HU228045B1 - Graft rejection suppressing agents - Google Patents

Description

Beültetett szerv vagy szövet (“gra§7) kilökődéséi: sznppresszálő hatóanyagok

A találmány tárgyit képezik olyan gyógyászati készítmények, amelyek “aktiváció által indukálható íimfodta immnnmíxiulátor-molekuls” (“AiLIM”, amelyeket indukálható kostimulátorkést, ICÖS-ként is ismerünk), különösen az ARIM által közvetített jelátviteli folyamatok biológiai aktivitását moduláló aktivitással rendelkező anyagot, tartalmaznak, máj, szív vagy ássák egy része ttanszplantacióját kísérő graftkilökodés elnyomásában. kezelésében vagy megelözéséban -történő alkateazásta, ahol az anyag az alábbi, (a)-tól (e) anyagok közül választott:

isi AIUM-fesz kötődő antitest vagy az antitest része;

(fc) A1LIM exíraeellnláris régiója egészét vagy tószét tartalmazó polipeptid;

(c) AII.ÍM extocelbláris régiója egészét vagy részét és ínusnuglobuhn-ndsézlánc konstans tógiólának egészét vagy részét tartalmazó tótóós polipeptid;

(d) AILIM-hoz kötődő polipeptid; és (e) AILIM elleni entisser-sz. DNS vagy antlszensz RNS.

A találmány tárgyát képezik továbbá az AILIM által közvetített jelátviteli felysnutok biológisi aktivitását moduláló aktivitással rendelkező anyag alkalmazásai az említeti gyógyászati alkalmazásra szolgáló gyógyszer elöálliíására,

ElŐnyösett, a. találmány tárgyát képezik olyan gyógyászati készítmények, amelyek AlLiM-et expresszié sejtek: proliferáiációját moduláló (pl. gátló), vagy ΑΠ.,ϊΜ-et expresszáló sejtek eitokintemreléséi (pl. yinterfenm-termelésőt vagy interieukin-4-temtelését} moduláló (pl, gátló) aktivitással rendelkező anyagot tartalmaznak.

Még specifikusahbas a találmány tárgyát képezik 1} szerv, szerv része vagy szövet átültetésével együtt járó szöveti kilökődést reakció Cgraítkilökődes’. immunológiai kilökődés) gátlását, kezelését vagy megelőzését szolgáló gyógyászati készítmények; és 2} szerv, szerv· része vagy szövet átültetésével együtt járó szöveti kllöfcődésí reakció (“graSkilökődés'', ismmnolőgiai kilökődés) inunuaszappresszív hatóanyagai gátló, terápiás vagy megelőző Itatása megnövelésére szolgáló gyógyászati készítmények,

Áz alábbiakban ismertettük a taláimánv hátterét.

A szervátültetést szabályozó törvények legutóbbi felülvizsgálata következtében végrehajtottak néhány szervátültetést Japánban agyhalott betegek szerveit felhasználva. Az egyik esetben egy donortól hőt beteg kapott, szerveket. Ezek után a szervátültetések száma várhatóan növekszik majd.

Másrészről az olyan japán betegek száma, akik. súlyos kardiovnszkuláris betegségben, szenvednek, mint például májbeíegségekbeii (akut májelégtelenség, májcirrózis stb.), szívbetegségekben (súlyos szívelégtelenség, kardíoffiiopátia, szrimagyofebodás), stb.), vesebetegségekben (veseelégtedenség, krónikus girnoerateneírííísz, diabetikus osfepália, pielortefeiíiss, stb,), tüdőbetegségekben (mindkét tüdő működésképtelensége stb.) és a hasnyálmirigy betegségeiben (diabeteszes betegek kezelése), akik szántára a terápiás szervátültetés életmentő íkh,}, becslések szerint évente körülbelül 6ÖÖ-zal emelkedik a szívbetegek, körülbelül 30ŐÖ-rel a májbetegek és körülbelül őöü-zaí a tüdőbetegek esetében. Míg a jogi helyzet fejlődött, az átültethető szervek hiánya pillanat.nyilag reális, létező probléma. Hasonló módon & szervek hiánya, komoly probkbua az Egyesüli Államokban, amely a szervátültetés szempontjából fejlett állam. Az Egyesüli Államokban (1999-ben) megközelítőleg 43ÖÖan várnak, szívátültetésre, és (1999-ben) megközelítőleg 430ÖÖ-en veseátültetésre, Ténylegesen megközelítőleg SOö-att illetve ntegközelüőleg 23öö-an halnak meg minden évben, mert nem jutnak szív- és veseátültetéshez.

Szövet (sha rí. bőr, szmáaáríya és csont) vagy szerv (mint pl ra&j, szív, vese, tüdő és hasnyáteirigy) átültetése magában foglal: 1) anto-traRszpfemációt (áuteiőg transzplantációt), 2) izo-tra-rszplantáclót, 3) .aUotranszpíaotácioi és 4) retjo-tr<íuszplaatácict.

Az anto-ö-mszplantácio kbéiezésen énjük azt, ha egy személy esetében a test egy részéi máshova átültetjük, példaként embijök azt, ha égés kezdésekor a saját, normál bőrt az-érintett területre átültetjük,

As izotraaszplaní&iót homogén, állatok: között ítajtják végre. Emberek esetében ilyen átültetésé hajtanak végje egypetéjű ikrek között (pl. vesék vagy májszővetek átültetése).

Alb-feaíiszpíslantáciői hajtanák végre két különböző személy -««etében, akik genetikai háttere különböző; ilyen átültetést Rakattak végre kátpetsjü ikrek között vagy egymással nem rokon egyének között.

Xeno-trsmszplantássót hajtanak végre: különböző áRatfajekhoz tartozó egyedeit között. Példaként emlitjök azt az esetet, amikor csimpánz vagy sertés szövetét vagy szervét emberbe ültetik

Amint, fent említettük, az agyhalob. betegekből törtetni aílo-tmnszpbritáciő (száma) várhatóan növekedni fog a szervátültetéssel kapcsolatos törvényhozás fejlődése- következtében, Az- átültethető -szervek abszolút hiányának megoldása céljából különböző kutatásokat végeznek, amelyek a xeötbtranszplaatáeiő, apccibküsabban a nem Román emlős, mint példánl a sertés szövetei vagy szervei emberbe történő transzplantációja gyakorlati alkalmazásait célozzák meg.

Az átültethető szövetek és szervek hiánya várhatóan megoldható az agyhalálra és transzplantációra vonatkozó törvények fejlődésével és a xeoo-imssspiantácios technikák javulásával, azonban egy másik, szélsőségesen nagy akadály az ako-traaszplaotáoióval és xeso-trartSzpiaRtáclóvai kapcsolatos betegségek kezelése. Még speci&kusafebao sz akadály a mcípsemben, a donortól származó szervek vagy szövetek mmszpiantációja után .fellépő súlyos immunológiai kilökődés (graf'tkiiőködés).

A graffkilökődés alatt azokat a különböző immunválaszokat értjük, amellyel a donortól beültetett szövet, grafí (élő test része, amelyet átültetünk, sejt, szövet vagy szerv) kilökésére és megsemmisítésére törekszik, ahol & donor genetikai báltere a Terápiásétól -eltérő (azaz öllo-baoszplantácló vagy xeno-Rajaszplaotáció esetében), mivel a recicns a gvo/i-oí idegen anyagként Ismeri fel. Az átültetést kísérő immunválaszok a kővetkezőképpen osztályozhatók: 1) Riperakut kilökődés, amely a transzplantációi követően azonnal fellépő erős kilökődés! reakció, 2) akut kilökődés, amely a. transzplantáció után néhány hónappal figyelhető meg, és 3) krónikus sransplaníáeió, amely a iraoszplasíácié után jó néhány hónappal lép fel.. Ráadásul a fo válaszreakciót a sejtes immunitás^ adja, noha a sejtes immunitást a T-scjtek által képviselt inununkompetens sejtek adják, és a butnoráhs immunitást bonyolultan koordinált antitestek adják,

A graSkilökódés eredíuényeképp a graft végső soron nekrotíkussá válik és: leesik. Ráadásul a recípieas nemcsak súlyos tüneteket mutat, mint például a láz, leukochőzís és kimerültség, hanem a transzplaatácső helyén duzzadást és érzékenységet is. Ráadásul súlyos komplikációk, mint például fertőzések is felléphetnek.

Közelebbről xenogéa grair, mint például: sertésből származó graft átültetésekor súlyos probléma, a hiperakut kilökődés lép lék amikor a gok perceken belől kilökődik.

.Korlátozóit számú, az immunkompeíens sejtek működését elnyomó Rnmtmszuppresszív hatóanyagot alkalmaznak az ilyen R.aoszplaíRáeiőkkal járó immtmológiai kilökődés (graftkilökődés) elnyomására, mivel az ailo-úonszplsoíáeió által okozott immunológiai kilökődést főképp a eelluláris immunitás okozza. Ilyen irrmamszuppressziv hatóanyag többek között a ciklospods. (CsA), a takmlimus (FK.-50Ö), az azattóprin (AZ), a ísbkotcnolát-mofetil (MbfE), a ndzoribie (MZ), a lefiunomid (LEE), az adreookortikális szteroiook (más néven adrenokortíkahs fecsratottok, kortikoszteroldok, kortikoidekk mint például a predrtízolon és metii-preördzolon, sirolimus (más néven ragaíniein), dezoxi-spergualtó (DSö) és ΕΪΎ72.0 (kémiai -neve·: 2-ammo.-2-[2-(4oki íl fentijei il]-1 ,3-príípándiobbidrt)kksríd).

A €T.l..A4-et és CDSk-ai, amelyek a T-sejtek aktiválásához szükséges kostímulátór-szignál jelátviteléért felelős molekulák (kosiímulatódei-átviteli molekulák), és különösen a CTLA-hatóanyagokat, amelyek a CLL.A4 oldható régióját és as azt kódoló gént alkalmazzák, szintén kifejlesztették klinikáikig immunsztippressziv hatőanyagokként.

Másrészt az utóbbi időben a €TLA4»hez és a CI>2b-hoz hasonlóan, amelyek kostimulátor-szigoál jelátviteli molekulák, egy aktiválással indukálható itórfocita muaumuodulátoxos molekulának nevezett molekulát (AILIM; humán, egér- és paíkányereáetü) (Int. Immunoi., 12(1), 51-55 (2000)1, amelyet neveznek indukálható kostimulátomak is fiCÖS; humán eredetű) [Natúré, 397(6716): 263-266 (1999); J. Immunoi.. 166(1): I (2000); L Immunoi., 1.65(9): 5035 (2000); Bteefeem. Siophys, Rés. Commun., 276(1): 335 (2000); Irarsunity, 13(1): 95 (2000); J. Exp. Med,, 192(1): 53 (2060); Eím J. Immunot, 30.(4): 1040 (2000);], a harmadik, olyas kostimuMtoros jelátviteli molekulaként .azonosították, amely .a límfoclták (mint pl, a T-sejtek) aktiválásához szükséges második jelet ^cosbmulátotjd) továbbítja, és a jellel kapcsoltan szabályozza sz aktivált limfeeíták .(mim pl. a T-sejtek) működését

Az AILIM-mcílekulávai kapcsolatos legutóbbi vizsgálatok megállapításai alapján az AlLlM-tuoIekulárőí valószínűsítik, hogy szerepet játszhat különböző betegségekben (például autoimmun betegségekben, allergiákban és gyulladásokban), amelyeket immunkotnpeíens sejtek, mint pl. a T-sejtek. (különösei· a T-sejtek) aktiválódása okoz. Nincs közlemény azonban az AlLIM-molekula és a szövet- vagy szervátültetést kísérő grafekilökődés (immunológiai kilökődés) közötti bármilyen öszefeggésról, valamint olyan kísérlet sem ismert, amely során az: ilyen, szövet- vagy szervátültetést kísérő kilökődés! reakciókat az AtLIM-möiekula aktivitásának modulálásával nyomták el, kezelték vagy előzték meg.

Ráadásul nemrég azonosítottak egy áj molekulát, amelyet B7h-nsk, S7RP-3-nek, GLdö-nck vagy LICOS-nak neveztek el, és amelyről feltételezik, hogy a kosthrnilátoriel-átviteií molekulával, az A.1L1Mmolekulával .kölcsönhatásba lépő iigandam. (Natúré, 402(0763: 827-832. (1999); Natóre Medleine, 5(12); 13651369 (1999); J. immunolgy, .164; 1653-1657 (2ÖOO); Cmr. Bioi, 10(6): 33-336 (2000)1.

E kétféle ój molekala, ©év szerint az AILIM (ICOS) és a B7RP-1 (B7Í5, GI.50, LICOS) azonosítása bizonyította, hogy a CD26 és CDS0 (B7-Í) : CD86 (B7-2) között és a CTI.A4 és CI3S0 (B7-1) / CÖS6 (B7-2) között az ismert első és a második jelátviteli reakx-iöutakon kívül van egy áj, hannadik kosíitnníátor jelátviteli reakcióik, amely alapvető a íustóciták, mint a T-sejtek fent ismerteteti, aktiválásához és az aktivált T-sejtek olyan működése tentrolljáhsz, amely az AILIM (1CÖS) és a B7RP-1 (B7h, GESO, IJCOS) közötti kölcsönhatáson at fejtik ki hatásukat.

Alapos vizsgálatok vasnak folyamatban a fenti új molekulák biológiai szerepeivel, a limfociták, mint a T-sejtek működésének a harmadik kösttmuláíer jelátvitel által való szabályozásával, valamint az új jelátvitel és a betegségek összefüggésével kapcsolatban.

