ES2347758T3 - Anticuerpo monoclonal humano contra la molecula ailim coestimuladora y transductora de señales y uso farmaceutico del mismo. - Google Patents

Anticuerpo monoclonal humano contra la molecula ailim coestimuladora y transductora de señales y uso farmaceutico del mismo. Download PDF

Info

Publication number
ES2347758T3
ES2347758T3 ES01111930T ES01111930T ES2347758T3 ES 2347758 T3 ES2347758 T3 ES 2347758T3 ES 01111930 T ES01111930 T ES 01111930T ES 01111930 T ES01111930 T ES 01111930T ES 2347758 T3 ES2347758 T3 ES 2347758T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
human
ailim
amino acid
antibody
monoclonal antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES01111930T
Other languages
English (en)
Inventor
Tsuji Takashi
Tezuka Katsunari
Hori Nobuaki
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Japan Tobacco Inc
Original Assignee
Japan Tobacco Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Japan Tobacco Inc filed Critical Japan Tobacco Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2347758T3 publication Critical patent/ES2347758T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Un anticuerpo monoclonal humano que se une a AILIM humana, en el que una región variable de cadena pesada de dicho anticuerpo monoclonal humano posee una secuencia de aminoácidos de los siguientes puntos (a) o (b): (c) secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos desde la posición 20 hasta la posición 117 de la SEQ ID NO: 28, o (d) secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos desde la posición 20 hasta la posición 117 de la SEQ ID NO: 28, en la que uno a diez restos de aminoácidos son eliminados o sustituidos, o a la que uno a diez restos de aminoácidos son insertados o añadidos, siempre que, cuando la región variable de cadena pesada posee la secuencia de aminoácidos del punto anterior (b) dicho anticuerpo comprende una cualquiera de las características de los siguientes puntos (i) a (iii): (iv) una actividad para impedir la reacción linfocitaria mixta; (v) una actividad para inducir la transducción de señales para inducir interferón-γ ;o (vi) una actividad para inducir la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo a células que expresan AILIM.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a anticuerpos humanos que se unen a AILIM (molécula inmunomoduladora de linfocitos inducible por activación, también denominada ICOS (coestimulador inducible); a anticuerpos monoclonales humanos que se unen a AILIM o a una porción de la misma; a ADN que codifica dicho anticuerpo monoclonal humano o a una porción del mismo, o a una porción de dicho ADN; a células (incluyendo células recombinantes genéticas) que producen dicho anticuerpo monoclonal humano o una porción del mismo; a un anticuerpo monoclonal humano o una porción del mismo producido por dichas células recombinantes genéticas; a una composición farmacéutica que comprende dicho anticuerpo monoclonal humano o una porción del mismo; a una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo contra AILIM para tratar trastornos relacionados con la alergia retardada; a un método para identificar, cuantificar o ensayar sustancias que se unen a AILIM o al ligando de AILIM; y a un kit utilizado para dicho método.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Un organismo vivo de mamíferos posee sistemas de respuesta inmunitaria que excluye a microorganismos patógenos (virus, bacterias, parásitos, etc.) o a cuerpos extraños (denominados ambos "antígeno" en lo sucesivo) que han invadido el organismo vivo. Uno de ellos se denomina sistema de respuesta inmune natural; el otro, sistema de respuesta inmune adquirida. El primero es un mecanismo de exclusión que comprende fagocitosis por parte de fagocitos (leucocitos polimorfonucleares, monocitos, macrófagos, etc.), ataque por parte de células citolíticas naturales (NK), y reconocimiento no específico tal como opsonización del antígeno por complementos. El segundo, el sistema de respuesta inmune adquirida, es un mecanismo de exclusión mediante linfocitos (principalmente células T y células B) que adquirieron la especificidad por el antígeno (a saber, linfocitos activados). Las células B que adquirieron la especificidad por el antígeno atacan al antígeno que existe fuera de las células a través de la producción de anticuerpos específicos contra el antígeno. Las células T que adquirieron la especificidad por el antígeno (a saber, células T activadas) se clasifican en células T ayudantes y células T citotóxicas (linfocitos citotóxicos, CTL). Las células T ayudantes regulan la diferenciación de las células B y la producción de anticuerpos, y destruyen el antígeno cooperando con los fagocitos. Las últimas, los CTLs, atacan las células infectadas con virus, etc., por sí mismas. (Experimental Medicine: SUPPLEMENT, "Bio Science Term Library, Immunity", Yodosha, páginas14-17 (1995)).
Esta adquisición de especificidad por el antígeno por parte de las células T (a saber, la activación de células T) se inicia a través del reconocimiento por parte de las células T del antígeno presentado por las células presentadoras de antígenos (APC), tales como macrófagos, células B o células dendríticas. Las células presentadoras de antígenos procesan los antígenos así incorporados y presentan estos antígenos procesados uniéndolos al complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Las células T reciben la señal primaria para la activación de las células (o adquisición de especificidad) reconociendo los antígenos procesados presentados por las células presentadoras de antígenos a través de un complejo entre el receptor de las células T (TcR) y el antígeno CD3 que existe sobre la superficie de la membrana celular (complejo TcR/CD3).
Sin embargo, la sola señal primaria mediada por el complejo TcR/CD3 no puede activar las células T suficientemente y lleva a una ausencia de reacción o anergia clonal, de manera que las células no pueden reaccionar con cualquier estímulo recibido a partir de ese momento. La liberación autocrina de interleuquina 2 (IL-2) es necesaria para que las células T se activen, se diferencien en clones de células T específicas del antígeno y proliferen. En la anergia clonal, las células T se inactivan debido a la falta de producción de IL-2 y a la falta de división celular. A saber, la activación de células T acompañada por la producción de citoquinas tales como IL-2 requiere la señal secundaria después de la primera señal a través del complejo TcR/CD3. Esta señal secundaria se denomina señal coestimuladora.
Las células T reciben esta señal secundaria y la transmiten a las células interactuando (adhesión celular) con moléculas distintas de MHC sobre las células presentadoras de antígenos a través de moléculas distintas del complejo TcR/CD3 sobre la superficie de células T. Esta señal secundaria evita la anergia celular (anergia clonal) y activa las células.
Aunque alguna parte del mecanismo de la transmisión de la señal secundaria entre células presentadoras de antígenos y linfocitos tales como las células T aún no ha sido aclarada en detalle, los estudios hasta el momento han revelado que un importante factor para la transmisión de la señal secundaria es la interacción de CD28 (también denominada Tp44, T44 o antígeno 9.3), que es una molécula de la superficie celular expresada principalmente sobre células T y células del timo, con CD80 (también denominada B7-1, B7, BB1 o B7/BB1), que es una molécula de la superficie celular expresada sobre células presentadoras de antígenos (macrófagos, monocitos, células dendríticas, etc.) y con CD86 (también denominada B7-2 o B70), que es también una molécula de la superficie celular sobre células presentadoras de antígenos (a saber, adhesión celular a través de la unión entre estas moléculas). Además, se ha aclarado experimentalmente que la interacción del antígeno-4 asociado a linfocitos T citolíticos (CTLA-4), cuya expresión se considera potenciada dependiendo de la señal secundaria, con CD80 (B7-1) y CD86 (B7-2) (a saber, adhesión celular a través de la unión entre estas moléculas) también desempeña un papel importante en la regulación de la activación de células T mediante la señal secundaria. En otras palabras, la regulación de la activación de células T mediante la transmisión de la señal secundaria implica al menos la interacción entre CD28 y CD80/CD86, el aumento de la expresión de CTLA-4, que se considera depende de la interacción, y la interacción entre CTLA-4 y CD80/CD86.
Se sabe que CD28 es una molécula coestimuladora que transmite la señal secundaria (señal coestimuladora) requerida para la activación de células T y para la prevención de la anergia. La señal secundaria transmitida uniendo esta molécula a moléculas coestimuladoras, CD80 (B7-1) y CD86 (B7-2), sobre las células presentadoras de antígenos (adhesión celular a través de la unión entre estas moléculas), estabiliza el ARNm de las citoquinas de tipo Th1 y en consecuencia promueve la producción por parte de las células T de una gran cantidad de citoquinas de tipo Th1 tales como 1L-2, IFN� y TNF�. La expresión de CTLA-4 es inducida por la señal primaria transmitida a través de TcR/CD3, y la expresión también es potenciada por la señal secundaria transmitida por la unión entre CD28 y CD80. Se está revelando que CTLA-4 recibe estas señales para funcionar inhibiendo la función de las células T, que es contraria a la activación de células T mediante la señal secundaria transmitida por CD28.
CD28 y CTLA-4 humanas son glicoproteínas de tipo I cuyos pesos moleculares son 44 kD y 41 a 43 kD, respectivamente. Ambas poseen un dominio similar a la inmunoglobulina, pertenecen a la superfamilia de las inmunoglobulinas, y funcionan ambas como molécula de adhesión celular y como molécula de transmisión de señales.
CD28 humana forma un homodímero con un enlace disulfuro mientras que CTLA-4 existe como monómero. Ambos genes CD28 y CTLA-4 están ubicados en "2q33" en el cromosoma humano y "1C" en el cromosoma de ratón, y están compuestos por cuatro (4) exones. CD28 y CTLA-4 humanas están constituidas por 220 y 223 aminoácidos, respectivamente, incluyendo las secuencias líderes, y la homología de aminoácidos entre ellas es 20 a 30%.
Los ligandos para CD28 y CTLA-4 son CD80 (B7-1) y CD86 (B7-2) en el ser humano y el ratón. CTLA-4 posee una afinidad para ambos ligandos aproximadamente 20 veces más alta que CD28. Se ha aclarado que la estructura de la secuencia de aminoácidos "MYPPPY (Met-Tyr-Pro-Pro-Pro-Tyr)" conservada a través de las especies animales es importante para la unión de CD28 y CTLA-4 a CD80 (B7-1). También se ha informado que, cuando CD28 es estimulada, la quinasa PI3 (fosfoinositida 3 quinasa, PI3K) se asocia con el resto de tirosina fosforilado en una secuencia parcial "YMNM (Tyr-Met-Asn-Met)” de CD28 y que CD28 desempeña un papel importante en la transmisión intracelular de señales a través de esta estructura "YxxM". Además, se ha informado que CTLA-4 también posee una secuencia representada por "YxxM," a saber "YVKM (Tyr-Val-Lis-Met)" en su región citoplásmica y que, después de ser estimulada, SYP se asocia con esta secuencia.
CD28 se expresa específicamente en timocitos y células T sanguíneas periféricas, y CTLA-4 se expresa específicamente en células T activadas (Cell Engineering: SUPPLEMENT, "Handbook of Adhesion Molecule", Shujunsha, páginas 93-102 (1994) ; ibid. páginas 120-136; Experimerital.Medicine: SUPPLEMENT, "BIO SCIENCE Term Library, Immunity ", Yodosha, páginas 94-98 (1995); Experimental Medicine: SUPPLEMENT, "BIO SCIENCE Term Library, Intracellular Signal Transduction", Yodosha, páginas 58-59 (1997); Nihon Rinsho, Vol.55, Núm. 6, páginas 215-220 (1997)) .
En la regulación de la función de las células T (la activación y la inhibición de la función de las células T), la importancia de las interacciones entre múltiples moléculas tales como moléculas coestimuladoras (CD28, CD80 (87-1), CD86 (B7-2), etc.) y CTLA-4, que coopera con las mismas, ha sido así reconocida, y esto ha atraído la atención a la relación entre estas moléculas y las enfermedades, y el tratamiento de enfermedades regulando la función de estas moléculas.
Según lo descrito más arriba, aunque un organismo vivo active su sistema de respuesta inmunitaria adquirida contra antígenos que son cuerpos extraños contra el organismo vivo (el mismo), también posee tolerancia inmunológica para no mostrar ninguna respuesta inmunitaria contra su propio componente (autoantígeno). Si la tolerancia inmunológica se rompe por alguna razón, se produce la respuesta inmunitaria al autoantígeno, las células T reactivas al autoantígeno son inducidas por el mismo mecanismo mencionado más arriba para caer en un estado anormal de inmunidad, y se producen diversas enfermedades autoinmunes.
En otras palabras, debido a que las células presentadoras de antígenos no estimuladas (APC) en tejidos normales no expresan moléculas coestimuladoras cuando el sistema inmunitario de un organismo vivo es normal, las células T están en estado de ausencia de reacción para mantener la tolerancia inmunológica aunque existan células T reactivas al autoantígeno, que reaccionan con el autoantígeno. Se ha sugerido que en un estado de inmunidad anormal, se activan más células T reactivas al autoantígeno debido al exceso anormal y a la continua expresión de las moléculas coestimuladoras para causar de ese modo enfermedades autoinmunes.
Recientemente, desde dichos puntos de vista, se han propuesto muchos intentos por tratar diversas enfermedades autoinmunes modulando la transmisión de las señales coestimuladoras, por ejemplo la transmisión de señales arriba mencionada entre CD28/CTLA-4 y CD80/CD86.
Los resultados de dichos intentos no han clarificado aún en detalle el mecanismo de la activación de células T mediante la interacción entre las moléculas coestimuladoras y las moléculas relacionadas. Otras moléculas desconocidas pueden estar involucradas en este mecanismo.
Recientemente, se ha identificado una nueva molécula coestimuladora como "CD28" y "CTLA-4" descritas más arriba, que se considera realiza la transducción de una segunda señal (señal coestimuladora) esencial para la activación de linfocitos tales como células T, y la regulación funcional acoplada con dicha señal de linfocitos activados tales como células T activadas. Esta molécula se ha denominado AILIM (molécula inmunomoduladora de linfocitos inducible por activación) (en seres humanos, ratones y ratas: Int. Immunol., Vol. 12, Núm. 1, páginas 51-55, 2000), también denominada ICOS (coestimulador inducible) (en seres humanos: Mature, Vol. 397, No.6716, páginas 263-266, 1999)).
Por otra parte, se han identificado muy recientemente nuevas moléculas denominadas B7h, B7RP-1, GL50 o LICOS que son ligandos (ligandos de AILIM) que interactúan con esta molécula de transmisión coestimuladora AILIM (ICOS) (Nature. Vol. 402, No. 6763, páginas 827-832, 1999; Nature -Medicine, Vol. 5, No. 12, páginas 1365-1369, 1999; J. Immunology, Vol. 164, páginas 1653-1657, 2000; Curr. Biol., Vol. 10, No. 6, páginas 333-336, 2000).
La identificación de estas dos clases de moléculas nuevas, a saber AILIM (ICOS) y B7RP-1 (B7h, GL50, LICOS), como la vía de transducción de señales para la señal coestimuladora esencial para la mencionada activación de linfocitos tales como células T, y el control de la función de las células T activadas, reveló que existe una nueva tercera vía por interacción entre AILIM (ICOS) y B7RP-1 (B7h, GL50, LICOS), además de la primera y segunda vías de transducción de señales que son vías de transducción ya conocidas entre CD28 y CD80 (B7-1) / CD86 (B7-2), y entre CTLA4 y CD80 (B7-1) / CD 86 (B7-2).
Están en vías de ejecución estudios sobre las funciones biológicas de estas nuevas moléculas, el control de la función de los linfocitos, tales como células T, a través de esta tercera vía de transducción de señales coestimuladoras mediante las moléculas, y la relación entre la nueva transducción de señales y las enfermedades (J. Immunol., 166(1), página 1, 2001; J. Immunol., 165(9), página 5035, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun., 276(1), página 335, 2000; Immunity, 13(1), página 95, 2000;
J. Exp. Med., 192 (1), página 53, 2000; Eur. J. Immunol., 30(4), página 1040, 2000 WO 01/15732).
El documento EP-A 0984023 revela anticuerpos anti-AILIM de ratón que inhiben la aglutinación de células linfocíticas y la posibilidad de uso de dichos anticuerpos para tratar enfermedades autoinmunes y enfermedades alérgicas.
FASEB .1., vol. 14, 20 de abril de 2000, A1169 revela que la expresión de la molécula coestimuladora inducible (ICOS) de ratón se incrementa por coestimulación de CD28 y regula el desarrollo de las células Th2.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
Específicamente, un objetivo de la presente invención es revelar las funciones biológicas de la nueva molécula AILIM, considerada, al igual que "CD28" y "CTLA-4", una molécula que transmite la señal secundaria (señal coestimuladora) esencial para la activación de linfocitos, tales como células T, y que controla las funciones de los linfocitos activados, tales como células T activadas, funcionando con la señal; revelar relaciones entre la expresión de AILIM y las enfermedades; y proporcionar un procedimiento y un producto farmacéutico que inhiba el desarrollo de diversas enfermedades dependientes del patrón de expresión de AILIM o que trate las enfermedades controlando las funciones biológicas de AILIM utilizando los métodos médicos y farmacéuticos (por ejemplo, un fármaco tal como un anticuerpo monoclonal y un compuesto de bajo peso molecular).
Para lograr los propósitos arriba descritos, los presentes inventores han practicado activamente estudios sobre anticuerpos humanos (particularmente anticuerpos monoclonales humanos) contra AILIMs de mamíferos (particularmente AILIM humana), y como resultado de los mismos, inmunizando ratones transgénicos preparados utilizando técnicas de recombinación genética para producir anticuerpos humanos contra AILIM (específicamente una fracción de membrana celular de células que expresan AILIM humana), consiguieron por primera vez en el mundo preparar una variedad de anticuerpos monoclonales que se unen a AILIM humana, particularmente aquellos que se unen a AILIM humana que regulan la transducción de señales mediadas por AILIM humana.
Debido a que los anticuerpos (particularmente anticuerpos monoclonales) de la presente invención se obtienen de seres humanos, no inducen absolutamente ningún rechazo inmunitario grave debido a la inmunogenicidad contra seres humanos, HAMA (antigenicidad humana anti-ratón), en el huésped, lo que ha sido un gran problema (efecto colateral) en la terapia que utiliza productos farmacéuticos de anticuerpos que comprenden anticuerpos obtenidos de mamíferos no humanos tales como ratones, y aumentando dramáticamente de ese modo el valor del anticuerpo como medicamento.
Por ello, los anticuerpos humanos (particularmente anticuerpos monoclonales humanos) que se unen a AILIMs de mamíferos (particularmente AILIM humana) de la presente invención y las composiciones farmacéuticas que comprenden dichos anticuerpos humanos (particularmente anticuerpos monoclonales humanos) son útiles como fármacos para controlar, sin ninguna inducción de rechazo inmunitario debido a HAMA en el huésped, diversas reacciones fisiológicas relacionadas con la transducción de señales coestimuladoras a células que expresan AILIM mediadas por AILIM (por ejemplo, proliferación de células que expresan AILIM, producción de citoquinas por células que expresan AILIM, citólisis inmunitaria o apoptosis de células que expresan AILIM, y actividad para inducir citotoxicidad dependiente de anticuerpos a células que expresan AILIM, etcétera), y/o son también útiles como fármacos para suprimir y prevenir el desarrollo de síntomas y/o el avance de diversos trastornos relacionados con la transducción de señales mediada por dicha AILIM, y como medicamento para tratar o prevenir dicho trastorno.
Específicamente, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención son capaces de controlar (suprimir o estimular) la proliferación de células que expresan AILIM o la producción de citoquinas (por ejemplo, interferón � o interleuquina 4, etc.) por parte de células que expresan AILIM, permitiendo de ese modo la supresión de diversas afecciones patológicas y el tratamiento o prevención de diversos trastornos causados por diversos fenómenos fisiológicos relacionados con la transducción de señales mediada por AILIM.
El uso de las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención permite la supresión, prevención y/o tratamiento de, por ejemplo, diversos trastornos (por ejemplo, artritis reumatoidea, esclerosis múltiple, tiroiditis autoinmune, dermatitis alérgica de tipo contacto, dermatosis inflamatoria crónica tal como liquen plano, lupus eritematoso sistémico, diabetes mellitus insulino-dependiente, psoriasis, etc.) clasificados en trastornos autoinmunes o alérgicos (particularmente enfermedad autoinmune y alergia retardada causada por inmunidad celular); artropatía (por ejemplo, artritis reumatoidea (RA) y osteoartritis (OA)), inflamación (por ejemplo hepatitis); reacción injerto contra huésped (reacción GVH); enfermedad injerto contra huésped (GVHD); rechazo inmunológico que acompaña el transplante (homoplastía o heteroplastía) de un tejido (tejidos tales como piel, córnea, hueso, etc.) u órgano (hígado, corazón, pulmón, riñón, páncreas, etc.); respuesta inmunitaria desencadenada por un antígeno extraño o autoantígeno (por ejemplo, producción de anticuerpos contra dicho antígeno, proliferación celular, producción de citoquinas); y trastornos posiblemente causados por la inmunidad intestinal anormal (específicamente trastornos intestinales inflamatorios (particularmente enfermedad del colon y colitis ulcerosa) y alergia alimentaria).
Además, en el campo de supresión/tratamiento de rechazo inmunológico que acompaña al transplante de los tejidos y órganos arriba descritos, es posible incrementar el efecto supresor sobre el rechazo al transplante del inmunosupresor conocido utilizando la composición farmacéutica de la presente invención junto con aquellos fármacos que han sido utilizados para la supresión del rechazo inmunológico en dicho tratamiento de transplante.
Es más, la composición farmacéutica de la presente invención puede aplicarse para tratar o prevenir cualquier enfermedad inflamatoria para la que se indican diversos esteroides como antiflogísticos.
La composición farmacéutica de la presente invención puede aplicase a una enfermedad inflamatoria, por ejemplo la inflamación que acompaña a diversas artritis (por ejemplo, artritis reumatoidea, osteoartritis), neumonía, hepatitis (incluyendo hepatitis viral), la inflamación que acompaña a las enfermedades infecciosas, enfermedades intestinales inflamatorias, enteritis intestinal, nefritis (inflamación que acompaña a la nefritis glomerular, nefrofibrosis), gastritis, angiitis, pancreatitis, peritonitis, bronquitis, miocarditis, cerebritis, inflamación en lesión por reperfusión postisquémica (lesión por reperfusión isquémica de miocardio), inflamación atribuida a rechazo inmunológico después del transplante de tejido y órgano, quemadura, diversas inflamaciones de la piel (psoriasis, dermatitis alérgica de tipo contacto, liquen plano que es una enfermedad inflamatoria crónica de la piel), inflamación en insuficiencia de múltiples órganos, inflamación posterior a una operación de PTCA o
PTCR, e inflamación que acompaña a la arteriosclerosis, y tiroiditis autoinmune. Además, utilizando un método para identificar sustancias que se unen a AILIM
o al ligando de AILIM, que es uno de las presentes invenciones, se hace posible la detección para seleccionar productos farmacéuticos (compuestos químicos sintéticos o anticuerpos) con actividad potencial para tratar diversos trastornos mediante la unión a AILIM o ligandos de AILIM para regular la transducción de señales mediada por la interacción de los mismos.
Específicamente, la presente invención es la invención descrita a partir de los siguientes puntos (1) a (31).
(1)
Un anticuerpo monoclonal humano que se une a AILIM humana, en el que una región variable de cadena pesada de dicho anticuerpo monoclonal humano posee una secuencia de aminoácidos de los siguientes puntos (a) o (b):
(a)
secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos desde la posición 20 hasta la posición 117 de la SEQ ID NO: 28, o
(b)
secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos desde la posición 20 hasta la posición 117 de la SEQ ID NO: 28 en la que uno a diez restos de aminoácidos son eliminados o sustituidos, o a la que uno a diez restos de aminoácidos son insertados o añadidos,
siempre que, cuando la región variable de cadena pesada posee la secuencia de aminoácidos del punto anterior (b), dicho anticuerpo comprende cualquiera de las características de los siguientes puntos (i) a (iii):
(i) una actividad para impedir la reacción linfocitaria mixta;
(ii) una actividad para inducir la transducción de señales para inducir al interferón �;o
(iii) una actividad para inducir la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos a células que expresan AILIM.
(2)
Un anticuerpo monoclonal humano que se une a AILIM humana, en el que un polipéptido de cadena pesada de dicho anticuerpo monoclonal humano posee una secuencia de aminoácidos de los siguientes puntos (a) o (b):
(a)
secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos desde la posición 20 hasta la posición 470 de la SEQ ID NO: 28, o
(b)
secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos desde la posición 20 hasta la posición 470 de la SEQ ID NO: 28 en la que uno a diez restos de aminoácidos son eliminados o sustituidos, o a la que uno a diez restos de aminoácidos son insertados o añadidos,
siempre que, cuando el polipéptido de cadena pesada posee la secuencia de aminoácidos del punto anterior (b), dicho anticuerpo comprende cualquiera de las características de los siguientes puntos (i) a (iii):
(i) una actividad para impedir la reacción linfocitaria mixta;
(ii) una actividad para inducir la transducción de señales para inducir al interferón �;o
(iii) una actividad para inducir la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos a células que expresan AILIM.
(3)
Un anticuerpo monoclonal humano que se une a AILIM humana, en el que una región variable de cadena liviana de dicho anticuerpo monoclonal humano posee una secuencia de aminoácidos de los siguientes puntos (a) o (b):
(a)
secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos desde la posición 23 hasta la posición 116 de la SEQ ID NO: 30, o
(b)
secuencia de aminoácidos que comprende aminoácidos desde la posición 23 hasta la posición 116 de la SEQ ID NO: 30 en la que uno a diez restos de aminoácidos son eliminados o sustituidos, o a la que uno a diez restos de aminoácidos son insertados o añadidos,
siempre que, cuando la región variable de cadena liviana posee la secuencia de aminoácidos del punto anterior (b), dicho anticuerpo comprende cualquiera de las características de los siguientes puntos (i) a (iii):
(i) una actividad para impedir la reacción linfocitaria mixta;
(ii) una actividad para inducir la transducción de señales para inducir al interferón �;o
(iii) una actividad para inducir la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos a células que expresan AILIM.
(4)
Un anticuerpo monoclonal humano que se une a AILIM humana, en el que un polipéptido de cadena liviana de dicho anticuerpo monoclonal humano posee una secuencia de aminoácidos de los siguientes puntos (a) o (b):
(a)
secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos desde la posición 23 hasta la posición 236 de la SEQ ID NO: 30, o
(b)
secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos desde la posición 23 hasta la posición 236 de la SEQ ID NO: 30 en la que uno a diez restos de aminoácidos son eliminados o sustituidos, o a la que uno a diez restos de aminoácidos son insertados o añadidos,
siempre que, cuando el polipéptido de cadena liviana posee la secuencia de aminoácidos del punto anterior (b), dicho anticuerpo comprende cualquiera de las características de los siguientes puntos (i) a (iii):
(i) una actividad para impedir la reacción linfocitaria mixta;
(ii) una actividad para inducir la transducción de señales para inducir al interferón �;o
(iii) una actividad para inducir la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos a células que expresan AILIM.
(5)
Un anticuerpo monoclonal humano que se une a AILIM humana y comprende las siguientes características (a) y (b):
(a)
una región variable de cadena pesada del anticuerpo comprende uno de los siguientes puntos (I) o (II):
(I)
una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido 20 hasta el 117 de la SEQ ID NO: 28; o
(II)
una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos desde la posición 20 hasta la posición 117 de la SEQ ID NO: 28 en la que uno a diez restos de aminoácidos son eliminados o sustituidos, o a la que uno a diez restos de aminoácidos son insertados o añadidos; y
(b)
una región variable de cadena liviana del anticuerpo comprende uno de los siguientes puntos (I) o (II):
(I)
una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido 23 hasta el 116 de la SEQ ID NO: 30; o
(II)
una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos desde la posición 23 hasta la posición 116 de la SEQ ID NO: 30 en la que uno a diez restos de aminoácidos son eliminados o sustituidos, o a la que uno a diez restos de aminoácidos son insertados o añadidos,
siempre que, cuando la región variable de cadena pesada es la del punto anterior (II) de (a) o la región variable de cadena liviana es la del punto anterior (II) de (b), dicho anticuerpo comprende cualquiera de las características de los siguientes puntos (i) a (iii):
(i) una actividad para impedir la reacción linfocitaria mixta;
(ii) una actividad para inducir la transducción de señales para inducir al interferón �;o
(iii) una actividad para inducir la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo a las células que expresan AILIM.
(6) Un anticuerpo monoclonal humano que se une a AILIM humana y
comprende las siguientes características (a) y (b):
(a)
un polipéptido de cadena pesada del anticuerpo comprende uno de los siguientes puntos (I) o (II):
(I)
una secuencia de aminoácidos desde el aminoácido 20 hasta el 470 de la SEQ ID NO: 28; o
(II)
una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos desde la posición 20 hasta la posición 470 de la SEQ ID NO: 28 en la que uno a diez restos de aminoácidos son eliminados o sustituidos, o a la que uno a diez restos de aminoácidos son insertados o añadidos; y
(b)
un polipéptido de cadena liviana del anticuerpo comprende uno de los siguientes puntos (I) o (II):
(I)
una secuencia de aminoácidos desde el aminoácido 23 hasta el 236 de la SEQ ID NO: 30; o
(II)
una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos desde la posición 23 hasta la 236 de la SEQ ID NO: 30 en la que uno a diez restos de aminoácidos son eliminados o sustituidos, o a la que uno a diez restos de aminoácidos son insertados o añadidos,
siempre que, cuando el polipéptido de cadena pesada es el del punto anterior
(II)
de (a) o el polipéptido de cadena liviana es el del punto anterior (II) de (b), dicho anticuerpo comprende cualquiera de las características de los siguientes puntos (i) a (iii):
(i) una actividad para impedir la reacción linfocitaria mixta;
(ii)
una actividad para inducir la transducción de señales para inducir al interferón �;o
una actividad para inducir la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos a células que expresan AILIM.
(7)
Un ADN que codifica un polipéptido de región variable de cadena pesada del anticuerpo humano del punto (1), en el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido 20 hasta el 117 de la SEQ ID NO: 28.
(8)
Un ADN que codifica un polipéptido de región variable de cadena liviana del anticuerpo del punto (3), en el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido 23 hasta el 116 de la SEQ ID NO: 30.
(9)
Un ADN que codifica un polipéptido de cadena pesada del anticuerpo humano del punto (2), en el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido 20 hasta el 470 de la SEQ ID NO: 28.
(10)
Un ADN que codifica un polipéptido de cadena liviana del anticuerpo humano del punto (4), en el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido 23 hasta el 236 de la SEQ ID NO: 30.
(11) Un ADN seleccionado del punto (a) o (b) siguiente:
(a)
un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 126 hasta el 419 de la SEQ ID NO: 27, o
(b)
un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 105 hasta el 386 de la SEQ ID NO: 29.
(12) Un ADN seleccionado del punto (a) o (b) siguiente:
(a)
un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 69 hasta el 1481 de la SEQ ID NO: 27, o
(b)
un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 39 hasta el 749 de la SEQ ID NO:29.
(13) Un vector que comprende el ADN de cualquiera de los puntos (7) a (12).
(14)
El vector del punto (13) que comprende un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 126 hasta el 419 de la SEQ ID NO: 27.
(15)
El vector del punto (13) que comprende un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 69 hasta el 1481 de la SEQ ID NO: 27.
(16)
El vector del punto (13) que comprende un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 105 hasta el 385 de la SEQ ID NO: 29.
(17)
El vector del punto (13) que comprende un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 39 hasta el 749 de la SEQ ID NO: 29.
(18)
El vector del punto (13) que comprende un ADN de acuerdo con los siguientes puntos (a) y (b):
(a)
un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 126 hasta el nucleótido 419 de la SEQ ID NO: 27, y
(b)
un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 105 hasta el nucleótido 386 de la SEQ ID NO: 29.
(19)
El vector del punto (13) que comprende un ADN de acuerdo con los siguientes puntos (a) y (b):
(a)
un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 69 hasta el 1481 de la SEQ ID NO: 27, y
(b)
un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 39 hasta el 749 de la SEQ ID NO: 29.
(20) Una célula embrionaria no humana que produce el anticuerpo monoclonal
humano de cualquiera de los puntos (1) a (6).
(21)
La célula del punto (20), en la que dicha célula es una célula fusionada obtenida mediante la fusión de una célula B, obtenida de un mamífero capaz de producir dicho anticuerpo monoclonal humano, y una célula de mieloma obtenida de un mamífero.
(22)
Un huésped no humano recombinante genético transformado por el vector de cualquiera de los puntos (13) a (19), dicho huésped se obtiene de un mamífero seleccionado del grupo que consiste en animal bovino, cabra, conejo, ratón, rata, hámster y cobayo.
(23)
El huésped recombinante genético del punto (22), en el que dicho huésped es una célula de mamífero no humano.
(24)
El huésped recombinante genético del punto (22), en el que dicho huésped es un huevo fertilizado de mamífero no humano.
(25)
Un anticuerpo monoclonal humano o una porción del mismo que se une a AILIM humana producida por un huésped recombinante genético de los puntos (22) o (23).
(26)
Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo humano de cualquiera de los puntos (1) a (6), y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
(27)
Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal humano o una porción del mismo del punto (25), y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
(28) Uso del anticuerpo o una porción del mismo de cualquiera de los puntos
(1)
a (6) y (25) para preparar una composición farmacéutica para la prevención, tratamiento o profilaxis de la alergia de tipo retardada.
(29) Uso del anticuerpo o una porción del mismo de cualquiera de los puntos
(1)
a (6) y (25) para preparar una composición farmacéutica para la prevención, tratamiento o profilaxis de la artritis reumatoidea.
(30) Uso del anticuerpo o una porción del mismo de cualquiera de los puntos
(1)
a (6) y (25) para preparar una composición farmacéutica para la prevención, tratamiento o profilaxis del lupus eritematoso sistémico.
(31) Uso del anticuerpo o una porción del mismo de cualquiera de los puntos
(1)
a (6) y (25) para preparar una composición farmacéutica para la prevención,
tratamiento o profilaxis de la psoriasis. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra las reactividades respectivas del anticuerpo anti-IgG humana, el anticuerpo anti-Ig� humana y el anticuerpo anti-IgFc humana frente al anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana, analizadas por ELISA celular utilizando un citómetro de flujo.
Los paneles (a) a (l) muestran los resultados respectivos de los ensayos indicados más abajo.
Panel (a): resultado del ensayo en el que se añadió un anticuerpo anti-IgG humana marcado con biotina como anticuerpo secundario en ausencia del anticuerpo primario en la microplaca donde se habían colocado células HPB-ALL de tipo salvaje.
Panel (b): resultado del ensayo en el que se añadió un anticuerpo anti-Ig� humana marcado con biotina como anticuerpo secundario en ausencia del anticuerpo primario en la microplaca donde se habían colocado células HPB-ALL de tipo salvaje.
Panel (c): resultado del ensayo en el que se añadió un anticuerpo anti-IgFc humana marcado con biotina como anticuerpo secundario en ausencia del anticuerpo primario en la microplaca donde se habían colocado células HPB-ALL de tipo salvaje.
Panel (d): resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab-136 como anticuerpo primario y se utilizó anticuerpo anti-IgG humana marcado con biotina como anticuerpo secundario.
Panel (e): resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab-136 como anticuerpo primario y se utilizó anticuerpo anti-Ig� humana marcado con biotina como anticuerpo secundario.
Panel (f): resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab-136 como anticuerpo primario y se utilizó anticuerpo anti-IgFc humana marcado con biotina como anticuerpo secundario.
Panel (g): resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab-138 como anticuerpo primario y se utilizó anticuerpo anti-IgG humana marcado con biotina como anticuerpo secundario.
Panel (h): resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab-138 como anticuerpo primario y se utilizó anticuerpo anti-Ig� humana marcado con biotina como anticuerpo secundario.
Panel (i) : resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab-138 como anticuerpo primario y se utilizó anticuerpo anti-IgFc humana marcado con biotina como anticuerpo secundario.
Panel (j): resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab-139 como anticuerpo primario y se utilizó anticuerpo anti-IgG humana marcado con biotina como anticuerpo secundario.
Panel (k): resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab-139 como anticuerpo primario y se utilizó anticuerpo anti-Ig� humana marcado con biotina como anticuerpo secundario.
Panel (I): resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab-139 como anticuerpo primario y se utilizó anticuerpo anti-IgFc humana utilizó marcado con biotina como anticuerpo secundario.
La curva con símbolos abiertos en cada panel corresponde al resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal humano anti-KLH como anticuerpo de control.
La Figura 2 muestra una curva de calibración con respecto al anticuerpo monoclonal de IgG humana (material estándar) ensayado mediante ELISA sándwich utilizando anticuerpo anti-IgG humana.
El eje vertical indica la intensidad de fluorescencia, y el eje horizontal indica la concentración del material estándar.
La Figura 3 muestra actividades de unión de diversos anticuerpos monoclonales anti-AILIM humana de ratón a células CHO recombinantes que sobreexpresan AILIM humana o a células CHO de tipo salvaje.
El eje vertical indica la intensidad de fluorescencia como un índice de actividad de unión a células recombinantes, y el eje horizontal indica la concentración del anticuerpo añadido.
El término "CHO" en la figura indica el resultado de un ensayo de unión a la célula CHO de tipo salvaje, y "humana" indica el resultado de un ensayo de unión a la célula CHO recombinante que sobreexpresa AILIM humana.
La Figura 4 muestra actividades de unión de diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana o anticuerpos monoclonales humanos anti-KLH como control negativo a células CHO recombinantes que sobreexpresan AILIM humana o a células CHO de tipo salvaje.
El eje vertical indica la intensidad de fluorescencia como un índice de actividad de unión a células recombinantes, y el eje horizontal indica la concentración del anticuerpo añadido.
El término “CHO" en la figura indica el resultado de un ensayo de unión a la célula CHO de tipo salvaje, y "humana" indica el resultado de un ensayo de unión a la célula CHO recombinante que sobreexpresa AILIM humana.
La Figura 5 muestra actividades de unión de diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana a células CHO recombinantes que
sobreexpresan AILIM humana o a células CHO de tipo salvaje.
El eje vertical indica la intensidad de fluorescencia como un índice de actividad de unión a células recombinantes, y el eje horizontal indica la concentración del anticuerpo añadido.
El término "CHO" en la figura indica el resultado de un ensayo de unión a la célula CHO de tipo salvaje, y "humana" indica el resultado de un ensayo de unión a la célula CHO recombinante que sobreexpresa AILIM humana.
La Figura 6 muestra actividades de unión de diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana a células CHO recombinantes que sobreexpresan AILIM humana o a células CHO de tipo salvaje.
El eje vertical indica la intensidad de fluorescencia como índice de actividad de unión a células recombinantes, y el eje horizontal indica la concentración del anticuerpo añadido.
El término "CHO" en la figura indica el resultado de un ensayo de unión a la célula CHO de tipo salvaje, y "humana" indica el resultado de un ensayo de unión a la célula CHO recombinante que sobreexpresa AILIM humana.
La Figura 7 muestra actividades de unión de anticuerpos monoclonales de rata anti-AILIM humana a células CHO recombinantes que sobreexpresan AILIM de ratón o a células CHO de tipo salvaje.
El eje vertical indica la intensidad de fluorescencia como índice de actividad de unión a células recombinantes, y el eje horizontal indica la concentración del anticuerpo añadido.
El término "CHO" en la figura indica el resultado de un ensayo de unión a la célula CHO de tipo salvaje, y "ratón" indica el resultado de un ensayo de unión a la célula CHO recombinante que sobreexpresa AILIM de ratón.
La Figura 8 muestra actividades de unión de diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana o anticuerpos monoclonales humanos anti-KLH como control negativo a células CHO recombinantes que sobreexpresan AILIM de ratón o a células CHO de tipo salvaje.
El eje vertical indica la intensidad de fluorescencia como índice de actividad de unión a células recombinantes, y el eje horizontal indica la concentración del anticuerpo añadido.
El término "CHO" en la figura indica el resultado de un ensayo de unión a la célula CHO de tipo salvaje, y "ratón" indica el resultado de un ensayo de unión a la célula CHO recombinante que sobreexpresa AILIM de ratón.
La Figura 9 muestra actividades de unión de diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana a células CHO recombinantes que sobreexpresan AILIM de ratón o a células CHO de tipo salvaje.
