NO20110218L - Transplantatrejeksjonssuppressorer - Google Patents

Abstract

Det ble funnet at antistoffer mot AILIM (også kjent som ICOS og 8F4) og AILIM-Ig har signifikant terapeutiske virkninger når det gjelder undertrykkelse og forebyggelse av transplantatrejeksjon, som er et alvorlig problem forbundet med transplantasjon av vev eller organer (homoplasi og heteroplasi) utført for behandling av forskjellige typer organsvikt (svikt i lever, hjerte, lunge, nyre, bukspyttkjertel osv).

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse gjelder farmasøytiske preparater som omfatter en forbindelse med en aktivitet som modulerer den biologiske aktivitet av "aktiverings-induserbart lymfocyttimmunmodulerende molekyl" (AILIM) (også kjent som "induserbar ko-stimulator" (ICOS)), fortrinnsvis signaloverføringen som formidles av AILIM.

Nærmere bestemt gjelder foreliggende oppfinnelse farmasøytiske preparater som omfatter en forbindelse med en aktivitet som modulerer (for eksempel inhiberer) proliferasjon av AILIM-uttrykkende celler eller modulerer (for eksempel inhiberer) dannelsen av et cytokin (for eksempel interferon-y eller interleukin-4) av AILIM-uttrykkende celler.

Nærmere bestemt gjelder foreliggende oppfinnelse (1) farmasøytiske preparater for inhibering, behandling eller forebyggelse av transplantatrejeksjon (immunologisk rejeksjon) forbundet med transplantasjon av et organ, en del av et organ eller et vev, og (2) farmasøytiske preparater for å fremme den inhiberende, terapeutiske eller forebyggende virkning av immunsupprimerende midler på transplantatrejeksjon (immunologisk rejeksjon) forbundet med transplantasjon av et organ, en del av et organ eller et vev.

Teknikkens stand

Grunnet den nylige revisjon av lover vedrørende organtransplantasjon har noen få organtransplantasjoner fra hjernedøde pasienter blitt utført i Japan. I et tilfelle mottok syv pasienter organer fra en donor. I tiden fremover forventes antall organtransplantasjoner å øke.

På den annen side forventes antall Japanske pasienter som lider av alvorlige kardiovaskulære sykdommer, som hepatiske sykdommer (akutt leversvikt, levercirrhose og så videre), hjertesykdommer (alvorlig hjertesvikt, kardiomyopati, hjertehypertrofi og så videre) nyresykdommer (nyresvikt, kronisk glomerulonefritt, diabetisk nefropati, pyelo-nefritt og så videre), pulmonare sykdommer (pulmonar dysfunksjon i begge lunger og så videre) og pankreatiske sykdommer (behandling av diabetiske pasienter), for hvilke organtransplantasjon er avgjørende for behandlingen, å øke hvert år med tilnærmet 600 hjertepasienter, tilnærmet 3 000 leverpasienter og tilnærmet 500 lungepasienter. Samtidig som de legale sider er under utvikling, er mangelen på transplanterbare organer også et reelt problem som foreligger i øyeblikket. På tilsvarende måte er mangelen på organer et alvorlig problem også i De Forente Stater, som er en avansert nasjon når det gjelder transplantasjon. I De Forente Stater venter tilnærmet 4 300 pasienter (1999) på hjertetransplantasjoner og tilnærmet 43 000 pasienter (1999) på nyretransplantasjoner. I virkeligheten dør tilnærmet 800 pasienter, henholdsvis 2 300 pasienter, hvert år uten å kunne motta hjerte-, henholdsvis nyretransplantasj oner.

Vevstransplantasjon (for eksempel av hud, hornhinne og bein) eller organtransplantasjon (for eksempel av lever, hjerte, nyre, lunge og bukspyttkjertel) omfatter: (1) autotransplantasjon (autolog transplantasjon), (2) isotransplantasjon, (3) allotransplantasjon og (4) xenotransplantasjon.

Autotransplantasjon viser til transplantasjon av en del av et individ til en annen del av samme individ, og et eksempel er behandling av brannsår ved transplantasjon av pasientens normale hud til det påvirkede området.

Isotransplantasjon utføres mellom homogene dyr. I dyr utføres en slik transplantasjon mellom monozygote tvillinger (for eksempel transplantasjon av en av nyrene eller av levervev).

Allotransplantasjon utføres mellom to forskjellige individer med forskjellig genetisk bakgrunn, og hos mennesker utføres slik transplantasjon mellom de zygote tvillinger eller mellom individer som ikke er beslektet med hverandre.

Xenotransplantasjon utføres mellom individer fra forskjellige dyrearter. Et eksempel er det tilfellet hvor et vev eller et organ fra en sjimpanse eller en gris transplanteres inn i et menneske.

Som nevnt ovenfor forventes antall allotransplantasjoner fra hjernedøde pasienter å øke grunnet utvikling av lovgivning vedrørende organtransplantasjon. For å løse problemet med den absolutte mangel på transplanterbare organer, utføres imidlertid forskjellige undersøkelser for tiden aktivt med det mål å finne praktiske anvendelser av xenotransplantasjon, nærmere bestemt transplantasjon av vev eller organer fra ikke-menneskelige pattedyr, for eksempel griser, til mennesker.

Selv om problemet med mangel på transplanterbare vev og organer forventes å løses ved utvikling av lover vedrørende hjernedød og transplantasjon og ved forbedrede xeno-transplantasjonsteknikker, foreligger det en annen ekstremt stor hindring for behandling av sykdommer ved allotransplantasjon og xenotransplantasjon. Nærmere bestemt er denne hindringen alvorlig immunologisk rejeksjon (transplanatrejeksjon) hos mottakere som opptrer etter transplantasjon av vev eller organer fra donorer.

Transplantatrejeksjon viser til forskjellige immunresponser som prøver å avvise og fjerne et transplantat (en del av en levende kropp som er transplantert, en celle, et vev eller et organ) fra en donor hvis genetiske bakgrunn er forskjellig fra mottakerens (det vil si

allotransplantasjon eller xenotransplantasjon), siden mottakeren oppfatter transplantatet som fremmed materiale. Immunresponsen som ledsager transplantasjonen kan klassifiseres i: (1) hyperakutt rejeksjon, som er en kraftig rejeksjon som opptrer umiddelbart etter transplantasjonen, (2) akutt rejeksjon, som observeres i løpet av noen få måneder etter transplantasjonen, og (3) kronisk rejeksjon, som observeres flere måneder etter transplantasjonen. Selv om cellulær immunitet grunnet immunkompetente celler representert ved T-celler og humoral immunitet grunnet antistoffer opptrer på en iboende koordinert måte, skjer hovedresponsen ved cellulær immunitet.

Som en følge av transplantatrejeksjon blir transplantatet til syvende og sist nekrotisk og faller av. Videre utvikler mottakeren ikke bare alvorlige systemiske symptomer som feber, leukocytose og tretthet, men også opphovning og ømhet i transplantasjonssetet. Videre kan alvorlige komplikasjoner, som infeksjoner, opptre.

Ved transplantasjon av et xenogent transplantat, for eksempel fra en gris, er et spesielt alvorlig problem opptreden av hyperakutt rejeksjon, hvorved transplantatet avvises i løpet av minutter.

Et begrenset antall immunsupprimerende midler som undertrykker funksjonen av immunkompetente celler anvendes for å undertrykke den immunologiske rejeksjon (transplantatrejeksjon) som opptrer ved slike transplantasjoner, siden den immunologiske rejeksjon, som opptrer ved allotransplantasjon, hovedsakelig skyldes cellulær immunitet. Slike immunsupprimerende midler omfatter syklosporin (CsA), takrolimus (FK-506), azatioprin (AZ), mykofenolatmofetil (MMF), mizoribin (MZ), leflunomid (LEF), adrenokortikale steroider (også kjent som adenokortikale hormoner, kortikosteroider, kortikoider) som prednisolon og metylprednisolon, sirolimus (også kjent rapamysin), deoksyspergualin (DSG) ogFTY720 (kjemisk navn: 2-amino-2-[2-(4-oktylfenyl)etyl]-l,3-propandiol-hydroklorid).

CTLA4 og CD28 som er molekyler som er ansvarlige for overføring av ko-stimulerende signaler som er nødvendige for aktivering av T-celler (ko-stimulerende, signaloverførende molekyler) og særlig CTLA4-medikamenter som benytter den løselige del av TCLA4, og genet som koder for dette, blir også utviklet klinisk som immunsupprimerende midler.

På den annen side ble nylig, i likhet med CTLA4 og CD28 som er ko-stimulerende, signaloverførende molekyler, et molekyl som kalles aktivasjonsinduserbart, lymfocyttimmunmodulerende molekyl (AILIM, fra menneske, mus og rotte, Int. Immunol., 12(1),

s 51-55, 200, også betegnet induserbar ko-stimulator (ICOS, fra menneske, Nature, 397

(6716), s 263-266, 1999), J. Immunol, 166 (1), s 1,2001, J. Immunol., 165 (9), s 5035, 2000, Biochem. Biophys. Res. Commun., 276 (1), s 335,2000, Immunity, 13 (1), s 95,2000, J. Exp. Med., 192 (1), s 53, 2000, Eur. J. Immunol., 30 (4), s 1040,2000) påvist som det tredje ko-stimulerende signaloverføringsmolekyl som overfører et andre signal (ko-stimulerende signal) som er nødvendig for aktivering av lymfocytter som T-celler, og som koblet til signalet, regulerer funksjonen av aktiverte lymfocytter, for eksempel aktiverte T-celler.

Basert på funnene fra nyere undersøkelser vedrørende dette molekyl, forventes AILIM-molekylet muligens å være involvert i forskjellige sykdommer (for eksempel autoimmune sykdommer, allergier og inflammasjoner) som skyldes aktivering av immunkompetente celler, for eksempel T-celler (særlig T-celler). Det foreligger imidlertid ingen rapporter vedrørende forholdet mellom den funksjonelle modulering av AILIM-molekylet og transplantatrejeksjon (immunologisk rejeksjon) forbundet med vevs- eller organtransplantasjon, så vel som forsøk på å undertrykke, behandle eller forebygge slike rejeksjons- reaksjoner som følge av vevs- eller organtransplantasjon ved å modulere aktiviteten av AILIM-molekylet.

I tillegg har svært nylig et nytt molekyl som betegnes B7h, B7RP-1, GL50 eller

LICOS, som anses å være en ligand som interagerer med ko-stimulerende signaloverførings-molekyl AILIM, blitt påvist. (Nature, bind 402, nr 6763, s 827-832, 1999, Nature Medicine, bind 5, nr 12, s 1365-1369,1999, J. Immunology, bind 164, s 1653 - 1657,2000, Curr. Biol. bind 10, nr. 6, s 333-336, 2000).

Påvisningen av disse to typene nye molekyler, nemlig AILIM (ICOS) og B7RP-1 (B7h, GL50, LICOS) viste at det i tillegg til de kjente første og andre signaloverføringsveier mellom CD28 og CD80 (B7-1) / CD86 (B7-2) og mellom CTLA4 og CD80 (B7-1) / CD 86 (B7-2), foreligger en ny, tredje ko-stimulerende signaloverføringsvei som er avgjørende for den ovenfor nevnte aktivering av lymfocytter, for eksempel T-celler, og for kontroll av funksjonen av aktiverte T-celler, som fungerer via interaksjonen mellom AILIM (ICOS) og B7RP-1 (B7RP-1 (B7h, GL50, LICOS).

Omfattende undersøkelser er i gang når det gjelder de biologiske funksjoner av disse nye molekyler, regulering av funksjonen av lymfocytter, for eksempel T-celler, via den tredje ko-stimulerende signaloverføring via disse molekylene, og sammenhengen mellom de nye signaloverføringsveiene og sykdommer.

Beskrivelse av oppfinnelsen

Nærmere bestemt er et formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe fremgangsmåter og farmasøytiske midler som undertrykker, behandler eller forebygger immunologiske rejeksjoner (transplantatrejeksjoner) forbundet med transplantasjon av et vev eller et organ (allotransplantasjon eller xenotransplantasjon) ved å benytte kjemiske og farmasøytiske teknikker (for eksempel farmasøytiske midler som lavmolekylære forbindelser og antistoffer) for å modulere den biologiske funksjon av et nytt molekyl, AILIM, som anses å overføre et andre signal (ko-stimulerende signal) som er nødvendig for aktivering av lymfocytter som T-celler, og som koblet til signalet modulerer funksjonen av aktiverte lymfocytter, for eksempel aktiverte T-celler.

Et annet formål er å tilveiebringe fremgangsmåter for å forsterke den supprimerende virkning på transplantatrejeksjon av foreliggende immunsupprimerende midler (syklosporin, azatioprin, adrenokortikale steroider, FK-506 og så videre) ved å anvende slike farma-søytiske midler som modulerer den biologiske funksjon av AILIM, for eksempel farmasøytiske midler som lavmolekylære forbindelser og antistoffer).

