TWI304811B - Human monoclonal antibody against a costimulatory signal transduction molecule ailim and pharmaceutical use thereof - Google Patents

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TWI304811B TW090111577A TW90111577A TWI304811B TW I304811 B TWI304811 B TW I304811B TW 090111577 A TW090111577 A TW 090111577A TW 90111577 A TW90111577 A TW 90111577A TW I304811 B TWI304811 B TW I304811B
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Description

1304811 五、發明說明（1) 發明領域 本發明 疫調節分子 類抗體；結 類單株抗體 單株抗體或 因重組細胞 單株抗體或 醫藥組合物 定、定量或 以及用於該 是有關於結合AILIM (活化可誘導之淋巴球免 )，也稱為I cos (可誘導之共同刺激物）之人 合AIL IM或其部份之人類單株抗體；編碼該人 或f 1份之DNA，或該DNA的部份；產生該人類 /、P伤之細胞（包括基因重組細胞）；由該基 所製備之人類單株抗體或其部份；包括該人類 其部份之醫藥組合物；包括抗AILIΜ的抗體之 ’以用於治療與延遲過敏症有關之疾病；鑑 分析與AILIM或AILIM配體結合的物質之方法； 方法之套組。 發明背景 活的動物體具有排除侵入到活體内的病原性微生物 (病毒、細菌、寄生蟲等）或外來物（兩者在以下合稱" 抗原”）之免疫反應系統。免疫反應系統中的一種稱為天 然的免疫反應系統，另一種則稱為後天免疫反應系統。前 者是一種排除機轉，包括吞噬細胞（多形核白血球、單核 球、巨嗤細胞等）之吞噬作用；天然殺手（ΝΚ )細胞之攻 擊；以及非專一性的辨識，例如，藉由補體之抗原形成調 理作用°獲得抗原專—性之Β細胞，可經由產生對抗原具 有專一性之抗體’而攻擊存在細胞外部的抗原。獲得抗原 專一性之Τ細胞（即活化的τ細胞），可分為助手Τ細胞及 細胞毒殺Τ細胞（殺手淋巴球；CTL )。助手τ細胞可調控Β
2125-3981.PF.ptd 第5頁 1304811 、發明說明（2) 細胞的分化及抗體的產生，並可破壞被吞噬細胞併入之抗 原。後者，CTLs本身會攻擊感染病毒的細胞等等（實驗醫 學：增刊，，'生物科學名詞圖書館，免疫"，Y〇d〇sha，第 14-17 頁，1995 )。 這個藉由T細胞之抗原專一性的獲得（即τ細胞的活化 )’是藉由抗原表現細胞（APC )，例如，巨噬細胞、B細 胞或樹突細胞所呈現之抗原，經由T細胞的辨識而開啟。 抗原表現細胞處理抗原，以便經由結合至主要組織相容複 合體（MHC )，而合併及呈現這些處理過的抗原。τ細胞藉 由辨識抗原表現細胞所呈現之處理過的抗原，經由存在細 胞膜表面之Τ細胞受體（TcR)及CD3抗原間之複合體 (T c R / C D 3複合體）’而接受初級訊息，以活化細胞（或 獲得專一性）。 然而，單獨T c R / C D 3複合體調節的初級訊息，無法充 分地活化T細胞並且導致無反應性或純種系之變應性缺失 (c 1 ona 1 anergy ) ’使得細胞不能與任何之後所接受的 刺激產生反應。介百素2 ( I L - 2 )的自我分泌對於活化τ細 胞是需要的，以分化成為抗原專一性的T細胞純種系並且 增殖。在純種系的變應性缺失中，T細胞是不活化的，因 為沒有IL - 2的產生也沒有這樣的細胞分裂。簡言之，伴隨 細胞激素（例如，I L - 2 )的產生之T細胞的活化，需要在 第一訊息之後的二次訊息經過TcR/CD3複合體。這個二次 訊息稱為共同刺激之訊息。 T細胞接受這個二次訊息，並藉由與除了抗原表現細
2125-3981-PF.ptd 第6頁 1304811
五、發明說明（3) 胞上的MHC之外的分子交互作用（細胞附著），經由除fT 細胞表面上的TcR/CD3複合體之外的分子，而將其傳遞炱 細胞。這個二次訊息可避免細胞變應性缺失（播應 性缺失）並可活化細胞。 、 雖然在抗原表現細胞及淋巴球（例如T細胞）間之二 次訊息傳遞的部份機轉仍未被詳細闡明，但目前的研究已 顯示，二次訊息傳遞的一個重要因子是CD28 (也稱為 Tp44、T44或9.3抗原，其主要是在τ細胞及胸腺細胞上所 表現的細胞表面分子），與CD80 (也稱為Β7-1、Β7、ΒΒ1 或Β7/ΒΒ1 ’其為在抗原表現細胞（巨噬細胞、單核球、樹 突細胞專）上所表現的細胞表面分子），以及與CD86 (也 稱為Β7-2或Β70 ’其也是在抗原表現細胞上所表現的細胞 表面分子）之父互作用（簡言之’細胞經由在這些分子之 間的結合之附著）。此外，實驗上也說明，細胞毒殺τ淋 巴球相關抗原4 ( C T L A - 4 ;其表現被認為是根據二次訊息 而增強）’與CD80 (B7-1 )及CD86 (B7-2 )的交互作用， 也在二次訊息活化T細胞的調控上，扮演重要的角色。換 句話說，由二次訊息的傳遞活化T細胞之調控，至少涉及 到CD2 8及CD8 0/CD86間的交互作用、CTLA-4表現之增強 (其被認為是取決於交互作用）以及CTLA-4與CD80/CD86 間的交互作用。 CD28已知是活化T細胞及避免變應性缺失所需之傳遞 二次訊息（共同刺激訊息）的共同刺激物分子。藉由將這 個分子與在抗原表現細胞上的共同刺激物分子、CD80
2125-3981-PF.ptd 第7頁 1304811 I、發明說明（4) ' ~ -- (B7-1)及CD86 (B7-2)結合（細胞經由在這些分子之間 的結合之附著）而傳遞之二次訊息’可穩定Th 1型細胞激 素之mRNA，並可因此促進由τ細胞引起之大量型細胞激 素（例如，IL-2、IFNr及TNFcO的產生。CTU_4的表現 是受到由T c R / C D 3所傳遞的初級訊息而誘導，並且這個表 現也可藉由CD28及CD80間之結合所傳遞的二次訊息而增 強。這顯示CTLA-4接受這些訊息用以抑制τ細胞作用，這 與CD28所傳遞二次訊息之τ細胞活化相反。， ^ 人類CD28及CTLA-4是第I型的醋蛋白，其分子量分別 是44 kD以及41至43 kD。兩者都具有類免疫球蛋白之功能 部位’屬於免疫球蛋白超家族’並且都具有作為細胞附著 分子及訊息傳遞分子之功能。 人類CD 2 8形成具有雙硫鍵的同種二聚體，而CTLA4則 以單體的形式存在。CD28及CTLA-4基因都位於人類染色體 的"2d33”以及老鼠染色體的"1C"上，並且是由4個外顯子 (exon)所組成。人類CD28及CTLA_4分別是由22〇及223個 胺基酸所組成’包括引導序列，並且它們之間的胺基酸同 源性是20到30 %。 在人類及老鼠中，CD28及CTLA-4的配體是CD80 (B7-1 )及CD86 (B7-2 )。對於兩種配體，CTLA-4比CD28具有大 約2 0倍高的親和力。在動物種類間保守的胺基酸序列結構 ” MYPPPY (甲硫胺酸_酪胺酸-脯胺酸_脯胺酸—脯胺酸-酪胺 酸）”已有闡明對於CD28及CTLA_4結合至CD80 (B7-1)是 重要的。也有報導指出，當CD28被刺激時，P I 3激酶（磷
2125-3981-PF.ptd 第8頁 1304811 五、發明說明（5) 酸肌醇3激酶，PI3K )結合CD28的卹a . 的邻份序列"YMNM (酪胺酸 -甲硫胺酸-天門冬酿胺-甲硫胺酸）”中之磷酸化的赂胺酸 殘基’以及CD28在經由這個"ΥχχΜ”結構的細胞間訊息傳遞 中，扮演重要的角色。此外，也有報導指出，CTLA_4也具 有ΥχχΜ所代表的序列，即在其細胞質區域中具有"γνκΜ (酪胺酸-纈胺酸-離胺酸-曱硫胺酸），，，並且在刺激之 後，SYP會結合這個序列。 CD28是專一性地表現在胸腺細胞及周圍血液τ細胞 中，而CTLA-4是專一性地表現在活化的τ細胞中（細胞工 程：增刊，"附著分子手冊"3[111〗111131^，第93-1 02頁， 1994 ;同一出處第120-136 ;實驗醫學：增刊，"生物科學 名詞圖書館，免疫·' ’Yodosha，第94-98頁，1995 ;實驗 醫學：增刊，"生物科學名詞圖書館，細胞間訊息傳遞”， Yodosha ，第58-59 頁，1997 ; Nihon Rinsho ， 55(6):215-220 ， 1997 )。 在T細胞功能的調控中（T細胞功能的活化及抑制）， 多個分子（例如，共同刺激物分子，如C D 2 8、C D 8 0 ( B 7 -1 )、CD86 (B7-2)等）以及與它們協同的CTLA-4間的交互 作用之重要性也因此被了解，並且在這些分子與疾病之間 的關係，以及藉由調控這些分子的功能而治療疾病，也已 受到注意。 如上所述，雖然活體可活化其後天免疫反應系統以對 抗外來物之抗原進入到體内，但其也具有免疫耐受性，以 便對於其本身的成份（自體抗原）不會顯示免疫反應。如
2125-3981-PF.ptd 第9頁 1304811 五、發明說明（6) 果免疫对文性因某些原因而被破壞，則會對自體抗原發生 免疫反應’對自體抗原有反應性的T細胞會受到上述某些 機轉而誘導，而陷入免疫力的異常狀態，並且會產生各種 的自體免疫疾病。 換句話說’由於當活體的免疫系統是正常時，在正常 組織中之非刺激性的抗原表現細胞不會表現共同刺激分 子’因此’即使會與自體抗原反應的T細胞存在的話，T細 胞也疋處於無反應狀態，以維持免疫时受性。已顯示在免 疫力的異常狀態中’許多對自體抗原有反應性的T細胞， 會由於異常過量及持續表現的共同刺激分子而活化，藉此 引起自體免疫疾病。 從最近這樣的觀點看來，許多藉由調節共同刺激訊息 傳遞（例如’上述在CD28/CTLA-4及CD80/CD86間的訊息傳 遞）’以治療各種自體免疫疾病的嘗試已被提出。 這些嘗試的結果尚未詳細地澄清藉由共同刺激分子及 相關分子間的交互作用，而將T細胞活化的機轉。其他未 知的分子也可能涉及這個機轉。 最近’已有類似上述"CD28"及"CTLA-4"的新穎共同刺 激分子被鑑定出來，一般認為是進行淋巴球（例如，τ細 胞）活化所必需之二次訊息（共同刺激訊息）傳導，以及 結合該活化的淋巴球（例如’活化的T細胞）的訊|、之功 能性調控。這個分子已命名為AILIM (活化可誘導^淋1巴 球免疫調節分子）（在人類、老鼠及大鼠：Int Immunol. ’1 2 ( 1 ):5 1 -55,2000 ) ’ 也稱為 IC〇s’（可誘導
1304811 五、發明說明（7) 之共同刺激物）（在人類：Nature， 397(6716):263-266 ， 1999 )。 另一方面，稱為B7h、B7RP-1、GL50或LIC0S的新嶺八 子，其為與這個共同刺激傳遞分子（AILIM IC0S )交互作 用的配體（AILIM配體），最近已被鑑定出來（Nature， 402(6763):827-832 ， 1999 ; Nature Medicine ， 5(12):1365-1369 ， 1999 ; J. Immunology 164:1653-1657 »2000 ； Curr. Biol. 10(6):333-336 . 2000 )。 這兩類分子（即AILIM ( ICOS )及B7RP-1 (B7h、 GL50、LICOS ))的鑑定’其作為上述淋巴球（例如，τ細 胞）活化所必需之共同刺激訊息的訊息傳遞途徑，以及活 化的Τ細胞的功能之控制，顯示除了已知的第一種及第二 種訊息途徑之外（其為已知的CD28與CD80 (Β7-1 ) /CD86 (Β7-2)間的傳遞途徑，以及CTLA-4與CD80 (Β7-1) /CD86 (Β7-2)間的傳遞途徑），有藉由AILIM (IC〇s)及 B7RP-1 (B7h、GL50、LICOS )間的交互作用之新穎的第三 種途徑。 對於這些新賴分子的生物性功能之研究；經由此第三 共同刺激訊息傳遞’藉由這個分子而對淋巴球（例如，τ 細胞）之功能性控制；以及此新穎的訊息傳遞及疾病之間 的關係’正在進展中（J. Immunol ·，166(1):1，2001 ; J. Immunol. ’ 165(9):5035 ， 2000 ;BBRC ,276(1):335 ， 2000 ; Immunity ， 13⑴：95 ， 2〇〇〇 ; j, Εχρ.㈣，
第11頁 1304811 五、發明說明（8) 192(1).53 ， 2000 , Eur. j. immun〇i ， 3〇(4):1〇4〇 , 2000 ; w〇 01/15732 )。 發明概述 特別地’本發明的—個目的是顯示新穎分子AILIM的 生物性功能，像是”CD28"及"CTLA_4n，考慮成為淋巴球 =t、’ τ細胞）活化所必需之二次訊息（共同刺激訊息 ^彳遞分子，以及藉由與該訊息作用而控制活化的淋巴 .例如/舌化的T細胞）之功能；顯示AI L IΜ的表現及疾 間的關係；以及利用醫療及藥學的方法（例如，單株 分子化合物的藥物），而提供抑制AILIM的表現 =,賴性之各種疾病發展的方法及醫藥A，以及藉由控 'M的生物性功能而治療該等疾病的方法及醫藥品。 & ΑΤϊ:Τι/ Υ ί上述9的，本發明已積極地進行對抗哺乳動 物A ILIM s (特別是人述自Λ τ τ τ „J M. ^ ^ jrrr ^類AlLlM)的人類抗體（特別是人類 翻ΑΠ二的έ Γ九，結果，藉由WAIUM (特別是表現人 乂 動物，以漆^ /）免疫由遺傳重組技術所製備的轉 生人類抗體，在世界上首先成功地製備各 可結合人類AILIM的單妷；，姓e 农侑谷種 類AIU_= 疋結合至可調控由人 L心得遞之人類AIL IΜ的單株抗體。 、因為本發明的抗體（特別是單株抗體）是衍生自人 f i因ηΙμ: ^們—點也不會在宿主中誘導由於對抗人類免 疫力，HAMA (人類括土 β 塔 貝充 备游μ片，i * 抗老机抗原性），所引起之任何嚴重的 ^ 利用包括衍生自非人類動物（例如，老鼠
2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（9) )的抗體之抗體醫藥品的治療中，已是一個非常大的問 (副作用），並且因此引人注目地增強抗體作為醫藥品的 因此’本發明可結合至哺乳動物AILIMs (特別是人 A I LIΜ )的人類抗體（特別是人類單株抗體），以及包括、 該等、人類罢採抗體;,）之藥學組成物， 有效地作為藥物，以控制（而不會在宿主中誘導由於“Μ 所引起的免疫排斥）有關共同刺激訊息傳遞至由aium調 節之表現AILIM的細胞之各種生理反應（例如，表現ailim 的細胞之增殖、由表現AILIM的細胞所調控之細胞激素的 產生、表現AILIΜ的細胞之免疫細胞溶解或細胞凋亡、以 及誘導對於表現AIUM的細胞之抗體依賴性的細胞毒性之 活性等等），及/或也可有效地作為藥物，以抑制並預防 與由該AILIM調冑之訊息傳遞有關的各種疾病之症狀之發 展及/或進展，並可作為醫藥品以治療或預防該疾病。 矣二I'，本發明之藥學組成物可控制（抑制或刺激） 田胞之增殖，或由表現AILI_細胞所調控之 田胞激素的產± (例如’干擾素r或介百素 =P制：AILIM所調節之訊息傳遞有關的各種生理心 狄之1 ί病原性症狀，並可治療或預防與A1L1M所調 P之U遞有關的各種生理現象所引起之各種疾病。 =本發明之藥學組成物，可抑制、預防及/或治 Ϊ疫：二:刀類為自體免疫或過敏性疾病（特別是由細胞 免疫力所引起的自體免疫疾病及延遲過敏
1304811 五、發明說明（10) (例如，風濕性關節炎、多發、 炎、過敏性接艏别由睿* 自體免疫甲狀腺 :生接觸型皮膚炎、慢性發炎皮膚病，例如， .M f、、工斑性狼瘡、胰島素依賴性糖尿病、牛皮癬尊黧 (〇’A) Γ生=ί例如，風濕性關節炎（ra)及骨關節！ GVH反雁、 ’肝炎）；移植對抗宿主反應 (心 Λ，移植對抗宿主疾病（GVHD);伴隨組織 (例如，皮膚、角膜、骨等等）或器官（例如， 臟、肺臟、腎臟、姨臟等等）移植（同種或異種=免： 排斥，由外源性抗原或自體抗原所誘發之免疫反應、史 =，對抗該抗原的抗體之產生、細胞增瘦、細胞；
=以及可能由異常的腸免疫力所引起的 J =性腸疾病（特別是克龍（cl〇ne)疾 炎）及營養性過敏症）^ 貝廣庇、、.D腸 此外，在伴隨上述組織或器官移植的免疫排斥之 /處理的領域中，可能藉由使用本發明之藥學組成物配人 已知的免疫抑制劑，而增強對於移植排斥的抑制效果，σ
中該免疫抑制劑已在這樣的移植治療中用於抑制免疫排其 斥。 又F 此外，本發明之藥學組成物可用於治療或預防以 醇作為抗發炎劑之任何發炎性疾病。 u
本發明之藥學組成物可應用於發炎性疾病，例如，， 隨各種關節炎（例如，風濕性關節炎、骨關節炎’伴 炎、肺炎、肝炎（包括病毒性肝炎）、伴隨感染性 發炎、發炎性腸疾病、腸炎、腎炎（伴隨腎臟絲球體腎之
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五、發明說明（11) 炎、腎纖維化之發炎）、胃炎、咽喉炎、胰臟炎、腹膜 炎、支氣管炎、心肌炎、腦炎、在缺血後再灌流損傷（心 肌缺血再灌流損傷）中之發炎、由組織或器官移植後的免 疫排斥造成的發炎、燒燙傷、各種皮膚發炎（牛皮癬、過 敏性接觸型皮膚炎、為慢性發炎皮膚病之苔蘚病）、多發 性器官衰竭之發炎、PTCA或PTCR手術後之發炎以及伴隨動 脈硬化症及自體免疫甲狀腺炎之發炎。 此外，藉由使用鑑定可與AILIM*AIUM配體結合的物 質之方法（其為本發明之一種形態），則可篩選具有活 的醫藥品（化學合成的化合物或抗體），以藉由結合 AILIM或AILIM配體，調控它們之間的交互作用所調^ 息傳遞，而治療各種疾病。 β 特別地，本發明說明於以下的（丨）到（丨〇 8 )。 (1) 一種結合至AILIM之人類抗體。 (1)之人類抗體，其中_AILIM是衍生自人 一種結合至AILIM之人類單株抗體或其部份。 (3)之人類單株抗體或其部份，盆 生自人類。 是衍 (5) (3)或（4)之人類單株抗體 立 單株抗體具有抑制由A I L I Μ調節之气自'傳遽〃推、3亥人類 活性。 卩之訊息傳遞進入至細胞的 (6) (5)之人類單株抗體或其部份，装中妨知* 傳遞的活性是下列（a)或（[)): 其中該抑制訊息 (&)抑制表現A1L 1M的細胞增殖之活性；或
1304811 五、發明說明（12) (b )抑制表現AILI Μ的細胞產生細胞激素之活性。 (7 )( 6 )之人類單株抗體或其部份’其中該細胞激素 是Thl型或Th2型Τ細胞所產生的細胞激素之—種。 (8) (7)之人類單株抗體或其部份，其中該細胞激素 是干擾素r或介百素4。 (9) (5)之人類單株抗體或其部份，其中該人類單株 抗體具有預防混合的淋巴球反應之活性。 (10) (3)或（4)之人類單株抗體或其部份，其中气人 類單株抗體具有誘導由AILIM調節之訊息傳遞進;;至細X胞 的活性。 (11) (10)之人類單株抗體或其部份，其中該誘導訊 息傳遞的活性是下列（a)或（b): 人 ° (a)誘導表現AILIM的細胞增殖之活性；或 (b )誘導表現AILIΜ的細胞產生細胞激素之活性。 (1 2 )( 11)之人類單株抗體或其部份，其中該細胞激 素是Thl型或Th2型Τ細胞所產生的細胞激素之一種。 (13) (12)之人類單株抗體或其部份，其中該細胞激 素是干擾素7或介百素4。 (14) (3)或（4)之人類單株抗體或其部份，其中該人 類單株抗體對於表現AILIΜ的細胞具有誘導抗體依賴性之 細胞毒性的活性，及/或對於表現A ILiM的細胞具有誘導免 疫細胞溶解或細胞凋亡的活性。 ' (15) (3)或（4)之人類單株抗體或其部份，其中在該 單株抗體及AILIM間之結合速率常數（ka )是1()>< 1〇3 /
1304811 五、發明說明（13) (1/M·秒）或更大。 (16) (15)之人類單株抗體或 率常數（ka)是l.Ox 1〇4 (1/M : ’其中該結合速 該結合速 ⑴）（⑻，λ麵單株抗體或其部ϋ 率常數（ka)疋Ι.Οχ 1〇5 (1/Μ .秒、 (⑻⑺或⑷之人類單株抗體或… 單株抗體及AILIM間之解離速率常數（kd;”:"其二在3該 (1/ 秒）或更小。 )疋 1. 〇 x 10-3 其中該解離速 〇 其中該解離速 (19) (18)之人類單株抗體或其 率常數（kd)是h〇x…U/秒）或更小 (20) (19)之人頬單株抗體或其部份 率常數（kd)，l.〇x 1〇_5 (1/秒）或更小。 ί ϋ ϋ 1 2 pi之人類單株抗體或其部份’其中在該 或 其中該解離常 其中該解離常 其中該解離常 其中編碼該人類 I早株抗體及AILIM間之解離常數（Kd)是1〇父1〇 6 u 更小。 (22) (21)之人類單株抗體或其部 數UO是l.Ox (M)或更小。 (23) (22)之人類單株抗體或其部份 數（Kd )是 1. 0 X 1〇'8 (M )或更小。 (24) (23 )之人類單株抗體或其部份 數（Kd )是 1. 0 X 1〇-9 (M )或更小。 (25) (4)之人頬單株抗體或其部份 單株抗體的重鏈可變區域之v區域DNA，是衍生自人類免疫 球蛋白重鏈v基因片段1〇2或313。
2125-3981-PF.ptd 第17頁 1304811 ------- 五、發明說明（14) (26) (4)之人類單株抗體或其部份，其中蝙碼該人類 單株抗體的輕鏈可變區域之V區域DNA，是衍生自人^ 球蛋白輕鏈V基因片段L5或A27。 (27) (25)或（26)之人類單株抗體或其部份，其中編 石馬該人類單株抗體的重鏈可變區域之v區域DNA，是街生自 人類免疫球蛋白重鏈V基因片段卜〇2或3-13，以及編丁碼該 人類單株抗體的輕鏈可變區域之V區域DNa，是衍生自人'^類 免疫球蛋白輕鏈V基因片段L5或A27。 仰（28) (27)之人類單株抗體或其部份，其中編碼該人 類單株抗體的重鏈可變區域之V區域DNA，是衍生自人X類免 疫球蛋白重鏈V基因片段卜〇2，以及編碼該人類單株 的fe鏈可變區域之V區域DNA，是衍生自人類免疫球 鏈V基因片段L5。 赏白知 (29) (27)之人類單株抗體或其部份，其中編碼該 類單株抗體的重鏈可變區域之V區域dna，是衍生自人〃 疫球蛋白重鏈V基因片段3_13，以及編碼該人類單類免 的輕鏈可變區域之V區域DNA，是衍生自人類免疫球儿體 鏈V基因片段A27。 蛋白fe (30) (4)之人類單株抗體或其部份，其中該人 抗體之重鏈可變區域，具有下列（a )到（f )中任一 之胺基酸序列： ^疋義 (a) 包括序列編號2 8的胺基酸位置2 〇到丨丨7之妝 序列； 賤基酸 (b) 包括序列編號28的胺基酸位置2〇到117之胺晨酸 第18頁 2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（15) 序列，其中一 一個或多個胺 (C)包括 序列； (d) 包括 序列，其中一 一個或多個胺 (e) 包括 序列；或 (f) 包括 序列，其中一 一個或多個胺 (31) (4) 抗體之重鏈多 胺基酸序列： (a) 包括 序列； (b) 包括 序列，其中一 一個或多個胺 (c )包括 序列； (d)包括 序列，其中一 個或多個胺基酸殘基被刪除或取代，或其中 基酸殘基被插入或增加； 序列編號32的胺基酸位置20到116之胺基酸 序列編號32的胺基酸位置20到116之胺基酸 個或多個胺基酸殘基被刪除或取代，或其中 基酸殘基被插入或增加； 序列編號36的胺基酸位置20到116之胺基酸 序列編號36的胺基酸位置20到116之胺基酸 個或多個胺基酸殘基被刪除或取代，或其中 基酸殘基被插入或增加。 之人類單株抗體或其部份，其中該人類單株 胜肽’具有下列（a)到（f)中任一種所定義之 序列編號28的胺基酸位置2〇到470之胺基酸 序列編號28的胺基酸位置2〇到470之胺基酸 個或多個胺基酸殘基被刪除或取代，或其中 基酸殘基被插入或增加； 序列編號32的胺基酸位置2〇到470之胺基酸 序列編號32的胺基酸位置2〇到470之胺基酸 個或多個胺基酸殘基被刪除或取代，或其中 2125-3981-PF.ptd 第19頁 1304811 五、發明說明（16) 一個或多個胺基酸殘基被插入或增加； (e) 包括序列編號36的胺基酸位置20到470之胺基酸 序列；或 (f) 包括序列編號36的胺基酸位置20到470之胺基酸 序列，其中一個或多個胺基酸殘基被删除或取代，或其中 一個或多個胺基酸殘基被插入或增加。 (32) (4)之人類單株抗體或其部份，其中該人類單株 抗體之輕鏈可變區域，具有下列（a )到（f )中任一種所定義 之胺基酸序列： (a) 包括序列編號30的胺基酸位置23到116之胺基酸 序列； (b) 包括序列編號30的胺基酸位置23到11 6之胺基酸 序列，其中一個或多個胺基酸殘基被删除或取代，或其中 一個或多個胺基酸殘基被插入或增加； (c) 包括序列編號34的胺基酸位置21到11 6之胺基酸 序列； (d) 包括序列編號34的胺基酸位置21到116之胺基酸 序列，其中一個或多個胺基酸殘基被刪除或取代，或其中 一個或多個胺基酸殘基被插入或增加； (e) 包括序列編號38的胺基酸位置21到116之胺基酸 序列；或 (f )包括序列編號38的胺基酸位置2 1到11 6之胺基酸 序列，其中一個或多個胺基酸殘基被刪除或取代，或其中 一個或多個胺基酸殘基被插入或增加。
2125-3981-PF.ptd 第20頁 1304811 五、發明說明（π) (33) (4)之人類單株抗體或其部份，其中該人類單株 抗體之輕鏈多胜肽，具有下列（a)到（f )中任一種所定義之 胺基酸序列： (a) 包括序列編號30的胺基酸位置23到236之胺基酸 序列； (b) 包括序列編號30的胺基酸位置23到236之胺基酸 序列，其中一個或多個胺基酸殘基被刪除或取代，或其中 一個或多個胺基酸殘基被插入或增加；
(c) 包括序列編號34的胺基酸位置21到236之胺基酸 序列； (d) 包括序列編號34的胺基酸位置21到236之胺基酸 序列，其中一個或多個胺基酸殘基被刪除或取代，或其中 一個或多個胺基酸殘基被插入或增加； (e) 包括序列編號38的胺基酸位置21到236之胺基酸 序列；或 (f)包括序列編號38的胺基酸位置21到236之胺基酸 序列’其中一個或多個胺基酸殘基被刪除或取代，或其中 一個或多個胺基酸殘基被插入或增加。
(34) (4)之人類單株抗體或其部份，其中該人類單株 抗體具有下列（a)及（b)之特徵： ' (a) —重鏈可變區域，具有包括序列編號28的胺基酸 2 0到11 7之胺基酸序列；以及 土 具有包括序列編號30的胺基酸 (b) —輕鏈可變區域 2 3到11 6之胺基酸序列。
2125-3981-PF.ptd 第21頁 1304811 五、發明說明（18) (35) (4)之人類單株抗體或其部份，其中該人類單株 抗體具有下列（a)及（b)之特徵： (a) —重鏈夕胜肽’具有包括序列編號28的胺基酸2〇 到4 7 0之胺基酸序列；以及 (b ) —輕鏈夕胜肽’具有包括序列編號3 〇的胺基酸2 3 到2 3 6之胺基酸序列。 (36) (4)之人類單株抗體或其部份，其中該人類單株 抗體具有下列（a)及（b)之特徵： (a) —重鏈可變區域，具有包括序列編號32的胺基酸 20到116之胺基酸序列；以及 (b) —輕鏈可變區域’具有包括序列編號34的胺基酸 2 1到11 6之胺基酸序列。 (37) (4)之人類單株抗體或其部份，其中該人類單株 抗體具有下列（a)及（b)之特徵： (a) —重鏈多胜肽’具有包括序列編號32的胺基酸2〇 到4 7 0之胺基酸序列；以及 (b) —輕鏈多胜肽，具有包括序列編號34的胺基酸以 到2 3 6之胺基酸序列。 其中該人類單株 (38) (4)之人類單株抗體或其部份 抗體具有下列（a)及（b )之特徵： (a) —重鏈可變區域’具有包括序列編號36的胺美 20到116之胺基酸序列；以及 土 (b) —輕鏈可變區域，具有包括序列編號38的胺美 2 1到11 6之胺基酸序列。
2125-3981-PF.ptd 第22頁 1304811 五、發明說明（19) (39) (4)之人類單株抗體或其部份，其中該人類單株 抗體具有下列（a)及（b)之特徵： (a) —重鏈多胜肽’具有包括序列編號36的胺基酸2〇 到4 7 0之胺基酸序列；以及 (b) —輕鏈多胜肽，具有包括序列編號38的胺基酸21 到2 3 6之胺基酸序列。 (40) (3)到（29)中任一之人類單株抗體或其部份，其 中該人類單株抗體是衍生自可產生人類抗體之轉殖的非人 類哺乳動物之單株抗體。 (41) (40)之人類單株抗體或其部份，其中該人類單 株抗體是藉由以表現A I L IΜ的細胞、衍生自該細胞的細胞 膜部份 '構成AI LIΜ的全分子或其部份、或編碼八丨L丨Μ的基 因或其部份，免疫可產生人類抗體之轉殖的非人類哺乳動 物而獲得。 (42) (40)或（41)之人類單株抗體或其部份，其中該 轉殖的非人類哺乳動物是一轉殖老鼠。 (43) —種編碼選擇自以下）所組成的族群中 之多胜肽的DNA或其部份： (a )包括序列編號2 8的胺基酸序列2 〇到11 7之多胜 肽； (b)包括序列編號3 〇的胺基酸序列2 3到11 6之多 肽； (〇包括序列編號32的胺基酸序列2〇到丨丨6之多胜
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(d)包括序列編號34的胺基酸序列21到丨丨6之多 肽； (e )包括序列編號3 6的胺基酸序列2 〇到丨丨6之多胜 肽；以及 (Ο包括序列編號38的胺基酸序列2 1到11 6之多胜 肽。 (4 4) 一種編碼選擇自以下（a)到（f )所組成的族群 之多胜肽的DNA或其部份： (a) 包括序列編號28的胺基酸序列2〇到470之多胜 肽； (b) 包括序列編號3 〇的胺基酸序列2 3到2 3 6之多胜 肽； (c) 包括序列編號32的胺基酸序列2〇到470之多胜 肽； (d )包括序列編號3 4的胺基酸序列2 1到2 3 6之多胜 肽； (e)包括序列編號3 6的胺基酸序列2 〇到4 7 〇之多胜 肽；以及 (〇包括序列編號3 8的胺基酸序列2 1到2 3 6之多胜 月太。 (4 5 ) —種編碼選擇自以下（a)到（f )所組成的族群中 之MA或其部份： (a) 包括序列編號2 7的核苔酸序列丨2 6到41 9之D N A ; (b) 包括序列編號2 9的核普酸序列1 〇 5到38 6之DNA ;
1304811 五、發明說明（21) 包括序列編號33的核苷酸序列88到475之DNA ; 包括序列編號35的核苷酸序列153到443之DNA ; (C)包括序列編號31的核苷酸序列151到441之DNA ; (d) (e) 以及 (f)包括序列編號37的核苷酸序列93到38 0之ΜΑ。 (4 6 )—種編碼選擇自以下（a)到（f )所組成的族群中 之DNA或其部份： (a) 包括序列編號27的核苷酸序列69到1481之DNA ; (b) 包括序列編號29的核苷酸序列39到749之DNA ; (c) 包括序列編號31的核苷酸序列94到1 506之DNA ; (d) 包括序列編號33的核苷酸序列28到738之DNA ; (e) 包括序列編號35的核苷酸序列96到1 508之DNa ; 以及 (f)包括序列編號37的核苷酸序列33到743之DNA。 (47) —種包括（43)到（46)中任一DNA之載體。 (48) (47)之載體，包括以下（a)到（c)中之任何一種
DNA 或
DNA (a) 包括序列編號27的核苷酸序列126到419之DNA ; (b) 包括序列編號31的核苷酸序列1 51到441之A ; (c) 包括序列編號35的核有1酸·序列1 53到443之DNA ° (49) (47)之載體’包括以下（a)到（c)中之任何一種 (a)包括序列編號27的核苷酸序列69到1481之DNA ;
第25頁 2125.3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（22) (b) 包括序列編號31的核甘酸序列9 4到1 5 0 6之D N A ’ 或 (c) 包括序列編號35的核脊酸序列96到1508之DNA。 (50) (47)之載體’包括以下U)到（c)中之任何一種 DNA ： (a) 包括序列編號2 9的核脊酸序列1 0 5到3 8 6之D N A ; (b) 包括序列編號33的核苷酸序列88到375之DNA ;或 (c )包括序列編號3 7的核苷酸序列9 3到3 8 0之DNA。 (51) (47)之載體，包括以下（a)到（c)中之任何一種 DNA ： (a) 包括序列編號29的核苷酸序列39到749之DNA ; (b) 包括序列編號33的核苷酸序列28到738之DNA ;或 (c) 包括序列編號37的核苷酸序列33到743之DNA。 (52) (47)之載體，包括以下（a)及（b)中之MA : (a) 包括序列編號27的核苷酸序列126到419之DNA ; 及 (b) 包括序列編號2 9的核脊酸序列1 0 5到3 8 6之D N A。 (53) (47)之載體，包括以下（a)及（b)中之DN A : (a) 包括序列編號27的核苷酸序列69到1481之DNA ; 及 (b) 包括序列編號29的核苷酸序列39到749之DNA。 (54) (47)之載體，包括以下（a)及（b)中之DNA : (a)包括序列編號31的核苷酸序列151到441之DNA ; 及
2125-3981-PF.ptd 第26頁 1304811 五、發明說明（23) (b)包括序列編號33的核苷酸序列88到375之DNA。 (55) (47)之載體，包括以下（a)及（b)中之DNA : (a) 包括序列編號31的核苷酸序列94到1 506之DNA ; 及 (b) 包括序列編號33的核苷酸序列28到738之DNA。 (56) (47)之载體，包括以下（a)及（b)中之DNA : (a) 包括序列編號35的核苷酸序列153到443之DNA ; 及 (b) 包括序列編號37的核苷酸序列93到380之DNA。 (57) (47)之載體，包括以下（a)及（b)中之DNA : (a) 包括序列編號35的核苷酸序列96到1 508之DNA ; 及 (b) 包括序列編號37的核苷酸序列33到743之DNA。 (58) —種產生（3)到（42)中任何一種人類單株抗體之 細胞。 ( 59 ) ( 58 )之細胞，其中該細胞是藉由將B細胞（其衍 生自可產生該人類單株抗體之哺乳動物）與骨髓瘤細胞 (其衍生自一哺乳動物）融合而得之融合細胞。 (60) —種遺傳重組宿主，係藉由轉移說明於以下 中的DNA或包括該j)NA的載體，或藉由轉移說明於以下（a) 及（b)中的DNA或包括該等DNA的載體而轉形： (a) —編碼可結合至人類a ILim的單株抗體之重鏈多 胜肽或其部份之DNA ; (b) —編碼可結合至人類Ailim的單株抗體之輕鏈多
2125-3981-PF.ptd 第27頁 1304811 五、發明說明（24) 胜肽或其部份之DNA。 (6 1)( 6 0 )之遺傳重組宿主，其中該單株抗體是人類 單株抗體。 ( 62 ) ( 60 )或（61)之遺傳重組宿主，其中該宿主是哺 乳動物細胞。 ( 63 ) ( 60 )或（61)之遺傳重組宿主，其中該宿主是哺 乳動物受精卵。 (64) (60)到（63)中之任何一種遺傳重組宿主，其中 該重鏈多胜肽是選擇自以下（a)到（c)所組成的族群中之重 鏈多胜肽： (a) 包括序列編號28的胺基酸序列20到11 7之重鏈多 胜肽； (b) 包括序列編號32的胺基酸序列20到11 6之重鍵多 胜肽；以及 (c) 包括序列編號36的胺基酸序列20到116之重鍵多 胜肽。 (65) (60)到（63)中之任何一種遺傳重組宿主，其 該重鏈多胜肽是選擇自以下（a)到（c)所組成的族群 鏈多胜肽： 吁平之重 (a) 包括序列編號28的胺基酸序列2〇到470之番 胜肽； 鏈多 (b) 包括序列編號3 2的胺基酸序列2 〇到4 7 〇之杳 胜肽；以及 ΐ鏈多 包括序列編號36的胺基酸序列2〇到47〇之重鏈多
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五、發明說明（25) 胜肽。 (66) (60)到（63)中之任何一種遣傳重組宿主，其 該輕鏈多胜肽是選擇自以下（a)到（c)所組成的族由、中 鏈多胜肽： 輕 (a) 包括序列編號30的胺基酸序列23到1 16之輕鍵夕 胜肽； 多 (b) 包括序列編號34的胺基酸序列21到1 16之輕鍵多 胜肽；以及 夕 (c) 包括序列編號38的胺基酸序列21到116之輕鍵多 胜肽。 夕 (67) (60)到（63)中之任何一種遺傳重組宿主，其中 該輕鏈多胜肽是選擇自以下（a)到（c)所組成的族群中之奉τ< 鏈多胜肽： Λ (a) 包括序列編號30的胺基酸序列23到236之輕鏈多 胜肽； (b) 包括序列編號34的胺基酸序列21到236之輕鏈多 胜肽；以及 (c) 包括序列編號38的胺基酸序列21到236之輕鏈多 胜肽。 (6 8 )( 6 0 )到（6 3 )中之任何一種遺傳重組宿主，其中 該重鏈及輕鏈多胜肽分別是以下（a)及（b)所定義之多胜 肽： (a)包括序列編號28的胺基酸序列20到117之重鏈多 胜肽；以及
