ES2344219T3 - Supresores de rechazo a injerto. - Google Patents
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Abstract
Una sustancia que tiene una actividad de modular la transducción de señales mediada por AILIM para aumentar el efecto de uno o más agente(s) inmunosupresor(es) sobre la supresión, tratamiento o prevención del rechazo a injerto que acompaña el trasplante de un órgano, una parte del mismo o un tejido, dicha sustancia se selecciona de cualquiera de (a) a (e): (a) un anticuerpo que se une a AILIM, o una parte de dicho anticuerpo; (b) un polipéptido que comprende el total o una parte de la región extracelular de AILIM; (c) un polipéptido de fusión que comprende el total o una parte de una región extracelular de AILIM y el total o un parte de una región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina; (d) un polipéptido que se une a AILIM; y (e) un ADN antisentido o un ARN antisentido contra AILIM.
Description
Supresores de rechazo a injerto.
La presente invención se refiere a composiciones
farmacéuticas que comprenden una sustancia que tiene una actividad
para modular la actividad biológica de la "molécula
inmunomoduladora de linfocitos inducible por activación" (AILIM,
en sus siglas en inglés) (también conocida como "coestimulador
inducible" (ICOS)), especialmente la transducción de señales
mediada por AILIM.
Específicamente, la presente invención se
refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden una sustancia
que tiene una actividad para modular (por ejemplo, inhibir) la
proliferación de células que expresan AILIM o modular (por ejemplo,
inhibir) la producción de una citoquina (por ejemplo,
interferón-\gamma o
interleuquina-4) por células que expresan
AILIM.
Más específicamente, la presente invención se
refiere a (1) composiciones farmacéuticas para la inhibición,
tratamiento o prevención de rechazo a injertos (rechazo
inmunológico) que acompaña el trasplante de un órgano, o una parte
del mismo, o un tejido; y (2) composiciones farmacéuticas para
aumentar el efecto inhibidor, terapéutico o preventivo de agentes
inmunosupresores sobre el rechazo a injertos (rechazo inmunológico)
que acompaña el trasplante de un órgano, o una parte del mismo, o
un tejido.
Debido a la reciente revisión de las leyes sobre
trasplante de órganos, se han realizado en Japón unos pocos
trasplantes de órganos de pacientes con muerte cerebral. En un caso,
siete pacientes recibieron tales beneficios de un donante. Después
de ello, se espera que los trasplantes de órganos aumenten.
Por otra parte, se estima que los pacientes
japoneses afectados por enfermedades cardiovasculares graves, tales
como, enfermedades hepáticas (insuficiencia hepática aguda, cirrosis
hepática, etc.), enfermedades cardíacas (insuficiencia cardíaca
grave, cardiomiopatía, hipertrofia cardíaca, etc.), enfermedades
renales (insuficiencia renal, glomerulonefritis crónica, nefropatía
diabética, pielonefritis, etc.), enfermedades pulmonares (disfunción
pulmonar de ambos pulmones, etc.) y enfermedades pancreáticas
(tratamiento de pacientes diabéticos), para cuyo tratamiento es
vital el trasplante de órganos, aumentan cada año en alrededor de
600 pacientes de corazón, alrededor de 3.000 pacientes de hígado y
alrededor de 500 pacientes de pulmón. Mientras se desarrolla el
aspecto legal, la falta de órganos trasplantables también es un
problema real que existe en este momento. De manera similar, la
falta de órganos es un problema serio también en los Estados Unidos,
que es un país avanzado en términos de trasplantes. En los Estados
Unidos, aproximadamente 4.300 personas (1999) están esperando
trasplantes de corazón y aproximadamente 43.000 personas (1999)
están esperando trasplantes renales. En realidad, aproximadamente
800 personas y aproximadamente 2.300 personas mueren cada año sin
poder recibir trasplantes de corazón y riñón, respectivamente.
El trasplante de tejidos (tales como piel,
córnea y hueso) u órganos (tales como hígado, corazón, riñón, pulmón
y páncreas) incluye: (1) autotrasplante (trasplante autólogo), (2)
isotrasplante, (3) alotrasplante y (4) xenotrasplante.
Autotrasplante se refiere al trasplante de una
parte de un individuo a otra parte del mismo individuo, y un
ejemplo es el caso de tratar una quemadura injertando la piel normal
de uno mismo en el área afectada.
El isotrasplante se realiza entre animales
homogéneos. En seres humanos, tal trasplante se realiza entre
gemelos homocigóticos (por ejemplo, trasplante de uno de los
riñones o tejidos hepáticos).
El alotrasplante se realiza entre dos individuos
diferentes que tienen contextos genéticos diferentes, y en seres
humanos, tal trasplante se realiza entre gemelos dicigóticos o entre
individuos que no tienen absolutamente ninguna relación sanguínea
entre sí.
El xenotrasplante se realiza entre individuos de
diferentes especies animales. Un ejemplo es el caso se trasplanta
un tejido o un órgano de un chimpancé o un cerdo en un ser
humano.
Como se ha mencionado anteriormente, se espera
que aumenten los alotrasplantes de pacientes cerebralmente muertos
debido al desarrollo de la legislación relativa al trasplante de
órganos. Sin embargo, para resolver la falta absoluta de órganos
trasplantables, actualmente se persiguen activamente varias
investigaciones cuyo fin son las aplicaciones prácticas del
xenotrasplante, más específicamente, el trasplante de tejidos u
órganos de mamíferos no humanos tales como cerdos a seres
humanos.
Mientras se espera que el tema de la falta de
tejidos y órganos trasplantables se resuelva mediante el desarrollo
de leyes sobre la muerte cerebral y trasplante, y mediante la mejora
de las técnicas de xenotrasplante, hay otro obstáculo
extremadamente grande en el tratamiento enfermedades mediante
alotrasplante y xenotrasplante. Más específicamente, el obstáculo
es el rechazo inmunológico grave (rechazo a injerto) en receptores
que se produce después del trasplante de tejidos u órganos de
donantes.
Rechazo a injerto se refiere a varias respuestas
inmunes que tratan de rechazar y eliminar un injerto (una parte de
un cuerpo vivo que se trasplante, una célula, un tejido o un órgano)
de un donante cuyo contexto genético es diferente al del receptor
(es decir, alotrasplante o xenotrasplante) ya que el receptor
reconoce el injerto como una sustancia extraña. Las respuestas
inmunes que acompañan este trasplante se pueden clasificar en: (1)
rechazo hiperagudo, que es un rechazo fuerte que se produce
inmediatamente después del trasplante; (2) rechazo agudo, que se
observa a los pocos meses después del trasplante; y (3) rechazo
crónico observado varios meses después del trasplante. Además,
aunque la inmunidad celular debida a las células inmunocompetentes
representadas por las células T y la inmunidad humoral debida a los
anticuerpos se producen de una manera intrincadamente coordinada,
la respuesta principal es mediante inmunidad celular.
Como resultado del rechazo a injerto, por último
el injerto se vuelve necrótico y se cae. Además, el receptor
desarrolla no solo síntomas sistémicos graves tales como fiebre,
leucocitosis y fatiga, sino también hinchazón y sensibilidad en el
sitio del trasplante. Además, pueden producirse complicaciones
graves tales como infecciones.
En particular, cuando se trasplanta una injerto
xenogénico tal como el de un cerdo, se produce el problema serio
del rechazo hiperagudo por lo que el injerto se rechaza en
minutos.
Un número limitado de agentes inmunosupresores
que suprimen la función de células inmunocompetentes se usan para
suprimir el rechazo inmunológico (rechazo a injerto) que acompaña
tales trasplantes, porque el rechazo inmunológico producido por el
alotrasplante se debe principalmente a inmunidad celular. Tales
agentes inmunosupresores incluyen ciclosporina (CsA); tacrolimus
(FK-506); azatioprina (AZ); micofenolato de mofetilo
(MMF); mizorribina (MZ); leflunomida (LEF); esteroides
corticosuprarrenales (también conocidos como hormonas
corticosuprarrenales, corticoesteroides, corticoides) tales como
prednisolona y metilprednisolona; sirolimus (también conocido como
rapamicina); deosxiespergualina (DSG) y FTY720 (nombre químico:
clorhidrato de
2-amino-2-[2-(4-octilfenil)etil]-1,3-propanediol).
También se están desarrollando clínicamente como
agentes inmunosupresores CTLA4 y CD28, que son moléculas
responsables de transducir señales coestimuladoras necesarias para
la activación de células T (moléculas de transducción de señal
coestimuladora), y especialmente fármacos de CTLA4 que usan la
región soluble de CTLA4 y el gen que la codifica.
Por otra parte, recientemente, de forma similar
a CTLA4 y CD28, que son moléculas de transducción de señales
coestimuladoras, se identificó una molécula llamada molécula
inmunomoduladora de linfocitos inducible por activación (AILIM,
humana, de ratón y rata; Int. Immunol., 12 (1),
p.51-55, 2000; también llamada coestimulador
inducible (ICOS; humano; Nature, 397(6716),
p.263-266, 1999); J. Immunol., 166(1), p.1,
2001; J. Immunol., 165(9), p.5035, 2000; Biochem. Biophys.
Res. Commun., 276(1), p.335, 2000; Immunity, 13(1),
p.95, 2000; J. Exp. Med., 192(1), p.53, 2000; Eur. J.
Immunol., 30(4), p.1040, 2000) como la tercera molécula
transductora de señales coestimuladoras que transduce una segunda
señal (señal coestimuladora) necesaria para la activación de
linfocitos tales como células T, y acoplada con la señal, regula la
función de linfocitos activados tales como células T activadas.
Basado en los descubrimientos de estudios
recientes relacionados con esta molécula, se predice que la molécula
AILIM esté posiblemente implicada en varias enfermedades (por
ejemplo, enfermedades autoinmunes, alergias e inflamaciones)
producidas por la activación de células inmunocompetentes tales como
células T (especialmente células T). Sin embargo, no hay
descripciones sobre la relación entre la modulación funcional de la
molécula AILIM y el rechazo a injertos (rechazo inmunológico) que
acompaña al trasplante de tejidos u órganos, así como intentos de
suprimir, tratar o prevenir tales reacciones de rechazo que
acompañan al trasplante de tejidos u órganos modulando la actividad
de la molécula AILIM.
Además, muy recientemente se ha identificado una
molécula nueva llamada B7h, B7RP-1, GL50 o LICOS que
se considera que es un ligando que interacciona con la molécula de
transducción de señales coestimuladoras AILIM (Nature. Vol.402,
No.6763, pp. 827-832, 1999; Nature Medicine, Vol.5,
No.12, pp.1365-1369, 1999; J. Immunology, Vol.164,
pp.1653-1657, 2000; Curr. Biol., Vol.10, No.6,
pp.333-336, 2000).
La identificación de estos dos nuevos tipos de
moléculas, es decir, AILIM (ICOS) y B7RP-1 (B7h,
GL50, LICOS), reveló que, además de la primera y segunda vías de
transducción de señales conocidas entre CD28 y CD80
(B7-1)/CD86 (B7-2) y entre CTLA4 y
CD80 (B7-1)/CD86 (B7-2), hay una
tercera vía de transducción de señales coestimuladoras nueva que es
esencial para la activación mencionada anteriormente de linfocitos
tales como células T y el control de la función de células T
activadas, que funciona a través de la interacción de AILIM (ICOS) y
B7RP-1 (B7h, GL50, LICOS).
Están en vía de realizarse estudios exhaustivos
sobre las funciones biológicas de estas moléculas nuevas, la
regulación de funciones de linfocitos tales como células T mediante
la tercera transducción de señales coestimuladoras por las
moléculas y la relación entre la nueva transducción de señales y
enfermedades.
Más específicamente, un objetivo de la presente
invención es proporcionar métodos y agentes farmacéuticos que
supriman, traten o prevengan rechazos inmunológicos (rechazo a
injerto) que acompañan a un trasplante de tejido o un órgano
(alotrasplante o xenotrasplante) usando técnicas médicas y
farmacéuticas (por ejemplo, agentes farmacéuticos tales como
compuestos de bajo peso molecular y anticuerpos) para modular la
función biológica de una molécula nueva, AILIM, que se considera
que transduce una segunda señal (señal coestimuladora) necesaria
para activar linfocitos tales como células T y acoplada con la
señal, modula la función de linfocitos activados tales como células
T activadas.
