 γ 또는 인터류킨 4의 생산을 억제하는 활성을 갖는 항체이다.
본 원의 "지연성 알레르기"란, 세포 면역에 의해 매개되는(특히 Th1-형 T 세포에 의해 매개되는) 알레르기, 즉 항원에 의해 감작된 T 세포(항원을 기억하는 기억 T 세포)에 의해 매개되는 알레르기를 의미하며, 항원에 감작된 생체는 동일 항원과 재 접촉시키는 경우 상기 기억 T 세포에 의해 야기되는 염증을 동반하는 알레르기 반응을 나타나는데 대략 24 내지 48 시간 걸리는 임의의 알레르기를 지칭한다.
상기 지연성 알레르기에는, 감염성 병원성 항원에 대한 알레르기, 예를 들어 결핵균으로부터 유래된 투베르쿨린 알레르기, 소량의 단백질에 대한 일시적인 존스-모트 지연성 알레르기, 피크릴 클로라이드와 같은 화학물질 또는 옻과 같은 식물 독소에 대한 접촉성 알레르기, 또는 동종이식에서 관찰되는 이식편에 대한 이식편 거부반응과 관련된 알레르기가 포함된다.
본 원의 "약학 조성물"은 유효 성분으로서 AILIM(바람직하게는 인간 AILIM) 또는 그의 일부에 결합하는 항체(바람직하게는 인간 항체), 또는 모노클로날 항체(바람직하게는 인간 모노클로날 항체) 또는 그의 일부 및 "약리학적으로 허용가능한 담체"를 포함하는 약물로서 유용한 조성물을 의미한다.
"약학적으로 허용가능한 담체"에는 부형제, 희석제, 증량제, 분해제, 안정제, 보존제, 완충제, 유화제, 방향제, 착색제, 감미제, 점도 증가제, 풍미제, 용해도 증가제 또는 다른 부가제들이 포함된다.
하나 이상의 상기와 같은 담체들을 사용함으로써, 약학 조성물을 정제, 환제, 산제, 과립제, 주사제, 액제, 캡슐제, 트로키제, 엘릭실제, 현탁제, 유탁제 또는 시럽제로 제형화할 수 있다.
상기 약학 조성물을 경구 또는 비 경구 투여할 수 있다. 비 경구 투여를 위한 다른 형태로서는, 하나 이상의 유효 성분을 포함하는, 통상적인 방법에 의해 처방되는 외용액제, 직장 투여를 위한 좌제 및 페서리가 있다.
투여량은, 환자의 연령, 성별, 체중 및 증상, 치료 효과, 투여 경로, 치료 기간, 또는 약학 조성물 중에 함유된 유효 성분의 종류(상기 언급된 폴리펩티드 또는 항체)에 따라 변할 수 있다. 대개, 상기 약학 조성물은 성인에게 1 회 투여 당 10 ㎍ 내지 1000 ㎎(또는 10 ㎍ 내지 500 ㎎)의 용량으로 투여될 수 있다. 다양한 조건들에 따라, 상기 언급한 투여량 미만의 투여량이 일부의 경우에 충분할 수도 있으며, 상기 언급한 투여량 이상의 투여량이 다른 경우에 필요할 수도 있다.
특히, 0.1 (㎍ 항체/㎖ 담체) 내지 10 (㎎ 항체/㎖ 담체)로 농도를 조절하면서, 무 독성의 약학적으로 허용가능한 담체, 예를 들어 생리 식염수 또는 상업적으로 입수할 수 있는 주사용 증류수에 항체를 용해 또는 현탁시킴으로써 주사제를 제조할 수 있다.
상기와 같이 제조된 주사제를, 치료가 필요한 인간 환자에게 하루에 1 회 이상 체중 ㎏ 당 1 ㎍ 내지 100 ㎎, 바람직하게는 50 ㎍ 내지 50 ㎎의 용량으로 투여할 수 있다. 투여 경로의 예는 의학적으로 적합한 투여 경로, 예를 들어 정맥 내 주사, 피하 주사, 피내 주사, 근육내 주사, 또는 복강 내 주사, 바람직하게는 정맥 내 주사이다.
상기 주사제를, 또한 비-수성 희석제(예를 들어 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예를 들어 올리브 오일, 및 알콜, 예를 들어 에탄올), 현탁제 또는 유탁제로 제조할 수도 있다.
상기 주사제는, 세균-비-침투성 필터로 여과, 살균제의 배합, 또는 조사에 의해 멸균시킬 수 있다. 상기 주사제를, 사용 시 준비되는 형태로 제조할 수 있다. 즉, 멸균 고형 조성물로 동결-건조시키고, 사용 전에 주사용 멸균 증류수 또는 또 다른 용매에 용해시킬 수 있다.
본 발명의 인간 항체를 포함하는 약학 조성물은, HAMA(인간 항-마우스 항체)로 인한 숙주 면역 거부반응의 유발 없이, AILIM-발현 세포로의 부자극 신호(2 차 신호)의 AILIM-매개된 전달과 관련된 다양한 생물학적 반응들(예를 들어, AILIM 발현 세포의 증식, AILIM 발현 세포에 의한 시토킨의 생산, AILIM 발현 세포의 면역 세포용해 또는 사망(세포사멸) 등)을 조절하기 위한 약학 제제로서, 및/또는AILIM-매개된 신호 전달과 관련된 질병의 개시 및/또는 진행을 억제 및 저지시킴으로써 다양한 질병들을 치료 또는 예방하기 위한 약학 제제로서 유용하다.
본 원의 "면역 세포용해"란 용어는 하기와 같은 생물학적 현상을 가리킨다.
세포의 용해(cytolysis, 세포용해)는, 살해 세포와의 결합에 의해서 뿐만 아니라, 항체(특히 세포-용해 항체)에 의해서 유발될 수 있다. 세포-용해 항체는 세포독성 항체이며, 이는 특히 면역 세포, 조직 세포 또는 정자와 같은 세포에 대해 용해 활성을 갖는다. 상기 항체가 세포-표면 항원에 결합하면, 상기 항체는 보체의 존재 하에서 세포용해를 유도하거나 또는 상기 세포에 대해 세포독성 효과를 일으킨다.
상기 면역 세포용해는 세포-표면 항원에 대한 항체의 특이적인 결합과 함께 상기 보체의 작용에 의해 유발된다. 상기 표면 항원에 결합된 항체는 C1 보체(C1)를 활성화시킨다. 후속적으로 C2 내지 C9 보체(C2-C9)와의 일련의 보체-결합 반응을 통해서 세포 손상 부위가 형성되며, 이어서 세포 내용물이 상기 세포로부터 방출되어 세포가 용해된다.
본 원의 "항체-의존성 세포성 세포독성"이란 용어는 또한 "ADCC"라고도 약기되는 생물학적 현상을 가리키며, 효과기 세포, 예를 들어 림프구, 대식세포 또는 다형핵 백혈구에 의한 표적 세포 상에서의 세포독성 작용으로, 상기는 효과기 세포 및 표적 세포뿐만 아니라 세포독성 사건의 유발에 관여하는 항체를 요한다.
본 원의 "혼합된 림프구 반응"이란 용어는 "MLR"로서 약기되는 생물학적 현상을 의미한다. 상기 반응을 또한 혼합된 백혈구 반응이라 칭한다.
별도의 개인들로부터 유래된 동종 백혈구 또는 림프구를 서로 혼합하여 수 일간 배양함으로써 세포의 아세포가 형성되며 상기 세포에서 DNA가 합성된다(즉, 세포 증식된다). 이러한 반응을 MLR(동종 MLR)이라 칭한다.
DNA 합성(세포 증식)을 상기 림프구들 중 어느 하나의 증식을 정지시킴으로써 분석할 수 있다. 상기 정지는 방사선 조사 또는 마이토마이신 처리에 의해 수행될 수 있다. 분석은 다른 림프구에서 합성된 DNA의 양을 측정함으로써 수행될 수 있다.
상기 합성된 DNA의 양을 트리튬과 같은 방사성 동위원소로 표지된 티미딘의 세포 핵에의 삽입량을 측정함으로써 분석할 수 있다.
본 발명의 AILIM(특히 바람직하게는 인간 AILIM)을 암호화하는 DNA를, AILIM을 암호화하는 mRNA로부터 cDNA를 클로닝하는 방법; 게놈 DNA의 단리 및 이들의 스플라이싱처리하는 방법; 주형으로서 cDNA 서열 또는 mRNA 서열을 사용하는 PCR에 의해 상기 DNA를 제조하는 방법; 또는 상기 DNA의 화학 합성하는 방법을 사용함으로써 통상적으로 사용되는 방법에 따라 수득할 수 있다.
본 발명에 따른 AILIM 리간드를 암호화하는 DNA를 또한 상술한 바와 동일한 방식으로 수득할 수 있다.
본 발명의 AILIM(특히 바람직하게는 인간 AILIM)을 암호화하는 DNA를, 상기와 같이 제조된 AILIM 암호화 DNA를 포함하는 DNA를 적절한 제한 효소로 절단(소화)시키고, 필요에 따라, 생성된 DNA 단편을 적절한 DNA 폴리머라제 등을 사용하여 링커 DNA 또는 태그(tag)와 연결시킴으로써 제조할 수 있다. 상기 AILIM 리간드암호화 DNA를 또한 동일한 방식으로 제조할 수 있다.
mRNA로부터 AILIM(특히 바람직하게는 인간 AILIM; 단백질은 이후에 목적 단백질로서 지칭한다) 암호화 cDNA를 클로닝하는 예시적인 방법을 하기에 나타낼 것이다.
AILIM 리간드 암호화 DNA를 또한 동일한 방식으로 클로닝할 수 있다.
우선, 목적 단백질을 암호화하는 전령 RNA를, 상기 목적 단백질을 발현하고 생산하는 조직 또는 세포로부터 제조한다. mRNA를 공지된 방법, 예를 들어 구아니딘-티오시아네이트 방법(Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry, Vol. 18, p 5294, 1979), 열 페놀 방법, 또는 AGPC 방법에 의해 전체 RNA를 단리시키고, 상기에 대해 올리고-dT 셀룰로즈 또는 폴리-U 세파로즈를 사용하여 친화성 크로마토그래피를 수행함으로써 제조할 수 있다.
이어서, 주형으로서 수득된 mRNA를 사용하여, cDNA를 예를 들어 오카야마 등(Okayama et al.)의 방법[Mol. Cell. Biol. Vol. 2, p. 161(1982); 동일 문헌, Vol. 3, p. 280(1983)] 또는 호프만 등(Hoffman et al.)의 방법[Gene Vol. 25, p. 263(1983)]과 같은 역 전사효소를 사용하는 널리 공지된 방법에 의해 합성하고 이중 가닥 cDNA로 전환시킨다. cDNA 라이브러리를, 대장균을 상기 cDNA를 갖는 플라스미드 벡터, 파아지 벡터 또는 코스미드 벡터로 형질전환시키거나, 또는 대장균을 생체 외 팩키징한 후에 트랜스펙션시킴으로써 제조한다.
본 발명에 사용된 플라스미드 벡터는 상기가 숙주에서 복제되고 유지되는 한 제한되지 않는다. 숙주에서 복제될 수 있는 임의의 파아지 벡터들을 또한 사용할수 있다. 통상적으로 사용되는 클로닝 벡터의 예는 pUC19, λgt10, λgt11 등이다. 상기 벡터를 하기 언급하는 바와 같이 면역학적 스크리닝에 적용시키는 경우, 숙주에서 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 발현할 수 있는 프로모터를 갖는 벡터를 사용하는 것이 바람직하다.
예를 들어 마니아티스 등(Maniatis et al.)의 방법[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 1.53, 1989]에 의해, cDNA를 플라스미드에 삽입시킬 수 있다. 예를 들어 흄 등(Hyunh et al.)의 방법[DNA cloning, a practical approach, Vol. 1, p. 49(1985)]에 의해, cDNA를 파아지 벡터에 삽입시킬 수 있다. 이러한 방법들은 상업적으로 입수할 수 있는 클로닝 키트(예를 들어 타카라 슈조(Takara Shuzo) 사의 제품)를 사용하여 간단히 수행될 수 있다. 상기와 같이 수득된 재조합 플라스미드 또는 파아지 벡터를 원핵 세포(예를 들어, 대장균: XL1Blue MRF', DH5α, HB101, MC1061/P3 등)와 같은 적절한 숙주 세포에 도입시킨다.
플라스미드를 숙주에 도입시키는 방법의 예로는, 염화 칼슘 법, 염화 칼슘/염화 루비듐 법(Molecular Cloning, A Laboratory Manual(second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 1.74(1989)), 및 전기영동 법이 있다. 파아지 벡터를 예를 들어 파아지 DNA를 생체 외에서 팩키징한 후에 증식된 숙주 내로 도입시키는 방법에 의해 숙주 세포에 도입시킬 수 있다. 생체 외 팩키징은 상업적으로 입수할 수 있는 생체 외 팩키징 키트(예를 들어 스트라타진(Stratagene) 또는 애머샴(Amersham) 사의 제품)를 사용하여 쉽게 수행될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA를, 상기 언급된 방법에 따라 제조된 cDNA 라이브러리로부터 일반적인 cDNA 스크리닝 방법을 조합함으로써 단리시킬 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열에 상응하는32P-표지된 화학 합성된 올리고뉴클레오티드를 탐침으로서 사용하는 공지된 콜로니 하이브리드형성 방법(Crunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 72, p. 3961(1975)) 또는 플라크 하이브리드 형성 방법(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 2.108(1989))에 의해, 목적하는 cDNA를 포함하는 클론을 스크리닝할 수 있다. 한편으로, 본 발명의 폴리펩티드 내의 특정 영역을 암호화하는 DNA 단편을 갖는 클론을, 합성 PCR 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 상기 영역을 증폭시킴으로써 스크리닝할 수 있다.
cDNA 발현 벡터(예를 들어, λZAPII 파아지 벡터)를 사용하여 제조된 cDNA 라이브러리를 사용하는 경우, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하는 항원-항체 반응에 의해, 목적하는 클론을 스크리닝할 수 있다. PCR 방법을 사용하는 스크리닝 방법은 다수의 클론을 스크리닝하는 경우에 바람직하다.
상기와 같이 수득된 DNA의 뉴클레오티드 서열을 막삼-길버트(Maxam-Gilbert) 방법(Maxam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.74, p. 560(1977)) 또는 파아지 M13을 사용하는 디데옥시뉴클레오티드 합성 사슬 종결 방법(Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.74, pp. 5463-5467(1977))에 의해 결정할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 전체 또는 그의 일부를 상기 언급한 바와 같이 수득된 클론을 제한 효소 등으로 절단시킴으로써 수득할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를, 상기 언급한 바와 같은 본 발명의 폴리펩티드 발현 세포로부터 유래된 게놈 DNA로부터 하기의 방법에 의해 단리시킬 수 있다.
상기와 같은 세포를 바람직하게는 SDS 또는 프로테이나제 K에 의해 용해시키고, 페놀 추출을 반복하여 DNA의 단백질 제거한다. RNA를 바람직하게는 리보뉴클레아제로 소화시킨다. 수득된 DNA를 적절한 제한 효소에 의해 부분적으로 소화하고, 수득된 DNA 단편들을 적합한 파아지 또는 코스미드로 증폭시켜 라이브러리를 생성시킨다. 이어서, 목적하는 서열을 갖는 클론들을 예를 들어 방사성 표지된 DNA 탐침을 사용하여 검출하고, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 전체 또는 그의 일부를 제한 효소 등에 의한 절단에 의해 상기 클론들로부터 수득한다.
PCR에 의한 목적 단백질을 암호화하는 DNA의 제조는 통상적인 방법("유전자 증폭 PCR 기법-기초와 새로운 전개", KYORITSU SHUPPAN, 1992 등)에 따라 주형으로서 목적 단백질을 암호화하는 공지된 mRNA 또는 cDNA를 사용하여 수행될 수 있다.
상기 목적 단백질 암호화 DNA를, 또한 상기 목적 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 바탕으로, 통상적인 방법에 의해 화학적으로 합성할 수도 있다.
본 발명의 AILIM(특히 바람직하게는 인간 AILIM) 또는 그의 일부(바람직하게는, 세포 외 영역)를, 통상적으로 사용되는 유전자 재조합 기법을 사용하는 통상적인 방법에 따라, 상기 예시된 방법에 기초한 AILIM 암호화 DNA(cDNA 또는 인트론-함유 게놈 DNA)를 적절한 제한 효소로 절단하여 상기 AILIM 암호화 DNA 단편을 수득하고, 이어서 필요에 따라, 생성된 DNA 단편을 링커 DNA 또는 태그와 함께, 적합한 DNA 폴리머라제 등을 사용하여 연결시켜 수득된 DNA를 사용하여 재조합 단백질로서 제조할 수 있다. AILIM 리간드(특히 바람직하게는 인간 AILIM 리간드) 또는 그의 일부(바람직하게는, 세포 외 영역)를 동일한 방식으로 제조할 수 있다.
구체적인 예를 하기에 예시한다. 즉, 상술한 바와 같이 제조된 DNA를 벡터(나중에 상세히 개시됨)에 삽입하여 발현 벡터를 수득한다. 이어서 상기 발현 벡터를 사용하여, 하기 개시된 바와 같은 숙주 세포를 형질전환시켜 형질전환체를 수득한다. 상기 형질전환체를 배양하여, 목적 단백질이 상기 배양 상청액 중에서 생산시킨다. 상기 배양 상청액 중의 목적 단백질을, 컬럼 크로마토그래피 등을 사용하여 쉽게 정제할 수 있다.
벡터가 임의의 다양한 숙주들, 예를 들어 원핵 세포 및/또는 진핵 세포에서 복제 및 유지되거나 또는 자기증식할 수 있는 것인 한, 재조합 AILIM(또는 그의 세포 외 영역)의 생산을 위한 발현 벡터의 유형은 특별한 제한이 없다. 이러한 발현 벡터에는 플라스미드 벡터 및 파아지 벡터(클로닝 벡터: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985)가 포함된다.
상기 발현 벡터를, AILIM(또는 그의 세포 외 영역) 암호화 DNA를 통상적인 방법에 의해 당해 분야에서 입수할 수 있는 재조합 용 벡터(플라스미드 DNA 및 박테리오파아지 DNA)와 연결시킴으로써 쉽게 제조할 수 있다. 사용되는 재조합 용 벡터의 구체적인 예로, 대장균-유래된 플라스미드, 예를 들어 pBR322, pBR325,pUC12, pUC13 및 pUC19, 효모-유래된 플라스미드, 예를 들어 pSH19 및 pSH15, 및 고초균(bacillus subtilis)-유래된 플라스미드, 예를 들어 pUB110, pTP5 및 pC194가 있다. 파아지의 예로는 박테리오파아지, 예를 들어 λ 파아지, 및 동물 또는 곤충 바이러스(pVL1393, 인비트로젠), 예를 들어 레트로바이러스, 우두 바이러스 및 핵 폴리헤드론 형성 바이러스가 있다.
본 발명의 AILIM(특히 바람직하게는 인간 AILIM) 또는 그의 가용성 세포 외 영역 암호화 DNA를 숙주 세포에서 발현시켜 상기 AILIM을 상기 숙주 세포의 표면 상에 발현시키거나, 또는 한편으로 AILIM(특히 바람직하게는 인간 AILIM)의 가용성 세포 외 영역을 생성시키고자 하는 경우 플라스미드 벡터가 유용하다. 원핵 세포 및/또는 진핵 세포와 같은 다양한 숙주 세포에서 상기 벡터가 AILIM(특히 바람직하게는 인간 AILIM) 또는 그의 가용성 세포 외 영역 암호화 유전자를 발현하여 상기 암호화된 단백질을 생산할 수 있는 한, 상기와 같은 플라스미드 벡터에 대해 특정한 제한은 없다. 예를 들어, 상기와 같은 플라스미드로는 pMAL C2, pcDNA3.1(-), pEF-BOS(Nucleic Acid Research, Vol.18, p.5322, 1990; 등), pME18S("Handbook for genetic engineering", Experimental Medicine, supplement, 1992; 등) 등이 있다.
세균, 특히 대장균을 숙주 세포로서 사용하는 경우, 발현 벡터는 일반적으로 적어도 프로모터-오퍼레이터 영역, 개시 코돈, 본 발명의 단백질 암호화 DNA, 종결 코돈, 종결자 영역 및 복제단위를 포함한다. 또한, 필요에 따라, 통상 사용되는 유전자 증폭 유전자(마커)를 포함할 수도 있다.
효모, 동물 세포 또는 곤충 세포를 숙주로서 사용하는 경우, 발현 벡터는 바람직하게는 적어도 프로모터, 개시 코돈, 본 발명의 AILIM(특히 바람직하게는 인간 AILIM) 또는 그의 세포 외 영역 암호화 DNA, 및 종결 코돈을 포함한다. 또한 신호 펩티드 암호화 DNA, 인헨서 서열, 본 발명의 AILIM 암호화 유전자의 5'- 및 3'-비 번역된 영역, 스플라이싱 접합부, 폴리아데닐화 부위, 선택성 마커 영역 및 복제단위를 포함할 수도 있다.
세균에서 본 발명의 AILIM(특히 바람직하게는 인간 AILIM) 또는 그의 세포 외 영역을 발현하기 위한 프로모터-오퍼레이터 영역은, 프로모터, 오퍼레이터 및 샤인-달가르노(SD) 서열(예를 들어, AAGG)을 포함한다. 예를 들어, 숙주가 에스케리키아인 경우, 상기는 바람직하게는 Trp 프로모터, lac 프로모터, recA 프로모터, λPL 프로모터, lpp 프로모터, tac 프로모터 등을 포함한다.