Som et resultat av omfattende forskning forbundet med den biologiske funksjon av AILIM hos pattedyr og en fremgangsmåte for undertrykkelse av immunologisk rejeksjon (transplantatrejeksjon), som er et alvorlig problem forbundet med transplantasjon (allotransplantasjon eller xenotransplantasjon) av transplantater (celler, et vev eller et organ) fant de foreliggende oppfinnere at (1) farmasøytiske midler som modulerer funksjonen av AILIM i vesentlig grad vil undertrykke den immunologiske rejeksjon (transplantatrejekson) forbundet med transplantasjon av et eller flere vev eller organer og (2) at den under-trykkende virkning av eksisterende immunsupprimerende midler på transplantatrejeksjon forsterkes ved å anvende farmasøytiske midler som modulerer funksjonen av AILIM og fullførte derved foreliggende oppfinnelse.

Et farmasøytisk preparat ifølge foreliggende oppfinnelse er anvendbart som et farmasøytisk middel for modulering av forskjellige reaksjoner in vivo hvori overføringen av et ko-stimulerende signal til AILIM-uttrykkende celler formidlet ved AILIM deltar (for eksempel proliferasjon av AILIM-uttrykkende celler, dannelse av ett eller flere cytokiner fra AILIM-uttrykkende celler, immunologisk cytolyse eller apoptose av AILIM-uttrykkende celler og evnen til å indusere antistoffavhengig, cellulær cytotoksisitet mot AILIM-uttrykkende celler), og/eller som et farmasøytisk middel for å forhindre start og/eller utvikling av forskjellige sykdommer hvori signaloverføringen som formidles av AILIM deltar, og for behandling eller profylakse av sykdommene.

Nærmere bestemt kan et farmasøytisk preparat ifølge foreliggende oppfinnelse modulere (undertrykke eller fremme) proliferasjonen av AILIM-uttrykkende celler og modulere (inhibere eller fremme) dannelsen av cytokiner (for eksempel interferon-y eller interleukin 4) fra AILIM-uttrykkende celler, og kan forhindre forskjellige sykdomstilstander som utløses ved forskjellige fysiologiske fenomener, i hvilke signaloverføringen som formidles av AILIM inngår, og tillater behandling eller forebyggelse av forskjellige sykdommer.

Anvendelsen av et farmasøytisk preparat ifølge foreliggende oppfinnelse tillater undertrykkelse, forebyggelse og/eller behandling av immunologisk rejeksjon (transplantatrejeksjon), som er et alvorlig problem i behandlingsformer hvor et organ (lever, hjerte, lunge, nyre, bukspyttkjertel og så videre), en del av et organ eller et vev (for eksempel hud, hornhinne og bein) fra en donor transplanteres (allotransplanteres eller xenotransplanteres) til en mottaker som lider av en alvorlig kardiovaskulær sykdom.

Videre tillater anvendelse av et farmasøytisk preparat ifølge foreliggende oppfinnelse forsterkning av den transplantatrejeksjonsundertrykkende virkning av eksisterende immunsupprimerende midler som tilføres for å undertrykke immunologisk rejeksjon ved slike transplantasjonsbehandlinger.

Nærmere bestemt omfatter foreliggende oppfinnelse:

(1) Et farmasøytisk preparat for undertrykkelse, behandling eller forebyggelse av transplantatrejeksjon forbundet med transplantasjon av et organ, en del av et organ eller et vev, hvor preparatet omfatter en forbindelse med en aktivitet som modulerer signalover-føringen som formidles av AILIM og et farmasøytisk akseptabelt bærerstoff. (2) Et farmasøytisk preparat for forsterkning av virkningen av ett eller flere immunsupprimerende midler på undertrykkelse, behandling eller forebyggelse av transplantatrejeksjon forbundet med transplantasjon av et organ, en del av et organ eller et vev, hvor preparatet omfatter en forbindelse med en aktivitet som modulerer signaloverføringen som formidles av AILIM og et farmasøytisk akseptabelt bærerstoff. (3) Det farmasøytiske preparat ifølge (2), hvori det immunsupprimerende middel er ett eller flere terapeutiske midler utvalgt fra gruppen som består av azatioprin, adrenokorti-kalt steroid, syklosporin, mizoribin og takrolimus (FK-506), mykofenolat-mofetil, leflunomid, sirolimus, deoksyspergualin, FTY720 og CTLA4-medikament. (4) Det farmasøytiske preparat ifølge ethvert av punktene (1) til (3), hvori transplantasjonen er allotransplantasjon. (5) Det farmasøytiske preparat ifølge ethvert av punktene (1) til (3), hvori transplantasjonen er xenotransplantasjon. (6) Det farmasøytiske preparat ifølge ethvert av punktene (1) til (5) hvori organet er lever, hjerte, nyre eller bukspyttkjertel. (7) Det farmasøytiske preparat ifølge ethvert av punktene (1) til (5), hvori vevet er hud, hornhinne eller beinvev. (8) Det farmasøytiske preparat ifølge ethvert av punktene (1) til (7), hvori forbindelsen er en proteinforbindelse. (9) Det farmasøytiske preparat ifølge punkt (8), hvori proteinforbindelsen er utvalgt fra gruppen som består av:

a) et antistoff som bindes AILIM eller del av et slikt antistoff,

b) et polypeptid som omfatter hele eller en del av et ekstracellulært område i

AILIM,

c) et fusjonspolypeptid som omfatter hele eller en del av et ekstracellulært område i AILIM og hele eller en del av et konstant område fra immunglobulintungkjeden, og

d) et polypeptid som bindes til AILIM.

(10) Det farmasøytisk preparat ifølge ethvert av punktene (1) til (7), hvori

forbindelsen er en ikke-proteinforbindelse.

(11) Det farmasøytisk preparat ifølge (10) hvori den ikke-proteinforbindelsen er DNA, RNA eller en kjemisk syntetisert forbindelse.

Foreliggende oppfinnelse beskrives i detalj heri nedenfor ved å definere begrepene og fremgangsmåtene for fremstilling av forbindelsene som anvendes i oppfinnelsen.

Heri betyr begrepet "pattedyr" menneske, ku, geit, kanin, mus, rotte, hamster og marsvin og er fortrinnsvis menneske, ku, rotte, mus eller hamster, og menneske er spesielt foretrukket.

"AILIM" ifølge foreliggende oppfinnelse er en forkortelse for "aktivasjonsinduserbart lymfocyttimmunmodulerende molekyl" og betegner et molekyl på celleoverflaten hos et pattedyr med strukturen og funksjonen som er beskrevet i tidligere rapporter (J. Immunol. 166 (1), s 1,2001, J. Immunol. 165 (9), s 5035,2000, Biochem. Biophys. Res. Commun., 276 (1), s 335,2000, Immunity, 13 (1), s 95,2000, J. Exp. Med., 192 (1), s 53, 2000, Eur. J. Immunol., 30 (4), s 1040, 2000, Int. Immunol., 12 (1), s 51,

2000, Nature, 397 (6716), s 263,1999, GenBank Accession Number: BAA82129 (menneske), BAA82128 (rotte), BAA82127 (rottevariant), BAA82126 (mus)).

Begrepet betegner spesielt foretrukket AILIM avledet fra et menneske (for eksempel 13) International Immunology, bind 12, nr 1, s 51 - 55,2000).

Dette AILIM betegnes også ICOS (Nature, bind 397, nr 6716, s 263-266, 1999) eller JTT-l-antigen/JTT-2-antigen (ubehandlet publisert japansk patentsøknad nr. (JP-A) Hei 11 -29599, internasjonal patentsøknad nr. W098/38216), og disse betegnelser viser til samme molekyl.

I tillegg omfatter "AILIM" som vist til i foreliggende oppfinnelse, et polypeptid med aminosyresekvensen til AILIM fra alle pattedyr som er beskrevet i den tidligere rapporterte litteratur, og spesielt foretrukket også et polypeptid med i det vesentlige samme aminosyresekvens som humant AILIM. Videre omfattes humane AILIM-varianter som ligner på den tidligere påviste AILIM-variant avledet fra rotte (GenBank aksesjonsbetegnelse: BAA82127) av "AILIM" ifølge foreliggende oppfinnelse.

Heri betyr uttrykket "med i det vesentlige samme aminosyresekvens" at "AILIM" ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter et polypeptid med en aminosyresekvens hvori flere aminosyrer, fortrinnsvis fra 1 til 10 aminosyrer, spesielt foretrukket fra 1 til 5 aminosyrer, er substituert, delert og/eller modifisert, og polypeptider med en aminosyresekvens hvori flere aminosyrer, fortrinnsvis fra 1 til 10 aminosyrer, spesielt foretrukket fra 1 til 5 aminosyrer, er addert, så lenge som polypeptidene har i det vesentlige de samme biologiske egenskaper som polypeptidet som omfatter aminosyresekvensen som er vist i tidligere rapporter.

Slike substitusjoner, delesjoner eller insersjoner av aminosyrer kan oppnås ifølge vanlige fremgangsmåter (Experimental Medicine, SUPPLEMENT, "Handbook of Genetic Engineering" (1992), og så videre).

Eksempler er setestyrt mutagenese med syntetisk oligonukleotid (dupleks med gap-fremgangsmåten), punktmutagenese hvorved en punktmutasjon innføres tilfeldig med behandling med nitritt eller sulfitt, fremgangsmåten hvorved en delesjonsmutant fremstilles med Bal31-enzym og så videre, kassettmutagenese, linkerscanningsfremgangsmåten, feilinkorporeringsfremgangsmåten, mistilpasset primer-fremgangsmåten, DNA-segmentsyntesefremgangsmåten og så videre.

Setestyrt mutagenese med syntetisk oligonukleotid (dupleks med gap-fremgangsmåten) kan for eksempel utføres som følger: Området man ønsker å mutagenisere klones inn i en M13-baketeriofagvektor med en "amber"-mutasjon, slik at det dannes et enkelttrådet bakteriofag-DNA. Etter linearisering av RF I-DNA fra en M13-vektor uten "amber"-mutasjon ved behandling med restriksjonsenzym, sammenblandes dette DNA med det ovenfor nevnte, enktelttådede bakteriofag-DNA, detanureres og hybridiseres til dette, slik at det dannes et "dupleks-DNA med gap". Et syntetisk oligonukleotid med innførte mutasjoner hybridiseres til dupleks-DNA med gap, og et lukket, sirkulært, dobbelttrådet DNA fremstilles ved reaksjon med DNA-polymerase og DNA-ligase. £.cø//-mutS-celler, som mangler reparasjonsaktivitet for feiltilpassede nukleotider, transfekteres med dette DNA. £.co//-celler uten supressoraktivitet infiseres med oppdyrket bakteriofag, og kun bakteriofag uten "amber"-mutasjoner analyseres.

Fremgangsmåten, ved hvilken en punktmutasjon innføres med niritt, benytter for eksempel prinsippet som nevnes nedenfor. Dersom DNA behandles med nitritt, deamineres nukleotider slik at adenin overføres til hypoksantin, cytosin til urasil, og guanin til xantin. Dersom deaminert DNA innføres i celler, erstattes "A:T" og "G:C" med "G:C" henholdsvis "A:T", siden hypoksanin, urasil og xantin baseparer med cytosin, adenin henholdsvis tymin, under DNA-replikasjonen. I praksis hybridiseres enkelttrådede DNA-fragmenter behandlet med nitritt til "dupleks-DNA med gap", hvoretter mutante stammer separeres ved manipul-asjon på tilsvarende måte som ved setestyrt mutagenese med syntetisk oligonukleotid (dupleks med gap-fremgangsmåten).

Begrepet "cytokin" som for eksempel i "dannelse av et cytokin ved AILIM-uttrykkende celler" i foreliggende oppfinnelse betyr et tilfeldig cytokin som dannes av AILIM uttrykkende celler (fortrinnsvis T-celler).

Eksempler på T-celler er T-celler av Th 1-type og Th2-type, og et cytokin ifølge foreliggende oppfinnelse betyr nærmere bestemt et cytokin som produseres av T-celler av Th 1-type og/eller et tilfeldig cytokin som produseres av T-celler av Th2-type.

Cytokiner som produseres av T-celler av Th 1-type omfatter IFN-y, IL-2, TNF og IL-3 og cytokiner som produseres av T-celler av Th2-type omfatter IL-3, IL-4,IL-5, IL-10 og TNF (Cell, bind 30, nr. 9, s 343-346, 1998).

Begrepet "forbindelse" som anvendt i foreliggende oppfinnelse, nærmere bestemt en "forbindelse med en aktivitet som modulerer signaloverføringen som formidles av AILIM", og mer spesifikt, "en forbindelse med en aktivitet som inhiberer proliferasjonen av AILIM-uttrykkende celler, eller som inhiberer produksjonen av et cytokin fra AILIM-uttrykkende celler" betyr en naturlig forekommende forbindelse, eller en kunstig fremstilt, tilfeldig forbindelse.

Heri betyr uttrykket "signaloverføring formidlet av AILIM" signaloverføring via AILIM som fører til en endring av enhver fenotype i de AILIM-uttrykkende celler som er beskrevet ovenfor eller i de påfølgende eksempler (endret celleproliferasjon, aktivering av celler, inaktivering av celler, apoptose og/eller evnen til å danne et tilfeldig cytokin fra AILIM-uttrykkende celler).

