ES2341341T3 - Anticuerpos terapeuticos humanizados contra las isoformas cd45. - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo humanizado que tiene una especificidad de unión tanto por el CD45RO como por el CD45RB que comprende la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 31 o 32 y una región variable de cadena liviana de la SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8.
Description
Anticuerpos terapéuticos humanizados contra las
isoformas CD45.
La presente invención se relaciona con
compuestos orgánicos, tal como moléculas de unión contra las
isoformas del antígeno CD45, tal como por ejemplo los anticuerpos
monoclonales (mAb) y el uso de los mismos.
Un método en el tratamiento de una variedad de
enfermedades es lograr la eliminación o la inactivación de
leucocitos patógenos y el potencial para la inducción de la
tolerancia para inactivar respuestas inmunes patológicas.
El rechazo del trasplante de órgano, célula y
tejido y las varias enfermedades autoinmunes se consideran que son
principalmente el resultado de la respuesta inmune mediada por
célula T activada por las células T auxiliares que son capaces de
reconocer antígenos específicos que son capturados, procesados y
presentados a las células T auxiliares por el antígeno que presenta
la célula (APC) tal como los macrófagos y las células dendríticas,
en la forma de un complejo antígeno-MHC, es decir la
célula T auxiliar cuando reconoce antígenos específicos se estimula
para producir citocinas tales como IL-2 y expresar o
regular de forma ascendente algunos receptores de citocina y otras
moléculas de activación y proliferar. Algunas de estas células T
activadas pueden actuar directa o indirectamente, es decir ayudar a
las células T o las células B citotóxicas efectoras, para destruir
las células o tejidos que expresan el antígeno seleccionado. Después
de la terminación de la respuesta inmune algunas de las células
maduras clónicamente seleccionadas permanecen como auxiliares de
memoria y células C citotóxicas de memoria, que circulan en el
cuerpo y reconocen rápidamente el antígeno si aparece de nuevo. Si
el antígeno que activa esta respuesta es un antígeno ambiental
inocuo, el resultado es alergia, si el antígeno no es un
xenoantígeno, sino que es un autoantígeno, esto puede resultar en
una enfermedad autoinmune; si el antígeno es un antígeno de un
órgano trasplantado, el resultado puede ser un rechazo de
injerto.
El sistema inmune se ha desarrollado para
autoreconocerse de no autoreconocerse. Esta propiedad le posibilita
a otro organismo sobrevivir en un ambiente expuesto a la exposición
diaria a los patógenos. Esta especificidad por no autoreconocerse y
la tolerancia hacia autoreconocerse se origina durante el desarrollo
del repertorio de la célula T en el timo a través de los procesos
de selección positiva y negativa, que también comprenden el
reconocimiento y la eliminación de las células T autorreactivas.
Este tipo de tolerancia se refiere a una tolerancia central. Sin
embrago algunas de estas células autorreactivas escapan a este
mecanismo selectivo y poseen un riesgo potencial para el desarrollo
de enfermedades autoinmunes. Para controlar las células T
autorreactivas que han escapado a la periferia, el sistema inmune
tiene mecanismos reguladores periféricos que suministran protección
contra la autoinmunidad. Estos mecanismos son la base para la
tolerancia periférica.
Los antígenos de superficie celular reconocidos
por los mAb específicos se designan generalmente mediante un número
CD (grupo de diferenciación) asignado mediante taller Internacional
de Tipificación de Leucocitos y el término CD45 aplicado aquí se
refiere a un antígeno común de leucocito de superficie celular CD45;
y un mAb para ese antígeno se designa como
"anti-CD45".
Los anticuerpos contra el antígeno común de
leucocito (LCA) o CD45 son un componente principal de la globulina
antilinfocito (ALG). El CD45 pertenece a la familia de las
fosfatasas tirosina de transmembrana y son tanto un regulador
positivo como negativo de la activación celular, dependiendo de la
interacción del receptor. La actividad de fosfatasa del CD45 parece
requerirse para la activación de las cinasas de la familia Src
asociadas con el receptor antígeno de los linfocitos B y T
(Trowbridge IS et al, Annu Rev Immunol. 1994; 12:
85-116). Así, en la activación de la célula T el
CD45 es esencial para la señal 1 y las células deficientes en CD45
tienen profundos defectos en los eventos de activación mediados por
TCR.
El antígeno CD45 existe en diferentes isoformas
que comprenden una familia de glucoproteínas de transmembrana.
Distintas isoformas del CD45 difieren en su estructura del dominio
extracelular que surge de un empalme alternativo de 3 exones
variables que codifican para parte de la región extracelular CD45
(Streuli MF. et al, J. Exp. Med. 1987; 166:
1548-1566). Las varias isoformas del CD45 tienen
diferentes dominios extracelulares, pero tienen los mismos
segmentos citoplasmáticos y de transmembrana que tienen 2 dominios
de fosfatasa altamente conservados homólogos de aproximadamente 300
residuos. Diferentes combinaciones de isoforma se expresan de
manera diferente sobre las subpoblaciones de linfocitos T y B
(Thomas ML. et al, Immunol. Today 1988; 9:
320-325). Algunos anticuerpos monoclonales
reconocen un epítopo común a todas las diferentes isoformas, aunque
otros mAb tienen una especificidad restringida (CD45R), dependiendo
de cuál de los exones empalmados alternativamente (A, B o C)
reconocen ellos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que
reconocen el producto del exón A son consecuentemente designados
CD45RA, aquellos que reconocen las varias isoformas que contienen el
exón B se han designado CD45RB (Beverley PCL et al, Immunol.
Supp. 1988; I: 3-5). Los anticuerpos tales como el
UCHL1 se unen selectivamente a la isoforma CD45RO de 180 kDa (sin
ninguno de los exones variables A, B o C) que parecen estar
restringidos a un subconjunto de células T activadas, células de
memoria y timocitos corticales y no se detectan sobre las células B
(Terry LA et al, Immunol. 1988; 64:
331-336).
La WO 2002/072832 describe anticuerpos
monoclonales (mAb), que son específicos para un epítopo tanto el
CD45RB como el CD45RO para uso terapéutico contra enfermedades
autoinmunes y rechazos de injertos.
El dominio pesado de variable del anticuerpo
humano puede ser n-glucosilado
(Dunn-Walters D. et al, Molecular Immunology
2000; 37: 107-113). La hipermutación somática
introduce predominantemente la sustitución de nucleótido único en
los genes de región variable con el fin de incrementar la
variabilidad de la inmunoglobulina.
La N-glucosilación en la región
variable se conoce por afectar la unión de antígeno. Sin embargo se
conocen los anticuerpos monoclonales aglucosilados, que, aunque
preservan su función biológica, al perder cada glucosilación sus
efectos colaterales adversos (Friends P. et al,
Transplantation 1999, 68; 1632-1687).
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 1 muestra que la inhibición del MLR
primario por el "candidato mAb" es dependiente de dosis en el
rango de 0.001 y 10 \mug/ml. "Concentración" es la
concentración del "candidato mAb".
Las Figuras muestran el mapa de plásmido del
vector de expresión HCMV-G1 HuA6-VHQ
que comprende la cadena pesada que tiene la secuencia de nucleótido
SEQ ID NO: 12 (3921-4274)- en la secuencia de
nucleótido del vector de expresión completa SEQ ID NO: 15.
La Figura 3 muestra el mapa del plásmido del
vector de expresión HCMV-G1
HuA6-VHE- que comprende la cadena pesada que tiene
la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 11
(3921-4274) en la secuencia de nucleótido del vector
de expresión completa SEQ ID NO: 16.
La Figura 4 muestra el mapa del plásmido del
vector de expresión HCMV-K HuAb-VL1
humV1 que comprende la cadena liviana que tiene la secuencia de
nucleótido SEQ ID NO: 14 (3964-4284) en la
secuencia de nucleótido del vector de expresión completa SEQ ID NO:
17.
La Figura 5 muestra el mapa del plásmido del
vector de expresión HCMV-K HuAb-VL1
humV2 que comprende la cadena liviana que tiene la secuencia de
nucleótido SEQ ID NO: 13 (3926-4246) en la
secuencia de nucleótido del vector de expresión completa SEQ ID NO:
18.
La Figura 6 muestra el mapa del plásmido del
vector de expresión LCVL1S_{P}20 que comprende la cadena liviana
que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 33 en la secuencia
de nucleótido del vector de expresión completa SEQ ID NO: 36.
La Figura 7 muestra el mapa del plásmido del
vector de expresión LCVL2S_{P}20 que comprende la cadena liviana
que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 13 en la secuencia
de nucleótido del vector de expresión completa SEQ ID NO: 39.
La Figura 8 muestra el mapa del plásmido del
vector de expresión HCVHEN73D Sp20 que comprende la cadena pesada
que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 34 en la secuencia
de nucleótido del vector de expresión completa SEQ ID NO: 37.
La Figura 9 muestra el mapa del plásmido del
vector de expresión HCVHQN73D Sp20 que comprende la cadena pesada
que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 35 en la secuencia
de nucleótido del vector de expresión completa SEQ ID NO: 38.
La Figura 10 muestra el mapa del plásmido del
vector de expresión HCVHESp20 que comprende la cadena pesada que
tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 11 en la secuencia de
nucleótido del vector de expresión completa SEQ ID NO: 40.
La Figura 11 muestra el mapa del plásmido del
vector de expresión HCVHQSp20 que comprende la cadena pesada que
tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 12 en la secuencia de
nucleótido del vector de expresión completa SEQ ID NO: 41.
La Figura 12 muestra el análisis de
Cromatografía de Exclusión de Tamaño de VHE/humV1, VHE/humV2,
VHQ/humV1 y VHQ/humV2, y del VHE/humV1 junto con
VHE-N73D/humV1.
La Figura 13 muestra la Cromatografía de
Intercambio de Catión del VHE/humV2, VHE/humV1, VHQ/humV2, VHQ/humV1
y del VHE/humV2 junto con el VHE-N73D/humV1.
La Figura 14 muestra la Cromatografía de Fase
Inversa del VHE/humV2 y VHE-N73D/humV1.
\newpage
Hemos encontrado un anticuerpo humanizado que
tiene especificidad de unión tanto por el CD45RO como por CD45 RB
que comprende una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO:
31 o 32 y una región variable de cadena liviana de la SEQ ID NO: 7
o SEQ ID NO: 8.
En otro aspecto el anticuerpo humanizado que
tiene la especificidad de unión tanto por el CD45RO o por el CD45RB
comprende:
- -
- una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 31 y una región variable de cadena liviana de la SEQ ID NO: 7.
- -
- una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 31 y una región variable cadena liviana de la SEQ ID NO: 8.
- -
- una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 32 y una región variable de cadena liviana de la SEQ ID NO: 7.
- -
- una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 32 y una región variable de cadena liviana de la SEQ ID NO: 8.
El anticuerpo humanizado CD45RB/RO también puede
suprimir el proceso inflamatorio que media el rechazo de piel de
aloinjerto humano. Además encuentra que el anticuerpo humanizado
CD45RO/RB puede suprimir el proceso inflamatorio que media el
rechazo de la piel de aloinjerto humano, en particular, puede
suprimir el proceso inflamatorio que media el rechazo de piel de
aloinjerto humano in vivo en ratones SCID trasplantados con
piel humana e injertados con esplenocitos mononucleares. Y
adicionalmente, se encontró que el anticuerpo humanizado CD45RB/RO
puede conducir a la supervivencia del aloinjerto islote humano
prolongado al evitar la infiltración del injerto y al inhibir la
reacción de rechazo mediada por leucocito in vivo.
Los anticuerpos humanizados CD45RO/RB de acuerdo
con la invención son capaces de unirse específicamente a las
isoformas CD45RB y CD45RO del antígeno CD45 solo o asociado con
otras moléculas. La reacción de unión se puede mostrar mediante
métodos estándar (ensayo cualitativo) que incluyen por ejemplo
cualquier clase de ensayo de unión tal como la inmunofluorescencia
directa o indirecta junto con microscopio de fluorescencia o el
análisis citofluorimétrico (FACS), el ensayo inmunoabsorbente ligado
a enzima (ELISA) o el radioinmunoensayo en el cual la unión de la
molécula a las células que expresan una isoforma CD45 particular se
pueden visualizar. Además, la unión de esta molécula puede dar como
resultado la alteración de la función de las células que expresan
estas isoformas. Por ejemplo la inhibición de la respuesta del
linfocito mezclado primario o secundario (MLR) se puede determinar,
tal como en un ensayo in vitro o un bioensayo para determinar
la inhibición del MLR primario o secundario en presencia o en
ausencia de la molécula de unión CD45RO/RB y determinar las
diferencias en la inhibición MLR primaria.
Alternativamente, los efectos moduladores
funcionales in vitro se pueden determinar al medir la
proliferación del PBMC o las células T o las células TCD4^{+}, la
producción de citocinas, el cambio en la expresión de las moléculas
de la superficie celular por ejemplo luego de la activación de la
célula en MLR, o luego de la estimulación con un antígeno
específico tal como el toxoide del tétano u otros antígenos, o con
estimuladores policlonales tales como la fitohemaglutinina (PHA) o
los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28
o los ésteres de forbol o los ionóforos Ca^{2+}. Los cultivos se
configuran de manera similar a como se describió para el MLR
excepto que en lugar de células alogénicas como estimuladores se
utiliza antígeno soluble o estimuladores policlonales, tales como
aquellos mencionados anteriormente. La proliferación de células T se
mide preferiblemente como se describió anteriormente mediante la
incorporación de ^{3}H-timidina.
La producción de citocina se midió
preferiblemente mediante ELISA (captura) donde el anticuerpo de
captura de citocina recubre la superficie de una placa de 96 pozos,
los sobrenadantes de los cultivos se agregan y se incuban durante 1
hora a temperatura ambiente y se agrega un anticuerpo de detección
específico para la citocina particular, luego un anticuerpo de
segunda etapa conjugado a una enzima tal como la peroxidasa de
rábano seguido por el sustrato correspondiente y se mide la
absorbancia en un lector de placa. El cambio en las moléculas de la
superficie celular se mide preferiblemente mediante
inmunofluorescencia directa o indirecta después de teñir las
células objetivo con anticuerpos específicos para una molécula
particular de superficie de célula. El anticuerpo se puede marcar
directamente con fluorocromo o se puede utilizar un anticuerpo de
segunda etapa fluorescentemente marcado específico para el primer
anticuerpo, y las células se analizan con un citofluorímetro.
El anticuerpo humanizado de la invención tiene
una especificidad de unión tanto para el CD45RO como para el CD45RB
("molécula de unión CD45RB/RO").
Preferiblemente el anticuerpo humanizado se une
a la isoforma CD45RO con una constante de disociación (Kd) <20
nM, preferiblemente con un Kd <15 nM o <10 nM, más
preferiblemente con un Kd <5 nM. Preferiblemente el anticuerpo
humanizado se une a las isoformas CD45RB con un Kd <50 nM,
preferiblemente con un Kd <15 nM o <10 nM, más
preferiblemente con un Kd <5 nM.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida adicional el
anticuerpo humanizado de la invención se une a aquellas isoformas
CD45 las cuales
- 1)
- incluyen los epítopos A y B pero no el epítopo C de la molécula CD45; y/o
- 2)
- incluye el epítopo B pero no el epítopo A ni el epítopo C de la molécula CD45; y/o
- 3)
- no incluye ninguno de los epítopos A, B o C de la molécula CD45.
\vskip1.000000\baselineskip
En aún una realización preferida adicional la
molécula de unión de la invención no se une a las isoformas CD45
que incluyen
- 1)
- todos los epítopos A, B y C de la molécula CD45; y/o
- 2)
- tanto los epítopos B como C pero no el epítopo A de la molécula CD45.
\vskip1.000000\baselineskip
En realizaciones preferidas adicionales la
molécula de la invención además
- 1)
- reconoce la memoria en células T aloactivadas in vivo; y/o
- 2)
- se une a su objetivo sobre células T humanas tales como por ejemplo las células PEER; en donde dicha unión preferiblemente es con Kd <15 nM, más preferiblemente con un Kd <10 nM, más preferiblemente con un Kd <5 nM; y/o
- 3)
- inhibe la función de la célula T alorreactiva in vitro, preferiblemente con un IC_{50} aproximadamente menos de 100 nM, preferiblemente menos de 50 nM o 30 nM más preferiblemente con un IC_{50} de aproximadamente 10 o 5 nM, más preferiblemente con un IC_{50} de aproximadamente 0.5 nM o aún 0.1 nM; y/o
- 4)
- induce la muerte celular a través de apoptosis en linfocitos T humanos; y/o
- 5)
- induce la tolerancia de la célula T específica de aloantígeno in vitro; y/o
- 6)
- evita la enfermedad del injerto contra el anfitrión xenogénica letal (GvHD) inducida en ratones SCID mediante inyección del PBMC humano cuando se administra en una cantidad efectiva; y/o
- 7)
- se une a los linfocitos, monocitos, citoblastos, linfocitos citolíticos naturales y/o granulocitos, pero no a las plaquetas o linfocitos B; y/o
- 8)
- soportan la diferenciación de células T con un fenotipo de la célula reguladora T característica (Treg); y/o
- 9)
- induce a las células reguladoras T capaces de suprimir la activación de la célula T indiferenciada; y/o
- 10)
- suprimir el proceso inflamatorio que media el rechazo de piel de aloinjerto humano, en particular, suprimir el proceso inflamatorio que media el rechazo de piel de aloinjerto, in vivo en ratones SCID trasplantados con piel humana e injertados con esplenocitos mononucleares; y/o
- 11)
- prolonga la supervivencia de aloinjerto de islote humano en un modelo de ratón hu-PBL-NOD/SCID.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización adicional preferida del
anticuerpo humanizado de la invención se une al mismo epítopo que
el anticuerpo monoclonal "A6" como se describió por Aversa
et al., Cellular Immunology 158, 314-328
(1994).
Debido a las propiedades de unión y a las
actividades biológicas anteriormente descritas, tal anticuerpo
humanizado de la invención es particularmente útil en medicina,
para terapia y/o profilaxis. Las enfermedades en la cual el
anticuerpo humanizado de la invención es particularmente útil
incluyen enfermedades autoinmunes, rechazo por trasplante,
dermatitis, enfermedad inflamatoria del intestino y/o alergias, como
se establecerá adicionalmente adelante.