효모에서 본 발명의 AILIM(특히 바람직하게는 인간 AILIM) 또는 그의 세포 외 영역을 발현하기 위한 프로모터의 예는, PH05 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터 등이다. 숙주가 바실러스인 경우, 그의 예는 SL01 프로모터, SP02 프로모터, penP 프로모터 등이다.
숙주가 포유동물 세포와 같은 진핵 세포인 경우, 그의 예는 SV40-유래된 프로모터, 레트로바이러스 프로모터, 열 쇼크 프로모터 등이다. 당연한 일로서, 프로모터는 상기 예들로 제한되지 않는다. 또한, 발현을 위해 인헨서를 사용하는 것이 효과적이다.
바람직한 개시 코돈은 예를 들어 메티오닌 코돈(ATG)이다.
종결 코돈으로서 통상적으로 사용되는 종결 코돈(예를 들어, TAG, TGA, TAA 등)을 예시한다.
통상적으로 사용되는 천연 또는 합성 종결자를 종결자 영역으로서 사용한다.
복제단위는 숙주 세포에서 전체 DNA 서열을 복제할 수 있는 DNA를 의미하며, 천연 플라스미드, 인위적으로 변형시킨 플라스미드(천연 플라스미드로부터 제조된 DNA 단편), 합성 플라스미드 등을 포함한다. 바람직한 플라스미드의 예로는, 대장균에 대해서는 pBR322 또는 그의 인위적인 유도체(pBR322를 적절한 제한 효소로 처리하여 수득한 DNA 단편), 효모에 대해서는 효모 2μ 플라스미드 또는 효모 염색체 DNA, 및 포유동물 세포에 대해서는 pRSVneo ATCC 37198, pSV2dhfr ATCC 37145, pdBPV-MMTneo ATCC 37224, pSV2neo ATCC 37149, pSV2bsr 등이 있다.
인헨서 서열, 폴리아데닐화 부위, 및 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 스플라이싱 접합부, 예를 들어 SV40으로부터 유도된 것들을 또한 사용할 수 있다.
통상 사용되는 선택성 마커를 통상적인 방법에 따라 사용할 수 있다. 그의 예는 항생제, 예를 들어 테트라사이클린, 암피실린 또는 가나마이신에 대한 내성 유전자, 또는 티미딘 키나제 유전자이다.
유전자 증폭을 위한 유전자의 예로는 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자, 티미딘 키나제 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 글루타메이트 신타제 유전자, 아데노신 데아미나제 유전자, 오르니틴 데카복실라제 유전자, 하이그로마이신-B-포스포트랜스퍼라제 유전자, 아스파테이트 트랜스카바밀라제 등이 있다.
본 발명의 발현 벡터를, 적어도 상기 언급한 프로모터, 개시 코돈, 본 발명의 단백질 암호화 DNA, 종결 코돈 및 종결자 영역을 적절한 복제단위에 연속해서 환상으로 연결시킴으로써 제조할 수 있다. 목적에 따라, 적절한 DNA 단편(예를 들어, 링커, 다른 제한 효소에 의해 생성된 제한 부위)을, 제한 효소에 의한 소화 또는 T4 DNA 리가제를 사용한 연결과 같은 통상적인 방법에 의해 사용할 수 있다.
본 발명의 형질전환체를, 상기 언급한 발현 벡터를 숙주 세포에 도입시킴으로써 제조할 수 있다.
본 발명에 사용된 숙주 세포는, 상기 언급한 발현 벡터에 적합하여 형질전환될 수 있는 한 제한되지 않는다. 그의 예로는 각종 세포, 예를 들어 본 발명의 기술 분야에 통상적으로 사용되는 천연 세포 또는 인위적으로 수립시킨 재조합 세포(예를 들어 세균(에스케리키아 및 바실러스), 효모(사카로마이세스, 피키아 등), 동물 세포 또는 곤충 세포)가 있다.
대장균 또는 동물 세포가 바람직하다. 구체적인 예로는 대장균(DH5α, DH10B, TB1, HB101, XL-2Blue 등), 마우스-유래된 세포(COP, L, C127, Sp2/0, NS-1, NIH 3T3 등), 래트-유래된 세포, 햄스터-유래된 세포(BHK, CHO 등), 원숭이-유래된 세포(COS1, COS3, COS7, CV1, Velo 등), 및 인간-유래된 세포(Hela, 이배체 섬유아세포-유래된 세포, 골수종, 나말와(Namalwa) 등)가 있다.
발현 벡터를 공지된 방법에 의해 숙주 세포에 도입(형질전환(형질이입))시킬 수 있다.
예를 들어 숙주가 세균(대장균, 고초균 등)인 경우 코헨 등(Cohen et al.)의 방법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.69, p. 2110(1972)], 원형질체 방법(Mol.Gen. Genet., Vol. 168, p. 111(1979)) 또는 컴피턴트 방법(J. Mol. Biol., Vol. 56, p. 209(1971)), 숙주가 사카로마이세스 세레비지아에인 경우 힌넨 등(Hinnen et al.)의 방법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, VOl. 75, p. 1927(1978)] 또는 리튬 방법(J. Bacteriol., Vol. 153, p. 163(1983)), 숙주가 동물 세포인 경우 그래햄(Graham)의 방법[Virology, Vol. 52, p. 456(1973)], 및 숙주가 곤충 세포인 경우 서머즈 등(Summers et al.)의 방법[Mol. Cell. Biol., Vol. 3, pp. 2156-2165(1983)]에 따라, 형질전환을 수행할 수 있다.
본 발명의 AILIM(특히 바람직하게는 인간 AILIM)의 세포 외 영역(가용성 AILIM)을, 상기 언급한 바와 같이 제조된 발현 벡터를 포함하는 형질전환체(하기에서 상기 용어는 형질이입체를 포함한다)를 영양 배지에서 배양함으로써 제조할 수 있다. AILIM 리간드를 동일한 방식으로 제조할 수 있다.
상기 영양 배지는 바람직하게는 숙주 세포(형질전환체)의 생육에 필요한 탄소원, 무기 질소원, 또는 유기 질소원을 포함한다. 탄소원의 예로는 글루코스, 덱스트란, 가용성 전분 및 슈크로즈가 있고, 무기 또는 유기 질소원의 예로는 암모늄 염, 니트레이트, 아미노산, 옥수수 침지액, 펩톤, 카제인, 고기(meat) 추출물, 대두 고형분 및 감자 추출물이 있다. 경우에 따라, 이들은 다른 영양분[예를 들어 무기 염(예를 들어 염화 칼슘, 인산이수소 나트륨 및 염화 마그네슘), 비타민, 항생제(예를 들어 테트라사이클린, 네오마이신, 암피실린, 가나마이신 등)]을 포함할 수도 있다.
배양은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 수행된다. 온도, 배지의 pH 및 배양 시간과 같은 배양 조건들은 본 발명의 단백질이 대량 생산되도록 적절하게 선택한다.
숙주 세포에 따라 사용되는 구체적인 배지와 배양 조건들을 하기에 예시하나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
숙주가 세균, 방선균, 효모, 사상균인 경우, 상기 언급한 영양 공급원을 포함하는 액체 배지가 적합하다. 상기 배지의 pH는 5 내지 8이 바람직하다.
숙주가 대장균인 경우, 바람직한 배지의 예는 LB 배지, M9 배지(Miller et al., Exp. Mol. Genet., Cold Spring Harbor Laboratory, p. 431(1972)), YT 배지 등이다. 상기 배지를 사용하여, 필요에 따라 통기시키고 교반하면서 14 내지 43 ℃에서 약 3 내지 24 시간 동안 배양을 수행할 수 있다.
숙주가 바실러스인 경우, 대개 필요에 따라 통기시키고 교반하면서 30 내지 40 ℃에서 약 16 내지 96 시간 동안 배양을 수행할 수 있다.
숙주가 효모인 경우, 배지의 예는 부르크홀더 최소 배지(Bostian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 77, p. 4505(1980))이다. 상기 배지의 pH는 바람직하게는 5 내지 8이다. 대개 필요에 따라 통기시키고 교반하면서 20 내지 35 ℃에서 약 14 내지 144 시간 동안 배양을 수행할 수 있다.
숙주가 동물 세포인 경우, 배지의 예는 약 5 내지 20%의 소 태아 혈청을 함유하는 MEM 배지(Science, Vol. 122, p. 501(1952)), DMEM 배지(Virology, Vol. 8, p. 396(1959)), RPMI1640 배지(J. Am. Med. Assoc., Vol. 199, p. 519(1967)), 199 배지(Proc. Soc. Exp. Biol. Med., Vol. 73, p.1(1950)), HamF12 배지 등이다.상기 배지의 pH는 바람직하게는 6 내지 8이다. 대개 필요에 따라 통기시키고 교반하면서 약 30 내지 40 ℃에서 약 15 내지 72 시간 동안 배양을 수행할 수 있다.
숙주가 곤충 세포인 경우, 배지의 예는 소 태아 혈청을 함유하는 그레이스 배지(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.82, p.8404(1985))이다. 상기 배지의 pH는 바람직하게는 5 내지 8이다. 대개 필요에 따라 통기시키고 교반하면서 약 20 내지 40 ℃에서 약 15 내지 100 시간 동안 배양을 수행할 수 있다.
본 발명의 AILIM(특히 바람직하게는 인간 AILIM)의 세포 외 영역(가용성 AILIM)을, 상기 언급된 형질전환된 세포(특히 동물 세포 또는 대장균)를 배양하고 상기 단백질을 배양 상청액에 분비시킴으로써 제조할 수 있다. 즉, 배양 여액(상청액)을 수득된 배양물의 여과 또는 원심분리와 같은 방법에 의해 수득하고, 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편을 천연 또는 합성 단백질의 정제 및 단리에 통상적으로 사용되는 통상의 방법에 의해 상기 배양 여액으로부터 정제 및 단리시킨다.
단리 및 정제 방법의 예로는, 특이적 친화성을 이용하는 방법, 예를 들어 친화성 크로마토그래피, 용해도를 이용하는 방법, 예를 들어 염석 및 용매 침전 방법, 분자량 차이를 이용하는 방법, 예를 들어 투석, 한외여과, 겔 여과 및 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 전하를 이용하는 방법, 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피 및 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 소수성 차이를 이용하는 방법, 예를 들어 역상 고 성능 액체 크로마토그래피, 및 등전점 차이를 이용하는 방법, 예를 들어 등전점 초점 맞추기가 있다.
목적 단백질이 배양된 형질전환체의 주변세포질 또는 세포질 중에 존재하는 경우, 우선 진균 체 또는 세포를 여과 또는 원심분리와 같은 통상의 방법에 의해 수확하고 적절한 완충액에 현탁시킨다. 상기 세포 등의 세포 벽 및/또는 세포막을 초음파처리, 리소자임 및 동결-융해과 같은 방법에 의해 파괴시킨 후에, 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 막 분획을 원심분리 또는 여과와 같은 방법에 의해 수득한다. 상기 막 분획을 트리톤-X100과 같은 계면활성제로 용해시켜 조 추출물을 수득한다. 최종적으로, 상기 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편을, 상술한 바와 같은 통상의 방법에 의해 상기 조 추출물로부터 단리 및 정제시킨다.
본 발명에서, "불용성 담체"란 용어는, 담체 상에 물리적 흡착 또는 화학적 결합에 의해 폴리펩티드를 고정화시키는데 사용되는 담체를 의미한다. 예를 들어, 상기 담체는 (1) 폴리스티렌 수지, 폴리카보네이트 수지, 실리콘 수지 또는 나일론 수지와 같은 플라스틱 또는 유리를 포함하는 수-불용성 물질로 된 플레이트, 시험관, 관 등의 내용적을 갖는 것, 비이드, 볼, 필터, 멤브레인 등으로 제조된 것, 및 (2) 친화성 크로마토그래피에 사용되는 불용성 담체, 예를 들어 셀룰로즈 담체, 아가로스 담체, 폴리아크릴아미드 담체, 덱스트란 담체, 폴리스티렌 담체, 폴리비닐알콜 담체, 폴리 아미노산 담체, 다공성 실리카 담체 등일 수 있다.
본 발명에 따른 "탐지가능한 신호를 제공할 수 있는 표지 물질"에는 예를 들어 효소, 형광 물질, 발광 물질, 비오틴, 아비딘 또는 방사성 동위원소, 보다 구체적으로 퍼옥시다제(예: 양고추냉이 퍼옥시다제), 알칼리 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 글루코스옥시다제, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 알콜 데하이드로게나제, 말레이트 데하이드로게나제, 페니실리나제, 카탈라제, 아포-글루코스 옥시아제, 우레아제, 루시페라제, 아세틸콜린 에스테라제 등과 같은 효소; 플루오레세인 이소티오시아네이트, 피코빌린 단백질, 희토금속 킬레이트제, 단실 클로라이드, 테트라메틸 로다민 이소티오시아네이트 등과 같은 형광 물질;3H,14C,125I,131I 등과 같은 방사성 동위원소; 비오틴, 아비딘 및 발광 물질이 포함된다.
이들 중에서, 방사성 동위원소 또는 형광 물질은 단독으로 사용될 때조차도 탐지가능한 신호를 제공할 수 있다. 다른 한편으로, 효소, 발광 물질, 비오틴 또는 아비딘은 단독으로 사용될 때 탐지가능한 신호를 제공하지 못하지만, 하나 이상의 물질과 반응하는 경우 탐지가능한 신호를 제공할 수 있다. 예를 들어 표지가 효소인 경우, 탐지를 위해서는 하나 이상의 기질이 필요하다. 다양한 유형의 기질들을 효소 활성의 측정 방법 유형(비색 측정법, 형광 투시법, 생물 발광 또는 화학 발광을 이용하는 방법 등)에 따라 사용할 수 있다. 예를 들어, 표지가 퍼옥시다제인 경우, 과산화 수소를 기질로서 사용할 수 있다. 한편으로, 표지가 비오틴인 경우, 아비딘 또는 효소-변형된 아비딘이 통상적으로 사용되나 이들로 제한하는 것은 아니다. 필요에 따라, 다양한 발광 물질들을 사용되는 기질의 유형에 따라 사용할 수 있다.
임의의 상기 언급한 표지들을 본 발명에 사용할 수 있다. 그러나, 바람직한 표지는 조작의 편의성뿐만 아니라 검출 또는 분석 감도를 고려할 때 퍼옥시다제 또는 비오틴과 같은 효소이다.
본 발명에 따른 "AILIM 또는 AILIM 리간드에 결합할 수 있는 물질의 동정 방법"은, 면역분석의 원리를 기초로 한다.
구체적으로, 문헌["Immunoassay", 3rdEdition., eds., Eiji Ishikawa et al., Igakushoin, 1987]에 개시된 것과 같은 다양한 방법들의 원리를 적용시킬 수 있다.
바람직하게 적용되는 원리의 예에는, 고상 1-항체 법, 액상 2-항체 법, 고상 2-항체 법, 샌드위치 법, 및 원포트법(일본 특공평(JP-B) 2-39747 호에 개시되어 있음)이 포함된다. 더욱이, 항원-항체 반응을 사용하는 분석 방법의 예로는 EMIT 방법(효소 증식시킨 면역분석 기법), 효소 채널링 면역분석, 효소 조절 매개 효소 면역분석(EMMIA), 효소 억제 면역분석, 면역효소계측 분석, 효소 증대 면역분석 및 기부 결합(proximal linkage) 면역분석이 있다.
본 발명에서, 임의의 이러한 면역분석 원리들을 목적에 따라 적합하게 선택할 수 있다. 그러나, 절차의 편이성 및/또는 경제적 이점, 및 특히 임상적인 융통성을 고려하는 경우, 샌드위치 방법, 원포트법 또는 고상 1-항체 법이 바람직하며, 샌드위치 방법 또는 원포트법이 보다 바람직하게 사용된다. 특히 바람직한 것은 96-웰 미세플레이트와 같은 다수의 웰들을 갖는 다-웰 미세적정 플레이트를 사용하는 샌드위치 방법, 또는 표면에 폴리펩티드가 고정화된 비이드를 사용하고 또한 퍼옥시다제와 같은 효소 또는 비오틴으로 표지된 카운터파트를 사용하는 원포트법이다.
본 발명을 하기 실시예들을 참고로 보다 상세히 예시하지만, 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석해서는 안된다.
실시예
실시예 1 면역원의 제조
<1-1> 인간 AILIM을 발현하는 재조합 세포의 제조
인간 AILIM을 고발현하는 2 가지 유형의 재조합 세포(CHO 세포 및 HPB-ALL 세포)를, 본 발명자들 중 하나인 테츠카(Tezuka)의 선행 보고서(Int. Immunology, Vol.12, No.1, p. 51-55, 2000) 뿐만 아니라 선행의 출원(일본 특개평(JP-A)11-29599 호 및 국제출원 WO98/38216)에 개시된 방법에 따라 제조하였다. 구체적으로 그 방법은 하기와 같다:
인간 AILIM을 암호화하는 전장의 ORF를 함유하는 cDNA(GenBank 수탁 번호: AB023135(cDNA); BAA82129(아미노산))를 벡터 pEF-neo에 삽입하였다. 이어서 생성된 재조합 발현 벡터를, 진 펄서(Gene Pulser, BioRad)와 함께 일렉트로포레이션(electroporation, 960 μF, 320 V)을 사용하는 통상적으로 사용되는 방법에 따라 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO 세포)와 인간 흉선종 주인 HBP-ALL 세포에 도입시켰다. 각각의 세포들을 제네티신(0.8 ㎎/㎖; Gibco BRL) 및 10% FCS 함유 RPMI1640 배지에서 배양시켜 약물-내성인 형질전환된 세포를 선별하였다.
<1-2> 인간 AILIM을 고발현하는 재조합 HPB-ALL 세포의 선별
상술한 <1-1>에서 선별된 약물-내성 HPB-ALL 세포의 배양액을 원심분리시켜 세포 펠릿을 수득하였다. 이전에 본 발명자들에 의해 수립되어 보고된 "SA12"라 칭하는 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체(마우스 항-인간 JTT-1 항원 모노클로날 항체)(JP-A 11-29599(실시예 12) 및 WO98/38216(실시예 12))를, 상기 세포 펠릿에 가하였다(농도: EDTA-BSA/PBS로 희석된 항체 용액(10 ㎍/㎖)을 100 ㎕/105세포의 비율로 가하였다). 생성된 혼합물을 4 ℃에서 30 분간 배양시켰다. 상기 세포를 상기 언급한 EDTA-BSA/PBS(200 ㎕)로 2 회 세척하고, 이어서 피코에리쓰린-표지된 스트렙트아비딘(SA-PE; 500 배 희석된 용액 100 ㎕)을 가하였다. 생성된 혼합물을 4 ℃에서 30 분간 배양하였다. 배양 후에, 세포를 EDTA-BSA/PBS로 3 회 세척하고 세포 현탁액을 제조하였다.
상기 세포 현탁액 중의 각 세포의 인간 AILIM의 발현 수준을 유식 세포 측정기인 FACSort(Beckton-Dichinson)에서 분석하여 인간 AILIM을 고발현하는 재조합 HPB-ALL 세포를 선별하였다. 선별된 세포를 10% FCS 및 G418(1 ㎎/㎖) 함유 RPMI1640 배지에서 컨플루언트(confluent)가 될 때까지 배양시켰다.
<1-3> 인간 AILIM을 고발현하는 재조합 CHO 세포의 선별
상술한 <1-1>에서 선별된 약물-내성 CHO 세포의 배양액을 원심분리시켜 세포 펠릿을 수득하였다. FITC로 표지한 상기 언급한 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 SA12를 각각의 세포 펠릿(EDTA-BSA/PBS로 희석한 항체 용액(1000 ㎍/㎖))에 가하였다. 생성된 혼합물을 4 ℃에서 30 분간 배양시켰다. 세포를 상기 언급한 EDTA-BSA/PBS로 세척하고, 이어서 EDTA-BSA/PBS(500 ㎕)를 상기 세포 펠릿에 가하여 세포 현탁액을 제조하였다.
상기 세포 현탁액 중의 각 세포의 인간 AILIM의 발현 수준을 유식 세포 측정기인 FACSort(Beckton-Dichinson)에서 분석하여 인간 AILIM을 고발현하는 재조합 HPB-ALL 세포를 선별하였다. 선별된 세포를 10% FCS 및 G418(1 ㎎/㎖) 함유 RPMI1640 배지에서 컨플루언트가 될 때까지 배양시켰다.
<1-4> 인간 AILIM을 고발현하는 HPB-ALL 세포로부터의 면역원의 제조
상술한 <1-2>에서 수득된 인간 AILIM을 고발현하는 HPB-ALL 세포를 원심분리시켰다. 회수된 세포 펠릿을 인산염 완충액(PBS; Nikken Seibutsu)으로 4 회 세척하고, 이어서 프로테아제 억제제 함유 완충액[25 mM HEPES(pH 7.4), 10 mM MgCl2, 0.25 M 슈크로즈, 및 프로테아제 억제제(아프로티닌 10 U/㎖, 펩스타틴 2 ㎍/㎖, 류펩틴 50 ㎍/㎖ 및 PMSF 0.35 ㎎/㎖) 함유]에 재 현탁시켰다. 세포 현탁액을 포터 형 호모지나이저(homogenizer)에서 처리하고, 저속으로 원심분리시켰다(1,500 rpm, 4 ℃에서, 10 분간). 후속적으로, 생성된 상청액을 초원심분리시켰다(100,000 g, 4 ℃에서 1 시간 동안). 침전된 막 분획을 회수하고, 인산염 완충액에 현탁시켰다(막 분획의 농도를 PBS 1 ㎖이 1x107세포로부터 유래된 막 분획을 함유하도록 조절하였다). 상기 현탁액을 -80 ℃에서 보관하였다. 상기 세포막 분획을 함유하는 현탁액을 본 발명의 인간 항체(이후에 개시될 것임)를 제조하는데 항원(면역원)으로서 사용하였다.