Közelebbről, a találmány célja eljárások és gyógyászati hatóanyagok biztosítása a szövet vagy szerv átültetését {allo&ausz^lant&ciót vagy xenotrsnszpiaaíáeiót) kísérő immunológiai kilökődés (graftkitókődés) elnyomása, kezelése vagy megelőzése céljából., orvosi és gyógyászati technikák (pl. gyógyászati hatóanyagok, mint

- 4 ♦ * például alacsony tneiekalaíÖmegS vegyületek és antitestek) alkalmazásával, egy új molekula, az AÍÍ.IM biológiai működése modulálására, amely tudásunk szériát íimibeiták, mist például T-sejíek aktiválásához szükséges második jel (kostitnaláter-szígnái) átviteléért felelős, és a jelhez kapcsolódóan .modulálja az aktívák .{ítnfociták, mint például az aksivákT-sejtck működését

A találmány szerinti megoldás egy másik célja eljárás- biztosítása a létező manunszuppresszív hatóanyagok (cikktsporm, azatiopiridin, adreaefcmtíkáhs szteroidok EK-SGő, stb.) gr&ftkilőkődésre gyakorolt sznppressziv hatásának növelésére az olyas gyógyászati hatóanyagok alkalmazásával, amelyek modulálják az AILIM biológiai működését {például gyógyászati hatóanyagok, mim az alacsony molekulatömegü vegyületek és antitestek).

Az endőseredeíá ARIM. biológiai funkciójára és az immunológiai kilökődésre {gtafödlőködés, amely graft, azaz sejt, szövet vagy szerv JsmnszpWttóóját, az a'lltűjsms^lantációt vagy xenotranszpisníácíot kísérő súlyos probléma) vonatkozó alapos kutatások eredményeképpen azt találtuk, hogy 1) az ARJM működésének modulálása jelentős mértékben, elnyomja, a szövet (szövetek) vagy szerv (szervek) transzplantációját kísérő immunológiai kilökődést (gtuAkilökédés), és 2) a létező immunsznppresszív hatóanyagok graftkilöködésre gyakorolt elnyomó hatását megnöveli az olyan gyógyászati hatóanyagok alkalmazása, amelyek az AILIM működését modulálják. Ezen felismerések alapján megalkottuk a találmányt.

A találmány tárgyát képező gyógyászati készítmény alkalmazható gyógy szerként .az olyan, különböző reakciók ín vívó modulálására, amelyekben szerepet játszik a kostimuláltorjel AILIM-expresszáló sejtekbe, AILIM által történ» átvitele (például AllJM-cspresszáló sejtek proiiferácíéja, ARJM-axpresszáló sejtek eitokintemieiése, AlLIM-expresszálő sejtek, iummsncitolízise vagy apoptózisa, és AILíM-exptesszáló sejtekkel szembeni antitest-függő eelluláris crtotoxícltás indukálására irányuló aktivitás), és/vagy az olyan, különböző betegségek fellépése és/vagy kifejlődése megelőzésére szolgáló gyógyszer, amely betegségben az AILIM általi jelátvitel .szerepet játszik, és a betegségek kezelésére vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer.

Előnyösen, a találmány tárgyát képező gyógyászati készítmény modulálhatja (elnyomhatja,, vagy elősegítheti) az AILIM-expresszsió sejtek proltfeációjáí, vagy modulálhatja (gátolhatja, vagy elősegítheti) az ΑΙΠΜ-expresszáló sejtek eítukhttertneléséí (például. γ-iuterferon vagy mterleukia-4), és megelőzheti az olyan, különböző, fiziológiai jelenségek által okozott betegség-állapotokat, amelyekben az. AILIM által közvetített jelátvitel szerepet játszik, és lehetővé teszi a különböző betegségek kezelését vagy megelőzését,

A találmány lárgyát képező gyógyászati készítmény alkalmazása lehetővé teszi az immunológiai kilökődés (graíikílökődés) elnyomását, megelőzései és/vagv kezelését, amely jelenség súlyos probléma az olyan terápiákban, ahol donortól szátmazó szervet (májat, szivet, tüdőt, vesét, hasnyálmirigyet, stb.) vagy annak egy részét, vagy szövetet (mint például bőrt, szaruhártyát és osostot) ültetnek át (aikítranszplartíádó vagy xeuoírauszpl&ntáció által) stdyos, kardiövaszkuiárs betegségben szenvedő recipienshe.

Ráadásul a találmány tárgyát képező gyógyászati készítmény lehetővé teszi az ilyen teatiszpktutáctós terápiákban az immunológiai kilökődés elnyomása céljából beadod, létező Immuttszuppreszív hatóanyagok gratikílökődésre gyakorolt elnyomó hatásának megnövelését,

Elöttyösebbsti, a találmány tárgyát képezik:

1. Gyógyászati készítmény szerv, szerv része vagy szövet transzplantációját kísérő gradkilökődés elnyomására, kezelésére vagy megelőzésére, amely tartalmaz AILIM által közvetíteti jelátviteli moduláló ativitássai rendelkező anyagot és gyógyámtilag elfogadott hordozót.

* *

2. Gyógyászati készítmény egy vagy több amnsszuppresszív hatóanyag szerv, szerv része vagy szövet transzpí&suáeíóját kísérő graSkilökodés: elnyomására, kezelésére vagy megelőzésére gyakorolt hatása növelésére, amely gyógyászati készítmény tartalmaz ÁXUM által közvetített jelátvitelt moduláló stívítássai rendelkező anyagot és gyógyászatilag elfogadod hordozót

3. A 2) gyógyászati készítmény, ahol az immusszuppresszív hatóanyag lehet azahoprín,. aárenokornkális szerűid, cíklosporin, tnizoribin és takrolmasz (FK.-5P6), nrlhofenolát-nxűfetíl, leflösoreád, szirollmnsz, desoxispsrgulamin, FTY?29, és CTLA4 hatóanyag.

4. Az 1-3. pontok bármelyike .alatti gyógyászati készítmény, ahol a transzplantáció alfetranszpíantáciö,

5. Az 1-3. pontok bármelyike .alatti gyógyászati készítmény, ahol a fca»S2píaatáctá xenotranszplaniáeiő.

6. Az 1-5. pontok bármelyike alatti gyógyászati készítmény, ahol a szerv a máj, a szív, a vese, a tüdő vagy a hasnyálmirigy.

7. Az 1 -5.. pontok bármelyike· alatti gyógyászati késziünésy, ahol a szövet bőr, szaruháriy-a vagy csontszövet,

8. Az 1-7. pontok bármelyike alatti gyógyászati készítmény, ahol az anyag fehégetetmészeüi: anyag.

9. A 8. pont szerinti gyógyászati készítmény, ahol a fehérjetermészetű anyag lehet:

a) ΑΙΪ,ΙΜ-hez kötődő antitest, vagy az antitest része;

b) ÁXUM extracdluláris régióját vagy annak részéi tartalmaz,® polipepiid;

c) A1LIM. exiracdhiláris régióját vagy annak részét, és immnaglohoiis-nehézlánoot vagy annak részét tartalmazó fúziós polipeptid; é,s

d) az AlLÍM-hez kötődó polipeptid.

10. Az 1-7. pontok bármelyike szerinti gyógyászati készítmény, ahol az anyag nem fehérietermészető anyag.

11. A IO. pont szerinti, ahol a sem fehérjetertnészeíá anyag DNS, RNS vagy kémialbg szintetizált vegyül®·..

Az. alábbiakban a találmány részletes leírását adjak meg s kifejezések és a találmányban alkalmazod anyagok előállítására szolgáló eljárások meghatározásával.

Az „emlős kifejezésen értünk emberi, szarvasmarhát, kecskét, nyalat, egeret, patkányt, hörcsögöt és aranyhörcsögöt; előnyösen embert, szarvasmarhát, patkányt, egeret vagy aranyhörcsögöt, és különösen előnyösen embert,

Az „AJLIM kifejezésen az „aktiválással indukálható limibcha hmmmmoíinlátor-ntolekula” rövidítését érijük, és olyan, emlöseredetü sejtfelszíni molekulát jelöl» amely szerkezetét és funkcióját korábbi közleményekben leírták fi. ImmimoL 166(1): 1 (2001); J, hamsad.,, 165(9):: 5025 (2Ö00); Siochem, Síophys, Rés. Cömman,, 276(1): 235 (2990); hmmmhy, B(l): 95 (2006); 1. Bxp. Med„ 192(1): 53 (2090); Enr. I Immunok, 39(4): 1040 (2000); fot ImmmmL 12(1): 51 (2000); Natúré, 397(0716): 263 (1999); GenBanksxárn:SAA§2129 (humán eredetű); BAA82128 (patkány eredetű); BAAS2127 (egy pstkányeredeíű változat):; B AA82126 (egérsredetü)l,

OlSsősen előnyösen & kifejezés hantán eredetS AIUM-et jelöl [példánk Imernadosal Imm-mology, .1.2(1): SÍ-55 (20ŐÖ)j.

.Az AlLLM-et nevezik ICOS-nak is [Natee, 397(6716): 263-266 (1999)], vagy JTT-í/ÍTT-S-aotigónBek {(JP-A) Hét 11-29599. sz. sem vizsgált, közzétett japán szabadalmi bejelentés, 5VO9S/3821Ó. sz., nemzetköz,!

- 6 szabadalmi bejekmtés], és széké: a molekulákat említve kölcsönösen ugyanazt a smiekulá· értjük.

Ráadásul az „ΑΠ..ΤΜ” kifejezésen értünk többek közöd olyan poiípeptíáet, amely aminosav^zekvcncíája mindegyik emlős esetében a korábban idézett irodalomban Íeirí az AiLiM-szekvemáa, és különösen előnyösen a humán eredetű A'íUM-mel azonos aruiuesav-szekveaeiájü polipeptidet. Ráadásul az „AlLINf ’ kifejezésen értünk többek között a korábban azonosított, paíkányerededl [GesBaak-szátn: BÁA82127] ÁHJM-váitotaokhoz hasonló, tanát? eredetű AILIM'-vsItezatokst

Az „alapvetően azonos atnlnosav-szekveíjciájü” kifejezésen azt értjük, hogy a találmány szmatl „AII-IM” tartalmaz olyan polipeptidet, amely annnossv-szekvencíájsbsu több aminosav, előnyösen 1-íO aminosav, különösen előnyösen 1-5 aminosav szuhsztiíttáiva, -deistáivá ás/vagy ínödositva,, és tartalmaz olyan, polipeptidet, amely andnosav-szekvesioiájához több aminosav, -előnyösen l-'i'Ö aminosav, különösen előnyösen 1 -5 aminosav vau hozzáadva, feltéve, hogy a polípeptidek alapvetően a korábbi közleményekben bemutatót;, axninosav-szekvenmát tartalmazó- polipeptidekkel azonos biológiái tulajdonságokkal rendelkeznek.

Az ammosavaík ilyen .szabsztitöeiói, deléeiói vagy beillesztései végrcb&jfhatóak a szokásos eljárások alkalmazásával [Rspentneutal Meáielne: kiég, kötet, „Haudboek. o.f Gettetic Esgineering” (.1992), stb.j.

A szintetikus oligonnkleottd alkalmazásával végrehajtott heiyspeeiSkes jnntagenezisre („gapped duplex” ellátás) példaként enüithejtük a pcmt-muíagenezlst, amely során ponlxnutácíót viszünk be véletlenszerűen nitritíel vagy szulfáttól való kezeléssel, amely eljárással deléeiós mutánst állítunk elő .SA/3/-enzimmel és így tovább, a kazetta-tnutógeuezlst, :a „llnker eljárást, a „hibás beépülés” eljárási, a „hibás” láncindltö eljárás?, a

DNS-sztígtnens-szintézis eljárást, stb.

A szintetikus olígonukleoSlddal végrehajtott helyspeeifdsns rmttageuezis („gapped” duplex eljárás) vég.rehajtfeató például a következők szerint. A. mötagemzální szándékozott régiót „umber” mutációt tartalmazó M'13-ingvektorba klónozzak egyiáneú fág-DNS előállítása céljából Az „amber” mutációt nem tartalmazó RF-IM13-ing DNS-ét restrikciós enzimmel -történő kezeléssel Imearízáljuk, maid a DNS-t összekeverjük a fenti:, egyláneü fág-DNS-sel, dtenateáljdk és armeiálássak vetjük alá, „g&pped duplex” DNS-t kialakítva. Eloállftttök „gapped duplex” DNS-sel Szintetikus ollgonukleotidot, amelybe mutációkat, viszünk be, valamin? zárt, cirkuláris, kettösláncú DNS-t a ÖNS-pblímerázanl és DNS-ligázzal való kezeléssel, .Aíismatch repaif aktivitásában, defjciens /»«&' ΙΪ. enb'-seíteket ezzel a DNS-sel transzfekeiőnak vetünk alá, Szupresszor-aktivitóssai nem.rendelkező Ii. eoő'-sejteket fertőzünk & felszaporitott fágokkal, és csak az „amber” mutációval nem rendelkező fágokra szknnelunk,

A pontmuíáciök nitrirtel törtónó. bevitelekor például az alábbi élvet alkalmazzuk. A DNS-t oitrníel kezelve a nökleottdok dezanwtálódnak, és az adtad hipoxsntisná, a citozín uraciíiá és a guania xantinná alakul át. Ha dezamiaálí DNS-t juttatunk a sejtbe, az ,A:T” és „G:C” ,,G:C’ -vei és „A:T’-vel helyettesttöáik, mivel a hipoxaattn, az oraeil és a xantia eitozinnak adeninnel és trminnei lép bázispárba a DNS-repbkáció során. Valójában a ídttittd. kezeit, egylá?rc?í DNS-fesgmensek „gapped dop.lex”-DNS-sel hibridizábiak, és ezután a mutáns törzseket elválasztiílk ugyanolytm kezeléssel, mint a szintetikus olígonukieotiddal -végrehajtott, helyspeeiSkus rmrlsgenezís („gapped duplex” eljárás) esetében.

A „eitokin” kifejezésen, mint az ,,AíLIM-expres»záló sejtek citcklntennelése” esetében is, AíLlMsxpresszáló sejtek (különösen a T-sejtek) által termeli, önkényesen kiválasztott, eitokin? értünk.

A T-sejtekre példaként említhetjük « Thl- és: ThS-tspnsú T-sejtetó, és a citökhs kifejezésen előnyösen Thl-iípesü és/vagy Th2-5ípusú T-sejtek által termelt, önkényesen kiválasztott eitokin; ériünk.

Φ s

A Thi-dpusú T-sejtek által tensdt eiíoklHek többek közölt as IFN-γ, az IL-2, a TNF, az XL-3, és a Th2típusú T-sejtek. által termelt ciíokmek többek között az IL-3, az 1L-4, az TI.-5, az ÍL-IO és a TNF (Cell. 3ö(9); 343-346(19¾}).

