SK287862B6 - Human monoclonal antibody against molecule AILIM, DNA encoding antibody, vector comprising DNA, cell producing antibody, genetic recombinant host, pharmaceutical composition comprising antibody and use of antibody - Google Patents

Abstract

Described is a human monoclonal antibody against molecule AILIM, wherein a heavy chain variable region has an amino acid sequence defined in claims; DNA encoding a heavy chain variable region polypeptide of the human antibody; a vector comprising the DNA; a cell producing the antibody; a genetic recombinant host; a pharmaceutical composition comprising the antibody and use of the antibody.

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka ľudských protilátok, ktoré sa viažu na AIL1M (imunomodulačná molekula vyvolávajúca aktiváciu lymfocytov, tiež nazývaná ako 1COS (vyvolaný ko-stimulátor); ľudských monoklonálnych protilátok, ktoré sa viažu na A1LIM alebo na jej časť; DNA, ktorá kóduje uvedenú ľudskú monoklonálnu protilátku alebo jej časť, alebo časti uvedenej DNA; buniek (zahrnujúcich genetické rekombinantne bunky) produkujúcich uvedenú ľudskú monoklonálnu protilátku alebo jej časť; ľudskej monoklonálnej protilátky alebo jej časti, ktorá je produkovaná uvedenými genetickými rekombinantnými bunkami; farmaceutickej kompozície obsahujúcej uvedenú ľudskú monoklonálnu protilátku alebo jej časť; farmaceutickej kompozície obsahujúcej protilátku proti A1LIM na liečbu porúch týkajúcich sa oneskorenej alergie; metódy identifikácie, kvantifikácie alebo testovania látok, ktoré sa viažu na AILIM alebo na ligand AIL1M; kitu použitého pre túto uvedenú metódu.

Doterajší stav techniky

Žijúci organizmus živočíchov má systémy imunitnej odpovede, ktoré vylúčia patogenické mikroorganizmy (vírusy, baktérie, parazity atď.) alebo iné cudzie telesá (ktoré sú v nasledujúcom teste nazývané „antigén“), ktoré vnikli do organizmu. Jeden z týchto systémov sa nazýva vrodená imunitná odpoveď a druhý sa nazýva získaná imunitná odpoveď. Prvý zo spomínaných systémov je vylučovací mechanizmus zahrnujúci fagocytózu pomocou fagocytov (polymorfojadrové leukocyty, monocyty, makrofágy atď.). Tento systém ďalej zahrnuje atak pomocou prirodzeného zabíjača (natural killer (NK)) buniek a nešpecifickú rekognizáciu takú ako opsonizácia antigénu pomocou komplementov. Druhý systém získanej imunitnej odpovede je vylučovací mechanizmus pomocou lymfocytov (hlavne T buniek a B buniek), ktoré získali špecifitu na antigén (menovite aktivované lymfocyty). B bunky, ktoré získali antigénovú špecifitu, napadnú antigén, ktorý existuje zvonku buniek cez tvorbu protilátok špecifických ku antigénu. T bunky, ktoré získali antigénovú špecifitu (menovite, aktivované T bunky), sú roztriedené na pomocné T bunky a cytotoxické T bunky (cytotoxické lymfocyty, CTL). Pomocné T bunky regulujú diferenciáciu B buniek a tvorbu protilátok a ničia antigén spolupracujúci s fagocytmi. Ďalej, CTL napádajú vírusom infikované bunky (Experimental Medicíne: SUPPLEMENT, „Bio Science Term Library, Immunity“, Yodosha, pp. 14 - 17 (1995)).

Toto získanie antigénovej špecifity pomocou T buniek (menovite aktivácia T buniek) je iniciované cez rozpoznanie T bunkami, antigén bol prezentovaný pomocou „buniek prezentujúcich antigén“ buniek (APC) takých ako makrofág, B bunky alebo dendritické bunky. Proces „buniek prezentujúcich antigén“ sa uskutočňuje cez viazanie na hlavný histokompatibilný komplex (MHC). T bunky prijímajú primárny signál na aktiváciu buniek (alebo na získanie špecifity) rozpoznaním antigénov pomocou „buniek prezentujúcich antigén“ cez komplex medzi T bunkovým receptorom (TcR) a CD3 antigénom existujúcim na povrchu bunkovej membrány (TcR/CD3 komplex).

Ale, samotný TcR/CD3 komplex sprostredkujúci primárny signál nemôže dostatočne aktivovať T bunky, čo vedie k nereaktívnosti alebo klonálnej anergii, takže bunky potom nemôžu reagovať na určitú stimuláciu. Autokrín interleukínu 2 (IL-2) je nevyhnutný na aktiváciu T buniek, na diferenciáciu na antigén špecifické T bunkové klony a na proliferáciu. V klonálnej anergii sú T bunky inaktivované, neprodukujú IL-2 a neprebieha bunkové delenie. Konkrétne, aktivácia T buniek bola sprevádzaná tvorbou cytokínov takých ako IL-2 a vyžaduje sekundárny signál, ktorý nasleduje po prvom signáli cez TcR/CD3 komplex. Tento sekundárny signál sa nazýva kostimulačný signál.

T bunky príjmu sekundárny signál a prenesú ho do buniek interakciou (bunková adhézia) s molekulami inými než TcR/CD3 komplex na T bunkovom povrchu. Tento sekundárny signál sa vyhne bunkovej anergii (klonálna anergia) a aktivuje bunky.

Aj keď určitá časť mechanizmu prenosu sekundárneho signálu medzi bunkami prezentujúcimi antigén a lymfocytmi takými ako T bunky nie je ešte objasnená podrobne, štúdie potvrdzujú, že dôležitý faktor pre prenos sekundárneho signálu je interakcia CD28 (tiež nazývaná Tp44, T44 alebo 9,3 antigén), ktorá je molekulou bunkového povrchu exprimovanou hlavne na T bunky a bunky týmusu, s CD80 (tiež nazývaná B7-1, B7, BB1 alebo B7/BB1), ktorá je molekulou bunkového povrchu exprimovanou na bunky prezentujúce antigén (makrofágy, monocyty, dendritické bunky atď.) a s CD86 (tiež nazývaná B7-2 alebo B70), ktorá je molekulou bunkového povrchu na bunkách prezentujúcich antigén (menovite bunková adhézia na viazanie medzi týmito molekulami). Ale experimentálne sa zistilo, že interakcia cytolitického T lymfocytu spojeného s antigénom 4 (CTLA-4), ktorého expresia sa má zvyšovať v závislosti od sekundárneho signálu, s CD80 (B7-1) a CD86 (B7-2) (menovite bunková adhézia na viazanie medzi týmito molekulami) hrá dôležitú úlohu v regulácii T bunkovej aktivácie pomocou sekundárneho signálu. Inými slovami, regulácia T bunkovej aktivácie pomocou prenosu sekundárneho signálu zahŕňa aspoň interakciu medzi CD28 a CD80/CD86, zvýšenie CTLA-4 expresie, ktorá je závislá od interakcie a interakciu medzí CTLA-4 a CD80/CD86.

CD28 je známa kostimulačná molekula prenášajúca sekundárny signál (kostimulačný signál) potrebný na aktiváciu T buniek a na vyvarovanie sa anergii. Sekundárny signál prenesený pomocou väzby tejto molekuly na kostimulačné molekuly, na CD80 (B7-1) a CD86 (B7-2), na bunky prezentujúce antigén (bunková adhézia na väzbu medzi týmito molekulami), stabilizuje mRNA cytokínov Thl-typu a následne podporuje tvorbu T buniek veľkého množstva cytokínov Thl-typu takých ako IL-2, IFNy a TNFa. Expresia CTLA-4 je vyvolaná primárnym signálom preneseným TcR/CD3 a expresia je tiež zvýšená sekundárnym signálom preneseným väzbou medzi CD28 a CD80. Bolo dokázané, že CTLA-4 prijíma tieto signály na inhibíciu T bunkovej funkcie, ktorá je protikladom ku aktivácii T buniek sekundárnym signálom preneseným CD28.

Ľudské CD28 a CTLA-4 sú glykoproteíny typu I s molekulovou hmotnosťou 44 kD, respektíve 41 až 43 kD. Obidva majú doménu podobnú imunoglobulínu, patria do imunoblobulínovej super rodiny, a majú funkciu ako molekula bunkovej adhézie a funkciu ako molekula prenášajúca signál.

Ľudská CD28 vytvára homodimér s disulfidovou väzbou, zatiaľ čo CTLA-4 existuje ako monomér. CD28 a CTLA-4 gény sú lokalizované v „2q33“ na ľudskom chromozóme a „1C“ v myšom chromozóme a sú zložené zo štyroch (4) exónov. Ľudská CD28 a CTLA-4 sú zložené z 220 respektíve 223 aminokyselín, zahrnujúcich vedúce sekvencie, aminokyselinová homológia medzi nimi je 20 až 30 %.

Ligandy pre CD28 a CTLA-4 sú v ľuďoch a myšiach CD80 (B7-1) a CD86 (B7-2). CTLA-4 má asi 20krát vyššiu afinitu k obidvom ligandom ako CD28. Bolo objavené, že aminokyselinová sekvencia so štruktúrou „MYPPPY (Met-Tyr-Pro-Pro-Pro-Tyr)“ uchovávaná v živočíšnych druhoch je dôležitá pri väzbe CD28 a CTLA-4 na CD80 (B7-1). Bolo dokázané, že ak CD28 je stimulovaná, PI3 kináza (fosfoinozitid 3 kináza, PI3K) sa spája s fosforylovaným tyrozínovým zvyškom do čiastočnej sekvencie „YMNM (Tyr-Met-Asn-Met)“ CD28 a CD28 hrá dôležitú úlohu v medzicelulámom signálnom prenose prostredníctvom tejto „YxxM“ štruktúry. Ďalej, bolo dokázané, že CTLA-4 má tiež sekvenciu reprezentovanú „YxxM“, menovite „YVKM“ (Tyr-Val-Lys-Met)“ v jej cytoplazmatickej oblasti a tiež bolo dokázané, že po stimulácii sa SYP spája s touto sekvenciou.

CD28 je špecificky exprimovaná v tymocytoch a periférnych krvných T bunkách a CTLA-4 je špecificky exprimovaná v aktivovaných T bunkách (Celí Engineering: SUPPLEMENT, „Elandbook of Adhesion Molecule“, Shujunsha, pp. 93-102 (1994); ibid. pp. 120-136; Experimental Medicíne: SUPPLEMENT, „BIO SCIENCE Term Library, Immunity“, Yodosha, pp. 94-98 (1995); Experimental Medicíne: SUPPLEMENT, „BIO SCIENCE Term Library, Intracellular Signál Transduction“, Yodosha, pp. 58-59 (1997); Nihon Rinsho, Vol. 55, No. 6, pp. 215-220 (1997).

Pri regulácii T bunkovej funkcie (aktivácia a inhibícia funkcie T buniek), bolo zistené, že sú dôležité interakcie medzi viacerými molekulami takými ako kostimulačné molekuly (CD28, CD80(B7-l), CD86(B7-2) atď.) a CTLA-4, ktorá s nimi kooperuje, a tento fakt upriamil pozornosť na vzťah medzi týmito molekulami a ochoreniami a liečbou ochorení pomocou regulácie funkcie týchto molekúl.

Ako je uvedené, aj keď žijúci organizmus aktivuje svoj systém získanej imunitnej odpovede proti antigénom, ktoré sú cudzími telesami pre organizmus, tiež má imunologickú toleranciu tak, že nenastane imunitná odpoveď proti jeho vlastnej zložke (autoantigénu). Ak imunologická tolerancia sa zníži z určitých dôvodov, nastáva imunitná odpoveď na autoantigén, indukujú sa T bunky reaktívne na autoantigén tým istým mechanizmom, ako je uvedený skôr a nastáva abnormálny stav imunity a tak vznikajú rôzne autoimunitné ochorenia.

Inými slovami, keď nestimulovaný antigén prezentujúcich buniek (APC) v normálnych tkanivách neexprimuje kostimulačné molekuly, tak imunitný systém žijúceho organizmu je normálny, T bunky sú v neodpovedajúcom stave, je udržaná imunologická tolerancia, aj keď existujú T bunky reaktívne na autoantigén, ktoré reagujú s autoantigénom. Bolo potvrdené, že v abnormálnom stave imunity je aktivovaných viacej T buniek reaktívnych na autoantigén a kvôli abnormálnemu nadbytku a plynulej expresii kostimulačných molekúl vznikajú autoimunitné ochorenia.

Z tohto hľadiska je možnosť liečby rôznych autoimunitných ochorení prostredníctvom modulovania prenosu kostimulačných signálov, napríklad bol navrhnutý spomínaný prenos signálu medzi CD28/CTLA-4 a CD80/CD86.

Výsledky týchto pokusov neboli ešte objasnené v detailoch mechanizmu aktivácie T bunky prostredníctvom interakcie medzi kostimulačnými molekulami a súvisiacimi molekulami. Iné neznáme molekuly môžu byť zahrnuté v tomto mechanizme.

V poslednej dobe bola identifikovaná nová kostimulačná molekula podobná opísanej „CD28“ a CTLA-4“, o ktorej sa predpokladá, že vykonáva prenos sekundárneho signálu (ko-stimulačný signál) potrebný na aktiváciu lymfocytov takých ako T bunky a funkčná regulácia je prepojená s uvedeným signálom aktivovaných lymfocytov takých ako aktivované T bunky. Táto molekula bola označená ako AIL1M (imunomodulačná molekula vyvolávajúca aktiváciu lymfocytov) (v ľuďoch, myšiach a krysách: Int. Immunol., Vol. 12, No. 1, p. 51-55, 2000), tiež sa nazýva ako ICOS (vyvolateľný ko-stimulátor) (v ľuďoch: Náture, Vol. 397, No. 6716, p. 263-266, 1999)).

Na druhej strane, nedávno boli identifikované nové molekuly nazývané B7h, B7RP-1, GL50 alebo L1COS, ktoré sú Ugandami (AILIM ligandy) interagujúcimi s touto kostimulačnou prenosovou molekulou AILIM (ICOS). (Náture. Vol. 402, No. 6763, pp. 827-832, 1999; Náture Medicíne, Vol. 5, No. 12, pp. 1365-1369, 1999; J. Immunology, Vol. 164, pp. 1653-1657, 2000; Curr. Biol., Vol. 10, No. 6, pp. 333-336, 2000).

Identifikácia týchto dvoch nových molekúl, konkrétne AILIM (ICOS) a B7RP-1 (B7h, GL50, LICOS), ako dráh signálneho prenosu pre kostimulačný signál nevyhnutný na uvedenú aktiváciu lymfocytov takých ako T bunky a kontrola funkcie aktivovaných T buniek, prezradila, že existuje nová tretia dráha prostredníctvom interakcie medzi AILIM (ICOS) a B7RP-1 (B7h, GL50, LICOS), okrem známej prvej a druhej signálnej dráhy, ktoré sú už známe transdukčné dráhy medzi CD28 a CD80 (B7-1)/CD86 (B7-2), a medzi CTLA4 a CD80 (B7-1)/CD86 (B7-2).

Štúdie na biologických funkciách týchto nových molekúl, funkčná kontrola lymfocytov, takých ako T bunky, sa vykonávajú cez prenos tretieho kostimulačnébo signálu preneseného molekulami a je sledovaný vzťah medzi novým prenosom signálu a ochoreniami (J. Immunol., 166(1), pp. 1, 2001; J. Immunol., 165 (9), pp. 5035, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun., 276(1), pp. 335, 2000; Immunity, 13(1), pp. 2000; J. Exp. Med., 192(1), pp. 53, 2000; Eur. J Immunol., 30(4), pp. 1040, 2000; WO 01/15732).

Podstata vynálezu

Konkrétne, predmetom predkladaného vynálezu je objavenie biologických funkcií novej molekuly AILIM, ktorá je považovaná, podobne ako „CD28“ a „CTLA-4“, za molekulu, ktorá prenáša sekundárny signál (kostimulačný signál), ktorý je nevyhnutný na aktiváciu lymfocytov, takých ako T bunky a ktorý kontroluje funkciu aktivovaných lymfocytov, takých ako aktivované T bunky, pomocou pracovania so signálom. Ďalej sú predmetom predkladaného vynálezu vzťahy medzi expresiou AILIM a ochoreniami, ako aj spôsob a farmaceutický prostriedok, ktorý inhibuje rozvoj rôznych ochorení závislých od dráhy expresie AILIM alebo liečba ochorení prostredníctvom kontroly biologických funkcií AILIM použitím lekárskych a farmaceutických metód (napríklad liečiv takých ako monoklonálna protilátka a nízko molekulová zlúčenina).

Na dosiahnutie uvedených cieľov pôvodcovia aktívne študovali ľudské protilátky (najmä ľudské monoklonálne protilátky) proti živočíšnym AILIM (najmä ľudská AILIM) pomocou imunizácie transgénovej myši pripravenej použitím geneticky rekombinantých techník na tvorbu ľudských protilátok s AILIM (konkrétne frakcia bunkovej membrány buniek exprimujúcich ľudský AILIM), a ako prví na svete mali úspech pri príprave rôznych monoklonálnych protilátok, ktoré sa viažu na ľudskú AILIM, najmä tých, ktoré sa viažu na ľudskú AILIM a ktoré regulujú prenos signálu sprostredkovaného ľudskou AILIM.

Keďže protilátky (najmä monoklonálne protilátky) podľa tohto vynálezu sú získané z ľudí, nevyvolávajú žiadne vážne imunitné reakcie vďaka imunogenite voči ľuďom, HAMA (ľudská proti-myšia antigenita), čo by bol veľký problém (vedľajší efekt) pri terapii využívajúcej farmaceutiká, ktoré obsahujú protilátky získané zo živočíchov (okrem ľudí) takých ako myši, čo dramaticky zvyšuje hodnotu protilátky v medicíne.

Teda, ľudské protilátky (najmä ľudské monoklonálne protilátky), ktoré sa viažu na živočíšne AILIM (najmä ľudská AILIM) podľa tohto vynálezu a farmaceutické kompozície obsahujúce uvedené ľudské protilátky (najmä ľudské monoklonálne protilátky), sú vhodné ako liečivá, ktoré kontrolujú, bez vyvolania imunitnej reakcie vďaka HAMA v hostiteľovi, rôzne fyziologické reakcie týkajúce sa prenosu ko-stimulačného signálu na bunky exprimujúce AILIM sprostredkovaného AILIM (napríklad proliferácia buniek exprimujúcich AILIM, tvorba cytokínu pomocou buniek exprimujúcich AILIM, cytolýza alebo apoptóza buniek exprimujúcich AILIM a aktivita, ktorá vyvoláva cytotoxicitu závislú od protilátky proti bunkám exprimujúcim AILIM atď.) a/alebo sú tiež užitočné ako liečivá na potlačenie a prevenciu rozvoja symptómov a/alebo progresie rôznych porúch týkajúcich sa prenosu signálu sprostredkovaného uvedenou AILIM a ako liečivo na liečbu alebo prevenciu uvedených porúch.

Špecificky, farmaceutické kompozícií v súlade s týmto vynálezom sú schopné kontrolovať (potlačenie alebo stimuláciu) proliferáciu buniek exprimujúcich AILIM alebo tvorbu cytokínu (napríklad interferón γ alebo interleukín 4 atď.) pomocou buniek exprimujúcich AILIM, týmto je umožnené potlačenie rôznych patologických stavov a je umožnená liečba alebo prevencia rôznych porúch spôsobených odlišným fyziologickým fenoménom týkajúcim sa prenosu signálu sprostredkovaného AILIM.

Použitie farmaceutických kompozícii v súlade s týmto vynálezom umožňuje potlačenie, prevenciu a/alebo liečbu, napríklad, rôznych porúch (napríklad reumatoidná artritída, skleróza multiplex, autoimunitná tyroiditída, alergická dermatitída kontaktného typu, chronická zápalová dermatóza taká ako plochy lišaj, systematický lupus erytematózus, diabetes závislý od inzulíne, psoriáza atď.) zatriedených na autoimunitné alebo alergické ochorenia (najmä autoimunitné ochorenie a oneskorené alergie spôsobené celulámou imunitou); artropatie (napríklad reumatoidnej artritídy (RA) a osteoartritídy (OA)), zápalov (napr. hepatitídy); reakcie hostiteľ versus transplantát (GHV reakcia); ochorenia hostiteľ versus transplantát; imunitnej reakcie sprevádzajúcej transplantáciu (homoplasty alebo heteroplasty) tkaniva (tkanív takých ako koža, rohovka, kosť atď.) alebo orgánu (pečeň, srdce, pľúca, oblička, pankreas atď.); imunitnej odpovede spustenej cudzím antigénom alebo autoantigénom (napríklad tvorba protilátok proti uvedenému antigénu, bunková proliferácia, tvorba cytokínov); a porúch, ktoré by mohli byť spôsobené abnormálnou intestinálnou imunitou (konkrétne zápalové intestinálne poruchy (najmä klonové ochorenie a ulceratívna kolitída) a alergia súvisiaca s potravinami).

Okrem toho, v oblasti supresie/liečby imunitnej reakcie sprevádzajúcej transplantáciu uvedených tkanív a orgánov je možnosť zvýšiť supresívny účinok na reakciu transplantátu známymi imunosupresívnymi látkami, použitím farmaceutickej kompozície tohto vynálezu spolu s uvedenými liečivami, ktoré by boli použiteľné na supresiu imunitnej reakcie v takomto ošetrení transplantátu.

Ale farmaceutická kompozícia predkladaného vynálezu môže byť aplikovaná pri liečbe alebo prevencii určitých zápalových ochorení, na ktoré sú indikované rôzne steroidy ako antiflogistiká.

Farmaceutická kompozícia predkladaného vynálezu môže byť aplikovaná pri zápalových ochoreniach, napríklad zápal sprevádzajúci rôzne artritídy (reumatoidná artritída, osteoartritída, pneumónia, hepatitída (zahrnujúca vírusovú hepatitídu), zápal sprevádzajúci infekčné ochorenia, zápalové ochorenia pečene, intestinálna enteritída, nefritída (zápal sprevádzajúci glomerulámu nefritídu, nefrofibróza), gastritída, angiitída, pankreatitída, peritonitída, bronchitída, myokarditída, zápal malého mozgu, zápal pri postischemickom reperfúznom poškodení (myokardiálne ischemické reperfúzne poškodenie), zápal prisudzovaný imunitnej reakcii po transplantácii tkaniva a orgánu, horúčka, rôzne kožné zápaly (psoriáza, alergická dermatitída kontaktného typu, plochý lišaj, ktorý je chronické zápalové kožné ochorenie), zápal pri mnohonásobnom orgánovom zlyhaní, zápal po operácii PTCA alebo PTCR a zápal sprevádzajúci artériosklerózu a autoimunitnú tyroiditídu.

V ďalšom, použitím metódy na identifikáciu látok, ktoré sa viažu na AILIM alebo AILIM ligand, ktorá je jedným z predmetov vynálezu, je možné skrínovať vybrané farmaceutiká (chemické syntetické zlúčeniny alebo protilátky) s potencionálnou účinnosťou pri liečbe rôznych porúch pomocou väzby na AILIM alebo AILIM ligandy a pri regulácii prenosu signálu sprostredkovaného ich interakciou.

Konkrétne je predmetom predkladaného vynálezu ľudská monoklonálna protilátka alebo jej časť, ktorá sa viaže na ľudskú AILIM, vyznačujúca sa tým, že variabilná oblasť ťažkého reťazca uvedenej ľudskej monoklonálnej protilátky má aminokyselinovú sekvenciu definovanú v bode (a) alebo (b):

(a) aminokyselinová sekvencia obsahujúca aminokyseliny od polohy 20 do 117 SEQ ID č; 28, alebo (b) aminokyselinová sekvencia obsahujúca aminokyseliny od polohy 20 do 117 SEQ 1D č: 28, v ktorej jeden až desať aminokyselinových zvyškov je vymazaných alebo substituovaných, alebo v ktorej jeden až desať aminokyselinových zvyškov je inzertovaných alebo pridaných, s podmienkou, že keď variabilná oblasť ťažkého reťazca má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v bode (b), uvedená protilátka má ktorúkoľvek z charakteristík uvedených v bodoch (i) až (iii):

(i) účinnosť na zabránenie zmiešanej lymfocytovej reakcie, (ii) účinnosť na vyvolanie signálnej transdukcie na indukciu interferónu γ, alebo (iii) účinnosť na vyvolanie bunkovej cytotoxicity závislej od antigénu proti bunkám exprimujúcim AILIM; ľudská monoklonálna protilátka alebo jej časť, ktorá sa viaže na ľudskú AILIM, vyznačujúca sa tým, že ťažký reťazec polypeptidu uvedenej ľudskej monoklonálnej protilátky má aminokyselinovú sekvenciu definovanú v bode (a) alebo (b):

(a) aminokyselinová sekvencia obsahujúca aminokyseliny od polohy 20 do 470 SEQ ID č: 28, alebo (b) aminokyselinová sekvencia obsahujúca aminokyseliny od polohy 20 do 470 SEQ ID č: 28, v ktorej jeden až desať aminokyselinových zvyškov je vymazaných alebo substituovaných alebo v ktorej jeden až desať aminokyselinových zvyškov je inzertovaných alebo pridaných, s podmienkou, že keď ťažký reťazec poplypeptidu má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v bode (b), uvedená protilátka má ktorúkoľvek z charakteristík uvedených v bodoch (i) až (iii):

(i) účinnosť na zabránenie zmiešanej lymfocytovej reakcie, (ii) účinnosť na vyvolanie signálnej transdukcie na indukciu interferónu γ, alebo (iii) účinnosť na vyvolanie bunkovej cytotoxicity závislej od antigénu proti bunkám exprimujúcim AILIM; ľudská monoklonálna protilátka alebo jej časť, ktorá sa viaže na ľudskú AILIM, vyznačujúca sa tým, že variabilná oblasť ľahkého reťazca uvedenej ľudskej monoklonálnej protilátky má aminokyselinovú sekvenciu definovanú v bode (a) alebo (b):

(a) aminokyselinová sekvencia obsahujúca aminokyseliny od polohy 23 do 116 SEQ ID č: 30, (b) aminokyselinová sekvencia obsahujúca aminokyseliny od polohy 23 do 116 SEQ ID č: 30, v ktorej jeden až desať aminokyselinových zvyškov je vymazaných alebo substituovaných alebo v ktorej jeden až desať aminokyselinových zvyškov je inzertovaných alebo pridaných, s podmienkou, že keď variabilná oblasť ľahkého reťazca má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v bode (b), uvedená protilátka má ktorúkoľvek z charakteristík uvedených v bodoch (i) až (iii):

(i) účinnosť na zabránenie zmiešanej lymfocytovej reakcie, (ii) účinnosť na vyvolanie signálnej transdukcie na indukciu interferónu γ, alebo (iii) účinnosť na vyvolanie bunkovej cytotoxicity závislej od antigénu proti bunkám exprimujúcim AILIM;

ľudská monoklonálna protilátka alebo jej časť, ktorá sa viaže na ľudskú AILIM, vyznačujúca sa tým, že ľahký reťazec polypeptidu uvedenej ľudskej monoklonálnej protilátky má aminokyselinovú sekvenciu definovanú v bode (a) alebo (b):

(a) aminokyselinová sekvencia obsahujúca aminokyseliny od polohy 23 do 236 SEQ ID č: 30, (b) aminokyselinová sekvencia obsahujúca aminokyseliny od polohy 23 do 236 SEQ ID č: 30, v ktorej jeden až desať aminokyselinových zvyškov je vymazaných alebo substituovaných alebo v ktorej jeden až desať aminokyselinových zvyškov je inzertovaných alebo pridaných, s podmienkou, že keď ľahký reťazec polypeptidu má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v bode (b), protilátka má ktorúkoľvek z charakteristík uvedených v bodoch (i) až (iii):

(i) účinnosť na zabránenie zmiešanej lymfocytovej reakcie, (ii) účinnosť na vyvolanie signálnej transdukcie na vyvolanie interferónu γ, alebo (iii) účinnosť na vyvolanie bunkovej cytotoxicity závislej od antigénu proti bunkám exprimujúcim AILIM; ľudská monoklonálna protilátka alebo jej časť, ktorá sa viaže na ľudskú AILIM, a má nasledujúce charakteristiky (a) a (b):

(a) variabilná oblasť ťažkého reťazca protilátky obsahuje ktorúkoľvek z nasledujúcich sekvencii (I) alebo (II): aminokyselinovú sekvenciu obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu od aminokyseliny 20 do 117 SEQ ID č: 28, alebo aminokyselinovú sekvenciu obsahujúcu aminokyseliny od polohy 20 do 117 SEQ ID NO: 28, v ktorej jeden až desať aminokyselinových zvyškov je vymazaných alebo substituovaných alebo v ktorom jeden až desať aminokyselinových zvyškov je inzertovaných alebo pridaných, a (b) variabilnú oblasť ľahkého reťazca protilátky obsahuje ktorúkoľvek z nasledujúcich sekvencii (I) alebo (II):

aminokyselinovú sekvenciu obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu od aminokyseliny 23 do 116 SEQ ID č: 30; alebo aminokyselinovú sekvenciu obsahujúcu aminokyseliny od polohy 23 do 116 SEQ ID NO: 30, v ktorej jeden až desať aminokyselinových zvyškov je vymazaných alebo substituovaných alebo v ktorej jeden až desať aminokyselinových zvyškov je inzertovaných alebo vložených, s podmienkou, že ak variabilná oblasť ťažkého reťazca je oblasť uvedená v bode (a)(II) alebo variabilná oblasť ľahkého reťazca je oblasť uvedená v bode (b)(II), uvedená protilátka má ktorúkoľvek z charakteristík uvedených v bodoch (i) až (iii):

(i) účinnosť na zabránenie zmiešanej lymfocytovej reakcie, (ii) účinnosť na vyvolanie signálnej transdukcie na vyvolanie interferónu γ, alebo (iii) účinnosť na vyvolanie bunkovej cytotoxicity závislej od antigénu proti bunkám exprimujúcim AILIM; ľudská monoklonálna protilátka alebo jej časť, ktorá sa viaže na ľudskú AILIM, a má nasledujúce charakteristiky (a) a (b):

(a) ťažký reťazec polypeptidu protilátky obsahuje ktorúkoľvek z nasledujúcich sekvencii (I) alebo (II):

(I) aminokyselinovú sekvenciu od aminokyseliny 20 do 470 podľa SEQ ID č: 28; alebo (II) aminokyselinovú sekvenciu obsahujúcu aminokyseliny od polohy 20 do 470 SEQ ID NO: 28, v ktorej jeden až desať aminokyselinových zvyškov je vymazaných alebo substituovaných alebo v ktorej jeden až desať aminokyselinových zvyškov je inzertovaných alebo vložených, a (b) ľahký reťazec polypeptidu protilátky obsahuje ktorúkoľvek z nasledujúcich sekvencii (I) alebo (II): aminokyselinovú sekvenciu od aminokyseliny 23 do 236 SEQ ID č: 30; alebo aminokyselinovú sekvenciu obsahujúcu aminokyseliny od polohy 23 do 236 SEQ ID NO: 30, v ktorej jeden až desať aminokyselinových zvyškov je vymazaných alebo substituovaných alebo v ktorej jeden až desať aminokyselinových zvyškov je inzertovaných alebo vložených, s podmienkou, že ak ťažký reťazec polypeptidu je reťazec uvedený v bode (a)(II) alebo ľahký reťazec polypeptidu je reťazec uvedený v bode (b)(II), uvedená protilátka má ktorúkoľvek z charakteristík uvedených v bodoch (i) až (iii):

(i) účinnosť na zabránenie zmiešanej lymfocytovej reakcie, (ii) účinnosť na vyvolanie signálnej transdukcie na indukciu interferónu γ, alebo (iii) účinnosť na vyvolanie bunkovej cytotoxicity závislej od antigénu proti bunkám exprimujúcim AILIM. Predmetom vynálezu je taktiež

DNA kódujúca variabilnú oblasť ťažkého reťazca polypetidu ľudskej protilátky,

DNA kódujúca ťažký reťazec polypeptidu protilátky,

DNA kódujúca variabilnú oblasť ľahkého reťazca polypeptidu ľudskej protilátky a

DNA kódujúca ľahký reťazec polypeptidu ľudskej protilátky.

Výhodne je DNA vybraná z (a) alebo (b) uvedených neskôr:

(a) DNA obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu od nukleotidu 126 do 419 SEQ ID č: 27, alebo (b) DNA obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu od nukleotidu 105 do 386 SEQ ID č: 29, alebo (a) DNA obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu od nukleotidu 69 do 1481 SEQ ID č: 27, alebo (b) DNA obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu od nukleotidu 39 do 749 SEQ ID č: 29.

Predmetom vynálezu je taktiež vektor obsahujúci uvedenú DNA.

Predmetom vynálezu je taktiež bunka produkujúca ľudskú monoklonálnu protilátku, kde bunka nie je ľudská zárodočná bunka.

Bunka je výhodne fúzovanou bunkou získanou fúziou B bunky získanej z cicavca schopného produkovať uvedenú ľudskú monoklonálnu protilátku a myelómovej bunky získanej z cicavca.

Predmetom vynálezu je ďalej genetický rekombinantný hostiteľ iného ako ľudského pôvodu transformovaný pomocou uvedeného vektora, pričom uvedený hostiteľ je získaný z cicavca vybraného zo skupiny pozostávajúcej z hovädzieho dobytka, kozy, králika, myši, potkana, škrečka a morčaťa.

Výhodne je genetický rekombinantný hostiteľ cicavčia bunka iného ako ľudského pôvodu, prednostne cicavčie oplodnené vajíčko iného ako ľudského pôvodu.

Predmetom vynálezu je taktiež ľudská monoklonálna protilátka alebo jej časť, ktorá sa viaže na ľudskú AIL1M, produkovaná uvedeným genetickým rekombinantným hostiteľom.

Predmetom vynálezu je taktiež farmaceutická kompozícia obsahujúca uvedenú ľudskú protilátku a farmaceutický prijateľný nosič.

Predmetom vynálezu je taktiež použitie protilátky alebo jej časti na prípravu farmaceutickej kompozície na zabránenie, liečenie alebo profylaxiu alergie oneskoreného typu, reumatoidnej artritídy, systémového lupus erytematosus, psoriázy, diabetes mellitus závislého od inzulínu, choroby štep versus hostiteľ, imunitnej reakcie sprevádzajúcej transplantáciu, alebo nefritídy.

Predkladaný vynález je ďalej opísaný podrobnejšie pomocou zadefinovanej uvedenej terminológie.

Výraz „cicavec“ zahŕňa človeka, kravu, kozu, zajaca, myš, krysu, škrečka a morské prasa, výhodne zahrnuje človeka, zajaca, krysu, škrečka alebo myš a najvýhodnejšie je, keď zahrnuje človeka, krysu, škrečka alebo myš.

Výraz „cicavce iné než ľudia“ a „ne-ľudské cicavce“, ako sú používané v tomto texte, sú synonymá a znamenajú všetky cicavce iné než človek.

Termín „aminokyseliny“, ako je používaný v tomto texte, zahrnuje každú aminokyselinu existujúcu v prírode, výhodne sú tieto aminokyseliny opísané podľa trojpísmenového systému alebo podľa jednopísmenového systému tak, ako je to uvedené:

glycín (Gly/G), alanín (Ala/A), Valín (Val/V), leucín (Leu/L), izoleucín (Ile/I), serín (Ser/S), treonín (Thr/T), kyselina aspartová (Asp/D), kyselina glutámová (Glu/E), asparagín (Asn/N), glutamín (Gln/Q), lyzín (Lys/K), arginín (Arg/R), cysteín (Cys/C), metionín (Met/M), fenylalanín (Phe/F), tyrozín (Tyr/Y), tryptofán (Trp/W), histidín (His/H), prolín (Pro/P).

Termín „AILIM“, ako je používaný tu, je skratka pre imunomodulačnú molekulu vyvolávajúcu aktiváciu lymfocytov, je označenie cicavčej bunkovo povrchovej molekuly majúcej štruktúru a funkciu, ako už bola opísaná v predchádzajúcom opise, výhodnejšie je to AILIM získaná z človeka konkrétne (napríklad, International Immunology, Vol. 12, č. 1, str. 51-55; číslo v génovej banke: BAA82129 (človek), BAA82128 (krysa), BAA82127 (krysí variant) a BAA82126 (myš).

Alternatívne, táto AILIM sa tiež označuje ako ICOS (Publikovaná Japonská patentová prihláška (JP-A) č. Hei 11-29599, Medzinárodná patentová prihláška č. W098/382 16) a dokumenty a ich skratky predstavujú tú istú molekulu.

Termín „AILIM ligand“ v tomto texte predstavuje bunkovo povrchovú molekulu, ktorá interaguje s uvedenou ko-stimulačnou molekulou AILIM (ICOS) a je označená ako B7h, B7RP-1, GL50 alebo LICOS (Náture, Vol. 402, č. 6763, str. 827-832, 1999; Náture Medicene, Vol. 5, č. 12, p. 1365-1369, 1999; J. Immunology, Vol. 164, p. 1653-1657, 2000; Curr. Biol. Vol. 10, No. 6, p. 333-336, 2000).

Ale termín „ALIM“, ako je používaný v tomto texte, zahrnuje polypeptid majúci v podstate tú istú aminokyselinovú sekvenciu ako AILIM každého cicavca opísaného v odkazoch, a výhodnejšie ako ľudská AILIM. Ďalej, variant ľudskej AILIM je podobný krysiemu variantu AILIM už označenému (úložné číslo v génovej banke: BAA82127) a tiež zahrnuje „AILIM“ podľa tohto vynálezu.

Termín „AILIM ligand“, ako je používaný v tomto texte, má podobný význam, ako je uvedené skôr.

Termín „polypeptidy majúce v podstate indentickú aminokyselinovú sekvenciu“ zahrnuje varianty polypeptidov, ako sú opísané neskôr.

Pokiaľ tieto varianty polypeptidov majú biologické vlastnosti v podstate ekvivalentné s pôvodným typom AILIM (najvýhodnejšie s AILIM získanou z človeka), sú polypeptidmi podľa vynálezu. Tieto polypeptidy majú aminokyselinovú sekvenciu pôvodného typu AILIM, v ktorej množstvo aminokyselinových zvyškov, výhodne 1 až 10 aminokyselinových zvyškov, najvýhodnejšie 1 až 5 aminokyselinových zvyškov, je vymazaných a/alebo modifikovaných a v ktorej množstvo aminokyselinových zvyškov, výhodne 1 až 10 aminokyselinových zvyškov, najvýhodnejšie 1 až 5 aminokyselinových zvyškov, je pridaných.

Ďalej, tieto polypeptidy môžu byť variantom polypeptidov majúcich množstvo týchto substitúcii, delécií, modifikácií a prídavkov aminokyselinových zvyškov v molekule.

Termín „AILIM ligand“ podľa tohto vynálezu má podobný význam, ako je uvedené.

A1LIM (konkrétne ľudská AILIM) a AILIM ligand (konkrétne ľudský AILIM ligand) podľa tohto vynálezu môžu byť pripravené okrem génovej rekombinančnej techniky použitím známych metód v stave techniky, takých ako chemické syntetické metódy, metódy bunkovej kultivácie atď. alebo použitím týchto metód s modifikáciami.