<1-5> 인간 AILIM을 고발현하는 CHO 세포로부터의 면역원의 제조
상술한 <1-3>에서 수득한 인간 AILIM을 고발현하는 CHO 세포를, 스크레이퍼로 분산시키고 원심분리시켰다. 회수된 세포 펠릿을 인산염 완충액(PBS; Nikken Seibutsu)으로 4 회 세척하고, 이어서 프로테아제 억제제 함유 완충액[25 mM HEPES(pH 7.4), 10 mM MgCl2, 0.25 M 슈크로즈, 및 프로테아제 억제제(아프로티닌 10 U/㎖, 펩스타틴 2 ㎍/㎖, 류펩틴 50 ㎍/㎖ 및 PMSF 0.35 ㎎/㎖) 함유]에 재 현탁시켰다. 세포 현탁액을 포터 형 호모지나이저에서 처리하고, 저속으로 원심분리시켰다(1,500 rpm, 4 ℃에서, 10 분간). 후속적으로, 생성된 상청액을 초원심분리시켰다(100,000 g, 4 ℃에서 1 시간). 침전된 막 분획을 회수하고, 인산염 완충액에 현탁시켰다(막 분획의 농도를 PBS 1 ㎖이 1x107세포로부터 유래된 막 분획을 함유하도록 조절하였다). 상기 현탁액을 -80 ℃에서 보관하였다. 상기 세포막 분획을 함유하는 현탁액을 본 발명의 인간 항체(이후에 개시될 것임)를 제조하는데 항원(면역원)으로서 사용하였다.
실시예 2 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 제조
본 실시예에서, 모노클로날 항체의 제조를 문헌[Experimental Medicine(supplement), Handbook for Cell Technology, eds., T. Kuroki et al., Yodosha, pp. 66-74, 1992; 및 Experimental Manual for Monoclonal Antibody, T. Ando et al., Kodansha, 1991]에 개시된 전형적인 방법에 따라 수행하였다.
실시예 1에 제공된 인간 AILIM 과 발현 재조합 세포로부터 제조된 세포막 분획을 인간 AILIM의 면역원으로서 사용하였다.
면역시킨 동물은 상술한 방법(Nature Genetics, Vol.7, p. 13-21, 1994; Nature Genetics, Vol. 15, p. 146-156, 1997; 국제 출원의 공개된 일본어 번역문 제 평 4-504365 호; 국제 출원의 공개된 일본어 번역문 제 평 7-509137 호; Nikkei Science, June, pp. 40-50, 1995; 등)에 의해 제조된 인간 항체-생산 트랜스제닉 마우스였다.
다중-웰 미세플레이트를 세포 배양에 사용하였다.
<2-1> 면역화 및 하이브리도마의 제조
상술한 <1-4>(HPB-ALL로부터 유래된 것)와 <1-5>(CHO로부터 유래된 것)에서 제조된 면역원(100 ㎕/마우스/투여)들 중 어느 하나를, 상기 언급한 인간 항체-생산 트랜스제닉 마우스에게 제공하였다. 상기 면역원을 1 차 면역화(0 일)로서 풋패드(footpad)에 프로인트 완전 아주반트(ICN/CAPPEL)와 함께 주입하였다.
1 차 면역화 후에, 상기 두 면역원들 중 어느 하나를 2 차 및/또는 3 차 면역화로서 1-주일 간격으로 풋패드에 추가 주입하였다. 동일한 방식으로, 하기에 기술하는 림프구 준비 전 2 일째에 최종 면역화를 위해 추가로 주입하였다.
최종 면역화 후 2 일 째에, 면역시킨 각각의 트랜스제닉 마우스의 (설하(subinguinal) 및 슬하(subgenual) 림프절과 비장으로부터 림프구를 준비하였다. 상기 림프구와 마우스 골수종 세포 P3/X63-AG8.653(ATCC No. CRL-1580)을 5:1의 비로 혼합하고, 폴리에틸렌 글리콜 1500(Boehringer Mannheim)을 융합제로서상기에 가하였다. 이어서, 상기 혼합물을 100배 부피의 무-혈청 기본 배지 EX-CELL301(JRH Bioscience)로 희석하였다. 후속적으로, 상기 혼합된 세포를 상기 기본 배지로 세척하고, 이어서 HAT 배지(하이포크산틴 13.61 ㎎, 아미노프테린 176 ㎍ 및 티미딘 3.88 ㎎을 함유하는 기본 배지 1 ℓ)에 현탁시켰다. 상기 세포를 96-웰 미세플레이트에 도말하고 10 내지 14 일간 완전 세포 융합으로 배양시켰다. 상기 세포 융합 처리에 의해 다수의 하이브리도마가 얻어졌다.
<2-2> 인간 모노클로날 항체-생산 하이브리도마의 스크리닝
상술한 <2-1>에서 제조된 다수의 하이브리도마를 하기 개시하는 세포 ELISA로 스크리닝하여 인간 AILIM에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 선별하였다.
상술한 인간 AILIM을 고발현하는 각각의 재조합 HPB-ALL 세포 및 재조합 CHO 세포를, ELISA 96-웰 미세플레이트의 각 웰에 도말하였다(1x105세포/웰). 배양을 37 ℃에서 2 일간 수행하였다.
후속적으로, 각 웰의 상청액을 버리고, 각 하이브리도마 배양액의 상청액 샘플을 여기에 가하고(50 ㎕/웰), 혼합물을 1 시간 동안 배양하였다. 반응을 완료시킨 후에, 혼합된 샘플 용액을 버리고 각 웰을 1% BSA(Sigma)를 함유하는 PBS로 3 회 세척하였다.
후속적으로, 퍼옥시다제-공액 결합된 염소 항-인간 면역글로불린(Fc) 항체(웰 당 2000 배 희석된 50 ㎕; American Corex; 1% BSA/PBS)를, 상기 하이브리도마상청액 중의 인간 면역글로불린(인간 모노클로날 항체)의 중쇄를 검출하기 위해서, 각 웰에 가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 배양하였다.
다른 한편으로, 퍼옥시다제-공액 결합된 염소 항-인간 면역글로불린 κ 사슬 사슬체(웰 당 2000 배 희석된 50 ㎕)를, 상기 하이브리도마 상청액 중의 인간 면역글로불린(인간 모노클로날 항체)의 경쇄를 검출하기 위해서, 각 웰에 가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 15 분간 배양하였다.
항-인간 IgFc 항체 또는 항-인간 Igκ 항체를 상기 미세플레이트의 각 웰로부터 제거하고, 상기 플레이트를 1% BSA 함유 PBS로 3 회 세척하였다. 테트라메틸벤지딘(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB), 100 ㎕/웰, BIO-RAD)을 각 웰에 가하고 생성된 혼합물을 실온에서 15 분간 배양하였다.
후속적으로, 1N H2SO4를 각 웰에 가하여(50 ㎕/웰) 반응을 정지시켰다. 상기 반응에 있어서 미세플레이트 판독기(Model 3550 Microplate Reader, BIO-RAD)에 의해 450 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
대조용 ELISA 실험을 하기의 항목들을 사용하여 상술한 바와 동일한 방식으로 수행하였다:
(1) 인간 AILIM 발현 재조합 HPB-ALL 세포 대신에 야생형 HPB-ALL 세포;
(2) 인간 AILIM 발현 재조합 CHO 세포 대신에 야생형 CHO 세포;
(3) 하이브리도마 상청액 대신에 인간 AILIM(SA12 또는 SG430; JP-A 11-29599(실시예 12) 및 WO98/38216(실시예 12))에 대한 마우스 모노클로날 항체;
(4) 하이브리도마 상청액 대신에 KLH(키홀 림핏 헤모시아닌, PIERCE)에 대한 인간 모노클로날 항체.
상기 인간 항-KLH 모노클로날 항체를, 상기 언급한 인간 항체-생산 트랜스제닉 마우스를 KLH(키홀 림핏 헤모시아닌, PIERCE)로 면역시킴으로써 상기 <2-1>에 개시한 바와 동일한 방식에 따라 제조하였다.
인간 AILIM에 결합할 수 있는 인간 모노클로날 항체를 생산하는 다수의 하이브리도마들을 상기 스크리닝에 의해 선별하였다.
<2-3> 하이브리도마의 1 차 클로닝
다음 분석 공정에 의해, 상술한 <2-2>에서 선별된 인간 AILIM에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 다양한 하이브리도마(모 세포주)로부터, 여러 유형의 하이브리도마 모노클로날들을 수립하였다.
상술한 <2-2>에서 선별된 각각의 하이브리도마를 24-웰 미세플레이트에 도말하였다. 각 웰 중의 하이브리도마의 세포 수를 피펫팅에 의해 측정하였다. 후속적으로, 10% 우태아 혈청(FCS; Trace Bioscience PTY), 1% 페니실린/스트렙토마이신(Sigma), 1% HT 보충물(Gibco BRL) 및 2.5% T-STIM 배양 보충물(Collaborative Biomedical Products)을 4.0 mM L-글루타민 및 지질 함유 EX-CELL301 배지(JRH Bioscience)에 가하였다. 생성된 변형 배지를 사용하여 하이브리도마를 1x104세포/㎖로 희석하고 상기 세포를 각 웰에 현탁시켰다.
각 웰의 세포 현탁액(300 ㎕ 또는 600 ㎕)을 합하고, 상기 변형 배지(150 ㎖또는 300 ㎖)와 잘 혼합한 다음, 상기 세포 현탁액의 200 ㎕ 분액을 각 웰이 4 개의 하이브리도마 세포를 함유하도록 다중 96-웰 미세플레이트의 각 웰에 가하였다. 상기 언급한 변형 배지(50 ㎖ 또는 100 ㎖)를 나머지 세포 현탁액에 새로 가하고, 이를 잘 혼합한 다음, 생성된 세포 현탁액을 각 웰이 2 개의 하이브리도마 세포를 함유하도록 달리 새로 제조된 다중 96-웰 미세플레이트의 각 웰에 가하였다.
배양을 1 내지 2 주간 계속하였다. 배양 후에, 단일 하이브리도마로부터 유래된 단일 콜로니가 다수의 웰들에서 발견되었다.
<2-2>에서 상술한 바와 같은 세포 ELISA를 사용하여, 인간 AILIM에 대한 인간 모노클로날 항체가 상기 콜로니를 함유하는 각 웰의 배양 상청액 중에 생산됨을 확인하였다.
<2-4> 하이브리도마의 2 차 클로닝
상술한 <2-3>에서 수득된 다양한 하이브리도마 클론들로부터의 각 클론의 서브클로닝(2 차 클로닝)을 <2-3>에서 상술한 바와 동일한 방법에 따라 수행하였다.
본 실험에서는 96-웰 미세플레이트의 각 웰의 세포 밀도를 1 세포/웰로 조절하였다.
상기 스크리닝에 의해, 인간 AILIM에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 다수의 하이브리도마 모노클로날들을 수득하였다. 포함된 클론들의 일부는 하기와 같다:
(클론 명)
AIF34(JMab-124), AIF182(JMab-126), AIF348(JMab-127), AIF620(JMab-128),AIF1052(JMab-135), AIH5D3(JMab-136), AIH386(JMab-137), AII289(JMab-138), AII394(JMab-139), AII488(JMab-140), AIJ40(JMab-141)
본 출원에서, 즉 본 실시예를 포함하여 하기의 모든 실시예에서 및 이러한 실시예에서 얻어진 결과를 포함하는 도면 및 표에서, 상기 나타낸 이름들을 사용한다.
실시예 3 모노클로날 항체의 성질에 대한 분석
<3-1> 중쇄 및 경쇄의 분석
하기 개시하는 ELISA 및 유식 세포 측정법을 사용함으로써, 상술한 <2-4>에서 클로닝된 각각의 하이브리도마 클론에 의해 생산된 인간 AILIM에 대한 모노클로날 항체가 실제로 인간 모노클로날 항체임을 확인하였다.
실시예 1에서 제조된, 인간 AILIM 고발현 재조합 HPB-ALL 세포를, 미세플레이트의 각 v-형상 웰에 도말하였다(3x104세포/웰). 세포를 10% FCS 함유 RPMI1640 배지에서 37 ℃에서 배양시켰다.
상기 배양을 완료시킨 후에, 상기 플레이트를 원심분리(1,800 rpm에서 2 분간)시켜 세포를 침전시키고, 이때 생성된 상청액은 버렸다. 후속적으로, 상술한 <2-4>에서 클로닝된 각 하이브리도마의 배양액으로부터의 상청액 샘플(50 ㎕/웰), 또는 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 SA12(2 ㎍/50 ㎕) 또는 한편으로 대조용 항체로서 인간 항-KLH 모노클로날 항체(50 ㎕/웰)를 각 웰에 가하였다. 상기 혼합물을 냉장고에서 30 분간 반응시켰다. 반응 후에, 샘플 용액을 버리고, 각웰을 인산염 완충액(5 mM EDTA 함유 0.5% BSA-PBS)으로 세척하였다.
후속적으로, 하기의 2 차 항체들 중 임의의 하나를, 세포를 현탁시키기 위해서 각 웰에 가하였다(상기 인산염 완충액으로 1000 배 희석하고 50 ㎕/웰의 양으로 가하였다). 상기 현탁액을 냉장고에서 30 분간 반응시켰다.
(2 차 항체)
비오틴-표지된 항-인간 IgG 항체(Zymed);
비오틴-표지된 항-인간 IgG 항체(Protos);
비오틴-표지된 항-인간 IgFc 항체(EY Laboratories); 또는
비오틴-표지된 항-인간 Igκ 항체(Vector).
반응 후에, 상기 2 차 항체를 버리고 상기 플레이트의 각 웰을 상기 언급한 인산염 완충액으로 세척하였다. 후속적으로, 피코에리쓰린-표지된 스트렙트아비딘(Streptavidin-PE; Pharmingen; 상기 인산염 완충액으로 500 배 희석한 것을 50 ㎕/웰)을 각 웰에 가하였다. 상기 혼합물을 냉장고에서 30 분간 반응시켰다. 반응 후에, 각 웰을 상기 언급한 인산염 완충액으로 세척하였다. 이어서, 상기 언급한 인산염 완충액을 상기 세포를 현탁시키기 위해서 각 웰에 가하였다(200 ㎕/웰).
각 웰 중의 인간 AILIM 고발현 HPB-ALL 세포에 대한 각 하이브리도마 클론의 배양 상청액 중의 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 반응성을 측정하기 위해서 분석을 수행하였다.
대조용 분석을, 하기의 항목들을 사용하여 상술한 바와 동일한 방식으로 수행하였다:
(1) 인간 AILIM 발현 재조합 HPB-ALL 세포 대신에 야생형 HPB-ALL 세포;
(2) 하이브리도마 상청액 대신에 KLH(키홀 림핏 헤모시아닌, PIERCE)에 대한 인간 모노클로날 항체.
상기 인간 항-KLH 모노클로날 항체를, 상기 <2-1>에 개시한 바와 동일한 방식에 따라 상기 언급한 인간 항체-생산 트랜스제닉 마우스를 KLH(키홀 림핏 헤모시아닌, PIERCE)로 면역시킴으로써 제조하였다.
상기 결과를 근거로, 상기 <2-4>에 개시한 하이브리도마 클론들 모두가 인간-유래된 중쇄 및 인간-유래된 κ 경쇄로 이루어진 인간 모노클로날 항체임이 확인되었다.
상기 결과의 예를 도 1에 예시하며, 도 1은 하이브리도마 클론 AIH5D3(JMab-136), AII289(JMab-138) 및 AII394(JMab-139)에 대한 분석 결과를 포함한다.
<3-2> 인간 모노클로날 항체의 아이소타입 결정(isotyping)
상술한 <2-4>에서 클로닝되고 <3-1>에서 분석된 하이브리도마에 의해 생산된 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 각각에 대해 아이소타입을 측정하였다. 인간 모노클로날 항체 아이소타입 결정용 키트(American Qualex)를 사용하여 상기 키트에 첨부된 실험 프로토콜에 따라 측정을 수행하였다.
인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 모두가 IgG2/κ인 것으로 측정되었다.
실시예 4 인간 AILIM에 대한 인간 모노클로날 항체(인간 항-인간 AILIM 모노클로날항체)의 대규모 제조 및 그의 정제
<4-1> 방법 1
상술한 <2-4>에서 제조된 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체를 생산하는 각 하이브리도마 클론의 세포를 조직 배양 플라스크(50 ㎖, FALCON)에 가하고, 37 ℃에서 5% CO2의 분위기 하에 10% 초 저 소 IgG FBS(GIBCO-BRL)를 함유하는 ASF104 배지(Ajinomoto)에서 컨플루언트가 될 때까지 배양시켰다.
후속적으로, 전체 배양액을 새로운 조직 배양 플라스크(750 ㎖, FALCON)로 옮기고, 세포를 37 ℃에서 5% CO2의 분위기 하에 10% 초 저 소 IgG FBS(GIBCO-BRL)를 함유하는 ASF104 배지(Ajinomoto)에서 컨플루언트가 될 때까지 배양시켰다.
배양 후 10 내지 20 일 째에, 각 하이브리도마의 배양 상청액을 회수하여 50 ㎖ 폴리프로필렌 원추형 튜브(FALCON)로 옮겼다. 상기 튜브를 500xg 하에서 5 분간 원심분리시켰다.
후속적으로, 생성된 원심분리 상청액을 멸균 필터 유니트(NALGEN)를 통해 여과하고, 여액을 회수하였다.
상기 여액을 인산염 완충액(30 ㎖)으로 예비-평형화시킨 하이트랩 단백질(HiTrap Protein) G 컬럼(하이트랩 친화성 컬럼 단백질 G; Amersham Pharmacia) 상에 3 ㎖/분의 유속으로 걸었다.
후속적으로, 상기 컬럼을 인산염 완충액(20 ㎖)으로 세척하고, 이어서 상기 컬럼 상에 100 mM 시트레이트 완충액(pH 2.0)을 약 1 ㎖/분의 저속으로 걸어, 목적의 항체를 용출시켰다. 후속적으로, 상기 용출된 용액을 750 mM 트리스-HCl 용액(pH 9.0)으로 중화시키고, 이어서 필터(Millipore)를 통해 여과하여 백색 침전물을 제거하였다. 생성된 여액을 인산염 완충액에 대해 투석시키고(밤새) 필터(Millipore)를 통해 여과시켰다. 상기와 같이 정제된 항-AILIM 인간 모노클로날 항체를 각 하이브리도마 주로부터 수득하였다.
사진 분광기(1A280=1.41 ㎎/㎖)를 사용하여 측정된 A280에서의 흡광도로부터 단백질 농도를 산출하였다.
<4-2> 방법 2
상술한 <2-4>에서 제조된 각각의 하이브리도마 클론의 세포를 10% 초 저 소 IgG FBS(GIBCO-BRL) 함유 ASF104 배지(Ajinomoto)에서 순화하고(1-2x106세포/㎖ 각각), 인테그라 셀 라인(Integra Cell Line) 1000(INTEGRA CL1000, INTEGRA BIOSCIENCE)에서 도말하고 배양시켰다. 배양 후 7 내지 10 일 째에, 세포 밀도가 1x108세포/㎖에 도달하면 각 하이브리도마 배양액의 상청액을 회수하였다.
각각의 배양 상청액을 인산염 완충액(30 ㎖)으로 예비-평형화시킨 하이트랩 단백질 G 컬럼(하이트랩 친화성 컬럼 단백질 G; Amersham Pharmacia) 상에 3 ㎖/분의 유속으로 걸었다.
후속적으로, 상기 컬럼을 인산염 완충액(20 ㎖)으로 세척하고, 이어서 100 mM 시트레이트 완충액(pH 2.0)을 상기 컬럼 상에 약 1 ㎖/분의 유속으로 걸어 항체를 용출시켰다. 이어서, 상기 용출된 용액을 750 mM 트리스-HCl 용액(pH 9.0)으로 중화시키고, 생성 용액을 필터(Millipore)를 통해 여과하여 백색 침전물을 제거하였다. 생성된 여액을 인산염 완충액에 대해 투석시키고(밤새), 이어서 필터(Millipore)를 통해 여과시켰다. 상기와 같이 정제된 항-AILIM 인간 모노클로날 항체를 각 하이브리도마 주로부터 수득하였다.
실시예 5 인간 AILIM에 대한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 반응성, 및 마우스 AILIM 및 래트 AILIM에 대한 상기 항체의 교차-반응성
세포 ELISA 방법을 사용하여, 상기 정제된 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체들의 인간 AILIM에 대한 반응성뿐만 아니라 마우스 AILIM과 래트 AILIM에 대한 교차 반응성에 대해서도 분석하였다.
<5-1> IgG 항체 농도를 측정하기 위한 ELISA 시스템의 수립 및 보정 곡선의 제조
상기 언급한 정제된 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 모두가 IgG(IgG2) 항체이므로, ELISA 시스템을 수립시켜 IgG 항체의 농도를 측정하였다.
