WO2004087210A1 - 抗cd52抗体による調節性t細胞分化誘導･増殖方法およびそのための医薬組成物 - Google Patents

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cell
agonist
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Junichi Masuyama
Tomoko Watanabe
Yoshiaki Soma
Yasunori Yamaguchi
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Kirin Beer Kabushiki Kaisha
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Definitions

  • the present invention relates to a novel method for suppressing immunity, in particular, a method for suppressing immunity by inducing differentiation and promoting proliferation of regulatory T cells (sometimes called inhibitory T cells), and
  • the invention relates to a pharmaceutical composition for use in the method.
  • the 4C8 monoclonal antibody is a monoclonal antibody that inhibits subendothelial migration after human T cells adhere to vascular endothelial cells (Masuyama, J. et al. , (1999) J. Exp. Med., 189, 979).
  • T cells In order for T cells to migrate to peripheral tissues such as inflamed areas, they tightly adhere to vascular endothelial cells via integrin molecules and then change to a form suitable for cell movement, and migrate through the gaps between vascular endothelial cells Need to be done.
  • CD4 + CD45R0 + CD26 strongly positive activated memory T cells selectively migrate, instead of all T cells adhering to vascular endothelial cells migrating into the subendothelium. That is, 4C8mAb is a monoclonal antibody that specifically inhibits T cell subset-selective subendothelial migration without inhibiting T cell adhesion to vascular endothelial cells.
  • T cells When T cells are stimulated with a low concentration of CD3 agonist that does not have T cell activation ability alone, T cells can be activated by simultaneously applying appropriate co-stimulation. Costimulation
  • CD3 agonist it not only enhances the activation ability of CD3 agonist, but also has a significant effect on the function of T cells after activation.
  • stimulation with 4C8mAb functioned as a co-stimulation, activating and proliferating CD4-positive T cells.
  • the cells after activation by co-stimulation of CD3 and 4C8 mAb showed an inhibitory activity on the proliferation of CD4-positive T cells by polyclonal stimulation in vitro, and Nodal T cells were found to be induced.
  • ⁇ cells One of the cells that plays a central role in the immune system as a host defense system against various pathogens is ⁇ cells.
  • ⁇ Cells are roughly divided into CD4-positive helper ⁇ cells and CD8-positive cytotoxic ⁇ cells. The former is mainly based on the pattern of cytokine production at a specific stage of differentiation and maturation after antigen stimulation. Thl cells that produce ⁇ ,
  • Th2 cells that produce IL-4.
  • the former is deeply involved in host defense as cell-mediated immunity and the latter as humoral immunity.
  • the immune response is deeply involved in the elimination of pathogens and the acquisition of infection resistance in a subtle balance by the action of T cells of these different properties.
  • a mechanism that eliminates foreign non-self antigens works, and immunological tolerance is established for self antigens that form a living body, and the mechanism of exclusion does not work.
  • an excessive immune response to self antigens causes autoimmune diseases.
  • immunological tolerance to self-antigens is not absolute, the mechanisms by which various immunological tolerances are induced at the T cell level are known.
  • peripheral tolerance This is the control of self-reactive T cells outside the thymus by a mechanism called (peripheral tolerance). The latter include induction of cell death or non-responsiveness to self antigens
  • Regulatory T cells are a new concept of T cells recently proposed, and are defined by having an inhibitory effect on other T cells.
  • the immune response is based on a subtle balance; for example, it is known that the Thl cells and Th2 cells described above antagonize each other's immune response and that one acts as a regulatory T cell for the other. It has come to be.
  • verification of the existence of a cell population as a regulatory T cell and analysis of its properties have been described in recent history of immunology. There is still much discussion.
  • Such regulatory T cells have been studied as cells that have the function of suppressing or regulating specific immune responses in vitro or in vivo, and vary depending on cell surface markers, the type of cytokine produced, and the mechanism of suppression and regulation. (Roncarolo, MG, and MK Levings. 2000. Curr. Opinion. Immunol. 12: 676-683.).
  • the T cell population described below as a marker for CD4 + CD25 + which is mainly used in humans such as mice and rats.
  • CD25-positive, RT6.1-positive (expressed in most of mature rat T cells), CD5-strongly positive, or CD45RB-weakly positive (mouse) or CD45RC-weakly positive (rat) from normal mouse or rat CD4-positive spleen cells. It has been clarified that removing specific cells and transferring the remaining T cells to immunodeficient animals induces organ-specific autoimmune diseases.
  • CD4 + CD25 + regulatory T cells have been identified in mice and rats as described above, the presence of similar cells in humans was only reported in 2001 from multiple groups ( Jonuleii, H. et al., 2001. J. Exp.
  • anti-CD3 antibody stimulation stimulates the cytokine synthesis of CD4 + CD25 + regulatory T cells.
  • allogeneic mature DCs allogeneic mature DC
  • cytokine synthesis of CD4 + CD25 + regulatory T cells No production was observed, indicating that the cells were not responding to antigen stimulation (anergy).
  • cytokines such as IL-2, IL-4, and IL-15
  • the DNA synthesis ability of CD4-positive CD25-positive regulatory T cells is increased, but CM-positive and CD25-negative Not as good as T cells.
  • CD4 + CD25 + T cells When CD4 + CD25 + T cells are stimulated with anti-CD3 antibodies or allogeneic mature DCs in the presence of CD25 + regulatory T cells, no CD4 + CD25 + regulatory T cells are present Compared to the lower one, a CD4 + CD25 + regulatory T cell cell number-dependent growth inhibitory effect is seen.
  • CD4 + CD25 + regulatory T cells have the ability to produce inhibitory site forces such as IL-10 and TGF / 31, although lower compared to mice CD4 + CD25-negative T cells It was reported that the growth inhibitory effect was not released by neutralizing antibodies against these cytokines, and that the inhibitory effect required direct cell-to-cell contact between CD4 + CD25 + T cells and CD4 + CD25 + regulatory T cells. Have been.
  • CD4 + CD25 + regulatory T cells have been reported in mice, rats and humans and their characterization has been progressing, detailed mechanisms of differentiation and suppression of these cells are still being elucidated, and specific markers It has not been found yet.
  • the regulation is induced by allogeneic antigen stimulation in the presence of IL-10 and repeated stimulation by allogeneic immature dendritic cells (allogeneic DCs).
  • Sex T cells have also been reported (Groux, H. et al., 1997. Nature. 389: 737-742; Jonul iet, H. et al., 2000. J. Exp. Med. 192: 1213-1222).
  • Trl cells are anergic, as are CD4-positive and CD25-positive regulatory T cells, but the T cell suppression mechanism can be partially explained by the IL-10 and TGF-31 produced. However, it is often unclear whether Trl cells and CD4 + CD25 + regulatory T cells are completely different T cell subsets or the same cells with different activation stages.
  • CD4 and CD25 which are known regulatory T cell markers in mice and rats, was used as an index. ⁇ It was confirmed that this was the same in comparison with other cell surface markers and functions known in rats. This suggested the presence of CD4-positive and CD25-positive regulatory T cells in humans.
  • These cells are a rare cell population that makes up only 5-10% of peripheral blood CD4-positive T cells and are unresponsive to activation and proliferation stimulation.
  • a cytokine such as IL-2, IL-4 or IL-15
  • it is not sufficient for clinical applications such as amplifying the cell number and transferring it to humans.
  • regulatory T cells can suppress autoimmune diseases by transferring them, and can also suppress transplant rejection and graft-versus-host disease (GvHD) (Hara, M., et al. et al., 2001.J. Immunol. 166: 3789-3796; Taylor, PA et al.,
  • regulatory T cells can be obtained by ex vivo treatment of a pharmaceutical composition that promotes the growth of regulatory ⁇ cells, or peripheral blood or bone marrow cells collected from a patient or another human. There is hope for the development of a therapy that can be expanded and returned to the patient's body.
  • the 4C8 antigen is a membrane protein that is originally expressed on a part of immune system cells and was discovered to identify molecules involved in subendothelial migration after human T cells adhere to vascular endothelial cells. is there.
  • Monoclonal antibodies obtained by immunizing mice with human T cells are screened using the index to inhibit the in vitro extravasation of T cells in vitro. Obtained (Masuyama, J. et al., 1999. J. Exp. Med. 189: 979-989; W099 / 12972).
  • T cells In order for T cells to migrate to peripheral tissues such as inflamed areas, they adhere firmly to vascular endothelial cells via integrin molecules, then change to a form suitable for cell movement, and migrate through vascular endothelial cell gaps Need to be done. It is known that not all ⁇ cells adhered to vascular endothelial cells migrate into the subendothelium, but activated memory cells, which are CD4 positive, CD45R0 positive, and CD26 strong positive, selectively migrate. That is, the anti-4C8 monoclonal antibody (mAb) is a mAb that specifically inhibits T cell subset-selective subendothelial migration without inhibiting T cell adhesion to vascular endothelial cells.
  • mAb monoclonal antibody
  • the 4C8 antigen was strongly expressed on CD3-positive T cells and also expressed on B cells, NK cells, monocytes, and eosinophils, but was expressed on neutrophils and endothelial cells do not do.
  • Cross-linking with 4C8mAb not only promotes actin polymerization of T cells and polarizes cell morphology, but also stimulates cell motility.
  • Campath-1 was discovered by Waldmann et al. As a rat antibody capable of removing lymphocytes from human bone marrow transplants (Hale, G. et al. (1983) Blood, 62, 873).
  • the antigen of Campath-1 (CD52) was long unknown but was identified as a novel molecule by Xia et al. In 1991 (Xia, MQ et al., (1991) European J. Immunol., 21, 1677). It was also reported in 1993 that HE5, identified by Kirchhoff et al. As a specific molecule in the male reproductive tract epithelium, was the same molecule as CD52 (Kirchhoff, C. et al., U993). Development, 34, 8).
  • Campath-1 binds to CD52, which is highly expressed on lymphocytes, and has the effect of removing lymphocytes by causing cytotoxicity by complement or antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC).
  • a highly efficient lymphocyte-depleting antibody has been studied intensively to remove lymphocytes from bone marrow transplants for the purpose of reducing GvHD and to treat lymphoma.
  • Campath registered trademark
  • (Alemtuzumab) which is -1H, has been described by Millennium as a remedy for B cell lymphoma (Pangolis GA et al, (2001) Medical Oncology, 18, 99).
  • CD52 its antigen
  • Cross-linking of CD52 with an antibody in T cells results in protein phosphorylation similar to that of antigen receptor stimulation (Hederere RA et al., (2000) International Immunology, 12, 505).
  • the anti-CD3 antibody may stimulate T cell proliferation by cross-linking with the CD52 antibody in response to stimulation with the anti-CD2 antibody, thereby enhancing T cell proliferation (Valentin H et al., (1992) Transplantation, 54, 97, Rowan WC et al., (1994) International Immunology, 7, 69).
  • CD52 is expressed on the epidermis of the male reproductive tract, as described above, in addition to lymphocytes, monocytes, and macrophages.
  • CD52 which is expressed on the male reproductive tract epithelium, is released from epithelial cells and is incorporated into the sugar coating on the sperm surface during sperm maturation. It is thought that the negative charge of sialic acid in the sugar chain added to CD52 may play a role in preventing aggregation of sperm.
  • antibodies to CD52 have been reported to cause infertility, but the role of CD52 in sperm function remains largely unknown (Kirchhof f C et al., (2001) Cells Tissues Organs, 168, 93).
  • CD52 is a 12 amino acid peptide that is bound to the cell membrane by a GPI anchor (Xia, MQ. Et al., (1991) European J. Immunol., 21, 1677). Since the molecule itself is very small and has no intracellular domain, it is difficult to infer the function from its structure, which is considered to be one of the reasons why research on the function of CD52 has not progressed.
  • Patent Document 1 International Publication W099 / 12972 Patent Literature 2 Patent Gazette Tohokuhei 2—5 0 3 5 1 4
  • Non-Patent Document 1 Masuyama, J. et al., (2002) J. Immunol., 169, 3710
  • Non-Patent Document 2 Hale, G. et al., (1983) Blood, 62, 873.
  • Non-Patent Document 3 Xia, M.Q. et al., (1991) European J. Immunol., 21, 1677
  • Non-Patent Document 8 Rowan WC et al., (1994) International Immunology, 7, 69
  • the present invention relates to a method for inducing differentiation and / or promoting proliferation of regulatory T cells through CD52, a method for suppressing the migration of immune cells through endothelial cells via CD52, a method for suppressing immunity by these methods, and It is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for use in these methods, particularly a pharmaceutical composition containing an anti-CD52 antibody as an active ingredient.
  • the present inventors have conducted intensive studies on the 4C8 antigen recognized by the 4C8 antibody and found that the antigen is a CD52 molecule. From the conventional knowledge of CD52, it could not be predicted that CD52 would be involved in the suppression of transvascular endothelial cell migration of activated T cells or the induction of regulatory T cells.
  • the present inventors have further studied the anti-CD52 antibody, and surprisingly found that the anti-CD52 antibody, which was known only to have lymphocyte depleting antibody activity from patients with B-cell lymphoma, surprisingly suppresses the transendothelial cell migration.
  • Activity and regulatory T cell-inducing activity and discovered that the activity of anti-CD52 antibody-activated T cell transvascular endothelial cell migration inhibitory activity and regulatory T cell-inducing activity can be widely used in immunotherapy. They have found and completed the present invention.
  • the present invention is as follows:
  • a pharmaceutical composition for immunosuppression comprising a CD52 agonist other than the 1.4C8 antibody as an active ingredient; 2.4 A pharmaceutical composition for inducing differentiation and / or promoting proliferation of regulatory T cells, comprising a CD52 agonist other than the 4C8 antibody as an active ingredient;
  • composition according to any one of the above 1 to 3, further comprising a CD3 agonist
  • composition according to any one of the above 1 to 7, wherein the CD52 agonist is an anti-CD52 antibody or a fragment thereof;
  • a method of promoting differentiation induction and / or proliferation of regulatory T cells by causing a CD52 agonist other than the 4C8 antibody to act on CD52 expressed on the surface of immune cells;
  • CD52 agonist is an anti-CD52 antibody or a fragment thereof
  • the anti-CD52 antibody is a humanized antibody or a human antibody
  • CD3 agonist is an anti-CD3 antibody or a fragment thereof.
  • the anti-CD3 antibody is a humanized antibody or a human antibody
  • 20 The method according to 1 above, wherein the immune cells are contained in peripheral blood, lymph nodes, or thymus.
  • FIG. 1 shows the results of FACS analysis of C0S-1 cells into which one of the 4C8-positive clones was introduced.
  • the thick solid line is the result of staining with 4C8 mAb, and the broken line is the result of staining with the isotype control. Similar results were obtained from other positive clones.
  • FIG. 4 is a graph showing that the proliferation of CD4-positive T cells stimulated by anti-CD3 antibody is suppressed depending on the number of cells added to both stimulated cells.
  • FIG. 3 shows the results of examining the suppression of migration of CD3-positive T cells into collagen gel under human umbilical vein vascular monolayer endothelial cells by adding 4C8 mAb or Campath-1H. Both 4C8mAb and Campath-1H suppressed the transendothelial cell migration of CD3-positive T cells.
  • FIG. 4 shows the results of examining the suppression of the mixed lymphocyte culture reaction of 4C8 mAb costimulator cells.
  • 4C8mAb costimulator cells suppressed the CD4-positive T-cell mixed lymphocyte culture reaction in a cell-dependent manner.
  • FIG. 5 shows the results obtained by examining the suppression of the response of sero-antigen-stimulated CD4-positive T cells by regulatory T cells induced using Campath-1H.
  • Campath-1H co-stimulator cells suppressed the CD4-positive T cell mixed lymphocyte culture reaction in a cell-dependent manner.
  • FIG. 6 shows the results of examining the suppression of regulatory T cells induced by the anti-CD52 antibody costimulation on the lymphocyte culture reaction containing CD8-positive T cells.