2125-3981-PF.ptd 第29頁 1304811 五、發明說明（26) (b )包括序列編號3 〇的胺基酸序列2 3到11 6之輕鏈多 胜狀。 (69) (60)到（63)中之任何一種遺傳重組宿主，其中 該重鏈及輕鏈多胜肽分別是以下（a)及（b)所定義之多胜 肽： (a) 包括序列編號28的胺基酸序列20到470之重鏈多 胜肽；以及 (b) 包括序列編號3〇的胺基酸序列23到236之輕鏈多 胜肽。 (70) (60)到（63)中之任何一種遺傳重組宿主，其中 該重鍵及輕鍵多胜肽分別是以下（a)及⑼）所定義之多胜 肽： (a )包括序列編號3 2的胺基酸序列2 〇到丨丨6之重鏈多 胜肽；以及 (b)包括序列編號34的胺基酸序列21到丨16之輕鏈多 胜狀。 (71 )( 6 0 )到（6 3)中之任何一種遺傳重組宿主，其中 !"重鏈及輕鏈多胜肽分別是以下（a)及（b)所定義之多胜 (a) 包括序列編號32的胺基酸序列2〇 之重鏈多 ;以及 (b) 匕括序列編號34的胺基酸序列到“^之輕鏈多 〇 (72) (60)到（63)中之 之任何一種遺傳重組宿主，其中 1304811 五、發明說明（27) 該重鏈及輕鏈多胜肽分別是以下（3)及（13)所定義之多胜 肽： (a) 包括序列編號36的胺基酸序列2〇到jig之重鏈多 胜肽；以及 (b) 包括序列編號38的胺基酸序列21到116之輕鏈多 胜肽 (73) (60)到（63)中之任何一種遺傳重組宿主，其中 該重鏈及輕鏈多胜肽分別是以下（a) &(b)所定義之多胜 肽： (a) 包括序列編號36的胺基酸序列20到470之重鏈多 胜肽；以及 (b) 包括序列編號38的胺基酸序列21到236之輕鏈多 胜肽。 (74) (60)到（63)中之任何一種遺傳重組宿主，其中 編碼該重鏈多胜肽的D N A是以下（a )到（c )申任何一種所定 義之DNA : (a) 包括序列編號27的核苷酸序列126到419之DNA ; (b) 包括序列編號31的核苷酸序列151到441之DNA ; 以及 (c) 包括序列編號35的核苷酸序列153到443之DNA。 (75) (60)到（63)中之任何一種遣傳重組宿主’其中 編碼該重鏈多胜肽的DN A是以下（a )到（c)中任何一種所定 義之DNA : (a)包括序列編號27的核苷酸序列69到148丨之DNA ;
IH 2125-3981-PF.ptd 第31頁 1304811 "^發明說明（28) "" (b) 包括序列編號31的核苷酸序列94到1 506之DNA ; 以及 (c) 包括序列編號35的核苷酸序列96到1 508之DNA。 (76) (60)到（63)中之任何一種遺傳重組宿主，其中 編碼該重鏈多胜狀的])NA是以下（a)到（c)中任何一種所定 義之DNA : (a) 包括序列編號29的核苷酸序列105到386之DNA ; (b) 包括序列編號33的核苷酸序列88到375之DNA ;以 及 (c) 包括序列編號37的核苷酸序列93到380之DNA。 (77) (60)到（63)中之任何一種遺傳重組宿主，其中 編碼該重鏈多胜肽的DNA是以下（a)到（c)中任何一種所定 義之DNA : (a) 包括序列編號29的核苷酸序列39到749之DNA ; (b) 包括序列編號33的核苷酸序列28到738之DNA ;以 及 (c) 包括序列編號37的核苷酸序列33到743之DNA。 (78 ) (60 )到（63)中之任何一種遺傳重組宿主，其中 編碼該重鏈多胜肽的DNA是以下（a)所說明之DNA，以及編 碼該輕鏈多胜肽的DNA是以下（b)所說明之DNA : (a) 包括序列編號27的核苷酸序列126到419之DNA ; 以及 (b) 包括序列編號29的核苷酸序列105到386之MA。 (7 9 )(6 0 )到（6 3 )中之任何一種遺傳重組宿主，其中
2125-3981-Ι¥.ρΜ 第32頁 1304811 五、發明說明（29) 編碼該重鏈多胜肽的DNA是以下（a)所說明之DNA，以及編 碼該輕鏈多胜肽的MA是以下（b)所說明之DNA : (a) 包括序列編號27的核苷酸序列69到1481之DNA ; 以及 (b) 包括序列編號29的核苷酸序列39到749之DNA。 (80) (60)到（63)中之任何一種遺傳重組宿主，其中 編碼該重鏈多胜肽的DNA是以下（a)所說明之DNA，以及編 碼該輕鏈多胜肽的DNA是以下（b)所說明之DNA : (a) 包括序列編號31的核苷酸序列151到441之DNA ; 以及 (b) 包括序列編號33的核苷酸序列88到375之DNA。 (81) (60)到（63)中之任何一種遺傳重組宿主，其中 編碼該重鏈多胜肽的DNA是以下（a)所說明之DNA，以及編 碼該輕鏈多胜肽的DNA是以下（b)所說明之DNA : (a) 包括序列編號31的核苷酸序列94到1 506之DNA ; 以及 (b) 包括序列編號33的核苷酸序列28到738之DNA。 (82) (60)到（63)中之任何一種遺傳重組宿主，其中 編碼該重鏈多胜肽的DNA是以下U)所說明之DNA，以及編 碼該輕鏈多胜肽的DNA是以下（b)所說明之DNA : (a) 包括序列編號35的核苷酸序列153到443之DNA ; 以及 (b) 包括序列編號3 7的核苷酸序列9 3到3 8 0之D N A。 (83) (60)到（63)中之任何一種遺傳重組宿主，其中
2125-3981-PF.ptd 第33頁 1304811 五、發明說明（30) 編碼該重鍵多胜肽的DNA是以下（a)所說明之MA，以及編 碼該輕鏈多胜肽的MA是以下（b)所說明之DNA : (a) 包括序列編號35的核苷酸序列“到^“之⑽八； 以及 (b) 包括序列編號3 7的核苷酸序列3 3到743之DNA。 (84) 由（6〇)到（β2)中的任何一種或（64)到（83)中的 住何一種遺傳重組宿主（除了該宿主是受精卵之外）所產 生之人類單株抗體或其部份。 (85) —種藥學組成物’包括（1)或（2)的人類抗體以 及藥學上可接受的載體。 (86) —種藥學組成物，包括（3)到（42)中任何一種人 類單株抗體或其部份，以及藥學上可接受的載體。 (87) —種藥學組成物，包括（84)之人類單株抗體或 其部份’以及藥學上可接受的載體。 一 (88) (85)到（87)中任何一種藥學組成物，其中該藥 學組成物是用於抑制由AI LIΜ調控的訊息傳遞進入至細 胞。 (89) (85)到（87)中任何一種藥學組成物，其中該藥 學組成物是用於預防表現AILIM的細胞之增殖。 八 | (90) (85)到（87)中任何一種藥學組成物，其中該藥 學組成物是用於預防表現AILIΜ的細胞產生細胞激素。 (91) (85)到（87)中任何一種藥學組成物，其中該藥 學組成物是用於誘導由AILIM調控的訊息傳遞進入至細 胞0 2125-3981-PF.ptd 第34頁 1304811 五、發明說明（31) (92) (85)到（87)中任何一種藥學組成物，其中該藥 學組成物是用於誘導表現AILIΜ的細胞之增殖。 (93) (85)到（87)中任何一種藥學組成物，其中該藥 學組成物是用於誘導表現A I L I Μ的細胞產生細胞激素。 ( 94) ( 85 )到（87)中任何一種藥學組成物，其中該藥 學組成物是用於誘導對抗表現A I L I Μ的細胞之抗體依賴性 之細胞毒性’及/或誘導表現A I L I Μ的細胞之免疫細胞溶解 或細胞〉周亡。 (9 5 ) —種防止、治療或預防延遲型過敏症之藥學組 成物’包括具有調節由AILIM調控的訊息傳遞之活性的物 質，以及藥學上可接受的載體。 (96) (95)之藥學組成物，其中該物質是蛋白質物 質。 (97) (96)之藥學組成物，其中該蛋白質物質是選擇 自以下所組成的族群中： (a )結合至AILIΜ的抗體或其部份； (b) 包括AILIM細胞外區域的全部或部份之多胜肽； (c) 包括AIL IM細胞外區域的全部或部份，以及免疫 球蛋白恆定區域的全部或部份之融合多胜狀；以及 (d) 結合至AILIM之多胜太。 (98) (97)之藥學組成物，其中嗜^ τ予、肷初丹γ这結合至AILIM的抗體 是（1)或（2)之人類抗體。 (99) (97)之藥學組成物，豆中嗜社入 , / 、 艰予，且力又视"甲茨結合至AILIM的抗體 疋（3)到（42)之任何一種人類單株抗體。
第35頁 1304811 五、發明說明（32) ( 1 00 ) ( 97 )之藥學組成物’其中該對抗AILIM的抗體 是（84)之人類單株抗體。 (101) (97)之藥學組成物，其中該物質是非蛋白質物 質。 (1 0 2 )( 1 0 1 )之藥學組成物，其中該非蛋白質物質是 DNA、RNA或化學合成的化合物。 (103) —種鑑定結合至AILIM或AILIM配體的物質之方 法，包括下列步驟： (a) 製備一不溶性的載體，其上固定完整的AILIM細 胞外區域或其部份； (b) 製備包括AILIM配體的全部細胞外區域之多胜肽 或其部份’其以可發散一可偵測的訊號之標示材料而標 不 ； (c) 將步驟（a)之不溶性的載體與步驟（b)多胜肽之反 1¾ · 應 ， (d) 將步驟（a)之不溶性的載體、步驟（b)多胜肽與該 物質’以任意的順序互相反應； (e )分別偵測步驟（c )所產生的複合物包含之該標示 材料所發散的訊號’以及步驟（d)所產生的複合物包含之 該標示材料所發散的訊號；以及 (Ο比較步驟（e)所偵測到的每個訊號之強度。 (104) 一種鑑定結合至AILIM或AILIM配體的物質之方 法’包括下列步驟： (a )製備一不溶性的載體，其上固定完整的A I L I Μ配
第36頁 1304811 五、發明說明（33) 體細胞外區域或其部份； (b) 製備包括AILIM的全部細胞外區域之多胜肽或其 部份’其以可發散—可偵測的訊號之標示材料而標示； (c) 將步驟（a)之不溶性的載體與步驟（b)多胜肽之反 應； (d )將步驟（a)之不溶性的載體、步驟（b )多胜肽與該 物質，以任意的順序互相反應； (e )分別偵測步驟（c )所產生的複合物包含之該標示 材料所發散的訊號，以及步驟（d)所產生的複合物包含之 該標示材料所發散的訊號；以及 (f )比較步驟（e)所偵測到的每個訊號之強度。 ( 1 05 ) ( 1 03)及（1〇4)之方法，其中該包括AILIM的全 部細胞外區域之多胜肽或其部份，是一包括ailim的全部 細，外區㉚或其部份以及免疫球蛋白重鏈之全部怪定區域 或其部份之多胜肽的融合多胜肽。 的八in 及(1〇4)之方法，其中該包括ailim配體 許二：：：的二；2多胜肽或其部份’是-包括AI LIΜ配 體的全部細胞外區域或其部份以及免 怪定區域或其部份之多胜肽的融合多蛋白重鏈之王 ( 1 0 7) ( 1 03 )到（1〇6)中之任 t。
是人類AILIM。 T之#種方法，其中祕UM ( 1 08) ( 1 03 )到（1〇7)中之任—
配體是人類AILIM配體。 /’其中該AILIM
1304811 五、發明說明（34) 圖示之簡單說明 第1圖顯示抗人類I gG抗體、抗人類I g /C抗體以及抗人 類I gFc抗體，對於人類抗人類AI l I Μ單株抗體之個別反應 力，係利用流式細胞儀，藉由細胞ELISA而分析。 (a)到（1)顯示個別的分析結果，說明如下： (a) :以生物素標示的抗人類1§〇抗體作為二次抗體， 在不含初級抗體的情形下，加到已放入野生型HPB_ALL細 胞的微量盤中之分析結果。 (b) :以生物素標示的抗人類I g /c抗體作為二次抗 體，在不含初級抗體的情形下，加到已放入野生型 HPB-ALL細胞的微量盤中之分析結果。 (c) :以生物素標示的抗人類I gFc抗體作為二次抗 體’在不含初級抗體的情形下，加到已放入野生型 HPB-ALL細胞的微量盤中之分析結果。 ^ (d):以人類抗人類AILIM單株抗體JMab-136作為初級 抗體’及以生物素標示的抗人類I gG抗體作為二次抗體之 分析結果。 ^ (e)，以人類抗人類AILIM單株抗體JMab-136作為初級 抗體’及以生物素標示的抗人類I g /c抗體作為二次抗體之 分析結果。 ^ (f) ·以人類抗人類AILIM單株抗體JMab-136作為初級 才几體’及以生物素標示的抗人類I gFc抗體作為二次抗體之 分析結果。 (g) •以人類抗人類AILIM單株抗體JMab-138作為初級
2125-3981-PF.ptd 第38頁 1304811 五、發明說明（35) 抗體’及以生物素標示的抗人類〗gG抗體作為二次抗體之 分析結果。 (h) :以人類抗人類AILI1|1單株抗體JMab-138作為初級 抗體’及以生物素標示的抗人類丨g κ抗體作為二次抗體之 分析結果。 (i) :以人類抗人類AILIM單株抗體JMab-138作為初級 抗體’及以生物素標示的抗人類丨gFc抗體作為二次抗體之 分析結果。 (j) :以人類抗人類AILIM單株抗體JMab-139作為初級
抗體’及以生物素標示的抗人類IgG抗體作為二次抗體之 分析結果。 (k) :以人類抗人類“[^單株抗體JMab-139作為初級 抗體’及以生物素標示的抗人類Ig/C抗體作為二次抗體之 分析結果。 (l) :以人類抗人類AILIM單株抗體JMab-139作為初級 抗體’及以生物素標示的抗人類I g F c抗體作為二次抗體之 分析結果。 每一圖中的空心符號之曲線對應於將人類抗KLH單株 抗體作為對照抗體之分析結果。
第2圖顯示利用抗人類igG抗體，藉由三明治elisa分 析之關於人類I gG單株抗體（標準材料）之校正曲線。 縱軸顯示螢光強度，橫軸顯示標準材料的濃度。 第3圖顯示各種老鼠抗人類^以诞單株抗體，對於大量 表現人類AILIM的重組CH0細胞或野生型CH0細胞之結合活
1304811 五、發明說明（36) 性。 .縱轴顯示榮光強度’作為對重組細胞的結合活性之指 標；橫轴顯示所加抗體的濃度。 圖中的名詞"CH0"表示對於野生型CH〇細胞的結合分析 之結果’以及"人類"表示對於大量表現人類AILIM的重組 CH0細胞的結合分析之結果。 ~第4圖顯示各種人類抗人類a〗L〗μ單株抗體或人類抗 KLH單株杬體作為陰性對照組，對於大量表現人類a I l I μ的 重組CH0細胞或野生型CH〇細胞之結合活性。 β •縱轴顯示螢光強度，作為對重組細胞的結合活性之指 標；橫轴顯示所加抗體的濃度。 圖中的名詞"CH0"表示對於野生型CH〇細胞的結合分析 in结果，以及"人類"表示對於大量表現人類AILIM的重組 CH0細胞的結合分析之結果。 第5圖顯示各種人類抗人類AILIM單株抗體，對於大量 現人類AILIM的重組CH0細胞或野生型CH〇細胞之結合活 性0 西縱軸顯示螢光強度，作為對重組細胞的結合活性之 標，橫軸顯示所加抗體的濃度。 曰 圖中的名詞"CH0"表示對於野生型CH〇細胞的結合分 t結果，以及”人類"表示對於大量表現人類AILIM的重 CH0細胞的結合分析之結果。 、’、 第6圖顯不各種人類抗人類“^肘單株抗體，對於大 表現人類AILIM的重組CH0細胞或野生型CH〇細胞之結合活重 第40頁 2125-398l-PF.ptd 1304811
性。 縱轴顯示榮光強度，作為對重組細胞的結合活性之指 標；橫轴顯示所加抗體的濃度。 圖中的名詞"CH0"表示對於野生型CH〇細胞的結合分析 之結果，以及人類"表不對於大量表現人類Ailim的重詛 CH0細胞的結合分析之結果。 第7圖顯示大鼠抗人類AILIM單株抗體，對於老鼠大量 表現AILIM的重組CH0細胞或野生型CH〇細胞之结合活性。 縱軸顯示螢光強度，作為對重組細胞的結合活性之指 標；橫轴顯示所加抗體的濃度。 圖中的名詞”CH〇”表示對於野生型⑶^細胞的結合分析 之結果，以及"老鼠"表示對於老鼠大量表現AILIM的重組 CH0細胞的結合分析之結果。 第8圖顯示各種人類抗人類AILIM單株抗體或人類抗 KLH單株抗體作為陰性對照組，對於老鼠大量表現“[丨材的 重組CH0細胞或野生型CH0細胞之結合活性。 縱軸顯示螢光強度，作為對重組細胞的結合活性之指 標；橫軸顯示所加抗體的濃度。 圖中的名詞"CH0"表示對於野生型(^〇細胞的結合分析 之結果，以及”老鼠"表示對於老鼠大量表現AILIM的重組 CH0細胞的結合分析之結果。 第9圖顯示各種人類抗人類ailim單株抗體，對於老鼠 大里表現AI L IΜ的重組C Η 0細胞或野生型c η 〇細胞之結合活 性。
2125-3981-PF.ptd 第41頁 1304811 五、發明說明（38) 縱轴顯示勞光強度，作為對重組細胞的結合活性之指 標；橫轴顯示所加抗體的濃度。 圖中的名詞"CH0"表示對於野生型(^〇細胞的結合分析 之結果，以及"老鼠'’表示對於老鼠大量表現AILIM的重組 CH0細胞的結合分析之結果。 第10圖顯示各種人類抗人類八丨以肘單株抗體，對於老 鼠大量表現AILIΜ的重組CHO細胞或野生型CH〇細胞之結合 活性。 縱轴顯示螢光強度，作為對重組細胞的結合活性之指 標；橫軸顯示所加抗體的濃度。 圖中的名詞"CH0"表示對於野生型CH〇細胞的結合分析 之結果，以及"老鼠”表示對於老鼠大量表現AILIM的重組 CHO細胞的結合分析之結果。 ，11圖顯示各種老鼠抗大單株抗體，對於大 鼠大量表現AILIM的重組CH0細胞或野生型CH〇細胞之結合 活性。 縱轴顯示螢光強度，作為對重組細胞的結合活性之指 標；橫軸顯示所加抗體.的濃度。 圖中的名詞” CHO"表示對於野生MCH〇細胞的結合分析 之結果，以及"大氣"表示對於大鼠大量表現AILIM的重組 CHO細胞的結合分析之結果。 第1 2圖顯示各種人類抗人類A丨L丨M單株抗體或人類抗 KLH單株抗體作為陰性對照組，對於大鼠大量表現“以肘的 重組CHO細胞或野生型CH〇細胞之結合活性。
2125-3981-PF.ptd 第42頁 1304811
縱軸顯示螢光強度’作為對重組細胞的結合活性之指 標；橫轴顯示所加抗體的濃度》 a 圖中的名詞11 CH0"表示對於野生型CH〇細胞的結合分析 之結果，以及"大鼠"表示對於大鼠大量表現AILIM的重組 CH0細胞的結合分析之結果。 第13圖顯示各種人類抗人類AILIM單株抗體，對於大 鼠大量表現AILIM的重組CH0細胞或野生型ch〇細胞之結合 活性。
縱轴顯示螢光強度，作為對重組細胞的結合活性之指 標；橫轴顯示所加抗體的濃度。 S 圖中的名詞M CH0"表示對於野生型CH〇細胞的結合分析 之結果，以及"大鼠"表示對於大鼠大量表現AILIM的重組 CH0細胞的結合分析之結果。 * 第14圖顯示各種人類抗人類AILIM單株抗體，對於大 鼠大量表現AILIM的重組CH0細胞或野生型CH0細胞之結合 活性。 縱軸顯示螢光強度，作為對重組細胞的結合活性之指 標；橫軸顯示所加抗體的濃度。 ~ 圖中的名詞n CH0"表示對於野生型CH0細胞的結合分析 之結果’以及"大鼠"表示對於大鼠大量表現AILIM的重組 CH0細胞的結合分析之結果。 第1 5圖顯示在傳遞共同刺激訊息的活性分析中，衍生 自正常健康人”供體A"之T細胞增殖活性，係利用覆蓋有抗 人類CD3單株抗體以及老鼠抗人類AILIM單株抗體之微量
2125-3981-PF.ptd 第 43 頁 1304811
盤，藉由各種老鼠抗人類ailim單株抗體而分析。 =軸表示細胞中併入^”胸苷的量，作 ^，&轴表不老鼠抗人類AILIM單株抗體之濃声。 16圖顯不在傳遞共同刺激訊息的活性分析中，二 常健康人"供體Α、τ細胞增殖活性，係利用覆:生 ’貝CD3單株抗體以及人類抗人類AIUM單株抗體之 几 盤，藉由各種人類抗人類AILIM單株抗體而分析。 縱軸表示細胞中併入[3H]胸苷的量，作為細胞择 又的指標；橫軸表示人類抗人類AILIM單株抗體之遭"度。王 第1 7圖顯示在傳遞共同刺激訊息的活性分析中，衍生 自正常健康人"供體B"之τ細胞增殖活性，係利用覆蓋有抗 人類C^>3單株抗體以及老鼠抗人類AILIM單株抗體之微量 盤’藉由各種老鼠抗人類AILIM單株抗體而分析。 縱轴表示細胞中併入[3H]胸苷的量，作為細胞增殖程 度的指標；橫軸表示老鼠抗人類AIUM單株抗體之濃度。 在此圖中’ n JHC1"表示使用抗人類CETP單株抗體作為 陰性對照組’以取代老鼠抗人類AI LIM單株抗體之分析結 果0 第1 8圖顯示在傳遞共同刺激訊息的活性分析中，衍生 自正常健康人"供體B'，之T細胞增殖活性，係利用覆蓋有抗 人類CD3單株抗體以及人類抗人類AILIM單株抗體之微量 盤’藉由各種人類抗人類AILIM單株抗體而分析。 縱軸表示細胞中併入[3 Η ]胸苷的量，作為細胞增殖程 度的指標；橫軸表示人類抗人類AILIM單株抗體之濃度。
2125-3981-PF.ptd 第44頁 1304811 五、發明說明（41) 在此圖中，"抗_KHL"表示使用人類抗4肌單株抗體作 二陰性對照組，以取代人類抗人類AILIM單株抗體之分析 結果。 $1 9圖顯示在傳遞共同刺激訊息的活性分析中，衍生 ^ ¥健康人供體之T細胞增殖活性，係利用覆蓋有抗 1巧3單株抗體以及人類抗人類A IUM單株抗體之微量 ’藉由各種人類抗人類A〗L丨Μ單株抗體而分析。 ，軸表示細胞中併入[^叼胸苷的量，作為細胞增殖程 又、私標；橫軸表示人類抗人類AIUM單株抗體之濃度。 A^此圖中’"抗-KHL"表示使用人類抗—KHL單株抗體作 。對照組，以取代人類抗人類4111]^單株抗體之分析 =20圖顯示在傳遞共同刺激訊息的活性分析中，衍生 人類cL健"康姓人k供體C "之Τ細胞增殖活性’係、利用覆蓋有抗 “早株抗體以及老鼠抗人類AIL ΙΜ單株抗體之微量 盤，猎由各種老鼠抗人類AILIM單株抗體而分析。 度的^由表ί =中併入[3H]胸苔的量’作為細胞增殖程 曰=，柺軸表不老鼠抗人類AILIM單株抗體之濃度。 陰性對昭也^以表不使用抗人類以”單株抗體作為 果。’、、、、，' 取代老鼠抗人類AILIM單株抗體之分析結 2圖顯示在傳遞共同刺激訊息的 人類CD3單嫉h :、 T細胞增殖活性，係利用覆蓋有抗 、 株抗體以及人類抗人類A I LIM單株抗體之微量
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盤，藉由各種人類抗人類^!^„單株抗體而分析。 =轴表示細胞中併入[3H]胸苷的量，作為細胞增殖程 又的心標’橫轴表示人類抗人類AI LIΜ單株抗體之濃度。 在此圖中，”抗一KHL"表示使用人類抗-KHL單株抗體作 為陰性對照組，以取代人類抗人類AI LIΜ單株抗體之分析 結果。 其他的標記如下： 124人類抗人類AILIM單株抗體JMabl24。 126人類抗人類AilIM單株抗體JMabl26。 127"人類抗人類AILIM單株抗體JMabl27。 第2 2圖顯示在傳遞共同刺激訊息的活性分析中，衍生 自正常健康人"供體C"之ΐ細胞增殖活性，係利用覆蓋有抗 人類CD3單株抗體以及人類抗人類AILIM單株抗體之微量 盤’藉由各種人類抗人類AILIM單株抗體而分析。 縱軸表示細胞中併入]胸苷的量，作為細胞增殖程 度的指標；橫軸表示人類抗人類AILIM單株抗體之濃度。 在此圖中，"抗-KHL"表示使用人類抗— KHL單株抗體作 為陰性對照組，以取代人類抗人類A! L! Μ單株抗體之分析 結果。 其他的標記如下： '128"人類抗人類AILIM單株抗體jMabl28。 1 135"人類抗人類AILIM單株抗體jMabl35。 '136"人類抗人類AILIM單株抗體jMabl36。 第2 3圖顯示在傳遞共同刺激訊息的活性分析中，衍生
2125-3981-PF.ptd 第46頁 1304811_ ΐ、發明說明（43) "~~~' " '— 自正常健α康人"供體c"之Τ細胞增殖活性，係利用覆蓋有抗 人類CD3單株抗體以及人類抗人類AILIM單株抗體之微量 盤’藉由各種人類抗人類AILIM單株抗體而分析。 表=細胞中併入[3H]胸苷的量，作為細胞增殖程 度的指標；橫軸表示人類抗人類AILIM單株抗體之濃度。 、在此圖中，”抗-KHL”表示使用人類抗-KHL單株抗體作 為陰性對照組，以取代人類抗人類AILIM單株抗體之分析 結果。 其他的標記如下： "137"人類抗人類^以付單株抗體JMabl37。 "138”人類抗人類…[…單株抗體JMabl38。 "139π人類抗人類AILIM單株抗體…礼丨^。 第24圖顯示在傳遞共同刺激訊息的活性分析中，衍生 自正常健康人"供體C”之τ細胞增殖活性，係利用覆蓋有抗 人類CD3單株抗體以及人類抗人類AILIM單株抗體之微量 盤’藉由各種人類抗人類AILIM單株抗體而分析。 ，轴表示細胞中併入[3H]胸苷的量，作為細胞增殖程 度的指標；橫軸表示人類抗人類AILIM單株抗體之濃度。 在此圖中’"抗-KHL”表示使用人類抗-KHL單株抗體作 為陰性對照組’以取代人類抗人類A〗L丨Μ單株抗體之分析 結果。 其他的標記如下： "140"人類抗人類AILIM單株抗體JMabl4〇。 14Γ人類抗人類AILIM單株抗體jMabl41。
1304811 五、發明說明（44) 第2 5圖顯示在傳遞共同刺激訊息的活性分析中，衍生 自正常健„康人"供體D"之了細胞增殖活性，係利用覆蓋有抗 =類CD3單株抗體以及老鼠抗人類ARIM單株抗體之微量 盤，藉由各種老鼠抗人類AILIM單株抗體而分析。 表=細胞中併入[3H]胸苷的量，作為細胞增殖程 度的指標；橫軸表示老鼠抗人類A I L IΜ單株抗體之濃度。 在此圖中’ "JHCl”表示使用抗人類CETp單株抗體作為 陰性對照組’以取代老鼠抗人類A I L I Μ單株抗體之分析結 果。 第2 6圖顯示在傳遞共同刺激訊息的活性分析中，衍生 自正常健康人"供體D”之Τ細胞增殖活性，係利用覆蓋有抗 人類CD3單株抗體以及人類抗人類A〗L丨μ單株抗體之微量 盤’藉由各種人類抗人類AILIM單株抗體而分析。 縱轴表示細胞中併入PH]胸苷的量，作為細胞增殖程 度的指標；橫軸表示人類抗人類A丨L丨Μ單株抗體之濃度。 在此圖中’"抗-KHL”表示使用人類抗-KHL單株抗體作 為陰性對照組’以取代人類抗人類Α丨L丨Μ單株抗體之分析 結果。 其他的標記如下： "124"人類抗人類AILIM單株抗體JMabl24。 "126"人類抗人類AILIM單株抗體JMabl26。 ” 127"人類抗人類AILIM單株抗體JMabl27。 第2 7圖顯示在傳遞共同刺激訊息的活性分析中，衍生 自正常健康人11供體Dn之了細胞增殖活性，係利用覆蓋有抗
第48頁 2l25-3981-PF.ptd 1304811 明說明（45) ' ~ 人類CD3單株抗體以及人類抗人類九丨^^單株抗體之微量 盤，藉由各種人類抗人類AILIM單株抗體而分析。 縱軸表示細胞中併入[3H]胸苷的量，作為細胞增殖程 度的指標；橫轴表示人類抗人類AILINi單株抗體之濃度。 在此圖中，”抗-KHL"表示使用人類抗 — khl單株抗體作 為陰性對照組’以取代人類抗人類A〗L〗Μ單株抗體之分析 結果。 其他的標記如下： "128π人類抗人類AILIM單株抗體jMabl28。 "135π人類抗人類AILIM單株抗體jMabl35。 "136"人類抗人類AILIM單株抗體jMabl36。 第2 8圖顯示在傳遞共同刺激訊息的活性分析中，衍生 自正常健康人”供體D"之T細胞增殖活性，係利用覆蓋有抗 人類CD3單株抗體以及人類抗人類AILIM單株抗體之微量 盤’藉由各種人類抗人類AILIM單株抗體而分析。 縱軸表示細胞中併入[3H]胸苷的量，作為細胞增殖程 度的指標；橫軸表示人類抗人類AILIM單株抗體之濃度。 在此圖中’"抗-KHL"表示使用人類抗_KHL單株抗體作 為陰性對照組，以取代人類抗人類A丨L丨Μ單株抗體之分析 結果。 其他的標記如下： "137”人類抗人類AILIM單株抗體jMabl37。 "138"人類抗人類AILIM單株抗體jMabl38。 ” 139"人類抗人類AILIM單株抗體jMabl39。
1304811 7發明說明（46) ' 第29圖顯示在傳遞共同刺激訊息的活性分析中，衍生 自正常健康人供體D"之τ細胞增殖活性，係利用覆蓋有抗 人類CD3單株抗體以及人類抗人類AIUM單株抗體之微量 盤，藉由各種人類抗人單株抗體而分析。 表=細胞中併入[3H]胸苷的量，作為細胞增殖程 度的指標；橫軸表示人類抗人類A丨L〗M單株抗體之濃度。 在此圖中，"抗-KHL"表示使用人類抗—KHL單株抗體作 為陰性對照組，以取代人類抗人類A丨L丨M單株抗體之分析 結果。 其他的標記如下： "140”人類抗人類AILIM單株抗體JMabl40。 "141"人類抗人類AIUM單株抗體;^&13141。 第3 0圖顯示在傳遞共同刺激訊息的活性分析中，衍生 自正常健康人"供體E"之T細胞增殖活性，係利用覆蓋有抗 人類CD3單株抗體以及老鼠抗人類AILIμ單株抗體之微量 盤’藉由各種老鼠抗人類AILIM單株抗體而分析。 縱軸表示細胞中併入[3Η]胸苷的量，作為細胞增殖程 度的指標；橫軸表示老鼠抗人類AILIM單株抗體之濃度。 在此圖中，"JHC1"表示使用抗人類CETP單株抗體作為 陰性對照組’以取代老鼠抗人類A ][ L丨Μ單株抗體之分析結 果。 第3 1圖顯示在傳遞共同刺激訊息的活性分析中，衍生 自正常健康人"供體Ε"之Τ細胞增殖活性，係利用覆蓋有抗 人類CD3單株抗體以及人類抗人類AILIM單株抗體之微量
2125-3981-PF.ptd 第50頁 1304811 五、發明說明（47) 盤，藉由各種人類抗人類AILIM單株抗體而分析。 縱軸表示細胞中併入[3 Η ]胸苜的量，作為細胞增殖程 度的指標；橫軸表示人類抗人類AI LIΜ單株抗體之濃度。 在此圖中，”抗-KHL”表示使用人類抗-KHL單株抗體作 為陰性對照組，以取代人類抗人類AI LIΜ單株抗體之分析 結果。 其他的標記如下： π124π人類抗人類AILIM單株抗體JMabl24。 "126"人類抗人類AILIM單株抗體JMabl26。 "127π人類抗人類AILIM單株抗體JMabl27。 第3 2圖顯示在傳遞共同刺激訊息的活性分析中，衍生 自正常健康人π供體E"之T細胞增殖活性，係利用覆蓋有抗 人類CD3單株抗體以及人類抗人類AILIM單株抗體之微量 盤’藉由各種人類抗人類AILIM單株抗體而分析。 縱軸表示細胞中併入[3H]胸苷的量，作為細胞增殖程 度的指標；橫軸表示人類抗人類A丨L〗Μ單株抗體之濃度。 在此圖中，"抗-KHL11表示使用人類抗-KHL單株抗體作 為陰性對照組，以取代人類抗人類A〗L〗Μ單株抗體之分析 結果。 其他的標記如下： "128"人類抗人類AILIM單株抗體JMabl28。 '|135”人類抗人類AILIM單株抗體JMabl35。 '136"人類抗人類AILIM單株抗體jMabl36。 第33圖顯示在傳遞共同刺激訊息的活性分析中，衍生
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五、發明說明（49) 第3 5圖顯示在傳遞共同刺激訊息的活性分析中， 自正常健康人π供體Dn之了細胞增瘦活性，係將各種老鼠抗 人類A I L IΜ單株抗體溶液（液相），單獨加到覆蓋有抗人 類CD3單株抗體的微量盤而分析。 縱軸表示細胞中併入[3Η]胸苷的量，作為細胞增殖程 度的指標；橫軸表示老鼠抗人類AILIM單株抗體之濃度。 在此圖中，"JHC1”表示使用抗人類CETp單株抗體作為 ^對照組，以取代老鼠抗人類A I L IΜ單株抗體之分析結 第36圖顯示在傳遞共同刺激 自正常健康人"供體D"之Τ細胞增 人類AILIM單株抗體溶液（液相） 類CD3單株抗體的微量盤而分析。 訊息的活性分析中，衍生 殖活性，係將各種人類抗 ，單獨加到覆蓋有抗人 # &縱轴表示細胞中併入[3Η]胸苷的量，作為細胞增殖程 又、指標，橫轴表示人類抗人類八丨以肘單株抗體之濃度。 在此圖中’"抗_KHL"表示使用人類抗_khl單株抗體作 二=性對照組’以取代人類抗人類ailim單株抗體之分析 箱果。 其他的標記如下： "j2'人類抗人類AILIM單株抗體JMaM24。 人類抗人類AILIM單株抗體jMabl26。 :7人類_抗人類AILIM單株抗體jMabm。 自正木7圖顯，不在傳遞共同刺激訊息的活性分析中，衍生 吊健康人供體D"之τ細胞增殖活性，係將各種人類抗
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五、發明說明（50) 人類A I L I Μ单株抗體溶液（液相），單獨加到覆蓋有抗人 類CD3單株抗體的微量盤而分析。 縱軸表示細胞中併入[3 Η ]胸每的量，作為細胞增殖程 度的指標；橫轴表示人類抗人類AILIM單株抗體，之濃产。 在此圖中’ π抗-KHL"表示使用人類抗-KHL單株抗體作 為陰性對照組’以取代人類抗人類AIL IΜ單株抗體之分析 結果。 其他的標記如下： π128"人類抗人類AILIM單株抗體:^讣丨^。 Η135π人類抗人類AILIM單株抗體1讣135。
"136"人類抗人類AILIM單株抗體jmabi36。 第38圖顯示在傳遞共同刺激訊息的活性分析中，衍生 自正常健康人"供體D"之T細胞增殖活性，係將各種人類抗 人類AILIM單株抗體溶液（液相）’單獨加到覆蓋有抗人 類CD3單株抗體的微量盤而分析。 縱軸表示細胞中併入[3 Η ]胸脊的量，作為細胞增殖程 度的指標；橫轴表示人類抗人類AILIM單株抗體之濃度。 在此圖中，"抗-KHL"表示使用人類抗—KHL單株抗體作 為陰性對照組’以取代人類抗人類A〗L〗M單株抗體之分析 結果。
其他的標記如下： Π137"人類抗人類AILIM單株抗體jnjabl37。 "138"人類抗人類AILIM單株抗體jjuabl38。 "139"人類抗人類AILIM單株抗體jMabl39。
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第3 9圖顯示在傳遞共同刺 自正常健康人"供趙D"之心；殖m分析中，衍生 人類AILIM單株抗體溶液（液θ ，，係將各種人類抗 類CD3單株抗體的微量盤’早獨加到覆蓋有抗人 縱軸表示細胞中併入「3 JIΊ故过 曰 度的指標；橫軸表示人類抗人作為細胞增殖程 』 頰柷人類AIL!M單株抗體之濃度。 在此圖中，抗-KHL"表示使用人類抗 為陰性對昭组，以敌冲又絲以 網仇ML早株抗體作 II f 卩取代人類抗人類AILIΜ單株抗體之分析 其他的標記如下：
:140"人類抗人類^!^“單株抗體JMabl4〇。 141人類抗人類AILIM單株抗體jujabMl。 第40圖顯示在衍生自正常健康人"供體B"之了細胞的培 養七清液中所產生的IFN_r的量，細胞是培養在覆蓋有老 鼠抗人類AILIM單株抗體以及抗人類CD3單株抗體之微量盤 中。 縱軸顯示IFN- 7的濃度’橫軸顯示老鼠抗人類AILI]tf 單株抗體的濃度。 在此圖中’ "JHCln表示使用抗人類CETP單株抗體作為 陰性對照組’以取代老鼠抗人類AI l IΜ單株抗體之分析結 果。 第41圖顯示在衍生自正常健康人•，供體B”之τ細胞的培 養上清液中所產生的IFN- r的量，細胞是培養在覆蓋有人 類抗人類AILIM單株抗體以及抗人類CD 3單株抗體之微量盤
2125-3981-PF.ptd 第55頁 1304811 五、發明說明（52) 中。 „縱軸顯示1FN_T的濃度，橫轴顯示老鼠抗人類AILIM 早株抗體的濃度。 在此圖中，"抗-KHL"表不使用人類抗^^壯單株抗體作 為陰性對照組，以取代人類抗人類AILIM單株抗體之分析 結果。 第42圖顯示在衍生自正常健康人"供體B"之τ細胞的培 ，上清液中所產生的IFN— 7的量，細胞是培養在覆蓋有人 2抗人類AILIM單株抗體以及抗人類CD3單株抗體之微量盤 縱軸顯示IFN-r的濃度，橫轴顯示老鼠抗人類“。^^ 皁株抗體的濃度。 & w ^此圖中，抗-KHL’表示使用人類抗— KHL單株抗體作 ^性對照組，以取代人類抗人類AILIM單株抗體之分析 =43圖顯不在何生自正常健康人"供體之丁細胞的培 窟浐：產”产的!FN~7的量，細胞是培養在覆蓋有老 中: M単株抗體以及抗人類CD3單株抗體之微量盤 縱軸顯示IFN r的濃度’橫轴顯示老鼠抗人類ailim 皁株抗體的濃度。 在此圖中，"JHC1”表示使用抗人類CETp單株抗體作為 去'對照組’以取代老鼠抗人類A丨L丨M單株抗體之分析結 果。 第56頁 2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（53) 第44圖顯示在衍生自正常健康人"供體c，，之τ細胞的培 養上清液中所產生的IF N-r的量，細胞是培養在覆蓋有人 類抗人類A I L I Μ單株抗體以及抗人類CD3單株抗體之微量盤 中。 縱轴顯示IFN- r的濃度，橫軸顯示老鼠抗人類八丨!^^ 單株抗體的濃度。 在此圖中，"抗-KHL"表示使用人類抗_KHL單株抗體作 為陰性對照組，以取代人類抗人類A丨L丨Μ單株抗體之分析 結果。 其他的標記如下： ”124"人類抗人類AILIM單株抗體JMabl24。 "126π人類抗人類AILIM單株抗體JMabl26。 "127"人類抗人類AILIM單株抗體JMabl27。 第45圖顯示在衍生自正常健康人"供體c"之τ細胞的培 養上清液中所產生的IFN-r的量，細胞是培養在覆蓋有人 類抗人類AILIM單株抗體以及抗人類CD3單株抗體之微量盤 中。 縱軸顯示IFN- r的濃度，橫軸顯示老鼠抗人類AILIM 單株抗體的濃度。 在此圖中，”抗-KHL"表示使用人類抗-KHL單株抗體作 為陰性對照組，以取代人類抗人類A I L IΜ單株抗體之分析 結果。 其他的標記如下： "128π人類抗人類AILIM單株抗體JMabl28。
2125-3981-PF.ptd 第57頁 1304811 五、發明說明（54) "135"人類抗人類AILIM單株抗體JMabl35。 ” 136”人類抗人類AILIM單株抗體JMabl36。 第46圖顯示在衍生自正常健康人”供體c"之τ細胞的培 養上清液中所產生的IFN- r的量，細胞是培養在覆蓋有人 類抗人類AILIM早株抗體以及抗人類CD3單株抗體之微量盤 中。 縱軸顯示IF N - 7的濃度，橫軸顯示老鼠抗人類A丨L j μ 單株抗體的濃度。 在此圖中，”抗-KHL”表示使用人類抗-KHL單株抗體作
為陰性對照組’以取代人類抗人類AI l IΜ單株抗體之分析 結果。 其他的標記如下： "137"人類抗人類AILIM單株抗體JMabl37。 "1 38 ”人類抗人類a I LIΜ單株抗體JMab 1 3 8。 "139"人類抗人類AILIM單株抗體JMabl 39。 第47圖顯示在衍生自正常健康人"供體c”之τ細胞的培 養上清液中所產生的IFN-γ的量，細胞是培養在覆蓋有人 類抗人類AILIM單株抗體以及抗人類CD3單株抗體之微量盤 中〇
縱軸顯示IFN- τ的濃度，橫軸顯示老鼠抗人類AILIM 單株抗體的濃度。 、 在此圖中，π抗-KHLn表示使用人類抗_KHL單株抗體作 為陰性對照組’以取代人類抗人類A〗L丨Μ單株抗體之分析 結果。
1304811 五、發明說明（55) 其他的標記如下： "140π人類抗人類AILIM單株抗體JMabl40。 "14Γ人類抗人類AILIM單株抗體JMabl41。 第48圖顯示T細胞增殖的抑制效果，係藉由各種混合 淋巴球反應（MRL )的T細胞增殖試驗中之測試樣品，將正 常健康人π供體A"之T細胞與正常健康人"供體D"之PBMC培 養。 縱軸顯示併入[3 Η ]胸苷的量，作為顯示細胞增殖程度 的指標；橫軸表示測試樣品之濃度。 在圖示中的每個說明顯示如下： "CD80 + 86":抗CD80抗體及抗CD86抗體的混合物。 "mlgGl":抗人類CD34/IgGl老鼠單株抗體。 "CTLA4-Ig":人類CTLA4-IgFc 嵌合分子。 "SA12":抗人類AILIM老鼠單株抗體。 第4 9圖顯示T細胞增殖的抑制效果，係藉由各種混合 淋巴球反應（MRL )的τ細胞增殖試驗中之測試樣品，將正 常健康人"供體Απ之T細胞與正常健康人"供體D"之pBMC培 養。 縱軸顯示併入[3H]胸苷的量，作為顯示細胞增殖程度 的指標；橫軸表示測試樣品之濃度。 & 在圖示中的每個說明顯示如下： "抗-KHL ，人類抗-KHL單株抗體，作為陰性對昭組。 "JMab-124"人類抗人類八以以單株抗體JMabi24’:、、 ，，126"人類抗人類八^^單株抗體JMabl26。
