JPWO2004087210A1 - 抗ｃｄ５２抗体による調節性ｔ細胞分化誘導・増殖方法およびそのための医薬組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、調節性Ｔ細胞の分化誘導および／または増殖促進方法、免疫細胞の経血管内皮細胞遊走抑制方法、ならびにこれらの方法による免疫を抑制する方法、ならびにこれらの方法に用いるための医薬組成物を提供することを目的とする。 抗ＣＤ５２抗体を含むＣＤ５２アゴニストをＣＤ５２発現Ｔ細胞に作用させることによる、調節性Ｔ細胞の分化誘導および／または増殖促進方法、免疫細胞の経血管内皮細胞遊走抑制方法、ならびにこれらの方法による免疫を抑制する方法が提供される。

Description

本発明は、新規の、免疫を抑制する方法、特に調節性Ｔ細胞（抑制性Ｔ細胞と呼ばれる場合もある）の分化誘導・増殖促進を誘導することにより免疫を抑制する方法、および該方法に使用するための医薬組成物に関する。

本発明者らは、４Ｃ８モノクローナル抗体（４Ｃ８ｍＡｂ）が、ヒトＴ細胞が血管内皮細胞に接着した後の、内皮下への遊走を阻害するモノクローナル抗体であることを発見した（Ｍａｓｕｙａｍａ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８９，９７９）。Ｔ細胞が炎症局所などの末梢組織に移行するためには、血管内皮細胞にインテグリン分子を介して強固に接着した後に細胞運動に適した形態に変化し、血管内皮細胞間間隙をすり抜けて遊走する過程が必要である。血管内皮細胞に接着したＴ細胞全てが内皮下へ遊走するのではなく、ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＯ陽性ＣＤ２６強陽性の活性化メモリーＴ細胞が選択的に遊走することが知られている。即ち、４Ｃ８ｍＡｂはＴ細胞の血管内皮細胞への接着は抑制せずに、Ｔ細胞サブセット選択的な内皮下への遊走を特異的に抑制するモノクローナル抗体である。
さらに、４Ｃ８ｍＡｂの新たな機能として調節性Ｔ細胞の誘導能が報告された（Ｍａｓｕｙａｍａ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６９，３７１０）。単独ではＴ細胞活性化能をもたない程度の低濃度のＣＤ３アゴニストでＴ細胞を刺激するときに、同時に適切な副刺激を加えることでＴ細胞を活性化させることができる。副刺激はＣＤ３アゴニストの活性化能の亢進を行うのみならず、活性化後のＴ細胞の機能にも大きな影響を与える。ＣＤ３アゴニストとして抗ＣＤ３抗体であるＯＫＴ３を用いたとき、４Ｃ８ｍＡｂによる刺激は副刺激として機能し、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化、増殖させた。さらに、ＣＤ３、４Ｃ８ｍＡｂの同時刺激による活性化後の細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてポリクローナル刺激によるＣＤ４陽性Ｔ細胞の増殖に対して抑制活性を示し、調節性Ｔ細胞が誘導されていることが判った。
１．調節性Ｔ細胞
種々の病原体に対する生体防御のシステムとしての免疫系の中心的役割を担う細胞群の一つにＴ細胞がある。Ｔ細胞は大別してＣＤ４陽性のヘルパーＴ細胞とＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔ細胞に分けられるが、前者は特に抗原刺激後の特定の分化成熟段階でのサイトカイン産生パターンによって、主にＩＦＮ−γを産生するＴｈ１細胞、ＩＬ−４を産生するＴｈ２細胞などに分類可能である。一般的に前者は細胞性免疫、後者は液性免疫として生体防御に深く関与している。免疫応答はこのような性質の異なるＴ細胞の働きによって巧妙なバランスのもとに病原体の排除や感染抵抗性の獲得に深く関与している。通常健全な免疫応答においては外来の非自己抗原に対してはそれらを排除する機構が働き、生体を形成する自己抗原に対しては免疫学的寛容が成立しており排除機構が働かないことが知られている。しかしながら自己抗原に対する過剰な免疫応答が働くことによって自己免疫疾患が生ずる。このように自己抗原に対する免疫学的寛容は絶対的なものではないが、Ｔ細胞レベルにおいても種々の免疫学的寛容が誘導される仕組みが分かっている。一つは、中枢寛容（ｃｅｎｔｒａｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）と呼ばれる胸腺における自己反応性Ｔ細胞クローンの排除の機構（Ｋｉｓｉｅｌｏｗ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，１９８８．Ｎａｔｕｒｅ．３３３：７４２−７４６．）、他方は末梢寛容（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）と呼ばれる機構による自己反応性Ｔ細胞の胸腺外での制御である。後者には、細胞死の誘導あるいは自己抗原に対する不応答性（ａｎｅｒｇｙ）の誘導（Ｒｏｃｈａ，Ｂ．，ａｎｄ Ｈ．ｖｏｎ Ｂｏｅｈｍｅｒ．１９９１．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５１：１２２５−１２２８．；Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｍ．Ｋ．，ａｎｄ Ｒ．Ｈ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ．１９８７．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６５：３０２−３１９．）と共に、調節性Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ）による能動的な抑制（Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｅ．Ｍ．２０００．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：４２３−４４９．）の機構が知られている。調節性Ｔ細胞とは、近年提唱されたＴ細胞の新たな概念であり、他のＴ細胞に対して抑制的な作用を有するということによって定義付けられる。免疫応答は巧妙なバランスのもとに成り立っており、例えば上述のＴｈ１細胞およびＴｈ２細胞はお互いにそれぞれの免疫応答に拮抗的に働き、一方が他方に対する調節性Ｔ細胞として作用することが知られるようになってきた。反面、調節性Ｔ細胞としての細胞集団の存在の検証とその性状解析については免疫学の近年の歴史においても多くの議論があるところである。このような調節性Ｔ細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて特定の免疫応答を抑制または調節する機能を有する細胞として研究され、細胞表面マーカー、産生するサイトカインの種類や抑制・調節の機構などによって種々の細胞集団として報告されてきている（Ｒｏｎｃａｒｏｌｏ，Ｍ．Ｇ．，ａｎｄ Ｍ．Ｋ．Ｌｅｖｉｎｇｓ．２０００．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：６７６−６８３．）。
これらの調節性Ｔ細胞の中でも近年最もよく研究されている細胞集団は、以下に述べるＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性であることをマーカーとするＴ細胞集団であり、主にマウスおよびラットなどのヒト以外の生物種で研究されてきた。即ち、正常マウスまたはラットのＣＤ４陽性脾臓細胞からＣＤ２５陽性、ＲＴ６．１陽性（ラットの成熟Ｔ細胞の大部分に発現）、ＣＤ５強陽性、またはＣＤ４５ＲＢ弱陽性（マウス）若しくはＣＤ４５ＲＣ弱陽性（ラット）の細胞を除去して、残りのＴ細胞を免疫不全の動物に移入することで臓器特異的自己免疫疾患が誘導されることが明らかとなった。これまでこのような調節性Ｔ細胞特異的なマーカーは見出されておらず、上記のマーカーは調節性Ｔ細胞の機能とは直接関連付けられない、細胞が活性化されている状態、抗原刺激を受けた状態、免疫学的記憶状態にあることを表すマーカーにしか過ぎない。しかしながら、免疫不全動物に臓器特異的自己免疫疾患を誘導する機能のみならず、逆に特定の細胞集団を移入することで自己免疫疾患および自己免疫性炎症を抑制する機能を有することを指標として調節性Ｔ細胞集団の解析が進み、ＣＤ４、ＣＤ２５共に陽性であるＴ細胞集団が調節性Ｔ細胞のマーカーとなり得ることが知られるに至った（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，１９８５．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６１：７２；Ｉｔｏｈ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，１９９９．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：５３１７−５３２６；Ｓａｋａｇｕｃｈｉ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，１９９５．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１１５１−１１６４；Ａｓａｎｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，１９９６．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：３８７−３９６；Ｒｅａｄ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，２０００．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：２９５−３０２；Ｓａｌｏｍｏｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，２０００．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１２：４３１−４４０；Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｌ．Ａ．，ａｎｄ Ｄ．Ｍａｓｏｎ．２０００．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：３１０５−３１１０．）。