Los anticuerpos humanizados se pueden por
ejemplo derivar de los anticuerpos producidos mediante células B o
hibridomas y cualquier fragmento de los mismos, por ejemplo, los
fragmentos F(ab')2 y FAB así como también anticuerpos
monocatenarios o de dominio único. Un anticuerpo monocatenario
consiste de las regiones variables de las cadenas pesada y liviana
del anticuerpo covalentemente unidas a un ligador de péptido que
consiste usualmente de 10 a 30 aminoácidos, preferiblemente de 15 a
25 aminoácidos. Por lo tanto, tal estructura no incluye la parte
constante de las cadenas pesada y liviana y se cree que el separador
péptido pequeño debe ser menos antigénico que una parte constante
completa. Por un anticuerpo humanizado se entiende un anticuerpo en
el cual las regiones hipervariables (CDR) son de origen no humano
(por ejemplo murino) todas o sustancialmente todas las otras
partes, por ejemplo, las regiones constantes y las partes altamente
conservadas de las regiones variables son de origen humano. Un
anticuerpo humanizado sin embargo puede retener unos pocos
aminoácidos de la secuencia de murino en las partes de las regiones
variables adyacentes a las regiones hipervariables.
Las regiones hipervariables, es decir, los CDR
de acuerdo con la presente invención se pueden asociar con
cualquier clase de regiones de estructura, por ejemplo, partes
constantes de las cadenas liviana y pesada de origen humano. Tales
regiones de estructura son descritas en "Sequences of proteins of
immunological interest", Kabat, E.A. et al, departamento
Estadounidense de los servicios de salud y humanos, Servicio público
de salud, Instituto Nacional de salud. Preferiblemente la parte
constante de la cadena pesada humana puede ser del tipo IgG1, que
incluye los subtipos, preferiblemente la parte constante de la
cadena liviana humana puede ser del tipo \kappa o \lambda, más
preferiblemente del tipo \kappa. Preferiblemente, dicha cadena
pesada comprende no más un sitio de glucosilación, más
preferiblemente el sitio de glucosilación es un sitio de
N-glucosilación, y más preferiblemente el sitio de
glucosilación está localizado en la parte constante de la cadena
pesada. Más preferiblemente ningún sitio de glucosilación está
presente en la región variable, preferiblemente ningún sitio de
glucosilación en la región de estructura.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto la presente invención suministra
un anticuerpo humanizado que comprende
- -
- un polipéptido de la SEQ ID NO: 31 y un polipéptido de la SEQ ID NO: 7 (tal como VHEN73D/humV2),
- -
- un polipéptido de la SEQ ID NO: 31 y un polipéptido de la SEQ ID NO: 8 (tal como VHEN73D/humV1),
- -
- un polipéptido de la SEQ ID NO: 32 y un polipéptido de la SEQ ID NO: 7 (tal como VHQN73D/humV2), o
- -
- un polipéptido de la SEQ ID NO: 32 y un polipéptido de la SEQ ID NO: 8 (tal como VHQN73D/humV1),
"Polipéptido", sino se especifica de otra
manera aquí, incluye cualquier péptido o proteína que comprende
aminoácidos unidos uno al otro mediante enlaces peptídicos que
tienen una secuencia de aminoácidos que inicia en la extremidad
N-terminal y terminan en la extremidad
C-terminal. El polipéptido de la presente invención
es un anticuerpo monoclonal. Preferiblemente es un anticuerpo
monoclonal humanizado (injertado-CDR), el anticuerpo
monoclonal humanizado (injertado-CDR) puede o no
incluir mutaciones adicionales introducidas en las secuencias de
estructura (FR) del anticuerpo aceptador. Preferiblemente el
anticuerpo humanizado comprende no más de un sitio de
glucosilación. Más preferiblemente dicho un sitio de glucosilación
es un sitio de N-glucosilación. Más preferiblemente
ningún sitio de glucosilación está presente en la región variable, y
aún más preferiblemente ningún sitio de glucosilación está presente
en la región variable de la cadena pesada más preferiblemente
ningún sitio de glucosilación está presente en las regiones de
estructura (FR).
El término "modificación covalente" incluye
las modificaciones de un polipéptido de acuerdo con la presente
invención, por ejemplo una secuencia especificada; o un fragmento de
ésta con un agente de derivación proteináceo o no proteináceo
orgánico, fusiones a secuencias de polipéptido heterólogo, y
modificaciones postraduccionales. Los polipéptidos modificados
covalentes, por ejemplo, una secuencia especificada, tienen aún la
capacidad de unirse al CD45RO o al CD45RB mediante reticulación.
Las modificaciones covalentes son tradicionalmente introducidas al
hacer reaccionar los residuos de aminoácido objetivo con un agente
de derivación orgánico que es capaz de reaccionar con los lados
seleccionados o los residuos terminales, o mediante mecanismos de
aprovechamiento de las modificaciones postraduccionales que
funcionan en las células huéspedes recombinantes seleccionadas.
Ciertas modificaciones postraduccionales son el resultado de la
acción de células huéspedes recombinantes sobre el polipéptido
expresado. Los residuos de glutaminilo y asparaginilo son
frecuentemente traduccionalmente desamidados a los correspondientes
residuos de glutamilo y aspartilo. Alternativamente, estos residuos
son desaminados bajo condiciones medianamente ácidas. Otras
modificaciones postraduccionales incluyen la hidroxilación de la
prolina y la lisina, la fosforilación de los grupos hidroxilo de
residuos de serilo, tiroxina y treonilo, la metilación de los
grupos \alpha-amino de lisina, arginina, y las
cadenas laterales de histidina, ver por ejemplo T. E. Creighton,
Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman &
Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983). Las
modificaciones covalentes, por ejemplo incluyen proteínas de fusión
que comprenden un polipéptido de acuerdo con la presente invención,
por ejemplo, de una secuencia especificada y sus variantes de
secuencia de aminoácidos, tal como las inmunoadesinas, las fusiones
N-terminales a las secuencias de señal
heteróloga.
"Aminoácido(s)" se refiere a todos
los aminoácidos L-\alpha aminoácidos de ocurrencia
natural, por ejemplo, e incluyen los D-aminoácidos.
Los aminoácidos se identifican por cualquiera de las designaciones
de una letra o tres letras bien conocidas.
El término "variante de secuencia de
aminoácido" se refiere a moléculas con algunas diferencias en sus
secuencias de aminoácidos comparadas con un polipéptido de acuerdo
con la presente invención, por ejemplo, de una secuencia
especificada. Las variantes de la secuencia de aminoácido del
polipéptido de acuerdo a la presente invención, por ejemplo, de una
secuencia especificada, tienen aún la capacidad de unirse al CD45RO
y al CD45RB. Las variantes de sustitución son aquellas que tienen
por lo menos un residuo de aminoácido removido y un diferente
aminoácido insertado en su lugar en la misma posición en un
polipéptido de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de
una secuencia especificada. Estas sustituciones pueden ser únicas,
donde solamente un aminoácido de la molécula sea sustituido, o
ellas pueden ser múltiples, donde dos o más aminoácidos han sido
sustituidos en la misma molécula. Las variaciones de inserción son
aquellas con uno o más aminoácidos insertados inmediatamente
adyacentes a un aminoácido en una posición particular en un
polipéptido de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de
una secuencia especificada. Inmediatamente adyacente a un aminoácido
significa conectado a cualquiera de los grupos funcionales
\alpha-carboxi o \alpha-amino
del aminoácido. Las variaciones de eliminación son aquellas con uno
o más aminoácidos en un polipéptido de acuerdo con la presente
invención, por ejemplo, de una secuencia especificada, removida.
Habitualmente, las variaciones de eliminación tendrán uno o dos
aminoácidos suprimidos en una región particular de la molécula.
En otro aspecto la presente invención suministra
polinucleótidos aislados que codifican el anticuerpo humanizado de
la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Los polinucleótidos que comprenden los
polinucleótidos que codifican un polipéptido de la SEQ ID NO: 31
y/o de la SEQ ID NO: 32, preferiblemente un polipéptido de la SEQ
ID NO: 7 o la SEQ ID NO: 8; por ejemplo que codifican:
- -
- un polipéptido de la SEQ ID NO: 31 y un polipéptido de la SEQ ID NO: 7,
- -
- un polipéptido de la SEQ ID NO: 31 y un polipéptido de la SEQ ID NO: 8,
- -
- un polipéptido de la SEQ ID NO: 32 y un polipéptido de la SEQ ID: 7 o,
- -
- un polipéptido de la SEQ ID NO: 32 y un polipéptido de la SEQ ID: 8.
\vskip1.000000\baselineskip
"Polinucleótido" si no se especifica de
otra manera aquí incluye cualquier polirribonucleótido o
polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado, o
ARN o ADN modificado, que incluye sin limitación ARN mono o
bicatenario, y ARN que es una mezcla de regiones mono o
bicatenarias.
El anticuerpo humanizado CD45RO/RB por ejemplo
que es un anticuerpo quimérico o humanizado, se puede producir
mediante técnicas de ADN recombinante. Así, una o más moléculas de
ADN que codifican el CD45RO/RB se pueden construir colocadas bajo
secuencias de control apropiadas y transferidas a un huésped
adecuado (organismo) para expresión mediante un vector
apropiado.
En otro aspecto la presente invención,
suministra un polinucleótido que codifica una cadena pesada y/o
liviana monocatenaria de un anticuerpo humanizado CD45RO/RB de
acuerdo con la presente invención; y el uso de un polinucleótido de
acuerdo con la presente invención para la producción de un
anticuerpo humanizado CD45RO/RB de acuerdo con la presente
invención por medios recombinantes.
Se puede obtener una molécula de unión CD45RO/RB
de acuerdo, por ejemplo, análogamente a un método convencional
junto con la información suministrada, aquí por ejemplo, con el
conocimiento de la secuencia de aminoácido de las regiones
hipervariables o variables y las secuencias de polinucleótido que
codifican estas regiones. Un método para construir un gen de
dominio variable es por ejemplo, descrito en la EP 239 400 y se
puede resumir brevemente como sigue: se puede clonar un gen que
codifica una región variable del mAb de cualquier especificidad. Se
determinan los segmentos de ADN que codifican la estructura y las
regiones hipervariables y se remueven los segmentos de ADN que
codifican las regiones hipervariables. Los casetes de CDR sintéticos
bicatenarios se preparan mediante síntesis de ADN de acuerdo con la
secuencia CDR y CDR' como se especifica aquí. Estos casetes se
suministran con extremos pegajosos de tal manera que ellos se puedan
ligar en las uniones de una estructura deseada de origen humano.
Los polinucleótidos que codifican los anticuerpos monocatenarios
también se pueden preparar de acuerdo a por ejemplo análogamente a
un método convencional. Un polinucleótido de acuerdo con la
presente invención preparado así puede ser convenientemente
transferido en un vector de expresión apropiado.
Las estirpes celulares apropiadas se pueden
encontrar de acuerdo con esto, por ejemplo, análogamente, a un
método convencional. Los vectores de expresión, por ejemplo, que
comprenden promotores y genes adecuados que codifican las partes
constantes de una cadena pesada y liviana se conocen, por ejemplo, y
están disponibles comercialmente. Los huéspedes apropiados se
conocen o se pueden encontrar de acuerdo, por ejemplo, análogamente,
a un método convencional e incluir cultivo de célula o animales
transgénicos.
En otro aspecto la presente invención suministra
un vector de expresión que comprende polinucleótidos de acuerdo con
la presente invención, en donde el vector es capaz de producir el
anticuerpo humanizado cuando dicho vector está presente en una
célula anfitriona compatible.
En otro aspecto, la presente invención
suministra una célula anfitriona aislada que comprende un vector de
expresión capaz de producir el anticuerpo humanizado. Hemos
encontrado adicionalmente que el anticuerpo humanizado CD45RO/RB de
acuerdo con la presente invención inhibe las respuestas aloinmunes
primarias en una forma dependiente de dosis como se determina
mediante el MLR in vitro. Los resultados indican que las
células que se han aloactivado en la presencia de un anticuerpo
humanizado CD45RO/RB de acuerdo con la presente invención están
afectadas en sus respuestas a aloantígeno. Esto confirma la
indicación de que un anticuerpo humanizado CD45RO/RB de acuerdo con
la presente invención puede actuar directamente sobre las células T
aloactivas efectoras y modular su función. Además, las propiedades
funcionales de las células T derivadas del MLR primario se estudian
adicionalmente en experimentos de reestimulación en MLR secundario;
utilizando células estimuladoras específicas o estimuladores de
tercera parte para evaluar la especificidad de los efectos
funcionales observados. Hemos encontrado que las células derivadas
de los MLR primarios en las cuales está presente el anticuerpo
humanizado CD45RO/RB de acuerdo con la presente invención, se
afectan en su capacidad a responder a estímulos ópticos subsecuentes
con células estimuladoras específicas, aunque no se agrega ningún
anticuerpo a los cultivos secundarios. La especificidad de la
inhibición se demuestra mediante la capacidad de las células
tratadas con el anticuerpo humanizado CD45RO/RB de acuerdo con la
presente invención para responder normalmente a células
estimuladoras de donantes de tercera parte no relacionados. Los
experimentos de reestimulación que utilizan células T derivadas de
cultivos MLR primarios indican así que las células que habían
aloactivado un anticuerpo humanizado CD45RO/RB de acuerdo con la
presente invención son hiposensibles, es decir son tolerantes al
aloantígeno original. Las actividades biológicas adicionales se
describen en los ejemplos 7, y 9 a 13.
Adicionalmente hemos encontrado que la
proliferación de células en células pretratadas con un anticuerpo
humanizado CD45RO/RB de acuerdo con la presente invención se podría
rescatar mediante el IL-2 exógeno. Esto indica que
el tratamiento de células T alorreactivas con un anticuerpo
humanizado CD45RO/RB de acuerdo con la presente invención induce un
estado de tolerancia. De hecho, las respuestas proliferativas
reducidas observadas en las células tratadas con un anticuerpo
humanizado CD45RO/RB de acuerdo con la presente invención, se deben
al daño de la función de la célula T, y estas células son capaces de
responder al IL-2 exógeno, indicando que estas
células están en un estado de insensible cierto anérgico. La
especificidad de esta respuesta se muestra mediante la capacidad de
las células tratadas con un anticuerpo humanizado CD45RO/RB de
acuerdo a la presente invención para proliferar normalmente a
células donantes no relacionadas al nivel de las células tratadas
de control.
Adicionalmente los experimentos indican que la
unión del anticuerpo humanizado CD45RO/RB de acuerdo con la
presente invención al CD45RO y al CD45RB puede inhibir las
respuestas de memoria de las células mononucleares de sangre
periférica (PBMC) de donantes inmunizados al antígeno de memoria
específico. La unión de un anticuerpo humanizado CD45RO/RB de
acuerdo con la presente invención al CD45RO y al CD45RB es también
así efectiva para inhibir las respuestas de memoria al AG soluble.
La capacidad de un anticuerpo humanizado CD45RO/RB de acuerdo con
la presente invención para inhibir las respuestas de memoria
inmunológica del antígeno del tétano en el PMC de los donantes
inmunizados indican que una molécula de unión de CD45RO/RB de
acuerdo con la presente invención es capaz de apuntar a un objetivo
y modular la activación de las células T de memoria. Por ejemplo,
estos datos indican que un anticuerpo humanizado CD45RO/RB de
acuerdo con la presente invención además de reconocer las células T
alorreactivas y activadas es capaz de modular su función, dando como
resultado la inducción de la energía de las células T. Esta
propiedad puede ser importante en el tratamiento de respuestas
inmunes en desarrollo a autoantígenos y alérgenos y posiblemente a
aloantígenos como se ve en las enfermedades autoinmunes, alergia y
rechazo crónico, y a enfermedades tales como la soriasis, la
enfermedad inflamatoria del intestino, donde las respuestas de
memoria tienen una función en el mantenimiento del estado de la
enfermedad. Se considera que es una característica importante de la
situación de la enfermedad, tal como las enfermedades autoinmunes
en las que las respuestas de memoria a los autoantígenos pueden
tener una función principal para el mantenimiento de la
enfermedad.
También hemos encontrado que el anticuerpo
humanizado CD45RO/RB de acuerdo con la presente invención puede
modular las respuestas proliferativas de las células T en una
respuesta de linfocito mezclada (MLR) in vivo, es decir un
anticuerpo humanizado CD45RO/RB de acuerdo con la presente invención
se encuentra que tiene unas propiedades inhibitorias
correspondientes en pruebas in vivo, tal como por ejemplo, la
prevención de la enfermedad del injerto contra el anfitrión
xenogénica letal (GvHD) o la supresión del proceso inflamatorio que
media el rechazo de piel de aloinjerto humano en modelos de ratones
SID, o que prolongan la supervivencia del aloinjerto de islote
humano en un modelo de ratón
hu-PBL-NOD/SCID.
Un anticuerpo humanizado CD5RO/RB de acuerdo con
la presente invención puede tener así propiedades inmunosupresoras
y tolerogénicas y puede ser útil para inducción a tolerancia in
vivo y ex vivo a aloantígenos, autoantígenos, alérgenos
y antígenos de flora bacteriana, por ejemplo, un anticuerpo
humanizado CD45RO/RB de acuerdo con la presente invención puede ser
útil en el tratamiento y profilaxis de enfermedades por ejemplo que
incluyen enfermedades autoinmunes tales como, pero no limitadas a
artritis reumatoide, artritis psoriásica, tiroiditis autoinmune,
enfermedad de Graves, diabetes tipo 1 y tipo 2, esclerosis múltiple,
enfermedad de Crohn (CD), colitis ulcerativa (UC), lupus
eritematoso sistémico, síndrome de Sjögren, escleroderma, gastritis
autoinmune, glomerunonefritis, rechazo por trasplante, tal como,
pero no limitado al injerto de órgano y tejido y rechazo de
semiinjerto, por ejemplo, para el tratamiento de receptores de por
ejemplo trasplante de corazón, pulmón, corazón y pulmón combinado,
hígado, riñón, pancreático, de piel o de cornea, enfermedad del
injerto contra el anfitrión (GVHD), tal como el que sigue al
trasplante de médula ósea, y/o al rechazo de trasplante de célula
de islote pancreático, y/o también soriasis, dermatitis tal como
dermatitis atópica y de contacto que incluye dermatitis de contacto
alérgica, enfermedad inflamatoria del intestino y/o alergias que
incluyen asma alérgica.