Otro objetivo es proporcionar métodos para
aumentar el efecto supresor sobre el rechazo a injertos por agentes
inmunosupresores existentes (ciclosporina, azatioprina, esteroides
corticosuprarrenales, FK-506, etc.) usando tales
agentes farmacéuticos que modulan la función biológica de AILIM (por
ejemplo, agentes farmacéuticos tales como compuestos de bajo peso
molecular o anticuerpos).
Como resultado de la investigación exhaustiva
relacionada con la función biológica de AILIM de mamífero y un
método para suprimir el rechazo inmunológico (rechazo a injerto),
que es un problema serio que acompaña a un trasplante de tejido o
un órgano (alotrasplante o xenotrasplante) de injertos (células, un
tejido o un órgano), los presentes inventores encontraron que (1)
los agentes farmacéuticos que modulan la función de AILIM suprimen
significativamente el rechazo inmunológico (rechazo a injerto) que
acompaña el trasplante de tejido(s) u órgano(s) y (2)
el efecto supresor en el rechazo a injerto de los agentes
inmunosupresores existentes aumenta usando agentes farmacéuticos
que modulan la función de AILIM, y completaron la presente
invención.
Una composición farmacéutica de la presente
invención es útil como un fármaco para modular varias reacciones
in vivo en las que está implicada la transducción de una
señal coestimuladora a células que expresan AILIM mediada por AILIM
(por ejemplo, proliferación de células que expresan AILIM,
producción de citoquina(s) por células que expresan AILIM,
citolisis inmune o apoptosis de células que expresan AILIM y la
actividad de inducir citotoxicidad celular dependiente de
anticuerpo contra células que expresan AILIM), y/o como fármacos
para prevenir el inicio y/o progresión de varias enfermedades en
las que está implicada la transducción de señales mediada por
AILIM, y para el tratamiento o profilaxis de las enfermedades.
Específicamente, una composición farmacéutica de
la presente invención puede modular (suprimir o fomentar) la
proliferación de células que expresan AILIM, o puede modular
(inhibir o fomentar) la producción de citoquinas (por ejemplo
interferón \gamma o interleuquina 4) por células que expresan
AILIM y puede prevenir varias enfermedades desencadenadas por
varios fenómenos fisiológicos en los que está implicada la
transducción de señales mediada por AILIM, y permite el tratamiento
o prevención de varias enfermedades.
El uso de una composición farmacéutica de esta
invención permite la supresión, prevención y/o tratamiento de
rechazo inmunológico (rechazo a injerto), que es un problema serio
en terapias donde se trasplanta (alotrasplanta o xenotrasplanta) un
órgano (hígado, corazón, pulmón, riñón, páncreas, etc.) o una parte
del mismo, o un tejido (tales como piel, córnea y hueso) de un
donante a un receptor afectado por una enfermedad cardiovascular
grave.
Además, el uso de una composición farmacéutica
de esta invención permite el aumento del efecto supresor de rechazo
a injerto de agentes inmunosupresores existentes administrados para
suprimir el rechazo inmunológico en tales terapias de
trasplante.
Más específicamente, las presentes invenciones
son como sigue:
(1) Una composición farmacéutica para suprimir,
tratar o prevenir el rechazo a injerto que acompaña el trasplante
de un órgano, una parte del mismo, o un tejido, dicha composición
comprende una sustancia que tiene una actividad de modular la
transducción de señales mediada por AILIM y un soporte
farmacéuticamente aceptable.
(2) Una composición farmacéutica para aumentar
el efecto de uno o más agente(s) inmunosupresor(es) en
la supresión, tratamiento o prevención del rechazo a injerto que
acompaña el trasplante de un órgano, una parte del mismo, o un
tejido, dicha composición comprende una sustancia que tiene una
actividad de modular la transducción de señales mediada por AILIM y
un soporte farmacéuticamente aceptable.
(3) La composición farmacéutica de (2), en donde
dicho agente inmunosupresor es uno o más agente(s)
terapéuti-
co(s) seleccionado(s) del grupo que consiste en azatioprina, esteroide corticosuprarrenal, ciclosporina, mizorribina y tacrolimus (FK-506), micofenolato de mofetilo, leflunomida, sirolimus, desoxiespergualina, FTY720 y fármaco de CTLA4.
co(s) seleccionado(s) del grupo que consiste en azatioprina, esteroide corticosuprarrenal, ciclosporina, mizorribina y tacrolimus (FK-506), micofenolato de mofetilo, leflunomida, sirolimus, desoxiespergualina, FTY720 y fármaco de CTLA4.
(4) La composición farmacéutica de cualquiera de
(1) a (3), en donde dicho trasplante es alotrasplante.
(5) La composición farmacéutica de cualquiera de
(1) a (3), en donde dicho trasplante es xenotrasplante.
(6) La composición farmacéutica de cualquiera de
(1) a (5), en donde dicho órgano es el hígado, corazón, riñón,
pulmón o páncreas.
(7) La composición farmacéutica de cualquiera de
(1) a (5), en donde dicho tejido es la piel, córnea o tejido
óseo.
(8) La composición farmacéutica de cualquiera de
(1) a (7), en donde dicha sustancia es una sustancia proteica.
(9) La composición farmacéutica de (8) en donde
dicha sustancia proteica se selecciona del grupo que consiste
en:
- a)
- un anticuerpo que se une a AILIM, o una parte de dicho anticuerpo;
- b)
- un polipéptido que comprende el total o una parte de una región extracelular de AILIM;
- c)
- un polipéptido de fusión que comprende el total o una parte de una región extracelular de AILIM y el total o una parte de una región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina;
- d)
- un polipéptido que se une a AILIM.
\vskip1.000000\baselineskip
(10) La composición farmacéutica de cualquiera
de (1) a (7), en donde dicha sustancia es una sustancia no
proteica.
(11) La composición farmacéutica de (10) en
donde dicha no proteica es ADN, ARN o un compuesto químicamente
sintetizado.
\vskip1.000000\baselineskip
Las presentes invenciones se describen en
detalle aquí posteriormente mediante la definición de los términos
y los métodos para producir las sustancias usadas en esta
invención.
Aquí, el término "mamífero" significa un
ser humano, vaca, cabra, conejo, ratón, rata, hámster y cobaya;
preferido es un ser humano, vaca, rata, ratón o hámster y
particularmente preferido es un ser humano.
"AILIM" de esta invención es una
abreviación para "molécula inmunomoduladora de linfocitos
inducible por activación" y significa una molécula de superficie
celular de un mamífero que tiene la estructura y función descritas
en artículos previos (J. Immunol., 166(1), p.1, 2001; J.
Immunol., 165(9), p.5035, 2000; Biochem. Biophys. Res.
Commun., 276(1), p.335, 2000; Immunity, 13(1), p.95,
2000; J. Exp. Med., 192(1), p.53, 2000; Eur. J. Immunol.,
30(4), p.1040, 2000; Int. Immunol., 12(1), p.51, 2000;
Nature, 397(6716), p.263, 1999; Número de acceso en GenBank:
BAA82129 (humana); BAA82128 (rata); BAA82127 (variante de rata);
BAA82126 (ratón)).
En especial preferiblemente, el término
significa AILIM derivada de un ser humano (por ejemplo,
International Immunology, Vol. 12, No. 1, p.51-55,
2000).
Esta AILIM también se denomina ICOS (Nature,
Vol.397, No.6716, p. 263-266, 1999) o antígeno
JTT-1/antígeno JTT-2 (Solicitud de
patente japonesa publicada sin examinar No. (JP-A)
Hei 11-29599, Solicitud International de Patente
No. WO98/38216) y estas moléculas se refieren mutuamente a la misma
molécula.
Además, "AILIM" como se la denomina en esta
invención incluye un polipéptido que tiene las secuencias de
aminoácidos de AILIM de cada mamífero descritas en bibliografía
previamente publicada y en especial preferiblemente también un
polipéptido que tiene sustancialmente la misma secuencia de
aminoácidos que la de AILIM humana. Además, también se incluyen en
"AILIM" de esta invención variantes humanas de AILIM similares
a la variante de AILIM previamente identificada derivada de rata
(Número de acceso de GenBank: BAA82127).
Aquí, la expresión "que tiene sustancialmente
la misma secuencia de aminoácidos" significa que "AILIM" de
la presente invención incluye un polipéptido que tiene una secuencia
de aminoácidos en la que múltiples aminoácidos, preferiblemente de
1 a 10 aminoácidos, en particular preferiblemente de 1 a 5
aminoácidos, se han sustituido, delecionado y/o modificado, y
polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos en las que
múltiples aminoácidos, preferiblemente de 1 a 10 aminoácidos, en
particular preferiblemente de 1 a 5 aminoácidos, se han añadido,
siempre que los polipéptidos tengan sustancialmente las mismas
propiedades biológicas que el polipéptido que comprende la
secuencia de aminoácidos mostradas en artículos anteriores.
Tales sustituciones, deleciones o inserciones de
aminoácidos se pueden alcanzar según el método normal (Experimental
Medicine: SUPLEMENTO, "Handbook of Genetic Engineering" (1992),
etc.).
Los ejemplos son mutagénesis dirigida con
oligonucleótidos sintéticos (método de dúplex con huecos),
mutagénesis puntual por la que se introduce una mutación puntual al
azar mediante tratamiento con nitrito o sulfito, el método por el
que se prepara un mutante de deleción con la enzima Bal31, etcétera,
mutagénesis con casete, método de barrido del enlazador, método de
mala incorporación, método del cebador mal emparejado, método de
síntesis de segmento de ADN, etc.
El método de mutagénesis dirigida con
oligonucleótido sintético (método de dúplex con huecos) se puede
realizar, por ejemplo, como sigue. Se clona la región que se quiere
mutagenizar en un vector de fago M13 que tiene una mutación ámbar
para preparar ADN monocatenario de fago. Después de linealizar el
ADN RFI del vector M13 sin mutación ámbar mediante tratamiento con
enzima de restricción, el ADN se mezcla con el ADN monocatenario de
fago mencionado anteriormente, se desnaturaliza y se alinea formando
de esta manera un "ADN dúplex con huecos". Se hibrida un
oligonucleótido sintético en el que se introducen las mutaciones con
el ADN dúplex con huecos y se prepara un ADN bicatenario circular
cerrado mediante reacción con ADN polimerasa y ADN ligasa. Se
transfectan con este ADN células de E. coli mutS,
deficientes en actividad reparadora de malos emparejamientos. Las
células de E. coli que no tienen actividad supresora se
infectan con los fagos crecidos y solo se criban los fagos que no
tienen mutaciones ámbar.
El método por el que se introduce una mutación
puntual con nitrito utiliza, por ejemplo, el principio mencionado
posteriormente. Si se trata ADN con nitrito, los nucleótidos se
desaminan para cambiar la adenina a hipoxantina, citosina a uracilo
y guanina a xantina. Si el ADN desaminado se introduce en las
células, se cambian "A:T" y "G:C" por "G:C" y
"A:T", respectivamente, porque hipoxantina, uracilo y xantina
se aparean con citosina, adenina y timina, respectivamente, en la
replicación de ADN. Realmente, los fragmentos monocatenarios de ADN
tratados con nitrito se hibridan con "ADN dúplex con huecos" y
posteriormente se separan cepas mutantes manipulando de la misma
manera que en la mutagénesis dirigida con oligonucleótido sintético
(método de dúplex con huecos).
El término "citoquina" como en
"producción de una citoquina por células que expresan AILIM" en
la presente invención significa una citoquina arbitraria producida
por células que expresan AILIM (especialmente, células T).
Ejemplos de células T son células T del tipo Th1
y del tipo Th2, y una citoquina de la presente invención
específicamente significa una citoquina producida por células T del
tipo Th1 y/o una citoquina arbitraria producida por células T del
tipo Th2.
Las citoquinas producidas por células T del tipo
Th1 incluyen IFN-\gamma, IL-2,
TNF, IL-3 y las citoquinas producidas por células T
de tipo Th2 incluyen IL-3, IL-4,
IL-5, IL-10 y TNF (Cell, Vol. 30,
No. 9, pp.343-346, 1998).
El término "sustancia" como se usa en la
presente invención, específicamente una "sustancia que tiene una
actividad para modular la transducción de señales mediada por
AILIM", y más específicamente "una sustancia que tiene una
actividad para inhibir la proliferación de células que expresan
AILIM o para inhibir la producción de una citoquina por células que
expresan AILIM" significa una sustancia natural o una sustancia
arbitraria preparada artificialmente.
Aquí, la expresión "transducción de señales
mediada por AILIM" significa transducción de señales a través de
AILIM que produce un cambio en cualquier fenotipo en las células que
expresan AILIM descritas anteriormente o en los ejemplos siguientes
(un cambio en la proliferación celular, activación de células,
apoptosis y/o la capacidad de producir una citoquina arbitraria por
células que expresan AILIM).