上記のようにマウスおよびラットにおいて、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性の調節性Ｔ細胞が同定された一方で、ヒトにおける同様の細胞の存在はようやく２００１年になって複数のグループから報告されたに過ぎない（Ｊｏｎｕｌｅｉｔ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，２００１．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９３：１２８５−１２９４；Ｌｅｖｉｎｇｓ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，２００１．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９３：１２９５−１３０１；Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，２００１．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９３：１３０３−１３１０；Ｔａａｍａ，Ｌ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，２００１．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１１２２−１１３１；Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｌ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，２００１．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１２４７−１２４５；Ｂａｅｃｈｅｒ−Ａｌｌａｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２００１．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：１２４５−１２５３．）。これらの報告はマウスで知られているＣＤ４およびＣＤ２５の発現を指標にヒト末梢血から分離された細胞集団を用いて種々の細胞表面マーカー、細胞の活性化刺激に対する不応答性（ａｎｅｒｇｙ）、産生されるサイトカインの種類、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける通常Ｔ細胞の増殖抑制機能およびその機構などの点においてマウスでの報告と同等であることを根拠としている。即ち、ヒト末梢血から分離されたＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ陽性のメモリーＴ細胞マーカーを発現しており、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陰性Ｔ細胞と比較してＨＬＡ−ＤＲなどの活性化マーカーの発現が高い。また細胞内には定常的にＣＴＬＡ−４を発現しており、刺激によりその発現が上昇する。更に抗ＣＤ３抗体刺激、抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体による刺激、同種異系の成熟樹状細胞（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｍａｔｕｒｅ ＤＣ）による刺激などでは、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性の調節性Ｔ細胞のＤＮＡ合成およびサイトカインの産生は見られず、抗原刺激に対する不応答状態（ａｎｅｒｇｙ）となっている。抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体による刺激にＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１５などのサイトカインを加えることで、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞のＤＮＡ合成能は高まるが、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陰性Ｔ細胞のそれには及ばない。ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞存在下にＣＤ４陽性ＣＤ２５陰性Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体または同種異系の成熟樹状細胞（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｍａｔｕｒｅ ＤＣ）によって刺激した場合、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞非存在下と比較してＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞細胞数依存的な増殖抑制作用が見られる。マウスに比較して低いものの、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞はＩＬ−１０、ＴＧＦβ１のような抑制性のサイトカインを産生する能力があるが、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陰性Ｔ細胞に対する増殖抑制作用は、これらサイトカインに対する中和抗体では解除されないこと、抑制作用にはＣＤ４陽性ＣＤ２５陰性Ｔ細胞とＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞の直接的細胞間接触が必要であることが報告されている。マウス、ラットおよびヒトにおいてＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞の存在が報告され性状解析が進んではいるものの、これら細胞の詳細な分化機構および抑制作用機構の解明は途上にあり、特異的なマーカーも見出されていないのが現状である。
またマウスおよびヒトにおいて、ＩＬ−１０存在下での同種異系の（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）抗原刺激や同種異系の未成熟樹状細胞（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｉｍｍａｔｕｒｅ ＤＣ）による繰り返し刺激によって誘導される調節性Ｔ細胞についても報告されている（Ｇｒｏｕｘ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，１９９７．Ｎａｔｕｒｅ．３８９：７３７−７４２；Ｊｏｎｕｌｉｅｔ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，２０００．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：１２１３−１２２２．）。これらの細胞は、Ｔｈ１、Ｔｈ２細胞とは異なり大量のＩＬ−１０を産生するものの、ＴＧＦ−β１、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−５の産生は高くなく、低レベルのＩＬ−２を産生し、ＩＬ−４を産生しないことを特徴としており、Ｔｒ１細胞と呼ばれている。Ｔｒ１細胞もＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞と同様にａｎｅｒｇｉｃであるが、Ｔ細胞抑制機構は産生されるＩＬ−１０やＴＧＦ−β１によって一部説明可能である。しかしながら、Ｔｒ１細胞とＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞が全く異なるＴ細胞サブセットであるのか、或いは分化活性化段階の異なる同一の細胞であるかについては不明な点が多い。
マウスおよびラットで知られている調節性Ｔ細胞マーカーであるＣＤ４、ＣＤ２５の発現を指標として、ヒトにおいても末梢血などからＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性のＴ細胞を分離して見たところ、マウスやラットで知られているその他の細胞表面マーカーや機能と照らし合わせて同様であることが確認された。このことから、ヒトにおけるＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性の調節性Ｔ細胞の存在が示唆された。
これら細胞は、末梢血ＣＤ４陽性Ｔ細胞の５〜１０％を占めるに過ぎない希少細胞集団である上に、活性化・増殖刺激に対して不応答状態である。この場合、抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体による刺激にＩＬ−２、ＩＬ−４またはＩＬ−１５などのサイトカインを加えることで細胞増殖を促すことは可能である。しかしながら、細胞数を増幅させヒトに移入するなどの臨床応用には十分なレベルではない。
調節性Ｔ細胞は、動物実験ではそれら細胞を移入することによって自己免疫疾患に抑制的に働くこと、移植拒絶反応や移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に抑制的に働くこと（Ｈａｒａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２００１．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：３７８９−３７９６；Ｔａｙｌｏｒ，Ｐ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，２００１．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９３：１３１１−１３１７．）から、調節性Ｔ細胞の免疫抑制作用を利用した細胞医療による自己免疫疾患、臓器移植などにおける治療への応用が考えられる。調節性Ｔ細胞の増殖を促進する医薬組成物、または患者もしくは別のヒトから採取した末梢血、骨髄細胞を生体外で処理することにより、調節性Ｔ細胞を増殖させ、患者の体内に戻す療法の開発が期待されている。
２．４Ｃ８抗原
４Ｃ８抗原は元々ヒトＴ細胞が血管内皮細胞に接着した後の内皮下への遊走に関与する分子を同定する目的で発見された、免疫系細胞の一部に発現する膜タンパク質である。ヒトＴ細胞をマウスに免疫することによって得られたモノクローナル抗体を、Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ血管外遊走を抑制することを指標にスクリーニングすることにより、４Ｃ８抗原を認識するモノクローナル抗体が取得された（Ｍａｓｕｙａｍａ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９９．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：９７９−９８９；ＷＯ９９／１２９７２号公報）。Ｔ細胞が炎症局所などの末梢組織に移行するためには、血管内皮細胞にインテグリン分子を介して強固に接着した後に細胞運動に適した形態に変化し、血管内皮細胞間間隙をすり抜けて遊走する過程が必要である。血管内皮細胞に接着したＴ細胞全てが内皮下へ遊走するのではなく、ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＯ陽性ＣＤ２６強陽性の活性化メモリーＴ細胞が選択的に遊走することが知られている。即ち抗４Ｃ８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）はＴ細胞の血管内皮細胞への接着は抑制せずに、Ｔ細胞サブセット選択的な内皮下への遊走を特異的に抑制するｍＡｂであり、４Ｃ８抗原はこのような遊走に必須の機能分子であると考えられる。４Ｃ８ｍＡｂにより４Ｃ８抗原の発現を検証したところ、４Ｃ８抗原はＣＤ３陽性Ｔ細胞に強く発現し、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、好酸球にも発現するが、好中球や内皮細胞には発現しない。４Ｃ８ｍＡｂによる架橋はＴ細胞のアクチン重合を促進し細胞形態に極性をもたせるのみならず、細胞運動を刺激する。
３．ＣＤ５２（ｃａｍｐａｔｈ−１抗原）
Ｃａｍｐａｔｈ−１はヒトの骨髄移植片からリンパ球を除去できるラット抗体としてＷａｌｄｍａｎｎらによって発見された（Ｈａｌｅ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｂｌｏｏｄ，６２，８７３）。Ｃａｍｐａｔｈ−１の抗原（ＣＤ５２）は長く不明であったが、１９９１年にＸｉａらによって新規分子として同定された（Ｘｉａ，Ｍ．Ｑ．ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２１，１６７７）。また、Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆらによって雄性生殖管上皮特異的分子として同定されたＨＥ５もＣＤ５２と同一の分子であったことが１９９３年に報告されている（Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，３４，８）。