El eje vertical indica la intensidad de fluorescencia como índice de actividad de unión a células recombinantes, y el eje horizontal indica la concentración del anticuerpo añadido.
El término "CHO" en la figura indica el resultado de un ensayo de unión a la célula CHO de tipo salvaje, y "ratón" indica el resultado de un ensayo de unión a la célula CHO recombinante que sobreexpresa AILIM de ratón.
La Figura 10 muestra actividades de unión de diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana a células CHO recombinantes que sobreexpresan AILIM de ratón o a células CHO de tipo salvaje.
El eje vertical indica la intensidad de fluorescencia como índice de actividad de unión a células recombinantes, y el eje horizontal indica la concentración del anticuerpo añadido.
El término "CHO" en la figura indica el resultado de un ensayo de unión a la célula CHO de tipo salvaje, y "ratón" indica el resultado del ensayo de unión a la célula CHO recombinante que sobreexpresa AILIM de ratón.
La Figura 11 muestra actividades de unión de diversos anticuerpos monoclonales de ratón anti-AILIM de rata a células CHO recombinantes que sobreexpresan AILIM de rata o a células CHO de tipo salvaje.
El eje vertical indica la intensidad de fluorescencia como índice de actividad de unión a células recombinantes, y el eje horizontal indica la concentración del anticuerpo añadido.
El término "CHO" en la figura indica el resultado de un ensayo de unión a la célula CHO de tipo salvaje, y "rata" indica el resultado de un ensayo de unión a la célula CHO recombinante que sobreexpresa AILIM de rata.
La Figura 12 muestra actividades de unión de diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana o anticuerpos monoclonales humanos anti-KLH como control negativo a células CHO recombinantes que sobreexpresan AILIM de rata o a células CHO de tipo salvaje.
El eje vertical indica la intensidad de fluorescencia como índice de actividad de unión a células recombinantes, y el eje horizontal indica la concentración del anticuerpo añadido.
El término "CHO" en la figura indica el resultado de un ensayo de unión a la célula CHO de tipo salvaje, y "rata" indica el resultado de un ensayo de unión a la célula CHO recombinante que sobreexpresa AILIM de rata.
La Figura 13 muestra actividades de unión de diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana a células CHO recombinantes que sobreexpresan AILIM de rata o a células CHO de tipo salvaje.
El eje vertical indica la intensidad de fluorescencia como índice de actividad de unión a células recombinantes, y el eje horizontal indica la concentración del anticuerpo añadido.
El término "CHO" en la figura indica el resultado de un ensayo de unión a la célula CHO de tipo salvaje, y "rata" indica el resultado de un ensayo de unión a la célula CHO recombinante que sobreexpresa AILIM de rata.
La Figura 14 muestra actividades de unión de diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana a células CHO recombinantes que sobreexpresan AILIM de rata o a células CHO de tipo salvaje.
El eje vertical indica la intensidad de fluorescencia como índice de actividad de unión a células recombinantes, y el eje horizontal indica la concentración del anticuerpo añadido.
El término "CHO" en la figura indica el resultado de un ensayo de unión a la célula CHO de tipo salvaje, y "rata" indica el resultado de un ensayo de unión a la célula CHO recombinante que sobreexpresa AILIM de rata.
La Figura 15 muestra la actividad de proliferación de células T obtenidas de una persona saludable normal, el "donante A", en el ensayo para determinar la actividad de transducción de señales coestimuladoras por parte de diversos anticuerpos monoclonales anti-AILIM humana de ratón utilizando una microplaca revestida con anticuerpo monoclonal anti-CD3 humana junto con anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón.
El eje vertical indica la cantidad de incorporación celular de [3H]timidina como índice del grado de proliferación celular, y el eje horizontal indica la concentración de anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón.
La Figura 16 muestra la actividad de proliferación de células T obtenidas de una persona saludable normal, el "donante A", en el ensayo para determinar la actividad de transducción de señales coestimuladoras por parte de diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana utilizando una microplaca revestida con anticuerpo monoclonal anti-CD3 humana junto con anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
El eje vertical indica la cantidad de incorporación celular de [3H]timidina como índice del grado de proliferación celular, y el eje horizontal indica la concentración de anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
La Figura 17 muestra la actividad de proliferación de células T obtenidas de una persona saludable normal, el "donante B", en el ensayo para determinar la actividad de transducción de señales coestimuladoras por parte de diversos anticuerpos monoclonales anti-AILIM humana de ratón utilizando una microplaca revestida con anticuerpo monoclonal anti-CD3 humana junto con anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón.
El eje vertical indica la cantidad de incorporación celular de [3H]timidina como índice del grado de proliferación celular, y el eje horizontal indica la concentración de anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón.
En esta figura, "JHC1" indicó el resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal anti-CETP humana como control negativo, en lugar del anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón.
La Figura 18 muestra la actividad de proliferación de células T obtenidas de una persona saludable normal, el "donante B", en el ensayo para determinar la actividad de transducción de señales coestimuladoras por parte de diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana utilizando una microplaca revestida con anticuerpo monoclonal anti-CD3 humana junto con anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
El eje vertical indica la cantidad de incorporación celular de [3H]timidina como índice del grado de proliferación celular, y el eje horizontal indica la concentración de anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
En esta figura, "anti-KLH" indica el resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal humano anti-KLH como control negativo, en lugar del anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
La Figura 19 muestra la actividad de proliferación de células T obtenidas de una persona saludable normal, el "donante B", en el ensayo para determinar la actividad de transducción de señales coestimuladoras por parte de diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana utilizando una microplaca revestida con anticuerpo monoclonal anti-CD3 humana junto con anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
El eje vertical indica la cantidad de incorporación celular de [3H]timidina como índice del grado de proliferación celular, y el eje horizontal indica la concentración de
anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
En esta figura, "anti-KLH" indica el resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal humano anti-KLH como control negativo, en lugar del anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
La Figura 20 muestra la actividad de proliferación de células T obtenidas de una persona saludable normal, el "donante C", en el ensayo para determinar la actividad de transducción de señales coestimuladoras por parte de diversos anticuerpos monoclonales anti-AILIM humana de ratón utilizando una microplaca revestida con anticuerpo monoclonal anti-CD3 humana junto con anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón.
El eje vertical indica la cantidad de incorporación celular de [3H]timidina como índice del grado de proliferación celular, y el eje horizontal indica la concentración de anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón.
En esta figura, "JHC1" indica el resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal anti-CETP humana como control negativo, en lugar del anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón.
La Figura 21 muestra la actividad de proliferación de células T obtenidas de una persona saludable normal, el "donante C", en el ensayo para determinar la actividad de transducción de señales coestimuladoras por parte de diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana utilizando una microplaca revestida con anticuerpo monoclonal anti-CD3 humana junto con anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
El eje vertical indica la cantidad de incorporación celular de [3H]timidina como índice del grado de proliferación celular, y el eje horizontal indica la concentración de anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
En esta figura, "anti-KLH" indica el resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal humano anti-KLH como control negativo, en lugar del anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Otras notaciones son las siguientes:
"124": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab124.
"126": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab126.
"127": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab127.
La Figura 22 muestra la actividad de proliferación de células T obtenidas de una persona saludable normal, el "donante C", en el ensayo para determinar la actividad de transducción de señales coestimuladoras por parte de diversos anticuerpos monoclonales anti-AILIM humana utilizando una microplaca revestida con anticuerpo monoclonal anti-CD3 humana junto con anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
El eje vertical indica la cantidad de incorporación celular de [3H]timidina como índice del grado de proliferación celular, y el eje horizontal indica la concentración de anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
En esta figura, "anti-KLH" indica el resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal humano anti-KLH como control negativo, en lugar del anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Otras notaciones son las siguientes:
"128": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab128.
"135": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab135.
"136": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab136.
La Figura 23 muestra la actividad de proliferación de células T obtenidas de una persona saludable normal, el "donante C", en el ensayo para determinar la actividad de transducción de señales coestimuladoras por parte de diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana utilizando una microplaca revestida con anticuerpo monoclonal anti-CD3 humana junto con anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
El eje vertical indica la cantidad de incorporación celular de [3H]timidina como índice del grado de proliferación celular, y el eje horizontal indica la concentración de anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
En esta figura, "anti-KLH" indica el resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal humano anti-KLH como control negativo, en lugar del anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Otras notaciones son las siguientes:
"137": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab137.
"138": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab138.
"139": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab139.
La Figura 24 muestra la actividad de proliferación de células T obtenidas de una persona saludable normal, el "donante C", en el ensayo para determinar la actividad de transducción de señales coestimuladoras por parte de diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana utilizando una microplaca revestida con anticuerpo monoclonal anti-CD3 humana junto con anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
El eje vertical indica la cantidad de incorporación celular de [3H]timidina como índice del grado de proliferación celular, y el eje horizontal indica la concentración de anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
En esta figura, "anti-KLH" indica el resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal humano anti-KLH como control negativo, en lugar del anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Otras notaciones son las siguientes:
"140": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab140.
"141": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab141.
La Figura 25 muestra la actividad de proliferación de células T obtenidas de una persona saludable normal, el "donante D", en el ensayo para determinar la actividad de transducción de señales coestimuladoras por parte de diversos anticuerpos monoclonales anti-AILIM humana de ratón utilizando una microplaca revestida con anticuerpo monoclonal anti-CD3 humana junto con anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón.
El eje vertical indica la cantidad de incorporación celular de [3H]timidina como índice del grado de proliferación celular, y el eje horizontal indica la concentración de anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón.
En esta figura, "JHC1" indica el resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal anti-CETP humana como control negativo, en lugar del anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón.
La Figura 26 muestra la actividad de proliferación de células T obtenidas de una persona saludable normal, el "donante D", en el ensayo para determinar la actividad de transducción de señales coestimuladoras por parte de diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana utilizando una microplaca revestida con anticuerpo monoclonal anti-CD3 humana junto con anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
El eje vertical indica la cantidad de incorporación celular de [3H]timidina como índice del grado de proliferación celular, y el eje horizontal indica la concentración de anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
En esta figura, "anti-KLH" indica el resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal humano anti-KLH como control negativo, en lugar del anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Otras notaciones son las siguientes:
"124": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab124.
"126 ": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab126. "127": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab127. La Figura 27 muestra la actividad de proliferación de células T obtenidas de
una persona saludable normal, el "donante D", en el ensayo para determinar la actividad de transducción de señales coestimuladoras por parte de diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana utilizando una microplaca revestida con anticuerpo monoclonal anti-CD3 humana junto con anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
El eje vertical indica la cantidad de incorporación celular de [3H]timidina como índice del grado de proliferación celular, y el eje horizontal indica la concentración de anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón.
En esta figura, "anti-KLH" indica el resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal humano anti-KLH como control negativo, en lugar del anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Otras notaciones son las siguientes: "128": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab128. "135": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab135. "136": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab136. La Figura 28 muestra la actividad de proliferación de células T obtenidas de
una persona saludable normal, el "donante D", en el ensayo para determinar la actividad de transducción de señales coestimuladoras por parte de diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana utilizando una microplaca revestida con anticuerpo monoclonal anti-CD3 humana junto con anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
El eje vertical indica la cantidad de incorporación celular de [3H]timidina como índice del grado de proliferación celular, y el eje horizontal indica la concentración de anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
En esta figura, "anti-KLH" indica el resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal humano anti-KLH como control negativo, en lugar del anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Otras notaciones son las siguientes:
"137":
anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab137.
"138":
anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab138.
"139":
anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab139.
La Figura 29 muestra la actividad de proliferación de células T obtenidas de
una persona saludable normal, el "donante D", en el ensayo para determinar la actividad de transducción de señales coestimuladoras por parte de diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana utilizando una microplaca revestida con anticuerpo monoclonal anti-CD3 humana junto con anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
El eje vertical indica la cantidad de incorporación celular de [3H]timidina como índice del grado de proliferación celular, y el eje horizontal indica la concentración de anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
En esta figura, "anti-KLH" indica el resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal humano anti-KLH como control negativo, en lugar del anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Otras notaciones son las siguientes:
"140": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab140.
"141": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab141.
La Figura 30 muestra la actividad de proliferación de células T obtenidas de una persona saludable normal, el "donante E", en el ensayo para determinar la actividad de transducción de señales coestimuladoras por parte de diversos anticuerpos monoclonales anti-AILIM humana de ratón utilizando una microplaca revestida con anticuerpo monoclonal anti-CD3 humana junto con anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón.
El eje vertical indica la cantidad de incorporación celular de [3H]timidina como índice del grado de proliferación celular, y el eje horizontal indica la concentración de anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón.
En esta figura, "JHC1" indica el resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal anti-CETP humana como control negativo, en lugar del anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón.
La Figura 31 muestra la actividad de proliferación de células T obtenidas de una persona saludable normal, el "donante E", en el ensayo para determinar la actividad de transducción de señales coestimuladoras por parte de diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana utilizando una microplaca revestida con anticuerpo monoclonal anti-CD3 humana junto con anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
El eje vertical indica la cantidad de incorporación celular de [3H]timidina como índice del grado de proliferación celular, y el eje horizontal indica la concentración de anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
En esta figura, "anti-KLH" indica el resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal humano anti-KLH como control negativo, en lugar del anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Otras notaciones son las siguientes:
"124": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab124.
"126": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab126.
"127": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab127.
La Figura 32 muestra la actividad de proliferación de células T obtenidas de una persona saludable normal, el "donante E", en el ensayo para determinar la actividad de transducción de señales coestimuladoras mediante diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana utilizando una microplaca revestida con anticuerpo monoclonal anti-CD3 humana junto con anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
El eje vertical indica la cantidad de incorporación celular de [3H]timidina como índice del grado de proliferación celular, y el eje horizontal indica la concentración de anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
En esta figura, "anti-KLH" indica el resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal humano anti-KLH como control negativo, en lugar del anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Otras notaciones son las siguientes:
"128": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab128.
"135": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab135.
"136": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab136.
La Figura 33 muestra la actividad de proliferación de células T obtenidas de una persona saludable normal, el "donante E", en el ensayo para determinar la actividad de transducción de señales coestimuladoras por parte de diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana utilizando una microplaca revestida con anticuerpo monoclonal anti-CD3 humana junto con anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
El eje vertical indica la cantidad de incorporación celular de [3H]timidina como índice del grado de proliferación celular, y el eje horizontal indica la concentración de anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
En esta figura, "anti-KLH" indica el resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal humano anti-KLH como control negativo, en lugar del anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Otras notaciones son las siguientes:
"137": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab137.
"138": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab138.
"139": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab139.
La Figura 34 muestra la actividad de proliferación de células T obtenidas de una persona saludable normal, el "donante E", en el ensayo para determinar la actividad de transducción de señales coestimuladoras por parte de diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana utilizando una microplaca revestida con anticuerpo monoclonal anti-CD3 humana junto con anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
El eje vertical indica la cantidad de incorporación celular de [3H]timidina como índice del grado de proliferación celular, y el eje horizontal indica la concentración de anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
En esta figura, "anti-KLH" indica el resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal humano anti-KLH como control negativo, en lugar del anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Otras notaciones son las siguientes:
"140": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab140.
"141": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab141.
La Figura 35 muestra la actividad de proliferación de células T obtenidas de una persona saludable normal, el "donante D", en el ensayo para determinar la actividad de diversos anticuerpos monoclonales anti-AILIM humana de ratón para transducir señales coestimuladoras, cuando se añadió una solución de anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón (en fase líquida) como único reactivo a una microplaca revestida con anticuerpo monoclonal anti-CD3 humana.
El eje vertical indica la cantidad de incorporación celular de [3H]timidina como índice del grado de proliferación celular, y el eje horizontal indica la concentración de anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón.
En esta figura, "JHC1" indica el resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal anti-CETP humana como control negativo, en lugar del anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón.
La Figura 36 muestra la actividad de proliferación de células T obtenidas de una persona saludable normal, el "donante D", en el ensayo para determinar la actividad de diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana para transducir señales coestimuladoras cuando se añadió una solución de anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana (en fase líquida) como único reactivo a una microplaca revestida con anticuerpo monoclonal anti-CD3 humana.
El eje vertical indica la cantidad de incorporación celular de [3H]timidina como índice del grado de proliferación celular, y el eje horizontal indica la concentración de anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
En esta figura, "anti-KLH" indica el resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal humano anti-KLH como control negativo, en lugar del anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Otras notaciones son las siguientes:
“124”: anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab124.
“125”: anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab125.
“126”: anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab126.
La Figura 37 muestra la actividad de proliferación de células T obtenidas de una persona saludable normal, el "donante D", en el ensayo para determinar la actividad de diversos anticuerpos monoclonales anti-AILIM humana para transducir señales coestimuladoras cuando se añadió una solución de anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana (en fase líquida) como único reactivo a una microplaca revestida con anticuerpo monoclonal anti-CD3 humana.
El eje vertical indica la cantidad de incorporación celular de [3H]timidina como índice del grado de proliferación celular, y el eje horizontal indica la concentración de anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
En esta figura, "anti-KLH" indica el resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal humano anti-KLH como control negativo, en lugar del anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Otras notaciones son las siguientes:
"128": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab128.
"135": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab135.
"136": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab136.
La Figura 38 muestra la actividad de proliferación de células T obtenidas de una persona saludable normal, el "donante D"; en el ensayo para determinar la actividad de diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana para transducir señales coestimuladoras cuando se añadió una solución de anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana (en fase líquida) como único reactivo a una microplaca revestida con anticuerpo monoclonal anti-CD3 humana.
El eje vertical indica la cantidad de incorporación celular de [3H]timidina como índice del grado de proliferación celular, y el eje horizontal indica la concentración de anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
En esta figura, "anti-KLH" indica el resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal humano anti-KLH como control negativo, en lugar del anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Otras notaciones son las siguientes:
“137”: anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab137.
“138”: anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab138.
“139”: anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab139.
La Figura 39 muestra la actividad de proliferación de células T obtenidas de una persona saludable normal, el "donante D", en el ensayo para determinar la actividad de diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana para transducir señales coestimuladoras cuando se añadió una solución de anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana (en fase líquida) como único reactivo a una microplaca revestida con anticuerpo monoclonal anti-CD3 humana.
El eje vertical indica la cantidad de incorporación celular de [3H]timidina como índice del grado de proliferación celular, y el eje horizontal indica la concentración de anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
En esta figura, "anti-KLH" indica el resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal humano anti-KLH como control negativo, en lugar del anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Otras notaciones son las siguientes:
“140”: anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab140.
“141”: anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab141.
La Figura 40 muestra la cantidad de IFN-� producido en el sobrenadante del cultivo de las células T obtenidas de una persona saludable normal, el "donante B", que se cultivaron en una microplaca revestida con anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón junto con anticuerpo monoclonal anti-CD3 humana.
El eje vertical indica la concentración de IFN-�, y el eje horizontal indica la concentración del anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón.
En esta figura, "JHC1" indica el resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal anti-CETP humana como control negativo, en lugar del anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón.
La Figura 41 muestra la cantidad de IFN-� producido en el sobrenadante del cultivo de células T obtenidas de una persona saludable normal, el "donante B”, que se cultivaron en una microplaca revestida con anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana junto con anticuerpo monoclonal anti-CD3 humana.
El eje vertical indica la concentración de IFN-�, y el eje horizontal indica la concentración del anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón.
En esta figura, "anti-KLH" indica el resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal humano anti-KLH como control negativo, en lugar del anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
La Figura 42 muestra la cantidad de IFN-� producido en el sobrenadante del cultivo de células T obtenidas de una persona saludable normal, el "donante B”, que se cultivaron en una microplaca revestida con anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana junto con anticuerpo monoclonal anti-CD3 humana.
El eje vertical indica la concentración de IFN-�, y el eje horizontal indica la concentración del anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón.
En esta figura, "anti-KLH" indica el resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal humano anti-KLH como control negativo, en lugar del anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
La Figura 43 muestra la cantidad de IFN-� producido en el sobrenadante del cultivo de células T obtenidas de una persona saludable normal, el "donante C”, que se cultivaron en una microplaca revestida con anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón junto con anticuerpo monoclonal anti-CD3 humana.
El eje vertical indica la concentración de IFN-�, y el eje horizontal indica la concentración del anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón.
En esta figura, “JHC1" indica el resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal anti-CETP humana como control negativo, en lugar del anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón.
La Figura 44 muestra la cantidad de IFN-� producido en el sobrenadante del cultivo de células T obtenidas de una persona saludable normal, el "donante C", que se cultivaron en una microplaca revestida con anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana junto con anticuerpo monoclonal anti-CD3 humana.
El eje vertical indica la concentración de IFN-�, y el eje horizontal indica la concentración del anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón.
En esta figura, "anti-KLH" indica el resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal humano anti-KLH como control negativo, en lugar del anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Otras notaciones son las siguientes: "124": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab124.
“125”: anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab125.
“126”: anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab126.
La Figura 45 muestra la cantidad de IFN-� producido en el sobrenadante del cultivo de células T obtenidas de una persona saludable normal, el "donante C", que se cultivaron en una microplaca revestida con anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana junto con anticuerpo monoclonal anti-CD3 humana.
El eje vertical indica la concentración de IFN-�, y el eje horizontal indica la concentración del anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón.
En esta figura, "anti-KLH" indica el resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal humano anti-KLH como control negativo, en lugar del anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Otras notaciones son las siguientes:
"128": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab128.
“135”: anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab135.
“136”: anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab136.
La Figura 46 muestra la cantidad de IFN-� producido en el sobrenadante del cultivo de células T obtenidas de una persona saludable normal, el "donante C", que se cultivaron en una microplaca revestida con anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana junto con anticuerpo monoclonal anti-CD3 humana.
El eje vertical indica la concentración de IFN-�, y el eje horizontal indica la concentración del anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón.
En esta figura, "anti-KLH" indica el resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal humano anti-KLH como control negativo, en lugar del anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Otras notaciones son las siguientes:
“137”: anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab137.
“138”: anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab138.
“139”: anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab139.
La Figura 47 muestra la cantidad de IFN-� producido en el sobrenadante del cultivo de células T obtenidas de una persona saludable normal, el "donante C", que se cultivaron en una microplaca revestida con anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana junto con anticuerpo monoclonal anti-CD3 humana.
El eje vertical indica la concentración de IFN-�, y el eje horizontal indica la concentración del anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón.
En esta figura, "anti-KLH" indica el resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal anti-KLH humana como control negativo, en lugar del anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
Otras notaciones son las siguientes:
“140”: anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab140.
“141”: anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab141.
La Figura 48 muestra el efecto inhibidor sobre la proliferación de células T en el caso de cultivar células T de una persona saludable normal, el "donante A", con PBMC de una persona saludable normal, el "donante D", mediante diversas muestras de ensayo en el ensayo de proliferación de las células T a través de las reacciones linfocitarias mixtas (MLR).
El eje vertical indica la cantidad de incorporación de [3H]timidina como índice que muestra un nivel de proliferación celular, y el eje horizontal muestra la concentración de las muestras de ensayo.
Cada descripción en las figuras muestra lo siguiente.
"CD80 + 86 ": La mezcla de anticuerpo anti-CD80 y anticuerpo anti-CD86
“mIgG1 ": Anticuerpo monoclonal anti-CD34/IgG1 humana de ratón
"CTLA4-Ig ": Molécula quimérica CTLA4-IgFc humana
"SA12": Anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón
La Figura 49 muestra el efecto inhibidor sobre la proliferación de células T en el caso de cultivar células T de una persona saludable normal, el "donante A", con PBMC de una persona saludable normal, el "donante D", mediante diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana en el ensayo de proliferación de las células T a través de las reacciones linfocitarias mixtas (MLR).
El eje vertical indica la cantidad de incorporación de [3H]timidina como índice que muestra un nivel de proliferación celular, y el eje horizontal muestra la concentración de las muestras de ensayo.
Otras notaciones son las siguientes:
"anti-KLH": anticuerpo monoclonal humano anti-KLH como control negativo.
"JMab-124 ": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab124.
“126”: anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab126.
“127”: anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab127.
“128”: anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab128.
"135": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab135.
"136": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab136.
"137": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab137.
La Figura 50 muestra el efecto inhibidor sobre la proliferación de células T en el caso de cultivar células T de una persona saludable normal, el "donante D", con PBMC de una persona saludable normal, el "donante B", mediante diversas muestras de ensayo en el ensayo de proliferación de las células T a través de las reacciones linfocitarias mixtas (MLR).
El eje vertical indica la cantidad de incorporación de [3H]timidina como índice que muestra un nivel de proliferación celular, y el eje horizontal muestra la concentración de las muestras de ensayo.
Cada descripción en las figuras muestra lo siguiente.
"CD80 + 86": La mezcla de anticuerpo anti-CD80 y anticuerpo anti-CD86
"mIgG1": Anticuerpo monoclonal anti-CD34/IgG1 humana de ratón
"CTLA4-Ig": Molécula quimérica CTLA4-IgFc humana
"SA12": Anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón
La Figura 51 muestra el efecto inhibidor sobre la proliferación de células T en el caso de cultivar células T de una persona saludable normal, el "donante D", con PBMC de una persona saludable normal, el "donante B", mediante diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana en el ensayo de proliferación de las células T a través de las reacciones linfocitarias mixtas (MLR).
El eje vertical indica la cantidad de incorporación de [3H]timidina como índice que muestra un nivel de proliferación celular, y el eje horizontal muestra la concentración de las muestras de ensayo.
Otras notaciones son las siguientes:
"anti-KLH": anticuerpo monoclonal humano anti-KLH como control negativo.
"JMab-124": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab124.
"126": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab226.
"127": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab127.
"128": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab128.
"135": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab135.
"136": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab136.
"137": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab137.
La Figura 52 muestra el efecto inhibidor sobre la proliferación de células T en el caso de cultivar células T de una persona saludable normal, el "donante C", con PBMC de una persona saludable normal, el "donante A", mediante diversas muestras de ensayo en el ensayo de proliferación de las células T a través de las reacciones
linfocitarias mixtas (MLR).
El eje vertical indica la cantidad de incorporación de [3H]timidina como índice que muestra un nivel de proliferación celular, y el eje horizontal muestra la concentración de las muestras de ensayo.
Cada descripción en las figuras muestra lo siguiente.
"CD80 + 86": La mezcla de anticuerpo anti-CD80 y anticuerpo anti-CD86
"mIgG1": Anticuerpo monoclonal anti-CD34/IgG1 humana de ratón
"CTLA4-Ig": Molécula quimérica CTLA4-IgFc humana
"SA12 ": Anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón
La Figura 53 muestra el efecto inhibidor sobre la proliferación de células T en el caso de cultivar células T de una persona saludable normal, el "donante C", con PBMC de una persona saludable normal, el "donante A", mediante diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana en el ensayo de proliferación de las células T a través de las reacciones linfocitarias mixtas (MLR).
El eje vertical indica la cantidad de incorporación de [3H]timidina como índice que muestra un nivel de proliferación celular, y el eje horizontal muestra la concentración de las muestras de ensayo.
Otras notaciones son las siguientes:
"anti-KLH": anticuerpo monoclonal humano anti-KLH como control negativo.
"JMab-124": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab124.
"126": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab126.
"127": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab127.
"128": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab128.
"135": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab135.
"136": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab136.
"137": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab137.
La Figura 54 muestra el efecto inhibidor sobre la proliferación de células T en el caso de cultivar células T de una persona saludable normal, el "donante E", con PBMC de una persona saludable normal, el "donante G", mediante diversas muestras de ensayo en el ensayo de proliferación de las células T a través de las reacciones linfocitarias mixtas (MLR).
El eje vertical indica la cantidad de incorporación de [3H]timidina como índice que muestra un nivel de proliferación celular, y el eje horizontal muestra la concentración de las muestras de ensayo.
Cada descripción en las figuras muestra lo siguiente.
" mlgG de control": Anticuerpo monoclonal anti-CD34/IgG1 humana de ratón "CD80 + 86 Ab": La mezcla de anticuerpo anti-CD80 y anticuerpo anti-CD86 "SA12": Anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón "CTLA4-Ig ": Molécula quimérica CTLA4-IgFc humana La Figura 55 muestra el efecto inhibidor sobre la proliferación de células T en el
caso de cultivar células T de una persona saludable normal, el "donante E", con PBMC de una persona saludable normal, el "donante G", mediante diversos anticuerpos monoclonales anti-AILIM humana en el ensayo de proliferación de las células T a través de las reacciones linfocitarias mixtas (MLR).
El eje vertical indica la cantidad de incorporación de [3H]timidina como índice que muestra un nivel de proliferación celular, y el eje horizontal muestra la concentración de las muestras de ensayo.
Otras notaciones son las siguientes: "anti-KLH": anticuerpo monoclonal humano anti-KLH como control negativo. "JMab-136": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab136. “138”: anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab138. “139”: anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab139. “140”: anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab140. “141”: anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab141. La Figura 56 muestra el efecto inhibidor sobre la proliferación de células T en el
caso de cultivar células T de una persona saludable normal, el "donante F", con PBMC de una persona saludable normal, el “donante E", mediante varias muestras de ensayo en el ensayo de proliferación de las células T a través de las reacciones linfocitarias mixtas (MLR).
El eje vertical indica la cantidad de incorporación de [3H]timidina como índice que muestra un nivel de proliferación celular, y el eje horizontal muestra la concentración de las muestras de ensayo.
Cada descripción en las figuras muestra lo siguiente. " mlgG de control": Anticuerpo monoclonal anti-CD34/IgG1 humana de ratón "CD80 + 86 Ab": La mezcla de anticuerpo anti-CD80 y anticuerpo anti-CD86 "SA12": Anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón "CTLA4-Ig”: Molécula quimérica CTLA4-IgFc humana La Figura 57 muestra el efecto inhibidor sobre la proliferación de células T en el
caso de cultivar células T de una persona saludable normal, el "donante F", con PBMC de una persona saludable normal, el "donante E", mediante diversas muestras de ensayo en el ensayo de proliferación de las células T a través de las reacciones linfocitarias mixtas (MLR).
El eje vertical indica la cantidad de incorporación de [3H]timidina como índice que muestra un nivel de proliferación celular, el eje horizontal muestra la concentración de las muestras de ensayo.
Cada descripción en las figuras muestra lo siguiente.
"anti-KLH": anticuerpo monoclonal humano anti-KLH como control negativo.
"JMab-136": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab136.
"138": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab138.
"139": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab139.
"140": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab140.
"141": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab141.
La Figura 58 muestra el efecto inhibidor sobre la proliferación de células T en el caso de cultivar células T de una persona saludable normal, el "donante G", con PBMC de una persona saludable normal, el "donante F", mediante diversas muestras de ensayo en el ensayo de proliferación de las células T a través de las reacciones linfocitarias mixtas (MLR).
El eje vertical indica la cantidad de incorporación de [3H]timidina como índice que muestra un nivel de proliferación celular, y el eje horizontal muestra la concentración de las muestras de ensayo.
Cada descripción en las figuras muestra lo siguiente.
"control mIgG": Anticuerpo monoclonal anti-CD34/IgG1 humana de ratón
"CD80 + 86 Ab": La mezcla de anticuerpo anti-CD80 y anticuerpo anti-CD86
"SA12": Anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón
"CTLA4-Ig": Molécula quimérica CTLA4-IgFc humana
La Figura 59 muestra el efecto inhibidor sobre la proliferación de células T en el caso de cultivar células T de una persona saludable normal, el "donante G", con PBMC de una persona saludable normal, el "donante F", mediante diversas muestras de ensayo en el ensayo de proliferación de las células T a través de las reacciones linfocitarias mixtas (MLR).
El eje vertical indica la cantidad de incorporación de [3H]timidina como índice que muestra un nivel de proliferación celular, y el eje horizontal muestra la concentración de las muestras de ensayo.
Cada descripción en las figuras muestra lo siguiente.
"anti-KLH ": anticuerpo monoclonal humano anti-KLH como control negativo.
"JMab-136": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab136 .
"138": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab138.
"139": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab139.
"140": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab140.
"141": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab141.
La Figura 60 muestra el efecto inhibidor de diversas sustancias de ensayo de control sobre la proliferación de células T en el ensayo que utiliza la reacción linfocitaria mixta (MLR). Se co-cultivaron células T de una persona saludable normal, el "donante A", con PBMCs de una persona saludable normal, el "donante D", precultivadas en presencia de la molécula quimérica CTLA4-Ig humana.
El eje vertical indica la cantidad de incorporación celular de [3H]timidina como índice del grado de proliferación celular, y el eje horizontal indica las concentraciones de las sustancias de ensayo.
Cada descripción en las figuras muestra lo siguiente.
"CD80 + 86": La mezcla de anticuerpo anti-CD80 y anticuerpo anti-CD86
"mIgG1 ": Anticuerpo monoclonal anti-CD34/IgG1 humana de ratón
"SA12 ": Anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón
La Figura 61 muestra el efecto inhibidor de diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana sobre la proliferación de células T en el ensayo que utiliza la reacción linfocitaria mixta (MLR). Se co-cultivaron células T de una persona saludable normal, el "donante A", con PBMCs de una persona saludable normal, el "donante D", precultivadas en presencia de la molécula quimérica CTLA4-lg humana.
El eje vertical indica la cantidad de incorporación celular de [3H]timidina como índice del grado de proliferación celular, y el eje horizontal indica las concentraciones de las sustancias de ensayo.
Otras notaciones son las siguientes:
"anti-KLH": anticuerpo monoclonal humano anti-KLH como control negativo.
"JMab-124": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JmMab124.
"126": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab126.
"127": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab127.
"128": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab128.
"135": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab135.
"136": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab136.
"137": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab137.
La Figura 62 muestra el efecto inhibidor de diversas sustancias de ensayo de control sobre la proliferación de células T en el ensayo que utiliza la reacción linfocitaria mixta (MLR). Se co-cultivaron células T de una persona saludable normal, el "donante D", con PBMCs de una persona saludable normal, el "donante B", precultivadas en presencia de la molécula quimérica CTLA4-Ig humana.
El eje vertical indica la cantidad de incorporación celular de [3H]timidina como índice del grado de proliferación celular, y el eje horizontal indica las concentraciones de las sustancias de ensayo.
Cada descripción en las figuras muestra lo siguiente.
"CD80 + 86”: La mezcla de anticuerpo anti-CD80 y anticuerpo anti-CD86
"mIgG1": Anticuerpo monoclonal anti-CD34/IgG1 humana de ratón
"SA12": Anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón
La Figura 63 muestra el efecto inhibidor de diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana sobre la proliferación de células T en el ensayo que utiliza la reacción linfocitaria mixta (MLR). Se co-cultivaron células T de una persona saludable normal, el "donante D”, con PBMCs de una persona saludable normal, el "donante B", precultivadas en presencia de la molécula quimérica CTLA4-Ig humana.
El eje vertical indica la cantidad de incorporación celular de [3H]timidina como índice del grado de proliferación celular, y el eje horizontal indica las concentraciones de las sustancias de ensayo.
Otras notaciones son las siguientes:
"anti-KLH": anticuerpo monoclonal humano anti-KLH como control negativo.
"JMab-124”: anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab124 .
"126": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab126.
"127": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab127.
"128": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab128.
"135": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab135.
"136": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab136.
"137": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab137.
La Figura 64 muestra el efecto inhibidor de diversas sustancias de ensayo de control sobre la proliferación de células T en el ensayo que utiliza la reacción linfocitaria mixta (MLR). Se co-cultivaron células T de una persona saludable normal, el "donante C", con PBMCs de una persona saludable normal, el "donante A", precultivadas en presencia de la molécula quimérica CTLA4-Ig humana.
El eje vertical indica la cantidad de incorporación celular de [3H]timidina como índice del grado de proliferación celular, y el eje horizontal indica las concentraciones
de las sustancias de ensayo.
Cada descripción en las figuras muestra lo siguiente. "CD80 + 86": La mezcla de anticuerpo anti-CD80 y anticuerpo anti-CD86 "mIgG1": Anticuerpo monoclonal anti-CD34/IgG1 humana de ratón "SA12": Anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón La Figura 65 muestra el efecto inhibidor de diversos anticuerpos monoclonales
humanos anti-AILIM humana sobre la proliferación de células T en el ensayo que utiliza la reacción linfocitaria mixta (MLR). Se co-cultivaron células T de una persona saludable normal, el "donante C", con PBMCs de una persona saludable normal, el "donante A", precultivadas en presencia de la molécula quimérica CTLA4-Ig humana.
El eje vertical indica la cantidad de incorporación celular de [3H]timidina como índice del grado de proliferación celular, y el eje horizontal indica las concentraciones de las sustancias de ensayo.
Otras notaciones son las siguientes: "anti-KLH ": anticuerpo monoclonal humano anti-KLH como control negativo. "JMab-124": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab124. "126": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab126. "127": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab127. "128": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab128. “135”: anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab135. “136”: anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab136. “137”: anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab137. La Figura 66 muestra el efecto inhibidor de diversas sustancias de ensayo de
control sobre la proliferación de células T en el ensayo que utiliza la reacción linfocitaria mixta (MLR). Se co-cultivaron células T de una persona saludable normal, el "donante E", con PBMCs de una persona saludable normal, el "donante G", precultivadas en presencia de la molécula quimérica CTLA4-lg humana.
El eje vertical indica la cantidad de incorporación celular de [3H]timidina como índice del grado de proliferación celular, y el eje horizontal indica las concentraciones de las sustancias de ensayo.
Cada descripción en las figuras muestra lo siguiente. " mIgG de control": Anticuerpo monoclonal anti-CD34/IgG1 humana de ratón "CD80 + 86 Ab": La mezcla de anticuerpo anti-CD80 y anticuerpo anti-CD86 "SA12": Anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón La Figura 67 muestra el efecto inhibidor de diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana sobre la proliferación de células T en el ensayo que utiliza la reacción linfocitaria mixta (MLR). Se co-cultivaron células T de una persona saludable normal, el "donante E", con PBMCs de una persona saludable normal, el "donante G", precultivadas en presencia de la molécula quimérica CTLA4-Ig humana.
El eje vertical indica la cantidad de incorporación celular de [3H]timidina como índice del grado de proliferación celular, y el eje horizontal indica las concentraciones de las sustancias de ensayo.
Otras notaciones son las siguientes:
"anti-KLH": anticuerpo monoclonal humano anti-KLH como control negativo.
"JMab-136": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab136.
"138": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab138.
"139": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab139.
"140": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab140.
"141": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab141.
La Figura 68 muestra el efecto inhibidor de diversas sustancias de ensayo de control sobre la proliferación de células T en el ensayo que utiliza la reacción linfocitaria mixta (MLR). Se co-cultivaron células T de una persona saludable normal, el "donante G", con PBMCs de una persona saludable normal, el "donante F", precultivadas en presencia de la molécula quimérica CTLA4-Ig humana.
El eje vertical indica la cantidad de incorporación celular de [3H]timidina como índice del grado de proliferación celular, y el eje horizontal indica las concentraciones de las sustancias de ensayo.
Cada descripción en las figuras muestra lo siguiente.
"mIgG de control": Anticuerpo monoclonal anti-CD34/IgG1 humana de ratón
"CD80 + 86 Ab": La mezcla de anticuerpo anti-CD80 y anticuerpo anti-CD86
"SA12": Anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón
La Figura 69 muestra el efecto inhibidor de diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana sobre la proliferación de células T en el ensayo que utiliza la reacción linfocitaria mixta (MLR). Se co-cultivaron células T de una persona saludable normal, el "donante .G", con PBMCs de una persona saludable normal, el "donante F", precultivadas en presencia de la molécula quimérica CTLA4-Ig humana.
El eje vertical indica la cantidad de incorporación celular de [3H]timidina como índice del grado de proliferación celular, y el eje horizontal indica las concentraciones de las sustancias de ensayo.