"La sustancia" se puede clasificar
fundamentalmente en una "sustancia proteica" y una "sustancia
no proteica".
Ejemplos de "sustancias proteicas" son los
siguientes polipéptidos, anticuerpos (anticuerpos policlonales,
anticuerpos monoclonales o partes de anticuerpos monoclonales).
Cuando la sustancia es un anticuerpo, es
preferiblemente un anticuerpo monoclonal. Cuando la sustancia es un
anticuerpo monoclonal, incluye no solo anticuerpos monoclonales
derivados de mamíferos no humanos, sino también los siguientes
anticuerpos monoclonales quiméricos recombinantes, anticuerpos
monoclonales humanizados recombinantes y anticuerpos monoclonales
humanos.
Cuando la sustancia es un polipéptido, incluye
los siguientes polipéptidos, fragmentos de polipéptido (olipéptido),
polipéptidos de fusión y polipéptidos químicamente modificados.
Ejemplos de oligopéptidos son péptidos que comprenden de 5 a 30
aminoácidos, preferiblemente de 5 a 20 aminoácidos. Se puede diseñar
una modificación dependiendo de varios fines, por ejemplo, para
aumentar la semivida en sangre en el caso de administración in
vivo o para aumentar la tolerancia contra degradación o para
aumentar la absorción en al aparato digestivo en administraciones
orales.
Ejemplos de polipéptidos son como sigue:
(1) Un polipéptido que comprende el total o una
parte de una región extracelular de AILIM;
(2) Un polipéptido de fusión que comprende el
total o una parte de una región extracelular de AILIM y el total o
una parte de una región constante de la cadena pesada de una
inmunoglobulina; o
(3) Un polipéptido que se une a AILIM.
Ejemplos de "sustancias no proteicas" son
ADN, ARN y compuestos químicamente sintetizados.
Aquí, "ADN" significa "ADN útil como un
fármaco ADN antisentido que comprende una secuencia parcial de
nucleótidos de un ADN que codifica la AILIM anterior
(preferiblemente AILIM humana), o ADN químicamente modificado de la
misma, que se puede diseñar basado en el ADN (ADNc o ADN genómico)
que codifica AILIM". Específicamente, el ADN antisentido puede
inhibir la transcripción del ADN que codifica AILIM a ARNm o la
traducción del ARNm a una proteína, hibridando con el ADN o ARN que
codifica AILIM.
La frase "secuencia parcial de nucleótidos"
como se denomina aquí se refiere a una secuencia parcial de
nucleótidos que comprende un número arbitrario de nucleótidos en
una región arbitraria. Una secuencia parcial de nucleótidos incluye
de 5 a 100 nucleótidos consecutivos, preferiblemente de 5 a 70
nucleótidos consecutivos, más preferiblemente de 5 a 50 nucleótidos
consecutivos e incluso más preferiblemente de 5 a 30 nucleótidos
consecutivos.
Cuando se usa el ADN como un fármaco ADN
antisentido, la secuencia de ADN se puede modificar químicamente en
parte para extender la semivida (estabilidad) en sangre cuando se
administra el ADN a pacientes, para aumentar la permeabilidad de
membranas intracitoplásmicas del ADN o para aumentar la resistencia
a degradación o la absorción de ADN administrado por vía oral en
los órganos digestivos. Las modificaciones químicas incluyen, por
ejemplo, la modificación de un enlace fosfato, una ribosa, un
nucleótido, el grupo azúcar y el extremo 3' y/o el extremo 5' en la
estructura de un oligonucleótido de ADN.
Las modificaciones de los enlaces fosfato
incluyen, por ejemplo, la conversión de uno o más enlaces a enlaces
fosfodiéster (D-oligo), enlaces fosforotioato,
enlaces fosforoditioato (S-oligo), enlaces metil
fosfonato (MP-oligo), enlaces fosforamidato,
enlaces no fosfato o enlaces metil fosfonotioato o combinaciones de
los mismos. La modificación de una ribosa incluye, por ejemplo, la
conversión a 2'-fluororribosa o
2'-O-metilribosa. La modificación
de un nucleótido incluye, por ejemplo, la conversión a
5-propiniluracilo o
2-aminoadenina.
Aquí, "ARN" significa "ARN útil como un
fármaco ARN antisentido que comprende una secuencia parcial de
nucleótidos de un ARN que codifica la AILIM anterior
(preferiblemente AILIM humana), o ARN químicamente modificado de la
misma, que se puede diseñar basado en el ARN que codifica la
AILIM". El ARN antisentido puede inhibir la transcripción del
ADN que codifica AILIM a ARNm o la traducción del ARNm a una
proteína, hibridando con el ADN o ARN que codifica AILIM.
La frase "secuencia parcial de nucleótidos"
como se emplea aquí, se refiere a una secuencia parcial de
nucleótidos que comprende un número arbitrario de nucleótidos en
una región arbitraria. Una secuencia parcial de nucleótidos incluye
de 5 a 100 nucleótidos consecutivos, preferiblemente de 5 a 70
nucleótidos consecutivos, más preferiblemente de 5 a 50 nucleótidos
consecutivos e incluso más preferiblemente de 5 a 30 nucleótidos
consecutivos.
La secuencia de ARN antisentido se puede
modificar químicamente en parte para extender la semivida en sangre
cuando se administra el ARN a pacientes, para aumentar la
permeabilidad de membranas intracitoplásmicas del ARN o para
aumentar la resistencia a degradación o la absorción de ARN
administrado por vía oral en los órganos digestivos. Las
modificaciones químicas incluyen modificaciones tales como las que
se aplican al ADN antisentido anterior.
Ejemplos de "un compuesto químicamente
sintetizado" son un compuesto arbitrario excluyendo los
anteriores ADN, ARN y sustancias proteicas, que tienen peso
molecular de alrededor de 100 hasta alrededor de 1000 o menos, más
preferiblemente un compuesto que tiene un peso molecular de
aproximadamente 100 hasta aproximadamente 800 y más preferiblemente
un peso molecular de aproximadamente 100 hasta aproximadamente
600.
El término "polipéptido" incluido en la
definición de la "sustancia" anterior significa una parte (un
fragmento) de una cadena polipeptídica que constituye AILIM
(preferiblemente AILIM humana), preferiblemente el total o una
parte de una región extracelular del polipéptido que constituye
AILLIM (se pueden añadir opcionalmente de 1 a 5 aminoácidos al
extremo N-terminal y/o C-terminal de
la región).
AILIM según la presente invención es una
molécula transmembrana que penetra la membrana celular, que
comprende 1 ó 2 cadenas polipeptídicas.
Aquí, una "proteína transmembrana"
significa una proteína que está unida a la membrana celular a través
de una región peptídica hidrofóbica que penetra en la bicapa
lipídica de la membrana una vez o varias veces, y cuya estructura
está, como un toto, compuesta de tres regiones principales, es
decir, una región extracelular, un región transmembrana y una
región citoplásmica, como se ha visto en muchos receptores o
moléculas de superficie celular. Tal proteína transmembrana
constituye cada receptor o molécula de superficie celular como un
monómero, o como un homodímero, heterodímero u oligómero acoplado
con una o varias cadenas que tienen la(s) misma(s) o
diferente(s) secuencia(s) de aminoácidos.
Aquí, una "región extracelular" significa
el total o una parte de la estructura parcial (región parcial) de
la estructura entera de la proteína transmembrana mencionada
anteriormente donde la estructura parcial existe fuera de la
membrana. En otras palabras, significa el total o una parte de la
región de la proteína transmembrana excluyendo la región
incorporada en la membrana (región transmembrana) y la región que
existe en el citoplasma después de la región transmembrana (región
citoplásmica).
"Un polipéptido de fusión" incluido en la
"sustancia proteica" anterior significa un polipéptido de
fusión que comprende el total o una parte de la región extracelular
de un polipéptido que constituye AILIM (preferiblemente AILIM
humana) y "el total o una parte de la región constante de la
cadena pesada de una inmunoglobulina (Ig, preferiblemente Ig
humana)". Preferiblemente, el polipéptido de fusión es un
polipéptido de fusión que tiene la región extracelular de AILIM y
una parte de la región constante de la cadena pesada de una IgG
humana, y en particular preferiblemente, un polipéptido de fusión
de la región extracelular de AILIM y una región (Fc) de la cadena
pesada de una IgG humana que comprende la región bisagra, el dominio
C_{H}2 y el dominio C_{H}3. Como IgG, es preferible IgG1, y
como AILIM, es preferible AILIM humana, de ratón o rata
(preferiblemente humana).
La expresión "el total o una parte de la
región constante de la cadena pesada de una inmunoglobulina (Ig)"
como se usa aquí significa la región constante o la región Fc de
una cadena pesada (cadena H) derivada de una inmunoglobulina
humana, o una parte de la misma. La inmunoglobulina puede ser
cualquier inmunoglobulina que pertenezca a cualquier clase y a
cualquier subclase. Específicamente, la inmunoglobulina incluye IgG
(IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), IgM, IgA (IgA1 e IgA2), IgD e IgE.
Preferiblemente, la inmunoglobulina es IgG (IgG1, IgG2, IgG3 o
IgG4) o IgM. Ejemplos de inmunoglobulinas particularmente preferidas
de la presente invención los las que pertenecen a las IgG de seres
humanos (IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4).
La inmunoglobulina tiene una unidad estructural
en forma de Y en la que cuatro cadenas compuestas de dos cadenas
ligeras (cadenas L) homólogas y dos cadenas pesadas (cadenas H)
homólogas están unidas a través de puentes disulfuro (puentes
S-S). La cadena ligera está compuesta de la región
variable de la cadena ligera (V_{L}) y la región constante de la
cadena ligera (C_{L}). La cadena pesada está compuesta de la
región variable de la cadena pesada (V_{H}) y la región constante
de la cadena pesada (C_{H}).
La región constante de la cadena pesada está
compuesta de algunos dominios que tienen secuencias de aminoácidos
únicas para cada clase (IgG, IgM, IgA, IgD e IgE) y para cada
subclase (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, IgA1 e IgA2).
La cadena ligera de las IgG (IgG1, IgG2, IgG3 e
IgG4) está compuesta de V_{H}, dominio C_{H}1, región bisagra,
dominio C_{H}2 y dominio C_{H}3 en este orden a partir del
N-terminal.
De forma similar, la cadena pesada de IgG1 está
compuesta de V_{H}, dominio C\gamma_{1}1, región bisagra,
dominio C\gamma_{1}2 y dominio C\gamma_{1}3 en este orden a
partir del N-terminal. La cadena pesada de IgG2
está compuesta de V_{H}, dominio C\gamma_{2}1, región bisagra,
dominio C\gamma_{2}2 y dominio C\gamma_{2}3 en este orden a
partir del N-terminal. La cadena pesada de IgG3 está
compuesta de V_{H}, dominio C\gamma_{3}1, región bisagra,
dominio C\gamma_{3}2 y dominio C\gamma_{3}3 en este orden a
partir del N-terminal. La cadena pesada de IgG4 está
compuesta de V_{H}, dominio C\gamma_{4}1, región bisagra,
dominio C\gamma_{4}2 y dominio C\gamma_{4}3 en este orden a
partir del N-terminal.
La cadena pesada de IgA está compuesta de
V_{H}, dominio C\alpha1, región bisagra, dominio C\alpha2 y
dominio C\alpha3 en este orden a partir del
N-terminal.
De forma similar, la cadena pesada de IgA1 está
compuesta de V_{H}, dominio C\alpha_{1}1, región bisagra,
dominio C\alpha_{1}2 y dominio C\alpha_{1}3 en este orden a
partir del N-terminal. La cadena pesada de IgA2
está compuesta de V_{H}, dominio C\alpha_{2}1, región bisagra,
dominio C\alpha_{2}2 y dominios C\alpha_{2}3 en este orden
a partir del N-terminal.
La cadena pesada de IgD está compuesta de
V_{H}, dominio C\delta1, región bisagra, dominio C\delta2 y
dominio C\delta3 en este orden a partir del
N-terminal.
La cadena pesada de IgM está compuesta de
V_{H}, dominio C\mu1, dominio C\mu2, dominio C\mu3 y dominio
C\mu4 en este orden a partir del N-terminal y no
tiene región bisagra como se ve en IgG, IgA e IgD.