Ｃａｍｐａｔｈ−１はリンパ球上に高発現しているＣＤ５２に結合し、補体による細胞障害あるいは抗体依存的細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を引き起こすことによってリンパ球を除去する作用を持つ。非常に効率の良いリンパ球除去抗体として、ＧｖＨＤ軽減を目的とした骨髄移植片からのリンパ球除去や、リンパ腫治療への応用が熱心に研究され、ラット抗体Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｇをヒト化したＣａｍｐａｔｈ−１ＨであるＣａｍｐａｔｈ（登録商標）（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）がＢ細胞リンパ腫の治療薬としてＭｉｌｌｅｎｎｉｕｍ社より上市されている（Ｐａｎｇｏｌｉｓ ＧＡ ｅｔ ａｌ，（２００１）Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１８，９９）。
しかしながら、その抗原であるＣＤ５２の機能についてはあまり明らかになっていない。Ｔ細胞において、ＣＤ５２を抗体によって架橋すると、抗原受容体を刺激した場合と類似したタンパク質のリン酸化が見られるという報告（Ｈｅｄｅｒｅｒｅ ＲＡ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２，５０５）がある他、抗ＣＤ３抗体あるいは抗ＣＤ２抗体に対する刺激に対してＣＤ５２の抗体による架橋が副刺激として作用し、Ｔ細胞の増殖を亢進するという報告がある（Ｖａｌｅｎｔｉｎ Ｈ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，５４，９７、Ｒｏｗａｎ ＷＣ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７，６９）。しかしＣＤ５２からどのようなシグナルが入っているのか、またＣＤ５２からの副刺激が細胞の機能にどのような影響を与えるのかについては判っていない。
ＣＤ５２はリンパ球、単球、マクロファージの他に、前述のように雄性生殖管の上皮にも発現している。雄性生殖管上皮に発現するＣＤ５２は上皮細胞から放出され、精子の成熟の過程で精子表面の糖衣にとりこまれる。ＣＤ５２に付加された糖鎖のシアル酸の陰電荷が精子同士の凝集を防ぐ役割を果たしているのではないかと考えられている。またＣＤ５２に対する抗体が不妊の原因となっている例も報告されているが、精子の機能におけるＣＤ５２の役割などはまだ不明な点が多い（Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ Ｃ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃｅｌｌｓ Ｔｉｓｓｕｅｓ Ｏｒｇａｎｓ，１６８，９３）。
ＣＤ５２は１２アミノ酸からなるペプチドであり、ＧＰＩアンカーにより細胞膜に結合している（Ｘｉａ，Ｍ．Ｑ．ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２１，１６７７）。分子自体が非常に小さく、また細胞内ドメインも持たないため、構造から機能を推測することが困難であり、このことがＣＤ５２の機能に関する研究が進んでいないことの一因であると考えられる。
国際公開 ＷＯ９９／１２９７２号公報 特許公報 特表平２−５０３５１４ Ｍａｓｕｙａｍａ，Ｊ．ら、（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６９，３７１０ Ｈａｌｅ，Ｇ．ら、（１９８３）Ｂｌｏｏｄ，６２，８７３ Ｘｉａ，Ｍ．Ｑ．ら、（１９９１）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２１，１６７７ Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ，Ｃら、（１９９３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，３４，８ Ｐａｎｇｏｌｉｓ ＧＡら、（２００１）Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１８，９９ Ｈｅｄｅｒｅｒｅ ＲＡら、（２０００）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２，５０５ Ｖａｌｅｎｔｉｎ Ｈら、（１９９２）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，５４，９７ Ｒｏｗａｎ ＷＣら、（１９９４）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７，６９ Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ Ｃら、（２００１）Ｃｅｌｌｓ Ｔｉｓｓｕｅｓ Ｏｒｇａｎｓ，１６８，９３

本発明は、ＣＤ５２を介した調節性Ｔ細胞の分化誘導および／または増殖促進方法、ＣＤ５２を介した免疫細胞の経血管内皮細胞遊走抑制方法、ならびにこれらの方法による免疫を抑制する方法、ならびにこれらの方法に用いるための医薬組成物、特に抗ＣＤ５２抗体を有効成分として含む医薬組成物を提供することを目的とする。
本発明者らは、４Ｃ８抗体により認識される４Ｃ８抗原について鋭意検討を行い、該抗原がＣＤ５２分子であることを見出した。従来のＣＤ５２についての知見からは、ＣＤ５２が活性化Ｔ細胞の経血管内皮細胞遊走抑制や調節性Ｔ細胞誘導に関与することは予測できなかった。本発明者らは、さらに抗ＣＤ５２抗体について鋭意検討を行い、それまでＢ細胞リンパ腫患者等からのリンパ球除去抗体活性のみ知られていた抗ＣＤ５２抗体が驚くべきことに経血管内皮細胞遊走抑制活性や調節性Ｔ細胞誘導活性を有していることを新たに見出し、抗ＣＤ５２抗体の活性化Ｔ細胞の経血管内皮細胞遊走抑制活性や調節性Ｔ細胞誘導活性を広く免疫療法に利用できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである：
１．４Ｃ８抗体以外のＣＤ５２アゴニストを有効成分として含有する、免疫抑制のための医薬組成物；
２．４Ｃ８抗体以外のＣＤ５２アゴニストを有効成分として含有する、調節性Ｔ細胞の分化誘導および／または増殖促進のための医薬組成物；
３．調節性Ｔ細胞が抗原選択的な抑制活性を有するものである、上記２記載の医薬組成物；
４．ＣＤ３アゴニストをさらに含む、上記１〜３のいずれかに記載の医薬組成物；
５．ＣＤ３アゴニストが抗ＣＤ３抗体またはそのフラグメントである、上記４記載の医薬組成物；
６．抗ＣＤ３抗体がヒト化抗体またはヒト抗体である、上記５記載の医薬組成物；
７．４Ｃ８抗体以外のＣＤ５２アゴニストを有効成分として含有する、免疫細胞の経血管内皮細胞遊走抑制のための医薬組成物；
８．ＣＤ５２アゴニストが抗ＣＤ５２抗体またはそのフラグメントである、上記１〜７のいずれかに記載の医薬組成物；
９．抗ＣＤ５２抗体がヒト化抗体またはヒト抗体である、上記８記載の医薬組成物；
１０．上記ヒト化抗体がラットヒト化抗体Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈである、上記９記載の医薬組成物；
１１．自己免疫疾患、アレルギー疾患または移植免疫応答の予防または治療のための、上記１〜１０のいずれかに記載の医薬組成物；
１２．免疫細胞の表面に発現するＣＤ５２に４Ｃ８抗体以外のＣＤ５２アゴニストを作用させることにより調節性Ｔ細胞の分化誘導および／または増殖を促進する方法；
１３．調節性Ｔ細胞が抗原選択的な抑制活性を有するものである、上記１２記載の調節性Ｔ細胞の分化誘導および／または増殖を促進する方法；
１４．ＣＤ５２アゴニストが抗ＣＤ５２抗体またはそのフラグメントである、上記１２記載の方法；
１５．抗ＣＤ５２抗体がヒト化抗体またはヒト抗体である、上記１４記載の方法；
１６．上記ヒト化抗体がラットヒト化抗体Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈである、上記１５記載の方法；
１７．上記免疫細胞の表面に発現するＣＤ３にＣＤ３アゴニストを作用させることをさらに含む、上記１２に記載の方法；
１８．ＣＤ３アゴニストが抗ＣＤ３抗体またはそのフラグメントである、上記１７記載の方法；
１９．抗ＣＤ３抗体がヒト化抗体またはヒト抗体である、上記１８記載の方法；
２０．上記免疫細胞が、末梢血、リンパ節または胸腺に含まれるものである、上記１２〜１９のいずれかに記載の方法；
２１．上記免疫細胞がＴ細胞である、上記２０記載の方法；
２２．上記免疫細胞が末梢血単核球である、上記２１記載の方法；
２３．免疫細胞へのＣＤ３アゴニスト刺激およびＣＤ５２アゴニスト刺激が、生体外で行われるものである上記１２〜２２のいずれかに記載の方法；
２４．免疫細胞へのＣＤ３アゴニスト刺激およびＣＤ５２アゴニスト刺激が、生体内で行われるものである上記１２〜２２のいずれかに記載の方法；
２５．免疫抑制効果、調節性Ｔ細胞の分化誘導および／もしくは増殖促進ならびに／または免疫細胞の経血管内皮細胞遊走抑制効果を有する薬剤となる、抗ＣＤ５２ヒト化抗体またはヒト抗体を作製する方法；
２６．免疫抑制効果、調節性Ｔ細胞の分化誘導および／もしくは増殖促進ならびに／または免疫細胞の経血管内皮細胞遊走抑制効果を有する薬剤を、ＣＤ５２との相互作用を指標にスクリーニングする方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願第２００３−９５７６５号ならびに日本国特許出願第２００３−４１３７８６号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。

図１は、４Ｃ８陽性クローンの１つを導入したＣＯＳ−１細胞のＦＡＣＳ解析結果である。太実線は４Ｃ８ｍＡｂ、破線はアイソタイプコントロールで染色した結果である。他の陽性クローンからも同様の結果を得た。
図２は、４Ｃ８ｍＡｂまたはＣａｍｐａｔｈ−１ＨをＣＤ３と共に副刺激した細胞を添加してＣＤ４陽性Ｔ細胞の抗ＣＤ３抗体刺激による増殖をチミジンの取り込みにより測定したところ、４Ｃ８ｍＡｂ副刺激細胞およびＣａｍｐａｔｈ−１Ｈ副刺激細胞ともに添加した細胞数に依存的に、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の抗ＣＤ３抗体刺激による増殖を抑制することを示す図である。
図３は、４Ｃ８ｍＡｂまたはＣａｍｐａｔｈ−１Ｈ添加によるＣＤ３陽性Ｔ細胞のヒト臍帯静脈血管単層内皮細胞下のコラーゲンゲル内への遊走抑制を調べた結果である。４Ｃ８ｍＡｂおよびＣａｍｐａｔｈ−１Ｈともに、ＣＤ３陽性Ｔ細胞の経内皮細胞遊走性を抑制した。
図４は、４Ｃ８ｍＡｂ副刺激細胞の混合リンパ球培養反応の抑制を調べた結果である。４Ｃ８ｍＡｂ副刺激細胞はＣＤ４陽性Ｔ細胞混合リンパ球培養反応を添加細胞数依存的に抑制した。
図５は、Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈを用いて誘導した調節性Ｔ細胞による、アロ抗原刺激ＣＤ４陽性Ｔ細胞の反応の抑制を調べた結果である。Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ副刺激細胞はＣＤ４陽性Ｔ細胞混合リンパ球培養反応を添加細胞数依存的に抑制した。
図６は、抗ＣＤ５２抗体副刺激により誘導される調節性Ｔ細胞のＣＤ８陽性Ｔ細胞混合リンパ球培養反応に対する抑制を調べた結果である。４Ｃ８ｍＡｂ副刺激細胞はＣＤ８陽性Ｔ細胞混合リンパ球培養反応を添加細胞数依存的に抑制した。
図７は、Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ副刺激により誘導される調節性Ｔ細胞の、ＣＤ８陽性Ｔ細胞混合リンパ球培養反応に対する抑制を調べた結果である。Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ副刺激により誘導される調節性Ｔ細胞はＣＤ８陽性Ｔ細胞混合リンパ球培養反応を添加細胞数依存的に抑制した。
図８は、アロ抗原反応後のＣＤ４陽性Ｔ細胞からの調節性Ｔ細胞の誘導を調べた結果である。アロ抗原反応に用いた単球由来成成熟樹状細胞の提供者である提供者Ｂに対する反応において、アロ抗原反応後調節性Ｔ細胞はコントロール調節性Ｔ細胞よりも強い抑制活性を示したが、第三者である提供者Ｃに対する反応において、両者の抑制活性は同等であった。
図９は、抗ＣＤ５２抗体副刺激により誘導される調節性Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅時の細胞数の変化である。培養３日目から８日目までＩＬ−２存在下で培養することにより調節性Ｔ細胞の増幅が認められた。