  • 4C8mAb costimulator cells suppressed CD8-positive T cell mixed lymphocyte culture reaction in a cell-dependent manner.
  • FIG. 7 shows the result of examining the suppression of regulatory T cells induced by Campath-1H costimulation on CD8-positive T cell mixed lymphocyte culture reaction. Regulatory T cells induced by Campath-IH costimulation suppressed CD8-positive T cell mixed lymphocyte culture reaction in a cell-dependent manner.
  • FIG. 8 shows the results obtained by examining the induction of regulatory T cells from CD4-positive T cells after the AR antigen reaction.
  • donor B the donor of the adult monocyte-derived mature dendritic cells used for the antigenic response
  • regulatory T cells after the antigenic response showed a stronger inhibitory activity than control regulatory ⁇ cells
  • provider c the inhibitory activities of both were equivalent.
  • FIG. 9 shows the change in cell number during in vitro expansion of regulatory T cells induced by anti-CD52 antibody costimulation. Culture From day 3 to day 8 of culture in the presence of IL-2, expansion of regulatory T cells was observed.
  • FIG. 10 shows the results of the inhibition of regulatory T cells on day 8 of the culture. Reduced suppressive ability was observed in the expanded regulatory T cells.
  • FIG. 11 shows the results of the inhibition of regulatory T cells after the anti-CD52 antibody co-stimulation (day 15). The suppressive ability of the expanded regulatory T cells was comparable to control cells.
  • Figure 12 shows the results of in vitro expansion of regulatory T cells induced by Campath-1H costimulation. By culture in the presence of IL-2, Campath-1H costimulator cells expanded 10-fold or more like 4C8mAb costimulator cells.
  • FIG. 13 shows the results of examining the inhibitory activity of Campath-1H costimulator cells after expansion.
  • Campath-1H co-stimulator cells retained inhibitory activity even after amplification, similar to 4C8 mAb co-stimulator cells.
  • Fig. 14 shows regulatory T cells induced by 4C8 mAb costimulation on one day or 2 ⁇ 10 7 human PBMCs administered to sublethal irradiated SCID mice the day after TM-j31 antibody administration.
  • 1X10 7 or 2X10 administered seven by itself or PBMC and 4C8mAb Fukutoge each 1X10 7 of regulatory T cells induced by stimulation with changes in body weight of mice administered (total 2X10 7) were Konji intraperitoneally Show.
  • Figure 1 5 is, TM- j3 1 antibody administration day, the SCID mice irradiated with radiation sublethal doses, administered 1X10 7 or 2X10 7 amino human PBMC alone, regulatory T induced by 4C8raAb costimulation Shows the survival rate of mice given 1X10 7 or 2X10 7 cells alone or intraperitoneally given a mixture of PBMC and 1X10 7 regulatory T cells each induced by costimulation of 4C8mAb (2X10 7 total) .
  • the body weight change was similar to that in the group to which no cells were administered.
  • autopsy was performed on the 12th day, and the body weight was measured only until the 12th day.
  • FIG. 18 shows the histological findings of the gastrointestinal tract (cecum) of the mice in the group to which PBMC alone was administered and the mice in the group to which PBMC and regulatory T cells were mixed. Observation of histological findings in the gastrointestinal tract conducted during the middle of the test period showed that in the PBMC-only group (left figure), mononuclear cell infiltration, edema, and dilation of capillaries were observed in the cecum, especially in the submucosa. However, no change was observed in the PBMC / regulatory T cell mixed administration group (right figure), the regulatory T cell alone administration group, or the non-cell administration group.
  • the CD52 agonist means a substance capable of transmitting a signal into a cell via CD52 by acting on a CD52 antigen expressed on the surface of an immune cell.
  • Signals induced by CD52 agonist stimulation cause 1) differentiation of the cells into regulatory T cells and / or 2) proliferation while retaining the characteristics of regulatory T cells, and / or 3) A response can be elicited that suppresses transvascular endothelial cell migration.
  • CD52 agonists include natural or synthetic ligands for the CD52 antigen, ie, any molecule that induces a signal through the CD52 molecule, and antibodies to the CD52 antigen. Such an antibody may recognize any site of CD52 and may be any as long as it induces a signal via CD52.
  • the antibodies used in the present invention are described in Masuyama, J. et al., 1999. J. Exp. Med.
  • T cells used as antigens were co-cultured with human umbilical vein vascular endothelial cells (HUVEC) cultured in monolayer on collagen gel, from peripheral blood mononuclear cell fractions collected from humans. By using mononuclear cells migrated through the monolayer, a desired antibody can be efficiently obtained.
  • anti-4C8 produced by Hypri-Doma JM-1 (deposited with the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the accession number FERM BP-7775 on September 26, 2001)
  • Selection using antibodies as competing reagents to suppress T cell staining by test antibodies ie, recognize the same epitope as anti-CD52 antibody produced by hybridoma JM-1) Acquisition becomes easier by combining.
  • the present invention can also be achieved by combining the step of selecting an antibody that recognizes the same epitope as the anti-4C8 antibody and the step of evaluating the ability to induce differentiation and proliferation of regulatory T cells described in Examples of the present invention.
  • Antibodies used for can be easily obtained.
  • a so-called humanized antibody can be obtained as the antibody used in the present invention by transplanting the variable region of the anti-CD52 antibody produced by the hybridoma JM-1 into the framework of the human antibody. It is possible.
  • mice that retain a human antibody gene that has not been rearranged and that produce a human antibody specific to the antigen upon sensitization with the antigen eg, Tomizuka et al., 2000. Proc. Natl. Acad.
  • CD52 costimulation causing stimulation through CD52 in addition to stimulation through the CD3 molecule may be referred to as CD52 costimulation.
  • the CD3 agonist acts on a CD3 molecule expressed on the surface of an immune cell, and is capable of inducing a reaction in which differentiation of the cell is promoted by signal transmission into the cell via CD3.
  • CD3 agonists include agonistic anti-CD3 antibodies such as 0KT3 (ATCC CRL-8001), UCHT1 (BD PharMingen), HIT3a (BD PharMingen).
  • agonists against various T cell antigen receptors particularly antibodies having agonist activity or fragments thereof, also cause ⁇ cell antigen receptor and CD3 complex formation and signal transduction into cells via CD3. And thus can be used as a CD3 agonist in the present invention.
  • 0T145 (Posnett et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 83 (20): 7888-92), which is an antibody against human beta cell antigen receptor Vbeta6.7, is mentioned. No.
  • a substance that recognizes a T cell antigen receptor and exerts an agonist action such as a soluble HLA molecule or a tetramer molecule of an HLA molecule and an antigen peptide, can also be used.
  • inflammatory cells such as T cells and macrophages
  • T cells and macrophages The migration of inflammatory cells, such as T cells and macrophages, through the vascular endothelium to extravascular inflammatory sites is an important step in the inflammatory response. Inhibiting the actions of molecules known to be involved in this step, such as chemokines and adhesion factors, using low-molecular weight antagonist antibodies, etc., to control allergic diseases and various immune diseases.
  • Many attempts have already been made (Yang, GX et al., (2003) Med. Res. Rev. 23: 369-392; Aydt, E. et al., (2002-2003) 70: 297-301; Erin, EM et al., (2002) Cuur. Drug Targets Inflamm. Allergy 1: 201-214; Saeki, T.
  • CD52 is involved in T cell transendothelial endothelial cell migration, and by administering an antibody or ligand to CD52, or a low-molecular agonist or antagonist, extracellular ⁇ Has been shown to inhibit the migration of spores and, consequently, the inflammatory and immune responses.
  • Campath-1H (Alemtuzumab)
  • Campath-1H (Alemtuzumab)
  • an anti-CD52 antibody that does not have a cell removing effect is also expected to have an immunosuppressive effect.
  • the anti-CD52 antibody having no lymphocyte removing effect can be selected by, for example, the following method.
  • both the cytotoxicity by complement and the antibody-dependent cellular cytotoxicity, which are the main mechanisms of cell elimination by antibodies, are greatly dependent on the antibody subclass.
  • Ig (1 ⁇ 2) in human antibodies and IgGl in mouse antibodies are subclasses of complement-dependent and antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (Ma ⁇ oney, DG (1998) 'Unconjugated monoclonal antibody therapy Monoclonal antibody-based therapy of cancer. New York: Dekker: 53-79.).
  • cytotoxic activity of complement by in vitro screening of antibody cytotoxicity after transfection of Fc part of various subclasses by genetic recombination technology.
  • the target cells expressing CD52 are incubated with 51 Cr for 1 hour at 37 ° C., and the target cells are labeled with 51 Cr. After washing, the cells are seeded on a 96-well plate.
  • Anti-CD52 antibody And incubate for 2 hours at 37 ° C. After incubating, collect the supernatant and measure the number of 51 Cr released into the supernatant using a top count (Packard).
  • the cytotoxic activity of the antibody by complement can be evaluated by the antibody. You can screen in this way.
  • the target cells expressing CD52 are incubated with 51 Cr at 37 ° C for 1 hour, and the target cells are labeled with 51 Cr. After washing the cells, the cells are seeded in a 96-well plate, and the anti-CD52 antibody and human peripheral blood mononuclear cells are added and incubated at 37 ° C for 4 hours. The supernatant is recovered after the incubation, and the amount of 5, Cr released into the supernatant is measured using a top count or the like, whereby the antibody-dependent cellular cytotoxicity of the antibody can be evaluated. Whether the antibody selected by the above method has no lymphocyte-removing activity can be finally confirmed by monitoring the number of lymphocytes when administered to humans.
  • the pharmaceutical composition containing CD52 agonist as an active ingredient and the pharmaceutical composition containing CD52 agonist and CD3 agonist as active ingredients provided by the present invention can be useful as an immunosuppressant.
  • the pharmaceutical composition may be useful as an agent targeting a specific mechanism of action of the immune system, or as an agent for inducing differentiation and / or promoting proliferation of regulatory T cells.
  • the pharmaceutical composition provided by the present invention may be administered to a living body, or may contain immune cells, particularly T cells, or immune cells collected from a patient or another human. Peripheral blood, lymph, lymph node cells, and thymocytes containing the cells may be processed in vitro.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated by a well-known method. That is, a pharmaceutical preparation containing various additives acceptable for the therapeutic effect, for example, a carrier, a pH buffer, a stabilizer, an excipient and the like is produced. Such preparations preferably include a physiologically acceptable diluent or carrier, and suitable carriers include saline, phosphate buffered saline, phosphate buffered saline.
  • the dosage form of the above preparations is oral administration in tablets, capsules, granules, powders, syrups, etc. Or parenteral administration by injection, infusion, suppository, or the like.
  • the administration method and dosage of the pharmaceutical composition can be appropriately determined in the course of preclinical tests and clinical tests.
  • oral administration is usually about 0.01 mg to 1000 mg per day for adults, depending on symptoms, age, body weight, etc., and these should be administered once or in several divided doses. Can be.
  • a single dose of about 0.01 mg to 100 mg can be administered by subcutaneous injection, intramuscular injection or intravenous injection.
  • the disease to be treated is a disease requiring treatment to produce an immunosuppressive effect, and specifically, an organ or cell for the treatment or prevention of graft-versus-host disease (GvHD) or graft rejection Treatment before and after transplantation, treatment or prevention of autoimmune diseases such as rheumatism, or allergic diseases such as contact hypersensitivity.
  • regulatory T cells are expanded by treating immune cells collected from a patient or another human, or peripheral blood, lymph, lymph node cells, and thymocytes containing immune cells in vitro. A therapy that returns the patient's body can be employed.
  • the present invention provides a method for inducing differentiation and / or promoting proliferation of regulatory T cells.
  • a CD52-expressing cell is brought into contact with a scavenger compound to detect its interaction or a CD52-stimulated response. It also includes screening of the compound that will become the target.
  • a cDNA library was prepared using CD3 positive cells, a 4C8 mAb positive cell fraction, as a gene source, and COS-1 cells that transiently expressed the library were used with 4C8 mAb and MACS (Miltenyi Biotec). By concentrating, isolated 'identified.
  • RNA was purified using 01 i gotex TM -dT30 ⁇ Super> mRNA Purification Kit (TAKARA BIO Inc.), 90 ⁇ g of total RNA power, 1.7 ⁇ g of poly (A) + RNA was obtained.
  • the cDNA synthesized from this poly (A) + bandage using Superscript TM Choice System for cDNA Synthesis is subjected to size fractionation by agarose gel electrophoresis, and cDNA of 1 Kb to 10 Kb is converted to a eukaryotic cell expression vector. It was cloned into pEF18S (Ohashi, H. et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 158-162). As a result, a CD3-positive T cell-derived cDNA library consisting of 7 ⁇ 10 6 independent clones was obtained.
  • 270 zg of plasmid was obtained using Maxi Kit (QIAGEN Inc.). Of these, 100 g were transiently introduced into 2 ⁇ 10 7 C0S-1 cells using TransIT-LT1 (TAKARA BIO Inc.). C8mAb-positive cells were purified from COS-1 cells in which the library 1 was transiently expressed using the antibody and MACS. Hirt method from 4C8mAb-positive C0S-1 cells (Hirt B.,
  • the nucleotide sequence of the positive clone was determined using ABI PRISM 3700 DNA Analyzer (Applied Biosystems), and the nucleotide database was searched by BLAST.All three positive clones were CD52 (Xia, MQ et al., 1991. Eur. J. Immunol. 21: 1677-1684).
  • the cDNA expressed in COS-1 cells was also stained with Campath-1H, which is known to be an anti-CD52 antibody.
  • the cDNAs of CD48, CD58, and CD59, the same GPI anchor proteins as CD52 were expressed in C0S-1 cells, and the staining with 4C8mAb was analyzed by FACSCalibur. It was confirmed that they did not recognize it (not shown). For these reasons, 4C8 was determined to be CD52.
  • Campath-1H (C1H) having CD52 as an antigen was used as a costimulator, it was examined whether regulatory T cells were induced from CD4 positive T cells in the same manner as when 4C8 mAb was used.
  • Peripheral blood mononuclear cells were separated from peripheral blood of healthy volunteers by density gradient centrifugation using Ficoll-Paque Plus (Amersham Pharmacia).
  • CD4-positive T cells were prepared from peripheral blood mononuclear cells by negative selection using MACS CD4 + T Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec) according to the operation manual of the reagent manufacturer.
  • the immobilization of the antibody on the plate was performed as follows. Anti-CD3 antibodies prepared in Loong / ml with PBS (0RTH0CL0NE 0KT3, Ortho Biotech) for 24 hours fin incubation was immobilized performed at 4 8 well plates (Costar) to be dispensed 4 ° C Thereafter, 4C8mAb or Campath-1H (CAMPATH, Berlex) adjusted to 10 g / ml using PBS was immobilized in the same manner.
  • CD4-positive T cells prepared as described above were converted to RPMI1640 (GIBC0) with 10% FCS and 15raM. Were suspended in HEPES buffer medium was added, the immobilized Plate antibodies in the manner described above were seeded at a 8X10 5 cells / well, 37 ° C / 5 ° in C0 2 incubator /. C0 and cultured for 2 in 3 days. After culturing, the cells are collected, washed, resuspended in the medium, seeded on a 24-well plate (Costar) at lX10 6 cells / well, and cultured for 4 days without stimulation to obtain a rest state. 4C8mAb co-stimulator cells or Campath-1H co-stimulator cells were used for inhibition.
  • the suppression case went as follows. Inoculate 96-well U-bottom plate (ICN) with 4 x 10 5 cells / well of peripheral blood mononuclear cells irradiated with X-rays (5000 rad) at lX10 5 cells / well of CD4 positive T cells, and add anti-CD3 antibody at a final concentration of 25 ng / ml And cultured for 3 days.