Takáto substitúcia, delécia alebo inzercia aminokyselín môže byť dosiahnutá bežnou metódou (Experimental Medicíne: SUPPLEMENT, „Handbook of Genetic Engineering“ (1992)).

Príklady metód na výrobu mutantných polypeptidov, ako sú uvedené skôr, zahrnujú smerovanú mutagenézu do miesta syntetického oligonukleotidu (medzerová duplexná metóda = „gapped duplex method), bodovú mutagenézu pomocou ktorej je bodová mutácia náhodou zavedená použitím nitritu alebo sulfitu, metódu pomocou ktorej je delečná mutácia pripravené použitím Bal31 enzýmu a podobne, kazetovú mutagenézu, spojovaciu skeningovú metódu (linker scanning method), metódu začlenenia chyby, „mismatch“ primérovú metódu, DNA segmentovú syntetickú metódu atď.

Smerovaná mutagenéza do miesta syntetického oligonukleotidu (gapped duplex method) môže byť vykonaná napríklad podľa nasledujúceho postupu. Oblasť, ktorá má podliehať mutagenéze, je klonovaná do Ml3 fágového vektora majúceho amber mutáciu, aby sa pripravila jedno-vláknová fágová DNA. Potom sa RF I DNA vektora M13 bez amber mutácie linearizuje reštrikčným enzýmom, DNA sa zmieša s jedno-vláknovou fágovou DNA uvedenou skôr, denaturuje sa a týmto sa vytvorí „medzerová duplexná DNA“ („gapped duplex DNA“). Syntetický oligonukleotid, do ktorého boli zavedené mutácie, je hybridizovaný „medzerovou duplexnou DNA a pripravili sa kruhovo uzatvorené dvojvláknové DNA pomocou reakcií s DNA polymerázou a DNA ligázou. E. coli zmutované bunky, deficientné v „mismatch“ opravnej aktivite, sú transfekované s touto DNA. E. coli bunky bez supresorovej aktivity sú infikované rastovými fágmi a len fágy bez amber mutácie sú skrinované.

Princípy metódy, pomocou ktorej je zavedená bodová mutácia pomocou nitritu, sú uvedené neskôr. Ak sa DNA spracuje nitritom, bázy sa deaminujú a adenín sa zmení na hypoxantín, cytozín na uracil a guanín na xantín. Ak deaminovaná DNA sa zavedie do buniek, „A:T“ a „G:C“ sa zamenia s „G:C“ a „A:T“, keďže hypoxantín, uracil a xantín vytvárajú bázový pár s cytozínom, adenínom a tymínom pri replikácii DNA. Fragmenty jedno-vláknovej DNA spracované nitritom sú hybridizované s „medzerovou duplexnou DNA“ a potom mutantné kmene sú separované manipuláciou podľa toho istého postupu ako pri priamej mutagenéze miesta syntetického oligonukleotidu (gapped duplex method).

Ďalej, termín „AIF1M“ zahrnuje „časť“ uvedenej AIF1M. V texte termín „časť“ zahrnuje polypeptid obsahujúci určitú čiastočnú sekvenciu definovanej AILIM aminokyselinovej sekvencie. Výhodne, uvedená časť predstavuje extracelulárnu oblasť definovanej AILIM (konkrétne ľudskej AILIM) alebo jej časti.

„AILIM ligand“ podľa tohto vynálezu má podobný význam, ako je uvedený skôr.

„Časť“ uvedenej AILIM (výhodne extraceluláma oblasť AILIM alebo jej časti) môže byť pripravená podľa známych techník v stave techniky, ako je uvedené neskôr alebo podľa modifikovaných metód pomocou genetickej rekombinantnej techniky alebo chemických syntetických metód, alebo pomocou vhodného štiepenia AILIM (výhodne ľudskej AILIM) izolovanej bunkovou kultivačnou metódou použitím proteolytických enzýmov atď.

„Časť AILIM ligandu“ môže byť pripravená pomocou podobných metód, ako je opísané.

„Ľudská protilátka“ podľa tohto vynálezu je ľudská protilátka, ktorá sa viaže na definovanú AILIM alebo na jej časť (výhodne AILIM získaná z človeka alebo jej časť). Konkrétne to znamená, že polyklonálna protilátka získaná z človeka (ľudská polyklonálna protilátka, ľudské antisérum) alebo monoklonálna protilátka (ľudská monoklonálna protilátka).

„Ľudská monoklonálna protilátka“ podľa tohto vynálezu je ľudská monoklonálna protilátka, ktorá sa viaže na definovanú AILIM alebo na jej časť (výhodne na AILIM získanú z človeka alebo na jej časť).

Konkrétnejšie, všetky oblasti obsahujúce variabilné a konštantné oblasti ťažkého reťazca (H-reťazec) a variabilné a konštantné oblasti ľahkého reťazca (L-reťazec) obsahujú ľudský imunoglobulín získaný z génu kódujúceho uvedený ľudský imunoglobulín.

L-reťazec je napríklad ľudský k reťazec alebo ľudský X reťazec.

Ľudská monoklonálna protilátka, ktorá sa viaže na AILIM (konkrétne výhodne AILIM získaná z človeka) podľa vynálezu alebo na jej časť, je ľudská monoklonálna protilátka charakterizovaná podľa bodu (5) až (42) alebo (84).

Konkrétnejšie, táto protilátka zahrnuje rôzne ľudské monoklonálne protilátky majúce rôzne charakteristiky a priemyselnú využiteľnosť, ako je opísané v uvedených príkladoch a obrázkoch.

Výhodným uskutočnením ľudskej monoklonálnej protilátky podľa tohto vynálezu je ľudská monoklonálna protilátka, ktorá sa viaže na AILIM alebo na jej časť definovanú podľa ktoréhokoľvek z bodov (5) až (42) alebo (84).

Konkrétnejšie ľudská monoklonálna protilátka zahrnuje rôzne typy ľudských monoklonálnych protilátok majúcich rôzne charakteristiky a priemyselné využitie a sú opísané v príkladoch a v obrázkoch uvedených neskôr.

Výhodným uskutočnením ľudskej monoklonálnej protilátky podľa tohto vynálezu je ľudská monoklonálna protilátka, ktorá sa viaže na AILIM alebo na jej časť definovanú v ktoromkoľvek z bodov (a) až (42) alebo (84).

Najvýhodnejším uskutočnením je ľudská monoklonálna protilátka, ktorá sa viaže na ľudskú AILIM, ako je opísaná v (30) alebo (39).

„Ľudská monoklonálna protilátka“ podľa tohto vynálezu môže byť pripravená imunizáciou transgénových nie ľudských cicavcov produkujúcich ľudskú protilátku s ktorýmkoľvek imunogénom (antigénom) uvedeným neskôr, (a) prirodzená bunka alebo umelo vzniknutá bunková línia exprimujúca uvedenú AILIM (výhodne AILIM získaná z človeka) na bunkový povrch;

(b) rekombinantná bunka pripravená použitím genetických rekombinantných techník ako aj expresiou uvedenej AILIM (výhodne AILIM získanej z človeka) na bunkový povrch;

(c) bunkový lyzát získaný pomocou solubilizácie buniek uvedených v bodoch (a) alebo (b), alebo polypeptidového fragmentu AILIM (výhodne AILIM získanej z človeka) získaného čistením uvedeného bunkového lyzátu;

(d) geneticky rekombinantná bunka pripravená použitím geneticky rekombinantných techník ako aj expresiou časti (výhodne extraceluláma oblasť alebo akýkoľvek jej výhodný peptid) uvedenej AILIM (výhodne AILIM získaná z človeka) ako rozpustný polypeptid;

(e) kultivačný supematant získaný kultiváciou genetickej rekombinantnej bunky uvedenej v (d) alebo extracelulámej oblasti polypeptidu (rozpustná AILIM) molekuly AILIM (výhodne AILIM získaná z človeka) získanej čistením z uvedeného kultivačného supernatantu;

(f) časť (zvlášť výhodne extraceluláma oblasť alebo výhodne jej peptid) chemicky syntetizovanej AILIM (zvlášť výhodne AILIM získanej z človeka).

Ďalej monoklonálna protilátka podľa tohto vynálezu sa tiež môže získať z kultivačného supernatantu pomocou kultivácie „geneticky rekombínantného hostiteľa“ (tu uvedený hostiteľ je eukaryotická bunka iná než fertilizované vajíčka (výhodne cicavčie bunky také ako CHO, lymfocyty a bunky myelómu)), ktorý môže byť pripravený transformáciou hostiteľa s cDNA (výhodne vektor obsahujúci uvedené cDNAs) kódujúcich každý z ťažkých a ľahkých reťazcov takejto ľudskej monoklonálnej protilátky podľa tohto vynálezu použitím geneticky rekombinančných technik a ktorá produkuje geneticky rekombinantnú ľudskú monoklonálnu protilátku.

Konkrétne, monoklonálna protilátka podľa tohto vynálezu sa môže získať kultiváciou geneticky rekombinantného hostiteľa opísaného v ktorýchkoľvek bodoch (60) až (62) alebo (64) až (80) podľa tohto vynálezu (tu uvedený hostiteľ je eukaryotická bunka iná než fertilizované vajíčko (výhodne cicavčie bunky také ako CHO, lymfocyty a bunky myelómu).

Ľudská monoklonálna protilátka podľa vynálezu môže byť ľudská monoklonálna protilátka majúca určitý izotyp patriaci medzi IgG (IgGl, IgG2, IgG3 a IgG4), IgH, IgA (IgAl a IgA2), IgD alebo IgE. Výhodne uvedená monoklonálna protilátka patrí do IgG (IgGl, IgG2, IgG3 a IgG4), výhodnejšie do IgGl, IgG2 alebo IgG4.

Ľudská monoklonálna protilátka podľa tohto vynálezu môže byť pripravená imunizáciou transgénového nie-ľudského cicavca produkujúceho ľudskú protilátku takého ako transgénová myš produkujúca protilátku s akýmikoľvek imunogénmi (antigénmi) uvedenými v bodoch (a) až (f) podľa bežne známej používanej výrobnej metódy.

Napríklad uvedený transgénový nie-ľudský cicavec produkujúci ľudskú protilátku je imunizovaný uvedeným antigénom v kombinácii s Freundovým adjuvant podľa požiadaviek. Polyklonálna protilátka sa môže získať zo séra získaného z uvedeného imunizovaného živočícha. Monoklonálna protilátka sa môže vyrobiť prípravou fúznych buniek (hybridómov) z uvedených buniek produkujúcich protilátku izolovaných z uvedeného imunizovaného živočícha a buniek myelómu so schopnosťou neprodukovať autoprotilatku. Ďalej sa monoklonálna protilátka môže vyrobiť pomocou klonovania uvedených hybridómov na účely výberu klonu produkujúceho monoklonálnu protilátku so špecifickou afinitou ku antigénu, ktorý sa použil na imunizáciu cicavca.

Presnejšie, monoklonálna protilátka sa môže pripraviť tak, ako je to opísané v nasledujúcom texte. Teda, uvedený transgénový nie-ľudský cicavec produkujúci ľudskú protilátku (konkrétne výhodne „transgénová myš produkujúca ľudskú protilátku) je imunizovaný tým, že sa mu niekoľkokrát do labky intramuskuláme, podkožné, vnútrožilovo, intraperitoneálne podá akýkoľvek imunogén uvedený v bodoch (a) až (c) alebo je imunizovaný transplantáciou uvedeného imunogénu do uvedeného cicavca. Zvyčajne sú imunizácie vykonávané jeden až štyrikrát, každý jeden až štrnásť dní po prvej imunizácii. Bunky produkujúce protilátku sú získané z cicavca, ktorý bol imunizovaný jedenkrát na piaty deň po poslednej imunizácii. Frekvencia a interval imunizácii môže byť vhodne upravený v závislosti od vlastnosti použitého imunogénu.

Hybridómy, ktoré sekrétujú ľudskú monoklonálnu protilátku, sa môžu pripraviť podľa metódy Kohlera a Milsteina (Náture, Vol. 256, pp. 495-497 (1975) a podľa jej modifikovanej metódy. Konkrétne sú hybridómy pripravené fúziou buniek produkujúcich protilátku, pričom bunky sa nachádzajú v slezine, lymfatickej uzline, kostnej dreni alebo v mandli, výhodne v slezine, získanej z transgénového nie-ľudského cicavca produkujúceho protilátku imunizovaného uvedeným spôsobom bunkami myelómu bez schopnosti produkovať autoprotilátku, pričom bunky myelómu sú získané, výhodne, z cicavcov takých ako myš, krysa, morča, škrečok, zajac alebo človek, výhodnejšie, myš, krysa alebo človek.

Napríklad, myelóm získaný z myši typu P3/X63-AG8.653 (ATCC No. CRL-1580), P3/NSI/1 -Ag4-1 (NS-1), P3/X63-Ag8.Ul (P3U1), SP2/0-Agl4 (Sp2/0, Sp2), NSO, PAI, FO alebo BW5147, myelóm získaný z krysy typu 210RCY3-Ag.2.3 alebo myelóm získaný z človeka typu U-266AR1, GM15006TG-A1-2, UC7296, CEM-AGR, D1R11 alebo CEM-T1 5 môže byť použitý ako myelóm vhodný na bunkovú fúziu.

Bunky produkujúce monoklonálne protilátky (napríklad hybridómy) môžu byť skrinované pomocou kultivácie buniek, napríklad, v mikrotitrových platniach a pomocou merania reaktivity kultivačného supematantu v jamke, v ktorej je pozorovaný nárast hybridómy na imunogén vhodný na imunizáciu, pomocou enzýmového imunotestu takého ako rádio imunotest (RIA) a test ELISA (enzym-linked immuno-solvent assay).

Monoklonálne protilátky môžu byť produkované z hybridómov pomocou kultivácie hybridómov in vitro alebo in vivo v tekutine nahromadenej pobrušnicovej dutine myši, krysy, morčaťa, škrečka alebo zajaca, výhodne myši alebo krysy, výhodnejšie myši a pomocou izolácie protilátok z výsledného kultivačného supematantu alebo z tekutiny nahromadenej v pobrušnicovej dutine cicavca.

Monoklonálne protilátky podľa tohto vynálezu sa môžu vyrobiť vo veľkej škále pomocou nasledujúcej metódy:

(1) gény (cDNA atď.) kódujúce ťažké a ľahké reťazce uvedenej monoklonálnej protilátky sú klonované z uvedených hybridómov;

(2) klonované gény kódujúce ťažké a ľahké reťazce sú inzertované do separátnych vektorov alebo jednotlivého vektora na účely prípravy expresného vektora;

(3) uvedený expresný vektor je prenesený do fertilizovaného vajíčka požadovaného nie-ľudského cicavca (takého ako koza);

(4) uvedené prenesené fertilizované vajíčko je transplantované do maternice náhradnej matky na účely získania chimerického nie-ľudského živočícha;

(5) ďalším párením uvedenej chimérickej kozy s ďalším nie-ľudským cicavcom sa vytvorí transgénový nie-ľudský cicavec (dobytok, koza, ovca alebo sviňa) s génmi kódujúcimi uvedené ťažké a ľahké reťazce začlenené do endogénneho génu; a (6) z mlieka uvedeného transgénového nie-ľudského cicavca je získaná vo veľkej škále monoklonálna protilátka odvodená z uvedeného génu ľudskej monoklonálnej protilátky (Nikkei Science, Apríl, 1997, p. 78 - 84).

Kultivácia in vitro buniek produkujúcich monoklonálne protilátky môže byť vykonávaná v závislosti od vlastností buniek, ktoré sú kultivované, od objektu testovacej štúdie a od rôznych podmienok kultivačnej metódy, s použitím známeho výživového média alebo akéhokoľvek výživového média získaného zo známeho bazálneho média na nárast, udržiavanie a skladovanie hybridómov na prípravu monoklonálnych protilátok v kultivačnom supematante.

Príklady bazálneho média sú médiá s nízkou koncentráciou vápnika také ako Ham'F12 médium, MCDB153médium alebo MEM médium s nízkou koncentráciou vápnika a médiá s vysokou koncentráciou vápnika také ako MCDB104 médium, MEM médium, D-MEM médium, RPMI1640 médium, ASF104 médium alebo RD médium. Bazálne médium môže obsahovať, napríklad, sérum, hormóny, cytokíny a/alebo rôzne anorganické a organické látky v závislosti od stanoveného cieľa.

Monoklonálne protilátky môžu byť izolované a čistené z kultivačného supematantu alebo z nahromadenej tekutiny v pobrušnicovej dutine pomocou precipitácie nasýteným síranom amónnym, pomocou euglobulínovej precipitačnej metódy, metódy s kyselinou kaprónovou, metódy s kyselinou kaprylovou, iónovo výmennej chromatografie (DEAE alebo DE52), afinitnej chromatografie použitím anti-imunoglobulinovej kolóny alebo kolóny s proteínom A.

Ľudská monoklonálna protilátka podľa tohto vynálezu zahrnuje ľudské monoklonálne protilátky obsahujúce ťažký reťazec a/alebo ľahký reťazec, ktorých aminokyselinová sekvencia pre každý reťazec má jeden alebo viacero aminokyseli nových zvyškov vymazaných, substituovaných alebo pridaných.

Termín „viacero aminokyselinových zvyškov“ znamená množstvo aminokyselinových zvyškov, konkrétne 1 až 10 aminokyselinových zvyškov, výhodne 1 až 5 aminokyselinových zvyškov.

Čiastočná modifikácia (delécia, substitúcia, inzercia alebo prídavok) ako je opísaná skôr, môže byť zavedená do aminokyselinovej sekvencie ľudskej monoklonálnej protilátky tohto vynálezu pomocou čiastočnej zmeny bázovej sekvencie kódujúcej uvedenú aminokyselinovú sekvenciu. Táto čiastočná zmena bázovej sekvencie môže byť zavedená pomocou štandardnej metódy použitím techniky „mutagenéza lokálne-špecifická“ (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 81, p. 5662-5666, 1984).

„Transgénový nie-ľudský cicavec produkujúci ľudskú protilátku“, konkrétne trasgénová myš produkujúca ľudskú protilátku, ktorá je výhodným uskutočnením, môže byť pripravená podľa publikovanej literatúry (Náture Genetics, Vol. 7, str. 13-21, 1994; Náture Genetics, Vol. 15, str. 146-156, 1997; Publikovaný Japonský preklad medzinárodnej prihlášky č. Hei 4-504365; Publikovaný Japonský preklad prihlášky č. Hei 7-509137;

Nikkei Science, jún, str. 40-50, 1995; Medzinárodná patentová prihláška č. W094/25585; Náture Vol. 368, str. 856-859, 1994 a Publikovaný Japonský preklad prihlášky č. Hei 6- 500233 atď).

Konkrétne, transgénová myš produkujúca ľudskú protilátku môže byť pripravená, napríklad, použitím techník zahrnujúcich nasledujúce postupy:

(1) príprava myši, pri ktorej endogénny imunoglobulínový ťažký reťazec génu je funkčne inaktivovaný substitúciou aspoň časti génového lókusu myšieho endogénneho imunoglobulínového ťažkého reťazca markerom génu tolerantným na liečivo (takým ako gén tolerantný na neomycín) pomocou homológnej rekombinácie, (2) príprava myši, pri ktorej endogénny imunoglobulínový ľahký reťazec génu (konkrétne κ reťazec génu) je funkčne inaktivovaný pomocou substitúcie aspoň časti génového lókusu myšieho endogénneho imunoglobulínového ľahkého reťazca s markerom génu tolerantným na liečivo (takým ako gén tolerantný na neomycín) pomocou homológnej rekombinácie, (3) príprava transgénovej myši, pri ktorej žiaduca oblasť génového lókusu ľudského imunoglobulínového ťažkého reťazca je začlenená do myšieho chromozómu použitím vektora reprezentovaného umelým kvasinkových chromozómom (YAC) schopným niesť gigantický gén;

(4) príprava transgénovej myši, pri ktorej žiaduca oblasť génového lókusu ľudského imunoglobulínového ľahkého reťazca (výhodne κ reťazec génu) je začlenená do myšieho chromózomu použitím vektora reprezentovaného umelým kvasinkovým chromozómom (YAC) schopným niesť gigantický gén;

(5) príprava transgénovej myši, ktorej endogénne imunoglobulínové ťažké a ľahké reťazce génu sú obidva funkčne inaktivované a pri ktorej chromozóm je začlenený do požadovaných oblastí ľudských imunoglobulínových ťažkých a ľahkých reťazcov génu prostredníctvom párenia transgénovej myši uvedenej v bodoch (1) až (4).

Spomínaná upravená myš sa môže pripraviť substitúciou vhodnej oblasti myšieho endogénneho imunoglobulínového génového lókusu s cudzím markerom génu (takým ako gén tolerantný na neomycín) založenou na homologickej rekombinácii na účely inaktivovania uvedeného génového lókusu, tak aby nedošlo k preskupeniu. Na inaktiváciu s využitím uvedenej homologickej rekombinácie môže byť napríklad použitá metóda označovaná ako pozitívna negatívna selekcia (PNS) (Nikkei Science, máj, str. 52-62, 1994).

Funkčná inaktivácia imunoglobulínového ťažkého reťazca génového lókusu sa môže dosiahnuť pomocou zavedenia poškodenia do časti J- alebo C-oblasti (napríklad, Cp oblasť). Funkčná inaktivácia imunoglobulínového ľahkého reťazca (napríklad κ reťazec) sa môže dosiahnuť pomocou zavedenia poškodenia do časti Jalebo C-oblasti, alebo do oblasti rozširujúcej sa cez J- a C-oblasti.

Transgénová myš sa môže pripraviť podľa metódy, ktorá sa zvyčajne používa na výrobu transgénového živočícha (napríklad, pozri „Newest Manual of Animal Celí Experiment“, LIC press, kapitola 7, str. 361-408, (1990)) Konkrétne, napríklad, HPRT-negatívna (hypoxantín-guanín fosforibozyltransferázagénový deficient) ES bunka (embryonálna kmeňová bunka) získaná z normálneho myšieho blastocystu je fuzovaná s kvasinkou obsahujúcou YAC vektor vložený do génu kódujúceho uvedený ľudský imunoglobulínový ťažký reťazec génového lókusu alebo ľahký reťazec génového lókusu, alebo ich časti a HPRT gén použitím sferoplastovej fúznej metódy. ES bunky, ktorých myší endogénny gén je integrovaný s uvedeným cudzím génom, sú selektované pomocou HAT selekčnej metódy. Potom sú skrinované ES bunky mikroinjektované do fertilizovaného vajíčka získaného z inej normálnej myši (blastocyst) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 77, č. 12, str. 7380-7384 (1980); U.S. Patent č. 4 873 191). Blastocyst je trasplantovaný do maternice inej normálnej myši ako náhradnej matky. Potom sa z náhradnej matky narodia chimerické transgénové myši. Párením chimerickej transgénovej myši s normálnou myšou sa získa heterogénová transgénová myš. Párením heterogénnych transgénových myší navzájom sa získajú homogenénne transgénové myši podľa Mendelových zákonov.

Termín „časť monoklonálnej protilátky“ používaný v tomto texte znamená čiastočnú oblasť uvedenej ľudskej monoklonálnej protilátky predkladaného vynálezu a konkrétne zahrnuje F(ab')₂, Fab', Fab, Fv (variabilný fragment protilátky), sFv, dsFv (disulfidom stabilizovaná Fv) alebo dAb (jediná doménová protilátka) (Exp. Opin. Ther. Patents, Vol. 6, č. 5, str. 441-456 (1996)).

„F(ab')₂“ a „Fab'“ môže byť pripravená spracovaním imunoglobulínu (monoklonálna protilátka) s proteázou takou ako pepsín a papaín a znamená fragment protilátky generovaný pomocou digerácie imunoglobulínu blízko disulfidových väzieb v závesných oblastiach medzi dvoma H reťazcami. Napríklad, papaín štiepi IgG proti disulfidovým väzbám v závesných oblastiach existujúcich medzi dvoma H reťazcami na účely vytvorenia dvoch homologických fragmentov protilátky, v ktorých L reťazec je zložený z V_L (L reťazec variabilnej oblastí) a C_L (L reťazec konštantnej oblasti) a H reťazcový fragment je zložený z V_H (H reťazec variabilnej oblasti) a C“ γΐ (γΐ oblasť v konštantnej oblasti H reťazca), sú spojené v ich C terminálnych oblastiach cez disulfidovú väzbu. Každý z týchto dvoch fragmentov homologických protilátok sa nazýva Fab’. Pepsín tiež štiepi IgG po disulfidových väzbách v závesných oblastiach existujúcich medzi dvoma H reťazcami na účely vytvorenia fragmentu protilátky nepatrne väčšieho než fragment, v ktorom dve spomínané Fab' sú spojené pri závesnej oblasti. Tento fragment protilátky sa nazýva F(ab')₂.

Termín „väzbová rýchlostná konštanta (ka)“ predstavuje hodnotu indikujúcu väzbovú silu (stupeň) uvedenej monoklonálnej protilátky k cieľovej protilátke vypočítanú na základe kinetiky reakcie antigénu protilátky.

Termín „disociačná rýchlostná konštanta (kd)“ predstavuje hodnotu indikujúcu disociačnú silu (stupeň) uvedenej monoklonálnej protilátky k cieľovému antigénu. „Disociačná konštanta (Kd)“ je hodnota získaná rozdielom hodnoty uvedenej „disociačnej rýchlostnej konštanty (kd) a hodnoty väzbovej rýchlostnej konštanty (ka). Tieto konštanty sú používané na vyjadrenie afinity uvedenej monoklonálnej protilátky ku antigénu a jeho aktivity neutralizovať antigén.

Uvedené konštanty môžu byť analyzované podľa rôznych metód a môžu byť jednoducho analyzované použitím komerčného testovacieho kitu Biacorex (Amersham Pharmacia) alebo podobného kitu podľa manuálu a experimentálnej metódy priloženej k uvedenému kitu. Hodnoty ka, kd a Kd získané použitím uvedeného kitu sú vyjadrené v jednotkách 1/M. Sek, 1 /Sek a M(mol). Vyššie ka hodnoty naznačujú silnejšiu antígénovú väzbovú aktivitu testovanej monoklonálnej protilátky a menšie Kd hodnoty ukazujú silnejšiu antigénovú neutralizačnú aktivitu protilátky.

Ľudská monoklonálna protilátka podľa tohto vynálezu je tá, ktorá má hodnoty ka, kd alebo Kd podľa nasledujúcich bodov (1) až (3):

(1) ľudská monoklonálna protilátka, ktorá sa viaže na ľudskú A1L1M alebo jej časť s väzbovou rýchlostnou konštantou (ka) 1,0 x 10⁴(l/M. Sek) alebo výhodne 1,0 x 10⁵ (1/M. Sek) alebo viac, (2) ľudská monoklonálna protilátka, ktorá sa viaže na ľudskú AILIM alebo na jej časť s disociačnou väzbovou konštantou (kd) 1,0 x 10⁴ (1/Sek) alebo nižšou, výhodne 1,0 x 10'⁵ (1/Sek) alebo nižšou, (3) ľudská monoklonálna protilátka, ktorá má reaktivitu ku ľudskej AILIM alebo k jej časti s disociačnou konštantou (Kd) 1,0 x 10‘⁷ (M) alebo nižšou, výhodne 1,0 x 10'⁸ (M) alebo nižšie a výhodnejšie 1,0 x 10‘⁹ alebo menej.

V tomto prípade pri každej hodnote ka, kd a Kd opísanej skôr sa očakáva nepatrné kolísanie v závislosti od rôznych podmienok v čase merania s odchýlkou chyby, ale prakticky sa neočakáva kolísanie v indexoch vo všeobecnosti.

Termín „monoklonálna protilátka produkovaná bunkou“ alebo genetický rekombinantná ľudská monoklonálna protilátka produkovaná „genetický rekombinantný hostiteľ“ podľa tohto vynálezu (tu uvedený hostiteľ je bunka s výnimkou fertilizovaného vajíčka) predstavuje určitú bunku produkujúcu uvedenú ľudskú monoklonálnu protilátku tohto vynálezu.

Konkrétne, napríklad, tento termín zahrnuje bunky opísané v ktoromkoľvek z nasledujúcich bodov (1) až (3), ale nieje to limitované len na tieto body:

(1) ľudská monoklonálna protilátka produkovaná B bunkou získaná pomocou imunizácie uvedenej ľudskej protilátky produkovanej transgénovým nie-ľudským cicavcom s definovaným imunogénom (antigénom) a zachytávanie bunky z uvedeného imunizovaného živočícha, (2) uvedená fúzna bunka (hybridom) ako následok fúzie ľudskej monoklonálnej protilátky produkovanej B bunkou sa získala z bunky myelómu odvodenej z cicavca, (3) genetický rekombinantná ľudská monoklonálna protilátka produkovaná geneticky rekombinantnou bunkou získanou transformáciou bunky okrem uvedenej B bunky a hybridómu (napríklad, CHO (vaječník čínskeho škrečka) bunky, BHK („baby hamster kidney“ oblička z mlád’aťa škrečka) bunky, lymfocytu takého ako myelóm) s génom kódujúcim uvedenú ľudskú monoklonálnu protilátku (gén kódujúci ťažký reťazec alebo gén kódujúci ľahký reťazec, alebo obidva gény) izolovaným z uvedenej ľudskej monoklonálnej protilátky produkovanej B bunkou alebo z ľudskej monoklonálnej protilátky produkovanej fuznou bunkou (hybridom).

V tomto texte termín genteticky rekombinantné ľudské monoklonálne protilátky produkované geneticky rekombinantnou bunkou uvedenou v bode (3) konkrétne znamená genetické rekombinantné bunky produkujúce geneticky rekombinantná ľudskú monoklonálnu protilátku generovanú B bunkou opísanou skôr v bode (1) alebo hybridómom spomínaným v bode (2).

Termín „hostiteľ“ v termíne „genetický rekombinantný hostiteľ“ podľa tohto vynálezu zahrnuje rôzne cicavčie bunky, ako sú opísané, fertilizované vajíčka niektorých nie-ľudských cicavcov (koza, sviňa, ovca, dobytok atď.). Pomocou transferingu génu (génu kódujúceho ťažký reťazec alebo génu kódujúceho ľahký reťazec, alebo obidva gény) kódujúceho určitú monoklonálnu protilátku (výhodne ľudskú monoklonálnu protilátku) k ľudskej AILIM podľa tohto vynálezu do tohto fertilizovaného vajíčka, môže byť získané fertilizované vajíčko. Toto geneticky rekombinantné fertilizované vajíčko je použité na prípravu transgénových živočíchov na výrobu uvedeného proteínu z mlieka vo veľkom rozsahu. (Nikkei Science, April, 1997, str. 78-84).

Termín „substancia“ týkajúci sa „substancie viažucej sa na AILIM“ a „substancie viažucej sa na AILIM ligand“ znamená akúkoľvek prirodzenú substanciu alebo akúkoľvek umelo pripravenú substanciu.

Termín „signálna transdukcia sprostredkovaná pomocou AILIM“ znamená signálnu transdukciu sprostredkovanú AILIM exprimovanými bunkami (bunková proliferácia, aktivácia buniek, apoptóza a/alebo zmena schopnosti produkcie ľubovoľného cytokínu z buniek exprimujúcich AILIM).

Termín „substancia“ môže byť hlavne vztiahnutý na „proteínovú substanciu“ a nie-proteínovú substanciu“.

Príklady „proteínových substancií“ sú polypeptidy, protilátky (polyklonálna protilátka, monoklonálna protilátka alebo časti monoklonálna protilátka a najmä výhodne ľudská protilátka spomínaná skôr).

Ak substancia je protilátka, substancia je výhodne monoklonálna protilátka. Ak substancia je monoklonálna protilátka, substancia zahrnuje nielen nie-ľudskú monoklonálnu protilátku získanú z cicavca, ale tiež rekombinantnú chimerickú monoklonálnu protilátku, rekombinantnú humanizovanú monoklonálnu protilátku a ľudskú monoklonálnu protilátku.

Termín „rekombinantná chimerická monoklonálna protilátka“ znamená monoklonálnu protilátku pripravenú pomocou genetického inžinierstva a konkrétne znamená chimerickú protilátku takú ako myšia/ľudská chimerická monoklonálna protilátka, ktorej variabilné oblasti sú získané z imunoglobulínu nie-ľudského cicavca (myš, krysa, škrečok atď.) a ktorej konštantné oblasti sú získané z ľudského imunoglobulínu.

Termín „humanizovaná monoklonálna protilátka (CDR-transplantovaná protilátka)“ podľa predkladaného vynálezu je monoklonálna protilátka pripravená genetickým inžinierstvom a konkrétne znamená humanizovanú monoklonálnu protilátku, pričom časť alebo celé komplementaritu určujúce oblasti hypervariabilnej oblasti sú získané z komplementaritu určujúcich oblastí hypervariabilnej oblasti z monoklonálnej protilátky nie-ľudského cicavca (myš, krysa, škrečok atď.), systémové oblasti variabilnej oblasti sú získané zo systémových oblastí variabilnej oblasti z ľudského imunoglobulínu a konštantná oblasť je získaná z ľudskej konštantnej oblasti z imunoglobulínu.

Komplementaritu určujúce oblasti hypervariabilnej oblasti existujú v hypervariabilnej oblasti vo variabilnej oblasti protilátky a znamenajú tri oblasti, ktoré sa priamo a komplementárne viažu na antigén (komplementaritu určujúce zvyšky, CDR1, CDR2 a CDR3). Systémové oblasti variabilnej oblasti predstavujú štyri pomerne zachovalé oblasti ležiace proti, po alebo medzi troma komplementaritu určujúcimi oblasťami (systémová oblasť, FR1, FR2, FR3 a FR4).

Inými slovami, humanizovaná monoklonálna protilátka predstavuje protilátku, v ktorej všetky oblasti s výnimkou časti alebo celých komplementaritu určujúcich oblastí hypervariabilnej oblasti nie-ľudskej monoklonálnej protilátky získanej z cicavca sú nahradené ich zodpovedajúcimi oblasťami odvodenými od ľudského imunoglobulínu.

Konštantná oblasť získaná z ľudského imunoglobulínu má aminokyselinové sekvencie inherentné v každom izotype takom ako IgG (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD a IgE. Konštantná oblasť humanizovanej monoklonálnej protilátky v predkladanom vynáleze môže byť tá z ľudského imunoglobulínu patriaca do akéhokoľvek izotypu. Výhodne je to konštantná oblasť ľudskej IgG. Systémové oblasti konštantnej oblasti získanej z ľudského imunoglobulínu nie sú obzvlášť limitované.

Ak substancia predkladaného vynálezu je polypeptid, substancia zahrnuje polypeptid, fragment polypeptidu (oligopeptid), fúzny polypeptid, chemicky modifikovaný jeden z nich. Príklady oligopeptidu sú peptid obsahujúci 5 až 30 aminokyselín, výhodne 5 až 20 aminokyselín. Chemická modifikácia môže byť navrhnutá v závislosti od rôznych cieľov, napríklad, od zvýšenia polčasu životnosti v krvi v prípade podania in vivo alebo zvýšenia tolerancie proti odbúraniu alebo zvýšeniu absorpcie v digestívnom trakte pri orálnom podaní.

Príklady na polypeptid sú nasledujúce:

(1) polypeptid obsahujúci celú alebo časť extracelulámej oblasti AIL1M;

(2) fúzny polypeptid obsahujúci celú alebo časť extracelulámej oblasti AILIM a celú alebo časť konštantnej oblasti imunoglobulínového ťažkého reťazca alebo (3) polypeptid, ktorý sa viaže na AILIM.

Príklady „nie-proteínu“ sú DNA, RNA a chemicky syntetizované zlúčeniny.

Termín „DNA“ predstavuje „DNA obsahujúcu čiastočnú nukleotidovú sekvenciu DNA alebo chemicky modifikovanú DNA“ vhodnú ako „antisense“ DNA farmaceutické označenie založené na nukleotidovej sekvencii DNA (zahrnujúci cDNA a genómovú DNA) kódujúcej uvedenú AILIM (výhodne ľudskú AILIM). Konkrétne, antisense DNA môže inhibivovať transkripciu DNA kódujúcej AILIM do mRNA, alebo transláciu mRNA do proteínu pomocou hybridizácie DNA alebo RNA kódujúcej AILIM.

Termín „čiastočná nukleotidová sekvencia“, ako je používaný v tomto texte, znamená čiastočnú nukieotidovú sekvenciu obsahujúcu ľubovoľný počet nukleotidov v ľubovoľnej oblasti. Čiastočná nukleotidová sekvencia obsahuje 5 až 100 postupných nukleotidov, výhodne 5 až 70 postupných nukleotidov, výhodnejšie 5 až 50 postupných nukleotidov a ešte výhodnejšie 5 až 30 postupných nukleotidov.

Ak DNA je použitá ako farmaceutická antisense DNA, DNA sekvencia môže byť chemicky modifikovaná v časti, na účely predĺženia polčasu životnosti (stability) krvnej koncentrácie DNA podávanej pacientom na zvýšenie priepustnosti intracytoplazmatickej membrány DNA alebo na zvýšenie odbúrania imunity alebo na absorpciu orálne podanej RNA v digestívnom orgáne. Príkladom chemickej modifikácie je chemická modifikácia aplikovaná na uvedenú antisense DNA.

Príkladmi „chemicky syntetizovanej zlúčeniny“ sú ľubovoľné zlúčeniny okrem uvedenej DNA, RNA a proteínovej substancie, majúce molekulovú hmotnosť asi 100 až asi 1000, výhodne zlúčeniny majúce mole13 kulovú hmotnosť asi 100 až asi 800 a najvýhodnejšie zlúčeniny majúce molekulovú hmotnosť asi 100 až asi 600.

„Polypeptid“ zahrnutý v definícii spomínanej „substancie“ predstavuje časť (fragment) polypeptidového reťazca vytvárajúceho A1LIM (výhodne ľudskú AILIM), výhodne celú alebo časť extracelulámej oblasti polypeptidu vytvárajúceho AILIM (1 až 5 aminokyselín je možné pridať do N-konca a/alebo C-konca oblasti).

AILIM zahrnutá v predkladanom vynáleze je transmembránová molekula penetrujúca cez bunkovú membránu obsahujúca 1 alebo 2 polypeptidové reťazce.

Termín „transmembránový proteín“ znamená proteín, ktorý je spojený s membránou cez hydrofóbny peptidový región penetrujúci lipidovou dvoj vrstvou membrány raz alebo niekoľkokrát a ktorého štruktúra, ako celku, je zložená z troch hlavných oblastí, ktorými sú extraceluláma oblasť, transmembránová oblasť, cytoplazmatická oblasť, ako je to vidieť pri viacerých receptoroch alebo molekulách bunkového povrchu. Takýto transmembránový proteín sa skladá z receptora alebo bunkovo povrchovej molekuly vo forme monoméru, homodiméru, heterodiméru alebo oligoméru s ďalším reťazcom (reťazcami) majúcim tú istú alebo rozdielnu aminokyselinovú sekvenciu.