図１０は、培養８日目（ｄａｙ８）における調節性Ｔ細胞の抑制アッセイの結果である。増幅された調節性Ｔ細胞ではその抑制能の減少が認められた。
図１１は、再度抗ＣＤ５２抗体副刺激を施した後（ｄａｙ１５）の調節性Ｔ細胞の抑制アッセイの結果である。増幅された調節性Ｔ細胞の抑制能は、コントロール細胞に比較して同等であった。
図１２は、Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ副刺激により誘導される調節性Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける増幅を調べた結果である。ＩＬ−２存在下での培養によってＣａｍｐａｔｈ−１Ｈ副刺激細胞は４Ｃ８ｍＡｂ副刺激細胞同様、１０倍以上に増幅した。
図１３は、Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ副刺激細胞の増幅後の抑制活性を調べた結果である。Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ副刺激細胞は４Ｃ８ｍＡｂ副刺激細胞同様に増幅後も抑制活性を保持していた。
図１４は、ＴＭ−β１抗体投与翌日に、亜致死量の放射線を照射したＳＣＩＤマウスに、ヒトＰＢＭＣの１もしくは２Ｘ１０^７個を単独で投与、４Ｃ８ｍＡｂ副刺激により誘導した調節性Ｔ細胞の１Ｘ１０^７もしくは２Ｘ１０^７個を単独で投与、またはＰＢＭＣと４Ｃ８ｍＡｂ副刺激により誘導した調節性Ｔ細胞の各１Ｘ１０^７個（合計２Ｘ１０^７個）を混じて腹腔内投与したマウスの体重の推移を示す。
図１５は、ＴＭ−β１抗体投与翌日に、亜致死量の放射線を照射したＳＣＩＤマウスに、ヒトＰＢＭＣの１Ｘ１０^７もしくは２Ｘ１０^７個を単独で投与、４Ｃ８ｍＡｂ副刺激により誘導した調節性Ｔ細胞の１Ｘ１０^７もしくは２Ｘ１０^７個を単独で投与、あるいはＰＢＭＣと４Ｃ８ｍＡｂ副刺激により誘導した調節性Ｔ細胞の各１Ｘ１０^７個（合計２Ｘ１０^７個）を混じて腹腔内投与したマウスの生存率を示す。
図１６は、ＴＭ−β１抗体投与翌日に、亜致死量の放射線を照射したＳＣＩＤマウスに、ヒトＰＢＭＣの１．２Ｘ１０^７個を単独、Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ副刺激により誘導した調節性Ｔ細胞の１．２Ｘ１０^７個を単独、あるいはＰＢＭＣとＣａｍｐａｔｈ−１Ｈ副刺激により誘導した調節性Ｔ細胞の各１．２Ｘ１０^７個（合計２．４Ｘ１０^７個）を混じて腹腔内投与したマウスの体重の推移を調べた結果である。ＰＢＭＣ単独投与群では約１週間後に一過性の体重回復傾向を示したが、その後また継続的に体重が減少した。一方、ＰＢＭＣと調節性Ｔ細胞混合投与群では細胞非投与群と同様な体重変動を示した。なお、調節性Ｔ細胞単独投与群は１２日目に剖検を行ったため１２日目までしか体重を測定していない。
図１７は、ＴＭ−β１抗体投与翌日に、亜致死量の放射線を照射したＳＣＩＤマウスに、ヒトＰＢＭＣの１．２Ｘ１０^７個を単独、Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ副刺激により誘導した調節性Ｔ細胞の１．２Ｘ１０^７個を単独、あるいはＰＢＭＣとＣａｍｐａｔｈ−１Ｈ副刺激により誘導した調節性Ｔ細胞の各１．２Ｘ１０^７個（合計２．４Ｘ１０^７個）を混じて腹腔内投与したマウスの生存率を示す。ＰＢＭＣ単独投与群は、２１日目に全例が死亡し、細胞非投与群ならびにＰＢＭＣと調節性Ｔ細胞混合投与群は全例が観察期間中生存した。
図１８は、ＰＢＭＣ単独投与群のマウスとＰＢＭＣと調節性Ｔ細胞混合投与群のマウスの消化管（盲腸）の組織所見を示す。試験期間の中間で実施した消化管の組織所見の観察において、ＰＢＭＣ単独投与群（左図）では、特に盲腸で粘膜下層における単核細胞浸潤と水腫、毛細血管の拡張などが種々の程度で認められたが、ＰＢＭＣと調節性Ｔ細胞混合投与群（右図）や調節性Ｔ細胞単独投与群ならびに細胞非投与群ではそれらの変化が認められなかった。

以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書において、ＣＤ５２アゴニストとは、免疫細胞表面に発現するＣＤ５２抗原に作用することにより、ＣＤ５２を介した細胞内へシグナルを伝達し得る物質を意味する。ＣＤ５２アゴニスト刺激により誘導されたシグナルにより、１）当該細胞の調節性Ｔ細胞への分化および／もしくは２）調節性Ｔ細胞としての特性を保持した状態での増殖、ならびに／または３）当該細胞の経血管内皮細胞遊走の抑制という応答が惹起され得る。ＣＤ５２アゴニストは、ＣＤ５２抗原に対する天然または合成のリガンド、すなわちＣＤ５２分子を介してシグナルを誘導するあらゆる分子、およびＣＤ５２抗原に対する抗体を包含する。かかる抗体は、ＣＤ５２のいずれの部位を認識するものであっても、ＣＤ５２を介するシグナルを誘導するものであればよい。本発明において使用される抗体は、益山らの報告（Ｍａｓｕｙａｍａ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９９．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：９７９−９８９；ＷＯ９９／１２９７２号公報）に従い、ヒトＴ細胞を免疫した動物より得られたモノクローナル抗体から、Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ血管外遊走を抑制することを指標に選抜することにより得られる、ＣＤ５２抗原アゴニスト機能を有する抗体などが挙げられる。また、抗体分子の抗原認識部位を保持する抗ＣＤ５２抗体フラグメントもまた、本発明のＣＤ５２アゴニストとして有用である。
また、本発明に有用なＣＤ５２アゴニストとして、ラットヒト化抗体Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ（アレツズマブ；Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）が挙げられる。これは、Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）として市販されており入手可能であり、また、その詳細な作製法については特許公報特表平２−５０３５１４に記載されている。
抗原として使用されるＴ細胞にはヒトから採取された末梢血単核球画分を、コラーゲンゲル上で単層に培養されたヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）と共培養した後、該単層を通過して遊走した単核球を用いることにより、効率的に所望の抗体を取得しうる。ハイブリドーマの選抜にあたっては、ハイブリドーマＪＭ−１（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００１年９月２６日付けで受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７７５７で寄託）により産生される抗４Ｃ８抗体を競合試薬として用いることにより、被検抗体によるＴ細胞染色が抑制されること（すなわちハイブリドーマＪＭ−１により産生される抗ＣＤ５２抗体と同一エピトープを認識すること）を指標にした選抜を組み合わせることにより、取得はさらに容易となる。また、抗４Ｃ８抗体と同一エピトープを認識する抗体の選抜工程と、本発明の実施例に記載した調節性Ｔ細胞の分化・増殖誘導能を評価する工程を組み合わせることによっても、本発明に使用する抗体を容易に取得することができる。また、例えばハイブリドーマＪＭ−１により産生される抗ＣＤ５２抗体の可変領域をヒト抗体のフレームワークに移植することにより、本発明に使用する抗体としていわゆるヒト化抗体を取得することも可能である。また、再配列されていないヒト抗体遺伝子を保持し、抗原の感作により当該抗原に特異的なヒト抗体を産生するマウス（例えばＴｏｍｉｚｕｋａ ｅｔ ａｌ．，２０００．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：７２２）を使用することにより、本発明に使用する抗体としてヒト抗体を取得することも可能である。
本発明の方法において、ＣＤ５２を発現する免疫細胞に対して、ＣＤ５２に加えて、ＣＤ３アゴニストを作用させることによって、ＣＤ５２の調節性Ｔ細胞への分化誘導能およびその増殖促進能が発揮され得る。これは、Ｔ細胞の分化に関わる主たる刺激伝達経路であるＣＤ３分子を介した信号伝達系を主刺激経路とすれば、ＣＤ５２を介した経路がいわゆる副刺激経路となる。本明細書において、ＣＤ３分子を介した刺激に加えてＣＤ５２を介した刺激をもたらすことを、ＣＤ５２副刺激と称することがある。本明細書においてＣＤ３アゴニストとは、免疫細胞の表面に発現したＣＤ３分子に作用し、ＣＤ３を介した細胞内への信号伝達により、当該細胞の分化が促進されるという反応を惹起しうる物質を意味する。ＣＤ３アゴニストの例としてアゴニスティックな抗ＣＤ３抗体、例えばＯＫＴ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−８００１）、ＵＣＨＴ１（Ｂ．Ｄ．ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、ＨＩＴ３ａ（Ｂ．Ｄ．ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）が挙げられる。また、種々のＴ細胞抗原受容体に対するアゴニスト、特にアゴニスト作用を有する抗体またはそのフラグメントも、Ｔ細胞抗原受容体とＣＤ３の複合体形成をもたらし、ＣＤ３を介した細胞内への信号伝達をもたらすので、本発明におけるＣＤ３アゴニストとして使用することができる。具体的には、ヒトＴ細胞抗原受容体Ｖｂｅｔａ６．７に対する抗体であるＯＴ１４５（Ｐｏｓｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８３（２０）：７８８８−９２）などが挙げられる。また、可溶性のＨＬＡ分子あるいはＨＬＡ分子と抗原ペプチドのテトラマー分子のような、Ｔ細胞抗原受容体が認識してアゴニスト作用を及ぼす物質も使用し得る。
Ｔ細胞やマクロファージなどの炎症細胞が血管内皮を通過して血管外の炎症部位へ遊走することは炎症反応の重要なステップである。このステップに関わることが知られているケモカインや接着因子などの分子の作用を低分子アンタゴニストや抗体などを用いて阻害することにより、アレルギーや各種免疫疾患を制御しようという試みは既に多く行われている（Ｙａｎｇ，Ｇ．Ｘ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．２３：３６９−３９２；Ａｙｄｔ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，（２００２−２００３）７０：２９７−３０１；Ｅｒｉｎ，Ｅ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｃｕｕｒ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｉｎｆｌａｍｍ．Ａｌｌｅｒｇｙ １：２０１−２１４；Ｓａｅｋｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｍ．Ｄｅｓ．９：１２０１−１２０８）。今回、新たにＣＤ５２がＴ細胞の経血管内皮細胞遊走に関わることが明らかとなったことにより、ＣＤ５２に対する抗体もしくはリガンド、または低分子アゴニストもしくはアンタゴニストを投与することでＴ細胞の血管外への遊走を阻害し、ひいては炎症反応・免疫反応を抑制する可能性が示された。