"Forbindelsen" kan i hovedsak inndeles i en "proteinforbindelse" og en "ikke-proteinforbindelse".

Eksempler på "proteinforbindelser" er de påfølgende polypeptider, antistoffer (polyklonale antistoffer, monoklonale antistoffer eller deler av monoklonale antistoffer).

Dersom forbindelsen er et antistoff, er den fortrinnsvis et monoklonalt antistoff. Dersom forbindelsen er et monoklonalt antistoff omfatter den ikke bare monoklonale antistoffer avledet fra ikke-menneskelige pattedyr, men også de påfølgende rekombinante, kimære monoklonale antistoffer, rekombinante, humaniserte monoklonale antistoffer og humane monoklonale antistoffer.

Dersom forbindelsen er et polypeptid, omfatter den følgende polypeptider, polypeptid (oligopeptid)-fragmenter, fusjonspolypeptider og kjemisk modifiserte polypeptider. Eksempler på oligopeptider er peptider som omfatter fra 5 til 30 aminosyrer, fortrinnsvis fra 5 til 20 aminosyrer. En kjemisk modifisering som utformes avhengig av forskjellige formål, for eksempel for å forlenge halveringstiden i blod når det gjelder tilførsel in vivo, eller for å forhøye toleransen mot degradering eller øke absorpsjonen i tarmkanalen for oral tilførsel.

Eksempler på polypeptider er som følger:

(1) Et polypeptid som omfatter hele eller en del av et ekstracellulært område i

AILIM,

(2) Et fusjonspolypeptid som omfatter hele eller en del av et ekstracellulært område

i AILIM og hele eller en del av et konstant område fra immunglobulintungkjeden, eller

(3) Et polypeptid som bindes til AILIM.

Eksempler på "ikke-proteinforbindelser" er DNA, RNA og kjemisk syntetiserte forbindelser.

Her betyr "DNA" "DNA som er anvendbart som et "antisens"-DNA-medikament og som omfatter en partiell nukleotidsekvens fra et DNA som koder for det ovenfor beskrevne AILIM (fortrinnsvis humant AILIM) eller kjemisk modifisert DNA derfra, og som kan være utformet basert på DNA (cDNA eller genomisk DNA) som koder for AILIM". Nærmere bestemt kan dette "antisens"-DNA inhibere transkripsjon av DNA som koder for AILIM til mRNA eller translasjon av mRNA til et protein ved å hybridisere til DNA eller RNA som koder for AILIM.

Uttrykket "partiell nukleotidsekvens" som vist til heri, viser til en partiell nukleotidsekvens som omfatter et tilfeldig antall nukleotider fra et tilfeldig område. En partiell nukleotidsekvens omfatter fra 5 til 100 på hverandre følgende nukleotider, fortrinnsvis fra 5 til 70 på hverandre følgende nukleotider, mer foretrukket fra 5 til 50 på hverandre følgende nukleotider, og enda mer foretrukket, fra 5 til 30 på hverandre følgende nukleotider.

Dersom dette DNA anvendes som et "antisens"-DNA-medikament, kan DNA-sekvensen være delvis kjemisk modifisert for å forlenge halveringstiden (stabiliteten) i blod når dette DNA tilføres til pasienter for å forhøye permeabiliteten i intracytoplasmatiske membraner av dette DNA, eller for å forhøye degraderingsresistensen eller absorpsjonen av oralt tilført DNA i fordøyelsesorganene. Kjemiske modifikasjoner omfatter for eksempel modifikasjon av en fosfatbinding, en riboseenhet, et nukleotid, sukkergruppen og den 3' ende og/eller den 5' ende i strukturen av et oligonukleotid-DNA.

Modifikasjoner av fosfatbindinger omfatter for eksempel overføring av én eller flere bindinger til fosfodiesterbindinger (D-oligo), fosforotioatbindinger, fosforoditioatbindinger (S-oligo), metylfosfonat (MP-oligo)-bindinger, fosforoarnidatbindinger, ikke-fosfatbindinger eller metylfosfonotioatbindinger, eller kombinasjoner av disse. Modifikasjon av en ribose omfatter for eksempel overføring til 2'-fluorribose eller 2'-0-metylribose. Modifikasjon av et nukleotid omfatter for eksempel overføring til 5-propynyluracil eller 2-aminoadenin.

Heri betyr "RNA" "RNA som er anvendbart som et "antisens"-RNA-medikament og som omfatter en partiell nukleotidsekvens fra et RNA som koder for det ovenfor nevnte AILIM (fortrinnsvis humant AILIM) eller kjemisk modifisert RNA derav, som kan være utformet basert på det RNA som koder for AILIM". Dette "antisens"-RNA kan inhibere transkripsjonen av det DNA som koder for AILIM til mRNA eller translasjon av mRNA til et protein ved å hybridisere til det DNA eller RNA som koder for AILIM.

Uttrykket "partiell nukleotidsekvens" som benyttet heri, viser til en partiell nukleotidsekvens som omfatter et tilfeldig antall nukleotider fra et tilfeldig område. En partiell nukleotidsekvens som omfatter fra 5 til 100 på hverandre følgende nukleotider, fortrinnsvis fra 5 til 70 på hverandre følgende nukleotider, mer foretrukket fra 5 til 50 på hverandre følgende nukleotider, og enda mer foretrukket, fra 5 til 30 på hverandre følgende nukleotider.

"Antisens"-RNA-sekvensen kan være delvis kjemisk modifisert for å forlenge halveringstiden i blod ved tilførsel av RNA til pasienter, for å forhøye permeabiliteten av intracytoplasmatiske membraner av dette RNA eller for å forhøye degraderingsresistensen eller absorpsjonen av oralt tilført RNA i fordøyelsesorganene. Kjemiske modifikasjoner omfatter modifikasjoner som dem angitt for det ovenfor beskrevne "antisens"-DNA.

Eksempler på "en kjemisk syntetisert forbindelse" er en tilfeldig forbindelse bortsett fra de ovenfor nevnte DNA-forbindelser, RNA-forbindelser og proteinforbindelser med en molekylvekt på mellom tilnærmet 100 til tilnærmet 1 000 eller mindre, fortrinnsvis en forbindelse med en molekylvekt på tilnærmet 100 til tilnærmet 800, og mer foretrukket med en molekylvekt på fra tilnærmet 100 til tilnærmet 600.

Begrepet "polypeptid", som inngår i definisjonen av den ovenfor beskrevne "forbindelse", betyr en del (et fragment) av en polypeptidkjede som utgjør AILIM (fortrinnsvis humant AILIM), fortrinnsvis hele, eller en del av, et ekstracellulært område fra polypeptidet som utgjør AILIM (1 til 5 aminosyrer kan om ønskelig adderes til N-enden og/eller C-enden av området).

AILIM ifølge foreliggende oppfinnelse er et transmembranmolekyl som penetrerer cellemembranen og som omfatter 1 eller 2 polypeptidkjeder.

Heri betyr et "transmembranprotein" et protein som er koblet til cellemembranen via et hydrofobt peptidområde som penetrerer lipiddobbeltlaget i membranen én eller flere ganger og hvis struktur totalt sett består av tre hovedområder, det vil si et ekstracellulært område, et transmembranområde og et cytoplasmatisk område, som observert i mange reseptorer eller celleoverflatemolekyler. Slike transmembranproteiner oppbygger reseptorer eller celleoverflatemolekyler som monomerer, eller som homodimerer, heterodimerer eller oligomerer koblet til én eller flere kjeder med samme eller forskjellig aminosyresekvens.

Heri betyr et "ekstracellulært område" hele, eller en del av, en partiell struktur (et partielt område) fra hele strukturen til det ovenfor nevnte transmembranprotein hvori den partielle struktur foreligger utenfor membranen. Med andre ord betyr det hele eller en del av det området i transmembranproteinet som ikke inngår i membranen (transmembranområdet) og som ikke foreligger i cytoplasma etter transmembranområdet (det cytoplasmatiske område).

"Et fusjonspolypeptid" som inngår i den ovenfor beskrevne "proteinforbindelse" betyr et fusjonspolypeptid som omfatter hele eller en del av det ekstracellulære område fra et polypeptid som utgjør AILIM (fortrinnsvis AILIM) og "hele eller en del av det konstante området fra en immunglobulintungkjede (lg, fortrinnsvis humant IG)". Fusjonspolypeptidet er fortrinnsvis et fusjonspolypeptid med det ekstracellulære område fra AILIM og en del av det konstante område fra en human IgG-tunkjede, og spesielt foretrukket, et fusjonspolypeptid mellom det ekstracellulære område fra AILIM og et område (Fc) fra en human IgG-tungkjede som omfatter et hengselområde, et CH2-domene og et CH3-domene. Som IgG foretrekkes IgGl, og som AILIM foretrekkes AILIM fra menneske, mus eller rotte (fortrinnsvis menneske).

Uttrykket "hele eller en del av det konstante område fra en immunglobulin (Ig)-tungkjede" som anvendt heri, betyr det konstante område eller Fc-området fra en humant avledet immunglobulintungkjede (H-kjede), eller en del av dette. Immunglobulinet kan være ethvert immunglobulin tilhørende enhver klasse og enhver underklasse. Nærmere bestemt omfatter immunglobulinet IgG (IgGl, IgG2, IgG3 og IgG4), IgM, IgA (IgAl og IgA2), IgD og IgE. Immunglobulinet er fortrinnsvis IgG (IgGl, IgG2, IgG3 eller lgG4 eller IgM. Eksempler på spesielt foretrukne immunglobuliner ifølge foreliggende oppfinnelse er immunglobulinene som tilhører humant avledede IgG (IgGl, IgG2, IgG3 eller IgG4).

Immunglobuliner har en Y-formet, strukturell enhet i hvilken fire kjeder omfattende to homologe lettkjeder (L-kjeder) og to homologe tungkjeder (H-kjeder) er sammenbundet via disulfidbindinger (S-S-bindinger). Lettkjeden består av lettkjedens variable område (VL) og lettkjedens konstante område (CL). Tungkjeden består av tungkjedens variable område (VH) og tungkjedens konstante område (CH).

Tungkjedens konstante områder er oppbygd av noen domener med en aminosyresekvens som er spesiell for hver klasse IgG, IgM, IgA, IgD og IgE og hver underklasse IgGl, lgG2, IgG3 og IgG4, IgAl og IgA2).

Tungkjeden IgG (IgGl, IgG2, IgG3 og IgG4) er oppbygd av VH-domenet, CH1-domenet, hengselområdet,C^-domenet og Ch3-domenet, i denne rekkefølge fra N-enden.

På tilsvarende måte er tungkjeden i IgGl oppbygd av VH-domenet, Cyil-domenet, hengselområdet, Cyi2-domenet og Cyi3-domenet, i denne rekkefølge fra N-enden. Tungkjeden i IgG2 er oppbygd av VH-domenet, Cy2l -domenet, hengselområdet, Cy22-domenet og Cy23-domenet, i denne rekkefølge fra N-enden. Tungkjeden i IgG3 er oppbygd av Vn-domenet, Cy3l-domenet, hengselområdet, Cy32-domenet og Cy33-domenet, i denne rekkefølge fra N-enden. Tungkjeden i IgG4 er oppbygd av VH-domenet, Cy4l-domenet, hengselområdet, Cy42-domenet og Cy43-domenet, i denne rekkefølge fra N-enden.

Tungkjeden i IgA er oppbygd av VH-domenet, Cal-domenet, hengselområdet, Ca2-domenet og Ccc3-domenet, i denne rekkefølge fra N-enden.

På tilsvarende måte er tungkjeden i IgAl oppbygd av VH-domenet, Cyi 1-domenet, hengselområdet, Cyi2-domenet og Cyi3-domenet, i denne rekkefølge fra N-enden. Tungkjeden i IgA2 er oppbygd av VH-domenet, Cy21-domenet, hengselområdet, Cy22-domenet og Cy23-domenet, i denne rekkefølge fra N-enden.

Tungkjeden i IgD er oppbygd av VH-domenet, CS 1-domenet, hengselområdet, C82-domenet og C83-domenet, i denne rekkefølge fra N-enden.

Tungkjeden i IgM er oppbygd av VH-domenet, Cul-domenet, Cu2-domenet, C|x3-domenet, og Cu4-domenet i denne rekkefølge fra N-enden, og har intet hengselområde som observert i IgG, IgA og IgD.

Tungkjeden i IgE er oppbygd av VH-domenet, Cs 1-domenet, Cs2-domenet, Ce3-domenet, og Ce4-domenet i denne rekkefølge fra N-enden, og har intet hengselområde som observert i IgG, IgA og IgD.

Dersom for eksempel IgG behandles med papain, spaltes molekylet noe over mot N-enden, bortenfor disulfidbindingene som foreligger i hengselområdet hvor disulfidbindingene sammenbinder de to tungkjedene, slik at det dannes to homologe Fab i hvilke et tungkjedefragment bestående av VH og CH1 er koblet til en lettkjede via en disulfidbinding, og et Fc i hvilket to homologe tungkjedefragmenter som består av hengselområdet, Ch2-domenet og Cn3-domenet er sammenkoblet via disulfidbindinger. (Se "Immunology Illustrated", den originale 2. utgave, Nankodo, s 65 - 75 (1992), og "Focus of Newest Medical Science "Recognition Mechanism of Immune System", Nankodo s 4 - 7 (1991) og så videre).