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"127"人類抗人類AILIM單株抗體^礼127。 "128"人類抗人類AILIM單株抗體川礼128。 135人類抗人類AILIM單株抗體1&1)135。 "136"人類抗人類AILIM單株抗。 "137"人類抗人類AILIM單株抗。 第50圖顯示T細胞增殖的抑制效果，係藉由各種混合 淋巴球反I應（MRL )的T細胞增殖試驗中之測試樣品，將正 常健康人供體D”之T細胞與正常健康人"供體B"之pBMC饵 養。 ° 縱轴顯示併入[3Η]胸苷的量，作為顯示細胞增殖程度 的指標；橫軸表示測試樣品之濃度。 在圖示中的每個說明顯示如下： "CD80 + 86n :抗CD80抗體及抗CD86抗體的混合物。 "mlgGl":抗人類CD34/IgGl老鼠單株抗體。 "CTLA4-Ig” ：人類CTLA4-IgFc 嵌合分子。 "SA12":抗人類AILIM老鼠單株抗體。 第5 1圖顯示T細胞增殖的抑制效果，係藉由各種混合 淋巴球反應（MRL )的T細胞增殖試驗中之測試樣品，將正 常健康人'供體D’1之T細胞與正常健康人”供體B"之讲 養。 。 縱軸顯示併入PH]胸苷的量，作為顯示細胞增殖 的指標；橫轴表示測試樣品之濃度。 又 在圖示中的每個說明顯示如下： "抗-KHL":人類抗-KHL單株抗體，作為陰性對照組
2125-3981-PF.ptd 第60頁 1304811 發明說明（57) • JMa?-124n人類抗人類ailim單株抗體JMabl24。 126’人類抗人類AILIM單株抗體jMabl26。 ”127"人類抗人類AILIM|株抗體JMabl2?。 "128人類抗人類Ailim單株抗體^❶^^。 ’135人類抗人類ailim單株抗體JMabl35。 "136人類抗人類AILIM單株抗體jMabl36。 "137人類抗人類AILIM單株抗體JMabl37。 第52圖顯示τ細胞增殖的抑制效果，係藉由各種混合 淋巴球反應（MRL )的T細胞增殖試驗中之測試樣品，將正 常健康人1供體Cn之了細胞與正常健康人"供體A"之pBMC培 養。 縱韩顯不併入p Η ]胸苷的量，作為顯示細胞增殖程度 的指標；橫軸表示測試樣品之濃度。 在圖示中的每個說明顯示如下： nCD80 + 86":抗CD80抗體及抗CD86抗體的混合物。 "mlgGl":抗人類CD34/IgGl老鼠單株抗體。 "CTLA4-Ig":人類CTLA4-IgFc 嵌合分子。 "SA12":抗人類AILIM老鼠單株抗體。 第53圖顯示T細胞增殖的抑制效果，係藉由各種混合 淋巴球反應（M R L )的T細胞增瘦試驗中之測試樣品，將正 常健康人"供體c"之τ細胞與正常健康人"供體Α"之PBMC培 養。 縱軸顯示併入[3 Η ]胸苷的量，作為顯示細胞增殖程度 的指標；橫軸表示測試樣品之濃度。
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在圖示中的每個說明顯示如下： "抗-KHL":人類抗-KHL單株抗體，作為陰性對照組。 "JMab-124"人類抗人類AILIM單株抗體JMabl24。' 。 "126”人類抗人類AILIM單株抗體jMabl26。 ”127”人類抗人類AILIM單株抗體jMabl27。 "128”人類抗人類AILIM單株抗體jMabl28。 "135"人類抗人類AILIM單株抗體jMabl35。 ” 136π人類抗人類AILIM單株抗體jMabl36。 ”137”人類抗人類AILIM單株抗體jMabl 37。 第54圖顯示T細胞增殖的抑制效果，係藉由各種混合 淋巴球反應（MRL )的T細胞增殖試驗中之測試樣品，將正 常健康人''供體E"之T細胞與正常健康人"供體G"之pBMC培 養。 縱轴顯示併入[3H]胸苷的量，作為顯示細胞增殖程度 的指標；橫軸表示測試樣品之濃度。 在圖不中的每個說明顯示如下： "對照m I gG":抗人類CD34/ I gG 1老鼠單株抗體。 "CD80 + 86Ab” ：抗CD80抗體及抗CD86抗體的混合物。 "SA1 2":抗人類AILIM老鼠單株抗體。 "CTLA4-Ig":人類CTLA4-IgFc 嵌合分子。 第5 5圖顯示T細胞增殖的抑制效果，係藉由各種混合 淋巴球反應（MRL )的T細胞增殖試驗中之測試樣品，將正 常健康人11供體Επ之T細胞與正常健康人"供體G”之pBMC培 養。
2125-3981.PF.ptd 第62頁 1304811
縱軸顯示併入[3H]胸苷的量，作為顯示細胞增殖程度 的指標；橫軸表示測試樣品之濃度。 在圖示中的每個說明顯示如下： "抗-KHL":人類抗-KHL單株抗體，作為陰性對照組。 ”JMab-136”人類抗人類AILIM單株抗體JMabl36。 "138"人類抗人類AILIM單株抗體JMabl38。 "139"人類抗人類AILIM單株抗體JMabl39。 π140"人類抗人類AILIM單株抗體JMabl40。 "141"人類抗人類AILIM單株抗體JMabl41。 第56圖顯示T細胞增殖的抑制效果，係藉由各種混合 淋巴球反應（M R L )的T細胞增殖試驗中之測試樣品，將正 常健康人11供體Fn之丁細胞與正常健康人"供體ε"之PBMC培 縱軸顯示併入[3 Η ]胸苷的量，作為顯示細胞增殖程度 的指標；橫軸表示測試樣品之濃度。 在圖示中的每個說明顯示如下： "對照mlgG” ：抗人類CD34/IgGl老鼠單株抗體。 "CD80 + 86Ab":抗CD80抗體及抗CD86抗體的混合物。 "S A1 211 ··抗人類A I L I Μ老鼠單株抗體。 "CTLA4-Ig":人類CTLA4-IgFc 故合分子。 第5 7圖顯示T細胞增殖的抑制效果，係藉由各種混合 淋巴球反應（MRL )的T細胞增殖試驗中之測試樣品，將正 常健康人"供體F"之T細胞與正常健康人”供體E'1之PBMC培 養0
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縱轴=示併入PH]胸苷的量，作為顯示細胞增殖程度 的指標；橫軸表示測試樣品之濃度。 在圖示中的每個說明顯示如下： ”抗-KHL” ：人類抗— KHL單株抗體，作為陰性對照組。 :JMa?-136"人類抗人類AILI1^株抗體JMabU6。 "1 38"人類抗人類AILIM單株抗體JMabl 38。 "139"人類抗人類AILIM單株抗體JMabl39。 π 140π人類抗人類AILIM單株抗體JMabl40。 Π14Γ人類抗人類AILIM單株抗體jMabl41。 第58圖顯示T細胞增殖的抑制效果，係藉由各種混合 淋巴球反應（M R L )的T細胞增殖試驗中之測試樣品，將正 常健康人"供體G"之Τ細胞與正常健康人"供體F"之PBMC培 養。 縱軸顯示併入[3Η ]胸苷的量，作為顯示細胞增殖程度 的指標；橫軸表示測試樣品之濃度。 在圖示中的每個說明顯示如下： "對照mlgG” ：抗人類CD34/IgGl老鼠單株抗體。 "CD80 + 86Ab":抗CD80抗體及抗CD86抗體的混合物。 "SA12":抗人類AILIM老鼠單株抗體。 "CTLA4-Ig” .人類分子。 第5 9圖顯示T細胞增殖的抑制效果，係藉由各種混合 淋巴球反應（MRL )的T細胞增殖試驗中之測試樣品，將正 常健康人"供體G”之T細胞與正常健康人"供體F"之PBMC培
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縱轴顯示併入PH]胸苷的量，作為顯示細胞增殖 的指標；橫轴表示測試樣品之濃度。 X 在圖示中的每個說明顯示如下： "抗-KHL":人類抗-KHL單株抗體，作為陰性對照組。 "JMab-136"人類抗人類^[^祕單株抗體JMaM36二〜° ”138"人類抗人類AILIM單株抗體1礼138。 "139"人類抗人類AILIM單株抗體“扑丨”。 "140"人類抗人類八丨以肘單株抗體JMabl4〇。 π141”人類抗人類AIUM單株抗體JMabl41。 第60圖顯示各種對照樣品對於利用混合淋巴球反應 (MRL )的分析中之T細胞增殖的抑制作用。正常健康人" 供體A"之T細胞與正常健康人"供體D„ iPBMCs共同培養， PBMCs是與含有人類CTLA4-IgFc的嵌合分子預先培養。 縱軸顯示細胞中併入pH]胸苷的量，作為細胞增殖程 度的指標，橫軸表示測試物質之濃度。 在圖示中的每個說明顯示如下： CD80 + 861':抗CD80抗體及抗CD86抗體的混合物。 對照mlgGl":抗人類CD34/IgGl老鼠單株抗體。 "SA12” ：抗人類AILIM老鼠單株抗體。 第61圖顯示各種對照樣品對於利用混合淋巴球反應 (MRL )的分析中之τ細胞增殖的抑制作用。正常健康人,， 供體A"之T細胞與正常健康人供體D"之pBMCs共同培養， PBMCs是與含有人類CTLA4—^以的嵌合分子預先培養。 縱軸顯不細胞中併入[3 Η ]胸苷的量，作為細胞增殖程
2125-3981-PF.ptd 第65頁 1304811 五、發明說明（62) 度的指標；橫轴表示測試物質之濃度。 在圖示中的每個說明顯示如下： 抗-KHL ·人類抗-KHL單株抗體’作為陰性對照組。 "JMab-124"人類抗人類AILIM單株抗體JMabl24。 "126π人類抗人類AILIM單株抗體jjjabl26。 "127"人類抗人類AILIM單株抗體jMabl27。 128人類抗人類AILIM%株抗體jMabl28。 "135”人類抗人類AILIM單株抗。 "136"人類抗人類AILIM單株抗體jMabl36。 "137"人類抗人類AILIM單株抗體jMabl37。 第6 2圖顯示各種對照樣品對於利用混合淋巴球反應 (MRL )的分析中之T細胞增殖的抑制作用。正常健康人” 供體D”之T細胞與正常健康人"供體B"之PBMCs共同培養， PBMCs是與含有人類CTLA4-IgFc的嵌合分子預先培^。 縱轴顯示細胞中併入PH]胸苷的量，作為細^增殖程 度的指標；橫軸表示測試物質之滚度。 在圖示中的每個說明顯示如下： "CD80 + 86” ：抗CD80抗體及抗(：!)86抗體的混合物。 ”對照mlgGl":抗人類CD34/IgGl老鼠單株抗體。 "SA12":抗人類AILIM老鼠單株抗體。 第63圖顯不各種對照樣品對於利用混合淋巴球反應 (MRL )的分析中之τ細胞增殖的抑制作用。正常健康又” 供體D"之T細胞與正常健康人”供體B” ipMCs共同培養， PBMCs是與含有人類CTLA4_IgFc的嵌合分子預先培養。 2125-3981-PF.ptd 第66頁 1304811 發明說明（63) 縱轴顯示細胞中併入[3H]胸苷的量，作為細胞增殖程 度的指標，橫軸表示測試物質之濃度。 在圖示中的每個說明顯示如下： "抗-KHL":人類抗-KHL單株抗體，作為陰性對照組。 ” JMab-124”人類抗人類AIUM單株抗體1吡124。 ”126”人類抗人類八11^^|單株抗體JMaM26。 "127"人類抗人類AILIM單株抗體JMabl2?。 π128"人類抗人類AILIM單株抗體；^31)128。 "135"人類抗人類AILIM單株抗體“❶丨“。 "136"人類抗人類AIlim單株抗體了|^!3136。 "137"人類抗人類AilIM單株抗體jMabl37。 第64圖顯示各種對照樣品對於利用混合淋巴球反應 (MRL )的分析中之了細胞增殖的抑制作用。正常健康人" 供體C"之T細胞與正常健康人”供體A„之pBMCs共同培養， PBMCs是與含有人嵌合分子預先培養。 縱^顯示細胞中併入PH]胸苷的量，作為細胞增殖程 度的指標；橫軸表示測試物質之濃度。 在圖示中的每個說明顯示如下： "CD80 + 86":抗CD80抗體及抗CD86抗體的混合物。 ”對照mlgGl” ：抗人類CD34/IgG1老鼠單株抗體。 "SA12":抗人類AILIM老鼠單株抗體。 第65圖顯示各種對照樣品對於利用混合淋巴球反應 (MRL )的分析中之τ細胞增殖的抑制作用。正常健康人,， 供體Cn之T細胞與正常健康人"供體A” iPBMCs共同培養，
1304811 五、發明說明（64) PBMCs是與含有人類CTLA4-IgFc的嵌合分子預先培養。 縱軸顯示細胞中併入[3H]胸苷的量，作為細胞增殖程 度的指標；橫轴表示測試物質之濃度。 在圖示中的每個說明顯示如下： 抗-KHL ‘人類抗-KHL單株抗體，作為陰性對照組。 nJMab-124n人類抗人類AILIM單株抗體JMabl24。 n126”人類抗人類AILIM單株抗體JMabl26。 π127"人類抗人類AILIM單株抗體JMabl27。 ”128"人類抗人類AILIM單株抗體JMabl28。 ”135”人類抗人類AILIM單株抗體JMabl35。 "136”人類抗人類AILIM單株抗體JMabl36。 π137”人類抗人類AILIM單株抗體JMabl37。 第66圖顯示各種對照樣品對於利用混合淋巴球反應 (MRL )的分析中之τ細胞增殖的抑制作用。正常健康人” 供體E”之T細胞與正常健康人"供體G"之pBMCs共同培養， PBMCs是與含有人類CTLA4_ IgFc的嵌合分子預先培 縱軸顯示細胞中併入[3H ]胸苷的量，作為細胞增殖程 度的指標；橫軸表示測試物質之濃度。 在圖示中的每個說明顯示如下： •對照mlgG” ：抗人類CD34/IgGl老鼠單株抗體。 , CD80 + 86Abn :抗CD80抗體及抗CD86抗體的混合物。 "SA12":抗人類AILIM老鼠單株抗體。 第67圖顯示各種對照樣品對於利用混合淋巴球反應 (MRL )的分析中之τ細胞增殖的抑制作用。正常健康
1304811 發明說明（65) 供體E”之T細胞與正常健康人”供體G"之PBMCs共同培養， PBMCs是與含有人類CTLA4-IgFc的嵌合分子預先培養。 縱軸顯示細胞中併入[3H]胸苷的量，作為細胞增殖程 度的指標；橫軸表示測試物質之濃度。 在圖不中的每個說明顯示如下： n抗-K H L":人類抗-K H L單株抗體，作為陰性對照組。 ” JMab-136”人類抗人類AILIM單株抗體JMabl36。 "138"人類抗人類AILIM單株抗體jMabl38。 "139”人類抗人類AILIM單株抗體jMabl39。 "140”人類抗人類AILIM單株抗體jMabl4〇。 "141"人類抗人類AILIM單株抗體jMabl41。 第6 8圖顯示各種對照樣品對於利用混合淋巴球反應 (MRL )的分析中之T細胞增殖的抑制作用。正常健康人” 供體G"之T細胞與正常健康人”供體f”之pBMCs共同培養， PBMCs是與含有人類CTLA4-IgFc的嵌合分子預先培養。 縱軸顯示細胞中併入PH]胸苷的量，作為細胞增殖程 度的指標；橫軸表示測試物質之濃度。 在圖示中的每個說明顯示如下： "對照mlgG” ：抗人類0034/18(；1老鼠單株抗體。 ” CD80 + 86Abn :抗CD80抗體及抗CD86抗體的混合物。 "SA12":抗人類AILIM老鼠單株抗體。 第6 9圖顯示各種對照樣品對於利用混合淋巴球反應 URL )的分析中之τ細胞增殖的抑制作用。正常健康人" 供體G"之T細胞與正常健康人"供體F"之pBMCs共同培養，
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PBMCs是與含有人類CTLA4-IgFc的嵌合分子預先培養。 縱軸顯示細胞中併入[3H]胸苷的量，作為細^增殖程 度的指標’橫轴表示測試物質之濃度。 在圖示中的每個說明顯示如下： 抗-KHL":人類抗-KHL單株抗體，作為陰性對照組。 :JMa广136”人類抗人類AILIM單株抗體JMabl36。、 138人類抗人類AIlim單株抗體JMabl38。 "139"人類抗人類AILIM單株抗。 140人類抗人類ailim單株抗體JMabl40。 141人類抗人類AILIM單株抗體JMabl41。 第7〇圖顯示各種人類抗人類^!^^單株抗體及對照抗 體之誘導ADCC的活性，其中野生型CH〇細胞是使用作為枰 的細胞。 ^ 縱轴表示由抗體之誘，ADCC的活性所引起之細胞毒性 的比率；橫軸表示抗體的濃度。 第71圖顯示各種人類抗人類八丨^祕單株抗體及對照抗 體之誘導ADCC的活性’其中大量表現人類AIUM的重組CH〇 細胞是使用作為標的細胞。 縱轴表示抗體之誘導ADCC的活性所造成的細胞受損之 頻率j橫軸表示抗體的濃度。 、 第72圖顯示抗AILIM抗體對於延遲過敏症之抑制效 果。 t a縱t表示所測量的紅色大小’作為延遲過敏症開始的 才曰軚，杈軸表示給予動物患者之測試樣品的類型。
1304811 五'發明說明（67) 第7 3圖顯示在測定欠你，μ & ^ ^ 疋各種人類抗人類AILIM單株抗體誘
導共同刺激訊息的活性分祕由，描工τ A 丨王刀析中，猴子T細胞之增殖活性， 係使用覆蓋有人類抗人魅ΑΤΤΤΜ留·ϋ·ί·>·ΛΑ „ 八類AILIM早株抗體以及抗人類cd3單 株抗體的微量盤而分;j：斤。 縱軸顯示細胞中供λ「3II Ί nA n $ T 1开入L3H]胸甘的量，作為細胞增殖程 度的1旨標；橫軸表示人類抗人類AIUM單株抗體之濃度。 此圖中，杬-KHL”表示使用人類抗_KHL單株抗體作 為陰性對照組，以取代人艏抒X相Λ T T T丨丨w ^代人頬抗人類A IL I Μ單株抗體之分析 結果。 第7 4圖顯示陰性對照抗體對抗各種濃度的可溶性 AILIM 配體（hB7h-IgFc)及可溶性 AILIM (AILIMIgFc) 間的結合之抑制活性。 縱軸顯不吸光值，作為抑制活性的指標；橫軸表示可 溶性AILIΜ的濃度。 第7 5圖顯示抗AILIΜ抗體對抗各種濃度的可溶性Α丨[j Μ 配體（hB7h-IgFc)及可溶性八^" (AIUM_IgFc)間的結 合之抑制活性。 縱軸顯示吸光值，作為抑制活性的指標；橫軸表示可 溶性AILIΜ的濃度。 第7 6圖顯示各種濃度的抗a I l I Μ抗體，對抗可溶性 AILIM 配體（hB7h-IgFc)及可溶性^^糾（AILIM_IgFc) 間的結合之抑制活性。 縱軸顯示吸光值’作為抑制活性的指標；橫軸表示可 溶性AI L IΜ的濃度。
2125-3981-PF.ptd $ 71頁 1304811 五、發明說明（68) 第7 7圖顯示在測定傳遞共同刺激訊息的活性分析中， 各種人類抗人類A I L I Μ單株抗體對於人類T細胞增殖之抑制 活性’係使用覆蓋有可溶性人類AILIM配體（hB7h-IgFc ) 以及抗人類CD3單株抗體的微量盤而分析。 縱轴顯示細胞中併入[3Η ]胸昏的量，作為細胞增殖程 度的指標；橫軸表示抗體之濃度。 第7 8圖顯示在測定傳遞共同刺激訊息的活性分析中， 各種人類抗人類AILIM單株抗體對於猴子τ細胞增殖之抑制 活性，係使用覆蓋有可溶性人類AI LIM配體（^7卜〖Μ。） 以及抗人類CD3單株抗體的微量盤而分析。 縱軸顯示細胞中併入[3H]胸苷的量，作為細胞增殖 度的指標；橫軸表示抗體之濃度。 發明詳述 本發明以下將藉由定羲名詞而詳細地說明。 此處之’’哺乳動物’’是指人類、牛、山羊、兔子、老 鼠、大鼠、倉鼠以及天竺鼠；較佳是人類、兔子、大 倉鼠或老鼠；特別較佳是人類、大鼠、倉鼠或老鼠。 此處所使用之名詞”除了人類以外的哺乳動物"及"非 人類的哺乳動物'，是互相同義的，是指定義如上之除了人 類以外的所有哺乳動物。 此處所使用之名詞"胺基酸"是指每個天然存在的胺基 酸；較佳是根據字母次序的三字母系統或單字母系統所說 明之胺基酸，如下所示：
2125-3981-PF.ptd 第72頁 1304811 五、發明說明（69) 甘胺酸（Gly/G);丙胺酸（Ala/A);纈胺酸 (Val/V );白胺酸（Leu/L );異白胺酸（iie/i );絲 胺酸（Ser/S );息寧胺酸（Thr/T );天門冬胺酸 (Asp/D);麩胺酸（Glu/E);天門冬醯胺（Asn/N); 麩胺酸醯胺（Gln/Q);離胺酸（Lys/L);精胺酸 (Arg/R);半胱胺酸（Cys/C);甲硫胺酸（Met/M); 苯丙胺酸（Phe/F);酪胺酸（Tyr/Y);色胺酸（Trp/W );組胺酸（His/H);脯胺酸（pro/p)。 此處所使用之名詞"A I [ ΐΐζ)是活化可誘導之淋巴球免 疫調節分子的簡寫’係指具^如先前報告所述之結構及功 能的哺乳動物細胞表面分子；特別更佳是衍生自人類的 AILIM (例如 ’Inti. Immunology, 12(1):51-55， GenBank 登錄號：BAA821 29 (人類）、BAA821 28 (大鼠 )、BAA82 1 27 (大鼠變種）以及BAA82126 (老鼠））。 可選擇地’這個AILIM也稱為IC0S (未審查公開之日 本專利申請案（JP-A)Hei 11-29599號；國際專利申請案 W098/38216 )，這些簡寫代表相同的分子。 此處所使用之名詞"AILIΜ配體”是指與該共同刺激分 子AILIM (IC0S)交互作用之細胞表面分子，並且稱為 B7h 、B7RP-1 、GL50 或LICOS (Nature， 402(6763):827-832 ’ 1999 ; Nature Medicine 5(12):1365-1369 * 1999 » J. Immunology 164:1653-1657 ’2000 ;Curr. Bi〇l. 10(6):333-336 ， 2000 )。
2125-3981-PF.ptd 第73頁 1304811 五、發明說明（70) 此外’此處所使用的” AILIM"也包括實質上具有相同 於在參考文獻中說明的每個哺乳動物之AILIM的胺基酸序 列之多多胜肽’特別較佳是具有相同於人類人丨LI Μ的胺基 酸序列之多胜肽。此外，已報導相似於大鼠AIL IΜ變異體 (GenBank登錄號：ΒΑΑ821 27 )之人類AILIM變異體，也包 括在本發明之"AILIM"内。 此處所使用的"AILIM配體"也定義為具有如上所述之 相同意義。 此處’"具有基本上相同胺基酸序列之多胜肽"是指如 下所述之變異體多胜肽。 也就是’只要這些變異體多胜肽具有基本上相當於天 然形式的AILIΜ之生物性質（特別較佳是衍生自人類的 AILIM) ’就是本發明之多胜肽。像是具有天然形式的 AILIM之胺基酸序列的多胜肽，其中複數的胺基酸殘基被 刪除及/或修飾，較佳是1到1 〇個胺基酸殘基，最佳是1到5 個胺基酸殘基；以及有複數的胺基酸殘基加入，較佳是1 到1 0個胺基酸殘基，最佳是1到5個胺基酸殘基。 此外，它們可以是在分子中具有複數胺基酸殘基的取 代、刪除、修飾及加入之變異體多胜肽。 本發明之AILIM配體也定義為具有如上所述之相同 意義。 除了基因重組技術之外，本發明之A I l IΜ (特別是人 類AILIM)及AILIM配體（特別是人類AILIM配體）也可藉 由適當地使用在此技藝領域中所熟知的方法而製備，例 2125-3981-PF.ptd 第74頁 1304811 五、發明說明（71) _ __ 如，化學合成法、細胞培養法等，或β、 這樣的胺基酸之取代、删除或^疋這些方法的修飾。 法而達成（實驗醫學：增刊，"、杳席入’可根據一般的方 )。 4傳工程手冊"，1 992等等 用於製造上述突變的多胜肽之方法 寡核苷酸定點致突變法（缺口雙股法’）的例子，是合成的 由以亞硝酸鹽或亞硫酸鹽處理，:隨’點突變法’係藉 突變是以Bal 31酵素及類似物所製備的方導入點突變；缺失 法；連接子掃描法；遺失併入法； 法;卡E致突變
片段合成法等等。 配對引子法；DNA 合成的寡核苷酸定點致突變法（缺口 例如，以下的方法而實施。將想要 =法）可由， 安伯突變的MU嗟菌體載體中，以製 二域選：:具有 沒有安伯突變的載體之RF ! DNA藉由“2DNA。在 線形化之後，綱A與上述單股嗟菌細J合酵素處理而 回，藉此形成"缺口雙股DNA "。導入至突 變陡並煉 核苷酸是與缺口雙股的DNA雜合，以及閉環的J二成二募 := 有合接合酶反應而製備。將大腸桿菌二s i 的錯誤配對修補活性）是以這侧A而轉 办將沒有抑制活性的大腸桿菌細胞以 染，並且僅筛選沒有安伯突變的嗟菌體。 函體感 以亞確酸鹽導入點突變之方法，係利用例如，以 說=的原理。如果DNA是以亞硝酸鹽處理的話，則驗基是 去胺基化’以將腺嘌呤換成次黃嘌呤，將胞嘧啶換成尿^
1304811 五、發明說明（72) 啶，以及將鳥嘌呤換成黃嘌呤。如果去胺基化的DNA導入 至細胞中的話，則"A : T"及"G : C"分別是以"G : C"及"A : T"而取代，因為再DNA的複製中，次黃嘌吟、尿嘴咬及黃 嘌呤分別會與胞嘧啶、腺嘌呤及胸嘧啶形成鹼基對。事實 上’以亞硝酸鹽處理的單股DNA片段是與”缺口雙股的DNA'， 雜合’之後，藉由相同於合成的募核苷酸定點致突變法 (缺口雙股法）之操作方式，而分離突變株。 此外，此處的"A I LIM”也包括該AILIΜ的"一部份·，。此 處的"一部份"是指包括以上定義的AILΙΜ胺基酸序列之任 何部份序列的多胜肽。 本發明之AILIM配體"也定義為具有如上所述之相同 意義。 該AILIM的"部份"（較佳是AILIM的細胞外區域或其任 何部份），可根據如下所述在此技藝領域中所熟知的方法 =f備，或根據其修飾的方法，藉由遺傳重組技術或或化 =合成法，或藉由適當地切割由使用蛋白分解酵素等的細 培養所分離之AILIΜ (特別較佳是人類A丨L丨M )而製備。 AILIΜ配體的部份"也可藉由上述相似的方法而製 其邱明之"人類抗體"是可結合至以上定義的AILIM或 翻二乃（特別較佳是衍生自人類的AIUM或其部份）1 =體。特別.也，其為衍生自人類的多株抗體（人類多株 ^類抗血清）或衍生自人類的單株抗體（人類單株
1304811 五、發明說明（73) 本發明之"人類單株抗體"是可結合至以上定義的 )之人類单株抗體。 更特別地，包括重鐘（Η絲\ —r a 及輕鏈U鏈）可變區域及d:變區域…區域f 生自編碼該人類免疫球蛋白的基因-之之人所類有區域球構白成。了 鍵的例子是人類/C鏈或人類λ鏈。 、' 可結合至本發明之A ILIΜ (牲2丨丨私a β _ AILIM)或其部份之人類單株尸舻乂疋衍生自人類的 或(84)中杯一 體，是具有上述⑸到⑷） <更特別地，：包括：單株抗體。 種特徵及工業應用性之各種人類單圖示所說明的各 本發明之人類單株抗體的較 至上述（5)到（42)或（84)中任佳；、體^施例，是可結合 人類單株抗體。 疋義的AILIM或其部份之 哺乳動物而製備。 之下列轉殖的非人類 衍生(:)人二=)表:二=』:別較佳是 ⑻-種利用遺傳重組技術製\之二立的，胞株，· 便在細胞表面上表現上述AIUM (特別較佳是街、=自胞人，類以 麵 2125-3981-PF.ptd 第77頁 1304811 五 '發明說明（74) 的AILIM ); (c) 種藉由將上述（3)或（匕）的細胞溶解所彳& (特別較佳是衍生自人類的AiUM); 夕胜肽片奴 (d) —種利用遺傳重組技術製備之遺 T t t Tll!U ( # '，J ^ ^ ^ ^ II ^ΑΙΠΜ Γ ^ „ l 、，父佳是細胞外區域或其任何較佳的胜肽）j 為一可溶性多胜狀； 表見成 卷上Hi藉由培養上述⑷之遺傳重組細胞所得之培 ,清液，或純化自該培養上清液的AILIM (特別較佳θ 人類的MUM)之細胞外區域多胜肽（可溶性饥； (f)化學合成的AILIMC特別較佳是衍生自人 =v。之部份（特別較佳是細胞外區域或其任何較佳的 主"所此Λ，上發3月之單株抗體也可藉由培養"遺傳重組宿 主所侍之培養上清液而獲得[此處，該宿主是除了典 以外的真核細胞（較佳是哺乳動物細胞，例如，中=会Ρ 印巢細!包、淋巴球及骨髓瘤細胞）]，其可利用遺傳重•且鼠 技術，藉由以編碼本發明之人類單株抗體的每個 、、 鏈的cDNAs (較佳是含有該(：1)^5的載體），轉形—宿主至 製備，並且其可產生遺傳重組的人類單株抗體。 而 特別地’本發明之單株抗體可藉由培養說明於上 (6 0 )到（6 2 )或（6 4)到（8 〇 )之遺傳重組的宿主而獲得（^ 2125-3981-PF.ptd 第78頁 1304811
J，該宿主是除了受精印以外的真核細胞（較佳是哺乳動 ))。 倉鼠卵巢細胞、淋巴球及骨髓瘤細胞
此外，本發明之人類單换浐 .τ Γ1 τ Γ9 Τ 頰早株抗體可以是具有屬於IgG (IgGl、IgG2、IgG3 及IgG4 ) 、T a /τ Ν Τ TW τ Ρ AW / S ) 、UA ( IgAl 及 IgA2 )、1^或丨^的任何同型物之人類單株抗體。 更佳 單株抗體是屬於1gG (UGi、IgG2、IgG3及IgG4/ 地是 IgGl、IgG2 或 IgG4。 本發明之人類單株抗體可根據已知常用的製造方法， 藉由以上述（a)到（f)之任何免疫原（抗原），免疫可產生 人類抗體的轉殖非人類哺乳動物（例如，以下說明之產生 人類抗體的轉殖老鼠）而製備。 也就是，例如，該可產生人類抗體的轉殖非人類哺乳 動物，是以該抗原結合弗洛依德氏佐劑作為引發需求而免 疫。多株抗體可從該免疫的動物所收集到的血清而獲得。 單株抗體可藉由從分離自該免疫的動物之該產生抗體的細 胞，以及不具有產生自體抗體能力的骨髓瘤細胞製備融合 細胞（融合瘤），並選殖該融合瘤，以選擇產生該單株抗 體的純種系，其對於免疫哺乳動物所使用的抗原具有專二 性的親和力。 更特別地，單株抗體可如以下之方法而製備。也就 是’該可產生人類抗體的轉殖非人類哺乳動物（特別較佳 是"產生人類抗體的轉殖老鼠”），是藉由將上述（a)到（c) 之任何免疫原’以皮下、肌肉内、靜脈注射到足墊，或一
1304811 五、發明說明（76) ' 次或夕-人的腹臈内注射，或將該免疫原移植到該哺乳動物 而免疫。通常，免疫作用是進行1次到4次，每一次是在第 一次免疫作用後的〗4天進行。產生抗體的細胞可在最後一 次免疫作用之後的大約i到5天，從這樣免疫的哺乳動物中 獲得。免疫作用的頻率及間隔，可根據，例如，所使用的 免疫原之性質，而適當地調整。 分泌人類單株抗體的融合瘤，可藉由K〇hler及
Milstein 的方法（Nature 256:495 -497，1 975 )及其修飾 的方法=製備。簡言之，融合瘤是藉由將包含在脾臟、淋 巴結、骨髓或得自上述免疫之可產生人類抗體的轉殖非人 類哺乳動物中所得到的扁桃腺（較佳是脾臟）之產生抗體 的細胞’與不具有產生自體抗體能力的骨髓瘤細胞（較佳 地’其衍生自哺乳動物，例如，老鼠、大鼠、天竺鼠、倉 鼠、兔子或人類，更佳是老鼠、大鼠或人類）融合而製 備。 例如’可使用衍生自老鼠的骨髓瘤P3/X63_AG8. 653 (ATCC CRL-1 580 ) ' P3/NSI/1 -Ag4-1 (NS-1) > P3/X63-Ag8.Ul (P3U1) 、SP2/0-Agl4 (Sp2/0 ，Sp2)、 NSO、PAI、F0或BW5147 ;衍生自大鼠的骨髓瘤U-266AR1、 GM1500-6TG-A卜2 、UC729-6 、CEM-AGR 、D1R11 或 CEM-T15，以用於細胞融合。 產生單株抗體的細胞（例如，融合瘤），可藉由將細 胞在，例如’微量盤中培養，並藉由測量觀察到融合瘤生 長的槽孔中之培養上清液，對於上述免疫所使用的免疫原
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單株抗體可藉由在活體外或活體内培養融合瘤 如，在老鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠或兔子的腹水；佳β 老鼠或大鼠的腹水；更佳是老鼠的腹水），以及從 = 培養上清液或哺乳動物腹水中分離抗體，而從融合瘤^、 造。 本發明之單株抗體可藉由下述方法而大量製造： (1) 將編碼該單株抗體的每個重鏈及輕鏈之基因 (cDNAs等），從該融合瘤中選殖出來； (2) 將編碼每個重鏈及輕鏈之選殖基因插入個別的載 體或單一的載體中，以製備表現載體； (3) 將該表現載體轉移至所需的非人類哺乳動物（例 如’山羊）之受精卵中； (4 )將帶有該基因的受精卵移植到孕母子宮中，以得 到嵌合的非人類哺乳動物； (5)進一步藉由以另一非人類哺乳動物與該欲合的山 羊交配，可產生具有併入内源性基因之編碼該每個重鏈及 輕鏈的基因之轉殖非人類哺乳動物（牛、山羊、錦旱或豬 );以及 (6 )從該轉殖非人類哺乳動物的乳汁中，可大量得到 衍生自該人類單株抗體基因之單株抗體（N i kke i Science， April， 1997， P.78-84)。
2125-3981-PF.ptd 第81頁 1304811 五 、發明說明（78) 活體外培養產生單株抗體的細胞，可〜 基礎培養液的已知營養培養液或任何營養谇=生自已知 瘤生長、維持及儲存，藉由根據，例如，^墓，使融合 質、試驗研究之目的以及各種培養方法的條=胞的性 在培養上清液產生單株抗體。 表現’以 基礎培養液的例子是低鈣濃度的培養
Ham’ F1 2培養液、位美、游七μ ϋ 曲4如’ 一 t狀MLDB培養液或低鈣濃度的MEM捭 及咼鈣浪度的培養液，例如，MCDB1〇4培 ^液，以 液、D-MEM培養液、RPMI164〇培養液、Asn〇4捭培養 培養液。基礎培養液可根據目的而包含，例如°，血或 爾蒙、細胞激素及/或各種無機或有機物質。 清、荷 單株抗體可從上述培養上清液或腹水中，藉 硫酸氨沈澱、優球蛋白沈澱法、己酸法、辛酸、去飽和的 換層析法（DEAE或DE52)、利用抗免疫球蛋白管杈f子交 質A管柱之親和力層析法而分離並且純化。 3蛋白 本發明之人類單株抗體包括由重鏈及/或輕鏈所組 的人類單株抗體’其每個鏈的胺基酸序列具有一個戍多 胺基酸殘基的刪除、取代或增加。 5夕個 此處之”多個胺基酸殘基"是指複數的胺基酸，特別是 1到1 0個胺基酸殘基’較佳是1到5個胺基酸殘基。 上述之部份修飾（刪除、取代、插入或增加），可藉 由將編碼該胺基酸序列的驗基序列部份改變，而導入至本 發明之人類單株抗體的胺基酸序列中。這個鹼基序列的部 份改變可藉由標準的方法’使用已知的定點突變技術而導
2125-3981-PF.ptd 第82頁 1304811 五、發明說明（79) 入（PNAS， USA 81:5662-5666 ， 1984)。 "轉殖的產生人類抗體之非人類哺乳動物"’較佳具體 實施例特別是產生人類抗體的轉殖老鼠，可根據公開文獻 而製備（Nature Genetics 7:1 3-2 1 ,1 994 ; Nature
Genetics 1 5:1 46-1 56，1 997 ;國際公開號Hei 4-504365 之公告的日本翻譯；國際公開號Hei 7-509137之公告的日 本翻譯；Nikkei Science，june，p.4〇一5〇，1 995 ;國 專利公開號W094/25585 ;Nature 3 68:856 —859 ;以及 ^ 公開號Hei 6-500233之公告的日本翻譯等）。 示 特別地，該產生人類抗體的轉殖老鼠可使用， 以下方法所組成的技術而製備： 如， λ因u ^ i f T *因剔除老鼠其内源性的免疫j求蛋白重赫 (例如，新黴素：= 物耐受性標記基因 重鏈基因的基因座之至少 鼠内源性免疫球蛋白 r Ο N 主I主少邛伤而功能性地失活；
盆 基因剔除老鼠其内源性的免疫破來A 基因（特別是/C鏈基因），是蕤的免疫球蛋白輕鏈 物耐受性椤汴A m , 疋藉由同源重組作用，以—— =耐又性‘ δ己基因（例如，新黴素“樂 内源性免疫ί求“輕鏈基 ：：因]取代老鼠 性地失活； 座之至少一部份而功沾 "月6 (3)製備一轉殖老鼠，苴所 基因座區域，是利用可攜帶；量；白重鏈 ⑽4))7表的載體而併入到老 ⑷製備1殖老鼠 ：色體中，
2125-3981-PF.ptd 第83頁 *的人類免疫球蛋白輕鏈 1304811 五、發明說明（80) 基因座區域（特別是/C鏈基因 g 的酵母人工染色體（YAC ) / ’疋利用可攜帶大量基因 色體中； 代表的载體而併入到老鼠染 (5)製備一轉殖老鼠， 輕鏈基因座均功能性地失活，、内源性的免疫球蛋白重鏈及 順序交配上述（1 )到（4)夕I 以及其染色體是藉由以任意 類免疫球蛋白重鏈。=剔除及轉殖老鼠’而併入人 、+，w 鍵基因座之所需區域。 上述的基因剔除老鼠可 性標記基因（例如，新黴去X據同，原重、，且作用，以一外源 免疫球蛋白基因座的因）·代老鼠内源性 排：。對於利用該同源重組；= ,,(Nikk . 種稱為陽性陰性篩選（PNS )的方 4 ( Uei Science，May, p. 52-62，1 994 )。 免疫球蛋白重鏈基因座的功能性失活，可萨由，例 ^ ’將:損傷導入至J〜或c一區域的一部份（例二c "區 而兀成。並且，免疫球蛋白輕鏈（例如，/c鏈）的功 月b 失活，可藉由，例如，將一損傷導入至卜或c _區域的 一部份’或延伸至J-或C-區域外的區域而完成。 轉殖老鼠可根據一般用以產生轉殖動物的方法而製備 (例如’參見"動物細胞實驗的最新操作手冊"，L〗c出 版，第7章，3 6 1 - 4 0 8頁，1 9 9 〇 )。特別地，例如，衍生自 正常老鼠囊胚的HPRT-陰性（次黃嘌呤—鳥嘌呤磷酸核糖基 轉移酶基因缺陷）ES細胞（胚胎幹細胞），是與含有γ AC 載體的酵母’利用球狀體融合方法而融合，此載體插入有
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編碼該人類免疫球蛋白重鏈基因座或輕鍵基 以及HPRT基因。其老鼠内泝w A 、，斗， 又& 1仍 丹宅虱内源性基因以該外源性基因嵌入的 ES細胞’是藉由HAT篩選方法而篩選。然後，將歸選的^ 細胞微注射至另一正常老鼠所得之受精卵（囊胚 (PNAS, USA 77(12):7380-7384，1 980 ;美國專利第 4’ 8 73, 191號）。將囊胚移植到作為孕母的另一正常老鼠 子宮中。接著，嵌核的轉殖老鼠從該孕母老鼠中出生。 由將嵌核的轉殖老鼠與正常老鼠交配，可獲得異源性的轉 殖老” ”將該異源性的轉殖老鼠互相交配，可根據孟 德爾定律而得到同源性的轉殖老鼠。 本發明所使用之"單株抗體的部份"是指本發明上述單 株抗體的部份區域，特別是包括F(ab，）2、Fab，、Fab、h (抗體的變異片段）、sFv、dsFv(雙硫鍵穩定的Fv)或 dAB (單一功能區域抗體）（Exp. 〇pin. Ther. 6(5) :44卜456，1 996 )。 F(ab )2"及Fab"可藉由將免疫球蛋白（單株抗體） 以-蛋白自（例如’胃蛋白酶及木瓜蛋白酶）處理而製 造，並且是指藉由消化免疫球蛋白靠近兩個重鏈樞紐區域 的雙硫鍵而產生的抗體片段。例如’木瓜蛋白酶切割兩個 重鍵槐紐區域的雙硫鍵上游之IgG，以產生兩個同源抗體 片段，其中L鏈片段包含VL (L鏈可變區）及匕（匕鏈恆定區 )，H鏈片段包含VH (H鏈可變區）及ChT1 (H鏈恆定區中 的γ1區域），是經由雙硫鍵而再其羧基端連結。這樣的 兩個同源抗體片段的每一個都稱為F a b，。胃蛋白酶也切割