La cadena pesada de IgE está compuesta de
V_{H}, dominio C\varepsilon1, dominio C\varepsilon2, dominio
C\varepsilon3 y dominio C\varepsilon4 en este orden a partir del
N-terminal y no tiene región bisagra como se ve en
IgG, IgA e IgD.
Si, por ejemplo, se trata IgG con papaína, se
corta en un lateral ligeramente N-terminal detrás de
los puentes disulfuro que existen en la región bisagra donde los
puentes disulfuro unen las dos cadenas pesadas para generar dos Fab
homólogos, en el que un fragmento de cadena pesada compuesto de
V_{H} y C_{H}1 está unido a una cadena ligera a través de un
puente disulfuro; y un Fc, en el que dos fragmentos de cadena pesada
homólogos compuestos de la región bisagra, el dominio C_{H}2 y el
dominio C_{H}3 están unidos a través de puentes disulfuro.
(Véase, "Immunology Illustrated", original 2ª ed., Nankodo,
pp.65-75 (1992); y "Focus of Newest Medical
Science ``Recognition Mechanism of Immune System''", Nankodo,
pp.4-7 (1991); etcétera).
Es decir, "una parte de la región constante de
la cadena pesada de una inmunoglobulina" mencionado anteriormente
significa una parte de la región constante de una cadena pesada de
inmunoglobulina que tiene las características estructurales
mocionadas anteriormente, y preferiblemente es una región constante
sin el dominio C1, o la región Fc. Específicamente, un ejemplo de
la misma es una región compuesta de la región bisagra, el dominio
C2 y el dominio C3 de cada una de IgG, IgA e IgD, o es una región
compuesta del dominio C2, el dominio C3 y el dominio C4 de cada una
de IgM e IgE. Un ejemplo particularmente preferible de la misma es
la región Fc de IgG1 humana.
El polipéptido de fusión mencionado
anteriormente tiene la ventaja de que es extremadamente fácil de
purificar usando cromatografía en columna de afinidad usando la
propiedad de la proteína A que se une específicamente al fragmento
de inmunoglobulina, porque el polipéptido de fusión de la presente
invención tiene una parte de la región constante (por ejemplo Fc)
de una inmunoglobulina tal como IgG como se ha mencionado
anteriormente como compañero de fusión. Además, puesto que están
disponibles varios anticuerpos contra Fc de varias inmunoglobulinas,
se puede realizar fácilmente un inmunoensayo para los polipéptidos
de fusión con anticuerpos contra Fc.
"Un polipéptido que se une a AILIM" está
comprendido en "un polipéptido" incluido en la definición de la
"sustancia" anterior.
Un ejemplo específico de "un polipéptido que
se une a AILIM" es el total o una parte de un polipéptido que
comprende una molécula conocida denominada B7h,
B7RP-1, GL50 o LICOS, que es un ligando que
interacciona con AILIM (Nature, Vo1.402, No.6763,
pp.827-832, 1999; Nature Medicine, Vol.5, No.12,
pp.1365-1369, 1999; J. Immunology, Vol.164,
pp.1653-1657, 2000; Curr. Biol., Vol.10 No 6,
pp.333-336, 2000).
Preferiblemente, el polipéptido es un
polipéptido que comprende el total o una parte de una región
extracelular de los ligandos anteriores (B7h,
B7RP-1, GL50, LICOS) o un polipéptido de fusión que
comprende el polipéptido y el total o una parte de la región
constante de la cadena pesada de una inmunoglobulina
(preferiblemente inmunoglobulina humana). Aquí, las expresiones
"región extracelular" y "región constante de la cadena pesada
de una inmunoglobulina" tienen los mismos significados que se
han mencionado anteriormente.
Se pueden producir los polipéptidos, partes de
polipéptidos (fragmento) y polipéptidos de fusión mencionados
anteriormente no solo mediante tecnología de ADN recombinante como
se menciona posteriormente, sino también mediante un método bien
conocido en la técnica tal como un método de síntesis química o un
método de cultivo celular o un método modificado del mismo.
El "anticuerpo" de la presente invención
puede ser un anticuerpo policlonal (antisuero) o un anticuerpo
monoclonal contra AILIM de mamífero (en particular preferiblemente
AILIM humana) definida anteriormente y preferiblemente un
anticuerpo monoclonal.
Específicamente, el anticuerpo es un anticuerpo
que tiene una actividad para inhibir la proliferación de células
que expresan AILIM uniéndose a AILIM o para inhibir la producción de
interferón-\gamma o interlequina-4
por células que expresan AILIM mediante unión a AILIM.
Los anticuerpos de la presente invención pueden
ser anticuerpos naturales obtenidos inmunizando mamíferos tales
como ratones, ratas, hámsteres, cobayas y conejos con un antígeno
tal como células (células naturales, líneas celulares, células
tumorales, etc.) que expresan AILIM de la presente invención,
transformantes preparados usando tecnología de ADN recombinante de
modo que sobreexpresen AILIM en la superficie de las mismas,
polipéptidos que constituyen AILIM o los polipéptidos de fusión
anteriormente mencionados que comprenden el polipéptido AILIM o la
región extracelular de AILIM. Los anticuerpos de la presente
invención también incluyen anticuerpos quiméricos y anticuerpos
humanizados (anticuerpos con CDR injertado) que se pueden producir
mediante tecnología de ADN recombinante y anticuerpos humanos que
se pueden producir usando animales transgénicos que producen
anticuerpos
humanos.
humanos.
Los anticuerpos monoclonales incluyen los que
tienen cualquier isotipo de IgG, IgM, IgA, IgD o IgE. Es preferible
IgG o IgM.
Se puede producir un anticuerpo policlonal
(antisuero) o un anticuerpo monoclonal por métodos conocidos. Es
decir, se inmuniza un mamífero, preferiblemente un ratón, rata,
hámster, cobaya, conejo, gato, perro, cerdo, cabra, caballo o vaca,
o más preferiblemente un ratón, rata, hámster, cobaya o conejo, por
ejemplo, con un antígeno mencionado anteriormente con adyuvante de
Freund, si es necesario.
Se puede obtener un anticuerpo policlonal a
partir del suero obtenido del animal así inmunizado. Además, los
anticuerpos monoclonales se producen como sigue. Se preparan
hibridomas de las células productoras de anticuerpo obtenidas del
animal así inmunizado y células de mieloma que no son capaces de
producir autoanticuerpos. Los hibridomas se clonan y se criban los
clones que producen los anticuerpos monoclonales que muestran una
afinidad específica hacia el antígeno usado para inmunizar el
mamífero.
Específicamente, se puede producir un anticuerpo
monoclonal como sigue. Se realizan las inmunizaciones inyectando o
implantando una vez o varias veces un antígeno mencionado
anteriormente como inmunógeno, si es necesario, con adyuvante de
Freund, por vía subcutánea, intramuscular, intravenosa, a través de
la almohadilla plantar o por vía intraperitoneal en un mamífero no
humano, específicamente un ratón, rata, hámster, cobaya o conejo,
preferiblemente un ratón, rata o hámster (incluyendo un animal
transgénico generado de modo que produzca anticuerpos derivados de
otro animal tal como un ratón transgénico que produce anticuerpos
humanos mencionado posteriormente). Normalmente, las inmunizaciones
se realizan de una a cuatro veces de uno a catorce días después de
la primera inmunización. Se obtienen las células productoras de
anticuerpos del mamífero así inmunizado aproximadamente de uno a
cinco después de la última inmunización. La frecuencia e intervalo
de inmunizaciones se puede organizar de forma apropiada dependiendo
de, por ejemplo, la propiedad del inmunógeno usado.
Se pueden preparar los hibridomas que secretan
anticuerpos monoclonales mediante el método de Köhler y Milstein
(Nature, Vol.256, pp.495-497 (1975)) o mediante un
método modificado del mismo. Es decir, se preparan los hibridomas
fusionando las células productoras de anticuerpos contenidas en el
bazo, ganglio linfático, médula ósea o amígdalas obtenidas de un
mamífero no humano inmunizado como se menciona anteriormente,
preferiblemente un bazo, con mielomas sin capacidad productora de
autoanticuerpos, que derivan de, preferiblemente, un mamífero tales
como ratón, rata, cobaya, hámster, conejo o ser humano, o más
preferiblemente un ratón, rata o ser humano.
Por ejemplo, se pueden usar como mieloma para
fusión celular un mieloma derivado de ratón
P3/X63-AG8.653 (653),
P3/NSI/1-Ag4-1
(NS-1), P3/X63-Ag8.U1 (P3U1),
SP2/0-Ag14 (Sp2/0, Sp2), PAI, F0, NSO o BW5147,
mieloma derivado de rata 210RCY3-Ag.2.3., o mieloma
derivado de ser humano U-266AR1,
GM1500-6TG-A1-2,
UC729-6, CEM-AGR, D1R11 o
CEM-T15.
Se pueden cribar los hibridomas que producen
anticuerpos monoclonales cultivando los hibridomas, por ejemplo, en
placas de microtitulación y midiendo la reactividad del sobrenadante
del cultivo en pocillos en los que se observa crecimiento del
hibridoma, hacia el inmunógeno usado para la inmunización mencionada
anteriormente, por ejemplo, mediante un inmunoensayo enzimático tal
como RIA y ELISA.
Los anticuerpos monoclonales se pueden producir
a partir de hibridomas cultivando los hibridomas in vitro o
in vivo tal como en el líquido ascítico de un ratón, rata,
cobaya, hámster o conejo, preferiblemente un ratón o rata, más
preferiblemente un ratón, y aislando los anticuerpos del
sobrenadante del cultivo resultante o líquido ascítico de un
mamífero.
Cultivar los hibridomas in vitro se puede
realizar dependiendo de, por ejemplo, la propiedad de las células
de ser cultivadas, el objeto del estudio y las varias condiciones
del método de cultivo, usando medios de nutrientes conocidos o
cualquier medio de nutrientes derivado medios basales conocidos para
crecer, mantener y almacenar los hibridomas para producir
anticuerpos monoclonales en el sobrenadante del cultivo.
Ejemplos de medios basales son medios con baja
concentración de calcio tales como medio de Ham F12, medio MCDB153
o medio MEM con baja concentración de calcio, y medios con alta
concentración de calcio tales como medio MCDB104, medio MEM, medio
D-MEM, medio RPMI1640, medio ASF104 o medio RD. Los
medios basales pueden contener, por ejemplo, suero, hormonas,
citoquinas y/o varias sustancias inorgánicas u orgánicas dependiendo
del objetivo.
Los anticuerpos monoclonales se pueden aislar y
purificar del sobrenadante del cultivo o del líquido ascítico
mencionados anteriormente mediante precipitación con sulfato de
amonio saturado, método de precipitación de euglobulina, método del
ácido caproico, método del ácido caprílico, cromatografía de
intercambio iónico (DEAE o DE52) y cromatografía de afinidad usando
una columna de anti-inmunoglobulina o una columna de
proteína A.
Un "anticuerpo monoclonal quimérico
recombinante" es un anticuerpo monoclonal preparado mediante
ingeniería genética y específicamente significa un anticuerpo
quimérico tal como un anticuerpo monoclonal quimérico de
ratón/humano cuyas regiones variables derivan de una inmunoglobulina
de un mamífero no humano (ratón, rata, hámster, etc.) y cuyas
regiones constantes derivan de una inmunoglobulina humana.
Una región constante derivada de una
inmunoglobulina humana tiene una secuencia de aminoácidos única para
cada isotipo tal como IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD e
IgE. La región constante del anticuerpo monoclonal quimérico
recombinante puede ser la de una inmunoglobulina humana
perteneciente a cualquier isotipo. Preferiblemente, es una región
constante de una IgG humana.
Se puede producir un anticuerpo monoclonal
quimérico, por ejemplo, como sigue. Huelga decir, que el método de
producción no está limitado al mismo.
Se puede producir un anticuerpo monoclonal
quimérico de ratón/humano, con referencia a Experimental Medicine:
SUPLEMENTO, Vol.1.6, No.10 (1988); y la solicitud de patente
japonesa publicada examinada No. (JP-B) Hei
3-73280. Es decir, se puede preparar insertando
operativamente el gen CH (gen C que codifica la región constante de
la cadena H) obtenido de un ADN que codifica la inmunoglobulina
humana después de los genes V_{H} activos (gen VDJ reorganizado
que codifica la región variable de la cadena H) obtenido de un ADN
que codifica un anticuerpo monoclonal de ratón aislado de un
hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal de ratón, y el gen
C_{L} (gen C que codifica la región constante de la cadena L)
obtenido de un ADN que codifica la inmunoglobulina humana después
de los genes V_{L} activos (gen VJ reorganizado que codifica la
región variable de la cadena L) obtenido de un ADN que codifica un
anticuerpo monoclonal de ratón aislado de un hibridoma, en el mismo
vector o un vector diferente en una manera expresable, seguido por
transformar células huésped con el vector de expresión y después
cultivar los transformantes.