Termín „extraceluláma oblasť“ znamená celú alebo časť z parciálnej štruktúry (čiastočná oblasť) z celej štruktúry uvedeného transmembránového proteínu, kde parciálna štruktúra existuje zvonku membrány. Inými slovami, tento termín znamená celú alebo časť oblasti transmembránového proteínu okrem oblasti začlenenej do membrány (transmembránová oblasť) a oblasti existujúcej v cytoplazme nasledujúcej po transmembránovej oblasti (cytoplazmatická oblasť).

„Fúzny polypeptid“ zahrnutý v uvedenom termíne „proteínová substancia“ predstavuje fúzny polypeptid obsahujúci celú alebo časť extracelulámej oblasti polypeptidu vytvárajúceho AILIM (výhodne ľudskú AILIM) a „celú alebo časť konštantnej oblasti imunoglobulínového ťažkého reťazca (Ig, výhodne ľudský lg)“. Výhodne, fúzny polypeptid je fúzny polypeptid s extracelulámou oblasťou AILIM a časťou konštantnej oblasti ľudského IgG ťažkého reťazca a najvýhodnejšie, fúzny polypeptid je fúzny polypeptid extracelulámej oblasti AILIM a oblasti (Fc) ľudského IgG ťažkého reťazca obsahujúceho závesnú oblasť, CH2 doménu a CH3 doménu. Ako IgG je výhodné IgGl a ako AILIM je výhodná ľudská, myšia alebo krysia AILIM (výhodne ľudská AILIM).

Termín „celá alebo časť konštantnej oblasti ľudského imunoglobulínového (Ig) ťažkého reťazca“, ako je používaný v tomto texte, znamená konštantnú oblasť alebo Fc oblasť imunoglobulínového ťažkého reťazca (H reťazec) alebo jej časť. Imunoglobulín môže byť akýkoľvek imunoglobulín patriaci do určitej triedy alebo podtriedy. Konkrétne, príkladné imunoglobulíny sú IgG (IgGl, IgG2, IgG3 a IgG4), IgM, IgA (IgAl a IgA2), IgD a IgE. Výhodne, imunoglobulín je IgG (IgGl, IgG2, IgG3 alebo IgG4) alebo IgM. Príklady najmä výhodného imunoglobulínu podľa vynálezu sú tie imunoglobulíny patriace ku ľudskému IgG (IgGl, IgG2 alebo IgG4).

Imunoglobulín má štruktúrnu jednotku v tvare Y, v ktorej štyri reťazce zložené z dvoch homologických ľahkých reťazcov (L reťazce) a z dvoch homologických ťažkých reťazcov (H reťazce) sú spojené cez disulfidové väzby (S-S) väzby. Ľahký reťazec je zložený z variabilnej oblasti ľahkého reťazca (V_L) a z konštantnej oblasti ľahkého reťazca (C_L). Ťažký reťazec je zložený z variabilnej oblasti (V_H) ťažkého reťazca a z konštantnej oblasti (C_H) ťažkého reťazca.

Konštantná oblasť ťažkého reťazca je zložená z niektorých domén majúcich aminokyselinové sekvencie inherentné v každej triede (IgG, IgM, IgA, IgD a IgE) a v každej podtriede (IgGl, IgG2, lgG3 a IgG4, IgAl a IgA2).

Ťažký reťazec IgG (IgGl, IgG2, lgG3 a IgG4) je zložený z V_H, CH1 domény, závesnej oblasti, CH2 domény a CH3 domény v tomto poradí od N konca.

Podobne, ťažký reťazec IgGl je zložený z Vh, Cyi 1 domény, závesnej oblasti, C'/|2 domény a Cy,3 domény v tomto poradí od N konca. Ťažký reťazec IgG2 je zložený z V_H, Cy₂l domény, závesnej oblasti, Cy₂2 domény a Cy₂3 domény v tomto poradí od N konca. Ťažký reťazec IgG3 je zložený z V_H, Cy₃l domény, závesnej oblasti, Cy₃2 domény a Cy₃3 domény v tomto poradí od N konca. Ťažký reťazec IgG4 je zložený z V_H, Cy₄l domény, závesnej oblasti, Cy₄2 domény a Cy₄3 domény v tomto poradí od N konca.

Ťažký reťazec IgA je zložený z V_H, Cal domény, závesnej oblasti, Ca2 domény a Ca3 domény v tomto poradí od N konca.

Podobne, ťažký reťazec IgAl je zložený z V_H, Ca,l domény, závesnej oblasti, Ca₂2 domény a Ccti3 domény v tomto poradí od N konca. Ťažký reťazec IgA2 je zložený z V_H, Ca₂l domény, závesnej oblasti, Ca₂2 domény a Ca₂3 domény v tomto poradí od N konca.

Ťažký reťazec IgD je zložený z V_H, Cól domény, závesnej oblasti, Có2 domény a C53 domény v tomto poradí od N konca.

Ťažký reťazec IgM je zložený z V_H, Cpl domény, Cp2 domény, Cp3 domény a Cp4 domény v tomto poradí od N konca a nemá závesnú oblasť, ako je vidieť v IgG, IgA a IgD.

Ťažký reťazec IgE je zložený z V_H, Ccl domény, Cc2 domény, Ce3 domény a Cs4 domény v tomto poradí od N konca a nemá závesnú oblasť, ako je vidieť v IgG, IgA a IgD.

Ak, napríklad, IgG je spracovaná papaínom, IgG je štiepená pri N konci mimo disulfidových väzieb existujúcich v závesnej oblasti, kde disulfidové väzby spájajú dva ťažké reťazce na vytvorenie dvoch homologických Fab, v ktorých fragment ťažkého reťazca zložený z V_H, a CH1 je spojený s ľahkým reťazcom cez disulfidovú väzbu a jeden Fc, v ktorých fragmenty homologického ťažkého reťazca zložené zo závesnej oblasti, CH2 domény, a CH3 domény sú spojené cez disulfidové väzby (pozri „Immunology Illustrated“, originálne 2. vydanie, Nankodom str. 65-75 (1992); a „Focus of Newest Medical Science“ Recognition Mechanism of Immune System“, Nankodo, str. 4-7 (1991); atď.)

Konkrétne, uvedený termín „časť konštantnej oblasti imunoglobulínového ťažkého reťazca“ znamená časť konštantnej oblasti imunoglobulínového ťažkého reťazca majúceho štrukturálne charakteristiky ako je uvedené skôr a výhodne je konštantná oblasť bez Cl domény alebo Fc oblasti. Konkrétne, jej príkladom je oblasť zložená zo závesnej oblasti, C2 domény a C3 domény každej IgG, IgA a IgD a je oblasť zložená z C2 domény, C3 domény a C4 domény z každej IgM a IgE. Výhodne je jej príkladom Fc oblasť ľudskej IgGl.

Fúzny polypeptid, ako je spomínaný skôr, je výhodný v tom, že môže byť veľmi jednoducho čistený použitím afinitnej kolónovej chromatografie s využitím vlastnosti proteínu A, ktorý sa špecificky viaže na imunoglobulínový fragment, pretože fúzny polypeptid podľa vynálezu má časť konštantnej oblasti (napríklad Fc) imunoglobulínu takého ako IgG ako fuzneho partnera. Keďže sú dostupné rôzne protilátky proti Fc imunoglobulínu, imunotest pre fúzne polypeptidy môže byť jednoducho vykonávaný protilátkami proti Fc.

„Polypeptid, ktorý sa viaže na A1LIM“, je zahrnutý pod pojem „polypeptid“ zahrnutý pod pojem „substancia“.

Konkrétnymi príkladmi „polypeptidu, ktorý sa viaže na AILIM“, je celý alebo časť polypeptidu vytvárajúceho známe B7h, B7RP-1, GL50 alebo molekulu nazývanú LICOS, ktoré sú ligandmi interagujúcimi s AILIM (Náture, Vol. 402, No. 6763, pp. 827-832, 1999; Náture Medicíne, Vol. 5, No. 12, pp. 1365-1369, 1999; J. Immunology, Vol. 164, pp. 1653-1657, 2000; Curr. Biol., Vol. 10, No. 6, pp.333-336, 2000).

Výhodne, polypeptid je polypeptid obsahujúci celú alebo časť extracelulámej oblasti uvedených ligandov (B7h, B7RP-1, GL50, LICOS) alebo fúzneho polypeptidu obsahujúceho polypeptid a celá alebo časť konštantnej oblasti imunoglobulínového ťažkého reťazca (výhodne ľudský imunoglobulín). Termíny „extraceluláma oblasť“ a „konštantná oblasť“ imunoglobulínového ťažkého reťazca“ majú význam, ako je uvedený.

Polypeptid, časť polypeptidu (fragment) a fúzny polypeptid uvedený skôr môžu byť produkované nielen pomocou technológie rekombinantnej DNA, ako je uvedená neskôr ale tiež pomocou metódy dobre známej v stave techniky takej ako chemická syntetická metóda a kultivačná metóda alebo ich modifikovaná metóda. „Protilátka“ podľa vynálezu môže byť polyklonálna protilátka (antisérum) alebo monoklonálna protilátka proti cicavčej AILIM (výhodne ľudskej AILIM) definovanej skôr a výhodne monoklonálna protilátka.

Konkrétne protilátka je protilátka majúca účinnosť pri inhibícii proliferácie buniek exprimujúcich AILIM pomocou viazania sa na AILIM alebo majúca účinnosť pri inhibícii tvorby interferónu γ alebo interleukínu 4 pomocou buniek exprimujúcich AILIM prostredníctvom väzby na AILIM.

„Oneskorený typ alergie“ je v tomto texte typ alergie sprostredkovaný bunkovou imunitou (konkrétne sprostredkovanej Th-l-typom T bunky), táto alergia je sprostredkovaná zocitlivením T bunky antigénom („memory T celí memorizing antigén“) a je vztiahnutá na akúkoľvek alergiu, ktorá pretrváva približne 24 až 48 hodín na prejavenie alergickej reakcie sprevádzanej zápalom spôsobeným uvedenou „memory“ T bunkou, kedy žijúci organizmus zocitlivený antigénom je opätovne kontaktovaný s tým istým antigénom.

Tento oneskorený typ alergie zahrnuje alergiu na infekčný patogénny antigén taký ako tuberkulínová alergia získaná z Mykobacterium tuberculosis, prechodná alergia oneskoreného typu Jones-Mote na maličké množstvo proteínu, kontaktná alergia na chemikálie také ako pikryl chlorid alebo rastlinný toxín taký ako „lacquer“ alebo alergia na transplantát pozorovaná pri alografii.

Termín „farmaceutická kompozícia“ v tomto texte znamená kompozíciu vhodnú ako liečivo obsahujúcu účinnú protilátku (výhodne ľudskú protilátku), ktorá sa viaže na AILIM (výhodne ľudskú AILIM) alebo na jej časť alebo monoklonálnu protilátku (výhodne ľudskú monoklonálnu protilátku) alebo jej časť a „farmaceutický prijateľný nosič“ „Farmaceutický prijateľný nosič“ zahrnuje excipient, riedidlo, expandér, rozkladné činidlo, stabilizátor, konzervačnú látku, pufer, emulzifikátor, aromatické látky, farbivá, sladidlá, viskozitu zvyšujúce činidlo, ochucovacie látky, rozpustnosť zvyšujúce činidlo alebo iné prídavné látky.

Použitím jedného alebo viacerých nosičov farmaceutická kompozícia môže byť formulovaná do tabliet, piluliek, práškov, granúl, injekcií, roztokov, kapsúl, pastilky, elixírov, suspenzie, emulzie alebo sirupov.

Farmaceutická kompozícia môže byť podaná orálne alebo parentálne. Iné formy na parenterálne podanie zahrnujú roztok na externú aplikáciu, čapík na rektálne podanie a pesar predpísaný podľa zvyčajnej metódy, ktorý obsahuje jednu alebo viac účinných zložiek.

Dávka sa môže meniť v závislosti od veku, pohlavia, hmotnosti a symptómov pacienta, účinku liečby, spôsobu podania, doby liečby alebo druhu účinnej látky (polypeptidu alebo protilátky uvedenej skôr) prítomnej vo farmaceutickej kompozícii. Zvyčajne, farmaceutická kompozícia môže byť podávaná dospelému v dávke od 10 pg do 1000 mg (alebo 10 pg do 500 mg) na jedno podanie. V závislosti od rôznych stavov, dáv15 ka nižšia než tá, ktorá je uvedená skôr, môže byť dostatočná v niektorých prípadoch a dávka väčšia než tá, ktorá je uvedená skôr, môže byť nevyhnutná v niektorých prípadoch.

Najmä, injekcia môže byť tvorená rozpustením alebo suspendovaním protilátky v netoxickom, farmaceutický prijateľnom nosiči takom ako fyziologický roztok alebo komerčne dostupná destilovaná voda pre injekciu s vyrovnanou koncentráciou na 0,1 pg protilátka/ml nosič na 10 mg protilátka/ml nosič.

Injekcia takto pripravená môže byť podaná ľudskému pacientovi, ktorý pg potrebuje liečbu v dávke 1 pg na 100 mg/kg telesnej hmotnosti, výhodne 50 pg/kg telesnej hmotnosti jeden alebo viackrát za deň. Príklady na spôsob podania sú lekársky vhodné spôsoby podania také ako intravenózna injekcia, subkutánna injekcia, intradermálna injekcia, intramuskulárna injekcia alebo intraperitoneálna injekcia, výhodne intravenózna injekcia.

Injekcia tiež môže byť pripravená do nevodného riedidla (napríklad, propylén glykol, polyetylén glykol, rastlinný olej taký ako olivový olej a alkohol taký ako etanol) vo forme emulzie alebo suspenzie.

Injekcia môže byť sterilizovaná filtráciou cez filter zachytávajúci baktérie, pomocou primiešania bakteriocídu alebo pomocou ožiarenia. Injekcia môže byť vyrobená vo forme, ktorá je pripravená pred použitím. Konkrétne, sterilnú tuhú kompozíciu je možné pripraviť vysušením mrazom a potom sa môže pred použitím rozpustiť v sterilnej destilovanej vode alebo v inom rozpúšťadle na účely použitia do injekcie.

Farmaceutické kompozície obsahujúce ľudské protilátky podľa vynálezu sú vhodné ako farmaceutické prípravky bez vyvolania imunitnej reakcie spôsobenej HAMA (ľudská anti-myšia protilátka), a sú vhodné na kontrolu rôznych biologických reakcií (napr. proliferácie buniek exprimujúcich AILIM, produkcie cytokínu bunkami exprimujúcimi AILIM, imunitnej cytolýzy alebo apoptózy buniek exprimujúcich AILIM a iné), ktoré sú spojené s prenosom kostimulačného signálu (sekundárny signál) prostredníctvom AILIM na bunku exprimujúcu AILIM a/alebo a sú vhodné ako farmaceutické prípravky na liečbu alebo prevenciu rôznych ochorení pomocou potlačenia a inhibície začiatku a/alebo vývoja ochorení spojených s prenosom signálu pomocou AILIM.

Termín „imunitná cytolýza“ v tomto texte znamená biologický fenomén opísaný v nasledujúcom.

Lýza bunky (cytolýza) môže byť vyvolaná protilátkou (najmä protilátkou lyžujúcou bunku) rovnako ako naviazaním zabíjača buniek. Protilátka lyžujúca bunku je cytotoxická protilátka, ktorá má najmä lyžujúcu aktivitu na bunky také ako imunitné bunky, tkanivové bunky alebo spermatické bunky. Keď sa protilátka naviaže na bunkovo povrchový antigén, spôsobí cytotoxický účinok na bunku alebo vyvolá cytolýzu v prítomnosti komplementu.

Táto imunitná cytolýza je vyvolaná účinkom komplementu v spojitosti so špecifickým naviazaním protilátky na bunkovo-povrchový antigén. Protilátková väzba na povrch antigénu aktivuje Cl komplement (Cl). Následne, poškodené miesta bunky sú vytvorené prostredníctvom reakcií fixujúcich komplement s C2 až C9 komplementárni (C2-C9) a potom je uvoľňovaný bunkový obsah z buniek, čím dochádza k lyžovaniu buniek.

Termín „bunková cytotoxicita závislá od protilátky“ v tomto texte znamená biologický prípad, ktorý je tiež uvádzaný ako „ADCC“ a znamená cytotoxický účinok na cieľové bunky pomocou buniek efektom takých ako lymfocyty, makrofágy alebo polymorfonukleárne leukocyty, ktoré sú nielen bunky efektom a cieľové bunky, ale tiež protilátky podieľajúce sa na vyvolaní cytotoxického javu.

Termín „zmiešaná Iymfocytová reakcia“ v tomto texte znamená biologický jav tiež nazývaný ako „MLR“. Reakcia je tiež označovaná ako zmiešaná leukocytová reakcia.

Alogénové leukocyty alebo lymfocyty získané od odlišných jedincov sú zmiešané a kultivované niekoľko dní, týmto je umožnený vznik blastu buniek a DNA syntéza v bunkách (napr. bunková proliferácia). Táto reakcia je označovaná ako MLR (alogénová MLR).

DNA syntéza (bunková proliferácia) môže byť analyzovaná zastavením proliferácie lymfocytov. Zástava môže byť vykonaná ošetrením pomocou žiarenia lebo mitomycínom. Analýza môže byť vykonávaná meraním množstva DNA syntetizovanej v ďalšom lymfocyte.

Množstvo syntetizovanej DNA môže byť analyzované meraním začleneného tymidínu, označeného rádioizotopom takým ako trícium do jadra bunky.

DNA kódujúca AILIM (najmä výhodne ľudskú AILIM) podľa predkladaného vynálezu môže byť získaná bežne používanou metódou s využitím postupov klonovania cDNA z mRNA kódujúcej AILIM; postupov na izolovanie genómovej DNA a jej spojenie; postupov na prípravu DNA pomocou metódy PCR s využitím cDNA sekvencie alebo mRNA sekvencie ako templátu; alebo postupov na chemickú syntézu DNA.

DNA kódujúca AILIM ligand podľa vynálezu môže byť tiež získaná tým istým spôsobom, ako je uvedené.

DNA kódujúca AILIM (najmä výhodne ľudskú AILIM) podľa vynálezu môže byť pripravená rezaním (narušením) DNA, ktorá obsahuje DNA kódujúcu AILIM pripravenú pomocou vhodného reštrikčného enzýmu a dosiahne sa ligácia výsledného DNA fragmentu s linkerom DNA alebo značkou vhodnou DNA polymerázou alebo podobne. DNA kódujúca AILIM ligand môže byť pripravená tým istým spôsobom.

Príkladná metóda bude uvedená nižšie na klone cDNA kódujúcej A1LIM (najmä výhodne ľudskú A1L1M; proteín je nižšie spomínaný ako proteín záujmu) z mRNA. DNA kódujúca AILIM ligand môže byť tiež klonovaná tým istým spôsobom.

Po prvé, mediátorová RNA kódujúca proteín nášho záujmu je pripravená z tkanív alebo buniek exprimujúcich a vytvárajúcich proteín nášho záujmu. mRNA môže byť pripravená izolovaním celkovej RNA pomocou známej metódy takej ako guanidín-tiokyanátová metóda (Chirgwin, J. M. a kol., Biochemistry, Vol. 18, p5294, 1979), horúca fenolová metóda alebo AGPC metóda a jej vystavením afinitnej chromatografie použitím oligo-dT celulózy alebo poly-U Sefarózy.

Potom c DNA je syntetizovaná s mRNA získanou ako templát pomocou dobre známej metódy s použitím reverznej transkriptázy takej ako metóda podľa Okayama a kol., (Mol. Celí. Biol. Vol. 2, str. 161 (1982); ibid. Vol. 3, str. 280 (1983) alebo pomocou metódy podľa Hoffmana a kol., (Gene Vol. 25, str. 263 (1983) a je konvertovaná do dvojvláknovej cDNA. cDNA knižnica je pripravená pomocou transformácie E. coli s plazmidovými vektormi, fágovými vektormi alebo kozmidovými vektormi majúcimi túto cDNA alebo pomocou transfektovania E. coli po in vitro balení.

Plazmidové vektory použité v tomto vynáleze nie sú limitované dobou ich replikovania a udržiavania v hostiteľoch. Určité fágové vektory, ktoré môžu byť replikované v hostiteľoch, sa tiež môžu použiť. Príklady zvyčajne používaných klonovacích vektorov zahrnujú pUC19, ZgtlO, /.gtl 1 atď. Ak je vektor aplikovaný na imunologický skríning, ako je uvedené, je výhodne použitý vektor majúci promótor, ktorý môže exprimovať gén kódujúci polypeptid podľa vynálezu v hostiteľovi.

sDNA môže byť inzertovaná do plazmidu prostredníctvom, napríklad, metódy podľa Maniatisa a kol. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, druhé vydanie, Cold Spring Harbor Laboratory, str. 1.53, 1989). cDNA môže byť inzertovaná do fágového vektora prostredníctvom, napríklad, metódy podľa Hyunha a kol., (DNA cloning, a practical approach, Vol. 1, str. 49 (1985)). Tieto metódy sa jednoducho dajú zrealizovať použitím komerčne dostupného klonovacieho kitu (napríklad, produkt od Takara Shuzo). Rekombinantný plazmid alebo fágový vektor takto získané boli začlenené do vhodných hostiteľských buniek takých ako prokaryotá (napríklad, E. coli: XLIBlue MRF', DH5a, HB101, MC1061/P3 atď.).

Príklady metódy na zavedenie plazmidu do hostiteľa zahrnujú chlorid vápenatý metódu, chlorid vápenatý/rubídium chlorid metódu opísané v Molecular Cloning, A Laboratory Manual (druhé vydanie, Cold Spring Harbor Laboratory, str. 1.74 (1989)) a metódu elektroporácie. Fágové vektory môžu byť začlenené do hostiteľskej bunky pomocou, napríklad, metódy, v ktorej fágové DNA sú zavedené do hostiteľov po in vitro balení. In vitro balenie môže byť jednoducho vykonané komerčne dostupným in vitro baliacim kitom (napríklad, produkt od Stratagene alebo Amersham).

cDNA kódujúca polypeptid podľa vynálezu môže byť izolovaná z cDNA knižnice ako aj pripravená podľa metódy uvedenej skôr pomocou kombinovania všeobecných cDNA skrininkových metód. Napríklad, kloň obsahujúci požadovanú cDNA môže byť skrinovaný podľa známej kolónovej hybridizačnej metódy (Crunstein a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 72, str. 3961 (1975) alebo podľa plakovej hybridizačnej metódy (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, druhé vydanie, Cold Spring Harbor Laboratory, str. 2.108 (1989) použitím chemicky syntetizovaných oligonukleotidov s označeným ³²P ako vzoriek, ktoré sú zodpovedajúce aminokyselinovej sekvencii polypeptidu podľa vynálezu.

Alternatívne, kloň majúci DNA fragment kódujúci špecifickú oblasť vnútri polypeptidu podľa vynálezu môže byť skrinovaný pomocou zosilnenia oblasti metódou PCR so syntetickými PCR primérmi.

Ak sa použije cDNA knižnica pripravená použitím cDNA expresného vektora (napríklad, λΖΑΡΙΙ fágový vektor), požadovaný kloň sa môže skrinovať pomocou reakcie antigén-protilátka s využitím protilátky proti polypeptidu podľa vynálezu. Skrininková metóda využívajúca PCT metódu je výhodne použitá, ak viaceré klony podliehajú skrininku.

Nukleotidová sekvencia DNA takto získaná môže byť určená metódou podľa Maxam-Gilberta (Maxam a kol. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 74, str. 560 (1977)) alebo podľa metódy „konca dideoxynukleotid syntetického reťazca“ s využitím fága M13 (Sanger a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 74, pp. 5463-5467 (1977)). Celý alebo časť génu kódujúceho polypeptid podľa vynálezu môže byť získaný odstránením klonu získaného, ako je uvedené skôr reštrikčnými enzýmami.

DNA kódujúca polypeptid podľa vynálezu môže byť izolovaná z genómovej DNA získanej z buniek exprimujúcich polypeptid podľa vynálezu, ako je uvedené skôr pomocou nasledujúcich metód.

Takéto bunky sú solubilizované výhodne pomocou SDS alebo proteinázy K a DNA sú deproteinizované pomocou fenolovej extrakcie. RNA sú štiepené výhodne ribonukleázou. Získané DNA sú čiastočne štiepené vhodnými reštrikčnými enzýmami a získané DNA fragmenty sú zosilnené vhodným fágom alebo kozmidom na vytvorenie knižnice. Potom sú detegované klony majúce požadovanú sekvenciu použitím rádioaktívne označených DNA vzoriek a celý gén alebo časť génu kódujúceho polypeptid podľa vynálezu je získaný z klonov odstránením pomocou reštrikčného enzýmu.

Príprava DNA, pomocou PCR, kódujúcej protein nášho záujmu sa môže uskutočňovať s použitím známej mRNA alebo cDNA kódujúcej protein nášho záujmu ako templátu v súlade s bežnou metódou („PCR techniky na génové zosilnenie základné a nové technológie“ KYORITSU SHUPPAN, 1992, atď.).

DNA kódujúca protein nášho záujmu môže byť chemicky syntetizovaná zvyčajnou metódou, založenou na nukleotidovej sekvencii kódujúcej protein nášho záujmu.

AILIM podľa vynálezu (najmä výhodne ľudská AILIM) alebo jej časť (výhodne extraceluláma oblasť) môže byť pripravená ako rekombinantný protein podľa bežnej metódy využívajúcej genetické rekombinančné techniky, využívajúce DNA získanú rezaním DNA kódujúcej AILIM (cDNA alebo intrón obsahujúcej genómovej DNA) podľa metódy opísanej skôr, na rezanie sa využívajú vhodné reštrikčné enzýmy, ktoré poskytujú DNA fragment kódujúci AILIM. Potom, ak je to žiaduce, nasleduje ligácia výsledného DNA fragmentu s linker DNA použitím vhodnej DNA polymerázy alebo podobne.

AILIM ligand (výhodne ľudský AILIM ligand) alebo jeho časť (výhodne extraceluláma oblasť) sa môže pripraviť tým istým spôsobom.

Konkrétny príklad je uvedený. Konkrétne, pripravená DNA, ako je opísaná, je vložená do vektora, ktorý bude detailnejšie opísaný neskôr, na získanie expresného vektora. Potom sa expresný vektor použije na transformáciu hostiteľskej bunky, ako je opísané a získa sa transformant. Transformant je kulitivovaný a je mu umožnené produkovať protein nášho záujmu do kultivačného supematantu. Protein nášho záujmu v kultivačnom supematante sa môže jednoducho čistiť použitím kolónovej chromatografie.

Neexistuje konkrétne obmedzenie týkajúce sa typu expresného vektora na tvorbu rekombinantnej AILIM (alebo jej extracelulámej oblasti), do určitej miery je vektor replikovaný a udržiavaný alebo produkovaný autonómne v určitých hostiteľoch takých ako prokaryotické bunky a/alebo eukaryotické bunky. Takéto expresné vektory zahrnujú plazmidové vektory a fágové vektory (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985).

Expresný vektor sa môže jednoducho pripraviť ligáciou DNA kódujúcej AILIM (alebo jej extracelulámu oblasť) s vektorom vhodným na rekombináciu (plazmid DNA a bakteriofág DNA) pomocou zvyčajnej metódy. Konkrétne príklady vektorov na využitie pri rekombinácii zahrnujú plazmid pBR322, pBR325, pUC12, pUC13 a pUC19 získaný z E. coli, plazmidy získané z kvasiniek, také ako pSH19 a pSH15 a plazmidy získané z Bacillus subtilis, také ako pUB 110, pTP5 a pC194. Príklady fágov zahrnujú bakteriofága takého ako λ fág a živočíšne alebo hmyzie vírusy (pVL1393, Invitrogen) také ako retrovírus, vírus kravských kiahní a vírus hmyzích lariev.

Plazmidové vektory sú vhodné, ak DNA kódujúca AILIM podľa vynálezu (výhodne ľudská AILIM) alebo jej extraceluláma oblasť je určená na expresiu v hostiteľskej bunke a týmto sa exprimuje AILIM na povrchu hostiteľskej bunky alebo sa produkuje extraceluláma oblasť AILIM (výhodne ľudskej AILIM). Neexistuje konkrétne obmedzenie pre takéto plazmidové vektory, takže vektory môžu exprimovať gén kódujúci AILIM (výhodne ľudskú AILIM) alebo jej extracelulámu oblasť a vytvárať kódovaný protein v rôznych hostiteľských bunkách takých ako prokaryotické bunky a/alebo eukaryotické bunky. Napríklad, takéto plazmidy zahrnujú pMAL C2, pcDNA3.1 (-), pEF-BOS (Nucleic Acid Research, Vol. 18, p. 5322, 1990; atď), pME18S („Handbook for genetic engineering, „Experimental Medicíne, supplement, 1992; atď.).

Ak sú baktérie, konkrétne A. coli, použité ako hostiteľské bunky, expresný vektor je všeobecne zložený z aspoň promótor-operátor oblasti, iniciačného kodónu, DNA kódujúcej protein podľa vynálezu, terminačného kodónu, terminačnej oblasti a replikónu.

Ak sú kvasinky, živočíšne bunky alebo bunky hmyzu použité ako hostiteľské bunky, expresný vektor je výhodne zložený aspoň z promótora, iniciačného kodónu, DNA kódujúcej AILIM (výhodne ľudskú AILIM) podľa vynálezu alebo jej extracelulámu oblasť a terminačného kodónu. Taktiež môže byť zložený z DNA kódujúcej signálny peptid, zlepšovacej sekvencie, 5'- a 3'- netranslatovanej oblasti génu kódujúceho AILIM podľa vynálezu, spojovacích spojov, polyadenylačného miesta, selektívnej markérovej oblasti a replikónu. Expresný vektor môže obsahovať, ak je to žiaduce, gén pre génovú amplifikáciu (markér), ktorý sa využíva zvyčajne.

Promótor-operátorová oblasť na expresiu AILIM (výhodne ľudskej AILIM) podľa vynálezu alebo jej extracelulámej oblasti v baktérii obsahuje promótor, operátor a Shine-Dalgarno (SD) sekvenciu (napríklad AAGG). Napríklad, ak je hostiteľ Escherichia, výhodne obsahuje Trp promótor, lac promótor, recA promótor, LPL promótor, tac promótor alebo podobne.

Príklady promótora na expresiu AILIM (konkrétne ľudskej AILIM) podľa vynálezu alebo jej extracelulámej oblasti v kvasinkách zahrnujú PH05 promótor, PGK promótor, GAP promótor, ADH promótor atď. Ak hostiteľom je Bacillus, príklady zahrnujú SL01 promótor, SP02 promótor, penP promótor atď.

Ak hostiteľom je eukaryotická bunka taká ako cicavčia bunka, príklady zahrnujú promótor získaný zo SV40, retrovírusový promótor atď. V našom prípade nie je promótor limitovaný na uvedené príklady. Použitie zlepšovača (enhancer) je účinné pri expresii.

Výhodný iniciačný kodón je, napríklad, metionínový kodón (ATG). Bežne používaný terminačný kodón (napríklad TAG, TGA, TAA atď.) je označovaný ako terminačný kodón.

Zvyčajne používané prirodzené alebo syntetické terminátory sú využiteľné ako terminačná oblasť.

Replikón predstavuje DNA schopnú replikovať celú DNA sekvenciu v hostiteľských bunkách a zahrnuje prirodzený plazmid, modifikovaný plazmid (DNA fragment pripravený z prirodzeného plazmidu), syntetický plazmid atď. Príklady výhodných plazmidov zahrnujú pBR322 alebo jeho umelé deriváty (DNA fragment získaný spracovaním pBR322 vhodnými reštrikčnými enzýmami) pre E. coli, kvasinkový 2 μ plazmid alebo kvasinkovú chromozomálnu DNA pre kvasinku a pRSVneo ATCC 37198, pSV2dhfr ATCC 37145, pdBPVMMTneo ATCC 37224, pSV2neo ATCC 37149, pSV2bsr atď. pre cicavčie bunky.

Zlepšovacia sekvencia, polyadenylačné miesto a spojovací spoj, ktorú sú zvyčajne používane v odbore a sú získané zo SV40 sa taktiež môžu použiť.

Zvyčajný výberový marker sa môže použiť v súlade s bežnou metódou. Medzi ne patria rezistentné gény pre antiobiotiká, také ako tetracyklín, ampicilín alebo kanamycín a tymidín kinázový gén.

Príklady génu na génové zosilnenie zahrnujú dihydrofolátový reduktázový gén (DHFR) gén, tymidín kinázový gén, neomycínový rezistentný gén, glutamátový syntázový gén, adenozínový deaminázový gén, omitínový dekarboxylázový gén, hydromycín-B-fosfotransferázový gén, aspartátový transkarbamylázový gén atď.

Expresný vektor podľa vynálezu môže byť pripravený pomocou plynulého a kruhového napojenia najmenej uvedeného promótora, iniciačného kodónu, DNA kódujúcej proteín podľa vynálezu, terminačného kodónu a terminačnej oblasti na vhodný replikón. Ak je žiaduce, môžu byť použité vhodné DNA fragmenty (napríklad, linkery, reštrikčné miesta generované inými reštrikčnými enzýmami) v metóde takej ako digécia s reštrikčným enzýmom alebo ligácia použitím T4 DNA ligázy.

Transformanty podľa vynálezu sa môžu pripraviť zavedením expresného vektora uvedeného skôr do hostiteľských buniek.

Hostiteľské bunky používané vo vynáleze nie sú obmedzené, pokiaľ sú kompatibilné s expresným vektorom uvedeným skôr a môžu byť transformované. Medzi tieto bunky patria rôzne bunky, také ako prirodzené bunky alebo umelo pripravené rekombinantné bunky bežne používané podľa doterajšieho stavu techniky (napríklad baktéria (Escherichia a Bacillus), kvasinky (Saccharomyces, Pichia atď.), živočíšne bunky alebo bunky hmyzu.

Výhodne sa používajú E. coli alebo živočíšne bunky. Špecifické príklady zahrnujú E. coli (DH5a, DH10B, TB1, HB101, XL-2Blue atď.), bunky získané z myši (COP, L, 027, Sp2/0, NS-1, NIH 3T3 atď.), bunky získané z krysy, bunky získané zo škrečka (BHK, CHO atď.), bunky získané z opice (ČOSI, COS3, COS7, CV1, Velo atď.) a bunky získané z človeka (Hela, diploidné bunky získané z fibroplastu, myelóm, Namalwa atď.). Expresný vektor môže byť zavedený (transformovaný, transduktovaný) do hostiteľských buniek prostredníctvom známej metódy.

Transformácia môže byť vykonávaná, napríklad, v súlade s metódou podľa Cohena a kol. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 69, p. 2110 (1972)), metódou protoplastu (Mol. Gen. Genet., Vol. 168, p. 111 (1979)) alebo kompetentnou metódou (J. Mol. Biol., Vol. 56, p. 209 (1971)), ak sú hostitelia baktérie (E. coli, Bacillus subtilis atď), s metódou podľa Hinnena a kol. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 75, p. 1927 (1978)), alebo v súlade s lítiovou metódou (J. Bacteriol., Vol. 153, p. 163 (1983)) ak je hostiteľom Saccharomyces cerevisiae, s metódou podľa Grahama (Virology, Vol. 52, p. 456 (1973)), ak sú hostitelia živočíšne bunky a v súlade s metódou podľa Summera a kol., (Mol. Celí. Biol., Vol. 3, pp. 2156-2165 (1983)) ak sú hostitelia bunky hmyzu.

Extracelulárna oblasť A1LIM (výhodne ľudskej AL1M) podľa vynálezu (rozpustná A1LIM) môže byť produkovaná kultiváciou transformantov (v nasledujúcom tento termín zahrnuje transduktantov) obsahujúcich expresný vektor pripravený ako je uvedené skôr v živnom médiu. A1L1M ligand môže byť produkovaný tým istým spôsobom.

Živné médiu výhodne obsahuje uhlíkový zdroj, anorganický zdroj dusíka alebo organický zdroj dusíka nevyhnutný na nárast hostiteľských buniek (transformantov). Príklady uhlíkového zdroja zahrnujú glukózu, dextrán, rozpustný škrob a sacharózu a príklady anorganického alebo organického zdroja dusíka zahrnujú amónne soli, nitráty, aminokyseliny, zrnový výťažok, peptón, kazeín, sójový koláč a extrakt zo zemiakov. Ak je žiaduce, môžu obsahovať aj iné živiny (napríklad anorganické soli (napríklad, chlorid vápenatý, dihydrogénfosfát sodný a chlorid horečnatý), vitamíny, antibiotiká (napríklad tetracyklín, neomycín, ampicilín, kanamycín atď.).

Kultivácia je vykonávaná metódou známou z doterajšieho stavu techniky. Kultivačné podmienky také ako teplota, pH média a kultivačný čas sú vybrané tak, aby sa produkoval proteín podľa vynálezu.

Špecifické médium a kultivačné podmienky, ktoré závisia od hostiteľských buniek, sú uvedené, ale nemajú obmedzujúci charakter.

Ak hostiteľmi sú baktéria, aktinomycetes, kvasinky, huby sú vhodné kvapalné médium s uvedeným živinovým zdrojom. Je výhodné použiť médium s hodnotou pH 5 až 8.

Ak hostiteľmi sú E. coli, príklady vhodného média zahrnujú LB médium, M9 médium (Miller a kol. Exp. Mol. Genet., Cold Spring Harbor Laboratory, p. 431 (1972)), YT médium atď. Používanie týchto médií a kultivácia je vykonávaná zvyčajne od 14 do 43 °C počas 3 až 24 hodín za prevzdušňovania a miešania, ak je nevyhnutné.

Ak hostiteľmi sú Bacillus, kultivácia môže byť vykonávaná zvyčajne pri 30 až 40 °C počas asi 16 až 96 hodín za prevzdušňovania a miešania, ak je nevyhnutné.

Ak hostiteľom je kvasinka, príklady média zahrnujú Burkholderovo minimálne médium (Bostian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 77, p. 4505 (1980)). Hodnota pH média je výhodne 5 až 8. Kultivácia môže byť vykonávaná zvyčajne pri 20 až 35 °C počas 14 až 144 hodín za prevzdušňovania a miešania, ak je nevyhnutné.

Ak je hostiteľom živočíšna bunka, príklady média zahrnujú MEM médium obsahujúce asi 5 až 20 % hovädzieho séra (Science, Vol. 122, p. 501 (1952)), DMEM médium (Virology, Vol. 8, p. 396 (1959)), RPMI1640 médium (J. Am. Med. Assoc., Vol. 199, p. 519 (1967)), 199 médium (Proc. Soc. Exp. Biol. Med., Vol. 73, p. 1 (1950)), HamF12 médium atď. Hodnota pH média je výhodne asi 6 až 8. Kultivácia môže byť vykonávaná zvyčajne pri asi 30 až 40 °C počas 15 až 72 hodín za prevzdušňovania a miešania, ak je nevyhnutné.

Ak hostiteľ je bunky hmyzu, príklad média zahrnuje Grace's médium obsahujúce hovädzie sérum (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 82, p. 8404 (1985)). Hodnota pH je výhodne asi 5 až 8. Kultivácia môže byť vykonávaná zvyčajne pri asi 20 až 40 °C počas 15 až 100 hodín za prevzdušňovania a miešania, ak je nevyhnutné.