  • ICN 96-well U-bottom plate
  • control group to which no regulatory T cells were added and the group to which 4C8 mAb co-stimulator cells or Campath-1H co-stimulator cells irradiated with X-rays (5000 rad) were added as regulatory T cells at 0.5 to 2 ⁇ 10 5 cells / well And [] thymidine incorporation were compared to evaluate the inhibitory activity.
  • [3 ⁇ 4] Thymidine incorporation was performed by adding 0.2 / iCi / well of [] thymidine on the third day of culture, collecting cells 8 hours later, and counting the number of [3 ⁇ 4] thymidine incorporated into the cells by a beta plate (PerkinElmer). It evaluated by measuring in. All cells used in one attestation are from the same donor.
  • the Campath-1H co-stimulator cells suppressed the proliferation of CD4-positive T cells by anti-CD3 antibody stimulation similarly to the 4C8mAb co-stimulator cells in a cell-dependent manner.
  • Example 3 Inhibition of transendothelial cell migration of CD3-positive T cells by Campath-1H
  • CD3-positive T cells were prepared from a peripheral blood mononuclear cell by enriching the CD3-positive T cell fraction using a nylon wool column, and then performing negative selection using an anti-CD16 magnetic antibody (Advanced Magnetics, Inc.).
  • Campath_lH suppressed the transendothelial cell migration of CD3-positive T cells, similar to 4C8mAb. Therefore, it was revealed that Campath-1H, an anti-CD52 antibody, together with 4C8mAb, induced suppression of transendothelial cell migration.
  • Example 4-1 Inhibition of regulatory T cells induced by anti-CD52 antibody costimulation on CD4 + T cell mixed lymphocyte culture reaction
  • CD4 + T cell mixed lymphocyte culture reaction assay was performed. 4C8 mAb was used as an anti-CD52 antibody.
  • Regulatory T cells were derived as described in Example 2. Monocyte-derived mature dendritic cells used as stimulator cells were induced as follows. CD14-positive cells were prepared from peripheral blood mononuclear cells by positive selection using MACS microbeads CD14 (Miltenyi Biotec) according to the operation manual of the reagent manufacturer.
  • CD14 positive cells RPMI1640 to 10% FCS 2 - mercaptoethanol (GIBC0), 100ng / ml of IL - 4, the 50 ng / ml of GM- CSF were suspended in medium was added, 3 X 10 6 in 6well plates (Falcon) Cells were seeded at cells / well and cultured for 5 days, LPS at a final concentration of 10 ng / ml was added, and culturing was further performed for 24 hours to induce mature monocyte-derived dendritic cells. Some of the cells were subjected to flow cytometer (FACScan, Becton Dickinson) analysis to confirm the expression of mature dendritic cell markers.
  • flow cytometer FACScan, Becton Dickinson
  • the mixed lymphocyte culture reaction was performed using CD4 + T cells (I X).
  • the 10 4 cells / W ell) were seeded in 96wellU bottom plate and cultured for 4 days. At this time, X-ray irradiation (5000 rad) was performed as a control group to which no regulatory T cells were added and a regulatory T cell.
  • X-ray irradiation 5000 rad
  • Thymidine incorporation was compared with the group to which 4C8 mAb costimulatory cells were added at l to 2 ⁇ 10 5 cells / well, and the inhibitory activity was evaluated.
  • Thymidine incorporation measurement was performed in the same manner as in Example 1. However, the culture time from addition of [3 ⁇ 4] thymidine to cell recovery was 16 hours. As shown in FIG. 4, the 4C8 mAb costimulator cells suppressed the CD4-positive T cell mixed lymphocyte culture reaction in a cell-dependent manner.
  • Example 4-2 Inhibition of regulatory T cells induced by costimulation of Campath-1H on CD4-positive T cell mixed lymphocyte culture reaction
  • regulatory T cells induced by Campath-1H co-stimulation like regulatory T cells induced by 4C8 mAb co-stimulation, are shown to suppress the response of CD4 + T cells induced by seroantigen stimulation. was done.
  • Example 5-1 Inhibition of regulatory T cells induced by costimulation of anti-CD52 antibody on CD8-positive T cell mixed lymphocyte culture reaction
  • CD8-positive T-cell mixed lymphocyte culture reaction assay was performed. Was done. 4C8 mAb was used as an anti-CD52 antibody.
  • CD8-positive T cells were obtained from peripheral blood mononuclear cells using the MACS CD8 + T Cell Isolation Kit (Miltenyi).
  • Example 2 Monocyte-derived mature dendritic cells used as stimulator cells were induced in the same manner as in Example 4-1.
  • the mixed lymphocyte culture reaction was performed using CD8-positive T cells prepared from Donor A.
  • the 4C8 mAb costimulator cells suppressed the CD8-positive T cell mixed lymphocyte culture reaction in a cell-dependent manner.
  • Example 5-2 Suppression of regulatory T cells induced by Campath-1H costimulation on CD8 + T cell mixed lymphocyte culture reaction
  • CD8-positive T-cell mixed lymphocytes A culture reaction was performed. The experiment was performed in the same manner as in Example 51-11.
  • Campath-1H costimulator cells suppressed the mixed lymphocyte culture reaction in a cell-dependent manner.
  • regulatory T cells induced by Campath-1H co-stimulation like regulatory T cells induced by 4C8 mAb co-stimulation, are shown to suppress the response of CD8-positive T cells induced by aro antigen stimulation.
  • Example 6 Induction of regulatory T cells from CD4-positive T cells after an Aro antigen reaction
  • Monocyte-derived mature dendritic cells used as stimulator cells were induced as follows.
  • Example 4 Monocyte-derived mature dendritic cells used as stimulator cells were induced as follows.
  • CD4-positive CD45RA-positive T cells were obtained from MACS CD45RA MicroBeads using CD4-positive T cells isolated by the method described in Example 2 above. (Miltenyi Biotec) was prepared by positive selection according to the operation manual of the reagent manufacturer.
  • the aroantigen reaction and the subsequent induction of regulatory T cells were performed as follows.
  • the CD4 + CD45RA + T cells prepared from donor A (1 X 10 6 ce lls / we ll) different from monocytes were prepared from donor B derived mature dendritic cells (l X 10 5 cells / well ), pyruvic The cells were suspended in a X-VIV0-15 medium supplemented with an acid (Gibco) and a MEM non-essential amino acid solution (Gibco) and seeded on a 24-well plate.
  • regulatory T cells after the Aro antigen reaction After culturing for 6 days, the cells are collected, readjusted to a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells / well, and the cells cultivated for further 4 days are used as T cells after the Aro antigen reaction. Induction was performed. Induction of regulatory T cells was performed by the method described in Example 2. However, T cells after the Aro reaction were used instead of CD4-positive T cells. As a control group, regulatory T cells were induced from CD4-positive T cells prepared from donor A.
  • regulatory T cells derived from T cells after the Aro reaction are referred to as regulatory T cells after the Aro antigen reaction
  • regulatory T cells derived from CD4 positive T cells are referred to as control regulatory T cells.
  • each regulatory T cell was evaluated by the mixed lymphocyte culture reaction described in Example 4. However, as stimulator cells, mature monocyte-derived dendritic cells prepared from donor B used for the generation of T cells after the antigen reaction, or monocyte-derived mature dendrites prepared from donor C, a third party ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ cells used.
  • the medium used for the reaction was X-VIV0-15 medium supplemented with pyruvic acid and a non-essential amino acid solution, and the culture period was 3 days.
  • Example 7-1 In vitro expansion of regulatory T cells induced by anti-CD52 antibody costimulation
  • CD4 positive T cells were seeded on a plate on which the anti-CD3 antibody and 4C8 mAb had been immobilized by the method described in Example 2 at a density of 8 ⁇ 10 5 cells / well, and cultured for 3 days. After culturing, the cells were collected and washed, resuspended in a medium containing 100 U / ml IL-2 (Chiron), and seeded on a 24-well plate at 1 ⁇ 10 6 cells / well. After culturing for 2 days, the cells were collected, readjusted to a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells / well in a medium containing 100 U / ml IL-2, and cultured for further 3 days.
  • Chiron U / ml IL-2
  • the cells were collected, and the first inhibition assay (day 8) was performed using a part of the cells according to the method described in Example 2. After washing for 8 days, some of the cells were washed and then cultured for 3 days on a plate immobilized with anti-CD3 antibody and 4C8 mAb and cultured for 4 days without stimulation. A second inhibition study (day 15) was performed using the obtained cells. As a control group, cells treated in exactly the same manner except that the cells were cultured in a medium containing no IL-2 during the period from the 3rd to the 8th day of culture were used for each inhibition assay.
  • culturing in the presence of IL-2 for 5 days increased the number of cells more than 10-fold, but as shown in Fig. 10, immediately after culturing in the presence of IL-2.
  • the inhibitory activity was significantly reduced compared to the control group.
  • the second inhibition assay day 15 after the cells were again subjected to anti-CD52 antibody substimulation, the inhibitory activity was recovered. The cell number increased 30-fold over the entire culture period of 15 days.
  • Example 7-2 In vitro expansion of regulatory T cells induced by costimulation of Campath-1H
  • Example 7-1 Induction and expansion of regulatory T cells were performed by the method described in Example 7-1. However, Campath-1H (immobilized on a plate at 30 g / ml or lOO ⁇ ug / ml) was used as a costimulation. In this example, the culture period in the presence of IL-2 was 4 days, and the inhibition was performed only on day 4. No IL-2 non-added group was provided and used as a co-stimulus as in Example 7.
  • Campath-1H tended to have a slightly weaker activation ability than 4C8mAb, in order to obtain sufficient activation, It was set 30 ⁇ ⁇ / ⁇ 1 or 100 / ig / ml and higher concentrations as conditions during solid stating.
  • Campath-1H co-stimulator cells expanded 10-fold or more similarly to 4C8mAb co-stimulator cells by culturing in the presence of IL-2.
  • the Carapath-IH costimulator cells retained the inhibitory activity even after amplification, similarly to the 4C8 mAb costimulator cells.
  • Example 8-1 Inhibition of Simultaneous Transfection of Murine Lethal Effect by Transfer of Human Peripheral Blood to SCID Mice and In Vivo Safety of Regulatory T Cells
  • SCID mice (6 weeks old, Oss, obtained from CLEA Japan) recognize the IL-2 receptor chain to suppress NK cell activity and facilitate engraftment of human cells.
  • 1 Antibody (20 ⁇ / mouse, Pharmingen) was intraperitoneally administered the day before human cell transfer, and irradiated with a sublethal dose (2.5 Gy) on the day of human cell transfer, followed by human cell transfer.
  • PBMC mononuclear cells
  • AXIS-SHIELD Lymphoprep
  • CM-positive T cells prepared regulatory T cells (method by showing the real ⁇ 7), administration PBMC 1X10 7 or 2X10 7 cells by itself, regulatory T cells 1X10 7 or administration 2X10 7 cells by itself, or provided with a respective group administered intraperitoneally Konji PBMC with regulatory T cells each 1X10 7 cells (the total of 2X10 7 cells).
  • a cell non-transferred group was provided.
  • the transferred PBMC was stained with an anti-CD3 antibody (Pharmingen) and measured with a FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson), confirming that the percentage of CD3-positive T cells contained in the PBMC was 42%. ing.
  • Each group used 5 mice. Mice were weighed and observed for 30 days after cell transfer.
  • mice When human PBMCs were intraperitoneally administered to SCID mice to which TM- ⁇ 1 antibody was administered, human T cells were activated and proliferated in the mice, resulting in the mice exhibiting xenograft-versus-host disease-like death and debilitating death I have confirmed that in advance.
  • PBMC alone When human PBMCs were intraperitoneally administered to SCID mice to which TM- ⁇ 1 antibody was administered, human T cells were activated and proliferated in the mice, resulting in the mice exhibiting xenograft-versus-host disease-like death and debilitating death I have confirmed that in advance.
  • PBMC alone When human PBMCs were intraperitoneally administered to SCID mice to which TM- ⁇ 1 antibody was administered, human T cells were activated and proliferated in the mice, resulting in the mice exhibiting xenograft-versus-host disease-like death and debilitating death I have confirmed that in advance.
  • PBMC alone When human PBMCs were intraperitone
  • Example 8-2 Inhibition of mouse lethal action by simultaneous administration of human peripheral blood to SCID mice and suppression by regulatory T cell co-administration and safety of regulatory T cells in vivo
  • SCID mice (8-week-old, female, obtained from CLEA Japan) recognize IL-2 ⁇ receptor to suppress NK cell activity and engraft human cells ⁇ -1
  • Antibodies (20 ug / mouse, Pharmingen) were intraperitoneally administered the day before the administration of human cells, and sublethal (2.5 Gy) irradiation was performed on the day of the administration of the human cells, followed by administration of the human cells.
  • Peripheral blood collected from healthy individuals by apheresis was subjected to specific gravity centrifugation using Lymphoprep (AXIS-SHIELD) to obtain mononuclear cells (PBMC) or P thigh C of the same donor as described in Example 2.
  • AXIS-SHIELD mononuclear cells
  • Regulatory T cells that were amplified and induced with Campath_lH from CD4-positive cells isolated in (see Example 7-2) were prepared.
  • a cell-unadministered group was administered without cells. Except for the group receiving the regulatory T cells alone, each group was subjected to necropsy 11 days after cell administration to observe the acute phase symptoms (including histological findings), and to measure the body weight and state of the mice for 21 days. In each group, 5 mice were used.
  • mice When we intraperitoneally administer human PBMC to SCID mice to which TM-] 31 antibody was administered, It has been previously confirmed that as a result of activation and proliferation of human T cells in mice, mice exhibit xenograft-versus-host disease-like symptoms and die weakly. In this experiment,
  • mice given PBMC alone died by day 21 in all groups without recovery from the transient weight loss due to irradiation at the beginning of the experiment (Figure 16).
  • Figure 17 In the group that received a mixture of P thigh C and regulatory T cells, the weight change was almost the same as in the non-cell-administered group, despite the fact that a total of twice the total amount of human cells was administered. As shown ( Figure 16), all cases survived ( Figure 17). In addition, mice administered with regulatory T cells alone tended to recover more weight gain than the non-administered cells (Figure 16), suggesting that they rarely show acute invasion of mice. Was. At necropsy during the study period, mononuclear cell infiltration in the gastrointestinal tract, edema and dilation of capillaries were observed in the PBMC-only group. No such change was observed in the single administration group (Fig. 18).
  • the regulatory T cells in this in vivo model system differ from PBMC in that they do not show any pathogenicity to mice by themselves, and that the lethal effects of PBMC on mice that occur when administered alone are regulatory T cells. It was clarified that co-administration of the compound significantly suppressed the effect.
  • regulatory T cells induced by the anti-CD52 antibody suppress excessive human T cell activation even in vivo, and their administration is accompanied by abnormal activation of T cells. It is suggested that it is an effective treatment for various diseases.
  • a signal mediated by CD52 is immunosuppressive, that is, induces differentiation and / or proliferation of regulatory T cells and suppresses transvascular endothelial cell migration.
  • a pharmaceutical composition for immunosuppression, induction of differentiation and / or promotion of proliferation of regulatory T cells, and suppression of transvascular endothelial cell migration i.e., autoimmune diseases, allergic diseases and transplantation immune responses. It is useful as an active ingredient of a pharmaceutical composition for suppressing response.
  • regulatory T cells can be prepared ex vivo using CD52 agonist, and symptoms / disease in which immunosuppression such as suppression of autoimmune disease and transplantation immune response is desired. Can be used for treatment and / or prevention.
  • the regulatory T cells having antigen selectivity shown by the present invention it is possible to avoid the side effects associated with the suppression of the entire immune system which may occur with the use of conventional immunosuppressants, It can be expected that only the target antigen-specific immune response will be suppressed.