Otras notaciones son las siguientes:
"anti-KLH": anticuerpo monoclonal humano anti-KLH como control negativo.
"JMab-136": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab136.
"138": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab138.
"139": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab139.
"140": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab140.
"141": anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMab141.
La Figura 70 muestra actividad de inducción de ADCC de diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana y anticuerpos de control donde se utilizaron células CHO de tipo salvaje como células diana.
El eje vertical indica el índice de citotoxicidad causado por la actividad de inducción de ADCC del anticuerpo, y el eje horizontal indica la concentración del anticuerpo.
La Figura 71 muestra la actividad de inducción de ADCC de diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana y el anticuerpo de control donde se utilizaron células CHO recombinantes humanas que sobreexpresan AILIM como células diana.
El eje vertical indica la frecuencia de daño celular originado por la actividad de inducción de ADCC del anticuerpo, y el eje horizontal indica la concentración de anticuerpo.
La Figura 72 muestra el efecto inhibidor del anticuerpo anti-AILIM sobre la alergia retardada.
El eje vertical indica el tamaño del enrojecimiento medido como índice de la aparición de la alergia retardada, y el eje horizontal indica el tipo de muestra de ensayo administrada a los sujetos animales.
La Figura 73 muestra la actividad de proliferación de células T de mono en el ensayo para determinar la actividad de diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana para transducir señales coestimuladoras, utilizando una microplaca revestida con anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana junto con anticuerpo monoclonal anti-CD3 humana.
El eje vertical indica la cantidad de incorporación celular de [3H]timidina como índice del grado de proliferación celular, y el eje horizontal indica la concentración del anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
En esta figura, "anti-KLH" indica el resultado del ensayo en el que se utilizó anticuerpo monoclonal humano anti-KLH como control negativo, en lugar del anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana.
La Figura 74 muestra la actividad inhibidora del anticuerpo de control negativo contra la unión entre los ligandos solubles de AILIM (hB7h-IgFc) y AILIM soluble (AILIM-IgFc) de diversas concentraciones.
El eje vertical indica la absorbancia como índice para la actividad inhibidora, y el eje horizontal indica la concentración de AILIM soluble.
La Figura 75 muestra la actividad inhibidora del anticuerpo anti-AILIM contra la unión entre los ligandos solubles de AILIM (hB7h-IgFc) y AILIM soluble (AILIM-IgFc) de diversas concentraciones.
El eje vertical indica la absorbancia como índice para la actividad inhibidora, y el eje horizontal indica la concentración de AILIM soluble.
La Figura 76 muestra la actividad inhibidora del anticuerpo anti-AILIM en diversas concentraciones contra la unión entre ligandos solubles de AILIM (hB7h-IgFc) y AILIM soluble (AILIM-IgFc) .
El eje vertical indica la absorbancia como índice para la actividad inhibidora, y el eje horizontal indica la concentración de AILIM soluble.
La Figura 77 muestra la actividad inhibidora de diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana ante la proliferación de células T humanas en el ensayo para determinar la actividad de transducción de la señal coestimuladora utilizando una microplaca revestida con ligando soluble de AILIM humana (hB7h-IgFc) junto con anticuerpo monoclonal anti-CD3 humana.
El eje vertical indica la cantidad de incorporación celular de [3H]timidina como índice del grado de proliferación celular, y el eje horizontal indica la concentración del anticuerpo.
La Figura 78 muestra la actividad inhibidora de diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana ante la proliferación de células T de mono en el ensayo para determinar la actividad de la transducción de la señal coestimuladora utilizando una microplaca revestida con ligando soluble de AILIM humana (hB7h-IgFc) junto con anticuerpo monoclonal anti-CD3 humana.
El eje vertical indica la cantidad de incorporación celular de [3H]timidina como índice del grado de proliferación celular, y el eje horizontal indica la concentración del anticuerpo.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Las presentes invenciones se describen en detalle en la presente memoria más abajo definiendo las terminologías de la presente invención.
En la presente memoria, "mamífero" significa ser humano, animal bovino, cabra, conejo, ratón, rata, hámster, y cobayo; ser humano, conejo, rata, hámster, o ratón es preferido y particularmente preferido es ser humano, rata, hámster, o ratón.
El término "mamíferos distintos de seres humanos" y "mamíferos no humanos" utilizado en la presente memoria, son sinónimos uno con otro, queriendo decir todos los mamíferos distintos de seres humanos definidos más arriba.
El término "aminoácidos" utilizado en la presente memoria, significa todo aminoácido que existe en la naturaleza, preferiblemente aquellos descritos conforme al sistema de tres letras alfabéticas o sistema de letra única según se muestra más abajo:
glicina (Gly/G), alanina (Ala/A), valina (Val/V), leucina (Leu/L), isoleucina (Ile/I), serina (Ser/S), treonina (Thr/T), ácido aspártico (Asp/D), ácido glutámico (Glu/E), asparagina (Asn/N), glutamina (Gln/Q), lisina (Lis/K), arginina (Arg/R), cisteína (Cys/C), metionina (Met/M), fenilalanina (Phe/F), tirosina (Tyr/Y), triptofano (Trp/W), histidina (His/H), prolina (Pro/P).
El término "AILIM" utilizado en la presente memoria es la abreviatura para Molécula Inmunomoduladora de Linfocitos Inducible por activación, indicando una molécula de mamífero de la superficie celular que posee la estructura y función como ya se describió en un informe previo, más preferiblemente una AILIM obtenida de ser humano en particular (por ejemplo, International Immunology, Vol. 12, Núm. 1, páginas 51-55 ; Número de Acceso a GenBank: BAA82129 (ser humano), BAA82128 (rata), BAA82127 (variante de rata) y BAA82126 (ratón)).
Alternativamente, esta AILIM también se denomina ICOS (Solicitud de Patente Japonesa Publicada no Examinada (JP-A) Núm. Hei 11-29599, Solicitud de Patente Internacional Núm. W098/38216), y estas abreviaturas indican la misma molécula.
"Ligando de AILIM" utilizado en la presente memoria significa una molécula de la superficie celular que interactúa con dicha molécula coestimuladora AILIM (ICOS), y se denomina como B7h, B7RP-1, GL50 o LICOS (Nature, Vol. 402, No, 6763, páginas 827-832, 1999; Nature Medicine, Vol. 5, Núm. 12, páginas 1365-1369, 1999; J. Immunology, Vol. 164, páginas 1653-1657, 2000; Curr. Biol. Vol. 10, Núm. 6, páginas 333-336, 2000).
Además, "AILIM' utilizado en la presente memoria también incluye un polipéptido que posee sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que aquella de AILIM de cada ser humano descrita en las referencias, y particularmente preferiblemente, aquellas de AILIM humana. Además, una variante de AILIM humana que es similar a la variante de AILIM de rata ya informada (Número de Acceso a GenBank: BAA82127) también está incluida en "AILIM" de la presente invención.
"ligando de AILIM" utilizado en la presente memoria también se define para que posea un significado similar que el de más arriba.
En la presente memoria, "polipéptidos que poseen secuencia de aminoácidos esencialmente idéntica" significa polipéptidos variantes según lo descrito más abajo.
Es decir, siempre que estos polipéptidos variantes posean las propiedades biológicas esencialmente equivalentes a AILIM de tipo natural (particularmente preferiblemente la AILIM obtenida de ser humano), son polipéptidos de la presente invención. Como aquellos que poseen secuencia de aminoácidos de AILIM de tipo natural, en la que una pluralidad de restos de aminoácidos, preferiblemente 1 a 10 restos de aminoácidos, mucho más preferiblemente 1 a 5 restos de aminoácidos son eliminados y/o modificados, y a los que una pluralidad de restos de aminoácidos, preferiblemente 1 a 10 restos de aminoácidos, mucho más preferiblemente 1 a 5 restos de aminoácidos son añadidos.
Además, estos pueden ser polipéptidos variantes que poseen una pluralidad de esta sustitución, eliminación, modificación y adición de restos de aminoácidos en la molécula.
"ligando de AILIM" en la presente invención también se define para que posea un significado similar que más arriba.
AILIM (particularmente AILIM humana) y el ligando de AILIM (particularmente el ligando de AILIM humana) en la presente invención pueden prepararse, además de la técnica recombinante génica, apropiadamente utilizando métodos bien conocidos en este campo técnico tales como métodos de síntesis química, procedimiento de cultivo celular, etc. o estos métodos con modificaciones.
Dicha sustitución, eliminación, o inserción de aminoácidos puede lograrse conforme al método usual (Experimental Medicine: SUPPLEMENT, "Handbook of Genetic Engineering" (1992); etcétera).
Los ejemplos de métodos para producir polipéptidos mutantes según se menciona más arriba son mutagénesis dirigida al sitio de oligonucleótido sintético (método de dúplex con brechas), mutagénesis puntual por la que una mutación puntual es introducida en forma aleatoria mediante tratamiento con enzima Ba131 y similares, mutagénesis de casete, método de barrido de conector, método de falta de incorporación, método de cebadores de apareamiento incorrecto, método de síntesis de segmentos de ADN, etc.
La mutagénesis dirigida al sitio de oligonucleótido sintético (método de dúplex con brechas) puede, por ejemplo, realizarse de la siguiente manera. La región deseada para ser mutagenizada se clona en el vector fago M13 que posee mutación ámbar para preparar el ADN del fago de hebra simple. Después el ADN RF I del vector M13 sin mutación ámbar se lineariza mediante tratamiento de enzimas de restricción, el ADN se mezcla con el ADN del fago de hebra simple mencionado más arriba, desnaturalizado, y se alinea de ese modo formando "ADN dúplex con brechas." Un oligonucleótido sintético oligonucleótido en el que se introducen mutaciones se hibridiza con el ADN dúplex con brechas y los ADNs de doble hebra circulares cerrados se prepararan mediante las reacciones con ADN polimerasa y ADN ligasa. Las células E. coli mutS, deficientes en la actividad de reparación de desfase, son transferidas con este ADN. Las células de E. coli. sin actividad supresora son infectadas con los fagos crecidos, y solamente se detectan los fagos sin mutación ámbar.
El método por el que una mutación puntual es introducida con nitrito utiliza, por ejemplo el principio según lo que se menciona más abajo. Si el ADN se trata con nitrito, se determina que las bases cambian la adenina en hipoxantina, citosina en uracilo, y guanina en xantina. Si el ADN desaminado se introduce en células, "A:T" y "G:C" son reemplazados con "G:C" y "A:T", respectivamente, debido a que la hipoxantina, uracilo, y xantina forman un par base con citosina, adenina, y timina, respectivamente, en la replicación de ADN. Realmente, los fragmentos de ADN de hebra simple tratados con nitrito se hibridizan con "ADN dúplex con brechas", y de ahí en adelante las cepas mutantes son separadas manipulando de la misma manera que la mutagénesis dirigida al sitio de oligonucleótido sintético (método de dúplex con brechas).
Además, "AILIM" en la presente memoria también incluye "una porción" de dicha AILIM. En la presente memoria, “una porción" significa un polipéptido que comprende cualquier secuencia parcial de las secuencia de aminoácidos AILIM definida más arriba.
Preferiblemente, dicha porción indica la región extracelular de AILIM definida más arriba (particularmente preferiblemente una AILIM humana) o cualquier porción de la misma.
El "ligando de AILIM" en la presente invención también está definido para tener un significado similar al anterior.
La "porción" de dicha AILIM (preferiblemente la región extracelular de AILIM o cualquier porción de la misma) puede prepararse en conformidad con métodos bien conocidos en este campo técnico según lo descrito más abajo o en conformidad con sus métodos modificados por técnica de recombinación genética o métodos de síntesis química, o escindiendo apropiadamente AILIM (particularmente preferiblemente una AILIM humana) aislada por el método de cultivo celular que utiliza enzimas proteolíticas, etc.
"Porción de ligando de AILIM" también puede prepararse mediante métodos similares según lo descrito más arriba.
"Anticuerpo humano" de la presente invención es un anticuerpo humano que se une a AILIM definida más arriba o una porción de la misma (particularmente preferiblemente una AILIM obtenida de ser humano o una porción de la misma). Específicamente, esto significa un anticuerpo policlonal obtenido de ser humano (anticuerpo policlonal humano, antisuero humano) o anticuerpo policlonal obtenido de ser humano (anticuerpo monoclonal humano).
El "anticuerpo monoclonal humano" de la presente invención es un anticuerpo monoclonal humano que se une a AILIM definida más arriba o una porción de la misma (particularmente preferiblemente una AILIM obtenida de ser humano o una porción de la misma).
Más específicamente, todas las regiones que comprenden las regiones variables y constantes de cadena pesada (H-cadena), y las regiones variables y constantes de cadena liviana (L-cadena) consisten en inmunoglobulina humana obtenida del gen que codifica dicha inmunoglobulina humana. La L-cadena está ejemplificada por la cadena x humana o cadena � humana.
El anticuerpo monoclonal humano que se une a AILIM (particularmente preferiblemente una AILIM obtenida de ser humano) de la presente invención o una porción de la misma es un anticuerpo monoclonal humano que posee característica definida en cualquiera de los puntos (1) a (6) o (25).
Más específicamente, este incluye diversos anticuerpos monoclonales humanos que posee diversas características y aplicabilidad industrial, según lo descrito en los ejemplos y dibujos más abajo.
Una realización preferida de anticuerpo monoclonal humano de la presente invención es un anticuerpo monoclonal humano que se une a AILIM o una porción del mismo definida en cualquiera de los puntos arriba mencionados (1) a (6) o (25).
La realización mucho más preferida es un anticuerpo monoclonal humano que se une a AILIM humana según lo que se describe en (1) o (6).
El "anticuerpo monoclonal humano" de la presente invención puede prepararse inmunizando los siguientes mamíferos transgénicos no humanos que producen anticuerpo humano con cualquiera de los inmunógenos (antígenos) descritos más abajo.
(a)
una célula natural o línea celular artificialmente establecida que expresa AILIM antes mencionada (particularmente preferiblemente una AILIM obtenida de ser humano) cobre la superficie celular.
(b)
una célula recombinante genética preparada que utiliza técnicas de recombinación genética para expresar AILIM definida más arriba (particularmente preferiblemente una AILIM obtenida de ser humano) sobre la superficie celular;
(e) un lisado celular obtenido solubilizando las células antes mencionadas en
(a)
o (b), o un fragmento de polipéptido de AILIM (particularmente preferiblemente una AILIM obtenida de ser humano) purificado a partir de dicho lisado celular;
(d)
una célula recombinante genética preparada utilizando técnicas de recombinación genética para expresar una porción (particularmente preferiblemente la región extracelular o cualquier realización preferido del mismo) de AILIM definida más arriba (particularmente preferiblemente una AILIM obtenida de ser humano) como un polipéptido soluble;
(e)
un sobrenadante de cultivo obtenido cultivando la célula recombinante genética antes mencionada en (d) o un polipéptido de región extracelular (.AILIM soluble) de AILIM (particularmente preferiblemente una AILIM obtenida de ser humano) purificado a partir de dicho sobrenadante de cultivo; o
(f)
una porción (particularmente preferiblemente la región extracelular o cualquier realización preferido de la misma) de AILIM químicamente sintetizada (particularmente preferiblemente una AILIM obtenida de ser humano).
Además, el anticuerpo monoclonal de la presente invención también puede obtenerse del sobrenadante de cultivo cultivando un "huésped recombinante genético" [en la presente memoria, dicho huésped es una célula eucariótica distinta de huevos fertilizados (preferiblemente células de mamíferos tales como CHO, linfocitos, y células de mieloma)], que puede prepararse transformando un huésped con ADNcs (preferiblemente un vector que contiene dichos ADNcs) que codifican cada una de las cadenas pesadas y livianas de dicho anticuerpo monoclonal humano de la presente invención que utiliza técnicas de recombinación genética, y que produce anticuerpo monoclonal humano recombinante genético.
Específicamente, el anticuerpo monoclonal de la presente invención puede obtenerse cultivando el huésped recombinante genético descrito en cualquiera de los puntos antes mencionados (22) a (24) de la presente invención (en la presente memoria, dicho huésped es una célula eucariótica distinta de un huevo fertilizado (preferiblemente células de mamífero tales como CHO, linfocitos, y células de mieloma)).
Además, el anticuerpo monoclonal humano de la presente invención puede ser un anticuerpo monoclonal humano que posee cualquier isotipo perteneciente a IgG (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), IgH, IgA (IgA1 e IgA2), IgD o IgE.
Preferiblemente, dicho anticuerpo monoclonal pertenece a IgG (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), más preferiblemente IgG1, IgG2 o IgG4.
El anticuerpo monoclonal humano de la presente invención puede prepararse inmunizando mamífero transgénico no humano que produce anticuerpo humano tal como ratón transgénico productor de anticuerpos humanos descrito más abajo con cualquiera de los inmunógenos (antígenos) antes mencionados en el punto (a) a (f) en conformidad con el método de fabricación conocido comúnmente utilizado .
Es decir, por ejemplo, dicho mamífero transgénico no humano que produce anticuerpo humano es inmunizado con dicho antígeno en combinación con el adyuvante de Freund según lo que el caso demande. El anticuerpo policlonal puede obtenerse desuero recolectado de dicho animal inmunizado. El anticuerpo monoclonal puede fabricarse preparando células de fusión (hibridomas) de dichas células productoras de anticuerpos aisladas de dicho animal inmunizado y células de mieloma con ninguna capacidad productora de autoanticuerpo, y clonando dichas hibridomas para seleccionar un clon que produce el anticuerpo monoclonal con una afinidad específica del antígeno utilizado para inmunizar el mamífero.
Más específicamente, el anticuerpo monoclonal puede prepararse según lo descrito más abajo. Es decir, dicho mamífero transgénico no humano productor de anticuerpos humanos (particularmente preferiblemente "ratón transgénico productor de anticuerpos humanos") es inmunizado inyectando cualquiera de los inmunógenos antes mencionados en los puntos (a) a (c) por vía intradérmica, por vía intramuscular, por vía intravenosa, en el almohadilla del pie, o por vía intraperitoneal una vez a varias veces, o transplantando dicho inmunógeno a dicho mamífero. Usualmente, las inmunizaciones se realizan una vez a cuatro veces cada uno a catorce días después de la inmunización. Las células productoras de anticuerpos se obtienen del mamífero así inmunizado en aproximadamente uno a cinco días después de la última inmunización. La frecuencia e intervalo de inmunizaciones puede disponerse adecuadamente dependiendo de, por ejemplo, la propiedad del inmunógeno utilizado.
Las hibridomas que segregan un anticuerpo monoclonal humano pueden prepararse mediante el método de Kohler y Milstein (Nature, Vol. 256, páginas 495497 (1975)) y mediante su método modificado. A saber, las hibridomas se preparan utilizando células productoras de anticuerpos contenidas en un bazo, ganglio linfático, médula ósea, o amígdala obtenidas de un mamífero transgénico no humano productor de anticuerpos humanos inmunizado según lo que se menciona más arriba, preferiblemente un bazo, con mielomas sin capacidad productora de antoanticuerpos, que se obtienen de, preferiblemente, un mamífero tal como un ratón, rata, cobayo, hámster, conejo, o ser humano, o más preferiblemente, un ratón, rata, o ser humano.
Por ejemplo, puede utilizarse mieloma obtenido de ratón P3/X63-AG8.653 (ATCC Núm. CRL-1580), P3/NSI/1-Ag4-1 (NS-3.), P3/X63-Ag8.Ul (P3U1), SP2/0-Ag14 (Sp2/0, Sp2), NSO, PAI, FO, o BW5147, mieloma obtenido de rata 210RCY3-Ag. 2.3,
o mieloma obtenido de ser humano U-266AR1, GM1500-6TG-A1-2, UC729-6, CEMAGR, D1R11, o CEM-T15 como mieloma utilizado para la fusión celular.
Las células que producen anticuerpos monoclonales (por ejemplo, hibridomas) pueden detectarse cultivando las células, por ejemplo, en placas de microtítulación y midiendo la reactividad del sobrenadante de cultivo en el pozo en el que se observa crecimiento de hibridoma, ante el inmunógeno utilizado para la inmunización mencionada más arriba, por ejemplo, mediante inmunoensayo de enzimas tal como radioinmunoensayo (RIA) y ensayo de inmunodisolvente ligado a enzimas (ELISA) .
Los anticuerpos monoclonales pueden producirse a partir de hibridomas cultivando las hibridomas in vitro o in vivo tal como en el fluido de ascitis de un ratón, rata, cobayo, hámster, o conejo, preferiblemente un ratón o rata, más preferiblemente ratón y aislando los anticuerpos del resultante del sobrenadante de cultivo o fluido de ascitis de un mamífero.
Los anticuerpos monoclonales de la presente invención pueden fabricarse a gran escala mediante el siguiente método:
(1)
los genes (ADNcs, etc.) que codifican cada una de las cadenas pesada y liviana de dicho anticuerpo monoclonal se clonan a partir de dichas hibridomas;
(2)
los genes clonados que codifican cada una de las cadenas pesada y liviana se insertan en vectores separados o un único vector para preparar el vector de expresión;
(3)
dicho vector de expresión se transfiere a un huevo fertilizado de un mamífero no humano deseado (tal como cabra);
(4)
dicho huevo fertilizado transferido con el gen es transplantado al útero de una madre de acogida para obtener un animal quimérico no humano;
(5)
apareando además dicha cabra quimérica con otro mamífero no humano, se produce un mamífero transgénico no humano (res, cabra, oveja o cerdo) con genes que codifican cada una de dichas cadenas pesada y liviana incorporadas al gen endógeno; y
(6)
de la leche de dicho mamífero transgénico no humano, se obtiene el anticuerpo monoclonal obtenido de dicho gen de anticuerpo monoclonal humano a gran escala (Nikkei Science, abril, 1997, páginas 78-84) .
El cultivo in vitro de las células que producen los anticuerpos monoclonales puede realizarse dependiendo de, por ejemplo, la propiedad de las células a ser cultivadas, el objeto de un estudio de ensayo, y las diversas condiciones de un método de cultivo, utilizando medios nutrientes conocidos o cualquier medio nutriente obtenido de medios basales conocidos para cultivar, mantener, y almacenar las hibridomas para producir anticuerpos monoclonales en sobrenadante de cultivo.
Los ejemplos de medios basales son medios de baja concentración de calcio tales como medio Ham' F12, medio MCDB153, o medio MEM de baja concentración de calcio, y medios de alta concentración de calcio tales como medio MCDB104, medio MEM, medio D-MEM, medio RPMI1640, medio ASF104, o medio RD. Los medios basales pueden contener, por ejemplo, suero, hormonas, citoquinas, y/o diversas sustancias inorgánicas u orgánicas dependiendo del objetivo.
Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse y purificarse desde el sobrenadante de cultivo o fluido de ascitis mencionado más arriba mediante la precipitación de sulfato de amonio saturado, método de precipitación de euglobulina, método de ácido caproico, método de ácido caprílico, cromatografía de intercambio iónico (DEAD o DE52), cromatografía por afinidad que utiliza columna de antiinmunoglobulina o columna de proteína A.
El anticuerpo monoclonal humano de la presente invención incluye anticuerpos monoclonales humanos que consisten en cadena pesada y/o cadena liviana en las que la secuencia de aminoácidos para cada cadena poseen uno o más restos de aminoácidos eliminados, sustituidos o añadidos.
En la presente memoria, "más restos de aminoácidos" significa una pluralidad de aminoácidos, específicamente 1 a 10 restos de aminoácidos, preferiblemente 1 a 5 restos de aminoácidos.
Puede introducirse una modificación parcial (eliminación, sustitución, inserción o adición) según lo descrito más arriba en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo monoclonal humano de la presente invención mediante alteración parcial de la secuencia base que codifica dicha secuencia de aminoácidos. Esta alteración parcial de la secuencia base puede introducirse mediante un método estándar que utiliza una técnica conocida de mutagénesis específica del sitio (Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU, Vol. 81, páginas 5662-5666, 1984).
El "mamífero no humano transgénico productor de anticuerpo humanos", particularmente el ratón transgénico productor de anticuerpos humanos que es una realización preferida, puede prepararse en conformidad con la literatura publicada (Nature Genetics, Vol. 7, páginas 13-21, 1994; Nature Genetics, Vol. 15, páginas 146156, 1997; Traducción Japonesa Publicada de la Publicación Internacional Núm. Hei 4-504365; Traducción Japonesa Publicada de la Publicación Núm. Hei 7-509137; Nikkei Science, junio, páginas 40-50, 1995; Publicación Internacional de Patente Núm. W094/25585; Nature, Vol . 368, páginas 856--859, 1994; y Traducción Japonesa Publicada de la Publicación Núm. Hei 6-500233, etc.)
Específicamente, dichos ratones transgénicos productores de anticuerpos humanos pueden prepararse, por ejemplo, utilizando técnicas que consisten en los siguientes procesos:
(1)
preparar un ratón knockout en el que el gen de cadena pesada de inmunoglobulina endógena es funcionalmente inactivado sustituyendo al menos una porción del locus del gen de la cadena pesada de inmunoglobulina endógena de ratón con un gen marcador de tolerancia al fármaco (tales como gen de tolerancia a la neomicina) por recombinación homóloga;
(2)
preparar un ratón knockout en el que el gen de cadena liviana de inmunoglobulina endógena (particularmente el gen de cadena x) es funcionalmente inactivado sustituyendo al menos una porción del locus del gen de la cadena liviana de inmunoglobulina endógena de ratón con un gen marcador de tolerancia al fármaco (tal como gen de tolerancia a la neomicina) por recombinación homóloga;
(3)
preparar un ratón transgénico en el que la región deseada del locus del gen de cadena pesada de inmunoglobulina humana se incorpora al cromosoma del ratón utilizando un vector representado por el cromosoma artificial de levadura (YAC) capaz de transportar un gen gigante;
(4)
preparar un ratón transgénico en el que la región deseada del locus del gen de cadena liviana de inmunoglobulina humana (particularmente el gen de cadena x) se incorpora al cromosoma del ratón utilizando un vector representado por
el cromosoma artificial de levadura (YAC) capaz de transportar un gen gigante; y
(5)
preparar ratón transgénico en el que los locus del gen de cadenas pesada y liviana de inmunoglobulina endógena se inactivan funcionalmente y en los que el cromosoma se incorpora con las regiones deseadas de ambos locus de gen de cadenas pesada y liviana de inmunoglobulina humana apareando los ratones knockout y transgénicos antes mencionados en el punto (1) a (4) en órdenes arbitrarios.
El ratón knockout descrito más arriba puede prepararse sustituyendo la región apropiada del locus del gen de inmunoglobulina endógena de ratón con un gen marcador extraño (tal como gen de tolerancia a la neomicina) en base a la recombinación homóloga para inactivar dicho locus del gen para que no sea realineado. Para la inactivación que utiliza dicha recombinación homóloga, por ejemplo, puede utilizarse un método denominado selección negativa positiva (PNS) (Nikkei Science, mayo, páginas 52-62, 1994) .
La inactivación funcional del locus del gen de cadena pesada de inmunoglobulina puede lograrse, por ejemplo, introduciendo una lesión en una parte de la región J o C (por ejemplo, región C�). Y la inactivación funcional de la cadena liviana de inmunoglobulina (por ejemplo, cadena x) puede lograrse, por ejemplo, introduciendo una lesión en una parte de la región J o C, o una región que se extiende sobre regiones J y C.
Un ratón transgénico puede prepararse en conformidad con el método según lo que se utiliza usualmente para producir un animal transgénico (por ejemplo , véase "Newest Manual of Animal Cell Experiment", LIC press, Capítulo 7, páginas 361-408, (1990)). Específicamente, por ejemplo, la célula ES (célula madre embrionaria) HPRT-negativa (gen deficiente de hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa) obtenida de un blastocisto de ratón normal se fusiona con levadura que contiene el vector YAC insertado con el gen que codifica dicho locus del gen de cadena pesada o locus del gen de cadena liviana de inmunoglobulina humana o una porción de la misma y el gen HPRT que utiliza método de fusión de esferoplastos. Las células ES en las que el gen endógeno de ratón está integrado con dicho gen extraño se seleccionan mediante el método de selección HAT. Después, las células ES detectadas se microinyectan en un huevo fertilizado obtenido de otro ratón normal (blastocisto) (Proc. Natl., Acad. Sci. USA, Vol.77, Núm. 12, páginas 7380-7384 (1980); Patente Estadounidense Núm. 4,873,191). El blastocisto es transplantado al útero de otro ratón normal como madre de acogida. Después, los ratones quiméricos transgénicos nacen del ratón madre de acogida. Al parear los ratones quiméricos transgénicos con ratones normales, se obtienen ratones transgénicos heterogénicos. Al aparear los ratones transgénicos heterogénicos uno con otro, se obtienen los ratones transgénicos homogénicos conforme a las leyes de Mendel.
La "porción de un anticuerpo monoclonal" utilizada en la presente invención significa una región parcial del anticuerpo monoclonal humano arriba mencionado de la presente invención, y específicamente, incluye F(ab')2, Fab', Fab, Fv (fragmento variable de anticuerpo), sFv, dsFv (Fv estabilizado con disulfuro), o dAb (anticuerpo de dominio único ) (Exp. Opin. Ther. Patents, Vol. 6, Núm.5, páginas 441-456 (1996)).
"F(ab')2 ” y "Fab" pueden producirse tratando la inmunoglobulina (anticuerpo monoclonal) con una proteasa tal como pepsina y papaina, y significa un fragmento de anticuerpo generado digiriendo la inmunoglobulina cerca de los enlaces de disulfuro en las regiones bisagra existentes entre cada una de las dos cadenas H. Por ejemplo, la papaina escinde IgG en dirección 5’ de los enlaces de disulfuro en las regiones bisagra que existen entre las dos cadenas H para generar dos fragmentos de anticuerpo homólogos en los que se conectan una cadena L compuesta de VL (región variable de cadena L) y CL (región constante de cadena L), y un fragmento de cadena H cadena compuesto de VH (región variable de cadena H) y CH�1 (región �1 en la región constante de cadena H) en sus regiones terminales C a través de un enlace de disulfuro. Cada uno de dichos dos fragmentos de anticuerpo homólogos se denomina Fab'. La pepsina también escinde IgG en dirección 3’ de los enlaces de disulfuro en las regiones bisagra que existen entre cada una de las dos cadenas H para generar un fragmento de anticuerpo levemente más largo que el fragmento en el que las dos Fab' arriba mencionadas se conectan en la región bisagra. Este fragmento de anticuerpo se denomina F(ab')2.
"Constante de velocidad de unión (ka)" en la presente memoria significa un valor que indica la fuerza de unión (grado) de dicho anticuerpo monoclonal al antígeno diana calculada en base a la cinética de reacción del anticuerpo. "Constante de velocidad de disociación (kd)" significa un valor que indica la fuerza de disociación (grado) de dicho anticuerpo monoclonal del antígeno diana. "Constante de disociación (Kd)" es un valor obtenido dividiendo dicha "constante de velocidad de disociación (kd) " por dicho valor de "constante de velocidad de unión (ka)". Estas constante se utilizan para representar la afinidad de dicho anticuerpo monoclonal con el antígeno y su actividad para neutralizar el antígeno.
Dichas constantes pueden analizarse en conformidad con diversos métodos, y pueden analizarse fácilmente utilizando un kit de ensayo comercial BiacoreX .(Amersham Pharmacia) o un kit. Similar en conformidad con el manual y método experimental anexado a dicho kit. Los valores ka, kd y Kd obtenidos utilizando dicho kit se expresan en unidades de 1/M.Segundo, 1/Segundo y M (mol), respectivamente. Los valores ka más altos indican una actividad de unió al antígeno más fuerte del anticuerpo monoclonal ensayado, y los valores Kd más pequeños muestran una actividad neutralizadora del antígeno más fuerte e del anticuerpo.
El anticuerpo monoclonal humano de la presente invención incluye aquellos que poseen el valor ka, kd o Kd tal como se muestra en los siguientes puntos (1) a (3):
(1)
anticuerpo monoclonal humano que se une a AILIM humana o una porción de la misma con la constante de velocidad de unión (ka) de 1,0 x 104 (1/M.Segundo) o más, preferiblemente 1.0 x 105 (1/M.Segundo) o más.
(2)
anticuerpo monoclonal humano que se une a AILIM humana o una porción de la misma con la constante de velocidad de disociación (kd) de 1,0 x 10-4 (1/Segundo) o menos, preferiblemente 1,0 x 10-5 (1/Segundo) o menos.
(3)
anticuerpo monoclonal humano que posee una reactividad a AILIM humana o una porción de la misma con la constante de disociación (Kd) de 1,0 x 10-7
(M)
o menos , preferiblemente 1,0 x 10-8 (M) o menos y más preferiblemente 1,0 x 10-9
(M)
o menos.
En este caso, cada valor de ka, kd y Kd descrito más arriba se espera que fluctúe levemente dependiendo de diversas condiciones al momento de la medición con un margen de error pero prácticamente con ninguna fluctuación en los índices en general.
La "células productora de anticuerpos monoclonales" o "huésped recombinante genético" productor del anticuerpo monoclonal humano recombinante genético de la presente invención (en la presente memoria, dicho huésped es una célula que excluye el huevo fertilizado) significa cualquier células que produce el anticuerpo monoclonal humano antes mencionado de la presente invención.
Específicamente, por ejemplo, esto incluye células descritas en cualquiera de los siguientes puntos (1) a (3), pero sin limitarse a ellos:
(1)
células B productora del anticuerpo monoclonal humano obtenida inmunizando el mamífero transgénico no humano productor de anticuerpos humanos antes mencionado con el inmunógeno (antígeno) definido más arriba y recolectando la células de dicho animal inmunizado.
(2)
Célula de fusión antes mencionadas (hibridoma) resultantes por fusión de la célula B productora del anticuerpo monoclonal humano de ese modo
obtenida con una célula de mieloma obtenida de un mamífero.
(3)
célula recombinante genética productora de anticuerpo monoclonal humano recombinante genético obtenida transformando una célula que excluye dicha célula B e hibridoma (por ejemplo, célula CHO (ovárica de hámster chino), célula BHK (riñón de hámster bebé), linfocito tal como mieloma) con el gen que codifica dicho anticuerpo monoclonal humano (gen que codifica la cadena pesada o que codifica la cadena liviana, o ambos genes) aislados de dicha célula B productora del anticuerpo monoclonal humano o célula de fusión productora del anticuerpo monoclonal humano (hibridoma).
En la presente memoria, la célula recombinante genética productora del anticuerpo monoclonal humano recombinante genético mencionadas más arriba en el punto (3) a saber significa una célula recombinante genética que produce el recombinante genético del anticuerpo monoclonal humano generado por la célula B descrita más arriba en el punto (1) o la hibridoma antes mencionada en el punto (2) .
Y, "huésped" en "huésped recombinante genético" de la presente invención incluye, además de diversas células de mamífero según lo descrito más arriba, huevos fertilizados de cualquier mamífero no humano (cabra, cerdo, oveja, res, etc.). Transfiriendo un gen (gen que codifica la cadena pesada o que codifica la cadena liviana, o ambos genes) que codifica cualquier anticuerpo monoclonal (preferiblemente anticuerpo monoclonal humano) contra AILIM humana de la presente invención en este huevo fertilizado, puede obtenerse un huevo fertilizado recombinante genético de la presente invención. Este huevo fertilizado recombinante genético se utiliza para preparar animales transgénicos para fabricar la proteína de leche antes mencionada a gran escala (Nikkei Science, abril, 1997, páginas 78-84).
"Una sustancia" que compone la presente invención, específicamente "una sustancia que posee una actividad moduladora de la transducción de señales mediadas por AILIM", y más específicamente "una sustancia que posee una actividad inhibidora de la proliferación de células que expresan AILIM, o inhibidora de la producción de una citoquina mediante células que expresan AILIM" significa una sustancia natural presente en la naturaleza, o una sustancia arbitraria preparada artificialmente.
"Sustancia" relacionada con "sustancia que se une a AILIM" y "sustancia que se une al ligando de AILIM" en la presente memoria también significa cualquier sustancia natural en la naturaleza o cualquier sustancia preparada artificialmente.
Aquí, "la transducción de señales mediada por AILIM" significa la transducción de señales a través de AILIM, que lleva a un cambio de un fenotipo arbitrario en las células que expresan AILIM (proliferación celular, activación de células, inactivación de apóptosis, y/o un cambio de una capacidad para producir una citoquina arbitraria de células que expresan AILIM) .
"La sustancia" puede clasificarse principalmente en "una sustancia proteica" y "una sustancia no proteica".
Los ejemplos de "sustancias proteicas" son los siguientes polipéptido, anticuerpo (un anticuerpo policlonal un anticuerpo monoclonal, o una porción de un anticuerpo monoclonal, y particularmente preferiblemente del anticuerpo humano mencionado más arriba).
Cuando la sustancia es un anticuerpo, la sustancia es preferiblemente u anticuerpo monoclonal. Cuando la sustancia es un anticuerpo monoclonal, la sustancia incluye no sólo un anticuerpo monoclonal obtenido de mamífero no humano, sino también un anticuerpo monoclonal recombinante genético, un anticuerpo monoclonal recombinante humanizado y anticuerpo monoclonal humano.
Aquí, el "anticuerpo monoclonal recombinante genético" es un anticuerpo monoclonal preparado mediante ingeniería genética, y específicamente significa un anticuerpo quimérico tal como anticuerpo monoclonal quimérico humano/ de ratón en el que las regiones variables se obtienen de inmunoglobulina de un mamífero no humano (ratón, rata, hámster, etc.) y en el que las regiones constantes se obtienen de inmunoglobulina humana.
El "anticuerpo monoclonal humanizado (anticuerpo injertado con CDR)" de la presente invención es un anticuerpo monoclonal preparado mediante ingeniería genética y específicamente significa un anticuerpo monoclonal humanizado en el que un a porción o la totalidad de las regiones determinantes de complementariedad de la región hipervariable se obtienen de las regiones determinantes de complementariedad de la región hipervariable de un anticuerpo monoclonal de un mamífero no humano (ratón, rata, hámster, etc.), las regiones marco de la región variable se obtienen de las regiones marco de la región variable de la inmunoglobulina humana, y la región constante se obtiene de una región constante humana de inmunoglobulina.
Las regiones determinantes de la complementariedad de la región hipervariable existen en la región hipervariable en la región variable de un anticuerpo y significan tres regiones que directamente y complementariamente se unen a un antígeno (restos determinantes de complementariedad, CDRI, CDR2, y CDR3). Las regiones marco de la región variable significan cuatro regiones comparativamente conservadas que yacen en dirección 5’, en dirección 3’ o entre las tres regiones determinantes de la complementariedad (región marco, FRI , FR2, FR3, y FR4).
En otras palabras, un anticuerpo monoclonal humanizado significa que en el que todas las regiones excepto una porción o la totalidad de las regiones determinantes de la complementariedad de la región hipervariable de un anticuerpo monoclonal obtenido de mamífero no humano han sido reemplazadas con sus regiones correspondientes obtenidas de una inmunoglobulina humana.
La región constante obtenida de inmunoglobulina humana posee la secuencia de aminoácidos inherente en cada isotipo tal como IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD, e IgE. La región constante de un anticuerpo monoclonal humanizado en la presente invención puede ser aquellas de la inmunoglobulina humana que pertenece a cualquier isotipo. Preferiblemente, esta es la región contante de IgG humana. Las regiones marco de la región constante obtenida de inmunoglobulina humana no son particularmente limitadas.
Cuando la sustancia de la presente invención es un polipéptido, la sustancia incluye el siguiente polipéptido, un fragmento del polipéptido (un oligopéptido ), un polipéptido de fusión, uno químicamente modificado del mismo. Los ejemplos de un oligopéptido son un péptido que comprende 5 a 30 aminoácidos, preferiblemente 5 a 20 aminoácidos. La modificación química puede diseñarse dependiendo de diversos propósitos, por ejemplo, el incremento de la semivida en sangre en el caso de administración in vivo, o el incremento de la tolerancia contra la degradación o incremento de la absorción en el tracto digestivo en la administración oral.