Az „anyag’' kifejezésen, előnyösen az „AlLIM-áltel közvetített jelátvitelt moduláló aktivitással rendelkező anyag”, és speciflkusabban az „AlLIM-exprösszálő sejtek prohferácíóját gátló aktivitással, vagy az AILEMexpresszalö sejtek ciíokintermeíését gátló aktivitással rendelkező aíiyag” kifejezésen olyan- anyagot értünk, amely természetes körülmények között előforduló anyag vagy mesterségesen előállítóit, Önkényesen kiválasztott anyag.

Az. „AIT.TM által közvetíteti jelátvitel kifejezésen az AÍTJM által közvetített jelátvitelt értünk, amely a fenti, vagy a. Példákban leirt, AILINl-espresszáló bármely íénofipusa változásához vezet (változás asejiproliferáclóban, sejtskövádóbas, apoptózisban és/vagy AllIM-expresszálő sejtek önkényesen kiválasztod dtetesa termelésére való képességében}.

A2 „anyag” főképp „fehéijetenaészetü” és „sem fehérjetermészetű anyagok” kategóriákba sorolható.

A „fehéijetemtészeiű anyagokra” példaként említhetjük a polipeptldeket, az antitesteket (poiikionái is: antitestek, monoklönális antitestek vagy moxmkkmális antitestek részel).

Ha az anyag antitest, az előnyösen monokloHális antitest Ha sz anyag monoklonális antitest, az nemcsak nem barnán emlős eredetű monoklonális antitest .lehet, hanem lehet rekombináns, monokionális klméraantitest, rekombináns, humanizált monoklonáiis antitest ás komán eredetS monokTosálls antitest,

Ha az anyag -polipeptid, az lehet többek között polipepíid, pohpeptid-fragmens (oligopeptíd}, fözáós polipeptid és kémiailag módossted polipepíid. Az oligopepisdekre példaként említhetjük az 5-30, előnyösen az 5-20 amínosavat tartalsnaző peptideket. Kémiai módosítás tervezhető a különböző céloktól függően, például az m vivő beadás esetében a vérben mérhető íéléletídS növelése vagy a degradásíóvsl szemben; tolerancia növelése, céljából, vagy orális beadás esetében az emészíőrendszorben az abszorpció növelése céljából,

A polípepbdekre példaként említhetjük a következőket:

1) AHIM extraceUnlárís régióját vagy annak részét tartalmazó polipeptid;

2} AlLIM extraeelhsiárís régióját vagy sírnak részét, és iamtunglobulin-uchézíánc konstans régióját vagy annak részét, tatíáfaazó fúziós polipepíid; vagy

3) AILIM-hez kötődő polipeptid.

A „nem fehérjetermészetű” anyagra példaként említhetjük a DNS-t, SNS-í és kémiailag szintetizált vegyűleteket.

A „DNS” alatt „antiszenz DNS-drogként alkalmazható, -a fenti AH.lM.-tet (előnyösen humán eredetű AILIM) kódoló DNS részleges nukleotídszekveneiáját tartalmazó DNS-t értünk, vagy kémiailag módosított DNS-t, amely tervezhető az AJLlM-et kódoló DNS-t (eDNS-t vagy genomi DNS-t) alapul véve”. Előnyösen, az antiszenz DNS gátolhatja az /kIUM-et kódoló DNS mFNS-ss való tra-nszknpciöját, vagy az mRNS feböjévé való transzlációját azáliai, hogy az AlLlM-et kódoló DNS-sel vagy RN'S-seí hlbridizál,

A „részleges aakteoudszekvenda” kifejezésen önkényesen kiválasztott régió önkényesen kiválasztott számú aüldeotidjá.t tartalmazó részleges rmkleotíászekvendát értünk. Részleges nuldeoíidszekvescia. tartalmaz 5-Iöö, előnyösen 5-70, előnyösebben 5-50, és a legelőnyösebben S-30 egymást kővető nukleotldot.

Fia DNS-t alkalmazunk antiszenz DNS-drogként, a DNS-szekveneiát részlegesen módosíthatjuk abból a óéiból, hogy meghosszabbítsuk a vérben mérhető íeléieíidejét (stabilitását) a DNS orálisan történő beadása esetében, a DNS mtra-cltopiazmatíkus membránon való permeahilitásának növelése céljából, vagy orális beadás

X « •esetébe» az emésztőrendszerben a degredácíóv»! szembeni rezisztencia vagy az abszorpció növelése céljából. Kémiai nsódosöások többek között az oIsgosnkleobó-DNS szerkezetébe» például :a feszfátkötés, ribóz, nukleotid, szénhidrát-molekulsrész és a 3'-vég: és/vagy az 5'-vég módosítása,

A fószíáikotés módosításai többek kőzett például egy vagy több Ibszfodiészter-köíés íD-oligo), a foszfoáitio-anádát-kötések (S-obgo), a metll-foszföaát-kőtések (MP-obgo), a íoszfo-anúdát-kötések, a xtesr foszfát-kötések vagy meáil-goszfimo-tioM-köt&ek konverziója, vagy ezek kombinációja.

A ribóz módosítása többek között például 2'-fluor-árihoz vagy 2'-0~meíílribózzá való konverzió. A rmkleotíd módosítása többek között például az S-propio»i!-uracií vagy 2-amino-adenm konverziója.

Az „RNS’’ kifejezésen az „an.tíszeuz KNS-ként alkalmazható, a fenti AflUM-et. (előnyösen humán eredetű AlLlM-et) kódoló részleges intkieotidszelivenciát vagy kémiailag nsódosátott SNS-t tartalmazó RNS-t értünk, amely tervezhető az AlLIM-et kódoló RNS-t alapul véve. Az aatiszenz RNS gátolhatja az: AHJM-et kódoló DNS mSNS-sé való transzkripcióját vagy az mRNS fehérjévé történő transzlációját azáltal, hogy az AJ1..1Met kódoló DNS-sel vtsgy RNS-sel hibndizál,

A „részleges aökteoödszekvewta” kifejezésen önkényesen kiválasztott: régió önkényesen kiválasztott számú rmkleoiidiát tartalmazó részleges nukieoüdszekvenciáí értőnk. Részleges nukleoíidszekvenesa tartalmaz 5-iöö, előnyösen 5-7Ö, előnyösebben 5-5Ö, és a legelőnyösebben 5-3Ö egymást követő nukleotidot.

Az amiszenz RNS-szekvenclát kémiailag módosíthatjuk abból a célból, hogy meghosszabbítsuk a vérben mérhető féléié üdéjét (stabilitását) a DNS orálisan történő beadása esetében, a DNS ú-tra-citoplazmatlkus membránon való pertneabtliíssárstk növelése céljából, vagy orális beadás esetében az. emésztőrendszerben a degradációvai szembeni rezisztencia vagy az abszorpció növelése céljából. Kémiai módosítások többek között azok a módosítások, amelyeket a fenti, antiszenz DNS esetében alkalmazunk, „Kémiailag szintetizált vegyűlet” alatt tetszőleges vegyieteket. kizárva a lent! DNS-t, RNS-t és fehérjetermészetű anyagokat, és amelyek molekulatömege 1ÖD-1ÖOO vagy kisebb, előnyösen olyan vegvöiet, amely molekulatömege löO-SŐÖ, és előnyösebben ID0-60Ö.

A fend „attyag'’ kifejezésen a ,,polipeptid” AfLÍM-et (előnyösen humán eredetű- AlLÍM-et) alkotó poispeptidláncoí vagy részét (fragmemsét), előnyösen az AlLlM-ei alkotó polipeptid eatrttcelluiárls régióját vagy részét értjük (a régié N-termhtélís és/vagy C-terminális részéhez adott esetbe» 1-5 ammosavai hozzáadhatunk).

A találmány szerint A.1L1M a sclímembránba hatoló ímnszmembráu molekula, amely 1 vagy 2 polipeptidiáneot tartalmaz,

A „transzniembrán fehérje” kifejezésen olyan fchét jét értünk, amely a membrán Hpid-kettősréíegés -egyszer vagy néhányszor áthaladó hidroíőb peptidrégién át kapcsolódik a sejtmembránhoz, és amelynek szerkezete teljes egészében, három fő régióból ált azaz estraocüuláris régióból, transzmembrán régiéből és cítopíazmatikns régióból, amint azt sok receptorban vagy sejtfelszíni molekulába» láthatjuk. Ilyen transzmembráu fehérje alkot műiden receptort vagy sejtfelszíni molekulát moaemerkést vagy feomodímerkést, heteredimerkési vagy oligomerként, azonos vagy különböző amlnosav-szekvesrelájú lánccal kapcsolva.

Az „extmeelluláris régió” kifejezésen a festi össsztneínferán fehérje egészét vagy részét étjük, ahol a részleges szerkezet a membránon kívül helyezkedik el. Másképp ez azt jelend, hogy a íraaszraensfetén. fehérje régiója vagy része, kivéve a membránba beépült régiót (íranszmembrás régiót) és ís tmnszmembrán régié: kővető, cítoplazmábars található régiót (citopluzmatikus régiót).

A fenti „febétjetersnészefú anyag” kifejezésben a „fúziós polipeptid” alatt fúziós polipeptidet értünk,

..

amely AILLM-et (előnyösen humán erededl AíLIM-et) a&otó· polipeptid extaceHuíáris régióját vagy részéi, és JinmoisglobxjíiH-aebézláac -(lg, előnyösen tanán ereded! lg) konstans régióját vagy részét tartalmaz;. Előnyösen a fózt-ós polipeptid az AlLIM extraeellnláris régióját és humán eredetű IgO-sehézIánc konstans régiója részét tartalmazó fúziós polipeptid, és különösen előnyösen az AlLIM exfcaoelMúris régióját és ti kapocsrégíót, a CR2~doméHí és CH3~domént tartalmazó hrnnán eredetű IgG-nehézláne. régióját (Fe) tartalmazó fúziós polipeptid. IgG-ként előnyös az IgG!, és AlLlM-ként előnyös a Íremén eredetű, az egéreredető vagy patkányeredetű ARIM (előnyöset! tanár, eredetű).

Az „smmnnglitaint-taiézlárse (Ig~nehézláne) konstans régiója vagy annak része” .kifejezésen tamás eredetű itntnuriglolmlm-nebézlsno (H) konstans régióját vagy Fc-régióját vagy annak részét érijük. Az .immunglobulin lehet bármely osztályba és bármely alosztályba tartozó immunglobulin. Előnyősén, az immunglobulin lehet !gö (IgG 1, lgG2, lgG3 és igG4), IgM, ÍgA (ígA l és ígA2), IgD és IgE, Előnyösen az immunglobulin IgG (IgGl, lgG2, lgG3 és lgG4) vagy IgM A találmány szerint megoldásban a különösen előnyös. immunglobulinokra példaként említhetjük a humán eredetű IgG-ket (IgGl, ígG2, lgG3 és IgG4).

Az immunglobulin egy Y-alská szerkezet:! egységgel bír, amelyben négy lánc alkot két homológ könnyűláncot (1,-láocok) és két homológ nehézláneot (Ή-láncok), és amelyek diszmfidhidakk&l (S-S-fcőtésekl kapcsolódnak. A könnyű-láncok a könnyé lánc-var íábilísrégiőból (Vt) és a köwryüiánc-kon.síansrégiőboi (CL) állnak. A nehézláneot a ndréslánc-variábilisrágló 0¾) és a ríebéztáne-konslansrégió (C_K) alkotja.

A nehézlánc-konsíarssrégiót olyan domének alkotják, amelyek aminosav-szekvenciája· egyedi minden osztályban (IgG, IgkL ÍgA, IgD és IgE) és minden alosztályban (IgG!, lgG2, IgG3 és IgG4, IgAl es IgA2).

Az IgG-nehézláne (IgGl, IgG2, lgG3 és ígG4) Vjrdoirtaből, C»i-doménbói, kapocsrégióból, Cy2doménbö! és Cj.(3-doménbó! áll, ebben a sorrendben, az.N-terminális irányból felsorolva.

Hasonlóan az IgGl-nehéziánc Vfs-domónből, Cvi 1-doménbob kapocsrégióból, CyG-doniénból, Ογβdoménból áll, ebben a sorrendben, az M-íermisális Eánybőí felsorolva. .Az IgG2-nehézIánc Vhi-donrénbői, GyG · áoménboL kapocsrégioból, Cy₂2réeménboi, CyG-döménhől áll, ebben a sorrendben, az N-tcrmmális irányból felsorolva. Az IgGú-nefeésláne V;!-áoménból, CyG-döméstból, kapocsrégióból, Cys2-domtaból_s Gyjo-doménböl áll, ebben a sorrendben, az N-terminális irányból felsorolva. Az lgű4-nefeézlánc Vg-doméaból, Cy^l -donténból, kapocsrégióból, Gy^-domésbói, CyG-doístréMl áll, ebben a sorrendben, az N-íermm,ális irányból felsorolva.

Az IgA-nehézlánc V:_rdoméí!bói, Col-doménbók kapocsrégióból, Ca2-<ioménbőb Cso-dotnénbó! áll, ebben a sorrendben, az N-termmá!is irányból felsorolva.

Hasonlóan, az IgGÁl-nebázfeo V_íráoménbók Csfl-doméöból, kapocsrégióból, C«i2-doménbó!, C«Gdotnénbói áll, ebben a sorrendben, az N-tennmális irányból felsorolva. Az IgA2-sehézláac Vrrdornénból, C«jldoménból, kapocsrégióból, Ctó-donrénhől, Cíí^l-dnmésrhól áll, ebben a sorrendben, az N-temünáhs irányból felsorolva.

As IgD~nehézlánc Yirdoménbóí, CŰi-doménbói, kapocsrégióból, CőS-deménból, Cól-domónhől áll, ebben a sorrendben, az M-terminális irányból felsorolva.

Az IgM-nehézláno Vs-doménhól, Cúl-áoméshől, Cg2-domér,ból, Cp,3-doménbéí és Cpd-dmnésból áll, ebben a sorrendben, as 'M-tsmainális irányból felsorolva, és hiányzik sz IgG-ben, az JgA-tat és as IgD-ben található kapocsrégió.

Az IgE-nebéziáne V^-dojnénból, Csl-domésfeől, Cs2~dornénból, Ce3-doménbóí ss Ce4-áoménból áll, ebben a sorrendben, az hi-termtaáhs irányból felsorolva, és hiányzik az IgG-ben, az IgÁ-ban és az IgD-ben

- ΙΟ található kapoosrégtö.