抗ＣＤ５２抗体であるＣａｍｐａｔｈ−１Ｈ（アレツズマブ；Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）については既に免疫を抑制する抗体として関節リウマチ、多発性硬化症、腎移植拒絶などを対象に臨床研究が実施されているが（Ｉｓａａｃｓ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．２００１．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．４４：１９９８−２００８；Ｃｏｌｅｓ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｌａｎｃｅｔ ３５４：１６９１−１６９５；Ｃａｌｎｅ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６８：１６１３−１６１６）、その作用機序は補体による細胞傷害または抗体依存的細胞性細胞傷害によるＣＤ５２発現リンパ球の除去である（Ｈａｌｅ，Ｇ．２００１．Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ．３：１３７−１４３）。リンパ球を除去すると、新たなリンパ球が再び分化してくるまでの間、リンパ球減少状態に陥る。関節リウマチを対象としたＣａｍｐａｔｈ−１Ｈの臨床試験において、Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈによって引き起こされる低リンパ球状態は非常に長期にわたることが明らかとなっており、Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ投与後に減少した各種リンパ球が正常な細胞数に回復するまでに要する時間は、ＮＫ細胞や単球で１ヶ月、Ｂ細胞で３−６ヶ月であり、Ｔ細胞においては３年後にも正常より低い細胞数であった（Ｉｓａａｃｓ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．２００１．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．４４：１９９８−２００８）。すなわち、Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈによる治療を停止したあとも、感染などのリスクが高い状態が継続するという副作用が生じる。これに対し、今回新たに得られた知見により、細胞除去作用を持たない抗ＣＤ５２抗体にも免疫抑制作用が期待されることが明らかとなった。経血管内皮細胞遊走抑制を作用機序とする、リンパ球除去効果を持たないような抗ＣＤ５２抗体を投与すれば、Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈの場合と異なり長期にわたるリンパ球減少状態を引き起こすことなく免疫抑制効果を得ることが可能であると考えられる。
リンパ球除去効果を持たない抗ＣＤ５２抗体の選別は、例えば次のような方法で可能である。まず、抗体による細胞除去の主要な作用機序である補体による細胞傷害および抗体依存的細胞性細胞傷害活性はいずれも抗体のサブクラスに大きく依存することが知られている。例えば、ヒト抗体ではＩｇＧ４、マウス抗体ではＩｇＧ１が補体による細胞傷害および抗体依存的細胞性細胞傷害活性の低いサブクラスである（Ｍａｌｏｎｅｙ，Ｄ．Ｇ．（１９９８）“Ｕｎｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｍａ．”Ｉｎ：Ｇｒｏｓｓｂａｒｄ ＭＬ，ｅｄ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｄｅｋｋｅｒ：５３−７９．）。そのような細胞除去活性を有さないサブクラスの抗体を選択、あるいはそのようなサブクラスのＦｃ部分を遺伝子組換え技術により導入・置換した上で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで抗体の細胞傷害活性スクリーニングを実施する。補体による細胞傷害活性のスクリーニングは次のような方法で可能である。ＣＤ５２を発現しているターゲット細胞を^５１Ｃｒと共に３７℃で１時間インキュベートし、ターゲット細胞を^５１Ｃｒで標識する。この細胞を洗浄後、９６ｗｅｌｌプレートに播種し、抗ＣＤ５２抗体とヒト補体とを添加して３７℃で２時間インキュベートする。インキュベート後に上清を回収し、トップカウント（Ｐａｃｋａｒｄ）などを用いて上清中に放出された^５１Ｃｒのカウントを測定することによってその抗体の補体による細胞傷害活性を評価可能である。また、抗体依存的細胞性細胞傷害活性は次のような方法でスクリーニングできる。ＣＤ５２を発現しているターゲット細胞を^５１Ｃｒと共に３７℃で１時間インキュベートし、ターゲット細胞を^５１Ｃｒで標識する。この細胞を洗浄後、９６ｗｅｌｌプレートに播種し、抗ＣＤ５２抗体とヒト末梢血単核球とを添加して３７℃で４時間インキュベートする。インキュベート後に上清を回収し、トップカウントなどを用いて上清中に放出された^５１Ｃｒのカウントを測定することによってその抗体の抗体依存的細胞性細胞傷害活性を評価可能である。上述の方法で選別された抗体がリンパ球除去活性を持たないことは、最終的にはヒトに投与した際のリンパ球数をモニターすることで確認できる。
上述のとおり、経血管内皮細胞遊走は、ＣＤ５２アゴニストをＣＤ５２に作用させることにより抑制されるので、免疫応答が抑制され得る。また、ＣＤ３とＣＤ５２とを共に刺激することによって調節性Ｔ細胞の分化誘導が促進され、かつ／または調節性Ｔ細胞の増殖が促進されることから、このＣＤ３とＣＤ５２との同時刺激もまた、免疫応答の抑制をもたらす。したがって、本発明により提供される、ＣＤ５２アゴニストを有効成分として含有する医薬組成物、およびＣＤ５２アゴニストとＣＤ３アゴニストとを有効成分として含有する医薬組成物は、免疫抑制剤として有用であり得る。該医薬組成物は、さらに特定の免疫系の作用機序を標的とする薬剤として、調節性Ｔ細胞の分化誘導および／または増殖促進剤として有用であり得る。
また、本発明によって提供される、医薬組成物は、生体内に投与されるものであってもよいし、患者または別のヒトから採取した免疫細胞、特にＴ細胞、あるいは免疫細胞を含む末梢血、リンパ液、リンパ節細胞、胸腺細胞を生体外で処理するためのものであっても良い。本発明の医薬組成物は、周知の方法で製剤化されうる。すなわち治療効果上許容される種々の添加物、例えば担体、ｐＨ緩衝剤、安定化剤、賦形剤等を添加した医薬製剤が製造される。このような製剤は、好ましくは、生理学的に許容され得る希釈剤またはキャリアを含んでおり、適切なキャリアには、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、および緩衝生理食塩水が含まれるが、これらに限定されるものではない。或いは、ＣＤ５２アゴニストは凍結乾燥（フリーズドライ）し、必要なときに上記の緩衝水溶液を添加することにより再構成して使用してもよい。上記製剤の投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、または、注射剤、点滴剤、坐薬等による非経口投与を挙げることができる。
上記医薬組成物の投与方法、投与量は、前臨床試験、臨床試験の過程において適宜決定されうる。例えば、症状、年齢、体重などによって異なるが、通常、経口投与では、成人に対して、１日約０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇであり、これらを１回、または数回に分けて投与することができる。また、非経口投与では、１回約０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇを皮下注射、筋肉注射または静脈注射によって投与することができる。
治療の対象となる疾患は、免疫抑制効果をもたらす処置が必要とされる疾患であり、具体的には移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）あるいは移植片拒絶の治療または予防を目的とした臓器又は細胞移植前後における処置、リウマチなどの自己免疫疾患、あるいは接触過敏症などのアレルギー性疾患の治療または予防が挙げられる。
本発明において、患者または別のヒトから採取した免疫細胞、あるいは免疫細胞を含む末梢血、リンパ液、リンパ節細胞、胸腺細胞を生体外で処理することにより、調節性Ｔ細胞を増殖させ、患者の体内に戻す療法を採用することができる。末梢血または骨髄細胞を生体より採取し、患者の体内に戻す幹細胞移植療法はすでに実施されている。また、免疫細胞の１種である樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）に人為的処理を施し、患者の体内に戻す癌治療も行われている（Ｍ．Ｊｅｆｆｏｒｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２：３４３−３５３，Ｊｕｎｅ，２００１）。採取された免疫細胞にＣＤ５２アゴニストおよびＣＤ３アゴニストを作用させることにより、調節性Ｔ細胞の分化誘導および／または増殖を促進することができ、該調節性Ｔ細胞を増殖させた後に患者の体内に戻すことにより治療または予防効果を奏することができる。このようないわゆるエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）の方法は、基礎研究の場において開発された実験系をほぼそのまま治療の場において再現するものであるとも言える。薬剤の生体内への投与が、体内吸収、代謝、または未知の因子による干渉作用などの影響により、期待した治療効果を奏しえない場合がありうることと比較すると、より実用化へのリスクの低い方法であるといえる。
さらに、本発明は、調節性Ｔ細胞の分化誘導および／もしくは増殖促進ならびに／または免疫細胞の経血管内皮細胞遊走抑制効果を有する薬剤の開発のために、ＣＤ５２を発現している細胞と候補化合物を接触させて、その相互作用またはＣＤ５２刺激応答を検出することにより、ＣＤ５２との相互作用を指標にしてＣＤ５２アゴニストとなる化合物をスクリーニングすることも包含する。
実施例１：４Ｃ８抗原の同定
ヒトＴ細胞が血管内皮細胞に接着した後の内皮下への遊走に関与する分子を同定する目的で最初に発見された免疫系細胞の一部に発現する膜タンパク質である４Ｃ８抗原に対するモノクローナル抗体４Ｃ８抗体が、Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ血管外遊走を抑制することを、すでに本発明者らは明らかにしている（Ｍａｓｕｙａｍａ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９９．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：９７９−９８９；ＷＯ９９／１２９７２号公報）。
まず、この４Ｃ８抗原の正体の同定を試みた。４Ｃ８抗原は、４Ｃ８ｍＡｂ陽性細胞画分であるＣＤ３陽性細胞を遺伝子源としてｃＤＮＡライブラリーを作製し、ライブラリーを一過性に発現させたＣＯＳ−１細胞を４Ｃ８ｍＡｂとＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて濃縮することにより、単離・同定した。
ヘパリン添加ヒト末梢血からＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅによる密度勾配遠心法により末梢血単核球を分離し、ＣＤ３陽性Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）とＭＡＣＳを用いて調製した。１０^８個のＣＤ３陽性Ｔ細胞からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ）を用い、９０μｇの総ＲＮＡを得た。ｐｏｌｙ（Ａ）^＋ＲＮＡはＯｌｉｇｏｔｅｘ^ＴＭ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯ Ｉｎｃ．）を用いて精製し、９０μｇの総ＲＮＡから１．７μｇのｐｏｌｙ（Ａ）^＋ＲＮＡを得た。このｐｏｌｙ（Ａ）^＋ＲＮＡからＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ^ＴＭＣｈｏｉｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ Ｃｏ．）を用いて合成したｃＤＮＡはアガロースゲル電気泳動によりサイズ分画を行い、１Ｋｂから１０ＫｂのｃＤＮＡを真核細胞発現ベクターｐＥＦ１８Ｓ（Ｏｈａｓｈｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，１９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１５８−１６２）にクローン化した。その結果、７×１０^６個の独立クローンからなるＣＤ３陽性Ｔ細胞由来ｃＤＮＡライブラリーを得た。