Extraceluláma oblasť (rozpustná AILIM) AILIM podľa vynálezu (výhodne ľudskej AILIM) môže byť získaná kultiváciou uvedených transformovaných buniek (konkrétne živočíšnej bunky alebo E. coli) a ponechaním na účely vylúčenia proteínu do kultivačného supematantu. Konkrétne, kultivačný filtrát (supematant) je získaný metódou takou ako filtrácia alebo centrifugácia získanej kultúry a polypeptid alebo polypeptidový fragment podľa vynálezu je čistený a izolovaný z kultivačného filtrátu bežnou metódou používanou pri bežnom čistení a izolovaní prirodzeného alebo umelého proteínu.

Príklady izolačnej a čistiacej metódy zahrnujú metódu využívajúcu špecifickú afinitu, takú ako afinitná chromatografia, metódu využívajúcu rozpustnosť, takú ako precipitačná metóda a vylúčenie soli, metódu využívajúcu rozdiel v molekulovej váhe, takú ako dialýza, ultrafiltrácia, gélová filtrácia a elektroforéza využívajúca sulfát-polyakrylamidový gél, metódu využívajúcu zmeny, takú ako iónovo výmenná chromatografia a hydroxyapatitová chromatografia, metódu využívajúcu rozdiel v hydrofobicite, takú ako vysoko účinná kvapalinová chromatografia s reverznou fázou a metódu využívajúcu rozdiel v izoelektrickom bode, takú ako izoelektrická fokusácia.

Ak protein nášho záujmu existuje v periplazme alebo cytoplazme kultivovaných transformantov, najprv sú zachytávané hubové telesá alebo bunky bežnou metódou, takou ako filtrácia alebo centrifugácia, a potom sú suspendované do vhodného pufra. Potom je rozrušená bunková stena a/alebo bunková membrána buniek metódou takou ako lýza so sonikáciou, lyzozýmom a mrazením. Membránová frakcia obsahujúca polypeptid podľa vynálezu je získaná metódu takou ako centrifugácia alebo filtrácia. Membránová frakcia je solubilizovaná detergentom takým ako Triton-XIOO na získanie surového extraktu. Nakoniec je polypeptid alebo polypeptidový fragment izolovaný a čistený zo surového extraktu bežnou metódou, ako je uvedená.

V predkladanom vynáleze termín „nerozpustný nosič“ predstavuje nosič, ktorý je používaný na imobilizáciu polypeptidov na seba pomocou fyzikálnej absorpcie alebo chemického viazania. Napríklad, nosič môže byť (1) platňa, testovacia skúmavka, skúmavka alebo podobný predmet majúci vnútorný priestor, kvapka, guľka, filter, membrána alebo podobne vyrobená z materiálov vo vode nerozpustných zahrnujúcich plasty napr. polystyrénová živica, polykarbonátová živica, silikónová živica alebo nylonová živica, alebo sklo a (2) nerozpustný nosič používaný v afinitnej chromatografii taký ako celulózový nosič, agarózový nosič, polyakrylamidový nosič, dextránový nosič, polystyrénový nosič, polyvinylový nosič, polyamino kyselinový nosič, pórovitý silikagélový nosič atď.

Termín „značiaca substancia schopná vydávať detekovateľný signál v súlade s predkladaným vynálezom zahrnuje, napríklad, enzým, fluorescenčný materiál, luminescenčný materiál, biotín, avidín alebo rádioizotop, konkrétnejšie enzými také ako peroxidáza (napr. chrenová peroxidáza), alkalická fosfatáza, β-D-galaktoxidáza, glukozooxidáza, glukóza-6-fosfát dehydrogenáza, alkohol dehydrogenáza, malát dehydrogenáza, penicilináza, kataláza, apo-glukóza oxidáza, ureáza, luciferáza, acetylcholín esteráza atď; fluorescenčné materiály také ako fluoresceín izotiokyanát, fykobilín protein, chelatujúce činidlá kovov vzácnych zemín, danzyl chlorid, tetrametyl rodamín izotiokyanát atď.; rádioizotopy také ako ³H, ^l4C, ^l25I, ¹³1I atď.; biotín, avidín a luminescenčný materiál.

Medzi rádioizotopom alebo fluorescenčným materiálom môže vznikať detekovateľný signál, dokonca, keď sa použije samotne. Na druhej strane, ak sa použije samotný enzým, luminiscenčný materiál, biotín alebo avidín poskytnú nedetekovateľný signál, ale ak sa nechá reagovať s jednou alebo viacerými substanciami, môže poskytnúť detekovateľný signál. Napríklad, ak značka je enzým na detekciu, je nevyhnutný aspoň substrát. Rôzne typy substrátov môžu byť používané v závislosti od typu metódy na meranie enzýmovej aktivity (kolorimetria, fluoroskopia, metóda používajúca bioluminescenciu alebo chemickú luminescenciu atď.). Na20 príklad, ak značka je peroxidáza, hydrogén peroxidáza môže byť použitá ako substrát. Alternatívne, ak značka je biotín, avidín alebo enzým-modifikovaný avidín je bežne používaný, ale nie je to obmedzujúce. Ak je to žiaduce, rôzne luminescentné substancie môžu byť využívané v závislosti od typu substrátu, ktorý sa použije.

Určité z uvedených značiek môžu byť používané v predkladanom vynáleze. Ale výhodná značka je enzým taký ako peroxidáza alebo biotín so zreteľom na citlivosť detekcie alebo testovania ako aj na vhodnosť manipulácie.

„Metóda na identifikáciu substancie schopnej väzby na AILIM alebo AILIM ligand“ v súlade s vynálezom je založená na princípe imunotestovania.

Konkrétne môžu byť aplikované princípy rôznych metód opísaných v „Immunoassay (3^rd Edition., eds., Eiji Ishikawa a kol., Igakushoin, 1987)“. Príklady výhodne používaných metód zahrnujú „tuhá-fáza jedna-protilátka metódu“ (solid-phase one-antibody method), „kvapalná-fáza dve-protilátky metódu“ (liquid-phase two-antibody method), „tuhá-fáza dve-protilátky metódu“ (solidphase two-antibody method), „sendvičovú metódu“ (sandwich method) a Jeden-pot“ (one-pot method) metódu, ako sú opísané v publikovanej japonskej patentovej prihláške (JP-B) č. Hei 2-39747. Testovacia metóda využívajúca antigén-protilátka reakciu zahrnuje EMIT metódu (enzýme multiplied immunoassay techníque), enzýmový tunelovací imunotest (enzýme channeling immunoassay), enzýmový imunotest sprostredkovaný enzýmovým modulátorom (EMMIA, enzýme modulátor mediated enzýme immunoassay), enzýmový inhibítor-imunotest (enzýme inhibítor immunoassay), imunoenzymometrický test (immunoenzymometric assay), enzým - imunotest a proximálny väzbový imunotest (enzýme enhanced immunoassay and proximal linkage immunoassay).

V predkladanom vynáleze niektoré z týchto imunotestov môžu byť vhodne vybrané v súlade s cieľom predkladaného vynálezu. Ale s ohľadom na zvyklosti postupu a/alebo ekonomické výhody a najmä klinickú univerzálnosť je výhodná sendvičová metóda, jeden-pot metóda alebo tuhá-fáza jedna-protilátka metóda, výhodnejšia sedvičová metóda alebo jeden-pot metóda. Konkrétne je uprednostňovaná sendvičová metóda využívajúca mikrotitračnú platňu s viacerými jamkami napríklad s 96 jamkami, alebo jeden-pot metóda využívajúca kvapky, na ktorých je imobilizovaný polypeptid a tiež využívajúca doplnok označený enzýmom takým ako peroxidáza alebo biotín.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 znázorňuje vhodné reaktivity anti-ľudskej IgG protilátky, anti-ľudskej IgK protilátky a anti-ľudskej IgFc protilátky k ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátke analyzované bunkovým testom ELISA využívajúcim prietokový cytometer.

Panely (a) na (1) znázorňujú vhodné výsledky testov uvedených neskôr.

Panel (a): výsledok testu, v ktorom biotínom označená anti-ľudská IgG protilátka ako sekundárna protilátka bola pridaná za neprítomnosti primárnej protilátky do mikroplatne, v ktorej bol umiestnený divý typ HPB-ALL buniek.

Panel (b): výsledok testu, v ktorom biotínom označená anti-ľudská IgK protilátka ako sekundárna protilátka bola pridaná za neprítomnosti primárnej protilátky do mikroplatne, v ktorej bol umiestnený divý typ HPB-ALL buniek.

Panel (c): výsledok testu, v ktorom biotínom označená anti-ľudská IgFc protilátka ako sekundárna protilátka bola pridaná za neprítomnosti primárnej protilátky do mikroplatne, v ktorej bol umiestnený divý typ HPB-ALL buniek.

Panel (d): výsledok testu, v ktorom ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMab-136 bola použitá ako primárna protilátka a biotínom označená anti-ľudská IgG protilátka bola použitá ako sekundárna protilátka.

Panel (e): výsledok testu, v ktorom ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMab-136 bola použitá ako primárna protilátka a biotínom označená anti-ľudská IgK protilátka bola použitá ako sekundárna protilátka.

Panel (f): výsledok testu, v ktorom ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMab-136 bola použitá ako primárna protilátka a biotínom označená anti-ľudská IgFc protilátka bola použitá ako sekundárna protilátka.

Panel (g): výsledok testu, v ktorom ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMab-138 bola použitá ako primárna protilátka a biotínom označená anti-ľudská IgG protilátka bola použitá ako sekundárna protilátka.

Panel (h): výsledok testu, v ktorom ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMab-138 bola použitá ako primárna protilátka a biotínom označená anti-ľudská IgK protilátka bola použitá ako sekundárna protilátka.

Panel (i): výsledok testu, v ktorom ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMab-138 bola použitá ako primárna protilátka a biotínom označená anti-ľudská IgFc protilátka bola použitá ako sekundárna protilátka.

Panel (j): výsledok testu, v ktorom ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMab-139 bola použitá ako primárna protilátka a biotínom označená anti-ľudská IgG protilátka bola použitá ako sekundárna protilátka.

Panel (k): výsledok testu, v ktorom ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMab-139 bola použitá ako primárna protilátka a biotínom označená anti-ľudská IgK protilátka bola použitá ako sekundárna protilátka.

Panel (1): výsledok testu, v ktorom ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMab-139 bola použitá ako primárna protilátka a biotínom označená anti-ľudská IgFc protilátka bola použitá ako sekundárna protilátka.

Krivka s otvorenými symbolmi v každom paneli zodpovedá výsledku testu, v ktorom ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka bola použitá ako kontrolná protilátka.

Obrázok 2 znázorňuje kalibračnú krivku s ohľadom na ľudskú IgG monoklonálnu protilátku (štandardný materiál) testovanú sendvičovou ELISA metódou využívajúcou anti-ľudskú IgG protilátku.

Vertikálna os znázorňuje fluorescenčnú intenzitu a horizontálna os znázorňuje koncentráciu štandardného materiálu.

Obrázok 3 znázorňuje väzbové aktivity rôznych myších anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok k ľudskej AILIM-preexprimujúcej rekombinantné CHO bunky alebo divý typ CHO buniek.

Vertikálna os znázorňuje fluorescenčné intenzity ako index väzbovej aktivity k rekombinantným bunkám a horizontálna os znázorňuje koncentráciu pridanej protilátky.

Termín „CHO“ v obrázku predstavuje výsledok väzbového testu k CHO bunke divého typu a „ľudský“ predstavuje výsledok väzbového testu rekombinantnej bunky exprimujúcej ľudskú AILIM.

Obrázok 4 znázorňuje väzbové aktivity k rôznym ľudským anti-ľudským AILIM monoklonálnym protilátkam alebo ľudským anti-KLH monoklonálnym protilátkam ako negatívnej kontrole k rekombinantnej bunke exprimujúcej ľudskú AILIM alebo CHO bunke divého typu.

Vertikálna os znázorňuje fluorescenčnú intenzitu ako index väzbovej aktivity ku rekombinantným bunkám a horizontálna os znázorňuje koncentráciu pridanej protilátky.

Termín „CHO“ na obrázku znázorňuje výsledok väzbového testu k CHO bunke divého typu a „ľudský“ znázorňuje výsledok väzbového testu k rekombinantnej bunke exprimujúcej ľudskú AILIM.

Obrázok 5 znázorňuje väzbové aktivity rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok k rekombinantnej CHO bunke exprimujúcej ľudskú AILIM alebo CHO bunke divého typu.

Vertikálna os znázorňuje fluorescenčnú intenzitu ako index väzbovej aktivity k rekombinantným bunkám a horizontálna os znázorňuje koncentráciu pridanej protilátky.

Termín „CHO“ v obrázku predstavuje výsledok väzbového testu na CHO bunku divého typu a termín „ľudský“ predstavuje výsledok väzbového testu na rekombinantná CHO bunku exprimujúcu ľudskú AILIM.

Obrázok 6 znázorňuje väzbové aktivity rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok na rekombinantné CHO bunky exprimujúce ľudskú AILIM alebo na CHO bunky divého typu.

Vertikálna os znázorňuje fluorescenčnú intenzitu ako index väzbovej aktivity na rekombinantné bunky a horizontálna os znázorňuje koncentráciu pridanej protilátky.

Termín „CHO“ na obrázku predstavuje výsledok väzbového testu na CHO bunku divého typu a termín „ľudský“ predstavuje výsledok väzbového testu na rekombinantná CHO bunku preexprimujúcu ľudskú AILIM.

Obrázok 7 znázorňuje väzbové aktivity krysích anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok na rekombinantné CHO bunky preexprimujúce AILIM alebo na CHO bunky divého typu.

Vertikálna os znázorňuje fluorescenčnú intenzitu ako index väzbovej aktivity na rekombinantné bunky a horizontálna os znázorňuje koncentráciu pridanej protilátky.

Termín „CHO“ na obrázku predstavuje výsledok väzbového testu na CHO bunku divého typu a termín „myší“ predstavuje výsledok väzbového testu na rekombinantná CHO bunku preexprimujúcu myšiu AILIM.

Obrázok 8 znázorňuje väzbové aktivity rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok alebo ľudskej anti-KLH monoklonálnych protilátok ako negatívnej kontroly na rekombinantná CHO bunku preexprimujúcu myšiu AILIM alebo na CHO bunky divého typu.

Vertikálna os znázorňuje fuorescenčnú intenzitu ako index väzbovej aktivity na rekombinantné bunky a horizontálna os znázorňuje koncentráciu pridanej protilátky.

Termín „CHO“ na obrázku predstavuje výsledok väzbového testu na CHO bunku divého typu a termín „myší“ predstavuje výsledok väzbového testu na rekombinantná CHO bunku preexprimujúcu myšiu AILIM.

Obrázok 9 znázorňuje väzbové aktivity rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok na rekombinantná CHO bunku preexprimujúcu myšiu AILIM alebo CHO bunky divého typu.

Vertikálna os znázorňuje fluorescenčnú intenzitu ako index väzbovej aktivity ku rekombinantným bunkám a horizontálna os znázorňuje koncentráciu pridanej protilátky.

Termín „CHO“ v obrázku znamená výsledok väzbového testu na CHO bunku divého typu a termín „myší“ znamená výsledok väzbového testu na rekombinantnú CHO bunku preexprimujúcu myšiu AILIM.

Obrázok 10 znázorňuje väzbové aktivity rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok ku rekombinantnej CHO bunke preexprimujúcej myšiu AILIM alebo CHO bunke divého typu.

Vertikálna os znázorňuje fluorescenčnú intenzitu ako index väzbovej aktivity ku rekombinantným bunkám a horizontálnu os znázorňuje koncentráciu pridanej protilátky.

Termín „CHO“ v obrázku predstavuje výsledok väzbového testu ku CHO bunke divého typu a termín „myší“ predstavuje výsledok väzbového testu ku rekombinantnej CHO bunke preexprimujúcej myšiu AILIM.

Obrázok 11 znázorňuje väzbové aktivity rôznych myších anti-krysích AILIM monoklonálnych protilátok ku rekombinantnej CHO bunke preexprimujúcej krysiu AILIM alebo CHO bunke divého typu.

Vertikálna os znázorňuje fluorescenčnú intenzitu ako index väzbovej aktivity ku rekombinantným bunkám a horizontálna os znázorňuje koncentráciu pridanej protilátky.

Termín „CHO“ na obrázku znamená výsledok väzbového testu na CHO bunku divého typu a termín „krysia“ znamená výsledok väzbového testu na rekombinantnú CHO bunku preexprimujúcu krysiu AILIM.

Obrázok 12 znázorňuje väzbové aktivity rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok alebo ľudských anti-KLH monoklonálnych protilátok ako negatívnej kontroly ku rekombinantnej CHO bunke preexprimujúcej krysiu AILIM alebo k CHO bunke divého typu.

Vertikálna os znázorňuje fluorescenčnú intenzitu ako index väzbovej aktivity ku rekombinantným bunkám a horizontálna os znázorňuje koncentráciu pridanej protilátky.

Termín „CHO“ na obrázku znamená výsledok väzbového testu na CHO bunku divého typu a termín „krysia“ znamená výsledok väzbového testu na rekombinantnú CHO bunku preexprimujúcu krysiu AILIM.

Obrázok 13 znázorňuje väzbové aktivity rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok ku rekombinantnej CHO bunke preexprimujúcej krysiu AILIM alebo k CHO bunke divého typu.

Vertikálna os znázorňuje fluorescenčnú intenzitu ako index väzbovej aktivity ku rekombinantným bunkám a horizontálna os znázorňuje koncentráciu pridanej protilátky.

Termín „CHO“ na obrázku znamená výsledok väzbového testu na CHO bunku divého typu a termín „krysia“ znamená výsledok väzbového testu na rekombinantnú CHO bunku preexprimujúcu krysiu AILIM.

Obrázok 14 znázorňuje väzbové aktivity rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok ku rekombinantnej CHO bunke preexprimujúcej krysiu AILIM alebo k CHO bunke divého typu.

Vertikálna os znázorňuje fluorescenčnú intenzitu ako index väzbovej aktivity ku rekombinantným bunkám a horizontálna os znázorňuje koncentráciu pridanej protilátky.

Termín „CHO“ na obrázku znamená výsledok väzbového testu na CHO bunku divého typu a termín „krysia“ znamená výsledok väzbového testu na rekombinantnú CHO bunku preexprimujúcu krysiu AILIM.

Obrázok 15 znázorňuje proliferačnú aktivitu T bunky získanej z normálneho zdravého jedinca „donor A“ v teste na aktivitu prenosu kostimulačného signálu prostredníctvom myších anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok, ktorý využíva mikroplatňu prekrytú anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou spoločne s myšou anti-ľudskou AILIM monoklonálnou protilátkou.

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkového začlenenia (³H) tymidínu ako indexu stupňa bunkovej proliferácia a horizontálna os znázorňuje koncentráciu myšej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

Obrázok 16 znázorňuje proliferačnú aktivitu T buniek získaných z normálneho zdravého jedinca „donor A“ v teste na aktivitu prenosu kostimulačného signálu prostredníctvom rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok, ktorý využíva mikroplatňu prekrytú anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou spoločne s ľudskou anti-ľudskou AILIM monoklonálnou protilátkou.

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkového začlenenia (³H) tymidínu ako indexu stupňa bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

Obrázok 17 znázorňuje proliferačnú aktivitu T buniek získaných z normálneho zdravého jedinca „donor B“ v teste na aktivitu prenosu kostimulačného signálu prostredníctvom rôznych myších anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok, ktorý využíva mikroplatňu prekrytú anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou spoločne s myšou anti-ľudskou AILIM monoklonálnou protilátkou.

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkového začlenenia (³H) tymidínu ako indexu stupňa bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu myšej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

V tomto obrázku, termín „JHC1“ predstavuje výsledok testu, v ktorom anti-ľudská CETP monoklonálna protilátka bola použitá ako negatívna kontrola namiesto myšej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

Obrázok 18 znázorňuje proliferačnú aktivitu T buniek získaných z normálneho zdravého jedinca „donor B“ v teste na aktivitu prenosu kostimulačného signálu prostredníctvom rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok s využitím mikroplatne prekrytej anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou spoločne s ľudskou anti-ľudskou AILIM monoklonálnou protilátkou.

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako indexu stupňa bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

V tomto obrázku „atni-KLH“ predstavuje výsledok testu, v ktorom ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka bola použitá ako negatívna kontrola namiesto ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

Obrázok 19 znázorňuje proliferačnú aktivitu T buniek získaných z normálnej zdravej osoby „donor B“ v teste na aktivitu prenosu kostimulačného signálu prostredníctvom rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok s využitím mikroplatne prekrytej anti-ľudskou CD3 mono-klonálnou protilátkou spoločne s ľudskou anti-ľudskou AILIM monoklonálnou protilátkou.

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkového začlenenia (³H) tymidínu ako indexu stupňa bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

V tomto obrázku „anti-KLH“ predstavuje výsledok testu, v ktorom ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka bola používaná ako negatívna kontrola namiesto ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

Obrázok 20 znázorňuje proliferačnú aktivitu T buniek získaných z normálneho zdravého jedinca „donor C“ v teste na aktivitu prenosu kostimulačného signálu prostredníctvom myších anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok s využitím mikroplatne prekytej anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou spoločne s myšou anti-ľudskou AILIM monoklonálnou protilátkou.

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako indexu stupňa bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu myšej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

V tomto obrázku termín „JHC1“ predstavuje výsledok testu, v ktorom anti-ľudská CETP monoklonálna protilátka bola používaná ako negatívna kontrola namiesto myšej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

Obrázok 21 znázorňuje proliferačnú aktivitu T buniek získaných z normálneho zdravého jedinca „donor C“ v teste na aktivitu prenosu kostimulačného signálu prostredníctvom rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok s využitím mikroplatne prekrytej anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou spoločne s ľudskou anti-ľudskou AILIM monoklonálnou protilátkou.

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako indexu stupňa bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

V tomto obrázku „anti-KLH“ predstavuje výsledok testu, v ktorom ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka bola používaná ako negatívna kontrola namiesto ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

Iné označenia sú nasledujúce: „124“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl24. „126“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl26. „127“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl27.

Obrázok 22 znázorňuje proliferačnú aktivitu T buniek získaných z normálneho zdravého jedinca „donor C“ v teste na aktivitu prenosu kostimulačného signálu pomocou rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok s využitím mikroplatne prekrytej anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou spoločne s ľudskou anti-ľudskou AILIM monoklonálnou protilátkou.

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako index stupňa bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

V tomto obrázku „anti-KLH“ znázorňuje výsledok testu, v ktorom ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka bola používaná ako negatívna kontrola namiesto ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

Iné označenia sú ako nasledujúce:

„128“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl28.

„135“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl35.

„136“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl36.

Obrázok 23 znázorňuje proliferačnú aktivitu T buniek získaných z normálneho zdravého jedinca „donor C“ v teste na aktivitu prenosu kostimulačného signálu pomocou rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok s využitím mikroplatne prekrytej s anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou spoločne s ľudskou anti-ľudskou AILIM monoklonálnou protilátkou.

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (3H) tymidínu ako index stupňa bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

V tomto obrázku „anti-KLH“ znázorňuje výsledok testu, v ktorom ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka bola použitá ako negatívna kontrola namiesto ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

Iné označenia sú nasledujúce:

„137“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl37.

„138“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl38.

„139“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl39.

Obrázok 24 znázorňuje proliferačnú aktivitu T buniek získaných z normálneho zdravého jedinca „donor C“ v teste na aktivitu prenosu kostimulačného signálu pomocou rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok s využitím mikroplatne prekrytej anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou spoločne s ľudskou anti-ľudskou AILIM monoklonálnou protilátkou.

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako indexu stupňa bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

V tomto obrázku „anti-KLH“ predstavuje výsledok testu, v ktorom ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka bola použitá ako negatívna kontrola namiesto ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

Iné označenia sú nasledujúce:

„140“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMab 140.

„141“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl41.

Obrázok 25 znázorňuje proliferačnú aktivitu T buniek získaných z normálneho zdravého jedinca „donor D“ v teste na aktivitu prenosu kostimulačného signálu pomocou rôznych myších anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok s využitím mikroplatne prekrytej anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou spoločne s myšou anti-ľudskou AILIM monoklonálnou protilátkou.

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako index stupňa bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu myšej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

V tomto obrázku „JHC1“ znázorňuje výsledok testu, v ktorom antiľudská CETP monoklonálna protilátka bola používaná ako negatívna kontrola namiesto myšej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

Obrázok 26 znázorňuje proliferačnú aktivitu T buniek získaných z normálneho zdravého jedinca „donor D“ v teste na aktivitu prenosu kostimulačného signálu pomocou rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok s využitím mikroplatne prekrytej anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou spoločne s ľudskou anti-ľudskou AILIM monoklonálnou protilátkou.

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako indexu stupňa bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

V tomto obrázku „anti-KLH“ znázorňuje výsledok testu, v ktorom ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka bola používaná ako negatívna kontrola namiesto ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

Iné označenia sú nasledujúce:

„124“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMab 124.

„126“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl26.

„127“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl27.

Obrázok 27 znázorňuje proliferačnú aktivitu T buniek získaných z normálneho zdravého jedinca „donor D“ v teste na aktivitu prenosu kostimulačného signálu pomocou rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok s využitím mikroplatne prekrytej anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou spoločne s ľudskou anti-ľudskou AILIM monoklonálnou protilátkou.

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako indexu stupňa bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu myšej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

V tomto obrázku „anti-KLH“ znázorňuje výsledok testu, v ktorom ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka bola používaná ako negatívna kontrola namiesto ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

Iné označenia sú nasledujúce:

„128“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMab 128.

„135“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl35.

„136“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl36.

Obrázok 28 znázorňuje proliferačnú aktivitu T buniek získaných z normálneho zdravého jedinca „donor D“ v teste na aktivitu prenosu kostimulačného signálu pomocou rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok s využitím mikroplatne prekrytej anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou spoločne s ľudskou anti-ľudskou AILIM monoklonálnou protilátkou.

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako indexu stupňa bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

V tomto obrázku „anti-KLH“ znázorňuje výsledok testu, v ktorom ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka bola používaná ako negatívna kontrola namiesto ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

Iné označenia sú nasledujúce:

„137“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl37.

„138“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMab 139.

„139“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMab 139.

Obrázok 29 znázorňuje proliferačnú aktivitu T buniek získaných z normálneho zdravého jedinca „donor D“ v teste na aktivitu prenosu kostimulačného signálu pomocou rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok s využitím mikroplatne prekrytej anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou spoločne s ľudskou anti-ľudskou AILIM monoklonálnou protilátkou.

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako indexu stupňa bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

V tomto obrázku „anti-KLH“ znázorňuje výsledok testu, v ktorom ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka bola používaná ako negatívna kontrola namiesto ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

Iné označenia sú nasledujúce:

„140“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl40.

„141“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl41.

Obrázok 30 znázorňuje proliferačnú aktivitu T buniek získaných z normálneho zdravého jedinca „donor E“ v teste na aktivitu prenosu kostimulačného signálu pomocou rôznych myších anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok s využitím mikroplatne prekrytej anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou spoločne s myšou anti-ľudskou AILIM monoklonálnou protilátkou.

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako indexu stupňa bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu myšej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

V tomto obrázku „JHC1“ znázorňuje výsledok testu, v ktorom antiľudská CETP monoklonálna protilátka bola používaná ako negatívna kontrola namiesto myšej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

Obrázok 31 znázorňuje proliferačnú aktivitu T buniek získaných z normálneho zdravého jedinca „donor E“ v teste na aktivitu prenosu kostimulačného signálu pomocou rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok s využitím mikroplatne prekrytej anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou spoločne s ľudskou anti-ľudskou AILIM monoklonálnou protilátkou.

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako indexu stupňa bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

V tomto obrázku „anti-KLH“ znázorňuje výsledok testu, v ktorom ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka bola používaná ako negatívna kontrola namiesto ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

Iné označenia sú nasledujúce:

„124“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl24.

„126“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl26.

„127“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl27.

Obrázok 32 znázorňuje proliferačnú aktivitu T buniek získaných z normálneho zdravého jedinca „donor E“ v teste na aktivitu prenosu kostimulačného signálu pomocou rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok s využitím mikroplatne prekrytej anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou spoločne s ľudskou anti-ľudskou AILIM monoklonálnou protilátkou.

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako indexu stupňa bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

V tomto obrázku „anti-KLH“ znázorňuje výsledok testu, v ktorom ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka bola používaná ako negatívna kontrola namiesto ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

Iné označenia sú nasledujúce:

„128“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl28.

„135“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl35.

„136“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl36.

Obrázok 33 znázorňuje proliferačnú aktivitu T buniek získaných z normálneho zdravého jedinca „donor E“ v teste na aktivitu prenosu kostimulačného signálu pomocou rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok s využitím mikroplatne prekrytej anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou spoločne s ľudskou anti-ľudskou AILIM monoklonálnou protilátkou.

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako indexu stupňa bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

V tomto obrázku „anti-KLH“ znázorňuje výsledok testu, v ktorom ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka bola používaná ako negatívna kontrola namiesto ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

Iné označenia sú nasledujúce:

„137“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl37.

„138“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl38.

„139“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl39.

Obrázok 34 znázorňuje proliferačnú aktivitu T buniek získaných z normálneho zdravého jedinca „donor E“ v teste na aktivitu prenosu kostimulačného signálu pomocou rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok s využitím mikroplatne prekrytej anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou spoločne s ľudskou anti-ľudskou AILIM monoklonálnou protilátkou.

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako indexu stupňa bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

V tomto obrázku „anti-KLH“ znázorňuje výsledok testu, v ktorom ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka bola používaná ako negatívna kontrola namiesto ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

Iné označenia sú nasledujúce:

„140“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl40.

„141“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl41.

Obrázok 35 znázorňuje proliferačnú aktivitu T buniek získaných z normálneho zdravého jedinca „donor D“ v teste na aktivitu rôznych myších antiľudských AILIM monoklonálnych protilátok na prenos kostimu26 lačného signálu, ak roztok myšej anti-ľudskej AIL1M monoklonálnej protilátky (v kvapalnej fázy) bol pridaný samotný do mikroplatne prekrytej anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou.

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako indexu stupňa bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu myšej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

V tomto obrázku „JHC1“ znázorňuje výsledok testu, v ktorom antiľudská CETP monoklonálna protilátka bola používaná ako negatívna kontrola namiesto myšej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

Obrázok 36 znázorňuje proliferačnú aktivitu T buniek získaných z normálneho zdravého jedinca „donor D“ v teste na aktivitu rôznych ľudských antiľudských AILIM monoklonálnych protilátok pri prenose kostimulačného signálu, ak roztok ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky (v kvapalnej fáze) bol pridaný samotný do mikroplatne prekrytej anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou.

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako indexu stupňa bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

V tomto obrázku „anti-KLH“ znázorňuje výsledok testu, v ktorom ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka bola používaná ako negatívna kontrola namiesto ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

Iné označenia sú nasledujúce:

„124“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl24.

„125“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl25.

„126“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl26.

Obrázok 37 znázorňuje proliferačnú aktivitu T buniek získaných z normálneho zdravého jedinca „donor D“ v teste na aktivitu rôznych ľudských antiľudských AILIM monoklonálnych protilátok pri prenose kostimulačného signál, ak roztok ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky (v kvapalnej fáze) bol pridaný samotný do mikroplatne prekrytej anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou.

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako indexu stupňa bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

V tomto obrázku „anti-KLH“ znázorňuje výsledok testu, v ktorom ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka bola používaná ako negatívna kontrola namiesto ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

Iné označenia sú nasledujúce:

„128“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl28.

„135“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl35.

„136“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl39.

Obrázok 38 znázorňuje proliferačnú aktivitu T buniek získaných z normálneho zdravého jedinca „donor D“ v teste na aktivitu rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok pri prenose kostimulačného signálu, ak roztok ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky (v kvapalnej fáze) bol pridaný samotný do mikroplatne prekrytej anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou.

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako indexu stupňa bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

V tomto obrázku „anti-KLH“ znázorňuje výsledok testu, v ktorom ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka bola používaná ako negatívna kontrola namiesto ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

Iné označenia sú nasledujúce:

„137“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl37.

„138“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl38.

„139“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl39.

Obrázok 39 znázorňuje proliferačnú aktivitu T buniek získaných z normálneho zdravého jedinca „donor D“ v teste na aktivitu rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok pri prenose kostimulačného signálu, ak roztok ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky (v kvapalnej fáze) bol pridaný samotný do mikroplatne prekrytej anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou.

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako indexu stupňa bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

V tomto obrázku „anti-KLH“ znázorňuje výsledok testu, v ktorom ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka bola používaná ako negatívna kontrola namiesto ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

Iné označenia sú nasledujúce:

„140“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl40.

„141“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl41.

Obrázok 40 znázorňuje množstvo lFN-γ produkovaného v kultivačnom supematante T buniek získaných z normálneho zdravého jedinca „donor B“, ktoré boli kultivované na mikroplatni prekrytej myšou anti-ľudskou AILIM monoklonálnou protilátkou spoločne s anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou.

Vertikálna os znázorňuje koncentráciu IFN-γ a horizontálna os znázorňuje koncentráciu myšej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

V tomto obrázku „JHC1“ znázorňuje výsledok testu, v ktorom anti-ľudská CETP monoklonálna protilátka bola používaná ako negatívna kontrola namiesto myšej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

Obrázok 41 znázorňuje množstvo IFN-γ produkovaného v kultivačnom supematante T buniek získaných z normálneho zdravého jedinca „donor B“, ktoré boli kultivované na mikroplatni prekrytej ľudskou anti-ľudskou AILIM monoklonálnou protilátkou spoločne s anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou.

Vertikálna os znázorňuje koncentráciu IFN-γ a horizontálna os znázorňuje koncentráciu myšej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

V tomto obrázku „anti-KLH“ znázorňuje výsledok testu, v ktorom ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka bola používaná ako negatívna kontrola namiesto ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

Obrázok 42 znázorňuje množstvo IFN-γ produkovaného v kultivačnom supematante T buniek získaných z normálneho zdravého jedinca „donor B“, ktoré boli kultivované na mikroplatni prekrytej ľudskou anti-ľudskou AILIM monoklonálnou protilátkou spoločne s anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou.

Vertikálna os znázorňuje koncentráciu IFN-γ a horizontálna os znázorňuje koncentráciu myšej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

V tomto obrázku „anti-KLH“ znázorňuje výsledok testu, v ktorom ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka bola používaná ako negatívna kontrola namiesto myšej ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

Obrázok 43 znázorňuje množstvo IFN-γ produkovaného v kultivačnom supematante T buniek získaných z normálneho zdravého jedinca „donor C“, ktoré boli kultivované na mikroplatni prekrytej myšou anti-ľudskou AILIM monoklonálnou protilátkou spoločne s anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou.

Vertikálna os znázorňuje koncentráciu IFN-γ a horizontálna os znázorňuje koncentráciu myšej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

V tomto obrázku „JHC1“ znázorňuje výsledok testu, v ktorom anti-ľudská CETP monoklonálna protilátka bola používaná ako negatívna kontrola namiesto myšej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

Obrázok 44 znázorňuje množstvo IFN-γ produkovaného v kultivačnom supematante T buniek získaných z normálneho zdravého jedinca „donor C“, ktoré boli kultivované na mikroplatni prekrytej ľudskou anti-ľudskou AILIM monoklonálnou protilátkou spoločne s anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou.

Vertikálna os znázorňuje koncentráciu IFN-γ a horizontálna os znázorňuje koncentráciu myšej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

V tomto obrázku „anti-KLH“ znázorňuje výsledok testu, v ktorom ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka bola používaná ako negatívna kontrola namiesto ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

Obrázok 45 znázorňuje množstvo IFN-γ produkovaného v kultivačnom supematante T buniek získaných z normálneho zdravého jedinca „donor C“, ktoré boli kultivované na mikroplatni prekrytej ľudskou antiľudskou AILIM monoklonálnou protilátkou spoločne s anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou.

Vertikálna os znázorňuje koncentráciu IFN-γ a horizontálna os znázorňuje koncentráciu myšej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

V tomto obrázku „anti-KLH“ znázorňuje výsledok testu, v ktorom ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka bola používaná ako negatívna kontrola namiesto ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

Iné označenia sú nasledujúce:

„128“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl28.

„135“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl35.

„136“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl36.

Obrázok 46 znázorňuje množstvo IFN-γ produkovaného v kultivačnom supematante T buniek získaných z normálneho zdravého jedinca „donor C“, ktoré boli kultivované na mikroplatni prekrytej ľudskou anti-ľudskou AILIM monoklonálnou protilátkou spoločne s anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou.

Vertikálna os znázorňuje koncentráciu IFN-γ a horizontálna os znázorňuje koncentráciu myšej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

V tomto obrázku „anti-KLH“ znázorňuje výsledok testu, v ktorom ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka bola používaná ako negatívna kontrola namiesto ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

Iné označenia sú nasledujúce:

„137“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl37.

„138“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl38.

„139“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl39.

Obrázok 47 znázorňuje množstvo IFN-γ produkovaného v kultivačnom supematante T buniek získaných z normálneho zdravého jedinca „donor C“, ktoré boli kultivované na mikroplatni prekrytej ľudskou anti-ľudskou AILIM monoklonálnou protilátkou spoločne s anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou.

Vertikálna os znázorňuje koncentráciu IFN-γ a horizontálna os znázorňuje koncentráciu myšej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

V tomto obrázku „anti-KLH“ znázorňuje výsledok testu, v ktorom ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka bola používaná ako negatívna kontrola namiesto ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

Iné označenia sú nasledujúce:

„140“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl40.

„141“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl41.

Obrázok 48 znázorňuje inhibičný účinok na T bunkovú proliferáciu v prípade kultivácie T buniek z normálneho zdravého jedinca „donor A“ s PBMC normálneho zdravého jedinca „donor D“ pomocou rôznych testovacích vzoriek v proliferačnom teste T buniek prostredníctvom zmiešaných lymfocytových reakcií (MLR).

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako index znázorňujúci stupeň bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu testovacích vzoriek.

Opis v obrázkoch znamená nasledujúce.

„CD80+86“: Zmes anti-CD80 protilátky a anti-CD86 protilátky „mlgGl“: Anti-ľudská CD34/IgFc chimerická molekula „CTLA4-Ig“: Ľudská CTLA4-IgFc chimerická molekula „SA12“: Anti-ľudská AILIM myšia monoklonálna protilátka.

Obrázok 49 znázorňuje inhibičný účinok na T bunkovú proliferáciu v prípade kultivácie T buniek z normálneho zdravého jedinca „donor A“ s PbMC normálneho zdravého jedinca „donor D“ pomocou rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok v proliferačnom teste T buniek prostredníctvom zmiešaných lymfocytových reakcií (MLR).