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Abstract

本発明は、調節性T細胞の分化誘導および/または増殖促進方法、免疫細胞の経血管内皮細胞遊走抑制方法、ならびにこれらの方法による免疫を抑制する方法、ならびにこれらの方法に用いるための医薬組成物を提供することを目的とする。　抗CD52抗体を含むCD52アゴニストをCD52発現T細胞に作用させることによる、調節性T細胞の分化誘導および/または増殖促進方法、免疫細胞の経血管内皮細胞遊走抑制方法、ならびにこれらの方法による免疫を抑制する方法が提供される。

Description

抗 CD52抗体による調節性 T細胞分化誘導'増殖方法およびそのための医薬組成物
技術分野
本発明は、 新規の、 免疫を抑制する方法、 特に調節性 T細胞 （抑制性 T細胞と 呼ばれる場合もある） の分化誘導 ·増殖促進を誘導することにより免疫を抑制す る方法、 およぴ該方法に使用するた明めの医薬組成物に関する。 田
背景技術
本発明者らは、 4C8モノクローナル抗体 （4C8mAb) 、 ヒ ト T細胞が血管内皮 細胞に接着した後の、 内皮下への遊走を阻害するモノクローナル抗体であること を発見した （Masuyama, J. et al. , (1999) J. Exp. Med.， 189， 979)。 T 細胞 が炎症局所などの末梢組織に移行するためには、 血管内皮細胞にインテグリン分 子を介して強固に接着した後に細胞運動に適した形態に変化し、 血管内皮細胞間 間隙をすり抜けて遊走する過程が必要である。 血管内皮細胞に接着した T細胞全 てが内皮下へ遊走するのではなく、 CD4陽性 CD45R0陽性 CD26強陽性の活性化メ モリー T細胞が選択的に遊走することが知られている。 即ち、 4C8mAbは T細胞の 血管内皮細胞への接着は抑制せずに、 T 細胞サブセット選択的な内皮下への遊走 を特異的に抑制するモノクローナル抗体である。
さらに、 4C8mAb の新たな機能として調節性 T 細胞の誘導能が報告された
(Masuyama, J. et al. , (2002) J. Immunol. , 169, 3710)。 単独では T細胞活 性化能をもたない程度の低濃度の CD3ァゴニストで T細胞を刺激するときに、 同 時に適切な副刺激を加えることで T細胞を活性化させることができる。 副刺激は
CD3ァゴニストの活性化能の亢進を行うのみならず、 活性化後の T細胞の機能に も大きな影響を与える。 CD3ァゴニストとして抗 CD3抗体である 0KT3を用いたと き、 4C8mAbによる刺激は副刺激として機能し、 CD4陽性 T細胞を活性化、 増殖さ せた。 さらに、 CD3、 4C8mAbの同時刺激による活性化後の細胞は in vitroにおい てポリクローナル刺激による CD4陽性 T細胞の増殖に対して抑制活性を示し、 調 節性 T細胞が誘導されていることが判った。
1 . 調節性 τ細胞
種々の病原体に対する生体防御のシステムとしての免疫系の中心的役割を担う 細胞群の一つに Τ細胞がある。 Τ細胞は大別して CD4陽性のヘルパー Τ細胞と CD8 陽性の細胞傷害性 Τ細胞に分けられるが、 前者は特に抗原刺激後の特定の分化成 熟段階でのサイ トカイン産生パターンによって、主に IFN- γを産生する Thl細胞、
IL- 4を産生する Th2細胞などに分類可能である。 一般的に前者は細胞性免疫、 後 者は液性免疫として生体防御に深く関与している。 免疫応答はこのような性質の 異なる T細胞の働きによつて巧妙なバランスのもとに病原体の排除や感染抵抗性 の獲得に深く関与している。 通常健全な免疫応答においては外来の非自己抗原に 対してはそれらを排除する機構が働き、 生体を形成する自己抗原に対しては免疫 学的寛容が成立しており排除機構が働かないことが知られている。 しかしながら 自己抗原に対する過剰な免疫応答が働くことによって自己免疫疾患が生ずる。 こ のように自己抗原に対する免疫学的寛容は絶対的なものではないが、 T 細胞レべ ルにおいても種々の免疫学的寛容が誘導される仕組みが分かっている。 一つは、 中枢寛容 （central tolerance) と呼ばれる胸腺における自己反応性 T細胞クロー ンの排除の機構 （Kisielow, P. et al. , 1988. Nature. 333： 742-746. ) 他方は末 梢寛容 （peripheral tolerance) と呼ばれる機構による自己反応性 T細胞の胸腺 外での制御である。 後者には、 細胞死の誘導あるいは自己抗原に対する不応答性
( anergy j の ！ ¾導 ( Rocha, B.， and H. von Boehmer. 1991. Science.
251：1225-1228.； Jenkins, M. K.， and R. H. Schwartz. 1987. J. Exp. Med.
165：302-319. ) と共に、 調節性 T細胞 （regulatory T cell) による能動的な抑 制 （Shevach, E. . 2000. Annu. Rev. Immunol. 18 : 423-449. ) の機構が知られて いる。 調節性 T細胞とは、 近年提唱された T細胞の新たな概念であり、 他の T細 胞に対して抑制的な作用を有するということによって定義付けられる。 免疫応答 は巧妙なバランスのもとに成り立っており、 例えば上述の Thl細胞および Th2細 胞はお互いにそれぞれの免疫応答に拮抗的に働き、 一方が他方に対する調節性 T 細胞として作用することが知られるようになつてきた。 反面、 調節性 T細胞とし ての細胞集団の存在の検証とその性状解析については免疫学の近年の歴史におい ても多くの議論があるところである。 このような調節性 T細胞は in vitroまたは in vivo において特定の免疫応答を抑制または調節する機能を有する細胞として 研究され、 細胞表面マーカー、 産生するサイ トカインの種類や抑制 ·調節の機構 などによって種々の細胞集団として報告されてきている （Roncarolo, M. G. , and M. K. Levings. 2000. Curr. Opinion. Immunol. 12： 676 - 683. )。
これらの調節性 T細胞の中でも近年最もよく研究されている細胞集団は、 以下 に述べる CD4陽性 CD25陽性であることをマーカーとする T細胞集団であり、主に マウスおよぴラットなどのヒ ト以外の生物種で研究されてきた。 即ち、 正常マウ スまたはラットの CD4陽性脾臓細胞から CD25陽性、 RT6. 1陽性 （ラットの成熟 T 細胞の大部分に発現）、 CD5強陽性、または CD45RB弱陽性（マウス）若しくは CD45RC 弱陽性 （ラット） の細胞を除去して、 残りの T細胞を免疫不全の動物に移入する ことで臓器特異的自己免疫疾患が誘導されることが明らかとなった。 これまでこ のような調節性 T細胞特異的なマーカーは見出されておらず、 上記のマーカーは 調節性 T細胞の機能とは直接関連付けられない、 細胞が活性化されている状態、 抗原刺激を受けた状態、 免疫学的記憶状態にあることを表すマーカーにしか過ぎ ない。 しかしながら、 免疫不全動物に臓器特異的自己免疫疾患を誘導する機能の みならず、 逆に特定の細胞集団を移入することで自己免疫疾患および自己免疫性 炎症を抑制する機能を有することを指標として調節性 T細胞集団の解析が進み、 CD4、 CD25共に陽性である T細胞集団が調節性 T細胞のマーカーとなり得ること が知られるに至った （Sakaguchi, S. , et al. , 1985. J. Exp. Med. 161 : 72 ; Itoh, M. , et al. , 1999. J. Immunol. 162 : 5317-5326 ; Sakaguchi. S. et al. , 1995. J. Immunol. 155 : 115卜 1164 ; Asano, M. et al. , 1996. J. Exp. Med. 184： 387-396； Read, S. et al. , 2000. J. Exp. Med. 192 : 295 - 302 ; Salomon, B. et al. , 2000. Immunity. 12 : 431 - 440 ; Stephens, L. A. , and D. Mason. 2000. J. Immunol. 165 : 3105- 3110. )。
上記のようにマウスおよびラットにおいて、 CD4陽性 CD25陽性の調節性 T細胞 が同定された一方で、ヒトにおける同様の細胞の存在はようやく 2001年になって 複数のグループから報告されたに過ぎない （Jonuleii , H. et al. , 2001. J. Exp.
Med. 193 : 1285 - 1294; Levings, M. K. et al. , 2001. J. Exp. Med. 193 : 1295—1301 ; Dieckmann, D. et al. , 2001. J. Exp. Med. 193 : 1303 - 1310 ; Taama, L. S. et al. , 2001. Eur. J. Immunol. 31 : 1122-1131 ; Stephens, L. A. et al. , 2001. Eur. J. Immunol. 31 : 1247-1245 ; Baecher-Allan, C. et al. , 2001. J. Immunol.
167 : 1245-1253. )。 これらの報告はマウスで知られている CD4および CD25の発現 を指標にヒ ト末梢血から分離された細胞集団を用いて種々の細胞表面マーカー、 細胞の活性化刺激に対する不応答性 （anergy)、 産生されるサイ ト力インの種類、 in vitroにおける通常 T細胞の増殖抑制機能およびその機構などの点においてマ ウスでの報告と同等であることを根拠としている。 即ち、 ヒ ト末梢血から分離さ れた CD4陽性 CD25陽性 T細胞は、 CD45R0陽性のメモリ一 T細胞マーカーを発現し ており、 CD4陽性 CD25陰性 T細胞と比較して HLA-DRなどの活性化マーカーの発 現が高い。 また細胞内には定常的に CTLA-4を発現しており、刺激によりその発現 が上昇する。 更に抗 CD3抗体刺激、抗 CD3抗体と抗 CD28抗体による刺激、 同種異 系の成熟榭状細胞 （allogeneic mature DC) による刺激などでは、 CD4陽性 CD25 陽性の調節性 T細胞の DNA合成おょぴサイトカインの産生は見られず、 抗原刺激 に対する不応答状態 （anergy) となっている。 抗 CD3抗体と抗 CD28抗体による刺 激に IL- 2、 IL- 4、 IL - 15などのサイトカインを加えることで、 CD4陽性 CD25陽性 調節性 T細胞の DNA合成能は高まるが、 CM陽性 CD25陰性 T細胞のそれには及ば なレ、。 CD4陽性 CD25陽性 調節性 T細胞存在下に CD4陽性 CD25陰性 T細胞を抗 CD3 抗体または同種異系の成熟樹状細胞 （allogeneic mature DC) によって刺激した 場合、 CD4陽性 CD25陽性調節性 T細胞非存在下と比較して CD4陽性 CD25陽性 調 節性 T細胞細胞数依存的な増殖抑制作用が見られる。 マウスに比較して低いもの の、 CD4陽性 CD25陽性調節性 T細胞は IL-10、 TGF /3 1のような抑制性のサイ ト力 インを産生する能力がある力 CD4陽性 CD25陰性 T細胞に対する増殖抑制作用は、 これらサイ トカインに対する中和抗体では解除されないこと、 抑制作用には CD4 陽性 CD25陰性 T細胞と CD4陽性 CD25陽性調節性 T細胞の直接的細胞間接触が必 要であることが報告されている。マウス、ラットおよびヒ トにおいて CD4陽性 CD25 陽性調節性 T細胞の存在が報告され性状解析が進んではいるものの、 これら細胞 の詳細な分化機構および抑制作用機構の解明は途上にあり、 特異的なマーカーも 見出されていないのが現状である。 またマウスおよびヒ トにおいて、 IL- 10 存在下での同種異系の （allogeneic) 抗原刺激や同種異系の未成熟樹状細胞 （allogeneic i讓 ature DC) による繰り返 し刺激によって誘導される調節性 T細胞についても報告されている（Groux， H. et al. , 1997. Nature. 389： 737-742； Jonul iet, H. et al. , 2000. J. Exp. Med. 192 : 1213-1222. ) 0 これらの細胞は、 Thl、 Th2細胞とは異なり大量の IL- 10を産 生するものの、 TGF - 1、 IFN- 7 、 IL-5の産生は高くなく、 低レベルの IL-2を産 生し、 IL-4 を産生しないことを特徴としており、 Trl 細胞と呼ばれている。 Trl 細胞も CD4陽性 CD25陽性 調節性 T細胞と同様に anergicであるが、 T細胞抑制 機構は産生される IL- 10や TGF - 3 1によつて一部説明可能である。しかしながら、 Trl細胞と CD4陽性 CD25陽性調節性 T細胞が全く異なる T細胞サブセットである のか、 或いは分化活性化段階の異なる同一の細胞であるかについては不明な点が 多い。
マウスおよぴラットで知られている調節性 T細胞マーカーである CD4、 CD25の 発現を指標として、 ヒトにおいても末梢血などから CD4陽性、 CD25陽性の T細胞 を分離して見たところ、 マウスゃラットで知られているその他の細胞表面マーカ 一や機能と照らし合わせて同様であることが確認された。 このことから、 ヒ トに おける CD4陽性、 CD25陽性の調節性 T細胞の存在が示唆された。
これら細胞は、末梢血 CD4陽性 T細胞の 5〜10%を占めるに過ぎない希少細胞集 団である上に、 活性化 ·増殖刺激に対して不応答状態である。 この場合、 抗 CD3 抗体と抗 CD28抗体による刺激に IL- 2、 IL- 4または IL- 15などのサイ トカインを 加えることで細胞増殖を促すことは可能である。 しかしながら、 細胞数を増幅さ せヒ トに移入するなどの臨床応用には十分なレベルではなレ、。
調節性 T細胞は、 動物実験ではそれら細胞を移入することによって自己免疫疾 患に抑制的に働くこと、 移植拒絶反応や移植片対宿主病 （GvHD) に抑制的に働く こと (Hara, M. et al. , 2001. J. Immunol. 166 : 3789-3796 ; Taylor, P. A. et al. ,
2001. J. Exp. Med. 193 : 1311-1317. ) から、 調節性 T細胞の免疫抑制作用を利用 した細胞医療による自己免疫疾患、 臓器移植などにおける治療への応用が考えら れる。 調節性 Τ細胞の増殖を促進する医薬組成物、 または患者もしくは別のヒ ト から採取した末梢血、 骨髄細胞を生体外で処理することにより、 調節性 Τ細胞を 増殖させ、 患者の体内に戻す療法の開発が期待されている。
2 . 4C8抗原
4C8抗原は元々ヒ ト T細胞が血管内皮細胞に接着した後の内皮下への遊走に関 与する分子を同定する目的で発見された、 免疫系細胞の一部に発現する膜タンパ ク質である。 ヒ ト T細胞をマウスに免疫することによって得られたモノクローナ ル抗体を、 T細胞の in vitro血管外遊走を抑制することを指標にスクリ一ユング することにより、 4C8抗原を認識するモノクローナル抗体が取得された（Masuyama, J. et al.， 1999. J. Exp. Med. 189 : 979- 989 ; W099/12972号公報）。 T細胞が炎 症局所などの末梢組織に移行するためには、 血管内皮細胞にインテグリン分子を 介して強固に接着した後に細胞運動に適した形態に変化し、 血管内皮細胞間間隙 をすり抜けて遊走する過程が必要である。 血管内皮細胞に接着した Τ細胞全てが 内皮下へ遊走するのではなく、 CD4陽性 CD45R0陽性 CD26強陽性の活性化メモリ 一 Τ細胞が選択的に遊走することが知られている。 即ち抗 4C8モノクローナル抗 体 （mAb) は T細胞の血管内皮細胞への接着は抑制せずに、 T細胞サブセット選択 的な内皮下への遊走を特異的に抑制する mAbであり、 4C8抗原はこのような遊走 に必須の機能分子であると考えられる。 4C8mAbにより 4C8抗原の発現を検証した ところ、 4C8抗原は CD3陽性 T細胞に強く発現し、 B細胞、 NK細胞、 単球、 好酸 球にも発現するが、 好中球や内皮細胞には発現しない。 4C8mAbによる架橋は T細 胞のァクチン重合を促進し細胞形態に極性をもたせるのみならず、 細胞運動を刺 激する。
3 . CD52 (campath-1抗原）