Los ejemplos del polipéptido son los siguientes:
(1)
Un polipéptido que comprende la totalidad o una porción de una región extracelular de AILIM;
(2)
Un polipéptido de fusión que comprende la totalidad o una porción de una región extracelular de AILIM y la totalidad o una porción de una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina; o
(3)
Un polipéptido que se une a AILIM. Los ejemplos de "no proteína" son ADN, ARN,, y un compuesto químicamente sintetizado.
Aquí, "ADN" significa "ADN que comprende una secuencia parcial de nucleótidos del ADN o ADN químicamente modificado del mismo" útil como un producto farmacéutico de ADN antisentido diseñado en base a una secuencia de nucleótidos de ADN (incluyendo ADNc y ADN genómico) que codifica la AILIM anterior (preferiblemente AILIM humana). Específicamente el ADN antisentido puede inhibir la transcripción del ADN que codifica AILIM en ARNm, o la traducción de ARNm en una proteína hibridizando el ADN o ARN, que codifica AILIM.
La "secuencia parcial de nucleótidos" según lo referido aquí indica una secuencia parcial de nucleótidos que comprende un número arbitrario de nucleótidos en una región arbitraria. La secuencia parcial de nucleótidos consiste en 5 a 100 nucleótidos consecutivos, preferiblemente 5 a 70 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente 5 a 50 nucleótidos consecutivos, y aún más preferiblemente 5 a 30 nucleótidos consecutivos.
Cuando el ADN se utiliza como un producto farmacéutico de ADN antisentido, la secuencia de ADN puede modificarse químicamente en parte para extender la semivida (estabilidad) de la concentración sanguínea del ADN administrado a pacientes, para incrementar la permeabilidad de la membrana intracitoplasmica del ADN, o para incrementar la resistencia a la degradación o la absorción del ADN administrado por vía oral en los órganos digestivos. La modificación química incluye, por ejemplo, la modificación de los enlaces de fosfato, las ribosas, las bases de nucleótido, el resto de azúcar, el extremo 3' y/o el extremo 5' en la estructura del ADN del oligonucleótido.
La modificación del enlace de fosfato incluye, por ejemplo, la conversión de uno o más de los enlaces en enlaces de fosfodiesteres (D-oligo), enlaces de fosforotioato, enlaces de fosforoditioato (S-oligo), fosfonato de metilo (MP-oligo), enlaces de fosforoamidata, enlaces de no fosfato o enlaces de fosfonotioato de metilo,
o combinaciones de los mismos. La modificación de la ribosa incluye, por ejemplo, la conversión en 2'-fluororibosa o 2'-O-metilribosa. La modificación de la base de nucleótido incluye, por ejemplo, la conversión en 5-propiniluracilo o 2-aminoadenina.
Aquí, "ARN," significa "ARN, que comprende una secuencia parcial de nucleótidos del ARN, o ARN químicamente modificado del mismo" útil como ARN antisentido, producto farmacéutico diseñado en base a secuencia de nucleótidos de ARN, que codifica la AILIM anterior (preferiblemente AILIM humana). El ARN antisentido, puede inhibir la transcripción del ADN que codifica AILIM en ARNm, o la traducción de ARNm en una proteína hibridizando el ADN o ARN, que codifica AILIM.
La "secuencia parcial de nucleótidos" referida aquí indica una secuencia parcial de nucleótidos que comprende un número arbitrario de nucleótidos en una región arbitraria. La secuencia parcial de nucleótidos consiste en 5 a 100 nucleótidos consecutivos, preferiblemente 5 a 70 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente 5 a 50 nucleótidos consecutivos, y aún más preferiblemente 5 a 30 nucleótidos consecutivos.
La secuencia de ARN antisentido, puede modificarse químicamente en parte para extender la semivida (estabilidad) de la concentración en sangre del ARN, administrado a pacientes, para incrementar la permeabilidad de la membrana intracitoplásmica del ARN, o para incrementar la resistencia a la degradación o la absorción del ARN administrado por vía oral, en el órgano digestivo. Un ejemplo de modificación química es la modificación química aplicada al ADN antisentido anterior.
Los ejemplos de “un compuesto químicamente sintetizado" son un compuesto arbitrario con la excepción del ADN anterior, ARN, y sustancias proteicas, que poseen un peso molecular de aproximadamente 100 a aproximadamente 1000, preferiblemente un compuesto que posee el peso molecular de aproximadamente 100 a aproximadamente 800, y más preferiblemente el peso molecular de aproximadamente 100 a aproximadamente 600.
Un "polipéptido" incluido en la definición de la anterior "sustancia" significa una porción (un fragmento) de una cadena de polipéptidos que constituye AILIM (preferiblemente AILIM humana), preferiblemente la totalidad o una porción de una región extracelular del polipéptido que constituye AILIM (opcionalmente pueden añadirse 1 a 5 aminoácidos en el extremo terminal N y/o extremo terminal C de la región).
AILIM que se incluye en la presente invención es una molécula transmembrana que penetra la membrana celular, que comprende 1 o 2 cadenas de polipéptidos .
Aquí, una "proteína transmembrana" significa una proteína que se conecta con la membrana a través de la región de péptido hidrofóbico que penetra la bicapa líquida de la membrana una vez o varias veces y en la que la estructura, en su totalidad, está compuesta de tres regiones principales, es decir, región extracelular, región transmembrana, y región citoplásmica, tal como se observa en muchos receptores o moléculas de la superficie celular. Dicha proteína transmembrana constituye cada receptor o molécula de la superficie celular en forma de un monómero, homodímero, heterodímero o oligómero con otras cadenas) que posee secuencia de aminoácidos igual o diferente.
Aquí, una "región extracelular" significa la totalidad o una porción de la estructura parcial (región parcial) de la estructura entera de la proteína transmembrana antes mencionada donde la estructura parcial existe fuera de la membrana. En otras palabras, esto significa la totalidad o una porción de la región de la proteína transmembrana excepto la región incorporada en la membrana (región transmembrana) y la región que existe en el citoplasma después de la región transmembrana (región citoplásmica).
"Un polipéptido de fusión" incluido en la anterior "sustancia proteica" significa un polipéptido de fusión que comprende la totalidad o una porción de una región extracelular de un polipéptido que constituye AILIM (preferiblemente AILIM humana), y "la totalidad o una porción de una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina (Ig, preferiblemente Ig humana) ". Preferiblemente, el polipéptido de fusión es un polipéptido de fusión con una región extracelular de AILIM y una porción de una región constante de cadena pesada de IgG humana y particularmente preferiblemente, un polipéptido de fusión de una región extracelular de AILIM y una región (Fc) de cadena pesada de IgG humana que comprende una región bisagra, dominio CH2 y dominio CH3. Como IgG, IgG1 es preferida, y como AILIM, AILIM humana, de ratón, o rata es preferible (preferiblemente humana).
"La totalidad o una porción de una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina humana (Ig) " utilizada en la presente memoria significa la región constante o la región Fc de cadena pesada de inmunoglobulina obtenida de ser humano (cadena H) según lo descrito, o una porción de la misma. La inmunoglobulina puede ser cualquier inmunoglobulina que pertenece a cualquier clase y cualquier subclase. Específicamente, los ejemplos de la inmunoglobulina son IgG (IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4), IgM, IgA (IgA1 e IgA2), IgD, e IgE. Preferiblemente, la inmunoglobulina es IgG (IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4), o 1gM. Los ejemplos de inmunoglobulina particularmente preferible de la presente invención son aquellos que pertenecen a IgG obtenida de ser humano (IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4).
La inmunoglobulina posee una unidad estructural con forma de Y en la que cuatro cadenas compuestas de dos cadenas livianas homólogas (cadenas L) y dos cadenas pesadas homólogas (cadenas H) se conectan a través de enlaces de disulfuro (enlaces S-S). La cadena liviana está compuesta de la región variable de cadena liviana (VL) y la región constante de cadena liviana (CL). La cadena pesada está compuesta de la región variable de cadena pesada (VH) y la región constante de cadena pesada (CB).
La región constante de cadena pesada está compuesta de algunos dominios que poseen las secuencias de aminoácidos inherentes en cada clase (IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE) y cada subclase (IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4, IgA1, e IgA2)
La cadena pesada de lgG (IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4) está compuesta de VH, dominio CH1, región bisagra, dominio CH2, y dominio CH3 en este orden desde el extremo terminal N.
Similarmente, la cadena pesada de IgG1 está compuesta de VH, dominio CY11, región bisagra, dominio CY12, y dominio CY13 en este orden desde el extremo terminal
N. La cadena pesada de IgG2 está compuesta de VH, dominio CY21, región bisagra, dominio C Y22, y dominio CY23 en este orden desde el extremo terminal N. La cadena pesada de IgG3 está compuesta de VH, dominio CY31, región bisagra, dominio CY32, dominio CY33 en este orden desde el extremo terminal N. La cadena pesada de IgG4 está compuesta de VH, dominio CY41, región bisagra, dominio CY42, y dominio CY43 en este orden desde el extremo terminal N.
La cadena pesada de IgA está compuesta de VH, dominio C�1, región bisagra, dominio C�2, dominio C�3 en este orden desde el extremo terminal N. Similarmente, la cadena pesada de IgA1 está compuesta de VH, dominio C�11, región bisagra, dominio C �12, dominio C �13 en este orden desde el extremo terminal
N . La cadena pesada de IgA2 está compuesta de VH, dominio C�21, región bisagra, dominio C�22, y dominio C�23 en este orden desde el extremo terminal N. La cadena pesada de IgD está compuesta de VH, dominio C�1, región bisagra, dominio C�2, y dominio C�3 en este orden desde el extremo terminal N.
La cadena pesada of IgM está compuesta de VH, dominio Cµ1, dominio Cµ2, dominio Cµ3, y dominio Cµ4 en este orden desde el extremo terminal N y no posee región bisagra según lo observado en IgG, IgA, e IgD.
La cadena pesada de IgE está compuesta de VH, dominio C�1, dominio C�2, dominio C�3, y dominio C�4 en este orden desde el extremo terminal N y no posee región bisagra según lo observado en IgG, IgA, e IgD.
Si, por ejemplo, IgG se trata con papaina, esta se escinde en el lado terminal N levemente más allá de los enlaces de disulfuro que existen en la región bisagra en la que los enlaces de disulfuro conectan dos cadenas pesadas para generar dos Fab homólogos, en los que un fragmento de cadena pesada compuesto de VH y CH1 se conecta con una cadena liviana a través de un enlace de disulfuro, y un Fc, en el que dos fragmentos homólogos de cadena pesada compuestos de la región bisagra, dominio CH2 y dominio CH3 se conectan a través de enlaces de disulfuro (Véase "Immunology Illustrated", 2° edición original, Nankodo, páginas 65-75 (1992); y "Focus of Newest Medical Science 'Recognition Mechanism of Immune System", Nankodo, páginas 4-7 (1991) ; etcétera) .
A saber, "una porción de una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina" mencionada más arriba significa una porción de una región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina que posee las características estructurales según lo que se menciona más arriba, y preferiblemente, es la región constante sin dominio C1, o la región Fc. Específicamente, el ejemplo del mismo es la región compuesta de la región bisagra, dominio C2, y dominio C3 de cada uno de IgG, IgA, e IgD, y es la región compuesta de dominio C2, dominio C3, y dominio C4 de cada uno de IgM e IgE. Un ejemplo particularmente preferible del mismo es la región Fc de IgG1 obtenido de ser humano.
El polipéptido de fusión mencionado más arriba posee la ventaja de que el polipéptido de fusión puede purificarse extremadamente fácilmente utilizando cromatografía de columna de afinidad que utiliza la propiedad de la proteína A, que se une específicamente al fragmento de inmunoglobulina debido a que el polipéptido de fusión de la presente invención posee una porción de una región constante (por ejemplo Fc) de una inmunoglobulina tal como IgG según lo que se menciona más arriba como un asociado de fusión. Además, debido a que están disponibles variables anticuerpos contra Fc de diversas inmunoglobulinas, puede realizarse fácilmente un inmunoensayo para los polipéptidos de fusión con anticuerpos contra Fc.
"Un polipéptido que se une a AILIM" está incluido en “un polipéptido" incluido en la definición de la anterior "sustancia".
Los ejemplos específicos de "un polipéptido que se une a AILIM" son la totalidad o una porción de un polipéptido que constituye B7h, B7RP-1, GLSO conocidos o una molécula denominada LICOS que son ligandos que interactúan con AILIM (Nature, Vol. 402, Núm. 6763, páginas 827-832, 1999; Nature Medicine, Vol. 5, Núm. 12, páginas 1365-1369, 1999; J. Immunology, Vol. 164, páginas 1653-1657, 2000; Curr. Biol., Vol. 10 Núm. 6, páginas 333-336, 2000).
Preferiblemente, el polipéptido es un polipéptido que comprende la totalidad o una porción de una región extracelular de los ligandos anteriores (B7h, B7RP-1, GL50 LICOS), o un polipéptido de fusión que comprende el polipéptido, y la totalidad o una porción de una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina (preferiblemente inmunoglobulina humana). Aquí, los términos "una región extracelular" y "una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina" poseen el mismo significado que los términos anteriores.
El polipéptido, una porción del polipéptido (fragmento), y el polipéptido de fusión mencionado más arriba pueden producirse no sólo mediante tecnología de ADN recombinante según lo que se menciona más abajo sino también mediante un método bien conocido en la técnica tal como un método químico sintético y un método de cultivo celular, o un método modificado de los mismos.
El "anticuerpo" de la presente invención puede ser un anticuerpo policlonal (antisuero) o un anticuerpo monoclonal contra AILIM de mamífero (particularmente preferiblemente AILIM humana) definida más arriba, y preferiblemente un anticuerpo monoclonal.
Específicamente el anticuerpo es un anticuerpo que posee una actividad inhibidora de la proliferación de células que expresan AILIM uniéndose a AILIM, o inhibidora de la producción de interferón-y o interleuquina 4 mediante células que expresan AILIM a través de la unión a AILIM.
La "alergia de tipo retardada" en la presente memoria esta alergia mediada por inmunidad celular (particularmente mediada por célula T de tipo Th1), es decir, la alergia está mediada por célula T sensibilizada con antígeno (célula T de memoria que memoriza el antígeno) y se refiere a cualquier alergia, que toma aproximadamente 24 a 48 horas para exhibir reacción alérgica acompañada con inflamación causada por dicha célula T de memoria cuando el organismo vivo sensibilizado con un antígeno es re-contactado con el mismo antígeno.
Esta alergia de tipo retardada incluye alergia a un antígeno patógeno infeccioso tal como alergia a la tuberculina obtenida de Mycobacterium tuberculosis, una alergia de tipo retardada transitoria de Jones-Mote a una cantidad muy pequeña de proteína, alergia de contacto a productos químicos tales como cloruro de picrilo o toxina vegetal tal como laca, o alergia relacionada con rechazo de injerto observado en el aloinjerto.
"Composición farmacéutica" en la presente memoria significa una composición útil como fármaco que comprende como ingredientes efectivos anticuerpo (preferiblemente anticuerpo humano), que se une a AILIM (preferiblemente AILIM humana) o una porción de la misma, o anticuerpo monoclonal (preferiblemente anticuerpo monoclonal humano) o una porción del mismo y un "vehículo famacológicamente aceptable"
El "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye un excipiente, un diluyente, un agente de expansión, un agente de descomposición, un estabilizante, un conservante, un tampón, un emulsionante, un agente aromático, un colorante, un edulcorante, un agente incrementador de viscosidad, un aromatizante, un agente incrementador de solubilidad, u otros aditivos.
Utilizando uno o más de dichos vehículos, una composición farmacéutica puede formularse en comprimidos, píldoras, polvos, gránulos, inyecciones, soluciones,
cápsulas, pastillas, elixires, suspensiones, emulsiones, o jarabes.
La composición farmacéutica puede administrarse por vía oral o parenteral. Oras formas de administración parenteral incluyen una solución para la aplicación externa, supositorio para administración rectal, y pesario, prescripto por el método habitual, que comprende uno o más ingredientes activos..
La dosificación puede variar dependiendo de la edad, sexo, peso, y síntoma de un paciente, efecto de tratamiento, vía de administración, período de tratamiento, o la clase de ingrediente activo (polipéptido o anticuerpo mencionado más arriba) contenido en la composición farmacéutica. Usualmente, la composición farmacéutica puede administrarse a un adulto en una dosis de 10 µg a 1000 mg (o 10 µg a 500 mg) en una administración. Dependiendo de varias condiciones, la dosificación menor que esa dosificación mencionada más arriba puede ser suficiente en algunos casos, y la dosificación mayor que esa dosificación mencionada más arriba puede ser necesaria en otros casos.
En particular, la inyección puede producirse disolviendo o suspendiendo el anticuerpo en un vehículo farmacéuticamente aceptable no tóxico tal como solución fisiológica o agua destilada para inyección comercialmente disponible ajustando una concentración a 0,1 �g de anticuerpo/ml de vehículo a 10 mg de anticuerpo/ml de vehículo.
La inyección producida de ese modo puede administrarse a un paciente humano que necesita el tratamiento en una dosis de 1 �g a 100 mg/kg. de peso corporal, preferiblemente 50 �g a 50 mg/kg. de peso corporal una vez o más veces por día. Los ejemplos de vía de administración son vías de administración médicamente apropiadas tales como inyección intravenosa, inyección subcutánea, inyección intradérmica, inyección intramuscular, o inyección intraperitoneal, preferiblemente inyección intravenosa.
La inyección también puede prepararse en un diluyente no acuoso (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol, aceite vegetal tal como aceite de oliva, y alcohol tal como etanol), suspensión, o emulsión.
La inyección puede esterilizarse mediante filtración con un filtro no penetrado por bacterias, mezclando bacteriocidas, o por irradiación. La inyección puede producirse en la forma es decir preparada al utilizarla . A saber, esta se liofiliza para que sea una composición sólida estéril, y puede disolverse en agua destilada, estéril para inyección u otro disolvente antes del uso.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos humanos de la presente invención son útiles como preparaciones farmacéuticas, sin inducir el inmunorechazo del huésped debido a HAMA (anticuerpo humano anti-ratón), para controlar una variedad de reacciones biológicas (por ejemplo, proliferación de células que expresan AILIM, producción de citoquina por células que expresan AILIM, citólisis inmune o muerte (apóptosis) de células que expresan AILIM y otros) que están asociadas a la transducción de señales coestimuladoras mediada por AILIM (señal secundaria) a células que expresan AILIM, y/o como preparaciones farmacéuticas para tratar o prevenir diversas enfermedades suprimiendo e inhibiendo la aparición y/o avance de enfermedades asociadas con la transducción de señales mediada por AILIM.
El término "citólisis inmune" en la presente memoria indica un fenómeno biológico como el siguiente.
La lisis de la célula (citólisis) puede ser inducida por un anticuerpo (particularmente anticuerpo de lisado celular) así como por la unión con células asesinas. El anticuerpo de lisado celular es un anticuerpo citotóxico, que particularmente posee actividad de lisado sobre células tales como células inmunes, célula tisular o espermas. Cuando el anticuerpo se une al antígeno de la superficie celular, éste causa un efecto citotóxico sobre la célula o induce citólisis en presencia del complemento.
Esta citólisis inmune está inducida por la acción del complemento en conjunción con la unión específica del anticuerpo al antígeno de la superficie celular. El anticuerpo unido al antígeno superficial activa el complemento C1 (C1). Posteriormente se forman sitios de daño celular a través de una serie de reacciones de fijación de complemento con los complementos C2 a C9 (C2-C9), y después los contenidos celulares son liberados de las células lisando de ese modo las células.
El término "citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo" en la presente memoria indica un evento biológico es decir también abreviado como "ADCC," y es una acción citotóxica sobre las células diana por células efectoras tales como linfocitos, macrófagos o leucocitos polimorfonucleares, que requieren no sólo las células efectoras y células diana sino también un anticuerpo participante en la inducción del evento ciotóxico.
El término "reacción de linfocitos mixtos" en la presente memoria significa un fenómeno biológico abreviado como "MLR". La reacción también se denomina como reacción de leucocitos mixtos.
Los leucocitos alogénicos o linfocitos obtenidos de individuos diferentes se mezclan uno con otro y se cultivan durante varios días, permitiendo de ese modo la formación de blastos de las células y síntesis de ADN en las células (es decir, proliferación celular). Esta reacción se denomina como MLR (MLR alogénica) .
La síntesis de ADN (proliferación celular) puede analizarse deteniendo la proliferación de cualquier linfocito. La detención puede lograrse mediante el tratamiento con irradiación o mitomicina. El análisis puede llevarse a cabo midiendo la cantidad de ADN sintetizado en el otro linfocito.
La cantidad de ADN sintetizado puede analizarse midiendo la incorporación de timidina, etiquetada con radioisótopo tal como tritio, en el núcleo de la célula.
El ADN que codifica AILIM (particularmente preferiblemente AILIM humana) de la presente invención puede obtenerse en conformidad con un método comúnmente utilizado que utiliza método para clonar ADNc de ARNm que codifica AILIM; método para asilar el ADN genómico y unirlos; método para preparar el ADN mediante PCR utilizando una secuencia de ADNc o secuencia de ARNm como una plantilla; o procedimiento para sintetizar químicamente el ADN.
El ADN que codifica el ligando de AILIM en conformidad con la presente invención también puede obtenerse de la misma manera según lo descrito más arriba.
El ADN que codifica AILIM (particularmente preferiblemente AILIM humana) de la presente invención puede prepararse cortando (digiriendo) el ADN que comprende ADN que codifica AILIM preparado como tal con enzimas de restricción apropiadas, y según se requiera, ligando el fragmento de ADN resultante con un ADN conector o cola utilizando un ADN polimerasa apropiado o similar. El ADN que codifica el ligando de AILIM también puede prepararse de la misma manera.
Un método ejemplar se mostrará más abajo para clonar el ADNc que codifica AILIM (particularmente preferiblemente AILIM humana; la proteína se denomina de aquí en adelante como la proteína de interés) del ARNm.
Un ADN que codifica el ligando de AILIM también puede clonarse de la misma manera.
Primero, el ARN mensajero, que codifica la proteína de interés se prepara a partir de tejidos o células que expresan y que producen la proteína de interés. El ARNm puede prepararse aislando el ARN total, mediante un método conocido tal como método de tiocianato de guanidina (Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry, Vol .18 , páginas 5294, 1979), método de fenol cliente, o método de AGFC, y sometiéndolo a cromatografía de afinidad utilizando celulosa oligo-dT o poli-U Sefarosa.
Después, con el ARNm obtenido como plantilla, el ADNc se sintetiza, por ejemplo, mediante un método bien conocido que utiliza transcriptasa inversa tal como el método de Okayama et al. (Mel. Cell. Biol. Vol.2, página 161 (1982); ibid. Vol .3 , página 280 (1983)) o el método de Hoffman et al. (Gene Vol . 25, página 263 (1983)), y se convierte en ADNc de doble hebra. Se prepara una biblioteca de ADNc transformando E.coli con vectores plásmidos, vectores fagos, o vectores cósmidos que poseen este ADNc o transfectando E. Coli después del envasado in vitro.
Los vectores plásmidos utilizados en la presente invención no sin limitados siempre que sean replicados y mantenidos en los huéspedes. También puede utilizarse cualquier vector fago que puede replicarse en huéspedes. Los ejemplos de los vectores de clonación usualmente utilizados son pUC19, �gt10, �gt11, etcétera. Cuando se aplica el vector a la detección inmunológica según lo que se menciona más abajo, preferiblemente se utiliza el vector que posee un promotor que puede expresar un gen que codifica el polipéptido de la presente invención en un huésped.
El ADNc puede insertarse en un plásmido mediante, por ejemplo, el método de Maniatis et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory, página 1.53, 1989). El ADNc puede insertarse en un vector fago mediante, por ejemplo, el método de Hyunh et al. (DNA cloning, a practical approach, Vol. 1, página 49 (1985) ). Estos métodos puede realizarse simplemente utilizando un kit de clonación comercialmente disponible (por ejemplo, un producto de Takara Shuzo). El vector plásmido recombinante o fago obtenido de ese modo se introduce en las células huésped apropiadas tales como una procariota (por ejemplo, E. coli: XLlBlue MRF' , DH5�, HB101, MC1061/P3, etc.).
Los ejemplos de un método para introducir un plásmido en un huésped son método de cloruro de calcio, método de cloruro de calcio/cloruro de rubidio descrito en Molecular Cloning, A Laboratory Manual (segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory, página 1.74 (1989)), y método de electroporación. Los vectores fagos pueden introducirse en células huésped, por ejemplo, mediante un método en el que los ADNs de fagos se introducen en huéspedes cultivados después del envasado in vitro. El envasado in vitro puede realizarse fácilmente con un kit de envasado in vitro comercialmente disponible (por ejemplo, un producto de Stratagene o Amersham).
El ADNc que codifica el polipéptido de la presente invención puede asilarse de la biblioteca de ADNc así preparada en conformidad con el método mencionado más arriba combinando los métodos de detección general de ADNc.
Por ejemplo, un clon que comprende el ADNc deseado puede detectarse mediante un método conocido de hibridización de colonia (Crunstein et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. EEUU, Vol. 72, página 3961 (1975)) o método de hibridización de plaqueta (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory, página 2.108 (1989)) que utiliza oligonucleótidos químicamente sensibilizados marcados con 32P como sondas, que son correspondientes con la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la presente invención. Alternativamente, un clon que posee un fragmento de ADN que codifica una región específica dentro del polipéptido de la presente invención puede detectarse amplificando la región por PCR con cebadores PCR sintéticos.
Cuando se utiliza una biblioteca de ADNc preparada utilizando un vector de expresión ADNc (por ejemplo, vector fago �ZAPII), el clon deseado puede detectarse por la reacción antígeno-anticuerpo utilizando un anticuerpo contra el polipéptido de la presente invención. Se utiliza preferiblemente un método de detección que utiliza método de PCR cuando se someten muchos clones a la detección.
La secuencia de nucleótidos del ADN obtenida de ese modo puede determinarse mediante el método de Maxam-Gilbert (Maxam et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.74, página 560 (1977)) o el método de terminación de cadena sintética de dideoxinucleótido que utiliza fago M13 (Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU, Vo1.74, páginas 5463-5467 (1977)). La totalidad o una porción del gen que codifica el polipéptido de la presente invención puede obtenerse escindiendo el clon obtenido según lo que se menciona más arriba con enzimas de restricción etcétera.
El ADN que codifica el polipéptido de la presente invención puede aislarse del ADN genómico obtenido de las células que expresan el polipéptido de la presente invención según lo que se menciona más arriba mediante el siguiente método.
Dichas células se solubilizan preferiblemente mediante SDS o proteinasa K, y los ADNs se desproteínizan repitiendo la extracción con fenol. Los ARNs se digieren preferiblemente con ribonucleasa. Los ADNs obtenidos son parcialmente digeridos con enzimas de restricción apropiadas, y los fragmentos de ADN obtenidos se amplifican con fago y cósmido apropiados para generar una biblioteca. Después, se detectan los clones que poseen la secuencia deseada, por ejemplo, utilizando sondas de ADN marcado radioactivamente, y se obtiene la totalidad o una porción del gen que codifica el polipéptido de la presente invención a partir de los clones por excisión con enzima de restricción, etcétera.
La preparación del ADN que codifica la proteína de interés mediante PCR puede llevarse a cabo utilizando ARNm conocido o ADNc que codifica la proteína de interés como plantilla en conformidad con un método usual ("PCR techniques for gene amplification - fundamental and new technologies" KYORITSU SHUPPAN, 1992, etc).
El ADN que codifica la proteína de interés también puede sintetizarse químicamente mediante el método usual, en base a la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de interés.
La AILIM de la invención (particularmente preferiblemente AILIM humana) o una porción de la misma (preferiblemente, la región extracelular) puede prepararse como una proteína recombinante en conformidad con un método usual con técnicas de recombinación genética comúnmente utilizadas, utilizando ADN obtenido cortando el ADN que codifica AILIM (ADNc o ADN genómico que contiene intrón) en base al método ilustrado más arriba con enzimas de restricción apropiadas para dar un fragmento de ADN que codifica AILIM, y después según lo requerido, ligando el fragmento de ADN resultante con un ADN conector o cola, utilizando un ADN polimerasa apropiado o similar.
El ligando de AILIM (particularmente preferiblemente el ligando de AILIM humana) o una porción de la misma (preferiblemente, la región extracelular) puede prepararse de la misma manera.
Más abajo se ilustra un ejemplo específico. A saber, el ADN preparado según lo descrito más arriba se inserta en un vector, que será descrito más adelante en detalle, para producir un vector de expresión. Después el vector de expresión se utiliza para transformar una células huésped según lo descrito más abajo para obtener un transformante. El transformante se cultiva y se permite que produzca la proteína de interés en el sobrenadante de cultivo. La proteína de interés en el sobrenadante de cultivo puede purificarse fácilmente utilizando cromatografía de columna.
No existe limitación particular sobre el tipo de vector de expresión para la producción de AILIM recombinante (o su región extracelular), siempre que el vector se replique y mantenga o produzca en forma autónoma en cualquiera de los diversos huéspedes tales como células procarióticas y/o células eucarióticas. Dicho vectores de expresión incluyen vectores plásmidos y vectores fagos (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York, 1985) .
El vector de expresión puede prepararse fácilmente ligando el ADN que codifica AILIM (o su región extracelular) con un vector para recombinación disponible en la técnica (ADN plásmido y ADN bacteriófago) mediante el método usual. Los ejemplos específicos de los vectores para recombinación utilizados son plásmidos obtenidos de E. Coli tales como pBR322, pBR325, pUC12, pUC13, y pUC19, plásmidos obtenidos de levadura tales como pSH19 y pSH15, y plásmidos obtenidos de Bacillus subtilis tales como pUB110, pTP5, y pC194. Los ejemplos de fagos son un bacteriófago tal como fago �, y un virus de animal o insecto (pVL1393, Invitrogen) tal como un retrovirus, virus de vaccinia, y virus de polihedrosis nuclear.
Los vectores plásmidos son útiles, cuando se prevé que se exprese un ADN que codifica AILIM de la invención (particularmente preferiblemente AILIM humana) o su región extracelular soluble en una célula huésped y expresando de ese modo AILIM sobre la superficie de la célula huésped, o alternativamente se prevé que se produzca la región extracelular soluble de AILIM (particularmente preferible AILIM humana). No existe limitación particular sobre dichos vectores plásmidos, siempre que los vectores puedan expresar el gen que codifica AILIM (particularmente preferiblemente AILIM humana) o su región extracelular soluble y producir la proteína codificada en diversas células huésped tales como células procarióticas y/o células eucarióticas. Por ejemplo, dichos plásmidos incluyen pMAL C2, ADNpc3.1 (-), pEF-BOS (Nucleic Acid Research, Vol. 18, página 5322, 1990; etc. ), pME18S ('Handbook for genetic engineering," Experimental Medicine, supplement, 1992; etc.), etc.
Cuando se utilizan bacterias, particularmente E. coli como células huésped, un vector de expresión generalmente está compuesto de, al menos, una región promotora-operadora, un codón de iniciación, el ADN que codifica la proteína de la presente invención, codón de terminación, región terminadora, y replicón.
Cuando la levadura, células animales, o células de insectos se utilizan como huéspedes, un vector de expresión preferiblemente está compuesto de, al menos, un promotor, un codón de iniciación, el ADN que codifica AILIM (particularmente preferiblemente AILIM humana) de la presente invención o s región extracelular, y un codón de terminación. También puede comprender el ADN que codifica un péptido de señal, secuencia potenciadora, región no traducida 5' y 3' del gen que codifica AILIM de la presente invención, articulaciones de unión, sitio de poliadenilación, región marcadora seleccionable, y replicón. El vector de expresión también puede contener, si se requiere, un gen para amplificación génica (marcador) que se utiliza usualmente.
Una región promotora-operadora para expresar AILIM (particularmente preferiblemente AILIM humana) de la presente invención o su región extracelular en bacterias comprende un promotor, un operador, y una secuencia Shine-Dalgarno (SD) (por ejemplo, AAGG). Por ejemplo, cuando el huésped es Escherichia, preferiblemente comprende promotor Trp, promotor lac, promotor recA, promotor �PL, promotor lpp, promotor tac, o similares.
Los ejemplos de un promotor para expresar AILIM (particularmente preferiblemente AILIM humana) de la presente invención o su región extracelular e levadura son promotor PH05, promotor PGK, promotor GAP, promotor ADH, etcétera. Cuando el huésped es Bacillus, los ejemplos de los mismos son promotor SL01, promotor SP02, promotor penP y etcétera.
Cuando el huésped es una célula eucariótica tal como una células de mamífero, los ejemplos de los mismos son promotor obtenido de SV40, promotor retrovirus, promotor de choque por calor, etcétera. Por norma, el promotor no se limita a los ejemplos anteriores. Además, utilizar un potenciador es efectivo para la expresión.
Un codón de iniciación preferible es, por ejemplo, un codón de metionina (ATG)
El codón de terminación comúnmente utilizado (por ejemplo, TAG, TGA, TAA, etcétera) se ilustra como codón de terminación.
Los terminadores sintéticos o naturales usualmente utilizados son utilizados como región terminadora.
Un replicón significa un ADN capaz de replicar la secuencia de ADN completa en células huésped, e incluye un plásmido natural, un plásmido artificialmente modificado (fragmento de ADN preparado a partir de un plásmido natural), un plásmido sintético, etcétera. Los ejemplos de plásmidos preferibles son pBR322 o sus derivados artificiales (fragmento de ADN obtenido tratando pBR322 con enzimas de restricción apropiadas) para E. coli, plásmido de levadura 2 µ o ADN cromosomal de levadura para levadura, y pRSVneo ATCC 37198, p5V2dhfr ATCC 37145, pdBPV-MMTneo ATCC 37224, pSV2neo ATCC 37149, pSV2bsr, etc. para células de mamífero.
También pueden utilizarse una secuencia potenciadora, sitio de poliadenilación, y articulación de unión que son usualmente utilizados en la técnica, tales como aquellas obtenidas de SV40.
Un marcador seleccionable usualmente utilizado puede utilizarse en conformidad con el método usual. Los ejemplos del mismos son genes de resistencia para antibióticos, tales como tetraciclina, ampicilina, o kanamicina, y gen timidina quinasa.
Los ejemplos de un gen para amplificación génica son gen dihidrofolato reductasa (DHFR), gen timidina quinasa, gen de resistencia a la neomicina, gen glutamato sintasa, gen adenosina deaminasa, gen ornitina decarboxilasa, gen higromicina-B-fofotransferasa, gen aspartato transcarbamilasa, etc.
El vector de expresión de la presente invención puede prepararse conectando continuamente y circularmente al menos el promotor arriba mencionado, codón de iniciación, ADN que codifica la proteína de la presente invención, codón de terminación, y región terminadora, a un replicón apropiado. Si se desea, pueden utilizarse fragmentos de ADN (por ejemplo, conectores, sitios de restricción generados con otras enzimas de restricción), mediante el método usual tal como digestión con una enzima de restricción o ligación que utiliza ADN ligasa T4.
Los transformantes de la presente invención pueden prepararse introduciendo el vector de expresión mencionado más arriba en células huésped.
Las células huésped utilizadas en la presente invención no son restrictivas siempre que sean compatibles con un vector de expresión mencionado más arriba u puedan transformarse. Los ejemplos de las mismas son diversas células tales como células naturales o células recombinantes artificialmente establecidas usualmente utilizadas en el campo técnico de la presente invención (por ejemplo, bacterias (Escherichia y Bacillus), levadura (Saccharomyces, Pichia, etc.), células animales, o células de insectos.
Preferiblemente se utilizan E. coli o células animales. Los ejemplos específicos son E. coli (DH5�, DH10B, TB1, HB101, XL-2Blue, etc.), células obtenidas de ratón (COP, L, C127, Sp2/0, NS-1, NIH 3T3, etc.), células obtenidas de rata, células obtenidas de hámster (BHK, CHO, etc.), células obtenidas de mono (COS1, COS3, COS7, CVI, Velo, etc.), y células obtenidas de ser humano (Hela, células obtenidas de fibroblasto diploide, mieloma, Namaiwa, etc.).
Un vector de expresión puede introducirse (transformarse (transducirse)) en células huésped mediante un método conocido.
La transformación puede realizarse, por ejemplo, en conformidad con el método de Cohen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU, Vol.69, página 2110 (1972)), método de protoplasto (MI. Gen. Genet., Vol .168, página 111 (1979)), o método competente (J. Mol. Biol., Vol.56, página 209 (1971)) cuando los huéspedes son bacterias (E. coli, Bacillus subtilis, etc.), el método de Hinnen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci.. EEUU, Vol.75, página 1927 (1978) ), o método de litio (J. Bacteriol., Vol.153, página 163 (1983)) cuando el huésped es Saccharomyces ' cerevisiae, el método de Graham (Virology, Vol.52, página 456 (1973)) cuando los huéspedes son células animales, y el método de Summers et al. (Mol. Cell. Biol., Vol.3, páginas 2156-2165 (1983)) cuando los huéspedes son células de insectos.
La región extracelular de AILIM (particularmente preferiblemente AILIM humana) de la presente invención (AILIM soluble) puede producirse cultivando transformantes (a continuación este término incluye transductantes) que comprenden un vector de expresión preparado según lo que se menciona más arriba en medio nutriente. El ligando de AILIM puede producirse de la misma manera.
El medio nutriente preferiblemente comprende fuente de carbono, fuente de nitrógeno inorgánico, o fuente de nitrógeno orgánico necesarias para el crecimiento de células huésped (transformantes). Los ejemplos de la fuente de carbono son glucosa, dextrano, almidón soluble, y sacarosa, y los ejemplos de la fuente de nitrógeno inorgánico u orgánico o son sales de amonio, nitratos, aminoácidos, licor de maíz fermentado, peptona, caseína, extracto de carne, torta de soja, y extracto de papa. Si se desea, pueden comprender otros nutrientes (por ejemplo, una sal inorgánica (por ejemplo, cloruro de calcio, dihidrogenfosfato de sodio, y cloruro de magnesio), vitaminas, antibióticos (por ejemplo, tetraciclina, neomicina, ampicilina, canamicina, etc.).
El cultivo se realiza mediante un método conocido en la técnica. Las condiciones de cultivo tales como temperatura, pH de los medios, y tiempo de cultivo se seleccionan adecuadamente de manera que la proteína de la presente invención se sobreproduzca.
Los medios específicos u condiciones de cultivo utilizadas dependiendo de las células huésped se ilustran más abajo, pero no son restrictivas de las mismas.
Cuando los huéspedes son bacterias, actinomicetos, levaduras, hongos filamentosos, son apropiados los medios líquidos que comprenden la fuente de nutriente mencionada más arriba. Preferiblemente se utilizan los medios con pH 5 a 8.
Cuando el huésped es E. coli, los ejemplos de medios preferibles son medios LB, medios M9 (Miller et al. Exp. Mal. Genet., Cold Spring Harbor Laboratory, página 43]. (1972)), medios YT, etc. Utilizando estos medios, usualmente el cultivo puede llevarse a cabo a 14 a 43 °C durante aproximadamente 3 a 24 horas con aireación y agitación, si es necesario.
Cuando el huésped es Bacillus, usualmente el cultivo puede llevarse a cabo a 30 a 40 °C durante aproximadamente 16 a 96 horas con aireación y agitación, si es necesario.
Cuando el huésped es levadura, los ejemplos de medios son medio mínimo de Burkholder (Bastian, Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU, Vol.77, páginas 4505 (1980)), El pH de los medios es preferiblemente 5 a 8. Usualmente el cultivo puede llevarse a cabo a 20 a 35°C durante aproximadamente 14 a 144 horas con aireación y agitación, si es necesario.