염소 항-인간 IgG(Fc) 항체(PBS 중의 1.2 ㎍/㎖; 100 ㎕/웰; Organon Teknika)를 96-웰 ELISA 미세플레이트(Nunc)의 각 웰에 가하였다. 상기 플레이트를 실온에서 2 시간 동안 배양시켜 상기 미세플레이트 상에 항-IgG(Fc) 항체를 흡착시켰다. 후속적으로, 상청액을 버리고, 상기 플레이트를 0.05% 트윈20 함유 인산염 완충액(PBS)으로 3 회 세척하였다. 블로킹 시약(0.5% 우 혈청 알부민(BSA) 및 0.1% 트윈20을 함유하는 PBS)을 각 웰에 가하고(200 ㎕/웰) 상기 플레이트를 실온에서 2 시간 동안 배양시켜 상기 플레이트 상의 항-IgG(Fc) 항체가 결합되지 않은 부위를 블로킹시켰다. 이어서, 상기 블로킹 시약을 버리고, 각 웰을 PBS로 2회 세척하였다.
표준 항체로서 사용된 인간-유래된 IgG2 항체(50 ㎕/웰; The Binding Site)를 다양한 농도(0 내지 100 ng/㎖)로 상기 플레이트의 각 웰에 가하고, 상기 플레이트를 실온에서 2 시간 동안 배양시켰다. 표준 항체의 잉여 용액을 제거하고 각 웰을 0.05% 트윈20 함유 인산염 완충액으로 3 회 세척하였다.
후속적으로, 퍼옥시다제-결합된 염소 항-인간 IgG/κ 항체를 각 웰(4,000 배 희석, 100 ㎕/웰, Protos)에 가하고 상기 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 배양시켰다.
상기 상청액을 버리고, 상기 미세플레이트를 0.05% 트윈20 함유 인산염 완충액으로 3 회 세척하였다. 기질 함유 완충액[조성: 오르토-페닐렌디아민(O-페닐렌디아민, OPD; 20 ㎎)/시트레이트-인산염 완충액(pH 5.0, 50 ㎖)/30% 과산화 수소 수용액(15 ㎕)]을 각 웰에 가하고(100 ㎕/웰) 상기 플레이트를 실온에서 약 7 분간 배양시켰다.
후속적으로, 2 M 황산을 각 웰(50 ㎕/웰)에 가하여 반응을 정지시켰다. 미세플레이트 판독기를 사용하여 490 ㎚의 파장에서 측정된 흡광도 값을 토대로 보정 곡선을 작성하였다(도 2).
상술한 바와 동일한 방식으로 시험 물질로서 배양 배지 단독 또는 BSA 용액 단독으로 대조용 분석을 수행하였다.
<5-2> 인간 AILIM에 대한 다양한 정제된 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 반응성뿐만 아니라 마우스 AILIM 및 래트 AILIM에 대한 상기 항체의 교차 반응성에대한 분석
<5-2-1> 시약의 제조
본 세포 ELISA에서 사용되는 시약들을 하기와 같이 제조하였다:
<5-2-1-1> 마우스 AILIM 고발현 재조합 CHO 세포의 제조
마우스 AILIM 과 발현 재조합 CHO 세포를 <1-1> 및 <1-3>에 상술한 바와 동일한 방식으로 제조하고 수득하였다.
마우스 AILIM의 전장의 ORF를 함유하는 cDNA(GenBank 수탁 번호: AB023132(cDNA); BAA82126(아미노산))를 벡터 pEF-neo에 삽입하고, 이어서 생성된 재조합 발현 벡터를, 진 펄서(BioRad)를 사용하는 일렉트로포레이션(960 μF, 320 V)에 통상적으로 사용되는 방법에 의해, 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO 세포)에 도입시켰다. 상기 세포를 제네티신(0.8 ㎎/㎖; Gibco BRL) 및 10% FCS 함유 RPMI1640 배지에서 배양시켜 약물-내성 형질전환된 세포를 선별하였으며, 이에 의해 마우스 AILIM-고발현 재조합 CHO 세포를 수득하였다.
<5-2-1-2> 래트 AILIM을 고발현하는 재조합 CHO 세포의 제조
래트 AILIM 고발현 재조합 CHO 세포를 <1-1> 및 <1-3>에 상술한 바와 동일한 방식으로 제조하고 수득하였다.
래트 AILIM의 전장의 ORF를 함유하는 cDNA(GenBank 수탁 번호: AB023134(cDNA); BAA82128(아미노산))를 벡터 pEF-neo에 삽입하고, 이어서 생성된 재조합 발현 벡터를, 진 펄서(BioRad)를 사용하는 일렉트로포레이션(960 μF, 320 V)에 통상적으로 사용되는 방법에 의해 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO 세포)에 도입시켰다. 상기 세포를 제네티신(0.8 ㎎/㎖; Gibco BRL) 및 10% FCS 함유 RPMI1640 배지에서 배양시켜 약물-내성 형질전환된 세포를 선별하였으며, 이에 의해 래트 AILIM-고발현 재조합 CHO 세포를 수득하였다.
<5-2-1-3> 마우스 AILIM에 대한 모노클로날 항체의 제조
상술한 <5-2-1-1>에서 제조된 마우스 AILIM 고발현 재조합 CHO 세포를 호모지나이저시키고 초원심분리시켰다(100,000xg). 세포막 분획을 함유하는 생성된 펠릿을 회수하고 이어서 PBS에 현탁시켰다. 생성된 세포막 분획을 1 차 면역화(0 일 째)를 위해 프로인트 완전 아주반트와 함께 위스타 래트의 풋패드에 주입하였다. 세포막 분획의 항원을 상기 1 차 면역화 후 7 일째, 14 일째 및 28 일째에 상기 래트의 풋패드에 추가로 제공하였다. 림프절 세포를 최종 면역화 후 2 일째에 이들로부터 수거하였다.
상기 림프절 세포 및 마우스 골수종 세포 PAI(JCR No.B0113; Res. Disclosure, Vol.217, p.155, 1982)를 5:1의 비로 배합하였다. 융합제로서 폴리에틸렌 글리콜 4000(Boehringer Mannheim)을 사용하여 상기 세포들을 서로 융합시켜, 모노클로날 항체-생산 하이브리도마를 제조하였다. 이를 HAT, 10% 우태아 혈청 및 아미노프테린 함유 ASF104 배지(Ajinomoto)에서 배양시킴으로써 하이브리도마를 선별하였다.
마우스 AILIM에 대한 각 하이브리도마의 배양 상청액 중의 래트 모노클로날 항체의 반응성을 상기 배양 상청액을 상기 언급한 마우스 AILIM 발현 CHO 세포와 반응시키고, 이어서 FITC-표지된 항-래트 IgG(Cappel)로 염색시킨 세포의 형광 강도를 EPICS-ELITE 유식 세포 측정기에서 측정함으로써 확인하였다. 상기 스크리닝에 의해 마우스 AILIM에 대한 반응성을 갖는 모노클로날 항체 생산 하이브리도마를 다수 수득하였다.
이들 중에서, 하이브리도마 주를 "B10.5"라 명명하였다. 상기 하이브리도마의 세포들을 ICR nu/nu 마우스(암컷, 7 내지 8 주된 것)에 복강 내 주입하였다(106내지 107세포/0.5 ㎖/마우스). 상기 주입 후 10 내지 20 일 째에, 각 마우스로부터 통상적으로 사용되는 방법에 따라 마취 하에 개복시켜 복수를 수거하였다. 래트 항-마우스 AILIM 모노클로날 항체 B10.5(IgG1)를 상기 복수로부터 대규모로 제조하였다.
<5-2-2> 인간, 마우스 및 래트 AILIM에 대한 항체의 반응성
하기 개시된 ELISA에 사용되는 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 및 대조용 항체의 농도들을, 상술한 <5-1>의 ELISA 및 보정 곡선을 기준으로 측정하였다.
실시예 1에서 제조된 인간 AILIM 고발현 재조합 CHO 세포, 상술한 <5-2-1-1>에서 제조된 마우스 AILIM 고발현 재조합 CHO 세포 및 상술한 <5-2-1-2>에서 제조된 래트 AILIM 고발현 재조합 CHO 세포의 각 세포들(7x103세포/웰)을 96-웰 ELISA 미세플레이트의 웰에 도말하고 37 ℃에서 컨플루언트가 될 때까지 배양시켰다.
후속적으로, 상기 상청액을 버리고, 이어서 상기 제조된 다양한 정제 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체들 중 임의의 하나 또는 대조용 항체(항체 농도: 200 ㎍/㎖의 항체를 1% BSA 함유 PBS로 3 배, 32배, 33배, 34배, 35배, 36배, 37배, 38배, 39배, 310배, 311배 및 312배 희석하였다)를 각 웰에 50 ㎕/웰의 양으로 가하고, 상기 플레이트들을 실온에서 2 시간 동안 반응시켰다. 모노클로날 항체의 용액들을 버리고, 각 웰을 1% BSA(Sigma) 함유 인산염 완충액으로 3 회 세척하였다.
후속적으로, 양고추냉이 퍼옥시다제-공액 결합된 항-인간 IgG(Fc) 항체를 각 웰에 가하고(1,000 배 희석, 50 ㎕/웰; American Qualex), 상기 플레이트들을 실온에서 1 시간 동안 배양시켰다.
상기 표지된 항체의 잉여 용액을 버리고 미세플레이트를 1% BSA 함유 인산염 완충액으로 3 회 세척하였다. 기질 함유 완충액[조성: 오르토-페닐렌디아민(O-페닐렌디아민, OPD; 20 ㎎)/시트레이트-인산염 완충액(pH 5.0, 50 ㎖)/30% 과산화 수소 수용액(15 ㎕)]을 각 웰에 가하고(100 ㎕/웰) 상기 플레이트를 실온에서 약 7 분간 배양시켰다.
후속적으로, 2 M 황산을 각 웰(50 ㎕/웰)에 가하여 반응을 정지시켰다. 미세플레이트 판독기(Bio Rad)를 사용하여 490 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
대조용 ELISA 분석을 하기의 대조용 항체들을 사용하여 수행하여, 상술한 바와 동일한 방식으로 상기 언급된 항체들을 평가하였다:
(1) 인간 AILIM에 대한 마우스 모노클로날 항체 SA12 또는 SG430(JP-A 11-29599(실시예 12) 및 WO98/38216(실시예 12));
(2) 마우스 AILIM에 대한 래트 모노클로날 항체 B10.5(상술한 <5-2-1-3>);
(3) 래트 AILIM에 대한 마우스 모노클로날 항체 JTT2(하이브리도마에 의해 생산된 모노클로날 항체로, 부다페스트 조약 하에 1996년 10월 11일자로 국제 기탁 기관으로 인정된 일본국 통상성 공업기술연구원 생명공학기술연구소에 기탁 번호 FERM BP-5708로 국제 기탁되었다; JP-A 11-29599(실시예 1 및 2) 및 WO98/38216(실시예 1 및 2));
(4) 하이브리도마 상청액 대신에 KLH(키홀 림핏 헤모시아닌, PIERCE)에 대한 상기 제조된 인간 모노클로날 항체.
대조용 ELISA 실험을 AILIM-발현 재조합 CHO 세포 대신에 하기에 나타낸 야생형 CHO 세포를 사용하여 상술한 바와 동일한 방식으로 수행하였다.
결과를 도 3 내지 14에 나타낸다.
수득된 결과를 토대로, 인간 AILIM(인간 AILIM 고발현 재조합 CHO 세포), 마우스 AILIM(마우스 AILIM 고발현 재조합 CHO 세포) 또는 래트 AILIM(래트 AILIM 고발현 재조합 CHO 세포)에 대한 각각의 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 반응성에 대한 지수로서 50% 유효 농도(ED50: ng/㎖)를 계산하였다. 상기 계산에 의해 수득된 결과를 하기에 나타낸다.
(A) 인간 AILIM 고발현 CHO에 대한 ED50
AIF34(JMab-124): 5.3 ng/㎖
AIF182(JMab-126): 3.6 ng/㎖
AIF348(JMab-127): 9.1 ng/㎖
AIF620(JMab-128): 10.1 ng/㎖
AIF1052(JMab-135): 2.0 ng/㎖
AIH5D3(JMab-136): 7.5 ng/㎖
AIH386(JMab-137): 9.6 ng/㎖
AII289(JMab-138): 10.5 ng/㎖
AII394(JMab-139): 10.6 ng/㎖
AII488(JMab-140): 11.0 ng/㎖
AIJ40(JMab-141): 3.7 ng/㎖
SA12: 1.8 ng/㎖
SG430: 1.2 ng/㎖
(B) 마우스 AILIM 고발현 CHO에 대한 ED50
AIF34(JMab-124): 42 ng/㎖
AIF348(JMab-127): 81 ng/㎖
AIF620(JMab-128): 100 ng/㎖
AII289(JMab-138): 53 ng/㎖
AII394(JMab-139): 60 ng/㎖
AII488(JMab-140): 70 ng/㎖
(C) 래트 AILIM 고발현 CHO에 대한 ED50
AIF34(JMab-124): 45 ng/㎖
AIF348(JMab-127): 62 ng/㎖
AIF620(JMab-128): 97 ng/㎖
AII289(JMab-138): 57 ng/㎖
AII394(JMab-139): 90 ng/㎖
AII488(JMab-140): 90 ng/㎖
상기 결과는, 본 발명의 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체가 인간 AILIM에 대해 유의하게 높은 특이성을 나타냄을 보였다.
더욱이, 6 가지 유형의 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체들(상기 (B) 및 (C)에 나타낸 것들)이 마우스 AILIM과 래트 AILIM 모두에 대해 반응성(결합 능력, 교차-반응성)인 것으로 밝혀졌다.
실시예 6 항원(인간 AILIM)에 대한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 친화성 및 중화활성의 측정
상기 제조된 다양한 정제 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 각각과 인간 AILIM 간의 반응에 대한 결합 속도 상수(ka), 해리 속도 상수(kd) 및 해리 상수(Kd)를 상업적으로 입수할 수 있는 키트인 비아코어(Biacore) X(Amersham Pharmacia)를 사용하여 측정하였다.
<6-1> 센서 칩 상에 고정화시킬 항원의 제조
키트 중의 센서 칩 상에 고정화킬 항원을, 인간 AILIM의 세포 외 영역 및 인간 IgG1의 불변 영역(Fc)으로 이루어진 재조합 키메라 항원(이후부터 "인간 AILIM-IgFc"라 칭함)로서 제조하였다.
인간 AILIM-IgFc를, 본 발명자들 중 하나인 테츠카의 선행 출원(JP-A 11-29599(실시예 16(2)) 및 WO98/38216(실시예 16(2))에 개시된 방법에 따라 수득된 항원을 추가로 정제시킴으로써 제조하였다.
인간 AILIM-IgFc를 생산하는 재조합 세포의 배양 상청액을, 인산염 완충액(30 ㎖)으로 예비-평형화시킨 하이트랩 단백질 G 컬럼(하이트랩 친화성 컬럼 단백질 G; Amersham-Pharmacia)에 3 ㎖/분의 유속으로 걸어 상기 컬럼 상에 배양 상청액 중의 인간 AILIM-IgFc를 흡착시켰다.
후속적으로, 상기 컬럼을 인산염 완충액(20 ㎖)으로 세척하고, 이어서 100 mM 시트레이트 완충액(pH 2.0)을 상기 컬럼에 약 1 ㎖/분의 유속으로 걸어 인간 AILIM-IgFc를 용출시켰다. 후속적으로, 상기 용출된 용액을 750 mM 트리스-HCl 용액(pH 9.0)으로 중화시키고, 이어서 인산염 완충액에 대해 투석시켰다(밤새). 이어서, 상기 투석된 용액을 필터(Millipore)를 통해 여과시켰다. 상기와 같이 정제된 항-인간 AILIM-IgFc를 수득하였다.
분광광도계(1A280=1 ㎎/㎖)를 사용하여 측정된 A280에서의 흡광도로부터 단백질 농도를 산출하였다. 인간 AILIM-IgFc의 농도는 0.28 ㎎/㎖로 측정되었다.
래트 AILIM의 세포 외 영역과 인간 IgG1의 불변 영역(Fc)으로 이루어진 정제된 키메라 단백질(래트 AILIM-IgFc; JP-A 11-29599(실시예 16(2)) 및 WO98/38216(실시예 16(2))를 또한 상술한 바와 동일한 방식으로 제조하였다. 수득된 래트 AILIM-IgFc의 농도는 0.45 ㎎/㎖로 측정되었다.
<6-2> 친화성 및 중화 활성의 측정
하기 개시되는 센서 칩 상의 항원(인간 AILIM-IgFc)의 고정화를 제외한 실험절차는, 상업적으로 입수할 수 있는 분석 키트인 비아코어 X(Amersham-Pharmacia)에 첨부된 사용 설명서 및 실험 프로토콜을 기초로 하였다.
HBS 완충액(0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA 및 0.005% 계면활성제 P20 함유, pH 7.0)을 상기 키트에 부착된 플로우 셀(Flow Cell)-1을 통해 5 ㎕/분의 유속으로 흘려보냈다. 후속적으로, 0.005 M NHS(N-하이드록시숙신이미드)와 0.2 M EDC(N-에틸-N'-디메틸아미노프로필-카보디이미드)를 함유하는 용액(15 ㎕)을 가하여 센서 칩 표면 상에 코팅된 CM의 카복실 그룹을 활성화시켰다.
후속적으로, 인간 AILIM-IgFc 용액(10 ㎍/㎖; 10 mM 아세트산 나트륨 완충액에 용해됨, pH 5.0) 23 ㎕를 가하여, 상기 센서 칩 상에 인간 AILIM-IgFc를 고정화시켰다. 후속적으로, 반응되지 않은 활성화된 카복실 그룹들을, 1 M 에탄올 아민 하이드로클로라이드 35 ㎕를 가하여 블로킹시켰다. 2 회의 고정화 처리에 의해 고정화된 인간 AILIM-IgFc의 양은 각각 2,444 RU(공명 단위) 및 2,213 RU이었다. 상기 단위 RU는 질량/단위 면적(1 RU = 1 pg/㎟)에 해당한다.
기준 유동 세포인 플로우 셀-2를, 인간 AILIM-IgFc의 부재 하에서 상술한 바와 동일한 방식으로 캡핑 처리하였다.
인산염 완충액을 상기 유동 세포(센서 칩)를 통해 20 ㎕/분의 유속으로 흘려, 상기 실시예에서 제조된 각각의 정제된 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체를 가하였다(10 내지 50 ㎍/㎖, 60 ㎕).
측정을 위한 표준 조건은 결합 단계 3 분 및 해리 단계 10 분이었다. 항원에 대한 항체의 결합량 및 상기 항원으로부터 항체의 해리량을 각각 시간에 따라감시하여 센서그램을 얻었다. 항원으로부터의 항체의 해리는, PBS를 상기 센서 칩에 20 ㎕/분의 유속으로 흘려보냄으로써 행하였다.
생성된 센서그램 데이터를 토대로, 키트에 첨부된 분석 소프트웨어(BIAevaluation 3.0)를 사용하여, 결합 속도 상수(ka), 해리 속도 상수(kd) 및 해리 상수(Kd; Kd=kd/ka)를 컴퓨터로 계산하였다.
상기 실시예에서 제조된 인간 AILIM에 대한 마우스 모노클로날 항체 SA12 및 SG430의 친화성 및 중화 활성을 또한 상술한 바와 동일한 방식으로 분석하였다.
수득된 각 값들을 하기에 나타낸다.
클론 명 ka(1/M.Sec) kd[1/Sec] Kd(M)
AIF34(JMab-124) 1.6x104 1.0x10-4 6.3x10-9
AIF182(JMab-126) 3.2x104 2.8x10-5 8.8x10-10
AIF348(JMab-127) 1.9x104 6.4x10-5 3.4x10-9
AIF620(JMab-128) 1.1x104 1.1x10-4 1.0x10-8
AIF1052(JMab-135) 1.6x104 6.3x10-5 3.9x10-9
AIH5D3(JMab-136) 2.8x104 4.9x10-6 1.8x10-10
AIH386(JMab-137) 1.2x105 3.1x10-4 2.6x10-9
AII289(JMab-138) 3.7x104 4.2x10-5 1.1x10-9
AII394(JMab-139) 3.1x104 2.4x10-5 7.7x10-10
AII488(JMab-140) 2.3x104 3.5x10-5 1.5x10-9
AIJ40(JMab-141) 1.9x104 1.9x10-5 1.0x10-9
SA12 7.8x103 7.9x10-5 1.0x10-8
SG430 2.2x104 1.5x10-4 6.8x10-9
상기 결과는, 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 및 항-인간 AILIM 마우스 모노클로날 항체 모두가 인간 AILIM에 대해 현저하게 높은 결합 친화성과 중화 활성을 나타냄을 보인다.
실시예 7 인간 T 세포에서 부자극 신호를 전달하는 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 활성
본 발명에 따른 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체가 인간 T 세포 반응(IFN-γ 및 IL-4와 같은 시토킨의 생산, 세포 증식 등)을 조절(증대 및/또는 억제)하는 능력을 갖는 지의 여부, 즉 상기 항체가 AILIM-매개된 부자극 신호의 세포 전달에 대해 조절 활성을 나타내는지의 여부를 분석하였다. 분석은, 지수로서 인간 T 세포에서 생산된 시토킨(IFN-γ 및 IL-4)의 양뿐만 아니라 인간 T 세포 증식 정도를 기초으로 수행하였다.
<7-1> 항체의 희석
항-인간 CD3 모노클로날 항체 OKT3(ATCC CRL-8001)를, 인산염 완충액(PBS)으로 최종 농도 8 ㎍/㎖로 희석하였다.