Campath-1 はヒ トの骨髄移植片からリンパ球を除去できるラット抗体として Waldmann らによって発見された （Hale, G. et al. (1983) Blood, 62, 873)。 Campath- 1の抗原 （CD52) は長く不明であつたが、 1991年に Xiaらによって新規 分子として同定された (Xia, M. Q. et al. , (1991) European J. Immunol. , 21， 1677)。 また、 Kirchhoff らによって雄性生殖管上皮特異的分子として同定さ れた HE5 も CD52 と同一の分子であったことが 1993 年に報告されている (Kirchhoff, C. et al. , u993) Molecular Reproduction and Development, 34， 8)。 Campath-1はリンパ球上に高発現している CD52に結合し、補体による細胞障害 あるいは抗体依存的細胞性細胞傷害 （ADCC) を引き起こすことによってリンパ球 を除去する作用を持つ。 非常に効率の良いリンパ球除去抗体として、 GvHD軽減を 目的とした骨髄移植片からのリンパ球除去や、 リンパ腫治療への応用が熱心に研 究され、 ラット抗体 Carapath-1Gをヒ トイ匕した Carapath-1Hである Campath (登録 商標） （Alemtuzumab)が B細胞リンパ腫の洽療薬として Mi l lennium社より上巿さ れている （Pangolis GA et al, (2001) Medical Oncology, 18, 99)。
しかしながら、その抗原である CD52の機能についてはあまり明らかになつてい ない。 T細胞において、 CD52を抗体によって架橋すると、 抗原受容体を刺激した 場合と類似したタンパク質のリン酸化が見られるという報告 （Hederere RA et al. , (2000) International Immunology, 12, 505) がある他、 抗 CD3抗体あるレヽ は抗 CD2抗体に対する刺激に対して CD52の抗体による架橋が副刺激として作用し、 T 細胞の増殖を亢進するという報告がある （Valentin H et al. , (1992) Transplantation, 54， 97、 Rowan WC et al.， (1994) Internat ional Immunology, 7, 69)。 しかし CD52からどのようなシグナルが入っているのか、 また CD52から の副刺激が細胞の機能にどのような影響を与えるのかについては判つていない。
CD52はリンパ球、 単球、 マクロファージの他に、 前述のように雄性生殖管の上 皮にも発現している。 雄性生殖管上皮に発現する CD52は上皮細胞から放出され、 精子の成熟の過程で精子表面の糖衣にとりこまれる。 CD52に付加された糖鎖のシ アル酸の陰電荷が精子同士の凝集を防ぐ役割を果たしているのではないかと考え られている。また CD52に対する抗体が不妊の原因となっている例も報告されてい るが、精子の機能における CD52の役割などはまだ不明な点が多い（Kirchhof f C et al. , (2001) Cells Tissues Organs, 168, 93)。
CD52は 12アミノ酸からなるぺプチドであり、GPIアンカーにより細胞膜に結合 している (Xia, M. Q. et al.， (1991) European J. Immunol. , 21, 1677)。 分子 自体が非常に小さく、 また細胞内ドメインも持たないため、 構造から機能を推測 することが困難であり、このことが CD52の機能に関する研究が進んでいないこと の一因であると考えられる。
特許文献 1 国際公開 W099/12972号公報 特許文献 2 特許公報 特表平 2— 5 0 3 5 1 4
非特許文献 1 Masuyama, J.ら、 （2002) J. Immunol. , 169, 3710
非特許文献 2 Hale, G.ら、 （1983) Blood, 62， 873
非特許文献 3 Xia, M. Q.ら、 (1991) European J. Immunol. , 21, 1677 非特許文献 4 Kirchhoff, C ら、 ( 1993) Molecular Reproduction and Development, 34, 8
非特許文献 5 Pangolis GAら、 （2001) Medical Oncology, 18， 99 非特許文献 6 Hederere RAら、 (2000) International Immunology, 12, 505 非特許文献 7 Valentin Hら、 （1992) Transplantation, 54, 97
非特許文献 8 Rowan WCら、 (1994) International Immunology, 7, 69 非特許文献 9 Kirchhoff Cら、 （2001) Cells Tissues Organs, 168, 93 発明の開示
本発明は、 CD52を介した調節性 T細胞の分化誘導および/または増殖促進方法、 CD52を介した免疫細胞の経血管内皮細胞遊走抑制方法、ならびにこれらの方法に よる免疫を抑制する方法、 ならびにこれらの方法に用いるための医薬組成物、 特 に抗 CD52抗体を有効成分として含む医薬組成物を提供することを目的とする。 本発明者らは、 4C8抗体により認識される 4C8抗原について鋭意検討を行い、 該抗原が CD52分子であることを見出した。 従来の CD52についての知見からは、 CD52が活性化 T細胞の経血管内皮細胞遊走抑制や調節性 T細胞誘導に関与するこ とは予測できなかった。本発明者らは、 さらに抗 CD52抗体について鋭意検討を行 い、 それまで B細胞リンパ腫患者等からのリンパ球除去抗体活性のみ知られてい た抗 CD52抗体が驚くべきことに経血管内皮細胞遊走抑制活性や調節性 T細胞誘導 活性を有していることを新たに見出し、抗 CD52抗体の活性化 T細胞の経血管内皮 細胞遊走抑制活性や調節性 T細胞誘導活性を広く免疫療法に利用できることを見 出し、 本発明を完成させるに至った。
すなわち、 本発明は以下の通りである ：
1 . 4C8抗体以外の CD52ァゴニストを有効成分として含有する、 免疫抑制のため の医薬組成物； 2 . 4C8抗体以外の CD52ァゴニストを有効成分として含有する、 調節性 T細胞の 分化誘導および/または増殖促進のための医薬組成物；
3 . 調節性 T細胞が抗原選択的な抑制活性を有するものである、 上記 2記載の医 薬組成物；
4 . CD3ァゴニストをさらに含む、 上記 1〜 3のいずれかに記載の医薬組成物；
5 . CD3ァゴニストが抗 CD3抗体またはそのフラグメントである、 上記 4記載の 医薬組成物；
6 . 抗 CD3抗体がヒト化抗体またはヒ ト抗体である、 上記 5記載の医薬組成物； 7 . 4C8抗体以外の CD52ァゴニストを有効成分として含有する、 免疫細胞の経血 管内皮細胞遊走抑制のための医薬組成物；
8 . CD52ァゴニストが抗 CD52抗体またはそのフラグメントである、 上記 1〜 7 のいずれかに記載の医薬組成物；
9 . 抗 CD52抗体がヒト化抗体またはヒ ト抗体である、上記 8記載の医薬組成物；
1 0 . 上記ヒ ト化抗体がラットヒ ト化抗体 Campath- 1Hである、上記 9記載の医薬 組成物；
1 1 . 自己免疫疾患、 アレルギー疾患または移植免疫応答の予防または治療のた めの、 上記 1〜 1 0のいずれかに記載の医薬組成物；
1 2 . 免疫細胞の表面に発現する CD52に 4C8抗体以外の CD52ァゴニス トを作用 させることにより調節性 T細胞の分化誘導および/または増殖を促進する方法；
1 3 . 調節性 T細胞が抗原選択的な抑制活性を有するものである、 上記 1 2記載 の調節性 T細胞の分化誘導および/または増殖を促進する方法；
1 4 . CD52ァゴニストが抗 CD52抗体またはそのフラグメントである、 上記 1 2 記載の方法；
1 5 . 抗 CD52抗体がヒ ト化抗体またはヒ ト抗体である、 上記 1 4記載の方法；
1 6 . 上記ヒ ト化抗体がラットヒ ト化抗体 Campath-1Hである、上記 1 5記載の方 法；
1 7 . 上記免疫細胞の表面に発現する CD3に CD3ァゴニストを作用させることを さらに含む、 上記 1 2に記載の方法；
1 8 . CD3ァゴニストが抗 CD3抗体またはそのフラグメントである、 上記 1 7記 载の方法；
1 9 . 抗 CD3抗体がヒ ト化抗体またはヒ ト抗体である、 上記 1 8記載の方法； 2 0 . 上記免疫細胞が、 末梢血、 リンパ節または胸腺に含まれるものである、 上 記 1 2〜 1 9のいずれかに記載の方法；
2 1 . 上記免疫細胞が T細胞である、 上記 2 0記載の方法；
2 2 . 上記免疫細胞が末梢血単核球である、 上記 2 1記載の方法；
2 3 .免疫細胞への CD3ァゴニスト刺激および CD52ァゴニスト刺激が、生体外で 行われるものである上記 1 2〜2 2のいずれかに記載の方法；
2 4 .免疫細胞への CD3ァゴニスト刺激および CD52ァゴニスト刺激が、生体内で 行われるものである上記 1 2〜2 2のいずれかに記載の方法；
2 5 .免疫抑制効果、調節性 T細胞の分化誘導および/もしくは増殖促進ならびに /または免疫細胞の経血管内皮細胞遊走抑制効果を有する薬剤となる、 抗 CD52 ヒ ト化抗体またはヒ ト抗体を作製する方法；
2 6 .免疫抑制効果、調節性 T細胞の分化誘導および/もしくは増殖促進ならぴに /または免疫細胞の経血管内皮細胞遊走抑制効果を有する薬剤を、 CD52 との相互 作用を指標にスクリーニングする方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願第 2003-95765 号ならび に日本国特許出願第 2003-413786号の明細書および/または図面に記載される内 容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 4C8陽性クローンの 1つを導入した C0S-1細胞の FACS解析結果である。 太実線は 4C8mAb、 破線はアイソタイプコントロールで染色した結果である。 他の 陽性クローンからも同様の結果を得た。
図 2は、 4C8mAbまたは Campath- 1Hを CD3と共に副刺激した細胞を添加して CD4 陽性 T細胞の抗 CD3抗体刺激による増殖をチミジンの取り込みにより測定したと ころ、 4C8mAb副刺激細胞および Campath- 1H副刺激細胞ともに添加した細胞数に 依存的に、 CD4陽性 T細胞の抗 CD3抗体刺激による増殖を抑制することを示す図 である。 図 3は、 4C8mAbまたは Campath- 1H添加による CD3陽性 T細胞のヒ ト臍帯静脈 血管単層内皮細胞下のコラーゲンゲル内への遊走抑制を調べた結果である。 4C8mAbおよび Campath- 1Hともに、 CD3陽性 T細胞の経内皮細胞遊走性を抑制した。 図 4は、 4C8mAb副刺激細胞の混合リンパ球培養反応の抑制を調べた結果である。
4C8mAb副刺激細胞は CD4陽性 T細胞混合リンパ球培養反応を添加細胞数依存的に 抑制した。
図 5は、 Campath- 1Hを用いて誘導した調節性 T細胞による、 ァロ抗原刺激 CD4 陽性 T細胞の反応の抑制を調べた結果である。 Campath- 1H副刺激細胞は CD4陽性 T細胞混合リンパ球培養反応を添加細胞数依存的に抑制した。
図 6は、抗 CD52抗体副刺激により誘導される調節性 T細胞の CD8陽性 T細胞混 合リンパ球培養反応に対する抑制を調べた結果である。 4C8mAb 副刺激細胞は CD 8陽性 T細胞混合リンパ球培養反応を添加細胞数依存的に抑制した。
図 7は、 Campath- 1H副刺激により誘導される調節性 T細胞の、 CD8陽性 T細胞 混合リンパ球培養反応に対する抑制を調べた結果である。 Campath-IH副刺激によ り誘導される調節性 T細胞は CD8陽性 T細胞混合リンパ球培養反応を添加細胞数 依存的に抑制した。
図 8は、 ァロ抗原反応後の CD4陽性 T細胞からの調節性 T細胞の誘導を調べた 結果である。 ァロ抗原反応に用いた単球由来成成熟榭状細胞の提供者である提供 者 Bに対する反応において、 ァロ抗原反応後調節性 T細胞はコントロール調節性 τ細胞よりも強い抑制活性を示したが、 第三者である提供者 cに対する反応にお いて、 両者の抑制活性は同等であった。
図 9は、 抗 CD52抗体副刺激により誘導される調節性 T細胞の in vitro増幅時 の細胞数の変化である。培養 3日目から 8 日目まで IL- 2存在下で培養することに より調節性 T細胞の増幅が認められた。
図 1 0は、 培養 8日目 （day 8) における調節性 T細胞の抑制アツセィの結果で ある。 増幅された調節性 T細胞ではその抑制能の減少が認められた。
図 1 1は、 再度抗 CD52抗体副刺激を施した後 （day 15) の調節性 T細胞の抑制 アツセィの結果である。 増幅された調節性 T細胞の抑制能は、 コントロール細胞 に比較して同等であった。 図 1 2は、 Campath - 1H副刺激により誘導される調節性 T細胞の in vitroにお ける増幅を調べた結果である。 IL- 2存在下での培養によって Campath - 1H副刺激 細胞は 4C8mAb副刺激細胞同様、 10倍以上に増幅した。
図 1 3は、 Campath- 1H 副刺激細胞の増幅後の抑制活性を調べた結果である。 Campath- 1H副刺激細胞は 4C8mAb副刺激細胞同様に増幅後も抑制活性を保持して レヽた。
図 1 4は、 TM- j3 1抗体投与翌日に、 亜致死量の放射線を照射した SCIDマウス に、 ヒ ト PBMCの 1もしくは 2X107個を単独で投与、 4C8mAb副刺激により誘導した 調節性 T細胞の 1X107もしくは 2X107個を単独で投与、または PBMCと 4C8mAb副刺 激により誘導した調節性 T細胞の各 1X107個 （合計 2X107個） を混じて腹腔内投与 したマウスの体重の推移を示す。
図 1 5は、 TM- j3 1抗体投与翌日に、 亜致死量の放射線を照射した SCIDマウス に、 ヒ ト PBMCの 1X107もしくは 2X107個を単独で投与、 4C8raAb副刺激により誘導 した調節性 T細胞の 1X107もしくは 2X107個を単独で投与、あるいは PBMCと 4C8mAb 副刺激により誘導した調節性 T細胞の各 1X107個 （合計 2X107個） を混じて腹腔内 投与したマウスの生存率を示す。
図 1 6は、 TM- jS 1抗体投与翌日に、 亜致死量の放射線を照射した SCIDマウス に、 ヒ ト PBMC の 1. 2X107個を単独、 Campath- 1H副刺激により誘導した調節性 T 細胞の 1. 2X107個を単独、 あるいは PBMCと Campath- 1H副刺激により誘導した調 節性 T細胞の各 1. 2X107個 （合計 2. 4X107個） を混じて腹腔内投与したマウスの体 重の推移を調べた結果である。 PBMC単独投与群では約 1週間後に一過性の体重回 復傾向を示したが、 その後また継続的に体重が減少した。 一方、 PBMCと調節性 T 細胞混合投与群では細胞非投与群と同様な体重変動を示した。 なお、 調節性 T細 胞単独投与群は 12 日目に剖検を行ったため 1 2日目までしか体重を測定してい ない。
図 1 7は、 TM- j3 1抗体投与翌日に、 亜致死量の放射線を照射した SCIDマウス に、 ヒ ト PBMC の 1. 2X107個を単独、 Campath- 1H副刺激により誘導した調節性 T 細胞の 1. 2X107個を単独、 あるいは PBMCと Campath- 1H副刺激により誘導した調 節性 T細胞の各 1. 2X107個 （合計 2. 4X107個） を混じて腹腔内投与したマウスの生 存率を示す。 PBMC単独投与群は、 21 日目に全例が死亡し、 細胞非投与群ならぴに PBMCと調節性 T細胞混合投与群は全例が観察期間中生存した。
図 1 8は、 PBMC単独投与群のマウスと PBMCと調節性 T細胞混合投与群のマゥ スの消化管（盲腸）の組織所見を示す。 試験期間の中間で実施した消化管の組織所 見の観察において、 PBMC単独投与群 （左図） では、 特に盲腸で粘膜下層における 単核細胞浸潤と水腫、 毛細血管の拡張などが種々の程度で認められたが、 PBMCと 調節性 T細胞混合投与群 （右図） や調節性 T細胞単独投与群ならびに細胞非投与 群ではそれらの変化が認められなかった。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。
本明細書において、 CD52 ァゴニストとは、 免疫細胞表面に発現する CD52抗原 に作用することにより、 CD52を介した細胞内へシグナルを伝達し得る物質を意味 する。 CD52ァゴニスト刺激により誘導されたシグナルにより、 1)当該細胞の調節 性 T細胞への分化および/もしくは 2)調節性 T細胞としての特性を保持した状態 での増殖、 ならびに/または 3)当該細胞の経血管内皮細胞遊走の抑制という応答 が惹起され得る。 CD52ァゴニストは、 CD52抗原に対する天然または合成のリガン ド、 すなわち CD52分子を介してシグナルを誘導するあらゆる分子、 および CD52 抗原に対する抗体を包含する。 かかる抗体は、 CD52のいずれの部位を認識するも のであっても、 CD52を介するシグナルを誘導するものであればよい。 本発明にお いて使用される抗体は、 益山らの報告 （Masuyama, J. et al. , 1999. J. Exp. Med.