Nærmere bestemt betyr "et område fra det konstante område i immunglobulintungkjeden" nevnt ovenfor en del av det konstante område i en immunglobulintungkjede med de strukturelle egenskaper som er nevnt ovenfor, og er fortrinnsvis et konstant område uten Cl-domenet eller Fc-området. Nærmere bestemt er et eksempel derpå et område som består av hengselområdet, C2-domenet og C3-domenet fra enten IgG, IgA og IgD, eller et område som består av C2-domenet, C3-domenet og C4-domenet fra enten IgM eller IgE. Et spesielt foretrukket eksempel derpå er Fc-området fra humant avledet IgGl.

Fusjonspolypeptidet nevnt ovenfor har også den fordel at det er ekstremt lett å rense ved anvendelse av affinitetskolonnekromatografi og utnyttelse av egenskapene til protein A som spesifikt bindes til immunglobulinfragmentet, siden fusjonspolypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse har en del av et konstant område (for eksempel Fc) fra et immunglobulin, for eksempel IgG som nevnt ovenfor, som en fusjonspartner. Siden forskjellige antistoffer mot Fc i forskjellige immunglobuliner er tilgjengelige, kan videre en immunanalyse for fusjonspolypeptidene lett utføres med antistoffer mot Fc.

"Et polypeptid som bindes til AILIM" inngår i "et polypeptid" som omfattes av definisjonen for den ovenfor beskrevne "forbindelse".

Et spesifikt eksempel på "et polypeptid som bindes til AILIM" er hele eller en del av et polypeptid som omfatter et kjent molekyl som betegnes "B7h, B7RP-1, GL50 eller LICOS som er en ligand eller som interagerer med AILIM (Nature, bind 402, nr, 6763,

s 827- 832,1999, Nature Medicine, bind 5, nr. 12, s 1365 - 1369,1999, J. Immunology, bind 164, s 1653 - 1657,2000, Curr. Biol, bind 10, nr 6, s 333 - 336,2000).

Polypeptidet er fortrinnsvis et polypeptid som omfatter hele eller en del av et ekstracellulært område fra de ovenfor beskrevne ligander (B7h, B7RP-1, GL50 eller LICOS), eller et fusjonspolypeptid som omfatter polypeptidet og hele eller en del av det konstante område fra en immunglobulintungkjede (fortrinnsvis humant immunglobulin). Her har uttrykkene "ekstracellulært område" og "konstant område fra immunglobulintungkjede" de samme betydninger som er angitt ovenfor.

Polypeptidene, deler av polypeptidet (fragmenter) og fusjonspolypeptidene nevnt ovenfor kan ikke bare fremstilles ved rekombinant-DNA-teknologi som nevnt ovenfor, men også ved en fremgangsmåte som er velkjent innen faget, for eksempel en kjemisk syntesefremgangsmåte eller en celledyrkningsfremgangsmåte, eller en modifikasjon av disse fremgangsmåtene.

"Antistoffet" ifølge foreliggende oppfinnelse kan være et polyklonalt antistoff (antiserum) eller et monoklonalt antistoff mot AILIM fra et pattedyr (spesielt foretrukket humant AILIM) som definert ovenfor, og er fortrinnsvis et monoklonalt antistoff.

Nærmere bestemt er antistoffet et antistoff med en aktivitet som inhiberer proliferasjon av AI LIM-uttrykkende celler ved å bindes til AILIM, eller som inhiberer dannelsen av interferon-y eller interleukin-4 fra AILIM-utrykkende celler ved å bindes til

AILIM.

Antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse kan være naturlige antistoffer erholdt ved å immunisere pattedyr som mus, rotter, hamstere, marsvin og kaniner med et antigen, for eksempel celler (naturlige celler, cellelinjer, tumorceller og så videre) som uttrykker AILIM ifølge foreliggende oppfinnelse, transformanter fremstilt ved anvendelse av rekombinant DNA-teknologi, slik at AILIM overuttrykkes på overflaten, polypeptider som utgjør AILIM, eller de ovenfor nevnte fusjonspolypeptider som omfatter AILIM-polypeptidet eller det ekstracellulære område fra AILIM. Antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter også kimære antistoffer og humaniserte antistoffer (CDR-transplanterte antistoffer) som kan dannes ved rekombinant DNA-teknologi, og humane antistoffer som kan fremstilles ved anvendelse av transgene dyr som danner humant antistoff.

Monoklonale antistoffer omfatter antistoffer av enhver isotype av IgG, IgM, IgA, IgD eller IgE. IgG eller IgM foretrekkes.

Et polyklonalt antistoff (antiserum) eller et monoklonalt antistoff kan fremstilles ved kjente fremgangsmåter. Nærmere bestemt immuniseres et pattedyr, fortrinnsvis en mus, en rotte, en hamster, et marsvin, en kanin, en katt, en hund, en gris, en geit, en hest eller en ku, eller mer foretrukket, en mus, en rotte, en hamster, et marsvin eller en kanin, med for eksempel et antigen som nevnt ovenfor, om nødvendig med Freunds adjuvans.

Et polyklonalt antistoff kan erholdes fra serum erholdt fra det således immuniserte dyr. 1 tillegg fremstilles monoklonale antistoffer som følger: Hybridomer fremstilles fra antistoffproduserende celler erholdt fra det således immuniserte dyr og myelomceller som ikke kan danne autoantistoffer. Hybridomene klones, og kloner som danner de monoklonale antistoffene med spesifikk affinitet for antigenet som ble benyttet for immunisering av pattedyret, erholdes ved screening.

Nærmere bestemt kan et monoklonalt antistoff fremstilles som følger: Immuniseringer utføres ved å injisere eller implantere én eller flere ganger et antigen som nevnt ovenfor som immunogen, om nødvendig med Freunds adjuvans, subkutant, intramuskulært, intravenøst, via fotputen eller intraperitonealt i et ikke-menneskelig pattedyr, nærmere bestemt en mus, en rotte, en hamster, et marsvin eller kanin, fortrinnsvis en mus, en rotte eller en hamster (innbefattet et transgent dyr fremstilt slik at det danner antistoffer avledet fra et annet dyr, for eksempel en transgen mus som danner humant antistoff som nevnt nedenfor). Vanligvis utføres immuniseringene én til fire ganger hver dag til hver fjortende dag etter den første immunisering. Antistoffproduserende celler erholdes fra det således immuniserte pattedyr tilnærmet én til fem dager etter siste immunisering. Hyppigheten av, og mellomrommene mellom, immuniseringene kan arrangeres på egnet vis, for eksempel avhengig av egenskapene til det benyttede immunogen.

Hybridomer som utskiller et monoklonalt antistoff kan fremstilles ved fremgangsmåten til Kohler og Milstein (Nature, bind 256, s 495-497 (1975)), eller en modifikasjon av denne. Nærmere bestemt fremstilles hybridomer ved å fusjonere antistoffproduserende celler som inngår i milt, lymfeknute, beinmarg eller tonsiller erholdt fra et ikke-menneskelig pattedyr immunisert som nevnt ovenfor, fortrinnsvis milt, med myelomer uten autoantistoff-dannende evne, fortrinnsvis avledet fra et pattedyr som mus, rotte, marsvin, hamster, kanin eller menneske, mer foretrukket mus, rotte eller menneske.

For eksempel kan de museavledede myelomer P3/X63-AG8.653 (653), P3/NSI/1-Ag4-1 (NS-1), P3/X63-Ag8.Ul (P3U1), SP2/0-Agl4 (Sp2/0, Sp2) PAI, FO, NSO eller BW5147 den rotteavledede myelom 210RCY3-Ag.2.3. eller de humant avledede myelomer U-266AR1, GM1500-6TG-A1-2, UC729-6, CEM-AGR, D1R11 eller CEM-T15 as som myelom i cellefusjonen.

Hybridomer som danner monoklonale antistoffer kan analyseres ved for eksempel å dyrke hybridomer i mikrotiterplater og måle reaktiviteten av dyrkningssupernatanten fra brønner i hvilke hybridomvekst observeres overfor immunogenet som ble anvendt for immuniseringen nevnt ovenfor, for eksempel ved en enzymimmunanalyse som RIA eller

ELISA.

Monoklonale antistoffer kan fremstilles fra hybridomer ved å dyrke hybridomene in vitro eller in vivo, for eksempel i ascitesvæsken hos mus, rotte, marsvin eller kanin, fortrinnsvis mus eller rotte, mer foretrukket mus, og isolere antistoffene fra den resulterende dyrkningssupernatant eller ascitesvæske fra et pattedyr.

Dyrking av hybridomer in vitro kan utføres, avhengig av for eksempel egenskapen til cellene som skal dyrkes, formålet med undersøkelsen og forskjellige betingelser forbundet med dyrkningsfremgangsmåten, ved anvendelse av kjente næringsmedier eller ethvert næringsmedium avledet fra kjente, basale medier for dyrking, opprettholdelse og lagring av hybridomene for dannelse av monoklonale antistoffer i dyrkningssupernatanten.

Eksempler på basalmedier er medier med lav kalsiumkonsentrasjon som Ham' F12-medium, MCDB153-medium eller MEM-medium med lav kalsiumkonsentrasjon, og medier med høy kalsiumkonsentrasjon som MCDB104-medium, MEM-medium. D-MEM-medium, RPMI1640-medium, ASF104-medium eller RD-medium. Basalmediene kan for eksempel inneholde serum, hormoner, cytokiner og/eller forskjellige uorganiske eller organiske forbindelser, avhengig av formålet.

Monoklonale antistoffer kan isoleres og renses fra dyrkningsupernatanten eller ascitesvæsken nevnt ovenfor ved utfelling med mettet ammoniumsulfat, euglobulinut-fellingsfremgangsmåten, kaproinsyrefremgangsmåten, kaprylsyrefremgangsmåten, ionebytterkromatografi (DEAE eller DE52) og ved affinitetskromatografi og anvendelse av en anti-immunglobulinkolonne eller en protein A-kolonne.

Et "rekombinant, kimært, monoklonalt antistoff" er et monoklonalt antistoff fremstilt ved genetisk modifisering og betyr nærmere bestemt et kimært antistoff, for eksempel et mus/menneske kimært, monoklonalt antistoff, hvis variable områder er avledet fra et immunglobulin fra et ikke-menneskelig pattedyr (mus, rotte, hamster osv.) og hvis konstante områder er avledet fra humant immunglobulin.

Et konstant område avledet fra humant immunglobulin har en aminosyresekvens som er spesiell for hver isotype, for eksempel IgG (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD og IgE. Det konstante område i de rekombinante, kimære, monoklonale antistoff kan være konstant område fra humant immunglobulin tilhørende enhver isotype. Det er fortrinnsvis et konstant område fra humant IgG.

Et kimært, monoklonalt antistoff kan for eksempel fremstilles som følger. Det er unødvendig å si at fremstillingsrfemgangsmåten ikke er begrenset til denne.

Et mus/menneske kimært, monoklonalt antistoff kan fremstilles ved henvisning til Experimental Medicine: SUPPLEMENT, bind 1,6, nr 10 (1988), og den behandlede, publiserte, japanske patentsøknad nr (JP-B) Hei 3-73280. Nærmere bestemt kan det fremstilles ved operativ innsetting av CH-genet (C-gen som koder for H-kjedens konstante område) erholdt fra DNA som koder for humant immunglobulin nedstrøms for aktive VH-gener (rearrangert VDJ-gen som koder for H-kjedens variable område) erholdt fra et DNA som koder for et monoklonalt museantistoff isolert fra hybridomer som danner det monoklonale museantistoff, og CL-genet (C-gen som koder for L-kjedens konstante område) erholdt fra et DNA som koder for humant immunglobulin nedstrøms for aktive VL-gener (rearrangert VJ-gen som koder for L-kjedens variable område) erholdt fra et DNA som koder for et monoklonalt museantistoff isolert fra en hybridom, i samme vektor eller i en forskjellig vektor på en uttrykkbar måte, fulgt av transformasjon av vertsceller med ekspresjonsvektoren og dyrking av transformantene.

Nærmere bestemt isoleres DNA først fra hybridomer som danner monoklonale museantistoffer ved den vanlige fremgangsmåte, kuttes med egnede restriksjonsenzymer (for eksempel EcoRI og Hindlll), fraksjoneres ved elektroforese (ved for eksempel anvendelse av en 0,7 % agarosegel) og analyseres ved Southern-blotting. Etter farging av elektroforesegelen, for eksempel med etidiumbromid, og fotografering, påføres gelen markørposisjoner, vaskes to ganger med vann og neddyppes i 0,25 M HC1 i 15 minutter. Gelen neddyppes så i en 0,4 NaOH-løsning i 10 minutter under forsiktig omrøring. DNA overføres til et filter i løpet av 4 timer ved den vanlige fremgangsmåte. Filteret gjenvinnes og vaskes to ganger med 2X SSC. Etter tilstrekkelig tørking av filteret bakes det ved 75 °C i 3 timer. Etter bakingen behandles filteret med 0,1 x SSC/0,1 % SDS ved 65 °C i 30 minutter. Filteret neddyppes så i 3 x SSC/0,1 % SDS. Det erholdte filter behandles med prehybridiseringsløsning i en plastpose ved 65 °C i 3 til 4 timer.