El otro aspecto de la presente invención
suministra el uso del anticuerpo humanizado CD45RO/RB de acuerdo
con la presente invención como un fármaco.
En un aspecto adicional la presente invención
suministra el anticuerpo humanizado de acuerdo con la presente
invención para uso en el tratamiento y/o profilaxis de enfermedades
autoinmunes de las enfermedades autoinmunes: rechazo de trasplante,
soriasis, dermatitis, enfermedad inflamatoria del intestino y/o
alergias.
En otro aspecto la presente invención suministra
un anticuerpo humanizado de acuerdo con la presente invención en el
tratamiento y/o profilaxis de la enfermedad del injerto contra el
anfitrión (GVHD).
En otro aspecto la presente invención suministra
un anticuerpo humanizado de acuerdo con la presente invención para
la preparación de un medicamento en el tratamiento de rechazo de
trasplante de célula de islote pancreático.
En otro aspecto de la presente invención
suministra un método de tratamiento y/o profilaxis de enfermedades
asociadas con enfermedades autoinmunes, rechazo de trasplante,
soriasis, dermatitis, enfermedad inflamatoria del intestino y/o
alergias que comprenden suministrar a un sujeto necesitado del
tratamiento y/o profilaxis una cantidad efectiva del anticuerpo
humanizado GD45RO/RB de acuerdo con la presente invención, por
ejemplo en la forma de una composición farmacéutica de acuerdo con
la presente invención.
Una realización de la presente invención
suministra un método de tratamiento y/o profilaxis de una enfermedad
asociada con el rechazo de trasplante de célula islote, por
ejemplo, un rechazo de trasplante de célula islote, que comprende
administrar a un sujeto necesitado de tal tratamiento y/o profilaxis
una cantidad efectiva de un anticuerpo humanizado de acuerdo con la
presente invención.
En las realizaciones preferidas dicho anticuerpo
humanizado CD45RO/RB para uso como farmacéutico, para la producción
de un medicamento o en un método de tratamiento y/o profilaxis de
una enfermedad asociada con enfermedades autoinmunes, rechazo de
trasplante, soriasis, dermatitis, enfermedad inflamatoria del
intestino y/o alergias comprende un polipéptido de la SEQ ID NO:
31 o de la SEQ ID NO: 32 y/o un polipéptido de la SEQ ID NO: 7 o
de la SEQ ID NO: 8. Preferiblemente el anticuerpo humanizado
CD45RO/RB comprende un polipéptido de la SEQ ID NO: 31 y un
polipéptido de la SEQ ID NO: 8.
Una "cantidad efectiva" de un anticuerpo
humanizado CD45RO/RB es una cantidad suficiente para efectuar
resultados benéficos o deseados que incluyen resultados clínicos
tales como disminuir uno o más síntomas que resultan de la
enfermedad autoinmune, rechazo de trasplante, soriasis, dermatitis,
enfermedad inflamatoria del intestino y/o alergias, incrementar la
calidad de vida, de aquellos que sufren de, disminuir la dosis de
otros medicamentos requeridos para tratar tales enfermedades,
mejorar el efecto de otra medicación, retrasar la progresión de la
enfermedad y/o prolongar la supervivencia de los pacientes, directa
o indirectamente.
Una cantidad efectiva se puede suministrar en
una o más administraciones y puede o no ser lograda en conjunto con
otro fármaco, compuesto o composición farmacéutica. Así, una
"cantidad efectiva" se puede considerar en el contexto de
administrar uno o más agentes terapéuticos, y se puede considerar un
agente simple a ser suministrado en una cantidad efectiva si, en
conjunto con uno o más de otros agentes, se puede lograr un
resultado deseable.
Adicionalmente se puede administrar un
anticuerpo humanizado CD45RO/RB de la invención como un ingrediente
activo solo o junto con otros fármacos en regímenes
inmunomoduladores u otros agentes antiinflamatorios por ejemplo
para el tratamiento o prevención de enfermedades asociadas con
enfermedades autoinmunes, rechazo por trasplante, soriasis,
dermatitis, enfermedad inflamatoria del intestino y/o alergias. Por
ejemplo, un anticuerpo humanizado CD45RO/RB de la invención se
puede utilizar en combinación con un inhibidor de calcineurina, por
ejemplo ciclosporina A, ciclosporina G, FK-506,
ABT-281, ASM 981; un inhibidor mTOR, por ejemplo
rapamicina,
40-O-(2-hidroxi)etil-rapamicina,
CCI779, ABT578, AP23573, AP23464, AP23675, AP23841,
TAFA-93, biolimus-7 o
bioimus-9; un corticoesteroide; una ciclofosfamida;
azatioprina; metotrexato; un agonista receptor S1P, por ejemplo FTY
720 un análogo de los mismos; leflunomida o análogos de los mismos
mizoribina; ácido micofenólico; micofenolato mofetil;
15-desoxiespergualina o análogos de los mismos;
anticuerpos monoclonales inmunosupresores, por ejemplo, anticuerpos
monoclonales a los receptores de leucocitos, por ejemplo, MHC, CD2,
CDS, CD4, CD11a/CD18. CD7, CD25, CD27, B7, CD40, CD45, CD58, CD137,
ICOS, CD150 (SLAM), OX40, 4-1BB o sus ligandos, por
ejemplo, CD154; u otros compuestos inmunomoduladores, por ejemplo
una molécula de unión recombinante que tiene por lo menos una
porción del dominio extracelular del CTLA4 o un mutante de los
mismos, por ejemplo, una porción por lo menos extracelular del
CTLA4 o un mutante de los mismos unidos a una secuencia de proteínas
no CTLA4, por ejemplo CTLA4Ig (designado a ATCC 68629) o un mutante
de los mismos, por ejemplo LEA29Y u otros inhibidores de molécula
de adhesión, por ejemplo mAb o los inhibidores de bajo peso
molecular que incluyen agonistas LFA-1, agonistas
de selectina y agonistas VLA-4.
Una cantidad efectiva de un anticuerpo
humanizado CD45RO/RB de la invención, solo o en conjunto con otros
fármacos, compuestos, o composición farmacéutica se puede
administrar mediante cualquier ruta convencional, que incluye
inyección o infusión gradual durante el tiempo. La administración,
puede por ejemplo, ser oral, intravenosa, intraperitoneal,
intramuscular, intracavidad, subcutánea, tópica o transdérmica. Por
"coadministración" se significa la administración del
compuesto de las composiciones de la invención junto con o
sustancialmente al mismo tiempo, o en el mismo vehículo o en
vehículos separados, de tal manera que luego de la administración,
por ejemplo, los compuestos están presentes simultáneamente en el
tracto gastrointestinal. Preferiblemente, los compuestos se
administran como una combinación fija.
En otro aspecto la presente invención suministra
una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo humanizado
CD45RO/RB de acuerdo con la presente invención en asocio con un
portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
El término "portador o diluyente
farmacéuticamente aceptable" como se utiliza aquí significa uno o
más rellenos sólidos o líquidos compatibles, sustancias diluyentes
o encapsulantes que son adecuadas para la administración a los
mamíferos que incluyen humanos. El término "portador" denota un
ingrediente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el cual
el ingrediente activo se combina para facilitar la aplicación.
El término "farmacéuticamente aceptable"
significa un material no toxico que no interfiere con la efectividad
de la actividad biológica de los ingredientes activos. Tales
preparaciones pueden contener rutinariamente concentraciones
farmacéuticamente aceptables de sales, agentes amortiguadores,
conservantes, portadores compatibles, agentes potenciadores inmunes
suplementarios tales como adyuvantes y citocinas y opcionalmente
otros agentes terapéuticos tales como agentes
quimioterapéuticos.
Cuando se utilizan en medicina, las sales deben
ser farmacéuticamente aceptables, pero las sales no
farmacéuticamente aceptables se pueden utilizar convenientemente
para preparar sales farmacéuticamente aceptables de estas y no
están excluidas del alcance de la invención.
Las composiciones farmacéuticas pueden contener
agentes amortiguadores adecuados, que incluyen: ácido acético en
una sal; ácido cítrico en una sal; ácido bórico en una sal; ácido
fosfórico en una sal. Las composiciones farmacéuticas también
pueden contener, opcionalmente, conservantes adecuados, tales como:
cloruro de benzalconio; clorobutanol; parabenos y timerosal.
Las dosis del polipéptido o ácido nucleico que
codifica dicho polipéptido administrado a un sujeto se pueden
seleccionar de acuerdo con diferentes parámetros, en particular de
acuerdo con el modo de administración utilizado y el estado del
sujeto. Otros factores incluyen el periodo deseado de tratamiento.
En el evento de que una respuesta en un sujeto sea insuficiente en
las dosis iniciales aplicadas, se pueden emplear mayores dosis (o
dosis efectivamente mayores mediante una ruta de suministro
diferente, más localizada) en la medida en que la tolerancia del
paciente lo permita.
Las composiciones farmacéuticas se pueden
presentar convenientemente en una forma de dosis unitarias y se
pueden preparar mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en
la técnica de farmacia. Todos los métodos incluyen la etapa de
llevar el agente activo en asocio con un portador que constituye uno
o más ingredientes accesorios. En general, las composiciones se
preparan al llevar uniforme e íntimamente el compuesto activo en
asocio con un portador líquido, un portador sólido finamente
dividido, o ambos y luego si es necesario, conformar el
producto.
Las composiciones adecuadas para la
administración oral se pueden presentar como unidades discretas
tales como cápsulas, comprimidos, pastillas, que contienen cada una
cantidad predeterminada del compuesto activo y otras composiciones
incluyen suspensiones en líquidos acuosos o líquidos no acuosos
tales como un jarabe, elíxir o una emulsión.
Las composiciones adecuadas para la
administración parenteral comprenden de manera conveniente una
preparación acuosa o no acuosa estéril de un polipéptido de ácido
nucleico que codifica el polipéptido, que es preferiblemente
isotónico con la sangre del receptor. Esta preparación se puede
formular de acuerdo con métodos conocidos utilizando agentes de
dispersión y humectación adecuados y agentes de suspensión. La
preparación inyectable estéril también puede ser una solución
inyectable estéril o una suspensión en diluyente o disolvente
parenteralmente no toxico aceptable, por ejemplo, como una solución
de 1,3-butanediol. Entre los vehículos y los
disolventes aceptables que se pueden emplear está el agua, la
solución de Ringer, y solución de cloruro de sodio isotónica.
Además, los aceites fijos estériles son empleados convencionalmente
como un disolvente o un medio de suspensión. Para este propósito
cualquier se puede emplear cualquier mezcla de aceite fijo ligero
que incluye mono o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos
grasos tales como el ácido oleico se pueden utilizar en la
preparación de inyectables. La formulación portadora adecuada para
administraciones orales subcutáneas, intravenosas, y
intramusculares, se pueden encontrar en el Remington's
Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA.
Una composición farmacéutica puede comprender
además, por ejemplo, ingredientes activos, por ejemplo, otros
anticuerpos inmunomoduladores tales como, pero no confinados a
anti-ICOS, anti-CD154,
anti-CD134L o proteínas recombinantes tales como,
pero no confinadas a rCTLA-4 (CD152), rOX40 (CD134),
o agentes antiinflamatorios o compuestos inmunomoduladores tales
como, pero no confinados a ciclosporina, FTY720, RAD, rapamicina,
FK506, 15-desoxiespergualina, esteroides; como se
describió anteriormente. Tal composición farmacéutica puede
comprender un anticuerpo humanizado CD45RO/RB de acuerdo con la
invención y fármacos inmunomoduladores y/o agentes antiinflamatorios
en forma de dosis unitarias comparadas preferiblemente en donde las
formas de dosis unitarias son adecuadas para la administración de
los compuestos componentes en cantidades enérgicamente efectivas,
junto con instrucciones para uso, opcionalmente y con medios
adicionales para facilitar el cumplimiento de la administración de
los compuestos componentes, por ejemplo, una etiqueta o dibujos.
Las composiciones de la invención se pueden administrar como una
combinación libre, o se pueden formular en una combinación fija. Las
dosis absolutas de los compuestos variarán dependiendo de un número
de factores, por ejemplo, el individuo, la ruta de administración,
la duración deseada, la tasa de liberación del agente activo y la
severidad de la afección a ser tratada.
Las enfermedades como se subrayó anteriormente a
ser tratadas con el anticuerpo humanizado CD45RO/RB de la presente
invención solo o en combinación con otros fármacos incluye, pero no
está limitado a enfermedades autoinmunes, que incluye artritis
reumatoide, artritis psoriásica, tiroiditis autoinmune, enfermedad
de Graves, diabetes tipo 1 y tipo 2, esclerosis múltiple,
enfermedad de Crohn (CD), colitis ulcerativa (UC), lupus eritematoso
sistémico, síndrome de Sjögren, escleroderma, gastritis autoinmune,
y glomerunonefritis; rechazo por trasplante, tal como, pero no
limitado a, aloinjerto de órgano y tejido y rechazo de xenoinjerto,
por ejemplo, para el tratamiento de receptores de por ejemplo
trasplantes de corazón, pulmón, corazón y un pulmón combinados,
hígado, riñón, pancreático, de piel o de cornea, enfermedad del
injerto contra el anfitrión (GVHD), tal como lo que sigue al
trasplante de médula ósea, y/o rechazo de trasplante de célula
islote pancreática, y/o también soriasis, dermatitis tal como
dermatitis atópica y de contacto que incluye dermatitis de contacto
alérgica, enfermedad inflamatoria del intestino y/o alergias que
incluyen asma alérgica.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención será más completamente entendida
mediante referencia a los siguientes ejemplos. Ellos no se deben
considerar, sin embargo, como limitantes al alcance de la invención.
En los siguientes ejemplos todas las temperaturas están en grados
Celsius.
El "candidato mAb" o "anticuerpo
quimérico" es una molécula de unión CD45RO/RB de acuerdo con la
presente invención que comprende la cadena liviana de la SEQ ID NO:
3 y la cadena pesada de la SEQ ID NO: 4.
El "anticuerpo humanizado" es una molécula
de unión CD45RO/RB de acuerdo con la presente invención que
comprende un polipéptido de la SEQ ID NO: 8 y un polipéptido de la
SEQ ID NO: 9 (VHE/humV1, VHE/VL1 o VHE/VLh), un polipéptido de la
SEQ ID NO: 8 y un polipéptido de la SEQ ID NO: 10 (VHQ/humV1,
VHQ/VL1 o VHQ/VLh); un polipéptido de la SEQ ID NO: 7 y un
polipéptido de la SEQ ID NO: 9 (VHE/humV2, VHE/VL2 o VHE/VLm); un
polipéptido de la SEQ ID NO:7 y un polipéptido de la SEQ ID NO: 10
(VHQ/humV2, VHQ/VL2 o VHQ/VLm); un polipéptido de la SEQ ID NO: 8 y
un polipéptido de la SEQ ID NO: 31 (VHEN73D/humV1, VHEN73D/VL1 o
VHEN73D/VLh); un polipéptido de la SEQ ID NO:8 y un polipéptido de
la SEQ ID NO: 32 (VHQN73D/humV1, VHQN73D/VL1 o VHQN73D/VLh); un
polipéptido de la SEQ ID NO: 7 y un polipéptido de la SEQ ID NO: 31
(VHEN73D/humV2, VHEN73D/VL2 o VHEN73D/VLm); o un polipéptido de la
SEQ ID NO: 7 y un polipéptido de la SEQ ID NO: 32 (VHQN73D/humV2,
VHQN73D/VL2 o VHEN73D/VLm).
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizan las siguientes abreviaturas:
- APC
- célula que presenta antígeno
- CEX
- cromatografía de intercambio de catión
- c.p.m.
- conteos por minuto
- dhfr
- dihidrofolato reductasa
- EDTA
- ácido etileno dinitrilo tetra acético
- ELISA
- ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima
- ESI-Q-TOF
- onización electrorociado-cuadrupolo - tiempo de vuelo
- FACS
- selección de célula activada por fluorescencia
- Fc
- fragmento cristalizable
- F(ab')_{2}
- unión de antígeno de fragmento; bivalente
- FITC
- fluoresceína isotiocianato
- FBS
- suero bovino fetal
- GVHD
- enfermedad de injerto -vs- huésped
- HCMV
- promotor de citomegalovirus humano
- HPLC
- cromatografía líquida de alto desempeño
- IFN-\gamma
- interferón gama
- IgE
- isotipo de inmunoglobulina E
- IgG
- isotipo de inmunoglobulina G
- IL-2
- interleuquina-2
- IU
- unidades internacionales
- MALDI-TOF
- ionización de desorbción láser asistida por matriz - tiempo de vuelo
- MLR
- reacción de linfocito mezclado
- MLC
- cultivo de linfocito mezclado
- MP1
- proteína de matriz 1 del hemófilo de la influenza
- MTX
- metotrexato
- PBS
- solución salida amortiguada con fosfato
- PBL
- leucocitos de sangre periférica
- PBMC
- células mononucleares de sangre periférica
- PCR
- reacción en cadena polimerasa
- RP
- cromatografía de fase inversa
- SEC
- cromatografía de exclusión de tamaño
- SCID
- inmunodeficiencia combinada severa
- T_{reg}
- células reguladoras T
- xGVHD
- enfermedad de xenoinjerto vs huésped
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Las muestras sanguíneas se combinan de donantes
humanos saludables. Las células mononucleares de sangre periférica
(PBMC) se aíslan mediante centrifugación sobre
Ficoll-Hypaque (Pharmacia LKB) de leucocitos de
sangre periférica completa, leucoferesis o capas leucocíticas con
tipo de sangre conocidos, pero tipo HLA desconocido. En algunos
experimentos MLR, los PBMC son directamente utilizados como células
estimuladoras después de la irradiación a 40 Gy. En otros
experimentos, las células T se agotan de PBMC al utilizar CD2 o CD3
Dynabeads (Dynal, Oslo, Noruega). Los glóbulos y las células
contaminantes se remueven mediante campo magnético. El PBMC agotado
de célula T se utiliza como células estimuladoras después de la
irradiación.