上記ライブラリーのＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培養液５００ｍｌから、Ｅｎｄｏｆｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．）を用いて２７０μｇのプラスミドを得た。このうち１００μｇを２×１０^７のＣＯＳ−１細胞にＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１（ＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯ Ｉｎｃ．）を用いて一過性に導入した。ライブラリーを一過性に発現させたＣＯＳ−１細胞から４Ｃ８ｍＡｂ陽性細胞を当該抗体とＭＡＣＳとを用いて精製した。４Ｃ８ｍＡｂ陽性ＣＯＳ−１細胞からＨｉｒｔ法（Ｈｉｒｔ Ｂ．，１９６７．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６：３６５−３６９）によりプラスミドを回収し、大腸菌（ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ ＤＨ１０Ｂ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ．）に導入して増幅した後プラスミドを上記と同様に調製した。上記ＣＯＳ−１細胞導入からプラスミド回収までの工程を更に３回繰り返した。
こうして得られた濃縮ライブラリーより無作為に３８４個の独立プラスミドクローンを単離し、上記と同様にＣＯＳ−１細胞に一過性に導入した後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて４Ｃ８陽性クローンを判別した。その結果、３個のクローンが４Ｃ８陽性となることが判明した（図１）。
陽性クローンの塩基配列をＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて決定し、ＢＬＡＳＴによりヌクレオチドデータベースの検索を行ったところ、３つの陽性クローンはいずれもＣＤ５２（Ｘｉａ，Ｍ．Ｑ．ｅｔ ａｌ．，１９９１．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：１６７７−１６８４）をコードすることが判明した。当該ｃＤＮＡをＣＯＳ−１細胞で発現させたものは、抗ＣＤ５２抗体であることが知られているＣａｍｐａｔｈ−１Ｈによっても染色された。また、ＣＤ５２と同じＧＰＩアンカータンパク質であるＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ５９のｃＤＮＡをＣＯＳ−１細胞で発現させ、４Ｃ８ｍＡｂによる染色性をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒで解析したところ陰性となり、４Ｃ８ｍＡｂがＧＰＩアンカータンパク質に共通の構造を認識していないことが確認された（図示せず）。これらのことから、４Ｃ８はＣＤ５２であると断定された。
実施例２：Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ副刺激による調節性Ｔ細胞の誘導
ＣＤ５２を抗原とするモノクローナル抗体Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ（Ｃ１Ｈ）を副刺激として用いたときに、４Ｃ８ｍＡｂを用いたときと同様にＣＤ４陽性Ｔ細胞から調節性Ｔ細胞が誘導されるかどうかを検討した。
健常人ボランティア末梢血からＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）による密度勾配遠心法により末梢血単核球を分離した。ＣＤ４陽性Ｔ細胞は、末梢血単核球よりＭＡＣＳ ＣＤ４＋Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて試薬製造者の操作手順書に従ってネガティブセレクションによって調製した。
プレートへの抗体の固相化は次のように行った。ＰＢＳを用いて１００ｎｇ／ｍｌに調製した抗ＣＤ３抗体（ＯＲＴＨＯＣＬＯＮＥ ＯＫＴ３，Ｏｒｔｈｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を４８ｗｅｌｌプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に分注して４℃で２４時間インキュベージョンを行って固相化した後、ＰＢＳを用いて１０μｇ／ｍｌに調製した４Ｃ８ｍＡｂあるいはＣａｍｐａｔｈ−１Ｈ（ＣＡＭＰＡＴＨ，Ｂｅｒｌｅｘ）を同様に固相化した。
前述の方法により調製したＣＤ４陽性Ｔ細胞はＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ）に１０％ＦＣＳと１５ｍＭのＨＥＰＥＳバッファーを添加した培地に懸濁し、上記の方法で抗体を固相化したプレートに８×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種し、ＣＯ_２インキュベータ中で３７℃／５％ＣＯ_２で３日間培養した。培養後に細胞を回収し洗浄した後、培地に再懸濁して２４ｗｅｌｌプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種し、更に４日間無刺激下で培養して休止状態にしたものを４Ｃ８ｍＡｂ副刺激細胞あるいはＣａｍｐａｔｈ−１Ｈ副刺激細胞として抑制アッセイに供した。
抑制アッセイは次のように行った。９６ｗｅｌｌＵ底プレート（ＩＣＮ）にＣＤ４陽性Ｔ細胞１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌをＸ線照射（５０００ｒａｄ）した末梢血単核球４×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌと共に播種し、抗ＣＤ３抗体を最終濃度２５ｎｇ／ｍｌで添加して３日間培養した。このとき、調節性Ｔ細胞を加えなかった対照群と調節性Ｔ細胞としてＸ線照射（５０００ｒａｄ）した４Ｃ８ｍＡｂ副刺激細胞またはＣａｍｐａｔｈ−１Ｈ副刺激細胞を０．５〜２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで添加した群とで［^３Ｈ］チミジン取り込みを比較して抑制活性を評価した。［^３Ｈ］チミジン取り込みは、培養３日目に０．２μＣｉ／ｗｅｌｌの［^３Ｈ］チミジンを添加して８時間後に細胞を回収し、細胞に取り込まれた［^３Ｈ］チミジンのカウントをベータプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で測定することにより評価した。１回のアッセイに用いた細胞は全て同一提供者由来である。
図２に示したように、Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ副刺激細胞は４Ｃ８ｍＡｂ副刺激細胞と同様にＣＤ４陽性Ｔ細胞の抗ＣＤ３抗体刺激による増殖を添加細胞数依存的に抑制した。
実施例３：Ｃａｍｐａｔｈ−１ＨによるＣＤ３陽性Ｔ細胞の経血管内皮細胞遊走の抑制
４Ｃ８ｍＡｂで報告されているＣＤ３陽性Ｔ細胞の経内皮細胞遊走に対する抑制活性（Ｍａｓｕｙａｍａ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１８９（６），９７９−９８９）が他の抗ＣＤ５２抗体でも見られるかどうかをＣａｍｐａｔｈ−１Ｈを用いて検討した。方法は上記論文で報告した方法に基づいて以下のように行った。
ＣＤ３陽性Ｔ細胞は末梢血単核球からナイロンウールカラムを用いてＣＤ３陽性Ｔ細胞画分を濃縮した後、抗ＣＤ１６磁気抗体（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を用いたネガティブセレクションにより調製した。
５０μｌ／ｗｅｌｌのコラーゲンゲルを敷いた９６ｗｅｌｌ平底プレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にヒト臍帯静脈血管内皮細胞をコンフルエントになるまで培養したものをアッセイに供した。ＣＤ３陽性Ｔ細胞はＭ１９９（ＧＩＢＣＯ）に０．５％ＢＳＡを添加した培地中に０．３〜３μｇ／ｍｌの４Ｃ８ｍＡｂまたはＣａｍｐａｔｈ−１Ｈを加え、２０分間氷上に静置して前処置を行った。このＣＤ３陽性Ｔ細胞（３×１０^５／ｗｅｌｌ）を抗体処置後、洗浄せずに前述のヒト臍帯静脈血管内皮細胞を敷いたプレートに播種した。このプレートを５０×ｇで１分間遠心した後、３７℃で３時間インキュベーションを行い、未接着ＣＤ３陽性Ｔ細胞と血管内皮細胞をＥＤＴＡで処理して洗浄除去後、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞層下のコラーゲンゲル内へ遊走しているＴ細胞数を位相差顕微鏡下で計数し、単位面積あたりの遊走細胞数を抗体処置群と未処置群で比較した。実験はすべてトリプリケートで行った。
図３に示したように、Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈは４Ｃ８ｍＡｂ同様にＣＤ３陽性Ｔ細胞の経内皮細胞遊走を抑制した。したがって、抗ＣＤ５２抗体であるＣａｍｐａｔｈ−１Ｈは４Ｃ８ｍＡｂともに、経内皮細胞遊走抑制を誘導することが判明した。
実施例４−１：抗ＣＤ５２抗体副刺激により誘導される調節性Ｔ細胞のＣＤ４陽性Ｔ細胞 混合リンパ球培養反応に対する抑制
抗ＣＤ５２抗体副刺激により誘導される調節性Ｔ細胞がアロ抗原刺激によるＣＤ４陽性Ｔ細胞の反応を抑制するかどうかを検討するため、ＣＤ４陽性Ｔ細胞混合リンパ球培養反応アッセイを行った。抗ＣＤ５２抗体としては４Ｃ８ｍＡｂを使用した。
調節性Ｔ細胞は実施例２に示した方法で誘導した。刺激細胞として用いた単球由来成熟樹状細胞は次のように誘導した。末梢血単核球よりＭＡＣＳマイクロビーズＣＤ１４（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて試薬製造者の操作手順書に従ってポジティブセレクションによってＣＤ１４陽性細胞を調製した。ＣＤ１４陽性細胞をＲＰＭＩ１６４０に１０％ＦＣＳ、２−メルカプトエタノール（ＧＩＢＣＯ）、１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４、５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを添加した培地に懸濁し、６ｗｅｌｌプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に３×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種して、５日間培養後、最終濃度１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを添加し、更に２４時間培養を行って単球由来成熟樹状細胞を誘導した。細胞の一部はフローサイトメータ（ＦＡＣＳｃａｎ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）解析に供し、成熟樹状細胞マーカーの発現を確認した。
混合リンパ球培養反応は提供者Ａから調製したＣＤ４陽性Ｔ細胞（１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）と異なる提供者Ｂから調製した単球由来成熟樹状細胞（１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を９６ｗｅｌｌＵ底プレートに播種し、４日間培養した。このとき、調節性Ｔ細胞を加えなかった対照群と調節性Ｔ細胞としてＸ線照射（５０００ｒａｄ）した４Ｃ８ｍＡｂ副刺激細胞を１〜２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで添加した群とで［^３Ｈ］チミジン取り込みを比較し抑制活性を評価した。［^３Ｈ］チミジン取り込み測定は実施例１と同様に行った。但し、［^３Ｈ］チミジン添加から細胞回収までの培養時間は１６時間とした。