상기 제조된 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 각각을, PBS로 최종 농도 40 ㎍/㎖로 희석하였다. 상기 항체 용액들을 PBS로 추가 희석하여 다양한 농도(40 ㎍/㎖ 내지 0.0049 ㎍/㎖)의 항체들을 제조하였다.
<7-2> 항체에 의한 미세플레이트의 코팅
96-웰 미세플레이트의 각 웰을, (1) 항-인간 CD3 모노클로날 항체 OKT3(8 ㎍/㎖; 각 웰에 25 ㎕) 및 상기 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체들 중 임의의 하나(40 ㎍/㎖ 내지 0.0049 ㎍/㎖; 각 웰에 25 ㎕), 또는 (2) 항-인간 CD3 모노클로날 항체 OKT3(8 ㎍/㎖; 각 웰에 25 ㎕) 단독으로 코팅하였다. 상기 플레이트들을 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 후속적으로, 항체 용액을 버리고, 각각의 웰을 PBS로 3 회 세척하였다. 세척 후에, 10% FCS 함유 RPMI1640 배지를 각 웰(100 ㎕/웰)에 가하고, 플레이트들을 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다.따라서, 상기 플레이트의 각 웰들을 상기 (1) 또는 (2)에 언급한 항체들로 코팅하였다.
대조용 항체로서 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 대신에 하기의 각 모노클로날 항체로 코팅된 플레이트들을 사용하여, 동일한 방식으로 대조용 실험을 수행하였다.
(1) 인간 AILIM에 대한 마우스 모노클로날 항체 SA12 또는 SG430(JP-A 11-29599(실시예 12) 및 WO98/38216(실시예 12));
(2) 마우스 항-인간 CETP 모노클로날 항체 JHC1(또한 JMab109라고도 칭함; JP-A 9-20800); 및
(3) 인간 항-KLH 모노클로날 항체(또한 JMab23이라고도 칭함; 상기 언급한 실시예).
상기 항체들로 코팅된 미세플레이트를 하기의 분석에 사용하였다.
<7-3> 인간 T 세포 현탁액의 제조
말초 혈을, 각각의 보통의 건강한 사람들(5 명; 공여자 A, B, C, D 및 E)로부터 채혈하였다. 단핵 세포 함유 분획을 림포프레프(LymphoPrep, Nycomed)를 사용하여 밀도-구배 원심분리에 의해 제조하였다. 판(Pan)-T 세포 단리 키트(Miltenyi) 및 마그네틱 소터(magnetic sorter)를 사용하여, 실험 절차에 대한 설명서에 따라 인간 단핵 세포 분획으로부터 인간 T 세포를 분리시켰다. T 세포 수를 혈구계수기로 측정하였다. 인간 T 세포를 10% FCS 함유 RPMI1640 배지에 현탁시켜 인간 T 세포 현탁액(1x106세포/㎖)을 제조하였다.
<7-4> 세포 배양
(1) 항-인간 CD3 항체 및 항-인간 AILIM 항체로 코팅된 미세플레이트를 사용하는 배양
인간 T 세포 현탁액(공여자 A, B, C, D 또는 E; 100 ㎕/웰; 1x105세포/웰)을 상기 언급한 항체로 코팅된 미세플레이트의 각 웰에 가하고, 상기 플레이트를 37 ℃, CO2배양기에서 3 일간 배양하였다.
배양 후에, 생성된 배양 상청액의 분액(50 ㎕)을 -20 ℃에서 보관하고 이어서 나중에 개시하는 분석(IFNγ에 대한 분석)에 사용하였다. 상기 배양 상청액의 분액들을 샘플링한 후에, 각각의 미세플레이트들을 하기의 분석에 사용하였다:
(2) 항-인간 CD3 항체만으로 코팅된 미세플레이트를 사용하는 배양
인간 T 세포 현탁액(공여자 D; 100 ㎕/웰; 1x105세포/웰)을 상기 언급한 항체로 코팅된 미세플레이트의 각 웰에 가하고, 이어서 여기에 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체들 중 어느 하나를 가하였다(40 ㎍/㎖ 내지 0.0049 ㎍/㎖의 항체 25 ㎕). 상기 플레이트를 37 ℃, CO2배양기에서 3 일간 배양하였다.
<7-5> T 세포의 증식 활성 측정
메틸 [3H]티미딘(0.5 μCi/웰; Amersham-Pharmacia)을 배양 후에 상기 플레이트의 각 웰에 가하고, 상기 플레이트를 37 ℃, CO2배양기에서 6 시간 동안 배양하였다. 배양 후에, 세포 수확기를 사용하여 세포들을 GF/C 필터(Packard) 상에 포착시켰다. 후속적으로, 상기 필터를 40 ℃에서 3 시간 이상 건조시키고, 이어서 여기에 마이크로신티(Microscinti) 0(20 ㎕/웰; Packard)을 가하였다. 상기 필터 상에 포착된 세포에 삽입되어 있는3H의 방사능을 β-계수기(TOP COUNT)로 측정하여 배양 후의 T 세포 증식 정도를 분석하였다.
결과를 도 15 내지 39에 나타낸다.
상기 분석의 결과, 미세플레이트를 항-인간 CD3 항체와 함께 항-인간 AILIM 모노클로날 항체(인간 모노클로날 항체 또는 마우스 모노클로날 항체)로 코팅시킨 경우, 인간 T 세포가 세포의 농도에 따라 유의하게 증식함을 나타냈다. 더욱이, 공여자들 중에서 세포 증식 정도에 약간의 차이가 있었다.
다른 한편으로, 플레이트를 항-인간 CD3 항체만으로 코팅시켜 항-인간 AILIM 모노클로날 항체를 용액 상태(액체 상)에서 상기 세포를 배양하는 동안 사용한 경우, 인간 T 세포는 유의하게 증식하지 않았다.
<7-6> T 세포 배양 상청액 중의 IFNγ에 대한 정량분석
상기 <7-4>의 (1)에 개시된 T 세포의 각 배양물(공여자 B 및 C)에 대해서, 배양 상청액 중의 IFNγ의 양을 상업적으로 입수할 수 있는 인간 IFNγ ELISA KIT(Amersham-Pharmacia; Endogen)에 의해 측정하였다.
결과를 도 40 내지 47에 나타낸다.
상기 분석의 결과, IFNγ의 생산이 항-인간 AILIM 모노클로날 항체(인간 모노클로날 항체 또는 마우스 모노클로날 항체)의 농도에 따라 유의하게 증가함을 보였다.
실시예 8 혼합된 림프구 반응(MLR)에 대한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 조절 활성
본 발명의 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체가 T 세포 반응(IFN-γ 및 IL-4와 같은 시토킨의 생산, 세포 증식 등)을 조절(증대 및/또는 억제)할 수 있는 지의 여부, 즉 세포로의 AILIM-매개된 부자극 신호의 전달을 조절할 수 있는 지의 여부를, 지수로서 동종이형의 혼합된 림프구 반응(동종이형 MLR)과 관련된 T 세포 증식 조절 활성(즉, 세포에서의 DNA 합성)을 분석함으로써 시험하였다.
<8-1> 인간 PBMC 및 T 세포의 제조
보통의 건강한 사람들(7 명: 공여자 A, B, C, D, E, F 및 G)로부터 각각 채혈한 말초 혈(200 ㎖)을 미세튜브(50 ㎖; Falcon) 중의 림포프레프(15 ㎖; Nycomed) 층 상에 분배하였다. 원심분리(1600 rmp에서 10 분간)시킨 후에, 중간 층들을 회수하였다. 회수된 세포를 인산염 완충액으로 2 배 이상 희석하고, 이어서 원심분리(1,800 rpm에서 10 분간)시켰다. 따라서, PBMC(말초 혈 단핵 세포; 2x108내지 5x108세포)를 제조하였다. 세포 수를 혈구계수기를 사용하여 측정하였다. MLR 분석에 사용할 세포의 분액(9 개 미세플레이트 당 1.08x108세포)을 취하여 빙 상에서 보관하였다. 나머지 세포는 하기 개시하는 T 세포의 분리를 위해사용하였다.
판(pan) T 단리 키트(Miltenyi Biotech)를 PBMC로부터 T 세포를 단리시키는데 사용하였다. 상기 키트에 첨부된 사용 설명서에 따라, 나머지 PBMC를 상기 키트에 첨부된 용액에 가하고, 상기 용액을 배양시켰다. 후속적으로, 세포를 5 mM EDTA 및 0.5% BSA 함유 PBS로 세척한 다음 PBS에 재 현탁시켰다. 후속적으로, 세포 현탁액을 PBS로 팽윤시킨 포지티브 선별 컬럼 VS+(Miltenyi Biotech)에 가하고 흡착되지 않은 분획을 회수하였다. 또한, PBS를 상기 컬럼에 걸고 세척 용액을 회수하였다. 동일한 처리를 1 회 반복하였다. 회수된 용액들을 함께 합하여 T 세포 분획을 얻었다. 상기 T 세포 분획을 원심분리시킨 후에, 세포를 PBS에 재 현탁시켰다. 생성된 T 세포의 세포 수를 혈구계수기를 사용하여 측정하였다. 상기 세포를 하기의 분석에 사용하였다.
<8-2> 혼합된 림프구 반응(MLR)
상술한 바와 같이, CD28과 CD80(B7-1)/CD86(B7-2), 및 CTLA4와 CD80(B7-1)/CD86(B7-2) 간의 2 개의 신호 전달 경로(상기에 대한 비교적 상세한 분석이 앞서 실시되었다)가, T 세포 등과 같은 림프구의 활성화에 필요한 부자극 신호 전달 경로로서 공지되어 있다.
즉, 혼합된 림프구 반응(MLR)에 반응하는 T 세포의 증식을 상기 2 개의 공지된 경로들 각각을 통한 신호 전달에 의해 유도할 수 있다.
따라서, 하기 나타내는 물질들을 사용함으로써, 본 발명의 시험을 수행하여 (1) CTLA4-매개된 신호 전달 경로의 차단에 의한 MLR의 억제; (2)CD80(B7-1)/CD86(B7-2)-매개된 신호 전달 경로의 차단에 의한 MLR의 억제; (3) CTLA4-매개된 경로와 CD80(B7-1)/CD86(B7-2)-매개된 신호 전달 경로 모두의 차단에 의한 MLR의 억제; (4) AILIM과 관련된 제 3 신호 전달 경로의 차단에 의한 MLR의 억제; 및 (5) CTLA4-매개된 경로와 AILIM-매개된 경로 모두의 차단에 의한 MLR의 억제를 분석하였다.
하기의 시험 물질들을 사용하였다.
(1) 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체(상술한 실시예에서 제조된 것);
(2) 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 SA12(상기 실시예에서와 동일한 것);
(3) 인간 항-KLH 모노클로날 항체(음성 대조용; 상기 실시예에서와 동일한 것);
(4) 마우스 IgG 항체(항-인간 CD34; 음성 대조용; Immunotech);
(5) 항-인간 CD80 모노클로날 항체(Pharmingen)와 항-인간 CD86 모노클로날 항체(Pharmingen)의 혼합물; 및
(6) 인간 CTLA4-IgFc 키메라 분자(Ancell).
혼합된 림프구 반응(MLR)을, 상기 <8-1>에서 개시한 공여자들로부터 제조된 PBMC와 T 세포를 사용하여, 하기의 6 개의 조합에 대해 수행하였다.
(i) T 세포(공여자 A)/PBMC(공여자 D)
(ii) T 세포(공여자 D)/PBMC(공여자 B)
(iii) T 세포(공여자 C)/PBMC(공여자 A)
(iv) T 세포(공여자 E)/PBMC(공여자 G)
(v) T 세포(공여자 F)/PBMC(공여자 E)
(vi) T 세포(공여자 G)/PBMC(공여자 F)
시험에 사용할 PBMC와 T 세포의 농도는 하기 개시하는 바와 같이 조절하였다.
PBMC를 PBS에 현탁시키고, 이어서 배양 접시(60 ㎜)로 옮겼다. 세포에 조사기(Hitachi MEDICO)를 사용하여 X-선(50 Gy)을 조사하였다. 세포를 회수하고, 원심분리시키고, 이어서 10% FCS 함유 RPMI1640 배지에 가하였다. 세포 수를 2x105세포/50 ㎕로 조절하였다.
각각의 공여자로부터 생성된 T 세포를 또한 10% FCS 함유 RPMI1640 배지에 가하고 세포 수를 1x105세포/50 ㎕로 조절하였다.
<8-2-1> 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체에 의한 MLR의 억제
10% FCS 함유 RPMI1640 배지를 U자 형 웰을 갖는 96-웰 미세플레이트의 각 웰에 가하였다. 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 또는 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 SA12의 용액을 10% FCS 함유 RPMI1640 배지로 희석하여 다양한 농도의 항체를 갖는 용액을 제조하였다. 희석된 항체 용액을 상기 웰에 가하였다(최종 농도: 0, 0.31, 1.25, 5 및 20 ㎍/㎖). 후속적으로, T 세포(50 ㎕)를 상기 웰에 가하였다. 상기 플레이트를 37 ℃, CO2배양기(NAPCO)에서 1 시간 동안 배양하였다. 반응을 완료시킨 후에, 상이한 공여자로부터 유래된 PBMC(50 ㎕)를 상기웰들에 가하여 MLR을 개시시켰다.
시험 물질로서 인간 항-인간 AILIM 항체 이외의 항체(상기 (3) 내지 (6)에 개시된 것)를 사용하여 MLR을 수행하는 경우, PBMC를 시험 물질과 배양시킨 후에 상이한 공여자로부터 유래된 T 세포를 반응시켰다.
배양 5 일 째에, 10% FCS 함유 RPMI1640 배지로 희석한 트리튬-표지된 티미딘(3H-티미딘; 20 ㎕; 1 μCi/웰)을 각 웰에 가하였다. 배양을 1 일 간 계속하였다. 배양을 완료시킨 후에, 세포를 세포 수확기(Packard)를 사용하여 수확하였다. 세포에 삽입되어 있는3H의 방사능을 β-계수기(TOP COUNT; Packard)에서 측정하여 배양 후 T 세포 증식 속도를 분석하였다.
결과를 도 48 내지 59에 나타낸다.
<8-2-2> CTLA4-매개된 신호 전달 경로가 사전에 차단된 MLR 시스템에서, 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체에 의한 MLR의 억제
10% FCS 함유 RPMI1640 배지를 U자 형 웰을 갖는 96-웰 미세플레이트의 각 웰에 가하였다. 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 또는 마우스 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 SA12의 용액을 10% FCS 함유 RPMI1640 배지로 희석하여, 다양한 농도의 항체를 갖는 용액을 제조하였다. 희석된 항체 용액을 상기 웰에 가하였다(최종 농도: 0, 0.31, 1.25, 5 및 20 ㎍/㎖). 후속적으로, T 세포(50 ㎕)를 상기 웰에 가하였다. 상기 플레이트를 37 ℃, CO2배양기(NAPCO)에서 1 시간 동안 배양하였다.
상기 T 세포의 배양 이외에, 다른 공여자들로부터 유래된 PBMC(10% FCS 함유 RPMI1640 배지 중의 것)를, 인간 CTLA4-IgFc를 상기 PBMC에 가한 후에 독립적으로 배양시켰다. 배양은 37 ℃, CO2배양기(NAPCO)에서 1 시간 동안 수행하였다. CTLA4-IgFc의 농도를 MLR의 출발 시에 20 ㎕/㎖로 조절하였다.
후속적으로, PBMC(50 ㎕)를 상술한 T 세포 배양액에 가하여 MLR을 개시시켰다.
시험 물질로서 인간 항-인간 AILIM 항체 이외의 항체(상기 (3) 내지 (5)에 개시된 것)를 사용하여 MLR을 수행하는 경우, CTLA4-IgFc의 존재 하에서 배양시킨 PBMC를 시험 물질과 배양 후에, 상이한 공여자로부터 유래된 T 세포를 반응시켰다.
배양 5 일 째에, 10% FCS 함유 RPMI1640 배지로 희석한 트리튬-표지된 티미딘(3H-티미딘; 20 ㎕; 1 μCi/웰)을 각 웰에 가하였다. 배양을 1 일 간 계속하였다. 배양을 완료시킨 후에, 세포를 세포 수확기(Packard)를 사용하여 수확하였다. 세포에 삽입되어 있는3H의 방사능을 β-계수기(TOP COUNT; Packard)에서 측정하여 배양 후 T 세포 증식 속도를 분석하였다.
결과를 도 60 내지 69에 나타낸다.
상술한 2 개의 시험으로부터 얻어진 결과는 하기와 같이 요약된다:
(1) CTLA4-IgFc는 CTLA4-매개된 신호 전달을 차단함으로써 T 세포의 동종 MLR-유도된 증식을 억제한다.
(2) 항-CD80 항체 및 항-CD86 항체는 CTLA4와 CD28의 리간드인 CD80/CD86에의해 매개되는 신호 전달을 억제함으로써, T 세포의 동종 MLR-유도된 증식을 억제한다.
(3) CTLA4-IgFc, 항-CD80 항체 및 항-CD86 항체와 동일하게, 인간 AILIM에 대한 모노클로날 항체는, 항체 농도-의존 방식으로 AILIM 매개된 신호 전달과 관련된 동종 MLR-유도된 T 세포 증식을 유의하게 억제한다.
즉, 상기 결과들은, CTLA4/CD80/CD86 및 CD28/CD80/CD86에 의해 매개된 공지된 경로들 이외에, AILIM 및 그의 리간드에 의해 매개된 제 3의 경로가 T 세포 활성화에 필요한 부자극 신호 전달 경로로서 존재할 뿐만 아니라, 상기 AILIM-매개된 신호 전달 경로가 AILIM에 대한 항체에 의해 억제됨을 보인다.
더욱 또한, 신호 전달에 대한 AILIM-매개된 경로의 기여가 CTLA4/CD80/CD86 및 CD28/CD80/CD86 매개된 경로의 기여에 필적할 수 있다는 가능성을 제기한다.
실시예 9 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC)을 일으키는 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 활성
항체에 의해 야기되는 생물학적 활성들에는 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC)의 유발이 포함된다. ADCC는 효과기 세포 및 표적 세포 이외에 항체를 필요로 하며, 림프구, 대식세포 또는 다형핵 백혈구와 같은 효과기 세포에 의해 유발되는 상기 표적 세포에 대한 손상을 일으키는 세포독성 작용이다.
ADCC를 일으키는 본 발명의 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 활성을 하기와 같이 분석하였다:
51Cr(0.1 mCi/106세포; Amersham-Pharmacia)을 상술한 실시예에서 제조된 인간 AILIM-고발현 재조합 HPB-ALL 세포의 배양액에 가하고, 혼합물을 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 상기 세포를 RPMI1640 배지로 8 회 세척하였다. 수득된 상기 동위원소-표지된 세포를 표적 세포로서 사용하였다.
상술한 바와 동일한 방식으로 대조용 세포로서 상기 동위원소로 표지한 야생형 인간 HPB-ALL 세포를 사용하여 대조 실험을 수행하였다.
림포세파(Lymphosepar) I(IBL)를 사용함으로써, PBMC 분획을 보통의 건강한 사람으로부터 채혈한 말초 혈로부터 분리시켰다. 생성된 인간 PBMC를 효과기 세포로서 사용하였다.
표적 세포(1x104세포/웰; 25 ㎕/웰)를 U자 형 웰을 갖는 96-웰 미세플레이트(Nunc)의 각 웰 상에 도말하였다. 후속적으로, 5% FBS 함유 RPMI1640 배지로 희석된 다양한 농도의 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체들 중 임의의 하나(0.0001 내지 1.0 ㎍/㎖; 25 ㎕/웰), 배지 단독(25 ㎕/웰) 또는 1% 노니뎃(Nonidet) P-40(25 ㎕/웰; 세포 용해 활성을 갖는 계면활성제)을 각 웰에 가하고 플레이트를 실온에서 20 분간 배양시켰다.
상술한 바와 동일한 방식으로 인간-항 AILIM 항체 대신에 양성 대조용으로서 항-인간 CD3 모노클로날 항체 OKT3(ATCC CRL-8001)을 사용하여 배양을 수행하였다.
후속적으로, 효과기 세포(E/T 비 = 50; 1x105세포/웰; 50 ㎕/웰)를 각 웰에가하고, 플레이트를 배양기에서 37 ℃, 5% CO2의 분위기 하에 16 시간 동안 배양시켰다.
배양 후에, 샘플들을 원심분리(1,500 rpm, 4 ℃, 10 분간)시켰다. 생성된 상청액을 회수하였다. 원심분리 상청액의 방사능을 γ-계수기로 측정하였다. 상기 방사능은 ADCC에 의한 세포막의 손상에 의해 상기 세포로부터 배양 상청액으로 방출된51Cr의 양을 나타낸다.
항-AILIM 항체 또는 항-CD3 항체에 의해 유발된 ADCC에 의해 야기된 세포막 손상%(세포 용해%)을, 배지만 관찰된 방사능을 세포막 손상(0)이 0%에 해당하고 노니뎃이 관찰된 방사능은 상기 세포막 손상이 100%에 해당한다는 가정 하에 측정하였다.
결과를 도 70 및 71에 나타낸다.
상기 시험 결과, 본 발명의 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체가 농도-의존 방식으로 ADCC-유발 활성을 나타냄을 보였다.
실시예 10 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 유전자 및 아미노산 서열 측정 및 이의 분석
상술한 실시예에서 제조된 다양한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체들의 중쇄를 암호화하는 cDNA뿐만 아니라 상기의 경쇄를 암호화하는 cDNA의 서열을 하기에 개시하는 바와 같이 측정하였다. 상기 유전자들의 구조적 특징을 또한 분석하였다.