1304811 五、發明說明（82) 兩個重鏈樞紐區域的雙硫鍵下游之IgG ’以產生抗體片 '^又 其稍微大於兩個上述F a b在柩紐區域連、纟j；·的片段。此 抗體片段稱為F(ab’）2。 ° 此處的結合速率常數（ka)"是指顯示該單株抗體與 標的抗原的結合強度（結合度）之數值，係根據抗體抗原 的反應動力學而計算。”解離速率常數（kd )"是指顯示該 單株抗體從標的抗原的解離強度（結合度）之數值，"解Λ 離常數（Kd )"是藉由將該”解離速率常數（kd )"除以該π 結合速率常數（ka) 11所得的數值。這些常數是用於表示 該單株抗體與抗原的親和力，以及其中和抗原的活性。 s亥4常數可根據各種方法而分析，並且可利用市售的 分析套組BiacoreX (Amersham Pharmacia)，或根據該套 組所附的操作及實驗方法之相似的套組，而容易地分析。 利用該套組所獲得之ka、kd及Kd數值，是分別以1 /M . 秒、1/秒及Μ (莫耳）單位而表示。較高的^數值表示 強的測試單株抗體之抗原結合活性，較小的以數值 強的抗體之抗原中和活性。 季父 本發明之人類單株抗體包括具有如以下（1)到（3) 的ka、kd及Kd數值之單株抗體： ’ (1) 可結合人類AILIM之人類單株抗體或其部份，具 有秒）或更大的結合速率常數（ka)，、 較佳疋1.0父1〇5(1/诞.秒）或更大。 (2) 可結合人類AILIM之人類單株抗體或其部份，具 有具有1. 0 X 1 〇-4 (丨/秒）或更小的解離速率常數（kd )、
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1304811 五、發明說明（83) " - 較佳是1. 〇 X 10'5 (1 /秒）或更小 (3)對於人類AILIM具有反應性之人類單株抗體或其 部份，具有1·0 X 10-7 (M)或更小解離 是或更小，更佳是uu。/⑴)或二:。 、目丨-3 Π 2子中’每個上述之^、kd &Kd數值會根據在 測置％的各種條件誤差幅度而稍微有變一 是沒有變動的。 1 一奴左个夕 魅1Ί ί二產生單株抗體的細胞"或遺傳重組之產生人 :早株抗體的㈣重組宿主"（此處，該宿主是不包括受 細胞），是指產生上述本發明之人類單株抗體的任 1可細胞。 二：如，其包括說明在以下⑴到(3)的細胞， 但並不限於它們： 斤ίί類單株抗體的Β細胞，係藉由以上述免疫 =(抗原）免疫上述產生人類抗體的轉殖非人動 ’並從該免疫的動物中收集細胞而獲得。 物之(骨2)髓= 衍生自哺乳動 ^之月髓瘤細胞融合’所得到之上述融合細胞（融合瘤 传將(分)離^ : ί之產生人類單株抗體的遺傳重組細胞， 係將刀離自該產生人類單株抗體的Β細胞或 抗體的融合細胞（融人瘤）中 因ί總&舌^ u 廇）中之、為碼β玄人類單株抗體的基 (編馬重鏈的基因或編碼輕鏈的基因 了心胞以外的細胞及融合瘤（例如，CHd=
2125-3981-PF.ptd 第87頁 1304811 五 、發明說明（84) )細胞、BHK (幼倉鼠腎臟）細 細胞）而獲得。 、淋巴球’例如骨髓瘤 簡言之，上述（3 )之遺傳重組 〇〇 遺傳重組細胞，是指由上述（丨） 產生人類單株抗體的 瘤所產生人類單株抗體之遺傳重纟旦=胞或上述（2)的融合 除了上述各種哺乳動物細胞之^ ι 組宿主"中的"宿主，，包括任何非卜，在本發明"遺傳重 豬、綿羊、牛等）&受精卵貝哺乳動* (山羊、 之人類AILIM之單株抗體（較佳是f編碼任何對抗本發明 (編碼重鏈的基因或編碼輕鏈的基因土因 受精印，可獲得本發明之遺傳重組的受精卵。這=該 =受精印可用於製備轉殖動物，以從乳汁中大量 "白質（Nlkkei Science，APri 1，1 997’ ρ·78-84 )。
f 之"•質'特別是，，具有調控由人類AILIM 調即的訊息傳遞之活性之物質"，更特別是"具有抑制表現 AILIM的細胞增殖，或抑制表現AILIM的細胞產生細胞激素 之活性之物質"’是指一天然存在的物質，或人工製備的 任何物質。 此處有關於"與AILIΜ結合的物質"以及"與a I LIΜ配體 、”σ 5的物質’之"物質” ’也指任何天然存在的物質或人工 製備的物質。 此處’ π由A I L I Μ調節的訊息傳遞”是指經由A IL I Μ的訊 息傳遞，導致在表現Α IL IΜ的細胞中之任意表現型的改變 (細胞增殖、細胞活化、細胞失活、細胞凋亡，及/或從
2125-3981*PF,ptd 第88頁 1304811 五、發明說明（85) 表現A IL IΜ的細胞中產生任音*的 —，丨此併"+ * 任忍細胞激素的能力之改變）。 該"物質"主要可分i丨丨$人# , y I C 為蛋白質物質"及"非蛋白質物質 "蛋白質物質"的例子是多胖阽 ^ 姓k胁々W认A M h 肽、抗體（多株抗體、單 株抗體或早株抗體的一部份，转則k y土 β ,丄 I仿特別較佳是上述的人類抗體 當物質 單株抗體時 抗體，也包 體以及人類 此處， 的單株抗體 合的單株抗 鼠、大鼠、 自人類的免 本發明 遺傳工程所 體，其中， 生自非人類 之高可變區 人類免疫球 自人類免疫 高可變 變區中，並 是抗體時’該物質較佳是單株抗體。當物質是 該物為不僅包括非人類哺乳動物衍生的單株 括重組嵌合的單株抗體、重組人類化的單株抗 單株抗體。 "重組嵌合的單株抗體"是藉由遺傳工程所製備 ，特別是指嵌合的抗體，例如，老鼠/人類嵌 體，其可變區域是衍生自非人類哺乳動物（老 倉鼠等）的免疫球蛋白，以及其恆定區是衍生 疫球蛋白。 之"人類化單株抗體（CDR_移植的抗體）"是由 製備的單株抗體，並且特別指人類化的單株抗 部份或全部的高可變區之互補決定區域，是衍 哺乳動物（老鼠、大鼠、倉鼠等）的單株抗體 的互補決定區域，可變區的結構區域是衍生自 蛋白的可變區之結構區域’以及怪定區是衍生 球蛋白的恆定區。 區之互補決定區域是存在於抗體可變區的高可 且是指直接及互補結合至抗原的三個區域（決 1304811 五、發明說明（86) --- 的殘基；CDR1、CDR2及CDR3)。可變區的結構區威 疋指在二個互補決定區域的上游、下游或其間之相對保守 性的區域（結構區域；FR1、FR2、FR3及FR4 )。 ’、 換句話說，人類化單株抗體是指除了非人類 衍生的單株抗體之高可變區的互補決定區域之部份或全部
以外的所有區域，已以其衍生自人類免疫球蛋白的對2區 域取代。 D —衍生自人類免疫球蛋白的恆定區本身具有每個同型物 的胺基酸序列，例如，IgG ( IgG1、IgG2、IgG3及丨运以 ^ : IgM、IgA、IgD或igE。本發明之人類化單株抗體的恆 定區，可以是從屬於任何同型物的人類化免疫球蛋白而 得。較佳地，其為人類]：gG的恆定區。衍生自人類免疫球 蛋白的怪定區之結構區域，並無特別地限制。 當本發明的物質是多胜肽時，該物質包括下列多胜 肽、多胜肽的片段（募胜肽）、融合多胜肽或其化學修飾 物。募胜肽的例子是包括5到3〇個胺基酸的胜肽，較佳是5 到20個胺基酸。化學修飾可根據各種目的而設計，例如， 在活體内給藥的例子中，設計成在血中有增加的半生期， 或疋口服給藥時’在消化道中增加對抗降解的耐受性或增 加的吸收。 多胜肽的例子如下： (1) 包括AILIM的細胞外區域之全部或部份的多胜 肽； (2) 包括AILIM的細胞外區域之全部或部份，以及免
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疫球(=部：:。份的…胜" 了 Λ例子是DNA、RNA及化學合成的化合物。 哲 NA疋指包括ΜΑ或其化學修飾的DNA之部份 0夂，歹1的Μ Α ，有效於作為根據編碼上述AILIΜ (較 =疋人類AILIM)的DNA之核苷酸序列（包括⑼“及基因植 DNA)而設計的反義DNA藥物。特別地，反義μα可藉由雜 合編碼AILIM的DNA或RNA，而抑制編碼八丨以肘的⑽人轉錄為 mRNA ’或抑制mRNA轉譯為蛋白質。 此處所指的"部份核苷酸序列"是指在任意區域包括任 意數目的核苷酸之部份核苷酸序列。部份核苷酸序列是由 5到1 0 0個連續核苷酸所組成，較佳是5到7 〇個連續核普 酸’更佳是5到50個連續核苷酸’還要更佳是5到30個連續 核脊酸。 當使用D N A作為反義D N A藥物時，D N A序列可部份地化 學修飾，以延長給藥至病患的DNA之血液濃度的半生期 (穩定性）；增加DNA之細胞質-細胞膜通透性；或是增加 口服給藥的DNA在消化器官中對抗降解的耐受性或吸收 性。化學修飾包括，例如，鱗酸鍵、核糖、核脊酸驗基、 糖分子、募核苷酸DNA結構中之3’端及/或5’端的修飾。 磷酸鍵的修飾包括，例如’將一個或多個鍵轉換成磷 酸二酯鍵（D-ol ig〇 )、磷酸硫酸鍵、磷酸二硫酸鍵 (S-olig〇)、構酸甲基酯（MP-oligo)、磷酸酿胺酸 鍵、非磷酸鍵或磷酸硫酸甲基酯鍵或其組合。核糖的修飾
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一〇-甲基核糖。核苷酸 丙炔基尿嘧啶或2 -胺基 包括’例如，轉換成2，-氟核糖或2, 驗基的修飾包括，例如，轉換成5 — 腺嘌呤。 此處，” RNA"是指"包括RNA的 化學修飾的RNA" ’其有效於作為根據：碼每酸:,其 物。該反細可藉㈣Λ甘二===，義， 編碼的ΜΑ轉錄為_，或抑制刚㈣譯為蛋=制 此處所指的"部份核苷酸序列”是指在任意區域包括 意數目的核甘酸之部份㈣酸序列。部份核料^是由 5到100個連續核苷酸所組成，較佳是5到7〇個連續核 佳是5到5G個連續㈣酸，還要更佳是5_個連續 反義RNA的序列可部份地化學修飾，以延長給 患的RNA之血液濃度的半生期（穩定性）；增加_之細胞 質-細胞膜通透性；或是增加口服給藥的RNA在消化 對抗降解的耐受性或吸收性。化學修飾的一個例子是應用 於上述反義DNA之化學修飾。 疋心、 ”化學合成的化合物"之例子是除了上述DNA、rna及蛋 白質=質以外的任意化合物’具有大約丨〇〇到大約丨〇〇〇的 分子量’較佳是具有100到大約8〇〇的分子量之化合物更 佳是具有100到大約60〇的分子量。 σ 在上述"物質"的定義中所包括的，，多胜肽"，是指構成 AILIM (較佳是人類AILIM)的多胜肽鏈之部份（片段），
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五、發明說明（89) 較佳是構成AI L IΜ的多胜肽細胞外區域之全部或部 個胺基酸可選擇性地加到該區域的胺基端及/或鲮基端 包 /步及本發明之AILIM是一穿過細胞膜之穿膜分 括1或2個多胜肽鏈。
此處，1穿過蛋白質”是指經由穿過細胞膜的脂質 脂疏水性區域-次或多次，而與細胞膜連結的蛋白質，二 及其完整的結構是由三個主要的區域所組成，也就是，细 胞外區域、穿膜區域以及細胞質區域，如同在許多受體或 細胞表面分子所看到的。這樣的穿膜蛋白質以單體、 二聚體、異質二聚體或寡聚體的形式，與另一且 忐 不同胺基酸序列的·，組成每個受體或細胞表；分子：5 此處，"細胞外區域"是指上述穿膜蛋白質的完整結構 中之部份結構（部份區域）中的全部或部份，《中部份结 構存在於細胞膜外部。換句話說，它是指除了併入到細胞 膜内的㊣域（穿膜區域）穿臈區域後存在於細胞質 的區域（細胞質區域）以外的穿膜蛋白質區域之全部或部 在上述"蛋白物質"中所包括的"融合多胜肽"，是指包 括组成AILIM (較佳是人類AILIM)的多胜肽細胞外區域之 全部或部份，以及"免疫球蛋白（Ig，較佳是人類Ig)重 鏈的恆定區之全部或部份”的融合多胜肽。較佳地，融合 多胜肽是具有AILIM的細胞外區域以及人類IgG重鏈恆定區 之部份的融合多胜肽，更佳地，是AILIM的細胞外區域以
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J人類:gG重鏈的區域（Fc)之融合多胜肽，包括樞紐 ^、CH2功能部位以及CH3功能部位。作為igG，較佳是 =G1，作為AILIM，較佳是人類、老鼠或大鼠的 佳是人類）。 、权 此處所使用的"人類免疫球蛋白（丨g )重鏈的恆定區 之，部或部份"是指人類衍生的免疫球蛋白重鏈（H鏈）之 恆疋區或Fc區域或其部份。免疫球蛋白可以是屬於任何種 類或任何亞種類之任何免疫球蛋白。特別地，免疫球蛋白
的例子是IgG ( IgGl、IgG2、IgG3 及IgG4 ) 、IgM、IgA (IgAl及IgA2) 、IgD及IgE 〇較佳地，免疫球蛋白是 (IgGl、IgG2 ' IgG3或IgG4 )或IgM。本發明之特別較佳 的免疫球蛋白的例子是屬於人類衍生的IgG之免疫球蛋 (IgGl、IgG2 或 IgG4 )。 免疫球蛋白具有Y字型的結構單元，其中，由兩個同 質輕鏈（L鏈）及兩個同質重鏈（H鏈）組成的四條鏈，是 經由雙硫鍵（S-S鍵）而連結。輕鏈是由輕鏈可變區（乂^ )以及輕鏈怪定區（CL )所組成。重鏈是由重鏈可變區 (νΗ )以及重鏈恆定區（cH )所組成。 重鏈恆定區是由一些具有固有種類（I gG、I gM、 I gA、I gD及I gE )的胺基酸序列，以及亞種類（i gG 1、
IgG2、IgG3及IgG4、IgAl及IgA2 )的胺基酸序列之功能部 位所組成。
IgG ( IgGl、IgG2、IgG3 及IgG4 )的重鏈是由VH、CH1 功能部位、樞紐區、CH2功能部位及CH3功能部位，以從胺
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基端的順序組合而成。 相似地，I g G1 區 〇 ^ ^ ™ *h i , 1丄功能部位、樞& 、2功能部位及C 7*丨3功能部位’以從胺基端植 組合而成。IgG2的重鏈是由Vh、C r“功能部位、樞紐員。序 C 7^2功能部位及C 7ζ3功能部位，以從胺基端的順序么區、 而成。IgG3的重鏈是由VH、Cr“功能部位、樞紐區、1合 τθ功能部位及C 7^3功能部位，以從胺基端的順序、纟人 成。I gG4的重鏈是由VH、C 741功能部位、樞紐區、c、且合而 功能部位及C 7^3功能部位，以從胺基端的順序組合而74 2 成。
IgA的重鏈是由VH、C ο: 1功能部位、樞紐區、c ^ 2工 能部位及C α 3功能部位’以從胺基端的順序組合而成力 相似地’ IgAl的重鏈是由VH、C 1功能部位、拖 區、C 2功能部位及C 3功能部位，以從胺基端的力 組合而成。I g A 2的重鏈是由V Η、C α21功能部位、拖紐填序 區、CcK22功能部位及Cc^23功能部位，以從胺基端 組合而成。 1 、順序 I gD的重鏈是由、C (5 1功能部位、樞紐區、c占2工 能部位及C 6 3功能部位’以從胺基端的順序組合而成功 IgM的重鏈是由VH、C " 1功能部位、c # 2功能部位°、 // 3功能部位及C β 4功能部位’以從胺基端的順序組人（ 成，其不具有如IgG、IgA及IgD所看到的樞紐區。、σ而 I gE的重鏈是由vh、C ε 1功能部位、c ε 2功能部位、 ε 3功能部位及C ε 4功能部位，以從胺基端的順序組合而(
1304811 五、發明說明（92) 成’其不具有如I gG、I gA及I gD所看到的樞紐區。 例如’如果將I gG以木瓜蛋白酶處理的話，其將在樞 紐區雙硫鍵後的稍微胺基端側被切割，其甲雙硫鍵連接兩 個重鏈以產生兩個同質的Fab，其中，由Vh &CH1所組成的 重鏈片段’是經由雙硫鍵而與一輕鏈及一 Fc連結，其中， 由柩紐區、CH2功能部位及CH3功能部位所組成的重^片 段’是是經由雙硫鍵而連結（參見，”圖解免疫學„，原始 二版，Nankodo’ pp. 65-75 ( 1 992 );以及"最新醫學科學 焦點、免疫系統的辨識機轉"，|，Nank〇d〇，pp 4_7 )等等）。
簡言之’上述"免疫球蛋白重鏈恆定區的部份"，是指 f有上述結構特徵之免疫球蛋白重鏈恆定區的部份，較佳 是不含C1區域或FC區域之的恒定區。特別地，其例子是由 每個IgG、IgA及IgD的樞紐區、C2功能部位及C3功能部位 所組成的區域，以及是由每個IgM及IgE的以功能部位、以 部位及C4功能部位所組成的區域。其特別較佳 疋人類衍生的IgGi之Fc區域。 親和六if融合多胜肽具有優點，即該融合多胜肽可藉 化，Ii 析，利用蛋白質A的性質，而相當容易地純
發明之=可專一性地與免疫球蛋白片段結合，因為本 〇夕胜肽具有免疫球蛋白（例如，上述的IgG) 以= = =)，以作為融合夥伴。“ 夕ϋ對抗不同免疫球蛋白Fc的不同抗體，因此，融 狀的免疫分析可藉由對抗Fc的抗體而易於進行。
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五、發明說明（93) "結合至AILIM的多胜肽"是包括在上述”物質μ定義的 多胜肽"中。 、 、 "結合至AILIΜ的多胜肽"之特定的例子是組成已知的 B7h、B7RP-1或GL50或稱為LIC0S的分子的多胜肽之全部戍 部份，其為與AILIM交互作用的配體（Nature, ° 402(6763):827-832 ’ 1999 ; Nature Medicine ， 5(12):1365-1369 j 1999 ； J. Immunology 164:1653-1657 ，2000 ;Curr. Biol. 10(6):333-336 ， 2000 ) 〇 較佳地’该多胜肽是包括上述配體（B7h、B7Rp-i、 GL50或LIC0S)細胞外區域的全部或部份之多胜肽，或是 包括，多胜肽及免疫球蛋白重鏈（較佳是人類免疫球蛋白 艮定·區的全口p或部份之融合多胜狀。此冑，名詞"細胞 〔卜，域'·及"免疫球蛋白重鏈恆定區„，具有相同於上述之 叫上Ϊ之ί胜肽、多胜肽的部份（片段）以及融合多胜 雜ώ: 以丁所述之重組DNA技術所製造，並且可 #卷法·^ #所熟知的方法，例如，化學合成法及細胞 培養法或其修飾的方法而製造。 m丨^ f定義如上之哺乳動物 單株抗體，較^單株"ΠΙΜ)的多株抗體（抗▲清）或 特別地，該括辨θ Η 士 # , MUM細胞的增殖之體二具有/二她1Μ結合而抑制表現 舌性’或疋藉由與A I LI Μ結合而抑制表 1304811
現AILIM的細胞產生干擾素r或介百素4之活性。 此處14遲型過敏症”是指由細胞免疫力所調節之過敏 (特別是由Thl型T細胞所調節），也就是，該過敏是由對 於抗原（記憶抗原之記憶T細胞）敏感之T細胞所調節，並 且是指任何的過敏’當對於該抗原敏感的活體再次接觸相 同的抗原時’其持續大約24到48小時，以顯示由該記憶τ 細胞所引起的發炎伴隨之過敏反應。
此延遲型過敏症包括對感染性病原抗原（例如，衍生 自結核桿菌之）之結核菌素的過敏、對小量蛋白質之短暫 Jones-Mote延遲型過敏、對化學物質（例如，苦味酸氣鹽 )或植物毒素（免漆）之接觸性過敏、 觀察到與移植排斥有關之過敏。 遐移*〒所 此處之”藥學組成物"是指 包括作為有效成份的抗體（較 至AILIM (較佳是人類AILIM ) 佳是人類單株抗體）或其部份 體，1 。 "藥學上可接受的載體"包 劑、分解劑、穩定劑、防腐劑 劑、著色劑、甜味劑、增稠劑 添加物。 藉由使用一種或多種這樣 形成錠劑、片劑、粉末、顆粒 片、萬能藥、懸浮液、乳液或 有效於作為藥物之組成物， 佳是人類抗體），其可結合 或其部份，或單株抗體（較 ’以及"藥學上可接受的载 括賦形劑、稀釋劑、擴展 、緩衝液、乳化劑、芳香 、香味劑、增溶劑或其他的 的載體，可將藥學組成物賦 、注射液、溶液、膠囊、含 糖漿。
1304811 五、發明說明（95) 藥學組成物可口服給藥曳 藥的其他形式包括一妒方^非腸月道給樂。非腸胃道给 直腸、、樂的检劑以及降；首越 液、 份。 齊“及陰道樂栓，其包括-種或多種的活成 用、,d=據ί患的年齡、性別、體重及症&、治療作 产之箱丨=二冶療週期或包含在藥學組成物中的活性成 73 述之多胜肽或抗體）而改變。通常，藥學 成物了每次叫微克到1 000毫克（或.麗克到；;0毫樂克學)組 =劑莖而給藥至成A。根據不同的的條件，在某些例子 中，少於上述的劑量可能是足夠的，以及在其他例子中， 多於上述的劑量也可能是必需的。 特別地，注射液可藉由將抗體溶解或分散在非毒性、 藥學上可接受的載體中（例#，生理食鹽水或市售蒸餾的 注射用水），並將濃度調整至0. i微克抗體/毫升載體到10 毫克抗體/毫升載體而製造。 所製造的注射液可每日一次或多次，以1微克到丨〇〇毫 克/公斤體重的劑量’較佳是5〇微克到5〇毫克/公斤體重的 劑里，給藥至需要治療的人類病患。給藥途徑的例子是醫 學上適合的給藥途徑’例如，靜脈注射、皮下注射、經皮 注射、肌肉内注射或腹膜内注射，較佳是靜脈注射。 也可將注射液製備到非水溶性的稀釋劑（例如，丙二 醇、聚乙二醇、植物油（例如橄欖油）以及醇類（例如乙 醇））、懸浮液或乳液。 注射液可藉由以不含細菌的濾紙過濾、混合殺菌劑或
1304811 五、發明說明（96) ί射:注射液可製備成藥使用才製備的形式。簡言 i在燥；無菌的固體組成物，並可在使用前溶 解在無菌蒸餾的注射用水或其他溶劑。 包括本發明之人類抗體㈣^且成物可有㈣作為藥 物製劑，而不會誘發HAMA (人類抗老鼠抗體 ^ =，以控制各種與AILIM調節的共同刺激訊息、广二次免訊‘ :)傳遞至表現AIUM的細胞有關之生物性反應（例如， ===^广__細胞所產生之細胞 激素表現AIL〖M的細胞之免疫細胞溶解或死 亡）及其他），及/或作為藥物製劑，以鞋 "/β 調笳的邙自值、麻古明— 展劑以藉由抑制與A ILIΜ 調知的：心傳遞有關之疾病’而治療或預防各種 此處的名詞”免疫細胞溶解”是指如下規 -細胞的溶解可藉由抗體（特別是溶解細胞以 及猎由與殺手細胞結合而誘發。溶解細胞的體θ几細 性的抗體，《特別地對於細胞（例 疋、、，田胞毒 =或精子）具有溶解活性。當抗體結合ί::;面；Γ 時’其在細胞上引起細胞毒殺作用，或在補：‘ 發細胞溶解。 的存在下誘 這個免疫細胞溶解是藉由補體的作用，配人 性地結合細胞表面抗原而誘發。結合至表 s k體專一 可活化(M補體。後續的細胞損害 1之抗體’ 與邮補體的固定反應而形成，然: 内容物，藉此溶解該等細胞。 中釋放細胞 此處之抗體依賴性細胞毒殺作用"是指縮寫為"A。⑶" 2125-3981-PF.ptd 第100頁 1304811 五、發明說明（97) 的生物事件，並且藉由受動細胞（例如，淋巴球、巨噬細 胞或多形核白血球）對標的細胞進行細胞毒殺作用，這不 僅需要受動細胞及標的細胞’並且也需要參與誘發細胞毒 殺事件的抗體。 此處的名詞"混合的淋巴球反應”是指縮寫為"MLR"的 生物現象。此反應也稱為混合的白血球反應。 衍生自獨立個體之同種異體的白血球或淋巴球，是互 相地混合並培養數日，藉此使得母細胞形成，以及DNA在 細胞内形成（即細胞增殖）。此反應稱為MLR (同種異體 的MLR )。 DNA形成（細胞增殖）可藉由停止淋巴球的增殖而分 析。停止可藉由以照射或絲裂黴素處理而完成。分析可藉 由測量在其他淋巴球所合成的DNA的量而進行。 所合成的DNA的量可藉由測量胸嘧咬（其以放射性同 位素標示’例如氚）併入到細胞核的程度而分析。 編碼本發明之AILIΜ (特別較佳是人類a IL IΜ )的 DNA ’可根據一般使用的方法，利用從編碼AILIM的心“選 殖cDNA的方法；分離基因組dna及將其剪接的方法；利用 cDNA序列或mRNA序列作為模板而藉由pcR製備DNA的方法； 或化學合成DNA的方法而獲得。 編碼本發明之AILIM配體的DNA，也可以相同於上述之 方式而獲得。 編碼本發明之AI L IΜ (特別較佳是人類A丨l IΜ )的 DNA ’可藉由以適當的限制酶切割（分解）DNA (其包括編
2125-3981-PF.ptd 第101頁 1304811 五、發明說明（98) 碼如此製備的AILIM之DNA)，以及，如果需要的話，將所 得的DNA片段與一連接子DNA或標籤以適當的DNA聚合酶或 類似物連接而獲得。 作為範例的方法將顯示如下’以將編碼A丨L丨M (特 較佳是人類AILIM ;此蛋白質之後稱為有興趣的蛋白質 的D N A，從m R N A中選殖出來。 編碼AILIM配體的DNA，也可以相同於上述之方式 殖出來。 ’選 首先，編碼有興趣的蛋白質之mRNA是從表現及製造 興趣的蛋白質之組織或細胞而製備。mRNA 1 法，例如，胍-硫氫酸法（Chirgwin, 】.Μ.等籍人由，已♦的方
Biochem. 1 8( 5294)，1 979 )、熱苯酚法或AGpc法分離编 體RNA，並利用寡-dT纖維素或聚-u瓊脂糖進 二 法而製備。 1刀臂折 接著，以所得到的mRNA作為模板，可藉由已知的方 法，利用反轉錄酶（例如，0kayama等人，M〇1, Ceii
Biol. 2 61 ,1982 ;同上，3:280，1983 的方法，或
Hoffman 等人，Gene 25:263，1 983 的方法）而合成 並轉換成雙股的cDNA。cDNA資料庫是藉由將大腸桿菌月 有此cDNj的質體載體、嗟菌體載體或枯接載體轉形而製-、 備，或藉由在活體外包裝後轉染大腸桿菌而製備。 用於本發明之質體載體並無特別限制’只 維持即可。任何可在宿主中複製的-菌4 體均可使用。一般使用的選殖載體的例子是PUC19、人戰
1304811 五、發明說明（99) ----- gtio、Agtll 等等。告 地是使用1右％ &田载體用於上述的免疫篩選時，較佳 用有一啟動子的載體#中該啟動子可在宿 表現編碼本發明的多胜肽之基因。 可將c D N A藉由，你丨.u 驗室手冊，篦- 例如，Maniat1S等人（分子選殖，實 ^ 7第—冷泉港實驗室，P. 1.53，1989)的 ⑼να選殖，摔作方\。T將CMA藉由，例如，Hyunh等人
Takara Shuzo之產!可t由市售的選殖套組（例如， 或嗤菌體載體，可= ：：到的重組質體 細胞（例⑹，大Ji 3 胞中’例如，原核 MC1〇61/P3 等等)杯菌，XUB1UeMRF’、⑽“、腿〇卜 辦/氣將化 1體Λ入1至宿主的方法的例子，是氣化辦法、氣化 冷泉港實驗室’Ρ. 174，1 989 )以 第= 'Ζ在活體外包裝後導入至生長的宿主之 外^ ^ έ伤主細胞中。活體外包裝可以市售的活體 於=^。且列如，stratagene或八託1^1^111之產品）而易 編碼本發明的多胜肽iCDNA可根據上述方法並結人一 般的cDNA f帛選方法’而從所製備的^觀資料庫中分離: ’包括所要的cDNA之選殖株可藉由已知的菌落雜 二 mrunstein等人，PNAS，USA 72:396 1，1 975 )或 命痛斑雜口方法（分子選殖，實驗室手冊，第二版，冷泉
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港實驗室’p. 2. 1 08, 1 989 )，利用32P-標示的化學合成 寡核苷酸作為引子而篩選，其中這些引子是對應於:^明 的多胜肽之胺基酸序列。可選擇地，具有編碼本發明的多 胜肽内之特定區域的DNA片段之選殖株，可藉由以合成的 PCR引子，以pcr放大該區域而筛選。 ° 當使用以cDNA表現載體（例如，又ΖΑΡΙ I嗟菌體載體 )所製備的cDNA資料庫時，所要的選殖株可藉由抗原一抗 體反應，利用對抗本發明的多胜肽之抗體而篩選广當有几許 多選殖株要進行篩選時，較佳是使用PCr之篩選方法W。 5 所得到的DNA之核苷酸序列’可藉由Maxam_GUbert去 (MaXam 等人，PNAS，USA 74:560，1 977 )或利用嗤菌體 M13之一去氧核苷酸合成鏈終止法（Sanger等人，pnas USA 74:5463-5467 ’1977)而決定。編碼本發明的多胜 之基因的全部或部份’可藉由以限制酶等去掉上述得到的 編碼本發明的多胜肽之DNA，可藉由以下的方法， 從上述表現編碼本發明的多胜肽之細胞所衍生的基因’體& DNA而分離。 這樣的細胞較佳是藉由SDS或蛋白酶κ而溶解，以及 MAs是藉由重複的苯盼萃取而去蛋白。RNAs較佳是以核 核酸酶而分解。將所得的DNAs以適當的限制酶而部份 解，並將所得的DNA片段以適當的噬菌體或粘 大，以產生-資料庫。接著’具有所要序列的選殖株，日 藉由使用，例如，放射活性標示的DNA探針而偵測，以及疋
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五、發明說明（101) 編碼本發明的多Μ B4* ^ 酶筈去f·1 肽之基因的全部或部份，可藉由以限制 酶等去掉上述得到的選殖株而獲得。 由PCR製備編碼右盘相 知有興趣的蛋白質之DNA，可藉由使用已 #、艰碼有興趣的蛋白哲 的方# A、#斤r |丨《質RNA或““作為模板，根據一般 的方法而進仃（基因放大之PCR技術-基礎及f新枯倂 ”KY〇RITSU SHUPPAN，1 992等等）付基礎及最新技術 把撼ΉΪΪί的蛋白質之MA，也可藉由-般的方法， 根據編碼有興趣的蛋白質之核脊酸序歹,^而化學合成。 ““t!:月ί?ΙΜ (特別較佳是人類ailim)或其部份 用的基因重組技術；u;:”方法而製備，以常 φ, 1 根據上述方法，利用適當的限制酶切 割由編碼AILIM的DNA (cDNA或含有插入序列的基因體DNA )所传到的DNA ’以得到編碼AIUM的艱片段；以及，如 J需要的話，將所得的DNA片段與一連接子ΜΑ或標籤以適 备的DNA聚合酶或類似物連接而獲得。 AILIΜ配體（特別較佳是人類A丨L〗M配體）或其部份 (較佳是細胞外區域），可以相同的方式而製備。 一個特定的例子說明如下。簡言之，將上述製備的 DNA插入到載體中（稱後將詳細說明），以產生表現載 體。接著使用表現載體以轉形以下之宿主細胞，以得到一 轉形株。培養轉形株並使其製造有 蛋 清液中。在培養上清液中之有興趣的蛋白質，可藉 管柱層析等而易於純化。 用於生產重組AILIM (或其細胞外區域）之表現載體
2125-3981-PF.ptd 第105頁 1304811 五、發明說明（102) 的種類並無特別限制’只要它們可在各種宿主巾（例如， 原核^胞及/或真核細胞）複製及維持或自主地產生即 可。k樣的表現載體包括質體載體及噬菌體載體（選殖載 體：實驗室手冊，Elsevier，紐約，1 985 )。 表現載體可藉由將編碼AILIM (或其細胞外區域）的 DNA與在此技藝中可用於重組的載體（質體dna及噬菌體 DNA ) ’藉由一般的方法連結而易於製備。用於重組的載 體之特定例子是大腸桿菌衍生的質體，例如，pBR322、 pBR325、pUC12、pUC13及pUC19 ;酵母菌衍生的質體，例 如，P S Η1 9及p S Η1 5 ;以及枯草桿菌衍生的質體，例如， pUBllO、ΡΤΡ5及pC194。噬菌體的例子是，例如，λ噬菌 體及動物或昆蟲病毒（pVLl 3 93，I nvi trogen )，例如， 反轉錄病毒、疫病毒及核多面體病毒。 當編碼本發明的AILIΜ (特別較佳是人類a ILIΜ )或其 可溶性細胞外區域之ΜΑ，是要在宿主細胞中表現，並藉 此在宿主細胞表面上表現AILIM時，或可選擇地，AILIM (特別較佳是人類AILIΜ )的可溶性細胞外區域是要被製 造時，質體載體是有效的。對於這樣的質體載體並沒有特 別的限制，只要它們可在各種宿主中（例如，原核細胞及 /或真核細胞）表現編碼AI LIΜ (特別較佳是人類AILIΜ ) 或其細胞外區域的基因，並製造編碼的蛋白質即可。例 如，這樣的質體包括PMALC2、pcDNA3. 1(-)、pEF-BOS (Nucl. Acid Res. 18:5322, 1990 等）、pME18S ("遺傳 工程手冊”實驗醫學，增刊，1 992等）等等。
2125-3981-PF.ptd 第106頁 1304811 五、發明說明（103) 當使用細菌，特沿丨B ΠΒ , 载體-般是至少包括一：動子二菌作為宿主細胞時，表現 子、終止區域以及複製子。 ’、乍子^域、起始密碼 當使用酵母菌、叙私& & 現載體較佳是至Ϊ包：物昆蟲細胞作為宿主時，表 明的AILIM (特別軔估θ /相丨Tr τ 碼子、編碼本發 DNA以及終止密碼子。：勺Μ )或其細胞外區域的 子序列、編踽太/、 編碼訊號胜肽的DNA、增強 ^列，編碼本發明AIUM基因之5，_及3 』 :接=、聚腺苔酸位置、可筛選的標記域製、 的話’表現載體也可包含-般用於基因放大 (標記）之基因。 八 在細菌中，表現本發明的]111^1^ (特別較佳是人類 AILIM )或其細胞外區域的啟動子_操作子區域，包括一啟 動子、操作子以及Shine-Dal gar no ( SD )序列（例如， aagg )。例如，當宿主是大腸桿菌時，其較佳是包括Trp 啟動子、lac啟動子、recA啟動子、APL啟動子、1PP啟動 子、tac啟動子或其類似物。 在酵母菌中，表現本發明的AI LIΜ (特別較佳是人類 AILIM )或其細胞外區域的啟動子是ΡΗ〇5啟動子、PGK啟動 子、GAP啟動子、ADH啟動子等等。當宿主是桿菌時，啟動 子的例子是SL01啟動子、SP02啟動子、penP啟動子等等。 當宿主是真核細胞時（例如，哺乳動物細胞），啟動 子的例子是SV-40衍生的啟動子、反轉錄病毒啟動子、熱 休克啟動子等等。當然，啟動子並不限於以上的例子。此 2125-3981-PF.ptd 第107頁 1304811 五、發明說明（104) 外’使用增強子可有效於表現。 較佳的起始密碼子是，例如，甲硫胺酸密碼子（AT(； )° 常用的終止密碼子（例如，TAG、TGA、TAA等 可 使用作為終止密碼子。 吊用』的天然或合成之終止子可使用作為終止區域。 、複製子是指可在宿主中細胞複製完整DNA序列的DN A， 並且包括天然的質體、人工修飾的質體（由天然質體製備 的DNA片段）、合成質體等等。較佳的質體的例子是 PBR322或其人工衍生物（以適當的限制酶處理pBR322所得 之DNA片段），以用於大腸桿菌；酵母菌2私質體或酵母菌 染色體DNA以用於酵母菌；以及pRSVne〇 ATCC 371 98、 pSV2dhfr ATCC 37145 'pdBPV-MMTneo ATCC 37224 ' pSV2neo ATCC 37149、pSV2bsr等，以用於哺乳動物細 胞。 也可使用一般在此技藝中所使用的增強子序列、聚腺 苷酸位置及剪接結合區，例如衍生自SV4〇的增強子序列、 聚腺苷酸位置及剪接結合區。 常用的篩選標記可根據一般的方法而使用。其例子是 對抗生素（例如，四環黴素、氨苄青黴素或康黴素）有抗 性的基因’以及胸嘧啶激酶基因。 用於基因放大的基因之例子是二氫葉酸還原酶（DHFR )基因、胸嘧啶激酶基因、新黴素抗性基因、麩胺酸合成 酶基因、腺嘌呤脫胺酶基因、鳥胺酸脫羧酶基因、激黴素
2125-3981-PF.ptd 第108頁 1304811 五、發明說明（105) -B -碟酸轉基_基因、 ,0 M 天門冬脫羧酶基因等等。 密碼ΐ 見至少上述的啟動子、起始 尽發明的蛋白質之ΜΑ、終止密踽孚，v s处 止區域，連續地；5 μ卢u、*从， 、止在媽子以及終 如果i：要的$ ΐ 接到一適當的複製子而製備。 的限制位置），可藉由-般的方法，由例其:， 以限制酶77解或以Τ4 DNA接合酶連接而使用。 胞而^明的轉形株可藉由將上述表現載體導人至宿主細 : ί t : I月之伤主細胞並無特別限制’只要它們可與 上迤表現載體相容並可被轉形即可。宿主細胞的例子是各 種的細胞’例一般用於本發明技術領域之天然細胞或 人工建立的重組細胞（例如，細菌（大腸桿菌及桿菌） )、酵母® (釀酒酵母、比齊酵母等）、動物細胞或見蟲 細胞。 車父佳疋使用大腸桿菌或動物細胞。特別的例子是大腸 桿菌（DH5 a、DH10B、TB1、HB101、XL-2Blue 等）、老鼠 衍生的細胞（COP、L、C127、Sp2/0、NS-1、NIH 3T3 等 )、大鼠衍生的細胞（C〇Sl、C0S3、C0S7、CV1、Velo 等 )以及人類衍生的細胞（Hela、兩倍體纖維母細胞衍生的 細胞、骨趙瘤細胞、N a m a 1 w a等）。 表現載體可藉由已知的方法而導入（轉形（轉導）） 至宿主細胞。 例如’當宿主是細菌時（大腸桿菌、枯草桿菌等）， m 第109頁 2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（106) 可根據Cohen 等人（PNAS，USA 69: 2110，1972 )、原生質 法（Mol· Gen. Genet. 168:111，1979 )或勝任細胞法 (J. Mol. Biol· 56:209，1971);當宿主是釀酒酵母 時’可根據Hinnen 等人（PNAS, USA 75:1927，1978 )或 鍾方法（J. Bacteriol. 1 53:1 63，1983);當宿主是動 物細胞時’可根據Graham (Virology 52:456，1973 )的 方法，以及當宿主是昆蟲細胞時，可根據Summers等人 (Mol· Cell. Biol· 3:2 1 56-2 1 65，1 983 )的方法，而進 行轉形作用。
本發明之AILIΜ (特別較佳是人類A I L I Μ )的細胞外區 域（可溶性AILIM) ’可藉由在營養培養液中，培養包括 上述製備的表現載體之轉形株（之後，此名詞包括轉導株 )而製造。AILIM配體也可以相同的方式而製備。 營養培養液較佳包括宿主細胞（轉形株）生長所必需 的碳源、無機氮源或有機氮源，碳源的例子是葡萄糖、葡 聚糖、可溶性澱粉及蔗糖；無機及有機氮源的例子是銨 鹽、硝酸鹽、胺基酸、玉米浸泡液、腺、酪蛋白、肉萃取 物、大豆餅及馬鈴薯萃取物。如果需要的話，它們可包括 其他，營養物，例如，無機鹽（例如，氣化鈣、二氫以酸
$及氣化鎂）、維生素、抗生素（例如，四環黴素、新黴 素、氨T青黴素、康黴素等）。 培養是藉由在此技藝中所熟知的方法而進行。可適當 地選擇培養的條件，例如，溫度、培養液的PH及培 間’以使得本發明之蛋白質可大量生產。