El PBMC, las células T CD3^{+} o células T
CD4^{+} se utilizan como las células de respuesta en MLR. Las
células se preparan de diferentes donantes a células estimuladoras.
Las células T CD3^{+} se purifican mediante selección negativa
utilizando anti-CD16 mAb (Zymed, CA), IgG
anti-ratón de cabra Dynabeads,
anti-CD14 Dynabeads, CD19 Dynabeads. Además los
anti-CD8 Dynabeads son utilizados para purificar las
células T CD4^{+}. Las células obtenidas se analizan mediante
FACScan o FACSCalibur (Becton Dickinson & Co., CA) y la pureza
de la células obtenidas fue >75%. Las células se suspenden en
medio RPMI1640, complementado con 10% de FBS inactivado con calor,
penicilina, estreptomicina y L-glutamina.
El anti-CD45R0/RB mAb quimérico
"candidato mAb" y un anticuerpo quimérico de control que
coincide con isotipo o también se genera. El IgG_{1} de control
de ratón (Humano) específico de anticuerpo para KLH (hemocianina de
lapa hueco de cerradura) o un IL-10 humano
recombinante se compra de BD Pharmingen (San Diego, CA). El CD154
anti-humano mAb 5c8 está de acuerdo Lederman et
al 1992.
Alícuotas de 1 x 10^{5} PBMC o 5 X 10^{4} de
las células CD3^{+} o CD4^{+} se mezclan con 1 x 10^{5} PBMC
irradiado o 5 x 10^{4} PBMC irradiado agotado de las Células T (50
Gy) en cada pozo de placas de cultivos de 96-pozos
(Costar, Cambridge, MA) en la presencia de mAb indicado o ausencia
de Ab. En algunos experimentos, el fragmento F(ab')_{2}
del lg anti-ratón de cabra o el lg
anti-humano de cabra específico para la porción Fc
(Jackson InmunoResearch, West Grove, PA) se agrega a 10 \mug/ml
además del candidato mAb para asegurar la reticulación in
vitro óptima de las moléculas CD45 objetivo. Las células
mezcladas se cultivan durante 4 o 5 días a 37ºC en CO_{2} al 5% y
la proliferación se determina al pulsar las células con
^{3}H-timidina durante las últimas
16-20 horas de cultivo.
Otros experimentos son similares a aquellos
descritos anteriormente, pero con Las siguientes excepciones: 1) El
medio utilizado es EX-VIVO
(Bio-Whittaker) que contiene 10% de FBS y 1% de
plasma humano; 2) IgG total Anti-ratón (5
\mug/ml) se utiliza como etapa de reticulación secundaria; 3)
Irradiación de células estimuladoras es 60 Gy.
El MLR Primario se efectúa en la presencia del
"candidato mAb" o el IgG_{1} quimérico de control (10
\mug/ml) ambos con un reactivo de segunda etapa, el fragmento
F(ab')_{2} de un Ig anti-humano de cabra
específico para la porción Fc (10 \mug/ml). La inhibición
porcentual del "candidato mAb" se calcula en comparación con
proliferación de la célula en la presencia del control IgG_{1}.
Los resultados se muestran en Tabla 1 de adelante:
Un mAb candidato de acuerdo con la presente
invención inhibe el MLR primario como se puede ver de la Tabla 1.
El efecto inhibidor Promedio 60.83 \pm 6.83% en cuatro diferentes
células T CD4^{+} derivadas de diferentes donantes y
estadísticamente significativas.
La inhibición del MLR primario por el
"candidato mAb" se muestra por ser dependiente de dosis en el
rango de 0.001 y 10 \mug/ml del "candidato mAb" como se
muestra en la Figura 1.
El IC_{50} para la Inhibición del MLR primario
mediante un "candidato mAb" se determina de los resultados
tres experimentos MLR separados utilizando un PBMC donante como
célula de respuesta. Así, las células T CD4^{+} de respuesta de
Donante #229 y #219 y el PBMC irradiado agotado de células T como
estimuladores se mezclan en la presencia de un "candidato mAb"
o un control quimérico de Ab con 10 \mug/ml de fragmento
F(ab')_{2} de Ig anti-humano de cabra. Los
experimentos son repetidos 3 veces y el porcentaje de proliferación
en la presencia de un "candidato mAb" se calcula en
comparación con la proliferación de la célula T en la presencia del
control Ab. El valor IC_{50} se determina utilizando Origen (V.
6.0®). El valor IC_{50} de la actividad celular se calcula por
0.87 \pm 0.35 nM (0.13 \pm 0.052 \mug/ml).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Con el fin de evaluar si el "candidato mAb"
induce no respuesta de las células T CD4^{+} al aloantígenos
específicos, el MLR Secundario se efectúa en ausencia de cualquiera
de los anticuerpos después del MLC primario. Las células T
CD4^{+} se cultivan con células estimuladoras alogénicas
irradiadas (PBMC agotado de células T) en la presencia del
anticuerpo indicado en placas de cultivo en 96 pozos durante 10 días
(MLC primario). luego, las células son recolectadas, puestas en
placas sobre el gradiente Ficoll-Hypaque para
remover las células muertas lavadas dos veces con RPMI, y
estimuladas con el mismo estimulador, células estimuladoras de 3ra
parte o IL-2 (50 U/ml). Las células se cultivan
durante 3 días y se determina la respuesta proliferativa al pulsar
las células con ^{3}H-timidina durante las últimas
16-20 horas de cultivo.
Específicamente, las células T CD4^{+} se
cultivan e irradiadas con células estimuladoras alogénicas
irradiadas (PBMC agotado de células T tomadas de otros donantes) en
la presencia de 10 \mug/ml del "candidato mAb", IgG_{1} de
control quimérico Ab y el fragmento F(ab')_{2} de Ig
anti-humano de cabra. La proliferación MLR primaria
se determina en el día 5. Para MLR Secundario, el respondedor y
células estimuladoras se cultivan durante 10 días en la presencia
del "candidato mAb", luego las células son cosechadas, lavadas
dos veces en RPMI1640 y reestimuladas con un estimulador
especifico, estimuladores de tercera parte o IL-2
(50 U/ml) en la ausencia de cualquier Ab. La proliferación de las
células se determina en el día 3. Los resultados se establecen en
la Tabla 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de probar si la proliferación
afectada se debe a no respuesta como una consecuencia del
tratamiento con un "candidato mAb", la células derivadas de
MLR primario se cultivan en la presencia de IL-2 (50
U/ml). La adición de los resultados IL-2 en el
rescate de las respuestas proliferativas de la células T que habían
sido tratadas con un "candidato mAb" en el MLR primario, a
niveles similares a aquellos observados en la presencia del control
Ab IgG_{1}. Estos datos indican que la respuesta secundaria
afectada en las células T tratados con un "candidato mAb" se
debe a la alteración funcional de las células T de respuesta que se
convierten en células de no respuesta a estimulador específico.
La inhibición porcentual se calcula de acuerdo
la siguiente fórmula:
Se efectúa análisis estadístico utilizando
SigmaStat (Vers. 2.03).
Los datos se analizan mediante una ANOVA de dos
vías seguidos por un método Dunnett. En todos los procedimientos de
prueba las probabilidades <0.05 se consideran como
significativas. En algunos experimentos, la prueba t se utiliza
(SigmaStat V.2.03).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Las células mononucleares de sangre periférica
humana (PBMC) se inyectan intraperitonealmente en ratones SCID
ratones C.B 17/GbmsTac-Prkdc^{scid} Lyst^{bg}
(Taconic, Germantown, NY) en una cantidad suficiente para inducir
enfermedad del injerto contra el anfitrión xenogénica letal (xGvHD)
en >90% en ratones dentro de las 4 semanas después de la
transferencia de célula. Tales ratones SCID tratados son en sucesivo
designados como ratones
hu-PBL-SCID.
Los ratones
Hu-PBL-SCID se tratan con un
"candidato mAb" o ratón o controles mAb ajustados con isotipos
quiméricos en el día 0, inmediatamente después de la inyección
PBMC, en el día 3, día 7 y a intervalos semanales posteriormente.
Los mAb se suministran subcutáneamente en 100 \mul de PBS a una
concentración final de 5 mg/kg de peso de cuerpo. El tratamiento se
detiene cuando todos los ratones de control estuvieron muertos.
El criterio principal para evaluar la eficacia
de un "candidato mAb" en este estudio fue la supervivencia de
los ratones hu-PBL-SCID. La
significancia de los resultados se evaluó mediante el método
estadístico de análisis de supervivencia utilizando la prueba
Log-rank (método de Mantel) con la ayuda del
software Systat v9.01. El método de análisis de supervivencia es
una prueba no paramétrica, que no solamente considera si un ratón
particular está aún vivo sino que también si éste se sacrifica por
razones irrelevantes al tratamiento/enfermedad tal como el
requisito de efectuar análisis in vitro con sus
órganos/células. Las biopsias del hígado, pulmón, riñón y bazo se
obtuvieron de ratones muertos para evaluación adicional. Además, los
ratones hu-PBL-SCID son pesados al
inicio (antes de la transferencia de las células) y durante (cada
dos días) El experimento como una estimación indirecta de su estado
de salud. Se generan líneas de regresión lineal utilizando el peso
del cuerpo versus los días de los valores de transferencia
post-PBMC obtenidos de cada ratón y posteriormente,
sus pendientes (control versus ratones tratados
anti-CD45) se compararon utilizando prueba
Mann-Whitney no paramétrica.
Todos los ratones
hu-PBL-SCID tratados con los
controles mAb tuvieron leucocitos humanos infiltrado en el pulmón,
hígado y bazo y murieron (4/4) dentro de ca. 2 a 3 semanas después
de la transferencia de la célula. La muerte es probablemente
consecuencia del xGvHD. Los ratones tratados mAb de control
adicionalmente perdieron peso de manera lineal, ca. 10% y más
dentro de las 3 semanas.
Todos los ratones
hu-PBL-SCID tratados con un
"candidato mAb" sobrevivieron (4/4) sin ningún signo aparente
de enfermedad más de 4 semanas, aunque el tratamiento el
"candidato mAb" se detuvo después de las 3 semanas. Los
ratones tratados con el "candidato mAb" incrementaron el peso
de manera lineal, hasta un ca. De 5% dentro de las 4 semanas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Son construidos los vectores de expresión de
acuerdo a los mapas de plásmido mostrados en las Figuras 2 a 11,
que comprenden los nucleótidos correspondientes que codifican la
secuencia de aminoácido del humV1 de región variable de cadena
liviana humanizada (SEQ ID NO: 8; Figuras 4 y 6), región variable de
cadena liviana humanizada humV2 (SEQ ID NO: 7; Figuras 5 y 7),
región variable de cadena pesada humanizada VHE (SEQ ID NO: 9;
Figura 3 y 10), o región variable de cadena pesada humanizada VHQ
(SEQ ID NO: 10; Figuras 2 y 11), la región variable de cadena
pesada humanizada VHE-N73D (SEQ ID NO: 31; Figura 8)
o de región variable de cadena pesada humanizada
VHQ-N73D (SEQ ID NO: 32; Figura 9), respetivamente.
Estos vectores de expresión tienen las secuencias de ADN
(nucleótido) SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 41 (VHQ), SEQ ID NO: 16 y
SEQ ID NO: 40 (VHE), SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 36 (humV1), SEQ
ID NO: 18 y SEQ ID NO: 39 (humV2), o SEQ ID NO 37 (VHEN73D) y SEQ
ID NO 38 (VHQ-N73D).
Con el fin de construir el vector de expresión
final para la cadena liviana humanizada completa del isotipo kapa
humano, los fragmentos de ADN que codifican las regiones variables
de cadena liviana completa (VLh y VLm) se separaron del VLh y VLm
que contiene los vectores de clonación PCR-Script
(Stratagene) (región VLm) utilizando HindIII y BgIII. Los
fragmentos purificados con gel luego se subclonan en los sitios
HindIII y BamHI del vector de expresión C21-HCMV
kapa el cual se crea durante la construcción del anticuerpo
anti-IgE humanizado TESC-21
(Kolbinger et al 1993) y que originalmente se recibió de M.
Bendig (MRC Collaborative Centre, Londres, RU) (Maeda et al.
1991). Los productos de ligación se purifican mediante extracción de
fenol/cloroformo, y electroporados en una cepa Coli®
XL1-Blue Epicurian competente de eletrocoporación
(Cat. Nº #200228, Stratagene). Después de poner en placas de LB/amp
agar durante toda la noche a 37ºC, cada una de las 12 colonias se
recogieron para preparar ADN de plásmido de un cultivo de 3 ml
utilizando BioRobot 9600 (Qiagen). Este produjo los vectores de
expresión de cadena liviana para las versiones de anticuerpo
humanizado VLh y VLm, respectivamente, como se describe
adicionalmente en las Figuras.
Para la construcción del vector de expresión
VHQ, se practica un método en forma de etapas. Primero, la región
de variable completa del VHQ se ensambla mediante PCR de acuerdo con
la metodología como se describió en Kolbinger et al 1993
(Proteen Eng. 1993 Nov; 6(8):971-80) y se
subclona en la expresión del
C21-HCMV-gama-1 de
la cual el inserto C21 se habría removido utilizando las mismas
enzimas. Un fragmento HindIII/BamHI del clon PCRScript que VHQ que
contiene la región variable completa se subclona en el vector de
expresión
C21-HCMV-gama-1
clivado con las mismas enzimas. Este produjo el vector de expresión
final para la versión del anticuerpo humanizado
VHQ.
VHQ.
La construcción del vector de expresión VHE
final que codifica la cadena pesada humanizada completa del isotipo
gama-1 humano se logra al ligar directamente un
fragmento de PCR restringido con HindIII y BamHI que codifica la
región variable en los sitios HindIII y BamHI del vector de
expresión C21-HCMV gama-1 el cual se
crea durante la construcción del anticuerpo
anti-IgE humanizado TESC-21
(Kolbinger et al. 1993) y que también se recibe
originalmente de M. Bendig (MRC Collaborative Centre, Londres, RU)
(Maeda et al. 1991).
El siguiente protocolo de transfección se adopta
para células COS adherentes en platos de cultivos de células de 150
mm, utilizando un reactivo de transfección SuperFect^{TM} (Cat.
Nº301305, Qiagen). Los cuatros diferentes vectores de expresión
descritos anteriormente son utilizados para transfección transitoria
de células. Para la expresión del anticuerpo humanizado, cada uno
de los dos clones que contienen insertos de cadena pesada (VHE o
VHQ, respectivamente) son co-transfectados en
células con cada uno de los dos clones que codifican las cadenas
livianas (humV1 o humV2, respectivamente), en 4 combinaciones
diferentes totales de los vectores de expresión de cadena liviana
(VHE/humV1, VHE/humV2, VHQ/humV1 y VHQ/humV2). Antes de la
transfección, los plásmidos son linearizados con endonucleasa de
restricción PvuI que cliva en la región que codifica el gen de
resistencia para ampicilina. El día antes de la transfección, 4 x
10^{6} células COS en 30 ml de medio de cultivo fresco se
siembran en platos de 150 mm de cultivos de células. La siembra en
esta densidad de célula generalmente produce 80% de confluencia
después de 24 horas. En el día de la transfección, cuatro diferentes
combinaciones de vectores de expresión ADN de cadena pesada y
cadena liviana linearizada (15 \mug cada una) son diluidos en un
volumen total de 900 \mul de medio fresco sin suero ni
antibiótico. Luego se mezcla 180 \mul de reactivo de transfección
SuperFect completamente con la solución de ADN. La mezcla de ADN se
incuba durante 10 min a temperatura ambiente para permitir la
formación del complejo. Aunque la formación de complejo tiene
lugar, el medio de crecimiento se remueve de los cultivos de célula
COS, y las células se lavan una vez con PBS. Luego se agregan 9 ml
de un medio de cultivo fresco (que contiene 10% FBS y antibióticos)
a cada tubo de reacción que contiene los complejos de reacción y
están bien mezclados. La preparación final se transfiere
inmediatamente a cada uno de los cuatros cultivos a ser
transfectados y se mezclan suavemente. Los cultivos de célula son
entonces incubados con complejos de ADN durante 3 horas a 37ºC y 5%
de CO_{2}. Después de la incubación, los complejos de
transfección que contienen el medio se remueven y se reemplazan con
30 ml de medio de cultivo fresco. A las 48 hr post transfección, se
cosechan los sobrenadantes del cultivo.
Para el análisis ELISA y FACS, los sobrenadantes
del cultivo recolectados de las células COS transfectadas con los
plásmidos pesado y ligero son concentrados como siguen. Se agregan
10 ml de cada sobrenadante a dispositivos Centriprep
YM-50 Centrifugal Filter (Cat. Nº 4310, Millipore)
como se describió por el fabricante. Los filtros Centriprep se
centrifugan durante 10 min a 3000 rpm a temperatura ambiente. La
etapa de centrifugación luego se repite de nuevo con los 20 ml
restantes del sobrenadante utilizando solamente 5 min de
centrifugación y supervisando la evolución de concentración. Se
recuperan los 500 \mul del intermedio del sobrenadante
concentrado, se transfieren a los nuevos dispositivos Microcon
Centrifugal Filter (Cat. Nº 42412, Microcon) y además se concentran
siguiendo el protocolo del fabricante. Los sobrenadantes
concentrados se centrifugan cuatro veces durante 24 min a 3000 rpm
a temperatura ambiente, un vez durante 10 min a 6000 rpm y luego,
tres veces durante 5 min, siempre supervisando la evolución de la
concentración. El volumen final del medio acondicionado concentrado
logrado es 100-120 \mul que corresponde a una
concentración de 250 a 300 veces del medio de cultivo original y
este se almacena a 4ºC hasta uso. Para comparación y control, el
medio de cultivo de las células no transfectadas se concentra
similarmente, utilizando el mismo protocolo de centrifugación
descrito anteriormente.