Ha például IgG-t papainnal. kezelünk, az ígG az N-terminális közeiében, a diszulfidhidakon. feli, a kapocsrégióban hasad, ahöl a álsmlffdbiöak összekapcsolják a két nehézláncot két homológ Fa'mt kialakítva, amelyben Vh-ból és CHl-böl álló néhéslássc-lfuguíens kapcsolódik egy feörayölánccaí diszolSdhtdal-; valamim egy Főből, amelyben kapocsrégióból, C;i2-donrénhól és Caá-doméaból álló két homológ nehézlánc-fragmeus kapcsolódik diszuiíidkötésekkei (lásd Naakodo, tüasxwnolegy Ilíustraíed, eredeti 2, kiad,, 65-75 (1992); és Nankodo, Focus- oíNewest Medieal Science, Reeognitkm Mechanism ©f Immuné System, 4-7 (1991); és Így tovább},.

A fenti, „immunglobuim-nehéziánc. konstansrégiója része” kifejezésen konkrétan isrunnnglobuhnaebéziáno konstans régióját értjük, amely a fend szerkezeti jellegzetességekkel rendelkezik, és előnyösen Cldomént vagy Fc-régiot nem tartalmazó konstans régiót Előnyösen, ezekre példaként emlithetfllk az IgG, IgA és IgD mindegyike esetében s kapocsrégíóból, C2-doménból és CS-dotnénból, vagy ÍgM és IgB esetében €2doménból, C3-doménből és C4-doméuból álló régiót, Különösen. előnyős példaként említhettük a humán eredetű eredetű IgGl -et.

A fenti: fúziós poiípepiidttek tnegv&ft az »z előnye, hogy tisztítása szélsőségesen könnyű· affinitása kromatográfsa alkalmazásával a protern-A kötési íölajdeságait alkalmazva, mely előnyösen az hrnrsurtglobuhnfragnsesshez kötődik, mivei a találntásy szerinti fúziós polipeptid tartalmaz húmungfobtuia, mint például Igö konstans régiója részét (pl. Fc-t) fúziós partnerként. Ráadásul, mivel a különböző imnmoglobuímok Fc-régiója elleni antitestek hozzáférhetőek, a fúziós polipeptidekre immunológiai, mérési eljárás könnyen végrehajtható az Fe elleni antitestekkel.

Az „AlLlM-hez kötődő polipeptid’'' fogahna beletartozik a „polipeptid” fogalomba, és azt pedig magában foglalja az „anyag” deflnicióia.

Az AILIM-bez kötődé polipeptid” specífikns példájaként említhetjük a B?h, B7RP-I, GL5Ö vagy L1ÖOS .néven ismert molekulákat tartalmazó poiipeptidet vagy azok egy részét, amely az AILIM-snel kölcsönhatásba lépő ligandum [Hstnre, 402(6763): 827-S32 (1999); Natúré Medicina 5(12): 1365-1369 (1999); 1 Immurtoiogy .(64: 1653-1657 (2ÖÖÖ); Curr. Siói., 10(6): 333-336 (2000)1.

Előnyösen a polipeptid a fenti iigandutnok (B7h, B7RP- i, GL56, LICÖS) extracelluláris régióját vagy részét tartalmazó polipeptid, vagy immsnglofetiiin-uehéziáöc (előnyösen. tanán eredetű ímmtmgiobuim) konstans régióját vagy részét tartalmazza. Itt az „extracelluláris régió” és „hnmtmgiobulin-aehédáae” kifejezések a fontiekkel azonos érteimöek.

A fenti poiipeptidek, polipeptidrészck (fragmensek) és fúziós poiipeptidek előáliíthatöak nemcsak az alábbi rekombiotms DNS-technolőgiávak hanem a iechaíkábaa ismert eljárással, mint például kémiai szintetikus ellátással vagy sejttenyésztési eljárással, vagy ezek: módosításával,

A találmány szerinti „antitest lehet a fent definiált,. emlőseredetö A1L.IM elleni (különösen előnyösen, iauríáíi eredetű AÍL1M) elleni políklonálís: antitest (szánra) vagy monokionális antitest, és előnyösen monoklonálís antitest.

Előnyösen,. az antitest AíLlM-expresszáló sejtek proitferációját az AlLÍM-hez való kötődéssel gátló aktivitással rendelkező antitest, vagy AlLlM-exprésszálo sejtek iaíerféroö-γ- vagy ínterleukin-ó-ternteiését

AIÍJM-bez való kötődéssel gátló aktivitással rendelkező antitest.

A találmány szerinti antitestek lehetnek: emlősök:, mint például egerek, patkányok, hörcsögök, aranyhörcsögök. és: ayölafc taágötwí, való iramtmizálásávak mint példán! a találmány szerinti AILIM-ct expresszáló sej

- n. sekkel (tertnéssetes sejtek, sejtvrmahtk, tuKíoreejtek sífo.j. rekombimms DNS-teehnológiáwl az AILIM sejtfélszisen való túlexpresszálása céljából előállított tratíszfermáitsokkal, AlLIM-et tartahaazö poíipeptidekkel vagy a fenti, ÁII,IM-et tartalmazó ftóós pohpcptídekkel, vagy az. AILIM exttaeeBuiárís· régiójával történő immunizálással kapott természetes aníríestek. A lalábnány szerinti antitestek lehetnek kiméraantitestek és humanizált antitestek („CDR-gsuftsd” antitestek), amelyek elöálhíhaíőak rekombináns DNS-technológiával, és olyan, humán eredetű antitestek, amelyek elöállíibalóak tanán eredetű antitesteket termelő transzgenlkus állatok alkalmazásával

Monoklonális antitestek többek között az IgG, IgM, ígA, ÍgD vagy IgE izotipnsok bármelyikébe sorolhatóak, Előnyős az ígG vagy IgM,

Polikionális antitest (antíszeranr) vagy monoklonális antitest előállítható ismert eljárások alkalmazásával. Konkréten, emlősállatot, előnyösön egeret, patkányt, hörcsögöt, aranyhörcsőgöt, nyniat, macskái, kutyát, sertést, kecskéi, lovat vagy borját, előnyösebben egeret, patkányt, hörcsögöt, aranyhörcsögöt vagy nyalat immunizálunk például a fenti antigénnel Fríuusd-fele aájuvánssai, ha szükséges.

Polikionális antitest állítható elő az: így immunizált hitetek szérumából. Ráadásul monoklonális antitesteket a kővetkezők szerint állínmk elő. Iribridómáka· állítunk elő az így immunizált állatokból nyeri aatitesttermeío sejtekből, és antoarttitestek ternteiésére képtelen mielómasejtekböl, A híbridömákal klónozzak, és az emlősállat: immunizálásában alkataazott antigénnel szembeni specifikus affinitást mutató mosoklonálls andtesteket termelő kiónokra szkrinelőnk..

Előnyösem monoklonális antitest állílható eiö a következők szerint Immunizálási hajiunk végre úgy, hogy a fenti antigént imnuínogenként egyszer vagy többször injektálva vagy beültetve, ha szükséges, LVeunrifele adju vitessed, szubkután, intfamnstricaiárísan, terra vénásan, ujjbegybe vagy intraperitoneálisan sem humán emlősbe, előnyösen, egérbe, patkányba, hörcsögbe, aranyhörcsögbe vagy nyúlba, előnyösen egérbe, patkányba vagy aranyhörcsögbe (többek közölt trauszgefekus állatba, amelyet így állítunk elő más állatból származó antitestek előállítása céljából, mint például az alábbiakban leírt, humán eredetű antitesteket termelő transzgeníkus egér). Az immunizálásokat rendszerint az 1-14. napon 1-4 alkalommal hajtjuk végre. Az igy hmmmízáií etnlósáliatíól antitest-termelő sejteket nyeritek az utolsó immunizálás után 1-5 nappal. Az immunizálás gyakorisága és időtartama elrendezhető alkalmas módon például az alkalmazott ímmunogén jellegétől függően.

Monoklonális antitestet szekretálő hibridómák előállífbatőak Kókler és Milstsm (Natúré, 256:495-497 (1975)3 eljárásával, vagy annak módosításával,. Konkreíau hibridő-mákat állítunk elő a fentiek: szerint immunizált, nem humán emlősállat lépében, nyirokcsomójában, csantvelőjáben vagy mandulájában, előnyösen lépéboa található, antítesttermelő sejtek és emlősből, előnyösen egérből, patkányból, nc&nyhőresögbői, hörcsögből, nyálból vagy emberből származó, előnyösen egérből, patkányból vagy emberből származó, sutoanfitest·· termelésre képtelen nddémák fuzíanáltalásával,.

Például egéretederii, P2ZXÓ3-AGS.Ö53 (Ö53), P3(NSÍ/1-Ag4-Í (NS-1), P3/X63~AGS,Ü1 (F3U1), SP2/0Agí4 (Sp2/0, Sp2), FAI, FÖ, NSO vagy 8ΛΥ5147 mielőma, vagy patkányeredető 21ÖR:CY3-Ág,2,.L, mielóma, vagy humán eredetű G-2ŐÓÁR1, GM15ÖÖ-ŐTG-A1-2, UC729-6, CEM-AGR, DIRI! vagy CEM-T15 midóma alkalmazható mielőmakéní sejtfúzió céljára.

Híbridórnákát termelő monoklonális antitestek szkrineihetok hibridómák tenyésztésével, például mikrorúer-lemezeken, és az üregekben a tenyészfeluluszot vizsgáljuk a feni ismertetett immunizálásra alkalmazott ímmunogénnei szembeni reaktivitásra, például enzimes immunológiai mérési eljárásban, mint például RIAbán vagy ELÍSA-bam

Mooeklonáks antitestek állíthatóak elő moridömákbói úgy, hogy a híferidómákaí á« vlíro vagy ói vívó tenyésztjük, például egér, patkány, a-anyhöresőg, hörcsög vagy nyúl, előnyösen egér vagy patkány, előnyösebben egér nscIrt'A-foiysdékában, és az antitesteket izoláljuk az eredményül kapóit felülűszöból vagy az emlősállat asciías - folyadékából.

A bibrídőmók #« vám tenyésztése végreltajtbaíő például a tenyésztendő sejtek tulajdonságaitól, a vizsgálat céljától és a tenyésztési eljárás különböző kőrűlntéiíveiíül függően, ismert lápközegek alkalmazásával vagy az Ismert, alaptápfcSzegbö! származó, a hibridőmák szaporítására, fenntartására és tárolására szolgáló bármely tápkőzeg alkalmazásával, a nsosoklouális antitestek tenyészfelölászőban lörtéuö előállítása céljából.

Álaptápkezegre példaként említhetjük az alacsony ksieiumrartahnü tápközegeket, mint például a Hamféle FI 2-tápkőz.eg, az MCDBlód-tápközeg,. vagy a magas kalciumtartalmú íápközegek, mint példán! az MCD8104-tápközsg, a MEM-tápközeg, az R?MIlő4Ö-lápközeg, az ASFlÖ4-tápkőzeg vagy sz RD-iápkőzeg. Az alaptápkőzeg tartalmazhat például szérunuskat, hormonokaí. cltokineketészvsgy különböző, szervetlen vagy szerves anyagokat, a céltól faggőeu.

Monoklosábs antitestek izolálhatóak és tisztíthatóak a tanti testyeszfeiülászőból. vagy .«íate?folyadékból teíitett ammómum-szulfátos kicsapással, euglobulin-kiesapási eljárással, kaprensavas kresapasi eljárással, ksprílsavas kicsapási eljárással, ioncserélő kromatográfiávai (DEAE vagy DE52), vagy affinitás! kröm&íográíiával, immunglobulin-elleni oszlop vagy protein-A-cszlop alkalmazásával.

A „rekombináns Iáméra moaoklonáiis antitest’’ genetikai műveletekkel előállított n-onoklosális antitest, és előnyösen, kíméraautltestet jelent, mist például egér&umsn kitnéra snonoklonábs antitestet, amely variábilis régiója nem humán emlősből (egérből, patkányból, hörcsögből stb.), és konstans régiója humán eredetű immunglobulinból származik.

Humán immunglobulinból, származó koaslans régió amiaosav-saekveactája egyedi minden izodpus esetében, mint például az JgO-nél (ígöl, ígG2, IgöJ, Ig<34), az IgM, az IgA, az IgD és az IgP esetében. A rekombináns, kiírtéra monoklonáíis antitest konstans régiója lehel bármely izotípusba tartozó, harsán eredetű immunglobulin. Előnyősén ez humán eredetű IgG konstans régiója.

Kiméra, monoklonáíis antitest elöálílíható például a következők szerint. Szükségtelen említenünk, hogy sz előállítási eljárás nem korlátozódik erre.

EgérÁhusnárt kiméra monoklonáíis antitest előállítható a következők alapján: Experimental Medieine; kiegészítő kötet, 1.6. (fö) (1988); és a ÍJP-B) Bei 3-732SÖ. számú, vizsgák, közzétett japán szabadalmi bejelentés. Konkrétan, az antitestek előállítható úgy, hogy a humán eredetű iítursunglobíilisi kódoló DNS-bel nyert CHgérst (a H-lásc koasiuns régióját kódoló C-géu) működőképesen beillesztjük egéreredetü, monoklonáíis antitestet termelő hibridőmákból Izolált DNS-boi nyert aktív Ví-i-génektol (átrendezett VDJ-gén, amely H-lánc variábilis régióját kódolja) ó'-o’-irátívbaa („doumstream”), és a hnreás eredetű immunglobulint kódoló DHS-bö! nyert CL-gént (az L-lánc konstans régióját kódoló C-gén) helyezzük működőképesen hibridömából izolált, egéreredetü monoklonáíis DNS-ből nyert Vt-gének (az; L-lánc variábilis régióját kódoló, átrendezett VJ-gén) hatása alá, azonos vektorba vagy különböző vektorba expresszálható módon, majd gazdasejteket transzformálunk &s expressziós vektorral és a uanszformánsokat tenyésztjük.