Deretter tilsettes P-merket probe-DNA og en hybridiseringsløsning til posen, og filteret får reagere ved 65 °C i tilnærmet 12 timer. Etter hybridiseringen vaskes filteret ved en egnet saltkonsentrasjon, reaksjonstemperatur og over et egnet tidsrom (for eksempel 2 x SSC/0,1 % SDS, romtemperatur, 10 minutter). Filteret overføres til en plastpose med et lite volum 2 x SSC og analyseres ved autoradiografi etter forsegling av posen.

Rearrangert VDJ-gen og VJ-gen som koder for H-kjeden og L-kjeden i et monoklonalt museantistoff påvises ved Southern-blottingen nevnt ovenfor. Området som omfatter det påviste DNA-fragment fraksjoneres ved sukrosetetthetsgradientsentrifugering og innsettes i en bakteriofagvektor (for eksempel Charon 4A, Charon 28, AEMB3 eller ÅEMBL4). E. coli (for eksempel LE392 eller NM539) transformeres med bakteriofag-vektoren slik at det dannes et genomisk bibliotek. Det genomiske bibliotek gjennomsøkes ved plakkhybridiseringsteknikk, for eksempel Benton-Davis-fremgangsmåten (Science, bind 196, s 180 - 182 (1977)) ved anvendelse av egnede prober (H-kjede-J-gen, L-kjede (ic)-J-gen og så videre) for erholdelse av positive kloner som omfatter rearrangert VDJ-gen eller VJ-gen. Ved fremstilling av et restriksjonskart og bestemmelse av nukleotidsekvensen til de erholdte kloner bekreftes det hvorvidt gener som omfatter det ønskede, rearrangerte VH (VDJ)-gen eller VL(VJ)-gen er erholdt.

Separat isoleres humant CH-gen og humant CL-gen som skal anvendes kimeriseringen. Dersom for eksempel et kimært antistoff med IgGl skal fremstilles, isoleres Cyl -genet som et Cn-gen og CK-genet som et CL-gen. Disse genene kan isoleres fra et humant genomisk bibliotek med Cyl-gen og Cic-gen fra mus, som tilsvarer humant Cyl-gen og humant CK-gen, som prober, idet man drar fordel av den høye homologi mellom nukleotidsekvensen til immunglobulingenet fra mus og det humane immunglobulingen.

Nærmere bestemt isoleres DNA-fragmenter som omfatter det humane CK-gen og et enhanserområde fra et humant genomisk X Charon 4A Haelll-AluI-bibliotek (Cell bind 15, s 1157-1174 (1978)), for eksempel ved anvendelse av et Hindlll-BamHI-fragment på 3kb fra klon Igl46 (Proe. Nati. Acad. Sei. USA., bind 75, s 4709-4713 (1978)) og et EcoRI-fragment på 6,8 kb fra klon MEP10 (Proe. Nati. Acad. Sei. USA., bind 78, s 474-478

(1981)) som prober. I tillegg innsettes for eksempel et fragment på 5,9 kb, erholdt etter kutting av humant, føtalt hepatocytt-DNA med Hindlll og fraksjonering ved agarosegel-elektroforese, i Å788, hvoretter humant Cyl-gen isoleres med probene nevnt ovenfor.

Ved anvendelse av således erholdt muse-VH-gen, muse VL-gen, humant CH-gen og humant CL-gen, og ved å ta promoterområdet og enhancerområdet i betraktning, innsettes det humane CH-gen nedstrøms for muse-Vn-genet, mens det humane CL-gen innsettes nedstrøms for muse-VL-genet i en ekspresjonsvektor, for eksempel pSV2gpt eller pSV2neo, ved hjelp av egnede restrisjonsenzymer og DNA-ligase ved den vanlige fremgangsmåte. 1 dette tilfellet kan kimære gener bestående av muse-VH-gen/humant Q rgen, henholdsvis muse-VL-gen/humant CL-gen innsettes i samme ekspresjonsvektor eller i forskjellige ekspresj onsvektorer.

Den eller de således fremstilte ekspresjonsvektorer med innsatt kimært gen innføres i myelomer som ikke danner antistoffer, for eksempel P3X63 • Ag8 • 653-celler eller SP210-celler, ved protoplastfusjonsfremgangsmåten, DEAE-dekstratrfemgangsmåten, kalsiumfos-fatfremgangsmåten eller elektroporeringsfremgangsmåten. Transformantene analyseres ved dyrking i medium som inneholder et medikament som tilsvarer medikamentresistensgenet som er innsatt i ekspresjonsvektoren, hvoretter celler som danner ønskede monoklonale antistoffer erholdes.

De ønskede, kimære monoklonale antistoffer erholdes fra dyrkningsupernatanten fra således analyserte antistoffdannende celler.

Det "humaniserte, monoklonale antistoff (CDR-transplanterte antistoff)" ifølge foreliggende oppfinnelse er et monoklonalt antistoff rfemstilt ved genetisk modifisering og betyr nærmere bestemt et humanisert, monoklonalt antistoff hvori en del eller hele det komplementaritetsbestemmende området i det hypervariable område er avledet fra de komplementaritetsbestemmende områder i det hypervariable område fra et monoklonalt antistoff fra ikke-menneskelig pattedyr (mus, rotte, hamster og så videre), hvor rammeverksområdene i det variable område er avledet fra rammeverksområdene i det variable område fra humant immunglobulin, og det konstante område er avledet fra et konstant område fra humant avledet immunglobulin.

De komplementaritetsbestemmende områder i det hypervariable område foreligger i det hypervariable område i det variable område i et antistoff og betyr tre områder som direkte og komplementært bindes til et antigen (komplementaritetsbestemmende aminosyrerester, CDR1, CDR2 og CDR3). Rammeverksområdene i det variable område betyr fire relativt konserverte områder som ligger oppstrøms, nedstrøms eller mellom de tre komplementaritetsbestemmende områder (rammeverksområder, FRI, FR2, FR3 og FR4).

Med andre ord betyr et humanisert monoklonalt antistoffet antistoff i hvilket alle områder, bortsett fra en del eller hele de komplementaritetsbestemmende områder i det hypervariable område fra et monoklonalt antistoff avledet fra et ikke-menneskelig pattedyr, er erstattet med de tilsvarende områder avledet fra et humant immunglobulin.

Det konstante område avledet fra humant immunglobulin har en aminosyresekvens som er spesiell for hver isotype, for eksempel IgG (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD og IgE. Det konstante område i et humanisert monoklonalt antistoff i foreliggende oppfinnelse kan være konstant område fra humant immunglobulin tilhørende enhver isotype. Det er fortrinnsvis et konstant område fra humant IgG. Rammeverksområdene i det konstante område avledet fra humant immunglobulin er ikke spesielt begrenset.

Et humanisert monoklonalt antistoff kan for eksempel fremstilles som følger. Det er unødvendig å si at produksjonsrfemgangsmåten ikke er begrenset til denne: For eksempel kan et rekombinant, humanisert, monoklonalt antistoff avledet fra et monoklonalt museantistoff fremstilles ved genetisk modifisering og henvisning til publisert japansk oversettelse av internasjonalt patentskrift (JP-WA) nr. Hei 4-506458 og JP-A Sho-62-296890. Nærmere bestemt isoleres minst ett CDR-gen fra muse-H-kjede og minst et CDR-gen fra muse-L-kjede tilsvarende muse-H-kjedens CDR-gen fra hybridomer som danner monoklonalt museantistoff, og humant H-kjedegen som koder for alle områder bortsett fra den humane H-kjedes CDR tilsvarende muse-H-kjedens CDR nevnt ovenfor og humant L-kjede-gen som koder for hele området bortsett fra den humane L-kjedes CDR tilsvarende muse-L-kjedens CDR nevnt ovenfor isoleres fra humane immunglobulingener.

De således isolerte CDR-gener fra muse-H-kjede og humane H-kjedegener innsettes operativt i en egnet vektor slik at de kan uttrykkes. På tilsvarende måte settes muse-L-kjedens CDR-gener og de humane L-kjede-gener operativt inn i en annen egnet vektor slik at de kan uttrykkes. Alternativt kan muse-H-kjedens CDR-gener/de humane H-kjedegener og muse-L-kj edens CDR-gener/de humane L-kjedegener innsettes operativt inn i samme ekspresjonsvektor på en uttrykkbar måte. Vertsceller transformeres med den således fremstilte ekspresjonsvektor for erholdelse av transformanter som danner humanisert monoklonalt antistoff. Ved dyrking av transformantene erholdes et ønsket, humanisert monoklonalt antistoff fra dyrkningsupernatanten.

Det "humane monoklonale antistoff' er et immunglobulin i hvilket alle områder som omfatter det variable og konstante område fra H-kjeden og det variable og konstante område fra L-kjeden som utgjør immunglobulinet, er avledet fra gener som koder for humant immunglobulin.

Det humane antistoff (fortrinnsvis det humane, monoklonale antistoff) kan fremstilles ved velkjente fremgangsmåter, for eksempel på samme måte som i fremstillings- fremgangsmåten for polyklonale eller monoklonale antistoffer nevnte ovenfor, ved å immunisere med et antigen et transgent dyr fremstilt ved å integrere minst ett humant immunglobulingen i immunglobulingenlocus hos et ikke-menneskelig pattedyr, for eksempel en mus.

For eksempel fremstilles en transgen mus som danner humane antistoffer ved fremgangsmåtene som er beskrevet i Nature Genetics, bind 7, s 13 - 21 (1994), Nature Genetics, bind 15, s 146 - 156 (1997), JP-WA Hei 4-504365, JP-WA Hei 7-509137, Nikkei Science, nr 6, s 40 - 50 (1995), W094/25585, Nature, bind 368, s 856 - 859 (1994) og JP-WA nr Hei 6-500233.

I tillegg kan en nylig utviklet teknikk for fremstilling av et humant avledet protein fra melk fra en transgen ku eller gris også benyttes (Nikkei Science, s 78 - 84 (april, 1997)).

Uttrykket "del av et antistoff' som anvendt i foreliggende oppfinnelse, betyr et delområde fra et monoklonalt antistoff som nevnt ovenfor. Det betyr nærmere bestemt F(ab')2, Fab', Fab, Fv (variabelt antistoff-rfagment), sFv, dsFv (disulfidstabilisert Fv) eller dAb (enkeltdomeneantistoff) (Exp. Opin. Ther. Patents, bind 6, nr. 5, s 441-456 (1996)).

"F(ab')2" og "Fab' " kan fremstilles ved å behandle immunglobulin (monoklonalt antistoff) med en protease som pepsin eller papain, og betyr et antistoff-fragment dannet ved å spalte immunglobulinet nær disulfidbroene i hengselområdene som foreligger mellom de to H-kj edene. Papain spalter for eksempel IgG oppstrøms for disulfidbindingene i hengselområdene som foreligger mellom de to H-kj edene slik at det dannes to homologe antistoff-fragmenter i hvilke en L-kjede som består av VL(L-kjedens variable område) og CL(L-kjedens konstante område) og et H-kjedefragment som består av Vh (H-kjedens variable område) og CHyl (yl-området i H-kjedens konstant område) er sammenkoblet i sine C-terminale områder via en disulfidbinding. Hvert av de to homologe antistoff-fragmentene kalles Fab'. Pepsin spalter også IgG nedstrøms for disulfidbindingene i hengselområdene som foreligger mellom de to H-kjedene slik at det dannes et antistoff-fragment som er noe større enn fragmentet i hvilket de to ovenfor nevnte Fab' er sammenkoblet i hengselområdet. Dette antistoff-fragment betegnes F(ab')2.

Uttrykket "transplantatrejeksjon" viser i foreliggende oppfinnelse til forskjellige immunresponser som prøver å avvise og fjerne et transplantat (en del av en levende kropp som er transplantert, en celle, et vev eller et organ) fra en donor hvis genetiske bakgrunn er forskjellig fra mottakerens (det vil si allotransplantasjon eller xenotransplantasjon), siden mottakeren gjenkjenner transplantatet som fremmed materiale. Immunresponsene som ledsager transplantasjonen kan oppdeles i (1) hyperakutt rejeksjon, som er en kraftig rejeksjon som opptrer umiddelbart etter transplantasjonen, (2) akutt rejeksjon, som observeres i løpet av noen fa måneder eller transplantasjonen, og (3) kronisk rejeksjon, som observeres flere måneder etter transplantasjonen. Videre er det slik at selv om cellulær immunitet grunnet immunkompetente celler representert ved T-celler, og humoral immunitet grunnet antistoffer, opptrer på en nøye koordinert måte, skjer hovedresponsen ved cellulær immunitet.