La estirpe celular de mieloma de ratón Sp2/0
(ATCC, CRL-1581) se electropora con los vectores de
expresión CHO anteriormente descritos que codifican la cadena
pesada (VHE o VHQ) y liviana (humV1 o humV2) de los anticuerpos
humanizados de unión CD45RO/RB. Cuatro diferentes combinaciones de
vectores de expresión de cadena pesada y liviana (VHE/humV1,
VHE/humV2, VHQ/humV1 y VHQ/humV2) se utilizan para la transfección
de acuerdo al siguiente protocolo: 20 \mug de ADN superembobinado
de cada plásmido se mezclan en una cubeta de electroporación
(espacio 0.4 cm) con 8 x 10^{6} células Sp2/0 vivas suspendidas
en DMEM/10% de medio de cultivo FCS. Las configuraciones de
electroporación son 1500 V, 25 \muF utilizando un instrumento
BioRad GenePulser. Después de la electroporación, las células se
cultivan durante 20 h en medio de cultivo (DMEM complementado con
10% de penicilina FCS, estreptomicina y
L-glutamina). En el día dos la selección del fármaco
G418 (Cat. Nº 10131-019, Gibco) se agrega a una
concentración final de 1 mg de fármaco activa/ml y las células se
distribuyen en una placa de 96-pozos, 200 \mul de
cada pozo con aprox. 10^{5} células por pozo. Diez a 15 días más
tarde, los clones supervivientes G418 se expanden en un medio que
contiene G418. La secreción de los mAbs humanizados de estos
transfectantes se evalúa mediante ELISA, utilizando un
IgG/Fc\gamma anti-humano de cabra de anticuerpo de
recubrimiento (Cat. Nº 109-005-098,
Jackson Labs) y anticuerpo acoplado a peroxidasa contra cadena
liviana kapa humana (Cat. Nº A-7164, Sigma). Los
transfectantes, con calificación positiva en este ensayo se
seleccionan para una comparación de productividad sobre una base
por célula por día, de nuevo utilizando ELISA (ver adelante). El
mejor clon de cada transfectante se selecciona para su clonación
inmediata al limitar la dilución, utilizando una densidad de siembra
de 1 célula por pozo. La productividad de los subclones de
supervivencia G418 se determina de nuevo como se describió
anteriormente.
Los subclones se expanden en medio de selección
que contiene G418, hasta que el volumen de cultivo alcanza 150 ml,
etapa en la cual el cultivo se continúa sin G418 en matraces
destinados a cargar botellas de rodillos.
Después de la primera transfección y selección,
los transfectantes estables crecen por fuera de las placas de 96
pozos a una frecuencia de 20.8% para VHE/humV1, 11.5% para
VHQ/humV1, 18.8% para VHE/humV2 y 7.3% para VHQ/humV2. Después de
dos rondas de subclonación los mejores dos productores son el clon
1.33.25 (3.87 pg/célula/días) y el clon 1.33.26 (3.43
pg/célula/día) para VHE/ humV1 y el clon 12.1.4 (1.19 pg/célula/día)
y el clon 12.1.20 (1.05 pg/célula/día) para VHQ/humV1. Los
transfectantes Sp2/0 estables para VHE/humV1 y VHQ/humV1 son
posteriormente expandidos para la producción de anticuerpos y
purificación.
Los anticuerpos son purificados de los
sobrenadantes de estirpes celulares de mieloma SP2/0 transfectadas
establemente que contiene 10% de FCS mediante una combinación de
cromatografía de afinidad utilizando una matriz IgGFc
anti-humana inmovilizada y cromatografía de
exclusión de tamaño. Si se requiere, se remueve la endotoxina
utilizando una columna Acticlean Etox (Sterogene
Bioseparations).
Los vectores de expresión de cadena liviana kapa
humana para las versiones VLh y VLm:
El cADN humV1 (= VL1) o humV2 (= VL2) se
amplifica mediante PCR del plásmido de expresión CHO SEQ ID NO: 17
o SEQ ID NO: 18 respectivamente, utilizando los cebadores
HuCD45LC-Mlu
(5'-AAAACGCGTTGTGA
CATTCTGCTGACCCAGTCT-3'; SEQ ID NO: 42) y el HuCD45LC-Hind (5'-AAAAAAGCTTGGTCCCCTGGCC
GAACGTGAA-3'; SEQ ID NO: 43). Cada fragmento de PCR 321 bp se digiere con MluI y HindIII y ligado directamente en el vector de expresión de cadena liviana chA6HCk.dhfr que se digiere con las mismas enzimas. Los plásmidos resultantes son nombrados LCVL1Sp20 (SEQ ID NO: 36; Figura 6) y LCVL2Sp20 (SEQ ID NO: 39; Figura 7) respectivamente. El LCVL1Sp20 luego se utiliza para la expresión en las células Sp2/0 del anticuerpo humanizado VHE/humV1, VHQ/humV1 o VHE-N73D/humV1; LCVL2Sp20 se puede entonces utilizar para la expresión en células Sp2/0 del anticuerpo humanizado VHE/humV2 VHQ/humV2 o VHE-N73D/humV2.
CATTCTGCTGACCCAGTCT-3'; SEQ ID NO: 42) y el HuCD45LC-Hind (5'-AAAAAAGCTTGGTCCCCTGGCC
GAACGTGAA-3'; SEQ ID NO: 43). Cada fragmento de PCR 321 bp se digiere con MluI y HindIII y ligado directamente en el vector de expresión de cadena liviana chA6HCk.dhfr que se digiere con las mismas enzimas. Los plásmidos resultantes son nombrados LCVL1Sp20 (SEQ ID NO: 36; Figura 6) y LCVL2Sp20 (SEQ ID NO: 39; Figura 7) respectivamente. El LCVL1Sp20 luego se utiliza para la expresión en las células Sp2/0 del anticuerpo humanizado VHE/humV1, VHQ/humV1 o VHE-N73D/humV1; LCVL2Sp20 se puede entonces utilizar para la expresión en células Sp2/0 del anticuerpo humanizado VHE/humV2 VHQ/humV2 o VHE-N73D/humV2.
Las dos regiones cADN V_{H} humanizada se
amplifican mediante PCR de los plásmidos recombinantes
HCMV-G1 HuA6-VHE (SEQ ID NO: 16;
Figura 3) y HCMV-G1 HuA6-VHQ (SEQ ID
NO: 15 Figura 2) respectivamente, utilizando los cebadores de PCR
HuCD45HCEup
(5'-CAGGCAGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCA-3';
SEQ ID NO: 44) o HuCD45HCQup
(5'-CAGGCACAGGTGCAGCTGGTGGAGTCA-3';
SEQ ID NO: 45) y HuCD45HClo
(5'-AAATCCTTCTAGAACTCACCTGAGGAGAC-3';
SEQ ID NO: 46). Los extremos 3' de los fragmentos de PCR se
digieren con BstEII. Cada fragmento PCR luego se clona en un vector
de casete de cadena pesada HCcassREAL cortado con BstEII y el
cortador de extremo romo HincII. Los plásmidos resultantes son
intermedios a las construcciones de expresión final y son
denominados HCcassHVESP20 y HCcassHVQSP20, respectivamente. La
subclonación también conduce a un cambio en la secuencia líder que
está asociada a ambas de las regiones V_{H} de los vectores
originales. Mientras que la secuencia de aminoácido de la secuencia
líder vieja es MDWTWRVFCLLAVVAPGAHS (SEQ ID NO: 47), se ha
remplazado durante la subclonación con MAWVWTLPFLMAAAQSVQA (SEQ ID
NO: 48).
Los intermedios HCcassVHESP20 o HCcassVHQSP20 se
digieren con ScaI y posteriormente, los plásmidos se digieren con
BamHI y EcoRI. Los fragmentos 2.9 kb que contienen el promotor de
cadena pesada Ig y la región V_{H} se purifican y se ligan con el
fragmento de 8.7 kb de un fragmento de digerido BamHI y EcoRI de una
construcción de cadena pesada. Los plásmidos resultantes se
denominan HCVHESp20 (SEQ ID NO: 40; Figura 10) y HCVHQSp20 (SEQ ID
NO: 41; 11), respectivamente; y se utiliza para la expresión en
células Sp2/0 del anticuerpo humanizado VHE/humV1. VHQ/humV1.
Los vectores de expresión HCVHESp20 (SEQ ID NO:
40; Figura 10) y HCVHQSp20 (SEQ ID NO: 41; Figura 11), se utilizan
como plantillas para mutagenia dirigida de sitio para lograr una
mutación N73D, (intercambio de asparagina aspartato en la posición
73 del aminoácido de la cadena pesada del anticuerpo humanizado)
esta mutación elimina un sitio de N-glucosilación
putativo. La mutagenia se efectúa con el kit QuikChange®
Multi-Site Directed Mutagénesis (Stratagene) y el
cebador aCD45H-N73D (5'-fosfo
GCCACATAACTGCAGACAAATCCATCAGCACAGC-3'; SEQ ID NO:
49) de acuerdo con el manual del kit. La secuencia de las
construcciones resultantes HCVHEN73DSp20 y HCVHQN73DSp20 están
confirmadas y se describen como la SEQ NO: 37 y SEQ NO: 38, y las
figuras 8 y 9, respectivamente. HCVHEN73DSp20 (SEQ NO: 37) junto
con la construcción de expresión de cadena liviana LCVL1 Sp20 (SEQ
NO: 36) se utilizan para la expresión en las células Sp2/0 del
anticuerpo humanizado VHE-N73D/humV1.
La estirpe celular de mieloma de ratones Sp2/0
Ag14.10 se electroporan con vectores que codifican la cadena pesada
(HCVHEN73DSp20; SEQ ID NO: 37) y liviana (LCVL1S_{P}20; SEQ ID
NO: 36) del anticuerpo humanizado VHEN73D/humV1. Para transfección
se utilizan células en fase de crecimiento exponencial con una
viabilidad mayor del 95%. Las células se lavan dos veces con
amortiguador TF frío (272 mM de sacarosa, 1 mM de MgCl_{2}, 7 mM
de amortiguador de fosfato pH 7.4) y la concentración de la célula
se ajusta a 2 x 10^{7} célula/ml en un amortiguador TF. Se mezcla
0.8 ml de suspensión de célula con 15 \mug cada una de la
construcción del plásmido de cadena pesada y liviana y se colocan
sobre hielo durante 10 minutos. Se hacen 5 transfecciones mediante
electroporación utilizando el Biorad Gene Pulser (280 V y 25
\muF). Después de la electroporación las células se colocan sobre
hielo durante 15 minutos seguido por transferencia en 50 ml de un
medio de cultivo frío (medio basado en RPMI sin FCS) y se incuban
durante 2 días a 37ºC y 57% de CO_{2}.
Para la selección de los transfectantes, las
células se cultivan en la presencia de 1.1 mg/ml G418 (Geneticin,
Gibco lote 3069464) durante aproximadamente 2 a 3 semanas. El
marcador de amplificación de dhfr (dihidrofolato reductasa)
localizado sobre la construcción de cadena liviana permite la
amplificación del gen dhfr así como también el transgén mediante
metotrexato de ácido fólico (MTX). Para la amplificación del gen, se
cultivan células resistentes G418 en la presencia de 200 nM de MTX
durante un periodo de 2-3 semanas seguido por un
incremento adicional en la concentración de MTX a 1 \muM que
resulta un agrupamiento de células heterogéneas amplificadas. La
concentración del anticuerpo se determina mediante la proteína A
analítica HPLC. Se seleccionan los mejores grupos de producción
para clonación mediante dilución limitante, utilizando una densidad
de siembra de 0.3 células por pozo para aislar los clones
productores altos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Para determinar las concentraciones de IgG del
anticuerpo humano recombinado expresado en los sobrenadantes de
cultivo, se ha desarrollado y utilizado un protocolo de ELISA de
captura utilizando el IgG humano como estándar. Las placas
microtituladoras de 96 pozos de fondo plano (Cat. Nº
4-39454, Nunc Immunoplate Maxisorp) se recubren
durante toda la noche a 4ºC con 100 \mul de IgG anti humano de
cabra (molécula completa, Cat. Nº I1011, SIGMA) a la concentración
final de 0.5 \mug/ml en PBS. Los pozos son entonces lavados tres
veces con un amortiguador de lavado (PBS que contiene 0.05% de
Tween 20) y se bloquean durante 1.5 horas a 37ºC con un
amortiguador de bloqueo (0.5% de BSA en PBS). Después de tres ciclos
de lavado, las muestras del anticuerpo y del IgG humano estándar
(Cat. No. 14506, SIGMA) se preparan mediante dilución de 1.5 veces
en serie en el amortiguador de bloqueo. Se transfieren 100 \mul
de las muestras diluidas o estándar en duplicado a la placa de
cubierta y se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente. Después
de la incubación las placas se lavan 3 veces con amortiguador de
lavado y posteriormente incubadas durante 1 hora con 100 \mul de
cadena liviana Kapa de IgG antihumano de cabra conjugado con
peroxidasa de rábano (Cat. Nº A-7164, SIGMA) diluido
en 1/4000 en un amortiguador de bloqueo. Los pozos de control
reciben 100 \mul del amortiguador de bloqueo o medio de cultivo
normal concentrado. Después de lavado se efectúa la cuantificación
colorimétrica de la peroxidasa unida en la muestra y los pozos
estándar, utilizando el kit de TMB Peroxidase EIA Substrate (Cat. Nº
172-1067, Bio-Rad) de acuerdo con
las instrucciones del fabricante. La mezcla de peroxidasa se agrega
a 100 \mul por pozo y se incuba durante 30 min a temperatura
ambiente en la oscuridad. La reacción colorimétrica se detiene
mediante la adición de 100 \mul de ácido sulfúrico 1M y la
absorbancia de cada pozo se lee a 450 nm utilizando un lector de
placa ELISA (Modelo 3350-UV, BioRad).
Con un coeficiente de correlación de 0.998 para
la curva estándar IgG, se determinan las siguientes concentraciones
para los cuatro diferentes concentrados de cultivo (ca.
250-300 veces concentrado) obtenido de las células
COS transfectadas:
- Sobrenadante VHE/humV1 = 8.26 \mug/ml
- Sobrenadante VHE/humV2 = 6.27 \mug/ml
- Sobrenadante VHQ/humV1 = 5.3 \mug/ml
- Sobrenadante VHQ/humV2 = 5.56 \mug/ml
Los anticuerpos purificados por afinidad
VHE/humV1, VHE/humV2, VHQ/humV1 y VHQ/humV2 se analizan mediante
cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) sobre un TSK gel Super
SW3000SWXL con el fin de determinar el contenido de proteína, el
porcentaje de agregados pequeños (anticuerpos oligoméricos) así como
también subproductos posibles y productos de degradación. Los
cromatogramas muestran VHE/humV1, VHE/humV2, VHQ/humV1 y VHQ/humV2
cuyo pico principal se divide y que la separación es más pronunciada
para grupos con cadena pesada (figura 12). Los resultados sugieren
que existen al menos dos moléculas con un tiempo retención típico
para un anticuerpo IgG presente en cada muestra.
El análisis de las moléculas de unión CD45RO/RB
humanizadas VHE/humV1, VHE/humV2, VHQ/humV1 y VHQ/humV2 mediante
SDS-PAGE bajo condiciones reductoras (gel de
gradiente, 4 a 20% de gel Tris-Glicina, Novex)
muestran la presencia de una banda adicional no esperada, que migra
ligeramente por encima de la banda que corresponde a la banda de
cadena pesada en cada muestra.
La diferencia en masa se estimula por estar en
el rango de 2 a 4 kDa. El análisis "Western Blot" revela que
la banda superior se reconoce por los anticuerpos antihumanos (H +
L) que sugieren que la banda adicional es una variante de la cadena
pesada.
La heterogeneidad de la carga se evalúa mediante
la cromatografía de intercambio de cationes (CEX) utilizando una
columna polyCatA (PolyLC Inc). Mientras el mAb quimérico está
esencialmente libre de heterogeneidad de carga diferente de las
variantes de lisina CE-terminales, todas las
moléculas de unión CD45RO/RB humanizadas, es decir VHE/humV1,
VHE/humV2, VHQ/humV1 y VHQ/humV2, se consideran muy heterogéneas en
carga. Una razón común para la heterogeneidad de carga en los
anticuerpos en la presencia/ausencia de Lys en el extremo
C-terminal de la cadena pesada de un anticuerpo que
resulta en tres picos CEX. El alto número de picos visibles en cada
cromatograma (>10; figura 13) indica que al menos está presente
una modificación adicional en todas las cuatro moléculas de
CD45RO/RB.
Con el fin de evaluar las diferencias
moleculares entre las dos especies de anticuerpos encontradas en los
grupos de proteínas del VHE/humV1, VHE/humV2, VHQ/humV1 y
VHQ/humV2, se selecciona para ser adicionalmente analizado. Los dos
picos SEC del VHE/humV2 se recolectan en un modo semipreparativo y
se reanalizan mediante SEC para confirmar su pureza. Las fracciones
recolectadas mediante SEC (Fracción 1 y Fracción 2) luego se
analizan mediante SDS-PAGE bajo condiciones
reductoras. La proporción de la banda adicional no esperada en
aproximadamente 49 kDa es diferente entre las dos fracciones,
fracción dos es casi libre de esta banda mayor
adicional.
adicional.
Las fracciones SEC F1, F2 y el grupo de
proteínas del VHE/humV2 luego se analizan adicionalmente mediante
espectrometría de masa ESI-Q-TOF. En
los espectrogramas de la agrupación de proteínas y la Fracción 2, se
observan los mismos grupos de señales. El primer grupo de señales a
aproximadamente 148.000 Da, se encuentra en el grupo de proteínas y
la Fracción 2, no se detecta en la fracción 1. En la Fracción 1 un
segundo grupo de señales (aproximadamente 150.300 Da) se detectan
además de otro grupo de señales aproximadamente 152'500 Da. El
segundo grupo de señales aproximadamente 150.320 Da podría no estar
correlacionado con ningunas formas de anticuerpo usualmente
observadas. Estos hallazgos sugieren que los dos picos del SEC y las
dos bandas superiores del SDS-PAGE reducido
corresponden cada una a variantes de una proteína esperada.