2125-3981-PF.ptd 第110頁 1304811 五、發明說明（107) ------ 所使用之特定的培養液；5 i ,^ 胥夜及培養條件，要根據宿主細胞 而決疋，如下所不，但並不限於該條件。 當宿主是細菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌時，包括 上述I源的液體培養液是適合的。較佳是使用具有pH 5到 8的培養液。 當值主疋大腸桿菌時，較佳培養液的例子是LB培養 液、M9培養液（Miller等人，Exp. Mol. Genet.冷泉港 實驗室，p，431,1972) 、γτ培養液等。使用這些培養 液’培養一般可在1 4到4 3 C進行大約3到2 4小時，伴隨通 氣及攪拌，果需要的話。 當宿主是桿菌時’培養一般可在3〇到4〇 °c進行大約16 到96小時，伴隨通氣及攪拌，果需要的話。 當宿主是酵母菌時’培養液的例子最低 營養培養液（Bos ti an，PNAS，USA 77:4505, 1980)。培 養液的pH較佳是5到8。培養一般可在2 〇到35 t：進行大約1 4 到1 44小時’伴隨通氣及攪拌，果需要的話。 當宿主是動物細胞時，培養液的例子是含有大約5到 20%胎牛血清之 MEM 培養液（Science 1 22:50 1，1952)、 DMEM 培養液（Virology 8:396，1 9 59 ) 、RPMI 1 640 培養 液（J. Am. Med. Assoc. 199:519，1 967 )、199 培養液 (Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 73:1 ， 1950) 、HamF12 培養液等。培養液的pH較佳是6到8。培養一般可在30到40 °C進行大約1 5到7 2小時，伴隨通氣及攪拌，果需要的話。 當宿主是昆蟲細胞時，培養液的例子是含有胎牛血清
2125-3981-PF.ptd 第111頁 1304811 五、發明說明（1G8) ' 之 Grace 氏培養液（PNAS’ USA 82:8404, 1985)。於養液 的pH較佳是5到8。培養一般可在20到4(TC進行大約^到 1 0 0小時’伴隨通氣及攪拌，果需要的話。 本發明之A ILIΜ (特別較’ 域（可溶性AILIM)，可藉由j 是動物細胞或大腸桿菌），並 清液而製造。簡言之，培養濾 培養液’例如’藉由過濾或離 胜肽或多胜肽片段，是藉由一 中純化及分離，以純化及分離 分離及純化方法的例子是 (例如’親和力層析）；利用 及溶劑沈澱法）；利用分子量 超過濾、膠體過濾及硫酸十二 ):利用電荷的方法（例如， 層析）；利用疏水性差異的方 層析）；以及利用等電點差異 )0 當有興趣的蛋白質存在於 時，首先，藉由一般的方法^ 體或細胞，並懸浮於適當的緩 胞膜等藉由’例如，以超音波 離的方法破壞之後，包括本發 例如，離心或過濾的方法而獲 ί圭是人類AILIΜ )的細胞外區 杳養上述的轉形細胞（特別 使其將蛋白質分泌到培養上 液（上清液）是將所得到的 心而獲得，以及本發明的多 般常用的方法而從培養濾液 天然或合成的蛋白質。 利用專一性親和力的方法 溶解度的方法（例如，鹽析 差異的方法（例如，透析、 醋鈉聚丙烯醯胺膠體電泳 離子交換層析及羥基磷灰石 法（例如，逆向高效能液態 的方法（例如，等電點聚焦 培養轉形株的胞漿或細胞質 例如，過濾或離心）回收菌 衝液中。在細胞壁及/或細 、溶菌酶及冷凍-解凍而溶 明的多胜肽之流份，是藉由 得。細胞膜流份是以清潔劑
1304811 五、發明說明（109)
Pi二=〇nX_1°〇)而溶解，以得到粗萃取物。最 從粗ί取!ίΐ多胜肽片[是藉由上述-般常用的方法而 從粗卒取物中分離及純化。 _由tΓ中，名㊅+溶性載體，是指用於將多胜月太， 或化學連結而固定於其上之載體。例如，載 t空間的盤子、試管、管子或類似 於ic n 紙、膜或類似物由包括塑膠之不溶 :=4製造’例如’聚苯乙稀樹脂、聚碳酸酿樹 之不、、容二曰二樹脂或玻璃；以及(2)詩親和力層析 之不冷I·生載體，例如，纖維素載體、瓊脂糖载體、 3 =體、葡聚糖載體、聚苯乙烯載體、聚乙烯醇載體烯 聚胺基酸載體、多孔性二氧化矽載體等等。 明之”可提供可谓測訊號之標示物質"包括， ，，酵素、螢光物質、冷光物質、生物素、 = =菜過氧化酶）、驗性磷酸酶、奸半乳糖脊_(、例 萄糖氧化酶、葡萄糖+磷酸脫氫酶、乙醇脫 脫氮酶、青黴素酶、過氧化氫酶、脫輔基〜葡以 酶尿素酶、螢光蟲酶、乙醯膽鹼酯酶等；螢光 例如螢光素異硫氰酸鹽、藻膽色素蛋白質、稀土金是 2、丹磺醯氣、四甲基若丹明異硫氰酸鹽等；放：=合 素是例如3H、UC、1251、1311等；生物 物生同位 冷光物質。 承货白及 在這些物質中，即使單獨使用，放射性同位
第113頁 1304811 五、發明說明（110) · 物質也可提供可偵測的訊號。另一方面，當單獨使用時， 酵素、冷光物質、生物素或抗生物素蛋白不會提供可偵測 的訊號，但當使其與一種或多種的物質反應時，其可提供 可偵測的訊號。例如，當標示是酵素時，至少需要一種基 質以用於偵測。可根據測量酵素活性（比色法、螢光鏡土 檢、使用生物冷光或化學冷光之方法等）之方法類型，而 使用各種類型的基質。例如，當標示是過氧化酶時，可使 用過氧化氫作為基質。可選擇地，當標示是生物素時，常 使用抗生物素蛋白或酵素修飾的抗生物素蛋白作為基質， 但並不限於它們。如果需要的話，可根據使用的基質之種 類而使用各種的冷光物質。 任何的上述標示都可用於本發明。然而，考量债測或 分析的敏感性以及操作的便利性，較佳的標示例 如’過氧化酶）或生物素。 畔京（例 、，本β發明之”鑑定可與AILIM 4AILIM配體結合的物質之 方法"是根據免疫分析的原理而建構。 特別地，可應用說明於"免疫分析（第3版，Ei】· 土
Ishikawa編輯，Igakushoin，1 987 )"的各種方法之原 包括固相單一抗體法、液相 明/台法及—管（one-pot) 本專利申請案（jp_B ) Hei 抗體反應的分析方法，是以 術）、酵素輪送免疫分析、 較佳所使用的原理之例子 二抗體法、固相二抗體法、三 法’如說明於審查中的公開日 2 - 3 9 7 4 7號。此外，利用抗原_ EM IT法（酵素加乘免疫分析技
2125-3981-PF.ptd 第114頁 1304811 五、發明說明（111) 酵素調節劑調 免疫分析、免 近端連接免疫 在本發明 要的目的而適 經濟利益，以及特別是 法、一管法或固相單一 法或一管法 郎的酵素 疫酵素計 分析作為 中，任何 當地選擇 )微量盤之多 有多胜肽的小 或生物素配對 本發明可 源的，由於在 抗老鼠抗原性 斥，而這些在 鼠衍生的抗體 題（副作用） 有很高的價值 特別較佳 孔微滴定 珠，以及 標不之一 結合至人 宿主中對 )，因此 包括非人 )之抗體 。本發明 t疫分析（EMMIA )、酵素抑制劑 量分析、酵素增強的免疫分析以及 範例。 這樣的免疫分析原理，都可根據所 。然而’考量方法的便利性及/或 臨床的多變性，較佳是使用三明治 抗體法的原理，更佳是使用三明治 是使用具有多槽孔（例如，9 6槽孔 盤的二明治法，或是使用其上固定 也利用以酵素（例如，過氧化酶） 管法。 類AILIM的人類單株抗體是人類來 人類的抗原性，也就是HAMA (人類 ’這些抗體不會誘發嚴重免疫排 類哺乳動物衍生的抗體（例如，老 藥物製劑中，已是嚴重的治療性問 之抗體因此在作為抗體藥物上，具 〇〇因此，本發明之抗AILIM (特別是人類AILIM )的人類 單株抗體’以及包括該人類單株抗體的藥學組成物’—點 也不會誘發由HAMA所引起的宿主免疫排斥；並因此可作為 藥物製劑’以控制各種與AILIM調節的共同刺激訊息（二 次訊息）傳遞至表現A ILIΜ的細胞有關之生物性反應（例 如，表現A I L I Μ的細胞之增殖、由表現八丨L丨Μ的細胞所調控
1304811 五、發明說明（112) 之細胞激素的產生、表現AILIM的細 細胞死亡（細胞祠亡）、以及誘導對胞於之免疫細胞溶解或 之抗體依賴性的細胞毒性之活性）；^ AILIM的細胞 預防與AILIM調節的訊息傳遞有關之各用於治療， 制該等疾病的開始及/或進展。 ；、病’控制及抑 特別地，藉由提供含有本發明之人類 體活期部份作為有效成份之藥物製劑， 防’例如’各種歸類於自體免疫疾病或過敏丄 =特： 所引起的自體免疫疾病及延遲過敏症）的 濕性關節炎、多發性硬化症、自體免 、ί;性接觸型皮膚炎、慢性發炎皮膚病，例 士亡姑姑、巧、圾庇很當贱島素依賴性糖尿病、牛 性疾病（例如，風濕性關節“ra)及 月關郎炎（0A));發炎（例如，肝炎）；移植對抗宿主 反應（GVH反應）；移植對抗宿主疾病（GVHD);伴隨组 織（例如，皮膚、角膜、骨等等）或器官（例如，肝臟、 心臟、肺臟、腎臟、胰臟等等）移植（同種或異種）之免 疫排斥L由外源性抗原或自體抗原所誘發之免疫反應（例 如，對抗該抗原的抗體之產生、細胞增殖、細胞激素之產 生j ;以及可能由異常的腸免疫力所引起的疾病（特別是 發炎性腸疾病（特別是克龍（cl〇ne )疾病及潰瘍性結腸 炎）；以及營養性過敏症。 本發明之藥學組成物可治療或預防以各種類固醇藥物 作為抗發炎藥物的某些發炎，例如，與各種關節炎有關之
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第116頁 1304811 五、發明說明（113) 發炎（例如’風濕性關節炎、骨關節炎）、肺炎、肝炎 (包括病毒性肝炎）、與感染性疾病有關之發炎、發炎性 腸疾病、腸炎、腎炎（腎臟絲球體腎炎、腎纖維化有關之 發炎）、胃炎、咽喉炎、胰臟炎、腹膜炎、支氣管炎、心 肌炎、腦炎、在缺血後再灌流損傷（心肌缺血再灌流損傷 7中之發炎、由組織或器官移植後的免疫排斥造成的發 炎、燒燙傷、各種皮膚發炎（牛皮癬、過敏性接觸型皮膚 炎、為慢性發炎皮膚病之苔蘚病）、多發性器官衰竭之發 炎、PTCA或PTCR手術後之發炎以及與動脈硬化症及自體 疫甲狀腺炎有關之發炎。
此外，關於上述與組織或 抑制或治療，本發明之藥學組 中用於抑制免疫排斥的免疫抑 制移植排斥的功效。 器官移植有關之免疫排斥的 成物可結合已知在移植治療 制劑’藉此增加已知藥物抑 此外，藉由使用鑑定可與AIUA^iuILlM配體結合 (其為本發明之—種形態），可控制AILI“ ailim配體間，經由體結合的交互 關之傳遞，藉此可篩選具有治療上述各 有 作用劑（化學合成的化合物或抗體）。、Ί ·、醫： 本發明將以實施例詳細說明如下，.
這些實施例。 仁本發明並不限: 實施例1 :免疫原之製備 〈1_1>表現人類AILIM之重組細胞之製備
1304811 五、發明說明（114)
大量表現人類AILIM之兩種形式的重組細胞（CH0細胞 及HPB-ALL細胞）係根據早期申請案所說明的方法（jp_A
No. Hei 1 1 -29599 及 W098/3821 6 )以及本發明人之一， Tezuka 的先前報導（lnt. Immunology, 12(1):51-55， 2000)製備而成。具體而言，該方法如下： 將包含編碼人類AILIM之全長0RF之cDNA (基因庫編 號：AB023 1 &5 (cDNA) ;BAA82 1 29 (胺基酸））插入載體 pEF neo。然後根據一般常用的方法，使用Gene Pulser (BioRad )以電轉殖（960 ，32〇V )將所產生的重組表 現載體導入中國倉鼠卵巢細胞（CH0細胞）以及胸腺瘤細 胞系HPB-ALL。將細胞分別培養於含有Geneticin (0.8毫 克/毫升；Gibco BRL)及10%FCS之RPMI 1 640培養液，以 篩選具有藥物抗性之轉形細胞。 <1-2>大量表現人類AILIM之重組HPB-ALL細胞之篩選 篩選自上述<1-1>之具有藥物抗性之HPB_ALL轉形細 的培養物經離心產生細胞小塊。將本發明人先前（了 p ' A匕 U-29599 (實施例 12)及 W098/382 1 6 (實施例 12))報 並建立的老鼠抗人類AILIΜ單株抗體，名為"SA12"(老導 抗人類J T T -1抗原單株抗體）加入於細胞_小塊中（濃户· 經EDTA-BSA/PBS稀釋的抗體溶液（10微克/毫升） 升/ 1 05細胞之比例加入）。將產生的混合物於4它培養3微 分鐘。以前述之EDTA-BSA/PBS ( 20 0微升）清洗細^二 次’然後加入藻紅蛋白標示的鏈黴抗生物素蛋白 (SA-PE ; 50 0倍稀釋的溶液1〇〇微升）。將產生的》、曰人 汴匕δ物
1304811 五、發明說明（115) 於4°C培養30分鐘。培養之後，以EDTA-BSA/PBS清洗細胞 三次，然後產生細胞懸浮液。 細胞懸浮液之細胞的人類A I LI Μ表現程度分別以流體 細胞計數儀（flow cytometer) ，FASCort (Beckton-Dichinson)進行分析’以筛選大量表現人類 AIL IM的重組HPB-ALL細胞。將經篩選的細胞培養於含有1〇 %FCS 及 G418 (1 毫克 / 毫升）的 RPMI 1 640。 <1-3>大量表現人類AILIM之重組CH0細胞之篩選 篩選自上述<1-1>之具有藥物抗性之CH0轉形細胞的培 養物經離心產生細胞小塊。將前述抗人類AILIΜ單株抗體 SA1 2經F ITC標示後加入於細胞小塊中（經EDTA-BSA/PBS稀 釋的抗體溶液（1 0 0微克/毫升）。將產生的混合物於4 培養30分鐘。以前述之EDTA-BSA/PBS (200微升）清洗細 胞，然後將EDTA-BSA/PBS ( 5 0 0微升）加入細胞小塊中以 產生細胞懸浮液。 細胞懸浮液之細胞的人類A ILI Μ表現程度分別以流體 細胞計數儀（flow cytometer) ，FASCort (Beckton-Dichinson)進行分析，以篩選大量表現人類 AILIΜ的重組Η P B - A L L細胞。將經篩選的細胞培養於含有1 〇 %FCS 及 G418 (1 毫克 / 毫升）的 RPMI 1 640。 <1-24>從大量表現人類AILIM之HPB-ALL細胞製備免疫球蛋 白
將獲得自前述<1-2>之大量表現人類AILIM之HPB-ALL 細胞離心。重新復原的細胞小塊以填酸緩衝液（PBS ;
2125-3981-PF.ptd 第 119 頁 1304811 五、發明說明（116)
Nikken Seibeibutsu)清洗四次，然後重新懸浮於含有蛋 白酶抑制劑之緩衝液（含有25 mM HEPES (pH 7.4) 、1〇 mM MgCl2、0.25 Μ蔗糖及蛋白酶抑制劑（10單位/毫升抗 蛋白駄酶（Aprot i nine) 、2微克/毫升胃蛋白抑制素 (Pepstatin) 、50微克/毫升甲[乙]-亮-亮-精三肽 (Leupeptin)及0.35 毫克/ 毫升PMSF))。以Potter-形 式的均質機處理細胞懸浮液，並經低速離心（1，5 0 0轉/分 鐘、4 °C、1 0分鐘）。接者，將所產生的懸浮液進行超高 速離心（1 0 0，0 0 0 g、4 °C、1小時）。重新恢復沈澱的細 胞膜部份’並懸浮於磷酸緩衝液中（調整細胞膜部份的濃 度，使得1毫升的PBS包含衍生自1 X 1 〇7細胞的細胞膜）。 將懸浮液儲存於-80 °C。含有細胞膜部份的懸浮液係作為 抗原（免疫原）以製備本發明的人類抗體，將說明如下。 〈卜5>從大量表現人類AILIM之CH0細胞製備免疫球蛋白 將獲得自前述<1-3>之大量表現人類AILIM之CH0以刮 刀分散並離心。重新復原的細胞小塊以構酸緩衝液 (PBS ; Nikken Seibeibutsu )清洗四次，然後重新懸浮 於含有蛋白酶抑制劑之緩衝液（含有25 mM HEPES (pH 7. 4 ) 、1 0 mM MgC 12、0. 2 5 Μ蔗糖及蛋白酶抑制劑（〇單位 /毫升抗蛋白酞酶（Aprotinine) 、2微克/毫升胃蛋白抑 制素（Pepstatin )、50微克/毫升曱[乙]_亮—亮_精三肽 (Leupeptin)及0.35 毫克/ 毫升pMSF))。以p〇tter_B 式的均質機處理細胞懸浮液，並經低速離心（丨，5 〇 〇轉/分 鐘' 4 °C、1 〇分鐘）。接者，將所產生的懸浮液進行超高
2125-398l-PF.ptd 第120頁 1304811 五、發明說明（117) 上1〇〇，_ g、4°C M小時）。重新恢復沈殿的細 胞膜部伤’並懸浮於磷酸緩衝液"調整細胞膜部份的濃 度，使得1毫升的PBS包含衍生自lx 1G7細胞的細胞膜）。 將懸沣液儲存於-80 t：。含有細胞膜部份的懸浮液係 抗原（免疫原）以製備本發明的人類抗體，將說明如下 實施例2 :產生人類抗AILIM單株抗體之融合瘤之製備 在本實施例中，單株抗體之製備係根據說明於" 醫學（增刊）細胞技術之手冊”（編輯，τ Kur〇ki等人 Yodosha，第66-74頁，1 992 )及”用於單株抗體之實驗手 冊 ” （T. Ando 等人 ’Kodansha)而進行。 實施例1所提供之製備自大量表現人類“以肘重組細 的細胞膜部份係作為人類AI l IΜ之免疫原。 用於免疫的動物是產生人類抗體的轉殖老鼠，其係以 上述方法所產生（Nature Genetics 7:13-21，1994 ; Nature Genetics 15:146-156 ,1 9 97 ;國際公開號Hei 4-504365之公告的日文翻譯；國際公開號Hei 7_5〇9i37之 公告的日文翻譯；Nikkei Science，June，p.40-50， 1 995 ;等等）。 使用多孔微盤以用於細胞培養。 <2-1>融合瘤之免疫及製備 製備自上述<1-4> (衍生自HPB-ALL )及〈卜5> (衍生 自CH0)之免疫原係用於上述產生人類抗體之轉殖老鼠。 免疫原連同弗洛依德氏之完全佐劑（ICN/CAppEL)注射至
2125-3981-PF.ptd 第121頁 1304811 五、發明說明（118) 足塾以作為初級免疫（第〇天）。 在初級免疫之後，此等二種免疫原以一星期之間距再 次注射於足塾以作為二次免疫及三次免疫。以相同的方 式’在製備淋巴細胞前二天，再次進行注射以作為最終免 疫，說明如下。 最終免疫二天後，從接受免疫之轉殖老鼠之（鼠蹊部 下方及膝下方）淋巴結及脾臟製備淋巴細胞。此等淋巴細 胞以及老鼠骨髓瘤細胞？3/^634(；8.653(^7'(：(：編號 CRL-1 580 )係以5 : 1之比例混合，並加入聚乙二醇丨5 〇 〇 (Boehringer Mannheim)以作為融合劑。然後，該混合 物以10倍體積的無血清基礎培養液EX_CELL3〇1 (JRH Bioscience )進行稀釋。接者，該混合的細胞以該基礎培 養液進行清洗’然後懸浮於HAT培養液（1公升之含有 13· 61毫克的次黃嘌呤（hyp0xanthine)、176微克的胺基蝶 呤以及3.88毫克的胸腺核苷之基礎培養液）。將細胞放置 於96孔微盤中’並培養10 — 14天以完成細胞融合。此等細 胞融合處理產生許多融合瘤。 <2-2>篩選產生人類單株抗體之融合瘤 將上述製備自<2-1>的一些融合瘤以下述的細胞el ISA 進行篩選以篩選出產生對抗人類AILIM之人類單株抗體之 融合瘤。 將上述大量產生人類AIL IM之重組HPB-ALL細胞及重組 CH0細胞放置於ELISA 96孔微盤之每個槽孔之中（ιχ 1〇5 細胞/槽孔）。在37 °C培養2天。
2125-3981-PF.ptd 第122頁 1304811 五' 發明說明（119) — " ---- 接者，丟棄每個槽孔的上清液’再加入每個 養物之上清液樣品（50微升/槽孔），並將此混合物觸° 一小時。待反應完成後，將混合的樣品溶液丢棄，培養 有1 %BSA (Sigma )之PBS清洗槽孔三次。 、’並以含 接者’將連結過氧化酶之羊抗人類免疫球蛋白 抗體（每個槽孔加入50微升的2000倍稀釋液）加入每^ 孔中’以偵測融合瘤上清液中的人類免疫球蛋白， 株抗體）之重鍵。將此混合物在室溫中培養1小時。頁早 另一方面，將連結過氧化酶之羊抗人類免疫球蛋白κ 鏈抗體（每個槽孔加入50微升的2000倍稀釋液）加入每= 槽孔中，以偵測融合瘤上清液中的人類免疫球蛋白（人類 單株抗體）之輕鍵。將此混合物在室溫中培養1 5分鐘。 將抗人類I gFc抗體或抗人類I g /c抗體從微盤中的每個 槽孔中移除’然後以含有1 %BSA之PBS清洗槽孔三次。在 每個槽孔中加入四甲基聯苯胺（3, 3,，5, 5,—四甲基聯苯胺 (TMB) ’100微升/槽孔，bi〇-rad) ’然後將產生的混合 物在室溫下培養1 5分鐘。 接著，每個槽孔加入1 N硫酸（50微升/槽孔）以終止 反應。藉由微盤測讀儀（型號3550微盤測讀儀B 10-RAD ) 監測該反應於4 5 0 n m波長之吸收度。 使用以下項目以相同於前述的方式進行對照組EL丨s A 實驗： (1 )野生型HPB-ALL細胞，取代表現人類AILIM之重 組HPB-ALL細胞;
2125-3981-PF.ptd 第123頁 1304811 ---—_ 五、發明說明（120) 細胞.（2 )野生型CH〇細胞，取代表現人類AILIM之重組CH0 對抗人類AIUM<老鼠單株抗體（SA12或 ，JP-ALL_29599 (實施例 12)及W098/382 1 6 (實施 例1 2 )) ’取代融合瘤上清液； (4 )對抗KLH之人類單株抗體（鑰孔帽貝血藍蛋白； IERCE) ’取代融合瘤上清液。 該人類抗KLH單株抗體係以Klh (鑰孔帽貝血藍蛋白； PIERCE )免疫前述產生人類抗體的轉殖老鼠，並根據以上 <2-1>所述之相同方法製備。 藉由這樣的篩選方法而進行許多有能力結合至人類 AILIM之產生人類單株抗體之融合瘤之篩選。 <2-3>融合瘤之初期選殖 藉由以下的分析程序，從篩選自上述<2_2>之各種融 合瘤（母細胞系）建立許多形式的融合瘤單一選殖株，其 可產生對抗人類AIL IM之人類單株抗體。 將篩選自上述<2-2>之融合瘤分別放置於24孔微盤。
藉由吸管吸取而測定每個槽孔中的融合瘤細胞計數。接 者’將10 %胎牛血清（FCS ; Trace B i osc i ence PTY ) '1 %盤尼西寧/鏈黴素（Sigma) 補充液（Gibc〇 bRL )及 2.5%T-STM 培養補充液（Colaborative Biomedicla Products)加入含有4.0 mML-榖醯胺酸及脂質脂 EX-CELL301培養液（jrh Bioscience)。使用所產生的改 良培養液稀釋融合瘤至1 X 1 〇4細胞/毫升，並將細胞懸浮
2125-3981-PF.ptd 第124頁 1304811 五、發明說明（121) 於每個槽孔中。 以該孔的細胞懸浮液（3〇〇微升或600微升）並 將兮4 〇養液混合均勻（150毫升或300毫升），然後 = 液之2°°微升分裝液加入於多删孔微㈣ 鮮的^ & ^，使得母個槽孔包含4個融合瘤細胞。將新 細胞早ΪΪί培養液（5〇毫升或i〇0毫升）加入於剩下的 ，混合均$，然後將產生的細胞懸浮液加入 神m的多個96孔微盤的每個槽孔中，使得每個 槽孔包含2個融合瘤細胞。 !績，至2週。在培養之後’在許多槽孔中發現衍 生自早一融合瘤之單一選殖株。 =上述<2-2>之細胞ELISA證實，對抗人類ARim之人 類I株抗體係產生於每個含有該群集之槽孔中的細胞上 液中。 <2-4>融合瘤之二次選殖 來自上述<2-3>所獲得的各種融合瘤選殖株之每個選 殖株的次選殖係根據<2-3>所述之相同方法而進行。 在這個實驗中，將96孔微盤之每個槽孔的細胞密度調 整至1細胞/槽孔。 此等篩選產生許多製造對抗人類AILIM之人類單株抗 體之融合瘤單一選殖株。所包括的一部份選殖株如下； (選殖株名稱） AIF34 (JMabl24) 、AIF182 (JMabl26) 、AIF348 (JMabl27) 、AIF620 (JMabl28) 、AIF1052 (JMabl35 1304811 五、發明說明（122) )'AIH5D3 (JMabl36) 'AIH386 (JMabl37) >AII289 (JMabl38) 、AII394 (JMabl39) 、AII488 (JMabl40 )、AIJ40 (JMabl41 )， 本申請案整體皆使用如上名稱，亦即下述之所有實施 例，包括本實施例，及含有獲得自這個實施例之分析結果 的圖和表。 實施例3 :單株抗體之性質分析 <3-1>重鏈及輕鏈之分析 藉由使用下述之ELISA及流體細胞計數儀證實，產生 自每個融合瘤選殖株（已選殖自上述<2-4> )之對抗人類 AILIM之單株抗體確實是人類單株抗體。 大量表現人類AILIM之重組HPB-ALL細胞（已製備自實 施例1 )係放置於微盤中的每個V型槽孔（3 X 1 04細胞/槽 孔）。在37。(：於含有10%FCS之RPMI 1 640培養液中培養細 胞。 完成培養之後，將微盤離心（1，800轉/分鐘，2分鐘 )以沈澱細胞，然後將產生的上清液丟棄。接者，將來自 前述<2-4>所選殖的每個融合瘤之培養物之上清液樣品、 或老鼠對抗人類AILIM單株抗體SA12 (2微克/50微升）或 人類抗KLH單株抗體（2微克/槽孔’作為對照組抗體）加 入於每個槽孔中。將該混合物於冰箱中反應3 〇分鐘。反應 後，將樣品溶液丟棄，然後以磷酸緩衝液（含有5mM EDTA 之0.5%BSA-PBS)清洗每個槽孔。
2125-3981-IT.ptd 第126頁 1304811 五、發明說明（123) 接者，將任一個下述之二級抗體（以上述磷酸緩衝液 稀釋1 000倍，並以50微升/槽孔之量加入）加入於每個槽 孔中，以懸浮細胞。將該懸浮液於冰箱中反應3 0分鐘。 (二級抗體） 生物素標示的抗人類IgG抗體（Zymed); 生物素標示的抗人類IgG抗體（Protos); 生物素標示的抗人類I gFc抗體（ΕΥ實驗室）；或生物素標 示的抗人類Ig/c抗體（Vector)。 反應後，將二級抗體丟棄，然後以上述磷酸緩衝液清 洗微盤中的每個槽孔。接者，藻紅蛋白標示的鏈黴抗生物 素蛋白（鍵黴抗生物素蛋白- PE ;Pharmingen :以上述碟 酸緩衝液稀釋500倍，並以50微升/槽孔之量加入）加入於 每個槽孔中。將該混合物於冰箱中反應3 〇分鐘。反應後， 以上述鱗酸緩衝液清洗每個槽孔。然後，將上述磷酸緩衝 液加入於每個槽孔中（200微升/槽孔）以懸浮細胞。 應 進行分析以測定每個融合瘤選殖株之培養上清液中的 抗人類AILIM單株抗體對於槽孔中大量表現人類AIUM之反 實驗 使用以下項目以相同於前述的方式進行對照組EL丨sa (1 )野生型HPB-ALL細胞，取代表現人類ML 組HPB-ALL細胞； ρΤ_(Λ)對抗KU之人類單株抗體（餘孔帽貝血藍蛋白； PURCE ) ’取代融合瘤上清液。 第127頁 2125-3981-PF.ptd 1304811 五 '發明說明（124) ^ 該人類抗KLH單株抗體係以KLH (餘孔帽貝血藍蛋白. PIERCE )免疫前述產生人類抗體的轉殖老鼠，並根據以上 <2-1>所述之相同方法製備而成。 根據結果證實，所有的前述融合瘤選殖株都是由人类負 衍生的重鏈及人類衍生的/c輕鏈所組成的人類單株抗體。 本結果中的一個實例係說明於第1圖，包括融合瘤選 殖株 AIH5D3 (JMab-136)、AII 28 9 (JMab-138)及 AI 1394 ( JMab-139 )之分析結果。 <3-2>人類單株抗體之同型分類（iS0typing) 測定已經選殖於<2-4>並分析於上述<3-1>之融合瘤所 產生的每個人類抗人類AILIM單株抗體之同型。使用人類 單株抗體同型分類套組試劑（American Qualex)根據試 劑所附的實驗方法進行測定。 所有的人類抗人類AILIM單株抗體經測定為igG2/ /c。 實施例4 :大量製備對抗人類AILIMi人類單株抗體（人類 抗人類A IL IΜ單株抗體）及其純化 <4-1>方法1 將已由上述<2-4〉製備的產生人類抗人類AILIM單株抗 體之每個融合瘤選殖株細胞加入組織培養瓶（5 〇毫升， FALCON) ’ 並於含有 1〇% 超低牛 IgGFBS (GIBC〇_BRL)之 ASF104 培養液（Ajinomoto)中，在37。(：及含有 5%(：02之 大氣下培養至長滿狀態。 培養10至12天後，重新獲取每個融合瘤之培養物上清
2125-3981-PF.ptd 第128頁 1304811 五、發明說明（125) 液，並移轉至50毫升之聚丙烯圓錐管（FALCON )中。在 500xg下離心該管5分鐘。 接者，將所產生的離心上清液透過無菌過濾單元 (NALGEN )進行過濾，並且重新獲取該濾液。 以3毫升/分鐘之流速，將該濾液裝載於預先以磷酸鹽 緩衝液（30毫升）平衡之Hitrap蛋白質G管柱（Hi Trap親 和力管柱蛋白質G ;Amersham Pharmacia)上。 接者，以磷酸鹽緩衝液（2 0毫升）清洗該管柱，然後 以約1毫升/分鐘之流速將10 0 mM擰檬酸鹽緩衝液（PH 2.0 )裝載於該管柱上，藉此將有興趣的抗體沖提出來。接 者’以750 mMTris-HCl之溶液（pH 9. 0 )將沖提出來的溶 液中和，然後經濾紙過濾（M i 11 i ρ 〇 r e )以移除白色沈 殿。所產生的濾液在磷酸鹽緩衝液中進行透析（隔夜）， 並經濾紙過濾（M i 11 i pore )。因此，經純化的抗a ILIΜ人 類單株抗體便由每個融合瘤系獲得。 蛋白質濃度係藉由使用光譜儀（1 A28() = l. 41毫克/毫 升）由A28Q之吸收度而測定。 <4-2>方法2 將已在上述<2-4〉製備的每個融合瘤選殖株細胞調節 於含有10%超低牛IgGFBS (GIBC0-BRL)之ASF104培養液 (Ajinomoto )中（每個選殖株有卜2χ1〇6細胞/毫升）， 並放置且培養於Intrgra細胞系1〇〇〇 (INTEGRA CL1〇〇〇， INTEGRA BI〇SCIENCE)。培養7至1〇天後，當細胞密度到 達1 X 1 08細胞/毫升時，重新獲取每個融合瘤培養物之上
1304811 五、發明說明（126) 清液。 以3毫升/分鐘之流速’將每個培養物上清液裝載於預 先以鱗酸鹽缓衝液（30毫升）平衡之Hitrap蛋白質G管柱 (HiTrap 親和力管柱蛋白質G ; Amersham Pharmacia ) 上。 接者，以磷酸鹽緩衝液（20毫升）清洗該管柱，然後 以約1毫升/分鐘之流速將1 0 0 mM檸檬酸鹽緩衝液（PH 2. 0 )裝載於該管柱上，藉此將抗體沖提出來。接者，以750 mM Tris-HCl之溶液（pH 9.0)將沖提出來的溶液中和， 然後經濾紙過濾（M i 11 i pore )以移除白色沈澱。所產生 的濾液在磷酸鹽緩衝液中進行透析（隔夜），並經濾紙過 濾（M i 11 i ρ 〇 r e )。因此’經純化的抗AI L I Μ人類單株抗體 便由每個融合瘤系獲得。 實施例5 :人類抗人類AILIM單株抗體對於人類AILIM之反 應性’及其對於老鼠A I LIΜ及大鼠A I L I Μ之交叉反應性 利用細胞EL ISA方法，分析上述經純化的各種人類抗 人類AILIΜ單株抗體之對於人類AIL IΜ之反應性以及對於老 鼠AILIM及大鼠AILIM之交又反應性。 <5-1 >建立ELISA系統以測定IgG抗體濃度及校正曲線之製 備 因為所有上述經純化人類抗人類A IL IΜ單株抗體為I gG (IgG2 )抗體’所以建立ELISA系統以測定IgG抗體之濃 度0
2125-3981-PF.ptd 第130頁 1304811 五、發明說明（127) 將山羊抗人類IgG (Fc)抗體（1.2微克/毫升於PBS ; 100微升/槽孔；〇rganon Teknika)加入於96孔ELISA微盤 (Nunc )之每個槽孔中。在室溫下培養該微盤2小時，以 吸附抗-IgG (Fc)抗體於微盤上。接者，丟棄上清液，然 後以含有0,05%Tween20之磷酸鹽緩衝液（PBS)清洗該微 盤二次。在每個槽孔中加入封鎖試劑（bl〇cking reagent )(含有0.5%牛血清白蛋白（BSA)及0.1%Tween20之 P B S ) ( 2 0 0微升/槽孔），然後將微盤放置於室溫下2小 時’以封鎖該微盤上沒有該抗-IgG (Fc)抗體之位置。然 後’將該封鎖試劑丟棄，並以PBS將每個槽孔清洗二次。 以人類衍生的IgG2抗體（50微升/槽孔；結合位置） 作為標準抗體，以不同濃度（〇至丨00 ng/毫升）將之加入 微盤中的各別槽孔中，然後將該微盤培養於室溫中2小 時。將過多的標準抗體溶液移除，然後以含有〇. 〇 5 % Tween20之磷酸鹽緩衝液（PBS )清洗該微盤三次。 接者，將連結過氧化酶之山羊抗人類j gG/冗抗體加入 每個槽孔中（ 40 0 0倍稀釋，100微升/槽孔，pr〇t〇s)，然 後將該微盤培養於室溫中1小時。 將上清液丟棄，然後以含有0 05 %Tween20之磷酸鹽 緩衝液（PBS )清洗該微盤三次。將含有基質（组成：鄰— 苯二胺（鄰-苯二胺；0PD ;2〇亳克））/擰檬酸鹽_鱗酸鹽 緩衝液（PH 5.0，50毫升）/3〇%的過氧化氫溶液〇5微 升））的緩衝液加入於每個槽孔中（1〇〇微升/槽孔），然 後將該微盤培養於室溫中7分鐘。
第131頁 1304811 五、發明說明（128) 接者’將2 Μ硫酸加入每個槽孔中以終止反應（50微 升/槽孔）。根據使用微盤測讀儀在49Onm波長下所測定的 吸收度值而製作校正曲線（第2圖）。 以上述相同方式，使用單獨的培養液或BSA溶液作為 待測物質，以進行對照組分析。 <5-2>分析各種人類抗人類AILIM單株抗體對於人類AILIM 之反應性，及其對於老鼠AILIM及大鼠AILIM之交叉反應性 < 5 - 2 -1 >試劑之製備
這個細胞ELISA所使用的試劑，其製備如下： <5-2-1-1>製備大量表現老鼠“1^111之重組(：110細胞 大量表現老鼠AILIM之重組CH0細胞係由上述<1-1>及 〈1-3〉之相同方法製備並獲得。
將包含編碼老鼠AILIM之全長0RF之cDNA (基因庫編 號：AB0 23 1 32 (cDNA ) ; BAA82 1 26 (胺基酸））插入載體 pEF-neo。然後根據一般常用的方法，使用Gene Pulser (BioRad )以電轉殖（960 yF，320V )將所產生的重組表 現載體導入中國倉鼠卵巢細胞（CH0細胞）。將細胞分別 培養於含有Geneticin (0.8毫克/毫升；Gibco BRL)及10 %FCS之RPMI 1 640培養液，以篩選具有藥物抗性之轉形細 胞’藉此獲得大量表現老鼠AILIM之重組CH0細胞。 〈5-2-1-2〉製備大量表現大鼠AILIM之重組CH〇細胞 大量表現大鼠AILIM之重組CH0細胞係由上述<1-1>及 〈卜3>之相同方法製備並獲得。 將包含編碼大鼠AILIM之全長0RF之cDNA (基因庫編
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第132頁 1304811 五、發明說明（129) 號：AB0231 34 (cDNA ) ; BAA82 1 28 (胺基酸））插入載體 pEF-neo。然後根據一般常用的方法，使用Gene puiser (BioRad)以電轉殖（ 960 /zF，32 0V)將所產生的重組表 現載體導入中國倉鼠卵巢細胞（C Η 0細胞）。將細胞分別 培養於含有Geneticin (0.8毫克/毫升；Gibco BRL)及10 %FCS之RPMI1640培養液’以篩選具有藥物抗性之轉形細 胞，藉此獲得大量表現大鼠A I L IΜ之重組C Η 0細胞。 〈5-2-1-3〉製備對抗老鼠AILIM之單株抗體 將製備自上述〈5-2-1-1〉之大量表現老鼠AILIM之重組 CH0細胞均質化，並進行超高速離心（i〇〇,〇〇〇xg)。重新 獲取含有細胞膜部份的小塊，並連同弗洛依德氏完全佐劑 注射進入W is tar大鼠之足墊中，以作為初級免疫（第〇天 )。在初級免疫後的第7天、第14天及第28天，再將細胞 膜部份之抗原施予老鼠的足墊中◊在最終免疫後，從它們 體内收集淋巴結細胞。
以5 : 1之比例將淋巴節細胞及老鼠骨髓癌細胞p a I (JCR 編號 B0113 ; Res. Disclosure 217:155，1 982 )結 合。藉由使用聚乙二醇4000 (Boehringer Mannheim)作 為融合劑使細胞互相融合，以製備製造單株抗體的融合 瘤。藉由將它們培養於含有HAT、1 0 %胎牛血清及胺基蝶 吟之ASF104培養液（A j inomoto )而達成融合瘤之篩選。 每個融合瘤之培養上清液中的大鼠單株抗體對於老鼠 AIL IΜ之反應係以如下方式測得：將培養上清液與上述表 現老鼠AILIM之CH0細胞進行反應，然後在epics_ELite流
2125-3981.PF.ptd 第133頁 1304811 五、發明說明（130) 體細胞計數儀中測量aFITC標示的抗大鼠IgG (Cappel ) 抗體所染色的細胞之螢光密度。該篩選實驗產生多個製造 具有對抗老鼠AILIM之反應性之單株抗體之融合瘤。 尤其’將名為"Β1 〇. 5之融合瘤系細胞以腹膜内注射 (10至107細胞/ 0.5毫升/老鼠）至icR nu/nu老鼠（母 鼠，7至8周大）。注射後1〇至2〇天，根據一般使用的方 法’在麻醉狀態下進行剖腹手術從每隻老鼠中收集腹水。 大鼠抗老鼠AILIM單株抗體旧0.5 (IgG1 )便由腹水大量製 備而成。 <5-2-2〉抗體對於人類、老鼠及大鼠AILIMi反應性 使用於下述EL ISA之人類抗人類a ILIΜ單株抗體及對照 組抗體之濃縮物係根據上述<5_1：>所說明的ELISA及校正曲 線而測定。 將實施例1所製備的大量表覌人類A丨L〗Μ之重組CH〇細 胞、上述<5 —2 —丨―丨〉所製備的大量表現老鼠AILIM之重組 CHO細胞、以及上述所製備的大量表現大鼠 AIUM之重組CH0細胞放置於㈣孔乩丨^微盤之槽孔，並在 3 7 C培養至長滿狀態。 A T T ，丟棄上清液，然後將經純化的各種人類抗人類 株抗體或以上製備的對照組抗體，以5 0微克/槽孔 入”個槽孔t (抗體濃度：以含有以咖之_ 稀釋200微克/毫升之抗體3次、32次、$次、&次、&次、 =38 *、39 *、31° 次、3U 次及312 次）’然後將 该微盤在室溫下反應2小時。將單株抗體之溶液丟棄，然