Som en følge av transplantatrejeksjonen blir transplantatet til slutt nekrotisk og faller av. Videre utvikler pasienten ikke bare alvorlige, systemiske symptomer som feber, leukocytose og tretthet, men også opphovning og ømhet i transplantasjonssetet. Videre kan alvorlige komplikasjoner som infeksjoner opptre.

Ved transplantasjon av et xenogent transplantat, for eksempel fra en gris, opptrer særlig det alvorlige problem forbundet med hyperakutt rejeksjon, hvorved transplantatet avvises i løpet av minutter.

Uttrykket "transplantat" ifølge foreliggende oppfinnelse viser til "et organ eller en del av et organ" eller "et vev" som transplanteres til et mottakerpattedyr fra et donorpattedyr.

Uttrykket "et organ eller en del av et organ" i forbindelse med transplantasjonen ifølge foreliggende oppfinnelse viser til et tilfeldig organ eller en del av dette som inngår i en levende pattedyrkropp (fortrinnsvis et menneske eller en gris, spesielt foretrukket et menneske). Et foretrukket eksempel er lever, hjerte, lunge, bukspyttkjertel, nyre, tykktarm, tynntarm eller en del av disse. Spesielt foretrukket er lever eller del av denne.

Begrepet "vev" i forbindelse med transplantasjonen ifølge foreliggende oppfinnelse viser til et tilfeldig vev avledet fra en levende pattedyrkropp (fortrinnsvis fra et menneske eller en gris, og mest foretrukket et menneske). Et foretrukket eksempel er et vev som hud, hornhinne, bein eller hjerteventil, begrepet er imidlertid ikke begrenset til disse.

Uttrykket "immunsupprimerende middel" viser i foreliggende oppfinnelse til ett eller flere immunsupprimerende midler som anvendes for undertrykkelse av en immunologisk rejeksjon (transplantatrejeksjon) i en mottaker forbundet med transplantasjon av et transplantat i klinisk transplantasjon av celler, vev eller organer, hvis fremstilling og salg som farmasøytisk middel er godkjent av en offentlig organisasjon, eller ett eller flere immunsupprimerende midler som i dag anvendes i kliniske eller prekliniske forsøk, eller som vil anvendes i kliniske forsøk i fremtiden, hvis fremstilling og salg som farmasøytisk middel kan bli godkjent av en offentlig organisasjon etter forsøkene.

Slike immunsupprimerende midler benyttes ikke bare alene, men også i kombinasjon med 2, 3 eller flere midler. Begrepet "immunsupprimerende middel" ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter derfor anvendelse av en enkel type farmasøytisk middel eller kombinert bruk av flere farmasøytiske midler (fortrinnsvis anvendt i kombinasjon med 2 eller 3 midler).

Det immunsupprimerende middel er fortrinnsvis for eksempel ett eller flere farmasøytiske midler utvalgt blant syklosporin (CsA), tacrolimus (FK-506), azatioprin (AZ), mykofenolatmofetil (MMF), mizoribin (MZ), leflunomid (LEF), adrenokortikale steroider (også betegnet adrenokortikale hormoner, kortikosteroid, kortikoid) som prednisolon og metylprednisolon, sirolimus (også betegnet rapamysin), deoksyspergualin (DSG), FTY720 (kjemisk navn: 2-amino-2-[2-(4-oktylfenyl)etyl]-l,3-propanediol-hydroklorid) og et "CTLA4-medikament" som beskrevet nedenfor. Tacrolimus (FK-506) og syklosporin foretrekkes spesielt, enten hver for seg eller sammen,

Begrepet "CTL4-medikament" ifølge foreliggende oppfinnelse viser til et medikament som inneholder som en aktiv bestanddel (1) et polypeptid som omfatter full-lengde (innbefattet molekylet med i det vesentlige samme aminosyresekvens), eller hele eller en del av det ekstracellulære område fra humant CTLA4 (cytotoksisk T-lymfocytt-assosiert antigen 4, <aminosyresekvens> GenBank aksesjonsbetegnelse NP 005205, <cDNA> Gen Bank aksesjonsbetengelse NM 005214), (2) et fusjonspolypeptid som omfatter hele eller en del av det ekstracellulære område fra humant CTLA4 og hele eller en del av et annet protein (spesielt foretrukket hele eller en del av det konstante område fra human immunglobulintungkjede) (i det påfølgende forkortet (CTLA4-IgFc eller CTLA4-lg), eller (3) et DNA som kan tilføre til et pattedyr (spesielt foretrukket et menneske) polypeptidet ifølge (1) eller fusjonspolypeptidet ifølge (2), eller en vektor som omfatter dette DNA (spesielt foretrukket er et plasmid som generelt anvendes i genterapi eller en virusvektor avledet fra et virus (retrovirus, adenovirus, adeno-assosiert virus og så videre) eller lignende).

Heri har alle begrepet/uttrykk som "ekstracellulært område", "en del av", "konstante område fra immunglobulintungkjeden", "fusjonspolypeptid" og "i det vesentlige samme" samme betydning som definert ovenfor.

Det foreligger en rekke rapporter vedrørende den signifikante immunsupprimerende virkning av det ovenfor nevnte CTL4-Ig. For eksempel har den høye immunsupprimerende virkning av Y100F (tyrosin i posisjon 100 er erstattet med fenylalanin) utviklet av Bristol-Myers Squibb/Repligen blitt bekreftet i forskjellige dyreforsøk, og dette produkt inngår også som et av CTLA4-medikamentene ifølge foreliggende oppfinnelse (Igaku no Ayumi, bind 194, nr 14, s 1195-1200,2000, J. Clin. Invest. bind 103, s 1223-1225, 1999, N. Engl. J. Med. bind 335, s 1369-1377,1996, J. Exp. Med. bind 178, s 1801-1806,1993, Blood, bind 94,

s 2523-2529,1999, Nature Med. bind 6, s 464-469,2000, Blood, bind 83, s 3815-3823, 1995, J. Clin. Invest., bind 2, s 473-482, 1998, Blood, bind 85, s 2607-2612, 1995, N. Engl. J. Med. bind 340, s 1704-1714,1999, N. Engl. J. Med. bind 335, s 1369-1377,1996, J. Clin. Invest., bind 103, s 1243-1252, 1999).

Uttrykket "farmasøytisk akseptabelt bærerstoff" ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter en eksipiens, et fortynningsmiddel, et fyllstoff, et dekomponeringsmiddel, en stabilisator, et konserveringsmiddel, en buffer et emulsjonsmiddel, et aromatisk middel, et fargestoff, et søtningsmiddel, et viskositetsforhøyende middel, et smaksstoff, et solubilitets-økende middel eller et annet tilsetningsstoff. Ved anvendelse av ett eller flere slike bærer-stoffer kan et farmasøytisk preparat utformes til tabletter, piller, pulvere, granulater, injeksjoner, løsninger, kapsler, drops, eliksirer, suspensjoner, emulsjoner, siruper osv.

Det farmasøytisk preparat kan tilføres oralt eller parenteralt. Andre former for parenteral tilførsel omfatter en løsning for ekstern påføring, en stikkpille for rektal tilførsel og et pessar, foreskrevet på den vanlige måte, som omfatter én eller flere aktive bestanddeler.

Dosen kan variere avhengig av pasientens alder, kjønn, vekt og symptomer, virkningen av behandlingen, tilførselsveien, behandlingstidsrommet, typen aktiv bestanddel ("forbindelsen" ifølge foreliggende oppfinnelse nevnt ovenfor) som inngår i det farmasøytiske preparat og så videre. Vanligvis kan det farmasøytiske preparat tilføres til et voksent individ i en dose på fra 10 u.g til 1 000 mg (eller 10 |ig til 500 mg) pr tilførsel. Avhengig av forskjellige tilstander kan en dose som er lavere enn ovenfor være tilstrekkelig i noen tilfeller, mens en dose som er høyere enn den nevnt ovenfor kan være nødvendig i andre tilfeller.

Når det gjelder en injeksjon kan denne fremstilles ved å løse eller suspendere et antistoff i et ikke-toksisk, farmasøytisk akseptabelt bærerstoff, for eksempel fysiologisk saltvann eller kommersielt tilgjengelig destillert injeksjonsvann, idet konsentrasjonen justeres innenfor området fra 0,1 \ ig til 10 mg antistoff/ml bærerstoff. Den således fremstilte injeksjon kan tilføres til en menneskelig pasient med behov for behandling i et doseringsområde fra 1 u.g til 100 mg/kg kroppsvekt, fortrinnsvis i området fra 50 \ ig til 50 mg/kg kroppsvekt, én eller flere ganger daglig. Eksempler på tilførselsveier er medisinsk egnede tilførselsveier som intravenøs injeksjon, subkutan injeksjon, intradermal injeksjon, intramuskulær injeksjon, intraperitoneal injeksjon eller lignende, fortrinnsvis intravenøs injeksjon.

Injeksjonen kan også fremstilles i et ikke-vandig fortynningsmiddel (for eksempel propylenglykol, polyetylenglykol, vegetabilsk olje som olivenolje og alkohol som etanol), suspensjon eller emulsjon. Injeksjonen kan steriliseres ved filtrering gjennom et bakteriefiltreringsfilter, ved innblanding av et bakteriedrepende middel eller ved bestråling.

Injeksjonen kan fremstilles på en slik måte at den skal klargjøres på brukstidspunktet. Nærmere bestemt frysetørkes den, slik at den er et sterilt, fast preparat som kan løses i sterilt destillert injeksjonsvann eller et annet løsemiddel før bruk.

Det farmasøytiske preparatet ifølge foreliggende oppfinnelse er ekstremt anvendbart for undertrykkelse, forebyggelse og/eller behandling av immunologisk rejeksjon (transplantatrejeksjon), noe som er et alvorlig problem ved behandlingsformer hvori et organ (lever, hjerte, lunge, nyre, bukspyttkjertel osv.), eller en del av et organ eller et vev (f. eks. hud, hornhinne og bein) fra en donor transplanteres (allotransplanteres eller xenoplanteres) til en mottaker som lider av en alvorlig kardiovaskulær sykdom.

Videre kan det farmasøytiske preparat ifølge foreliggende oppfinnelse forsterke virkningen på undertrykkelse av transplantatrejeksjon (immunologisk rejeksjon) ved eksisterende immunsupprimerende midler, tilført for å understreke transplantatrejeksjon under slike transplantasjonsbehandlinger dersom det farmasøytiske preparat anvendes i kombinasjon med de immunsupprimerende midler.

Kort beskrivelse av figurene

Fig. 1 viser virkningen av et anti-AILIM-antistoff og/eller et immunsupprimerende middel på undertrykkelse av immunologisk rejeksjon (transplantatrejeksjon) forbundet med organtransplantasjon ved å bruke som mål den forlengede transplantatoverlevelse i en mottaker som fikk transplantert lever fra en donor. Fig. 2 viser virkningen på undertrykkelse av immunologisk rejeksjon (transplantatrejeksjon) som ledsager organtransplantasjon ved anti-AILIM-antistoff og/eller et immunsupprimerende middel, hvor det som mål benyttes antall dager med transplantatoverlevelse i den transplanterte lever fra en donor til en mottaker. Fig. 3 viser virkningen av undertrykkelse av immunologisk rejeksjon (transplantatrejeksjon) forbundet med organtransplantasjon ved anti-AILIM-antistoff (også kalt anti-ICOS-antistoff), hvor det benyttes som mål antall dager med transplantatoverlevelse av det transplanterte hjerte fra en donor til en mottaker. Fig. 4 er et fotografi som viser graden av infiltrasjon av AILIM-uttrykkende celler i et transplantert hjerte. Fig. 5 viser virkningen av undertrykkelse av immunologisk rejeksjon (transplantatrejeksjon) forbundet med organtransplantasjon ved anti-AILIM-antistoff og/eller AdCTLA4-Ig, hvor det benyttes som mål antall dager med transplantatoverlevelse av det transplanterte hjerte fra en donor til en mottaker. Fig. 6 viser virkningen av et anti-AILIM-antistoff i rekombinasjon med AdCTLA4-Ig på undertrykkelse av immunologisk rejeksjon (transplantatrejeksjon) forbundet med organtransplantasjon, hvor det som mål benyttes forekomst eller fravær av transplantatoverlevelse av et transplantert hjerte (primær hjertetransplantasjon og sekundær hjertetransplantasjon) og transplantert hud (primær hudtransplantasjon) i en mottaker.

Den beste utførelse av oppfinnelsen

I det påfølgende vil foreliggende oppfinnelse illustreres spesifikt ved henvisning til eksempler, men dette skal ikke oppfattes som at oppfinnelsen er begrenset til utførelsene beskrevet i eksemplene.

Eksempel 1

Understrekelse av transplantatrejeksjon ved en AILIM-modulerende forbindelse ved levertransplantasjon

Materialer og fremgangsmåter

Dvr

Voksne Lewis-rotter (hannrotter, 210-250 g) og DA-rotter (hannrotter, 210-250 g) ble anvendt som mottakere henholdsvis donorer.