Para obtener un patrón menos confiable en
espectrometría de masa, las cadenas del anticuerpo se analizan
adicionalmente de manera separada. Las fracciones se reducen y
alquilan. Con el fin de confirmar la terminación de la reacciones
las muestras reducidas y alquilatadas se analizan mediante
cromatografía de fase inversa (RP) (SORBAX, Poroshell
300SB-C8). Después de la reducción y la alquilación,
la forma del pico es casi la misma que después de solo la
reducción. Se observa un cambio en el tiempo de retención. Se
obtienen patrones similares para la Fracción 1 y la Fracción 2 del
SEC reducido y de las muestras alquilatadas. La muestra del
agrupamiento VHE/humV2, Fracción 1 SEC y Fracción 2 SEC (reducida y
alquilatada) se analiza con espectrometría de masa
ESI-Q-TOF. Varios picos de masa se
podrían asignar a formas de anticuerpo esperadas. La mayor muestra
de picos se encontró en todas las tres muestras (grupo de proteínas
F1 y F2) pero sus intensidades en la Fracción 2 son muy bajas
(figura 14).
(figura 14).
El anticuerpo reducido y alquilatado se inyecta
sobre columna de cromatografía de fase inversa (RP) y se recolectan
los dos picos que corresponden a las variantes de cadena pesada.
Luego se determinan los perfiles de oligosacáridos de estos
anticuerpos fraccionados RP. Entre los residuos de oligosacáridos G0
y G1 anticipados encontrados en todas las muestras, varios otros
picos se detectan en el cromatograma del Fracción 1 (rastros de
aquellos picos también son detectables en los cromatogramas de la
Fracción 2 y agrupamientos de proteínas).
Tomados juntos, los resultados sugieren que las
especies de anticuerpo mayor que contienen glucosilación adicional,
típicamente no encontrados en anticuerpos monoclonales expresados
SP2/0, que cuentan para la diferencia de masa. En razón a que la
glucosilación compleja larga encontrada mediante análisis de
carbohidrato y espectrometría de masa sería muy improbable para el
sitio de glucosilación conservado en la región constante del
anticuerpo, se hace una búsqueda para otros sitios posible en la
secuencia de aminoácido de los anticuerpos humanizados. Se
identifica un sitio de proteína (N73) para
N-glucosilación
(N-X-S) en el dominio de variable de
las dos variantes de cadena
pesada.
pesada.
Se efectúan análisis adicionales utilizando
material purificado del agrupamiento VHE/humV1. Para reducir la
heterogeneidad del material, la lisina -terminal-C
removida mediante tratamiento con carboxipeptidasa B. El anticuerpo
VHE/humV1 se fracciona mediante cromatografía de intercambió de
catión preparativo utilizando SP Sefarosa (Pharmacia). La columna
se equilibra con 25 mM de fosfato de sodio, pH 6.0 (= amortiguador
A) y la proteína unida se eluye con 250 mM de NaCl en el
amortiguador A (= amortiguador B; gradiente de 0-65%
B). La pureza de las fracciones se analiza al utilizarse CEX. Las
fracciones recolectadas se reinyectan sobre la columna SEC para
buscar una correlación entre los resultados obtenidos con las dos
técnicas. El cromatograma indica que el primer grupo de picos CEX
se correlaciona con el pre-pico en el análisis SEC
del anticuerpo, que el segundo grupo de picos en CEX conduce junto
con el primer pico de análisis SEC del agrupamiento de proteínas (o
Fracción 1), y que el último pico en CEX eluye el último pico en SEC
(o Fracción 2).
En conclusión, los resultados descritos
anteriormente (perfil de oligosacárido para las Fracciones SEC 1 y
2, patrón CEX obtenido después de descarboxilación, patrón SEC
obtenido para las fracciones recolectadas en CEX, espectrometría de
masa) sugiere fuertemente la presencia de especies de anticuerpo con
oligosacáridos complejos que originan a) heterogeneidad de masa,
que conduce a un doble pico en el SEC y b) la banda de cadena
pesada doble observada en heterogeneidad de carga
SDS-PAGE que conduce al patrón CEX.
En razón a que las mayores especies de
anticuerpo eluyen tempranamente sobre el CEX, que muestra que ellos
son menos posiblemente cargados, la presencia de ácido siálico (un
componente de la glucosilación de complejo y negativamente cargada)
se mide en las fracciones diferentes obtenidas mediante CEX
preparativos. El ácido siálico está presente en todas las 4
muestras con grados variantes. El ácido siálico encontrado es más
probablemente la forma ácida de
N-glicolil-neuramínico (con base en
el tiempo de retención más corto comparado con el estándar ácido de
N-acetilneuramínico). La muy baja presencia del
ácido siálico en una Fracción CEX en contraste a su muy alta
abundancia en otra Fracción CEX sugiere fuertemente que el
componente de azúcar negativamente cargado contribuye a la
heterogeneidad de masa/carga. Las Fracciones CEX se analizan
mediante espectrometría de masa
ESI-Q-TOF.
ESI-Q-TOF.
Las mismas fracciones también se analizan
mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras. Se
pueden concluir que la banda de la cadena pesada superior
corresponde a la porción del anticuerpo con un perfil de
oligosacárido complejo que contiene el ácido siálico. La banda de
cadena pesada inferior corresponde al anticuerpo esperado que
exhibe un perfil oligosacárido convencional.
Con el fin de confirmar el uso del sitio de
glucosilación potencial en el dominio de variable la cadena pesada,
alrededor de 1 mg de cada Fracción CEX se trata con papaína para
separar la parte Fab de la parte Fc del anticuerpo. La
cromatografía preparativa se efectúa sobre una columna
Mono-S. Cada una de la sub-Fracción
recolectada se reinyecta sobre la columna RP para identificar sus
contenidos en términos de los dominios Fab y/o Fc. Cada una de la
sub-Fracción recolectada luego se analiza con
espectrometría de masa ESIQ-TOF. Los resultados
obtenidos muestra que a) el sitio de glucosilación conservado en la
parte Fc de la cadena pesada está ocupado por formas de
oligosacárido bi-antenarias con ninguna (G0), una
(G1) o dos unidades de galatosa terminal (G2); b) que encontrase,
el sitio de glucosilación irregular (N73) lleva oligosacáridos
complejos que contienen ácido N-glicolil
neuramínico.
neuramínico.
En conclusión, el residuo de asparagina N73 en
el dominio variable de la cadena pesada se encontró que era
parcialmente N-glucosilado. Estas especies de azúcar
originan heterogeneidad de masa así como también heterogeneidad de
carga que son detectadas por la cromatografía de exclusión de tamaño
SDS-PAGE, y la cromatografía de intercambio de
catión.
Con el fin de eliminar la heterogenicidad de los
anticuerpos VHE/humV1, VHE/humV2, VHQ/humV1 y
VHQ/humV2 humanizados el residuo de asparagina en la posición N73 en el dominio variable de la cadena pesada se sustituye por un residuo de ácido aspártico (ver ejemplo 4). El VHE-N73D/humV1 luego se analiza adicional-
mente.
VHQ/humV2 humanizados el residuo de asparagina en la posición N73 en el dominio variable de la cadena pesada se sustituye por un residuo de ácido aspártico (ver ejemplo 4). El VHE-N73D/humV1 luego se analiza adicional-
mente.
El SEC se efectúa como se describió
anteriormente. Una diferencia clara entre el VHE/humV1 y
VHE-N73D /humV1 se observa en SEC. En contraste con
el pico doble obtenido del VHE/humV1, solamente se obtiene un pico
para el VHE-N73D/humV1 (Figura 12). Aproximadamente
se cuantifican 0.2% de agregados mediante SEC.
El VHE/humV2 y VHE-N73D/humV1 se
analizan adicionalmente mediante SDS-PAGE bajo
condiciones reductoras como se subrayó anteriormente. Solo es
visible una banda para el VHE-N73D/humV1 en la
posición de cadena pesada esperada (HC) (aproximadamente 50 kDa).
La banda HC observada para el VHE-N73D/humV1
corresponde a la banda inferior del doblete observado para el
VHE/humV2. La posición de la banda de cadena liviana es la misma
para la proteína analizada.
La cromatografía de intercambio de catión (CEX)
se efectúa como se subrayó anteriormente. Los resultados obtenidos
para el análisis CEX muestran que la heterogeneidad de carga del
VHE-N73D/humV1 se reduce a las variantes de Lisina
C-terminal (tres picos) comparadas con la
heterogeneidad de carga alta del VHE/humV2 (>10; Figura 13).
La masa detectada para la cadena pesada y la
cadena liviana obtenida mediante análisis MALDI TOF (espectrometría
de masa) están en acuerdo cercano con la masa esperada, deducida de
la secuencia de aminoácidos del VHE-N73D/humV1.
Después de la reducción con DDT los dos
anticuerpos humanizados VHE/humV2 y VHE-N73D/humV1
se analizan mediante cromatografía de fase inversa (RP). Debido a
la glucosilación parcial sobre la asparagina N73, dos "cadenas
pesadas" se observan para el VHE/humV2 (doble pico en
aproximadamente 18.5 min) entre el pico que corresponde a la cadena
liviana (a aproximadamente 17.3 min). Para
VHE-N73D/humV1, solo se observa un pico para la
cadena pesada (Figura 14).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
La estirpe de células T humana PEER se escoge
como la célula objetivo para el análisis FACS porque ésta expresa
el antígeno CD45 sobre su superficie celular. Para analizar la
afinidad de unión de los sobrenadantes del anticuerpo humanizado,
se efectúan los experimentos de competición que utilizan el
anticuerpo quimérico marcado FITC como una referencia y se comparan
con la inhibición del anticuerpo de ratón purificado y el anticuerpo
quimérico. Los cultivos de células PEER se centrifugan durante 10
segundos a 3000 rpm y el medio se remueve. Las células son
resuspendidas en amortiguador FACS (PBS que contiene 1% de FBS y
0.1% de azida sodio) y se siembra en una placa microtituladora con
fondo redondo de 96-pozos a una densidad de célula
de 1x10^{5} células por pozo. La placa se centrifuga y se
descarta el sobrenadante. Para estudio de bloqueo, 25 \mul de
medio no transfectado concentrado o anticuerpo de control ajustado
de isotipo (control negativo), anticuerpo de ratón no marcado, o
anticuerpo quimérico (control positivo) así como también
sobrenadantes concentrados que contienen las varias combinaciones
del anticuerpo humanizado (muestra), se agrega primero en cada pozo
a las concentraciones indicadas en el texto. Después de 1 hora de
incubación a 4ºC, las células PEER se lavan con 200 \mul de
amortiguador FACS mediante centrifugación. Las células son
posteriormente incubadas durante 1 hora a 4ºC con anticuerpo
quimérico conjugado con FITC en 25 \mul de amortiguador FACS a una
concentración final de 20 \mug/ml. Las células se lavan y se
re-suspenden en 300 \mul de amortiguador de FACS
que contiene 2 \mug/ml de yoduro de propidio el cual permite la
regulación de las células viables. Las preparaciones de células se
analizan sobre un citómetro de flujo (FACSCalibur, Becton
Dickinson).
Dickinson).
Los análisis FACS indican un bloque dependiente
de dosis de anticuerpo quimérico marcado con fluorocromo por los
sobrenadantes del cultivo de anticuerpo humanizado concentrado. No
se ve un bloque dependiente de dosis de la unión del anticuerpo
quimérico con el anticuerpo de control ajustado con isotipo, que
indica que el efecto de bloqueo por las diferentes combinaciones
del anticuerpo humanizado es específico del epítopo y que la
especificidad del epítopo parece ser retenida después del proceso de
humanización.
El sobrenadante no diluido de los transfectantes
SP2/0 anteriormente mencionados o el anticuerpo quimérico
(controles positivos) o isotipo o el anticuerpo de control ajustado
con isotipo (controles negativos) a 2 \mug/ml en medio de cultivo
se incuban con 1.5x10^{5} de célula PEER en 100 \mul durante 30
min a 4ºC. Luego, 100 \mul de PBS que contienen el anticuerpo
quimérico marcado con FITC se agregan a cada muestra y la
incubación a 4ºC continúa durante otros 30 minutos. Después del
lavado, las células se resuspenden en FACS-PBS que
contiene 1 \mug/ml de
7-Amino-Actinomicina D y se analizan
mediante citometría de flujo utilizando un instrumento FACSCalibur
Becton Dickinson y el software CellQuest Pro. La regulación es sobre
células vivas, es decir evento
7-Amino-Actinomicina D -
negativo.
Los análisis FACS muestran que las moléculas de
unión CD45RB/RO humanizadas no marcadas, por ejemplo VHE/humV1 y
VHQ/ humV1 pero no el anticuerpo de control ajustado con isotipo
compiten con el anticuerpo quimérico marcado con FITC para unir a
la estirpe de células T positiva CD45 humana PEER.
Para evaluar si la modificación de la molécula
de unión CD45R0/RB humanizada VHE/humV1, es decir el intercambio de
la asparagina a aspartato en la posición 73 de aminoácido de la
cadena pesada de la molécula de unión CD45RO/RB, modificada la
reactividad con el epítopo consanguíneo, la reactividad del VHE
N73D/humV1 con una estirpe de células T humana que expresa CD45 de
PEER se analiza en un experimento de unión de competición.
Las célula PEER se incuban con
VHE-N73D/humV1, con su predecesor quimérico o con un
anticuerpo IgG1 de control de isotipo de no unión. El anticuerpo no
unido se lava y las células se someten a una incubación con
anti-CD45R0/RB quimérico marcado con fluorocromo
fluoresceína isotiocianato (FITC) o el anticuerpo de control IgG1
del isotipo marcado con FITC. Después de lavado, las células se
someten a análisis de citometría de flujo para cuantificar la
cantidad de anticuerpo marcado con FITC unido a la célula PEER
pre-incubadas: los cultivos de célula PEER se
centrifugan durante 10 min a 400 veces la fuerza de gravedad
estándar (g) y el medio se remueve. Las células se resuspenden en
amortiguador de FACS (PBS que contiene 1% v/v de FBS, 0.1 v/v de
EDTA y 0.1% v/v de azida de sodio) y se siembra en placas
microtituladoras de fondo en V de 96 pozos a una densidad celular de
1x10^{5} células por pozo. La placa se centrifuga y se descarta
el sobrenadante. Cada muestra de las células se incuba durante 30
minutos a 4ºC en 50 \mul de amortiguador FACS que contiene 20
\mug/ml de anti-CD45R0/RB mAb,
VHE-N73D/humV1 o el control IgG1 Ab quimérico.
Luego, las células PEER se lavan dos veces con 150 \mul de
amortiguador FACS mediante centrifugación. Las células se incuban
posteriormente durante 30 minutos a 4ºC en 50 \mul de
amortiguador FACS que contiene 20 \mug/ml del mAb quimérico
conjugado con FITC o del control Ab 3G5 conjugado con FITC.
Finalmente, las células se lavan y se resuspenden en 200 \mul de
amortiguador FACS que contiene 7-amino Actinomicina
D (7-AAD) a 1 \mug/ml, que sigue la identificación
de las células viables durante análisis. La preparación de la
célula se analiza sobre un Citometría de flujo FACSCalibur (Becton
Dickinson).
Se observa que el VHE-N73D/humV1
no marcado y el anti-CD45R0/RB mAb quimérico no
marcado pero no el anticuerpo de control IgG1 evitan que se unieran
el anti-CD45R0/RB mAb quimérico marcado con FITC a
las células PEER que expresan CD45 tal como se determina por una
señal de fluorescencia disminuida. En conclusión, se encontró que
la modificación del anticuerpo VHE/humV1 al
VHE-N73D/humV1 no cambia la especificidad del
epítopo de la molécula de unión anti-CD45R0/RB
humanizada.
Para determinar la afinidad del anticuerpo
VHE-N73D/humV1 por su epítopo, la reactividad del
VHE-N73D/
humV1 con una estirpe de células T que expresa CD45 humano PEER o la estirpe de células T que expresa CD45 del macaco HSC-F se pueden cuantificar en un experimento de unión de competición, similar al procedimiento descrito en Daley et al., 1995; J. Mol. Biol. 253:243.
humV1 con una estirpe de células T que expresa CD45 humano PEER o la estirpe de células T que expresa CD45 del macaco HSC-F se pueden cuantificar en un experimento de unión de competición, similar al procedimiento descrito en Daley et al., 1995; J. Mol. Biol. 253:243.
En resumen, la intensidad de teñido del PEER o
las células HSC-F con un anticuerpo marcado con FITC
en la presencia de varias concentraciones del anticuerpo competidor
no marcado de utiliza para calcular las afinidades de los
anticuerpos no marcados. Más precisamente, en una primera etapa, se
mide la concentración y la estequiometría que marca el fluorocromo
del anticuerpo CD45RB/RO anti-humano derivado de
ratón marcado con FITC A6 (mA6). Luego, la concentración de la
molécula objetivo, CD45, sobre la superficie del PEER o la estirpe
celular HSC-F se determina con la ayuda del
anticuerpo mA6 conjugado con FITC anteriormente mencionado
(anti-huCD45 derivado de ratón) y utilizando
glóbulo fluorescentes con un grado de marcación molecular conocido.
Con la concentración de los receptores CD45 celulares y su ligando
conjugado a FITC conocido, la afinidad del mA6 conjugado al FITC a
los receptores CD45 celulares se determina mediante un procedimiento
de titulación de equilibrio a base de FACS. Finalmente, la afinidad
del anticuerpo no marcado VHE-N73D/humV1 se
determina de las reacciones de teñido de competición con el mA6
conjugado a FITC sobre PEER o las células HSC-F que
miden el incremento en la fluorescencia del FITC como una función
de la concentración total del VHE-N73D/humV1. Si la
ecuación cúbica que representa la descripción algebraicamente
explicita de equilibrios de unión en una mezcla de dos ligandos de
competición que se unen a un receptor se implementa en el programa
Origin 7.5, el programa de software se utiliza para calcular el
valor de constante de disociación (Kd) para el
VHE-N73D/humV1 luego de los análisis de ajuste de
la curva
reiterativa.
reiterativa.
En un experimento la constante de disociación
del VHE-N73D/humV1 para el objetivo celular PEER
humano se calcula como 2.44 \pm 0.07 nM - para el objetivo de las
células HSC-F macaco se calcula como 1.67 \pm 0.00
nM, asumiendo la unión del anticuerpo divalente a las moléculas
CD45RO/RB objetivo.