Előnyösen, a 'DNS-t először egéreredetü antitestet termelő hibridőmákból a szokásos eljárással extraháljuk, alkalmas restrikciós enzimekkel emésztjük (például EooáZ-gyel és riőrimTAmal), elekteforézisnek vetjük alá (például 0,7%-os .agsrózgélt alkalmazva) és óosláern-blottal vizsgáljuk. Áz eleteoforézisnek kitett gélt festjük • 13 «« 9 A 4 * * * « X ♦ 4 * *· * * ^Λ » például etidium-hromlddjíl és fefeyk^ezzűk, a gélen a markerpoziciókat megjelöljük, a gélt kétszer mossuk és 0.25 M HCl-bes áztatjuk 15 percig. Ezután s. gélt 0.4 N NaÖH-oIáatban áziaíjuklö percig, és finoman ritzatjuk, A DNS-t filterre visszük 4 órán ál, a szokásos eljárás alkalmazásával, A filtert kiemeljük, és kétszer mossuk 2xSSG-puiferben. Ha a filter eléggé kiszáradt, 75*000: 3 órán át hőkezelésnek vetjük alá. A hőkezelés után a filtert Ö.lxSSC/ö.1% SDS-ben 65^,JC-on 38 perces át kezeltük. Ezután 3xSSC/0.1% SDS-ben áztattak, A kapott filtert prehíbridtzációs oldattal kezeltük műanyag zsákba® ó5^sC-on, 30 percig.

Ezután ’^P-ral jelölt próba-DNS-t és hibridizációs oldatot teszünk a zsákba, és ő5°C-on 12 őri® át: kezeltük. A hibridizáció után a filtert megfelelő sékoocreutráeió, reakciós hőmérséklet: és reakcióidő mellett mostok (például 2xSSC/04% SDS, szobahőmérséklet, 18 pete). A filtert műanyag zsákba kis térfogatú 2xSSOben, és a zsák lezárása után antoradiográfiának tettük: ki,

Egéreredetü mönoklosális antitest H-láseát és L-láncát kódoló, átrendeződött VDJ-gént és VJ-géut a fenti ómttke/zt-bloííolási eljárással szoJiositnak. Az azonosított DNS-fiagmssst tartalmazó régiót cukorsürűséggradíens-centrífugálással frabcionáljek, és fágvekíorha (pl. €W©»4«, Com-onzd, ÁEMSZJ és z£47fi/,4). K eoii-t (pl. ££592 és W5.il?) Irattszformáljtisk a fágvektörr&l gettomkönyvtár létrehozása céljából, A genom·· könyvtárt plakkhibridizácíós technikával, mint például j?w©»-.Davőf-eljárássai [Science, 196: 180-182 (1977)] szkrineljúk, alkalmas próbák alkalmazásával (íí-láne í-géa, L-íánc (κ) J-gén, stb.) az átrendeződött VDJ-gén.t vagy VJ-géot tartalmazó kiének előállítási céljából. Restrikciós térkép készítésével: és a kapott klánok nuklerúidszekveneiája meghatározásával igazoljak, hogy a gének a kívánt, átrendeződött VM-géneket (VDJgéaeket) vagy YL-génefcet (VJ-géacket) ttíítalmazó géneket kaptok meg.

A kiméraképzáshez alkalmazott CH-géneket és iramán eredetű CL-géneket külön-kulón izoláltak. Például ha a ki-ném-antlfeslet humán eredetű IgG 1 -gyei állítjuk, elő, Cyl-géoekeí izolálunk €H-géaks®t, és Ckgéneket CL-génként. Ezeket a géneket humán eredetű genemi könyvtárból izolálhatjuk egéreredetű Cyl-gén és egéreredetü Cr-gén próbaként való alkalmazásával, amely gének a humán Cyl-géunek. és Cx-génnek. felel meg, kihasználva az egéreredetü és s hantán eredetű imnumgfobölingén közötti homológját.

Előnyösen, a ltumáa CK-géní és egy erdKírteur-r-égtót íarialmaző DNS-fragmenst. izolálunk humán z~ Ckarott4A 7&eA7-,4úd-genemi fcönyvtásbói (Cell, 15: 1157-1174 (1987)], például az igl4ő-klőa 3 kb. hosszúságú //?«d7A^r-Sű‘mA7-fragmeríse (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 4709-4713 (1978)] és a ád£'ó7Ó-klőtt ő.§ .kb. hosszúságú fik-mRf-fmgmsnse [Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 78: 474-478 (1.981)1 próbaként való alkalmazásával. Ráadásul például kutsán eredetű magzati hepstoeita-DhíS-t /findZíZ-mai emésztünk, agarózgéi-elektroforézissel fiákcionáljuk, majd egy 5.9 kb, hosszúságú fragmenst illesztünk zZdó-ba, majd humán Cyí-gént izolálunk a festi próbákkal.

Az- így kapott egéremfefü VH-gén, egéreredetü Vl-gén, humán eredetű CH-gén és humán eredetű Ctgéa alkalmazásával, és a prornóter-régióf és exboftcer-régióí figyelembe véve, humán CH-géni. illesztettünk egéreredetü VH-géntől 3 75'Arányban (fioranarremn), és humán CL-géní illesztettünk egéreredetü. V'k-gémöl 3'5'-irányban (uUtvuítt-eöm) expressziós vektorba, mint például a pSfUgpí vagy pfifUneo alkalmas restrikciós enzimekkel és DNS-ligázzal, a szokásos eljárás alkalmazásával. Ebben az esetben egéreredetü VU-gén/husiáa eredetű CH-gén, valamint egéreredetü YH-gés/husnán eredetű CL-gés kiméra génjeit illesztjük azonos vagy különböző expressziós vektorba.

Az igy előállhort, kknéragéní tartalmazó expresziós vektort (vektorokat) antitestet nem termelő míelóntákba, példán! F3AÓ3 ^dgő^öíd-sejtekbe vagy ŐéU/ö-sejíekbe visszük be proteplaszt-fúziós eljárással,

DEAE-dextrán-eijsíássai, kateiöm-fossfái-eljárással vagy elekttoporálási eljárással. A «aaszformáhsokat az expresszíós vektorban íalálliató drogrerisrieueíának megfetelő drogot tartalmazó tápközeggel szkríneljük, és ezután a kívánt, monokíonális kkaéra-aatítestekst termelő sejteket kinyerjük.

A kíváat, numoklonális kíméra-arítiiesEtsketaz így szkrínelt, antitest-termelő sejtek iélűlűszóiáből kinyerjük.

A „homamsált mmoktaáiis antitest (ÜDR-gop&d antitest)” kifejezésen olyas monoklonális antitestei .őrttok, -amelyet .genetikai műveletekkel álltaak elő, és előnyösen, olyan,, humanizált, moaokfcöális antitestet értünk, ahol a hipereariábilis régió komplementaritást. meghatározó régiót részben vagy egészen sem komán eínlő&eredetü (egér, patkány, hörcsög, stb.) monoklonális: antitest bipervariábilis régió komplementaritást meghatározó régióiból, a variábilis régió •vázszerkezet-régiéi hatan immunglobulin variábilis régióiból származnak, és a konstans régié humán eredetű immunglobulin konstans régiójából származik. A hipervsriábílis régió komplementaritást meghatározó régiói -antitest variábilis régiójában, a variábilis régióban van, és három régiót jelent, amelyek közvetlenül és komplesrester módon kötátoek antigénhez (komplementaritást meghatározó atninosnvak, CDR1, CDR2 és CDR3). A variábilis régió vázszerkezete négy, viszonylag konzervált régió, amelyek a bárom komplementaritást meghatározó régióhoz viszonyítva doítwr&w íráaybas vagy azok között helyezkedik el (vázszerkfizet-régió, FR, FR2, PR3 és FR4).

Más szavakkal, humanizált monoklonális antitest alatt olyan antitestet értőnk, amelyben nem humán eredetű monoklonális antitest íninden régióját, kivéve a komplementaritást meghatározó régiók részét vagy egészét a megfelelő, humán eredeté imrnongíöböknbéi származó régiókkal helyettesijük.

Humán eredeté imn-unglobtílinból származó konstans tégióamisosav-szekvesetájs minden izotípas, mim például az Ig<3 (IgGl, lgÖ2, IgGS, IgG~), lg.M, IgA, ígD és IgE őseiében egyedi. A találmány szerinti monklonális, harnanizáh antitest konstans régiója származhat bármely izotipusba tartozó humán iismungiobuimfeól. Előnyösen ez huntárs IgG konstans régiója. A humán immuagolobulmbóí származó vázszerkezet-régiók nem különösen korlátozottak.

Humanizált, monoklonális antitest előállítható például a következőképpen. Szükségtelen említenünk, hogy az előállítási eljárás nem korlátozódik ezekre.

Például egóreredeíá,. roonoklonális antitestből származó -rekombináns, hnrnsnizáíh monoklonális antitest .genetikai műveletekkel [ilei 4-SÖS4SS. sz. és JP-A Sho 62-29689Ö. sz nemzetközi közzététel közzétett, japán fordítása]. Konkrétan, legalább egy egéreredetű Fi-lánc-CDR-gsnt és legalább egy, egéreredetü L-láoe-CDRgthtt, amely az egéreredetü FÍ-lánc-CDR-géímek .felel meg, izolálunk egéreredetti monoklonális antitestet termelő hiferidőmákból, és a tanán eredeté H-tac-géo (kivéve a fend, egéreredeté H-lánc-CDR-nek megfelelő, humán, H-láoe-CDR-t) teljes régióját kódoló gént, vahmint a humán eredeté L-iáne-gén (kivéve a humán L-láneCDR-t, amely a fenti, egéreredefö H-lsno-CDR-uek felel meg) teljes régióját kódoló gént izoláljak humán immanglobnlia-génekbót

Az .így izolált, egéreredetü H-láne-CDR-génf (géneket) és a humán eredetű H-láoc-gént (géneket) működőképesen beillesztjük alkalmas vektorba úgy, hogy ezek expresszálhatóak legyenek. Httsonló módon, az egéreredetű L-lánc-COR-géni (géneket) és a humán eredetű t-láse-gém (géneket) működőképesen beillesztjük egy másik, alkalmas vétóiba úgy, hogy ezek espresszálhalóak legyenek. Alternatív módon az egéreredefé H-láncCDR-gérrt (géneket) / humán eredetű frláse-géat (géneket) és egéreredetü L-iáne-CDR-gent (géneket) / humán eredetű L-láne-gént (géneket) működőképesen heiiieszffeetjhk azonos expresszíós vektorban, expmsszálhatómódon. Gazdasejteket transzlormáhmk az így elóállitott expresszíós vektorai humanizált, monoklonális antitest

- 15 előállítása céljából A trauszfemánsok tenyésztésével a kívánt,, humanitat, romoktoáSs antitestet a tenyészfoíülöszóbeí kinyerjük.

A „humán eredetű monoktaálís antitest” kifejezése» olyan immuugJobuliní értünk, amelyben az- fennsungiobulmt alkotó H-lánc variábilis és konstans régióit tartalmazó teljes régiékaU és az L-láac variábilis és konstans régiói tanán tanunglobulíni kódoló génekből származnak,

A tanán eredetű antitest (előnyösen iramán eredetű monoklonális antitest) eióálliíhaís jói ismert eijárásokkal, példán! ugyanúgy, tan tat, a poiiklonális vagy monoklonábs antitestek esetében, transzgenikns állat olyan antigéned történő immunizálásával, amelyben tanán eredetű buraynglobulingént mícgrátak nem humán emlős, mint példán! egér géníókuszába legalább egy tanán immungcbulm-gént.

Például tartán antitesteket termelő fe-anszgenikas egér előállítható a következő közlemények szerint: [Natúré üenetics, 7: 13-21 (1994); Matere Geaetics, fe: 146-156 (1997): a JP-WA Hét 4-504365. sz. nemzetközi közzététel japán fordítása; a ÍP-VVA Kei 7-509137. sz. nemzetközi közzététel japán fordítása; Nikkel Science, ó: 40-50 (1995); a WO94/2558S. sz. maaztaözi közzétételi hat; Natúré, 36S: 85Ó-SS9 (1994); sJP-WA Heí 65Ö02.33. ss. nemzetközi közzététel japán fordítása].

Ráadása! alkalmazható a humán eredetű fehérje transzgenikus tehénben vagy sertésben történő előállítására szolgáló technika (Nikkel Science, 78-84(1997. április)j„

Az „antitest része' kifejezésen a fenti monoklonális antitest a fenti monoklonális antitest régiórészletét értjük. Előnyösen jelest F(ab')rk Irab'-t, Fab-i, Fv-t (antitest variábilis foagmense),_; sFv-t, dsFv-t (diszutfidda? stabilizált Fv), vagy dAb-t (egydoméoes antitest) (Esp. Opin. Ther. Patents, 6(5): 441-456 (1996)],.

„E(&b')₂” és „Fab'” előállítható immunglobulint (monoklonális antitest) proteázzai, mint például pépszínnel ós papaiam! kezelve, és jelent olyan aatítest-fi'agraeust, amelyet ágy állítunk elő, hogy immunglobulint emésztünk a két Fl-láso közötti kapocsfegiéban, a díszulfídkötések mellett. Például a pápáin az ígö-t a két Hlánc közötti kapíxrsregiőban a dlszalfidőidtől N-terrtaáhs irányban (up.ri.rauní) Írásit, keit homológ aatitesífiagmenst képezve, amelyekben YL-böl (L-lánc variábilis régió) és CL-ból (L-iáne konstans régió) álló L-lánc, és VH-ból (H-íártc variábilis régió) és CKyl (v!-régió a H-iárte konstans régiójában) álló L-lánc, amelyek Ctennmáiis régióiknál diszulSdhiddal kapcsolódnak. Két ilyen homológ aahfesí-fragmeost Fab'-nék nevezünk, A pepszin az IgG-t szintén, hasítja, a két H-lánc közötti kapocsrégióban, a díszulfidhidtöl C-termhtálN (do-uvmteetííK) irányban olyan aottast-íragmeust képezve, amely kissé nagyobb, mini kettő, fenti Eab'~t a kapocsrégiőban összekapcsoló fragmeos. Ezt az sntóest-fragmenst F(ab');-nek nevezzük.