189 : 979-989 ; W099 2972号公報） に従い、 ヒ ト T細胞を免疫した動物より得ら れたモノクロ一ナル抗体から、 T細胞の in vitro血管外遊走を抑制することを指 標に選抜することにより得られる、 CD52抗原ァゴニス ト機能を有する抗体などが 挙げられる。また、.抗体分子の抗原認識部位を保持する抗 CD52抗体フラグメント もまた、 本発明の CD52ァゴニス トとして有用である。
また、 本発明に有用な CD52 ァゴ-ス トとして、 ラッ トヒ ト化抗体 Campath- 1H
(ァレツズマブ； Alemtuzumab) が挙げられる。 これは、 Campath (登録商標） と して市販されており入手可能であり、 また、 その詳細な作製法については特許公 報特表平 2— 5 0 3 5 1 4に記載されている。
抗原として使用される T細胞にはヒ トから採取された末梢血単核球画分を、 コ ラーゲンゲル上で単層に培養されたヒ ト臍帯静脈血管内皮細胞（HUVEC) と共培養 した後、 該単層を通過して遊走した単核球を用いることにより、 効率的に所望の 抗体を取得しうる。ハイブリ ドーマの選抜にあたっては、ハイプリ ドーマ JM - 1 (独 立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに 2001年 9月 26 日付けで 受託番号 FERM BP - 7757で寄託） により産生される抗 4C8抗体を競合試薬として用 いることにより、 被検抗体による T細胞染色が抑制されること （すなわちハイブ リ ドーマ JM-1により産生される抗 CD52抗体と同一ェピトープを認識すること） を指標にした選抜を組み合わせることにより、 取得はさらに容易となる。 また、 抗 4C8抗体と同一ェピトープを認識する抗体の選抜工程と、 本発明の実施例に記 載した調節性 T細胞の分化 ·増殖誘導能を評価する工程を組み合わせることによ つても、 本発明に使用する抗体を容易に取得することができる。 また、 例えばハ ィプリ ドーマ JM- 1により産生される抗 CD52抗体の可変領域をヒ ト抗体のフレー ムワークに移植することにより、 本発明に使用する抗体としていわゆるヒ ト化抗 体を取得することも可能である。 また、 再配列されていないヒ ト抗体遺伝子を保 持し、 抗原の感作により当該抗原に特異的なヒ ト抗体を産生するマウス （例えば Tomizuka et al. , 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97： 722) を使用すること により、 本発明に使用する抗体としてヒ ト抗体を取得することも可能である。 本発明の方法において、 CD52を発現する免疫細胞に対して、 CD52にカ卩えて、 CD3 ァゴニストを作用させることによって、 CD52の調節性 T細胞への分化誘導能およ びその増殖促進能が発揮され得る。 これは、 T 細胞の分化に関わる主たる刺激伝 達経路である CD3分子を介した信号伝達系を主刺激経路とすれば、 CD52を介した 経路がいわゆる副刺激経路となる。 本明細書において、 CD3 分子を介した刺激に 加えて CD52を介した刺激をもたらすことを、 CD52副刺激と称することがある。 本明細書において CD3ァゴニストとは、 免疫細胞の表面に発現した CD3分子に作 用し、 CD3 を介した細胞内への信号伝達により、 当該細胞の分化が促進されると いう反応を惹起しうる物質を意味する。 CD3 ァゴニス トの例としてァゴニスティ ックな抗 CD3抗体、 例えば 0KT3 (ATCC CRL- 8001)、 UCHT1 (B. D. PharMingen)、 HIT3a (B. D. PharMingen) が挙げられる。 また、 種々の T細胞抗原受容体に対す るァゴニスト、 特にァゴニスト作用を有する抗体またはそのフラグメントも、 Τ 細胞抗原受容体と CD3の複合体形成をもたらし、 CD3を介した細胞内への信号伝 達をもたらすので、本発明における CD3ァゴニストとして使用することができる。 具体的には、ヒ ト Τ細胞抗原受容体 Vbeta6. 7に対する抗体である 0T145 (Posnett et al. , 1986， Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 83 (20)： 7888-92) などが挙げられ る。 また、 可溶性の HLA分子あるいは HLA分子と抗原べプチドのテトラマー分子 のような、 T 細胞抗原受容体が認識してァゴニスト作用を及ぼす物質も使用し得 る。
T細胞やマクロファージなどの炎症細胞が血管内皮を通過して血管外の炎症部 位へ遊走することは炎症反応の重要なステップである。 このステップに関わるこ とが知られているケモカインや接着因子などの分子の作用を低分子アンタゴニス トゃ抗体などを用いて阻害することにより、 ァレルギ一や各種免疫疾患を制御し ようとレ、う試みは既に多く行われている （Yang, G. X. et al. , (2003) Med. Res. Rev. 23： 369-392； Aydt, E. et al. , (2002-2003) 70： 297 - 301 ; Erin, E. M. et al. , (2002) Cuur. Drug Targets Inf lamm. Allergy 1： 201-214； Saeki, T. et al. , (2003) Curr. Pham. Des. 9： 1201 - 1208)。 今回、 新たに CD52が T細胞の経血管 内皮細胞遊走に関わることが明らかとなったことにより、 CD52に対する抗体もし くはリガンド、 または低分子ァゴニストもしくはアンタゴニストを投与すること で Τ細胞の血管外への遊走を阻害し、 ひいては炎症反応 ·免疫反応を抑制する可 能性が示された。
抗 CD52抗体である Campath- 1H (ァレツズマブ； Alemtuzumab) については既に 免疫を抑制する抗体として関節リウマチ、 多発性硬化症、 腎移植拒絶などを対象 に臨床研究が実施されているが (Isaacs, J. D. et al. 2001. Arthritis Rheum. 44：
1998-2008； Coles, A. J. et al. , (1999) Lancet 354 : 1691-1695； Calne, R. et al. , (1999) Transplantation 68： 1613-1616)、 その作用機序は補体による細胞 傷害または抗体依存的細胞性細胞傷害による CD52 発現リンパ球の除去である
(Hale, G. 2001. Cytotherapy. 3 : 137-143)。 リンパ球を除去すると、 新たなリン パ球が再び分化してくるまでの間、 リンパ球減少状態に陥る。 関節リウマチを対 象とした Campath - 1Hの臨床試験において、 Campath- 1H によって引き起こされる 低リンパ球状態は非常に長期にわたることが明らかとなっており、 Campath - 1H投 与後に減少した各種リンパ球が正常な細胞数に回復するまでに要する時間は、 NK 細胞や単球で 1ヶ月、 B細胞で 3-6ヶ月であり、 T細胞においては 3年後にも正常 より低い細胞数であった （Isaacs, J. D. et al. 2001. Arthriti s Rheum. 44： 1998-2008)。 すなわち、 Campath-1Hによる治療を停止したあとも、 感染などのリ スクが高い状態が継続するという副作用が生じる。 これに対し、 今回新たに得ら れた知見により、細胞除去作用を持たない抗 CD52抗体にも免疫抑制作用が期待さ れることが明らかとなった。 経血管内皮細胞遊走抑制を作用機序とする、 リ ンパ 球除去効果を持たないような抗 CD52抗体を投与すれば、 Campath- 1Hの場合と異 なり長期にわたるリンパ球減少状態を引き起こすことなく免疫抑制効果を得るこ とが可能であると考えられる。
リンパ球除去効果を持たない抗 CD52抗体の選別は、例えば次のような方法で可 能である。 まず、 抗体による細胞除去の主要な作用機序である補体による細胞傷 害および抗体依存的細胞性細胞傷害活性はいずれも抗体のサブクラスに大きく依 存することが知られている。 例えば、 ヒ ト抗体では Ig(½、 マウス抗体では IgGl が補体による細胞傷害おょぴ抗体依存的細胞性細胞傷害活性の低いサブクラスで ある (Ma丄 oney, D. G. (1998) 'Unconjugated monoclonal antibody therapy of lymphoma. " In : Grossbard ML, ed. Monoclonal antibody - based therapy of cancer. New York : Dekker : 53 - 79. )。 そのような細胞除去活性を有さないサブク ラスの抗体を選択、あるいはそのようなサブクラスの Fc部分を遺伝子組換え技術 により導入 '置換した上で、 in vitroで抗体の細胞傷害活性スクリ一ニングを実 施する。 補体による細胞傷害活性のスクリーニングは次のような方法で可能であ る。 CD52を発現しているターゲット細胞を 51Crと共に 37°Cで 1時間インキュべ ートし、 ターゲット細胞を 51Crで標識する。 この細胞を洗浄後、 96wel lプレート に播種し、 抗 CD52抗体とヒ ト捕体とを添加して 37°Cで 2時間インキュベートす る。 ィンキュベート後に上清を回収し、 トップカウント (Packard) などを用いて 上清中に放出された 51Crのカウントを測定することによってその抗体の補体によ る細胞傷害活性を評価可能である。 また、 抗体依存的細胞性細胞傷害活性は次の ような方法でスクリ一ユングできる。 CD52を発現しているターゲット細胞を 51Cr と共に 37°Cで 1時間インキュベートし、 ターゲット細胞を51 Crで標識する。 この 細胞を洗浄後、 96wellプレートに播種し、 抗 CD52抗体とヒ ト末梢血単核球とを 添加して 37°Cで 4時間インキュベートする。 インキュベート後に上清を回収し、 トップカウントなどを用いて上清中に放出された 5 ,Crのカウン 1、を測定すること によってその抗体の抗体依存的細胞性細胞傷害活性を評価可能である。 上述の方 法で選別された抗体がリンパ球除去活性を持たないことは、 最終的にはヒ トに投 与した際のリンパ球数をモニターすることで確認できる。
上述のとおり、 経血管内皮細胞遊走は、 CD52ァゴニストを CD52に作用させる ことにより抑制されるので、 免疫応答が抑制され得る。 また、 CD3と CD52とを共 に刺激することによつて調節性 T細胞の分化誘導が促進され、かつ/または調節性 T細胞の増殖が促進されることから、 この CD3と CD52との同時刺激もまた、 免疫 応答の抑制をもたらす。 したがって、 本発明により提供される、 CD52ァゴニスト を有効成分として含有する医薬組成物、および CD52ァゴニストと CD3ァゴニスト とを有効成分として含有する医薬組成物は、 免疫抑制剤として有用であり得る。 該医薬組成物は、 さらに特定の免疫系の作用機序を標的とする薬剤として、 調節 性 T細胞の分化誘導および/または増殖促進剤として有用であり得る。
また、 本発明によって提供される、 医薬組成物は、 生体内に投与されるもので あってもよいし、 患者または別のヒ トから採取した免疫細胞、 特に T細胞、 ある いは免疫細胞を含む末梢血、 リンパ液、 リンパ節細胞、 胸腺細胞を生体外で処理 するためのものであっても良い。 本発明の医薬組成物は、 周知の方法で製剤化さ れうる。 すなわち治療効果上許容される種々の添加物、 例えば担体、 pH緩衝剤、 安定化剤、 賦形剤等を添加した医薬製剤が製造される。 このような製剤は、 好ま しくは、 生理学的に許容され得る希釈剤またはキャリアを含んでおり、 適切なキ ャリアには、 生理的食塩水、 リン酸緩衝生理食塩水、 リン酸緩衝生理食塩水ダル コース液、 およぴ緩衝生理食塩水が含まれるが、 これらに限定されるものではな い。 或いは、 CD52ァゴニストは凍結乾燥 (フリーズドライ） し、 必要なときに上 記の緩衝水溶液を添加することにより再構成して使用してもよい。 上記製剤の投 与形態としては、 錠剤、 カプセル剤、 顆粒剤、 散剤、 シロップ剤等による経口投 与、 または、 注射剤、 点滴剤、 坐薬等による非経口投与を挙げることができる。 上記医薬組成物の投与方法、 投与量は、 前臨床試験、 臨床試験の過程において 適宜決定されうる。 例えば、 症状、 年齢、 体重などによって異なるが、 通常、 経 口投与では、 成人に対して、 1 日約 0. 01mg〜1000mgであり、 これらを 1回、 また は数回に分けて投与することができる。 また、 非経口投与では、 1回約 0. 01mg〜 lOOOmgを皮下注射、 筋肉注射または静脈注射によって投与することができる。 治療の対象となる疾患は、 免疫抑制効果をもたらす処置が必要とされる疾患で あり、 具体的には移植片対宿主病 （GvHD) あるいは移植片拒絶の治療または予防 を目的とした臓器又は細胞移植前後における処置、リゥマチなどの自己免疫疾患、 あるいは接触過敏症などのアレルギー性疾患の治療または予防が挙げられる。 本発明において、 患者または別のヒ トから採取した免疫細胞、 あるいは免疫細 胞を含む末梢血、 リンパ液、 リンパ節細胞、 胸腺細胞を生体外で処理することに より、調節性 T細胞を増殖させ、患者の体内に戻す療法を採用することができる。 末梢血または骨髄細胞を生体より採取し、 患者の体内に戻す幹細胞移植療法はす でに実施されている。 また、 免疫細胞の 1種である樹状細胞 （dendritic cel l) に人為的処理を施し、 患者の体内に戻す癌治療も行われている （M. Jefford, et al. , The Lancet Oncology, 2： 343—353, June, 2001)。 採取された免疫細胞に CD52ァゴニストおよび CD3ァゴニストを作用させることにより、調節性 T細胞の 分化誘導および/または増殖を促進することができ、該調節性 T細胞を増殖させた 後に患者の体内に戻すことにより治療または予防効果を奏することができる。 こ のようないわゆるェクスビポ （ex vivo) の方法は、 基礎研究の場において開発さ れた実験系をほぼそのまま治療の場において再現するものであるとも言える。 薬 剤の生体内への投与が、 体内吸収、 代謝、 または未知の因子による干渉作用など の影響により、期待した治療効果を奏しえない場合があり うることと比較すると、 より実用化へのリスクの低い方法であるといえる。
さらに、本発明は、調節性 T細胞の分化誘導および/もしくは増殖促進ならぴに
/または免疫細胞の経血管内皮細胞遊走抑制効果を有する薬剤の開発のために、
CD52 を発現している細胞と候捕化合物を接触させて、 その相互作用または CD52 刺激応答を検出することにより、 CD52 との相互作用を指標にして CD52 ァゴニス トとなる化合物をスクリ一ユングすることも包含する。
実施例 1 ： 4C8抗原の同定
ヒ ト T細胞が血管内皮細胞に接着した後の内皮下への遊走に関与する分子を同 定する目的で最初に発見された免疫系細胞の一部に発現する膜タンパク質である 4C8抗原に対するモノクローナル抗体 4C8抗体が、 T細胞の in vitro血管外遊走 を抑制することを、 すでに本発明者らは明らかにしている （Masuyama, J. et al. , 1999. J. Exp. Med. 189 : 979-989 ; W099/12972号公報）。
まず、 この 4C8抗原の正体の同定を試みた。 4C8抗原は、 4C8mAb陽性細胞画分 である CD3陽性細胞を遺伝子源として cDNAライブラリ一を作製し、ライブラリ一 を一過性に発現させた COS- 1細胞を 4C8mAbと MACS (Miltenyi Biotec) を用いて 濃縮することにより、 単離 '同定した。