\newpage
Ejemplo
7
En este estudio, hemos considerado si el
anticuerpo quimérico de unión CD45RB/RO, cuando está presente en
los cultivos de las células T humanas primarias policlonalmente
activadas (i) soporta la diferenciación de las células T con un
fenotipo Treg característico, (ii) evita o mejora la apoptosis que
sigue a la activación de la célula T, y (iii) afecta la expresión
de los antígenos y receptores específicos de subconjunto después de
la estimulación.
Células T primarias (mezclas de subconjuntos T
de CD4^{+} y CD8^{+}) se someten a activación mediante
anti-CD3 más anti-CD28 mAb (200
ng/ml cada uno) en la presencia o ausencia (=control) del anticuerpo
quimérico que se une a CD45RB/RO. Los anticuerpos de exceso se
remueven mediante lavado en el día 2. El
7-amino-Actinomicina D
(7-AAD) como un tinte de teñido de ADN tomado por
las células apoptósicas y necrótica se utiliza para medir la muerte
celular luego de la actividad. Los resultados muestran la activación
de las células T en la presencia del anticuerpo quimérico que se
une a CD45RB/RO y se incrementa la fracción de las células positivas
7-AAD que dos veces en el día 2 después de la
activación. En el día 7, la porción de las células positivas
7-AAD es de nuevo similar en los cultivos tratados
con anticuerpo quimérico que se une CD45RB/RO y los cultivos de
control.
La expresión incrementada de CD25 y la proteína
reguladora negativa CTLA-4 (CD152) es un marcador de
célula Treg. La supresión funcional de las respuestas de células T
primarias y secundarias mediante el anticuerpo quimérico que se une
a CD45RB/RO puede ser debido a la inducción de las células Treg.
Para manejar este tema, las células T se activan mediante
anti-CD3 ^{+} CD28 mAbs y cultivadas en la
presencia del anticuerpo quimérico que se une a CD45RB/RO o del mAb
de control unión anti-LPS. El curso de tiempo de la
expresión CTLA-4 y CD25 revela diferencias marcadas
entre los controles y las células T tratadas con anticuerpo
quimérico que se unen a CD45RB/RO en los días 1 y 3 después de la
estimulación secundaria, que indica un fenotipo Treg.
Se ha reportado que cantidades sustanciales de
CTLA-4 también se pueden encontrar
intracelularmente. Por lo tanto, en paralelo al teñido con el
CTLA-4 de superficie, se analiza la expresión
CTLA-4 intracelular. Se ven diferencias moderadas
entre los cultivos de célula T en el día 4 después de la
estimulación. Después de un cultivo prolongado, sin embargo, altos
niveles de CTLA-4 intracelular se sostienen
solamente en las células T tratadas con anticuerpo quimérico que se
une a CD45RB/RO pero no a las células T de control.
Luego de la estimulación, las células T inducen
y regulan en forma ascendente la expresión de varios receptores de
superficie, tal como el CD25, CD152 (CTLA-4), CD154
(ligando CD40) y otros. En contraste, el nivel de expresión de CD4
o CD8 se cree que permanece relativamente constante. Nosotros
observamos reproduciblemente un fuerte incremento tanto en el
antígeno CD4 y CD8 sobre las células T tratadas con anticuerpo
quimérico que se une a CD45RB/RO pero no sobre las células T
tratadas con Ab de control después de activación. La emergencia de
la población de la célula T positiva doble CD4/CD8 parece ser debida
a la regulación en forma ascendente del CD4 sobre el subconjunto
CD8^{+} y al contrario, el CD8^{+} sobre el subconjunto
CD4^{+}. Esto contrasta con un porcentaje moderadamente bajo de
células T positivas dobles en los cultivos de control.
La células Treg se conocen por ser
constitutivamente positivas para el CD25, la cadena alfa receptoria
IL-2. La regulación de otras subunidades del
receptor IL-2 trimétrico sobre las células Treg no
se conoce. Recientemente hemos comparado la expresión de la cadena
beta del receptor IL-2, por ejemplo CD122, sobre las
células T activadas y propagadas en la presencia o ausencia del
anticuerpo quimérico de unión CD45RB/RO. Los resultados muestran
que las células T tratadas con anticuerpo quimérico que se une a
CD45RB/RO tienen aproximadamente diez veces menos expresión de
CD122 comparadas con la células T en los cultivos de control. Esta
diferencia puede indicar que las celular Treg requieren otros
factores que el IL-2 para proliferar.
\newpage
Ejemplo
8
SEQ ID NO: 1
Parte de la secuencia de aminoácido de la cadena
liviana quimérica
SEQ ID NO: 2
Parte de la secuencia de aminoácido de la cadena
pesada quimérica
SEQ ID NO: 3
Secuencia de aminoácidos de la cadena liviana
quimérica
SEQ ID NO: 4
Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada
quimérica
SEQ ID NO: 5
Secuencia de nucleótido que codifica un
polipéptido de la SEQ ID NO: 1
\newpage
SEQ ID NO: 6
Secuencia de nucleótido que codifica un
polipéptido de la SEQ ID NO: 2
SEQ ID NO: 7
Parte de la secuencia de cadena liviana
humanizada designada hum V2 (humV2 = VLm)
SEQ ID NO: 8
Parte de la secuencia de aminoácido de cadena
liviana humanizada designada hum V1 (humV1 = Vlh)
SEQ ID NO: 9
Parte de la secuencia de aminoácido de cadena
pesada humanizada designada VHE
SEQ ID NO: 10
Parte de la secuencia de aminoácido de cadena
pesada humanizada designada VHQ
SEQ ID NO: 11
Secuencia de nucleótido que codifica la
secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 9
\newpage
SEQ ID NO: 12
Secuencia de nucleótido que codifica la
secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 13
Secuencia de nucleótido que codifica la
secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 14
Secuencia de nucleótido que codifica la
secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 8
\newpage
SEQ ID NO: 15
Secuencia de nucleótido del vector de expresión
HCMV-G1 HuA6-VHQ (secuencia de ADN
completa de un vector de expresión de cadena pesada humanizada que
comprende la SEQ ID NO: 12 (VHQ) de 3921-4274)
\newpage
SEQ ID NO: 16
Secuencia de nucleótido del vector de expresión
HCMV-G1 HuA6-VHE (secuencia de ADN
completa de un vector de expresión de cadena pesada humanizada que
comprende la SEQ ID NO: 11 (VHE) de 3921-4274)
\newpage
SEQ ID NO: 17
Secuencia de nucleótido del vector de expresión
HCMV-K HuAb-VL1 hum V1 (secuencia de
ADN completa de un vector de expresión de cadena liviana humanizada
que comprende la SEQ ID NO: 14 (hum V1 = VLh) de
3964-4284)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 18
Secuencia de nucleótido del vector de expresión
HCMV-K HuAb-VL1 hum V2 (secuencia de
ADN completa de un vector de expresión de cadena liviana humanizada
que comprende la SEQ ID NO: 13 (hum V2 = VLm) de
3926-4246)
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 31
Parte de la secuencia de cadena pesada
humanizada designada VHE-N37D
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 32
Parte de la secuencia de cadena pesada
humanizada designada VHQ-N73D
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 33
Secuencia de nucleótido que codifica una
aminoácido de la SEQ ID NO: 8
SEQ ID NO: 34
Secuencia de nucleótido que codifica un
aminoácido de la SEQ ID NO: 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 35
Secuencia de nucleótido que codifica un
aminoácido de la SEQ ID NO: 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 36
Secuencia de nucleótido de la expresión del
vector LCVL1Sp20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 37
Secuencia de nucleótido de la expresión del
vector HCVHEN73DSp20
\newpage
SEQ ID NO: 38
Secuencia de nucleótido de la expresión del
vector HCVHQN73DSp20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 39
Secuencia de nucleótido de la expresión del
vector LCVL2Sp20
\newpage
SEQ ID NO: 40
Secuencia de nucleótido de la expresión del
vector HCVHESp20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 41
Secuencia de nucleótido de la expresión del
vector HCVHQSp20
Ejemplo
9
Para determinar la eficacia de los anticuerpos
humanizados que se unen a CD45RO/RB VHE/humV1 y VHQ/
humV1 en comparación con el anticuerpo quimérico se analiza la capacidad para inducir apoptosis en las células T humanas y también la capacidad para inhibir la proliferación de célula T humana.
humV1 en comparación con el anticuerpo quimérico se analiza la capacidad para inducir apoptosis en las células T humanas y también la capacidad para inhibir la proliferación de célula T humana.
Las células mononucleares de sangre periférica
(PBMC) se aíslan de las muestras de leucoféresis y los donantes
humanos saludables con un tipo de sangre conocido, pero tipo HLA
desconocido mediante centrifugación sobre
Ficoll-Hypaque (Pharmacia LKB). El PBMC utilizado
como estimulador se vacía primero de las células T y NK al utilizar
glóbulos ferromagnéticos recubiertos con CD3 (Miltenyi). Los
glóbulos y las células contaminantes se remueven mediante campo
magnético. El PBMC agotado de célula T se utilizan como células
estimuladoras después de la irradiación (50 Gy). Las células T
CD4^{+} son utilizadas como células de respuesta en el MLR y se
aíslan del PBMC con un kit de selección negativo de células CD4
(Miltenyi).
Las células obtenidas se analizan mediante
FACScan o FACSCalibur (Becton Dickinson & Co., CA) y la pureza
de las células obtenidas es de >75%. Las células se suspenden en
un medio RPMI1640 complementado con 10% de FCS, inactivado
caliente, penicilina, estreptomicina y
L-glutamina.
El PBMC humano de los tres donantes voluntarios
saludables se cultiva en un medio de crecimiento (RPMI1640+
10% de FCS) durante toda la noche (<16h) en presencia del mAb quimérico que se une al CD45R0/RB, los anticuerpos humanizados (VHE/humV1 y VHQ/humV1) o el mAb de control anti-LPS. Si se indica, un reactivo de reticulación, el fragmento F(ab')_{2} de IgG anti-humano de cabra (Cat.No.109-006-098, JacksonLab) se incluye a un \mug/ml de concentración que es dos veces tan alto como la concentración de anticuerpos anti-CD45 de la muestra. La concentración de PBS en todos los pozos introducida por los reactivos del anticuerpo se mantiene constante entre todas las muestras, a saber a 20% (v/v) para las muestras sin reticulador o a 40%(v/v) para las muestras con reticulador. Experimentos anteriores demuestran que la cantidad de PBS no afecta la lectura.
10% de FCS) durante toda la noche (<16h) en presencia del mAb quimérico que se une al CD45R0/RB, los anticuerpos humanizados (VHE/humV1 y VHQ/humV1) o el mAb de control anti-LPS. Si se indica, un reactivo de reticulación, el fragmento F(ab')_{2} de IgG anti-humano de cabra (Cat.No.109-006-098, JacksonLab) se incluye a un \mug/ml de concentración que es dos veces tan alto como la concentración de anticuerpos anti-CD45 de la muestra. La concentración de PBS en todos los pozos introducida por los reactivos del anticuerpo se mantiene constante entre todas las muestras, a saber a 20% (v/v) para las muestras sin reticulador o a 40%(v/v) para las muestras con reticulador. Experimentos anteriores demuestran que la cantidad de PBS no afecta la lectura.
Después de cultivo durante toda la noche en la
presencia de los anticuerpos, las muestras se someten a análisis de
citometría de flujo y a teñido con la AnnexinaV-FITC
marcador de apoptosis (Cat.No. 556419, BD/Pharmingen) y el marcador
de célula T CD2-PE (Cat.No. 556609, BD/Pharmingen).
Las muestras se corren en un instrumento FACSCalibur de Becton
Dickinson y los datos se analizan utilizando un software CellQuest
Pro.
A partir de los datos recolectados, las curvas
se obtienen utilizando el software Origin v7.0300 La ecuación
utilizada para el ajuste es
A_{1}: valor final (para las sesiones de
ajuste establecidas en "compartido" y "flotante")
A_{2}: valor inicial (para las sesiones de
ajuste establecidas en "compartido" y "flotante")
P: poder
X_{0}: ED_{50}; IC_{50} (ver
adelante).
\vskip1.000000\baselineskip
En ausencia del reticulador, el VHE/humV1 es más
efectivo, con un valor ED_{50} de 148\pm71 nM, seguido por
VHQ/humV1 con 377\pm219 nM. El anticuerpo quimérico que se une
CD45R0/RB es menos efectivo con un valor ED_{50} de 2440\pm1205
nM.
En la presencia de antisuero de reticulación,
los valores ED_{50} se cambian dramáticamente hacia mayor
eficacia por al menos dos órdenes de magnitud. Además, la presencia
de un reticulador permite mayores niveles de apoptosis a muy altas
concentraciones de anticuerpo, alcanzando ahora hasta el 80%
mientras que la ausencia del reticulador solo permite hasta el 50%
de apoptosis. En la presencia del reticulador, las curvas
(concentración de anticuerpo/% apoptosis) son
bi-modales con dos mesetas: la primer meseta se
alcanza a bajas concentraciones de anticuerpo (\sim5 nM),
mientras que el nivel de apoptosis corresponde al nivel máximo
obtenido en ausencia de reticulador. En la segunda meseta se
alcanza la concentración más alta de anticuerpo para (\sim500 nM)
y se observa apoptosis dentro del 70-80% de la
población de célula T.
Ambos mAb humanizados que se unen a CD45R0/RB
son igualmente efectivos y mejor o iguales comparados con el mAb
quimérico que se une a CD45R0/RB con respecto a su capacidad para
inducir apoptosis a células T humanas primarias.
Uno x 10^{5} PBMC o 5 x 10^{4} de las
células CD4+ se mezclan con PBMC irradiado del que se han agotado
1x 10^{5} o 5 x10^{4} células T (50 Gy) en cada pozo de placas
de cultivo de 96 pozos en la presencia o ausencia de diferentes
concentraciones de mAb.
Las células mezcladas se cultivan durante 5 días
y se determina la proliferación al pulsar las células con
^{3}H-timidina durante las últimas
16-20 horas de cultivo. La inhibición MLR en cada
concentración de anticuerpo se expresa como la inhibición
porcentual como se describió en el ejemplo 2.
El efecto de incrementar las concentraciones de
VHE/humV1 y VHQ/humV1 sobre MLR se evalúa en el respondedor 3:
combinaciones estimuladoras. Todos los anticuerpos inhiben el MLR de
una manera dependiente de dosis. Los valores IC_{50} (ver
anteriormente) son similares para el Ab VHE/humV1 (7 \pm 7 nM) y
VHQ/humV1 (39 \pm 54 nM) humanizados. Ambos anticuerpos
humanizados son más potentes para inhibir el MLR que el anticuerpo
quimérico parental (IC_{50} de 347 \pm 434 nM). Como se ve
usualmente con los experimentos MLR, la variabilidad del donante es
alta en estos experimentos.
Para manejar el efecto biológico del
VHE-N73D/humV1 que induce apoptosis en las células
mononucleares periféricas sanguíneas humanas (PBM) los PBMC
objetivo se incuban durante toda la noche en presencia de varias
concentraciones de VHE-N73D/humV1 y se analizan
posteriormente para unión del marcador de apoptosis AnnexinV
mediante análisis de citometría de flujo. Los PBMC se incuban
durante toda la noche en medio de cultivo de tejido que tiene
varias concentraciones del VHE-N73D/humV1 u otra
variante de la molécula que se une a CD45RO/RB humanizado,
VHE/humV1, o el anti-CD45RO/RB mAb quimérico o un
mAb de control IgG1 isotipo. Además, se agregan los fragmentos
F(ab')_{2} de reticulación del IgFc antihumano de cabra a 2
x la concentración de masa de cada mAb, semejando reticulación del
anticuerpo humanizado CD45RO/RB mediante los receptores Fc que
pueden ocurrir in vivo. Al siguiente día las células se
lavan mediante centrifugación durante 10 min a 400 veces la gravedad
estándar y el medio removido. Las células se suspenden en el
amortiguador FACS (PBS que contiene el 1% v/v de FBS, 0.1% w/v de
EDTA y 0.1% w/v de azida sodio) y se siembran en placas
microtituladoras con un fondo de 96 pozos con una densidad celular
de 1x10^{5} células por pozo. Cada muestra de célula se incuba
durante 30 minutos a 4ºC en 50 \mul de amortiguador FACS que
contiene 100 \mug/ml de suero de ratón normal para bloquear
sitios de unión no específicos sobre las células con CD2 conjugado a
ficoeritrina (PE) para identificar las células T humanas. Después
de lavar dos veces mediante centrifugación, las células se
resuspenden en 100 \mul de amortiguador que tiñe AnnexinV
"calcium-proficient" (Vendor BD/Pharmingen kit
556419) que contiene 1:100 v/v de AnnexinV marcada con FITC. Luego
de la incubación durante 15 minutos a temperatura ambiente en la
oscuridad, se agrega 7-amino actinomicina D
(7-AAD) para dar una concentración final de 1
\mug/ml y se analiza utilizando un citómetro de flujo FACS
Calibur (Becton Dickinson). Los valores ED_{50} para la eficacia
de los anticuerpos para inducir apoptosis se puede calcular de los
análisis de la cantidad de apoptosis (= intensidad de la
fluorescencia de AnnexinV-FITC) inducida como una
función de la concentración del anticuerpo utilizando el software
Origin 7.5 con una ecuación de ajuste de curva
sigmoidal/Logística.
Luego de tales análisis se observa un efecto
bifásico de todos los anticuerpos humanizados CD45RO/RB probados: a
bajas concentraciones de anticuerpo, se encuentra un bajo nivel de
menos de 30% de apoptosis de célula T. El valor ED_{50} para
alcanzar el nivel de esta apoptosis se calcula como 0.31 \pm 0.13
nM para VHE-N73D/humV1. A mayores concentraciones
de anticuerpo, la apoptosis se puede inducir hasta en el 70% de las
células T. El valor ED_{50} para alcanzar este mayor nivel de
apoptosis se calcula como 352 \pm 83 nM para
VHE-N73D/humV1. En resumen, se encuentra que el
VHE-N73D/humV1 también induce apoptosis en células T
humanas, que se puede mejorar mediante reticulación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
La molécula CD45 se expresa sobre todos los
leucocitos. Sin embargo, diferentes isoformas CD45 se expresan
mediante varios subconjuntos de leucocitos. Con el fin de determinar
la reactividad del subconjunto de leucocitos de la molécula de
anticuerpo quimérico que se une a CD45RB/RO se efectúa la marcación
inmunofluorescente de los leucocitos humanos con marcadores
específicos de subconjunto y marcación inmunofluorescente simultánea
con el anticuerpo quimérico que se denomina CD45RB/RO conjugado con
tinte, seguido por análisis de citometría de flujo.