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako index znázorňujúci stupeň bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu testovacích vzoriek.

Iné označenia sú nasledujúce:

„anti-KLH“: ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka ako negatívna kontrola.

JMab-124“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl24.

„126“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl26.

„127“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl27.

„128“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl 28.

„135“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl35.

„136“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl36.

„137“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMab 137.

Obrázok 50 znázorňuje inhibičný účinok na T bunkovú proliferáciu v prípade kultivácie T buniek z normálneho zdravého jedinca „donor A“ s PBMC normálneho zdravého jedinca „donor B“ pomocou rôznych testovacích vzoriek v proliferačnom teste T buniek prostredníctvom zmiešaných lymfocytových reakcií (MLR).

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako index znázorňujúci stupeň bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu testovacích vzoriek.

Opis v obrázkoch znázorňuje nasledujúce:

„CD80+86“: Zmes anti-CD80 protilátky a anti-CD86 protilátky „mlgGl“: Anti-ľudská CD34/IgGl myšia monoklonálna protilátky „CTLA4-Ig“: Ľudská CTLA4-IgFc chimerická molekula „SA12“: Anti-ľudská AILIM myšia monoklonálna protilátka

Obrázok 51 znázorňuje inhibičný účinok na T bunkovú proliferáciu v prípade kultivácie T buniek z normálneho zdravého jedinca „donor D“ s PBMC normálneho zdravého jedinca „donor B“ pomocou rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok v proliferačnom teste T buniek prostredníctvom zmiešaných lymfocytových reakcií (MLR).

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako index znázorňujúci stupeň bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu testovacích vzoriek.

Iné označenia sú nasledujúce:

„anti-KLH“: ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka ako negatívna kontrola.

JMab-124“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl24.

„126“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMab 126.

„127“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl27.

„128“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl28.

„135“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl35.

„136“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl36.

„137“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMab 137.

Obrázok 52 znázorňuje inhibičný účinok na T bunkovú proliferáciu v prípade kultivácie T buniek z normálneho zdravého jedinca „donor C“ s PBMC normálneho zdravého jedinca „donor A“ pomocou rôznych testovacích vzoriek v proliferačnom teste T buniek prostredníctvom zmiešaných lymfocytových reakcií (MLR).

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako index znázorňujúci stupeň bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu testovacích vzoriek.

Opis v obrázkoch predstavujú nasledujúce:

„CD8O+86“: Zmes anti-CD80 protilátky a anti-CD86 protilátky „mlgGl“: Anti-ľudská CD34/IgGl myšia monoklonálna protilátka „CTLA4-Ig“: Ľudská CTLA4-IgFc chimerická molekula „SA12“: Anti-ľudská AILIM myšia monoklonálna protilátka

Obrázok 53 znázorňuje inhibičný účinok na T bunkovú proliferáciu v prípade kultivácie T buniek z normálneho zdravého jedinca „donor C“ s PBMC normálneho zdravého jedinca „donor A“ pomocou rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok v proliferačnom teste T buniek prostredníctvom zmiešaných lymfocytových reakcií (MLR).

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako index znázorňujúci stupeň bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu testovacích vzoriek.

Iné označenia sú nasledujúce:

„anti-KLH“: ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka ako negatívna kontrola.

JMab-124“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl24.

„126“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl26.

„127“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl27.

„128“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl28.

„135“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl35.

„136“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl36.

„137“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl37.

Obrázok 54 znázorňuje inhibičný účinok na T bunkovú proliferáciu v prípade kultivácie T buniek z normálneho zdravého jedinca „donor G“ pomocou rôznych testovacích vzoriek v proliferačnom teste T buniek prostredníctvom zmiešaných lymfocytových reakcií (MLR).

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako index znázorňujúci stupeň bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu testovacích vzoriek.

Opis v obrázkoch predstavuje nasledujúce.

„kontrolná mlgG“: Anti-ľudská CD34/IgGl myšia monoklonálna protilátka „CD80 + 86Ab“: Zmes anti-CD80 protilátky a anti-CD86 protilátky „SA 12“: Anti-ľudská AILIM myšia monoklonálna protilátka „CTLA4-Ig“: Ľudská CTLA4-IgFc chimerická molekula

Obrázok 55 znázorňuje inhibičný účinok na T bunkovú proliferáciu v prípade kultivácie T buniek z normálneho zdravého jedinca „donor C“ s PBMC normálneho zdravého jedinca „donor G“ pomocou rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok v proliferačnom teste T buniek prostredníctvom zmiešaných lymfocytových reakcií (MLR).

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako index znázorňujúci stupeň bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu testovacích vzoriek.

Iné označenia sú nasledujúce:

„anti-KLH“: ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka ako negatívna kontrola.

„JMab-136“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl36.

„138“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl38.

„139“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl39.

„140“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl40.

„141“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl41.

Obrázok 56 znázorňuje inhibičný účinok na T bunkovú proliferáciu v prípade kultivácie T buniek z normálneho zdravého jedinca „donor F“ s PBMC normálneho zdravého jedinca „donor E“ pomocou rôznych testovacích vzoriek v proliferačnom teste T buniek prostredníctvom zmiešaných lymfocytových reakcií (MLR).

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako index znázorňujúci stupeň bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu testovacích vzoriek.

Opis v obrázkoch znázorňuje nasledujúce:

„kontrolná mlgG“: Anti-ľudská CD34/IgGl myšia monoklonálna protilátka „CD80+86Ab“: Zmes anti-CD80 protilátky a anti-CD86 protilátky „SA12“: Anti-ľudská AILIM myšia monoklonálna protilátka „CTLA4-Ig“: Ľudská CTLA4-IgFc chimerická molekula

Obrázok 57 znázorňuje inhibičný účinok na T bunkovú proliferáciu v prípade kultivácie T buniek z normálneho zdravého jedinca „donor F“ s PBMC normálneho zdravého jedinca „donor E“ pomocou rôznych testovacích vzoriek v proliferačnom teste T buniek prostredníctvom zmiešaných lymfocytových reakcií (MLR).

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako index znázorňujúci stupeň bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu testovacích vzoriek.

Iné označenia sú nasledujúce:

„anti-KLH“: ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka ako negatívna kontrola.

„JMab-136“: ľudská anti-ľudská AIL1M monoklonálna protilátka JMab 136.

„138“: ľudská anti-ľudská A1LIM monoklonálna protilátka JMab 138.

„139“: ľudská anti-ľudská A1LIM monoklonálna protilátka JMabl39.

„140“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl40.

„141“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl41.

Obrázok 58 znázorňuje inhibičný účinok na T bunkovú proliferáciu v prípade kultivácie T buniek z normálneho zdravého jedinca „donor G“ s PBMC normálneho zdravého jedinca „donor F“ pomocou rôznych testovacích vzoriek v proliferačnom teste T buniek prostredníctvom zmiešaných lymfocytových reakcií (MLR).

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako index znázorňujúci stupeň bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu testovacích vzoriek.

Iné označenia sú nasledujúce:

„kontrolná mlgG“: Anti-ľudská CD34/IgGl myšia monoklonálna protilátka „CD80+86Ab“: Zmes anti-CD80 protilátky a anti-CD86 protilátky „SA12“: Anti-ľudská AILIM myšia monoklonálna protilátka „CTLA4-Ig“: Ľudská CTLA4-IgFc chimerická molekula

Obrázok 59 znázorňuje inhibičný účinok na T bunkovú proliferáciu v prípade kultivácie T buniek z normálneho zdravého jedinca „donor G“ s PBMC normálneho zdravého jedinca „donor F“ pomocou rôznych testovacích vzoriek v proliferačnom teste T buniek prostredníctvom zmiešaných lymfocytových reakcií (MLR).

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako index znázorňujúci stupeň bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu testovacích vzoriek.

Iné označenia sú nasledujúce:

„anti-KLH“: ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka ako negatívna kontrola.

„JMab-136“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMab 136.

„138“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl38.

„139“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl39.

„141“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl41.

„141“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl41.

Obrázok 60 znázorňuje inhibičný účinok rôznych kontrolných testovacích látok na bunkovú proliferáciu

T buniek v teste využívajúcom zmes lymfocytovej reakcie (MLR). T bunky z normálneho zdravého jedinca „donor A“ boli ko-kultivované s PBMC z normálneho zdravého jedinca „donor D“ kultivovaného v prítomnosti ľudskej CTLA4-Ig chimerickej molekuly.

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako index znázorňujúci stupeň bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentrácie testovacích látok.

Iné označenia sú nasledujúce:

„CD80 + 86“: Zmes anti-CD80 protilátky a anti-CD86 protilátky „SA12“: Anti-ľudská AILIM myšia monoklonálna protilátka „mlgGl“: Anti-ľudská AILIM myšia monoklonálna protilátka

Obrázok 61 znázorňuje inhibičný účinok rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok na bunkovú proliferáciu T buniek v teste využívajúcom zmes lymfocytovej reakcie (MLR). T bunky z normálneho zdravého jedinca „donor A“ boli ko-kultivované s PBMC z normálneho zdravého jedinca „donor D“ kultivovaného v prítomnosti ľudskej CTLA4-Ig chimerickej molekuly.

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako index znázorňujúci stupeň bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentrácie testovacích látok.

Iné označenia sú nasledujúce:

„anti-KLH“: ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka ako negatívna kontrola.

„JMab-124“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMab 124.

„83“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMab 139.

„127“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl27.

„128“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl28.

„135“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl35 „136“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl36.

„137“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMab 137.

Obrázok 62 znázorňuje inhibičný účinok rôznych kontrolných testovacích látok na bunkovú proliferáciu

T buniek v teste využívajúcom zmes lymfocytovej reakcie (MLR). T bunky z normálneho zdravého jedinca „donor D“ boli ko-kultivované s PBMC z normálneho zdravého jedinca „donor B“ kultivovaného v prítomnosti ľudskej CTLA4-Ig chimerickej molekuly.

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako index znázorňujúci stupeň bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentrácie testovacích látok.

Iné označenia sú nasledujúce:

„CD80+86“: Zmes anti-CD80 protilátky a anti-CD86 protilátky „SA12“: Anti-ľudská AILIM myšia monoklonálna protilátka „mlgGl“: Anti-ľudská CD34/IgGl myšia monoklonálna protilátka.

Obrázok 63 znázorňuje inhibičný účinok rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok na bunkovú proliferáciu T buniek v teste využívajúcom zmes lymfocytovej reakcie (MLR). T bunky z normálneho zdravého jedinca „donor D“ boli ko-kultivované s PBMC z normálneho zdravého jedinca „donor B“ kultivovaného v prítomnosti ľudskej CTLA4-Ig chimerickej molekuly.

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako index znázorňujúci stupeň bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentrácie testovacích látok.

Iné označenia sú nasledujúce:

„anti-KLH“: ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka ako negatívna kontrola.

„JMab-124“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl24.

„126“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl26.

„127“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl27.

„128“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl28.

„135“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl35 „136“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl36.

„137“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl37.

Obrázok 64 znázorňuje inhibičný účinok rôznych kontrolných testovacích látok na bunkovú proliferáciu

T buniek v teste využívajúcom zmes lymfocytovej reakcie (MLR). T bunky z normálneho zdravého jedinca „donor C“ boli kokultivované s PBMC z normálneho zdravého jedinca „donor A“ kultivovaného v prítomnosti ľudskej CTLA4-Ig chimerickej molekuly.

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako index znázorňujúci stupeň bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentrácie testovacích látok.

Iné označenia sú nasledujúce:

„CD80 + 86“: Zmes anti-CD80 protilátky a anti-CD86 protilátky „SA12“: Anti-ľudská AILIM myšia monoklonálna protilátka „mlgGl“: Anti-ľudská CD34/lgGl myšia monoklonálna protilátka

Obrázok 65 znázorňuje inhibičný účinok rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok na bunkovú proliferáciu T buniek v teste využívajúcom zmes lymfocytovej reakcie (MLR). T bunky z normálneho zdravého jedinca „donor C“ boli ko-kultivované s PBMC z normálneho zdravého jedinca „donor A“ ultivovaného v prítomnosti ľudskej CTLA4-Ig chimerickej molekuly.

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako index znázorňujúci stupeň bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentrácie testovacích látok.

Iné označenia sú nasledujúce:

„anti-KLH“: ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka ako negatívna kontrola.

„JMab-124“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl24.

„126“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl26.

„127“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl27.

„128“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl28.

„135“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl35 „136“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl36.

„137“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl37.

Obrázok 66 znázorňuje inhibičný účinok rôznych kontrolných testovacích látok na bunkovú proliferáciu

T buniek v teste využívajúcom zmes lymfocytovej reakcie (MLR). T bunky z normálneho zdravého jedinca „donor E“ boli ko-kultivované s PBMC z normálneho zdravého jedinca „donor G“ kultivovaného v prítomnosti ľudskej CTLA4-Ig chimerickej molekuly.

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako index znázorňujúci stupeň bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu testovacích vzoriek.

Iné označenia sú nasledujúce:

„kontrolná mlgG“: Anti-ľudská CD34/IgGl myšia monoklonálna protilátka.

„CD80+86“: Zmes anti-CD80 protilátky a anti-CD86 protilátky „SA 12“: Anti-ľudská AILIM myšia monoklonálna protilátka.

Obrázok 67 znázorňuje inhibičný účinok rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok na bunkovú proliferáciu T buniek v teste využívajúcom zmes lymfocytovej reakcie (MLR). T bunky z normálneho zdravého jedinca „donor E“ boli ko-kultivované s PBMC z normálneho zdravého jedinca „donor G“ kultivovaného v prítomnosti ľudskej CTLA4-Ig chimerickej molekuly.

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako index znázorňujúci stupeň bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentrácie testovacích látok.

Iné označenia sú nasledujúce:

„anti-KLH“: ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka ako negatívna kontrola, „JMab-136“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl36.

„138“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl38.

„139“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMab 139.

„140“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMab 140.

„141“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl41.

Obrázok 68 znázorňuje inhibičný účinok rôznych kontrolných testovacích látok na bunkovú proliferáciu T buniek v teste využívajúcom zmes lymfocytovej reakcie (MLR). T bunky z normálneho zdravého jedinca „donor G“ boli ko-kultivované s PBMC z normálneho zdravého jedinca „donor F“ kultivovaného v prítomnosti ľudskej CTLA4-Ig chimerickej molekuly.

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako index znázorňujúci stupeň bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentrácie testovacích látok.

Opis v obrázkoch predstavuje nasledujúce.

„kontrolná mlgG“: Anti-ľudská CD34/IgG 1 myšia monoklonálna protilátka.

„CD80 + 86Ab“: Zmes anti-CD80 protilátky a anti-CD86 protilátky „SA12“: Anti-ľudská AILIM myšia monoklonálna protilátka

Obrázok 69 znázorňuje inhibičný účinok rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok na proliferáciu T buniek v teste využívajúcom zmes lymfocytovej reakcie (MLR). T bunky z normálneho zdravého jedinca „donor G“ boli ko-kultivované s PBMC z normálneho zdravého jedinca „donor F“ kultivovaného v prítomnosti ľudskej CTLA4-Ig chimerickej molekuly.

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako index znázorňujúci stupeň bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentrácie testovacích látok.

Iné označenia sú nasledujúce:

„anti-KLH“: ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka ako negatívna kontrola.

„JMab-136“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl36.

„138“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl38.

„139“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMab 139.

„140“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMab 140.

„141“: ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMabl41.

Obrázok 70 znázorňuje ADCC-indukujúci účinok rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok a kontrolnej protilátky, pričom CHO bunky divého typu boli použité ako cieľové bunky.

Vertikálna os znázorňuje rýchlosť cytotoxicity spôsobenej ADCC-indukujúcim účinkom protilátky a horizontálna os znázorňuje koncentráciu protilátky.

Obrázok 71 znázorňuje ADCC-indukujúci účinok rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok a kontrolnej protilátky, pričom ľudské AILIM-preexprimujúce rekombinantné CHO bunky divého typu boli použité ako cieľové bunky.

Vertikálna os znázorňuje frekvenciu bunkového poškodenia spôsobeného ADCC-indukujúcim účinkom protilátky a horizontálna os znázorňuje koncentráciu protilátky.

Obrázok 72 znázorňuje inhibičný účinok anti-AILIM protilátky na oneskorenú alergiu.

Vertikálna os znázorňuje veľkosť začervenania meranú ako index začiatku oneskorenej alergie a horizontálna os znázorňuje typ testovanej vzorky podávanej živočíšnym subjektom.

Obrázok 73 znázorňuje proliferačnú aktivitu opičích T buniek v teste na určenie aktivity rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok na prenos kostimulačného signálu s využitím mikroplatne prekrytej ľudskou anti-ľudskou AILIM monoklonálnou protilátkou spoločne s anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou.

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako index znázorňujúci stupeň bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

V tomto obrázku „anti-KLH“ predstavuje výsledok testu, v ktorom ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka bola používaná ako negatívna kontrola namiesto ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

Obrázok 74 znázorňuje inhibičný účinok negatívnej kontrolnej protilátky proti väzbe medzi rozpustnými AILIM ligandmi (hB7h-IgFc) a rozpustnou AILIM (AILIM-IgFc) rôznych koncentrácií.

Vertikálna os znázorňuje absorbanciu ako index pre inhibičný účinok a horizontálna os znázorňuje koncentráciu rozpustnej AILIM.

Obrázok 75 znázorňuje inhibičný účinok anti AILIM protilátky proti väzbe medzi rozpustnými AILIM ligandmi (hB7h-IgFc) a rozpustnou AILIM (AILIM-IgFc) rôznych koncentrácií.

Vertikálna os znázorňuje absorbanciu ako index pre inhibičný účinok a horizontálna os znázorňuje koncentráciu rozpustnej AILIM.

Obrázok 76 znázorňuje inhibičný účinok anti AILIM protilátky v rôznych koncentráciách proti väzbe medzi rozpustnými AILIM ligandmi (hB7h-IgFc) a rozpustnou AILIM (AILIM-IgFc).

Vertikálna os znázorňuje absorbanciu ako index pre inhibičný účinok a horizontálna os znázorňuje koncentráciu rozpustnej AILIM.

Obrázok 77 znázorňuje inhibičný účinok rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok na proliferáciu ľudských T buniek v teste na určenie aktivity prenosu kostimulačného signálu s využitím mikroplatne prekrytej rozpustným AILIM ligandom (hB7h-IgFc) spoločne s anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou.

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako index znázorňujúci stupeň bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

Obrázok 78 znázorňuje inhibičný účinok rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok na proliferáciu opičích T buniek v teste na určenie aktivity prenosu kostimulačného signálu s využitím mikroplatne prekrytej rozpustným ľudským AILIM ligandom (hB7b-IgFc) spoločne s anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou.

Vertikálna os znázorňuje množstvo bunkovo začleneného (³H) tymidínu ako index znázorňujúci stupeň bunkovej proliferácie a horizontálna os znázorňuje koncentráciu protilátky.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Predkladaný vynález je detailnejšie opísaný pomocou uvedených príkladov uskutočnenia, ktoré však nie sú chápané ako obmedzujúce.

Príklad 1

Príprava imunogénu (1-1) Príprava rekombinantnej bunky exprimujúcei ľudskú AILIM

Dva typy rekombinantných buniek (CHO bunka a HPB-ALL bunka) pre-exprimujúce ľudskú AILIM boli pripravené podľa metódy, ako je opísaná v skorších prihláškach (JP-A č. Hei 11-29599 a W098/38216) a tiež v článku (Int. Immunology, Vol. 12, č. 1, str. 51-55, 2000) od jedného z pôvodcov pánaTezuka.

Konkrétne je metóda charakterizovaná v nasledujúcom texte.

cDNA (GenBank úložné číslo: AB023135 (cDNA); BAA82129 (aminokyselina)) obsahujúca ORF kompletnej dĺžky, ktorý kóduje ľudskú AILIM, bola vložená do vektora pEF-neo. Potom výsledný rekombinantný vektor expresie bol zavedený do buniek vaječníka čínskeho škrečka (CHO bunka) a buniek ľudskej tymómovej línie, HPB-ALL v súlade s bežne používanou metódou využívajúcou elektroporáciu (960 pF, 320V) s Génovým pulzarom (Gene Pulser - BioRad). Vhodné bunky sa kultivovali v RPMI1640 médiu obsahujúcom Geneticín (0,8 mg/ml; Gibco BRL) a 10 % ECS na výber transformovaných buniek odolných proti liečivu.

(1-2) Selekcia rekombinantných HPB-ALL buniek pre-exprimujúcich ľudskú AILIM

Kultúra HPB-ALL buniek odolných proti liečivu získaná v (1-1) bola centrifugovaná na účely získania bunkových peletov. Myšia anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka konkrétne „SA12“ (myšia anti-ľudská JTT-1 antigénová monoklonálna protilátka), ktorá bola diskutovaná v predchádzajúcej prihláške (JP-A 11-29599 (príklad 12) a W098/38216 (príklad 12) pôvodcami, sa pridala do bunkového peletu (koncentrácia: roztok protilátky (10 pg/ml) zriedený s EDTA-BSA/PBS bol pridaný v pomere 100 pl/10⁵ buniek). Výsledné zmesi sa inkubovali pri 4 °C počas 30 minút. Bunky sa premyli dvakrát so spomínaným EDTA-BSA/PBS (200 pl) a po sa pridal streptavidín označený fýkoerytrínom (SA-PE; 100 pl 500-násobne zriedeného roztoku). Výsledné zmesi sa inkubovali pri 4 °C počas 30 minút. Po inkubácii sa bunky premyli 3-krát s EDTA-BSA/PBS a pripravili sa bunkové suspenzie.

Stupne expresie ľudskej AILIM vhodných buniek v bunkových suspenziách sa analyzovali pomocou prietokového cytometra, FACSort (Beckton-Dichinson) na účely výberu rekombinantných HPB-ALL buniek pre-exprimujúcich ľudskú AILIM. Vybrané bunky sa kultivovali na účely spojenia v RMPI1640 médiu obsahujúcom 10 % FCS a G418 (1 mg/ml).

(1-3) Výber rekombinantných CHO buniek pre-exprimujúcich ľudskú AILIM

Kultúra CHO buniek odolných proti liečivu vybraných v (1-1) sa centrifugovala na získanie bunkových peletov. Spomínaná myšia anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka SA 12, ktorá bola označená s FITC, sa pridala do každej bunkovej pelety (roztok protilátky (100 pg/ml) zriedený s EDTA- BSA/PBS). Výsledné zmesi sa inkubovali pri 4 °C 30 minút. Bunky sa premyli s uvedeným EDTA-BSA/PBS a potom sa pripravili bunkové suspenzie pridaním EDTA-BSA/PBS (500 μΐ) ku bunkovým peletom.

Stupne expresie ľudskej AILIM vhodných buniek v bunkových suspenziách sa analyzovali pomocou prietokového cytometra, FACSort (Beckton-Dichinson) na účely výberu rekombinantných HPB-ALL buniek pre-exprimujúcich ľudskú AILIM. Vybrané bunky sa kultivovali na účely spojenia v RPMI1640 médiu obsahujúcom 10 % FCS a G418 (1 mg/ml).

(1-4) Príprava imunogénu z HPB-ALL buniek pre-exprimujúcich ľudskú AILIM

HPB-ALL bunky pre-exprimujúce ľudskú AILIM, ktoré boli získané v (1 - 2, sa centrifugovali. Získaná bunková peleta sa premyla 4-krát s fosfátovým pufrom (PBS; Nikken Seibutsu) a potom sa resuspendovala v pufri obsahujúcom inhibítor proteázy (obsahujúcom 25 mM HEPES (pH 7,4), 10 mM MgCl₂, 0,25M sacharóza a proteázový inhibítor (10 U/ml Aprotinín, 2 pg/ml Pepstatín, 50 pg/ml Leupeptín a 0,35 mg/ml PMSF)). Bunková suspenzia sa spracovala v homogenizére Potter-typu a centrifugovala sa pri nízkej rýchlosti (pri 1500 rpm pri 4 °C počas 10 minút). Následne, výsledný supematant sa podrobil ultracentrifugácii (pri 100 000 g pri 4 °C jednu hodinu). Získala sa precipitovaná membránová frakcia a suspendovala sa vo fosfátovom pufri (koncentrácia membránovej frakcie bola upravená tak, že 1 ml PBS obsahuje membránovú frakciu získanú z 1 x 10⁷ buniek). Suspenzia sa uskladnila pri -80 °C. Suspenzia obsahujúca frakciu bunkovej membrány sa použila ako antigén (imunogén) na prípravu ľudskej protilátky podľa vynálezu, ktorá bude opísaná neskôr.

(1-5) Príprava imunogénu z CHO buniek pre-exprimujúcich ľudskú AILIM

CHO bunky pre-exprimujúce ľudskú AILIM, ktorá bola získaná v (1-3), sa dispergovali a centrifugovali.

Získaná bunková peleta sa premyla 4-krát fosfátovým pufrom (PBS; Nikken Seibutsu) a potom sa resuspendovala v pufri obsahujúcom proteázový inhibítor (obsahujúcom 25 mM HEPES (pH 7,4), 10 mM MgCl₂, 0,25M sacharózy a proteázový inhibítor (lOU/ml Aprotinín, 2 pg/ml Pepstatín, 50 pg/ml Leupeptín a 0,35 mg/ml PMSF)). Bunková suspenzia sa spracovala v Potter-type homogenizére a centrifugovala sa pri nízkej rýchlosti (pri 1500 rpm pri 4 °C počas 10 minút). Následne sa výsledný supematant podrobil ultracentrifugácii (pri 100 000 g pri 4 °C počas jednej hodiny). Precipitované membránové frakcie boli preliečené a suspendované vo fosfátovom pufri (koncentrácia membránovej frakcie bola upravená tak, že 1 ml PBS obsahoval membránovú frakciu získanú z 1 x 10⁷ buniek). Suspenzia sa skladovala pri -80 °C. Suspenzia obsahujúca frakciu bunkovej membrány sa používala ako antigén (imunogén) na účely prípravy ľudskej protilátky podľa vynálezu, ako bude opísané.

Príklad 2

Príprava hybridómu produkujúceho ľudskú anti-ľudskú AILIM monoklonálnu protilátku

V predkladanom príklade sa príprava monoklonálnej protilátky uskutočnila podľa typickej metódy, ako je opísané v „Experimental Medicíne (dodatok), Handbook for Celí Technology“ (vyd., T. Kuroki a kol., Yodosha, str. 66-74, 1992) a „Experimental Manual for Monoclonal Antibody“ (T. Ando a kol., Kodansha, 1991).

Frakcia bunkovej membrány pripravená z rekombinantných buniek pre-exprimujúcich ľudskú AILIM získaná v príklade 1 sa použila ako imunogén ľudskej AILIM.

Živočíšne subjekty na imunizáciu boli transgénové myši produkujúce ľudské protilátky vytvorené opísanou metódou (Náture Genetics, Vol. 7, str. 13-21, 1994; Náture Genetics, Vol. 15, str. 146-156, 1997; publikovaný japonský preklad medzinárodnej prihlášky č. Hei 4-504365; publikovaný japonský preklad medzinárodnej prihlášky č. Hei 7-509137; Nikkei Science, jún, str. 40-50, 1995; atď.).

Na bunkovú kultiváciu boli použité mnohojamkové mikroplatne.

(2-1) Imunizácia a príprava hybridómu

Ktorýkoľvek z imunogénov (100 μΐ/myš/podávanie) pripravených v (1-4) (získaných z HPB-ALL) a v (1-5) (získaných z CHO) boli podávané uvedeným transgénovým myšiam produkujúcim protilátku. Imunogén bol injektovaný spoločne s Freundovou prísadou (ICN/CAPPEL) do labky ako prvotná imunizácia (deň 0).

Po primárnej imunizácii bol akýkoľvek z imunogénov prídavné injektovaný do labky v jednotýždňovom intervale ako sekundárna a/alebo terciáma imunizácia. Tým istým spôsobom bola injekcia realizovaná na finálnu imunizáciu dva dni pred prípravou lymfocytov, ktorá je opísaná.

Dva dni po finálnej imunizácii sa lymfocyty pripravili z (subinguinálnych a subgenuálnych) lymfatických uzlín a sleziny vhodnej transgénovej myši pripravenej na imunizáciu. Lymfocyty a myšie myelómové bunky P3/X63/AG8.653 (ATCC č. CRL-1580) boli zmiešané v pomere 5:1a pridal sa polyetylén glykol 1500 (Boehringer Mannheim) ako fúzne činidlo. Potom sa zmes zriedila 10 objemovými jednotkami bazálneho média EX-CELL301 (JRH Bioscience) bez séra.

Následne sa zmiešané bunky premyli bazálnym médiom a potom sa suspendovali v HAT médiu (11 bazálneho média obsahujúceho 13,61 mg hypoxantínu, 176 pg aminopterínu a 3,88 mg tymidínu). Bunky sa premiestnili do 96 jamkových mikroplatní a kultivovali sa 10 - 14 dní na účely bunkovej fúzie. Bunkovou fúziou sa získali viaceré hybridómy.

(2-2) Skrinink ľudskej monoklonálnej protilátky produkovanej hybridómom

Hybridómy pripravené v (2-1) boli skrinované pomocou bunkovej ELISA, ako je opísané na účely výberu hybridómov produkujúcich ľudskú monoklonálnu protilátku proti ľudskej AILIM.

Vhodné rekombinantné HPB-ALL bunky a rekombinantné CHO bunky pre-exprimujúce ľudskú AILIM, ktoré boli opísané, sa umiestnili do každej jamky ELISA 96 jamkových mikroplatní (1 x 10⁵ bunka/jamka). Inkubácia bola realizovaná pri 37 °C dva dni.

Následne bol supematant vybraný z každej jamky a pridali sa vzorky supematantu každej hybridómovej kultúry (50 pl/jamku) a zmes sa inkubovala jednu hodinu. Potom prebehla reakcia, zmiešaná vzorka sa odložila a každá jamka sa premyla trikrát PBS obsahujúcim 1 % BSA (Sigma).

Následne sa pridala kozia anti-ľudská imunoglobulínová (Fc) protilátka (50 μί 2000-násobne zriedená na jamku; Ameircan Corex; 1 % BSA/PBS) konjugovaná peroxidázou do každej jamky na účely určenia ťažkého reťazca ľudského imunoglobulínu (ľudská monoklonálna protilátka) v hybridómovom supematante. Zmes sa inkubovala pri izbovej teplote jednu hodinu.

Na druhej strane peroxidázou konjugovaný kozí anti-ľudský κ reťazec imunoglobulínovej protilátky (50 μί 2000-krát zriedeného na jamku) sa pridal do každej jamky na účely určenia ľahkého reťazca ľudského imunoglobulínu (ľudská monoklonálna protilátka) v hybridómovom supematante. Zmes sa inkubovala pri izbovej teplote počas 15 minút.

Anti-ľudská IgFc protilátka alebo anti-ľudská IgK protilátka boli odstránené z každej jamky mikroplatnía potom sa platne premyli trikrát s PBS obsahujúcim 1 % BSA. Tetrametylbenzidín (3,3',5,5'-tetrametylbenzidín (TMB), 100 μί/jamku, BIO-RAD) sa pridal do každej jamky a výsledná zmes sa inkubovala pri izbovej teplote počas 15 minút.

Následne sa do každej jamky pridala IN kyselina sírová (50 μί/jamku) na účely ochladenia reakcie. Reakcia sa monitorovala na absorbancii pri vlnovej dĺžke 450 nm pomocou mikroplatňového čítača (Model 3550 Mikroplatňový čítač, BIO-RAD).

Kontrolný ELISA experiment sa vykonával tým istým spôsobom,ako je opísané skôr podľa nasledujúcich bodov:

(1) HPB-ALL bunky divého typu namiesto ľudskej AILIM exprimujúcej rekombinantné HPB-ALL bunky;

(2) CHO bunky divého typu namiesto ľudskej AILIM exprimujúcej rekombinantné CHO bunky;

(3) Myšie monoklonálne protilátky proti ľudskej AILIM (SA12 alebo SG430; JP-A11-29599 (príklad 12) a W098/38216 (príklad 12)) namiesto hybridómového supematantu;

(4) Ľudská monoklonálna protilátka proti KLH (keyhole limpet hemocyanin, PIERCE) namiesto hybridómoveho supematantu.

Ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka bola pripravená tým istým spôsobom,ako je to opísané v (2-1), pomocou imunizácie ľudskej protilátky produkovanej transgénovou myšou s KLH (keyhole limpet hemocyani, PIERCE).

Rôzne hybridómy produkujúce ľudskú monoklonálnu protilátku schopnú väzby na ľudskú AILIM boli vybrané pomocou uvedeného skrininku.

(2-3) Primáme klonovanie hybridómu

Rôzne typy hybridómových monoklonov boli získané z rôznych hybridómov (rodičovské bunkové línie), ktoré boli vybrané v (2-2) produkujúcich ľudské monoklonálne protilátky proti ľudskej AILIM pomocou nasledujúceho testového postupu.

Vhodné hybridómy vybrané v (2-2) opísané skôr boli umiestnené v 24 jamkových mikroplatniach. Počet buniek hybridómu v každej jamke bol určený pomocou pipety. Následne sa pridalo 10 % teľacieho séra (FCS; Trace Bioscience PTY), 1 % penicilín/streptomycín (Sigma), 1 % HT doplnku (Gibco BRL) a 2,5 % T-STIM kultivačného doplnku (Collaborative Biomedical Products) do EX-CELL301 média (JRH Bioscience) obsahujúceho 4,0 mM L-glutamínu a lipidu. Výsledné modifikované médium bolo používané na riedenie hybridómov na 1 x 10⁴ buniek/ml a bunky sa suspendovali v každej jamke.

Bunková suspenzia (300 μί alebo 600 μί) každej jamky sa spojila a miešala s modifikovaným médiom (150 ml alebo 300 ml) a potom sa pridal 200 μί alikvót bunkovej suspenzie do každej jamky mnohonásobných 96 jamkových mikroplatnítak, že každá jamka obsahovala 4 bunky hybridómu. Spomínané modifikované médium (50 ml alebo 100 ml) sa nanovo pridalo do zostávajúcej bunkovej suspenzie, ktorá bola miešaná a potom výsledná bunková suspenzia sa pridala do každej jamky inej čerstvo pripravenej mnohonásobnej 96 jamkovej mikroplatne tak, že každá jamka obsahovala dve bunky hybridómu.

Kultivácia pokračovala 1 až 2 týždne. Po kultivácii sa jednotlivé kolóny získané z jednotlivej hybridómy našli vo viacerých jamkách.

Pomocou bunkového ELISA testu, ako bolo uvedené skôr v (2-2), sa overilo, že ľudská monoklonálna protilátka proti ľudskej AILIM bola produkovaná v kultivačnom supematante v každej jamke obsahujúcej kolónie.

(2-4) Sekundárne klonovanie hybridómu

Subklonovanie (sekundárne klonovanie) každého klonu z rôznych hybridómových klonov získaných v (2-3) sa vykonávalo podľa tej istej metódy, ako je opísaná v (2-3).

Bunková hustota každej jamky v 96 jamkovej mikroplatni bola upravená na 1 bunku/jamku v predkladanom experimente.

Skrinink priniesol viaceré hybridómové monoklony produkujúce ľudskú monoklonálnu protilátku proti ľudskej AILIM. Časť klonov zahrnovala:

(Meno klonu)

AIF34 (JMab 124), AIF182 (JMab-126), AIF348 (JMab-127), AIF620 (JMab-128), AIF1052 (JMab-135), AIH5D3 (JMab-136), AIH386 (JMab-137), AII289 (JMab-138), AII394 (JMab-139), AII488 (JMab-140), AIJ40 (JMab-141)

Mená uvedené skôr sú používané v predkladanej prihláške vynálezu, konkrétne vo všetkých príkladoch opisovaných neskôr, zahrnujúcich predkladané príklady a obrázky a tabuľky obsahujúce výsledky testov získané v týchto príkladoch.

Príklad 3

Analýza vlastností monoklonálnej protilátky (3-1) Analýzy ťažkého reťazca a ľahkého reťazca

Použitím ELISA testu a opísaného prietokového cytometra sa potvrdilo, že monoklonálna protilátka proti ľudskej AILIM produkovanej pomocou každého hybridómového klonu, ktorý bol klonovaný v (2-4), bola naozaj ľudská monoklonálna protilátka.

Rekombinantná HPB-ALL bunky pre-exprimujúce ľudskú AILIM, ktorá bola pripravená v príklade 1, boli vložené do každej jamky v tvare v mikroplatni (3 x 10⁴ bunka/jamka).Bunky boli kultivované pri 37 °C v RPMI1640 médiu obsahujúcom 10 % FCS.

Potom sa kultúra kompletovala, platňa sa centrifugovala (pri 1800 rpm počas 2 minút) na účely precipitácie buniek a potom sa výsledný supematant odložil. Následne, vzorka (50 μΐ/jamku) z kultúry každého hybridómu klonovaného v (2-4) alebo myšia anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka SA12 (2 pg/50 μΐ) alebo alternatívne ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka (50 μΐ/jamku) ako kontrolná protilátka sa pridali do každej jamky. Zmes sa ponechala reagovať 30 minút v chladničke. Po reakcii sa roztok vzorky odložil a každá jamka sa premyla fosfátovým pufrom (0,5 % BSA-PBS obsahujúci 5 mM EDTA).

Následné sa pridala akákoľvek zo sekundárnych protilátok do každej jamky (zriedená 1000-krát s uvedeným fosfátovým pufrom a pridaná v množstve 50 μΐ/jamku) na účely suspendovania buniek. Suspenzia reagovala 30 minút v chladničke.

(Sekundárna protilátka)

Biotínom označená anti-ľudská IgG protilátka (Zymed)

Biotínom označená anti-ľudská IgG protilátka (Protos)

Biotínom označená anti-ľudská IgK protilátka (Vector)

Po reakcii sa sekundárna protilátka odložila a každá jamka platne sa premyla uvedeným fosfátovým pufrom. Následne, streptavidín označený fykoerytrínom (Streptavidín-PE; Pharmingen; zriedený 500-krát s uvedeným fosfátovým pufrom a pridaný v množstve 50 μΐ/jamku) sa pridal do každej jamky. Zmes reagovala 30 minút v chladničke. Po reakcii, každá jamka sa premyla spomínaným fosfátovým pufrom. Potom sa uvedený fosfátový pufor pridal do každej jamky (200 μΐ/jamku) na účely suspendovania buniek.

Analýza bola vykonávaná na určenie reaktivity anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky v kultivačnom supematante každého hybridómového klonu na HPB-ALL bunky pre-exprimujúce ľudskú AILIM v každej jamke.

Kontrolný test sa vykonával tým istým spôsobom, ako bolo opísané podľa nasledujúcich bodov:

(1) HPB-ALL bunky divého typu namiesto ľudskej AILIM exprimujúcej rekombinantné HPB-ALL bunky;

(2) ľudská monoklonálna protilátka proti KLH (keyhole limpet hemocyanín, PIERCE) namiesto hybridómového supematantu.

Ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka sa pripravila podľa toho istého spôsobu, ako je uvedený skôr v (2-1) pomocou imunizácie ľudskej protilátky produkovanej transgénovou myšou s K.LH (keyhole limpet hemokyanín, PIERCE).

Na základe výsledku boli všetky hybridómové klony opísané v (2-4) overené, že sú ľudské monoklonálne protilátky obsahujúce ťažký reťazec získaný z človeka a κ ľahký reťazec získaný z človeka.

Príklad výsledku je znázornený na obrázku 1, ktorý zahrnuje výsledok testu pre hybridómové klony AIH5D3 (JMab-136), AII289 (JMab-138) a AII394 (JMab-139).

(3-2) Izotypovanie ľudskej monoklonálnej protilátky

Izotyp sa určil pre každú ľudskú anti-ľudskú AILIM monoklonálnu protilátku produkovanú pomocou hybridómov, ktoré boli klonované v (2-4) a analyzované v (3-1). Determinácia sa vykonávala použitím ľudskej monoklonálnej protilátky - Izotypovací Kit (American Qualex) v súlade s experimentálnym protokolom pripojeným ku kitu.

Všetky ľudské anti-ľudské AILIM monoklonálne protilátky boli určené ako IgG2/K.

Príklad 4

Príprava ľudskej monoklonálnej protilátky proti ľudskej AILIM (ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka) vo veľkom rozsahu a jej čistenie (4-1) Metóda 1

Bunky každého hybridómového klonu produkujúce ľudskú anti-ľudskú AILIM monoklonálnu protilátku, ktoré boli pripravené v (2-4), sa pridali do fľaše s tkaninovou kultúrou (50 ml, FALCON) a kultivovali sa v ASF104 médiu (Ajinomoto) obsahujúcom 10 % ultra nízke hovädzie IgG FBS (GIBCO-BRL) na účely spojenia pod atmosférou 5 % CO₂ pri 37 °C.

Následne, celá kultivačná kvapalina sa preniesla do fľaše s tkanivovou kultúrou (750 ml, FALCON) a bunky sa kultivovali v ASF104 médiu (Ajinomoto) obsahujúcom 10 % ultra nízke hovädzie IgG FBS (GIBCO-BRL) na účelom spojenia pod atmosférou 5 % CO₂ pri 37 °C.

až 20 dní po kultivácií sa kultivačný supematant každého hybridómu prevrstvil a preniesol do 50 ml polypropylénovej kónickej skúmavky (FALCON). Skúmavka sa centrifugovala pod 500 xg počas 5 minút.

Následne, výsledný centrifugálny supematant sa prefíltroval cez sterilizovanú filtračnú jednotku (NALGEN) a filtrát sa regeneroval.

Filtrát sa vložil do HiTrap Proteínovej G kolóny (HiTrap afinitná kolóna Proteín G; Amersham Pharmacia) ekvilibrovanej fosfátovým pufrom (30 ml) pri nízkej rýchlosti 3 ml/min.

Následne sa kolóna premyla fosfátovým pufrom (20 ml) a potom sa protilátka nášho záujmu eluovala pomocou vloženého 100 mM citrátového pufra (ph2,0) na kolónu pri nízkej rýchlosti asi 1 ml/min. Eluovaný roztok sa neutralizoval roztokom (ph 9,0) 750 mM Tris-HCL a potom sa filtroval cez filter (Millipore) na účely odstránenia bieleho precipitátu. Výsledný filtrát sa dialyzoval proti fosfátovému pufru (cez noc) a filtroval cez filter (Millipore). Teda prečistená anti-AILIM ľudská monoklonálna protilátka sa získala z každej hybridómovej línie.

Proteínová koncentrácia sa určila z absorbancie pri A280 meraním s využitím fotospektrometra (1A280 = = 1,41 mg/ml).

(4-2) Metóda 2

Bunky každého hybridómového klonu, ktoré boli pripravené v (2-4), sa uviedli do určitého stavu v ASF104 médiu (Ajinomoto) obsahujúcom 10 % ultra nízke hovädzie IgG FBS (GIBCO-BRL) (1 - 2 x 10⁶ buniek/ml) a kultivovali sa v Integra bunkovej línii 1000 (INTEGRA CL1000, INTEGRA BIOSCIENCE). 7 až 10 dní po kultivácii, keď bunková hustota dosiahla 1 x 10⁸ buniek na ml, supematant každej hybridómovej kultúry sa regeneroval.

Každý kultivačný supematant sa vložil do HiTrap Proteín G kolóny (HiTrap afinitná kolóna Proteínu G; Amersham Pharmacia) ekvilibrovanej s fosfátovým pufrom (30 ml) pri nízkej rýchlosti 3 ml/min.

Následne sa kolóna premyla fosfátovým pufrom (20 ml) a potom 100 mM citrátového pufra (pH 2,0) sa umiestnilo do kolóny pri prietokovej rýchlosti asi 1 ml/min. na účely eluovania protilátky. Potom sa roztok (pH 9,0) 750 mM Tris-HCl pridal na neutralizáciu elučného roztoku a výsledný roztok sa prefíltroval cez filter (Millipore) na účely odstránenia bieleho precipitátu. Výsledný filtrát sa dialyzoval proti fosfátovému pufru (cez noc) a potom sa filtroval cez filter (Millipore). Teda čistená anti-AILIM ľudská monoklonálna protilátka bola získaná z každej hybridómovej línie.

Príklad 5

Reaktivita ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky ku ľudskej AILIM a kros-reaktivita ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky k myšej AILIM a krysej AILIM

Čistené rôzne ľudské anti-ľudské AILIM monoklonálne protilátky, skôr uvedené, boli analyzované na ich reaktivitu ku ľudskej AILIM rovnako ako na ich kros-reaktivitu ku myšej AILIM a krysej AILIM pomocou ELISA testu.

(5-1) Zriadenie ELISA systému na určenie koncentrácie IgG protilátky a príprava kalibračných kriviek

Pretože všetky uvedené čistené anti-ľudské AILIM monoklonálne protilátky boli IgG (IgG2) protilátky, ELISA systém bol zriadený na určenie koncentrácie IgG protilátky.

Kozia anti-ľudská IgG (Fc) protilátka (1,2 pg/ml v PBS; 100 pl/jamku; Organon Teknika) sa pridala do každej jamky 96 jamkovej ELISA mikroplatne (Nunc). Platňa sa inkubovala pri izbovej teplote dve hodiny na absorbovanie anti-IgG (Fc) protilátky na mikroplatňu. Následne, supematant sa odložil a platňa sa premyla trikrát fosfátovým pufrom (PBS) obsahujúcim 0,05 % Tween20. Blokovací reagent (PBS obsahujúce 0,5 % hovädzieho sérového albumínu (BSA) a 0,1 % Tween20) sa pridal do každej jamky (200 pl/jamku) a platňa sa inkubovala pri izbovej teplote dve hodiny na účely blokovania anti-IgG (Fc) protilátky-voľné miestu na platni. Potom sa blokovací reagent odložil a každá jamka sa premyla dvakrát s PBS.

Ľudská IgG2 protilátka (50 pl/jamku; The Binding Site), ktorá bola používaná ako štandardná protilátka, sa pridala v rôznych koncentráciách (0 až 100 ng/ml) do vhodných jamiek platne a platňa sa inkubovala pri izbovej teplote dve hodiny. Nadbytok roztokov štandardnej protilátky bol odstránený a každá jamka bola premytá trikrát fosfátovým pufrom obsahujúcim 0,05 % Tween20.

Následne, kozia anti-ľudská IgG/κ protilátka konjugovaná perixidázou sa pridala do každej jamky (4000-krát zriedená, 100 pl/jamku, Protos) a platňa sa inkubovala pri izbovej teplote jednu hodinu.

Supematant sa odložil a mikroplatňa sa premyla trikrát fosfátovým pufrom obsahujúcim 0,05 % Tween20. Pufer obsahujúci substrát (kompozícia: ortofenyléndiamín-O-fenyléndiamín, OPD; 20 mg)/citrát-fosfátový pufer (ph 5,0, 50 ml)/vodný roztok 30 % peroxidu vodíka (15 pl) sa pridal do každej jamky (100 pl/jamku) a platňa sa inkubovala pri izbovej teplote asi 7 minút.

Následne sa pridali 2M kyseliny sírovej do každej jamky (50 pl/jamku) na zastavenie reakcie. Kalibračné krivky sa vytvorili (obrázok 2) na základe hodnôt absorbancie nameranej pri vlnovej dĺžke 490 nm použitím mikroplatňového čitača.

Kontrolné testy sa vykonávali s kultivačným médiom samotným alebo s BSA samotným roztokom ako testovacou látkou tým istým spôsobom, ako je opísané.

(5-2) Analýzy na reaktivitu rôznych čistených ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok proti ľudskej AILIM rovnako ako na ich krôsreaktivitu proti myšej AILIM a krysej AILIM (5-2-1) Príprava reagentov

Reagenty, ktoré boli používané v tomto bunkovom ELISA teste, sa pripravili podľa nasledujúceho:

(5-2-1-1-) Príprava rekombinantnej CHO bunky pre-exprimujúcej myšiu AILIM

Rekombinantné CHO bunky pre-exprimujúce myšiu AILIM sa pripravili a získali tým istým spôsobom, ako je opísané skôr v (1-1) a (1-3).

cDNA (GenBank Accession Number: AB023132 (cDNA); BAA82126 (aminokyselina)) obsahujúca ORF plnej dĺžky myšej AILIM sa vložila do vektora pEF-neo a potom výsledný rekombinantný vektor expresie sa zaviedol do buniek vaječníkov čínskych škrečkov (CHO bunka) pomocou bežne používanej metódy na elektroporáciu (960 pF, 320 V) s využitím génového pulzaru (Gene Pulser, BioRad). Bunky sa kultivovali v RPMI1640 médiu obsahujúcom Geneticín (0,8 mg/ml; Gibco BRL) a 10 % FCS na účely výberu transformovaných buniek odolných proti liečivu, týmto obsahujúcich myšie AILIM pre-exprimujúce rekombinantné CHO bunky.

Rekombinantné CHO bunky pre-exprimujúce krysiu AILIM boli pripravené a získané tým istým spôsobom ako v (1-1) a (1-3).

cDNA (GenBank úložné číslo: AB023134 (cDNA); BAA82128 (aminokyselina)) obsahujúca ORF plnej dĺžky krysej AILIM sa vložila do vektora pEF-neo a potom výsledný rekombinantný vektor expresie sa zaviedol do buniek vaječníkov čínskeho škrečka (CHO bunka) pomocou bežne používanej metódy na elektroporáciu (960 pF, 320 V) s použitím génového pulseru (Gene Pulser, BioRad). Bunky sa kultivovali v RPMI1640 médiu obsahujúcom Geneticín (0,8 mg/ml; Gibco BRL) a 10 % FCS na účely výberu transformovaných buniek odolných proti liečivu, týmto obsahujúcich rekombinantné CHO bunky exprimujúce krysiu AILIM.

(5-2-1-3) Príprava monoklonálnej protilátky proti myšej AILIM

Rekombinantné CHO bunky pre-exprimujúce myšiu AILIM, ktoré boli pripravené v (5-2-1-1), sa homogenizovali a pripravili na ultracentrifugáciu (100 000 x g). Výsledný pelet obsahujúci frakciu bunkovej membrány sa regeneroval a potom suspendoval v PBS. Výsledná frakcia bunkovej membrány sa injektovala spoločne s Freundonovým kompleným doplnkom krysiam Wistar do labky na primárnu imunizáciu (deň 0). Antigén frakcie bunkovej membrány sa podal krysiam do labky na siedmy, štrnásty a dvadsiatyôsmy deň po primárnej imunizácii. Bunky lymfatickej uzliny sa zachytávali po dvoch dňoch po konečnej imunizácii.

Bunky lymfatickej uzliny a myšie myelómové bunky PAI (JCR č. B00113; Res. Disclosure, Vol. 217, p. 155, 1982) sa spojili v pomere 5:1: Bunky sa fúzovali použitím polyetylén glykolu 4000 (Boehringer Mannheim) ako fúzneho činidla na prípravu hybridómov produkujúcich monoklonálne protilátky. Výber hybridómov sa dosiahol ich kultiváciou v ASF104 médiu (Ajinomoto) obsahujúcom HAT, 10 % teľacie sérum a aminopterín.

Reaktivita krysej monoklonálnej protilátky v kultivačnom supematante každého hybridómu proti myšej AILIM sa určila pomocou reakcie kultivačného supematantu s uvedenými CHO bunkami pre-exprimujúcimi myšiu AILIM a potom meraním intenzity fluorescencie buniek sfarbených s anti-krysou IgG označenou FITC (Cappel) v EPICS-ELITE prietokovom cytometri.

Skrínink poskytol mnohonásobné hybridómy produkujúce monoklonálnu protilátku majúcu reaktivitu proti myšej AILIM.

Medzi týmito hybridómovými líniami bola konkrétne „B10.5.“ Bunky tohto hybridómu boli intraperitoneálne injektované (10⁶ až 10⁷ buniek/0,5 ml/myš) do 1CR nu/nu myši (samice, 7 až 8 týždňov staré). Desať až 20 dní po injekcii sa zbierala tekutina z každej myši laparotómiou za anestézie podľa bežne používanej metódy. Krysia anti-myšia AILIM monoklonálna protilátka B10.5 (IgGl) sa pripravila z tekutiny vo veľkej škále.

(5-2-2) Reaktivita protilátky proti ľudskej, myšej a krysej AILIM

Koncentrácie ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky a kontrolnej protilátky na použitie v ELISA teste opísanom neskôr sa určili na základe ELISA a kalibračných kriviek v (5-1).

Bunky (7 x 10³ bunky/jamka) rekombinantnej CHO bunky pre-exprimujúcej ľudskú AILIM pripravené v príklade 1, rekombinantná CHO bunka pre-exprimujúca myšiu AILIM pripravená v (5-2-1-1-) a rekombinantná CHO bunka pre-exprimujúca krysiu AILIM pripravená v (5-2-1-2) sa vložili do jamiek 96 jamkových ELISA mikroplatní a kultivovali sa pri 37 °C.

Následne sa supematant odložil a potom akákoľvek z čistených rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok alebo kontrolných protilátok pripravených skôr sa pridala do každej jamky (koncentrácie protilátky: protilátka 200 pg/ml zriedená s PBS obsahujúcim 1 % BSA, 3-krát, 3²'krát, 3³-krát, 3⁴-krát, 3⁵-krát, 3^ó-krát, 3⁷-krát, 3⁸-krát, 3⁹-krát, 3^l0-krát, 3“-krát, 3^l2-krát) v množstve 50 μΐ/jatnku a platne reagovali pri izbovej teplote dve hodiny. Roztoky monoklonálnych protilátok sa odložili a každá jamka sa premyla trikrát fosfátovým pufrom obsahujúcim 1 % BSA (Sigma).

Do každej jamky sa potom pridala anti-ľudská IgG (Fc) protilátka konjugovaná s chrenovou peroxidázou (zriedená 1000-krát, 50 μΐ/jamku; American Qualex) a platne sa inkubovali pri izbovej teplote jednu hodinu.

Nadbytok roztoku označenej protilátky sa odložil a mikroplatne sa premyli trikrát fosfátovým pufrom obsahujúcim 1 % BSA. Pufer obsahujúci substrát (kompozícia: orto-fenyléndiamín (0-fenyléndiamín, OPD; 20 mg)/citrátfosfátový pufer (pH 5,0, 50 ml)/vodný roztok 30 % peroxidu vodíka (15 μΐ)) sa pridal do každej jamky (100 μΐ/jamku) a platne sa inkubovali pri izbovej teplote asi 7 minút.

Následne sa pridala 2M kyselina sírová do každej jamky (50 μΐ/jamku) na zastavenie reakcie. Absorbancia bola meraná pri vlnovej dĺžke 490 nm s použitím mikroplatňového čítača (Bio-Rad).

Kontrolný ELISA test sa vykonával s nasledujúcim kontrolnými protilátkami na účely vyhodnotenia uvedených protilátok tým istým spôsobom, ako je uvedené.

(1) Myšia monoklonálna protilátka SA12 alebo SG430 proti ľudskej AILIM (JP-A 11-29599 (príklad 12) a W098/38216 (príklad 12).

(2) Krysia monoklonálna protilátka B 10.5 proti myšej AILIM (5-2-1-3).

(3) Myšia monoklonálna protilátka JTT2 proti krysej AILIM (monoklonálna protilátka produkovaná pomocou hybridómu, ktorá bola medzinárodne uložená 11. októbra 1996 pod medzinárodným úložným číslom FERM BP-5708 v The National Inštitúte of Bioscience and Human-Technology, The Agency of Industrial Science and Technology, The Ministry o f International Trade and Industry), ktoré sú medzinárodné autority kompetentné na ukladanie takého materiálu podľa Budapeštianskej dohody; JP-A 11-29599 (príklady 1 a 2) a WO 98/38216 (príklady 1 a 2)).

(4) Pripravená ľudská monoklonálna protilátka proti KLH (keyhole limpet hemocyanin, PIERCE) namiesto hybridómového supematantu.

Kontrolný ELISA experiment sa vykonával tým istým spôsobom, ako je uvedené s využitím CHO bunky divého typu namiesto rekombinantných CHO buniek pre-exprimujúcich AILIM.

Výsledok je znázornený na obrázkoch 3 až 14.

Na základe získaných výsledkov 50 % účinná koncentrácia (ED50:ng/ml) sa vypočítala ako index pre reaktivitu každej ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky proti ľudskej AILIM (rekombinantné CHO bunky pre-exprimujúce ľudskú AILIM, proti myšej AILIM (rekombinantné CHO bunky preexprimujúce myšiu AILIM) alebo proti krysej AILIM (rekombinantné CHO bunky pre-exprimujúce krysiu AILIM). Výsledky získané pomocou výpočtov sú uvedené neskôr.

(A) ED50 pre CHO preAIF 34 (JMab-124): AIF182 (JMab-126): AIF348 (JMab-127): AIF620 (JMab-128): AIF1052 (JMab-135): AIH5D3 (JMab-136): AIH386 (JMab-137): AII289 (JMab-138): AII394 (JMab-139): AII488 (JMab-140): AIJ 40 (JMab-141):

SA 12:

SG430:

(B) ED50 pre CHO preAIF 34 (JMab-124): AIF348 (JMab-127): AIF620 (JMab-128): AII289 (JMab-138): AII394 (JMab-139): AII488 (JMab-140):

(C) ED50 pre CHO pre· AIF 34 (JMab-124): AIF348 (JMab-127): AIF620 (JMab-128): AII289 (JMab-138): AII394 (JMab-139): AII488 (JMab-140):

exprimujúce ľudskú AILIM 5,3 ng/ml

3,6 ng/ml

9.1 ng/ml

10.1 ng/ml 2,0 ng/ml

7.5 ng/ml

9.6 ng/ml

10.5 ng/ml

10.6 ng/ml 11,0 ng/ml

3.7 ng/ml

1.8 ng/ml 1,2 ng/ml exprimujúce myšie AILIM 42 ng/ml 81 ng/ml 100 ng/ml 53 ng/ml 60 ng/ml 70 ng/ml exprimujúce krysie AILIM 45 ng/ml 62 ng/ml 97 ng/ml 57 ng/ml 90 ng/ml 90 ng/ml

Výsledky potvrdzujú, že ľudské anti-ľudské AILIM monoklonálne protilátky podľa vynálezu prejavujú významne vysokú špecifitu ku ľudskej AILIM.

Ďalej bolo dokázané, že šesť typov ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok (znázornené v (B) a (C)) bolo reaktívnych k ľudskej AILIM aj ku krysej AILIM (väzbová schopnosť, krosreaktivita).

Príklad 6

Určenie afinity a neutralizačnej aktivity ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky proti antigénu (ľudská AILIM)

Asociačná rýchlostná konštanta (ka), disociačná rýchlostná konštanta (kd) a disociačná konštanta (Kd) s ohľadom na reakciu medzi čistenými rôznymi ľudskými anti-ľudskými AILIM monoklonálnymi protilátkami pripravenými skôr a ľudskou AILIM boli určené použitím komerčne dostupného kitu Biacore X (Amersham Pharmacia).

(6-1) Príprava antigénu imobilizovaného na senzorový čip

Antigén imobilizovaný na senzorový čip v kite sa pripravil ako rekombinantný chimérický antigén (tu označovaný ako „ľudská AILlM-IgFc“) obsahujúci extracelulámu oblasť ľudskej AILIM a konštantnú oblasť (Fc) ľudského IgGl.

Ľudská AILlM-lgFc sa pripravila pomocou ďalšieho čistenia anigénu získaného podľa metódy, ako je opísaná v skorších prihláškach (JP-A 11-29599 (príklad 16 (2)) a WO 98/38216 (príklad 16 (2)) pôvodcom pánom Tezuka.

Kultivačný supematant rekombinantných buniek produkujúcich ľudskú AILIM-IgFc sa vložil na HiTrap proteínovú G kolónu (HiTrap afmitná kolóna Proteín G; Amersham-Pharmacia) ekvilibrovanú fosfátovým pufrom (30 ml) pri nízkej rýchlosti 3 ml/min. na účely absorbovania ľudskej AILIM-IgFc v kultivačnom supematante na kolóne.

Následne sa kolóna premyla fosfátovým pufrom (20 ml) a potom 100 mM citrátového pufra (pH 2,0) sa vložilo na kolónu pri prietokovej rýchlosti asi 1 ml/min. na účely eluovania ľudskej AILIM-IgFc. Následne sa eluovaný roztok neutralizoval roztokom (pH 9,0) 750 mM Tris-HCl a potom sa dialyzoval proti fosfátovému pufru (cez noc). Potom sa dialyzovaný roztok filtroval cez filter (Millipore). Takto sa získala čistená anti-ľudská AILIM-IgFc.

Koncentrácia proteínu sa určila z absorbancie pri A280 nameranej s použitím fotospektrometra (1Α_Μ0 = = 1 mg/ml). Koncentrácia ľudskej AILIM-IgFc sa určila na 0,28 mg/ml.

Čistený chimérický proteín obsahujúci extracelulámu oblasť krysej AILIM a konštantnú oblasť (Fc) ľudskej IgGl (krysia AILIM-IgFc; JP-A-11-29599 (príklad 16 (2)) a WO 98/38216 (príklad 16 (2) sa pripravil tým istým spôsobom, ako je opísaný skôr. Koncentrácia získanej krysej AILIM-IgFc sa určila na 0,45 mg/ml. (6-2) Určenie afinity a neutralizačnej afinity

Experimentálne postupy s výnimkou imobilizácie antigénu (ľudská AILIM-IgFc) na senzorový čip, ktorá je opísaná neskôr, sú založené na inštrukčnom manuáli a experimentálnom protokole pripojenom ku komerčne dostupnému testovaciemu kitu Biacore X (Amersham-Pharmacia).

HBS pufer (obsahujúci 0,01M HEPES, 0,15M NaCl, 3 mM EDTA a 0,005 % detergentu P20, (ph 7,0) sa nechal pretekať cez „tok bunka-1“ (Flow Cell-1) pripojený ku kitu pri prietokovej rýchlosti 5 μΐ/min. Následne, roztok (15 μΐ) obsahujúci 0,005 M NHS (N-hydroxysukcínimid) a 0,2M EDC (N-etylimetylaminopropyljkarboditnid) sa pridal ku aktívnym karboxylovým skupinám CM prekrytej na povrchu senzorového čipu.

Následne, 23 roztoku ľudskej AILIM-IgFc (10 pg/ml; rozpusteného v 10 mM pufru-acetát sodný (pH 5,0)) sa pridalo ku imobilizovanej ľudskej AILIM-IgFc na senzorovom čipe. Nezreagované aktivované karboxylové skupiny sa blokovali pridaním 35 μΐ IM etanolamín hydrochloridu. Množstvá ľudskej AILIM-IgFc imobilizovanej pomocou imobilizačného spracovania vykonaného dvakrát boli 2,444RU (rezonančná jednotka) a 2,213 RU. Jednotka, RU, zodpovedá množstvu na jednotku plochy; 1RU = 1 pg/mm².

„Tok bunka-2“ (Flow-Cell2), ktorý je referenčný, sa pripravil na krycie spracovanie v prítomnosti ľudskej AILIM-IgFc tým istým spôsobom, ako je uvedený skôr.

Fosfátový pufer sa nechal pretekať cez tok bunky (senzorový čip) pri prietokovej rýchlosti 20 μΐ/min. a pridala sa každá z čistených ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok, ktoré boli pripravené v príklade (10 až 50 pg/ml, 60 μΐ).

Štandardná podmienka na meranie bola: asociačná fáza na tri minúty a disociačná fáza na 10 minút. Vhodné množstvá protilátky naviazané a uvoľnené z antigénu sa monitorovali na získanie senzorgramu. Disociácia protilátky z antigénu sa dosiahla pomocou pretekania PBS cez senzorový čip pri prietokovej lýchlosti 20 μΐ/min.

Na základe výsledných senzorgramových údajov, asociačná rýchlostná konštanta (ka), disociačná rýchlostná konštanta (kd) a disociačná konštanta (Kd; Kd = kd/ka) sa vypočítali použitím analytického softvéru (BIAevaluation 3,0) pripojeného ku kitu.

Afinita a neutralizačná aktivita myších monoklonálnych protilátok SA 12 a SG430 na ľudskú AILIM pripravenú v príklade opísanom skôr sa tiež analyzovala tým istým spôsobom, ako je opísané skôr.

Vhodné získané hodnoty sú uvedené.

meno klonu	ka (1/M.Sek)	kd (1/Sck)	Kd (M)
AU· 34 (JMab-124)	1,6 x ÍÔJ	1.0 x 10	6,3 x iii *
AIF182 (JMab-126)	3,2x10* 1	2.8 x 10'*	8,8 x 10
AIF348 (JMab-127)	i,9 x 10*	6,4 x 1 0 '	3,4 x 10'’
AIE620 (JMab-128)	1,1 x i (P	1,1 x 10	1,0 x ío
AIF1052 (JMab-135)	1,6 x 10“	6,3 x 10	3,9 x 10'’
A1H5D3 (JMab-136)	2,8 x 104	4,9 x ΙΟ	1,8 x 10'’
AÍH386 (JMab-137)	1,2 x 10’	3,1 x 10’	2,6 x 10’
ΑΠ289 (JMab-138)	3,7 x 10’	4,2 x 10	1,1 x 10’
ΛΙΙ394 (JMab-138)	3,1 x 10’	2,4 x 10	7.7 x 10’1“
ΛΙΙ488 (JMab-140)	2,3 x 104	3.5 x 10”	1,5 x 10
AIJ40 (JMab-141)	1,9 x 10’	1,9 x 10	1,0 x ΙΟ’’
SA 12	7,8 x 10J	7,9 x 10	1,0 x 10
SG430	2,2 x 10“	1,5 x 10’*	6,8 x 10

Výsledky ukazujú, že všetky ľudské anti-ľudské AILIM monoklonálne protilátky a anti-ľudské AILIM myšie monoklonálne protilátky prejavujú očividne vysokú väzbovú afinitu a neutralizačnú aktivitu proti ľudskej AILIM.

Príklad 7

Aktivita ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky proti prenosu kostimulačného signálu v ľudskej T bunke

Analyzovalo sa, či ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka v súlade s predkladaným vynálezom má schopnosť kontrolovania (zvýšenie a/alebo inhibícia) odpovedí T bunky (tvorby cytokínov takých ako IFN-γ a IL-4, bunkovej proliferácie atď.) alebo nie, inými slovami, či protilátky prejavujú regulačnú aktivitu na bunkový prenos kostimulačného signálu sprostredkovaného AILIM alebo nie. Analýza bola vykonávaná na základe množstva cytokínov (IFN-γ a IL-4) produkovaného v ľudských T bunkách rovnako ako na základe stupňa proliferácie ľudských T buniek ako indexu.

(7-1) Zriedenie protilátky

Anti-ľudská CD3 monoklonálna protilátka OKT3 (ATCC CRL-8001) sa zriedila fosfátovým pufrom (PBS) na konečnú koncentráciu 8 (pg/ml).

Každá z rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok pripravených skôr bola zriedená s PBS na konečnú koncentráciu 40 pg/ml. Roztoky protilátky sa ďalej riedili s PBS na účely prípravy rôznych koncentrácií protilátok (40 pg/ml - 0,0049 pg/ml).

(7-2) Prekrytie mikroplatne protilátkou

Každá jamka 96 jamkových mikroplatní sa prekryla s (1) anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou OKT3 (8 pg/ml; 25 pl do každej jamky) a akoukoľvek z rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok (40 pg/ml - 0,0049 pg/ml; 25 pl na každú jamku) alebo (2) anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou OKT3 (8 pg/ml; 25 pl na každú jamku) samotnou. Platne sa inkubovali pri 37 °C dve hodiny. Roztoky protilátky sa odložili a každá jamka sa premyla trikrát s PBS. Po premytí sa do každej jamky pridalo RPMI1640 médium obsahujúce 10 % FCS (100 pl/jamku) a platne sa inkubovali pri 37 °C jednu hodinu. Vhodné jamky platní sa prekryli protilátkami uvedenými skôr v (1) alebo (2).

Kontrolné experimetny sa vykonávali tým istým spôsobom s použitím platní prekrytých nasledujúcimi vhodnými monoklonálnymi protilátkami ako kontrolnými protilátkami namiesto ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok.

(1) Myšia monoklonálna protilátka SA 12 alebo SG430 proti ľudskej AILIM (JP-A 11-29599 (príklad 12) a WO 98/38216 (príklad 12).

(2) Myšia anti-ľudská CETP monoklonálna protilátka JHC1 (tiež označovaná ako JMablO9; JP-A 9-20800) a (3) ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka (tiež označovaná ako JMab23; spomínaný príklad).

Mikroplatne prekryté protilátkami boli používané v nasledujúcom teste.

(7-3) Príprava suspenzie ľudských T buniek

Periférna krv sa zachytávala z normálnych zdravých jedincov (5 osôb; donor A, B, C, D a E). Frakcia obsahujúca monojadrové bunky sa pripravila centrifugáciou v hustotnom gradiente s použitím LymphoPrep (Nycomed). Ľudské T bunky sa oddelili od frakcie ľudskej monojadrovej bunky podľa manuálu na experimentálny postup s využitím izolačného kitu (Pan-T celí Isolation Kit; Miltenyi) a magnetického triediča. Množstvo T buniek sa určilo použitím hemacytometra. Ľudské T bunky sa suspendovali v RPMI 1640 médiu obsahujúcom 10 % FCS na účely prípravy suspenzie ľudských T buniek (1 x 10⁶ buniek/ml).

(7-4) Bunková kultúra (1) Kultúra využívajúca mikroplatňu prekrytú anti-ľudskou CD3 protilátkou a anti-ľudskou AILIM protilátkou

Suspenzia ľudských T buniek (donor A, B, C, D, alebo E; 100 pFjamku; 1 x 10⁵ buniek/jamku) sa pridala do každej jamky mikroplatne prekryte uvedenou protilátkou a platňa a inkubovala pri 37 °C tri dni v CO₂ inkubátore.

Po kultivácii, alikvóty výsledných kultivačných supematantov (50 pl) sa skladovali pri -20 °C a potom sa použili v teste opísanom neskôr (test pre IFNy). Po vzorkovaní alikvótov kultivačných supematantov sa použili vhodné mikroplatne na nasledujúci test:

(2) Kultúra využívajúca mikroplatňu prekrytú samotnou anti-ľudskou CD3 protilátkou.

Suspenzia T buniek (donor D; 100 pl/jamku; 1 x 10⁵ buniek/jamku) sa pridala do každej jamky mikroplatne prekrytých uvedenou protilátkou a potom akákoľvek z rôznych ľudských anti-ľudských AILIM mono43 klonálnych protilátok sa pridala do suspenzie (25 μΐ protilátky 40 pg/ml - 0,0049 ng/ml). Platne sa inkubovali pri 37 °C počas troch dní v CO₂ inkubátore.

(7-5) Určenie proliferačnej aktivity T bunky

Metyl (³H) tymidín (0,5 pCi/jamku; Amersham-Pharmacia) sa pridal do každej jamky platní po inkubácii a platne sa inkubovali pri 37 °C šesť hodín v CO₂ inkubárore. Po inkubácii sa bunky zachytili na GF/C filtroch (Packard) využívajúcich bunkový zberač. Následne sa filtre vysušili pri 40 °C počas troch hodín alebo dlhšie a potom sa pridal Microscinti 0 (20 μΐ/jamku; Packard). Rádioaktivita zabudovaného (³H) do bunky zachytenej na filtroch sa merala pomocou P-počítača (TOP COUNT) na účely analýzy stupňa proliferácie T bunky po kultivácii.

Výsledky sú znázornené na obrázkoch 15 až 39.

Výsledok tohto testu potvrdzuje, že ľudské T bunky boli jednoznačne proliferované v závislosti od koncentrácie buniek v prípade, ak mikroplatne boli prekryté anti-ľudskou AILIM monoklonálnou protilátkou (ľudská monoklonálna protilátka alebo myšia monoklonálna protilátka) spoločne s anti-ľudskou CD3 protilátkou. Ďalej sa potvrdili určité rozdiely v stupni bunkovej proliferácie medzi donormi.

Na druhej strane, ľudské T bunky nenarástli v prípade, ak platne boli prekryté samotnou anti-ľudskou CD3 protilátkou a anti-ľudskou AILIM monoklonálnou protilátkou (ľudská monoklonálna protilátka alebo myšia monoklonálna protilátka) v roztoku, ktorý bol používaný počas kultivácie buniek.

(7-6) Kvantifikácia IFNy v kultivačnom supematante T bunky

Vo vhodných kultúrach T buniek (donory B a C) opísaných v (1) (7-4), množstvá IFNy v kultivačných supematantoch boli určené pomocou komerčne dostupného ELISA kitu pre ľudské IFNy (AmershamPharmacia; Endogen),

Výsledky sú znázornené na obrázkoch 40 až 47.

Výsledok tohto testu potvrdzuje, že tvorba IFNy sa podstatne zvýšila v závislosti od koncentrácie antiľudskej AILIM monoklonálnej protilátky (ľudskej monoklonálnej protilátky alebo myšej monoklonálnej protilátky)

Príklad 8

Regulačná aktivita ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky na zmiešanú lymfocytovú reakciu (MLR)

Testovalo sa, či ľudské anti-ľudské AILIM monoklonálne protilátky predkladaného vynálezu sú schopné kontrolovať (zvýšenie a/alebo inhibíciu) odpovedí T buniek (tvorbu cytokínov takých ako IFN-γ a IL-4, bunkovú proliferáciu atď.) alebo nie. Na druhej strane sa testovala schopnosť regulovania prenosu kostimulačného signálu prostredníctvom AILIM do buniek pomocou analyzovania aktivity (konkrétne DNA syntéza v bunkách) kontrolujúcej proliferáciu T bunky spojenú s alogénovou zmiešanou lymfocytovou reakciou (alogénová MLR) ako indexom.

(8-1) Príprava ľudskej PBMC a T bunky

Periférna krv (200 ml) zachytávaná z normálnych zdravých jedincov (7 jedincov, donor A, B, C, D, E, F a G) bola ponechaná na vrstvách Lymphoprep (15 ml; Nycomed) v mikroskúmavkách (50 ml; Falcon). Po centrifugácii (pri 1600 rpm počas 10 min.) sa objavili medziproduktové vrstvy. Získané bunky sa zriedili dvakrát alebo viacej fosfátovým pufrom a potom sa centrifugovali (pri 1800 rpm počas 10 minút). PBMC (monojadrová bunka periférnej krvi; 2 x 10⁸ - 5 x 10⁸ buniek) boli pripravené. Počet buniek sa určil použitím hemacytometra. Alikvót buniek použitý v MLR teste (1,08 x 10⁸ buniek/ 9 mikroplatni) sa udržiaval na ľade. Zostávajúce bunky boli použité na oddelenie T buniek opísaných neskôr.

Izolačný kit (PanT Isolation kit; Miltenyi Biotech) sa použil na separáciu T buniek z PBMC. V súlade s manuálom pripojeným ku kitu sa zostávajúce PBMC pridali do roztoku pripojeného ku kitu a roztok sa inkuboval. Následne sa bunky premyli s PBS obsahujúcim 5 mM EDTA a 0,5 % BSA a potom sa resuspendovali v PBS. Bunková suspenzia sa pridala do pozitívnej výberovej kolóny VS+ (Miltenyi Biotech) s PBS a získala sa neadsorbovaná frakcia. PBS sa vložilo do kolóny a premytý roztok sa regeneroval. Toto isté spracovanie sa opakovalo. Regenerované roztoky sa spojili dokopy a získala sa frakcia T buniek. Po centrifugácii frakcie T buniek sa bunky resuspendovali v PBS. Bunkový počet výsledných T buniek sa určil použitím hemacytometrom. Bunky boli použité v nasledujúcom teste.

(8-2) Zmiešaná lymfocytová reakcia (MLR)

Ako bolo opísané, sú známe dve signalizačné dráhy, jedna medzi CD28 a CD80(B7-l)/CD86(B7-2) a iná medzi CTLA4 a CD80 (B7-1 )/CD86(B7- 2), pre ktoré bola vykonávaná porovnávacia detailná analýza a ako kostimulačné signalizačné dráhy požadované na aktiváciu lymfocytov takých ako T bunky.

Konkrétne, proliferácia T buniek pri odpovedi na zmiešanú lymfocytovú reakciu (MLR) môže byť indukovaná pomocou prenosu signálu cez každú z týchto známych dráh.

Použitím uvedených látok bol, test tohto vynálezu zameraný na analýzu (1) inhibície MLR pomocou blokovania signalizačnej dráhy sprostredkovanej CTLA4; (2) inhibície MLR pomocou blokovania signalizačnej dráhy prostredníctvom CD80 (B7-1)/CD86 (B7-2); (3) inhibície MLR pomocou blokovania obidvoch dráh;

(4) inhibície MLR pomocou blokovania terciámej signalizačnej dráhy spojenej s AILIM a (5) inhibície MLR pomocou blokovania dráhy sprostredkovanej CTLA4 a dráhy sprostredkovanej AILIM.

Použili sa nasledujúce testovacie látky.

(1) Ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka (pripravená v uvedenom príklade).

(2) Myšia anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka SA12 (rovnaká ako v uvedenom príklade).

(3) Ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka (negatívna kontrola; rovnaká ako v uvedenom príklade).

(4) Myšia IgG protilátka (anti-ľudská CD34; negatívna kontrola; Immunotech).

(5) Zmes anti-ľudskej CD80 monoklonálnej protilátky (Pharmingen) a anti-ľudskej CD86 monoklonálnej protilátky (Pharmingen), a (6) ľudská CTLA4-IgFc chimérová molekula (Ancell).

Zmiešaná lymfocytová reakcia (MLR) bola vedená na nasledujúcich šesť kombinácií s použitím PBMC a T buniek pripravených z donorov opísaných skôr v (1-8).

(i) T bunka (donor A)/PBMC (donor D) (ii) T bunka (donor D)/PBMC (donor B) (iii) T bunka (donor C)/PBMC (donor A) (iv) T bunka (donor E)/PBMC (donor G) (v) T bunka (donor F)/PBMC (donor E) (vi) T bunka (donor G)/PBMC (donor F)

Koncentrácie PBMC a T buniek použitých v teste sa upravili tak, ako je to uvedené.