へパリン添加ヒ ト末梢血から Ficoll- Hypaque による密度勾配遠心法により末 梢血単核球を分離し、 CD3陽性 T細胞を抗 CD3抗体 （Miltenyi Biotec) と MACS を用いて調製した。 108個の CD3陽性 T細胞から RNeasy Mini Kit (QIAGEN Inc)を 用い、 90 μ g の総 RNA を得た。 poly (A) +RNA は 01 i gotex™-dT30 < Super > mRNA Purification Kit (TAKARA BIO Inc. ) を用いて精製し、 90 μ gの総 RNA力、ら 1· 7 μ gの poly (A) +RNAを得た。この poly (A) +匪力 ら Superscript™Choice System for cDNA Synthesis (Invitorogen Co. )を用いて合成した cDNAはァガロースゲル電気 泳動によりサイズ分画を行い、 1 Kbから 10Kb の cDNAを真核細胞発現ベクター pEF18S (Ohashi, H. et al. , 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 : 158 - 162) に クローン化した。 その結果、 7 X 106個の独立クローンからなる CD3陽性 T細胞由 来 cDNAライブラリ一を得た。
上記ライブラリーの LB (Luria-Bertani)培養液 500ml力、ら、 Endofree Plasmid
Maxi Kit (QIAGEN Inc. )を用いて 270 z gのプラスミ ドを得た。 このうち 100 g を 2 X 107の C0S-1細胞に TransIT- LT1 (TAKARA BIO Inc. ) を用いて一過性に導入 した。ライブラリ一を一過性に発現させた COS - 1細胞から C8mAb陽性細胞を当該 抗体と MACSとを用いて精製した。 4C8mAb陽性 C0S-1細胞から Hirt法 （Hirt B.，
1967. J. Mol. Biol. , 26 : 365 - 369)によりプラスミ ドを回収し、大腸菌（ElectroMAX
DH10B, Invitrogen Co. ) に導入して増幅した後プラスミ ドを上記と同様に調製し た。 上記 COS-l細胞導入からプラスミ ド回収までの工程を更に 3回繰り返した。 こうして得られた濃縮ライブラリーより無作為に 384個の独立プラスミ ドク口 一ンを単離し、 上記と同様に COS- 1 細胞に一過性に導入した後、 FACSCalibur (Becton- Dickinson) を用いて 4C8陽性クローンを判別した。 その結果、 3個の クローンが 4C8陽性となることが判明した (図 1 )。
陽性クローンの塩基配列を ABI PRISM 3700 DNA Analyzer (Applied Biosystems) を用いて決定し、 BLASTによりヌクレオチドデータベースの検索を行ったところ、 3つの陽性クローンはいずれも CD52 (Xia, M. Q. et al. , 1991. Eur. J. Immunol. 21： 1677-1684) をコードすることが判明した。 当該 cDNAを COS- 1細胞で発現さ せたものは、 抗 CD52抗体であることが知られている Campath- 1Hによっても染色 された。 また、 CD52と同じ GPIアンカータンパク質である CD48、 CD58、 CD59の cDNAを C0S-1細胞で発現させ、 4C8mAbによる染色性を FACSCaliburで解析したと ころ陰性となり、 4C8mAbが GPIアンカータンパク質に共通の構造を認識していな いことが確認された （図示せず）。 これらのことから、 4C8は CD52であると断定 された。
実施例 2 ： Campath- 1H副刺激による調節性 T細胞の誘導
CD52を抗原とするモノクローナル抗体 Campath- 1H (C1H)を副刺激として用いた ときに、 4C8mAbを用いたときと同様に CD4陽性 T細胞から調節性 T細胞が誘導さ れるかどうかを検討した。
健常人ポランティア末梢血から Ficoll— Paque Plus (Amersham Pharmacia) に よる密度勾配遠心法により末梢血単核球を分離した。 CD4陽性 T細胞は、 末梢血 単核球より MACS CD4+ T Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec) を用いて試薬 製造者の操作手順書に従ってネガテイブセレクションによつて調製した。
プレートへの抗体の固相化は次のように行った。 PBSを用いて lOOng/mlに調製 した抗 CD3抗体 （0RTH0CL0NE 0KT3, Ortho Biotech) を 48wellプレート （Costar) に分注して 4°Cで 24時間ィンキュベーションを行って固相化した後、 PBSを用い て 10 g/mlに調製した 4C8mAbあるいは Campath - 1H (CAMPATH, Berlex) を同様 に固相化した。
前述の方法により調製した CD4陽性 T細胞は RPMI1640 (GIBC0)に 10%FCSと 15raM の HEPESバッファーを添加した培地に懸濁し、 上記の方法で抗体を固相化したプ レートに 8X105cells/well となるように播種し、 C02インキュベータ中で 37°C /5°/。C02で 3 日間培養した。 培養後に細胞を回収し洗浄した後、 培地に再懸濁して 24wellプレート（Costar)に lX106cells/well となるように播種し、 更に 4 日間 無刺激下で培養して休止状態にしたものを 4C8mAb 副刺激細胞あるいは Campath-1H副刺激細胞として抑制アツセィに供した。
抑制ァッセィは次のように行つた。 96wellU底プレート (ICN) に CD4 陽性 T 細胞 lX105cells/wellを X線照射（5000rad)した末梢血単核球 4X 105cells/well と共に播種し、 抗 CD3抗体を最終濃度 25ng/mlで添加して 3 日間培養した。 この とき、 調節性 T 細胞を加えなかった対照群と調節性 T 細胞として X 線照射 (5000rad)した 4C8mAb 副刺激細胞または Campath- 1H 副刺激細胞を 0.5〜2X 105cells/well で添加した群とで [ ]チミジン取り込みを比較して抑制活性を評 価した。 [¾]チミジン取り込みは、 培養 3 日目に 0.2/iCi/wellの [ ]チミジンを 添加して 8時間後に細胞を回収し、 細胞に取り込まれた [¾]チミジンのカウント をベータプレート （PerkinElmer) で測定することにより評価した。 1回のアツセ ィに用いた細胞は全て同一提供者由来である。
図 2に示したように、 Campath- 1H副刺激細胞は 4C8mAb副刺激細胞と同様に CD4 陽性 T細胞の抗 CD3抗体刺激による増殖を添加細胞数依存的に抑制した。
実施例 3 ： Campath- 1Hによる CD3陽性 T細胞の経血管内皮細胞遊走の抑制
4C8mAbで報告されている CD3陽性 T細胞の経内皮細胞遊走に対する抑制活性
(Masuyama, J. et al. , 1999, Journal of Experimental Medicine, 189(6)， 979-989)が他の抗 CD52抗体でも見られるかどうかを Campath- 1Hを用いて検討し た。 方法は上記論文で報告した方法に基づいて以下のように行った。
CD3陽性 T細胞は末梢血単核球からナイロンウールカラムを用いて CD3陽性 T 細胞画分を濃縮した後、 抗 CD16磁気抗体 （Advanced Magnetics, Inc. ) を用いた ネガティブセレクションにより調製した。
50 μ 1 Ave 11 のコラーゲンゲノレを敷いた 96 we 11 平底プレー ト (Becton
Dickinson)にヒ ト臍帯静脈血管内皮細胞をコンフルェントになるまで培養したも のをアツセィに供した。 CD3陽性 T細胞は M199 (GIBC0) に 0.5% BSAを添加した 培地中に 0. 3〜3 g/mlの 4C8mAbまたは Campath- 1Hを加え、 20分間氷上に静置 して前処置を行った。 この CD3陽性 T細胞 （3 X 105/well) を抗体処置後、 洗浄せ ずに前述のヒ ト臍帯静脈血管内皮細胞を敷いたプレートに播種した。 このプレー トを 50 X gで 1分間遠心した後、 37。Cで 3時間インキュベーションを行い、 未接 着 CD3陽性 T細胞と血管内皮細胞を EDTAで処理して洗浄除去後、ヒ ト臍帯静脈血 管内皮細胞層下のコラーゲンゲル内へ遊走している T細胞数を位相差顕微鏡下で 計数し、 単位面積あたりの遊走細胞数を抗体処置群と未処置群で比較した。 実験 はすべてトリプリケートで行つた。
図 3に示したように、 Campath_lHは 4C8mAb同様に CD3陽性 T細胞の経内皮細 胞遊走を抑制した。したがって、抗 CD52抗体である Campath- 1Hは 4C8mAbともに、 経内皮細胞遊走抑制を誘導することが判明した。
実施例 4 - 1 :抗 CD52抗体副刺激により誘導される調節性 T細胞の CD4陽性 T細胞 混合リンパ球培養反応に対する抑制
抗 CD52抗体副刺激により誘導される調節性 T細胞がァロ抗原刺激による CD4 陽性 T細胞の反応を抑制するかどうかを検討するため、 CD4陽性 T細胞混合リン パ球培養反応ァッセィを行った。 抗 CD52抗体としては 4C8mAbを使用した。
調節性 T細胞は実施例 2に示した方法で誘導した。 刺激細胞として用いた単球 由来成熟榭状細胞は次のように誘導した。末梢血単核球より MACSマイクロビーズ CD14 (Miltenyi Biotec) を用いて試薬製造者の操作手順書に従ってポジティブセ レクシヨンによって CD14 陽性細胞を調製した。 CD14 陽性細胞を RPMI1640 に 10%FCS 2 -メルカプトエタノール (GIBC0)、 100ng/mlの IL - 4、 50ng/mlの GM- CSF を添加した培地に懸濁し、 6wellプレート （Falcon) に 3 X 106cells/wellで播種 して、 5日間培養後、 最終濃度 10ng/mlの LPSを添加し、 更に 24時間培養を行つ て単球由来成熟樹状細胞を誘導した。細胞の一部はフローサイ トメータ（FACScan, Becton Dickinson) 解析に供し、 成熟樹状細胞マーカーの発現を確認した。
混合リンパ球培養反応は提供者 A から調製した CD4 陽性 T 細胞 （I X
105cel ls/well ) と異なる提供者 B から調製した単球由来成熟樹状細胞（1 X
104cells/Well)を 96wellU底プレートに播種し、 4 日間培養した。 このとき、 調 節性 T細胞を加えなかった対照群と調節性 T細胞として X線照射（5000rad)した 4C8mAb副刺激細胞を l〜2 X 105cells/wellで添加した群とで [¾]チミジン取り込 みを比較し抑制活性を評価した。 [¾]チミジン取り込み測定は実施例 1と同様に 行った。 但し、 [¾]チミジン添加から細胞回収までの培養時間は 16時間とした。 図 4に示したように、 4C8mAb副刺激細胞は CD4陽性 T細胞混合リンパ球培養反 応を添加細胞数依存的に抑制した。
実施例 4 - 2 ： Campath-1H副刺激により誘導される調節性 T細胞の CD4陽性 T細 胞混合リンパ球培養反応に対する抑制
抗 CD52抗体として Campath- 1Hを用いて誘導した調節性 T細胞によってもァロ 抗原刺激による CD4陽性 T細胞の反応が抑制されるかどうかを検討した。 実験は 上記実施例 4-1と同様の方法で実施した。 ただし、 反応期間は 3日間とした。 図 5に示したように、 Camapth- 1H副刺激細胞は CD4陽性 T細胞混合リンパ球培 養反応を添加細胞数依存的に抑制した。
したがって、 Campath- 1H副刺激により誘導される調節性 T細胞は、 4C8mAb副刺 激により誘導される調節性 T細胞と同様に、 ァロ抗原刺激による CD4陽性 T細胞 の反応を抑制することが示された。
実施例 5— 1 ：抗 CD52抗体副刺激により誘導される調節性 T細胞の CD8陽性 T 細胞混合リンパ球培養反応に対する抑制
抗 CD52抗体副刺激により誘導される調節性 T細胞がァロ抗原刺激による CD8 陽性 T細胞の反応に対しても抑制を示すかどうかを検討するため、 CD8陽性 T細 胞混合リンパ球培養反応ァッセィを行った。 抗 CD52抗体としては 4C8mAbを使用 した。
CD8陽性 T細胞は、末梢血単核球より MACS CD8+ T Cell Isolation Kit (Miltenyi
Biotec) を用いて試薬製造者の操作手順書に従いネガティブセレクションによつ て調製した。 調節性 T細胞は実施例 2に示した方法で誘導した。 刺激細胞として 用いた単球由来成熟樹状細胞は実施例 4-1と同様に誘導した。
混合リ ンパ球培養反応は提供者 A から調製した CD8 陽性 T 細胞
( lxl05cells/well ) と異なる提供者 B から調製した単球由来成熟樹状細胞
(lxl04cells/well)を 96wellU底プレートに播種し、 3 日間培養した。 このとき、 調節性 T細胞を加えなかつた対照群と調節性 T細胞として X線照射（5000rad)した 4C8mAb副刺激細胞を l-2xl05cel l s/wel lで添加した群とで [¾]チミジン取り込み を比較し抑制活性を評価した。 [3H]チミジン取り込み測定は上記実施例 4一 2と 同様に行った。
図 6に示したように、 4C8mAb副刺激細胞は CD8陽性 T細胞混合リンパ球培養反 応を添加細胞数依存的に抑制した。
実施例 5— 2： Campath-1H副刺激により誘導される調節性 T細胞の CD8陽性 T細 胞混合リンパ球培養反応に対する抑制
抗 CD52抗体として Campath - 1Hを用いて誘導した調節性 T細胞によってもァロ 抗原刺激による CD8陽性 T細胞の反応に対しても抑制を示すかどうかを検討する ため、 CD8陽性 T細胞混合リンパ球培養反応アツセィを行った。 実験は実施例 5 一 1と同様の方法で実施した。
図 7に示したように、 Campath- 1H副刺激細胞は混合リンパ球培養反応を添加細 胞数依存的に抑制した。
したがって、 Campath- 1H副刺激により誘導される調節性 T細胞は、 4C8mAb副刺 激により誘導される調節性 T細胞と同様に、 ァロ抗原刺激による CD8陽性 T細胞 の反応を抑制することが示された。
実施例 6 ：ァロ抗原反応後の CD4陽性 T細胞からの調節性 T細胞の誘導
ァ口抗原反応後の CD4陽性 T細胞に抗 CD52抗体副刺激を加えることによって、 抗原選択的な抑制活性をもつた調節性 T細胞を誘導することが可能であるかどう かを検討した。
刺激細胞として用いた単球由来成熟樹状細胞は次のように誘導した。 実施例 4
- 1に示した方法で調製した CD14陽性細胞を、 X- VIVO- 15培地（Cambrex)に 1%熱 非働化済自己血漿、 100 ng/ml IL-4、 50 ng/ml GM-CSFを添加した培地に懸濁し、
6wel lプレートに 3 X 106 cells/wellで 7 日間培養後、 細胞を回収 ·洗浄し、 前 述の培地に 10 ng/ml 11-1 β (R&D systems)、 3 μ g/ral IL-6 (キリン社内施設に て生産）、 10 ng/ml TNF a (PeproTech)、 1 ！丄 g/ml プロスタグランジン E2 (Sigma) を添加した培地に懸濁して l X 106cel ls/wel lで 6wellプレートに播種し、 更に 2 日間培養して単球由来成熟樹状細胞を誘導した。 CD4陽性 CD45RA陽性 T細胞は上 記実施例 2に記載の方法で単離した CD4陽性 T細胞から、 MACS CD45RA MicroBeads (Miltenyi Biotec)を用いて、試薬製造者の操作手順書に従いポジティブセレクシ ョンによって調製した。