Monoklonalt anti- rotte- AILIM- antistoff

Et monoklonalt antistoff renset fra ascitesvæske eller dyrkningssupernatant erholdt ved dyrking in vitro eller in vivo av den tidligere rapporterte hybridom betegnet "JTT-1" (denne hybridom har blitt internasjonalt deponert den 11. oktober 1996 hos National Institute of Bioscience and Technology, Ministry of Economy, Trade and Industry, som er en internasjonal deponeringsagent godkjent under Budapestkonvensjonen. Internasjonal aksesjonsbetegnelse nr. FERM BP-5707) som danner et monoklonalt anti-rotte-AILIM-antistoff fra mus (monoklonalt anti-rotte-JTT-1-antigen-antistoff fra mus) ble anvendt (JP-A Hei 11-29599 (Eksempel 1 og 2), og internasjonal søknad nr. W098/38216 (Eksempel 1 og 2)). I det påfølgende betegnes dette antistoff for enkelthets skyld "anti-AILIM-antistoff.

Levertranspl antasi on

Ifølge den tidligere rapporterte fremgangsmåte til Kamada et al. ble lever fra DA-donorrotter transplantert i Lewis-mottakerrotter (Surgery, 93, s. 64, 1983; Transplantation, 30, s. 43, 1980; Transplantation, 28, s. 47, 1979).

Nærmere bestemt ble lever erholdt fra DA-rotter, vasket ved å la isavkjølt sterilt destillert vann gjennomstrømme leveren fra portalvenen. Deretter ble levertransplantasjonen i Lewis-mottakerrotter innledet ved å overbinde den suprahepatiske vena cava. Ved anvendelse av mansjett-teknikken ble så portalvenen og den infrahepatiske vena cava overbundet. (Transplant. Proe, 19, s. 1158,1987, Transplantation, 43, s. 745, 1987).

Dersom mottakerrottene døde i løpet av 3 dager etter avsluttet transplantasjon, ble dette ansett som en teknisk feil ved transplantasjonen. 95 % av transplantasjonene var vellykkede.

Tilførsel av anti- AILIM- antistoff og/ eller et immunsupprimerende middel

Etter fullført transplantasjon ble anti-AILIM-antistoff og/eller det immunsupprimerende middel FK-506 tilført til hver av Lewis-rottene (hvor hver gruppe omfattet 5-9 dyr) i de doser og på de tidspunkt som er angitt nedenfor. Dagen hvor transplantasjonen ble fullført, ble regnet som dag null (0).

Gruppen som verken ble tilført anti-AILIM-antistoff eller det immunsupprimerende middel FK-506, ble benyttet som kontrollgruppe.

1. Anti-AILIM-antistoff (1 mg/kg, intravenøs injeksjon, dag 0)

2. Anti-AILIM-antistoff (1 mg/kg, intravenøs injeksjon, dag 0 og 6)

3. Anti-AILIM-antistoff (1 mg/kg, intravenøs injeksjon, dag 0,3 og 6)

4. Anti-AILIM-antistoff (1 mg/kg, intravenøs injeksjon, dag 0, 3, 6, 9 og 12) 5. Anti-AILIM-antistoff (0,3 mg/kg, intravenøs injeksjon, dag 0, 3, 6,9 og 12)

6. FK-506 (1 mg/kg, intramuskulær injeksjon, dag 0)

7. Anti-AILIM-antistoff (1 mg/kg, intravenøs injeksjon, dag 0) og FK-506 (1 mg/kg, intramuskulær, dag 0)

Varigheten av transplantatoverlevelse av den transplanterte lever i mottakeren ble evaluert og bestemt ifølge Kaplan-Meier-analysen.

Resultater

Resultatene er vist i Fig. 1 og Fig. 2. Noen av verdiene i Fig. 2 er oppdateringer av verdiene i Fig. 1.

Resultatet var at i gruppen som ble tilført anti-AILIM-antistoff (1 mg/kg) 3 ganger eller 5 ganger over et tidsrom etter transplantasjonen, ble en signifikant forlengelse av overlevelse av den transplanterte lever observert, sammenlignet med kontrollgruppen.

I gruppen som ble tilført en lav dose av anti-AILIM-antistoff (0,3 mg/kg) 5 ganger i et tidsrom etter transplantasjonen, ble en tilsvarende signifikant forlengelse av overlevelsen av den transplanterte lever også observert.

Dersom anti-AILIM-antistoffet ble tilført kun én gang i kombinasjon med FK-506, som er et immunsupprimerende middel som anvendes klinisk for flere formål, ble overraskende nok overlevelsen av den transplanterte lever svært forlenget, betydelig lenger enn dersom kun FK-506 (1 mg/kg) ble tilført én gang.

Disse resultater viste følgende:

1) Anti-AILIM-antistoffet understreket i vesentlig grad transplantatrejeksjon (immunologisk rejeksjon) forbundet med transplantasjon av et transplantat, f. eks. et organ. 2) Transplantatrejeksjon forbundet med transplantasjon av et transplantat, f. eks. et organ, kan undertrykkes videre ved å anvende anti-AILIM-antistoffet i forbindelse med et immunsupprimerende middel, sammenlignet med undertrykkelsen som oppnås dersom kun ett av disse midler benyttes.

Eksempel 2

Undertrykkelse av immunologisk rejeksjon ved en AILTM-modulerende forbindelse ved hjertetransplantasjon (Del 1)

Reagenser, dyr og analysefremgangsmåte

Dyr

Voksne C3H/He-mus (hannmus, 6 uker gamle) og BALB/c-mus (hannmus, 6 uker gamle) ble anvendt som mottakere, henholdsvis donorer.

Fremstilling av et monoklonalt anti- muse- AILIM- antistoff

Fremstillingen ble utført som følger:

Anvendelse av cDNA som koder for fullengde-aminosyresekvensen for det tidligere rapporterte muse-AILIM (Int. Immunol, bind 12, nr. 1, s. 51-55, 2000), en transformert celle som uttrykte muse-AILIM fremstilt ifølge standard fremgangsmåter og benyttelse av genetisk rekombinasjonsteknologi.

Den transformerte celle ble homogenisert og ultrasentrifugert (100 000 x g), og nedsentrifugert materiale innbefattet cellemembranfraksjonen ble oppsamlet og suspendert i PBS. Den erholdte cellemembranfraksjonen ble injisert sammen med komplett Freunds adjuvans i fotputen hos en Wistar-rotte for innledende injisering (dag 0). I tillegg ble cellemembranfraksjonen tilført som antigen i fotputen på dag 7, dag 14 og dag 28. To dager etter siste immunisering ble celler fra lymfeknute oppsamlet.

Lymfeknutecellene og musemyelomcellene PAI (JCR nr. BOI 13, Res. Disclosure, bind 217, s. 155, 1982) ble blandet i et forhold på 5:1, og hybridomer som blandet monoklonalt antistoff, ble fremstilt ved fusjon av cellene ved anvendelse av polyetylenglykol 4000 (Boehringer Mannheim) som fusjonsmiddel. Hybridomseleksjonen ble utført ved dyrking i et HAT-holdig ASF104-medium (Ajinomoto) tilsatt 10 % føtalt bovint serum og aminopterin.

Fluorescencintensiteten av celler farget ved å la dyrkningssupernatanten fra hver hybridom reagere med de ovenfor nevnte transfekterte celler som uttrykte rekombinant muse-AILIM, fulgt av reaksjon med FITC-merket anti-rotte-IgG (Cappel), ble målt ved anvendelse av et EPICS-ELITE "flow"-cytometer for å bekrefte reaktiviteten overfor muse-AILIM av de monoklonale antistoffer som ble dannet i dyrkningssupernatanten fra hver hybridom. Resultatet var at flere hybridomer som dannet monoklonale antistoffer med reaktivitet mot muse-AILIM, ble erholdt.

Én av disse hybridomer ble betegnet "Bl0.5". Denne hybridomen (IO<6>til IO7 celler/0,5 ml/per mus) ble injisert intraperitonealt i en TCR nu/nu-mus (hunnmus, 7 til 8 uker gammel). Ti til tjue dager senere ble laparotomi utført på musen under bedøvelse, og fremstilling i stor skala av monoklonalt anti-muse-AILIM-antistoff fra rotte (IgG2a) ble utført fra den erholdte ascites ifølge standard fremgangsmåter. I det påfølgende betegnes dette antistoff for enkelthets skyld "anti-AILIM-antistoff.

Hjertetransplantasjon

Ved å følge den tidligere rapporterte fremgangsmåte ble hjerter fra BALB/c-donormus transplantert til ukulen hos CrH/He/mottakermus. Opphørt pulsering av det transplanterte hjerte ble ansett som fullført transplantatrejeksjon.

Eksperiment 1 ( tilførsel av anti- AILIM- antistoff)

Hver CrH/He-mus (10 mus) som hadde gjennomgått transplantasjonen, ble tilført anti-AILIM-antistoff (10 mg/kg) umiddelbart etter transplantasjonen (dag 0: 200 \ ig), på dag 2 (200 ug), dag 4 (200 ug, dag 7 (200 ug) og dag 10 (100 jxg). Gruppen som ikke ble tilført anti-AILIM-antistoff (25 mus), ble anvendt som kontroll.

Varigheten av overlevelse av det transplanterte hjerte i mottakeren etter transplantasjonen ble evaluert og bestemt ifølge Kaplan-Meier-analysen.

Gjennomsnittlig varighet av overlevelse av det transplanterte hjertet i mottakerne var som følger:

( gruppe tilført anti- AILIM- antistoff)

varighet av transplantatoverlevelse: 9 dager i 1 mus, 10 dager i 3 mus, 13 dager i 4 mus, 16 dager i 2 mus

( kontrollgruppe)

varighet av transplantatoverlevelse: 6 dager i 2 mus, 7 dager i 9 mus, 8 dager i 7 mus, 9 dager i 3 mus, 10 dager i 4 mus

Varigheten av transplantatoverlevelse i kontrollgruppen som ikke ble tilført anti-AILIM-antistoff, var 7,9 dager, mens den i motsetning til dette var 12,3 dager i gruppen tilført anti-AILIM-antistoff, og en signifikant forlengelse av overlevelsen av det transplanterte hjerte ble påvist i gruppen tilført anti-AILIM-antistoff.

Eksperiment 2 ( tilførsel av anti- AILIM- antistoff)

Dyrene (donorer og mottakere) og det benyttede anti-AILIM-antistoff var som nevnt ovenfor.

Hjertetransplantasjonen ble utført på tilsvarende måte som i Eksempel 1.

Hver C3H/He-mus som hadde gjennomgått transplantasjonen, ble tilført anti-AILIM-antistoff (100 p.g/dag) intraperitonealt umiddelbart etter transplantasjonen (dag 0), på dag 2, dag 4, dag 7 og dag 10. Gruppen som ikke fikk tilført anti-AILIM-antistoff ble benyttet som kontroll.

Gjennomsnittlig varighet av overlevelse av det transplanterte hjerte i mottakermusene var tilnærmet 7,7 dager i kontrollgruppen, mens den var tilnærmet 40,9 dager (intermediær verdi: 29 dager/maksimal verdi: 120 dager) (Fig. 3). Nærmere bestemt ble det observert en signifikant forlengelse av overlevelse av det transplanterte hjerte i gruppen tilført anti-AILIM-antistoff.

Ved hematoksylin/eosin-farging (HE-farging) ifølge standard fremgangsmåter ble videre graden av infiltrasjon av AILIM(ICOS)-uttrykkende celler i det transplanterte hjerte analysert, både i kontrollmusene (ingen terapeutisk behandling etter hjertetransplantasjonen) og i musene som ble tilført anti-AILIM-antistoff etter transplantesjonen.

Resultatet var at en signifikant infiltrasjon av AILIM (ICOS)-uttrykkende celler ble observert i den ubehandlede gruppe, så vel som nekrose av hjertemuskelen (den fargede delen). I det transplanterte hjertet hos en mus som var tilført anti-AILIM-antistoff, ble derimot nekrose av hjertemuskelen ikke observert, og en signifikant reduksjon av infiltrasjonen av AILIM (ICOS)-uttrykkende celler ble bekreftet (fig. 4).

Eksempel 3

Undertrykkelse av immunologisk rejeksjon ved AILIM-modulerende forbindelser ved hjerte- og hudtransplantasjon

Reagenser, dyr og analysefremgangsmåte

Adenovirusvektor

Et rekombinant adenovirus som inneholder en ekstra ekspresjonskassett med enten cDNA som koder for hCTLA4-Ig (fusjonsprotein som omfatter det ekstracellulære området fra humant CTLA4 og humant Fc) eller P-galaktosidasegenet fra E. coli (LacZ) ble fremstilt ved homolog rekombinasjon mellom ekspresjonskosmidkassetten pAdex/CAhCTLA4-Ig (Transplantation, bind 68, nr 6, s. 758, 1999) og genomet til utgangsstammen til adenoviruset (Proe. Nati. Acad. Sei. USA, bind 90, nr. 24, s. 11498-11502, 1993).