PBMC sa suspendovali v PBS a potom sa preniesli do kultivačnej misky (60 mm). Bunky boli podrobené difrakčnému žiareniu (50 Gy) so žiarením (Hitachi MED1CO). Bunky boli regenerované, centrifugované a potom sa pridali do PRMI1640 média obsahujúceho 10 % FCS. Bunkový počet sa upravil na 2 x 10⁵ bunky/50 μΐ.

Výsledné T bunky z každého donora sa pridali do PRMI1640 média obsahujúceho 10 % FCS a bunkový počet sa upravil na 1 x 10³ buniek/50 μΐ.

(8-2-1) Inhibícia MLR pomocou ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky

PRMI1640 médium obsahujúce 10 % FCS sa pridalo do každej jamky 96 jamkovej mikroplatne majúcej jamky v tvare U. Roztok ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky alebo myšej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky SA12 sa zriedil s PRM11640 médiom obsahujúcim 10 % FCS na prípravu roztokov s rôznymi koncentráciami protilátky. Zriedené roztoky protilátok sa pridali do jamiek (konečná koncentrácia: 0, 0,31, 1,25, 5 a 20 pg/ml). T bunky (50 μΐ) sa pridali do jamiek. Platňa sa inkubovala pri 37 °C jednu hodinu v CO₂ inkubátore (NAPCO). Potom sa reakcia kompletovala, do jamiek sa pridali PBMC (50 μΐ) získané z rozdielnych donorov na začatie MLR.

Keď MLR bola riadená s použitím protilátky inej než ľudská anti-ľudská AILIM protilátka (opísaná v (3) až (6)) ako testovacej látky, T bunky získané z rozdielnych donorov boli ponechané reagovať po inkubácii PBMC s testovacou látkou.

Na piaty deň kultivácie, tymidín označený tríciom (³H-tymidín; 20 μΐ; 1 pCi/jamku) zriedený s PRM11640 médiom obsahujúcim 10 % FCS sa pridal do každej jamky. Kultivácia pokračovala ďalší deň. Potom bola kultivácia kompletovaná, bunky sa zozbierali použitím bunkového zberača (Packard). Rádioaktivita ³H začleneného do buniek bola meraná v β-počítači (TOP COUNT; Packard) na účely analyzovania rýchlosti T bunkovej proliferácie po kultivácii.

Výsledky sú znázornené na obrázkoch 48 až 59.

(8-2-2) Inhibícia MLR pomocou ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky v MLR systéme, kde signalizačná dráha sprostredkovaná CTLA4 bola blokovaná PRMI1640 médium obsahujúce 10 % FCS sa pridalo do každej jamky 96 jamkovej mikroplatne majúcej jamky v tvare U. Roztok ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky alebo myšej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky SA 12 sa zriedil s PRMI1640 médiom obsahujúcim 10 % FCS na prípravu roztokov s rôznymi koncentráciami protilátky.

Zriedené roztoky protilátok sa pridali do jamiek (konečná koncentrácia: 0, 0,31, 1,25, 5 a 20 pg/ml). T bunky (50 pl) sa pridali do jamiek. Platňa sa inkubovala pri 37 °C jednu hodinu v CO₂ inkubátore (NAPCO).

Na účely kultivácie T buniek, PBMC (v RPMI1640 médiu obsahujúcom 10 % FCS) získané z iných donorov boli kultivované nezávisle po pridaní ľudskej CTLA4-IgFc do PBMC. Kultivácia sa vykonávala pri 37 °C jednu hodinu v CO₂ inkubátore (NAPCO). Koncentrácia CTLA4-IgFc bola upravená na 20 pg/ml na začiatku MLR.

Následne sa pridali PBMC (50 μΐ) do kultúry T buniek opísanej na účely iniciovania MLR.

Ak MLR bola riadená použitím protilátky inej než ľudská anti-ľudská AILIM protilátka (opísaná v (3) až (5)) ako testovacej látky, T bunky získané z rozličných donorov sa nechali reagovať po inkubácii PBMC, ktoré boli kultivované v prítomnosti CTLA4-IgFc, s testovanou látkou.

Na piati deň kultivácie, tymidín označený tríciom (³H-tymidín; 20 μΐ; 1 pCi/jamku) zriedený PRMI1640 médiom obsahujúcim 10 % FCS sa pridal do každej jamky. Kultivácia pokračovala jeden deň. Keď kultivácia prebehla kompletne, bunky sa zozbierali pomocou bunkového zberača (Packard). Rádioaktivita ³H zabudovaného do buniek bola meraná v β-počítači (TOP COUNT; Packard) na účely analyzovania rýchlosti T bunkovej proliferácie po kultivácii.

Výsledky sú znázornené na obrázkoch 60 až 69.

Výsledky získané z dvoch testov opísaných skôr sú zhrnuté do nasledujúceho:

(1) CTLA4-IgFc blokujú prenos signálu sprostredkovaný CTLA-4, a tým inhibujú proliferáciu T buniek vyvolanú alogénovou MLR.

(2) Anti-CD80 protilátka a anti-CD86 protilátka inhibujú prenos signálu sprostredkovaný pomocou CD80/CD86, ktorý je ligand pre CTLA4 a CD28 a tým inhibujú proliferáciu T bunky vyvolanú alogénovou MLR.

(3) Monoklonálna protilátka proti ľudskej AILIM, podobne CTLA4-IgFc, anti-CD80 protilátka a anti-CD86 protilátka inhibujú proliferáciu T bunky vyvolanú alogénovou MLR spojenú s prenosom signálu sprostredkovaným AILIM v spôsobe závislom od koncentrácie protilátky.

Inými slovami, tieto výsledky potvrdzujú, že terciáma dráha sprostredkovaná AILIM a jej ligandom, okrem známych dráh sprostredkovaných CTLA4/CD80/CD86 a sprostredkovaných pomocou CD28/CD80/CD86, existuje ako kostimulačná signálna dráha potrebná na aktiváciu T bunky, rovnako tieto výsledky potvrdzujú, že signálna dráha sprostredkovaná AILIM je inhibovaná protilátkou proti AILIM. Ďalej je zvýšená možnosť, že príspevok dráhy sprostredkovanej AILIM ku prenosu signálu môže byť porovnateľný s príspevkom dráhy sprostredkovanej CDTLA4/CD80/CD86 a dráhy sprostredkovanej CD28/CD80/CD86.

Príklad 9

Účinok ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky na vyvolanie bunkovej cytotoxicity závislej od protilátky (ADCC)

Biologické aktivity spôsobené protilátkami zahrnujú vyvolanie bunkovej cytotoxicity závislej od protilátky (ADCC). ADCC je cytotoxický účinok, ktorý si vyžaduje protilátku kvôli bunkám efektoru a cieľovým bunkám, ktoré indukujú poškodenia na cieľových bunkách vyvolané efektorovými bunkami takými ako lymfocyty, makrofág alebo polymorfojadrový leukocyt.

Účinok anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky podľa vynálezu na vyvolanie ADCC, bol analyzovaný podľa nasledujúceho:

^5lCr (0,1 mCi/10⁶ bunky; Amersham-Pharmacia) sa pridal do kultúry ľudských rekombinantných HPB-ALL buniek pre-exprimujúcich AILIM pripravených v príklade opísanom skôr a zmes sa inkubovala pri 37 °C dve hodiny. Bunky sa premyli osemkrát s RPMI1640 médiom. Bunky označené izotopom sa použili ako cieľové bunky.

Kontrolné experimenty sa vykonávali s použitím ľudských HPB-ALL buniek divého typu označených s izotopom ako kontrolnými bunkami tým istým spôsobom, ako bolo opísané.

Použitím Lymphosepar I (IBL), PBMC frakcie sa separovali z periférnej krvi zachytávanej z normálnych zdravých jedincov. Výsledné ľudské PBMC boli používané ako efektoré bunky.

Cieľové bunky (1 x 10⁴ buniek/jamku; 25 μΐ/jamku) sa vložili do každej jamky 96 jamkovej mikroplatne (Nunc) majúcej jamky v tvare U. Potom akákoľvek z rôznych koncentrácií ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok zriedených s RPMI1640 médiom obsahujúcim 5 % FBS (0,0001 - 1,0 μΐ/ml; 25 μΐ/jamku), samotné médium (25 μΐ/jamku) alebo 1 % Nonidet P-40 (25 μΐ/jamku; detergent majúci účinok na lýzu bunky) sa pridala do každej jamky a platňa sa inkubovala pri izbovej teplote 20 minút.

Kultivácia sa uskutočňovala s použitím anti-ľudskej CD3 monoklonálnej protilátky OKT3 (ATCC CRL-8001) ako pozitívnej kontrolnej protilátky namiesto anti-ľudskej AILIM protilátky tým istým spôsobom, ako je opísaný skôr.

Efektorové bunky (E/T pomer = 50; 1 x 10⁵ buniek/jamku) sa pridali do každej jamky a platňa sa inkubovala pri 37 °C počas 16 hodín pod atmosférou 5 % CO₂ v inkubátore.

Po kultivácii sa vzorky centrifugovali (pri 1500 rpm pri 4 °C počas 10 minút). Výsledný supematant sa regeneroval. Rádioaktivita v centrifugovanom supematante sa merala pomocou γ-počítača. Rádioaktivita predstavujúca množstvo 51Cr uvoľneného z buniek do kultivačného supematantu poškodením bunkovej membrány pomocou ADCC.

Percento poškodenia bunkovej membrány (percento bunkovej lýzy), ktoré je spôsobené ADCC indukovanou pomocou anti-AILIM protilátky alebo anti-CD3 protilátky, sa určilo za predpokladu, že pozorovaná rádioaktivita so samotným médiom zodpovedá 0 % s ohľadom na poškodenie bunkovej membrány (0) a že s Nonidet zodpovedá 100 % s ohľadom na poškodenie bunkovej membrány.

Výsledky sú znázornené v obrázkoch 70 a 71.

Výsledok testu potvrdil, že ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka podľa vynálezu prejavuje aktivitu indukovanú ADCC v spôsobe závislom od koncentrácie.

Príklad 10

Určenie génových a aminokyselinových sekvencií ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky a ich analýza

Sekvencie cDNA kódujúcej ťažké reťazce rovnako ako cDNA kódujúcej ľahké reťazce rôznych ľudských anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok, ktoré boli pripravené v príklade uvedenom skôr, sa určili nasledovne. Štrukturálne znaky génov boli takisto analyzované.

Použitím čistiaceho kitu (Quick PrepmRNAPurification Kit; Amersham-Pharmacia), PolyA⁺RNA bola extrahovaná a čistená z hybridómov (klony: A1H5D3 (JMab-136), AII289 (JMab-138) a AII394 (JMab-139), ktoré produkovali ľudskú monoklonálnu protilátku proti ľudskej AILIM pripravenej v príklade uvedenom skôr.

Bunky hybridómu sa suspendovali v pufri lýzy bunky (Lysis Buffer) a lyžovali použitím injekcie na ich solubilizáciu. Oligo (dT) živica sa pridala do solubilizovaného materiálu a zmes sa jemne miešala. Následne sa Oligo (dT) živica premyla a potom PolyA⁺RNA sa eluovala elučným pufrom. Eluovaná PolyA⁺RNA sa vyzrážala etanolom a potom sa rozpustila v Tris-EDTA pufri. Koncentrácia získanej PolyA⁺RNA sa určila pomocou absorbancie pri vlnovej dĺžke 260 nm.

Dvojzávitnica cDNA sa syntetizovala použitím PolyA+RNA ako templátu podľa metódy reverznej transkriptázy M-MLV s použitím komerčne dostupného cDNA syntetického kitu (GIBCOBRL) a syntetického oligo DNA Notl-T (SEQ ID č: 1) ako priméru.

Jednovláknová cDNA sa syntetizovala v roztoku (asi 50 μΐ) obsahujúcom PolyA⁺RNA (asi 5 μg) čistenú od hybridómov ako templát, primér (asi 400 pmole) a M-MLV reverzná transkriptáza pri 37 °C jednu hodinu. Následne, dNTP, DNA polymeráza I, RNaseH, DNA ligáza, pufer a destilovaná voda sa pridali do reakčného roztoku (4 μΐ) a zmes sa inkubovala pri 16 °C dve hodiny na účely syntézy dvojvláknovej cDNA. Výsledná dvojvláknová cDNA sa extrahovala fenol/chloroformom a potom sa precipitovala etanolom.

Následne, EcoRI linker DNA (asi 300 pmol) a DNA ligáza (Ligation High; 33 μΐ; TOYOBO) sa pridali do roztoku obsahujúceho dvoj vláknovú cDNA v TE pufri (asi 50 μΐ) a zmes sa inkubovala pri 16 °C asi 80 minút na ligovanie cDNA s linkerom DNA. Linker DNA bol dvojvláknová DNA obsahujúca oligo DNA (20adp; SEQ ID č.: 2) a oligo DNA (24adp; SEQ ID č: 3), ktorá bola 5'-fosforylovaná a chladená v súlade s bežne používanou metódou.

DNA ligát sa extrahoval fenol/chloroformom a potom sa precipitoval etanolom. Následne sa DNA reaktant štiepil komerčne vhodným reštrikčným enzýmom Nôti (TOYOBO) a potom sa inkuboval komerčne vhodným ATP roztokom (GIBCO BRL) a T4 kinázou (TOYOBO) pri 37 °C počas 30 minút na účely fosforylácie 5' konca.

Výsledná DNA sa precipitovala etanolom a potom sa frakcionalizovala pomocou elektroferézy na polyakrylamidovom géli. Kúsok gélu obsahujúci DNA asi 500bp až 2000bp sa odrezal von. Rez gélu sa vykonal, kým DNA sfarbená etidium bromidom bola vizualizovaná pomocou žiarenia UV vo fotografickom zariadení.

Gélový rez sa rozdrvil a potom sa suspendoval v TE pufri. Suspenzia sa centrifugovala a získal sa výsledný supematant.

DNA sa ligovala na komerčne dostupný lambda fágový vektor /.EXcell (0,25 pg; Amersham Pharmacia) v prítomnosti komerčne dostupnej DNA ligázy (Ligation High; TOYBO) (pri 16 °C počas 30 minút). V nasledujúcom kroku sa DNA ligát zbalil do lambda fágu s využitím komerčne dostupného lambda fágového baliaceho kitu Gigapack III Gold (STRATAGENE) a výsledné fágové častice sa infikovali na E. coli NM522 ako hostiteľa na prípravu cDNA knižnice. Všetky manipulácie sa vykonávali v súlade s experimentálnym protokolom pripojeným ku kitu.

Následne, cDNA knižnica bola skrinovaná pomocou plakovej hybridizačnej metódy (Maniatis a kol., „Molecular Cloning: A Laboratory Manual, „Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) podľa nasledujúceho:

cDNA knižnica (1 x 10⁴ plakov) sa vložila na agarové platne a jej replikačné filtre sa pripravili s použitím membrán Hybond-N nylon (Amersham Pharmacia). Tieto replikačné filtre sa podrobili hybridizácii použitím vzoriek označených /²P-ATP v hybridizačnom pufri podľa plakovej hybridizačnej metódy. Použité vzorky boli H1GLC (SEQ ID č. 4) pre ľahký reťazec protilátky a NHCc2 (SEQ ID č: 5) pre ťažký reťazec protilátky. Izolácia jednotlivého plaku sa vykonala z pozitívnych klonov získaných v primárnom skríninku a v sekundárnom skríninku.

Každý ťažký reťazec a ľahký reťazec protilátky bol zosilnený PCR využívajúcou jediný PCR primér a Taq PCR kit (TAKARA) pomocou fágovej suspenzie z každého pozitívneho klonu ako temlátu DNA. Pár primérov používaný pre ľahký reťazec protilátky bol ExcellE (SEQ ID č: 6) a ckl 17 (SEQ ID č. 7) a pár primérov používaný pre ťažký reťazec protilátky bol ExcellE (SEQ ID č. 6) a NHCc2 (SEQ ID č. 5). Výsledné PCR produkty boli frakcionované podľa bežnej metódy s využitím elektroforézy na agarózovom géli. Kúsky gélu obsahujúce DNA asi 600 bp zodpovedajúce ťažkého reťazcu a ľahkému reťazcu sa odstrihli von. Nukleotidové sekvencie DNA čistenej z gélu sa analyzovali pomocou DNA Sekvenátora (373A; PE-Applied Biosystems), ABI PRISM sekvenčného softvéru (PE-Applied Biosystems) a ABI PRISM Auto Assembler (PE-Applied Biosystems). DNA z každého pozitívneho klonu bola overená, či má dostatočne dlhú nukleotidovú sekvenciu.

z.Fág z plaku každého pozitívneho klonu sa infikoval na E. coli NP66 na in-vivo excíziu plazmidu DNA nášho záujmu a výsledné filamentné fágy sa vložili na platne obsahujúce ampicilín na účely získania kolónie. Následne sa získal čistený plazmid DNA z kolónií pomocou bežne používanej metódy a E. coli JM109 sa transformovali plazmidmi. Potom sa transformované bunky preniesli na platne s výživovým agarom obsahujúce ampicilín na vytvorenie kolónií.

Následne, bakteriálna suspenzia v ampicilín obsahujúcom LB médiu získaná z každej kolónie sa preniesla na kvapalné výživové médium a baktérie boli kultivované pri 37 °C 24 hodín. Baktérie sa zbierali z kultúry a potom plazmid DNA sa čistil pomocou kitu čistiaceho plazmid (Quiagen). Každý z plazmidovej DNA sa štiepil reštrikčnými enzýmami EcoRI/NotI na potvrdenie prítomnosti vektora DNA a inzertnej DNA (ťažký reťazec cDNA alebo ľahký reťazec cDNA).

Každá nukleotidová sekvencia cDNA kódujúca ťažký reťazec a ľahký reťazec protilátky, ktorá je vložená do čisteného plazmidu, sa určila bežne používanou metódou s využitím DNA sekvenátora (377A; PE-Applied Biosystems) a ABI PRISM Auto Assembler (PE-aplikovaný biosystém) a ABI PRISM Auto Assembler (PE-aplikovaný biosystém).

Priméry používané na určenie sekvencie boli nasledujúce: (Priméry používané na určenie ťažkého reťazca cDNA)

M13R primér (SEQ ID č: 8; STRATAGENE), ExcellE (SEQ ID č: 6), 136H (SEQ ID č: 9), 138/9H (SEQ ID č: 10), AILIMHC1 (SEQ ID č: 11), HCcl (SEQ ID č: 12), NHCc2 (SEQ ID č: 5), HCc7 (SEQ ID č: 13), HCc8 (SEQ ID Č.T4), HCc3 (SEQ ID č: 15), HCc4 (SEQ ID č: 16), HCc6 (SEQ ID č: 17), H1GHC (SEQ ID č: 18), HCc9 (SEQ ID č: 19), HCc5 (SEQ ID č: 20) a polyA (SEQ ID č: 21).

(Priméry používané na určenie ľahkého reťazca DNA)

M13R primér (SEQ ID č: 8; STRATAGENE), ExcellE (SEQ ID č: 6), AIL1MHC1 (SEQ ID č: 22), AILIMLC2 (SEQ ID č: 23), LCcl (SEQ ID č: 24), ckl 17 (SEQ ID č: 7), H1GLC (SEQ ID č: 4), LCc2 (SEQ ID č: 25), HIK (SEQ ID č: 26) a polyA (SEQ ID č: 21).

Sekvenčná listina uvedená neskôr obsahuje cDNA sekvenciu kódujúcu ťažký reťazec a cDNA sekvenciu kódujúcu ľahký reťazec ľudskej monoklonálnej protilátky proti ľudskej AILIM, ktoré sú produkované každým hybridómom uvedeným skôr a tiež aminokyselinové sekvencie vyvodené z cDNA sekvencii.

Kloň AIH5D3 (JMab-136) (Ťažký reťazec)

DNA sekvencia: SEQ ID č: 27 (signálna sekvencia : počet nukleotidov 69 až 125, V oblasť: počet nukleotidov 126 až 419)

Aminokyselinová sekvencia: SEQ ID č: 28 (obsahujúca signálnu sekvenciu: počet aminokyselín 1 až 19, variabilná oblasť: počet aminokyselín 20 až 118) (Ľahký reťazec)

DNA sekvencia: SEQ ID č: 29 (signálna sekvencia : počet nukleotidov 39 až 104, V oblasť: počet nukleotidov 105 až 386)

Aminokyselinová sekvencia: SEQ ID č: 30 (obsahujúca signálnu sekvenciu: počet aminokyselín 1 až 22, variabilná oblasť: počet aminokyselín 23 až 116)

Kloň AII289 (JMab-138) (Ťažký reťazec)

DNA sekvencia: SEQ ID č: 31 (obsahujúca signálnu sekvenciu : počet nukleotidov 94 až 150, V oblasť: počet nukleotidov 151 až 441)

Aminokyselinová sekvencia: SEQ ID č: 32 (obsahujúca signálnu sekvenciu: počet aminokyselín 1 až 19, variabilná oblasť: počet aminokyselín 20 až 116) (Ľahký reťazec)

DNA sekvencia: SEQ ID č: 33 (obsahujúca signálnu sekvenciu : počet nukleotidov 28 až 87, V oblasť: počet nukleotidov 88 až 375)

Aminokyselinová sekvencia: SEQ ID č: 34 (obsahujúca signálnu sekvenciu: počet aminokyselín 1 až 20, variabilná oblasť: počet aminokyselín 21 až 116)

Kloň AII394 (JMab-139) (Ťažký reťazec)

DNA sekvencia: SEQ ID č: 35 (signálna sekvencia: počet nukleotidov 96 až 152, V oblasť: počet nukleotidov 153 až 443)

Aminokyselinová sekvencia: SEQ ID č: 36 (obsahujúca signálnu sekvenciu: počet aminokyselín 1 až 19, variabilná oblasť: počet aminokyselín 20 až 116) (Ľahký reťazec)

DNA sekvencia: SEQ ID č: 37 (signálna sekvencia : počet nukleotidov 33 až 92, V oblasť: počet nukleotidov 93 až 380)

Aminokyselinová sekvencia: SEQ ID č: 38 (obsahujúca signálnu sekvenciu: počet aminokyselín 1 až 20, variabilná oblasť: počet aminokyselín 21 až 116)

Použitím analytického softvéru pre génovú sekvenciu bola vyhľadaná knižnica V BASE sekvencie pre variabilné oblasti génov ľudského imunoglobulínu konštruovaná Tomlinsonom a kol. (Immunol. Today, Vol. 16, No. 5, p. 237-242, 1995) pre každú z DNA sekvencií určených v tomto texte.

Výsledok dokazuje, že gény V oblasti vhodného ťažkého reťazca a ľahkého reťazca uvedených ľudských monoklonálnych protilátok obsahujú nasledujúce segmenty.

(Ťažký reťazec génu V-oblasti) kloň AIH5D3 (JMab-136): 1-02 kloň AII289 (JMab-138): 3-13 kloň AII394 (JMab-139): 3-13 (Ľahký reťazec génu V-oblasti) kloň AIH5D3 (JMab-136): L5 kloň AII289 (JMab-138): A27 kloň AII394 (JMab-139): A27

Príklad 11

Inhibičný účinok ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky na hypersenzitivitu pomalého typu (DTH)

Biologický systém imunitnej odpovede, funkcia ktorého je eliminovaná škodlivými antigénmi (patogénové mikroorganizmy také ako vírusy, baktérie a parazity, cudzie telesá atď.) na žijúce organizmy a môže byť rozdelený na vrodenú imunitu a získanú imunitu.

Prvý z menovaných je systém eliminácie založený na nešpecifickom rozpoznaní, ktoré zahrnuje fagocytózu pomocou fagocytov (polymorfojadrový leukocyt, monocyt, makrofág atď.), a tak pomocou buniek prirodzených zabíjačov (N K) a opsonizáciu antigénu pomocou komplementu, atď.

Druhý z menovaných, získaná imunitná odpoveď, je systém eliminácie pomocou lymfocytov (hlavne T bunky a B bunky), ktorý vyžaduje špecificitu (aktiváciu) na antigén.

Ďalej, získaná imunitná odpoveď môže byť rozdelená na bunkovú imunitu a humorálnu imunitu.

Na rozdiel od humorálnej imunity závislej od protilátky, bunková imunita je imunitná odpoveď vyjadrená vo všeobecnosti pomocou priameho účinku T bunky na antigén ako cieľ. Bunková imunita je zahrnutá v imunitnej odpovedi na vírus alebo tumor, imunitnej odpovedi vyvolanej po transplantácii tkaniva alebo orgánu, precitlivelosť na určité lieky a pri niektorých autoimunitných ochoreniach.

Najtypickejší fenomén patriaci do bunkovej imunity je dobre známa tuberkulínová alergia (alebo tuberkulínová hypersenzibilita). Tuberkulínová alergia je pomalá alergia aktivovaná infekciou tubercle bacillus. Alergia je spôsobená infekciou tubercle bacillus a môže byť vyvolaná podkožnou injekciou tuberkulínového proteínu produkovaného v kultivačnom supematane tubercle bacillus do žijúceho organizmu.

Oneskorená alergia je alergia sprostredkovaná T bunkou (pamäťová T bunka memorujúca antigén) senzitivizovanou antigénom. Alergia je nazývaná „oneskoreného typu“, pretože senzitivizácia trvá 24 až 48 hodín a až potom sa prejaví alergická odpoveď so zápalom vyvolaným pamäťovými T bunkami, ak sú v kontakte s antigénom.

Fenomén tuberkulínovej alergie, ktorá je reprezentatívna oneskorená alergia, má využitie pri „tuberkulínovom teste“ na diagnostikovanie či senzitivizácia pomocou infekcie tubercle bacillus bola už prítomná v organizme alebo nie. Konkrétne je test vedený nasledovne: čistený tuberkulín (čistený proteínový derivát; PPD; 0,1 ml derivátu 0,05 pg/0,1 ml (2,5TU) na všeobecné diagnostické použitie), ktorý je tuberkulínový proteín čistený z kultúry tubercle bacillus, je podkožné podávaný živočíchovi; začervenanie je merané po 48 hodinách po injekcii a prítomnosť infekcie tubercle bacillus môže byť diagnostikovaná na základe veľkosti začervenania. Ak je priemer začervenania menší ako 4 mm, potom subjekt je negatívny; ak je priemer v intervale 4-9 mm, potom subjekt je chybne pozitívny a ak je priemer 10 mm alebo viac, potom je subjekt rozhodne pozitívny.

Oneskorené alergie spojené s bunkovou imunitou zahrnujú napríklad hypersenzitivitu typu Jones-Mote prechodne vyvolanú malým množstvom proteínu alebo podobne, kontaktnú alergiu na liečivá také ako pikryl chlorid alebo rastlinné toxíny také ako Japonský lak alebo alergiu spojenú s reakciou na transplantát (napr. alogénovú reakciu na transplantát), alergiu na antigén z infekčného patogénu takého ako tuberkulínová alergia spôsobená tubercle bacillus, ako je uvedené skôr. V tomto teste inhibičný účinok anti-AILIM protilátky na hypersenzitivitu oneskoreného typu (oneskorenú alergiu) bol vyhodnotený pomocou spomínaného tuberkulínového testu. Test pod vedený nasledovne:

Každý z makakov (samce, hmotnosť 6 - 8,5 kg, Environmental Biological Life Science Research Center Inc., 3 jedince v každej skupine), ktoré boli senzitivizované s BCG (Bacille de Calmette et Guerin), ktorý je zoslabená žijúca baktéria tubercle bacillus hovädzieho typu, bol uvedený do anestézy ketamín hydrochloridom (10 mg/kg, intramuskuláma injekcia) a potom akákoľvek z testovacích vzoriek uvedených neskôr sa podkožné podala v množstve 0,1 ml do každého injekčného miesta (6 injekcií miesta/jedinec) v hrudí. Rozdiel medzi injekčnými miestami vzorky bol 3 cm alebo dlhší.

(1) 1:1 zmiešaný roztok ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky (JMab-136; 0,2 mg; 10 pg v každom injekčnom mieste) a tuberkulín (4 pg/l ml fyziologického roztoku);

(2) 1 : 1 zmiešaný roztok ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky (JMab-136; 2 mg; 100 pg do každého injekčného miesta) a tuberkulín (4 pg/l ml fyziologický roztok);

(3) fosfátový pufer (PBS (-)) ako kontrola;

(4) 1 : 1 zmiešaný roztok komerčne dostupného steroidálneho anti-zápalového činidla, Prednizolón (0,2 mg; 10 pg do každého injekčného miesta) a tuberkulín (4 pg/l ml fyziologického roztoku) ako pozitívna kontrola;

(5) 1 : 1 zmiešaný roztok ľudskej anti-KLH monoklonálnej protilátky (príklad (2-2); 0,2 mg; 10 pg do každého injekčného miesta) a tuberkulín (4pg/l ml fyziologického roztoku) ako negatívna kontrola.

Deň po injekcii každej vzorky sa najväčší a najmenší priemer začervenania v každom injekčnom mieste meral na určenie plochy začervenania.

Výsledky sú znázornené na obrázku 72.

Výsledok potvrdzuje, že začervenanie spôsobené oneskorenou alergiou sa výrazne prejaví v ktorejkoľvek zo skupín podrobenej injekcii anti-AILIM protilátok v porovnaní s kontrolnými a negatívnymi kontrolnými skupinami. Inhibičný účinok bol porovnateľný, ak bolo použité steroidné protizápalové liečivo ako pozitívna kontrola.

Príklad 12

Analýza na expresiu AILIM v rôznych tkanivách pacientov s ochorením hostiteľ versus transplantát (GVHD)

Expresia AILIM v rôznych tkanivách získaných biopsiou z pacientov, ktorí boli vystavení transplantácii alogénovým štepom z donorov a z pacientov, ktorým bolo klinicky diagnostikované akútne alebo chronické ochorenie hostiteľ versus transplantát (GVHD) po transplantácii sa analyzovala bežne používanou metódou. Tkanivá boli sfarbené s HE a ľudskou anti-ľudskou AILIM monoklonálnou protilátkou (JMab-36) pripravenou v príklade uvedenom skôr.

Analýza sa vykonávala s použitím 33 vzoriek z rôznych tkanív získaných z akútnych GVHD pacientov (28 prípadov) a tiež 5 vzoriek z chronických GVHD pacientov (5 prípadov).

Výsledky boli nasledujúce: AILIM-pozitívna reakcia bola dokázaná v 15 z 29 vzoriek kožného tkaniva; v 1 z 3 vzoriek žalúdočného tkaniva a v 1 až 1 vzorky z tkaniva hrubého čreva; ktoré boli všetky získané z akútnych GVHD pacientov. AILIM-pozitívna reakcia bola dokázaná v 1 z 3 vzoriek kožného tkaniva; v 2 z 2 vzoriek žalúdočného tkaniva; ktoré boli všetky získané z chronických GVHD pacientov. Ďalej, AILIM-pozitívna reakcia bola dokázaná v 10 z 13 vzoriek, v ktorých bola pozorovaná lymfocytová infdtrácia.

Príklad 13

Účinok ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky na prenos kostimulačného signálu v T bunke opice.

Experiment vedený v príklade 7 mal demonštrovať, že ľudské anti-ľudské AILIM monoklonálne protilátky podľa vynálezu sú schopné zvýšiť proliferáciu ľudských T buniek prostredníctvom kontroly odpovede ľudskej T bunky, konkrétne kontroly prenosu kostimulačného signálu sprostredkovaného AILIM na bunku.

V tomto teste bolo analyzované, či ľudské monoklonálne protilátky prejavujú účinnosť pri zvýšení bunkovej proliferácie opičích T buniek pomocou tej istej metódy, ako je opísaná v príklade 7 alebo nie.

(13-1) Zriedenie protilátky

Anti-ľudská CD3 monoklonálna protilátka SP34 (BD-Pharmingen) bola zriedená fosfátovým pufrom (PBS) na konečnú koncentráciu 1 pg/ml.

Pripravená ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka JMAbl36 sa zriedila s PBS na konečnú koncentráciu 40 pg/ml. Roztoky protilátky sa ďalej zriedili s PBS na prípravu rôznych koncentrácií protilátok (40 pg/ml - 0,064 pg/ml).

(13-2) Prekrytie mikroplatne protilátkou

Každá jamka 96 jamkových mikroplatní sa prekryla anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou SP34 (1 pg/ml; 25 pl do každej jamky) a ľudskou anti-ľudskou AILIM monoklonálnou protilátkou JMabl36 (40 pg/ml - 0,064 pg/ml; 25 pl do každej jamky). Platne sa inkubovali pri 37 °C dve hodiny. Následne roztoky protilátky sa odložili a každá jamka sa premyla trikrát PBS. Po premytí, RPMI1640 médium obsahujúce 10 % FCS sa pridalo do každej jamky (100 pl/jamku) a platne sa inkubovali pri 37 °C jednu hodinu. Vhodné jamky platní sa prekryli protilátkami uvedenými skôr.

Kontrolné experimenty sa vykonávali tým istým spôsobom s použitím platní prekrytej ľudskou anti-KLH monoklonálnou protilátkou (JMab23; pozri predchádzajúci príklad) ako kontrolnými protilátkami namiesto ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky.

Mikroplatne prekryté protilátkami boli používané v nasledujúcich testoch.

(13-3) Príprava suspenzie opičích T buniek

Periférna krv sa zachytávala z makakov a monojadrové bunky sa frakcionalizovali centrifugáciou v hustotnom gradiente s využitím NycoPrepl ,077A (Nycomed). V súlade s experimentálnym manuálom sa opičie T bunky separovali z monojadrových buniek makakov s využitím anti-ľudskej CD4 protilátky M-T477 (BD-Pharmingen), anti-ľudskej CD28 protilátky RPA-T8 (BD-Pharmingen), anti-myšej IgG mikrokvapky (Miltenyi) a magnetického deliča. Počet T buniek sa určil s použitím hemacytometra. Opičie T bunky sa suspendovali v RPMI1640 médiu obsahujúcom 10 % FCS. Pripravila sa teda suspenzia opičích T buniek (1 x 10⁶ buniek/ml).

(13-4) Bunková kultúra (1) Kultúra využívajúca mikroplatňu prekrytú anti-ľudskou CD3 protilátkou a anti-ľudskou AILIM protilátkou

Suspenzia opičích T buniek sa pridala do každej jamky mikroplatne prekrytej protilátkou uvedenou skôr a platňa sa inkubovala pri 37 °C dva dni v CO₂ inkubátore.

Potom sa kultivácia ukončila a vhodné mikroplatne sa použili v nasledujúcich testoch:

(13-5) Určenie proliferačnej aktivity T bunky

Metyl (³H) tymidín (0,5 pCi/jamku; Amersham-Pharmacia) sa pridal do každej jamky platní po inkubácii a platne sa inkubovali pri 37 °C šesť hodín v CO₂ inkubátore.

Po inkubácii sa bunky zachytili na GF/C filtroch (Packard) s využitím bunkového zberača. Následne sa filtre vysušili pri 40 °C tri hodiny alebo dlhšie a potom sa pridal Microscinti 0 (20 μΐ/jamku; Packard). Reaktivita ³H začleneného do buniek zachytených na filtroch bola meraná pomocou β-počítača (TOP COUNT) na analýzu stupňa bunkovej proliferácie T buniek po kultivácii.

Výsledok je znázornený na obrázku 73.

Výsledok tohto testu potvrdzuje, že opičie T bunky boli v podstate proliverované v závislosti od koncentrácie buniek, ak mikroplatne boli prekryté anti-ľudskou AILIM monoklonálnou protilátkou (ľudská monoklonálna protilátka alebo myšia monoklonálna protilátka) spoločne s anti-ľudskou CD3 protilátkou.

Výsledok tiež potvrdzuje, že ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka podľa vynálezu môže byť viazaná na opičiu AILIM a má účinok pri regulácii funkcie opičej AILIM.

Príklad 14

Ustanovenie metódy na indentifikáciu a kvantifikáciu látok schopných väzby na AILIM alebo AILIM ligand

Metóda ELISA (Enzým-viazaný test s imuno roztokom) sa ustanovila na identifikáciu alebo kvantifikáciu látky schopnej sa viazať na AILIM (ICOS) alebo AILIM ligand (B7h/B7RPl/GL50/LlCOS).

Princíp opísanej metódy je založený na odhadnutí, pomocou ELISA, stupňa inhibície väzby medzi rozpustnou AILIM (hAILIM-IgFc) a rozpustným AILIM ligandom (hB7h-IgFc) spôsobenej látkou.

(14-1) Vzorka

Boli použité nasledujúce vzorky:

(1) Streptavidín-HRP (Southern Biotechnology Associates, Inc.).

(2) Rozpustný ľudský AILIM ligand (fúzny proteín medzi extracelulámou oblasťou ľudskej B7h a konštantnou oblasťou ľudskej IgG 1).

Proteín sa pripravil opísanou metódou v (14-2);

(3) rozpustná AILIM-IgFc označená biotínom

AILIM-IgFc bola pripravená ďalším čistením antigénu získaného podľa tej istej metódy, ako je opísaná v skorších prihláškach (JP-A 11-29599 (príklad 16 (2)) a WO 98/38216 (príklad 16 (2))) pôvodcom pánom Tezuka.

(4) Ľudská anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka (JMab-136; opísaná skôr).

(5) Ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka (negatívna kontrolná protilátka; JMab-23; opísaná skôr).

(6) Fosfátový pufer (PBS (-); Nikken Seibutsu).

(7) PRMI1640 médium (Nikken Seibutsu).

(8) Teľacie sérum (FCS; JRH-Bioscience).

(9) 30 % hovädzie sérum (BSA; Sigma).

(10) Tween20 (BioRad).

(11) TMB⁺ substrátový chromogén (Dáko).

(14-2) Príprava rozpustného ľudského AILIM ligandu (fúzny proteín (hB7h-IgFc) extracelulárnej oblasti ľudského B7h a konštantnej oblasti ľudského IgGl)

Celková RNA sa pripravila z monojadrových buniek získaných z periférnej krvi uvedeným spôsobom. cDNA sa syntetizovala zo získanej celkovej RNA (5 pg) ako templát použitím „Superscript Preamplification System“ pre syntézu cDNA (GIBCO-BRL).

Následne 5’ primér (5-GAGGTCTCCGCCCTCGAGATGCGGCTGGGCAGTCC-3', SEQ ID č: 39) majúci Xhol reštrikčné miesto a 3’ primér (5’-CACAGGACAGCCAGGGGATCCCACGTGGCCGCG-3', SEQ ID č: 40) majúci BamHI reštrikčné miesto pri ich vhodných koncoch označených a syntetizovaných na zosilnenie cDNA kódujúcej extracelulámu oblasť ľudského AILIM ligandu (hB7h) pomocou PCR. Použitím cDNA ako templátu a primérového páru sa uskutočnila PCR na prípravu DNA majúcej Xhol a BamHI pri vhodných koncoch obsahujúcich cDNA kódujúcich extracelulámu oblasť ľudského B7h. Výsledné PCR produkty boli štiepené s Xhol a BamHI a frakcionizované pomocou elektroforézy na agarózovom géli na účely izolácie pásu zodpovedajúceho asi 720 bp cDNA fragmentu, ktorý bol určený na kódovanie extracelulárnej oblasti. Izolovaný cDNA fragment sa subklonoval do plazmidu pBluescript II SK (+) (Stratagene) predštiepeného s Xhol a BamHI. Dokázalo sa, že cDNA fragment obsahoval časť kódujúcu extracelulámu oblasť ľudského B7h pomocou sekvenčnej analýzy s využitím automatizovaného fluórometríckého DNA sekvenátora (Applied Biosystems = aplikované biosystémy).