Cuando el huésped es una célula animal, los ejemplos de medios son medios MEM que contienen aproximadamente suero fetal bovino al 5 a 20% (Science, Vol.122, página 501 (1952)), medios DMEM (Virology, Vol.8, página 396 (1959)), medios RPMI1640 (J. Am. Med. Assoc., Vol.199, página 519 (1967)), medios 199 (Proc. Soc. Exp. Biol. Med., Vol.73, página 1 (1950)), medios HamF12, etc. El pH de los medios es preferiblemente aproximadamente 6 a 8. Usualmente el cultivo puede llevarse a cabo a aproximadamente 30 a 40°C durante aproximadamente 15 a 72 horas con aireación y agitación, si es necesario.
Cuando el huésped es una célula de insecto, un ejemplo de medios es medios de Grace que contienen suero fetal bovino (Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU, Vol. 82, página 8404 (1985)). El pH de los mismos es preferiblemente aproximadamente 5 a 8. Usualmente el cultivo puede llevarse a cabo a aproximadamente 20 a 40°C durante 15 a 100 horas con aireación y agitación, si es necesario.
La región extracelular (AILIM soluble) de AILIM de la invención (particularmente preferiblemente AILIM humana) puede producirse cultivando las células transformadas mencionadas más arriba (particularmente, célula animal o E. coli) y permitiendo la secreción de la proteína en el sobrenadante de cultivo. A saber, un filtrado de cultivo (sobrenadante) se obtiene mediante el método tal como filtración o centrifugación del cultivo obtenido, y el polipéptido o fragmento de polipéptido de la presente invención se purifica y se aisla del filtrado del cultivo mediante el método usual comúnmente utilizado para purificar y aislar una proteína sintética o natural.
Los ejemplos de procedimientos de aislación y purificación son un método que utiliza afinidad específica, tal como cromatografía por afinidad, un método que utiliza solubilidad, tal como método de precipitación salina y precipitación de disolvente, un método que utiliza la diferencia en peso molecular, tal como diálisis, ultrafiltración, filtración en gel, y electroforesis en gel de dodecil sulfato sódico-poliacrilamida, un método que utiliza cargas, tal como cromatografía de intercambio iónico y cromatografía hidroxilapatita, un método que utiliza la diferencia en hidrofobicidad, tal como cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa, y un método que utiliza la diferencia en el punto isoeléctrico, tal como enfoque isoeléctrico.
Cuando la proteína de interés existe en el periplasma o citoplasma de los transformantes cultivados, primero, los organismos fungoides o células se cosechan mediante el método usual tal como filtración o centrifugación y se suspenden en tampón apropiado. Después de que la pared celular y/o membrana celular de las células etcétera se rompen mediante el método tal como lisis con sonicación, lisozima, y congelamiento y descongelamiento, la fracción de membrana que comprende el polipéptido de la presente invención se obtiene mediante el método tal como centrifugación o filtración. La fracción de membrana se solubiliza con un detergente tal como Triton-X100 para obtener el extracto crudo. Finalmente, el polipéptido o el fragmento de polipéptido se aisla y se purifica desde el extracto crudo mediante el método usual según lo ilustrado más arriba.
En la presente invención, el término "vehículo insoluble" significa un vehículo que se utiliza para inmobilizar polipéptidos sobre ellos mediante adsorción física o conexión química. Por ejemplo, el vehículo puede ser (1) placa, tubo de ensayo, tubo,
o similares que poseen espacio interno, lecho, bola, filtro, membrana, o similares hechos de materiales insolubles en agua incluyendo plásticos tales como resina de poliestireno, resina de policarbonato, resina de silicona o resina de nylon, o vidrio, y (2) vehículo insoluble utilizado en cromatografía por afinidad tal como vehículo de celulosa, vehículo de agarosa, vehículo de poliacril amida, vehículo de dextrano, vehículo de poliestireno, vehículo de polivnilalcohol, vehículo de poli aminoácido, vehículo de sílice poroso, etc.
La "sustancia de marcado capaz de dar señal detectable " en conformidad con la presente invención incluye, por ejemplo, enzima, material fluorescente, material luminescente, biotina, avidina o radioisótopo, más específicamente, enzimas tales como peroxidasa (por ejemplo, peroxidasa de rábano), fosfatasa alcalina, �-Dgalactosidasa, glucoseoxidasa, dehidrogenasa de glucosa-6-fosfato, dehidrogenasa de alcohol, dehidrogenasa de malato, penicilinasa, catalasa, apo-glucosa oxidasa, ureasa, luciferasa, acetilcolinaesterasa, etc.; materiales fluorescentes tales como isotiocianato de fluoresceina, proteína de ficobilina, agentes quelantes de metales térreos raros, cloruro de dansilo, isotiocianato de tetrametil rodamina, etc.; radioisótopos tales como 3H, 14C, 125I, 131I, etc.; biotina, avidina y material luminescente.
Entre ellos, el radioisótopo o material fluorescente puede dar señal detectable aún cuando se utiliza sólo. Por otro lado, cuando se utilizan como únicos reactivos, la enzima, material luminescente, biotina o avidina no proporcionan ninguna señal detectable, pero cuando se permite que reaccionen con una o más sustancias, pueden proporcionar señal detectable. Por ejemplo, cuando el marcador es una enzima, es necesario al menos un sustrato para la detección. Pueden utilizarse diversos tipos de sustratos dependiendo del tipo de método para medir la actividad de la enzima (colorimetría, fluoroscopía, método que utiliza bioluminiscencia o quimioluminiscencia, etc.). Por ejemplo, cuando el marcador es peroxidasa, puede utilizarse peróxido de hidrógeno como sustrato. Alternativamente, cuando el marcador es biotina, comúnmente se utiliza avidina o avidina modificada con enzima pero no se limita a las mismas. Según lo requerido, puede utilizarse una variedad de sustancias luminescentes dependiendo del tipo de sustrato a ser utilizado.
Pueden utilizarse cualquiera de los marcadores arriba mencionados en la presente invención. Sin embargo, el marcador preferible es una enzima tal como peroxidasa o biotina considerando la sensibilidad de detección o ensayo así como la conveniencia de manipulación.
Se construye un "método para identificar una sustancia capaz de unirse a AILIM o ligando de AILIM" en conformidad con la invención en base al principio de inmunoensayo.
Específicamente, pueden aplicarse los principios de diversos métodos según se describe en " Immunoassay (3° Edición, eds. , Eiji Ishikawa et al, Igakushoin, 1987)".
Los ejemplos de principios preferiblemente utilizados incluyen método de un anticuerpo de fase sólida, método de dos anticuerpos de fase líquida, método de dos anticuerpos, método sándwich de fase sólida, y método en recipiente único según lo que se describe en la Solicitud de Patente Japonesa Publicada Examinada (JP-B) Núm. Hei. 2-39747. Además, el método de ensayo que emplea reacción de antígenoanticuerpo está ejemplificado por el método EMIT (técnica de inmunoensayo de enzimas multiplicadas), inmunoensayo de canalización de enzimas, inmunoensayo de enzimas mediado por modulador enzimático (EMMIA), inmunoensayo inhibidor de enzimas, ensayo inmunoenzimomótrico, inmunoensayo de enzima potenciada e inmunoensayo de conexión proximal.
En la presente invención, puede seleccionarse adecuadamente cualquiera de dichos principios de inmunoensayo en conformidad con el propósito. Sin embargo, considerando la conveniencia del método y/o ventaja económica, y particularmente versatilidad clínica, preferiblemente se utiliza el principio de método sándwich, método en recipiente único, o método de un anticuerpo de fase sólida, más preferiblemente método sándwich o método en recipiente único. Particularmente preferible es el método sándwich que utiliza placa de microtitulación de múltiples pocillos que posee muchos pocillos tales como microplaca de 96 pocillos, o método en recipiente único que utiliza perlas sobre las que el polipéptido se inmoviliza y utilizando también un complemento marcado con enzima tal como peroxidasa o con biotina.
Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención capaces de unirse a AILIM humana son de origen humano, y por ello estos anticuerpos no inducen ningún inmunorechazo grave debido a la antigenicidad contra el ser humano, es decir, HAMA (Antigenicidad humana antiratón) en un huésped, que ha sido un problema terapéutico grave (efecto colateral) en las preparaciones farmacéuticas de anticuerpos que comprenden anticuerpo obtenido de mamífero no humano tal como anticuerpo obtenido de ratón. El anticuerpo de la invención es de ese modo de gran valor como producto farmacéutico de anticuerpo.
De ese modo, el anticuerpo monoclonal humano de la invención contra AILIM (particularmente AILIM humana) y las composiciones farmacéuticas que comprenden el anticuerpo monoclonal humano no inducen inmunorechazo del huésped causado por HAMA en absoluto; y de ese modo pueden utilizarse como preparaciones farmacéuticas capaces de controlar una variedad de reacciones biológicas (por ejemplo, proliferación de células que expresan AILIM, producción de citoquina por células que expresan AILIM, citólisis inmune o muerte celular (apóptosis) de células que expresan AILIM, y actividad de inducción del daño dependiente del anticuerpo de células que expresan AILIM) asociado a la transducción de la señal coestimuladora mediada por AILIM (señal secundaria) a células que expresan AILIM; y/o puede utilizarse para tratar o prevenir diversas enfermedades asociadas a la transducción de la señal mediada por AILIM, controlando e inhibiendo la aparición y/o avance de las enfermedades.
Específicamente, al proporcionar preparaciones farmacéuticas que contienen el anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM de la invención o una porción de la misma como ingrediente activo, es posible inhibir o tratar y prevenir, por ejemplo, una variedad de enfermedades (por ejemplo, artritis reumatoidea, esclerosis múltiple, tiroiditis autoinmune, dermatitis alérgica de contacto, liquen plano como enfermedad inflamatoria crónica de la piel, lupus eritematoso sistémico, diabetes mellitus insulina dependiente y psoriasis, etc.) clasificadas como enfermedades autoinmunes o enfermedades alérgicas (particularmente, enfermedades autoinmunes y alergias retardadas por inmunidad celular); artropatías (por ejemplo, artritis reumatoidea (RA), osteoartritis (OA)), inflamación (por ejemplo, hepatitis); reacción injerto contra huésped (reacción GVH); enfermedad injerto contra huésped (enfermedad injerto contra huésped; GVHD); inmunorechazo asociado al transplante (injerto alogénico o injerto heterogéneo) de tejidos (tejidos tales como piel, córnea y hueso) u órganos (hígado, corazón, pulmón, riñón, páncreas, etc.); respuesta inmune contra el antígeno extraño
o autoantígeno (por ejemplo, producción de anticuerpo contra el antígeno, proliferación celular, producción de citoquinas, etc.); y enfermedades que son potencialmente causadas por anormalidad en la inmunidad del intestino (específicamente, enfermedad intestinal inflamatoria (particularmente, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa); y alergia alimentaria, etc.
Las composiciones farmacéuticas en conformidad con la presente invención hacen posible tratar o prevenir algunas inflamaciones para las que se utilizan diversos fármacos esteroides como fármacos antiinflamatorios, por ejemplo, inflamación asociada a diversas artritides (artritis reumatoidea, osteoartritis, etc.), neumonía, hepatitis (incluyendo hepatitis viral), inflamación asociada a enfermedades infecciosas, enfermedad inflamatoria del intestino, enteritis, nefritis (nefritis glomerular, inflamación asociada a fibrosis de riñón, gastritis, vasculitis, pancreatitis, peritonitis, bronquitis, miocarditis, encefalitis, inflamación asociada a lesión por reperfusión isquémica (lesión por reperfusión isquémica de miocardio, etc.), inflamación asociada al inmunorrechazo después del transplante de tejido y órganos, quemadura, varias inflamaciones de piel (psoriasis, ' dermatitis alérgica de tipo contacto, liquen plano como una enfermedad inflamatoria crónica de la piel), inflamación asociada a fallas de múltiples órganos, inflamación después de la operación de PTCA o PTCR, e inflamación asociada a la arterioesclerosis, y tiroiditis autoinmune.
Además, con respecto a la antes mencionada inhibición y tratamiento de inmunorrechazo asociado al transplante de tejidos u órganos según lo descrito más arriba, las composiciones farmacéuticas en conformidad con la presente invención pueden utilizarse en conjunción con inmunosupresores conocidos utilizados para inhibir el inmunorrechazo en la terapia de transplante incrementando de ese modo el efecto del fármaco conocido para inhibir el rechazo al injerto.
Además, mediante el uso del método para identificar sustancias capaces de unirse a AILIM o ligando de AILIM, que está dentro del alcance de la presente invención, es posible controlar la señal. Transducción asociada a la interacción entre AILIM y el ligando de AILIM a través de la unión a AILIM o ligando de AILIM, y logrando de ese modo la detección y selección de agentes farmacéuticos (compuesto químico sintético y anticuerpo) que posee actividad potencial para tratar las diversas enfermedades antes mencionadas.
La presente invención se ilustra en mayor detalle más abajo con referencia a los Ejemplos, pero no debe interpretarse como restrictiva de los mismos.
Ejemplo 1 Preparación del inmunógeno
<1-1> Preparación de células recombinantes que expresan AILIM humana
Se prepararon dos tipos de células recombinantes (célula CHO y célula HPBALL) que sobreexpresan AILIM humana de acuerdo con el método descrito en solicitudes anteriores (JP-A Núm. Hei. 11-29599 y WO98/38216), así como en un informe previo (Int. Immunology, Vol. 12, No.1, páginas 51-55, 2000) de uno de los presentes inventores, Tezuka. Específicamente, el método es el siguiente:
Un ADNc (Número de Acceso a GenBank: AB023135 (ADNc); BAA82129 (aminoácido)) que contenía el ORF de longitud completa que codifica AILIM humana se insertó en un vector pEF-neo. Después el vector de expresión recombinante resultante se introdujo en células de ovario de hámster chino (células CHO) y células de una línea de timoma humano, HPB-ALL, de acuerdo con un método comúnmente utilizado que utiliza electroporación (960�F, 320V) con un Pulsador Génico (BioRad). Se cultivaron las células respectivas en medio RPMI1640 que contenía Geneticina (0,8mg/ml; Gibco BRL) y 10% de FCS para seleccionar células transformadas resistentes al fármaco.
<1-2> Selección de células HPB-ALL recombinantes que sobreexpresan AILIM humana
El cultivo de las células HPB-ALL resistentes al fármaco seleccionadas en el punto <1-1> descrito más arriba se centrifugó para dar pélets celulares. Un anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón denominado "SA12" (anticuerpo monoclonal de ratón anti-antígeno JTT-1 humano), que había sido establecido e informado previamente (JP-A 11-29599 (Ejemplo 12) y WO98/38216 (Ejemplo 12)) por los presentes inventores se añadió al pélet celular (concentración: solución del anticuerpo (10�g/ml) diluida con EDTA-BSA/PBS se añadió en una relación de 100µl/105 células). Las mezclas resultantes se incubaron a 4°C durante 30 minutos. Las células se lavaron dos veces con EDTA-BSA/PBS arriba mencionado (200�l), y después se añadió a las mismas estreptavidina marcada con ficoeritrina (SA-PE; 100µl de solución diluida 500 veces). Las mezclas resultantes se incubaron a 4°C durante 30 minutos. Después de la incubación, se lavaron las células 3 veces con EDTA-BSA/PBS, y se prepararon las suspensiones de células.
Se analizaron los niveles de expresión de AILIM humana de las respectivas células en las suspensiones de células en un citómetro de flujo FACSort (Beckton-Dichinson) para seleccionar células HPB-ALL recombinantes que sobreexpresan AILIM humana. Se cultivaron las células seleccionadas hasta confluencia en Medio RPMI1540 que contenía 10% de FCS y G418 (1mg/ml).
<1-3> Selección de células CHO recombinantes que sobreexpresan AILIM humana
El cultivo de las células CHO resistentes al fármaco seleccionadas en el punto <1-1> descrito más arriba se centrifugaron para dar pélets celulares. El anticuerpo monoclonal de ratón anti-AILIM humana arriba mencionado SA12, que se había marcado con FITC, se añadió a cada pélet celular (solución del anticuerpo (100�g/ml) diluida con EDTA-BSA/PBS). Las mezclas resultantes se incubaron a 4°C durante 30 minutos. Se lavaron las células con EDTA-BSA/PBS arriba mencionado, y después se prepararon suspensiones de células añadiendo EDTA-BSA/PBS (500µl) a los pélets celulares.
Se analizaron los niveles de expresión de AILIM humana de las respectivas células en las suspensiones de células en un citómetro de flujo FACSort (Beckton-Dichinson) para seleccionar las células HPB-ALL recombinantes que sobreexpresan AILIM humana. Se cultivaron las células seleccionadas hasta confluencia en medio RPMI1540 que contenía 10% de FCS y G418 (1mg/ml).
<1-4> Preparación de inmunógeno a partir de células HPB-ALL que sobreexpresan AILIM humana
Se centrifugaron las células HPB-ALL que sobreexpresan AILIM humana, que se habían obtenido en el punto <1-2> descrito más arriba. El pélet celular recuperado se lavó 4 veces con tampón de fosfato (PBS; Nikken Seibutsu) y después se resuspendió en un tampón que contenía inhibidor de proteasa (que contenía HEPES 25mM (pH 7,4), MgCl2 10mM, Sacarosa 0,25M e inhibidor de proteasa (10U/ml Aprotinina, 2µg/ml de Pepstatina, 50µg/ml de Leupeptina y 0,35mg/ml de PMSF)). La suspensión de células se trató en un homogenizador de tipo Potter y se centrifugó a baja velocidad (a 1.500 r.p.m. a 4°C durante 10 minutos). Posteriormente, el sobrenadante resultante se sometió a ultracentrifugación (a 100.000g a 4°C durante 1 hora). Se recuperó la fracción de membrana precipitada, y se suspendió en tampón de fosfato (la concentración de la fracción de membrana se ajustó de manera que 1ml de PBS contenía la fracción de membrana obtenida de 1x107 células). La suspensión se conservó a -80°C. La suspensión que contenía la fracción de membrana celular se utilizó como antígeno (inmunógeno) para preparar el anticuerpo humano de la presente invención, que se describirá más adelante.
<1-5> Preparación de inmunógeno a partir de células CHO que sobreexpresan AILIM humana
Las células CHO que sobreexpresan AILIM humana, que se habían obtenido en el punto <1-3> descrito más arriba, se dispersaron con un raspador y se centrifugaron. El pélet celular recuperado se lavó 4 veces con tampón de fosfato (PBS; Nikken Seibutsu) y después se resuspendió en un tampón que contenía inhibidor de proteasa (que contenía HEPES 25mM (pH 7,4), MgCl2 10mM, Sacarosa 0,25M e inhibidor de proteasa (10U/ml de Aprotinina, 2µg/ml de Pepstatina, 50µg/ml de Leupeptina y 0,35mg/ml de PMSF)). La suspensión de células se trató en un homogenizador de tipo Potter, y se centrifugó a baja velocidad (a 1.500 r.p.m. a 4°C durante 10 minutos). Posteriormente, el sobrenadante resultante se sometió a ultracentrifugación (a 100.000g a 40C durante 1 hora). Se recuperó la fracción de membrana precipitada y se suspendió en tampón de fosfato (la concentración de la fracción de membrana se ajustó de manera que 1ml de PBS contenía la fracción de membrana obtenida de 1x107 células). La suspensión se conservó a –80°C. La suspensión que contenía la fracción de membrana celular se utilizó como antígeno (inmunógeno) para preparar el anticuerpo humano de la presente invención, que se describirá más adelante.
Ejemplo 2 Preparación de un hibridoma que produce anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana
En el presente Ejemplo, se llevó a cabo la preparación de anticuerpo monoclonal de acuerdo con un método típico según se describe en "Experimental Medicine (supplement) ,Handbook for Cell Technology" (eds., T.Kuroki et al., Yodosha, páginas 66-74, 1992) y "Experimental Manual for Monoclonal Antibody " (T. Ando et al., Kodansha, 1991).
La fracción de membrana celular preparada a partir de células recombinantes que sobreexpresan AILIM humana proporcionada en el Ejemplo 1 se utilizó como inmunógeno de AILIM humana.
Los animales sometidos a inmunización fueron ratones transgénicos productores de anticuerpos humanos creados por un método descrito más arriba (Nature Genetics, Vol.7, páginas 13-21, 1994; Nature Genetics, Vol.15, páginas 146156, 1997; Traducción Japonesa Publicada de la Solicitud Internacional Núm. Hei 4504365; Traducción Japonesa Publicada de la Solicitud Internacional Núm., Hei 7509137; Nikkei Science, Junio, páginas 40-50, 1995; etc.) .
Se utilizaron micropalcas de múltiples pocillos para el cultivo celular.
<2-1> Inmunización y preparación de hibridoma
Uno de los inmunógenos (100µl/ratón/administración) preparados en el punto <1-4> (obtenido de HPB-ALL) y en el punto <1-5> (obtenido de CHO) descritos anteriormente se administró al ratón transgénico productor de anticuerpos humanos arriba mencionado. El inmunógeno se inyectó junto con adyuvante completo de Freund (ICN/CAPPEL) en la almohadilla de la pata como inmunización primaria (día 0).
Tras la inmunización primaria, se inyectó adicionalmente uno de los dos inmunógenos a la almohadilla del pie en un intervalo de 1 semana como inmunización secundaria y/o terciaria. De la misma manera, además se realizó la inyección para la inmunización final dos días antes de la preparación de linfocitos, que se describe más abajo.
Dos días después de la inmunización final, se prepararon los linfocitos a partir de ganglios linfáticos (subinguinal y subgenual) y bazos de los respectivos ratones transgénicos sometidos a inmunización. Los linfocitos y las células de mieloma de ratón P3/X63--AG8.653 (ATCC Núm. CRL-1580) se mezclaron en relación 5:1 y se añadió polietilenglicol 1500 (Boehringer Mannheim) a los mismos como agente de fusión. Después, la mezcla se diluyó con 10 volúmenes de medio basal libre de suero EX-CELL301 (JRH Bioscience). Posteriormente, se lavaron las células mezcladas con el medio basal y después se suspendieron en medio HAT (1L de medio basal contenía 13,61 mg de hipoxantina, 176 µg de aminopterina y 3,88 mg de timidina). Las células se colocaron sobre microplacas de 96 pocillos y se cultivaron durante 10-14 días para completar la fusión celular. El tratamiento de fusión celular produjo muchos hibridomas.
<2-2> Detección del hibridoma productor de anticuerpo monoclonal humano
Se detectó un número de hibridomas preparados en el punto <2--1> descrito más arriba con ELISA celular según se describe más abajo para seleccionar hibridomas que producen anticuerpo monoclonal humano contra AILIM humana.
Las respectivas células recombinantes HPB-ALL y las células recombinantes CHO que sobreexpresan AILIM humana, que se describen más arriba, se colocaron en cada pocillo de las microplacas de 96 pocillos de ELISA (1X105 célula/pocillo). Se llevó a cabo la incubación a 37°C durante 2 días.
Posteriormente, se descartó el sobrenadante de cada pocillo, se añadieron muestras de sobrenadante de cada cultivo de hibridoma a los mismos (50�l/pocillo) y la mezcla se incubó durante 1 hora. Después de completada la reacción, se descartó la solución de muestra mixta y cada pocillo se lavó 3 veces con PBS que contenía 1% de BSA (Sigma).
Posteriormente, se añadió a cada pocillo anticuerpo de cabra anti- inmunoglobulina humana (Fc) conjugado con peroxidasa (50�l de dilución 1:2000 por pocillo; American Corex; 1% de BSA/PBS) para detectar la cadena pesada de inmunoglobulina humana (anticuerpo monoclonal humano) en el sobrenadante de hibridoma. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora.
Por otra parte, se añadió el anticuerpo de cabra cadena anti-cadena � de inmunoglobulina humana conjugado con peroxidasa (50�l de dilución 1:2000 por pocillo) a cada pocillo para detectar la cadena liviana de inmunoglobulina humana (anticuerpo monoclonal humano) en el sobrenadante de hibridoma. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos.
Se eliminó el anticuerpo anti-IgFc humana o el anticuerpo anti-Ig� humana de cada pocillo de las microplacas, y después se lavaron las placas 3 veces con PBS que contenía 1% de BSA. Se añadió tetrametilbencidina (3,3’,5,5'-tetrametilbencidina (TMB), 100�l/pocillo, BIO-RAD) a cada pocillo y la mezcla resultante se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos.
Posteriormente, se añadió H2SO4 1N a cada pocillo (50µl/pocillo) para inactivar la reacción. La reacción se monitoreó para determinar la absorbancia a una longitud de onda de 450nm mediante un lector de microplacas (Lector de microplacas Modelo 3550, BlO-RAD).
Se realizó el experimento de control ELISA de la misma manera descrita más arriba utilizando los siguientes puntos:
(1)
Células HPB-ALL de tipo salvaje, en lugar de células HPB-ALL recombinantes que expresan AILIM humana;
(2)
Células CHO de tipo salvaje, en lugar de células CHO recombinantes que expresan AILIM humana;
(3)
Anticuerpos monoclonales de ratón contra AILIM humana (SA12 o SG430; JP-A 11-29599 (Ejemplo 12) y WO98/38216 (Ejemplo 12)) en lugar de sobrenadante de hibridoma;
(4)
Anticuerpo monoclonal humano contra KLH (hemocianina de Megathura crenulata, PIERCE) en lugar de sobrenadante de hibridoma.
El anticuerpo monoclonal humano anti-KLH se preparó de acuerdo con la misma forma descrita más arriba en el punto <2-1>, inmunizando los ratones transgénicos productores de anticuerpos humanos arriba mencionados con KLH (hemocianina de Megathura crenulata, PIERCE).
Se seleccionaron muchos hibridomas que producen anticuerpo monoclonal
humano capaces de unirse a AILIM humana mediante dicha detección. <2-3> Clonación primaria de hibridomas Se establecieron muchos tipos de monoclones de hibridoma a partir de diversos hibridomas (líneas celulares padre), que se habían seleccionado en el punto <2-2> descrito más arriba, que producen anticuerpo monoclonal humano contra AILIM humana mediante el siguiente procedimiento de ensayo.
Los respectivos hibridomas seleccionados en el punto <2-2> descrito más arriba se colocaron en microplacas de 24 pocillos. Se determinó el recuento celular del hibridoma en cada pocillo mediante pipeteo. Posteriormente, se añadieron 10% de suero fetal bovino (FCS; Trace Bioscience PTY), 1% de penicilina /estreptomicina (Sigma), 1% de Suplemento HT (Gibco BRL) y 2,5% de Suplemento de cultivo T-STIM (Collaborative Biomedical Products) al medio EX-CELL301 (JRH Bioscience) que contenía L-glutamina 4,0 mM y lípidos. El medio modificado resultante se utilizó para diluir hibridomas a razón de 1x104 células/ml y las células se suspendieron en cada pocillo.
Se combinó la suspensión de células (300 µl o 600 µl) de cada pocillo y se mezcló bien con el medio modificado (150 ml o 300 ml), y después se añadió una alícuota de 200 µl de la suspensión de células a cada pocillo de múltiples microplacas de 96 pocillos de manera que cada pocillo contuviera 4 células del hibridoma. Se añadió el arriba mencionado medio modificado (50ml o 100ml) recién preparado a la suspensión de células remanente, que se mezcló bien, y después la suspensión de células resultante se añadió a cada pocillo de otras múltiples microplacas de 96 pocillos recién preparadas de manera que cada pocillo contuviera 2 células del hibridoma.
El cultivo se continuó durante 1 a 2 semanas. Después del cultivo, se encontraron colonias únicas obtenidas de un único hibridoma en muchos pocillos.
Con el ELISA celular descrito más arriba en el punto <2-2>, se verificó que se produjo el anticuerpo monoclonal humano contra AILIM humana en el sobrenadante de cultivo en cada pocillo que contenía la colonia.
<2-4> Clonación secundaria de hibridomas
Se realizó la subclonación (clonación secundaria) de cada clon a partir de diferentes clones de hibridoma obtenidos en el punto <2-3> descrito más arriba de acuerdo con el mismo método descrito más arriba en el punto <2-3>.
Se ajustó la densidad celular de cada pocillo en una microplaca de 96 pocillos a 1 célula/pocillo en el presente experimento.
La detección arrojó muchos monoclones de hibridoma que produjeron anticuerpo monoclonal humano contra AILIM humana. Parte de los clones incluidos fueron los siguientes:
(Nombre del clon)
AIF34 (JMab124), AIF182 (JMab-126), AIF348 (JMab-127), AIF624 (JMab128), AIF1052 (JMab-135), AIH5D3 (JMab-136), AIH386 (JMab-137), AII289 (JMab138), AII394 (JMab-139), AII488 (JMab-140), AIJ40 (JMab-141)
Los nombres que se muestran más arriba son utilizados a lo largo de la presente solicitud, a saber en todos los Ejemplos descritos más abajo incluyendo el presente Ejemplo, y en las Figuras y Tablas que contienen el resultado del ensayo obtenido en este Ejemplo.
Ejemplo 3 Análisis de propiedades de anticuerpo monoclonal
<3-1> Análisis de la cadena pesada y cadena liviana
Utilizando ELISA y citometría de flujo descritos más abajo, se verifico que el anticuerpo monoclonal contra AILIM humana producido por cada clon de hibridoma, que había sido clonado en el punto <2-4> descrito más arriba, era realmente un anticuerpo monoclonal humano.
Las células HPB-ALL recombinantes que sobreexpresan AILIM humana, que se habían preparado en el Ejemplo 1, se colocaron en cada pocillo con forma de v de la microplaca (3x104 células/pocillo). Las células se cultivaron a 370C en medio RPMI1640 que contenía 10% de FCS.
Después de completado el cultivo, se centrifugó la placa (a 1.800 r.p.m. durante 2 minutos) para precipitar las células, y después se descartó el sobrenadante resultante. Posteriormente, se añadió la muestra de sobrenadante (50µl/pocillo) del cultivo de cada hibridoma clonado en el punto <2-4> descrito más arriba, o anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de ratón SA12 (2�g/50µl) o alternativamente anticuerpo monoclonal humano anti-KLH (50�l/pocillo) como anticuerpo control a cada pocillo. La mezcla se hizo reaccionar durante 30 minutos en un refrigerador. Después de la reacción, se descartó la solución de muestra y cada pocillo se lavó con tampón de fosfato (BSA -PBS al 0,5% que contenía EDTA 5mM).
Posteriormente, se añadió uno cualquiera de los anticuerpos secundarios indicados más abajo a cada pocillo (diluido 1000 veces con el tampón de fosfato anterior y se añadió en una cantidad de 50 �l/pocillo) para suspender las células. La suspensión se hizo reaccionar durante 30 minutos en un refrigerador.
(Anticuerpo secundario)
Anticuerpo anti-IgG humana marcado con biotina (Zymed);
Anticuerpo anti-IgG humana marcado con biotina (Protos);
Anticuerpo anti-IgFc humana marcado con biotina (EY Laboratories); o
Anticuerpo anti-Ig� humana marcado con biotina (Vector).
Después de la reacción, se descartó el anticuerpo secundario y cada pocillo de la placa se lavó con el tampón de fosfato arriba mencionado. Posteriormente, se añadió estreptavidina marcada con ficoeritrina (Streptavidin-PE; Phariningen; diluida 500 veces con el tampón de fosfato arriba mencionado y añadida en una cantidad de 50 µl/pocillo) a cada pocillo. La mezcla se hizo reaccionar durante 30 minutos en un refrigerador. Después de la reacción, cada pocillo se lavó con el tampón de fosfato arriba mencionado. Después, el tampón de fosfato arriba mencionado se añadió a cada pocillo (200µl/pocillo) para suspender las células.
Se realizó el análisis para determinar la reactividad del anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana en el sobrenadante de cultivo de cada clon de hibridoma a las células HPB-ALL que sobreexpresan AILIM humana en cada pocillo.
Se realizó el ensayo de control de la misma manera descrita más arriba utilizando los siguientes puntos:
(1)
Células HPB-ALL de tipo salvaje, en lugar de células HPB-ALL recombinantes que expresan AILIM humana;
(2)
Anticuerpo monoclonal humano contra KLH (hemocianina de Megathura crenulata, PIERCE) en lugar de sobrenadante de hibridoma.
El anticuerpo monoclonal humano anti-KLH se preparó conforme a la misma forma descrita más arriba en el punto <2-1>, inmunizando los ratones transgénicos productores de anticuerpos humanos arriba mencionados con KLH (hemocianina de Megathura crenulata, PIERCE).
En base al resultado, se verificó que todos los clones de hibridoma descritos más arriba en el punto <2-4> eran anticuerpos monoclonales humanos que consistían en cadena pesada obtenida de ser humano y cadena liviana � obtenida de ser humano.
Un ejemplo del resultado se ilustra en la Figura 1, que incluye el resultado del ensayo para los clones de hibridoma AIH5D3 (JMab-136), A11289 (JMab-138) y A11394 (JMab-139).
<3-2> Isotipificación de anticuerpo monoclonal humano
Se determinó el isotipo para cada uno de los anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana producidos por los hibridomas que se habían clonado en el punto <2-4> y analizado en el punto <3-1> descrito más arriba. Se llevó a cabo la determinación utilizando un Kit de Isotipificación de Anticuerpo Monoclonal Humano (American Qualex) de acuerdo con el protocolo experimental anexado al kit.
Se determinó que todos los anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana eran IgG2/�.
Ejemplo 4 Preparación de anticuerpo monoclonal humano contra AILIM humana (anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana) a gran escala y su purificación
<4-1> Método 1
Se añadieron células de cada clon de hibridoma que produce anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana, que se habían preparado en el punto <2-4> descrito más arriba, a un frasco para cultivo de tejidos (50ml, FALCON), y se cultivaron en medio ASF104 (Ajinomoto) que contenía 10% de FBS de IgG de bovino de peso molecular ultra bajo (GIBCO-BRL) hasta confluencia bajo atmósfera de CO2 al 5% a 37°C.
Posteriormente, el líquido de cultivo completo se transfirió a un nuevo frasco para cultivo de tejidos (750ml, FALCON) y las células se cultivaron en medio ASF104 (Ajinomoto) que contenía 10% de FBS de IgG de bovino de peso molecular ultra bajo (GXBCO-BRL) hasta confluencia bajo atmósfera de CO2 al 5% a 37ºC.
10 a 20 días después del cultivo, se recuperó el sobrenadante de cultivo de cada hibridoma y se transfirió a un tubo cónico de polipropileno de 50 ml (FALCON). El tubo se centrifugó a 500xg durante 5 minutos.
Posteriormente, se filtró el sobrenadante centrifugado resultante a través de una Unidad de Filtro de Esterilización (NALGEN) y se recuperó el filtrado.
El filtrado se cargó en una columna de Proteína G HiTrap (Proteína G de columna de afinidad HiTrap; Amersham Pharmacia) preequilibrada con tampón de fosfato (30ml) con un caudal de 3 ml/min.
Posteriormente, se lavó la columna con tampón de fosfato (20ml) y después se eluyó el anticuerpo de interés cargando tampón de citrato 100mM (pH 2,0) en la columna a un caudal bajo de aproximadamente 1ml/min. Posteriormente, la solución eluída se neutralizó con una solución (pH 9,0) de Tris-HCl 750mM, y después se filtró a través de un filtro (Millipore) para eliminar el precipitado blanco. El filtrado resultante se dializó contra tampón de fosfato (toda la noche) y se filtró a través de un filtro (Millipore). De ese modo se obtuvo de cada línea de hibridoma el anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM purificado.
Se determinó la concentración de proteína a partir de la absorbancia a A280 medida utilizando un fotoespectrómetro (1 A280 =1,41 mg/ml).
<4-2> Método 2
La células de cada clon de hibridoma, que había sido preparado en el punto <2-4> descrito más arriba, se acondicionaron en medio ASF104 (Ajinomoto) que contenía 10% de FBS de IgG de bovino de peso molecular ultra bajo (GIBCO-BRL) (12X106 células/ml cada uno), y se colocaron en placa y se cultivaron en Integra Cell Line 1000 (INTEGRA CL1000, INTEGRA BIOSCIENCE). 7 a 10 días después del cultivo, cuando la densidad celular alcanzó 1X108 células/ml, se recuperó el sobrenadante de cada cultivo de hibridoma.
Cada sobrenadante de cultivo se cargó en una columna de Proteína G HiTrap (Proteína G de columna de afinidad HiTrap; Amersham Pharmacia) pre-equilibrada con tampón de fosfato (30m1) a un caudal de 3ml/min.
Posteriormente, se lavó la columna con tampón de fosfato (20ml), y después se cargó tampón de citrato 100mM (pH 2,0) en la columna a un caudal de aproximadamente 1ml/min para eluir el anticuerpo. Después, se añadió una solución (pH 9,0) de Tris-HC1 750mM para neutralizar la solución eluída; y la solución resultante se filtró a través de un filtro (Millipore) para eliminar el precipitado blanco. El filtrado resultante se dializó contra tampón de fosfato (toda la noche) y después se filtró a través de un filtro (Millipore). De ese modo se obtuvo el anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM purificado de cada línea de hibridoma.
Ejemplo 5 Reactividad de anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana frente a AILIM humana, y reactividad cruzada del mismo frente a AILIM de ratón y AILIM de rata
Se analizaron diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana purificados de los anteriores para determinar su reactividad frente a AILIM humana así como la reactividad cruzada frente a AILIM de ratón y AILIM de rata, utilizando el método ELISA celular.
<5-1> Establecimiento del sistema ELISA para determinar la concentración del anticuerpo IgG y preparación de curvas de calibración
Debido a que todos los anticuerpos monoclonales anti-AILIM humana purificados arriba mencionados eran anticuerpos IgG (IgG2), se estableció el sistema ELISA para determinar la concentración del anticuerpo IgG.
Se añadió anticuerpo anti-IgG (Pc) humana de cabra (1,2�g/ml en PBS; 100µl/pocillo; Organon Teknika) a cada pocillo de una microplaca de ELISA de 96 pocillos (Nunc). La placa se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas para absorber el anticuerpo anti-IgG (Pc) sobre la microplaca. Posteriormente, se descartó el sobrenadante y la placa se lavó 3 veces con tampón de fosfato (PBS) que contenía Tween 20 al 0,05%. Se añadió un agente de bloqueo (PBS que contenía 0,5% de albúmina de suero bovino (BSA) y Tween 20 al 0,1%) a cada pocillo (200µl/pocillo) y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas para bloquear los sitios libres del anticuerpo anti-IgG (Pc) sobre la placa. Después, se descartó el reactivo de bloqueo y se lavó cada pocillo dos veces con PBS.
Se añadió anticuerpo IgG2 obtenido de ser humano (50�l/pocillo; The Binding Site), que se utilizó como anticuerpo estándar, a diversas concentraciones (0 a 100ng/ml) a los respectivos pocillos de la placa y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas. Las soluciones excedentes del anticuerpo estándar se eliminaron y cada pocillo se lavó 3 veces con tampón de fosfato que contenía Tween 20 al 0,05%.
Posteriormente, se añadió anticuerpo anti-IgG/x humana de cabra conjugado con peroxidasa a cada pocillo (diluido 4.000 veces, 100 µl/pocillo, Protos) y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora.
El sobrenadante se descartó y la microplaca se lavó 3 veces con tampón de fosfato que contenía Tween 20 al 0,05%. Se añadió un tampón que contenía sustrato (composición: orto-fenilendiamina (O-fenilendiamina, OPD; 20mg) / tampón citrato- fosfato (pH 5,0, 50 ml) / solución acuosa de peróxido de hidrógeno al 30% (15�l)) a cada pocillo (100µl/pocillo) y la placa se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 7 minutos.
Posteriormente, se añadió ácido sulfúrico 2M a cada pocillo (50µl/pocillo) para interrumpir la reacción. Se trazaron las curvas de calibración (Figura 2) en base a los valores de absorbancia medidos a una longitud de onda de 490 nm utilizando un lector de microplacas.
Se realizaron ensayos de control con el medio de cultivo como único reactivo o solución BSA como único reactivo como sustancia de prueba de la misma manera descrita más arriba.