A „graítkílöködés” kifejezésen kdtlöobözö immunválaszokat értünk, amelyek a recipienstöl különböző genetikai hátterű donorból származó graft (elő testrész, amelyet írasszplantáltak; sejt, szövet vagy szerv) (azaz allohan.szplantáoíő vagy xenotranszptatáeiö) kilökésére és eliminálására irányulnak, mivel a recipisns a grata idegen anyagként Isttta fel. A transzplantációt kísérő immunválaszok a következők szerint osztályozhaíöák: I) hiperafcut kilökődés, amely közvetlenül a transzplantációt kővető erős kilökődést reakció, 2) akut kilökődés, amelyet a feasszpiantáció után néhány hónappal figyelünk meg, 3) krónikus kilökődés, amelyet transzplantáció után több hónappal figyelünk meg. Ráaadásul a fő válaszreakciót a celluláris immunitás adja, soha a celluláris immunitás a T-sejtek által képviselt immnnpkömpeíens sejteknek köszönhető' és az antitesteknek tulajdonítható humorális immunitás bonyolultan összehangolt módom lép fel.

A grafikilőkődés eredményeképpen a grafi végső soron nefaotíkussá válik és leesik. Ráadásuk a beteg nemes&k súlyos szisztémás tüneteket mutat, mist a láz, leukocítózis és kimerültség, hanem a transzplantáció

- .16 ·

X* φ φ * X Χ· * «· χ « ♦' ♦ <

helyén duzzadást és érzékenységet is. Ráadásul felléphetHek súlyos komplikációk, mint a fertőzések.

Közelebbről xenogón. grafttal, tóiét például sertésből származó gr&fttaí végrehajtott üasszplaníáeió során a hiperata kilökődés súlyos problémája lép fel mikor a graft perceken beiül kilökődik.

A „grafr kifejezésen emlöseredetű donortól eurlőssredetű recípiensbe átültetett „szervet vagy annak részét”, vagy „szö vetei” értőnk.

A „szerv vagy annak része” kiiejezésen a transzplantációra voaaíközöas önkényesen kiválasztott szervet vagy annak részét értjük, amelyet emlősállat vagy ember (előnyösen ember vagy sertés, és különösen előnyösen ember) élő teste tartalmaz. 'Előnyös példaként említhetjük a májat, szivet, tüdőt, hasnyálmirigyet, vesét, vastagbelet, vékonybelei vagy ezek részét Különösen előnyős a máj vagy annak része·.

A „szövet” kifejezésen a transzplantációra vörtatkozóan emlősállat vagy ember előnyösen ember vagy sertés., és különösen előnyösen ember) élő testéből származik. .Szövette -előnyös példakém: említhetjük a bőn, a szambártyát, csontot vagy szívbillentyűt, azonban, aetn korlátozódik ezekre,

Áz „hmrmnszappresszív hatóanyag” kifejezésen értünk bármely, létező fnMnoHSZupjwesszlv hatóanyagot,, amelyet grafí transzplantációja által, sejtek, szövetek vagy szervek klinikai trartszplstdációja: soráa recipiessnek okozott Immunológiai kilökődés (graíikílöködés) elsyomásárs .alkalmaznák, és amely gyártását. és gyógyászati hatóanyagként való értékesítését állami szervezet hagyta jóvá:; vagy bármely más immansznppresszív hatóanyag, amelyet jelenleg klinikai vagy preklmikaí kísérletekben alkalmaznak, vagy a klinikai kísérletekben alkalmazni fognak a jövőlxm, amely gyártását és gyógyászati hatóanyagként való értékesítését állami szervezet jóváhagyhass a kísérleteket követően,.

Az ilyen immunszuppressziv hatóanyagokat nemcsak Önmagokban alkalmazzák, hanem 2, 3 vagy több hatóanyaggal kombinálva. Ezáltal az „immunszuppressziv hatóanyag” kifejezés magában foglalja gyógyászati hatóanyag önmagában történő alkalmazását, vagy több gyógyászati hatóanyag kombinált alkalmazását (előnyösen 2 vagy 3 hatóanyag kombinált alkalmazását)·.

Előnyösen az immuoszappressziv hatóanyag például egy vagy több a következőkben felsoroltak közök eiklosporm (CsA), takrolúnus (FK-506), szatioprm (AZ), rnrkofene-lát-mofetil (MMF), mtzesribin (MZ), letlnsomid (LEE), sz adrenokorttkáhs szíeroidok (más néven adrenokortikálls hormonok, kordkoszteroldok, kortlkoidok), mint például a predthzoios és metil-predmzokm, slrolimtss (más néven rapnmicin), dczsxispergaalín (EsSG) és PTY720 (kémiai neve: 2-amino-2-(2-(4-oktlilenil)etiÍj~ 1,3-propándioi-Ibdrokforíd, és az: slábbidkban leírásra kerülő ,,CTLA.-drog”. ölőnösen előnyösek a takrollmus (EK-SOS) és a ciklosponn közül sz egyik vagy mindkettő,

A „CTEA-dreg” kifejezésen olyan gyógyszert értünk, amely aktív hatóanyagként tartalmaz 1) barnán eredetű CTLA.4 (ciíoloxikus T-limfoci'ávs) asszociált 4-os antigén) extracelhdáris régióját vagy annak részét ammossv-szekvencia: GenBank-száns: NP 005205; «DNS: GenBank-szám: N'M 005214); 2) humán eredetű extmeelluláris régióját vagy részét, , és más fehérjét (különösen előnyösen humán eredetű immunglobulinnehézláne konstans régiója) vagy részét tartalmazó fúziós polipeptídet (ezeket CTLA4-IgFo-kértt vagy CTLA4íg-ként jelöljük); vagy 3) DNS, amely az 1. polipeptid vagy 2. fúziós polipeptid emlősnek, (különösen előnyösen embernek) való bejuttatására alkalmas, vagy a DNS-t tartalmazó vektor (különösen előnyösen génterápiában általában alkalmazott plazmád, vagy vírusból (retrovirusfeől. adsnovirusból, adeno-asszocsáli. vírusból származó) virális vektor, vagy ehhez hasonlóak.

Az „cxtí'aeelluláríS régió”, a „rész”, az „immunglobuliu-nehéziánc”, a „foziős polipeptid” ős a „gyakori»- 17 tilag ugyanaz” kifejezéseket a fent meghatározott értelemben alkalmazzuk.

A fest említett CTLÁ4-íg jelentős immunszupprtssziv hatásáról számos közlemény jelent meg. .Például a 5r&ío/-A/yeKs Syiv/óő/kepógos által kifejlesztett Y1Ö9F (a löö. pozícióba» & tóostet femlatomra cseréljük) nagy árannnszupfaesszív hatását számos állatkísérlet megerősítette,, és ez a térnék az egyik CTEA4-áxogkéni -szinté»: a találmány tárgyát képezi [Igákune Aymm, 194(141:1195*1200 (2000); ,1. Cltn. tevést, 1Ö3: 1223-1225 (1999); N. Esgt 1 Med., 3.35: 1369-1377 (1999); 1 Exp. Med. 173: 1801-1806 (1993); Blood, 94: 2523-2529 (1999); NatoreMed., 6. 464-469 (2ÖÖŐ); Blood, O'· 3815*3823 (1995); X Clia-. lovast., 2: 473-432 (1993); Blood, 35: 2607-2612 (1995); X Clin. tevést,. 2: 473*482 (1998); Blood, 85: 2607-2612 (1995); N, Eagt 5. Med, 335: 1369-1377 (1996); J. Clia, tevést., 103:1243-1252 (1999)),

A „gyógyászatilag elfogadott hordozó” kifejezés magában foglal exeipiesst, hígítót, töltőanyagot oldószert, stabilizálöszert, tartósítószert, pufiért, emulgsálót, aromatizátót, -hatóanyagot színezéket, édesítőt, viszkozitást növelő hatóanyagot, ízesítőt, oldhatóságot növelő hatóanyagot, vagy más adalékot Egy vagy több ilyen hordozó alkalmazásával gyógyászati késziteény íbnmdázhsio íahteítákhmt, pirulákban, porokban, granniáhrtnokbatg injekcióba^- oldatban, kapszulákban, pasztillákban, slixkekbetg sznszpenziókhan, emulziókban, szirupokban slfe.

A gyógyászati készítmény beadható orálisan. vagy parenterálisan. A parenterálís beadás más formái többek között a külső alkalmazásra szolgáló oldat, kúp rektális beadásra és egy vagy több aktív hatóanyagot tartalmazó pesszárinm (hüvelykúp), a szokásos előírással

A dózis függhet az életkortól, a nemtói,- súlytól és a beteg tüneteitől, a kezelés időtartamától, a gyógyászati készítmény állal tartalmazott aktív hatóanyag fajtájától (a fenti, találmány tárgyát képező „anyag”). A gyógyászati készítmény felnőttnek beadható 10- löö® pg (vagy 1Ö-50Ö pg.) dózisban, alkalmanként. A különböző körülményektől függően a fenti dózisnál kisebb dózis lehet elegendő bizonyos esetekben, vagy nagyobb dózis szükséges lehet más esetekben.

injekció esetében ez előállítható úgy, hogy amitestet nem toxikus, gyógyászatilag elfogadott hordozóban, trónt például üzioiógtaí sóoldatfesn vagy kereskedelmi forgalomban hozzáférhető desztillált vízben feloldjuk vagy szuszpendáljak injekció céljára ágy, hogy 0.1 pg - 10 mg antítest/ral hordozó koncentrációt állltenk be. Az így előállított injekció beadható humán betegnek szükséges kezelés esetében, 1 pg - ISO mg··kg, előnyösen 5(1 pg - 59 mg/kg testtömeg dóztsíartományban, naponta egy vagy több sikalon-mak A beadás- módjára példaként. említhetjük az intravénás injekciói, sssbkuíán injekciót, íntradermáiís Injekciót, iatramuszkuláns injekciót, mönperitoneális injekciót és ehhez hasonlókat, előnyős az intravénás injekció.

Az injekciót előállíthatjuk nem vizes hígítóban (például propiíén-glikoiban, növényi olajban, mint például olívaolajba» és alkoholban, mist példáid etanolban), szuszpenzióban vagy emulzióban.

Az injekció sterilizálható bakteritanszürőn sz&ve, baktériumölöszerrcl keverve vagy besugárzással. Az injekció előállítható az alkalmazás időpontjában. Konkrétan, fagyasztva szárításnak tesszük ki steril, szilárd készítményt előállítva, amely steril desztillált vízben, vagy' más oldószerben feloldható injekció céljára alkalmazás előtt.

A találmány szerinti gyógyászati készítmény extrém módon alkalmas az immunológiai kilökődés (graftkilöködés) elnyomására, megelőzésére és/vagy kezelésére; amely immunológiai kilökődés- (graitkilökődés) súlyos probléma olyasa terápiákban, ahol donortól származó szervet (májai, szivet, tüdőt, vesét, hasnyálmirigyet, stb.) vagy részéi, vagy szövetet (mint például bőrt, szaruháríyát és csontot) íranszplantámak (allotranszplaníáciőval vagy xenoiranszpiantácíóval) súlyos, kardiovaszkuláns betegségben szenvedő recípiensnek.

Ráadásul a találmány szerinti gyógyászat! készítmény megnövelheti a gmfíkiiökődés (immunológiái ki- 18 * <

lökődés) olyan, létező immunszappressziv hatóanyagokkal történő elnyomását, amely hatóanyagokat az ilyen transzplantációs terápiák során adnak, be, ha a gyógyászati készítményt az immunszuppresszív hatóanyagokkal kombinálva alkamazzuk.

Azjdábmaki^.azái^.röyjdJsímsái.adísknteg,

Az I- ábra AJUM-eiíeni antitest és/vagy immunsztsppressziv hatóanyag: szerv transzplantációját kísérő immunológiai kilökődés (gmhkiiökődés) elnyomására gyakorolt hatását matatja be, indexként a gmftiúiélés olyan recipiensben való meglmssz&bbodását alkalmazzuk, amelybe donortól származó májat üllettek:A 2. ábra szerv transzplantációját kísérő ionnunolögia! kilökődés (graftkilöködésj Áíi JM-eífenl antitesttel és/vagy istmunszuppresszív hatóanyaggal való elnyomásának hatását mutatja be. teásaként a graftiéléíés: olyan recipiensben való meghosszabbodását (napokban kifejezve) alkalmazzak, amelybe donortól származó májat ültettek.

A 3, ábra szerv temszpiantáeiójáí kísérő immunológiai kilökődés (graítkiíökődés) AlilM-eíieni antitesttel (másképp nevezve ICOS-elfem antitest) való elnyomásának hatását matatja he. indexként a grafthdéiés olyan reeipísusben való meghosszabbodását (napokban tetejezve) slitabnazzuk, amelybe donortól származó szivet hiteitek;

A 4. ábra AILIM-expresszáló sejtektranszpteniák szívbe való ia&lteálódásának. fokát bemutató ienykép.

Az 5. ábra szerv transzplantációját kísérő immunológiai kilökődés (grahk'tióködés) AILIM-eileni antitesttel és/vagy AdCTLA4-íg-vel való elnyomásának hatását matatja be, indexként a graftídlélés olyan recípíensben való meghosszabbodását (napokban kifejezve) alkalmazzuk, amelybe donortól származó szivet ültettek.

A ö. ábra AÍLiM-ellen.1 antitest és ÁdCTLÁŐ-Ig kombinációja szerv transzplantációját kísérő immunológioi kilökődésre (graítkiíökődés) gyakorolt elnyomó hatását mutatja be, indexként az átültetett szív (elsődleges szívátültetés és másodlagos szívátültetés) recipiensben való grafttéíélese vagy annak hiányát alkalmazva, _:Aáj.aláhbÍÍAban.ismertetjük a találmány igen előnyös: megvalósítási módjait.

Az alábbiakban a Példákra hivatkozva dlnsztráljuk a találmányt, azonban ezáltal nem kívánjuk korlátozni annak oltalmi körét

1, példa

Graítkiíökődés elnyomása AiLíM-nroduláló anyaggal májátültetés esetében

1, Anyagok és módszerek:

1.1. Állatok

Felnőtt Amtes-paikányokni (hímek, 2ÍÖ-25Ö g) és DA-patkányokat (hímek, 2.IŐ-2.5Ö g) alkalmaztunk reeipsensként és donorként.