図４に示したように、４Ｃ８ｍＡｂ副刺激細胞はＣＤ４陽性Ｔ細胞混合リンパ球培養反応を添加細胞数依存的に抑制した。
実施例４−２：Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ副刺激により誘導される調節性Ｔ細胞のＣＤ４陽性Ｔ細 胞混合リンパ球培養反応に対する抑制
抗ＣＤ５２抗体としてＣａｍｐａｔｈ−１Ｈを用いて誘導した調節性Ｔ細胞によってもアロ抗原刺激によるＣＤ４陽性Ｔ細胞の反応が抑制されるかどうかを検討した。実験は上記実施例４−１と同様の方法で実施した。ただし、反応期間は３日間とした。
図５に示したように、Ｃａｍａｐｔｈ−１Ｈ副刺激細胞はＣＤ４陽性Ｔ細胞混合リンパ球培養反応を添加細胞数依存的に抑制した。
したがって、Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ副刺激により誘導される調節性Ｔ細胞は、４Ｃ８ｍＡｂ副刺激により誘導される調節性Ｔ細胞と同様に、アロ抗原刺激によるＣＤ４陽性Ｔ細胞の反応を抑制することが示された。
実施例５−１：抗ＣＤ５２抗体副刺激により誘導される調節性Ｔ細胞のＣＤ８陽性Ｔ 細胞混合リンパ球培養反応に対する抑制
抗ＣＤ５２抗体副刺激により誘導される調節性Ｔ細胞がアロ抗原刺激によるＣＤ８陽性Ｔ細胞の反応に対しても抑制を示すかどうかを検討するため、ＣＤ８陽性Ｔ細胞混合リンパ球培養反応アッセイを行った。抗ＣＤ５２抗体としては４Ｃ８ｍＡｂを使用した。
ＣＤ８陽性Ｔ細胞は、末梢血単核球よりＭＡＣＳ ＣＤ８＋Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて試薬製造者の操作手順書に従いネガティブセレクションによって調製した。調節性Ｔ細胞は実施例２に示した方法で誘導した。刺激細胞として用いた単球由来成熟樹状細胞は実施例４−１と同様に誘導した。
混合リンパ球培養反応は提供者Ａから調製したＣＤ８陽性Ｔ細胞（１ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）と異なる提供者Ｂから調製した単球由来成熟樹状細胞（１ｘ１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を９６ｗｅｌｌＵ底プレートに播種し、３日間培養した。このとき、調節性Ｔ細胞を加えなかった対照群と調節性Ｔ細胞としてＸ線照射（５０００ｒａｄ）した４Ｃ８ｍＡｂ副刺激細胞を１−２ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで添加した群とで［^３Ｈ］チミジン取り込みを比較し抑制活性を評価した。［^３Ｈ］チミジン取り込み測定は上記実施例４−２と同様に行った。
図６に示したように、４Ｃ８ｍＡｂ副刺激細胞はＣＤ８陽性Ｔ細胞混合リンパ球培養反応を添加細胞数依存的に抑制した。
実施例５−２：Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ副刺激により誘導される調節性Ｔ細胞のＣＤ８陽性Ｔ細 胞混合リンパ球培養反応に対する抑制
抗ＣＤ５２抗体としてＣａｍｐａｔｈ−１Ｈを用いて誘導した調節性Ｔ細胞によってもアロ抗原刺激によるＣＤ８陽性Ｔ細胞の反応に対しても抑制を示すかどうかを検討するため、ＣＤ８陽性Ｔ細胞混合リンパ球培養反応アッセイを行った。実験は実施例５−１と同様の方法で実施した。
図７に示したように、Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ副刺激細胞は混合リンパ球培養反応を添加細胞数依存的に抑制した。
したがって、Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ副刺激により誘導される調節性Ｔ細胞は、４Ｃ８ｍＡｂ副刺激により誘導される調節性Ｔ細胞と同様に、アロ抗原刺激によるＣＤ８陽性Ｔ細胞の反応を抑制することが示された。
実施例６：アロ抗原反応後のＣＤ４陽性Ｔ細胞からの調節性Ｔ細胞の誘導
アロ抗原反応後のＣＤ４陽性Ｔ細胞に抗ＣＤ５２抗体副刺激を加えることによって、抗原選択的な抑制活性をもった調節性Ｔ細胞を誘導することが可能であるかどうかを検討した。
刺激細胞として用いた単球由来成熟樹状細胞は次のように誘導した。実施例４−１に示した方法で調製したＣＤ１４陽性細胞を、Ｘ−ＶＩＶＯ−１５培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）に１％熱非働化済自己血漿、１００ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−４、５０ｎｇ／ｍｌ ＧＭ−ＣＳＦを添加した培地に懸濁し、６ｗｅｌｌプレートに３×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで７日間培養後、細胞を回収・洗浄し、前述の培地に１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１β（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、３μｇ／ｍｌ ＩＬ−６（キリン社内施設にて生産）、１０ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦα（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、１μｇ／ｍｌプロスタグランジンＥ２（Ｓｉｇｍａ）を添加した培地に懸濁して１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで６ｗｅｌｌプレートに播種し、更に２日間培養して単球由来成熟樹状細胞を誘導した。ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性Ｔ細胞は上記実施例２に記載の方法で単離したＣＤ４陽性Ｔ細胞から、ＭＡＣＳ ＣＤ４５ＲＡ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、試薬製造者の操作手順書に従いポジティブセレクションによって調製した。
アロ抗原反応およびその後の調節性Ｔ細胞誘導は次のように行った。提供者Ａから調製したＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性Ｔ細胞（１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）と異なる提供者Ｂから調製した単球由来成熟樹状細胞（１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を、ピルビン酸（Ｇｉｂｃｏ）およびＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＸ−ＶＩＶＯ−１５培地に懸濁して２４ｗｅｌｌプレートに播種した。６日間培養後、細胞を回収し、１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように再調製し、更に４日間培養した細胞をアロ抗原反応後Ｔ細胞として、この細胞集団から調節性Ｔ細胞の誘導を行った。調節性Ｔ細胞の誘導は実施例２に示した方法で行った。ただし、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の代わりにアロ反応後Ｔ細胞を用いた。対照群として、提供者Ａから調製したＣＤ４陽性Ｔ細胞から調節性Ｔ細胞を誘導した。以下、アロ反応後Ｔ細胞から誘導した調節性Ｔ細胞をアロ抗原反応後調節性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性Ｔ細胞から誘導した調節性Ｔ細胞をコントロール調節性Ｔ細胞と記す。
各調節性Ｔ細胞の抑制活性の評価は実施例４に記載の混合リンパ球培養反応によって行った。ただし、刺激細胞として、アロ抗原反応後Ｔ細胞の作製の際に用いた提供者Ｂから調製した単球由来成熟樹状細胞、あるいは第三者である提供者Ｃから調製した単球由来成熟樹状細胞を用いた。反応の際の培地としてはＸ−ＶＩＶＯ−１５培地にピルビン酸と非必須アミノ酸溶液を添加したものを用い、培養期間は３日間とした。
図８に示したように、提供者Ｂに対する反応において、アロ抗原反応後調節Ｔ細胞はコントロール調節性Ｔ細胞よりも強い抑制活性を示した。しかしながら、第三者である提供者Ｃに対する反応において、両者の抑制活性は同等であった。以上のことから、アロ抗原反応後Ｔ細胞から抗ＣＤ５２抗体を用いて調節性Ｔ細胞を誘導することで、アロ抗原選択的な抑制活性を示す調節性Ｔ細胞が得られることが判った。
実施例７−１：抗ＣＤ５２抗体副刺激により誘導される調節性Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏに おける増幅
抗ＣＤ５２抗体副刺激により誘導される調節性Ｔ細胞をＩＬ−２存在下で培養することにより増幅が可能であるかどうかを検討した。
抗ＣＤ３抗体および４Ｃ８ ｍＡｂを実施例２に記載の方法で固相化したプレートに、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を８×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種して３日間培養した。培養後に細胞を回収・洗浄した後、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２（Ｃｈｉｒｏｎ）含有培地に再懸濁して２４ｗｅｌｌプレートに１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種した。２日間の培養の後、細胞を回収し、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２含有培地で１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるよう再調製して、更に３日間培養した。計８日間の培養後の細胞を回収し、一部を用いて１回目の抑制アッセイ（ｄａｙ８）を実施例２に記載の方法で実施した。更に、８日間培養後の細胞の一部は、洗浄したのち、抗ＣＤ３抗体および４Ｃ８ｍＡｂを固相化したプレートでの３日間の培養と無刺激下での４日間の培養を実施例２に示した方法で行い、得られた細胞を用いて２回目の抑制アッセイ（ｄａｙ１５）を実施した。対照群として、培養３日目から８日目までの期間をＩＬ−２不含培地で培養する点以外は全く同じ処理を行った細胞を、それぞれの抑制アッセイで用いた。
図９に示したように、ＩＬ−２存在下で５日間培養することによって、細胞数は１０倍以上に増加したが、図１０に示したように、ＩＬ−２存在下での培養直後に実施した１回目の抑制アッセイ（ｄａｙ８）では、対照群に較べて抑制活性が大きく減弱していた。しかしながら、図１１に示したように、この細胞に再度抗ＣＤ５２抗体副刺激を施した後の２回目の抑制アッセイ（ｄａｙ１５）では、抑制活性の回復が見られた。１５日間の全培養期間で細胞数は３０倍に増加した。
実施例７−２：Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ副刺激により誘導される調節性Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏに おける増幅
抗ＣＤ５２抗体としてＣａｍｐａｔｈ−１Ｈを用いて誘導した調節性Ｔ細胞もＩＬ−２存在下で培養することにより増幅が可能であるかどうかを検討した。
調節性Ｔ細胞の誘導および増幅は実施例７−１に記載の方法で実施した。ただし、副刺激としてＣａｍｐａｔｈ−１Ｈ（３０μｇ／ｍｌまたは１００μｇ／ｍｌにてプレートに固相化）を用いた。また、ＩＬ−２存在下での培養期間はこの実施例では４日間、抑制アッセイはｄａｙ１４でのみ実施した。ＩＬ−２非添加群は設けず、実施例７同様に副刺激として４Ｃ８ｍＡｂを用いたものを対照群とした。Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈは４Ｃ８ｍＡｂに較べて活性化能が若干弱い傾向があったため、充分な活性化を得るため、この実施例においては固相化の際の条件として３０μｇ／ｍｌあるいは１００μｇ／ｍｌと高い濃度を設定した。