Los subconjuntos específicos para una
preparación recientemente aislada de células mononucleares de sangre
periférica humana (PBMC), plaquetas humanas, neutrófilos de sangre
periférica humana o citoblastos hematopoyéticas derivadas de la
ósea humana se identifican mediante incubación con anticuerpos
acoplados a ficoeritrina contra CD2 (linfocitos T), CD14
(monocitos), CD19 (linfocitos B), CD34 (células madre), CD42a
(plaquetas), CD56 (linfocitos citolíticos naturales) o CD66b
(granulocitos). La unión simultánea de una molécula de unión
CD45RB/RO quimérica marcada con FITC se detecta sobre los
linfocitos, monocitos, células madre, linfocitos citolíticos
naturales y granulocitos pero no sobre las plaquetas o los
linfocitos B.
Con el fin de determinar la reactividad del
subconjunto de leucocitos de la marcación inmunofluorescente del
VHEN73D/humV1 de los leucocitos marcados con marcadores específicos
e inmunofluorescencia simultánea se efectúa la marcación con un
VHEN73D/humV1 conjugado con tinte, seguido por análisis de
citometría de flujo.
En resumen, los subconjuntos específicos de una
preparación recientemente aislada de células mononucleares de
sangre periférica humana (PBMC) o neutrófilos de sangre periférica
humana se identifican luego de la incubación con los anticuerpos
acoplados a ficoeritrina contra CD3, CD4, CD8 (linfocitos T), CD14
(monocitos), CD16 (linfocitos citolíticos naturales y monocitos),
CD19 (linfocitos B), o CD66b (granulocitos). La unión simultánea del
VHE-N73D/humV1 marcada con el FITC se detecta sobre
los linfocitos T, monocitos, células madre, linfocitos citolíticos
naturales y granulocitos pero no sobre los linfocitos B. Así, las
moléculas de VHE-N73D/humV1 no reaccionan con los
linfocitos B humanos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
11
Para demostrar la capacidad de un anticuerpo
quimérico que se une a CD45RO/RB para inducir las células T
supresoras, el anticuerpo está incluido en varias concentraciones
durante la generación de las estirpes celulares T CD8+ reactivas
con la proteína matriz de antígeno 1 (MP1) del hemófilo de la
influenza. Estas estirpes son generadas a través de
co-cultivo repetido de los linfocitos humanos CD8+
con los monocitos humanos CD14+ pulsados con el antígeno.
Posteriormente, los monocitos CD14+ se pueden reemplazar con una
estirpe celular positiva de antígeno-2 de leucocito
humano como una célula que presenta antígeno MP1 (APC). Si tales
células T CD8+ específicas de MP1 provenientes de un cultivo
contienen el anticuerpo quimérico que se une al CD45RO/RB se mezclan
con células T CD8+ humanas recientemente aisladas y esta mezcla de
células se estimula con el antígeno MP1 sobre el APC, la adición de
las células T CD8+ del cultivo en la presencia de la molécula
CD45RO/RB es capaz de reducir la producción de
IFN-gama en una forma dependiente de dosis de
anticuerpo. Ningún anticuerpo quimérico que se una al CD45RO/RB
está presente durante este cultivo de ensayo y
FIN-gama indicando que el
pre-tratamiento con el CD45RO/RB ha inducido
células T CD8+ capaces de suprimir la activación de células T
recientemente aisladas. En razón de esta inducción de las células
reguladoras T supresoras por medio del anticuerpo quimérico que se
une a CD45RO/RB, el anticuerpo puede ser útil en enfermedades, donde
una población de células T desreguladas y/o activadas se cree que
contribuye a la patología. Ejemplos de tales enfermedades incluyen
enfermedades autoinmunes, enfermedades por rechazo, soriasis,
enfermedad inflamatoria del intestino y alergias.
Para demostrar la capacidad de una molécula que
se une a CD45RO/RB quimérica para hacer que las células T tengan
hiporespuesta (anérgica) a estimulación adicional es decir para
paralizar funcionalmente las células T, el anticuerpo está incluido
durante la generación de las estirpes celulares CD8+ reactivas con
la proteína de matriz de antígeno 1(MP1) del hemófilo de la
influencia como se subrayó anteriormente. La parálisis se evalúa al
activar las células T (expuestas antes al anticuerpo quimérico que
se une a CD45RO/RB) con el antígeno MP1 presentado por la molécula
que se une al APC Nº CD45RO/RB está presente en este cultivo. Las
células CD8+ T no expuestas al anticuerpo quimérico que se une al
CD45RO/RB previamente producen IFN-\gamma luego
del estímulo mencionado. En contraste, las células CD8+ T
pretratadas con anticuerpo quimérico que une CD45RO/RB muestran una
producción marcadamente reducida a inexistente de esta citocina en
respuesta al estímulo de antígeno, que demuestra la capacidad del
anticuerpo quimérico que se une a CD45RO/RB al paralizar
funcionalmente las células T humanas. En razón de la inducción de
la hiperrespuesta a la célula T funcional por la molécula que se
une a CD45RO/RB, el anticuerpo se puede utilizar en enfermedades,
tales como enfermedades autoinmunes tales como rechazo por
trasplante, soriasis, dermatitis, enfermedad inflamatoria del
intestino o alergias donde se cree que una población de células T
activadas contribuyen a la patología.
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Ejemplo
12
El beneficio terapéutico del anticuerpo
quimérico que se une a CD45RB/RO en inflamación de piel se prueba
utilizando ratones SCID. La piel humana proveniente de individuos
normales se trasplanta sobre ratones SCID (Skin
SCID-hu) y el proceso inflamatorio se semeja
mediante transferencia adoptiva de los leucocitos mononucleares
aislados de los individuos humanos no relacionados con el donante de
la piel humana.
Dos piezas pequeñas (1 cm^{2}) de piel adulta
humana (obtenida del West Hungarian Regional Tissue Bank; WHRTB,
Gyor) que consiste de la epidermis completa, la dermis papilar y
parte de la dermis reticular, se trasplantan a los lados trasero
superior derecho e izquierdo en los ratones SCID. Los ratones C.B 17
/GbmsTac-Prkdc^{scid} Lyst^{bg} (Taconic,
Germantown, NY) en reemplazo de la piel del ratón. La calidad de los
injertos se monitorea durante 5-6 semanas
siguientes al trasplante y los ratones con trasplante exitoso
(ratones Skin SCID-hu, generalmente > 85%) se
seleccionan para pruebas in vivo del anticuerpo quimérico que
se une al CD45RB/RO.
Los leucocitos mononucleares (Spl) se aíslan de
biopsias de bazo de adulto humano (WHRTB, Gyor) después de la
suspensión de células (utilizando un tamiz de disociación de célula
equipado con una malla de tamaño 50) y los procedimientos de
gradiente de densidad estándar. Las alícuotas de \sim5 x10^{8}
Spl se resuspenden en 1.5 ml de RPMI-10% de FCS y
se inyectan intraperitonealmente (i.p.), en el día experimental 0,
en los ratones Skin SCID-hu. Estos números Spl se
han encontrado en experimentos previos por ser suficientes para
inducir un xeno-GvHD letal >90% de los ratones
dentro de las 4-6 semanas después de la trasferencia
celular.
Los ratones Skin SCID-hu,
reconstituidos con Spl humano, se tratan con anticuerpo quimérico
que se une a CD45RB/RO o con el control anti-LPS
mAb en el día 0, inmediatamente después de la inyección de célula
mononuclear, en los días 3 y 7 y a intervalos semanales
posteriormente. Los anticuerpos se suministran subcutáneamente
(s.c.) en 100 \mul de PBS a una concentración final de 1 mg/kg de
peso de cuerpo (b.w.).
La eficacia del anticuerpo quimérico que se une
al CD45RB/RO se evalúa mediante la supervivencia de los ratones
trasplantados y al monitorear el rechazo de los injertos de piel. La
significancia de los resultados se evalúa mediante el método
estadístico de análisis de supervivencia utilizando la prueba
Log-rank (método Mantel) con la ayuda del software
Systat v10. Al final de las biopsias del experimento de los injertos
de piel humana y del hígado de ratón, pulmón, riñón y bazo se
obtienen de ratones sacrificados para propósitos histológicos.
Todos los ratones se pesan al inicio (antes de la transferencia
celular) y a través del experimento (cada 2 días) como un
estimación indirecta de su estado de salud. Las líneas de regresión
lineal son generadas utilizando el peso del cuerpo versus los
valores de días de transferencia post-PBMC obtenidos
de cada uno de los ratones y posteriormente, sus pendientes
(control versus ratones tratados anti-CD45) se
comparan utilizando la prueba no paramétrica
Mann-Whitney.
Los injertos de piel humana son muy bien
tolerados por los ratones SCID. Inicialmente, los injertos sufren
un periodo de hiperproliferación de queratinocito que resulta en la
formación de unas incrustaciones hiperqueratócicas. Aproximadamente
5 semanas después del trasplante, las incrustaciones caen de los
injertos y revelan un tejido que contiene todas las estructuras
características observadas en la piel humana normal. Durante este
proceso, los injertos de piel humana se funden con la piel de ratón
adyacente y generan una red de vasos humanos recientemente crecidos
que conectan los injertos con el tejido de ratón subyacente. El Spl
circulante trasferido hacia los ratones Skin
SCID-hu (en el día experimental 0, aproximadamente 6
semanas después del trasplante de piel) infiltran los injertos de
piel y después del reconocimiento de las moléculas de aloantígeno
expresadas sobre la piel humana montan una respuesta inflamatoria;
que tiene semejanza con el proceso inflamatorio que ocurre en la
piel de soriasis y que en algunos casos destruye completamente el
injerto.
El tratamiento de estos con el anticuerpo
quimérico que se une a CD45RB/RO suprime el proceso inflamatorio y
evita el rechazo de los injertos de piel humana. En contraste, la
muestra obtenida de los ratones tratados con control muestra una
infiltración masiva con múltiples signos de necrosis y una
destrucción dramática de la epidermis. Este proceso es fácilmente
monitoreado por el ojo y documentado por fotografía simple de los
ratones.
Seis de cada seis ratones Skin
SCID-hu transferidos con SPL humano alogénico y
tratados con anti-LPS mAb de control muestran una
respuesta inflamatoria fuerte claramente visible por el ojo 23 días
después de la transferencia de célula mononuclear. Todos los
ratones muestran considerables lesiones, incluyendo le eritema,
descamación y pústulas pronunciadas. En contraste los injertos de
piel de todos los ratones tratados con anticuerpo quimérico que se
denomina CD45RB/RO tienen una apariencia normal. Las diferencias
dramáticas entre los dos grupos de ratones son específicamente
debidas al tratamiento de anticuerpo razón a que la piel humana de
todos los ratones tiene una apariencia idéntica al inicio del
experimento. Este aspecto no cambia hasta la segunda semana después
de la transferencia de la célula, tiempo en el cual el grupo de
control inicia el desarrollo de lesiones de piel. El experimento se
termina en el día 34 después de la transferencia mononuclear. Para
ese tiempo, uno de los ratones de control ya había muerto (día 30)
los otros 4 se habían sacrificado (días 27, 27, 27, y 30) debido a
un fuerte xeno-GvHD. La reacción patológica
observada en los ratones tratados con control de anticuerpo también
se correlaciona con la pérdida de peso de cuerpo en estos
animales.
En contraste, el grupo tratado con el anticuerpo
quimérico que se une con CD45RB/RO exhibe un estado saludable
durante el tiempo completo del experimento.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
13
Los ratones hembra NOD/SCID (Charles River
Laboratories, Calco, Italia) se mantienen bajo condiciones
específicas libres de patógeno. El nivel de glucosa en la sangre de
la cola venosa se cuantifica utilizando un sistema Glucometer Elite
(Bayer, Alemania). La diabetes se induce en los ratones NOD/SCID
mediante inyección intravenosa de 180 mg/kg de estreptozotocina
(Sigma, St.Luis, MO). Un diagnóstico de la diabetes se hace después
de dos mediciones de glucosa consecutiva mayor de 250 mg/dl.
\vskip1.000000\baselineskip
Los páncreas se obtienen de donantes multiórgano
cadavéricos con el corazón palpitante. Los islotes se aíslan de
acuerdo con el método descrito en Bertuzzi et al., Diabetes,
1999, 48: 1971-8. Los islotes purificados se
cultivan en matraces estériles que contienen 25 ml de medio M 199
(Seromed Biochrom, Berlín, Alemania) complementado con 10% de FCS,
1% de L-glutamina, 100 unidades/ml de penicilina y
100 \mug/ml de estreptomicina (medio completo). Los islotes se
incuban a 30º en 5% de CO_{2} y 95% de aire humidificado. Los
ratones se anestesian con una inyección intraperitoneal de avertina
y se trasplantan alícuotas de 1500 IE de islotes humanos bajo la
cápsula de piel de los ratones NOD/SCID diabéticos receptores, como
se describió en Davalli A.M. et al., Diabetes, 1996, 45:
1161-7. Se inyectan 50 x 10^{6} de PBMC
recientemente aislados intraperitoneal a los ratones NOD/SCID.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ratones trasplantados
Hu-PBL-NOD/SCID se tratan con s.c.
tratados por días 0, +3 y +5 con 1 mg/kg de un anticuerpo quimérico
que se une a CD45RB/RO. Los ratones de control se tratan con la
solución salina o con mAB purificado con IgG (Vinci.Biochem,
Italia).
Los polos del riñón que contienen el injerto de
islote humano se congelan instantáneamente en Tissue Tek (Miles
Lab., IN) y se almacenan a -70º. Secciones congeladas de 5 \mum de
grueso se tiñen con mA_{B} biotinilado contra insulina humana o
CD3 humano seguido por conjugado de
estreptavidina-peroxidasa. Se utiliza
diaminobenzidina (DAKO, Carpenteria, CA) como cromógeno y
hematoxilina como contrateñido. La infiltración de linfocitos de
los injertos se evalúa sobre hematoxilina y las secciones congeladas
teñidas con eosina.
Los resultados en los ratones NOD/SCID normales
trasplantados con islotes humanos permanecen normoglicémicos hasta
los 100 días postrasplante, mientras que el tiempo de rechazo medio
de los ratones hu-PBL-NOD/SCID con
los islotes humanos es de 35 \pm 13 días. El tratamiento corto de
los ratones hu-PBL-NOD/SCID
trasplantados con islotes humanos con mAB de la presente invención
prolongan significativamente la supervivencia de los islotes
humanos con una tasa de supervivencia mayor del 70% del día 60 y 50%
en el día 100 postrasplante.
El análisis histológico de los injertos de
islote humano efectuados a los 100 días postrasplante en los ratones
hu-PBL-NOD/SCID muestran una
infiltración masiva de células T positivas CD3+, CD4+ y CD8+
positivas en los ratones receptores de control. En contraste, en
los ratones receptores tratados con un anticuerpo quimérico que se
une a CD45RB/RO se observa una infiltración significativamente
inferior de las células humanas. El teñido positivo para la
insulina demuestra la función de injerto en los ratones receptores
hu-PBL-NOD/SCID tratados con un
anticuerpo quimérico que se une con CD45RB/RO comparado con los
ratones receptores de control. Un islote trasplantado y con un
anticuerpo quimérico que se une con CD45RB/RO tratado en ratones
hu-PBL-NOD/SCID con islote
trasplantado y tratados con anticuerpo quimérico que se une a
CD45RB/RO cantidades inferiores de IFN-gama humana
se detectan en el suero comparado con los ratones receptores de
control.
Estos datos indican que el tratamiento de corto
plazo con el anticuerpo quimérico que se une a CD45RB/RO conduce a
una supervivencia del injerto de islote humano prolongado y al
inhibir la reacción de rechazo mediada por leucocito in
vivo.
Claims (10)
1. Un anticuerpo humanizado que tiene una
especificidad de unión tanto por el CD45RO como por el CD45RB que
comprende la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 31
o 32 y una región variable de cadena liviana de la SEQ ID NO: 7 o
SEQ ID NO: 8.
2. El anticuerpo humanizado de la reivindicación
1 que tiene una especificidad de unión tanto por el CD45RO como el
CD45RB que comprende:
- Una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 31 y una región variable de una cadena liviana de la SEQ ID NO: 7,
- Una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 31 y una región variable de cadena liviana de la SEQ ID NO: 8,
- Una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 32 y una región variable de cadena liviana de la SEQ ID NO: 7, o
- Una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 32 y una región variable de cadena liviana de la SEQ ID NO: 8.
3. Polinucleótidos aislados que codifican el
anticuerpo humanizado de las reivindicaciones 1 o 2.
4. Un vector de expresión que comprende los
polinucleótidos de las reivindicaciones 3 cuyo vector es capaz de
producir un anticuerpo humanizado cuando dicho vector está presente
en una célula o huésped compatible.
5. Una célula anfitriona aislada que comprende
un vector de expresión de la reivindicación 4.
6. Un anticuerpo humanizado de las
reivindicaciones 1 o 2 para uso como farmacéutico.
7. El anticuerpo de la reivindicación 6 para uso
en el tratamiento y/o profilaxis de enfermedades autoinmunes,
rechazo por trasplante, soriasis, dermatitis, enfermedades
inflamatorias del intestino y/o alergias.
8. El anticuerpo de la reivindicación 7 en el
tratamiento y/o profilaxis de la enfermedad del injerto contra el
anfitrión (GVHD).
9. El anticuerpo de la reivindicación 7 en la
preparación de un medicamento para el tratamiento de rechazo por
trasplante de célula islote pancreática.
10. Una composición farmacéutica que comprende
el anticuerpo de la reivindicación 1 o 2 en asocio con por lo menos
un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
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