Específicamente, primero se extraen los ADN de
hibridomas productores de anticuerpo monoclonal de ratón mediante
el método normal, se digieren con las enzimas de restricción
apropiadas (por ejemplo, EcoRI y HindIII), se someten a
electroforesis (usando, por ejemplo, un gel de agarosa al 0,7%) y se
analizan mediante transferencia de Southern. Después de teñir un
gel de electroforesis, por ejemplo con bromuro de etidio, y
fotografiarlo, al gel se le dan posiciones marcadoras, se lava dos
veces con agua y se remoja en HCl 0,25 M durante 15 minutos.
Después, el gel se remoja en una solución de NaOH 0,4 N durante 10
minutos con agitación suave. Los ADN se transfieren a un filtro
durante 4 horas mediante el método normal. El filtro se recupera y
se lava dos veces con SSC 2X. Después de secar suficientemente el
filtro, se hornea a 75ºC durante 3 horas. Después de hornear, el
filtro se trata con SSC 0,1X/SDS al 0,1% a 65ºC durante 30 minutos.
A continuación, se remoja en SSC 3X/SDS al 0,1%. El filtro obtenido
se trata con una solución de prehibridación en una bolsa de plástico
a 65ºC durante 3 a 4 horas.
Después, se añaden a la bolsa la sonda de ADN
marcada con ^{32}P y una solución de hibridación y se hacen
reaccionar a 65ºC alrededor de 12 horas. Después de la hibridación,
el filtro se lava a la concentración de sal, temperatura de
reacción y tiempo apropiados (por ejemplo, SSC 2X/SDS al 0,1%,
temperatura ambiente, 10 minutos). El filtro se pone en una bolsa
de plástico con un pequeño volumen de SSC 2X y se somete a
autorradiografía después de sellar la bolsa.
Se identifican el gen VDJ y el gen VJ
reorganizados que codifican la cadena H y la cadena L de un
anticuerpo monoclonal de ratón mediante la transferencia de
Southern mencionada anteriormente. La región que comprende el
fragmento de ADN identificado se fracciona mediante centrifugación
en gradiente de densidad de sacarosa y se inserta en un vector de
fago (por ejemplo, Charon 4A, Charon 28, \lambdaEMBL3 y
\lambdaEMBL4). Se transforma E. coli (por ejemplo LE392 y
NM539) con el vector de fago para generar una genoteca genómica. Se
criba la genoteca genómica mediante una técnica de hibridación en
placa tal como el método de Benton-Davis (Science,
Vol.196, pp.18-182 (1977)) usando las sondas
apropiadas (gen J de la cadena H, gen J de la cadena L (\kappa),
etc.) para obtener clones positivos que comprenden el gen VDJ o el
gen VJ reorganizados. Al hacer un mapa de restricción y determinar
la secuencia de nucleótidos de los clones obtenidos, se confirma si
se han obtenido los genes que comprenden el gen (VDJ) de V_{H} o
el gen (VJ) de V_{L} reorganizados deseados.
Por separado, se aíslan el gen C_{H} humano y
el gen C_{L} humano usados para la quimerización. Por ejemplo,
cuando se produce un anticuerpo quimérico con IgG1 humana, se aísla
el gen C\gamma1 como un gen C_{H} y el gen C\kappa como gen
C_{L}. Estos genes se pueden aislar de una genoteca genómica
humana con el gen C\gamma1 de ratón y el gen C\kappa de ratón,
correspondientes al gen C\gamma1 humano y el gen C\kappa
humano, respectivamente, como sondas, aprovechando la alta homología
entre las secuencias de nucleótidos del gen de la inmunoglobulina
de ratón y el gen de la inmunoglobulina humana.
Específicamente, se aíslan fragmentos de ADN que
comprenden el gen C\kappa humano y una región potenciadora de la
genoteca genómica humana \lambda Charon 4A
HaeIII-AluI (Cell, Vol.15,
pp.1157-1174 (1978)), por ejemplo, usando un
fragmento de 3 kb HindIII-BamHI del clon Ig146
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.75, pp.4709-4713
(1978)) y un fragmento EcoRI de 6.8 kb del clon MEP10 (Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, Vol.78, pp.474-478 (1981)) como
sondas. Además, por ejemplo, después de digerir el ADN de
hepatocitos fetales humanos con HindIII y fraccionarlo mediante
electroforesis en gel de agarosa, se inserta un fragmento de 5,9 kb
en \lambda788 y después se aísla el gen C\gamma1 humano con las
sondas mencionadas anteriormente.
Usando el gen V_{H} de ratón, el gen V_{L}
de ratón, el gen C_{H} humano y el gen C_{L} humano así
obtenidos, y considerando la región promotora y la región
potenciadora, se inserta un gen C_{H} humano después del gen
V_{H} de ratón y se inserta el gen C_{L} humano después del gen
V_{L} de ratón en un vector de expresión tal como pSV2gtp o
pSV2neo con las enzimas de restricción apropiadas y ADN ligasa
mediante el método normal. En este caso, se pueden insertar genes
quiméricos de gen V_{H} de ratón/gen C_{H} humano y gen V_{L}
de ratón/gen C_{L} humano, respectivamente en el mismo vector de
expresión o en diferentes vectores de expresión.
El/los vector(es) de expresión con genes
quiméricos insertados así preparados se introducen en mielomas que
no producen anticuerpos, por ejemplo, células
P3X63\cdotAg8\cdot653 o células SP210 mediante el método de
fusión del protoplasto, método del DEAE-dextrano,
método del fosfato de calcio o método de electroporación. Se criban
los transformantes cultivándolos en medio que contiene un fármaco
que corresponde al gen de resistencia a fármaco insertado en el
vector de expresión y, después, se obtienen las células que producen
los anticuerpos monoclonales quiméricos deseados.
Los anticuerpos monoclonales quiméricos deseados
se obtienen del sobrenadante del cultivo de las células productoras
de anticuerpo cribadas así.
El "anticuerpo monoclonal humanizado
(anticuerpo con CDR injertado)" de la presente invención es un
anticuerpo monoclonal preparado mediante ingeniería genética y
específicamente significa un anticuerpo monoclonal humanizado en
donde una parte o el total de las regiones determinantes de
complementariedad de la región hipervariable derivan de las
regiones determinantes de complementariedad de la región
hipervariable de un anticuerpo monoclonal de un mamífero no humano
(ratón, rata, hámster, etc.), las regiones marco de la región
variable derivan de las regiones marco de la región variable de una
inmunoglobulina humana y la región constante deriva de una región
constante de una inmunoglobulina derivada de un ser humano.
Las regiones determinantes de complementariedad
de la región hipervariable existen en la región hipervariable en la
región variable de un anticuerpo y significa tres regiones que se
unen directa y complementariamente a un antígeno (residuos
determinantes de complementariedad, CDR1, CDR2 y CDR3). Las regiones
marco de la región variable significan cuatro regiones
comparativamente conservadas situadas delante, detrás o entre las
tres regiones determinantes de complementariedad (región marco,
FR1, FR2, FR3 y FR4).
En otras palabras, un anticuerpo monoclonal
humanizado significa ese en el que todas las regiones excepto una
parte o todas las regiones determinantes de complementariedad de la
región hipervariable de un anticuerpo monoclonal derivado de un
mamífero no humano se han cambiado por sus regiones correspondientes
derivadas de una inmunoglobulina humana.
La región constante derivada de una
inmunoglobulina humana tiene una secuencia única para cada isotipo
tales como IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD e IgE. La
región constante de un anticuerpo monoclonal humanizado en la
presente invención puede ser la de una inmunoglobulina humana que
pertenece a cualquier isotipo. Preferiblemente, es una región
constante de IgG humana. Las regiones marco de la región constante
derivada de una inmunoglobulina humana no están particularmente
limitadas.
Se puede producir un anticuerpo monoclonal
humanizado, por ejemplo, como sigue. Huelga decir, que el método de
producción no está limitado al mismo.
Por ejemplo, se puede preparar un anticuerpo
monoclonal humanizado recombinante derivado de un anticuerpo
monoclonal de ratón mediante ingeniería genética, con referencia a
la traducción japonesa publicada de la publicación internacional
(JP-WA) No. Hei 4-506458 y
JP-A Sho 62-296890. Es decir, se
aíslan al menos un gen CDR de la cadena H de ratón y al menos un
gen CDR de la cadena L de ratón correspondiente al gen CDR de la
cadena H de ratón de hibridomas que producen el anticuerpo
monoclonal de ratón, y el gen de la cadena H humana que codifica
las regiones enteras excepto la CDR de la cadena H humana
correspondiente a la CDR de la cadena H de ratón mencionada
anteriormente y el gen de la cadena L humana que codifica la región
completa excepto la CDR de la cadena L humana correspondiente a la
CDR de la cadena L de ratón mencionada anteriormente se aíslan de
genes humanos de inmunoglobulinas.
El/los gen(es) CDR de la cadena H de
ratón y el/los gen(es) de la cadena H humana así aislados se
insertan operativamente en un vector apropiado de modo que se
puedan expresar. De forma similar, el/los gen(es) CDR de la
cadena L de ratón y el/los gen(es) de la cadena L humana se
insertan operativamente en otro vector apropiado de modo que se
puedan expresar. De modo alternativo, el/los gen(es) CDR de
la cadena H de ratón/gen(es) de la cadena H humana y el/los
gen(es) CDR de la cadena L de ratón/gen(es) de la
cadena L humana se pueden insertar operativamente en el mismo
vector de expresión en una manera expresable. Se transforman células
huésped con el vector de expresión así preparado para obtener
transformantes que producen anticuerpo monoclonal humanizado. Al
cultivar los transformantes, se obtiene un anticuerpo monoclonal
humanizado deseado del sobrenadante del cultivo.
El "anticuerpo monoclonal humano" es una
inmunoglobulina en que las regiones enteras que comprenden la región
variable y constante de la cadena H y la región variable y
constante de la cadena L que constituyen la inmunoglobulina derivan
de genes que codifican inmunoglobulina humana.
El anticuerpo humano (preferiblemente anticuerpo
monoclonal humano) se puede producir mediante métodos bien
conocidos, por ejemplo, de la misma manera que el método de
producción de anticuerpos policlonales o monoclonales mencionado
anteriormente inmunizando, con un antígeno, un animal transgénico
preparado integrando al menos un gen de inmunoglobulina humano en
el locus génico de un mamífero no humano tal como un ratón.
Por ejemplo, se prepara un ratón transgénico que
produce anticuerpos humanos mediante los métodos descritos en
Nature Genetics, Vol.7, pp.13-21 (1994); Nature
Genetics, Vo1.15, pp.146-156 (1997);
JP-WA Hei 4-504365;
JP-WA Hei 7-509137; Nikkei Science,
No.6, pp.40-50 (1995); WO94/25585; Nature, Vol.368,
pp.856-859 (1994); y JP-WA No. Hei
6-500233.
Además, también se puede aplicar una técnica
recientemente desarrollada para producir una proteína derivada de
la humana de la leche de una vaca o cerdo transgénico (Nikkei
Science, pp.78-84 (Abril, 1997)).
La frase "parte de un anticuerpo" como se
usa en la presente invención significa una región parcial de un
anticuerpo monoclonal como se ha mencionado anteriormente.
Específicamente significa F(ab')_{2}, Fab', Fab, Fv
(fragmento variable de anticuerpo), sFv, dsFv (Fv estabilizado por
disulfuro) o dAb (anticuerpo de dominio único) (Exp. Opin. Ther.
Patents, Vol.6, No.5, pp.441-456 (1996)).
Se pueden producir "F(ab')_{2}" y
"Fab'" tratando una inmunoglobulina (anticuerpo monoclonal) con
una proteasa tales como pepsina y papaína, y significa un fragmento
de anticuerpo generado al digerir la inmunoglobulina cerca de los
puentes disulfuro en las regiones bisagra que existen entre cada una
de las dos cadenas H. Por ejemplo, la papaína corta la IgG antes de
los puentes disulfuro en las regiones bisagra que existen entre
cada una de las dos cadenas H para generar dos fragmentos homólogos
de anticuerpo en los que una cadena L compuesta de V_{L} (región
variable de la cadena L) y C_{L} (región constante de la cadena L)
y un fragmento de la cadena H compuesto de V_{H} (región variable
de la cadena H) y C_{H}\gamma1 (región \gamma1 en la región
constante de la cadena H) están unido en sus regiones
C-terminales a través de un puente disulfuro. Cada
uno de tales dos fragmentos homólogos de anticuerpo se llama Fab'.