<5-2> Análisis para determinar la reactividad de diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana purificados frente a AILIM humana así como para la reactividad cruzada de los mismos frente a AILIM de ratón y AILIM de rata
<5-2-1> Preparación de reactivos
Los reactivos a ser utilizados en este ELISA celular se prepararon de la
siguiente manera:
<5-2-1-1> Preparación de células CHO recombinantes que sobreexpresan AILIM de ratón
Las células recombinantes CHO que sobreexpresan AILIM de ratón se prepararon y se obtuvieron de la misma manera descrita más arriba en los puntos <11> y <1--3>.
El ADNc (Número de Acceso a GenBank: AB023132 (ADNc); BAA82126 (aminoácido)) que contenía el ORF de longitud completa de AILIM de ratón se insertó en un vector pEF-neo, y después el vector de expresión recombinante resultante se introdujo en células de ovario de hámster chino (células CHO) por un método comúnmente utilizado para electroporación (960 µF, 320 V) utilizando un Pulsador Génico (BioRad). Las células se cultivaron en medio RPMI1640 que contenía Geneticina (0,8mg/ml; Gibco BRL) y 10% de FCS para seleccionar células transformadas resistentes al fármaco, obteniendo de ese modo células CHO recombinantes de ratón que sobreexpresan AILIM.
<5-2-1-2> Preparación de células CHO recombinantes que sobreexpresan AILIM de rata
Las células CHO recombinantes que sobreexpresan AILIM de rata se prepararon y se obtuvieron de la misma manera descrita más arriba en los puntos <11> y <1-3> .
Un ADNc (Número de Acceso a GenBank: AB023134 (ADNc); BAA82128 (aminoácido)) que contenía el ORF de longitud completa de AILIM de rata se insertó en un vector pEF-neo, y después el vector de expresión recombinante resultante se introdujo en células de ovario de hámster chino (células CHO) por un método comúnmente utilizado para electroporación (960 µF, 320 V) utilizando un Pulsador Génico (BioRad). Las células se cultivaron en medio RPMI1640 que contenía Geneticina (0,8mg/ml; Gibco BRL) y 10% de FCS para seleccionar células transformadas resistentes al fármaco, obteniendo de ese modo células CHO recombinantes de rata que sobreexpresan AILIM.
<5-2-1-3> Preparación de anticuerpo monoclonal contra AILIM de ratón
Las células recombinantes CHO que sobreexpresan AILIM de ratón que se habían preparado en el punto <5-2-1-1> descrito más arriba se homogeneizaron, y se sometieron a ultracentrifugación (100.000x g). Se recuperó el pélet resultante que contenía la fracción de membrana celular y después se suspendió en PBS. La fracción de membrana celular resultante se inyectó junto con adyuvante completo de Freund a ratas Wistar en la almohadilla del pie para inmunización primaria (día 0). El antígeno de la fracción de membrana celular además se administró a las ratas en la almohadilla del pie al 7º día, 14º día y 28º día después de la inmunización primaria. Se recolectaron células del ganglio linfático de los mismos 2 días después de la inmunización final.
Las células de ganglio linfático y las células de mieloma de ratón PAI (JCR Núm. B0113; Res. Disclosure, Vol.217, página 155, 1982) se combinaron en una relación 5:1. Las células se fusionaron entre sí utilizando polietilenglicol 4000 (Boehringer Mannheim) como agente de fusión para preparar hibridomas productores de anticuerpo monoclonal. La selección de hibridomas se logró cultivándolas en medio ASF104 (Ajinomoto) que contenía HAT, 10% de suero fetal bovino y aminopterina.
La reactividad del anticuerpo monoclonal de rata en el sobrenadante de cultivo de cada hibridoma frente a AILIM de ratón se determinó haciendo reaccionar el sobrenadante de cultivo con las células CHO que expresan AILIM de ratón arriba mencionadas y midiendo después la intensidad de fluorescencia de las células teñidas con IgG anti-rata marcada con FITC (Cappel) en un citómetro de flujo EPICS-ELITE. La detección arrojó múltiples hibridomas que produjeron anticuerpo monoclonal que poseía reactividad frente a AILIM de ratón.
Entre ellas, una línea de hibridomas se denominó "B10.5." Se inyectaron células de este hibridoma por vía intraperitoneal (106 a 107 células/0,5ml/ratón) a ratones ICR nu/nu (hembra, de 7 a 8 semanas). 10 a 20 días después de la inyección, se recolectaron los ascitis de cada ratón mediante laparotomía bajo anestesia de acuerdo con un método comúnmente utilizado. El anticuerpo monoclonal AILIM B10.5 (IgG1) anti-ratón de rata se preparó a partir del ascitis a gran escala.
<5-2-2> La reactividad del anticuerpo contra AILIM humana de ratón y rata
Las concentraciones del anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana y anticuerpo de control a ser utilizados en el ELISA descrito más abajo se determinaron en base al ELISA y a curvas de calibración del punto <5-1> descrito más arriba.
Cada célula (7x103células/pocillo) de la célula CHO recombinante que sobreexpresa AILIM humana preparada en el Ejemplo 1, la célula CHO recombinante que sobreexpresa AILIM de ratón preparada en el punto <5-2-1-1> descrito más arriba, y la célula CHO recombinante que sobreexpresa AILIM de rata preparada en el punto <5-2-1-2> descrito más arriba se colocaron en pocillos de microplacas ELISA de 96 pocillos y se cultivaron hasta confluencia a 37°C.
Posteriormente, se descartó el sobrenadante, y después se añadió uno cualquiera de los diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana purificados o anticuerpos control preparados más arriba a cada pocillo (concentraciones de anticuerpo: se diluyó anticuerpo de 200µg/ml con PBS que contenía 1% de BSA, 3 veces, 32 veces, 33 veces, 34 veces, 35 veces, 36 veces, 37 veces, 38 veces, 39 veces, 310 veces, 311 veces y 312 veces) en una cantidad de 50�l/pocillo, y las placas se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas. Se descartaron las soluciones de los anticuerpos monoclonales y cada pocillo se lavó 3 veces con tampón de fosfato que contenía 1% de BSA (Sigma) .
Posteriormente, se añadió anticuerpo anti-IgG (Fc) humana conjugado con peroxidasa de rábano a cada pocillo (diluido 1.000 veces, 50�l/pocillo; American Qualex), y la placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora.
La solución excedente del anticuerpo marcado se descartó y las microplacas se lavaron 3 veces con tampón de fosfato que contenía 1% de BSA. Se añadió sustrato que contenía tampón (composición: orto-fenilendiamina (O-fenilendiamina, OPD; 20mg) / tampón de citrato-fosfato (pH 5,0, 50 ml) /solución acuosa de peróxido de hidrógeno al 30% (15�l)) a cada pocillo (100�l/pocillo) y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante aproximadamente 7 minutos.
Posteriormente, se añadió ácido sulfúrico 2M a cada pocillo (50µl/pocillo) para interrumpir la reacción. Se midió la absorbancia a una longitud de onda de 490 nm utilizando un lector de microplacas (Bio-Rad).
Se llevó a cabo el ensayo de control ELISA con los siguientes anticuerpos control para evaluar los anticuerpos arriba mencionados de la misma manera descrita más arriba:
(1)
anticuerpo monoclonal de ratón SA12 o SG430 contra AILIM humana (JP-A 11-29599 (Ejemplo 12) y W098/38216 (Ejemplo 12));
(2)
anticuerpo monoclonal de rata B10.5 contra AILIM de ratón (<5-2-1-3> descrito más arriba);
(3)
anticuerpo monoclonal de ratón JTT2 contra AILIM de rata (anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma, que se ha depositado internacionalmente el 11 de octubre de 1996, bajo el número de acceso internacional FERM BP-5708 en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial, Ministerio de Comercio e Industria Internacional)), que es una autoridad depositaria internacional de acuerdo con el Tratado de Budapest; JP-A 1129599 (Ejemplos 1 y 2) y W098/38216 (Ejemplos 1 y 2)).
(4) El anticuerpo monoclonal humano contra KLH ((hemocianina de Megathura crenulata, PIERCE) preparado más arriba en lugar de sobrenadante de hibridoma.
El experimento de ELISA control se llevó a cabo de la misma manera descrita más arriba utilizando la célula CHO de tipo salvaje que se muestra más abajo, en lugar de células CHO recombinantes que expresan AILIM.
El resultado se muestra en las Figuras 3 a 14.
En base al resultado obtenido, se calculó una concentración efectiva del 50% (ED50:ng/ml) como un índice para la reactividad de cada anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana contra AILIM humana (célula CHO recombinante que sobreexpresa AILIM humana), AILIM de ratón (células recombinantes CHO que sobreexpresan AILIM de ratón) o AILIM de rata (célula CHO recombinante que sobreexpresa AILIM de rata). Los resultados obtenidos mediante el cálculo se muestran más abajo.
(A)
ED50 para CHO que sobreexpresan AILIM humana AIF 34 (JMab-124): 5,3ng/ml AIF182 (JMab-126): 3,6ng/ml AIF348 (JMab-127): 9,1ng/ml AIF620 (JMab-128): 10,1ng/ml AIF1052 (JMab-135): 2,0ng/ml AIH5D3 (JMab-136): 7,5ng/ml AIH386 (JMab-137): 9,6ng/ml AII289 (JMab-138): 10,5ng/ml AII394 (JMab-139): 10,6ng/ml AII488 (JMab-140): 11,0ng/ml AIJ 40 (JMab-141): 3,7ng/ml SA 12: 1,8ng/ml SG430: 1,2ng/ml
(B)
ED50 para CHO que sobreexpresan AILIM de ratón AIF 34 (JMab-124): 42ng/ml AIF348 (JMab-127): 81ng/ml AIF620 (JMab-128): 100ng/ml AII289 (JMab-138): 53ng/ml AII394 (JMab-139): 60ng/ml AII488 (JMab-140): 70ng/ml
(C)
ED50 para CHO que sobreexpresan AILIM de rata
AIF 34 (JMab-124): 45ng/ml
AIF348 (JMab-127): 62ng/ml
AIF620 (JMab-128): 97ng/ml
AII289 (JMab-138): 57ng/ml
AII394 (JMab-139): 90ng/ml
AII488 (JMab-140): 90ng/ml
El resultado mostró que los anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana de la presente invención exhibieron especificidades significativamente altas para AILIM humana.
Además, se ha revelado que 6 tipos de anticuerpos monoclonales anti-AILIM
humana(quesemuestranmásarribaenelpunto(B) y(C)) sonreactivostantofrentea daiin
AILIM de ratón como AILIM de rata (capacidad de unión, reactividad cruzada).
f
Ejmpo 6 Demin de ad y a
óinac
ter
le
icuerpo ltean
itzan
lteura
daiivtc
d ne d
tn
molhmao a
n
La constante de velocidad de unión (ka), constante de velocidad de disociación
u
(kd) y constante de disociación (Kd) con respecto a la reacción entre cada uno de los
lnoconadiversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana purificados
preparados más arriba y AILIM humana se determinaron utilizando un kit Biacore X
comercialmente disponible (Amersham Pharmacia).
<6-1> Preparación del antígeno a ser inmovilizado en el chip sensor
Se preparó el antígeno a ser inmovilizado en el chip sensor en el kit así como un antígeno quimérico recombinante (de aquí en adelante denominado "AILIM humana-IgFc ") que consiste en la región extracelular de AILIM humana y la región constante (Fc) de IgG1 humana.
Se preparó AILIM humana-IgFc purificando además el antígeno obtenido de acuerdo con el método descrito en solicitudes anteriores (JP-A 11-29599 (Ejemplo 16 (2)) y W098/38216 (Ejemplo 16 (2)) por uno de los presentes inventores, Tezuka.
El sobrenadante de cultivo de las células recombinantes que producen AILIM humana-IgFc se cargó en una columna de Proteína G HiTrap (Proteína G de columna de afinidad HiTrap; Amersham-Pharmacia) pre-equilibrada con tampón de fosfato (30ml) a un caudal de 3ml/min para absorber AILIM humana-IgFc en el sobrenadante de cultivo en la columna.
Posteriormente, se lavó la columna con tampón de fosfato (20ml), y después se cargó tampón de citrato 100mM (pH 2,0) en la columna a un caudal de
)
na
u
o(AILIM hma
ígentnl
tonr
n
u
i
-AILIM hmaa ca e a
aproximadamente 1ml/min para eluir la AILIM humana-IgFc. Posteriormente, la solución eluída se neutralizó con una solución (pH 9,0) de Tris-HCl 750mM, y después se dializó contra tampón de fosfato (toda la noche). Después, la solución dializada se filtró a través de un filtro (Millipore). De ese modo se obtuvo anti-AILIM humana-IgFc purificada.
La concentración de proteína se determinó a partir de la absorbancia A280 medida utilizando un fotoespectrómetro (1 A280 = 1mg/ml). Se determinó que la concentración de AILIM humana-IgFc era 0,28mg/ml.
La proteína quimérica purificada que consiste en la región extracelular de AILIM de rata y la región constante (Fc) de IgG1 humana (AILIM de rata-IgFc; JP-A 1129599 (Ejemplo 16 (2)) y W098/38216 (Ejemplo 16 (2)) también se preparó de la misma manera descrita más arriba. Se determinó que la concentración de AILIM de rata-IgFc obtenida era 0,45mg/ml.
<6-2> Determinación de la afinidad y la actividad neutralizante
Los métodos experimentales, con excepción de la inmovilización del antígeno (AILIM humana-IgFc) sobre el chip sensor, que se describe más abajo, se basaron en el manual de instrucciones y protocolo experimental anexado al kit de ensayo Biacore X comercialmente disponible (Amersham-Pharmacia).
Se permitió que el tampón HBS (que contenía HEPES 0,01M, NaCl 0,15M, EDTA 3mM y detergente P20 al 0,005%, (pH 7,0)) fluyera a través de una Celda de Flujo-1 anexada al kit a un caudal de 5µl/min. Posteriormente, se añadió una solución (15µl) que contenía NHS (N-hidroxisuccinimida) 0,005M y EDC (N-etil-N'- (dimetilaminopropil)carbodiimida) 0,2M para activar los grupos carboxilo de CM que revestían la superficie del chip sensor.
Posteriormente, se añadieron 23µl de solución de AILIM humana-IgFc (10µg/ml; disuelta en tampón de acetato de sodio 10mM (pH 5,0)) para inmovilizar la AILIM humana-lgFc sobre el chip sensor. Posteriormente, los grupos carboxilo activados sin reaccionar se bloquearon añadiendo 35µl de hidrocloruro de etanolamina 1M. Las cantidades de AILIM humana-IgFc inmovilizada mediante el tratamiento de inmovilización realizado dos veces fueron 2.444RU (unidades de resonancia) y 2.213RU, respectivamente. La unidad, RU, corresponde a la masa por unidad de área; 1 RU = 1pg/mm2.
La Celda de Flujo-2, que es una celda de flujo de referencia, se sometió al tratamiento de revestimiento en ausencia de AILIM humana-IgFc de la misma manera descrita más arriba.
Se permitió que el tampón de fosfato fluyera a través de la celda de flujo (chip sensor) a un caudal de 20�l/min, y se añadió al mismo (10 a 50µg/ml, 60µl) cada uno de los anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana purificados, que se habían preparado en el Ejemplo más arriba.
Las condiciones estándar para la medición fueron: fase de asociación durante 3 minutos y fase de disociación durante 10 minutos. Las cantidades respectivas de anticuerpo unido a y liberado del antígeno se monitorearon en el tiempo para obtener un sensograma. La disociación del anticuerpo del antígeno se logró corriendo PBS a través del chip sensor a un caudal de 20�l/min.
En base a los datos del sensograma resultante, se computaron la constante de velocidad de asociación (ka), constante de velocidad de disociación (kd) y constante de disociación (Kd; Kd=kd/ka) utilizando el software analítico (BlAevaluation 3.0) anexado al kit
También se analizaron la afinidad y la actividad neutralizante de los anticuerpos monoclonales de ratón SA12 y SG430 contra AILIM humana preparada en el Ejemplo descrito más arriba de la misma manera descrita más arriba.
Los valores respectivos obtenidos se muestran a continuación. <Nombre del clon> <ka (1/M.Seg.)> <kd[l/Seg.> <Kd (M)> AIF 34 (JMab-124) 1,6x104 1,0x10-4 6,3x10-9 AIF182 (JMab-126) 3,2x104 2,8x10-5 8,8x10-10 AIF348 (JMab-127) 1,9X104 6,4X10-5 3,4x10-9 AIF620 (JMab-128) 1,1x104 1,1x10-4 1,0x10-8 AIF1052 (JMab-135) 1,6x104 6,3X10-5 3,9x10-9 AIH5D3 (JMab-136) 2,8x104 4,9x10 –6 1,8x10-10 AIH386 (JMab-137) 1,2x105 3,1x10-4 2,6x10-9 AII289 (JMab-138) 3,7x104 4,2x10-5 1,1x10-9 AII394 (JMab-139) 3,1x104 2,4xl0-5 7,7x10-10 AII488 (JMab-140) 2,3x104 3,5x10-5 1,5x10-9 AIJ 40 (JMab-141) 1,9x104 1,9x10-5 1,0x10-9 SA 12 7,8x103 7,9x10-5 1,0X10-8 SG430 2,2x104 1,5x10-4 6,8x10-9 El resultado muestra que todos los anticuerpos monoclonales humanos anti-
AILIM humana y anticuerpos monoclonales anti-AILIM humana de ratón exhiben afinidad de unión marcadamente alta y actividad neutralizante contra AILIM humana. Ejemplo 7 Actividad del anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana
para transducir señales coestimuladoras en células T humanas
Se analizó si los anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana de acuerdo con la presente invención tenían o no la capacidad de controlar (potenciar y/o inhibir) las respuestas de las células T humanas (producción de citoquinas tales como IFN-� e IL-4, proliferación celular, etc.); en otras palabras, si los anticuerpos exhibían o no actividad reguladora sobre la transducción celular de señales coestimuladoras mediadas por AILIM. El análisis se llevó a cabo en base a la cantidad de citoquinas (IFN-� e IL-4) producidas en células T humanas así como el grado de proliferación de células T humanas como índice.
<7-1> Dilución del anticuerpo
El anticuerpo monoclonal OKT3 anti-CD3 humana (ATCC CRL-8001) se diluyó con tampón de fosfato (PBS) hasta la concentración final de 8µg/ml.
Cada uno de los diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana preparados más arriba se diluyó con PBS hasta una concentración final de 40µg/ml. Las soluciones del anticuerpos además se diluyeron con PBS para preparar diversas concentraciones de anticuerpos (40µg/ml-0,0049µg/ml).
<7-2> Revestimiento de microplaca con anticuerpo
Cada pocillo de microplacas de 96 pocillos se revistió con (1) anticuerpo monoclonal OKT3 anti-CD3 humana (8�g/ml; 25µl a cada pocillo) y uno cualquiera de los diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana (40µg/ml0,0049µg/ml; 25�l a cada pocillo), o (2) anticuerpo monoclonal OKT3 anti-CD3 humana (8�g/ml; 25�l a cada pocillo) como único reactivo. La placas se incubaron a 37° durante 2 horas. Posteriormente, se descartaron las soluciones de anticuerpo y cada pocillo se lavó 3 veces con PBS. Después del lavado, se añadió medio RPMI1640 que contenía 10% de FCS a cada pocillo (100µl/pocillo) y las placas se incubaron a 37° durante 1 hora. De ese modo, los pocillos respectivos de las placas se revistieron con los anticuerpos mencionados más arriba en el punto (1) o (2).
Se llevaron a cabo experimentos de control de la misma manera utilizando placas revestidas con los siguientes respectivos anticuerpos monoclonales como anticuerpos control en lugar de los anticuerpos monoclonales anti-AILIM humana.
(1)
anticuerpo monoclonal de ratón SA12 o SG430 contra AILIM humana (JPA 11-29599 (Ejemplo 12) y WO98/38216 (Ejemplo 12));
(2)
anticuerpo monoclonal JHC1 anti-CETP humana (también denominado JMab109; JP-A 9-20800) ; y
(3) Anticuerpo monoclonal humano anti-KLH (también denominado JMab23; el
Ejemplo arriba mencionado).
Se utilizaron las microplacas revestidas con los anticuerpos en los siguientes ensayos.
<7-3> Preparación de suspensión de células T humanas
Se recolectó sangre periférica de cada persona saludable normal (5 personas; donante A, B, C, D y E). Se preparó la fracción que contenía células mononucleares mediante centrifugación con gradiente de densidad utilizando LymphoPrep (Nycomed). Se separaron las células T humanas de la fracción celular mononuclear humana de acuerdo con el manual para el procedimiento experimental utilizando un kit de Aislamiento Pan-células T (Miltenyi) y Clasificador Magnético. El recuento de células T se determinó utilizando un hemacitómetro. Las células T humanas se suspendieron en medio RPMI1640 que contenía 10% de FCS para preparar una suspensión de células T humanas (1x106 células/ml).
<7-4> Cultivo de células
(1) Cultivo utilizando microplaca revestida con anticuerpo anti-CD3 humana y anticuerpo anti-AILIM humana
Se añadió suspensión de células T humanas (donante A, B, C, D o E; 100µl/pocillo; 1x105 células/pocillo) a cada pocillo de la microplaca revestida con el anticuerpo mencionado más arriba y la placa se incubó a 37°C durante 3 días en una incubadora de CO2.
Después del cultivo, se almacenaron alícuotas del sobrenadante de cultivos resultante (50�l) a -20°C y después se utilizaron en el ensayo descrito más adelante (ensayo para IFN�). Después del muestreo de las alícuotas de los sobrenadantes de cultivo, se utilizaron las respectivas microplacas para el siguiente ensayo:
(2) Cultivo utilizando microplaca revestida con anticuerpo anti-CD3 humana como único reactivo.
Se añadió suspensión de células T humanas (donante D; 100µl/pocillo; 1x105 células/pocillo) a cada pocillo de las microplacas revestidas con el anticuerpo arriba mencionado y después se añadió a las mismas uno cualquiera de los diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana (25�l del anticuerpo de 40µg/ml-0,0049�g/ml). Las placas se incubaron a 37°C durante 3 días en una incubadora de CO2.
<7-5> Determinación de la actividad de proliferación de células T Se añadió metil [3H]timidina (0,5�Ci/pocillo; Amersham-Pharmacia) a cada pocillo de las placas después de la incubación, y la placas se incubaron a 37°C
durante 6 horas en una incubadora de CO2. Después de la incubación, las células se atraparon en filtros GF/C (Packard) utilizando una Cosechadora de Células. Posteriormente, se secaron los filtros a 40°C durante 3 horas o más, y después se añadió Microscinti 0 (20µl/pocillo; Packard) a los mismos. Se midió la radioactividad del 3H incorporado de las células atrapadas en los filtros mediante un contador � (TOP COUNT) para analizar el grado de proliferación de células T después del cultivo.
Los resultados se muestran en las Figuras 15 a 39.
El resultado de ese ensayo mostró que las células T humanas proliferaron considerablemente dependiendo de la concentración de las células cuando las microplacas se revistieron con anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana (anticuerpo monoclonal humano o anticuerpo monoclonal de ratón) junto con anticuerpo anti-CD3 humana. Además, hubo algunas diferencias en el grado de proliferación celular entre los donantes.
Por otra parte, las células T humanas no crecieron considerablemente cuando las placas se habían revestido con anticuerpo anti-CD3 humana como único reactivo y se utilizó anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana (anticuerpo monoclonal humano o anticuerpo monoclonal de ratón) en solución (fase líquida) durante el cultivo de las células.
<7-6> Cuantificación de IFN� en sobrenadante de cultivo de célula T
Para los respectivos cultivos de células T (donantes B y C) descritos en el punto (1) de <7-4>, las cantidades de IFN� en el sobrenadante de cultivos se determinaron mediante un kit ELISA para IFN� humano comercialmente disponible (Amersham-Pharmacia; Endogen)
Los resultados se muestran en las Figuras 40 a 47.
El resultado de este ensayo mostró que la producción de IFN� se incrementó considerablemente dependiendo de la concentración de anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana (anticuerpo monoclonal humano o anticuerpo monoclonal de ratón).
Ejemplo 8 Actividad reguladora del anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana sobre la reacción linfocitaria mixta (MLR)
Se ensayó si los anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana de la presente invención eran capaces o no de controlar (potenciar y/o inhibir) las respuestas de las células T (producción de citoquinas tales como IFN-� e IL-4, proliferación celular, etc.); en otras palabras, capaces de regular la transducción de señales coestimuladoras mediadas por AILIM a células, analizando la actividad (a saber, síntesis de ADN en células) de control de la proliferación de células T asociada
con la reacción alogénica linfocitaria mixta (MLR alogénica) como índice.
<8-1> Preparación de PBMC y células T humanas
La sangre periférica (200ml) recolectada de cada persona saludable normal (7 personas; donantes A, B, C, D, E, F y G) se dispensó sobre las capas de Lymphoprep (15ml; Nycomed) en microtubos (50ml; Falcon). Después de la centrifugación (a 1600rpm durante 10 minutos), se recuperaron las capas intermedias. Las células recuperadas se diluyeron 2 veces o más con tampón de fosfato y después se centrifugaron (a 1.800rpm durante 10 minutos). De ese modo, se prepararon PBMC (células mononucleares de sangre periférica; 2x108-5x108 células). Se determinó el recuento de células utilizando un hemacitómetro. Se tomó una alícuota de las células a ser utilizadas en el ensayo MLR (1,08x108 células / 9 microplacas) y se mantuvo en hielo. Las células restantes se utilizaron para la separación de células T que se describe más abajo.
Se utilizó el kit de aislamiento PanT (Miltenyi Biotech) para la separación de células T de PBMC. De acuerdo con el manual anexado al kit, las PBMCs remanentes se añadieron a una solución anexada al kit y se incubó la solución. Posteriormente, se lavaron las células con PBS que contenía EDTA 5mM y BSA al 0,5% y después se resuspendieron en PBS. Posteriormente, se añadió la suspensión de células a una Columna de Selección Positiva VS+ (Miltenyi Biotech) hinchada con PBS, y se recuperó la fracción no absorbida. Además, se cargó PBS en la columna, y se recuperó la solución de lavado. El mismo tratamiento se repitió una vez. Las soluciones recuperadas se combinaron para dar una fracción de células T. Después de la centrifugación de la fracción de células T, las células se resuspendieron en PBS. El recuento de células de las células T resultantes se determinó utilizando un hemacitómetro. Las células se utilizaron en el siguiente ensayo.
<8-2> Reacción linfocitaria mixta (MLR)
Según se describió más arriba, dos vías de señalización, una entre CD28 y CD80 (B7-1)/CD86 (B7-2) y la otra entre CTLA4 y CD80 (B7-1)/CD86 (B7-2), para la que se había realizado previamente un análisis comparativamente detallado, se conocen como vías de señalización coestimuladora requeridas para la activación de linfocitos tales como células T, etc.
A saber, la proliferación de células T en respuesta a la reacción linfocitaria mixta (MLR) puede inducirse mediante la transducción de señales a través de cada una de las dos vías conocidas.
De ese modo, utilizando las sustancias indicadas más abajo, se realizó el ensayo de la presente invención para analizar (1) la inhibición de MLR bloqueando la vía de señalización medida por CTLA4; (2) la inhibición de MLR bloqueando la vía de señalización mediada por CD80 (B7-1)/CD86 (B7-2); (3) la inhibición de MLR bloqueando ambas vías mediadas por CTLA4 y la vía de señalización mediada por CD80 (B7-1)/CD86 (87-2); (4) la inhibición de MLR bloqueando la vía de señalización terciaria asociada con AILIM; y (5) la inhibición de MLR bloqueando ambas vías, la mediada por CTLA4 y la mediada por AILIM.
Se utilizaron las siguientes sustancias de ensayo.
(1)
Anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana (preparado en el Ejemplo descrito más arriba);
(2)
Anticuerpo monoclonal de ratón SA12 anti-AILIM humana (el mismo que en el Ejemplo anterior);
(3)
Anticuerpo monoclonal humano anti-KLH (control negativo; el mismo que en el Ejemplo anterior);
(4)
Anticuerpo IgG de ratón (anti-CD34 humana; control negativo; Immunotech);
(5)
Una mezcla de anticuerpo monoclonal anti-CD80 humana (Pharmingen) y anticuerpo monoclonal anti-CD86 humana (Pharmingen); y
(6) Una molécula quimérica CTLA4-IgFc humana (Ancell).
La reacción linfocitaria mixta (MLR) se realizó sobre las siguientes 6 combinaciones utilizando PBMCs y células T preparadas a partir de los donantes que se describen más arriba en el apartado <8-1>.
(i)
células T (donante A)/PBMC (donante D)
(ii)
células T (donante D)/PBMC (donante B)
(ii)
células T (donante C)/PBMC (donante A)
(iii) células T (donante E)/PBMC (donante G)
(iv) células T (donante F)/PBMC (donante E)
(v) células T (donante G)/PBMC (donante F) Las concentraciones de PBMCs y células T a ser utilizadas en el ensayo se ajustaron según lo descrito más abajo.
Se suspendieron PBMCs en PBS, y después se transfirieron a platos de cultivo (60 mm). Las células se sometieron a irradiación de rayos X (50 Gy) con un irradiador (Hitachi MEDICO). Se recuperaron las células, se centrifugaron y después se añadieron a medio PRMI1640 que contenía 10% de FCS. Se ajustó el recuento celular a 2X105 células/50�l.
También se añadieron las células T resultantes de cada donante al medio PRMI1640 que contenía 10% de FCS y se ajustó el recuento de células a 1x105 células/50µl.
<8-2-1> Inhibición de MLR por anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana
Se añadió medio PRMI1640 que contenía 10% de FCS a cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos que poseía pocillos con forma de U. Se diluyó una solución de anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana o anticuerpo monoclonal de ratón SA12 anti-AILIM humana con medio PRMI1640 que contenía 10% de FCS para preparar soluciones con diversas concentraciones del anticuerpo. Las soluciones diluidas de anticuerpos se añadieron a los pocillos (concentración final: 0, 0,31, 1,25, 5 y 20µg/ml). Posteriormente, se añadieron células T (50µl) a los pocillos. La placa se incubó a 37°C durante 1 hora en una incubadora de CO2 (NAPCO). Después de completada la reacción, se añadieron las PBMCs (50�l) obtenidas de un donante diferente a los pocillos para iniciar la MLR.
Cuando se realizó la MLR utilizando un anticuerpo distinto del anticuerpo humano anti-AILIM humana (descrito más arriba en los puntos (3) a (6)) como sustancia de ensayo, se permitió que las células T obtenidas de un donante diferente reaccionaran después de la incubación de las PBMCs con la sustancia de ensayo.
Al quinto día del cultivo, se añadió timidina marcada con tritio (3H-Timidina; 20�l; 1�Ci/pocillo) diluida con medio PRMI1640 que contenía 10% de FCS a cada pocillo. Se continuó el cultivo durante un día. Después de completado el cultivo, las células se cosecharon utilizando una Cosechadora de Células (Packard). Se midió la radioactividad del 3H incorporado a las células en un contador � (TOP COUNT; Packard) para analizar el índice de proliferación de células T después del cultivo.
Los resultados se muestran en las Figuras 48 a 59.
<8-2-2> Inhibición de MLR mediante el anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana en el sistema de MLR en el que la vía de señalización mediada por CTLA4 se ha bloqueado previamente
Se añadió medio PRMI1640 que contenía 10% de FCS a cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos que poseía pocillos con forma de U. Se diluyó una solución de anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana o anticuerpo monoclonal de ratón SA12 anti-AILIM humana con medio PRMI1640 que contenía 10% de FCS para preparar soluciones con diversas concentraciones del anticuerpo. Se añadieron las soluciones diluidas del anticuerpo a los pocillos (concentración final: 0, 0,31, 1,25, 5 y 20µg/ml). Posteriormente, se añadieron células T (50�l) a los pocillos. La placa se incubó a 370C durante 1 hora en una incubadora de CO2 (NAPCO).
Además del cultivo de las células T, se cultivaron las PBMCs (en medio RPMI1640 que contenía 10% de FCS) obtenidas de otros donantes independientemente después de añadir CTLA4-IgFc humana a las PBMCs. El cultivo se llevó a cabo a 37°C durante 1 hora en una incubadora de CO2 (NAPCO). La concentración de CTLA4-IgFc se ajustó a 20µg/ml al comienzo de la MLR.
Posteriormente, se añadieron PBMCs (50�l) al cultivo de células T descrito más arriba para iniciar la MLR.
Cuando se realizó la MLR utilizando un anticuerpo distinto del anticuerpo humano anti-AILIM humana (descrito más arriba en los puntos (3) a (5)) como sustancia de ensayo, se permitió que las células T obtenidas de un donante diferente reaccionaran después de la incubación de PBMCs, que se habían cultivado en presencia de CTLA4-IgFc, con la sustancia de ensayo.
Al quinto día del cultivo, se añadió timidina marcada con tritio (3H-Timidina; 20µl; 1µCi/pocillo) diluida con medio PRMI1640 que contenía 10% de FCS a cada pocillo. Se continuó el cultivo durante un día. Después de completado el cultivo, las células se cosecharon utilizando una Cosechadora de Células (Packard). Se midió la radioactividad del 3H incorporado a las células en un contador � (TOP COUNT; Packard) para analizar el índice de proliferación de células T después del cultivo.
Los resultados se muestran en las Figuras 60 a 69.
Los resultados obtenidos de los dos ensayos descritos más arriba se resumen a continuación:
(1)
CTLA4-IgFc bloquea la transducción de señales mediada por CTLA-4, e inhibiendo de ese modo la proliferación de células T inducida por la MLR alogénica.
(2)
El anticuerpo anti-CD80 y el anticuerpo anti-CD86 inhiben la transducción de señales mediada por CD80/CD86, que es un ligando para CTLA4 y CD28, e inhibiendo de ese modo la proliferación de células T inducida por la MLR alogénica.
(3)
Un anticuerpo monoclonal contra AILIM humana, como CTLA4-IgFc, anticuerpo anti-CD80 y anticuerpo anti-CD86, inhibe significativamente la proliferación de células T inducida por la MLR alogénica asociada con la transducción de señales mediada por AILIM de una manera dependiente de la concentración del anticuerpo.
En otras palabras, estos resultados muestran que existe una vía terciaria mediada por AILIM y el ligando de la misma además de las vías conocidas mediadas por CTLA4/CD80/CD86 y mediadas por CD28/CD80/CD86, como vías de señalización coestimuladora requeridas para la activación de células T, así como que la vía de señalización mediada por AILIM es inhibida por el anticuerpo contra AILIM.
Además, surge la posibilidad de que la contribución de la vía mediada por AILIM a la transducción de señales puede ser comparable con la de la vía mediada por CTLA4/CD80/CD86 y la vía mediada por CD28/CD80/CD86.
Ejemplo 9 Actividad del anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana para inducir la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC)
Las actividades biológicas causadas por anticuerpos incluyen la inducción de la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). La ADCC es una acción citotóxica que requiere el anticuerpo además de las células efectoras y células diana, que induce daño en las células diana inducidas por las células efectoras tales como linfocitos, macrófagos o leucocitos polimorfonucleares.
Se analizó la actividad del anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana de la presente invención para inducir ADCC de la siguiente manera:
Se añadió 51Cr (0,1 mCi/106 células; Amersham-Pharmacia) al cultivo de células HPB-ALL recombinantes que sobreexpresa AILIM humana preparado en el Ejemplo descrito más arriba, y la mezcla se incubó a 37°C durante 2 horas. Se lavaron las células 8 veces con medio RPMI1640. Las células marcadas con isótopo obtenidas se utilizaron como células diana.
Se realizaron los experimentos de control utilizando células HPB-ALL humanas de tipo salvaje marcadas con el isótopo como células control de la misma manera descrita más arriba.
Utilizando Lymphosepar I (IBL), se separaron las fracciones de PBMC de la sangre periférica recolectada de personas saludables normales. Las PBMCs humanas resultantes se utilizaron como células efectoras.
Se colocaron células diana (1x104 células/pocillo; 25�l/pocillo) sobre cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos (Nunc) que poseía pocillos con forma de U. Posteriormente, se añadió una cualquiera de las diversas concentraciones de anticuerpos monoclonales anti-AILIM humana diluidos con medio RPMI1640 que contenía FBS al 5% (0,0001-1,0�g/ml; 25�l/pocillo), el medio solo (25µl/pocillo) o Nonidet P-40 al 1% (25 �l /pocillo; detergente que posee actividad de lisado celular) a cada pocillo y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos.
Se llevó a cabo el cultivo utilizando anticuerpo monoclonal OKT3 anti-CD3 humana (ATCC CRL-8001) como anticuerpo control positivo en lugar de anticuerpo
anti-AILIM humana de la misma manera descrita más arriba.
Posteriormente, se añadieron células efectoras (relación E/T=50; 1x105 células/pocillo; 50µl/pocillo) a cada pocillo y la placa se incubó a 37°C durante 16 horas bajo una atmósfera de CO2 al 5% en una incubadora.
Después del cultivo, las muestras se centrifugaron (a 1.500rpm a 4°C durante 10 minutos). El sobrenadante resultante se recuperó. La radioactividad en el sobrenadante centrifugado se midió mediante un contador �. La radioactividad representa la cantidad de 51Cr liberado de las células en el sobrenadante de cultivo por el daño provocado a la membrana celular por la ADCC.
El porcentaje de daño a la membrana celular (lisis celular porcentual), que fue causado por la ADCC inducida por el anticuerpo anti-AILIM o el anticuerpo anti-CD3, se determinó bajo el supuesto de que la radioactividad observada con el medio solo corresponde al 0% con respecto al daño a la membrana celular (0) y que con Nonidet corresponde al 100% con respecto al daño a la membrana celular.
Los resultados se muestran en las Figuras 70 y 71.
El resultado del ensayo mostró que el anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana de la presente invención exhibió actividad de inducción por ADCC de una manera dependiente de la concentración.
Ejemplo 10 Determinación del gen y de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana y análisis de los mismos
Las secuencias de ADNcs que codifican las cadenas pesadas así como los ADNcs que codifican las cadenas livianas de diversos anticuerpos monoclonales humanos anti-AILIM humana, que se habían preparado en el Ejemplo descrito más arriba, se determinaron según se describe a continuación. También se analizaron las características estructurales de los genes.
Utilizando el Kit de Purificación de ARNm QuickPrep (Amersham-Pharmacia), se extrajeron PoliA+ARNs y se purificaron a partir de cada uno de los hibridomas (clones: AIH5D3 (JMab-136), AII289. (JMab-138) y AII394 (JMab-139)), que producen anticuerpo monoclonal humano contra AILIM humana preparados en el Ejemplo descrito más arriba.
Las células de hibridoma se suspendieron en un tampón de lisis celular (Tampón de Lisis), y se lisaron utilizando una jeringa para solubilizarlas. Se añadió resina Oligo (dT) al material solubilizado y la mezcla se agitó suavemente. Posteriormente, se lavó la resina Oligo (dT), y después PoliA+ARN, se eluyó con Tampón de Elución. El PoliA4ARN eluído se precipitó con etanol, y después se disolvió en tampón Tris-EDTA. La concentración del PoliA+ARN obtenido se determinó por absorbancia a una longitud de onda de 260 nm.
Se sintetizó el ADNc de doble hebra utilizando PoliA+ARN, como plantilla de acuerdo con el método de Transcriptasa Inversa M-MLV utilizando un kit de síntesis de ADNc comercialmente disponible (GIBCOBRL) y NotI-T de oligo ADN sintético (SEQ ID NO: 1) como cebador.
Específicamente, se sintetizó ADNc monocatenario en una solución (aproximadamente 50�l) que contenía PoliA+ARN (aproximadamente 50�g) purificado de los hibridomas como plantilla, el cebador (aproximadamente 400 pmoles) y Transcriptasa Inversa M-MLV a 37°C durante 1 hora. Posteriormente, se añadieron dNTP, ADN polimerasa I, RNaseH, ADN ligasa, tampón y agua destilada a la solución de reacción (4�l), y la mezcla se incubó a 16°C durante 2 horas para sintetizar el ADNc de doble hebra. El ADNc de doble hebra resultante se extrajo con fenol/cloroformo y después se precipitó con etanol.