1.2. Patkányeredetü AlLiM-elleni antitest

A korábban közök, „ΓΠ-ί elnevezésű, egéreredetü patkány-AlLlhí-elleni tnonoktónális antitestet alkalmaztunk, (egéreredeiő, patkány-JTT-l-antigén-elleni monoklonálís antitest), amelyet hibridóma (melyet Budapesti Szerződés szerint leiéibe helyeztek

19Ö6, október ί I-én a Aníiono; .óísdtóte eóSíosefenee mm /sífmrm-i’ecA.vo/ogy- áófeAóy ócomney, Trade {mb /sdsrtey-nál, amely a Budapesi-szerzödés által igazolt nemzetközi léten hgynőkség, letéti szánt: FERM BP-5707) m vtón és át vívó tenyésztésével nyert tenyészieiülúszéjából vagy ascltes-folyadékból tisatítottak. Ezt az. antitestet egyszerűen „AÍESd-elbni antitest’’-nek nevezzük.

1J. Májlranszplantáció

Kamada és munkatársai korábban közölt eljárását követve a donor .OA-patkányok: máját recipiens óewfeΑ.« patkányírkba trans^ylaatáltuk (Saígery, 93: 64 (1979)}.

Előnyösen, a Dri-patkányokbél kapóit májakat sterilizált, bőséges desztillált vízzel mostuk a -bemeneti vénán át. 'Ernán. a májak reciptess.őeH'te-patkáuyokba történő transzplantációját a máj feletti ve»a <w elvárrásával kezdtük. Ezután a ,43iaaűKsetts^>'-tecfclka alkalmazásával a bemeneti vénát és a máj alatti vem cwt összevarrtok [Traasplant. Proe,, 19'. 1158 (1987); Trausplastatiou, 43; 745 (1987)j.

Ha. a recipiens patkányok a transzplantáció befejezését követő 3 napon belől elpusztultak, ezt a transzplantációbau bekövetkezett -technikai hibának batároziuk meg. Ennek eredményeként a sikeres operációk aránya 95% volt

1.4. ASLIM-eileni antitest és/vagy im-osmszuppressziv hatóanyag beadása

A transzplantáció befejezése után az AH.,íM-elleni. antitestet .és/vagy az FK-506 ímnmaszuppresszív hatóanyagot adtok be mindegyik Imríx-padcásynak (minden csoport 5-9' állatot tartalmazott) a fent -ismertetett dózisokban és ütemezés szerint, A transzplantáció befejezésének napját szánritotoik a 8. napnak (Ö).

Kon.ítollkónt azt a csoportot, slkte-uaztök, amelytől az AiLIM-ellem antitestet és az FK.-5Ő6tototosszuppresszív hatóanyagot sem. adtok be,

1. AHJM-eilem antitest (1 mg/kg;' Intravénás injekció; 0. nap)

2. ILlM-eilsni antitest (1 mg/kg; intravénás iajekci'é; 0. és ó. nap)

3. AHJM-eiteai antitest (I mg/kg; intravénás injekció; 0., 3. és ő, nap)

4. ÁILíM-elleni antitest (1 mg/kg; intravénás injekció; 0., 3., 6. és 9. nap)

5. AlLÍM-elleni antitest (0.3 mg/kg; intravénás injekció; 0., 3,.6. és 9. nap)

6. FK.-5ÖÓ (1 mg/kg; tetramüszkalteis injekció; Ö, nap)

7. AJLIM-elleni antitest (1 mg/kg; intravénás injekció; 0. napi és FK-SÖő (1 mg/kg; intramaszkuláns; ö, nap).

A teanszpiantáh máj recipieusben való túlélésének időtartamai meghatároztok a áGap/ur-Mcíer-teszt alkalmazásával.

2. Eredmények

As eredményeket az i. ás a 2. ábrás mutatjuk be. A 2. ábrán az adatok egy-része az 1. ábra adatait frissíti.

Eredményként azt a .következtetés·, vonhatjuk le. hogy abban a csoporton, ahol AIEIM-elleni antitestet aáiunk be (1 mg/kg) 3-szor vagy 5-azör, a transzplantációt követően egy adott idoperióduson át, a transzpí&níák mái grahtülélésénsk jeletoös mértékű meghosszabbodását Egyeltek meg a kontrolihoz viszonyítva.

Ráadásul shbaa a csoportban, ahol alacsony dőzisú AlLIM-elleni aniisesteí adtunk be 5-szőr transzplantációt követően egy adott idoperióduson át, a transzplantált máj graEtúlélésének .hasonló, jelentős mértékű meghosszabbodását -figydiSk taeg.

Ráadásuk meglepő módon, az ΑΠ..Ι.Μ-elleni antitestet. tikár csak' egyszer, FK.~50ő~toi (klinikaiíag többféle célra alkalmazott, mmtortszuppressziv hatóanyaggal) kombinációban beadva a tranxzpíaniált máj grsRtáléíése nagymértékben meghosszabbodik; a túlélési idő jelentős mértékben hosszabb volt, mint amikor csak az FK-506ot alkalmaztok, egy alkalommal.

.Az eredmények alapján a következőket állíthatjuk:

1) Az AIElM-elleni antitest jelentős mértekben elnyomja a graíikilökődést (Immunológiai kilökődést), amely grafí, például szerv transzplantációját kíséri.

2) A grafe például szerv baaszpianíádőját kísérő graílkilőkődés még jobban elnyomható AltlM-eltó an- 20 titest immímsziipprösszív hatóanyaggal történő beadásával, ahhoz viszonyítva, ha csak sz egyiket alkalmazzak.

2. példa

Immunológia! kilökődés elnyomása AlLlM-modulálő anyaggal szivtfaösspiantáció során(1. rész)

1, Reagensek, állatok és mérési eljárások

1.1, Állatok belsőit, C3/FlA?-egerekei (hűnek, ő hetesek) és RdEFÁ-egereket (hímek, 6 hetesek) alkalmaztunk reeipisnsként és dosorkésí.

1.2, Egér AILlM-eliení nmstoklonáhs antitest előállítása

Az előállítást a kővetkezőképpen hallottuk végre:

A korábba» közölt [Int. ímmaoot, .1.2(1): 51-55: Í2ö00)j egéreredetií Á1L1M teljes hosszúságú amraosavszekvencíáját kódoló cDHS-t alkalmazva egéreredetű AlLM-et expresszáló íransztőrmált sejteket állítottunk elő standard eljárásokkal, genetikai rekombinációs technológia alkalmazásával.

A transzformált sejteket homogenizáltuk és ultraeenírttugálásnak vetettük alá (löö Ö00 x g), és a sejlmembránfrakcióí tsrtahnstző, centrifugált ntaradékot összegyűjtöttük, és PBS-ben szuszpendáltuk. A kapott sejhs&mbráafrákeiőí komplett Freand-féle adjuvásssál együtt Ilkvíor-patkányok ujjhegyébe injektáltuk kezdeti isnmosizáiáskéní (Ö, nap). Ráadásul a sejtmenibrántrakciót antigénként az ujjbegybe beadtok (adott) időközönként, a 7., 14. és 28, napon, A végső immumzálás után két nappal nyirokcsomói sejteket gyújtöttílnk össze.

A nyirokcsomói sejteket és.Ríl-mielómasejtekeí (JCR sz. 130113.; Rés, Dísciosure, 217; 155 (1982)] 5:1 arányban Összekevertünk, és ntonoktesálls antitestet termelő hihridómákat állítottunk elő sejtfúzióval 4000-es polí-etílénglíkoí (fföetósger Afömtóm) fúziós hatóanyagként történő alkalmazásával. A bíbridómaszelekciót /ó41-oí, 10% magzati bortászérumot és arninopiersst tartalmazó AKFtiM-iápközsgfeen (Ajinomeío) való tenyésztéssel haj tottak végre.

A sej tok llooreszcenclamíenziíását mértük (a sejteket, ágy festettük, hogy mindegyik hífertöórnát reagálíattimk & fenti, rokombmáas, ÁIERd-expresszáló, transzfektált sejtekkel, majd F/TC-jelők, paíkányellem ígGvel (Chnpí·:/), £/VG$-jWT£ jfow eitométer alkalmazásával a mindegyik hihndéms esetében a tenyészfelOlúszóhan előállított., monokionáhs antitestek egéreredetú AILÍM-elieai reaktivitásának megerősítésére. Ennek eredményeként kaptunk néhány híferidómát, amely egéreredetú AILIM-ellesí reaktivitással rendelkező mosoklonális antitestet temelt,

Áz egyik ilyen hihridóraát JBIO.5''-nekneveztük el. Ezt a bibritiómát (lOMö⁷ sejtiOő ml egér) injektáltuk intrtípetitoneslisan /CR mfern egérbe (nőstény, ?-S hetes). 10-20 nap elteltével laparatómiát liajtotinnk végre az egéren altatásban, és a kapott «rejttu-foiyadekhói nagy léptékű, egér AltlM-ellenl, patkányeredetű monokionális antitest (lgG2a) előállítást hajtottunk végre standard eljárásoknak megfelelően. Ezt az antitestet ezután ,,AILIM~ellenl antitestnek” nevezzük.

1.3, Szívátültetés

A korábban közölt eljárást követve RRÓR/b-dfönoregerek szivét reoipiens Cl/AHe-egerek hasüregébe ültettük. A trsnszplanláit szív dobogásának megszűnését vettük a graftkílöködés lezajlásának.

2.1. Kísérlet (AlLíM-dlerh antitest beadása)

Mindegyik, transzplantáción átesett, ÜJ/f-A%-egérn.ek (10 egér) az ΑΠ-ΙΜ-eUear antitestet (10 mg/kg) közvetlenül a transzplantáció után beadtuk (0. nap, 200 pg),. a z,, napon (200 pg), a 4, napon (200 pg), a 7. napon (290 gg) és a 10. napon (109 pg). Kontrollként olyan csoportot alkalmaztunk (25 egér), amelyeknek nem adtak be ΑΠ,ΙΜ-clIeoi antitestek

Az átültetett szivek fegnszplamáeióf kővető graöíülélését a recipiensfeen megbecsültük és hUkm-Áfeterteszi alkalmazásával meghatározzuk.

Az átültetett szivek transzplantációi követé·, a reciplenshen meghatározott gx&fttúlélésének átlagos időtartama a következő:

AÍLlM-elleal antitestet kapott csoport: s graftídlélés Időtartama: 9 nap 1 egérben, 10 nap 3 egérbe», 13 nap 4 egérben, 16 nap 2 egérben.

Kontrollcsoport:· a grafitnlélés Időtartama; 6 nap 2 egérben, 7 nap 9 egérben. 8 nap 7 egérben, 9 nap 3 egérben, lö nap 4 egérben.

A kontrollcsoportban, ahol AlLÍM-elleni antitestet nem adtunk be. a. graít-íölélés Időtartama 7.9 nap volt, ezzel szentben az AlLIM-elleni antitesttel kezelt csoport esetében ez 12.3 nap volt, es a íraaszplaaíált szív graíhűlélése jelentős mértékű meghosszabbodását demonstráltuk az AILlM-elleni antitesttel kezeli csoportban.

3,2. Kísértet (AlLlM-elfeni antitest beadása)

Ugyanazokat az állatokat (donorok és: reciplensek}: és: AlLiM-elieni antitestet alkalmaztuk, mint a fentiekben.

A szívátültetést az L kísérletben leírtakhoz hasonló módon hajtottuk végre..

Mindegyik, rtasszplaníáoiön átesett, CUAohte-egrhrsek mirsperítoneáksan beadtuk az Aíl.W-eilent andtestet (löö pgótap) közvetlenül a trariszpíantácíőt követően (Cl. nap), a 2.. 4., 7. és 10. napon. Kontroliként olyan csoportot, alkalmaztunk, amelynél AlLM-oltó anthesteí nem adtunk be.

Az átültetett szivek transzplantációt követő, a reoípiensben meghatározott grahtnlelésének átlagos időtartama rnegközolitöleg 7,7 sáp volt a kontrollcsoportban, mig az AlLÍM-elleni antitesttel kezelt csoport esetében ez megközelítőleg 40,9 nap volt (intermedier érték; 29 nap, maximumérték'. 129 nap), (3. ábra). Konkrétan az AlLÍM-elleni antitesttel kezeit csoport esetén a íranszplartták szív graftníléiésének jelentős mértékű meghoszszabbodását deatoosítáltak.

Ráadásul, Iretnatoxilin/oozb-féstésseí standard: eljárások alkalmazásával) vizsgáltuk az AILIMexpresszáló (ICOS-expresszáló} sejtek transzplantáli szívbe történő iníUtralódásának mértékét minden konírolleger esetében (a. transzplantáció uíáa terápiás kezelést sem alkalmaztunk) és a transzplantáció után AIUMelleni antitesttel kezelt egér esetébe».

Etmek eredményeképpen, sULÍM-expresszáló (ICOS-expresazáió) sejtek jelentős mértékű infíhrálódását, valamint a szívizom nekrőzísát Egyeltük meg (festödőlt rész). Másrészt sz Ail.lM-eiteni antitesttel kezeit egére esetében a transzplantáli szívben a szívizom nekrőzísát nem figyelhettük meg, az .AiI..lA'1-expresszálö (1CÖSsxpresszáló) sejtek inEhrálodássnak jelentős mértékű csökkenését megerősítettük (4, ábra).

3. példa.

.Az immunológiai kilökődés elnyomása szív--és bőrátültetés esetében AlLÍM-moduláló anyagokkal

1, Reagensek, állatok és mérési eljárások

1.1, .Adenovirusvektor hCTLÁ4~íg-t (komán eredeíüCTLAd extracolteláris régióját és humán eredetű Fc-t tartalmazó hiziós fehérje) kódoló cDNS vagy akár az E. cmi β-galaktezídáz-gézfjét (fecZ) kódoló cDNS expressziös kazettáját tartalmazó tidenovteust állítottunk elő a pádex/CÁhCTLA4-.lg expressziös kozmiáknzetía [Trnnspkmíadon, ŐS(n); 758 (1999)] és a szülői törzs adenovírns genonga (Froc. NatL Acad. Sci. USA., 90,(24); 3.14.93-11502 (1993)] homológrekombinációjával.

Ezután a rekotobiuátis vitet humán veséből származó - 293-sejlvonalban protíferácsósak vetettük alá. Az ilyen módon előállított virusvektort ősszegyöitöriúk és --SfioC-on fagyasztva tároltok. A hCTLA-íg cDNS-ét taxialmazó rsfcomfewáss adeasovísrast és LaeZ-t tartalmazó adenovirust AdOXA-lg-nek és AdL&cZ-nsk neveztük el.