La pepsina también corta IgG después de los puentes disulfuro en
las regiones bisagra que existen entre cada una de las dos cadenas H
para generar un fragmento de anticuerpo ligeramente mayor que el
fragmento en el que dos Fab' mencionados anteriormente están unidos
en la región bisagra. Este fragmento de anticuerpo se denomina
F(ab')_{2}.
El término "rechazo a injerto" de la
presente invención se refiere a varias respuestas inmunes que tratan
de rechazar y eliminar un injerto (una parte de un cuerpo vivo que
se trasplanta; una célula, un tejido o un órgano) de un donante
cuyo contexto genético es diferente al del receptor (es decir,
alotrasplante o xenotrasplante) ya que el receptor reconoce el
injerto como materia extraña. Las respuestas inmunes que acompañan a
este trasplante se pueden clasificar en (1) rechazo hiperagudo, que
es un rechazo fuerte que se produce inmediatamente después del
trasplante, (2) rechazo agudo, que se observa a los pocos meses del
trasplante y (3) rechazo crónico observado varios meses después del
trasplante. Además, aunque la inmunidad celular debida a las células
inmunocompetentes representadas por las células T y la inmunidad
humoral debida a los anticuerpos se producen de una manera
intrincadamente coordinada, la respuesta principal es mediante
inmunidad celular.
Como resultado del rechazo al injerto, el
injerto por último se vuelve necrótico y se cae. Además, el paciente
desarrolla no solo síntomas sistémicos graves tales como fiebre,
leucocitosis y fatiga, sino también hinchazón y sensibilidad en el
sitio del trasplante. Además, se pueden producir complicaciones
graves tales como infecciones.
En particular, cuando se trasplante un injerto
xenogénico tal como el de un cerdo, se produce el problema serio
del rechazo hiperagudo, por lo que el injerto se rechaza en
minutos.
El término "injerto" de esta invención se
refiere a "un órgano o una parte del mismo" o "un tejido"
que se trasplanta a un mamífero receptor de un mamífero
donante.
La frase "un órgano o una parte del mismo"
refiriéndose al trasplante de esta invención se refiere a un órgano
arbitrario o una parte del mismo que compone el cuerpo vivo de un
mamífero (preferiblemente un ser humano o un cerdo, y en especial
preferiblemente un ser humano). Un ejemplo preferido es el hígado,
corazón, pulmón, páncreas riñón, intestino grueso, intestino
delgado o una parte de los mismos. Especialmente preferido es el
hígado o una parte del mismo.
El término "tejido" refiriéndose al
trasplante de esta invención se refiere a un tejido arbitrario que
deriva del cuerpo vivo de un mamífero (preferiblemente un ser
humano o un cerdo, y preferiblemente un ser humano). Un ejemplo
preferido es un tejido tal como piel, córnea, hueso o válvula
cardíaca; sin embargo, no se limita a ellos.
El término "agente inmunosupresor" de esta
invención se refiere a uno cualquiera o más de los agentes
inmunosupresores existentes usados para suprimir un rechazo
inmunológico (rechazo a injerto) en un receptor producido por el
trasplante de un injerto en el trasplante clínico de células, tejido
u órganos, cuya fabricación y venta como agente farmacéutico ha
sido aprobada por una organización gubernamental; o uno cualquiera o
más de los agentes inmunosupresores que actualmente están en uso
en ensayos clínicos o preclínicos o se usará en ensayos clínicos en
el futuro, cuya fabricación y venta como agente farmacéutico puede
ser aprobada por una organización gubernamental después de los
ensayos.
Tales agentes inmunosupresores no sólo se usan
solos, sino también en combinación con 2, 3 o más agentes. Por lo
tanto, el término "agente inmunosupresor" según esta invención
incluye el uso de tipo único de agente farmacéutico o el uso
combinado de una pluralidad de agentes farmacéuticos
(preferiblemente usados en combinación con 2 ó 3 agentes).
Preferiblemente, el agente inmunosupresor es uno
o más agentes farmacéuticos seleccionados de ciclosporina (CsA);
tacrolimus (FK-506); azatioprina (AZ); micofenolato
de mofetilo (MMF); mizorribina (MZ); leflunomida (LEF); esteroides
corticosuprarrenales (también llamados hormonas
corticosuprarrenales, corticoesteroides, corticoides) tales como
prednisolona y metilprednisolona; sirolimus (también llamado
rapamicina); desoxiespergualina (DSG); FTY720 (nombre químico:
clorhidrato de
2-amino-2-[2-(4-octilfenil)etil]-1,3-propanediol)
y un "fármaco de CTLA4" descrito posteriormente. Especialmente
preferible son bien uno o ambos de tacrolimus
(FK-506) y ciclosporina.
El término "fármaco de CTLA4" de esta
invención se refiere a un medicamento que contiene como principio
activo (1) un polipéptido que comprende la longitud completa
(incluyendo moléculas que tienen prácticamente la misma secuencia
de aminoácidos), o el total o una parte de la región extracelular de
CTLA4 humana (antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos;
<secuencia de aminoácidos> No. de acceso en GenBank NP
005205; <ADNc> No. de acceso en GenBank NM 005214); (2) un
polipéptido de fusión que comprende el total o una parte de la
región extracelular de CTLA4 humano y el total o una parte de otra
proteína (en especial preferiblemente, el total o una parte de la
región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana)
(de aquí en adelante abreviado como CTLA4-IgFc o
CTLA4-Ig); o (3) un ADN que puede proporcionar a un
mamífero (en especial preferiblemente un ser humano) el polipéptido
de (1) o el polipéptido de fusión de (2), o un vector que comprende
el ADN (especialmente preferible es un plásmido en general usado en
terapia génica, o un vector vírico derivado de un virus
(retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, etc.) o similar).
Aquí, cada uno de los términos/frases tales como
"región extracelular", "una parte", "región constante de
la cadena pesada de la inmunoglobulina humana", "polipéptido
de fusión" y "prácticamente el mismo" tiene el mismo
significado que se ha definido anteriormente.
Hay un número de artículos sobre el
significativo efecto inmunosupresor del anteriormente mencionado
CTLA4-Ig. Por ejemplo, se ha confirmado el gran
efecto inmunosupresor de Y100F (la tirosina de la posición 100 se
sustituye con alanina) desarrollado por
Bristol-Myers Squibb/Repligen a partir de varios
experimentos con animales, y este producto también se incluye como
una de los fármacos de CTLA4 de esta invención. (Igaku no Ayumi,
Vol.194, No.14, p.1195-1200, 2000; J. Clin.
Invest., Vol.103, p.1223-1225, 1999; N. Engl. J.
Med., Vol.335, p.1369-1377, 1996; J. Exp. Med.,
Vol.178, p.1801-1806, 1993; Blood, Vol.94,
p.2523-2529, 1999; Nature Med., Vol.6,
p.464-469, 2000; Blood, Vol.83,
p.3815-3823, 1995; J. Clin. Invest., Vol.2,
p.473-482, 1998; Blood, Vol.85,
p.2607-2612, 1995; N. Engl. J. Med., Vol.340,
p.1704-1714, 1999; N. Engl. J. Med. Vol.335,
p.1369-1377, 1996; J. Clin. Invest., Vol.103,
p.1243-1252, 1999).
\newpage
La frase "soporte farmacéuticamente
aceptable" de esta invención incluye un excipiente, un diluyente,
un relleno, un agente de descomposición, un estabilizante, un
conservante, un tampón, un emulsionante, un agente aromático, un
colorante, un edulcorante, un agente que aumenta la viscosidad, un
saborizante, un agente que aumenta la solubilidad o algún otro
aditivo. Usando uno o más de tales soportes, se puede formular una
composición farmacéutica en comprimidos, píldoras, polvos,
gránulos, inyecciones, soluciones, cápsulas, pastillas, elixires,
suspensiones, emulsiones, jarabes, etc.
La composición farmacéutica se puede administrar
por vía oral o parenteral. Otras formas para la administración
parenteral incluyen una solución para la aplicación externa,
supositorios para la administración rectal y un óvulo vaginal
prescrito mediante el método usual, que comprende uno o más
principios activos.
La dosis puede variar dependiendo de la edad,
sexo, peso y síntomas de un paciente, efecto del tratamiento, vía
de administración, periodo de tratamiento, el tipo de principio
activo (la "sustancia" según la presente invención, mencionada
anteriormente) contenido en la composición farmacéutica, etc.
Normalmente, la composición farmacéutica se puede administrar a un
adulto en una dosis de 10 \mug a 1000 mg (o de 10 \mug a 500 mg)
por una administración. Dependiendo de varias condiciones, en
algunos casos una dosis menor de la mencionada anteriormente puede
ser suficiente y en otros una dosis mayor que la mencionada
anteriormente puede ser necesaria.
En el caso de una inyección, se puede producir
disolviendo o resuspendiendo un anticuerpo en un soporte no tóxico
farmacéuticamente aceptable tal como solución salina fisiológica o
agua destilada para inyección comercialmente disponible ajustando
la concentración en el intervalo de 0,1 \mug de anticuerpo/ml de
soporte a 100 mg de anticuerpo/ml de soporte. La inyección así
producida se puede administrar a un paciente humano en necesidad de
tratamiento en un intervalo de dosis de 1 \mug a 100 mg/kg de peso
corporal, preferiblemente en el intervalo de 50 \mug a 50 mg/kg
de peso corporal, una o más veces al día. Ejemplos de vías de
administración son vías de administración médicamente apropiadas
tales como inyección intravenosa, inyección subcutánea, inyección
intradérmica, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal o
similares, preferiblemente inyección intravenosa.
La inyección también se puede preparar en un
diluyente no acuoso (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol,
aceite vegetal tal como aceite de oliva, y alcohol tal como etanol),
suspensión o emulsión.
La inyección se puede esterilizar mediante
filtración con un filtro que filtra bacterias, mezclando un
bactericida o mediante irradiación. La inyección se puede producir
de tal manera que se prepara al tiempo de uso. Es decir, se
liofiliza para ser una composición sólida estéril que se puede
disolver en agua destilada estéril para inyección u otro solvente
antes de su uso.
La composición farmacéutica de la presente
invención es extremadamente útil para la supresión, prevención y/o
tratamiento de rechazo inmunológico (rechazo a injerto), que es un
problema serio en terapias donde se trasplanta un órgano
(alotrasplanta o xenotrasplanta) (hígado, corazón, pulmón, riñón,
páncreas, etc.) o una parte del mismo, o un tejido (tal como piel,
córnea y hueso) de un donante a un receptor afectado por una
enfermedad cardiovascular
grave.
grave.
Además, la composición farmacéutica de esta
invención puede aumentar el efecto de supresión de rechazo a injerto
(rechazo inmunológico) por agentes inmunosupresores existentes
administrados para suprimir el rechazo a injerto durante tales
terapias de trasplante cuando se usa la composición farmacéutica en
combinación con los agentes inmunosupresores.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 1 muestra el efecto de un anticuerpo
anti-AILIM y/o un agente inmunosupresor en la
supresión de rechazo inmunológico (rechazo a injerto) que acompaña
el trasplante de órganos, usando como índice, la prolongación de la
supervivencia del injerto en un receptor al que se trasplantó un
hígado de un donante.
La figura 2 muestra el efecto de supresión de
rechazo inmunológico (rechazo a injerto) que se produce acompañando
al trasplante de órgano por un anticuerpo anti-AILIM
y/o un agente inmunosupresor, que usa como índice, los días
extendidos de la supervivencia del injerto de un hígado trasplantado
de un donante a un receptor.
La figura 3 muestra el efecto de supresión de
rechazo inmunológico (rechazo a injerto) que se produce acompañando
al trasplante de órgano por un anticuerpo anti-AILIM
(de otra manera denominado anticuerpo anti-ICOS),
que usa como índice la extensión de días de supervivencia del
injerto del corazón trasplantado de un donante a un receptor.
La figura 4 muestra el efecto de supresión de
rechazo inmunológico (rechazo a injerto) que se produce acompañando
al trasplante de órgano por AILIM-Ig (de otra manera
denominado ICOS-Ig), que usa como índice la
extensión de días de supervivencia del injerto del corazón
trasplantado de un donante a un receptor.
La figura 5 es una fotografía que muestra el
grado de infiltración de células que expresan AILIM en un corazón
trasplantado.