1304811 五、發明說明（131) 後以含有1 %BSA之磷酸鹽緩衝液清洗每個槽孔三次。 接者’將連結嫜菜過氧化酶之抗人類126 (Fc )抗體 加入於每個槽孔中（稀釋倍，5〇微升/槽孔； American Qua lex )’然後將該微盤培養於室溫下1小時。 將過多的經標示抗體溶液丟棄，然後以含有1 %BSA之 磷酸鹽緩衝液清洗每個槽孔三次。將含有基質（組成：鄰 _苯二胺（鄰—苯二胺；〇PD ; 2〇毫克））/檸檬酸鹽-磷酸 鹽緩衝液（pH 5.0 ’ 50毫升）/30%的過氧化氫溶液（15 微升））的緩衝液加入於每個槽孔中（1〇〇微升/槽孔）， 然後將該微盤培養於室溫中7分鐘。 接者，將2 Μ硫酸加入每個槽孔中以終止反應（5〇微 升/槽孔）。使用微盤測讀儀在4 9 〇 ηιη波長下測定吸收度。 以上述相同方式，使用下述對照組抗體進行對照組 ELISA，以評估上述抗體： (1 )對抗人類AILIM ( JP-A 1 1 -29599 (實施例12 ) 以及WO 98/382 1 9 (實施例12))之老鼠單株抗體^12或 SG430 ； (2)對抗老鼠AILIM之大鼠單株抗體81〇.5 (前述 〈5-2-1-3〉）； (3)對抗大鼠AILIM之老鼠單株抗體JTT2 (由融合瘤 產生的單株抗體，其已於1996年1〇月η日在生物科學及人 類科技之國家機關國際編號FERM Bp-5708進行國際寄存， 其為國際貿易及工業部之工業科學及科技機構，^為布遠
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五、發明說明（132) 及2)以及W0 98/3821 6 (實施例1及2))。 (4 )上述對抗KLH之人類單株抗體（鑰孔帽貝血藍蛋 白’ P IERCE ) ’取代融合瘤上清液。 對照組EL I S A實驗係以前述之相同方法，使用以下的 野生型CH0細胞’取代表之重組CH0細胞而進行。 結果顯示於第3至1 4圖。 根據所得到的結果，50 %有效濃度（ED : ng/毫升） 經計算為每個人類抗人類AILIM單株抗體對於人類AILIM (大量表現人類AILIM之重組CHO細胞）、老鼠AILIM (大 量表現老鼠AILIM之重組CH0細胞）或大鼠AILIM (大量表 現大鼠AILIM之重組CH0細胞）之反應的指數。經由計算 所或的結果顯示如下： (A)對於大量表現人類AILIM之CH0之ED50 AIF 34 AIF 182 AIF 348 AIF 620 AIF 1052 AIH 5D3 AIH 386 All 289 All 394 All 488 AIJ 40 (Mab-124) (JMab-126) (JMab-127) (JMab-128) (JMab-135) (JMab-136) (JMab-137) (JMab-138) (JMab-139) (JMab-140) (JMab-141) 5. 3 ng/毫升 3. 6 ng/毫升 9· 1 ng/亳升 10· 1 ng/ 毫升 2.0 ng/毫升 7. 5 ng/毫升 9. 6 ng/毫升 10· 5 ng/ 毫升 10· 6 ng/ 毫升 11·0 ng/ 毫升 3· 7 ng/毫升
2125-3981-PF.ptd 第136頁 1304811 五、發明說明（133) SA 12 ： 1.8 ng/ 毫升 SG430: 1.2ng/ 毫升 (B)對於大量表現老鼠AILIM之CH0之ED50 AIF 34 AIF 348 AIF 620 AIJ 289 All 394 AIJ 488 42 ng/毫升 81 ng/毫升 1 00 ng/毫升 53 ng/毫升 60 ng/毫升 70 ng/毫升 (JMab-124) (JMab-127) (JMab-128) (JMab-138) (JMab-139) (JMab-140) (C)對於大量表現大鼠AILIM之CHO之ED50 AIF 34 (JMab-124) : 5 ng/ 毫升 AIF 348 AIF 620 AIJ 289 All 394 AIJ 488 (JMab-127) : 62 ng/ 毫升 (JMab-1 28 ) : 97 ng/ 毫升 (JMab-138) : 57 ng/ 毫升 (JMab-139) : 90 ng/ 毫升 (JMab-140) :90 ng/ 毫升 結果顯示本發明之人類抗人類株抗體，對於 人類AIL IΜ具有明顯高的專一性。 此外’也顯示有六種人類抗人類A IL IΜ單株抗體（顯 示於以上的（Β)及（〇)，可與老鼠AILIM及大鼠AILIM反應 (結合能力’交又反應性）。 實施例6 :人類抗人類AILIM單株抗體對於抗原（人類 A I LIΜ )之親和力及中和活性之測定
第137頁 2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（134) - 關於上述製備之各種純化的人類抗人類A丨L丨M單株抗 體’與人類AILIM間的反應之結合速率常數（ka)、解離 速率常數（kd)及解離常數（Kd)，是利用市售的的分析 套組BiacoreX (Amersham Pharmacia)而測定。 < 6 -1 >固定在感測器晶片上的抗原之製備 在套組中’固定在感測器晶片上的抗原，是製備成重 組嵌合之抗原（此後稱為"人類AILIM-IgFc”），其由人類 AILIM的細胞外區域及人類IgGl的恆定區（pc)所組成。 人類AILIM-IgFc是根據本發明的發明者之一，
Tezuka，早期申請案（JP-A 1 1 -29599 (實施例16(2))及 W0 98/38216 (實施例16(2)))所說明之方法，藉由將所 得的抗原進一步純化而製備。 將產生人類AILI Μ- I gFc的重組細胞之培養上清液，以 3毫升/分鐘的流速，裝填到預先以磷酸鹽緩衝液（3 〇毫升 )的HiTrap蛋白質G管柱中（HiTrap親和力管柱蛋白質G ; Amersham Pharmacia ) ’以在管柱上吸附培養上清液中的 人類AILIM-IgFc。 接著，將管柱以磷酸鹽緩衝液（2 0毫升）清洗，然後 將100 mM的檸檬酸緩衝液（pH 2.0)，以大約1毫升/分鐘 的流速裝填到管枉，以沖提人類AI LI Μ- I gFc。接著，將沖 提的溶液以750 mM的Tris-HCl溶液（pH 9.0)中和，然後 在磷酸鹽緩衝液中透析（隔夜）。接著，將透析的溶液經 由濾紙過濾（M i 1 1 i pore )。藉此得到純化之抗人類 AILIM-IgFc 。
1304811 五、發明說明（135) 蛋白質浪度係藉由使用光譜儀（1 A28〇 = 1毫克/毫升） 由Aw。之吸收度而測定。人類A丨L丨M_丨gFc的濃度測定為 0. 28毫克/毫升。 純化之由大鼠A IL I Μ的細胞外區域及人類I g G1的怪定 區（卩〇)所組成的嵌合蛋白質（大鼠丸11^1]|1-1舀？(：；】？—八 1 卜29599 (實施例 16(2))及WO 98/3821 6 (實施例 16(2) ))’也根據相同於上述的方式而製備。所得之大鼠 AILIM-IgFc的濃度測定為〇. 45毫克/毫升。 <6-2>親和力及中和活性之測定 實驗方法除了固定在感測器晶片上的抗原（人類 AILIM-IgFc)之外（其說明如下），其餘是根據市售的的 分析套組BiacoreX (Amersham Pharmacia)所附的操作手 冊及實驗方法。 使HBS 緩衝液（含有〇. 〇1 M HEPES、0. 15 M NaCl、3 mM EDTA以及0.005 %清潔劑P20 ;pH 7.4)經由套組所附 的流動單元-1，以5微升/分鐘的流速而流動。接著，加入 含有0.0 05 M NHS (N-羥基琥珀醯亞胺）及〇.2 M EDC (N-乙基- Ν’-(二甲基胺基丙基）碳二醯胺）的溶液（15微升 )，以活化塗佈在感測器晶片表面上的CM之羧基。 接著，加入23微升的人類AILIM-IgFc溶液（10微克/ 毫升；溶於10 mM的醋酸鈉緩衝液中（pH 5.0))，以在 感測器晶片上固定人類人111祕-4[<3。接著，將未反應之活 化的羧基，藉由加入3 5微升1 Μ之乙醇胺氫氣化物而封 阻。藉由兩次固定化處理所固定之人類AILIM-IgFc的量，
2125-3981-PF.ptd 第139頁 1304811 五、發明說明（136) 分別是2, 444 RU (共振單位）及2, 213 RU。此單位（RU ) 對應於質量/單位面積；1 RU = 1 pg /平方毫米。 將參考流動單元（流動單元-2 )，以相同於上述的方 式，在不含人類AILIM-IgFc下進行加蓋處理。 使磷酸鹽缓衝液經由流動單元（感測器晶片），以2 〇 微升/分鐘的流速而流動，並將每個純化的人類抗人類 AILIM單株抗體（在上述實施例中製備），加到其中（1〇 到50微克/毫升；60微升）。 測量的標準條件是：結合相3分鐘，以及解離相1 〇分 鐘。隨著時間監測個別結合到抗原以及從抗原釋放出來的 抗體量’以得到感測圖。抗體從抗原中之解離，是藉由經 過感測器晶片，以20微升/分鐘流速流動的PBS而達成。 根據所得的感測圖數據，結合速率常數（k a )、解離 速率常數（kd)及解離常數（Kd ; Kd = kd/ka )，是利用套 組所附的分析軟體（BIAevaluation 3.0)而計算。 對於上述實施例所製備的人類A丨L丨Μ，老鼠單株抗體 SA1 2及SG430的親和力及中和活性，也是以相同於上述的 方式而分析。 所得到的個別值顯示如下。
2125-3981-PF.ptd 第140頁 1304811 五、發明說明（137) 純種系名 < ka (l/M·秒）> < kd [1/秒]> < Kd (M)> AIF34 (JMab-124) 1.6χ l〇< Ι.Οχ 10-* 6.3x 10-J AIF182 (JMab-126) 3.2x l〇< 2.8x 10-5 8.8χ 10·10 AIF348 (JMab-127) 1.9x 10* 6.4x l〇-i 3.Αχ ΙΟ'9 AIF620 (JMab-128) l.lx 10+ l.lx 10·* Ι.Οχ ΙΟ'8 AIF1052(Jmab-135) 1.6x 10* ΰ.3χ 1〇-ί 3.9x 10-9 AIH5D3 (JMab-136) 2.8x l〇4 4.9x 10-6 AIH386 (JMab-137) 1.2x l〇5 3.lx 10-4 2.6x ΙΟ'9 AII289 (JMab-138) 3.7χ l〇« 4.2χ 10--5 l.ixCid·® ^ AII394 (JMab-139) 3.1xl〇4 2_4x 10-5 7.7x (l b·10 J AII488 (JMab-140) 2.3x l〇4 3.5x 10-5 1.5x 10.9 AIJ40 (JMab-141) 1.9x l〇* 1.9x 10-5 1. Ox io-9 SA12 7.8x l〇3 7.9x l〇-i 1. Ox 10-8 SG430 2.2x 10+ 1.5x !〇·♦ 6.8x 10·9 結果顯示所有的人類抗人類A ! L〗Μ單株抗體以及抗人 類AILIM的老鼠單株抗體’對於人類人丨以^都具有明顯的高 結合親和力以及中和活性。 實施例7 :人類抗人類a I LIΜ單株抗體對於在人類τ細胞中 傳遞共同刺激訊息之活性 也分析本發明之人類抗人類Α丨L丨Μ單株抗體是否具有 控制（增強及/或抑制）人類Τ細胞反應（細胞激素（例 如’IFN-了 、IL-4)的產生 '細胞增殖等等）之能力，換 句話說，分析抗體對KAILIM調節的共同刺激訊息之細胞
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疋否具有調控活性。分析是根據在人類τ細胞中 所產生的細胞激素（IFN~ 7及IL-4 )的量，以及人類Τ細 胞增殖的程度作為指標。 <7-1 >抗體的稀釋 將抗人類CD3單株抗體0KT3 (ATCC CRL-800 1 )，以磷 酸鹽緩衝液（PBS )稀釋到8微克/毫升的最終濃度。
將上述製備的各種人類抗人類AILIM單株抗體，以PBS
稀釋到40微克/毫升的最終濃度。將抗體溶液進一步以PBS 稀釋’以製備各種濃度的抗體（4〇微克/毫升到〇. 〇〇49微 克/毫升）。 <7-2>以抗體覆蓋微量盤 將96孔微量盤的每個槽孔’（丨）以抗人類⑶^單株抗 體OKT3 (8微克/毫升；每個槽孔25微升），以及各種人類 抗人類AILIM單株抗體（4〇微克/毫升到〇〇〇49微克/毫 升’每個槽孔25微升）覆蓋’或（2 )單獨以抗人類CD3單 ，抗體ΟΚγ (8微克/毫升；每個槽孔25微升）覆蓋。將微 里盤在37 t培養2小時。接著，丟棄抗體溶液，並將每個 槽孔以PBS清洗3次。清洗後，將含 培養液加到每個槽孔（1〇〇微升/槽孔），並將微量盤在37 C培養1小時。藉此’每個槽孔都以上述（1 )或（2 )的 抗體所覆蓋。 對照實驗是利用下列單株抗體作為對照抗體，以取代 人類抗人類AILIM單株抗體而覆蓋的微量盤’以相同的方 式而進行。
1304811 五、發明說明（139) (1)對抗人類AILIM的老鼠單株抗體SA12或SG430 (JP-ALL-29599 (實施例 12)及W098/3821 6 (實施例 12) (2) 老鼠抗人類CETP單株抗體JHC1 (也稱為 JMabl09 ;JP-A 9-20800);以及 (3) 人類抗KLH單株抗體（也稱為jMab23 ;上述實施 例）。 將以抗體覆蓋的微量盤用於以下以下分析。 <7-3>人類T細胞懸浮液之製備 將周圍血液從每個正常健康的人中收集（5人；供體 A、B、C、D及E )。將含有單核球細胞的流份，利用 LymphoPrep ( Nycomed )以密度梯度離心法而製備。藉由 使用Pan-T細胞分離套組（Miltenyi)及磁分類器，根據 實驗方法的操作，而將人類T細胞從人類單核球細胞的流 伤中分開。τ細胞計數是利用血球計數儀而測定。將人類τ 細胞懸浮於含有10%FCS的RPMI 1 640培養液，以製備人類 T細胞懸浮液（1 X 1 〇6細胞/毫升）。 <7-4>細胞培養 (1)利用以抗人類CD3抗體以及抗人類AILIM抗體 之微量盤培養 盖 將人類T細胞懸浮液（供體A、B、c、D或E ; 100微升/ 槽孔；1 X 1 〇5細胞/槽孔）加到以上述抗體覆蓋之微量盤 的每個槽孔，並將微量盤在二氧化碳培養箱中，以37培 養3天。 β
1304811 五、發明說明（140) 培養後’將所得的培養懸浮液（50微升）之分鐘，儲 存在-20 °C ’然後用於下述的分析（分析IFN τ ) ^取樣培 養懸浮液的分裝物之後，將個別的微量盤用於以下的分 析： (2)利用單獨以抗人類CD3抗體覆蓋之微量盤培養 將人類T細胞懸浮液（供體D ; 100微升/槽孔；1 X 1〇5 細胞/槽孔）加到以上述抗體覆蓋之微量盤的每個槽孔， 然後加入各種人類抗人類^以^單株抗體（25微升；40微 克/毫升-0. 049微克/毫升）。將微量盤在二氧化碳培養箱 中，以37。(：培養3天。
<7-5>Τ細胞增殖活性的測定 在培養後，將曱基[3Η]胸癌咬（0.5微居禮/槽孔； Amersham-Pharmacia)加到微量盤的每個槽孔，並將微量 盤在二氧化碳培養箱中，以37 °C培養6小時。培養後，利 用細胞回收機將細胞放到GF/C濾紙（Packard )。接著， 將濾紙在40°C乾燥3小時或更久，然後加入MiCr〇scinti 〇 (20微升/槽孔；packard )。在濾紙上併入細胞的3H放射 活性，是藉由沒-計數器（TOP COUNT )測量，以分析培養 後T細胞增殖的程度。
結果顯示在第15到39圖。 當微量盤是以抗人類A ILIM單株抗體（人類單株抗體 或老鼠單株抗體）以及抗人類CD3抗體覆蓋時，這個分析 結果’顯示人類T細胞是明顯地根據細胞的濃度而增殖。 另一方面，當微量盤是單獨以抗人類CD3抗體覆蓋
2125-3981-PF.ptd 第144頁 1304811 五、發明說明（141) 時’並且在培養細胞的期間’使用在溶液中（液相）之抗 人類AILIM單株抗體（人類單株抗體或老鼠單株抗體） 時，人類T細胞並沒有明顯生長， <7-6>在T細胞培養上清液中IFN r之定量 對於<7-4>中（1)中所說明的T細胞（供體B及C)之個 別培養物，在培養上清液中的IFNr的量，是藉由市售的 人類 IFNrELISA套組而測定（Amersham-Pharmacia ; Endogen )。 結果顯示於第4 〇到4 7圖。 這個_分析結果’顯示IFN 7的產生是明顯地根據抗人 類AILIM單株抗體（人類單株抗體或老鼠單株抗體）的濃 度而增加。 實施例8 :人類抗人類AILIM單株抗體對於混合的淋巴球反 應（MLR )之調控活性 fί /本v發4明之人類抗人類A 1 L 1 M單株抗體是否可控制 ά 5抑制）Τ細胞反應（細胞激素例如I F Ν - 7、 節的丘π 备田胞增殖等），即測試是否可調控Α 1 L 1Μ調 混合淋巴球反庫細⑯’係藉由分析與同種異體的 的活性（簡+ μ】種異體的MLR)有關之控制Τ細胞增殖 <H>人_°MC之及TD二在細/中的合成〕，而作為指標。 從每個正常健康的；製備 _ 1)、£、卩及〇)之周圍心、中收集（7人；供體八4、（：、 ° 血液（200毫升），分散在微管（50
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毫升，Falcon)中之Lymph〇prep 層上（15 毫升；Nyc〇raed )。離心之後（1，600轉/分鐘；1 0分鐘），回收中間層。 將回收的細胞稀釋2次，或進一步以磷酸鹽緩衝液稀釋， 然後離〜（1，8〇〇轉/分鐘；1〇分鐘）。藉此製備pBMC (周 圍血液單核球細胞；2 X 1 08-5 X 1 08細胞）。細胞計數是利 用也球計數儀而測定。將要用於MRL分析的細胞之分裝 (1. 08 X 1 〇8細胞/9微量盤）取出並置於冰上。將剩下的 細胞用於以下T細胞的分離。 使用PanT分離套組（Miltenyi Biotech)從PBMC中分
離T細胞。根據套組所附的手冊，將剩下的pBMCs加到套組 所附的溶液中’並且培養溶液。接著，將細胞以含有5 mM EDTA及0. 5 %BSA的PBS清洗，然後再懸浮於PBS中。接著， 將細胞懸浮液加到以PBS膨潤的陽性篩選管柱VS + (Mi 1 tenyi Biotech ) ’並回收未吸附的流份。此外，將 PBS裝填至管柱，並回收清洗的溶液。相同的處理重複一 次。將回收的溶液合在一起，得到T細胞流份。在τ細胞流 份離心之後，將細胞再懸浮於PBS中。所得的T細胞之計數 是利用血球計數儀而測定。將細胞用於以下的分析。 <8-2>混合淋巴球反應（MLR) 如上所述，兩個訊息途徑：一個在CD28及CD80 (B7-1 )/CD86 (B7-2)之間，另一個在CTLA-4 與 CD80 (B7-1) /CD8 6 (B7-2 )之間，其相當詳細的分析先前已經完成， 已知是淋巴球（例如，T細胞等）的活化所需之共同刺激 的訊息傳遞途徑。
2125-3981-PF.ptd 第146頁 1304811 五、發明說明（143) 簡言之’對於混合淋巴球反應（MLR )的T細胞之增 殖，可藉由經過兩種已知途徑的每一種之訊息傳遞而誘 發。 因此’藉由使用以下所示之物質進行本發明之測試， 以分析：（1 )藉由阻隔CTLA-4調節的訊息傳遞途徑之MLR 的抑制；（2 )藉由阻隔CD80 (B7-1 ) /CD86 (B7-2 )調節 的訊息傳遞途徑之的抑制；（3 )藉由阻隔CTLA-4調節 的訊息傳遞途徑以及CD80 (B7-1)/CD86 (B7-2)調節的 訊息傳遞途徑之MLR的抑制；（4)藉由阻隔有關AILIM的 三級訊息傳遞途徑之MLR的抑制；以及（5 )藉由阻隔 CTLA-4調節的訊息傳遞途徑以及AILIM調節的訊息傳遞途 徑之MLR的抑制。 使用以下的測試物質： (1) 人類抗人類AILIM單株抗體（在上述實施例中製 備）； (2) 老鼠抗人類AILIM單株抗體SA12 (相同於上述實 施例）； (3) 人類抗KLH單株抗體（陰性對照組；相同於上述 (4) 老鼠I gG抗體（抗人類CD3 4 ;陰性對照組；
Immunotech )； (5) 抗人類CD80單株抗體（Pharmingen)及抗人类貝 CD86單株抗體（Pharmingen)之混合物；以及 (6) 人類 CTLA4-IgFc 嵌合分子（Ancell)。
2125-3981-PF.ptd 第 147 頁 1304811 五、發明說明（144) 混合淋巴球反應（MLR )是利用在上述< 8 _ 1 >的供體所 製備的PBMCs及T細胞’在以下6種組合中進行。 (i ) T細胞（供體A ) /PBMC (供體D ) (ii) T細胞（供體D)/PBMC (供體B) (iii) T細胞（供體C ) /PBMC (供體a ) (iv) T細胞（供體E)/PBMC (供體G) (v) T細胞（供體F ) /PBMC (供體E ) (vi) T細胞（供體G ) /PBMC (供體F ) 如下所述’調整使用於測試中的PBMCs及T細胞之濃 度。 將PBMCs懸浮於PBS中，然後轉移至培養皿（6〇毫米 )，將細胞以放射器（Hitachi MEDICO)進行X光照射 (5 0 G y )。回收細胞，離心，然後加到含有1 〇 % ρ [ §之 RPMI 1 640培養液。將細胞計數調整到2 χ 1〇5細胞/5〇微 升。 從每個供體中所得的τ細胞也加到含有丨0 %FCS之 RPMI 1 640培養液，並將細胞計數調整到ιχ 1〇5細胞/5〇微 升。 <8-2-1〉藉由人類抗人單株抗體之MLR的抑制 將含有1 0 %FCS之RPMI 1 640培養液加到具#u型槽孔之 96孔微量盤的每個槽孔中。將人類抗人類AIUM單株抗體 或老鼠抗人類AILIM單株抗體SA12的溶液，以含有i〇%FCS 之RPMI 1 640培養液稀釋，以製備具有各種抗體濃度之溶 液。將稀釋的抗體溶液加到槽孔中（最終濃度：、
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0.31、1.25、5及20微克/毫升）。接著，細胞（5〇微 升）加到槽孔中。將微量盤在二氧化碳培養箱中（NApc〇 )，以37 C培養1小時。反應完成後，將衍生自不同供體 的PBMCs ( 50微升）加到槽孔中，以起動壯尺。 當MLR利用除了人類抗人類AIL IM單株抗體（說明於上 述（3 ) % ( 6 ))之外的抗體作為測試物質而進行時，使 衍生自不同供體的τ細胞，在PBMCs#測試物質培養之後進 行反應。 在培養的第5天，將以含有1〇%FCS2RpMI164〇培養液 稀釋之標示氤的胸嘧啶（3H_胸嘧啶；2〇微升；1微居禮/ 槽孔）加到每個槽孔中。繼續培養丨天。培養完成之後， 利用細胞回收機（Packard)回收細胞。併入細胞的⑽放 ^活性，是藉由Θ -計數器（T0P c〇UNT )測量，以分析培 養後T細胞增殖的程度。 結果顯示在第4 8到5 9圖。 <8-2-2〉在MLR系統中，藉由人類抗人類AIUM單株抗體之 MLR的抑制，其中CTLA_4調節的訊息傳遞途徑已先前地被 將含有1 0 %FCS之RPMI 1 640培養液加到具#u型槽孔之 96孔微量盤的每個槽孔中。將人類抗人類“以肘單株抗體 或老鼠抗人類AILIM單株抗體SA12的溶液，以含有1〇%FCS 之_4。培養液稀釋，以製備具有各種抗體3濃有 =CS 液。將稀釋的抗體溶液加到槽孔中（最終濃度：〇、 〇· 31、1. 25、5及20微克/毫升）。接著，將τ細胞（5〇微
1304811 五'發明說明（146) 升）加到槽孔中。將微量盤在二氧化碳培養箱中（NAPC0 )，以3 7 °C培養1小時。 除了 T細胞的培養之外，在將人類CTLA4-IgFc加到 PBMCs後，獨立培養衍生自其他供體的PBMCs (在含有1〇 % FCS之RPMI1640培養液中）。培養是在二氧化碳培養箱中 (NAPC0 )，以37 °C培養1小時。在MLR開始時，將 CTLA4-IgFc的濃度調整至20微克/毫升。 接著，將PBMCs ( 50微升）加到上述T細胞培養物中， 以起動MLR。 當MLR利用除了人類抗人類AIL IM單株抗體（說明於上 述（3 )到（5 ))之外的抗體作為測試物質而進行時，使 衍生自不同供體的T細胞，在PBMCs (其已在CTLA4-IgFc的 存在下培養）與測試物質培養之後進行反應。 在培養的第5天，將以含有l〇%FCS之RPMI 1 640培養液 稀釋之標示氚的胸嘧啶（3H-胸嘧啶；20微升；1微居禮/ 槽孔）加到每個槽孔中。繼續培養1天。培養完成之後， 利用細胞回收機（Packard )回收細胞。併入細胞的3H放 射活性’是藉由/3 -計數器（TOP COUNT )測量，以分析培 養後T細胞增殖的程度。 結果顯示在第6 0到6 9圖。 從上述兩個測試所得到的結果，摘要如下： (1) CTLA4-IgFc阻斷CTLA4調節的訊息傳遞，並藉此 .抑制同種異體的MLR所誘發的T細胞增殖。 (2) 抗CD80抗體及抗CD86抗體抑制由CD80/CD86調節
2125-3981-PF.ptd 第150頁 1304811 五、發明說明（147) 的訊息傳遞’而CD80/ CD86是CTLA4及CD28之配體，並藉 此抑制同種異體的MLR所誘發的T細胞增殖。 (3)抗人類AILIM之早株抗體’像是CTLA4_IgFc、抗 CD80抗體及抗CD86抗體，明顯地以抗體濃度依賴之方式， 抑制與AILIΜ調節的訊息傳遞有關之同種異體的μ l R所誘發 的Τ細胞增殖。 換句話說’除了已知由CTLA4/CD80/CD86所調節的途 徑及由C D 2 8 / C D 8 0 / C D 8 6所調節的途徑，作為τ細胞活化所 需的共同刺激訊息傳遞途徑，以及AILIΜ調節的訊息傳遞 途徑之外，這些結果顯示由AILIΜ及其配體調節的三級途 徑，是藉由對抗AILIΜ的抗體而抑制。 此外’ AI LIΜ調節的途徑對訊息傳遞的貢獻，可相較 於CTLA4/CD80/CD86調節的途徑以及CD28/CD80/CD86調節 的途徑對訊息傳遞的貢獻，也有增加的可能性。 . 實施例9 :人類抗人類A ILIΜ單株抗體對於誘發抗體依賴性 的細胞毒性（ADCC )之活性 由抗體所引起的生物活性包括抗體依賴性的細胞毒性 (ADCC )之誘發。ADCC是一種需要除了受動細胞及標的細 胞以外的抗體之細胞毒殺作用’其在受動細胞（淋巴球、 巨嗤細胞或多形核白血球）誘發之標的細胞上誘發損害。 本發明之抗人類AILIM單株抗體對於誘發ADCC的活 性，分析如下： 將wCr (0· 1 毫居禮/1〇6 細胞；Amersham-Pharmacia )
2125-3981-PF.ptd 第151頁 1304811 五、發明說明（148) 加到上述實施例製備之大量表現人類AILIM的重組HPB-ALL 細胞之培養物中，並將混合物在37。(：培養2小時。將細胞 以R Ρ ΜI 1 6 4 0培養液清洗8次。將同位素標示的細胞使用作 為標的細胞。 對照組實施例是以相同於上述的方式，利用以同位素 標示的野生型人類HPB-ALL細胞作為對照組細胞。 藉由使用Lymphosepar I (IBL) ，PBMC流份是從正常 健康的人所收集的周圍血液而分離。將所得的人類PBMCs 使用作為受動細胞。 將標的細胞（1 x 1 〇4細胞/槽孔；25微升/槽孔）置於 具有ϋ型槽孔的96孔微量盤（Nunc )的每個槽孔。接著， 以含有5 %FCS之RPMI 1 640培養液稀釋的各種濃度之人類抗 人類AILIM單株抗體（〇.〇〇〇「；!.〇微克/毫升；25微升/槽 孔）、單獨培養液（25微升/槽孔）或1 %Nonidet P40 (25微升/槽孔；具有溶解細胞活性的清潔劑），加到每 個槽孔中’並將微量盤在室溫下培養2〇分鐘。 利用抗人類CD3單株抗體〇KT3 ( ATCC CRL-800 1 )作為 陽性對照組抗體’以取代抗人類A丨L丨Μ抗體，以相同於上 述的方式進行培養。 接著’將受動細胞（Ε/Τ比=50 ; 1 X 105細胞/槽孔； 50微升/槽孔）加到每個槽孔中，並將微量盤在二氧化後 培養箱中’以37 t：培養16小時。 培養後，將樣品離心（4。(：，1，500轉/分鐘，1 〇分鐘 )°回收所得的上清液。在離心上清液中的放射活性，是
1304811 五、發明說明（149) 以T計數器而測量。放射活性代表細胞膜受到ADCC而損 害，51C r從細胞釋放到培養上清液的量。 細胞膜受損的百分比（細胞溶離百分比），其由抗 AILIM抗體或抗CD3抗體所誘發的ADCC而引起，是假設單獨 培養液所觀察到的放射活性對應〇 %的細胞膜受損（〇 )， 以及Non i de t對應1 0 0 %的細胞膜受損的情況下測定。 結果顯示在第70及71圖。 測試的結果顯示本發明之人類抗人類A ILI Μ單株抗 體，是以濃度依賴性的方式，具有誘發ADCC之活性。 實施例10 :人類抗人類AILIM單株抗體之基因及胺基酸的 測定及其分析 如下所述’測定編碼各種人類抗人類A丨LIΜ單株抗體 的重鏈cDNAs及輕鏈cDNAs的序列，其已在上述實施例中製 備。同時也分析這些基因的結構特徵。 藉由使用Quick Prep mRNA純化套組 (Amersham-Pharmacia)，將聚A+ RNAs 從每個融合瘤 (選殖株：AIH5D3 (JMab-136) 、AII 289 (JMab-138)及 AII 394 (JMab-139))中萃取並純化，這些融合瘤製造對 抗上述實施例中製備的人類AILIM之人類單株抗體。 將融合瘤細胞懸浮於細胞胞溶緩衝液中（胞溶緩衝液 )’並藉由使用針筒將其溶解而胞溶。將寡（dT)樹脂加到 溶解的材料中’並將混合物溫和地搖晃。接著，清洗寡 (dT)樹脂，然後將聚A+ RNA以沖提緩衝液沖提。將沖提的
1304811 五、發明說明（150) 聚A+ RNA以酒精沈澱。然後溶解在Tris_EDTA緩衝液。所 付到的聚A+ RNA之濃度，是藉由波長260 nm的吸光值而測 定。 藉由使用聚A+ RNA作為模板，根據M-MLV反轉錄酶 法’利用市售的cDNA合成套組（Gibco BRL )以及合成的 寡DNA Not I-T (序列編號：1 )作為引子，而合成雙股 cDNA。 特別地’單股cDNA是在含有聚A+ RNA (約5微克） (純化自融合瘤作為模板）、引子（約40 0 pmo 1 )及 M-MLV反轉錄酶的溶液中（約5 〇微升），在3 7。(：反應1小時 而合成。接著，將dNTP、DNA聚合酶I、RNaseH、DNA接合 酶、缓衝液及蒸餾水，加到反應溶液中（4微升），並將 混合物在16 °C培養2小時，以合成雙股cDNA。將所得的雙 股cDNA以酚/氯仿萃取，然後以酒精沈澱。 接著，將EcoRI連接子DNA (約300 pmol )及DNA接合 酶（Ligation High ; 33微升；Τ0Υ0Β0)加到在TE緩衝液 中含有雙股cDNA的溶液（約50微升），並將混合物在16 °C 培養大約80分鐘，以將cDNA與連接子DNA接合。所使用的 連接子DNA是由寡DNA ( 20 adp ;序列編號2 )及寡DNA ( 24 adp ;序列編號3 )所組成的雙股DNA，藉由一般的方法， 其5 ’端已被填酸化並且互相煉回。 將DNA接合物以酚/氣仿萃取’然後以酒精沈澱。接 著，將DNA反應物以市售的限制酶Notl (Τ0Υ0Β0 )切割， 然後以市售的ATP溶液（Gibco BRL)及T4激酶（Τ0Υ0Β0)
2125-3981-PF.ptd 第154頁 1304811 五、發明說明（151) 在37 °C培養30分鐘’以將其5,端磷酸化。將所得的dna以 酒精沈澱’然後以聚丙烯醯胺膠體電泳分化。將一片含有 大約500 bp到2000 bp的DNA之膠體切割。在切割膠體的同 時’以漠化乙鍵染色的DNA是在一照相裝置中，藉由照射 UV光而顯影。 將切下的膠體擠碎並懸浮在TE緩衝液中。將懸浮液離 心並回收所得的上清液。 將回收的DNA在市售的DNA接合酶（Ugation High ; TOYOBO)的存在下，連接到市售的又噬菌體載體 (0.25微克；人11^^1^111-?11&1'11^(^&)(16。(：培養3〇分鐘 )。在下個步驟中，將DNA接合物以市售的又噬菌體包裝 套組Gigapack III Gold (Stratagene)裝’入 λ 噬菌體- 中，並將所得的噬菌體顆粒感染大腸桿菌ΝΜ522 (作為宿 主），以製備cDNA資料庫。所有的操作都是根據套組所附 的實驗步驟而進行。 接著’將cDNA資料庫藉由溶菌斑雜合法而篩選 j Man 1 at is等人，π分子選殖：實驗室手冊”，冷泉港實驗 至’冷泉港’紐約），說明如下： 將cDNA資料庫（1 X 1 〇4溶菌斑）印於洋菜平板上，並 藉由使用Hybone-N尼龍膜（Amersham-Pharmacia)而製備 其複製物濾紙。根據溶菌斑雜合法，在雜合緩衝液中使用 以r32P-ATP標示的探針，而將複製物濾紙進行雜合處理。 所使用的探針是用於抗體輕鏈的H〗GLC (序列編號4 )以及 用於抗體重鏈的閭以之（序列編號5 )。單一溶菌斑的分離
第155頁 1304811 五、發明說明（152) 是從初次及二次篩選所得到的陽性選殖株而進行。 藉由使用每個陽性選殖株中的噬菌體懸浮液作為模 板，利用單一PCR引子及Taq PCR套組（TAKARA )，而將每 個抗體的重鍵及輕鍵以P C R放大。用於抗體輕鏈的一對引 子是EXcellE (序列編號6)及ckll7 (序列編號7)，以及 用於抗體重鏈的一對引子是EXcel 1E (序列編號6 )及 NHCc2 (序列編號5 )。將所得的pCR產物根據一般的方 法，以瓊脂糖膠體電泳而分化。將含有大約6〇〇 bp的⑽^ (對應於重鏈及輕鏈）之膠體片切下。從膠體中所純化的 DNAs之核苷酸序列，是利用DNa定序儀（373A : pE應用生 物系統）、ABI PRISM定序軟體（PE應用生物系統）及ABI PRISM自動組合儀（PE應用生物系統）而分析。證實從每 個陽性選殖株中得到的DNA都具有足夠的核苷酸序列長 |度。
曰，每個陽性選殖株的溶菌斑中得到的λ噬菌體感染大 腸桿菌ΝΡ66，《活體内切除有興趣的質體ΜΑ，並將所得 ，的絲^噬菌體印於含有氨苄青黴素的平板上，以得到菌 落。接著’以常用的方法從菌落中回收並純化質體DNAs， 並將大腸桿菌JM1 09以該等質體轉形。接著，將轉形的細 胞印於！有氨苄青黴素的營養洋菜平板上，以形成菌落。 ，著，在含有氨苄青黴素的“培養液中，將衍生自每 π ^細菌懸浮液轉移到一液體培養液中，並將細菌在 2 4小時。將細菌從培養液中回收，然後將質體 精質體純化套組（Quiagen )而純化。每個質體DNA 2125-3981-PF.ptd 第156頁 1304811 五、發明說明（153) 均以限制酶EcoRI/Notl切割，以證實載體DNA及插入DNA (重鏈cDNA或輕鏈cDNA )的存在。 編碼抗體重鏈及輕鏈的cDNA之每個核苷酸序列，其插 入在個純化的質體中，是藉由常用的方法，利用DNA定序 儀（377A : PE應用生物系統）、ABI PRISM定序軟體（PE 應用生物系統）及ABI PRISM自動組合儀（PE應用生物系 統）而測定。 用於序列測定的引子如下： 〈用於測定重鏈cDNA的引子〉 M13R引子（序列編號8 ;Stratagene) 、EXcellE (序 列編號6 ) 、136H (序列編號9 ) 、138/9H (序列編號10 )、AILIMHC1 (序列編號11) 、HCcl (序列編號12)、 NHCc2 (序列編號5 ) 、HCc7 (序列編號13 ) 、HCc8 (序列 編號14) 、HCc3(序列編號15) 、HCc4(序列編號16)、 HCc6 (序列編號17 ) 、HIGHC (序列編號18 ) 、HCc9 (序 列編號19) 、HCc5 (序列編號20 )以及聚A (序列編號21 )° 〈用於測定輕鏈cDNA的引子〉
M13R 引子（序列編號8 ; Stratagene ) 、EXcel 1E (序列編號6) 、AILIMLC1 (序列編號22 ) 、AILIMLC2 (序列編號23) 、LCcl (序列編號24 ) 、ckl 1 7 (序列編 號7 ) 、HIGLC (序列編號4 ) 、LCc2 (序列編號25 ) 、HIK (序列編號2 6 )以及聚A (序列編號2 1 )。 以下所示的序列表包含編碼對抗人類A I L I Μ的人類單
2125-3981-PF.ptd 第157頁 1304811 五、發明說明（154) 株抗體的重鍵及輕鏈之cDNA序列，其是由上述的每個融合 瘤所製造，以及包含該cDNA序列所推導的胺基酸序列。 選殖株 AIH5D3 ( JMab-136 ) 〈重鏈〉 D N A序列：序列編號2 7 (訊息序列：核苔酸編號6 9到 1 2 5，V區域：核苷酸編號1 2 6到41 9 ) 胺基酸序列：序列編號28 (包括訊息序列：胺基酸編 號1到19，可變區：胺基酸編號20到118 ) 〈輕鏈〉 DNA序列··序列編號29 (訊息序列：核苷酸編號39到 104，V區域：核苷酸編號105到386 ) 胺基酸序列：序列編號30 (包括訊息序列：胺基酸編 號1到22，可變區：胺基酸編號23到116 ) 選殖株AI 1 289 ( JMab-138 ) 〈重鍵〉 DNA序列：序列編號31 (包括訊息序列：核苷酸編號 9 4到1 5 0，V區域：核苔酸編號1 5 1到4 41 ) 胺基酸序列：序列編號3 2 (包括訊息序列：胺基酸編 號1到1 9，可變區：胺基酸編號2〇到11 6 ) 〈輕鏈〉 DNA序列：序列編號33 (訊息序列：核苷酸編號28到 8 7，V區域：核苷酸編號8 8到3 7 5 ) 胺基酸序列.序列編说3 4 (包括訊息序列：胺基酸編 號1到2 0，可變區：胺基酸編號2 1到11 6 )
2125-3981-PF.ptd 第158頁 1304811 五、發明說明（155) 選殖株AII394 (JMab_139 ) 〈重鏈〉 DNA序列：序列編號35 (訊息序列：核苷酸編號96到 152，V區域：核苷酸編號153到443 ) 胺基酸序列：序列編號3 6 (包括訊息序列：胺基酸編 號1到19，可變區：胺基酸編號20到116 ) 〈輕鏈〉 DNA序列：序列編號37 (訊息序列：核苷酸編號33到 92，V區域：核苷酸編號93到380 ) 胺基酸序列：序列編號38 (包括訊息序列：胺基酸編 號1到2 0，可變區：胺基酸編號2 1到11 6 ) 藉由使用分析基因序列的軟體，由Tom 1 inson等人 (Immunol. Today 16(5):237-242，1 995 )所構築之人類 免疫球蛋白可變區基因之資料庫V BASE序列，可搜尋此處 所測定的每個DNA序列。 結果顯示上述人類單株抗體之個別重鏈及輕鍵的V區 域基因，包含下列片段： 〈重鏈V區域基因〉 選殖株 AIH5D3 (JMab-136 ) :1-02 選殖株 AI1289 (JMab-138 ) :3-13 選殖株 AI1394 (JMab-139 ) :3-13 〈輕鏈V區域基因〉 選殖株 AIH5D3 (JMab-136 ) ：L5 選殖株 AI 1289 (JMab-138 ) ：A27