Na druhej strane, DNA kódujúca Fc ľudského IgGl ako fúzneho partnera bola pripravená ako BamHIXbal DNA fragment (asi 1,3kb) pomocou štiepenia plazmidu (pozri, Celí, Vol. 61, p. 1303-1313, 1990; pripraveného podľa Dr. Seed a kol., pri Massachusetts General Hospital) s BamHI a Xbal. Tento fragment obsahoval exóny kódujúce závesné oblasti ľudského IgGl, Cyl3.

Xhol-BamHI fragment kódujúci extracelulámu oblasť ľudského B7h (hB7h) a BamHI-Xbal fragment obsahujúci exóny kódujúce Fc (označované ako „IgFc“) ľudského IgGl pripraveného, ako je opísané, boli subklonované do plazmidu pBluescript II SK (+) (Stratagene) predštiepeného s Xhol a Xbal.

Plazmid sa štiepil s Xhol a Xbal na prípravu DNA fragmentu asi 1,8 kb obsahujúceho fúznu DNA medzi extracelulámou oblasťou ľudského B7h a ľudského IgFc. Použitím T4 DNA ligázy, tento fúzny DNA fragment sa vložil do vektora expresie pME18S (Medical Immunology, Vol. 20, No. 1, p. 27-32, 1990 a „Handbook for Genetic Engineering, „Experimental Medicíne, doplnok, Yodosha, pp. 101-07, 1992) medzi Xhol a Xbal miest na účely vytvorenia plazmidu phB7h-IgFc.

Monovrstvové COS7 bunky (ATCC CRL-1651) kultivované subkofluované v DMEM médiu obsahujúcom 10 % teľacie sérum a ampicilín sa transformovali plazmidom phB7h-IgFc pomocou elektroporácie za vzniku transformovaných buniek.

Transformované bunky sa ponechali na expresiu hB7h-IgFc pomocou ich kultivácie v ASF104 médiu bez séra počas 72 hodín.

HB7h-lgFc sa čistil použitím afinitnej kolóny s proteínom G (Amersham Pharmacia) podľa nasledujúceho:

Uvedený kultivačný supematant sa centrifugoval na získanie centrifúgovaného supematantu. Výsledný supematant sa vložil na afinitnú kolónu s proteínom G ekvilibrovanú väzbovým pufrom. Kolóna sa premyla väzbovým pufrom a potom sa eluovala na vykonanie elučného pufra. Eluovaný roztok sa regeneroval a potom sa dialyzoval proti fosfátovému pufru. Dialyzovaný pufer sa vymenil dvakrát alebo viac. Teda sa získal čistený hB7h-IgFc.

(14-3) Zriedená protilátka a rozpustná ľudská AILIM (hAILIM-IgFc) a ich reakcia

Originálne roztoky (20 pg/ml) anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky (JMab-136) a ľudskej anti-KLH monoklonálnej protilátky (JMab-23) ako negatívnej kontrolnej protilátky sa zriedili v sériách 11 hladín a každá vzorka (200 μΐ) sa spojila a zmiešala s 200 μΐ RPMI1640 média obsahujúceho 10 % FCS. Pripravili sa roztoky s rôznymi koncentráciami protilátky. hAILIM- IgFc označený biotínom (2 μΙ/skúmavku; konečná koncentrácia 1 pg/ml) sa pridal do každého z pripravených roztokov s rôznymi koncentráciami. Výsledné roztoky sa zmiešali a inkubovali pri izbovej teplote 30 minút.

(14-4) Test na účinnosť anti-AILIM monoklonálnej protilátky na inhibovanie väzby medzi hAILIM-IgFc a hB7h-IgFc hB7h-IgFc sa pridala do každej jamky 96 jamkovej mikroplatne (50 (μΐ/jamku (800 ng/jamku)). Platňa sa uzavrela a potom sa inkubovala pri 37 °C jednu hodinu. Roztok sa odstránil z každej jamky a jamky sa premyli trikrát s PBS (120 μΐ). Potom sa pridal PBS obsahujúci 0,5 % BSA (100 μΐ/jamku) do každej jamky na blokovanie nereaktívnych miest. Platňa sa uzavrela a inkubovala pri 37 °C jednu hodinu. Po inkubácii sa roztok odstránil a potom sa jamky premyli trikrát s PBS (120 μΐ). Každá vzorka (50 μΐ/jamku) pripravená v (14-3) sa pridala do jamiek. Platňa sa uzavrela a inkubovala pri 37 °C jednu hodinu. Roztok sa odstránil z každej jamky. Jamky sa premyli trikrát s RPMI1640 médiom obsahujúcim 10 % FCS (120 μΐ) zohriatym na 37 °C. PBS obsahujúci 3,7 % formalínu (100 μΐ/jamku) sa pridal do každej jamky a platňa sa inkubovala na ľade päť minút. Roztok sa odstránil z každej jamky a jamky sa premyli trikrát s 0,1 % Tween20 (120 μΐ). Potom sa pridal Streptavidín-HRP (50 μΐ/jamku) do každej jamky. Platňa sa uzavrela a inkubovala pri izbovej teplote 30 minút. Roztok sa odstránil z každej jamky a platňa sa premyla trikrát s PBS obsahujúcim 0,1 % Tween20 (120 μΐ). Následne sa pridal TMB’ substrátový chromogén (50 μΐ/jamku) do každej jamky a platňa sa inkubovala pri izbovej teplote 20 minút. Potom sa pridala 2N kyselina sírová (50 μΐ/jamku) do každej jamky na zastavenie reakcie. Absorbancia každej jamky sa merala pri vlnovej dĺžke 450 nm pomocou THERMO max (Molekulárne zariadenia).

Výsledky sú znázornené na obrázkoch 74 až 76.

Výsledky potvrdzujú, že anti-AILIM protilátka má účinnosť pri inhibícii väzby medzi hAILIM-IgFc a hB7h-IgFc v spôsobe závislom od dávky.

Tento príklad potvrdzuje, že testovací systém znázornený predkladanou metódou môže byť použitý na skrinovanie a identifikovanie látok schopných väzby na ILIM alebo AILIM ligand (napríklad, protilátka alebo syntetická zlúčenina s nízkou molekulovou váhou).

Príklad 15

Účinnosť ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky na inhibíciu proliferácie ľudskej T bunky spojenej s prenosom kostimulačného signálu sprostredkovaného AILIM-AILIM ligandom

Analyzovalo sa, či anti-ľudská AILIM monokonálna protilátka podľa vynálezu mala regulačný účinok na prenos signálu sprostredkovaný AILIM na povrchu ľudskej T bunky, na základe merania inhibičného účinku ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky na bunkovú proliferáciu vyvolanú kontaktovaním ľudskej T bunky s AILIM ligandom (B7h/B7RP 1/GL50/LICOS).

(15-1) Zriedenie protilátky

Anti-ľudská CD3 monoklonálna protilátka OKT3 (ATCC CRL-8001) sa zriedila fosfátovým pufrom (PBS) na konečnú koncentráciu 8 pg/ml.

Rozpustný ľudský AILIM ligand (hB7h-IgFc) pripravený skôr sa zriedil s PBS na konečnú koncentráciu 40 pg/ml. Roztoky protilátky sa ďalej zriedili s PBS na prípravu rôznych koncentrácií protilátok (40 pg/ml 0,064 pg/ml).

(15-2) Prekrytie mikroplatne protilátky

Každá jamka z 96 jamkových mikroplatní sa prekryla s (1) anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou OKT3 (8 pg/ml; 25 μΐ v každej jamke) a hB7h- IgFc (40 pg/ml - 0,064 pg/ml; 25 μΐ v každej jamke). Platne sa inkubovali pri 37 °C dve hodiny. Následne sa roztoky protilátky odložili a každá jamka a premyla trikrát s PBS. Po premytí sa pridalo RPMI 1640 médiu obsahujúce 10 % FCS do každej jamky (100 μΐ/jamku) a platne sa inkubovali pri 37 °C, počas jednej hodiny. Teda vhodné jamky platní boli prekryté.

(15-3) Príprava suspenzie ľudských T buniek

Periférna krv sa zachytávala z normálnych zdravých jedincov a monojadrové bunky sa frakcionalizovali centrifugáciou v hustotnom gradiente s použitím LymphoPrep (Nycomed). Podľa experimentálneho manuálu sa ľudské T bunky oddelili z ľudských monojadrových buniek s použitím izolačného kitu (Pan-t celí Isolation kit; Miltenyl) a magnetického triediča. Počet T buniek sa určil použitím hemacytometra. Ľudské T bunky sa suspendovali v RPMI1640 médiu obsahujúcom 10 % FCS doplnené s ľudskou anti-ľudskou AILIM monoklonálnou protilátkou JMab-136 (20 pg/ml). Pripravila sa suspenzia ľudských T buniek (1 x 10^ô buniek/ml) a inkubovala sa pri izbovej teplote 30 minút.

Ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka JMab23 (20 pg/ml) bola používaná ako negatívna kontrolná protilátka.

(15-4) Bunková kultúra

Tým istým spôsobom, ako je opísané, ľudská T bunková suspenzia (100 μΐ/jamku; 1 x 10⁵ buniek/jamku) sa pridala do každej jamky mikroplatne prekrytej s anti-ľudskou CD3 protilátkou a hB7h-IgFc a platňa sa inkubovala pri 37 °C tri dni v CO₂ inkubátore.

(15-5) Určenie proliferačnej aktivity T bunky

Do každej jamky sa pridal metyl (³H) tymidín (0,5 pCi/jamku; Amersham-Pharmacia) po kultivácii a platne sa inkubovali pri 37 °C šesť hodín v CO₂ inkubátore. Po inkubácii sa bunky zachytili na GF/C filtroch (Packard) s využitím bunkového zberača. Následne sa filtre vysušili pri 40 °C počas troch hodín alebo dlhšie a potom sa k nim pridal Microscinti 0 (20 μΐ/jamku; Packard). Rádioaktivita začleneného trícia v zachytených bunkách na filtri sa merala pomocou β-počítača (TOP COUNT) na analýzu stupňa bunkovej proliferácie T bunky po kultivácii.

Výsledok je znázornený v obrázkoch 77.

Výsledok získaný v tomto teste potvrdil, že ľudské T bunky rástli v závislosti od koncentrácie ľudskej B7h-IgFc (teste využívajúcom negatívnu kontrolnú protilátku). Ďalej sa potvrdilo, že anti-ľudské AILIM monoklonálne protilátky inhibujú proliferáciu ľudských T buniek.

Príklad 16

Účinok ľudskej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky na inhibíciu proliferácie opičej T bunky spojenej s prenosom kostimulačného signálu sprostredkovaným AILIM-AILIM ligandom

Ten istý test sa realizoval, ale s použitím opičích T buniek namiesto ľudských T buniek používaných v príklade 15.

(16-1) Zriedenie protilátky

Anti-ľudská CD3 monoklonálna protilátka SP34 (BD-Pharmingen) sa zriedila fosfátovým pufrom (PBS) na konečnú koncentráciu 1 pg/ml.

Ľudská B7h-IgFc pripravená skôr sa zriedila s PBS na konečnú koncentráciu 40 pg/ml. Roztok protilátky sa ďalej zriedil s PBS na prípravu rôznych koncentrácií protilátky (40 pg/ml - 0,0064 pg/ml).

(16-2) Prekrytie mikroplatne protilátkou

Každá jamka z 96 jamkových mikroplatni sa premyla s (1) anti-ľudskou CD3 monoklonálnou protilátkou SP34 (BD-Pharmingen) (1 pg/ml; 25 pl v každej jamke a ľudskou B7h-IgFc (40 pg/ml - 0,0064 pg/ml; 25 pl v každej jamke). Platne boli inkubované pri 37 °C dve hodiny. Následne sa roztok protilátky odložil a každá jamka sa premyla trikrát s PBS. Po premytí, RPMI1640 médium obsahujúce 10 % FCS sa pridalo do každej jamky (100 pl/jamku) a platne sa inkubovali pri 37 °C jednu hodinu. Teda vhodné jamky platní sa prekryli protilátkou.

(16-3) Príprava suspenzie opičích T buniek

Periférna krv sa zachytávala z makakov. Frakcia obsahujúca monojadrové bunky sa pripravila centrifugáciou v hustotnom gradiente s využitím NycoPrepl ,077A (Nycomed). Podľa experimentálneho manuálu sa separovali opičie T bunky monojadrových buniek s použitím anti-ľudskej CD4 protilátky M-T477 (BD-Pharmingen), anti-ľudskej CD8 protilátky RPA-T8 (BD-Pharmingen), anti-myšej IgG mikrokvapky (Miltenyi) a magnetického triediča. Počet T buniek sa určil použitím hemacytometra. Opičie T bunky sa suspendovali v RPMI1640 médiu obsahujúcom ľudskú anti-ľudskú AILIM monoklonálnu protilátku JMab-136 (20 pg/ml) a 10 % FCS na prípravu suspenzie opičích T buniek (1 x 10⁶ buniek/ml). Suspenzia sa inkubovala pri izbovej teplote 30 minút.

Ľudská anti-KLH monoklonálna protilátka JMab-23 (20 pg/ml) sa použila ako negatívna kontrolná protilátka.

(16-4) Bunková kultúra

Tým istým spôsobom, ako je opísané, sa suspenzia opičích T buniek (100 μΐ/jamku; 1 x 10⁵ buniek/jamku) pridala do každej jamky mikroplatne prekrytej anti-ľudskou CD3 protilátkou a hB7h-IgFc a platňa sa inkubovala pri 37 °C počas troch dní v CO₂ inkubátore.

(16-5) Určenie aktivity T bunkovej proliferácie

Metyl (³H) tymidín (0,5 pCi/jamku; Amersham Pharmacia) sa pridal do každej jamky platní po kultivácii a platne sa inkubovali pri 37 °C šesť hodín v CO₂ inkubátore. Po inkubácii sa bunky zachytili na GF/C filtroch (Packard) s použitím bunkového zberača. Následne sa filtre vysušili pri 40 °C za tri hodiny alebo dlhšie a potom sa pridal Microscinti 0 (20 μΐ/jamku; Packard). Rádioaktivita začleneného trícia do buniek zachytených na filtroch bola meraná pomocou P-počítača (TOP COUNT) na analyzovanie stupňa T bunkovej proliferácie po kultivácii. Výsledok je uvedený v obrázku 78.

Výsledok získaný v tomto teste potvrdil, že opičie T bunky rástli v závislosti od koncentrácie ľudskej B7h-lgFc (v teste s využitím negatívnej kontrolnej protilátky). Ďalej sa potvrdilo, že anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka inhibovala proliferáciu opičích T buniek.

Priemyselná využiteľnosť

Ľudské monoklonálne protilátky podľa vynálezu schopné väzby na ľudskú AILIM sú ľudského pôvodu a preto tieto protilátky nevyvolávajú vážnu imunitnú rejekciu spôsobenú antigenicitou ku človeku, napr. HAMA (ľudskú anti-myšiu antigenicitu) v hostiteľovi, ktorá bola vážnym terapeutickým problémom (vedľajší účinok) pri farmaceutických prípravkoch s protilátkou obsahujúcich ne-ľudské protilátky získané z cicavcov, také ako protilátky získané z myší. Protilátka podľa vynálezu má teda veľkú hodnotu ako farmaceutická protilátka.

Teda, ľudská monoklonálna protilátka podľa vynálezu proti AILIM (najmä ľudskej AILIM) a farmaceutické kompozície obsahujúce ľudskú monoklonálnu protilátku nevyvolávajú hostiteľskú imunitnú rejekciu spôsobenú HAMA; a teda môžu byť používané ako farmaceutické prostriedky schopné kontrolovania rôznych biologických reakcií (napr. proliferácia buniek exprimujúcich AILIM, tvorba cytokínu pomocou buniek exprimujúcich AILIM, imuno cytolýza alebo zánik (apoptóza) buniek exprimujúcich AILIM a aktivita vyvolávajúca poškodenie buniek exprimujúcich AILIM závislé od protilátky) spojených s prenosom kostimulačného signálu sprostredkovaného AILIM (sekundárny signál) na bunky exprimujúce AILIM; a/alebo môžu byť používané na liečbu alebo prevenciu rôznych ochorení spojených s prenosom signálu sprostredkovaným AILIM, kontrolovaním a inhibíciou začiatku a/alebo progresu ochorení.

Konkrétne, poskytnutím farmaceutických prípravkov obsahujúcich ľudskú anti-AILIM monoklonálnu protilátku podľa vynálezu alebo jej časť ako aktívnu zložku, je možné inhibovať alebo liečiť a predchádzať, napríklad, rôznym ochoreniam (napr. reumatoidnej artritíde, skleróze multiplex, autoimunitnej tyroiditíde, alergickej kontaktnej dermatitíde, plochému lišaju ako chronickému zápalovému ochoreniu kože, systémovému lupus erytematosus, cukrovke závislej od inzulínu a psoriáze atď.) zatriedeným medzi autoimunitné ochorenia alebo alergické ochorenia (konkrétne autoimunitné ochorenia a oneskorené alergie bunkovej imunity); artropatie (napr. reumatoidná artritída (RA), osteoartritída (OA)), zápaly (napr. hepatitída); reakciu hostiteľ versus transplantát (GVH reakcia); ochorenie hostiteľ versus transplantát (ochorenie hostiteľ versus transplantát; GVHD); imunitnú rejekciu spojenú s transplantáciou (alogénový štep alebo heterogénny štep) tkanív (tkanív takých ako koža, rohovka a kosť) alebo orgánov (pečeň, srdce, pľúca, oblička, pankreas atď.); imunitnú reakciu na cudzí anigén alebo vlastný antigén (napríklad tvorba protilátky proti antigénu, bunková proliferácia, tvorba cytokínu atď.); ochorenia, ktoré sú potencionálne spôsobené abnormalitou v črevnej imunite (konkrétne zápalové črevné ochorenia (najmä Crohnove ochorenie a ulceratívna kolitída); alimentáme alergie atď.

Farmaceutické kompozície podľa predkladaného vynálezu umožňujú liečiť alebo predchádzať niektorým zápalom, pri ktorých sú používané rôzne steroidné liečivá ako anti-zápalové liečivá, napríklad zápalom spojeným s rôznymi artritídami (reumatoidná artritída, osteoartritída atď.), pneumónia, hepatitída (zahrnujúca vírusovú hepatitídu), zápalom spojených s infekciami, zápalovým črevným ochorením, enteritíde, nefritíde (glomeruláma nefŕitída, zápal spojený s obličkovou fibrózou, gastritída, vaskulitída, pankreatída, peritonitída, bronchitída, myokarditída, encefalitída, zápal spojený s reperfúznym ischemickým poškodením (myokardové ischemické reperfúzne poškodenie atď.), zápalom spojeným s imunitnou rejekciou po transplantácii tkanív alebo orgánov, oparenina, rôzne kožné zápaly (psoriáza, alergická kontaktná dermatitída, plochý lišaj ako chronické zápalové kožné ochorenia), zápal spojený s mnohonásobným poškodením orgánu, zápal po operácii PTCA alebo PTCR a zápal spojený s aterosklerózou, autoimunitnou tyroiditídou atď.

S ohľadom na spomínanú inhibíciu a liečbu imunitnej rejekcie spojenej s transplantáciou tkanív alebo orgánov, ako je opísané skôr, farmaceutické kompozície v súlade s vynálezom môžu byť používané v spojitosti so známymi imunosupresantmi používanými na inhibíciu imunitnej rejekcie v transplantačnej terapii, týmto zvyšujú účinok známych liečiv na inhibíciu rejekcie.

Ďalej, použitím metódy identifikácie látok schopných viazať sa na AILIM alebo AILIM ligand, ktorá je v rámci predmetu predkladaného vynálezu, je možné kontrolovať prenos signálu spojený s interakciou medzi AILIM a AILIM ligandom prostredníctvom väzby na AILIM alebo AILIM ligand a týmto dosiahnuť skrinink a výber farmaceutického agens (syntetická chemická zlúčenina a protilátka) majúceho vhodný účinok na liečbu spomínaných rôznych ochorení.

Zoznam sekvencii

SEQ ID č: 1

Iná informácia: Opis umelej sekvencie: Umelo syntetizovaná primérová sekvencia, Notl-T.

SEQ ID č: 2

Iná informácia: Opis umelej sekvencie: Umelo syntetizovaný linker sekvencie, 20 adp.

SEQ ID č: 3

Iná informácia: Opis umelej sekvencie: Umelo syntetizovaný linker sekvencie, AILIMHC1.

SEQ ID č: 4

Iná informácia: Opis umelej sekvencie: Umelo syntetizovaný linker sekvencie, HIGLC.

SEQ ID č: 5

Iná informácia: Opis umelej sekvencie: Umelo syntetizovaný linker sekvencie, NHCc2.

SEQ IDč: 6

Iná informácia: Opis umelej sekvencie: Umelo syntetizovaný linker sekvencie, ExcellE.

SEQ ID č: 7

Iná informácia: Opis umelej sekvencie: Umelo syntetizovaný linker sekvencie, ckl 17.

SEQ ID č: 8

Iná informácia: Opis umelej sekvencie: Umelo syntetizovaný linker sekvencie, M13R.

SEQ ID č: 9

Iná informácia: Opis umelej sekvencie: Umelo syntetizovaný linker sekvencie, 136H.

SEQ IDč: 10

Iná informácia: Opis umelej sekvencie: Umelo syntetizovaný linker sekvencie, 138/9H.

SEQ IDč: 11

Iná informácia: Opis umelej sekvencie: Umelo syntetizovaný linker sekvencie, AILIMHC1.

SEQ IDč: 12

Iná informácia: Opis umelej sekvencie: Umelo syntetizovaný linker sekvencie, HCcl.

SEQ IDč: 13

Iná informácia: Opis umelej sekvencie: Umelo syntetizovaný linker sekvencie, HCc7.

SEQ ID č: 14

Iná informácia: Opis umelej sekvencie: Umelo syntetizovaný linker sekvencie, HCc8.

SEQ IDč: 15

Iná informácia: Opis umelej sekvencie: Umelo syntetizovaný linker sekvencie, HCc3.

SEQ IDč: 16

Iná informácia: Opis umelej sekvencie: Umelo syntetizovaný linker sekvencie, HCc4.

SEQlDč: 17

Iná informácia: Opis umelej sekvencie: Umelo syntetizovaný linker sekvencie, E[Cc6.

SEQ IDč: 18

Iná informácia: Opis umelej sekvencie: Umelo syntetizovaný linker sekvencie, HIGHC.

SEQ IDč: 19

Iná informácia: Opis umelej sekvencie: Umelo syntetizovaný linker sekvencie, AILIMHC1.

SEQ IDč: 20

Iná informácia: Opis umelej sekvencie: Umelo syntetizovaný linker sekvencie, HCc5.

SEQ IDč: 21

Iná informácia: Opis umelej sekvencie: Umelo syntetizovaný linker sekvencie, polyA.

SEQ IDč: 22

Iná informácia: Opis umelej sekvencie: Umelo syntetizovaný linker sekvencie, AILIMMLC1.

SEQ ID č: 23

Iná informácia: Opis umelej sekvencie: Umelo syntetizovaný linker sekvencie, AILIMLC2.

SEQ ID č: 24

Iná informácia: Opis umelej sekvencie: Umelo syntetizovaný linker sekvencie, LCcl.

SEQ ID č: 25

Iná informácia: Opis umelej sekvencie: Umelo syntetizovaný linker sekvencie, LcC2.

SEQ ID č: 26

Iná informácia: Opis umelej sekvencie: Umelo syntetizovaný linker sekvencie, HIK.

SEQ ID č: 39

Iná informácia: Opis umelej sekvencie: Umelo syntetizovaný linker sekvencie, AILIMHC1.

SEQ ID č: 40

Iná informácia: Opis umelej sekvencie: Umelo syntetizovaný linker sekvencie.

Sekvenčná listina

Claims (11)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Ľudská monoklonálna protilátka alebo jej časť, ktorá sa viaže na ľudskú AILIM, vyznačuj úca sa tým, že variabilná oblasť ťažkého reťazca uvedenej ľudskej monoklonálnej protilátky má aminokyselinovú sekvenciu definovanú v bode (a) alebo (b):

   (a) aminokyselinová sekvencia obsahujúca aminokyseliny od polohy 20 do 117 SEQ ID č: 28 alebo (b) aminokyselinová sekvencia obsahujúca aminokyseliny od polohy 20 do 117 SEQ ID č: 28, v ktorej jeden až desať aminokyselinových zvyškov je vymazaných alebo substituovaných, alebo v ktorej jeden až desať aminokyselinových zvyškov je inzertovaných alebo pridaných, s podmienkou, že keď variabilná oblasť ťažkého reťazca má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v bode (b), uvedená protilátka má ktorúkoľvek z charakteristík uvedených v bodoch (i) až (iii):

   (i) účinnosť na zabránenie zmiešanej lymfocytovej reakcie, (ii) účinnosť na vyvolanie signálnej transdukcie na indukciu interferónu γ alebo (iii) účinnosť na vyvolanie bunkovej cytotoxicity závislej od antigénu proti bunkám exprimujúcim AILIM.
2. 2. Ľudská monoklonálna protilátka alebo jej časť, ktorá sa viaže na ľudskú AILIM, vyznačuj úca sa tým, že ťažký reťazec polypeptidu uvedenej ľudskej monoklonálnej protilátky má aminokyselinovú sekvenciu definovanú v bode (a) alebo (b):

   (a) aminokyselinová sekvencia obsahujúca aminokyseliny od polohy 20 do 470 SEQ ID č: 28 alebo (b) aminokyselinová sekvencia obsahujúca aminokyseliny od polohy 20 do 470 SEQ ID č: 28, v ktorej jeden až desať aminokyselinových zvyškov je vymazaných alebo substituovaných, alebo v ktorej jeden až desať aminokyselinových zvyškov je inzertovaných alebo pridaných, s podmienkou, že keď ťažký reťazec poplypeptidu má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v bode (b), uvedená protilátka má ktorúkoľvek z charakteristík uvedených v bodoch (i) až (iii):

   (i) účinnosť na zabránenie zmiešanej lymfocytovej reakcie, (ii) účinnosť na vyvolanie signálnej transdukcie na indukciu interferónu γ alebo (iii) účinnosť na vyvolanie bunkovej cytotoxicity závislej od antigénu proti bunkám exprimujúcim AILIM.
3. 3. Ľudská monoklonálna protilátka alebo jej časť, ktorá sa viaže na ľudskú AILIM, vyznačujúca sa tým, že variabilná oblasť ľahkého reťazca uvedenej ľudskej monoklonálnej protilátky má aminokyselinovú sekvenciu definovanú v bode (a) alebo (b):

   aminokyselinová sekvencia obsahujúca aminokyseliny od polohy 23 do 116 SEQ ID č: 30, aminokyselinová sekvencia obsahujúca aminokyseliny od polohy 23 do 116 SEQ ID č: 30, v ktorej jeden až desať aminokyselinových zvyškov je vymazaných alebo substituovaných, alebo v ktorej jeden až desať aminokyselinových zvyškov je inzertovaných alebo pridaných, s podmienkou, že keď variabilná oblasť ľahkého reťazca má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v bode (b), uvedená protilátka má ktorúkoľvek z charakteristík uvedených v bodoch (i) až (iii):

   (i) účinnosť na zabránenie zmiešanej lymfocytovej reakcie, (ii) účinnosť na vyvolanie signálnej transdukcie na indukciu interferónu γ alebo (iii) účinnosť na vyvolanie bunkovej cytotoxicity závislej od antigénu proti bunkám exprimujúcim AILIM.
4. 4. Ľudská monoklonálna protilátka alebo jej časť, ktorá sa viaže na ľudskú AILIM, vyznačuj úca sa tým, že ľahký reťazec polypeptidu uvedenej ľudskej monoklonálnej protilátky má aminokyselinovú sekvenciu definovanú v bode (a) alebo (b):

   (a) aminokyselinová sekvencia obsahujúca aminokyseliny od polohy 23 do 236 SEQ ID č: 30, (b) aminokyselinová sekvencia obsahujúca aminokyseliny od polohy 23 do 236 SEQ ID č: 30, v ktorej jeden až desať aminokyselinových zvyškov je vymazaných alebo substituovaných, alebo v ktorej jeden až desať aminokyselinových zvyškov je inzertovaných alebo pridaných, s podmienkou, že keď ľahký reťazec polypeptidu má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v bode (b), protilátka má ktorúkoľvek z charakteristík uvedených v bodoch (i) až (iii):

   (i) účinnosť na zabránenie zmiešanej lymfocytovej reakcie, (ii) účinnosť na vyvolanie signálnej transdukcie na vyvolanie interferónu γ alebo (iii) účinnosť na vyvolanie bunkovej cytotoxicity závislej od antigénu proti bunkám exprimujúcim AILIM.
5. 5. Ľudská monoklonálna protilátka alebo jej časť, ktorá sa viaže na ľudskú AILIM, a má nasledujúce charakteristiky (a) a (b):

   (a) variabilná oblasť ťažkého reťazca protilátky obsahuje ktorúkoľvek z nasledujúcich sekvencii (1) alebo (Π):

   (I) aminokyselinovú sekvenciu obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu od aminokyseliny 20 do 117 SEQ ID č: 28 alebo (II) aminokyselinovú sekvenciu obsahujúcu aminokyseliny od polohy 20 do 117 SEQ ID NO: 28, v ktorej jeden až desať aminokyselinových zvyškov je vymazaných alebo substituovaných, alebo v ktorom jeden až desať aminokyselinových zvyškov je inzertovaných alebo pridaných, a (b) variabilnú oblasť ľahkého reťazca protilátky obsahuje ktorúkoľvek z nasledujúcich sekvencií (I) alebo (II):

   (I) aminokyselinovú sekvenciu obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu od aminokyseliny 23 do 116 SEQ ID č: 30 alebo (II) aminokyselinovú sekvenciu obsahujúcu aminokyseliny od polohy 23 do 116 SEQ ID NO: 30, v ktorej jeden až desať aminokyselinových zvyškov je vymazaných alebo substituovaných, alebo v ktorej jeden až desať aminokyselinových zvyškov je inzertovaných alebo vložených, s podmienkou, že ak variabilná oblasť ťažkého reťazca je oblasť uvedená v bode (a) (II) alebo variabilná oblasť ľahkého reťazca je oblasť uvedená v bode (b) (II), uvedená protilátka má ktorúkoľvek z charakteristík uvedených v bodoch (i) až (iii):

   (i) účinnosť na zabránenie zmiešanej lymfocytovej reakcie, (ii) účinnosť na vyvolanie signálnej transdukcie na vyvolanie interferónu γ alebo (iii) účinnosť na vyvolanie bunkovej cytotoxicity závislej od antigénu proti bunkám exprimujúcim AILIM.
6. 6. Ľudská monoklonálna protilátka alebo jej časť, ktorá sa viaže na ľudskú AILIM, a má nasledujúce charakteristiky (a) a (b):

   (a) ťažký reťazec polypeptidu protilátky obsahuje ktorúkoľvek z nasledujúcich sekvencií (I) alebo (II):

   (I) aminokyselinovú sekvenciu od aminokyseliny 20 do 470 podľa SEQ ID č: 28 alebo (II) aminokyselinovú sekvenciu obsahujúcu aminokyseliny od polohy 20 do 470 SEQ ID NO: 28, v ktorej jeden až desať aminokyselinových zvyškov je vymazaných alebo substituovanýc, alebo v ktorej jeden až desať aminokyselinových zvyškov je inzertovaných alebo vložených, a (b) ľahký reťazec polypeptidu protilátky obsahuje ktorúkoľvek z nasledujúcich sekvencií (I) alebo (II):

   (I) aminokyselinovú sekvenciu od aminokyseliny 23 do 236 SEQ ID č: 30 alebo (II) aminokyselinovú sekvenciu obsahujúcu aminokyseliny od polohy 23 do 236 SEQ ID NO: 30, v ktorej jeden až desať aminokyselinových zvyškov je vymazaných alebo substituovaných, alebo v ktorej jeden až desať aminokyselinových zvyškov je inzertovaných alebo vložených, s podmienkou, že ak ťažký reťazec polypeptidu je reťazec uvedený v bode (a) (II) alebo ľahký reťazec polypeptidu je reťazec uvedený v bode (b) (II), uvedená protilátka má ktorúkoľvek z charakteristík uvedených v bodoch (i) až (iii):

   (i) účinnosť na zabránenie zmiešanej lymfocytovej reakcie, (ii) účinnosť na vyvolanie signálnej transdukcie na indukciu interferónu γ alebo (iii) účinnosť na vyvolanie bunkovej cytotoxicity závislej od antigénu proti bunkám exprimujúcim AILIM.
7. 7. DNA kódujúca variabilnú oblasť ťažkého reťazca polypetidu ľudskej protilátky podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že uvedený polypeptid obsahuje aminokyselinovú sekvenciu od aminokyseliny 20 do 117 SEQ ID č: 28.
8. 8. DNA kódujúca ťažký reťazec polypeptidu protilátky podľa nároku 3, vyznačujúca sa tým, že uvedený polypeptid obsahuje aminokyselinovú sekvenciu od aminokyseliny 20 do 470 podľa SEQ IDč: 28.
9. 9. DNA kódujúca variabilnú oblasť ľahkého reťazca polypeptidu ľudskej protilátky podľa nároku 3, vyznačujúca sa tým, že uvedený polypeptid obsahuje aminokyselinovú sekvenciu od aminokyseliny 23 do 116 SEQ ID NO: 30.
10. 10. DNA kódujúca ľahký reťazec polypeptidu ľudskej protilátky podľa nároku 4, vyznačujúca sa tým, že uvedený polypeptid obsahuje aminokyselinovú sekvenciu od aminokyseliny 23 do 236 SEQ ID NO: 30.
11. 11.

    (a) (b) 12.

    (a) (b)

    13.

    14. tidovú

    15. tidovú

    16. tidovú

    17. tidovú

    18. (b):

    DNA vybraná z (a) alebo (b) uvedených neskôr:

    DNA obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu od nukleotidu 126 do 419 SEQ ID č: 27 alebo DNA obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu od nukleotidu 105 do 386 SEQ ID č: 29.

    DNA vybraná z (a) alebo (b) uvedených neskôr:

    DNA obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu od nukleotidu 69 do 1481 SEQ ID č: 27 alebo DNA obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu od nukleotidu 39 do 749 SEQ ID č: 29. Vektor obsahujúci DNA podľa ktoréhokoľvek z nárokov 7 až 12.

    Vektor podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, sekvenciu od nukleotidu 126 do 419 SEQ ID č: 27.

    Vektor podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, sekvenciu od nukleotidu 69 do 1481 SEQ ID č: 27.

    Vektor podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, sekvenciu od nukleotidu 105 do 386 SEQ ID č: 29.

    Vektor podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, sekvenciu od nukleotidu 39 do 749 SEQ ID č: 29.

    Vektor podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým že obsahuje DNA obsahujúcu nukleože obsahuje DNA obsahujúcu nukleože obsahuje DNA obsahujúcu nukleože obsahuje DNA obsahujúcu nukleože obsahuje DNA podľa bodov (a) a (a) DNA obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu od nukleotidu 126 do 419 SEQ ID Č: 27 a (b) DNA obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu od nukleotidu 105 do 386 SEQ ID č: 29.

    19. Vektor podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že obsahuje DNA podľa bodov (a) a (b):

    (a) DNA obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu od nukleotidu 69 do 1481 SEQ ID č: 27 a (b) DNA obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu od nukleotidu 39 do 749 SEQ ID č: 29.

    20. Bunka produkujúca ľudskú monoklonálnu protilátku podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, kde bunka nie je ľudská zárodočná bunka.

    21. Bunka podľa nároku 20, vyznačujúca sa tým, že je fúzovanou bunkou získanou fúziou B bunky získanej z cicavca schopného produkovať uvedenú ľudskú monoklonálnu protilátku a myelómovej bunky získanej z cicavca.

    22. Genetický rekombinantný hostiteľ iného ako ľudského pôvodu transformovaný pomocou vektora podľa ktoréhokoľvek z nárokov 13 až 19, uvedený hostiteľ je získaný z cicavca vybraného zo skupiny pozostávajúcej z hovädzieho dobytka, kozy, králika, myši, potkana, škrečka a morčaťa.

    23. Genetický rekombinantný hostiteľ podľa nároku 22, vyznačujúci sa tým, že uvedený hostiteľ je cicavčia bunka iného ako ľudského pôvodu.

    24. Genetický rekombinantný hostiteľ podľa nároku 22, vyznačujúci sa tým, že uvedený hostiteľ je cicavčie oplodnené vajíčko iného ako ľudského pôvodu.

    25. Ľudská monoklonálna protilátka alebo jej časť, ktorá sa viaže na ľudskú AILIM, produkovaná genetickým rekombinantným hostiteľom podľa nároku 22 alebo 23.

    26. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje ľudskú protilátku podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6 a farmaceutický prijateľný nosič.

    27. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje ľudskú monoklonálnu protilátku alebo jej časť podľa nároku 25 a farmaceutický prijateľný nosič.

    28. Použitie protilátky alebo jej časti podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6 a 25 na prípravu farmaceutickej kompozície na zabránenie, liečenie alebo profylaxiu alergie oneskoreného typu.

    29. Použitie protilátky alebo jej časti podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6 a 25 na prípravu farmaceutickej kompozície na zabránenie, liečenie alebo profylaxiu reumatoidnej artritídy.

    30. Použitie protilátky alebo jej časti podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6 a 25 na prípravu farmaceutickej kompozície na zabránenie, liečenie alebo profylaxiu systémového lupus erytematosus.

    31. Použitie protilátky alebo jej časti podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6 a 25 na prípravu farmaceutickej kompozície na zabránenie, liečenie alebo profylaxiu psoriázy.

    32. Použitie protilátky alebo jej časti podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6 a 25 na prípravu farmaceutickej kompozície na zabránenie, liečenie alebo profylaxiu diabetes mellitus závislého od inzulínu.

    33. Použitie protilátky alebo jej časti podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6 a 25 na prípravu farmaceutickej kompozície na zabránenie, liečenie alebo profylaxiu choroby štep versus hostiteľ.

    34. Použitie protilátky alebo jej časti podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6 a 25 na prípravu farmaceutickej kompozície na zabránenie, liečenie alebo profylaxiu imunitnej reakcie sprevádzajúcej transplantáciu.

    35. Použitie protilátky alebo jej časti podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6 a 25 na prípravu farmaceutickej kompozície na zabránenie, liečenie alebo profylaxiu nefritídy.