La figura 6 muestra el efecto de supresión de
rechazo inmunológico (rechazo a injerto) que se produce acompañando
al trasplante de órgano por un anticuerpo anti-AILIM
y/o AdCTLA4-Ig, que usa como índice la extensión de
días de supervivencia del injerto del corazón trasplantado de un
donante a un receptor.
La figura 7 muestra el efecto de un
anti-AILIM usado en combinación con
AdCTLA4-Ig en la supresión del rechazo inmunológico
(rechazo a injerto) que acompaña al trasplante de órganos, usando
como índice la presencia o ausencia de supervivencia del injerto de
un corazón trasplantado (trasplante primario de corazón y trasplante
secundario de corazón) y piel trasplantada (trasplante primario de
piel) en un donante.
De aquí en adelante, la presente invención se
ilustrará específicamente con referencia a los ejemplos, pero no se
debe considerar que esté limitada a las formas de realización
descritas en los ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron ratas Lewis adultas (machos,
210-250 g) y ratas DA adultas (machos,
210-250 g) como receptores y donantes,
respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó un anticuerpo monoclonal purificado de
líquido ascítico o del sobrenadante del cultivo obtenido de
cultivar in vitro o in vivo el hibridoma previamente
descrito denominado "JTT-1" (este hibridoma se
ha depositado internacionalmente el 11 de octubre de 1996, en el
Instituto Nacional de Biociencias y Tecnología Humana, Ciencia y
Tecnología Industrial Avanzada, Ministerio de Economía, Comercio e
Industria, que es un agencia internacional de depósitos certificada
según el tratado de Budapest. No. de acceso internacional: FERM
BP-5707) que produce un anticuerpo monoclonal de
ratón anti-AILIM de rata (anticuerpo monoclonal de
ratón anti-antígeno JTT-1 de rata)
(JP-A Hei 11-29599 (ejemplos 1 y 2)
y solicitud internacional de patente No. WO98/38216 (ejemplos 1 y
2)). De aquí en adelante, este anticuerpo se denomina simplemente
"anticuerpo anti-AILIM".
\vskip1.000000\baselineskip
Según el método descrito anteriormente por
Kamada et al., se trasplantaron hígados de ratas donantes DA
en ratas receptoras Lewis (Surgery, 93, p.64, 1983;
Transplantation, 30, p.43, 1980; Transplantation, 28, p.47,
1979).
Específicamente, los hígados obtenidos de ratas
DA se lavaron limpiando con un chorro de agua destilada estéril
helada desde la vena porta. A continuación, se inició el trasplante
de los hígados a las ratas Lewis receptoras cosiendo la vena cava
suprahepática. Después, usando la técnica del manguito, se cosieron
la vena porta y la vena cava infrahepática (Transplant. Proc., 19,
p.1158, 1987; Transplantation, 43, p.745, 1987).
Si las ratas receptoras murieron en los 3 días
posteriores a la terminación del trasplante, se determinó que esto
era un fallo técnico del trasplante. Como resultado, la tasa de
éxito del trasplante fue del 95%.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de terminar el trasplante, se
administraron el anticuerpo anti-AILIM y/o el agente
inmunosupresor FK-506 a cada una de las ratas Lewis
(cada grupo contenía de 5-9 animales) en las dosis y
los tiempos descritos posteriormente. El día en que se completó el
trasplante se contó como día cero (0).
El grupo al que no se administró ni el
anticuerpo anti-AILIM ni el agente inmunosupresor
FK-506 se usó como control.
1. Anticuerpo anti-AILIM (1
mg/kg; inyección intravenosa, día 0).
2. Anticuerpo anti-AILIM (1
mg/kg; inyección intravenosa, días 0 y 6).
3. Anticuerpo anti-AILIM (1
mg/kg; inyección intravenosa, días 0, 3 y 6).
4. Anticuerpo anti-AILIM (1
mg/kg; inyección intravenosa, días 0, 3, 6, 9 y 12).
5. Anticuerpo anti-AILIM (0,3
mg/kg; inyección intravenosa, días 0, 3, 6, 9 y 12).
6. FK-506 (1 mg/kg, inyección
intramuscular; día 0).
7. Anticuerpo anti-AILIM (1
mg/kg; inyección intravenosa, día 0) y FK-506 (1
mg/kg, intramuscular; día 0).
\vskip1.000000\baselineskip
La duración de la supervivencia del injerto del
hígado trasplantado en el receptor se evaluó y determinó según la
prueba de Kaplan-Meier.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados se muestran en la figura 1 y la
figura 2. Partes de los datos en la figura 2 son actualizaciones de
los datos en la figura 1.
Como resultado, en el grupo al que se administró
el anticuerpo anti-AILIM (1 mg/kg) 3 veces o 5 veces
a lo largo del tiempo que siguió al trasplante, se observó una
prolongación significativa de la supervivencia del injerto del
hígado trasplantado comparado con la del control.
Además, en el grupo en el que se administró una
dosis baja de anticuerpo anti-AILIM (0,3 mg/kg) 5
veces a lo largo del tiempo después del trasplante, también se
observó una prolongación significativa similar de la supervivencia
del injerto del hígado trasplantado.
Además, sorprendentemente, cuando el anticuerpo
anti-AILIM se administró incluso solo una vez en
combinación con FK-506, que es un agente
inmunosupresor clínicamente usado para múltiples fines, la
supervivencia del injerto del hígado trasplantado se prolongó
mucho, que fue significativamente más larga que cuando sólo se
administró FK-506 (1 mg/kg) una vez.
A partir de estos resultados, se reveló lo
siguiente.
1) El anticuerpo anti-AILIM
suprime significativamente el rechazo a injerto (rechazo
inmunológico) que acompaña al trasplante de un injerto tal como un
órgano.
2) El rechazo a injerto que acompaña al
trasplante de un injerto tal como un órgano se puede suprimir
adicionalmente usando el anticuerpo anti-AILIM en
combinación con un agente inmunosupresor, comparado a cuando sólo se
usa uno de ellos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron ratones adultos C3H/He (machos, 6
semanas de edad) y ratones adultos BALB/c (machos, 6 semanas de
edad) como receptores y donantes, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
La preparación se hizo como sigue.
Usando el ADNc que codifica la secuencia de
aminoácidos de longitud completa de AILIM de ratón previamente
descrita (Int. Immunol., Vol. 12, No.1, p.51-55,
2000), se preparó una célula transformada que expresaba AILIM de
ratón según métodos estándar usando tecnología de recombinación
genética.
La célula transformada se homogenizó y se
ultracentrifugó (100.000 x g) y el residuo centrifugado que contenía
la fracción de membrana celular se recogió y resuspendió en PBS. La
fracción de membrana celular obtenida se inyectó junto con
adyuvante de Freund completo en la almohadilla plantar de una rata
Wistar para la inmunización inicial (día 0). Además, la fracción de
membrana celular se administró como antígeno en la almohadilla
plantar con intervalos, en el día 7, día 14 y día 28. Dos días
después de la inmunización final, se recogieron las células e los
ganglios
linfáticos.
linfáticos.
Se mezclaron las células de los ganglios
linfáticos y células de mieloma de ratón PAI (JCR No. B0113; Res.
Disclosure, Vol.217, p.155, 1982) en una relación 5:1 y se preparó
un hibridoma productor de anticuerpo mediante fusión de las células
usando polietilenglicol 4000 (Boehringer Mannheim) como agente de
fusión. La selección de hibridomas se realizó mediante cultivo en
medio ASF104 que contenía HAT (Ajinomoto) con suero bovino fetal al
10% y aminopterina.
Se midieron las intensidades de fluorescencia de
las células teñidas haciendo reaccionar los sobrenadantes de
cultivo de cada hibridoma con las células transfectadas que
expresaban AILIM de ratón mencionadas anteriormente y después
haciéndolas reaccionar con IgG anti-rata marcada con
FITC (Cappel) usando el citómetro de flujo
EPICS-ELITE para confirmar la reactividad de los
anticuerpos monoclonales producidos en el sobrenadante del cultivo
de cada hibridoma contra AILIM de ratón. Como resultado, se
obtuvieron varios hibridomas que producían anticuerpos monoclonales
que tenían reactividad hacia AILIM de ratón.
Uno de estos hibridomas se nombró "B10.5".
Este hibridoma (de 10^{6} a 10^{7} células/0,5 mL/ratón cada
uno) se inyectó por vía intraperitoneal en un ratón nu/nu ICR
(hembra, de 7 a 8 semanas de edad). De diez a veinte días después,
se realizó una laparotomía en el ratón con anestesia, y se llevó a
cabo la preparación a gran escala de anticuerpo monoclonal de rata
anti-AILIM de ratón (IgG2a) a partir de ascitis
obtenidos según procedimientos estándar. De aquí en adelante, este
anticuerpo se denomina simplemente "anticuerpo
anti-AILIM".
\vskip1.000000\baselineskip
Siguiendo el método anteriormente descrito, se
trasplantaron los corazones de ratones donantes BALB/c en los
abdómenes de ratones receptores C3H/He. Se juzgó que la desaparición
del latido del corazón trasplantado era la finalización del rechazo
a injerto.
\vskip1.000000\baselineskip
A cada ratón C3H/He (10 ratones) que había
completado el trasplante, se le administró el anticuerpo
anti-AILIM (10 mg/kg) inmediatamente después del
trasplante (día 0; 200 \mug), el día 2 (200 \mug), día 4 (200
\mug), día 7 (200 \mug) y día 10 (100 \mug). El grupo al que
no se administró anticuerpo anti-AILIM (25 ratones)
se usó como control.
La duración de la supervivencia de injerto del
corazón trasplantado en el receptor después del trasplante se
evaluó y determinó según la prueba de
Kaplan-Meier.
La duración media de la supervivencia del
injerto del corazón trasplantado en los receptores fue como
sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
(Grupo al que se administró el anticuerpo
anti-AILIM)
Duración de la supervivencia del injerto: 9 días
en un ratón, 10 días en 3 ratones, 13 días en 4 ratones, 16 días en
2 ratones
\vskip1.000000\baselineskip
(Grupo control)
Duración de la supervivencia del injerto: 6 días
en 2 ratones, 7 días en 9 ratones, 8 días en 7 ratones, 9 días en 3
ratones, 10 días en 4 ratones.
La duración de la supervivencia del injerto en
el grupo control al que no se administró el anticuerpo
anti-AILIM fue de 7,9 días, pero en contraste, fue
de 12,3 días en el grupo al que se le administró el anticuerpo
anti-AILIM, y se demostró una prolongación
significativa de la supervivencia del injerto en el grupo con
anticuerpo anti-AILIM administrado.
\vskip1.000000\baselineskip
Los animales (donantes y receptores) y el
anticuerpo anti-AILIM usados fueron los mismos que
los mencionados anteriormente. La AILIM-Ig usada en
este examen era una proteína de fusión entre IgG-Fc
y la región extracelular de AILIM de ratón preparada de forma
similar a la descripción anterior (Solicitud internacional de
patente No. WO98/38216; Solicitud europea de patente No.
EP0984023).
El trasplante de corazón fue llevado a cabo de
manera similar al experimento 1.
A cada ratón C3H/He que había completado el
trasplante se le administró el anticuerpo anti-AILIM
(100 \mug/día) o AILIM-Ig (100 \mug/día) por
vía intraperitoneal inmediatamente después del trasplante (día 0),
el día 2, día 4, día 7 y día 10. El grupo al que no se administró
ni el anticuerpo anti-AILIM ni
AILIM-Ig se usó como control.
La duración media de la supervivencia del
injerto del corazón trasplantado en los ratones receptores fue
aproximadamente de 7,7 días en el grupo control, mientras que en
grupo al que se administró anticuerpo anti-AILIM fue
aproximadamente de 40,9 días (valor intermedio: 29 días/valor
máximo: 120 días) y en el grupo al que se administró
AILIM-Ig fue de 30 días o más (valor intermedio: 20
días/valor máximo: 64 días) (Fig. 3 y Fig. 4). Es decir, tanto en
el grupo al que se administró el anticuerpo
anti-AILIM como en el grupo al que se administró
AILIM-Ig se demostró una prolongación significativa
de la supervivencia del injerto del corazón trasplantado.
Además, mediante la tinción con
hematoxilina/eosina (tinción HE) según métodos estándar, se analizó
el grado de infiltración de células que expresan AILIM (ICOS) en el
corazón trasplantado en cada uno de los ratones control (sin
tratamiento terapéutico después del trasplante de corazón) y los
ratones a los que administró anticuerpo anti-AILIM
después del trasplante.