Posteriormente, se añadió ADN conector EcoRl (aproximadamente 300 pmoles) y ADN ligasa (Alta ligación; 33�l; TOYOBO) a la solución que contenía el ADNc de doble hebra en tampón TE (aproximadamente 50�l) y la mezcla se incubó a 16°C durante aproximadamente 80 minutos para ligar el ADNc con el ADN conector. El ADN conector utilizado era un ADN de doble hebra que consistía en oligo ADN (20adp; SEQ ID NO: 2) y oligo ADN (24adp; SEQ ID NO: 3), que habían sido fosforilados en 5' y alineados uno con otro mediante un método comúnmente utilizado.
La ligadura de ADN se extrajo con fenol/cloroformo, y después se precipitó con etanol. Posteriormente, el ADN reactivo se digirió con una enzima de restricción Notl comercialmente disponible (TOYOBO), y después se incubó con una solución de ATP comercialmente disponible (GIBCO BRL) y T4 quinasa (TOYOBO) a 37°C durante 30 minutos para fosforilar el extremo 5' del mismo.
El ADN resultante se precipitó con etanol y después se fraccionó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. Se cortó un trozo de gel que contenía ADN de aproximadamente 500 pb a 2000 pb. El corte del gel se llevó a cabo mientras el ADN teñido con bromuro de etidio se visualizaba irradiando luz UV en un dispositivo fotográfico.
El gel cortado se trituró y después se suspendió en tampón TE. La suspensión se centrifugó y se recuperó el sobrenadante resultante.
El ADN recuperado se ligó a un vector fago lambda �EXcell comercialmente disponible (0,25�g; Amersham Pharmacia) en presencia de ADN Ligasa comercialmente disponible (Ligation High; TOYOBO) (a 16°C durante 30 minutos). En la siguiente etapa, la ligadura de ADN se empacó en fago lambda utilizando un kit de empacado de fago lambda Gigapack III Gold comercialmente disponible (STRATAGENE) y las partículas de fago resultantes se infectaron en E. coli NM522 como huésped para preparar una biblioteca de ADNc. Todas las manipulaciones se realizaron de acuerdo con el protocolo experimental anexado al kit.
Posteriormente, la biblioteca de ADNc se detectó mediante un método de hibridización de plaquetas (Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Labolatory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York) de la siguiente manera:
La biblioteca de ADNc (1x104 placas) se colocó en placas de agar y los filtros de réplica de las mismas se prepararon utilizando membranas de nylon Hybond-N (Amersharn Pharmacia). Estos filtros de réplica se sometieron a tratamiento de hibridización utilizando sondas marcadas utilizando �32P-ATP en un tampón de hibridización de acuerdo con el método de hibridización de placas. Las sondas utilizadas fueron HIGLC (SEQ ID NO: 4) para la cadena liviana del anticuerpo y NHCc2 (SEQ ID NO: 5) para la cadena pesada del anticuerpo. Se llevó a cabo el aislamiento de placas únicas a partir de los clones positivos obtenidos en la detección primaria y detección secundaria.
Tanto la cadena pesada como la cadena liviana del anticuerpo se amplificaron mediante PCR utilizando un cebador de PCR único y el kit Taq PCR (TAKARA) utilizando suspensión de fagos de cada clon positivo como ADN plantilla. Un par de cebadores utilizados para la cadena liviana del anticuerpo fueron ExcellE (SEQ ID NO: 6) y ckll7 (SEQ ID NO: 7), y un par de cebadores utilizados para la cadena pesada del anticuerpo fueron ExcellE (SEQ ID NO: 6) y NHCc2 (SEQ ID NO: 5). Los productos de PCR resultantes fueron fraccionados de acuerdo con un método usual que utiliza electroforesis en gel de agarosa. Se cortaron trozos de gel que contenían ADNs de aproximadamente 600 pb correspondientes a la cadena pesada y la cadena liviana. Las secuencias de nucleótidos de los ADNs purificados del gel se analizaron utilizando un Secuenciador de ADN (373A; PE-Applied Biosystems), Software de secuenciación ABI PRISM (PE-Applied Biosystems) y Auto Ensamblador ABI PRISM (PE-Applied Biosystems). Se verificó que el ADN de cada clon positivo tuviera suficiente longitud de secuencia de nucleótidos.
El Fago � de la placa de cada clon positivo se infectó en E. coli NP66 para la excisión in-vivo del ADN plásmido de interés, y los fagos filametosos resultantes se colocaron en placas que contenían ampicilina para dar colonias. Posteriormente, los ADNs plásmidos se recuperaron y purificaron a partir de las colonias mediante un método comúnmente utilizado, y E. coli JM109 se transformó con los plásmidos. Posteriormente, las células transformadas se colocaron en placas de agar nutriente que contenían ampicilina para formar colonias.
Posteriormente, la suspensión bacteriana en medio LB que contenía ampicilina obtenida de cada colonia se transfirió a un medio líquido nutriente y las bacterias se cultivaron a 37°C durante 24 horas. Las bacterias se cosecharon del cultivo, y después se purificó el ADN plásmido mediante un kit de purificación de plásmidos (Quiagen). Se digirió cada uno de los ADNs plásmidos con enzimas de restricción EcoRI/Notl para verificar la presencia de ADN vector e insertar el ADN (ADNc de cadena pesada o ADNc de cadena liviana).
Cada secuencia de nucleótidos de ADNc que codifica la cadena pesada y la cadena liviana del anticuerpo, que se insertó en cada plásmido purificado, se determinó mediante un método comúnmente utilizado utilizando Secuenciador de ADN (377A; PE-Applied Biosystems), Software de Secuenciación ABI PRISM (PE-Applied Biosystems) y Auto Ensamblador ABI PRISM (PE-Applied Biosystems).
Los cebadores utilizados para la determinación de secuencias fueron los siguientes:
<Cebadores utilizados para la determinación de ADNc de cadena pesada >
Cebador M13R (SEQ ID NO: 8; STRATAGENE), ExcellE (SEQ ID NO: 6), 136H (SEQ ID NO: 9), 138/9H (SEQ ID NO: 10), AILIMHC1 (SEQ ID NO: 11), HCc1 (SEQ ID NO: 12), NHCc2 (SEQ ID NO: 5), HCc7 (SEQ ID NO: 13), HCc8 (SEQ ID NO: 14), HCc3 (SEQ ID NO: 15), HCc4 (SEQ ID NO: 16), HCc6 (SEQ ID NO: 17), HIGHC (SEQ ID NO: 18), HCc9 (SEQ ID NO: 19), HCc5 (SEQ ID NO: 20) y poliA (SEQ ID NO: 21).
<Cebadores utilizados para la determinación de ADNc de cadena liviana >
Cebador M13R (SEQ ID NO: 8; STRATAGENE), ExcellE (SEQ ID NO: ..6), AILIMLC1 (SEQ ID NO: 22), AILIMLC2 (SEQ ID NO: 23), LCcI (SEQ ID NO: 24), ckll7 (SEQ ID NO: 7), HIGLC (SEQ ID NO: 4), LCc2 (SEQ ID NO: 25), HIK (SEQ ID NO: 26), y poliA (SEQ ID NO: 21).
El listado de secuencia que se muestra más adelante contiene secuencias de ADNc que codifican la cadena pesada y secuencias de ADNc que codifican la cadena liviana del anticuerpo monoclonal humano contra AILIM humana, que son producidos por cada hibridoma mencionado más arriba, así como las secuencias de aminoácidos
deducidas de las secuencias de ADNc.
Clon AIH5D3 (JMab-136) <Cadena pesada> Secuencia de ADN: SEQ ID NO: 27 (secuencia señal: nucleótidos números 69
a 125, región V: nucleótidos números 126 a 419) Secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO: 28 (que comprende la secuencia
señal: aminoácidos números 1 a 19, región variable: aminoácidos números 20 a 118). <Cadena liviana> Secuencia de ADN: SEQ ID NO: 29 (secuencia señal: nucleótidos números 39
a 104, región V: nucleótidos números 105 a 386) Secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO: 30 (que comprende la secuencia
señal: aminoácidos números 1 a 22, región variable: aminoácidos números 23 a 116) Clon AII289 (JMab-138) <Cadena pesada> Secuencia de ADN: SEQ ID NO: 31 (que comprende la secuencia señal:
nucleótidos números 94 a 150, región V: nucleótidos números 151 a 441) Secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO: 32 (que comprende la secuencia
señal: aminoácidos números 1 a 19, región variable: aminoácidos números 20 a 116) <Cadena liviana> Secuencia de ADN: SEQ ID NO: 33 (que comprende la secuencia señal:
nucleótidos números 28 a 87, región V: nucleótidos números 88 a 375) Secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO: 34 (que comprende la secuencia
señal: aminoácidos números 1 a 20, región variable: aminoácidos números 21 a 116) Clon AII394 (JMab-139) <Cadena pesada> Secuencia de ADN: SEQ ID NO: 35 (secuencia señal: nucleótidos números 96
a 152, región V: nucleótidos números 153 a 443) Secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO: 36 (que comprende la secuencia
señal: aminoácidos números 1 a 19, región variable: aminoácidos números 20 a 116) <Cadena liviana> Secuencia de ADN: SEQ ID NO: 37 (secuencia señal: nucleótidos números 33
a 92, región V: nucleótidos números 93 a 380) Secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO: 38 (que comprende la secuencia señal: aminoácidos números 1 a 20, región variable: aminoácidos números 21 a 116) Utilizando software analítico para secuencia génica, se buscó la Secuencia
BASE V de la biblioteca para genes de región variable de inmunoglobulina humana construida por Tomlinson et al. (Immunol. Today, Vol.16, No.5, páginas 237-242, 1995) para cada una de las secuencias de ADN determinadas en la presente memoria.
El resultado mostró que los genes de región V de la respectiva cadena pesada y cadena liviana de los anticuerpos monoclonales humanos arriba mencionados estaban constituidos por los siguientes segmentos.
<Gen de región V de cadena pesada >
clon AIH5D3 (JMab-136): 1-02
clon AII289 (JMab-138): 3-13
clon AII394 (JMab-139): 3-13
< Gen de región V de cadena liviana >
clon AIH5D3 (JMab-136): L5
clon AII289 (JMab-138): A27
clon AII394 (JMab-139): A27
Ejemplo 11 Efecto inhibitorio del anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana sobre la hipersensibilidad de tipo retardada (DTH)
El sistema biológico de respuesta inmune, cuya función es eliminar los antígenos dañinos (microorganismos patógenos tales como virus, bacterias y parásitos, cuerpos extraños, etc.) para los organismos vivos, y puede dividirse ampliamente en inmunidad congénita e inmunidad adquirida.
La primera es un sistema de eliminación en base al reconocimiento no específico que incluye fagocitosis por fagocitos (leucocitos polimorfonucleares, monocitos, macrófagos, etc.), ataque por células citolíticas naturales (NK) y opsonización de antígeno por complemento, etc.
La última, la respuesta inmune adquirida, es un sistema de eliminación por linfocitos (principalmente, células T y células B) que adquirieron especificidad (activación) para el antígeno.
Además, la respuesta inmune adquirida puede dividirse ampliamente en inmunidad celular e inmunidad humoral.
En contraposición a la inmunidad humoral dependiente del anticuerpo, la inmunidad celular es una respuesta inmune expresada en general por la acción directa de la célula T sobre un antígeno como diana. Se sabe que la inmunidad celular está involucrada en la respuesta inmunitaria a un virus o tumor, la respuesta inmunitaria inducida después del transplante de un tejido u órgano, la hipersensibilidad a algunos fármacos y algunas de las enfermedades autoinmunes.
El fenómeno más típico que pertenece a la inmunidad celular es la bien conocida alergia a la tuberculina (casi sinónimo de hipersensibilidad a la tuberculina). La alergia a la tuberculina es una alergia retardada desencadenada por la infección por el bacilo de la tuberculosis. La alergia se debe a la infección por el bacilo de la tuberculosis y puede ser inducida provocando la respuesta inmunitaria inyectando por vía intracutánea, a un organismo vivo, la proteína tuberculina producida en el sobrenadante de cultivo del bacilo de la tuberculosis.
La alergia retardada es una alergia mediada por la célula T (antígeno memorizador de célula T de memoria) sensibilizada con un antígeno. La alergia se denomina "de tipo retardada” porque toma 24 a 48 horas para que un organismo vivo sensibilizado con el antígeno exprese la respuesta alérgica con inflamación inducida por la célula T de memoria cuando se pone en contacto nuevamente con el antígeno.
El fenómeno de alergia a la tuberculina, que es representativa de las alergias retardadas, generalmente se ha utilizado en el "ensayo de tuberculina" para diagnosticar si la sensibilización por la infección del bacilo de la tuberculosis ya se ha establecido en un animal o no. Específicamente, el ensayo se realiza de la siguiente manera: La tuberculina purificada (derivado de proteína purificada; PPD; 0,1ml del derivado de 0,05µg/0,1ml (2,5TU) para uso diagnóstico general), que es una proteína de tuberculina purificada del cultivo de bacilo de la tuberculosis, se administra por vía intracutánea a un animal; el eje mayor del enrojecimiento de la piel en el sitio de la inyección se mide 48 horas después de la inyección; y la presencia de infección del bacilo de la tuberculosis puede diagnosticarse en base al eje mayor medido. Si el eje mayor del enrojecimiento es más corto que 4mm, entonces el sujeto es negativo; si el mismo está en el intervalo de 4-9mm, entonces el sujeto es falso positivo; y si es de 10mm o mayor, entonces el sujeto es decididamente positivo.
Las alergias retardadas asociadas a la inmunidad celular incluyen, por ejemplo, hipersensibilidad de tipo Jones-Mote inducida transitoriamente por una pequeña cantidad de proteína o similar, la alergia de contacto a fármacos tales como cloruro de picrilo o toxinas vegetales tales como laca japonesa, o alergia asociada al rechazo al injerto (por ejemplo, injerto alogénico) así como la alergia al antígeno arriba mencionada de patógeno infeccioso tal como alergia a la tuberculina causada por el bacilo de la tuberculosis descrito más arriba.
En este ensayo, se evaluó el efecto inhibidor del anticuerpo anti-AILIM sobre la hipersensibilidad de tipo retardada (alergia retardada) utilizando el ensayo de tuberculina arriba mencionado. El ensayo se realizó de la siguiente manera:.
Monos cynomolgus (machos, de peso corporal: 6,0-8,5kg, Environmental Biological Life Science Research Center Inc.; 3 individuos en cada grupo) que habían sido sensibilizados con BCG (Bacille de Calmette et Guerin), que es una bacteria viva atenuada del bacilo de la tuberculosis de tipo bovino, se anestesiaron con hidrocloruro de ketamina (10mg/kg, inyección intramuscular), y después una cualquiera de las muestras de ensayo indicadas más abajo les fueron administradas por vía intracutánea con una cantidad de 0,1ml a cada sitio de inyección (6 sitios de inyección/individuo) en el pecho. Las distancias entre los sitios de inyección de la muestra fueron de 3 cm o más.
(1)
Solución mixta 1:1 de anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana (JMab-136; 0,2mg; 10�g en cada sitio de inyección) y tuberculina (4�g/1ml de solución fisiológica);
(2)
Solución mixta 1:1 de anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana (JMab-136; 2mg; 100 �g en cada sitio de inyección) y tuberculina (4µg/1ml de solución fisiológica);
(3) tampón de fosfato (PBS (-)) como control;
(4)
Solución mixta 1:1 de un agente antiinflamatorio esteroidal comercialmente disponible, Prednisolona (0,2mg; 10�g en cada sitio de inyección) y tuberculina (4�g/1ml de solución fisiológica) como control positivo;
(5)
Solución mixta 1:1 de anticuerpo monoclonal humano anti-KLH (Ejemplo <2-2>; 0,2mg; 10µg en cada sitio de inyección) y tuberculina (4µg/1ml de solución fisiológica) como control negativo.
24 horas después de la inyección de cada muestra, se midieron el eje mayor y eje menor del enrojecimiento en cada sitio de inyección para determinar el área del enrojecimiento.
El resultado se muestra en la Figura 72.
El resultado mostró que el enrojecimiento debido a la alergia retardada se inhibió considerablemente en cualquiera de los grupos sometidos a la inyección de los anticuerpos anti-AILIM, en comparación con los grupos control y control negativo. El efecto inhibidor fue comparable al del fármaco antiinflamatorio esteroidal utilizado como control positivo.
Ejemplo 12 Análisis para la expresión de AILIM en diversos tejidos de pacientes con enfermedad injerto versus huésped (GVHD) La expresión de AILIM en una variedad de tejidos obtenidos de biopsia de pacientes, que eran receptores sometidos a transplante de injerto alogénico de
tndonantesyalosqueseleshabíadiagnosticadoclínicamentequeestabanafectados enfermedad injerto huésped (GVHD) aguda crónica después del con versus o transplante,seanalizómedianteunmétodocomúnmenteutilizado. Los tejidosse tiñeron HE anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana (JMab-36) con y preparadoenelEjemplodescritomásarriba. Sellevó cabo el análisis utilizando 33 de diversos tejidos muestras a recolectadosdepacientesconGVHD aguda(28casos)asícomo5muestrasde Losresultadosfueronlossiguientes:seencontróreacciónAILIM-positivaen15 delas29muestrasdetejidodepiel;en1de3muestrasdetejidodeestómago;yen1 de1muestradetejidodecolon;quefuerontodasobtenidasdepacientesconGVHD aguda.SeencontróreacciónAILIM-positivaen1de3muestrasdetejidodepiel;en2 de2muestrasdetejidodecolon;quefuerontodasobtenidasdepacientesconGVHD crónica.Además,seencontróreacciónAILIM-positivaen10de13muestrasenlas quesehabíaobservadoinfiltraciónconsiderabledelinfocitos. lidEjo 13 Acd dl httnoconacuerpnnuampe aomomao a
pacientes con GVHD crónica (5 casos).
iiv
le
ara
n
u
i
-AILIM hmaa p
no.
llua é
ldaora
itoes
ñleae
ss cmus en cs Tde mo
ditransucr
El experimento realizado en el Ejemplo 7 ha demostrado que los anticuerpos monoclonales anti-AILIM humana de la presente invención son capaces de potenciar la proliferación de células T humanas controlando la respuesta de las células T humanas, específicamente controlando la transducción de señales coestimuladoras mediadas por AILIM a la célula. En este ensayo, se analizó si los anticuerpos monoclonales humanos exhiben o no actividad de potenciación de la proliferación celular de células T de mono por el mismo método descrito en el Ejemplo 7.
<13-1> Dilución del anticuerpo
El anticuerpo monoclonal anti-CD3 humana SP34 (BD-Pharmingen) se diluyó con tampón de fosfato (PBS) hasta una concentración final de 1µg/ml.
El anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMAb136 preparado anteriormente se diluyó con PBS hasta una concentración final de 40µg/ml. La solución del anticuerpos además se diluyó con PBS para preparar diversas concentraciones de anticuerpos (40µg/ml-0,064µg/ml).
<13-2> Revestimiento de la microplaca con anticuerpo
Cada pocillo de microplacas de 96 pocillos se revistió con anticuerpo monoclonal anti-CD3 humana SP34 (1�g/ml; 25�l a cada pocillo) y el anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana JMAb136 (40µg/ml-0,064�g/ml; 25�l a cada pocillo). Las placas se incubaron a 37 ° C durante 2 horas. Posteriormente, se descartaron las soluciones de anticuerpo y cada pocillo se lavó 3 veces con PBS. Después del lavado, se añadió medio RPMI1640 que contenía 10% de FCS a cada pocillo (100�l/pocillo) y las placas se incubaron a 37°C durante 1 hora. De ese modo los pocillos respectivos de las placas se revistieron con los anticuerpos mencionados más arriba.
Se realizaron experimentos de control de la misma manera utilizando placas revestidas con anticuerpo monoclonal humano anti-KLH (JMab23; véanse los Ejemplos previos) como anticuerpos de control en lugar de los anticuerpos monoclonales anti-AILIM humana.
Las microplacas revestidas con los anticuerpos se utilizaron en los siguientes ensayos.
<13-3> Preparación de suspensión de células T de mono
Se recolectó sangre periférica de monos cynomolgus y las células mononucleares se fraccionaron por centrifugación con gradiente de densidad utilizando NycoPrepl.077A (Nycomed). De acuerdo con el manual experimental, las células T de mono se separaron de las células mononucleares de mono cynomolgus utilizando anticuerpo M-T477 anti-CD4 humana (BD-Pharmingen), anticuerpo RPA-T8 anti-CD8 humana (BD-Pharmingen), microesferas de lgG anti-ratón (Miltenyi) y un Clasificador Magnético. El recuento de células T se determinó utilizando un hemacitómetro. Las células T de mono se suspendieron en medio RPMI1640 que contenía 10% de FCS. De ese modo se preparó la suspensión de células T de mono (1x106 células/ml).
<13-4> Cultivo de células
(1) Cultivo utilizando microplaca revestida con anticuerpo anti-CD3 humana y anticuerpo anti-AILIM humana.
Se añadió suspensión de células T de simio a cada pocillo de una microplaca revestida con el anticuerpo mencionada más arriba y la placa se incubó a 37°C durante 2 días en una incubadora de CO2.
Después de completado el cultivo, las respectivas microplacas se utilizaron en los siguientes ensayos:
<13-5> Determinación de la actividad de proliferación de células T
Se añadió metil [3H]timidina (0,5�Ci/pocillo; Amersham-Pharmacia) a cada
pocillo de las placas después de la incubación y las placas se incubaron a 37°C durante 6 horas en una incubadora de CO2. Después de la incubación, se atraparon las células en filtros GF/C (Packard) utilizando una Cosechadora de Células. Posteriormente, se secaron los filtros a 40°C durante 3 horas o más, y después se añadió Microscinti 0 (20�l/pocillo; Packard) a los mismos. Se midió la radioactividad del 3H incorporado en las células atrapada en los filtros mediante un contador � (TOP
El resultado se muestra en la Figura 73.
humana. le
microplacas se revistieron con anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana (anticuerpo
dto
monoclonal humano o anticuerpo monoclonal de ratón) junto con anticuerpo anti-CD3
considerablemente dependiendo de la concentración de las células cuando las ar
El resultado también sugiere que los anticuerpos monoclonales anti-AILIM
ten
humana de la presente invención pueden unirse a AILIM de mono y tener actividad
COUNT) paraanalizar elgradodeproliferacióndecélulasTdespuésdelcultivo. ElresultadodeesteensayomostróquelascélulasTdesimioproliferaron pararegular lafuncióndeAILIMdemono. liec
bta
Ejmpo 14 Esmio d méo pa i
le
icarf
idten
y c
itusancas
icar f
ituan
s
inrs
s de u
capaceSeestableció método de ELISA (ensayo de inmunosorción ligado un a
enzimas) para identificar o cuantificar una sustancia capaz de unirse a AILIM (ICOS) o ligando de AILIM (B7h/B7RP1/GL50/LICOS).
El principio del método descrito más abajo en detalle como ejemplo se basa en estimar, mediante ELISA, el grado de inhibición sobre la unión entre AILIM humana soluble (AILIMh-IgFc) y el ligando de AILIM humana soluble (hB7h-IgFc) provocada por la sustancia.
<14-1> Muestra
Se utilizaron las siguientes muestras:
(1) Estreptavidina-HRP (Southern Biotechnology Associates, Inc.);
(2) Ligando de AILIM humana soluble (proteína de fusión entre la región extracelular de B7h humana y la región constante de IgG1 humana).
La proteína se preparó mediante el método descrito más abajo en el punto <14-2>;
(3) AILIM soluble-IgFc marcada con biotina;
Se preparó AILIM-IgFc purificando adicionalmente el antígeno obtenido de acuerdo con el mismo método descrito en las solicitudes anteriores (JP-A 11-29599
idgan
e a AILIM o lo d
M
e AILI
(Ejemplo 16 (2)) y WO98/38216 (Ejemplo 16 (2))) de uno de los presentes inventores, Tezuka;
(4)
Anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana (JMab-136; descrito más arriba);
(5)
Anticuerpo monoclonal humano anti-KLH (anticuerpo de control negativo; JMab-23; descrito más arriba);
(6)
Tampón de fosfato (PBS (-); Nikken Seibutsu);
(7)
Medio PRMI1640 (Nikken Seibutsu);
(8)
Suero fetal bovino (FCS; JRH-Bioscience) ;
(9)
Albúmina de suero bovino al 30% (BSA; Sigma);
(10)
Tween20 (BioRad) ;
(11)
Cromógeno sustrato de TMB+ (Dako) .
<14-2> Preparación de ligando de AILIM humana soluble (proteína de fusión (hB7h-IgFc) de la región extracelular de B7h humano y la región constante de IgG1 humana)
Se preparó ARN total a partir de células mononucleares obtenidas de sangre periférica de la misma manera descrita en el Ejemplo anterior. Se sintetizó ADNc del ATN total obtenido (5�g) como plantilla y utilizando Sistema de Preamplificación Superscript para Síntesis de ADNc de Primera Hebra (GIBCO-BRL).
Posteriormente, se diseñaron y se sintetizaron el cebador 5' (5'GAGGTCTCCGCCCTCGAGATGCGGCTGGGCAGTCC-3', SEQ ID NO: 39) que poseía el sitio de restricción Xhol y el cebador 3' (5’CACAGGACAGCCAGGGGATCCCACGTGGCCGCG-3', SEQ ID NO: 40) que poseía el sitio de restricción BamHi en sus extremos respectivos para amplificar el ADNc que codifica la región extracelular del ligando de AILIM humana (hB7h) mediante PCR. Utilizando el ADNc como plantilla y el par de cebadores, se realizó una PCR para preparar un ADN que poseía Xhol y BamHI en los extremos respectivos de los mismos que contenía ADNc que codifica la región extracelular de B7h humano. Los productos de PCR resultantes se digirieron con Xhol y BamH2, se fraccionaron mediante electroforesis en gel de agarosa para aislar una banda correspondiente a un fragmento de ADNc de aproximadamente 720 pb, que se predijo que codifica la región extracelular de interés. El fragmento de ADNc aislado se subclonó en el plásmido pBluescript II SK (+) (Stratagene) predigerido con Xhol y BamHI. Se verificó que el fragmento de ADNc contenía la porción que codifica la región extracelular de B7h humana mediante análisis de secuenciación utilizando un secuenciador de ADN
fluorométrico automatizado (Applied Biosystems).
Por otra parte, se preparó el ADN que codifica Fc de IgG1 humana como asociado de fusión como un fragmento de ADN BamHI-Xba2 (aproximadamente 1,3kb) digiriendo un plásmido (véase, Cell, Vol.61, páginas 1303-1313, 1990; preparado por Dr. Seed et al., en el Massachusetts General Hospital) con BamHI y Xbal. Este fragmento contenía exones que codifican las regiones bisagra de IgG1, C�12, y C�13 humanas.
El fragmento Xhol-BamHI que codifica la región extracelular de B7h humana (hB7h) y el fragmento BamH I-XbaI que contenía exones que codifican Fc (abreviado "IgFc") de IgG1 humana, preparado según se describe más arriba, se subclonaron en un plásmido pBluescript II SK (+) (Stratagene) predigerido con Xhol y Xbal.
Posteriormente, el plásmido se digirió con Xhol y Xbal para preparar un fragmento de ADN de aproximadamente 1,8 kb que contenía ADN de fusión entre la región extracelular de B7h humana e IgFc humana. Utilizando T4 ADN ligasa, este fragmento de ADN de fusión se insertó en un vector de expresión pME18S (Medical Immunology, Vol.20, No.1, páginas 27-32, 1990, y "Handbook for Genetic Engineering" Experimental Medicine, supplement, Yodosha, páginas 101-107, 1992) entre los sitios Xhol y Xbal, para construir un plásmido phB7h-IgFc.
Células monocapa COS7 (ATCC CRL-1651) se cultivaron hasta sub-confluencia en medio DMEM que contenía 10% de suero fetal bovino y ampicilina, se transformaron con el plásmido phB7h-IgFc mediante electroporación para producir células transformadas.
Se permitió que las células transformadas expresaran hB7h-IgFc cultivándolas en medio ASF104 libre de suero durante 72 horas.
Se purificó HB7h-IgFc utilizando una columna de afinidad de Proteína G Sefarosa (Amersham Pharmacia) de la siguiente manera:
El sobrenadante de cultivo arriba mencionado se centrifugó para obtener sobrenadante centrifugado. El sobrenadante resultante se cargó en una columna de afinidad de Sefarosa Proteína G pre-equilibrada con un tampón de unión. Posteriormente, se lavó la columna con el tampón de unión, y después se llevó a cabo la elución con un tampón de elución. La solución eluída se recuperó y después se dializó contra tampón de fosfato. El tampón de diálisis externo se cambió dos veces o más. De ese modo se obtuvo hB7h-IgFc purificada.
<14-3> Dilución de anticuerpo y AILIM humana soluble (AILIMh-IgFc) y reacción de los mismos
Soluciones originales (20�g/ml) de anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana (JMab-136) y anticuerpo monoclonal humano anti-KLH (JMab-23) como anticuerpo de control negativo se diluyeron en una serie de 11 niveles, y cada muestra (200�l) se combinó y se mezcló bien con 200µl de medio RPMI1640 que contenía 10% de FCS. De ese modo se prepararon diversas concentraciones de soluciones de los anticuerpos. Se añadió AILIMh-IgFc marcado con biotina (2µl/tubo; concentración final 1�g/ml) a cada una de las soluciones preparadas con diversas concentraciones. Las soluciones resultantes se mezclaron bien y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos.
<14-4> Ensayo para determinar la actividad del anticuerpo monoclonal anti-AILIM para inhibir la unión entre AILIMh-IgFc y hB7h-IgFc
Se añadió hB7h-IgFc a cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos (50µl/pocillo (800ng/pocillo)). La placa se selló y después se incubó a 37°C durante 1 hora. Se eliminó la solución de cada pocillo, y los pocillos se lavaron 3 veces con PBS (120�l). Posteriormente, se añadió PBS que contenía 0,5% de BSA (100�l/pocillo) a cada pocillo para bloquear los sitios sin reaccionar. La placa se selló y se incubó a 37°C durante 1 hora. Después de la incubación, la solución se eliminó y después los pocillos se lavaron 3 veces con PBS (1,20µl). Posteriormente, se añadió cada muestra (50�l/pocillo) preparada en el punto <14-3> a los pocillos. La placa se selló y se incubó a 37°C durante 1 hora. Se eliminó la solución de cada pocillo. Los pocillos se lavaron 3 veces con medio RPMI1640 que contenía 10% de FCS (120�l) precalentado a 37°C. Posteriormente, se añadió PBS que contenía 3,7% de formalina (100µl/pocillo) a cada pocillo, y la placa se incubó en hielo durante 5 minutos. Se eliminó la solución de cada pocillo y los pocillos se lavaron 3 veces con Tween 20 al 0,1% (120�l). Posteriormente, se añadió estreptavidina-HRP (50�l/pocillo) a cada pocillo. La placa se selló y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se eliminó la solución de cada pocillo y la placa se lavó 3 veces con PBS que contenía Tween 20 al 0,1% (120�l). Posteriormente, se añadió sustrato cromógeno TMB+ (50µl/pocillo) a cada pocillo y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos. Posteriormente, se añadió ácido sulfúrico 2N (50µl/pocillo) a cada pocillo para interrumpir la reacción. Se midió la absorbancia de cada pocillo a una longitud de onda de 450nm mediante THERMO max (Molecular Devices).
Los resultados se muestran en las Figuras 74 a 76.
Los resultados mostraron que el anticuerpo anti-AILIM tenía la actividad de inhibir la unión entre AILIMh-IgFc y hB7h-IgFc de una manera dependiente de la dosis.
Por consiguiente, este Ejemplo indica que puede utilizarse un sistema de ensayo ilustrado por el presente método para detectar e identificar sustancias capaces de unirse a AILIM o al ligando de AILIM (por ejemplo, anticuerpo o compuesto sintético de bajo peso molecular).
Ejemplo 15 Actividad del anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana para inhibir la proliferación de células T humanas, asociada con la transducción de señales coestimuladoras mediadas por AILIM-ligando de AILIM
Se analizó si los anticuerpos monoclonales anti-AILIM humana de la presente invención tenían o no actividad reguladora sobre la transducción de señales mediada por AILIM sobre la superficie de células T humanas, basándose en la medición del efecto inhibidor del anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana sobre la proliferación celular inducida poniendo en contacto células T humanas con el ligando de AILIM (B7h/B7RP1/GL50/LICOS)
<15-1> Dilución del anticuerpo
Se diluyó el anticuerpo monoclonal OKT3 anti-CD3 humana (ATCC CRL-8001) con tampón de fosfato (PBS) hasta una concentración final de 8µg/ml.
El ligando de AILIM humana soluble (hB7h-lgFc) preparado más arriba se diluyó con PBS hasta una concentración final de 40µg/ml. Las soluciones de los anticuerpos además se diluyeron con PBS para preparar diversas concentraciones de anticuerpos (40µg/ml-0,064µg/ml).
<15-2> Revestimiento de microplaca con anticuerpo
Cada pocillo de las microplacas de 96 pocillos se revistió con (1) anticuerpo monoclonal OKT3 anti-CD3 humana (8µg/ml; 25�l en cada pocillo) y hB7h-1gFc (40µg/ml-0,064µg/ml;25µl en cada pocillo). Las placas se incubaron a 37°C durante 2 horas. Posteriormente, se descartaron las soluciones del anticuerpo y cada pocillo se lavó 3 veces con PBS. Después del lavado, se añadió medio RPMI1640 que contenía 10% de FCS a cada pocillo (100�l/pocillo), y las placas se incubaron a 37°C durante 1 hora. De ese modo se revistieron los respectivos pocillos de las placas.
<15-3> Preparación de suspensión de células T humanas
Se recolectó sangre periférica de personas saludables normales y las células mononucleares se fraccionaron mediante centrifugación con gradiente de densidad utilizando LymphoPrep (Nycomed). De acuerdo con el manual experimental, se separaron las células T humanas de las células mononucleares humanas utilizando un Kit de Aislamiento Pan-célula T (Miltenyi) y un Clasificador Magnético. Se determinó el recuento de células T utilizando un hemacitómetro. Se suspendieron las células T humanas en un medio RPMI1640 que contenía 10% de FCS provisto de anticuerpo monoclonal humano 3Mab136 anti-AILIM humana (20µg/ml). La suspensión de células T humanas (1x106 células/ml) preparada se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Se utilizó anticuerpo monoclonal humano anti-KLH JMAb23 (20µg/ml) como anticuerpo control negativo.
.<15-4> Cultivo celular
De la misma manera descrita más arriba, se añadió suspensión de células T humanas (100µl/pocillo; 1X105 células/pocillo) a cada pocillo de una microplaca revestida con anticuerpo anti-CD3 humana y hB7h-IgFc, y la placa se incubó a 37°C durante 3 días en una incubadora de CO2.
<15-5> Determinación de la actividad de proliferación de células T
Se añadió metil [3H]timidina (0,5�Ci/pocillo; Amersham-Pharmacia) a cada pocillo de las placas después del cultivo y las placas se incubaron a 37°C durante 6 horas en una incubadora de CO2. Después de la incubación, se atraparon las células en filtros GF/C (Packard) utilizando una Cosechadora de Células. Posteriormente, se secaron los filtros a 40°C durante 3 horas o más y después se añadió Microscinti 0 (20�l/pocillo; Packard) a los mismos. Se midió la radioactividad del 3H incorporado a las células atrapadas en los filtros mediante un contador � (TOP COUNT) para analizar el grado de proliferación de células T después del cultivo.
El resultado se muestra en la Figura 77.
El resultado obtenido en este ensayo demostró que las células T humanas crecieron considerablemente dependiendo de la concentración de B7h-IgFc humana (en el ensayo que utiliza el anticuerpo control negativo). Además, el anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana inhibió considerablemente la proliferación de células T humanas.
Ejemplo 16 Actividad del anticuerpo monoclonal humano anti-AILIM humana para inhibir la proliferación de células T de mono, asociada a la transducción de señales coestimuladoras mediada por AILIM-ligando de AILIM
Se realizó el mismo ensayo utilizando células T de mono en lugar de las células T humanas utilizadas en el Ejemplo 15 descrito más arriba.
<16-1> Dilución del anticuerpo y otros
Se diluyó anticuerpo monoclonal SP34 anti-CD3 humana (BD-Pharmingen) con tampón de fosfato (PBS) hasta una concentración final de 1µg/ml.
La B7h-IgFc humana preparada más arriba se diluyó con PBS hasta una concentración final de 40µg/ml. La solución del anticuerpo además se diluyó con PBS
para preparar diversas concentraciones del anticuerpo (40µg/ml-0,0064µg/ml).
<16-2> Revestimiento de microplacas con anticuerpo
Cada pocillo de microplacas de 96 pocillos se revistió con (1) anticuerpo monoclonal SP34 anti-CD3 humana (BD-Pharmingen) (1�g/ml; 25µl en cada pocillo) y B7h-IgFc humana (40�g/ml-0,0064µg/ml; 25�l en cada pocillo). Las placas se incubaron a 37°C durante 2 horas. Posteriormente, la solución del anticuerpo se descartó y cada pocillo se lavó 3 veces con PBS. Después del lavado, se añadió medio RPMI1640 que contenía 10% de FCS a cada pocillo (100µl/pocillo) y las placas se incubaron a 37ºC durante 1 hora. De ese modo, los respectivos pocillos de las placas se revistieron con el anticuerpo.
<16-3> Preparación de suspensión de células T de mono
Se recolectó sangre periférica de monos cynomolgus. Se preparó una fracción que contenía células mononucleares mediante centrifugación con gradiente de densidad utilizando NycoPrepl.077A (Nycomed). De acuerdo con el manual experimental, las células T de mono se separaron de las células mononucleares de mono cynomolgus utilizando anticuerpo M-T477 anti-CD4 humana (BD-Pharmingen), anticuerpo RPA-T8 anti-CD8 humana (BD-Pharmingen), microesferas de IgG antiratón (Miltenyi) y un Clasificador Magnético. Se determinó el recuento de células T utilizando un hemacitómetro. Se suspendieron las células T de mono en medio RPMI1640 que contenía anticuerpo monoclonal humano JMab-136 anti-AILIM humana (20µg/ml) y 10% de FCS para preparar la suspensión de células T de mono (1x106 células/ml). La suspensión se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Se utilizó anticuerpo monoclonal humano JMab-23 anti-KLH (20�g/ml) como anticuerpo control negativo.
<16-4> Cultivo celular
De la misma manera descrita más arriba, se añadió suspensión de células T de mono (100�I/pocillo; 1X105 células/pocillo) a cada pocillo de una microplaca revestida con anticuerpo anti-CD3 humana y hB7h-IgFc, y la placa se incubó a 37°C durante 3 días en una incubadora de CO2.
<16-5> Determinación de la actividad de proliferación de células T
Se añadió metil [3H]timidina (0.5�Ci/pocillo; Amersham-Pharmacia) a cada pocillo de las placas después del cultivo y las placas se incubaron a 37°C durante 6 horas en una incubadora de CO2. Después de la incubación, se atraparon las células en filtros GF/C (Packard) utilizando una Cosechadora de Células. Posteriormente, se secaron los filtros a 40°C durante 3 horas o más y después se añadió Microscinti 0 (20µl/pocillo; Packard) a los mismos. Se midió la radioactividad del [3H] incorporado en las células atrapadas en los filtros mediante un contador � (TOP COUNT) para analizar el grado de proliferación de células T después del cultivo.
El resultado se muestra en la Figura 78.
El resultado obtenido en este ensayo demostró que las células T de mono crecieron considerablemente dependiendo de la concentración de 87h-IgFc humana (en el ensayo que utiliza el anticuerpo control negativo). Además, el anticuerpo monoclonal anti-AILIM humana inhibió considerablemente la proliferación de células T de mono.