퀵 프렙(Quick Prep) mRNA 정제 키트(Amersham-Pharmacia)를 사용함으로써, 폴리 A+RNA를 상술한 실시예에서 제조된 인간 AILIM에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 각각의 하이브리도마(클론: AIH5D3(JMab-136), AII289(JMab-138) 및 AII394(JMab-139))로부터 추출하고 정제하였다.
상기 하이브리도마 세포들을 세포 용해 완충액(Lysis Buffer)에 현탁시킨 다음, 시린지(synringe)를 사용하여 용해시켰다. 올리고(dT) 수지를 상기 용해된 물질에 가하고 상기 혼합물을 서서히 진탕시켰다. 후속적으로 올리고(dT) 수지를 세척하고, 이어서 폴리A+RNA를 용출 완충액으로 용출시켰다. 융출된 폴리A+RNA를 에탄올로 침전시키고, 이어서 트리스-EDTA 완충액에 용해시켰다. 수득된 폴리A+RNA의 농도를 260 ㎚ 파장에서의 흡광도에 의해 측정하였다.
주형으로서 폴리A+RNA를 사용하여, 상업적으로 입수할 수 있는 cDAN 합성 키트(GIBCOBRL) 및 합성 올리고 DNA NotI-T(서열번호: 1)를 프라이머로서 사용한 M-MLV 역 전사효소 방법에 따라, 이중 가닥 cDNA를 합성하였다.
구체적으로, 주형으로서 하이브리도마로부터 정제된 폴리A+RNA(약 5 ㎍), 프라이머(약 400 pmole) 및 M-MLV 역 전사효소를 함유하는 용액(약 50 ㎕)에서 37 ℃에서 1 시간 동안 단일 가닥 cDNA를 합성하였다. 후속적으로, dNTP, DAN 폴리머라제 I, RNaseH, DNA 리가제, 완충액 및 증류수를 상기 반응 용액(4 ㎕)에 가하고, 상기 혼합물을 16 ℃에서 2 시간 동안 배양시켜 이중 가닥 cDAN를 합성하였다.생성된 이중 가닥 cDNA를 페놀/클로로포름으로 추출하고 이어서 에탄올로 침전시켰다.
후속적으로, EcoRI 링커 DNA(약 300 pmole) 및 DNA 리가제(Ligation High; 33 ㎕; TOYOBO)를 TE 완충액 중에 상기 이중 가닥 cDNA를 함유하는 용액(약 50 ㎕)에 가하고, 상기 혼합물을 16 ℃에서 약 80 분간 배양시켜 상기 cDNA를 링커 DNA와 연결시켰다. 사용된 링커 DNA는 올리고 DNA(20 adp; 서열번호: 2)와 올리고 DNA(24 adp; 서열번호: 3)(이들은 통상적으로 사용되는 방법에 의해 5'-인산화되고 서로 어닐링되었다)로 이루어진 이중 가닥 DNA였다.
상기 DNA 연결물을 페놀/클로로포름으로 추출하고, 이어서 에탄올로 침전시켰다. 후속적으로, 상기 DNA 반응물을 상업적으로 입수할 수 있는 제한 효소 NotI(TOYOBO)로 소화시키고, 이어서 상업적으로 입수할 수 있는 ATP 용액(GIBCO BRL) 및 T4 키나제(TOYOBO)와 함께 37 ℃에서 30 분간 배양시켜 그의 5' 단부를 인산화시켰다.
생성된 DNA를 에탄올로 침전시키고, 이어서 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분획화시켰다. 약 500 bp 내지 2000 pb의 DNA를 함유하는 겔 조각을 절단시켰다. 상기 겔의 절단은 에티듐 브로마이드로 염색한 DNA가 사진기 하에서 UV 광의 조사에 의해 가시화되는 동안 수행되었다.
상기 겔 절단물을 분쇄하고 이어서 TE 완충액에 현탁시켰다. 상기 현탁액을 원심분리시키고 생성된 현탁액을 회수하였다.
회수된 DNA를 상업적으로 입수할 수 있는 DNA 리가제(Ligation High;TOYOBO)의 존재 하에서 상업적으로 입수할 수 있는 람다 파아지 벡터 λEXcell(0.25 ㎍; Amersham Pharmacia)에 연결시켰다(16 ℃, 30 분간). 다음 단계에서, 상기 DNA 연결물을 상업적으로 입수할 수 있는 람다 팩키징 키트 기가팩(Gigapack) III 골드(STRATAGENE)를 사용하여 람다 파아지로 팩키징하고, 생성된 파아지 입자를 숙주로서 대장균 NM522에 감염시켜 cDNA 라이브러리를 제조하였다. 상기 모든 조작들은 상기 키트에 첨부된 실험 프로토콜에 따라 수행하였다.
후속적으로, 상기 cDNA 라이브러리를 플라크 하이브리드 형성 방법(Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Labolatory Maunal", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York)에 의해 하기와 같이 스크리닝하였다:
상기 cDNA 라이브러리(1x104플라크)를 아가 플레이트에 도말하고 그의 복제 필터를 하이본드(Hybond)-N 나일론 멤브레인(Amersham Pharmacia)을 사용하여 제조하였다. 이들 복제 필터를, γ32P-ATP를 사용하여 표지한 프로브를 사용하여, 상기 플라크 하이브리드 형성 방법에 따라 하이브리드 형성 완충액 중에서 하이브리드 형성 처리하였다. 사용된 프로브는 항체 경쇄에 대해 HIGLC(서열번호: 4)이고, 항체 중쇄에 대해서는 NHCc2(서열번호: 5)이었다. 1 차 스크리닝 및 2 차 스크리닝에서 수득된 양성 클론들로부터 단일 플라크 단리를 수행하였다.
항체의 중쇄와 경쇄를 각각 주형 DNA로서 각각의 양성 클론으로부터의 파아지 현탁액을 사용하고 단일 PCR 프라이머 및 Taq PCR 키트(TAKARA)를 사용하는 PCR에 의해 증폭시켰다. 항체 경쇄에 사용된 프라이머 한 쌍은 ExcellE(서열번호: 6) 및 ck117(서열번호: 7)이고, 항체 중쇄에 사용된 프라이머 한 쌍은 ExcellE(서열번호: 6)와 NHCc2(서열번호: 5)이었다. 생성된 PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동을 사용하는 통상의 방법에 따라 분획화하였다. 상기 중쇄 및 경쇄에 상응하는 약 600 pb의 DNA를 함유하는 겔 조각들을 절단시켰다. 상기 겔로부터 정제된 DNA의 뉴클레오티드 서열을 DNA 순서판독기(373A; PE-Applied Biosystems), ABI PRISM 순서결정 소프트웨어(PE-Applied Biosystems) 및 ABI PRISM 자동 어셈블러(PE-Applied Biosystems)를 사용하여 분석하였다. 각각의 양성 클론으로부터의 DNA는, 충분한 뉴클레오티드 서열 길이를 갖는 것으로 입증되었다.
각각의 양성 클론의 플라크로부터의 λ파아지를 목적의 플라스미드 DNA의 생체 내 절제를 위해 대장균 NP66에 감염시키고, 생성된 사상 파아지를 암피실린-함유 플레이트 상에 도말하여 콜로니를 수득하였다. 후속적으로, 플라스미드 DNA를 통상적으로 사용되는 방법에 의해 상기 콜로니로부터 회수 및 정제하고, 대장균 JM109를 상기 플라스미드로 형질전환시켰다. 후속적으로, 상기 형질전환된 세포를 암피실린 함유 영양 아가 플레이트 상에 도말하여 콜로니를 형성시켰다.
후속적으로, 각각의 콜로니로부터 유래된 암피실린 함유 LB 배지 중의 세균 현탁액을 액체 영양 배지로 옮기고, 상기 세균을 37 ℃에서 24 시간 동안 배양시켰다. 상기 세균을 상기 배양액으로부터 수확하고, 이어서 플라스미드 DNA를 플라스미드 정제 키트(Quiagen)에 의해 정제하였다. 각각의 상기 플라스미드 DNA를 제한 효소 EcoRI/NotI으로 소화하여 벡터 DNA 및 삽입 DNA(중쇄 cDNA 또는 경쇄cDNA)의 존재를 확인하였다.
각각의 정제된 플라스미드에 삽입된 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 cDNA의 각 뉴클레오티드 서열을, DNA 순서판독기(373A; PE-Applied Biosystems), ABI PRISM 순서결정 소프트웨어(PE-Applied Biosystems) 및 ABI PRISM 자동 어셈블러(PE-Applied Biosystems)를 사용하여 통상적으로 사용되는 방법에 의해 측정하였다.
상기 서열 측정에 사용된 프라이머는 하기와 같다:
<중쇄 cDNA의 측정을 위해 사용된 프라이머>
M13R 프라이머(서열번호: 8; STRATAGENE), ExcellE(서열번호: 6), 136H(서열번호: 9), 138/9H(서열번호: 10), AILIMHC1(서열번호: 11), HCc1(서열번호: 12), NHCc2(서열번호: 5), HCc7(서열번호: 13), HCc8(서열번호: 14), HCc3(서열번호: 15), HCc4(서열번호: 16), HCc6(서열번호: 17), HIGHC(서열번호: 18), HCc9(서열번호: 19), HCc5(서열번호: 20) 및 폴리A(서열번호: 21).
<경쇄 cDNA의 측정을 위해 사용된 프라이머>
M13R 프라이머(서열번호: 8; STRATAGENE), ExcellE(서열번호: 6), AILIMLC1(서열번호: 22), AILIMLC2(서열번호: 23), LCc1(서열번호: 24), ck117(서열번호: 7), HIGLC(서열번호: 4), LCc2(서열번호: 25), HIK(서열번호: 26) 및 폴리A(서열번호: 21).
하기 나타낸 서열 목록은 상기 언급된 각각의 하이브리도마에 의해 생산된 인간 AILIM에 대한 인간 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄 암호화 cDNA 서열과, 상기 cDNA 서열로부터 연역되는 아미노산 서열을 함유한다.
클론 AIH5D3(JMab-136)
<중쇄>
DNA 서열: 서열번호: 27(신호 서열: 뉴클레오티드 69 내지 125 번, V 영역: 뉴클레오티드 126 내지 419 번)
아미노산 서열: 서열번호: 28(신호 서열: 아미노산 1 내지 19 번, 가변 영역: 아미노산 20 번 내지 118 번을 포함한다)
<경쇄>
DNA 서열: 서열번호: 29(신호 서열: 뉴클레오티드 39 내지 104 번, V 영역: 뉴클레오티드 105 내지 386 번)
아미노산 서열: 서열번호: 30(신호 서열: 아미노산 1 내지 22 번, 가변 영역: 아미노산 23 번 내지 116 번을 포함한다)
클론 AII289(JMab-138)
<중쇄>
DNA 서열: 서열번호: 31(신호 서열: 뉴클레오티드 94 내지 150 번, V 영역: 뉴클레오티드 151 내지 441 번을 포함한다)
아미노산 서열: 서열번호: 32(신호 서열: 아미노산 1 내지 19 번, 가변 영역: 아미노산 20 번 내지 116 번을 포함한다)
<경쇄>
DNA 서열: 서열번호: 33(신호 서열: 뉴클레오티드 28 내지 87 번, V 영역:뉴클레오티드 88 내지 375 번을 포함한다)
아미노산 서열: 서열번호: 34(신호 서열: 아미노산 1 내지 20 번, 가변 영역: 아미노산 21 번 내지 116 번을 포함한다)
클론 AII394(JMab-139)
<중쇄>
DNA 서열: 서열번호: 35(신호 서열: 뉴클레오티드 96 내지 152 번, V 영역: 뉴클레오티드 153 내지 443 번)
아미노산 서열: 서열번호: 36(신호 서열: 아미노산 1 내지 19 번, 가변 영역: 아미노산 20 번 내지 116 번을 포함한다)
<경쇄>
DNA 서열: 서열번호: 37(신호 서열: 뉴클레오티드 33 내지 92 번, V 영역: 뉴클레오티드 93 내지 380 번)
아미노산 서열: 서열번호: 38(신호 서열: 아미노산 1 내지 20 번, 가변 영역: 아미노산 21 번 내지 116 번을 포함한다)
유전자 서열용 분석 소프트웨어를 사용함으로써, 문헌[Tomlinson et al., Immunol. Today, Vol. 16, No. 5, p. 237-242, 1995]의 방법에 의해 제작된 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자에 대한 라이브러리 V BASE 서열을, 본 발명에서 측정된 DNA 서열 각각에 대해 찾았다.
결과는, 상기 언급한 인간 모노클로날 항체의 각각의 중쇄 및 경쇄의 V-영역 유전자가 하기의 분절들로 이루어졌음을 나타내었다.
<중쇄 V-영역 유전자>
클론 AIH5D3(JMab-136): 1-02
클론 AII289(JMab-138): 3-13
클론 AII394(JMab-139): 3-13
<경쇄 V-영역 유전자>
클론 AIH5D3(JMab-136): L5
클론 AII289(JMab-138): A27
클론 AII394(JMab-139): A27
실시예 11 지연성 과민증(DTH)에 대한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 억제 효과
유해 항원(병원성 미생물, 예를 들어 바이러스, 세균 및 기생충, 이물 등)을 제거하고자 하는 생체에 대한 면역반응의 생물학적 시스템은, 대체적으로 선천성 면역과 후천성 면역으로 나뉠 수 있다.
전자는 식세포(다형핵 백혈구, 단핵세포, 대식세포 등)에 의한 식작용, 천연 킬러(NH) 세포에 의한 공격, 및 보체에 의한 항원의 옵소닌화 등을 포함한 비-특이적인 인식을 기본으로 하는 제거 시스템이다.
후자인 후천성 면역 반응은 항원에 대한 특이성(활성)을 습득한 림프구(주로, T 세포 및 B 세포)에 의한 제거 시스템이다.
또한, 후천성 면역 반응은 광범위하게 세포성 면역과 체액성 면역으로 나뉠 수 있다.
항체-의존성 체액성 면역과 달리, 세포성 면역은 표적으로서의 항원에 대한 T 세포의 직접적인 작용에 의해 일반적으로 발현되는 면역 반응이다. 세포성 면역은 바이러스 또는 종양에 대한 면역 반응, 조직 또는 기관 이식 후 유발되는 면역 반응, 일부 약물에 대한 과민증, 및 자기면역 질환들 중 일부에 관여하고 있는 것으로 공지되어 있다.
세포성 면역에 속하는 대부분의 전형적인 현상은, 널리 공지된 투베르쿨린 알레르기(투베르쿨린 과민증과 거의 동의어임)이다. 투베르쿨린 알레르기는 결핵균에 의한 감염에 의해 촉발되는 지연성 알레르기이다. 상기 알레르기는 결핵균에 의한 감염이 원인이며, 생체에 결핵균의 배양 상청액 중에 생산된 투베르쿨린 단백질을 피하 주입하여 면역 반응을 일으킴으로써 유발시킬 수 있다.
지연성 알레르기는 항원에 의해 민감하게된 T 세포(항원을 기억하는 기억 T 세포)에 의해 매개되는 알레르기이다. 상기 알레르기를 "지연성"이라 칭하는데, 그 이유는 항원에 감작된 생체가 상기 항원과 다시 접촉 시 기억 T 세포에 의해 유발되는 염증을 갖는 알레르기 반응을 나타내는데 24 내지 48 시간이 걸리기 때문이다.
지연성 알레르기의 전형인 투베르쿨린 알레르기의 현상은 일반적으로 결합균의 감염에 의한 감작이 동물에 이미 확립되었는 지의 여부를 진단하기 위한 "투베르쿨린 시험"에 사용되었다. 구체적으로, 상기 시험은 하기와 같이 수행된다: 결핵균의 배양액으로부터 정제된 투베르쿨린 단백질인 정제된 투베르쿨린(정제된 단백질 유도체; PPD; 일반적인 진단용으로는 유도체 0.05 ㎍/0.1 ㎖(2.5 TU)의 0.1㎖)을 동물에게 피하 투여하고; 주입 후 48 시간 째에 주입 부위의 피부 홍반의 주축을 측정하고; 결핵균의 감염 존재를 상기 측정된 주축을 근거로 진단할 수 있다. 상기 홍반의 주축이 4 ㎜ 보다 짧으면, 상기 대상자는 음성이며; 4 내지 9 ㎜ 범위 이내인 경우에는 상기 대상자는 가 양성이고; 10 ㎜ 이상이면 상기 대상자는 양성으로 판단된다.
세포성 면역과 관련된 지연성 알레르기에는, 예를 들어 상술한 결핵균에 의해 야기된 투베르쿨린 알레르기와 같은 감염성 병원균의 항원에 대한 상기 언급한 알레르기 외에 소량의 단백질 등에 의해 일시적으로 유발되는 존스-모트형 과민증, 피크릴 클로라이드와 같은 약물 또는 일본 옻과 같은 식물 독소에 의한 접촉 알레르기, 또는 이식편 거부반응(예를 들어 동종이형 이식편)과 관련된 알레르기가 포함된다.
본 시험에서, 지연성 과민증(지연성 알레르기)에 대한 항-AILIM 항체의 억제 효과를 상기 언급한 투베르쿨린 시험을 사용하여 평가하였다. 시험을 하기와 같이 수행하였다:
소과 결핵균의 감독된 생균인 BCG(칼메트 구에린 간균)로 감작시킨 비비 원숭이(수컷, 체중: 6.0 내지 8.5 ㎏, 환경 생물 생명 과학 연구 센터 주식회사(Environmental Biological Life Science Research Center Inc.; 각 그룹 당 3 마리)를 각각 케타민 하이드로클로라이드(10 ㎎/㎏, 근 내 주입)로 마취시키고, 이어서 하기 나타낸 시험 샘플들 중 임의의 하나를 0.1 ㎖의 양으로 가슴의 각 주입 부위에 피하 제공하였다(6 개의 주입 부위/개인). 상기 샘플의 주입부위간의 거리는 3 ㎝ 이상이었다.
(1) 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체(JMab-136; 0.2 ㎎; 각 주입 부위에서 10 ㎍)와 투베르쿨린(생리 식염수 1 ㎖ 당 4 ㎍)의 1:1 혼합 용액;
(2) 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체(JMab-136; 2 ㎎; 각 주입 부위에서 100 ㎍)와 투베르쿨린(생리 식염수 1 ㎖ 당 4 ㎍)의 1:1 혼합 용액;
(3) 대조용으로서 인산염 완충액(PBS(-));
(4) 양성 대조용으로서 상업적으로 입수할 수 있는 스테로이드성 소염제인 프레드니솔론(0.2 ㎎; 각 주입 부위에서 10 ㎍)과 투베르쿨린(생리 식염수 1 ㎖ 당 4 ㎍)의 1:1 혼합 용액;
(5) 음성 대조용으로서 인간 항-KLH 모노클로날 항체(실시예 <2-2>; 0.2 ㎎; 각 주입 부위에서 10 ㎍)와 투베르쿨린(생리 식염수 1 ㎖ 당 4 ㎍)의 1:1 혼합 용액.
각 샘플 주입 후 24 시간 째에, 각 주입 부위의 홍반의 주축과 부축을 측정하여 상기 홍반의 면적을 결정하였다.
결과를 도 72에 나타낸다.
상기 결과는, 지연성 알레르기로 인한 홍반이 대조군 및 음성 대조군에 비해 항-AILIM 항체를 주입시킨 임의의 그룹에서 유의하게 억제됨을 보였다. 상기 억제 효과는 양성 대조군으로서 사용된 스테로이드성 소염 약물의 효과에 필적할만 하였다.
실시예 12 이식편 대 숙주병(GVHD) 환자의 다양한 조직들에서의 AILIM의 발현 분석
공여자로부터 동종 이식편을 이식받은 수용자이고 상기 이식 후 급성 또는 만성 이식편 대 숙주병(GVHD)에 걸린 것으로 임상적으로 진단된 환자로부터 생검법에 의해 수득된 다양한 조직에서의 AILIM의 발현을, 통상적으로 사용되는 방법에 의해 분석하였다. 상술한 실시예에서 제조된 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체(JMab-36) 및 HE로서, 조직들을 염색하였다.
급성 GVHD 환자(28 명의 사례)로부터 수거된 다양한 조직들로부터의 33 개의 샘플뿐만 아니라 만성 GVHD 환자(5 명의 사례)로부터 수거된 5 개의 샘플을 사용하여 분석을 수행하였다.
결과는 하기와 같았다: AILIM-양성 반응이 29 개의 피부 조직 샘플 중 15 개; 3 개의 위 조직 샘플 중 하나; 및 1 개의 결장 조직 샘플 중 하나에서 발견되었고; 상기 조직들은 모두 급성 GVHD 환자의 것이었다. AILIM-양성 반응은 3 개의 피부 조직 샘플 중 1 개; 2 개의 결장 조직 샘플 중 2 개에서 발견되었고; 이들 조직은 모두 만성 GVHD 환자의 것이었다. 더욱이, AILIM-양성 반응은 유의한 림프구 침윤이 관찰된 13 개의 샘플들 중 10 개에서 발견되었다.
실시예 13 원숭이 T 세포에서 부자극 신호를 전달하는 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 활성
실시예 7에서 수행된 실험에 의해, 본 발명의 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체가 인간 T 세포 반응을 조절함으로써, 구체적으로 상기 세포로의 AILIM-매개된 부자극 신호의 전달을 조절함으로써, 인간 T 세포의 증식을 증대시킬 수 있음을 입증하였다. 본 시험에서, 상기 인간 모노클로날 항체가 실시예 7에 개시된바와 동일한 방법에 의해 원숭이 T 세포의 세포 증식을 증대시키는 활성을 나타내는지의 여부에 대해 분석하였다.