図１２に示したように、ＩＬ−２存在下での培養によってＣａｍｐａｔｈ−１Ｈ副刺激細胞は４Ｃ８ｍＡｂ副刺激細胞同様、１０倍以上に増幅した。また、図１３に示したようにＣａｍｐａｔｈ−１Ｈ副刺激細胞は４Ｃ８ｍＡｂ副刺激細胞同様に増幅後も抑制活性を保持していた。
したがって、ＩＬ−２存在下での増幅後に抗ＣＤ５２抗体副刺激を繰り返すことによって、抑制活性を保持した調節性Ｔ細胞を増幅することが可能であることが示された。
実施例８−１：ＳＣＩＤマウスへのヒト末梢血移入によるマウス致死作用の調節性Ｔ 細胞同時移入による抑制と調節性Ｔ細胞の生体内における安全性
ＳＣＩＤマウス（６週齢、オス、日本クレアから入手）に対し、ＮＫ細胞の活性を抑制しヒト細胞を生着しやすくするためにＩＬ−２受容体β鎖を認識するＴＭ−β１抗体（２０μｇ／マウス，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）をヒト細胞移入前日に腹腔内投与し、ヒト細胞移入日に亜致死量（２．５Ｇｙ）の放射線を照射した後、ヒト細胞の移入を行った。健常人からアフェレーシスによって採取した末梢血をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＡＸＩＳ−ＳＨＩＥＬＤ）による比重遠心法によって得た単核細胞（ＰＢＭＣ）、または同一ドナーのＰＢＭＣから実施例２に記載の方法で分離したＣＤ４陽性Ｔ細胞から４Ｃ８ｍＡｂで増幅・誘導した（実施例７で示した方法による）調節性Ｔ細胞を用意し、ＰＢＭＣ １Ｘ１０^７もしくは２Ｘ１０^７個を単独で投与、調節性Ｔ細胞１Ｘ１０^７もしくは２Ｘ１０^７個を単独で投与、またはＰＢＭＣと調節性Ｔ細胞各１Ｘ１０^７個（合計２Ｘ１０^７個）を混じて腹腔内投与する各群を設けた。その他に、細胞非移入群を設けた。なお、移入したＰＢＭＣを抗ＣＤ３抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色しＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて測定することにより、ＰＢＭＣに含まれるＣＤ３陽性Ｔ細胞の割合は、４２％であることを確認している。何れの群も５匹のマウスを用いた。マウスの体重測定と状態の観察を細胞移入後３０日間行った。
ＴＭ−β１抗体を投与したＳＣＩＤマウスにヒトＰＢＭＣを腹腔内投与すると、マウス体内でヒトＴ細胞が活性化して増殖する結果、マウスが異種移植片対宿主症様を呈し衰弱死亡することを事前に確認している。今回の実験においてもＰＢＭＣを単独で１Ｘ１０^７もしくは２Ｘ１０^７個移入されたマウスは、実験開始時に行った放射線照射による一過性の体重減少から回復することなく（図１４）、何れの群においても全例が約２週間で死亡した（図１５）。一方、調節性Ｔ細胞を単独で１Ｘ１０^７もしくは２Ｘ１０^７個移入されたマウスでは、死亡例は認められず、細胞非移入群とほぼ同様な体重変動を示しながら（図１４）、全例が３０日間の観察期間終了まで生存した（図１５）。ＰＢＭＣと調節性Ｔ細胞を混じて投与された群では、ＰＢＭＣ単独移入群よりやや遅れて３／５例が死亡したが、残りの２／５例は観察期間終了時まで生存し、ＰＢＭＣ単独投与した何れの群よりも有意な生存延長（Ｌｏｇｒａｎｋ ｔｅｓｔによる）を示した（図１５）。
実施例８−２：ＳＣＩＤマウスへのヒト末梢血投与によるマウス致死作用の調節性Ｔ 細胞同時投与による抑制と調節性Ｔ細胞の生体内における安全性
ＳＣＩＤマウス（８週齢、メス、日本クレアから入手）に対し、ＮＫ細胞の活性を抑制してヒト細胞を生着しやすくするために、ＩＬ−２β受容体を認識するＴＭ−β１抗体（２０μｇ／マウス，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）をヒト細胞投与前日に腹腔内投与し、ヒト細胞投与日に亜致死量（２．５Ｇｙ）の放射線を照射した後、ヒト細胞の投与を行った。健常人からアフェレーシスによって採取した末梢血を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＡＸＩＳ−ＳＨＩＥＬＤ）による比重遠心法に供し、得られた単核細胞（ＰＢＭＣ）または同一ドナーのＰＢＭＣから実施例２記載の方法で単離したＣＤ４陽性細胞からＣａｍｐａｔｈ−１Ｈで増幅・誘導した（実施例７−２参照）調節性Ｔ細胞を用意した。ＰＢＭＣ１．２Ｘ１０^７個を単独で投与する群、調節性Ｔ細胞１．２Ｘ１０^７個を単独で投与する群、ＰＢＭＣと調節性Ｔ細胞とをそれぞれ１．２Ｘ１０^７個（合計２．４Ｘ１０^７個）を混じて腹腔内投与する群、および細胞を投与しない細胞非投与群を設けた。調節性Ｔ細胞単独投与群を除いた各群は、細胞投与後１１日目で剖検を行い急性期の症状（組織所見を含む）を観察する群とマウスの体重測定と状態を２１日間観察する群とに分け、それぞれの群には５匹のマウスを用いた。なお、得られた細胞数の関係から調節性Ｔ細胞単独投与群（２匹）は、細胞投与後１２日目における剖検のみを行った。なお、投与したＰＢＭＣ中に含まれるＣＤ３陽性Ｔ細胞の割合は、抗ＣＤ３抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色しＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を測定することにより、４９．４％であることが予め確認されている。
我々は、ＴＭ−β１抗体を投与したＳＣＩＤマウスにヒトＰＢＭＣを腹腔内投与すると、マウス体内でヒトＴ細胞が活性化して増殖する結果、マウスが異種移植片対宿主症様を呈し衰弱死亡することが事前に確認されている。今回の実験においても、ＰＢＭＣを単独で投与されたマウスは、実験開始時に行った放射線照射による一過性の体重減少から回復することなく（図１６）、何れの群においても全例が２１日目までに死亡した（図１７）。ＰＢＭＣと調節性Ｔ細胞を混じて投与された群では、単純には合計２倍量のヒト細胞を投与されたにもかかわらず細胞非投与群とほぼ同様な体重の推移を示し（図１６）、全例が生存した（図１７）。なお、調節性Ｔ細胞を単独で投与されたマウスでは、細胞非投与群を上回る体重増加の回復傾向を示し（図１６）、マウスに対する急性期の侵襲を示すことは少ないことが示唆された。また、試験期間中の剖検時において、ＰＢＭＣ単独投与群では消化管における単核細胞浸潤、水腫や毛細血管の拡張などがみられたが、ＰＢＭＣと調節性Ｔ細胞混合投与群や調節性Ｔ細胞単独投与群ではそのような変化が認められなかった（図１８）。
以上の成績から、本ｉｎ ｖｉｖｏモデル系において調節性Ｔ細胞はＰＢＭＣと異なり、単独ではマウスに対して全く病原性を示さないこと、および単独投与で起こるＰＢＭＣのマウスに対する致死作用が調節性Ｔ細胞を同時に投与することにより顕著に抑制されることが明らかになった。またこれらのことから、抗ＣＤ５２抗体により誘導された調節性Ｔ細胞は、生体内においても過度なヒトＴ細胞の活性化を抑制することから、その投与はＴ細胞の異常活性化に伴い発症する各種疾患に対し、有効な治療法となることが示唆された。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

産業上の利用の可能性

本発明により、ＣＤ５２を介したシグナルが免疫抑制的、すなわち、調節性Ｔ細胞の分化誘導および／または増殖促進ならびに経血管内皮細胞遊走抑制を誘導することが明らかとなり、ＣＤ５２に対する抗体を含むＣＤ５２アゴニストが免疫抑制、調節性Ｔ細胞の分化誘導および／または増殖促進ならびに経血管内皮細胞遊走抑制のための医薬組成物、すなわち自己免疫疾患、アレルギー疾患および移植免疫応答抑制等のための医薬組成物の有効成分として有用である。さらに、本発明により、ＣＤ５２アゴニストを用いて調節性Ｔ細胞をｅｘ ｖｉｖｏで調製することが可能となり、自己免疫疾患および移植免疫応答の抑制などの免疫抑制が望まれる症状・疾患に対する治療および／または予防への利用が可能となる。
また、本発明によって示された、抗原選択性を持った調節性Ｔ細胞を用いることにより、従来の免疫抑制剤の使用で起こる可能性がある免疫系全般に対する抑制に伴う副作用を回避しつつ、標的抗原特異的な免疫反応のみを抑制することが期待できる。

Claims (26)

1. ４Ｃ８抗体以外のＣＤ５２アゴニストを有効成分として含有する、免疫抑制のための医薬組成物。
2. ４Ｃ８抗体以外のＣＤ５２アゴニストを有効成分として含有する、調節性Ｔ細胞の分化誘導および／または増殖促進のための医薬組成物。
3. 調節性Ｔ細胞が抗原選択的な抑制活性を有するものである、請求項１または２記載の医薬組成物。
4. ＣＤ３アゴニストをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の医薬組成物。
5. ＣＤ３アゴニストが抗ＣＤ３抗体またはそのフラグメントである、請求項４記載の医薬組成物。
6. 抗ＣＤ３抗体がヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項５記載の医薬組成物。
7. ４Ｃ８抗体以外のＣＤ５２アゴニストを有効成分として含有する、免疫細胞の経血管内皮細胞遊走抑制のための医薬組成物。
8. ＣＤ５２アゴニストが抗ＣＤ５２抗体またはそのフラグメントである、請求項１〜７のいずれか１項記載の医薬組成物。
9. 抗ＣＤ５２抗体がヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項８記載の医薬組成物。
10. 上記ヒト化抗体がラットヒト化抗体Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈである、請求項９記載の医薬組成物。
11. 自己免疫疾患、アレルギー疾患または移植免疫応答の予防または治療のための、請求項１〜１０のいずれか１項記載の医薬組成物。
12. 免疫細胞の表面に発現するＣＤ５２に４Ｃ８抗体以外のＣＤ５２アゴニストを作用させることにより調節性Ｔ細胞の分化誘導および／または増殖を促進する方法。
13. 調節性Ｔ細胞が抗原選択的な抑制活性を有するものである、請求項１２記載の調節性Ｔ細胞の分化誘導および／または増殖を促進する方法。
14. ＣＤ５２アゴニストが抗ＣＤ５２抗体またはそのフラグメントである、請求項１２記載の方法。
15. 抗ＣＤ５２抗体がヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項１４記載の方法。
16. 上記ヒト化抗体がラットヒト化抗体Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈである、請求項１５記載の方法。
17. 上記免疫細胞の表面に発現するＣＤ３にＣＤ３アゴニストを作用させることをさらに含む、請求１２記載の方法。
18. ＣＤ３アゴニストが抗ＣＤ３抗体またはそのフラグメントである、請求項１７記載の方法。
19. 抗ＣＤ３抗体がヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項１８記載の方法。
20. 上記免疫細胞が、末梢血、リンパ節または胸腺に含まれるものである、請求項１２〜１９のいずれか１項記載の方法。
21. 上記免疫細胞がＴ細胞である、請求項２０記載の方法。
22. 上記免疫細胞が末梢血単核球である、請求項２１記載の方法。
23. 免疫細胞へのＣＤ３アゴニスト刺激およびＣＤ５２アゴニスト刺激が、生体外で行われるものである請求項１２〜２２のいずれか１項記載の方法。
24. 免疫細胞へのＣＤ３アゴニスト刺激およびＣＤ５２アゴニスト刺激が、生体内で行われるものである請求項１２〜２２のいずれか１項記載の方法。
25. 免疫抑制効果、調節性Ｔ細胞の分化誘導および／もしくは増殖促進ならびに／または免疫細胞の経血管内皮細胞遊走抑制効果を有する薬剤となる、抗ＣＤ５２ヒト化抗体またはヒト抗体を作製する方法。
26. 免疫抑制効果、調節性Ｔ細胞の分化誘導および／もしくは増殖促進ならびに／または免疫細胞の経血管内皮細胞遊走抑制効果を有する薬剤を、ＣＤ５２との相互作用を指標にスクリーニングする方法。

Images