1.2. Állatok és antitestek

Felnőtt, hiút (2lfi~2SÖg) Lewis (RTi^!) patkányokat alkalmaztunk recipiessként, és felnőtt, hím (21Θ250g) DA (RlT) vagy BN (RT Γ) patkányokat afalmazteak donorként

Az i. példa szerint előállított, egéreredetü, patkány AILJM-eíleni monoklonális antitestet alkalmaztok.

1.3, Szív- és bőrátültetés: ás mérési eljárások

Korábban közölt eljárását követve [X Thorae. Cardíovasc, Surg., 57(2): 225-229' (1969)) DA~ patkányoktól nyert sziveket TenA-patkanyok hasüregébe ültettük, A szrvttouszpfetoádőt követően azonsat patkány AÍLÍM-elleni antitestet: (1 mg/kg) és/vagy AdCTl,A4-l.g~t (Ifi³ „plakképző” egység, pfe) adtunk he intravénásán, egyetlen dózisban a reeipíens patkányoknak.

Kontrollként olyan csoportot aikttlmazlunk, amelynél a transsplaritalt állatoknak AÍLJMoBsöí antitestet és AdCTLÁ4-Jg-t sem adtok be, és olyat, amelynél AdI,acY-t.adtunk be. A kezelési eljárást minden állatcsoportnál az alábbiakban mutatjuk be,

1. csoport: Állotraoszplatoáció íxtompszappressziv kezelés nélkül.

2. csoport: Izottonszpiantáció iőentoZímvis) immnnpszuppressziv kezelés: nélkül.

3. csoport: Ailotrasszpbrúádő (Lewó/DA) AdtacZ beadásával.

4. csoport: Allotraesaplaatáeió (ImvA/DA): Ad€TLA4-lg beadásával.

5. csoport: Aliotranszplantáció (LmvA/ÖA) ΑΠ.ΤΜ:-elleni antitest beadásával.

ő. csoport: Allotrsnszpísntáció (ReoA/ö/i) AdCTLA4-Ig és AILIM-elleni antitest beadásával,

A transzplantált szív dobogásának megszűnését vettük a grahkíiökodés lezajlásának. A grahkííökódést a transzpkmtálí szív szövetébe inrilőálódoít sejtek hísztológiai vizsgálatával és az izoxnsejtek nekrózisán&k (standard eljárásokat követő) ATÍ-íesiésével történő vizsgálatával erősítettük meg.

Ezután a 4. és b, csoportban (ahol a szivek hosszú ideig túlélést mutattak) a recípiens patkányok laterális meliüregiáiáfca a .D/l-áonotpatkátíyttk megfelelően vastag feörgrafiját irartszplaniáhnk. A börtranszplsntáció után .AHJM-elleni antitesttel, AdCTLA4-Ig-vel vagy ilyenekkel tmmunazuppresszi'v kezelést nem hajtattok végre. A bőrgrnfi-tálélés időtartamának végét vizuális megfigyeléssel, a graft 10%-ra vagy kisebbre csökkenésével határoztok meg.

Ezután a kezdeti, ZM-p&tkányok sziviraaszpiautációja után 26Ö nappal a Pri-donorp&tkány szivét mandzsetta-íec'baifca [Ásta Pátitól, Mierobtol. Seaná. (A), 79(4); 366-372 (1971)] újra átültettük a 6. csoportba (amely a donorbör-transzplímtácíő során grafíkiiőködést mutatott) tartozó,. 3 recípíees patkány cenékális régiójába trsnszplaatáknk,

Ráadásul a kezdeti. öA-dotjerpatkányok szsvtranszplantáeiója után. 150 nappal RA-doarapatkányok szivét ira&szpltettákúk a ő. csoportba (ahol a írsnszplsstált szív hosszú időn keresztül túlélést mutatott) tartozó, fennmaradt .recipiens-paíkányrskba,

A gtofttúlélés recspieasben tapasztalt mértékének: statisztikai kiértékelését Rín-doraA/mérTeszl. szerint kp tóitok végre.

2. Vizsgálati eredmények

Ácsiöt az. 5. ábrán bemutattak, a úanszplaofált szívek recipienshen -való· túlélésének a nem kezek, xenot:m'u;xplaoiáeiőn átesett állatok csoportjához (1. csoport) viszonyított, jelentés mértékű meghosszabbodását figyeltük «reg, illetve nem figyeltük meg az AdLacZ-vel kezelt állatok csoportjában (3. csoport) ás egyszeri dózisba» AÍLfM-ellem antitesttel kezelt állatok csoportjában (5, csoport).

Másrészt az ÁdCH.,A4-lg-el kezelt állatok csoportjában (4. csoport) a transzplsatált szív grafitölélése (kezdethess átültetett ZM -patkányszív) jelentős mértékben meghosszabbodott (átlag: megközelítőleg 64 nap). Ráadásul a 4. csoportba (10 patkány) tartozó 3 patkány esetében a transzpíaniáit .szív grafitölélése esetébe® hosszú, löő napos, vagy hosszabb Időszakot ügy éltünk meg (5. ábra).

Ráadásul abban a csoportba», ahol ÁdCTLA44g.-t és ΑΙΠΜ-eUeal antitestet kombinációban alkalmazóink (6, csoport), a transzplsstálí szív grafitölélése (kezdeti, öd-paíkánysziv) korlátlanul (3ÖÖ nap vagy több) meghosszabbodott mindegyik recipiems esetében (5. ábra,)

A 4. csoport recípíensáhen a fcamzplaafálí szív grafttáléíése (kezdeti, Z?.4-paíkánysziv) kilökődött a tmszplantáft bőrrel együtt, míg a 6. csoport a tfsrtszplantáít szív kilökődését nem figyeltük meg.

Amint tó & o- ábrán hesKúaíjük, a. 4, és 6, csoportba tartozó mindegyik patkány esetében, amelyik donortól transzplrnttált bőrt kapott, a transspta&k bőr kilökődött. Azonban a 4. csoporttal és a. kontrollcsoporttal ellentétben, ahol a transzplantáh bőr kilökődése 12 napon beiül lezajlott, a ó. csoportban a kilökődés- kissé később zajlott le, ló napon beiül vagy hamarabb. Ez az eredmény azt mutatja, hogy az AdCTLA4~Ig és ΑΗ..ΪΜeliem amitest kosnbisált alkalmazása késleltetheti a börgrafi kilökődését az AdCTLA4-lg. önmagában történő

Érdekes módon a 6. patkánycsoport reeipiess állatni esetében, ahol a transzpiantált szív (kezdeti, ZX4paskányszív) hosszú idejű graftóíiélcsét igazoltuk, a íranszplantált bőr teljes mértékben kilökődött a. fentiek szerint, azonban a második rtanszpiantáit szív esetébe® (a másodszor óanszplsmált íM-paikánydonorsziv) korlátlan idejű graíitóléléséi láttuk. Ráadásul a reetpiens patkányok esetébe» a kezdetben transzplaníáit donorsziv túlélést mutatott a vizsgálat során.

A 6. csoport cselében, amelyekbe•^V-psdcáaytfemomivet transzpianíáitönk, «.kezdetben transzplastált ZX4patkányszivek tovább dobogtak, és túlélést mutálták a vizsgálat során, azonban a másodszorra transzptetóli &¥ paíkánydonorszlvek rövid klórt beül kilökődtek az i, csoport állatainál megfigyelt eredményekhez hasonlóan

A találmány szraró gyógyászati készítmények extrém .módon alkalmazhatóak a szerv (máj, szív, tüdő, vese, hasnyálmirigy stb.), annak része vagy szövet (bőr, szamhártya, csőm, stb.), súlyos, kardiövaszkuláris betegségekben szenvedő recipienshe, donortól történő transzplantációjával (ailotranszplantáciöval vagy xenotranszplattíációval) járó terápiákat kísérő súlyos probléma, az ijmnonológiai kilökődés (graftkilöködés) elnyomására, megelőzésére -és/vagy kezelésére.

A találmány szerinti gyógyászati készítmények ezen kívül erősen elnyomják a graftkíiökődést létező, graftkilöködés (isrumraolőglai kilökődés) elnyomására az ilyen transzplantációs terápiában alkalmazott, knmuxtszuppresszív hatóanyagokkal kombinációban alkalmazva.

Ráadásul a találmány szennt:, AKJM-elfeni, humán eredetű antitestet tartalmazó gyógyászati készítmény kitünően alkalmazható gyógyszer, mivel nem okoz semmilyen mellékhatást, mint például allergiát, amely az egéreredetü antitest embernek történő beadásakor fellép.

Claims (12)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. AILIM által közvetített jelátviteli moduláló aktivitással bíró anyag alkalmazása máj, szív vagy azok egy része trauszpiantácíéját kísérő grahkiíököílés elnyomására, kezelésére vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer előállítására, amely anyag az alábbi, (a)-;ól (e) anyagok közűi választott:

   (aj AILIM-hoz kötődő antitest vagy az antites t része;

   (b) AILIM extraeeliuiáris régiója egészét vagy részét tartalmazó poiipeptíd;

   (ej AILIM extracelhdácis régiója egészét vagy részét és immunglobniis-nehszlánc konstans régiójának egészét vagy részét tartalmazó fúziós poiipeptíd:

   (d) AiLíM-hoz kötődő pslípsptlá; és (ej AILIM ellem antíszensz DNS vagy antíszensz RNS,
2. 2. AILIM általi közvetített jelátvitelt moduláló aktivitással bíró anyag alkalmazása egy vagy több immunszuppresszlv hatóanyagnak a máj, szív vagy azok egy része.transzplantációját kísérő grafrkíiökődés elnyomására, kezelésére vagy megelőzésére gyakorolt hatásának növelésére szolgáló gyógyszer elóállitására, amely anyag az alábbi, (aj-tól (e) anyagok közül választott;

   (aj AILIM-hoz kötődő antitest vagy az antitest része;

   (b) AILIM exiraeelluláris régiója egészét vagy részét tartalmazó poiipeptíd;

   (ej AILIM extraceiíuláris régiója egészét vagy részét és Imtnunglobuiin-nehézlánc konstans régiójának egészéi vagy részét tartalmazó í&ziós poiipeptíd;

   (dj AILIM-hoz kötődő poiipeptid; és (ej AILIM elleni antiszensz DNS vagy aniiszensz RNS.
3. 3. A 2. igénypont szerinti, alkalmazás, ahol az mummszuppressziv hatóanyag egy vagy több, terápiás feaiótmyag a· következükben felsoroltak közök azaiioprio. adrenokortikális szteroidok, cikiosporin, mlzoribin és takroinnusz (LK-50Ő), mikoiénolátíuioféds, lel&notnid, sirolimus, dezoxi-spergualin, FTY72O és CTLA4hatóanyag.
4. 4. Az 1-3, igénypontok bármelyike szerfala alkalmazás, takrolímasszai (FK-506) és/vagy CTLA4hatóaoyaggal kombinációba történő alkalmazásra,
5. 5. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a kanszpiantácíő allotramzplaníáció.
6. 6. Az 1-3, igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a transzplantáció xermtranszplantáció.
7. 7. Az l-ó. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az: anyag AlLÍM-hez kötődő antitest vagy az antitest része,

   S, Gyógyászati készítmény máj, szív vagy azok egy része transzplantációját kísérő graftkilökodés elnyomásában, keze lésébe o vagy megelőzésébe» történő alkalmazásra, amely gyógyászati készítmény .AILIM által közvetíteti jelátvitelt moduláló aktivitással bíró anyagot és gyógyászatiíag elfogadható hordozót tartalmaz, amely anyag az alábbi, (aj-tói (ej anyagok közül választott:

   (a) AILIM-hoz kötődő antitest vagy az antitest része;

   (b) AILIM extraceiluláris régiója egészét vagy részéi tartalmazó poiipeptíd;

   (ej AILIM extraceiluláris régiója egészét vagy részét és immunglobulin-nefeézlánc konstans régiójának egészéi vagy részét tartalmazó fúziós poiipeptid;

   ♦« X*

   X > * ♦ (á) AlIJM-hoz kötődő polipeptid; és (e) AHJM elleni antiszensz DNS vagy antiszensz RNS.
8. 9. Gyógyászati készítmény egy vagy több immnnszoppressziv hatóanyagnak máj, szív vagy azok egy része transzplantációját kísérő graftkilökődés elnyomására, kezelésére vagy megelőzésére gyakorolt hatásának növelésében történd alkalmazásra, amely gyógyászati készítmény AIL1M által közvetített jelátvitelt moduláló aktivitássá; bíró anyagot és gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz, amely anyag az alábbi, (a)-tól (e) anyagok közül választott:

   (a) AlLFM-hoz kötődő antitest vagy az antitest része:;

   (b) AÍLIM extraeehuiáris régiója egészét vagy részét tartalmazó polipeptid;

   {ói AfiJM extracelhüáris régiója egészét vagy részét és immnöglobidin-aehézlánc konstans régiójának egészét vagy részét íartahnsző fúziós polipeptid;

   (d) Aítlfd-boz kötődő polipeptid; és (e) AILIM ellepi antiszensz DNS vagy antiszensz RNS, lö. A 9. igésypoKt -szerinti gyógyászati készáhnény, ahol az -hmnörsszuppresszív hatóanyag egy vagy több terápiás hatóanyag a következőkben felsoroltak közöl: azatioprin, adresokoriikális· szíeroidok, ciklosporm, mizorifein és íakrolimusz (F&-506), mjkofenolát-mofetil, tefhsnontid, stroiimus, dezoxi-spergualin, FTY720 és CTLA4-hatóanyag.
9. 11. A 8-I-Ö. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati készítmény, takrolinxusszai (FK-506) és/vagy CTLÁ4-ha!óanyaggai kombinációban történő aikafeíszásra.
10. 12. A 8-11. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati készítmény, ahol a transzplantáció allotranszpianideíó.
11. 13. A 8-11. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati készítmény,, ahol a transzplantáció xenotraaszplastáeió,
12. 14. zk 8-13. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati készítmény, ahol az anyag AELlM-hez kötődő antiiesí vagy az antitest része.