<13-1> 항체의 희석
항-인간 CD3 모노클로날 항체 SP34(BD-Pharmingen)를 인산염 완충액(PBS)으로 최종 농도 1 ㎍/㎖로 희석하였다.
상기 제조된 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMAb136을 PBS로 최종 농도 40 ㎍/㎖로 희석하였다. 상기 항체 용액들을 PBS로 추가로 희석하여 다양한 농도의 항체들(40 ㎍/㎖ 내지 0.064 ㎍/㎖)을 제조하였다.
<13-2> 미세플레이트의 항체에 의한 코팅
96-웰 미세플레이트의 각 웰을, 항-인간 CD3 모노클로날 항체 SP34(1 ㎍/㎖; 각 웰에 25 ㎕) 및 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMAb136(40 ㎍/㎖ 내지 0.064 ㎍/㎖; 각 웰에 25 ㎕)으로 코팅시켰다. 상기 플레이트들을 37 ℃에서 2 시간 동안 배양시켰다. 후속적으로, 상기 항체 용액들을 버리고, 각각의 웰을 PBS로 3 회 세척하였다. 상기 세척 후에, 10% FCS 함유 RPMI1640 배지를 각 웰에 가하고(100 ㎕/웰), 상기 플레이트들을 37 ℃에서 1 시간 동안 배양시켰다. 따라서 상기 플레이트의 각 웰들을 상기 언급한 항체들로 코팅시켰다.
인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 대신에 음성 항체로서 인간 항-KLH 모노클로날 항체(JMab23; 선행 실시예 참고)로 코팅시킨 플레이트를 사용하여 동일한 방식으로 대조용 실험을 수행하였다.
상기 항체들로 코팅된 미세플레이트들을 하기의 분석에 사용하였다.
<13-3> 원숭이 T 세포 현탁액의 제조
말초 혈을 게잡이 원숭이로부터 채혈하고, 단핵 세포를 니코프레프(NycoPrep)1.077A(Nycomed)를 사용하여 밀도 구배 원심분리에 의해 분획화하였다. 실험 설명서에 따라, 항-인간 CD4 항체 M-T477(BD-Pharmingen), 항-인간 CD8 항체 RPA-T8(BD-Pharmingen), 항-마우스 IgG 미소비이드(Miltenyi) 및 마그네틱 소터를 사용하여, 상기 게잡이 원숭이 단핵 세포로부터 원숭이 T 세포를 분리시켰다. T 세포 수를 혈구계수기를 사용하여 측정하였다. 원숭이 T 세포를 10% FCS 함유 RPMI1640 배지에 현탁시켰다. 따라서 원숭이 T 세포 현탁액(1x106세포/㎖)이 제조되었다.
<13-4> 세포 배양
(1) 항-인간 CD3 항체 및 항-인간 AILIM 항체로 코팅시킨 미세플레이트를 사용하는 배양
원숭이 T 세포 현탁액을 상기 언급한 항체로 코팅시킨 미세플레이트의 각 웰에 가하고, 상기 플레이트를 37 ℃, CO2배양기에서 2 일간 배양시켰다.
상기 배양을 완료시킨 후에, 각각의 미세플레이트를 하기의 분석에 사용하였다:
<13-5> T 세포의 증식 활성 측정
메틸 [3H]티미딘(0.5 μCi/웰; Amersham-Pharmacia)을 상기 배양 후 플레이트들의 각 웰에 가하고, 상기 플레이트들을 37 ℃, CO2배양기에서 6 시간 동안 배양시켰다. 배양 후에, 세포를 세포 수확기를 사용하여 GF/C 필터(Packard) 상에 포착시켰다. 후속적으로, 상기 필터를 40 ℃에서 3 시간 이상 건조시키고, 이어서 마이크로신티 0(20 ㎕/웰; Packard)를 여기에 가하였다. 상기 필터상에 포착된 세포에 삽입되어 있는3H의 방사능을 β-계수기(TOP COUNT)로 측정하여 상기 배양 후 T 세포 증식 정도를 분석하였다.
결과를 도 73에 나타낸다.
상기 분석의 결과, 미세플레이트를 항-인간 CD3 항체와 함께 항-인간 AILIM 모노클로날 항체(인간 모노클로날 항체 또는 마우스 모노클로날 항체)로 코팅시킬 때, 원숭이 T 세포가 상기 세포의 농도에 따라 현저하게 증식됨을 보였다.
상기 결과는, 또한 본 발명의 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체가 원숭이 AILIM에 결합할 수 있고 원숭이 AILIM의 기능을 조절하는 활성을 가짐을 시사한다.
실시예 14 AILIM 또는 AILIM 리간드에 결합할 수 있는 물질의 동정 방법 및 정량 분석 방법의 구축
AILIM(ICOS) 또는 AILIM 리간드(B7h/B7RP1/GL50/LICOS)에 결합할 수 있는 물질을 동정하거나 정량분석하기 위해서 ELISA(효소-결합된 면역 용매 분석) 방법을 구축시켰다.
예로서 하기에 상세히 개시되는 방법의 원리는 해당 물질이 가용성 인간 AILIM(hAILIM-IgFc)과 가용성 인간 AILIM 리간드(hB7h-IgFc) 간의 결합을 저해하는정도를, ELISA에 의해, 평가하는 것을 기본으로 한다.
<14-1> 샘플
하기의 샘플들을 사용하였다:
(1) 스트렙트아비딘-HRP(Southern Biotechnology Associates, Inc.);
(2) 가용성 인간 AILIM 리간드(인간 B7h의 세포 외 영역과 인간 IgG1의 불변 영역간의 융합 단백질);
상기 단백질은 <14-2>에 개시된 방법에 의해 제조되었다;
(3) 비오틴-표지된 가용성 AILIM-IgFc;
상기 AILIM-IgFc는 본 발명자들 중 하나인 테츠카의 선행 출원(JP-A 11-29599(실시예 16(2)) 및 WO98/38216(실시예 16(2))에 개시된 바와 동일한 방법에 따라 수득된 항원을 추가로 정제시킴으로써 제조하였다;
(4) 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체(JMab-136; 상기 개시됨);
(5) 인간 항-KLH 모노클로날 항체(음성 대조용 항체: JMab-23; 상기 개시됨);
(6) 인산염 완충액(PBS(-); Nikken Seibutsu);
(7) RPMI1640 배지(Nikken Seibutsu);
(8) 우태아 혈청(FCS; JRH-Bioscience);
(9) 30% 우 혈청 알부민(BSA; Sigma);
(10) 트윈20(BioRad);
(11) TMB+기질 크로모겐(Dako).
<14-2> 가용성 인간 AILIM 리간드(인간 B7h의 세포 외 영역 및 인간 IgG1의 불변 영역의 융합 단백질(hB7h-IgFc))의 제조
전체 RNA를, 상기 실시예에 개시한 바와 동일한 방식으로 인간 말초 혈-유래된 단핵 세포로부터 제조하였다. 주형으로서 상기 수득된 전체 RNA(5 ㎍)로부터 제 1 가닥 cDNA 합성용 슈퍼스크립트 예비증폭 시스템(Superscript Preamplification System for First Strand cDAN Synthesis(GIBCO-BRL))을 사용하여 cDNA를 합성하였다.
후속적으로, 각각의 단부에 XhoI 제한 부위를 갖는 5' 프라이머(5'-GAGGTCTCCGCCCTCGAGATGCGGCTGGGCAGTCC-3', 서열번호: 39) 및 BamHI 제한 부위를 갖는 3' 프라이머(5'-CACAGGACAGCCAGGGGATCCCACGTGGCCGCG-3', 서열번호: 40)를 구상하고 합성하여 PCR에 의해 인간 AILIM 리간드(hB7h)의 세포 외 영역을 암호화하는 cDNA를 증폭시켰다. 주형으로서 cDNA 및 상기 프라이머 쌍을 사용함으로써, PCR을 수행하여 인간 B7h의 세포 외 영역을 암호화하는 cDNA를 함유하고, 각각의 단부에 XhoI 및 BamHI을 갖는 DNA를 제조하였다. 생성된 PCR 산물을 XhoI 및 BamHI으로 소화하고, 아가로스 겔 전기영동에 의해 분획화시켜, 목적의 세포 외 영역을 암호화하는 것으로 예측되는 약 720-bp의 cDNA 단편에 상응하는 밴드를 단리시켰다. 상기 단리된 cDNA 단편을 XhoI 및 BamHI으로 예비-소화시킨 플라스미드 pBluescript II SK(+)(Stratagene) 내로 서브클로닝시켰다. 자동화된 형광 측정성 DNA 순서판독기(Applied Biosystems)를 사용하는 서열 분석에 의해, 상기 cDNA 단편이 인간 B7h의 세포 외 영역을 암호화하는 부분을 함유함이 입증되었다.
다른 한편으로, 융합 짝으로서 인간 IgG1의 Fc를 암호화하는 DNA를, 플라스미드(문헌[Cell, Vol. 61, p. 1303-1313, 1990] 참조; 매사추세츠 종합병원에서 시이드(Seed) 박사 등에 의해 제조됨)를 BamHI 및 XbaI으로 소화시킴으로써 BamHI-XbaI DNA 단편(약 1.3 kb)으로서 제조하였다. 상기 단편은 인간 IgG1, Cγ12 및 Cγ13의 경첩 영역을 암호화하는 엑손들을 함유하였다.
상술한 바와 같이 제조된 인간 B7h(hB7h)의 세포 외 영역을 암호화하는 XhoI-BamHI 단편 및 인간 IgG1의 Fc("IgFc"라 약기함)를 암호화하는 엑손을 함유하는 BamHI-XbaI 단편을, XhoI 및 XbaI으로 예비-소화시킨 플라스미드 pBluescript II SK(+)(Stratagene) 내로 서브클로닝시켰다.
후속적으로, 상기 플라스미드를 XhoI 및 XbaI으로 소화시켜, 인간 B7h의 세포 외 영역과 인간 IgFc 간의 융합 DNA를 함유하는 약 1.8 kb의 DNA 단편을 제조하였다. T4 DNA 리가제를 사용함으로써, 상기 융합 DNA 단편을 XhoI과 XbaI 부위의 사이에서 발현 벡터 pME18S(Medical Immunology, Vol. 20, No. 1, p. 27-32, 1990, 및 "Handbook for Genetic Engineering", Experimental Medicine, supplement, Yodosha, pp. 101-107, 1992)에 삽입하여, 플라스미드 phB7h-IgFc를 제작하였다.
10% 우태아 혈청 및 암피실린을 함유하는 DMEM 배지에서 서브컨플루언트(subconfluent)가 될 때까지 배양시킨 단층 COS7 세포(ATCC CRL-1651)를, 일렉트로포레이션에 의해 플라스미드 phB7h-IgFc로 형질전환시켜 형질전환된 세포를 수득하였다.
상기 형질전환된 세포를 혈청 비 함유 ASF104 배지에서 72 시간 동안 배양시킴으로써 hB7h-IgFc를 발현시켰다.
HB7h-IgFc를 하기와 같이 단백질 G 세파로스 친화성 컬럼(Amersham Pharmacia)을 사용하여 정제하였다:
상기 언급한 배양 상청액을 원심분리시켜 원심분리 상청액을 수득하였다. 생성된 상청액을 결합 완충액으로 예비 평형화시킨 단백질 G 세파로스 친화성 컬럼에 걸었다. 후속적으로, 상기 컬럼을 상기 결합 완충액으로 세척하고, 이어서 용출 완충액으로 용출시켰다. 상기 용출된 용액을 회수하고, 이어서 인산염 완충액에 투석시켰다. 외부의 투석 완충액을 2 회 이상 교환하였다. 따라서 정제된 hB7h-IgFc가 수득되었다.
<14-3> 항체 및 가용성 인간 AILIM(hAILIM-IgFc)의 희석 및 그의 반응
음성 대조용 항체로서 인간 항-KLH 모노클로날 항체(JMab-23) 및 항-인간 AILIM 모노클로날 항체(JMab-136)의 원래 용액(20 ㎍/㎖)을 일련의 11 개 단계로 희석시키고, 각 샘플(200 ㎕)에 10% FCS 함유 RPMI1640 배지 200 ㎕를 가하고 잘 혼합하였다. 따라서 다양한 농도의 항체 용액이 제조되었다. 비오틴-표지된 hAILIM-IgFc(2 ㎕/튜브; 최종 농도 1 ㎍/㎖)를 다양한 농도로 제조된 용액 각각에 가하였다. 생성된 용액을 잘 혼합하고 실온에서 30 분간 배양시켰다.
<14-4> hAILIM-IgFc와 hB7h-IgFc 간의 결합을 억제하는 항-AILIM 모노클로날 항체의 활성에 대한 분석
hB7h-IgFc를 96-웰 미세플레이트(50 ㎕/웰(800 ng/웰))의 각 웰에 가하였다. 상기 플레이트를 밀폐시키고, 이어서 37 ℃에서 1 시간 동안 배양시켰다. 각각의 웰로부터 용액을 제거하고, 상기 웰을 PBS(120 ㎕)로 3 회 세척하였다. 후속적으로, 0.5% BSA(100 ㎕/웰) 함유 PBS를 각 웰에 가하여 반응되지 않은 부위들을 블로킹시켰다. 상기 플레이트를 밀폐시키고 37 ℃에서 1 시간 동안 배양시켰다. 배양 후에, 상기 용액을 제거하고, 이어서 상기 웰들을 PBS(120 ㎕)로 3 회 세척하였다. 후속적으로, <14-3>에서 제조된 각 샘플(50 ㎕/웰)을 상기 웰에 가하였다. 상기 플레이트를 밀폐시키고 37 ℃에서 1 시간 동안 배양시켰다. 용액을 각 웰로부터 제거하였다. 상기 웰들을 37 ℃에서 예열시킨 10% FCS 함유 RPMI1640 배지(120 ㎕)로 3 회 세척하였다. 후속적으로, 3.7% 포르말린 함유 PBS(100 ㎕/웰)를 각 웰에 가하고, 상기 플레이트를 빙 상에서 5 분간 배양시켰다. 용액을 각 웰로부터 제거하고, 상기 웰들을 0.1% 트윈20(120 ㎕)으로 3 회 세척하였다. 후속적으로, 스트렙트아비딘-HRP(50 ㎕/웰)를 각 웰에 가하였다. 상기 플레이트를 밀폐시키고 실온에서 30 분간 배양시켰다. 용액을 각 웰로부터 제거하고, 상기 플레이트를 0.1% 트윈20 함유 PBS(120 ㎕)로 3 회 세척하였다. 후속적으로, TMB+기질 크로모겐(50 ㎕/웰)을 각 웰에 가하고 상기 플레이트를 실온에서 20 분간 배양시켰다. 후속적으로, 2N 황산(50 ㎕/웰)을 각 웰에 가하여 상기 반응을 중단시켰다. 각 웰의 흡광도를 THERMO max(Molecular Devices)에 의해 450 ㎚의 파장에서 측정하였다.
결과를 도 74 내지 76에 나타낸다.
상기 결과는 항-AILIM 항체가 투여량-의존 방식으로 hAILIM-IgFc와 hB7h-IgFc 간의 결합을 억제하는 활성을 가짐을 보였다.
따라서, 본 실시예는 본 발명의 방법에 의해 예시된 분석 시스템을 이용하여 AILIM 또는 AILIM 리간드에 결합할 수 있는 물질(예를 들어, 항체 또는 합성 저 분자량 화합물)을 스크리닝하고 동정할 수 있음을 나타낸다.
실시예 15 AILIM-AILIM 리간드-매개된 부자극 신호의 전달과 관련된 인간 T 세포의 증식을 억제하는 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 활성
인간 T 세포를 AILIM 리간드(B7h/B7RP1/GL50/LICOS)와 접촉시킴으로써 유도된 세포 증식에 대한 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 억제 효과 측정을 기초로, 본 발명의 항-인간 AILIM 모노클로날 항체가 인간 T 세포의 표면상에서 AILIM에 의해 매개된 신호의 전달에 대한 조절 활성을 갖는지의 여부를 분석하였다.
<15-1> 항체의 희석
항-인간 CD3 모노클로날 항체 OKT3(ATCC CRL-8001)를 인산염 완충액(PBS)으로 최종 농도 8 ㎍/㎖로 희석하였다.
상기 제조된 가용성 인간 AILIM 리간드(hB7h-IgFc)를 PBS로 최종 농도 40 ㎍/㎖로 희석하였다. 상기 항체 용액들을 PBS로 추가 희석하여 다양한 농도(40 ㎍/㎖ 내지 0.064 ㎍/㎖)의 항체들을 제조하였다.
<15-2> 항체에 의한 미세플레이트의 코팅
96-웰 미세플레이트의 각 웰을, (1) 항-인간 CD3 모노클로날 항체 OKT3(8 ㎍/㎖; 각 웰에 25 ㎕) 및 hB7h-IgFc(40 ㎍/㎖ 내지 0.064 ㎍/㎖; 각 웰에 25 ㎕)로 코팅하였다. 상기 플레이트들을 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 후속적으로, 항체 용액을 버리고, 각각의 웰을 PBS로 3 회 세척하였다. 세척 후에, 10% FCS 함유 RPMI1640 배지를 각 웰(100 ㎕/웰)에 가하고, 플레이트들을 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 따라서, 상기 플레이트의 각 웰들이 코팅되었다.
<15-3> 인간 T 세포 현탁액의 제조
말초 혈을 각각의 보통의 건강한 사람들로부터 채혈하고, 단핵 세포를 림포프레프(Nycomed)를 사용하여 밀도-구배 원심분리에 의해 분획화하였다. 실험 설명서에 따라, 판(Pan)-T 세포 단리 키트(Miltenyi) 및 마그네틱 소터를 사용함으로써 인간 단핵 세포로부터 인간 T 세포를 분리시켰다. T 세포 수를 혈구계수기로 측정하였다. 인간 T 세포를 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab136(20 ㎍/㎖)이 보충된 10% FCS 함유 RPMI1640 배지에 현탁시켰다. 제조된 인간 T 세포 현탁액(1x106세포/㎖)을 실온에서 30 분간 배양시켰다.
인간 항-KLH 모노클로날 항체 JMAb23(20 ㎍/㎖)을 음성 대조용 항체로서 사용하였다.
<15-4> 세포 배양
상술한 바와 동일한 방식으로, 인간 T 세포 현탁액(100 ㎕/웰; 1x105세포/웰)을 항-인간 CD3 항체 및 hB7h-IgFc로 코팅한 미세플레이트의 각 웰에 가하고,상기 플레이트를 37 ℃, CO2배양기에서 3 일간 배양하였다.
<15-5> T 세포의 증식 활성 측정
메틸 [3H]티미딘(0.5 μCi/웰; Amersham-Pharmacia)을 배양 후의 상기 플레이트의 각 웰에 가하고, 상기 플레이트를 37 ℃, CO2배양기에서 6 시간 동안 배양하였다. 배양 후에, 세포들을 세포 수확기를 사용하여 GF/C 필터(Packard) 상에 포착시켰다. 후속적으로, 상기 필터를 40 ℃에서 3 시간 이상 건조시키고, 이어서 여기에 마이크로신티 0(20 ㎕/웰; Packard)을 가하였다. 상기 필터 상에 포착된 세포에 삽입되어 있는3H의 방사능을 β-계수기(TOP COUNT)로 측정하여 배양 후의 T 세포 증식 정도를 분석하였다.
결과를 도 77에 나타낸다.
상기 시험에서 얻어진 결과는, 인간 T 세포가 인간 B7h-IgFc의 농도에 따라 유의하게 생육함을 보였다(음성 대조용 항체를 사용하는 분석에서). 또한, 상기 항-인간 AILIM 모노클로날 항체가 인간 T 세포의 증식을 유의하게 억제하였다.
실시예 16 AILIM-AILIM 리간드-매개된 부자극 신호의 전달과 관련된 원숭이 T 세포의 증식을 억제하는 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체의 활성
상술한 실시예 15에 사용된 인간 T 세포 대신에 원숭이 T 세포를 사용하여, 동일한 시험을 수행하였다.
<16-1> 항체 및 기타의 희석
항-인간 CD3 모노클로날 항체 SP34(BD-Pharmingen)를 인산염 완충액(PBS)으로 최종 농도 1 ㎍/㎖로 희석하였다.
상기 제조된 인간 B7h-IgFc를 PBS로 최종 농도 40 ㎍/㎖로 희석하였다. 상기 항체 용액을 PBS로 추가 희석하여 다양한 농도(40 ㎍/㎖ 내지 0.0064 ㎍/㎖)의 항체를 제조하였다.
<16-2> 항체에 의한 미세플레이트의 코팅
96-웰 미세플레이트의 각 웰을, (1) 항-인간 CD3 모노클로날 항체 SP34(BD-Pharmingen)(1 ㎍/㎖; 각 웰에 25 ㎕) 및 인간 B7h-IgFc(40 ㎍/㎖ 내지 0.0064 ㎍/㎖; 각 웰에 25 ㎕)로 코팅하였다. 상기 플레이트들을 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 후속적으로, 항체 용액을 버리고, 각각의 웰을 PBS로 3 회 세척하였다. 세척 후에, 10% FCS 함유 RPMI1640 배지를 각 웰(100 ㎕/웰)에 가하고, 플레이트들을 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 따라서, 상기 플레이트의 각 웰들이 항체로 코팅되었다.