TEXTO LIBRE DEL LISTADO DE SECUENCIAS
SEQ ID NO: 1
Otra información: Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia del cebador artificialmente sintetizado, Notl-T.
SEQ ID NO: 2
Otra información: Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia del conector artificialmente sintetizado, 20adp.
SEQ ID NO: 3
Otra información: Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia del conector artificialmente sintetizado, 24adp.
SEQ ID NO: 4
Otra información: Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia del cebador artificialmente sintetizado, HIGLC.
SEQ ID NO: 5
Otra información: Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia del cebador artificialmente sintetizado, NHCc2.
SEQ ID NO: 6
Otra información: Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia del cebador artificialmente sintetizado, ExcellE.
SEQ ID NO: 7
Otra información: Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia del cebador artificialmente sintetizado, ck117.
SEQ ID NO: 8
Otra información: Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia del cebador artificialmente sintetizado, M13R.
SEQ ID NO: 9
Otra información: Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia del cebador artificialmente sintetizado, 136H.
SEQ ID NO: 10
Otra información: Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia del cebador artificialmente sintetizado, 138/9H.
SEQ ID NO: 11
Otra información: Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia del cebador artificialmente sintetizado, AILIMHC1.
SEQ ID NO: 12
Otra información: Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia del cebador artificialmente sintetizado, HCc1.
SEQ ID NO: 13
Otra información: Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia del cebador artificialmente sintetizado, HCc7.
SEQ ID NO: 14
Otra información: Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia del cebador artificialmente sintetizado, HCc8.
SEQ ID NO: 15
Otra información: Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia del cebador artificialmente sintetizado, HCc3.
SEQ ID NO: 16
Otra información: Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia del cebador artificialmente sintetizado, HCc4.
SEQ ID NO: 17
Otra información: Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia del cebador artificialmente sintetizado, HCc6.
SEQ ID NO: 18
Otra información: Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia del cebador artificialmente sintetizado, HIGHC.
SEQ ID NO: 19
Otra información: Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia del cebador artificialmente sintetizado, HCc9.
SEQ ID NO: 20
Otra información.: Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia del cebador artificialmente sintetizado, HCc5.
SEQ ID NO: 21
Otra información: Descripción de Secuencia Artificial: .Secuencia del cebador
artificialmente sintetizado, poliA.
5 SEQ ID NO: 22
Otra información: Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia del cebador
artificialmente sintetizado, AILIMLC1.
SEQ ID NO: 23
Otra información: Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia del cebador 10 artificialmente sintetizado, AILIMLC2.
SEQ ID NO: 24
Otra información: Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia del cebador
artificialmente sintetizado, LCc1. SEQ ID NO: 25 15 Otra información: Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia del cebador
artificialmente sintetizado, LCc2.
SEQ ID NO: 26
Otra información: Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia del cebador
artificialmente sintetizado, HIK. 20 SEQ ID NO: 39 Otra información: Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia de cebador
artificialmente sintetizado.
SEQ ID NO: 40
Otra información: Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia de cebador 25 artificialmente sintetizado.
30
35
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
5
10
imagen1

Claims (36)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un anticuerpo monoclonal humano que se une a AILIM humana, en el que una región variable de cadena pesada de dicho anticuerpo monoclonal humano posee una secuencia de aminoácidos de los siguientes puntos (a) o (b):
    (c)
    secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos desde la posición 20 hasta la posición 117 de la SEQ ID NO: 28, o
    (d)
    secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos desde la posición 20 hasta la posición 117 de la SEQ ID NO: 28, en la que uno a diez restos de aminoácidos son eliminados o sustituidos, o a la que uno a diez restos de aminoácidos son insertados o añadidos,
    siempre que, cuando la región variable de cadena pesada posee la secuencia de aminoácidos del punto anterior (b) dicho anticuerpo comprende una cualquiera de las características de los siguientes puntos (i) a (iii):
    (iv) una actividad para impedir la reacción linfocitaria mixta;
    (v)
    una actividad para inducir la transducción de señales para inducir interferón-�;o
    (vi)
    una actividad para inducir la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo a células que expresan AILIM.
  2. 2. Un anticuerpo monoclonal humano que se une a AILIM humana, en el que un polipéptido de cadena pesada de dicho anticuerpo monoclonal humano posee una secuencia de aminoácidos de los siguientes puntos (a) o (b):
    (c)
    secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos desde la posición 20 hasta la posición 470 de la SEQ ID NO: 28, o
    (d)
    secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos desde la posición 20 hasta la posición 470 de la SEQ ID NO: 28, en la que uno a diez restos de aminoácidos son eliminados o sustituidos, o a la que uno a diez restos de aminoácidos son insertados o añadidos,
    siempre que, cuando el polipéptido de cadena pesada posee la secuencia de aminoácidos del punto anterior (b) dicho anticuerpo comprende una cualquiera de las características de los siguientes puntos (i) a (iii):
    (i) una actividad para impedir la reacción linfocitaria mixta;
    (ii) una actividad para inducir la transducción de señales para inducir interferón�;o
    (iii) una actividad para inducir la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo a células que expresan AILIM.
  3. 3. Un anticuerpo monoclonal humano que se une a AILIM humana, en el que una región variable de cadena liviana de dicho anticuerpo monoclonal humano posee una secuencia de aminoácidos de los siguientes puntos (a) o (b):
    (c)
    secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos desde la posición 23 hasta la posición 116 de la SEQ ID NO: 30, o
    (d)
    secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos desde la posición 23 hasta la posición 116 de la SEQ ID NO: 30, en la que uno a diez restos de aminoácidos son eliminados o sustituidos, o a la que uno a diez restos de aminoácidos son insertados o añadidos,
    siempre que, cuando la región variable de cadena liviana posee la secuencia de aminoácidos del punto anterior (b), dicho anticuerpo comprende una cualquiera de las características de los siguientes puntos (i) a (iii):
    (i) una actividad para impedir la reacción linfocitaria mixta;
    (ii) una actividad para inducir la transducción de señales para inducir interferón-�;o
    (iii) una actividad para inducir la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo a las células que expresan AILIM.
  4. 4. Un anticuerpo monoclonal humano que se une a AILIM humana, en el que un polipéptido de cadena liviana de dicho anticuerpo monoclonal humano posee una secuencia de aminoácidos de los siguientes puntos (a) o (b):
    (c)
    secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos desde la posición 23 hasta la posición 236 de la SEQ ID NO: 30, o
    (d)
    secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos desde la posición 23 hasta la posición 236 de la SEQ ID NO: 30, en la que uno a diez restos de aminoácidos son eliminados o sustituidos, o a la que uno a diez restos de aminoácidos son insertados o añadidos,
    siempre que, cuando el polipéptido de cadena liviana posee la secuencia de aminoácidos del punto anterior (b), dicho anticuerpo comprende una cualquiera de las características de los siguientes puntos (i) a (iii):
    (i) una actividad para impedir la reacción linfocitaria mixta;
    (ii) una actividad para inducir la transducción de señales para inducir interferón-�;o
    (iii) una actividad para inducir la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo a las células que expresan AILIM.
  5. 5. Un anticuerpo monoclonal humano que se une a AILIM humana y
    comprende las siguientes características (a) y (b):
    (a)
    una región variable de cadena pesada del anticuerpo comprende uno de los siguientes puntos (I) o (II):
    (I)
    una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido 20 hasta el aminoácido 117 de la SEQ ID NO: 28; o
    (II)
    una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos desde la posición 20 hasta la posición 117 de la SEQ ID NO: 28, en la que uno a diez restos de aminoácidos son eliminados o sustituidos, o a la que uno a diez restos de aminoácidos son insertados o añadidos; y
    (b)
    una región variable de cadena liviana del anticuerpo comprende uno cualquiera de los siguientes puntos (I) o (II):
    (I)
    una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido 23 hasta el aminoácido 116 de la SEQ ID NO: 30; o
    (II)
    una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos desde la posición 23 hasta la posición 116 de la SEQ ID NO: 30, en la que uno a diez restos de aminoácidos son eliminados o sustituidos, o a la que uno a diez restos de aminoácidos son insertados o añadidos,
    siempre que, cuando la región variable de cadena pesada es la del punto anterior (II) de (a) o la región variable de cadena liviana es la del punto anterior (II) de (b), dicho anticuerpo comprende una cualquiera de las características de los siguientes puntos (i) a (iii):
    (i) una actividad para impedir la reacción linfocitaria mixta;
    (ii) una actividad para inducir la transducción de señales para inducir interferón-�;o
    (iii) una actividad para inducir la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo a las células que expresan AILIM.
  6. 6. Un anticuerpo monoclonal humano que se une a AILIM humana y comprende las siguientes características (a) y (b):
    (a)
    un polipéptido de cadena pesada del anticuerpo comprende uno cualquiera de los siguientes puntos (I) o (II):
    (I)
    una secuencia de aminoácidos desde el aminoácido 20 hasta el aminoácido 470 de la SEQ ID NO: 28; o
    (II)
    una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos desde la posición 20 hasta la posición 470 de la SEQ ID NO: 28, en la que uno a diez restos de aminoácidos son eliminados o sustituidos, o a la que uno a diez restos de
    aminoácidos son insertados o añadidos; y
    (b)
    un polipéptido de cadena liviana del anticuerpo comprende uno de los siguientes puntos (I) o (II):
    (I)
    una secuencia de aminoácidos desde el aminoácido 23 hasta el aminoácido 236 de la SEQ ID NO: 30; o
    (II)
    una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos desde la posición 23 hasta la posición 236 de la SEQ ID NO: 30, en la que uno a diez restos de aminoácidos son eliminados o sustituidos, o a la que uno a diez restos de aminoácidos son insertados o añadidos,
    siempre que, cuando el polipéptido de cadena pesada es el del punto anterior
    (II)
    de (a) o el polipéptido de cadena liviana es el del punto anterior (II) de (b), dicho anticuerpo comprende una cualquiera de las características de los siguientes puntos (i) a (iii):
    (i) una actividad para impedir la reacción linfocitaria mixta;
    (ii)
    una actividad para inducir la transducción de señales para inducir interferón-�;o
    (iii) una actividad para inducir la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo a las células que expresan AILIM.
  7. 7.
    Un ADN que codifica un polipéptido de región variable de cadena pesada del anticuerpo humano de la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido 20 hasta el aminoácido 117 de la SEQ ID NO: 28.
  8. 8.
    Un ADN que codifica un polipéptido de región variable de cadena liviana del anticuerpo de la reivindicación 3, el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido 23 hasta el aminoácido 116 de la SEQ ID NO: 30.
  9. 9.
    Un ADN que codifica un polipéptido de cadena pesada del anticuerpo humano de la reivindicación 2, en el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido 20 hasta el aminoácido 470 de la SEQ ID NO: 28.
  10. 10.
    Un ADN que codifica un polipéptido de cadena liviana del anticuerpo humano de la reivindicación 4, en el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido 23 hasta el aminoácido 236 de la SEQ ID NO: 30.
  11. 11. Un ADN seleccionado de los puntos (a) o (b) siguientes:
    (a) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 126 hasta el nucleótido 419 de la SEQ ID NO: 27, o
    (b) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido
    105 hasta el nucleótido 386 de la SEQ ID NO: 29.
  12. 12. Un ADN seleccionado de los puntos (a) o (b) siguientes:
    (a)
    un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 69 hasta el nucleótido 1481 de la SEQ ID NO: 27, o
    (b)
    un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 39 hasta el nucleótido 749 de la SEQ ID NO:29.
  13. 13.
    Un vector que comprende el ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12.
  14. 14.
    El vector de la reivindicación 13, que comprende un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 126 hasta el nucleótido 419 de la SEQ ID NO: 27.
  15. 15.
    El vector de la reivindicación 13, que comprende un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 69 hasta el nucleótido 1481 de la SEQ ID NO: 27.
  16. 16.
    El vector de la reivindicación 13, que comprende un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 105 hasta el nucleótido 385 de la SEQ ID NO: 29.
  17. 17.
    El vector de la reivindicación 13, que comprende un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 39 hasta el nucleótido 749 de la SEQ ID NO: 29.
  18. 18.
    El vector de la reivindicación 13, que comprende un ADN de acuerdo con los siguientes puntos (a) y (b):
    (a)
    un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 126 hasta el nucleótido 419 de la SEQ ID NO: 27 y
    (b)
    un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 105 hasta el nucleótido 386 de la SEQ ID NO: 29.
  19. 19. El vector de la reivindicación 13, que comprende un ADN de acuerdo con los siguientes puntos (a) y (b):
    (a)
    un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 69 hasta el nucleótido 1481 de la SEQ ID NO: 27 y
    (b)
    un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 39 hasta el nucleótido 749 de la SEQ ID NO: 29.
  20. 20.
    Una célula que produce el anticuerpo monoclonal humano de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la célula no es una célula embrionaria humana.
  21. 21.
    La célula de la reivindicación 20, donde dicha célula es una célula fusionada obtenida mediante la fusión de la célula B, obtenida de un mamífero capaz de producir dicho anticuerpo monoclonal humano y una célula de mieloma obtenida de un mamífero.
  22. 22.
    Un huésped no humano recombinante genético transformado por el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19, obteniéndose dicho huésped de un mamífero seleccionado del grupo que consiste en animal bovino, cabra, conejo, ratón, rata, hámster y cobayo.
  23. 23.
    El huésped recombinante genético de la reivindicación 22, donde dicho huésped es una célula de mamífero no humano.
  24. 24.
    El huésped recombinante genético de la reivindicación 22, donde dicho huésped es un huevo fertilizado de mamífero no humano.
  25. 25.
    Un anticuerpo monoclonal humano o una porción del mismo que se une a AILIM humana producida por un huésped recombinante genético de las reivindicaciones 22 o 23.
  26. 26.
    Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo humano de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  27. 27.
    Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal humano o una porción del mismo de la reivindicación 25, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  28. 28.
    Uso del anticuerpo o una porción del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y 25 para preparar una composición farmacéutica para la prevención, tratamiento o profilaxis de la alergia de tipo retardada.
  29. 29.
    Uso del anticuerpo o una porción del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y 25 para preparar una composición farmacéutica para la prevención, tratamiento o profilaxis de la artritis reumatoidea.
  30. 30.
    Uso del anticuerpo o una porción del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y 25 para preparar una composición farmacéutica para la prevención, tratamiento o profilaxis del lupus eritematoso sistémico.
  31. 31.
    Uso del anticuerpo o una porción del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y 25 para preparar una composición farmacéutica para la prevención, tratamiento o profilaxis de la psoriasis.
  32. 32.
    Uso del anticuerpo o una porción del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y 25 para preparar una composición farmacéutica para la
    prevención, tratamiento o profilaxis de enfermedades inflamatorias.
  33. 33.
    El anticuerpo o una porción del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y 25 para su uso en la prevención, tratamiento o profilaxis de la alergia de tipo retardada.
    5 34. El anticuerpo o una porción del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y 25 para su uso en la prevención, tratamiento o profilaxis de la artritis reumatoidea.
  34. 35. El anticuerpo o una porción del mismo de una cualquiera de las
    reivindicaciones 1 a 6 y 25 para su uso en la prevención, tratamiento o profilaxis del 10 lupus eritematoso sistémico.
  35. 36. El anticuerpo o una porción del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y 25 para su uso en la prevención, tratamiento o profilaxis de la psoriasis.
  36. 37. El anticuerpo o una porción del mismo de una cualquiera de las
    15 reivindicaciones 1 a 6 y 25 para su uso en la prevención, tratamiento o profilaxis de enfermedades inflamatorias.
ES01111930T 2000-05-18 2001-05-18 Anticuerpo monoclonal humano contra la molecula ailim coestimuladora y transductora de señales y uso farmaceutico del mismo. Expired - Lifetime ES2347758T3 (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2000-147116 2000-05-18
JP2000147116 2000-05-18
JP2001-99508 2001-03-30
JP2001099508A JP3597140B2 (ja) 2000-05-18 2001-03-30 副刺激伝達分子ａｉｌｉｍに対するヒトモノクローナル抗体及びその医薬用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2347758T3 true ES2347758T3 (es) 2010-11-04

Family

ID=26592169

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES01111930T Expired - Lifetime ES2347758T3 (es) 2000-05-18 2001-05-18 Anticuerpo monoclonal humano contra la molecula ailim coestimuladora y transductora de señales y uso farmaceutico del mismo.

Country Status (29)

Country Link
US (4) US6803039B2 (es)
EP (3) EP2295467A1 (es)
JP (1) JP3597140B2 (es)
KR (2) KR100609442B1 (es)
CN (1) CN100482688C (es)
AR (2) AR028927A1 (es)
AT (1) ATE473243T1 (es)
AU (3) AU773625B2 (es)
BR (2) BR0106646A (es)
CA (3) CA2722134A1 (es)
CY (1) CY1110816T1 (es)
CZ (1) CZ302902B6 (es)
DE (1) DE60142500D1 (es)
DK (1) DK1158004T3 (es)
ES (1) ES2347758T3 (es)
HK (1) HK1043371B (es)
HU (1) HU230770B1 (es)
IL (3) IL147448A0 (es)
MX (1) MXPA02000687A (es)
MY (1) MY137640A (es)
NO (1) NO333921B1 (es)
NZ (2) NZ516411A (es)
PE (1) PE20011337A1 (es)
PT (1) PT1158004E (es)
SG (4) SG153626A1 (es)
SK (1) SK287862B6 (es)
TR (3) TR200202735T1 (es)
TW (2) TWI304811B (es)
WO (1) WO2001087981A2 (es)

Families Citing this family (88)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7112655B1 (en) 1997-02-27 2006-09-26 Japan Tobacco, Inc. JTT-1 protein and methods of inhibiting lymphocyte activation
JP3521382B2 (ja) 1997-02-27 2004-04-19 日本たばこ産業株式会社 細胞間接着及びシグナル伝達を媒介する細胞表面分子
DE19821060A1 (de) * 1997-09-23 1999-04-15 Bundesrepublik Deutschland Let Ko-stimulierendes Polypeptid von T-Zellen, monoklonale Antikörper sowie die Herstellung und deren Verwendung
JP3871503B2 (ja) 1999-08-30 2007-01-24 日本たばこ産業株式会社 免疫性疾患治療剤
JP4210454B2 (ja) * 2001-03-27 2009-01-21 日本たばこ産業株式会社 炎症性腸疾患治療剤
US8022058B2 (en) 2000-05-10 2011-09-20 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Agents for preventing and treating disorders involving modulation of the RyR receptors
US7393652B2 (en) 2000-05-10 2008-07-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for identifying a chemical compound that directly enhances binding of FKBP12.6 to PKA-phosphorylated type 2 ryanodine receptor (RyR2)
US7879840B2 (en) 2005-08-25 2011-02-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Agents for preventing and treating disorders involving modulation of the RyR receptors
US7718644B2 (en) 2004-01-22 2010-05-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Anti-arrhythmic and heart failure drugs that target the leak in the ryanodine receptor (RyR2) and uses thereof
JP3597140B2 (ja) * 2000-05-18 2004-12-02 日本たばこ産業株式会社 副刺激伝達分子ａｉｌｉｍに対するヒトモノクローナル抗体及びその医薬用途
JP4212278B2 (ja) 2001-03-01 2009-01-21 日本たばこ産業株式会社 移植片拒絶反応抑制剤
WO2004003544A1 (en) * 2002-06-26 2004-01-08 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the diagnosis and treatment of demyelinating inflammatory disorders
EP1603450A4 (en) 2003-03-07 2009-07-29 Univ Columbia METHODS USING TYPE 1 RYANODINE RECEPTOR
TWI476206B (zh) * 2003-07-18 2015-03-11 Amgen Inc 對肝細胞生長因子具專一性之結合劑
HN2004000285A (es) * 2003-08-04 2006-04-27 Pfizer Prod Inc ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET
US7435799B2 (en) * 2004-01-08 2008-10-14 Applied Molecular Evolution TNF-α binding molecules
US8710045B2 (en) 2004-01-22 2014-04-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Agents for preventing and treating disorders involving modulation of the ryanodine receptors
CA2562764A1 (en) * 2004-04-23 2005-11-03 Richard Kroczek Method for the treatment of t cell mediated conditions by depletion of icos-positive cells in vivo
US7397250B2 (en) * 2004-11-12 2008-07-08 Baker Hughes Incorporated High resolution resistivity earth imager
US7385401B2 (en) 2005-07-08 2008-06-10 Baker Hughes Incorporated High resolution resistivity earth imager
US7704990B2 (en) 2005-08-25 2010-04-27 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Agents for preventing and treating disorders involving modulation of the RyR receptors
US7365545B2 (en) 2005-12-29 2008-04-29 Baker Hughes Incorporated Two-axial pad formation resistivity imager
WO2007111931A2 (en) * 2006-03-22 2007-10-04 Imperial Innovations Limited Compositions and methods relating to modulation of immune system components
TWI395754B (zh) * 2006-04-24 2013-05-11 Amgen Inc 人類化之ｃ-ｋｉｔ抗體
US9244059B2 (en) 2007-04-30 2016-01-26 Immutep Parc Club Orsay Cytotoxic anti-LAG-3 monoclonal antibody and its use in the treatment or prevention of organ transplant rejection and autoimmune disease
US20080279851A1 (en) 2007-05-07 2008-11-13 Medlmmune, Llc Anti-icos antibodies and their use in treatment of oncology, transplantation and autoimmune disease
WO2009009114A2 (en) * 2007-07-12 2009-01-15 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
US8753690B2 (en) 2008-02-27 2014-06-17 Biomet Biologics, Llc Methods and compositions for delivering interleukin-1 receptor antagonist
EP2259774B1 (en) 2008-02-27 2012-12-12 Biomet Biologics, LLC Methods and compositions for delivering interleukin-1 receptor antagonist
US8390294B2 (en) * 2008-07-23 2013-03-05 Baker Hughes Incorporated Multi-resolution borehole resistivity imaging
US8174266B2 (en) * 2008-07-23 2012-05-08 Baker Hughes Incorporated Multi-resolution borehole resistivity imaging
BRPI0921845A2 (pt) * 2008-11-12 2019-09-17 Medimmune Llc formulação aquosa estéril estável, forma de dosagem unitária farmacêutica, seringa pré-carregada, e, métodos para tratar uma doença ou distúrbio, para tratar ou prevenir rejeição, para esgotar células t que expressam icos em um paciente humano, e para interromper arquitetura central germinal em um órgão linfóide secundário de um primata
US8815242B2 (en) * 2009-05-27 2014-08-26 Synageva Biopharma Corp. Avian derived antibodies
WO2011020024A2 (en) * 2009-08-13 2011-02-17 The Johns Hopkins University Methods of modulating immune function
US9763875B2 (en) 2009-08-27 2017-09-19 Biomet Biologics, Llc Implantable device for production of interleukin-1 receptor antagonist
EP2531216B1 (en) 2010-02-04 2019-03-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Icos critically regulates the expansion and function of inflammatory human th17 cells
EP2691419B1 (en) * 2011-03-31 2016-11-09 INSERM - Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Antibodies directed against icos and uses thereof
CN109022465B (zh) 2011-10-28 2022-04-29 特瓦制药澳大利亚私人有限公司 多肽构建体及其用途
EP3508215A3 (en) 2012-12-03 2019-10-02 Bristol-Myers Squibb Company Enhancing anti-cancer activity of immunomodulatory fc fusion proteins
US10143725B2 (en) 2013-03-15 2018-12-04 Biomet Biologics, Llc Treatment of pain using protein solutions
CA2902831C (en) 2013-03-15 2023-04-25 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Anti-lag-3 binding proteins
US9895418B2 (en) 2013-03-15 2018-02-20 Biomet Biologics, Llc Treatment of peripheral vascular disease using protein solutions
US9878011B2 (en) 2013-03-15 2018-01-30 Biomet Biologics, Llc Treatment of inflammatory respiratory disease using biological solutions
US20140271589A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Biomet Biologics, Llc Treatment of collagen defects using protein solutions
US9950035B2 (en) * 2013-03-15 2018-04-24 Biomet Biologics, Llc Methods and non-immunogenic compositions for treating inflammatory disorders
US10208095B2 (en) 2013-03-15 2019-02-19 Biomet Manufacturing, Llc Methods for making cytokine compositions from tissues using non-centrifugal methods
US9758806B2 (en) 2013-03-15 2017-09-12 Biomet Biologics, Llc Acellular compositions for treating inflammatory disorders
US9833474B2 (en) 2013-11-26 2017-12-05 Biomet Biologies, LLC Methods of mediating macrophage phenotypes
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
US20160145344A1 (en) * 2014-10-20 2016-05-26 University Of Southern California Murine and human innate lymphoid cells and lung inflammation
US10441635B2 (en) 2014-11-10 2019-10-15 Biomet Biologics, Llc Methods of treating pain using protein solutions
MA41414A (fr) 2015-01-28 2017-12-05 Centre Nat Rech Scient Protéines de liaison agonistes d' icos
US9763800B2 (en) 2015-03-18 2017-09-19 Biomet C. V. Implant configured for hammertoe and small bone fixation
ME03819B (me) * 2015-03-23 2021-04-20 Jounce Therapeutics Inc Antitela za icos
US10786547B2 (en) 2015-07-16 2020-09-29 Biokine Therapeutics Ltd. Compositions, articles of manufacture and methods for treating cancer
NZ738875A (en) 2015-07-31 2023-06-30 Vascular Biogenics Ltd Motile sperm domain containing protein 2 and cancer
ES2836684T3 (es) * 2015-07-31 2021-06-28 Vascular Biogenics Ltd Proteína 2 que contiene el dominio del esperma móvil e inflamación
WO2017037203A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Immutep S.A.S. Anti-LAG-3 Antibodies
WO2017220990A1 (en) 2016-06-20 2017-12-28 Kymab Limited Anti-pd-l1 antibodies
WO2018029474A2 (en) 2016-08-09 2018-02-15 Kymab Limited Anti-icos antibodies
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
EP3497128A2 (en) 2016-08-09 2019-06-19 Kymab Limited Anti-icos antibodies
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
EP3534947A1 (en) 2016-11-03 2019-09-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
TWI788340B (zh) 2017-04-07 2023-01-01 美商必治妥美雅史谷比公司 抗icos促效劑抗體及其用途
JP6886854B2 (ja) * 2017-04-13 2021-06-16 シスメックス株式会社 被検物質の情報取得方法
GB201709808D0 (en) 2017-06-20 2017-08-02 Kymab Ltd Antibodies
US10981992B2 (en) * 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
GB201721338D0 (en) 2017-12-19 2018-01-31 Kymab Ltd Anti-icos Antibodies
US11629189B2 (en) 2017-12-19 2023-04-18 Kymab Limited Bispecific antibody for ICOS and PD-L1
EP3502140A1 (en) 2017-12-21 2019-06-26 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of tumor targeted icos agonists with t-cell bispecific molecules
IL314733A (en) * 2018-03-26 2024-10-01 Regeneron Pharma Humanized rodents for testing therapeutic agents
WO2019241730A2 (en) 2018-06-15 2019-12-19 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Increasing immune activity through modulation of postcellular signaling factors
MA55805A (fr) 2019-05-03 2022-03-09 Flagship Pioneering Innovations V Inc Métodes de modulation de l'activité immunitaire
EP3990492A1 (en) 2019-06-27 2022-05-04 F. Hoffmann-La Roche AG Novel icos antibodies and tumor-targeted antigen binding molecules comprising them
EP4076434A1 (en) 2019-12-17 2022-10-26 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Combination anti-cancer therapies with inducers of iron-dependent cellular disassembly
KR20230008751A (ko) 2020-05-12 2023-01-16 인쎄름 (엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔) 피부 t-세포 림프종 및 tfh 유래된 림프종을 치료하는 신규한 방법
GB202007099D0 (en) 2020-05-14 2020-07-01 Kymab Ltd Tumour biomarkers for immunotherapy
US20230355804A1 (en) 2020-06-29 2023-11-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Viruses engineered to promote thanotransmission and their use in treating cancer
IL301202A (en) 2020-09-10 2023-05-01 Vascular Biogenics Ltd Antibodies against MOTILE SPERM DOMAIN CONTAINING PROTEIN 2 and methods of using them
WO2022212784A1 (en) 2021-03-31 2022-10-06 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer
CA3219336A1 (en) 2021-05-18 2022-11-24 Kymab Limited Uses of anti-icos antibodies
GB202107994D0 (en) 2021-06-04 2021-07-21 Kymab Ltd Treatment of cancer
CA3224374A1 (en) 2021-06-29 2023-01-05 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Immune cells engineered to promote thanotransmission and uses thereof
WO2023222854A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Kymab Limited Uses of anti-icos antibodies
WO2024040195A1 (en) 2022-08-17 2024-02-22 Capstan Therapeutics, Inc. Conditioning for in vivo immune cell engineering
WO2024077191A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additionalpolypeptides and their use in treating cancer
WO2024151687A1 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Genetic switches and their use in treating cancer

Family Cites Families (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH642458A5 (en) 1980-04-25 1984-04-13 Hoffmann La Roche Immunological method
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
JP2615456B2 (ja) 1987-11-13 1997-05-28 松下電器産業株式会社 スピーカシステム
DE122006000007I1 (de) 1987-12-31 2006-04-27 Tanox Biosystems Inc Antigene epitope, die sich ausschlisslich auf ige-tragenden B-Lymphocyten befinden.
US5506126A (en) 1988-02-25 1996-04-09 The General Hospital Corporation Rapid immunoselection cloning method
US6075181A (en) * 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US6641809B1 (en) 1990-03-26 2003-11-04 Bristol-Myers Squibb Company Method of regulating cellular processes mediated by B7 and CD28
DK0814159T3 (da) 1990-08-29 2005-10-24 Genpharm Int Transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US5770197A (en) 1991-06-27 1998-06-23 Bristol-Myers Squibb Company Methods for regulating the immune response using B7 binding molecules and IL4-binding molecules
JP3162438B2 (ja) 1991-09-12 2001-04-25 住友製薬株式会社 高感度特異的抗体測定法
CA2140638C (en) 1992-07-24 2010-05-04 Raju Kucherlapati Generation of xenogeneic antibodies
CN1701814A (zh) 1992-11-13 2005-11-30 马克斯普朗克科学促进协会 作为血管内皮生长因子受体的f1k－1
CA2161351C (en) 1993-04-26 2010-12-21 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5484892A (en) 1993-05-21 1996-01-16 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Monoclonal antibodies that block ligand binding to the CD22 receptor in mature B cells
WO1995024217A1 (en) * 1994-03-08 1995-09-14 Dana-Farber Cancer Institute Methods for modulating t cell unresponsiveness
US6719972B1 (en) 1994-06-03 2004-04-13 Repligen Corporation Methods of inhibiting T cell proliferation or IL-2 accumulation with CTLA4- specific antibodies
US5747461A (en) 1994-07-26 1998-05-05 Markov; Angel K. Synergistic administration of cyclosporine and fructose diphosphate
JP3580948B2 (ja) 1995-05-02 2004-10-27 日本たばこ産業株式会社 ヒト由来ｃｅｔｐに反応性を有するモノクローナル抗体及びヒト由来ｃｅｔｐの定量方法
US5914112A (en) 1996-01-23 1999-06-22 Genentech, Inc. Anti-CD18 antibodies in stroke
DK0877626T3 (da) 1996-01-23 2002-12-30 Univ Vermont Anti-CD18 antistoffer til anvendelse mod slagtilfælde
CA2266346A1 (en) 1996-09-18 1998-03-26 Zetesis S.P.A. Use of proteins as agents against autoimmune diseases
DE69739725D1 (de) 1996-11-08 2010-02-11 Biogen Idec Inc Identifikation von bindungs- interaktionen zwischen gewissen antikorpern und den humanen costimulatorischen antigenen b7.1 (cd80) und b7.2 (cd28)
AU4145597A (en) 1997-02-20 1998-09-09 Cedars-Sinai Medical Center Ulcerative colitis panca secretory vesicle antigen and methods of using sa me
US7112655B1 (en) * 1997-02-27 2006-09-26 Japan Tobacco, Inc. JTT-1 protein and methods of inhibiting lymphocyte activation
JP3521382B2 (ja) 1997-02-27 2004-04-19 日本たばこ産業株式会社 細胞間接着及びシグナル伝達を媒介する細胞表面分子
GB9704174D0 (en) 1997-02-28 1997-04-16 Univ Birmingham Agent for medical treatment
NZ500078A (en) 1997-04-07 2001-10-26 Genentech Inc Humanized anti-VEGF antibodies and their use in inhibiting VEGF-induced angiogenesis in mammals
DK0989858T3 (da) 1997-06-12 2004-08-09 Applied Research Systems CD28/CTLA-4-inhiberende peptidomimetika og farmaceutiske præparater deraf
US7259247B1 (en) * 1997-09-23 2007-08-21 Bundersrespublik Deutschaland Letztvertreten Durch Den Direktor Des Robert-Koch-Institutes Anti-human T-cell costimulating polypeptide monoclonal antibodies
DE19821060A1 (de) * 1997-09-23 1999-04-15 Bundesrepublik Deutschland Let Ko-stimulierendes Polypeptid von T-Zellen, monoklonale Antikörper sowie die Herstellung und deren Verwendung
US6297022B1 (en) 1997-10-08 2001-10-02 Smithkline Beecham Corporation Method of identifying agonists and antagonists for tumor necrosis related receptor TR1
JPH11228442A (ja) 1998-02-09 1999-08-24 Cypros Pharmaceut Corp 臓器移植後のシクロスポリン投与量を低減するためのフルクトース二リン酸の使用
AU767241B2 (en) 1998-09-14 2003-11-06 Qiang Xu Immunosuppressive agents
JP2000154151A (ja) 1998-09-14 2000-06-06 Kyo Jo 免疫抑制剤
JP2003532370A (ja) 1998-10-07 2003-11-05 ミレニアム・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 新規なＴｈ２特異的分子およびその使用方法
DK2332978T3 (da) * 1999-02-03 2014-06-23 Amgen Inc Nye polypeptider, der er involveret ved et immunrespons
WO2000067788A2 (en) 1999-05-06 2000-11-16 Genetics Institute, Inc. Use of soluble costimulatory molecules to enhance immune responses
US6613327B1 (en) 1999-07-28 2003-09-02 Genetics Institute, Inc. Methods of preventing immune-mediated abortion by inhibiting a CD28-mediated costimulatory signal
AU6458400A (en) 1999-08-11 2001-03-13 Isis Innovation Limited Nucleic acid, polypeptides, assays, therapeutic methods and means
JP4210454B2 (ja) 2001-03-27 2009-01-21 日本たばこ産業株式会社 炎症性腸疾患治療剤
JP3871503B2 (ja) 1999-08-30 2007-01-24 日本たばこ産業株式会社 免疫性疾患治療剤
JP2003508088A (ja) 1999-09-03 2003-03-04 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド ５２個のヒト分泌タンパク質
EP1218504B1 (en) 1999-09-21 2007-07-11 Genetics Institute, LLC Gl50 molecules and uses therefor
CA2386641A1 (en) 1999-10-29 2001-05-10 Human Genome Sciences, Inc. 32 human secreted proteins
WO2001064704A1 (en) 2000-03-02 2001-09-07 Mayo Foundation For Medical Education And Research hB7-H2, A NOVEL CO-STIMULATORY MOLECULE
JP3597140B2 (ja) 2000-05-18 2004-12-02 日本たばこ産業株式会社 副刺激伝達分子ａｉｌｉｍに対するヒトモノクローナル抗体及びその医薬用途
RU2262511C2 (ru) 2000-05-18 2005-10-20 Джапан Тобакко, Инк. Человеческое моноклональное антитело против ailim, костимулирующей молекулы передачи сигнала, и его фармацевтическое применение
WO2002044364A2 (en) 2000-11-28 2002-06-06 Amgen Inc. Polypeptides involved in immune response
JP4212278B2 (ja) 2001-03-01 2009-01-21 日本たばこ産業株式会社 移植片拒絶反応抑制剤

Also Published As

Publication number Publication date
IL147448A0 (en) 2002-08-14
NO333921B1 (no) 2013-10-21
TWI304811B (en) 2009-01-01
EP2295467A1 (en) 2011-03-16
TR200202736T1 (tr) 2005-06-21
US20040180052A1 (en) 2004-09-16
SK287862B6 (sk) 2012-02-03
EP1158004B1 (en) 2010-07-07
TR200200781T1 (tr) 2003-02-21
CZ302902B6 (cs) 2012-01-11
IL207060A0 (en) 2010-12-30
SK2412002A3 (en) 2002-07-02
BRPI0106646B1 (pt) 2018-02-14
US6803039B2 (en) 2004-10-12
CA2344086A1 (en) 2001-11-18
CA2344086C (en) 2009-02-10
CZ200254A3 (cs) 2002-06-12
SG135917A1 (en) 2007-10-29
HK1043371A1 (en) 2002-09-13
KR100609442B1 (ko) 2006-08-03
AU2004201697A1 (en) 2004-05-20
NZ533324A (en) 2005-07-29
CY1110816T1 (el) 2015-06-10
CN1439022A (zh) 2003-08-27
BR0106646A (pt) 2002-04-16
MXPA02000687A (es) 2004-08-12
CN100482688C (zh) 2009-04-29
AU5674701A (en) 2001-11-26
US20020102658A1 (en) 2002-08-01
CA2722134A1 (en) 2001-11-18
WO2001087981A2 (en) 2001-11-22
HUP0202532A3 (en) 2005-07-28
US20080199466A1 (en) 2008-08-21
TR200202735T1 (tr) 2005-04-21
HK1043371B (zh) 2010-10-08
EP1158004A2 (en) 2001-11-28
WO2001087981A3 (en) 2002-06-13
AR058366A2 (es) 2008-01-30
PE20011337A1 (es) 2002-01-02
MY137640A (en) 2009-02-27
AU773625B2 (en) 2004-05-27
AR028927A1 (es) 2003-05-28
NO20020263D0 (no) 2002-01-17
SG153626A1 (en) 2009-07-29
HUP0202532A2 (hu) 2002-11-28
DE60142500D1 (de) 2010-08-19
IL147448A (en) 2011-01-31
SG165161A1 (en) 2010-10-28
US20120039874A1 (en) 2012-02-16
HU230770B1 (hu) 2018-03-28
US7988965B2 (en) 2011-08-02
EP1158004A3 (en) 2002-07-24
EP2216343A1 (en) 2010-08-11
PT1158004E (pt) 2010-10-04
NO20020263L (no) 2002-03-18
TWI316546B (en) 2009-11-01
TW200825171A (en) 2008-06-16
ATE473243T1 (de) 2010-07-15
CA2635963A1 (en) 2001-11-18
CA2635963C (en) 2011-01-25
KR20020026542A (ko) 2002-04-10
KR20050008858A (ko) 2005-01-21
US7166283B2 (en) 2007-01-23
AU4388101A (en) 2001-11-22
DK1158004T3 (da) 2010-08-16
JP2002034581A (ja) 2002-02-05
SG187990A1 (en) 2013-03-28
NZ516411A (en) 2004-08-27
IL207060A (en) 2017-02-28
JP3597140B2 (ja) 2004-12-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2347758T3 (es) Anticuerpo monoclonal humano contra la molecula ailim coestimuladora y transductora de señales y uso farmaceutico del mismo.
US7465445B2 (en) Methods of preventing or treating graft versus host reaction by administering an antibody or portion thereof that binds to AILIM
RU2262511C2 (ru) Человеческое моноклональное антитело против ailim, костимулирующей молекулы передачи сигнала, и его фармацевтическое применение
JP4386776B2 (ja) 副刺激伝達分子ａｉｌｉｍに対するヒトモノクローナル抗体及びその医薬用途
JP3543966B2 (ja) 副刺激伝達分子ａｉｌｉｍに対するヒトモノクローナル抗体及びその医薬用途
JP4234992B2 (ja) 副刺激伝達分子ａｉｌｉｍに対するヒトモノクローナル抗体及びその医薬用途
CA2477192A1 (en) Human monoclonal antibody against a costimulatory signal transduction molecule ailim and pharmaceutical use thereof