2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（156) 選殖株 AII 394 (JMab-139 ) : A27 實施例1 1 :人類抗人類A I L IΜ單株抗體對於延遲型過敏症 (D Τ Η )之抑制作用 生物的免疫反應系統，其功能是排除對活體有害的抗 原（病原性微生物’例如，病毒、細菌及寄生蟲、外來物 等），並可廣泛地分成先天免疫力及後天免疫力。 前者是基於非專一性的辨識之排除系統，包括吞噬細 胞（多形核白血球、單核球、巨噬細胞等）之吞噬作用； 天然殺手（ΝΚ )細胞之攻擊；以及藉由補體之抗原形成調 理作用等。 後者（後天免疫反應）是藉由淋巴球（主要是Τ細胞 及Β細胞）的排除系統，其獲得對抗原的專一性（活化 )° 此外’後天免疫反應可廣泛地分成細胞免疫力及體液 免疫力。 不像抗體依賴性的體液免疫力，細胞免疫力是一般藉 由Τ細胞對抗原（作為標的）的直接作用所表現之免疫反 應。細胞免疫力已知是涉及對病毒或腫瘤的免疫反應；組 織或器官移植後誘發的免疫反應；對某些藥物的過敏性； 以及一些自體免疫疾病。 屬於細胞免疫力的最典型現象是已知的結核菌素過敏 (通常與結核菌素過敏症同義）。結核菌素過敏是一種由 結核桿菌感染而誘發之延遲性過敏症。此過敏症是由於結
2125-3981-PF.ptd 第160頁 1304811 五、發明說明（157) 核桿菌的感染所引起，並可藉由將結核桿菌的培養上清液 所產生的結核菌素’以皮内注射到活體引起的免疫反應而 誘發。 延遲性過敏是藉由感應抗原的T細胞（記憶抗原之記 憶T細胞）所調節的過敏症。此過敏稱為M延遲型"，是因 為活體需要花2 4到4 8小時感應該抗原，當與該抗原再次接 觸時^以表現過敏反應伴隨由記憶T細胞所誘發之發炎。 結核菌素過敏的現象，其為延遲性過敏症之代表，一 般已被應用在”結核菌素測試"中，以診斷結核桿菌的感染 =引起之敏感，是否已在動物體中建立。特別地，該測試 疋以下述方式進行：純化的結核菌素（一般診斷使用純化 的蛋白質衍生物；PPD ; 〇. ；!毫升的衍生物，〇. 〇5微克/〇.丄 毫升（2. 5單位）），其為純化自結核桿菌培養物之結核 菌素蛋白質，是以皮内給藥至動物；在注射後的48小時測 量注射部位的表皮紅斑大軸；以及，結核桿菌感染的存 在可根據所測量到的大軸而診斷。如果紅斑的大軸小於 4公釐，則該病患是陰性的；如果紅斑的大軸是在4 _ 9公釐 内，則該病患是偽陽性；如果紅斑的大軸是1 〇公釐或更 大’則該病患是判定為陽性。 / 與細胞免疫力有關之延遲性過敏症的例子包括，例 如，由少，蛋白質或類似物所短暫誘發的Jones_Mote型過 敏症，對藥物之接觸性過敏症，例如，苦味酸氣或植物毒 素（例如，曰本免漆）；或與移植排斥有關之過敏症（例 如，同種異體的移植）；以及上述從感染性病原之抗原的
I 第161頁 2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（158) ' 過敏，例如，由上述結核桿菌所引起的結核菌素過敏症。 在這個測試中’抗A I L I Μ抗體對於延遲型過敏症的抑 制作用’是藉由使用上述的結核菌素測試而評估。該測試 是以下述方式進行： 將每隻西諾模（Cyn〇m〇lgUS)猴子（雄性，體重 6· 0-8. 5公斤，環境生物命科學研究中心公司；每組3隻 )’其已感應BCG (卡介苗；牛型結核桿菌之減毒活菌 )’以氣胺酮氫氯化物（10毫克/公斤；肌肉内注射）麻 醉’然後將0. 1毫升的量之下述任一測試樣品，在胸部之 注射部位皮内給藥（6個注射部位/隻）。樣品的注射部位 之間隔是3公分或更長。 (1) 人類抗人類AILIM單株抗體（jMab-136 ;0.2毫 克；每個注射部位1 〇微克）與結核菌素（4微克/毫升之生 理鹽水）之1 : 1的混合溶液； (2) 人類抗人類AILIM單株抗體（JMab_136 ; 2毫克； 母個注射部位100微克）與結核菌素（4微克/毫升之生理 鹽水）之1 : 1的混合溶液； (3) 麟酸鹽緩衝液作為對照組（p b g (_ )); (4) 市售類固醇抗發炎作用劑，pre(jn i s〇 1 〇ne ( 〇. 2 毫克；每個注射部位10微克）與結核菌素（4微克/毫升之 生理發水）之1 : 1的混合溶液，作為陽性對照組； (5) 人類抗KLH單株抗體（實施例<2_2> ; 2毫克； 每個注射部位1 〇微克）與結核菌素（4微克/毫升之生理鹽 水）之1 : 1的混合溶液’作為陰性對照組。
1304811 五、發明說明（159) 在每個樣品注射2 4小時 > 依 ,θ l ^ a , Α 吟之後’測量每個注射部位的紅 斑之大軸及小軸，以測定紅斑面積。 結果顯示在第7 2圖。 、结果顯示由遲延性過制_ „ ^ , αΛ 敏所弓丨起的紅斑’相較於對照組 及陰性對照組，在接受括Α Π Τ 1 «Λ ^ α 牡丧又1 L 1Μ抗體注射的任何一組中， 均被明顯地抑制。抑制效果 ^ ^ 卩制蚁果可與作為陽性對照組的類固醇 抗發炎樂物之效果相比較。 f : :1 2 ·在各種具有移植對抗宿主疾病（GVHD )的病患 ，、且織中之A I L IΜ表現的分析 曰在病患的活體切片中所得到的各種組織中，其中病患 疋從供體進行同種異體的移植之接受者，並且在移植後， 已臨床地診斷是受到急性或慢性的移植對抗宿主疾病 (GVHD )之影響，丸汎…的表現是藉由常用的方法而分 析將組織以犯及上述實施例製備的人類抗人類AILIM單 株抗體（JMab-136)而染色。 利用從急性GVHD病患（28例）收集到的各種組織之33 個樣品，以及從慢性GVHD病患（5例）收集到 之5個樣品，來進行分析。 徑姐螂 結果如下：AILIM的陽性反應，在29個皮膚組織的樣 品中發現1 5個；在3個胃組織的樣品中發現1個；以及^ 個直腸組織的樣品中發現1個；這些樣品均得自於糸， GVHD病患。AIL IM的陽性反應，在3個皮膚組織的'樣= 現1個；在2個直腸組織的樣品中發現2個；這此’ σσ 、2樣品均得
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五、發明說明（160) 自於慢性GVHD病患。此外’在明顯觀察到淋巴球 < /參透液& 13個樣品中，也發現10個AILIM的陽性反應。 α的 實施例13 :人類抗人類AILIM單株抗體對於在猴子？細 傳遞共同刺激訊息之活性 、”田胞中 實施例7所進行的實驗’已證實本發明之人類抗人； AI L IΜ早株抗體’可經由控制人類τ細胞反應，牲别θ」 1寸別疋控吿丨| AI LIΜ調節的共同刺激訊息傳遞至細胞，而增強 、买貝1細胎 的增殖。在這個測試中’分析人類單株抗體是否具有相S 於實施例7所說明的方法’而增強猴子Τ細胞的增殖的^同 性。 〈13-1>抗體之稀釋 將抗人類CD3單株抗體SP34 (BD-Pharmingen)以碟酸 鹽緩衝液（PBS )稀釋到最終濃度1微克/毫升。 將上述製備的人類抗人類AILIM單株抗體（JMab-136 )以PBS稀釋到最終濃度4〇微克/毫升。將抗體溶液進一步 以PBS稀釋’以製備各種濃度的抗體（4〇微克/毫升到, 0. 064微克/毫升）。 <13-2>以抗體覆蓋微量盤 將96孔微量盤的每個槽孔，以抗人類CD3單株抗體 SP34 ( 1微克/毫升；每個槽孔25微升），以及各種人類抗 人類AILIM單株抗體jMab-136 (40微克/毫升到0.064微克/ 毫升；每個槽孔2 5微升）覆蓋。將微量盤在37 °C培養2小 時。接著’丟棄抗體溶液，並將每個槽孔以PBS清洗3次。
2125-3981-PF.ptd 第164頁 1304811 五、發明說明（161) 清洗後，將含有10%代3的即旧1 64 0培養液加到每個槽孔 (1 0 0微升/槽孔），並將微量盤在3 7 t培養i小時。藉 此，每個槽孔都以上述的抗體所覆蓋。 對照實驗是利用人類抗KLH單株抗體（JMab23，參見 先刖實施例）作為對照抗體，取代人類抗人類A丨L丨M單株 抗體而覆蓋的微量盤，以相同的方式而進行。 將以抗體覆蓋的微量盤用於以下以下分析。 < 1 3 - 3 >猴子Τ細胞懸浮液之製備 將周圍血液從猴子中收集，並將含有單核球細胞的流 份’利用NycoPrep 1.077Α (Nycomed)以密度梯度離心法 而製備。藉由使用抗人類CD4抗體M-T477 (BD-Pharmingen )、抗人類 CD8 抗體 RPA-T8 (BD-Pharmingen )、抗老鼠 IgG微珠（Mi ltenyi )及磁分類器，根據實驗方法的操 作’而將猴子T細胞從猴子單核球細胞的流份中分開。τ細 胞計數是利用血球計數儀而測定。將猴子T細胞懸浮於含 有10%FCS的RPMI 1 640培養液，以製備猴子T細胞懸浮液 (1 X 1 06細胞/毫升）。 〈13-4>細胞培養 利用以抗人類CD3抗體以及抗人類AILIM抗體覆蓋之微 量盤培養 將猴子T細胞懸浮液加到以上述抗體覆蓋之微量盤的 每個槽孔，並將微量盤在二氧化碳培養箱中，以3 7 t培養 2天。 培養完成後，將個別的微量盤用於以下的分析：
2125-3981-PF.ptd 第165頁 1304811 五、發明說明（162) < 13-5>T細胞增殖活性的測定 在培養後’將曱基ρΗ]胸嘧啶（〇. 5微居禮/槽孔； Amersham-Pharmacia)加到微量盤的每個槽孔，並將微量 盤在二氧化碳培養箱中’以37。〇培養6小時。培養後，利 用細胞回收機將細胞放到GF/C濾紙（Packard )。接著， 將濾、紙在40°C乾燥3小時或更久，然後加入Microscinti 〇 (20微升/槽孔；packard ) ^在濾紙上併入細胞的3H放射 活性’是藉由石-計數器（T〇P COUNT )測量，以分析培養 後T細胞增殖的程度。 結果顯示在第73圖。 當微量盤是以抗人類AILIM單株抗體（人類單株抗體 或老鼠單株抗體）以及抗人類CD3抗體覆蓋時，這個分析 結果’顯示猴子T細胞是明顯地根據細胞的濃度而增殖。 結果也顯示本發明之人類抗人類AILIM單株抗體，可 與猴子AILIM結合’並且具有調控猴子AILIm的功能之活 性。 實施例1 4 :建立鑑定及定量可與A〗L丨μ或a ILIΜ配體結合的 物質之方法 建立EL ISA (酵素連結免疫吸附分析）方法，以鑑定 或定量可與AILIM (IC0S)或AILIM配體 (B7h/B7RP-l/GL50/LICOS)結合的物質。 以下詳細說明作為實施例的方法之原理，是根據估 計、藉由ELISA、對於由該物質所引起的可溶性八丨[^1 Μ
2125-3981-PF.ptd 第166頁 1304811 五、發明說明（163) (hAILIM-IgFc)與可溶性AILIM配體（hB7h-IgFc)之間 的結合之抑制程度而建立。 <14-1>樣品 使用以下的樣品： (1) 抗生物素蛋白鏈菌素-瘅菜過氧化酶（南方生技 聯合公司）； (2) 可溶性人類AILIM配體（人類B7h的細胞外區域及 人類I gG 1的恆定區之間的融合蛋白質）； 蛋白質是藉由說明於〈14-2>的方法而製備； (3) 標示生物素之可溶性AILIM_IgFc ; AILIM-IgFc疋根據本發明的發明者之一，Tezuka，早期申 請案（JP-A U-29599 (實施例 16(2))及W0 98/3821 6 (實施例1 6 (2 )))所說明之方法，藉由將所得的抗原進 一步純化而製備； (4) 人類抗人類AILIM單株抗體（JMab-136 ;如上所 述）； (5) 人類抗KLH單株抗體（陰性對照抗體；JMab23， 如上所述）； (6) 磷酸鹽緩衝液（pbs(-) ;Nikken Seibutsu); (7) PRMI 1640 培養液（Nikken Seibutsu); (8) 胎牛血清（FCS ; JRH-Bui oscience ); (9) 30%牛也清白蛋白（BSA ;Sigma); (10) Tween20 (BioRad )； (11) TMB+基質色原（Dako)。
2125-3981-PF.ptd 第167頁 1304811 五、發明說明（164) <14-2>可溶性人類AILIM配體（人類B7h的細胞外區域及人 類IgGl的恆定區之間的融合蛋白質（hB7h-IgFc ))之製 備 以相同於上述實施例3所說明之方式，將總體rN a從人 類周圍血液衍生的單核球細胞中製備。將所得到的總體 RNA (5微克）作為权板，並利用合成第一股cDNA之 Superscript 預先放大系統（Gibco-BRL)，以合成 cDNA。 接著，設計並合成在個別端具有Xh〇 I限切位的5，引子 (5’-GAGGTCTCCGCCCTCGAGATGCGGCTGGGCAGTCC-3，；序列 編號3 9 )，以及具有BamI限切位的3，引子 (5’-CACAGGACAGCCAGGGGATCCCACGTGGCCGCG-3，；序列編 號40) ’以藉由PCR放大編碼人類AILIM配體（B7h)的細 胞外區域之cDNA。利用cDNA作為模板以及引子對，進行 PCR以製備在其個別端具有Xhol及BamI的DNA，其包含編碼 人類B7h的細胞外區域之cDNA。將所得的PCR產物以Xh〇l及 B a m I切割’藉由壤脂糖膠體電泳分化，以分離對應大約 72 0 bp的cDNA片段之條帶，這個片段被預測為編碼所要的 細胞外區域。將分離的cDNA片段次選殖到以xh〇i及Bami預 先切割的質體pBluescript II SK ( + ) (Stratagene)。 利用自動螢光DNA定序儀（應用生物系統）的定序分析， 證實該cDNA片段包含編碼人類B7h的細胞外區域部份。 另一方面，編碼人類I g G1的F c以作為融合夥伴之 DNA，是藉由以BamI及Xbal切割質體（參見，Cell 61:1303-1313 ’1990 ;由Seed博士等人在麻州综合醫院所
2125-3981-PF.ptd 第168頁 1304811 五、發明說明（165) 製備）’而製備成BamI-Xbal的DNA片段（約1. 3 kb )。這 個片段包含編碼人類IgGl、C 及C 的樞紐區域之外 顯子（exon)。 將編碼人類B7h (hB7h)的細胞外區域之XhoI-BamI片 段，以及由上述製備包含編碼人類IgGl的Fc (縮寫為 "I gFc")的外顯子之Bam I -Xba I片段，次選殖到以Xho I及 Xbal 預先切割的質體pBiuescript II SK ( + ) (Stratagene )。 接著，將質體以Xhol及Xbal切割，以製備包含人類 B 7 h細胞外區域及人類I g F c之間的融合D N A之大約1 · 8 k b的 DNA片段。藉由使用T4 DNA接合酶，將此融合DNA片段插入 到Xhol及Xbal位置之間的表現載體pME18S (醫學免疫學 20(1):27-32 ’1990 ;以及"遺傳工程手冊"實驗醫學：増 刊’ Yodosha ’第101-107頁’1992)，以構築質體 phB7h-IgFc 〇 在含有10 %胎牛血清及氨T青黴素的DMEM培養液中， 將培養到半滿的單層C0S7細胞（ATCC CRL-1651 )，藉由 電轉殖的方法以質體phB7h- I gFc轉形，以產生轉形細胞。 藉由在不含血清的ASF104培養液中培養72小時，而使 轉形細胞表現116711-18?〇。 將hB7h-IgFc藉由使用蛋白質G瓊脂糖親和力管柱 (Amer sham-Pharmac i a )而純化，說明如下: 將上述的培養上清液離心得到離心上清液。將所得的 上清液裝到以結合缓衝液預先平衡的蛋白質G瓊脂糖親和
2125-3981-PF.ptd 第 169 頁 1304811 五、發明說明（166) --- 1、g柱/接著’將管柱以結合緩衝液清洗，然後以沖提緩 液進行冲提。回收沖提液然後以磷酸鹽緩衝液透析。將 外部的透析緩衝液更換2次或更多。藉此得到純化的 hB7h-IgFc 。 <14-3〉抗體及可溶性人類aium (hAlLlMlgFc)的稀釋及 其反應 將抗人類AILIM單株抗體（jMab_136)及人類抗KLH單 株抗體（JMab-23)作為陰性對照抗體的原始溶液（2〇微 克/毫升），連續稀釋11次，並將每個樣品與2〇〇微升含有 10 %FCS的RPMI 1 640培養液結合並混合均勻。藉此製備各 種濃度的抗體溶液。將各種濃度脂標示生物素的 hAILIM-IgFc (2微升/管；最終濃度！微克/毫升）加到每 個所製備的溶液中。將所得的溶液並混合均勻並在室溫培 養3 0分鐘。 <14-4>抗AILIM單株抗體對於抑制hAILIM-IgFc及 hB7h-IgFc間的結合之活性分析 將hB7h~IgFc加到96孔微直盤的每個槽孔（5〇微升/样 孔，800 ng/槽孔）。將微量盤密封並在37 °C培養1小時。 將溶液從每個槽孔中移除’然後將槽孔以p B S ( 1 2 0微升） 清洗3次。接著，將含有〇. 5 %BSA的PBS加到每個槽孔 (1 00微升/槽孔），以阻隔未反應的部位。將微量盤密封 並在37 °C培養1小時。培養之後’移除溶液並將槽孔以pBs (1 2 0微升）清洗3次。接著’將< 1 4 - 3 >所製備的每個樣品 (50微升/槽孔）加到槽孔。將微量盤密封並在37 ^ $養^
1304811 五、發明說明（167) 小時。從每個槽孔中移除溶液。將槽孔以在3 7 °C預熱，含 有10 %FCS的RPMI 1 640培養液（20 0微升）清洗3次。接 著，將含有3. 7%福馬林的PBS (100微升/槽孔）加到每個 槽孔，並將微量盤在冰上培養5分鐘。從每個槽孔中移除 溶液，並將槽孔以0. 1 %Tween20 ( 1 20微升）清洗3次。接 著，加入抗生物素蛋白鏈菌素掉菜過氧化酶（50微升/槽 孔）。將微量盤密封並在室溫培養3 0分鐘。從每個槽孔中 移除溶液’並將槽孔以0.1%Tween20 (120微升）清洗3 次。接著’加入TMB+基質色原（50微升/槽孔）。將微量 盤密封並在室溫培養20分鐘◊從每個槽孔中移除溶液，並 將槽孔以0. 1 %Tween20 ( 1 20微升）清洗3次。接著，加入 硫酸（50微升/槽孔）以停止反應。藉由THERMO max (分 子儀器公司）’在450 nm的波長測量每個槽孔的吸光值。 結果顯示在第74到76圖。 結果顯不抗AILIΜ抗體具有以劑量依賴性的方式，抑 制h AI LIΜ - I g F c及h Β 7 h - I g F c間的結合之活性。 因此’這個實施例顯示，本發明所示的分析系統可用 於篩選及鑑定可與AILIM或AILIM配體結合的物質（例如， 抗體或合成的低分子量化合物）。 實施例15 :人類抗人類AILIM單株抗體對於 配體調節的共同刺激訊息傳遞有關之人類τ細胞增殖的抑 制活性 根據人類抗人類AILIM單株抗體對於接觸人類了細胞及
2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（168) AILIM配體（B7h/B7RP-1/GL50/LICOS)所誘發之細胞增殖 的抑制效果’分析本發明之抗人類A丨L〗Μ單株抗體是否對 於人類Τ細胞表面的a I L I Μ調節之訊息傳遞具有調控的活 性。 <15-1>抗體之稀釋 將抗人類CD3單株抗體〇KT3 (ATCC CRL-80 0 1 )以攝酸 鹽緩衝液（PBS )稀釋到最終濃度8微克/毫升。 將上述製備的可溶性人類AILIM配體（hB7h-IgFc)以 PBS稀釋到最終濃度4〇微克/毫升。將抗體溶液進一步以 PBS稀釋’以製備各種濃度的抗體（4〇微克/毫升到〇 〇64 微克/毫升）。 <15-2>以抗體覆蓋微量盤 將96孔微量盤的每個槽孔，以抗人類CD3單株抗體 0KT3 (8微克/毫升；每個槽孔25微升），以及hB7h_IgFc (40微克/毫升到〇. 〇64微克/毫升；每個槽孔25微升）覆 盍。將微ϊ盤在37 C培養2小時。接著，丢棄抗體溶液’ 並將每個槽孔以PBS清洗3次。清洗後，將含有1 〇 %FCS的 RPMI1640培養液加到每個槽孔（1〇〇微升/槽孔），並將微 量盤在37 °C培養1小時。藉此，每個槽孔都以上述的抗體 所覆蓋。 <15-3>人類T細胞懸浮液之製備 將周圍血液從人類正常健康的人中收集，並將含有單 核球細胞的流份’利用LymphoPrep (Nycomed)以密度梯 度離心法而製備。藉由使用pan_T細胞分離套組
2125-3981-PF.ptd 第172頁 1304811 五、發明說明（169) (Mi 1 tenyi )及磁分類器，根據實驗方法的操作，而將人 類T細胞從人類單核球細胞的流份中分開。τ細胞計數是利 用血球計數儀而測定。將人類T細胞懸浮於含有i 〇 %FCS， 並補充人類抗人類AILIM單株抗體JMabl36 (20微克/毫升 )的RPMI 1 640培養液。將所製備的人類τ細胞懸浮液（1 X 1 06細胞/毫升）在室溫培養3〇分鐘。 使用人類抗KLH單株抗體JMab23 (20微克/毫升）作為 陰性對照抗體。 < 1 5 - 4 >細胞培養 以相同的方式’將人類T細胞懸浮液（1 〇 〇微升/槽 孔；1 X 1 05細胞/槽孔）加到以抗人類CD3抗體及 hB7h-IgFc覆蓋之微量盤的每個槽孔，並將微量盤在二氧 化碳培養箱中，以3 7 t培養3天。 < 1 5 - 5 > T細胞增殖活性的測定 在培養後’將曱基[3H]胸嘧啶（〇. 5微居禮/槽孔； Amersham-Pharmacia)加到微量盤的每個槽孔，並將微量 盤在二氧化碳培養箱中，以3 7 °C培養6小時。培養後，利 用細胞回收機將細胞放到GF/C濾紙（Packard )。接著， 將漉紙在40 C乾燥3小時或更久’然後加入Microscinti 0 (20微升/槽孔；Packard )。在濾紙上併入細胞的3h放射 活性’是藉由/3 -計數器（TOP COUNT )測量，以分析培養 後T細胞增殖的程度。 結果顯不在第7 7圖。 在這個測試中所得到的結果顯示，人類T細胞的生長
2125-3981-I¥.ptcl 第173頁 1304811 五、發明說明（170) 是明顯地取決於人類hB7h-IgFc的濃度（在使用陰性對照 抗體的分析中）。此外，抗人類A I L IΜ單株抗體也明顯地 抑制人類Τ細胞的增殖。 實施例16 :人類抗人類AILIM單株抗體對於與AILIM-AILIM 配體調節的共同刺激訊息傳遞有關之猴子Τ細胞增殖的抑 制活性 藉由使用猴子Τ細胞以取代上述實施例1 5中所使用的 人類Τ細胞，進行相同的測試。 <16-1>抗體之稀釋 將抗人類CD3單株抗.體SP34 (BD-Pharmingen)以磷酸 鹽緩衝液（PBS )稀釋到最終濃度1微克/毫升。 將上述製備的人類B7h-IgFc以PBS稀釋到最終濃度4〇 微克/毫升。將抗體溶液進一步以PBS稀釋，以製備各種濃 度的抗體（40微克/宅升到0.064微克/毫升）。 <16-2>以抗體覆蓋微量盤 將96孔微量盤的每個槽孔，以抗人類CD3單株抗體 SP34 ( 1微克/毫升；每個槽孔25微升），以及人類 B7h-IgFc (40微克/毫升到0.064微克/毫升；每個槽孔25 微升）覆蓋。將微量盤在37。(：培養2小時。接著，丟棄抗 體溶液’並將每個槽孔以PBS清洗3次。清洗後，將含有1 〇 %FCS的RPMI 1 640培養液加到每個槽孔（1 〇〇微升/槽孔 )’並將微量盤在3 7 °C培養1小時。藉此，每個槽孔都以 上述的抗體所覆蓋。
2125.39Sl-PF.ptd 第174頁 1304811 五、發明說明（171) < 1 6 - 3 >狼子T細胞懸浮液之製備 將周圍血液從猴子中收集，並將含有單核球細胞的流 伤’利用NycoPrep 1.077A (Nycomed)以密度梯度離心法 而製備。藉由使用抗人類CD4抗體M-T477 (BD-Pharmingen )、抗人類CD8抗體RPA-T8(BD-Pharmingen)、抗老鼠 IgG微珠（Mi 1 tenyi )及磁分類器’根據實驗方法的操 作，而將猴子T細胞從猴子單核球細胞的流份中分開。τ細 胞計數是利用血球計數儀而測定。將猴子T細胞懸浮於含 有人類抗人類AILIM單株抗體JMabl 36 ( 20微克/毫升）及 10%FCS的RPMI 1 640培養液，以製備猴子τ細胞懸浮液（1 X 106細胞/毫升）。將懸浮液在室溫培養3〇分鐘。 使用人類抗KLH單株抗體JMab23 (20微克/毫升）作為 陰性對照抗體。 < 1 6 - 4 >細胞培養 以相同的方式，將猴子T細胞懸浮液（1〇〇微升/槽 孔；1 X 1 05細胞/槽孔）加到以抗人類CD3抗體及 hB7h-IgFc覆蓋之微量盤的每個槽孔，並將微量盤在二氧 化碳培養箱中，以37 °C培養3天。 培養完成後’將個別的微量盤用於以下的分析： < 1 6 - 5 > T細胞增殖活性的測定 在培養後’將甲基[3H]胸嘧咬（0.5微居禮/槽孔； Amersham-Pharmacia)加到微量盤的每個槽孔，並將微量 盤在二氧化碳培養箱中，以3 7 °C培養6小時。培養後，利 用細胞回收機將細胞放到GF/C濾紙（Packard )。接著，
2125-3981-H?.ptd 第 175 頁 1304811 發明說明（172) 將滤紙在4(TC乾燥3小時或更久，然後加入Microscinti 〇 (20微升/槽孔；packard )。在濾紙上併入細胞的3h放射 活性’是藉由Θ -計數器（TOP COUNT )測量，以分析培養 後T細胞增殖的程度。 結果顯示在第7 8圖。 在這個測試中所得到的結果顯示，猴子T細胞的生長 是明顯地取決於人類hB7h-IgFc的濃度（在使用陰性對照 抗體的分析中）。此外，抗人類AI L I Μ單株抗體也明顯地 抑制猴子Τ細胞的增殖。 序列表本文 序列編號1 其他資訊：人工序列之說明：人工合成的引子序列， NotI-Τ 。 序列編號2 其他資訊：人工序列之說明：人工合成的連接子序 列，20 adp 。 序列編號3 其他資訊：人工序列之說明：人工合成的連接子序 列，24 adp 〇 序列編號4 其他資訊：人工序列之說明：人工合成的弓丨子序列， HIGLC 。 序列編號5
1304811 五、發明說明（173) 其他資訊：人工序列之說明：人工合成的引子序列， NHCc2。 序列編號6 其他資訊：人工序列之說明：人工合成的引子序列，
Excel 1E ° 序列編號7 其他資訊：人工序列之說明：人工合成的引子序列， ck 11 7 〇 序列編號8 其他資訊：人工序列之說明：人工合成的引子序列， M13R。 序列編號9 其他資訊：人工序列之說明：人工合成的引子序列， 136H。 序列編號1 0 其他資訊：人工序列之說明：人工合成的引子序列， 138/9H 。 序列編號11 其他資訊：人工序列之說明：人工合成的引子序列， AILIMHC1 。 序列編號1 2 其他資訊：人工序列之說明：人工合成的引子序列， HCcl。 序列編號1 3
2125-3981-PF.ptd 第177頁 1304811 五、發明說明（174) 其他資訊：人工序列之說明：人工合成的引子序列， HCc7。 序列編號1 4 其他資訊：人工序列之說明：人工合成的引子序列， HCc8。 序列編號1 5 其他資訊：人工序列之說明：人工合成的引子序列， HCc3。 序列編號1 6 其他資訊：人工序列之說明：人工合成的引子序列， HCc4。 序列編號1 7 其他資訊：人工序列之說明：人工合成的引子序列， HCc6。 序列編號1 8 其他資訊：人工序列之說明：人工合成的引子序列， HIGHC 。 序列編號1 9 其他資訊：人工序列之說明：人工合成的引子序列， HCc9。 序列編號20 其他資訊：人工序列之說明：人工合成的引子序列， HCc5。 序列編號21
2125-3981-PF.ptd 第178頁 1304811 五、發明說明（175) 其他資訊：人工序列之說明：人工合成的引子序列， 聚A。 序列編號2 2 其他資訊：人工序列之說明：人工合成的引子序列， AILIMLC1 。 序列編號2 3 其他資訊：人工序列之說明：人工合成的引子序列， AILIMLC2 。 序列編號24 其他資訊：人工序列之說明：人工合成的引子序列， LCcl ° 序列編號2 5 其他資訊：人工序列之說明：人工合成的引子序列， LCc2。 序列編號2 6 其他資訊：人工序列之說明：人工合成的引子序列， HIK ° 序列編號3 9 其他資訊：人工序列之說明：人工合成的引子序列。 序列編號40 其他資訊：人工序列之說明：人工合成的引子序列。
2125-3981-PF.ptd 第179頁 1304811 五、發明說明（176) 序列表 <110〉曰本煙草產業股份有限公司 <120〉對抗共同刺激之訊息傳遞分子AILIM之人類單株抗趙及其醫藥用途
<130> J1-A0101Y1P <140> 第180頁
<141〉 <150〉 JP P2000-147116 <151〉 2000-05-18 <150> JP P2001-99508 <151〉 2001-03-30 <160> 40
<170> Patentln Ver. 2. 1 <210〉 1 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence ΙΙΙΙΗ 2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（177) <220> <223> Description of Artificial Sequence··Artificially synthesized primer sequence, Notl-T. <220> <221〉 primer—bind <222〉（1).· (45) <400> 1 aactggaagc ttcagcggcc gcagagattt ΐΐΐΐΊΐΐΐΙ;!; ttttt 45
<210> 2 <211> 20 <212〉 DNA <213> Artificial Sequence <220〉 <223> Description of Artificial Sequence：Artificially synthesized linker sequence, 20adp. <400> 2 cgtggtgtca tggcactgcg 20 lillll 第181頁
2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（178)
<210〉 3 <211〉 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220〉 <223> Description of Artificial Sequence：Artificially synthesized linker sequence, 24adp. <400〉 3 aattcgcagt gccatgacac cacg 24
<210> 4 <211〉 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220〉 <223> Description of Artificial Sequence Artificially synthesized primer sequence, HIGLC. <220〉 <221> primer一bind <222> (1).. (23)
US 第182頁
2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（179) <400〉 4 gtctgctttg ctcagcgtca ggg 23
<210〉 5 <211〉 21 <212〉 DNA <213> Artificial Sequence <220〉 <223> Description of Artificial Sequence：Artificially synthesized primer sequence, NHCc2. <220> <221〉 primer一 bind I <222〉（1)..(21) <400> 5 caccggttcg gggaagtagt c 21
<210〉 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence 1111 第183頁
2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（180) <220〉 <223> Description of Artificial Sequence：Artificially synthesized primer sequence, ExcelIE. <220〉 <221> primer_bind <222〉（1)·· (21) <400〉 6 ggtgacacta tagaatacag g 21
<210〉 7 <211> 25 〈212〉 DNA <213> Artificial Sequence <220> <223〉 Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence, ckll7. <220> <221〉 primer一bind <222〉 （1).· (25) <400〉 7
1iH 第184頁
2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（181) gcaggcacac aacagaggca gttcc 25
<210〉 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220〉 <223> Description of Artificial Sequence：Artificially synthesized primer sequence, M13R, 〈220〉 <221〉 primer一bind <222〉（1)·· (20) <400〉 8 cacaggaaac agctatgacc 20
<210〉 9 <211〉 21 <212〉 DNA <213> Artificial Sequence <220〉 im 第185頁
2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（182) <223> Description of Artificial Sequence：Artificially synthesized primer sequence, 136H. <220〉 <221〉 primer_bind <222〉（1)·· (21) <400> 9 cctggacaag ggcttgagtg g 21
〈210〉 10 <211〉 21 <212〉 DNA <213> Artificial Sequence <220〉 <223> Description of Artificial Sequence：Artificially synthesized primer sequence, 138/9H. <220〉 <221> primer一bind <222〉 （1)..(21) <400〉 10 acaggaaaag gtctggagtg g 21 __l 第186頁
2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（183)
<210〉 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence 〈220>
<223> Description of Artificial Sequence：Artificially synthesized primer sequence, AILIMHCL <220〉 <221> primer_bind <222〉 （1).· (21) <400〉 11 acagtaatac acggccgtgt c 21
<210〉 12 <211> 21 〈212〉 DNA <213> Artificial Sequence <220〉 <223> Description of Artificial Sequence：Artificially ill 第187頁 2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（184) synthesized primer sequence, HCcl. <220〉 <221> primer_bind <222〉（1).. (21) <400> 12 gactacttcc ccgaaccggt g 21
〈210〉 13 <211> 22 <212〉 DNA <213> Artificial Sequence <220〉 <223> Description of Artificial Sequence：Artificially synthesized primer sequence, HCc7. <220〉 <221〉 primer—bind 〈222〉 （1).· (22) <400> 13 gtggcaggac cgtcagtctt cc 22
第188頁 2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（185)
<210> 14 <211〉 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence：Artificially synthesized primer sequence, HCc8. 〈220〉 <221〉 primer—bind <222〉（1)..(24) <400> 14 aagaggaaga ctgacggtcc tgcc 24
〈210〉 15 <211> 23 <212〉 DNA <213> Artificial Sequence 〈220〉 <223> Description of Artificial Sequence：Artificially synthesized primer sequence, HCc3.