<16-3> 원숭이 T 세포 현탁액의 제조
말초 혈을 게잡이 원숭이로부터 채혈하였다. 단핵 세포를 함유하는 분획을 니코프레프1.077A(Nycomed)를 사용하여 밀도-구배 원심분리에 의해 제조하였다. 실험 설명서에 따라, 항-인간 CD4 항체 M-T477(BD-Pharmingen), 항-인간 CD8 항체 RPA-T8(BD-Pharmingen), 항-마우스 IgG 미세비이드(Miltenyi) 및 마그네틱 소터를 사용함으로써, 게잡이 원숭이 단핵 세포로부터 원숭이 T 세포를 분리시켰다. T 세포 수를 혈구계수기로 측정하였다. 원숭이 T 세포를 인간 항-인간 AILIM 모노클로날 항체 JMab136(20 ㎍/㎖) 및 10% FCS 함유 RPMI1640 배지에 현탁시켜 원숭이 T 세포 현탁액(1x106세포/㎖)을 제조하였다. 상기 현탁액을 실온에서 30 분간 배양시켰다.
인간 항-KLH 모노클로날 항체 JMab-23(20 ㎍/㎖)을 음성 대조용 항체로서 사용하였다.
<16-4> 세포 배양
상술한 바와 동일한 방식으로, 원숭이 T 세포 현탁액(100 ㎕/웰; 1x105세포/웰)을 항-인간 CD3 항체 및 hB7h-IgFc로 코팅한 미세플레이트의 각 웰에 가하고, 상기 플레이트를 37 ℃, CO2배양기에서 3 일간 배양하였다.
<16-5> T 세포의 증식 활성 측정
메틸 [3H]티미딘(0.5 μCi/웰; Amersham-Pharmacia)을 배양 후의 상기 플레이트의 각 웰에 가하고, 상기 플레이트를 37 ℃, CO2배양기에서 6 시간 동안 배양하였다. 배양 후에, 세포들을 세포 수확기를 사용하여 GF/C 필터(Packard) 상에 포착시켰다. 후속적으로, 상기 필터를 40 ℃에서 3 시간 이상 건조시키고, 이어서 여기에 마이크로신티 0(20 ㎕/웰; Packard)을 가하였다. 상기 필터 상에 포착된 세포에 삽입되어 있는3H의 방사능을 β-계수기(TOP COUNT)로 측정하여, 배양 후의 T 세포 증식 정도를 분석하였다.
결과를 도 78에 나타낸다.
상기 시험에서 얻어진 결과는 원숭이 T 세포가 인간 B7h-IgFc의 농도에 따라 유의하게 생육함을 보였다(음성 대조용 항체를 사용하는 분석에서). 또한, 상기 항-인간 AILIM 모노클로날 항체가 원숭이 T 세포의 증식을 유의하게 억제하였다.
인간 AILIM에 결합할 수 있는 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 인간 유래의 것이며, 따라서 이들 항체는 마우스-유래된 항체와 같은 비-인간 포유동물 유래된 항체를 포함하는 항체 약학 제제에서 심각한 치료 문제(부작용)였던, 숙주에서의 인간에 대한 항원성, 즉 HAMA(인간 항-마우스 항원성)로 인한 어떠한 심각한 면역 거부반응도 유발시키지 않는다. 본 발명의 항체는 의약품으로서의 가치를 크게하였다.
따라서, AILIM(특히 인간 AILIM)에 대한 본 발명의 인간 모노클로날 항체 및 상기 인간 모노클로날 항체를 포함하는 약학 조성물은, 숙주에서 HAMA에 의해 야기되는 면역 거부반응을 전혀 유발시키지 않으며; 따라서 AILIM-발현 세포로의 AILIM-매개된 부자극 신호(2 차 신호)의 전달과 관련된 다양한 생물학적 반응들(예를 들어, AILIM-발현 세포의 증식, AILIM-발현 세포에 의한 시토킨 생산, AILIM-발현 세포의 면역 세포용해 또는 세포사멸, 및 AILIM-발현 세포의 항체-의존성 손상을 유발시키는 활성)을 조절할 수 있는 약학 제제로서; 및/또는 상기 AILIM에 의해 매개된 신호 전달과 관련된 다양한 질환들의 발생 및/또는 진행을 억제하고 예방하는, 상기 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 인간 항-AILIM 모노클로날 항체 또는 그의 일부를 함유하는 약학 제제를 활성 성분으로서 제공함으로써, 예를 들어 자기면역 또는 알레르기성 질환(특히 세포 면역성에 의해 야기되는 자기면역 질병 및 지연성 알레르기)으로 분류되는 각종 질환들(예를 들어, 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 자기면역성 갑상선염, 알레르기성 접촉 피부염, 만성 염증성 피부병인 편평 태선, 전신 홍반성 루프스, 인슐린-의존성 당뇨병, 건선 등); 관절병증(예를 들어, 류마티스성 관절염(RA) 및 골관절염(OA)), 염증(예를 들어, 간염); 이식편 대 숙주 반응(GVH 반응); 이식편 대 숙주 병(GVHD); 조직(피부, 각막, 골 등) 또는 기관(간, 심장, 폐, 신장, 췌장 등)의 이식(동종이식 또는 이종이식)에 동반되는 면역 거부반응; 외래 항원 또는 자기항원에 대한 면역 반응(예를 들어 상기 항원에 대한 항체의 생산, 세포 증식, 시토킨의 생산 등); 및 비정상적인 장 면역성에 의해 잠재적으로 발병되는 질환(구체적으로 염증성 장 질환(특히 크론 병 및 궤양성 대장염) 및 식사성 알레르기 등)을 억제 또는 예방 및 치료할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 소염제로서 각종 스테로이드의 사용이 지시되는 일부 염증들, 예를 들어 염증을 동반하는 각종 관절염(예를 들어, 류마티스성 관절염, 골 관절염 등), 폐렴, 간염(바이러스성 간염 포함), 염증을 동반하는 감염성 질병, 염증성 장 질병, 장염, 신염(염증을 동반하는 사구체 신염, 신섬유증), 위염, 맥관염, 췌장염, 복막염, 기관지염, 심근염, 뇌염, 허혈 후 재관류 손상(심근 허혈성 재관류 손상)과 관련된 염증, 조직 및 기관 이식 후 면역 거부반응과 관련된 염증, 화상, 각종 피부 염증(건선, 알레르기성 접촉 피부염, 만성 염증성 피부병인 편평 태선), 다발성 기관 기능 부전과 관련된 염증, PTCA 또는 PTCR 수술 후의 염증, 및 염증을 동반하는 동맥경화증, 자기면역 갑상선염 등의 치료 또는 예방을 가능하게 한다.
또한, 상술한 조직 또는 기관의 이식과 관련된 면역 거부반응의 상기 언급한 억제 또는 치료에 관해서, 본 발명에 따른 약학 조성물을 이식 요법에서의 면역 거부반응을 억제하는데 사용되는 공지된 면역억제제와 함께 사용하여 상기 이식편 거부반응을 억제시키는 공지된 약물의 효과를 증가시킬 수 있다.
더욱이, 본 발명의 범위 내에 있는 AILIM 또는 AILIM 리간드에 결합할 수 있는 물질들을 동정하는 방법을 사용함으로써, AILIM 또는 AILIM 리간드에의 결합을 통해 AILIM과 AILIM 리간드 간의 상호작용과 관련된 신호 전달을 조절할 수 있고, 이에 의해 상기 언급한 다양한 질환들의 치료에 효능 있는 활성을 갖는 약학 제제(합성 화학 화합물 및 항체)의 스크리닝과 선별을 성취할 수 있다.
서열 목록 프리 텍스트
서열번호: 1
다른 정보: 인공 서열의 서술: 인위적으로 합성된 프라이머 서열, NotI-T
서열번호: 2
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SEQUENCE LISTING <110> Japan Tobacco, Inc. <120> Human Monoclonal Antibody Against A Costimulatory Signal Transduction Molecule AILIM And Pharmaceutical Use Thereof <130> J1-A0101Y1P <140> <141> <150> JP P2000-147116 <151> 2000-05-18 <150> JP P2001-99508 <151> 2001-03-30 <160> 40 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence, NotI-T. <220> <221> primer_bind <222> (1)..(45) <400> 1 aactggaagc ttcagcggcc gcagagattt tttttttttt ttttt 45 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized linker sequence, 20adp. <400> 2 cgtggtgtca tggcactgcg 20 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized linker sequence, 24adp. <400> 3 aattcgcagt gccatgacac cacg 24 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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gag tgg atg gga tgg atc aac cct cac agt ggt ggc aca aac 302 Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro His Ser Gly Gly Thr Asn 65 70 75 tat gca cag aag ttt cag ggc agg gtc acc atg acc agg gac acg tcc 350 Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser 80 85 90 atc agc aca gcc tac atg gag ctg agc agg ctg aga tcc gac gac acg 398 Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr 95 100 105 110 gcc gtg tat tac tgt gcg agg acg tat tac tat gat agt agt ggt tat 446 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr 115 120 125 tac cat gat gct ttt gat atc tgg ggc caa ggg aca atg gtc acc gtc 494 Tyr His Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val 130 135 140 tct tca gcc tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gcg ccc tgc 542 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys 145 150 155 tcc agg agc acc tcc gag agc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag 590 Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 160 165 170 gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gct ctg 638 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 175 180 185 190 acc agc ggc gtg cac acc ttc cca gct gtc cta cag tcc tca gga ctc 686 Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu 195 200 205 tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc aac ttc ggc acc 734 Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr 210 215 220 cag acc tac acc tgc aac gta gat cac aag ccc agc aac acc aag gtg 782 Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 225 230 235 gac aag aca gtt gag cgc aaa tgt tgt gtc gag tgc cca ccg tgc cca 830 Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro 240 245 250 gca cca cct gtg gca gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc 878 Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 255 260 265 270 aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc acg tgc gtg gtg 926 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 275 280 285 gtg gac gtg agc cac gaa gac ccc gag gtc cag ttc aac tgg tac gtg 974 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val 290 295 300 gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag cca cgg gag gag cag 1022 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 305 310 315 ttc aac agc acg ttc cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtt gtg cac cag 1070 Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln 320 325 330 gac tgg ctg aac ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa ggc 1118 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly 335 340 345 350 ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa acc aaa ggg cag ccc 1166 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro 355 360 365 cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc 1214 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 370 375 380 aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tac ccc agc 1262 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 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Leu Ile 55 60 65 70 tat gtt gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agc ggc 296 Tyr Val Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 75 80 85 agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag cct 344 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 90 95 100 gaa gat ttt gca act tac tat tgt caa cag gct aac agt ttc ccg tgg 392 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Trp 105 110 115 acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cga act gtg gct gca 440 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 120 125 130 cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag ttg aaa tct gga 488 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 135 140 145 150 act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gcc 536 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 155 160 165 aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag 584 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 170 175 180 gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc tac agc ctc agc 632 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 185 190 195 agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac 680 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 200 205 210 gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc 728 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 215 220 225 230 ttc aac agg gga gag tgt tag agggagaagt gcccccacct gctcctcagt 779 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 235 tccagcctga ccccctccca tcctttggcc tctgaccctt tttccacagg ggacctaccc 839 ctattgcggt cctccagctc atctttcacc tcacccccct cctcctcctt ggctttaatt 899 atgctaatgt tggaggagaa tgaataaata aagtgaatct ttgcaaaaaa aaaaaaaaaa 959 aatctctgcg gccgc 974 <210> 30 <211> 236 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Phe Pro Gly Ser Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Val Ser 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Pro Gly Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 75 80 85 atc tcc aga gaa aat gcc aag aac tcc ttg tat ctt caa atg aac agc 402 Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 90 95 100 ctg aga gcc ggg gac acg gct gtg tat tac tgt gta aga gat aat agg 450 Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Asp Asn Arg 105 110 115 aag gtg acc cac gag cac tac tac tac tac ggt atg gac gtc tgg ggc 498 Lys Val Thr His Glu His Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly 120 125 130 135 caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca gcc tcc acc aag ggc cca tcg 546 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 140 145 150 gtc ttc ccc ctg gcg ccc tgc tcc agg agc acc tcc gag agc aca gcg 594 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 155 160 165 gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg 642 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 170 175 180 tcg tgg aac tca ggc gct ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc cca gct 690 Ser Trp Asn Ser Gly 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Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 300 305 310 aca aag cca cgg gag gag cag ttc aac agc acg ttc cgt gtg gtc agc 1074 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser 315 320 325 gtc ctc acc gtt gtg cac cag gac tgg ctg aac ggc aag gag tac aag 1122 Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 330 335 340 tgc aag gtc tcc aac aaa ggc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc 1170 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 345 350 355 tcc aaa acc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc 1218 Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 360 365 370 375 cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg 1266 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 380 385 390 gtc aaa ggc ttc tac ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat 1314 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 395 400 405 ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc aca cct ccc atg 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Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Ala Ile Gly Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly 65 70 75 80 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser 85 90 95 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Val Arg Asp Asn Arg Lys Val Thr His Glu His Tyr Tyr Tyr 115 120 125 Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 145 150 155 160 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 165 170 175 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 180 185 190 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 195 200 205 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 210 215 220 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 225 230 235 240 Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu 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agc ctc agc agc acc ctg 630 Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu 190 195 200 acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa 678 Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu 205 210 215 gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc ttc aac agg 726 Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg 220 225 230 gga gag tgt tag agggagaant gcccccacct gctcctcagt tccagcctga 778 Gly Glu Cys 235 ccccctccca tcctttggcc tctgaccctt tttccacagg ggacctaccc ctattgcggt 838 cctccagctc atctttcacc tcacccccct cctcctcctt ggctttaatt atgctaatgt 898 tggaggagaa tgaataaata aagtgaatct ttgcacctgt gaaaaaaaaa 948 <210> 34 <211> 236 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn 35 40 45 Ile Arg Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 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Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn 90 95 100 agc ctg aga gcc ggg gac acg gct gtg tat tac tgt gta aga gat aag 449 Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Asp Lys 105 110 115 agg acg gtg acc cac gag cac tac tac tac tac ggt atg gac gtc tgg 497 Arg Thr Val Thr His Glu His Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 120 125 130 ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca gcc tcc acc aag ggc cca 545 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 135 140 145 150 tcg gtc ttc ccc ctg gcg ccc tgc tcc agg agc acc tcc gag agc aca 593 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 155 160 165 gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acc 641 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 170 175 180 gtg tcg tgg aac tca ggc gct ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc cca 689 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 185 190 195 gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc 737 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 200 205 210 gtg ccc tcc agc aac ttc ggc acc cag acc tac acc tgc aac gta gat 785 Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 215 220 225 230 cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aca gtt gag cgc aaa tgt 833 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys 235 240 245 tgt gtc gag tgc cca ccg tgc cca gca cca cct gtg gca gga ccg tca 881 Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser 250 255 260 gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg 929 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 265 270 275 acc cct gag gtc acg tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac ccc 977 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 280 285 290 gag gtc cag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc 1025 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 295 300 305 310 aag aca aag cca cgg gag gag cag ttc aac agc acg 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tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc 1409 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 425 430 435 agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct 1457 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 440 445 450 ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa 1505 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 455 460 465 470 tga gtgccacggc cggcaagccc ccgctcccca ggctctcggg gtcgcgtgag 1558 gatgcttggc acgtaccccg tgtacatact tcccaggcac ccagcatgga aataaagcac 1618 ccagcgctgc cctgggcccc tgcgaaaaaa aaaaaaaaaa aatctctgcg gccgc 1673 <210> 36 <211> 470 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Ala Ile Gly Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly 65 70 75 80 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser 85 90 95 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Val Arg Asp Lys Arg Thr Val Thr His Glu His Tyr Tyr Tyr 115 120 125 Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 145 150 155 160 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 165 170 175 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 180 185 190 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 195 200 205 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 210 215 220 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 225 230 235 240 Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 260 265 270 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 275 280 285 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 290 295 300 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 305 310 315 320 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 325 330 335 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 340 345 350 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 355 360 365 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 370 375 380 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 385 390 395 400 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 405 410 415 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 420 425 430 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 435 440 445 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 450 455 460 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 37 <211> 970 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> 5'UTR <222> (1)..(32) <220> <221> CDS <222> (33)..(743) <220> <221> 3'UTR <222> (744)..(970) <220> <221> sig_peptide <222> (33)..(92) <400> 37 gaattcgcag tgccatgaca ccacggggaa cc atg gaa acc cca gcg cag ctt 53 Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu 1 5 ctc ttc ctc ctg cta ctc tgg ctc cca gat acc acc gga gaa att gtg 101 Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val 10 15 20 ttg acg cag tct cca ggc acc ctg tct ttg tct cca ggg gaa aga gcc 149 Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala 25 30 35 acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt att agc agc agc tcc tta gcc 197 Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Ser Ser Leu Ala 40 45 50 55 tgg tac cag cag aaa cct ggc cag gct ccc ggg ctc ctc atc ttt ggt 245 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Gly Leu Leu Ile Phe Gly 60 65 70 gca tcc agc agg gcc act ggc atc cca gac agg ttc agt ggc agt ggg 293 Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly 75 80 85 tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc aga ctg gag cct gaa gat 341 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp 90 95 100 ttt gca gtg tat tac tgt cag cag ttt ggt agc tca cct atg tgc agt 389 Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Ser Ser Pro Met Cys Ser 105 110 115 ttt ggc cag ggg acc aag ctg gag atc aaa cga act gtg gct gca cca 437 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 120 125 130 135 tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag ttg aaa tct gga act 485 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 140 145 150 gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa 533 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 155 160 165 gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag gag 581 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 170 175 180 agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc tac agc ctc agc agc 629 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 185 190 195 acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc 677 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 200 205 210 215 tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc ttc 725 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 220 225 230 aac agg gga gag tgt tag agggagaagt gcccccacct gctcctcagt 773 Asn Arg Gly Glu Cys 235 tccagcctga ccccctccca tcctttggcc tctgaccctt tttccacagg ggacctaccc 833 ctattgcggt cctccagctc atctttcacc tcacccccct cctcctcctt ggctttaatt 893 atgctaatgt tggaggagaa tgaataaata aagtgaatct ttgcaaaaaa aaaaaaaaaa 953 aaaatctctg cggccgc 970 <210> 38 <211> 236 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Ile Ser Ser Ser Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 50 55 60 Pro Gly Leu Leu Ile Phe Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro 65 70 75 80 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe 100 105 110 Gly Ser Ser Pro Met Cys Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 115 120 125 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 155 160 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 165 170 175 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 180 185 190 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 210 215 220 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 39 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(35) <400> 39 gaggtctccg ccctcgagat gcggctgggc agtcc 35 <210> 40 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(33) <400> 40 cacaggacag ccaggggatc ccacgtggcc gcg 33

Claims (6)

  1. (a) AILIM의 세포 외 영역 전체 또는 그의 일부가 고정화된 불용성 담체를 제조하는 공정;
    (b) 탐지 가능한 신호를 방출하는 표지 물질로 표지된 AILIM 리간드의 세포 외 영역 전체 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 공정;
    (c) 상기 공정 (b)의 폴리펩티드를 상기 공정 (a)의 불용성 담체와 반응시키는 공정;
    (d) 상기 공정 (a)의 불용성 담체, 상기 공정 (b)의 폴리펩티드, 및 하기 물질을 서로 임의적인 순서로 반응시키는 공정;
    (e) 상기 공정 (c)에서 제조된 복합체 중에 함유된 상기 표지 물질로부터 방출되는 신호, 및 상기 공정 (d)에서 제조된 복합체 중에 함유된 상기 표지 물질로부터 방출되는 신호를 각각 탐지하는 공정; 및
    (f) 상기 공정 (e)에서 탐지된 각 신호들의 크기를 비교하는 공정
    을 포함하는, AILIM 또는 AILIM 리간드에 결합하는 물질의 동정 방법.
  2. (a) AILIM 리간드의 세포 외 영역 전체 또는 그의 일부가 고정화된 불용성 담체를 제조하는 공정;
    (b) 탐지 가능한 신호를 방출하는 표지 물질로 표지된 AILIM의 세포 외 영역 전체 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 공정;
    (c) 상기 공정 (b)의 폴리펩티드를 상기 공정 (a)의 불용성 담체와 반응시키는 공정;
    (d) 상기 공정 (a)의 불용성 담체, 상기 공정 (b)의 폴리펩티드, 및 하기 물질을 서로 임의적인 순서로 반응시키는 공정;
    (e) 상기 공정 (c)에서 제조된 복합체 중에 함유된 상기 표지 물질로부터 방출되는 신호, 및 상기 공정 (d)에서 제조된 복합체 중에 함유된 상기 표지 물질로부터 방출되는 신호를 각각 탐지하는 공정; 및
    (f) 상기 공정 (e)에서 탐지된 각 신호들의 크기를 비교하는 공정
    을 포함하는, AILIM 또는 AILIM 리간드에 결합하는 물질의 동정 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    AILIM의 세포 외 영역 전체 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드가, AILIM의 세포 외 영역 전체 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드, 및 면역글로불린 중쇄의 불변 영역 전체 또는 그의 일부를 포함하는 융합 폴리펩티드인 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    AILIM 리간드의 세포 외 영역 전체 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드가, AILIM 리간드의 세포 외 영역 전체 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드, 및 면역글로불린 중쇄의 불변 영역 전체 또는 그의 일부를 포함하는 융합 폴리펩티드인 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    AILIM이 인간 AILIM인 방법.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    AILIM 리간드가 인간 AILIM 리간드인 방법.
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