Deretter ble det rekombinante virus oppformert i cellelinjen 293, avledet fra human nyre. Virusvektoren som ble fremstilt på denne måte, ble oppsamlet og lagret ved nedfrysing ved -80 °C. Det rekombinante adenovirus som inneholdt cDNA for hCTLA4-Ig og adenoviruset som inneholdt LacZ, ble betegnet AdCTLA4-Ig henholdsvis AdLacZ.

Dyr og antistoff

Voksne (210-250 g) Lewis (RT1') -hannrotter ble anvendt som mottakere og voksne (210-250 g) DA (RTl<a>)-hannrotter eller BN (RTl<n>)-hannrotter ble anvendt som donorer.

Det monoklonale anti-rotte-AILIM-antistoff fra mus fremstilt i eksempel 1 ble benyttet.

Hjerte- og hudtransplantasjon og analysefremgangsmåte

Ifølge en tidligere rapportert fremgangsmåte (J. Thorac. Cardiovasc. Surg, bind 57, nr. 2, s. 225-229, 1969) ble hjerter fra DA-rotter transplantert til bukhulen til Lewis-rotter. Umiddelbart etter hjertetransplantasjonen ble et anti-rotte-AILIM-antistoff (1 mg/kg) og/eller AdCTLA4-Ig (IO<9>plakkdannende enheter, pfu) tilført intravenøst i en enkelt dose til mottakerrotten.

Gruppen med transplanterte dyr som verken ble tilført anti-rotte-AILIM-antistoff eller AdCTLA4-Ig, og gruppen med transplanterte dyr som ble tilført AdLacZ i stedet, ble benyttet som kontroller. Behandlingsfremgangsmåten for hver dyregruppe er som vist nedenfor.

Gruppe 1: Allotransplantasjon (Lewis/DA) uten immunsupprimerende behandling.

Gruppe 2: Isotransplantasjon (Lewis/Lewis) uten immunsupprimerende behandling.

Gruppe 3: Allotransplantasjon (Lewis/DA) med tilførsel av AdLacZ.

Gruppe 4: Allotransplantasjon (Lewis/DA) med tilførsel av AdCTLA4-Ig.

Gruppe 5: Allotransplantasjon (Lewis/DA) med tilførsel av anti-AILIM-antistoff.

Gruppe 6: Allotransplantasjon (Lewis/DA) med tilførsel av AdCTLA4-Ig og anti-AILIM-anti stoff.

Opphørt pulsering av det transplanterte hjertet ble ansett som fullført transplantatrejeksjon. Transplantatrejeksjonen ble bekreftet ved histologisk analyse av mononukleære celler som infiltrerte det transplanterte hjertevev og nekrose av muskelcellene ved HE-farging ifølge standard fremgangsmåter.

Deretter ble et tilstrekkelig tykt hudtransplantat fra en DA-donorrotte transplantert til den laterale toraksvegg hos mottakerrottene i gruppe 4 og gruppe 6, i hvilke det transplanterte hjerte overlevde i lengre tid, på dag 140 etter hjertetransplantasjonen. Etter hudtransplantasjonen ble immunsupprimerende behandling med anti-AILIM-antistoff, AdCTLA4-Ig eller lignende ikke utført. Opphørt overlevelse av hudtransplantatet ble ansett å være når visuelt observerbart hudtransplantat var redusert til 10 % eller mindre av utgangstilstanden.

På dag 200 etter den innledende transplantasjonen av DA-rottehjertet ble så hjertet fra en donor-DA-rotte på nytt transplantert ved benyttelse av mansjetteknikken (Acta. Pathol. Microbiol. Scand. [A], bind 79, nr. 4, s. 366-372, 1971) til cerviksområdet på 3 mottakerrotter fra gruppe 6, som viste transplantatrejeksjon etter å ha mottatt donortransplantater.

På dag 150 etter den innledende hjertetransplantasjon fra DA-donor-rotter ble videre BN-donor-rottehjerter transplantert til de gjenværende mottakermus fra gruppe 6, i hvilke det transplanterte hjerte overlevde over lengre tid.

Statistisk evaluering av overlevelsesgraden av transplantatet i mottakerne ble utført ifølge Kaplan-Meier-analysen.

Undersøkelsesresultater

Som vist i fig. 5 ble det ikke observert signifikant forlengelse av overlevelsen av det transplanterte hjertet i mottakere, sammenlignet med gruppen med ubehandlede dyr som mottok xenotransplantater (gruppe 1), for gruppen med dyr (gruppe 3) tilført AdLacZ og for gruppen med dyr som ble tilført en enkelt dose av anti-AILIM-antistoff) (gruppe 5).

For gruppen med dyr tilført AdCTLA4-Ig var derimot overlevelsen av det transplanterte hjertet (det opprinnelig transplanterte DA-rottehjerte) signifikant forlenget (gjennomsnitt: tilnærmet 64 dager). Hos 3 rotter fra gruppe 4(10 rotter) ble videre overlevelse av det transplanterte hjertet over et lengre tidsrom på 100 dager eller mer observert (fig. 5).

I gruppen av dyr hvor AdCTLA4-Ig og anti-AILIM-antistoff ble anvendt i kombinasjon (gruppe 6) var overlevelsen av det transplanterte hjertet (det opprinnelige DA-rottehjerte) forlenget i ubegrenset tid (300 dager eller mer) hos alle mottakere (fig. 5).

Hos mottakerrottene fra gruppe 4 ble det transplanterte hjertet (det opprinnelig transplanterte hjerte DA-donorrottehjerte) avvist sammen med avvisning av transplantert hud, mens rejeksjon av det transplanterte hjertet ikke ble observert hos mottakermus fra gruppe 6.

Som vist i fig. 6 ble den transplanterte hud avvist hos alle mottakerrotter fra gruppe 4 og gruppe 6 som fikk transplantert hud fra en donor. I motsetning til gruppe 4 og kontrollgruppen, i hvilke avvisningen av den transplanterte hud var fullført i løpet av 12 dager eller mindre etter hustransplantasjonen, var fullført rejeksjon noe forsinket og ble observert i løpet av 16 dager eller mindre i gruppe 6. Dette resultat viser at kombinert anvendelse av AdCTLA4-Ig og anti-AILIM-antistoff kan forsinke avvisningen av den transplanterte hud, sammenlignet med det tilfellet hvor AdCTAL4-Ig anvendes alene.

Hos mottakermusene fra gruppe 6, for hvilke lang tids overlevelse av det transplanterte hjerte (det opprinnelige DA-rottehjerte) ble bekreftet, ble interessant nok den transplanterte hud fullstendig avvist som nevnt ovenfor, men transplantatoverlevelse ble observert i ubegrenset tid for det andre transplanterte hjerte (DA-donorrottehjerte transplantert for annen gang). Hos mottakerrottene overlevde videre det opprinnelig transplanterte donorhjerte gjennom hele undersøkelsen.

Hos mottakere fra gruppe 6 med transplantert BN-donorhjerte fortsatte det opprinnelig transplanterte DA-rottehjerte å pulsere og overlevde gjennom undersøkelsen, mens BN-donorrottehjertene som ble transplantert for annen gang, ble avvist i løpet av et tidsrom som tilsvarer resultatene fra dyr fra gruppe 1.

Industriell anvendbarhet

De farmasøytiske preparater ifølge foreliggende oppfinnelse er ekstremt anvendbare for undertrykkelse, forebyggelse og/eller behandling av immunologisk rejeksjon (transplantatrejeksjon), et alvorlig problem forbundet med behandling ved transplantasjon (allotransplantasjon eller xenotransplantasjon) av organer (lever, hjerte, lunge, nyre, bukspyttkjertel osv.), deler av organer eller vev (hud, hornhinne, bein osv.) fra donorer til mottakere som lider av alvorlige kardiovaskulære sykdommer.

De farmasøytiske preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også i større grad undertrykke transplantatrejeksjoner ved anvendelse i kombinasjon med eksisterende immunsupprimerende midler som tilføres for å undertrykke transplantatrejeksjon (immunologisk rejeksjon) ved slik transplantasjonsbehandling.

Videre er et farmasøytisk preparat som omfatter et humant antistoff mot AILIM som inngår i de farmasøytiske preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse, et ekstremt anvendbart medikament siden det ikke gir bivirkninger, f. eks. allergi, som observeres dersom antistoff avledet fra mus tilføres til mennesker.

Claims (12)

1. Anvendelse av en forbindelse som har en aktivitet for å modulere signal-overføring formidlet av AILIM for fremstilling av et medikament for suppresjon, behandling eller forebyggelse av transplantatawisning etter transplantasjon av lever, hjerte eller en del derav, der nevnte forbindelse er utvalgt fra enhver av a) til e) nedenfor; a) et antistoff som bindes til AILIM, eller en del av antistoffet, b) et polypeptid som omfatter hele eller en del av et ekstracellulært område av AILIM, c) et fusjonspolypeptid som omfatter hele eller en del av et ekstracellulært område av AILIM og hele eller en del av et konstant område fra tungkjedeimmunoglobulinet, d) et polypeptid som binder til AILIM, og e) et antisense-DNA eller et antisense-RNA mot AILIM.

2. Anvendelse av en forbindelse som har en aktivitet for å modulere signaloverføring formidlet fra AILIM for fremstilling av et medikament for forsterkning av virkningen av et eller flere immunsupprimerende midler på suppresjonen, behandlingen eller forebyggelsen av transplantatawisning etter transplantasjon av lever, hjerte eller en del derav, der forbindelsen er utvalgt fra de følgende punkter a) til e); a) et antistoff som bindes til AILIM, eller en del av antistoffet, b) et polypeptid som omfatter hele eller en del av et ekstracellulært område av AILIM, c) et fusjonspolypeptid som omfatter hele eller en del av et ekstracellulært område av AILIM og hele eller en del av et konstant område fra tungkjedeimmunoglobulinet, d) et polypeptid som binder til AILIM, og e) et antisense-DNA eller et antisense-RNA mot AILIM.

3. Anvendelse ifølge krav 2, hvori det immunosupprimerende middel er ett eller flere terapeutiske midler utvalgt fra gruppen bestående av azatioprin, adrenokortikal steroid, syklosporin, mizoribin og tracrolimus (FK-506), mykofenolatmofetil, leflunomid, sirolimus, deoksyspergualin, FTY720 og et CTLA4-medikament.

4. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 1-3, for anvendelse i kombinasjon med tacrolimus FK-506 og/eller CTLA4-medikament.

5. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 1-4, hvori transplantasjonen er allotransplantasjon eller xenotransplantasjon.

6. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 1-5, hvori forbindelsen er et antistoff som binder til AILIM, eller en del av antistoffet.

7. Farmasøytisk preparat for anvendelse ved suppresjon, behandling eller forebyggelse av transplantatawisning etter transplantasjon av lever, hjerte eller en del derav, der preparatet omfatter en forbindelse som har en aktivitet for å modulere signaloverføring formidlet av AILIM utvalgt fra hvilket som helst av punktene a) til e) nedenfor, og en farmasøytisk akseptabel bærer; a) et antistoff som bindes til AILIM, eller en del av antistoffet, b) et polypeptid som omfatter hele eller en del av et ekstracellulært område av AILIM, c) et fusjonspolypeptid som omfatter hele eller en del av et ekstracellulært område av AILIM og hele eller en del av et konstant område fra tungkjedeimmunoglobulinet, d) et polypeptid som binder til AILIM, og e) et antisense-DNA eller et antisense-RNA mot AILIM.

8. Farmasøytisk preparat for anvendelse ved forsterkning av virkningen av ett eller flere immunsupprimerende midler på suppresjon, behandling eller forebyggelse av transplantatawisning etter transplantasjon av lever, hjerte eller en del derav, der preparatet omfatter en forbindelse som har en aktivitet til å modulere signaloverføring formidlet av AILIM utvalgt fra hvilket som helst av a) til e) nedenfor, og en farmasøytisk akseptabel bærer; a) et antistoff som bindes til AILIM, eller en del av antistoffet, b) et polypeptid som omfatter hele eller en del av et ekstracellulært område av AILIM, c) et fusjonspolypeptid som omfatter hele eller en del av et ekstracellulært område av AILIM, og hele eller en del av et konstant område fra tungkjedeimmunoglobulinet, d) et polypeptid som binder til AILIM, og e) et antisense-DNA eller et antisense-RNA mot AILIM.

9. Farmasøytisk preparat ifølge krav 8, karakterisert ved at det immunsupprimerende middel er ett eller flere terapeutiske midler utvalgt fra gruppen bestående av av azatioprin, adrenokortikal steroid, syklosporin, mizoribin og tracrolimus (FK-506), mykofenolatmofetil, leflunomid, sirolimus, deoksyspergualin, FTY720 og et CTLA4-medikament.

10. Farmasøytisk preparat ifølge ethvert av kravene 7 til 9, for anvendelse i kombinasjon med tacrolimus (FK-506) og/eller et CTLA4-medikament.

11. Farmasøytisk preparat ifølge ethvert av kravene 7 til 10, karakterisert ved at transplantasjonen er allotransplantasjon eller xenotransplantasjon.

12. Farmasøytisk preparat ifølge ethvert av kravene 7 til 12, hvori forbindelsen er et antistoff som binder til AILIM eller en del av antistoffet.