Tim 第189頁
2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（186) <220〉 <221〉 primer—bind <222〉 （1)·· (23) <400> 15 ccgttgtgca ccaggactgg ctg 23
<210〉 16 <211〉 23 <212〉 DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence：Artificially synthesized primer sequence, HCc4. <220〉 <221〉 primer一bind <222〉（1)·· (23) <400> 16 tgcacttgta ctccttgccg ttc 23 ΙϋΗΙ 第190頁
2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（187)
<210〉 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220〉 <223> Description of Artificial Sequence：Artificially synthesized primer sequence, HCc6. <220〉 <221> primer_bind <222> (1).. (23) <400> 17 cagccggaga acaactacaa gac 23
<210〉 18 〈211〉 22 <212〉 DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence：Artificially synthesized primer sequence, HIGHC. lifii 第191頁
2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（188) <220〉 <221> primer_bind <222〉（1)·. (22) <400> 18 tcttgtagtt gttctccggc tg 22
<210〉 19 <211> 22 <212〉 DNA <213> Artificial Sequence <220〉 <223> Description of Artificial Sequence：Artificially synthesized primer sequence, HCc9. <220〉 <221〉 primer_bind <222〉（1)_. (22) <400〉 19 tacttcccag gcacccagca tg 22 <210> 20 IBi 第192頁
2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（189)
<211〉 23 <212〉 DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence：Artificially synthesized primer sequence, HCc5. <220〉 <221〉 primer—bind <222〉（1)..(23) <400> 20 atgctgggtg cctgggaagt atg 23
<210〉 21 <211> 21 <212〉 DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence；Artificially synthesized primer sequence, polyA. <220〉 IBil 第193頁
2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（190) <221〉 primer一bind <222> (1)..(21) <400〉 21 tcaaactatc ggccttgctg g 21
<210〉 22 <211> 21 〈212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence：Artificially synthesized primer sequence, AILIMLC1. <220〉 <221> primer_bind <222〉（1)·. (21) <400> 22 tagcctggta tcagcagaaa c 21 <210> 23 〈211〉 21 nm 第194頁 2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（191)
<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence：Artificially synthesized primer sequence, AILIMLC2. 〈220〉 <221〉 primer_bind <222〉 （1)._ (21) <400> 23 gtttctgctg ataccaggct a 21
<210> 24 <211> 22 <212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence <220〉 <223> Description of Artificial Sequence：Artificially synthesized primer sequence, LCcl. <220〉 <221〉 primer—bind mi 第195頁
2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（192) <222〉（1).· (22) <400> 24 gcaccatctg tcttcatctt cc 22
<210〉 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence：Artificially synthesized primer sequence, LCc2. <220〉 <221> primer_bind <222〉 （1).. (21) <400> 25 caaagagctt caacagggga g 21
<210〉 26 <211> 20 <212> DNA
IBB 第196頁
2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（193) <213> Artificial Sequence <220〉 <223> Description of Artificial Sequence：Artificially synthesized primer sequence, HIK. <220〉 <221〉 primer一bind <222〉（1)_. (20) 〈400〉 26 aggctggaac tgaggagcag 20 〈210〉 27 <211〉 1616 <212> DNA <213> Homo sapiens <220〉 <221〉5，UTR <222〉（1)·· (68) <220〉 <221〉 CDS <222〉 （69)..(1481) ISii 第197頁
2125-3981-PF.ptd 1304811
五、發明說明（194) <220〉 <221〉3，UTR <222〉（1482).. (1616) <220> 〈221> sig_peptide <222〉（69).· (125) <400> 27 gaattcgcag tgccatgaca ccacgcatct gtcctctaga gaatcccctg agagctccgt 60 tcctcacc atg gac tgg acc tgg agg ate etc ttc ttg gtg gca gca gee 110 Met Asp Trp Thr Trp Arg lie Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala 1 5 10 aca gga gee cac tee cag gtg cag ctg gtg cag tet ggg get gag gtg 158
Thr Gly Ala His Ser Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val 15 20 25 30 aag aag cct ggg gee tea gtg aag gtc tee tgc aag get tet gga tac 206
Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 acc ttc acc ggc tac tat atg cac tgg gtg ega cag gee cct gga caa 254
Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin
2125-3981-PF.ptd 第198頁 1304811 五、發明說明（195) 50 55 60 ggg ctt gag tgg atg gga tgg ate aac cct cac agt ggt ggc aca aac 302
Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp lie Asn Pro His Ser Gly Gly Thr Asn 65 70 75 tat gca cag aag ttt cag ggc agg gtc acc atg acc agg gac aeg tcc 350
Tyr Ala Gin Lys Phe Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser 80 85 90 ate age aca gee tac atg gag ctg age agg ctg aga tec gac gac aeg 398 lie Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr 95 100 105 110 gee gtg tat tac tgt geg agg aeg tat tac tat gat agt agt ggt tat 446
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr 115 120 125 tac cat gat get ttt gat ate tgg ggc caa ggg aca atg gtc acc gtc 494
Tyr His Asp Ala Phe Asp lie Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr Val 130 135 140 tet tea gee tec acc aag ggc cca teg gtc ttc ccc ctg geg ccc tgc 542
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys 145 150 155 iBi 第199頁
2125-398i-PF.ptd 1304811 五、發明說明（196) tcc agg age acc tee gag age aca geg gee ctg ggc tgc ctg gtc aag 590
Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 160 165 170 gac tac ttc ccc gaa ccg gtg aeg gtg teg tgg aac tea ggc get ctg 638
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 175 180 185 190 acc age ggc gtg cac acc ttc cca get gtc eta cag tec tea gga etc 686
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu 195 200 205 tac tec etc age age gtg gtg acc gtg ccc tec age aac ttc ggc acc 734
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr 210 215 220 cag acc tac acc tgc aac gta gat cac aag ccc age aac acc aag gtg 782
Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 225 230 235 gac aag aca gtt gag ege aaa tgt tgt gtc gag tgc cca ccg tgc cca 830
Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro 240 245 250 gca cca cct gtg gca gga ccg tea gtc ttc etc ttc ccc cca aaa ccc 878
Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 1^· 2125-3981-PF.ptd
第200頁 1304811 五、發明說明（197) 255 260 265 270 aag gac acc etc atg ate tee egg acc cct gag gtc aeg tgc gtg gtg 926
Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 275 280 285 gtg gac gtg age cac gaa gac ccc gag gtc cag ttc aac tgg tac gtg 974
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val 290 295 300
gac ggc gtg gag gtg cat aat gee aag aca aag cca egg gag gag cag 1022
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin 305 310 315 ttc aac age aeg ttc cgt gtg gtc age gtc etc acc gtt gtg cac cag 1070
Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gin 320 325 330 gac tgg ctg aac ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tee aac aaa ggc 1118
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly 335 340 345 350 etc cca gee ccc ate gag aaa acc ate tee aaa acc aaa ggg cag ccc 1166
Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro 355 360 365
第201頁 2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（198) cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc egg gag gag atg acc 1214
Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 370 375 380 aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tac ccc age 1262
Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 385 390 395 gac ate gcc gtg gag tgg gag age aat ggg cag ccg gag aac aac tac 1310
Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr 400 405 410 aag acc aca cct ccc atg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc etc tac 1358
Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 415 420 425 430 age aag etc acc gtg gac aag age agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc 1406
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe 435 440 445 tea tgc tcc gtg atg cat gag get ctg cac aac cac tac aeg cag aag 1454
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys 450 455 460 age etc tcc ctg tet ccg ggt aaa tga gtgccacggc cggcaagccc 1501
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 1^· 第202頁
2125-3981-i¥.ptd 1304811
2125-3981-PF.ptd 第203頁
1304811 五、發明說明（200) 100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr His 115 120 125
Asp Ala Phe Asp lie Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 130 135 140
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 145 150 155 160
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 165 170 175
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 180 185 190
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 195 200 205
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr 210 215 220
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 225 230 235 240
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 260 265 270
Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn mi 第204頁
2125-3981-IT.ptd 1304811 五、發明說明（201) 305 310 315 320
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp 325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 340 345 350
Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu 355 360 365
Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 370 375 380
Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie 385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 405 410 415
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 420 425 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Yal Phe Ser Cys 435 440 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210〉 29 <211> 974
Bii 第205頁 2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（202)
<212> DNA <213〉 Homo sapiens <220〉 <221〉5，UTR <222> (1)..(38) <220〉 <221〉 CDS <222〉（39)..(749) <220〉 <221〉3，UTR <222〉（750)..(974) <220〉 <221> sig_peptide <222〉（39)·· (104) <400〉 29 gaattcgcag tgccatgaca ccacggtcag gacacagc atg gac atg agg gtc ccc 56
Met Asp Met Arg Val Pro 1 5 get cag etc ctg ggg etc ctg ctg etc tgg ttc cca ggt tee aga tgc 104
Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Phe Pro Gly Ser Arg Cys
(I 第206頁 2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（203) 10 15 20 gac ate cag atg acc cag tet cca tet tee gtg tet gca tet gta gga 152
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 25 30 35 gac aga gtc acc ate act tgt egg geg agt cag ggt att age agg ttg 200
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly He Ser Arg Leu 40 45 50 tta gee tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gee cct aaa etc ctg ate 248
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 55 60 65 70 tat gtt gca tee agt ttg caa agt ggg gtc cca tea agg ttc age ggc 296
Tyr Val Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 75 80 85 agt gga tet ggg aca gat ttc act etc acc ate age age ctg cag cct 344
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 90 95 100 gaa gat ttt gca act tac tat tgt caa cag get aac agt ttc ccg tgg 392
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ala Asn Ser Phe Pro Trp 105 110 115
第207頁 2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（204) acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa ate aaa ega act gtg get gca 440
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg Thr Val Ala Ala 120 125 130 cca tet gtc ttc ate ttc ccg cca tet gat gag cag ttg aaa tet gga 488
Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 135 140 145 150 act gee tet gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gee 536
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 155 160 165 aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gee etc caa teg ggt aac tee cag 584
Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 170 175 180 gag agt gtc aca gag cag gac age aag gac age acc tac age etc age 632
Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 185 190 195 age acc ctg acg ctg age aaa gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac 680
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 200 205 210 gee tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg age teg ccc gtc aca aag age 728
Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 第208頁
2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（205) 215 220 225 230 ttc aac agg gga gag tgt tag agggagaagt gcccccacct gctcctcagt 779
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 235 tccagcctga ccccctccca tcctttggcc tctgaccctt tttccacagg ggacctaccc 839 ctattgcggt cctccagctc atctttcacc tcacccccct cctcctcctt ggctttaatt 899 atgctaatgt tggaggagaa tgaataaata aagtgaatct ttgcaaaaaa aaaaaaaaaa 959 aatctctgcg gccgc 974 <210> 30 <211> 236 <212> PRT <213〉 Homo sapiens <400〉 30
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 15 10 15
Phe Pro Gly Ser Arg Cys Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser 20 25 30
Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser IHfi 第209頁
2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（206) 35 40 45
Gin Gly He Ser Arg Leu Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys 50 55 60
Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Val Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val 65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95
He Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 100 105 110
Ala Asn Ser Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie 115 120 125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140
Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 165 170 175
Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp 180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser 210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 1B1 2125-3981-PF.ptd 第 210 頁 1304811 五、發明說明（207) <210> 31 <211> 1708 <212〉 DNA <213〉 Homo sapiens <220> <221〉5’UTR <222〉（1)·· (93) <220> <221〉 CDS <222〉（94)·· (1506) <220〉 <221〉3，UTK <222〉（1507).· (1708) <220> <221> sig_peptide <222〉（94).· (150) <400〉 31 gaattcgcag taccatgaca ccacgggagc cccagccttg ggattcccaa gtgtttgtaa 60 ΙΙϋ·Ι 第211頁
2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（208) tcagtgatca ggactgagca cacaggactc acc atg gag ttg ggg ctg age tgg 114
Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp 1 5 gtt ttc ett gtt get ata tta gaa ggt gtc cag tgt gag gtg cag ctg 162
Val Phe Leu Val Ala lie Leu Glu Gly Val Gin Cys Glu Val Gin Leu 10 15 20 gtg gag tet ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg ggg tcc ctg aga etc 210
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu 25 30 35 tcc tgt gca gcc tet gga ttc acc ttc agt age tac gac atg cac tgg 258
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asp Met His Trp 40 45 50 55 gtc ege caa get aca gga aaa ggt ctg gag tgg gtc tea get att ggt 306
Val Arg Gin Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala lie Gly 60 65 70 act get ggt gac aca tac tat cca ggc tcc gtg aag ggc ega ttc acc 354
Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 75 80 85 ate tcc aga gaa aat gcc aag aac tcc ttg tat ett caa atg aac age 402 lie Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser
第212頁 2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（209) 90 95 100 ctg aga gcc ggg gac acg get gtg tat tac tgt gta aga gat aat agg 450
Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Asp Asn Arg 105 110 115 aag gtg acc cac gag cac tac tac tac tac ggt atg gac gtc tgg ggc 498
Lys Val Thr His Glu His Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly 120 125 130 135 caa ggg acc aeg gtc acc gtc tcc tea gcc tcc acc aag ggc cca teg 546
Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 140 145 150 gtc ttc ccc ctg geg ccc tgc tee agg age acc tee gag age aca geg 594
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 155 160 165 gee ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg aeg gtg 642
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 170 175 180 tgg aac tea ggc get ctg acc age ggc gtg cac acc ttc cca get 690
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 185 190 195 ΊΒ1Ι 第213頁
2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（210) gtc eta cag tee tea gga etc tac tee etc age age gtg gtg ace gtg 738
Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 200 205 210 215 ccc tee age aac ttc ggc acc cag acc tac acc tgc aac gta gat cac 786
Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 220 225 230 aag ccc age aac acc aag gtg gac aag aca gtt gag ege aaa tgt tgt 834
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys 235 240 245 gtc gag tgc cca ccg tgc cca gca cca cct gtg gca gga ccg tea gtc 882
Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 250 255 260 ttc etc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc etc atg ate tee egg acc 930
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr 265 270 275 cct gag gtc aeg tgc gtg gtg gtg gac gtg age cac gaa gac ccc gag 978
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 280 285 290 295 gtc cag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gee aag 1026
Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys mm 第214頁 2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（211) 300 305 310 aca aag cca egg gag gag cag ttc aac age aeg ttc cgt gtg gtc age 1074
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser 315 320 325 gtc etc acc gtt gtg cac cag gac tgg ctg aac ggc aag gag tac aag 1122
Val Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 330 335 340 tgc aag gtc tee aac aaa ggc etc cca gee ccc ate gag aaa acc ate 1170
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie 345 350 355 tee aaa acc aaa ggg cag ccc ega gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc 1218
Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro 360 365 370 375 cca tee egg gag gag atg acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg 1266
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu 380 385 390 gtc aaa ggc ttc tac ccc age gac ate gee gtg gag tgg gag age aat 1314
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 395 400 405 ϋΙΗ 第215頁
2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（212) ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc aca cct ccc atg ctg gac tcc 1362
Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser 410 415 420 gac ggc tcc ttc ttc etc tac age aag etc acc gtg gac aag age agg 1410
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 425 430 435 tgg cag cag ggg aac gtc ttc tea tgc tcc gtg atg cat gag get ctg 1458
Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
440 445 450 455 cac aac cac tac aeg cag aag age etc tcc ctg tet ccg ggt aaa tga 1506
His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 460 465 470 gtgccacggc cggcaagccc ccgctcccca ggctctcggg gtcgcgtgag gatgettgge 1566 acgtaccccg tgtacatact tcccaggcac ccagcatgga aataaagcac ccagcgctgc 1626
cctgggcccc tgcnaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1686 aaaaaaaaat ctctgcggcc gc 1708 〈210〉 32
第216頁 2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（213) <211> 470 <212〉 PRT <213〉 Homo sapiens <400> 32
Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala lie Leu Glu Gly 15 10 15
Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin 20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45
Ser Ser Tyr Asp Met His Trp Val Arg Gin Ala Thr Gly Lys Gly Leu 50 55 60
Glu Trp Val Ser Ala lie Gly Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly 65 70 75 80
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser 85 90 95
Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110
Tyr Cys Val Arg Asp Asn Arg Lys Val Thr His Glu His Tyr Tyr Tyr 115 120 125
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 140
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 145 150 155 160
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr mi 第217頁 2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（214) 165 170 175
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 180 185 190
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 195 200 205
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr 210 215 220
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 225 230 235 240
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 260 265 270
Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn 305 310 315 320
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp 325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 340 345 350
Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu 355 360 365
Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
Imi 2125-3981-PF.ptd 第 218 頁 1304811 五、發明說明（215) 370 375 380
Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie 385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 405 410 415
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 420 425 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys 435 440 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210〉 33 <211〉 948
<212> DNA <213> Homo sapiens 第219頁
<220> <221〉5’UTR <222〉 （1)., (27) <220〉 ΙϋΙϋΙΙΙ 2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（216) <221〉 CDS <222> (28).. (738) <220〉 <221〉3，UTR <222〉（739)·· (948) <220> <221> sig_peptide <222〉（28)·· (87) <400> 33 gaattcgcag tgccatgaca ccacgcc atg gaa acc cca gcg cag ctt etc ttc 54
Met Glu Thr Pro Ala Gin Leu Leu Phe 1 5 etc ctg eta etc tgg etc cca gat acc acc gga gaa att gtg ttg aeg 102
Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu He Val Leu Thr 10 15 20 25 cag tet cca ggc acc ctg tet ttg tet cca ggg gaa aga gee acc etc 150
Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu 30 35 40 tee tgc agg gee agt cag aat att aga age age tac tta gee tgg tac 198
Ser Cys Arg Ala Ser Gin Asn He Arg Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr 第220頁 2125-39Sl-PF.ptd 1304811 五、發明說明（217) 45 50 55 cag cag aaa cct ggc cag get ccc ggg etc etc ate tat ggt gca tee 246
Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Gly Leu Leu lie Tyr Gly Ala Ser 60 65 7〇 age agg gee act ggc ate cca gac agg ttc agt ggc agt ggg tet ggg 294
Ser Arg Ala Thr Gly He Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 75 80 85 aca gac ttc act etc acc ate age aga ctg gag cct gaa gat ttt gca 342
Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala 90 95 100 105 gtg tat tac tgt cag cag ttt ggt age tea cct atg tgc agt ttt ggc 390
Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Gly Ser Ser Pro Met Cys Ser Phe Gly ， 110 115 120 cag ggg acc aag ctg gag ate aaa ega act gtg get gca cca tet gtc 438
Gin Gly Thr Lys Leu Glu He Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val 125 130 135 ttc ate ttc ccg cca tet gat gag cag ttg aaa tet gga act gee tet 486
Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser 140 145 150
IliHl 第221頁
2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（218) gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag 534
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin 155 160 165 tgg aag gtg gat aac gcc etc caa teg ggt aac tee cag gag agt gtc 582
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val 170 175 180 185 aca gag cag gac age aag gac age acc tac age etc age age acc ctg 630
Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu 190 195 200 aeg ctg age aaa gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa 678
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu 205 210 215 gtc acc cat cag ggc ctg age teg ccc gtc aca aag age ttc aac agg 726
Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg 220 225 230 gga gag tgt tag agggagaant gcccccacct gctcctcagt tccagcctga 778
Gly Glu Cys 235 ccccctccca tcctttggcc tctgaccctt tttccacagg ggacctaccc etattgeggt 838
HUH 第222頁 2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（219) cctccagctc atctttcacc tcacccccct cctcctcctt ggctttaatt atgctaatgt 898 tggaggagaa tgaataaata aagtgaatct ttgcacctgt gaaaaaaaaa 948
<210> 34 <211〉 236 <212〉 PRT <213> Homo sapiens <400> 34
Met Glu Thr Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 15 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser 20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Asn 35 40 45
He Arg Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala 50 55 60
Pro Gly Leu Leu lie Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly He Pro 65 70 75 80
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 85 90 95
Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe 100 105 110
Gly Ser Ser Pro Met Cys Ser Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie iiiif 第223頁 2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（220) 115 120 125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140
Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 165 170 175
Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp 180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser 210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210〉 35 <211> 1673 <212〉 DNA <213〉 Homo sapiens <220〉 <221〉5，UTR <222〉（1)..(95) imi 2125-398卜 IT.ptd 第224頁 1304811
2125-3981-PF.ptd
第225頁 1304811 五、發明說明（222) 25 30 35 etc tee tgt gca gee tet gga ttc acc ttc agt age tac gac atg cac 257
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asp Met His 40 45 50 tgg gtc ege caa get aca gga aaa ggt ctg gag tgg gtc tea get att 305
Trp Val Arg Gin Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala lie 55 60 65 70 ggt act get ggt gac aca tac tat cca ggc tee gtg aag ggc ega ttc 353
Gly Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Val Lys Gly Arg Phe 75 80 85 acc ate tee aga gaa aat gee aag aac tee ttg tat ett caa atg aac 401
Thr He Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gin Met Asn 90 95 100 age ctg aga gee ggg gac aeg get gtg tat tac tgt gta aga gat aag 449
Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Asp Lys 105 110 115 agg aeg gtg acc cac gag cac tac tac tac tac ggt atg gac gtc tgg 497
Arg Thr Val Thr His Glu His Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 120 125 130
第226頁 2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（223) ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tea gcc tcc acc aag ggc cca 545
Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 135 140 145 150 teg gtc ttc ccc ctg geg ccc tgc tee agg age acc tee gag age aca 593
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 155 160 165 geg gee ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acc 641
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 170 175 180 gtg teg tgg aac tea ggc get ctg acc age ggc gtg cac acc ttc cca 689
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 185 190 195 get gtc eta cag tee tea gga etc tac tee etc age age gtg gtg acc 737
Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 200 205 210 gtg ccc tee age aac ttc ggc acc cag acc tac acc tgc aac gta gat 785
Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 215 220 225 230 cac aag ccc age aac acc aag gtg gac aag aca gtt gag ege aaa tgt 833
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys m· 第227頁
2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（224) 235 240 245 tgt gtc gag tgc cca ccg tgc cca gca cca cct gtg gca gga ccg tea 881
Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser 250 255 260 gtc ttc etc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc etc atg ate tee egg 929
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg 265 270 275 acc cct gag gtc aeg tgc gtg gtg gtg gac gtg age cac gaa gac ccc 977
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 280 285 290 gag gtc cag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gee 1025
Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 295 300 305 310 aag aca aag cca egg gag gag cag ttc aac age aeg ttc cgt gtg gtc 1073
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val 315 320 325 age gtc etc acc gtt gtg cac cag gac tgg ctg aac ggc aag gag tac 1121
Ser Val Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 330 335 340 1^1 第228頁
2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明 (225) aag tgc aag gtc tcc aac aaa ggc etc cca gec ccc ate gag aaa acc 1169 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr 345 350 355 ate tcc aaa acc aaa ggg cag ccc ega gaa cca cag gtg tac acc Ctg 1217 lie Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu 360 365 370 ccc cca tcc egg gag gag atg acc aag aac cag gtc age Ctg acc tgc 1265 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys 375 380 385 390 ctg gtc aaa ggc ttc tac ccc age gac ate gee gtg gag tgg gag age 1313 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser 395 400 405 aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc aca cct CCC atg ctg gac 1361 Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp 410 415 420 tcc gac ggc tcc ttc ttc etc tac age aag etc acc gtg gac aag age 1409 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 425 430 435 agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tea tgc tcc gtg atg cat gag get 1457 Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala iiHi
2125-3981-PF.ptd 第229頁 1304811 五、發明說明（226) 440 445 450 ctg cac aac cac tac acg cag aag age etc tee ctg tet ccg ggt aaa 1505
Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 455 460 465 470 tga gtgccacggc cggcaagccc ccgctcccca ggctctcggg gtcgcgtgag 1558 gatgettgge acgtaccccg tgtacatact tcccaggcac ccagcatgga aataaagcac 1618 ccagcgctgc cctgggcccc tgcgaaaaaa aaaaaaaaaa aatctctgcg geege 1673
<210> 36 <211> 470 <212〉 PRT <213〉 Homo sapiens <400> 36
Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala lie Leu Glu Gly 1 5 10 15
Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin 20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45
Ser Ser Tyr Asp Met His Trp Val Arg Gin Ala Thr Gly Lys Gly Leu 第230頁
2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（227) 50 55 60
Glu Trp Val Ser Ala lie Gly Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly 65 70 75 80
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser 85 90 95
Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110
Tyr Cys Val Arg Asp Lys Arg Thr Val Thr His Glu His Tyr Tyr Tyr 115 120 125
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 140
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 145 150 155 160
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 165 170 175
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 180 185 190
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 195 200 205
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr 210 215 220
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 225 230 235 240
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 2125-3981-PF.ptd 第231頁 1304811 五、發明說明（228) 260 265 270
Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn 305 310 315 320
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp 325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 340 345 350
Ala Pro He Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu 355 360 365
Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 370 375 380
Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie 385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 405 410 415
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 420 425 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys 435 440 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
第232頁 2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（229) 465 470 <210> 37 <211> 970 <212> DNA <213> Homo sapiens <220〉 <221〉5’UTR <222> (1).. (32) <220〉 <221〉 CDS <222〉（33)..(743) <220〉 <221〉3，UTR <222〉（744)..(970) <220> <221> sig_peptide <222〉 （33)·. (92) <400> 37
1ISI1I 第233頁
2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（230) gaattcgcag tgccatgaca ccacggggaa cc atg gaa acc cca gcg cag ctt 53
Met Glu Thr Pro Ala Gin Leu 1 5 etc ttc etc ctg eta etc tgg etc cca gat acc acc gga gaa att gtg 101
Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu He Val 10 15 20 ttg aeg cag tet cca ggc acc ctg tet ttg tet cca ggg gaa aga gee 149
Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala 25 30 35 acc etc tee tgc agg gee agt cag agt att age age age tee tta gee 197
Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Ser Ser Ser Leu Ala 40 45 50 55 tgg tac cag cag aaa cct ggc cag get ccc ggg etc etc ate ttt ggt 245
Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Gly Leu Leu lie Phe Gly 60 65 70 gca tee age agg gee act ggc ate cca gac agg ttc agt ggc agt ggg 293
Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly 75 80 85 tet ggg aca gac ttc act etc acc ate age aga ctg gag cct gaa gat 341
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp IBii 第234頁
2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（231) 90 95 100 ttt gca gtg tat tac tgt cag cag ttt ggt age tea cct atg tgc agt 389
Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Gly Ser Ser Pro Met Cys Ser 105 110 115 ttt ggc cag ggg acc aag ctg gag ate aaa ega act gtg get gca cca 437
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 120 125 130 135 tet gtc ttc ate ttc ccg cca tet gat gag cag ttg aaa tet gga act 485
Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr 140 145 150 gee tet gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gee aaa 533
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 155 160 165 gta cag tgg aag gtg gat aac gee etc caa teg ggt aac tee cag gag 581
Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu 170 175 180 agt gtc aca gag cag gac age aag gac age acc tac age etc age age 629
Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 185 190 195 liii 第235頁 2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（232) acc ctg acg ctg age aaa gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gee 677
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 200 205 210 215 tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg age teg ccc gtc aca aag age ttc 725
Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 220 225 230 773 aac agg gga gag tgt tag agggagaagt gcccccacct gctcctcagt Asn Arg Gly Glu Cys 235 tccagcctga ccccctccca tcctttggcc tctgaccctt tttccacagg ggacctaccc 833 etattgeggt cctccagctc atctttcacc tcacccccct cctcctcctt ggctttaatt 893 atgetaatgt tggaggagaa tgaataaata aagtgaatct ttgcaaaaaa aaaaaaaaaa 953 970 aaaatctctg cggccgc
<210〉 38 <211〉 236 <212〉 PRT <213〉 Homo sapiens
2125-3981-PF.ptd 第236頁 1304811 五、發明說明（233) <400〉 38
Met Glu Thr Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 15 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser 20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser 35 40 45 lie Ser Ser Ser Ser Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala 50 55 60
Pro Gly Leu Leu lie Phe Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly He Pro 65 70 75 80
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 85 90 95
Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe 100 105 110
Gly Ser Ser Pro Met Cys Ser Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie 115 120 125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140
Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 165 170 175
Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp 180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
第237頁 2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（234) 195 200 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser 210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235
<210> 39 <211〉 35 〈212〉 DNA <213> Artificial Sequence <220〉 <223> Description of Artificial Sequence：Artificially synthesized primer sequence <220〉 <221> primer一bind <222〉（1)..(35) <400〉 39 gaggtctccg ccctcgagat gcggctgggc agtcc 35 <210〉 40 <2H> 33 1B1 第238頁 2125-3981-PF.ptd 1304811 五、發明說明（235)
<212〉 DNA <213> Artificial Sequence <220〉 <223> Description of Artificial Sequence：Artificially synthesized primer sequence <220> 〈221〉 primer一bind <222> (1).. (33) <400> 40 cacaggacag ccaggggatc ccacgtggcc gcg 33 ill 第239頁 2125-3981-PF.ptd

Claims (1)

  1. f ?年/月？。曰修(声^太 播·的-物·質之矛 lSS-_9〇111577 六、申請專利範圍 _ 法 I —種鑑定結合至AILIM或AILIM配 包括下列步驟： (a ) fj m 的々k「 備—不溶性的載體’其上固定完整的AILIM細 胞外區域或其部份； 十甘7)製備包括A I L IΜ配體的全部細胞外區域之多胜肽 现具部份，盆ι 、 示· 乂可發散一可偵測的訊號之標示材料而標 應 (c)將步驟（a)之不溶性的載體與步驟（b)多胜肽之反 (，d)、將步驟（3)之不溶性的載體、步驟（b)多胜肽與該 貝以任意的順序互相反應； 妯％it),分別偵測步驟（c)所產生的複合物包含之該標示 兮^ - I政的訊號’以及步驟（d)所產生的複合物包含之 该私示材料所發散的訊號；以及 (f)比較步驟（e)所偵測到的每個訊號之強度。 2.—種鐘定結合至AILIM或AILIM配體的物質之方 法，包括下列步驟： 方 製備一不溶性的載體，其上固定完整的ailim配 體、，、田胞外區域或其部份； 八（b)衣備包括A1LIΜ的全部細胞外區域之多胜肽或其 °伤’其以可發散—可偵測的訊號之標示材料而標示；
    第240頁 應.（C)將步驟（a)之不溶性的載體與步驟（b)多胜肽之反 物曾⑷们將步驟U)之不溶性的載體、步驟⑻多胜肚與該 1304811
    -案號 90111577 六、申請專利範圍 材料(所別谓測步驟（C)所產生的複合物包含之該標示 ::所：：的訊號，以A步驟⑷所產生的複合物 w亥標不材料所發散的訊號；以及 ( (〇比較步驟（e)所偵測到的每個訊號之強度。 3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中^包 AILIΜ的全部細胞外區域之多胜肽或其部份，是一^包匕括 AILIM的全部細胞外區域或其部份以及免疫球^白^ 全部怪定區域或其部份之多胜肽的融合多胜狀。 4. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該包 AILIΜ的全部細胞外區域之多胜肽或其部份，是一 χ包ι括 AILIΜ的全部細胞外區域或其部份以及免疫球=白^ 全部怪定區域或其部份之多胜肽的融合多胜狀。 之 5·如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該包 AILIM配體的全部細胞外區域之多胜肽或其部份，〃是I— 括AILIΜ配體的全部細胞外區域或其部份 :=包 .^ 157 Μ及免疫球蛋白 重鏈之全部恆定區域或其部份之多胜肽的融合多胜肽。 6. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該包。 AILIM配體的全部細胞外區域之多胜肽或其部份，'^是括 括AILIM配體的全部細胞外區域或其部份^ 包 ^ 1切u及免疫球蛋白 重鏈之全部忸定區域或其部份之多胜肽的融合多胜。 7. 如申請專利範圍第1項到第6項中任、° 法 } ^ ;所迹之方 其中該AILIM是人類AILIM。 項所述之方 其中該AILIM 法 8. 如申請專利範圍第1項到第6項中任 其中該AILIM配體是人類AILIM配體。 9. 如申請專利範圍第7項所述之方法
    2125-3981-PF3.ptc 第241頁
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    第242頁
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