Como resultado, en el grupo sin tratar, se
observó una infiltración significativa de células que expresan
AILIM (ICOS) así como necrosis del músculo cardíaco (parte teñida).
Por otra parte, en el corazón trasplantado de un ratón al que se
administró anticuerpo anti-AILIM, no se pudo
observar necrosis del músculo cardíaco y se confirmó un descenso
significativo de células que expresan AILIM (ICOS) (Fig. 5).
\vskip1.000000\baselineskip
Se produjo un adenovirus recombinante que
contenía un casete de expresión del ADNc que codifica
hCTLA4-Ig (proteína de fusión que comprende la
región extracelular de CTLA4 humana y Fc humana) o el gen de la
\beta-galactosidasa (LacZ) de E. coli
mediante recombinación homóloga entre el casete del cósmido de
expresión pAdex/CAhCTLA4-Ig (Transplantation,
Vol.68, No.6, p.758, 1999) y el genoma del adenovirus de la cepa
parental (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.90, No.24,
p.11498-11502, 1993).
A continuación, el virus recombinante se hizo
proliferar en la línea celular 293 derivada de riñón humano. Se
recogió el vector vírico preparado de esta manera y se almacenó
mediante congelación a -80ºC. El adenovirus recombinante que
contenía el ADNc de hCTLA4-Ig y el adenovirus
recombinante que contenía LacZ se llamaron
AdhCTLA4-Ig y AdLacZ, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron ratas adultas macho
(210-250 g) Lewis (RT1^{1}) como receptores, y se
usaron ratas adultas macho (210-205 g) DA
(RT1^{a}) o BN (RT1^{n}) como donantes.
Se usó el anticuerpo monoclonal de ratón
anti-AILIM de rata preparado en el ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Siguiendo un método previamente descrito (J.
Thorac. Cardiovasc. Surg., Vol.57, No.2, p.225-229,
1969), los corazones obtenidos de ratas DA se trasplantaron en el
abdomen de ratas Lewis. Inmediatamente después del trasplante de
corazón, se administraron un anticuerpo anti-AILIM
de rata (1 mg/kg) y/o AdCTLA4-Ig (10^{9} unidades
formadoras de placa; ufp) por vía intravenosa en una dosis única a
las ratas receptoras.
El grupo de animales trasplantados a los que no
se les administró ni el anticuerpo anti-AILIM de
rata ni AdCTLA4-Ig, y el grupo de animales
trasplantados al que en su lugar se les administró AdLacZ se usaron
como controles. El método de tratamiento de cada grupo de animales
es como se muestra a continuación.
Grupo 1: Alotrasplante (Lewis/DA)
sin tratamiento inmunosupresor.
Grupo 2: Isotrasplante (Lewis/Lewis)
sin tratamiento inmunosupresor.
Grupo 3: Alotrasplante (Lewis/DA)
con administración de AdLacZ.
Grupo 4: Alotrasplante (Lewis/DA)
con administración de AdCTLA4-Ig.
Grupo 5: Alotrasplante (Lewis/DA)
con administración de anticuerpo anti-AILIM.
Grupo 6: Alotrasplante (Lewis/DA)
con administración de AdCTLA4-Ig y anticuerpo
anti-AILIM.
Se juzgó que la desaparición del latido del
corazón trasplantado era el final del rechazo al injerto. El rechazo
al injerto se confirmó analizando histológicamente células
mononucleares que se infiltraban en el tejido cardíaco trasplantado
y la necrosis de las células musculares mediante tinción HE según
métodos estándar.
A continuación, a la pared torácica lateral de
las ratas receptoras del grupo 4 y el grupo 6 en las que el corazón
trasplantado sobrevivió un periodo largo, se les trasplantó un
injerto de piel suficientemente grueso de una rata donante DA el
día 140 a partir del trasplante de corazón. Después del trasplante
de piel, no se realizó un tratamiento inmunosupresor con el
anticuerpo anti-AILIM, AdCTLA4-Ig o
similar. Se determinó el final de la duración de la supervivencia
del injerto de piel cuando el grado de injerto de piel visualmente
observable disminuyó al 10% o menos del estado inicial.
Después, el día 200 a partir del trasplante
inicial del corazón de la rata DA, usando la técnica del manguito
(Acta. Pathol. Microbiol. Scand. [A], Vol.79, No.4,
p.366-372, 1971), se trasplantó de nuevo el corazón
de una rata donante DA en la región cervical de 3 ratas receptoras
del grupo 6 que indicaron rechazo a injerto después de recibir
trasplante de piel donante.
Además, el día 150 a partir del trasplante
inicial de corazón de ratas donantes DA, se trasplantaron corazones
de ratas donante BN en las ratas receptoras restantes del grupo 6 en
las que el corazón trasplantado sobrevivió durante un periodo
largo.
Se realizó la evaluación estadística del grado
de supervivencia del injerto en los receptores según la prueba de
Kaplan-Meier.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra en la figura 6, no se observó
una prolongación significativa de la supervivencia del injerto del
corazón trasplantado en receptores comparados con el grupo de
animales sin tratar en los que se realizó xenotrasplante (grupo 1)
en el grupo de animales a los que se administró AdLacZ (Grupo 3) ni
en el grupo de animales a los se dio una única dosis de anticuerpo
anti-AILIM (grupo 5).
Por otra parte, en el grupo de animales a los
que se administró AdCTLA4-Ig (Grupo 4), la
supervivencia del injerto del corazón trasplantado (inicialmente
corazón de rata DA trasplantado) se prolongó significativamente (la
media: aproximadamente 64 días). Además, en 3 ratas del grupo 4 (10
ratas), se observó la supervivencia del injerto del corazón
trasplantado durante un periodo largo de de 100 días o más (Fig.
6).
Además, en el grupo de animales en los que se
usaron en combinación AdCTLA4-Ig y anticuerpo
anti-AILIM (grupo 6), la supervivencia del injerto
del corazón trasplantado (corazón de rata DA inicial) se prolongó
indefinidamente (300 días o más) en todos los receptores (Fig.
6).
En las ratas receptoras del grupo 4, el corazón
trasplantado (inicialmente corazón de rata donante DA trasplantado)
se rechazó junto con el rechazo de piel trasplantada, mientras que
en ratas receptoras del grupo 6, no se observó el rechazo del
corazón trasplantado.
Como se muestra en la figura 7, en todas las
ratas receptoras del grupo 4 y del grupo 6 que recibieron trasplante
de piel de un donante, la piel trasplantada se rechazó. Sin
embargo, al contrario que el grupo 4 y el grupo control en los que
el rechazo de la piel trasplantada se completó en 12 días o menos a
partir del trasplante de piel, la terminación del rechazo estuvo
algo retrasada y se vio a los 16 días o menos en el grupo 6. Este
resultado muestra que el uso combinado de AdCTLA4-Ig
y anticuerpo anti-AILIM puede retrasar el rechazo de
la piel injertada comparado con el caso en que
AdCTLA4-Ig se usa sola.
De forma interesante, en las ratas receptoras
del grupo 6 en el que se confirmó la supervivencia a largo plazo
del corazón trasplantado (corazón de rata DA inicial), la piel
trasplantada se rechazó por completo como se ha mencionado
anteriormente, pero se vio supervivencia del injerto durante un
periodo indefinido en el segundo corazón trasplantado (corazón de
rata donante DA trasplantado la segunda vez). Además, en las ratas
receptoras, el corazón donante trasplantado inicialmente sobrevivió
a lo largo de todo el examen.
En el receptor del grupo 6 a los que se
trasplantaron corazones de ratas donantes BN, los corazones de ratas
DA inicialmente trasplantados continuaron latiendo y sobrevivieron
durante el examen, pero los corazones de ratas donan-
tes BN trasplantados la segunda vez se rechazaron en un periodo similar a los resultados de los animales del grupo 1.
tes BN trasplantados la segunda vez se rechazaron en un periodo similar a los resultados de los animales del grupo 1.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención son extremadamente útiles en la supresión, prevención y/o
tratamiento de rechazo inmunológico (rechazo a injerto), un problema
serio que acompaña a las terapias mediante trasplante
(alotrasplante o xenotrasplante) de órganos (hígado, corazón,
pulmones, riñones, páncreas, etc.), partes de los mismos o tejidos
(piel, córnea, hueso, etc.) de donantes a receptores afectados por
enfermedades cardiovasculares graves.
Las composiciones farmacéuticas de esta
invención también pueden suprimir más intensamente los rechazos a
injertos cuando se usan en combinación con agentes inmunosupresores
existentes que se administran para suprimir rechazos a injerto
(rechazos inmunológicos) en tales terapias de trasplante.
Además, una composición farmacéutica que
comprende un anticuerpo humano contra AILIM incluido en las
composiciones farmacéuticas de esta invención es un medicamento
extremadamente útil, porque no produce efectos secundarios tal como
alergia cuando el anticuerpo derivado de ratón se administra a seres
humanos.
Claims (9)
1. Una sustancia que tiene una actividad de
modular la transducción de señales mediada por AILIM para aumentar
el efecto de uno o más agente(s) inmunosupresor(es)
sobre la supresión, tratamiento o prevención del rechazo a injerto
que acompaña el trasplante de un órgano, una parte del mismo o un
tejido, dicha sustancia se selecciona de cualquiera de (a) a
(e):
- (a)
- un anticuerpo que se une a AILIM, o una parte de dicho anticuerpo;
- (b)
- un polipéptido que comprende el total o una parte de la región extracelular de AILIM;
- (c)
- un polipéptido de fusión que comprende el total o una parte de una región extracelular de AILIM y el total o un parte de una región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina;
- (d)
- un polipéptido que se une a AILIM; y
- (e)
- un ADN antisentido o un ARN antisentido contra AILIM.
\vskip1.000000\baselineskip
2. La sustancia de la reivindicación 1, en donde
dicho agente inmunosupresor es uno o más agente(s)
terapéuti-
co(s) seleccionado(s) del grupo que consiste en azatioprina, esteroide corticosuprarrenal, ciclosporina, mizorribina y tacrolimus (FK-506), micofenolato de mofetilo, leflunomida, sirolimus, desoxiespergualina, FTY720 y un fármaco de CTLA4.
co(s) seleccionado(s) del grupo que consiste en azatioprina, esteroide corticosuprarrenal, ciclosporina, mizorribina y tacrolimus (FK-506), micofenolato de mofetilo, leflunomida, sirolimus, desoxiespergualina, FTY720 y un fármaco de CTLA4.
3. La sustancia de la reivindicación 1 ó 2, para
su uso en combinación con tacrolimus (FK-506) y/o un
fármaco de CTLA4.
4. La sustancia de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho trasplante es
alotrasplante.
5. La sustancia de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho trasplante es
xenotrasplante.
6. La sustancia de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha sustancia es un anticuerpo
que se une a AILIM, o una parte de dicho anticuerpo.
7. Una combinación farmacéutica de una sustancia
que tiene una actividad de modular la transducción de señales
mediada por AILIM y uno o más agente(s)
inmunosupresor(es), en donde dicha sustancia se selecciona de
cualquiera de los siguientes de (a) a (e):
- (a)
- un anticuerpo que se une a AILIM, o una parte de dicho anticuerpo;
- (b)
- un polipéptido que comprende el total o una parte de la región extracelular de AILIM;
- (c)
- un polipéptido de fusión que comprende el total o una parte de una región extracelular de AILIM y el total o un parte de una región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina;
- (d)
- un polipéptido que se une a AILIM; y
- (e)
- un ADN antisentido o un ARN antisentido contra AILIM.
\vskip1.000000\baselineskip
8. La combinación farmacéutica de la
reivindicación 7, en donde dicho agente inmunosupresor es uno o más
agen-
te(s) terapéutico(s) seleccionado(s) del grupo que consiste en azatioprina, esteroide corticosuprarrenal, ciclosporina, mizorribina y tacrolimus (FK-506), micofenolato de mofetilo, leflunomida, sirolimus, desoxiespergualina, FTY720 y un fármaco de CTLA4.
te(s) terapéutico(s) seleccionado(s) del grupo que consiste en azatioprina, esteroide corticosuprarrenal, ciclosporina, mizorribina y tacrolimus (FK-506), micofenolato de mofetilo, leflunomida, sirolimus, desoxiespergualina, FTY720 y un fármaco de CTLA4.
9. La combinación farmacéutica de cualquiera de
las reivindicaciones 7 u 8, en donde dicha sustancia es un
anticuerpo que se une a AILIM o una parte de dicho anticuerpo.
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