ァロ抗原反応およびその後の調節性 T細胞誘導は次のように行った。 提供者 A から調製した CD4陽性 CD45RA陽性 T細胞 （1 X 106 cells/well) と異なる提供者 B から調製した単球由来成熟樹状細胞 （l X 105cells/well) を、 ピルビン酸（Gibco) および MEM非必須ァミノ酸溶液 （Gibco) を添加した X- VIV0-15培地に懸濁して 24wellプレートに播種した。 6日間培養後、 細胞を回収し、 1 X 106cells/wel lに なるように再調製し、 更に 4日間培養した細胞をァロ抗原反応後 T細胞として、 この細胞集団から調節性 T細胞の誘導を行った。 調節性 T細胞の誘導は実施例 2 に示した方法で行った。 ただし、 CD4陽性 T細胞の代わりにァロ反応後 T細胞を 用いた。 対照群として、 提供者 Aから調製した CD4陽性 T細胞から調節性 T細胞 を誘導した。 以下、 ァロ反応後 T細胞から誘導した調節性 T細胞をァロ抗原反応 後調節性 T細胞、 CD4陽性 T細胞から誘導した調節性 T細胞をコント口ール調節 性 T細胞と記す。
各調節性 T細胞の抑制活性の評価は実施例 4に記載の混合リンパ球培養反応に よって行った。 ただし、 刺激細胞として、 ァロ抗原反応後 T細胞の作製の際に用 いた提供者 Bから調製した単球由来成熟樹状細胞、 あるいは第三者である提供者 C から調製した単球由来成熟榭状細胞を用いた。 反応の際の培地としては X-VIV0-15 培地にピルビン酸と非必須ァミノ酸溶液を添加したものを用い、 培養 期間は 3日間とした。
図 8に示したように、 提供者 Bに対する反応において、 ァロ抗原反応後調節 T 細胞はコント口ール調節性 T細胞よりも強い抑制活性を示した。 しかしながら、 第三者である提供者 Cに対する反応において、 両者の抑制活性は同等であった。 以上のことから、ァロ抗原反応後 T細胞から抗 CD52抗体を用いて調節性 T細胞を 誘導することで、 ァロ抗原選択的な抑制活性を示す調節性 T細胞が得られること が半 ljつた。
実施例 7— 1 ：抗 CD52抗体副刺激により誘導される調節性 T細胞の in vitroに おける増
抗 CD52抗体副刺激により誘導される調節性 T細胞を IL- 2存在下で培養する とにより増幅が可能であるかどうかを検討した。
抗 CD3抗体および 4C8 mAbを実施例 2に記載の方法で固相化したプレートに、 CD4陽性 T細胞を 8 X 105 cells/well となるように播種して 3 日間培養した。 培 養後に細胞を回収 ·洗浄した後、 100 U/ml IL-2 (Chiron) 含有培地に再懸濁して 24wellプレートに 1 X 106 cells/wellとなるように播種した。 2 日間の培養の後、 細胞を回収し、 100 U/ml IL-2含有培地で 1 X 106 cells/well になるよう再調製 して、 更に 3 日間培養した。 計 8 日間の培養後の細胞を回収し、 一部を用いて 1 回目の抑制ァッセィ（day 8)を実施例 2に記載の方法で実施した。 更に、 8日間培 養後の細胞の一部は、 洗浄したのち、 抗 CD3抗体および 4C8 mAbを固相化したプ レートでの 3 日間の培養と無刺激下での 4日間の培養を実施例 2に示した方法で 行い、 得られた細胞を用いて 2回目の抑制アツセィ（day 15)を実施した。 対照群 として、培養 3 日目から 8日目までの期間を IL - 2不含培地で培養する点以外は全 く同じ処理を行った細胞を、 それぞれの抑制アツセィで用いた。
図 9に示したように、 IL- 2存在下で 5日間培養することによって、細胞数は 10 倍以上に増加したが、 図 1 0に示したように、 IL-2存在下での培養直後に実施し た 1回目の抑制アツセィ （day 8) では、 対照群に較べて抑制活性が大きく減弱し ていた。 しかしながら、 図 1 1に示したように、 この細胞に再度抗 CD52抗体副刺 激を施した後の 2回目の抑制アツセィ（day 15)では、抑制活性の回復が見られた。 15日間の全培養期間で細胞数は 30倍に増加した。
実施例 7— 2 ： Campath-1H副刺激により誘導される調節性 T細胞の in vitroに おける増幅
抗 CD52抗体として Campath- 1Hを用いて誘導した調節性 T細胞も IL- 2存在下で 培養することにより増幅が可能であるかどうかを検討した。
調節性 T細胞の誘導および増幅は実施例 7— 1に記載の方法で実施した。 ただ し、副刺激として Campath- 1H (30 g/mlまたは lOO ^u g/mlにてプレートに固相化） を用いた。 また、 IL- 2存在下での培養期間はこの実施例では 4日間、 抑制アツセ ィは dayl 4でのみ実施した。 IL- 2非添加群は設けず、実施例 7同様に副刺激とし
X 4 C8mAbを用いたものを対照群とした。 Campath- 1Hは 4C8mAbに較べて活性化能 が若干弱い傾向があつたため、 充分な活性化を得るため、 この実施例においては 固相化の際の条件として 30 μ β/ηι1あるいは 100 /i g/mlと高い濃度を設定した。 図 1 2に示したように、 IL- 2存在下での培養によって Campath- 1H副刺激細胞 は 4C8mAb副刺激細胞同様、 10倍以上に増幅した。 また、 図 1 3に示したように Carapath-IH副刺激細胞は 4C8mAb副刺激細胞同様に増幅後も抑制活性を保持して いた。
したがって、 IL-2存在下での増幅後に抗 CD52抗体副刺激を繰り返すことによ つて、 抑制活性を保持した調節性 T細胞を増幅することが可能であることが示さ れた。
実施例 8— 1 ： SCIDマウスへのヒ ト末梢血移入によるマウス致死作用の調節性 T 細胞同時移入による抑制と調節性 T細胞の生体内における安全性
SCIDマウス （6週齢、 ォス、 日本クレアから入手） に対し、 NK細胞の活性を抑 制しヒ ト細胞を生着しやすくするために IL- 2受容体 鎖を認識する ΤΜ- ]3 1抗体 (20 μ §/マウス, Pharmingen) をヒ ト細胞移入前日に腹腔内投与し、 ヒ ト細胞移 入日に亜致死量 （2. 5Gy) の放射線を照射した後、 ヒ ト細胞の移入を行った。 健常 人からァフェレ一シスによって採取した末梢血を Lymphoprep (AXIS-SHIELD) に よる比重遠心法によって得た単核細胞 （PBMC；)、 または同一ドナーの PBMCから実 施例 2に記載の方法で分離した CM陽性 T細胞から 4C8mAbで増幅 ·誘導した（実 施例 7で示した方法による） 調節性 T細胞を用意し、 PBMC 1X107もしくは 2X107 個を単独で投与、調節性 T細胞 1X107もしくは 2X107個を単独で投与、または PBMC と調節性 T細胞各 1X107個（合計 2X107個）を混じて腹腔内投与する各群を設けた。 その他に、細胞非移入群を設けた。なお、移入した PBMCを抗 CD3抗体（Pharmingen) で染色し FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson)にて測定することに より、 PBMCに含まれる CD3陽性 T細胞の割合は、 42%であることを確認している。 何れの群も 5匹のマウスを用いた。 マウスの体重測定と状態の観察を細胞移入後 30日間行った。
TM- β 1抗体を投与した SCIDマウスにヒ ト PBMCを腹腔内投与すると、マウス体 内でヒト T細胞が活性化して増殖する結果、 マウスが異種移植片対宿主症様を呈 し衰弱死亡することを事前に確認している。今回の実験においても PBMCを単独で
1X107もしくは 2X107個移入されたマウスは、 実験開始時に行った放射線照射によ る一過性の体重減少から回復することなく （図 1 4 )、何れの群においても全例が 約 2週間で死亡した（図 1 5 )。一方、調節性 T細胞を単独で 1X107もしくは 2X107 個移入されたマウスでは、 死亡例は認められず、 細胞非移入群とほぼ同様な体重 変動を示しながら （図 1 4 )、 全例が 30日間の観察期間終了まで生存した （図 1 5 )。 PBMCと調節性 T細胞を混じて投与された群では、 PBMC単独移入群よりやや 遅れて 3/5例が死亡したが、残りの 2/5例は観察期間終了時まで生存し、 PBMC単 独投与した何れの群よりも有意な生存延長 （Logrank testによる） を示した （図 1 5 )。
実施例 8— 2 ： SCIDマウスへのヒト末梢血投与によるマウス致死作用の調節性 T 細胞同時投与による抑制と調節性 T細胞の生体内における安全性
SCIDマウス （8週齢、 メス、 日本クレアから入手） に対し、 NK細胞の活性を抑 制してヒ ト細胞を生着しゃすくするために、 IL - 2 β受容体を認識する ΤΜ- 1抗体 (20 u g/マウス, Pharmingen) をヒ ト細胞投与前日に腹腔内投与し、 ヒ ト細胞投 与日に亜致死量 （2. 5Gy) の放射線を照射した後、 ヒ ト細胞の投与を行った。 健常 人からァフェレ一シスによって採取した末梢血を、 Lymphoprep (AXIS-SHIELD) に よる比重遠心法に供し、得られた単核細胞 （PBMC) または同一ドナーの P腿 Cから 実施例 2記載の方法で単離した CD4陽性細胞から Campath_lHで増幅'誘導した（実 施例 7— 2参照） 調節性 T細胞を用意した。 PBMC1. 2X107個を単独で投与する群、 調節性 T細胞 1. 2X107個を単独で投与する群、 PBMCと調節性 T細胞とをそれぞれ 1. 2X107個 （合計 2. 4X107個） を混じて腹腔内投与する群、 および細胞を投与しな い細胞非投与群を設けた。 調節性 T細胞単独投与群を除いた各群は、 細胞投与後 11 日目で剖検を行い急性期の症状 （組織所見を含む） を観察する群とマウスの体 重測定と状態を 21 日間観察する群とに分け、それぞれの群には 5匹のマウスを用 いた。 なお、 得られた細胞数の関係から調節性 T細胞単独投与群 （2匹） は、 細 胞投与後 12日目における剖検のみを行った。 なお、 投与した PBMC中に含まれる CD3陽性 T細胞の割合は、 抗 CD3抗体 （Pharraingen) で染色し FACSCalibur f low cytometer (Becton Dickinson)を測定することにより、 49. 4%であることが予め確 認されている。
我々は、 TM- ]3 1抗体を投与した SCIDマウスにヒ ト PBMCを腹腔内投与すると、 マウス体内でヒ ト T細胞が活性化して増殖する結果、 マウスが異種移植片対宿主 症様を呈し衰弱死亡することが事前に確認されている。 今回の実験においても、
PBMCを単独で投与されたマウスは、実験開始時に行った放射線照射による一過性 の体重減少から回復することなく (図 1 6 )、 何れの群においても全例が 21 日目 までに死亡した （図 1 7 )。 P腿 C と調節性 T細胞を混じて投与された群では、 単 純には合計 2倍量のヒ ト細胞を投与されたにもかかわらず細胞非投与群とほぼ同 様な体重の推移を示し （図 1 6 )、 全例が生存した （図 1 7 )。 なお、 調節性 T細 胞を単独で投与されたマウスでは、 細胞非投与群を上回る体重増加の回復傾向を 示し（図 1 6 )、マウスに対する急性期の侵襲を示すことは少ないことが示唆され た。 また、 試験期間中の剖検時において、 PBMC単独投与群では消化管における単 核細胞浸潤、 水腫や毛細血管の拡張などがみられたが、 PBMCと調節性 T細胞混合 投与群や調節性 T細胞単独投与群ではそのような変化が認められなかった （図 1 8 )。
以上の成績から、 本 in vivoモデル系において調節性 T細胞は PBMCと異なり、 単独ではマウスに対して全く病原性を示さないこと、 および単独投与で起こる PBMCのマウスに対する致死作用が調節性 T細胞を同時に投与することにより顕著 に抑制されることが明らかになった。またこれらのことから、抗 CD52抗体により 誘導された調節性 T細胞は、 生体内においても過度なヒ ト T細胞の活性化を抑制 することから、 その投与は T細胞の異常活性化に伴い発症する各種疾患に対し、 有効な治療法となることが示唆された。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。 産業上の利用の可能性
本発明により、 CD52を介したシグナルが免疫抑制的、 すなわち、 調節性 T細胞 の分化誘導および/または増殖促進ならびに経血管内皮細胞遊走抑制を誘導する ことが明らかとなり、 CD52に対する抗体を含む CD52 ァゴニス トが免疫抑制、 調 節性 T 細胞の分化誘導および/または増殖促進ならびに経血管内皮細胞遊走抑制 のための医薬組成物、 すなわち自己免疫疾患、 アレルギー疾患および移植免疫応 答抑制等のための医薬組成物の有効成分として有用である。 さらに、 本発明によ り、 CD52ァゴニストを用いて調節性 T細胞を ex vivoで調製することが可能とな り、 自己免疫疾患および移植免疫応答の抑制などの免疫抑制が望まれる症状 ·疾 患に対する治療および/または予防への利用が可能となる。
また、 本発明によって示された、 抗原選択性を持った調節性 T細胞を用いること により、 従来の免疫抑制剤の使用で起こる可能性がある免疫系全般に対する抑制 に伴う副作用を回避しつつ、 標的抗原特異的な免疫反応のみを抑制することが期 待できる。

Claims

請求の範囲
I . 4C8抗体以外の CD52ァゴニストを有効成分として含有する、 免疫抑制の ための医薬組成物。
2 . 4C8抗体以外の CD52ァゴニストを有効成分として含有する、 調節性 T細 胞の分化誘導および/または増殖促進のための医薬組成物。
3 . 調節性 T細胞が抗原選択的な抑制活性を有するものである、 請求項 1ま たは 2記載の医薬組成物。
4 . CD3 ァゴニス トをさらに含む、 請求項 1〜 3のいずれか 1項記載の医薬 組成物。
5 . CD3ァゴニストが抗 CD3抗体またはそのフラグメントである、 請求項 4 記載の医薬組成物。
6 . 抗 CD3抗体がヒ ト化抗体またはヒ ト抗体である、 請求項 5記載の医薬組 成物。
7 . 4C8抗体以外の CD52ァゴニストを有効成分として含有する、 免疫細胞の 経血管内皮細胞遊走抑制のための医薬組成物。
8 . CD52ァゴニストが抗 CD52抗体またはそのフラグメントである、 請求項 1〜 7のいずれか 1項記載の医薬組成物。
9 . 抗 CD52抗体がヒ ト化抗体またはヒ ト抗体である、請求項 8記載の医薬組 成物。
1 0 . 上記ヒ ト化抗体がラットヒ ト化抗体 Campath- 1Hである、請求項 9記載 の医薬組成物。
I I . 自己免疫疾患、 アレルギー疾患または移植免疫応答の予防または治療 のための、 請求項 1〜 1 0のいずれか 1項記載の医薬組成物。
1 2 . 免疫細胞の表面に発現する CD52に 4C8抗体以外の CD52ァゴニストを 作用させることにより調節性 T 細胞の分化誘導および/または増殖を促進する方 法。
1 3 . 調節性 T細胞が抗原選択的な抑制活性を有するものである、 請求項 1
2記載の調節性 T細胞の分化誘導および/または増殖を促進する方法。
1 4 . CD52ァゴニストが抗 CD52抗体またはそのフラグメントである、 請求 項 1 2記載の方法。
1 5 . 抗 CD52抗体がヒ ト化抗体またはヒ ト抗体である、請求項 1 4記載の方 法。
1 6 . 上記ヒ ト化抗体がラッ トヒ ト化抗体 Campath-1Hである、請求項 1 5記 載の方法。
1 7 . 上記免疫細胞の表面に発現する CD3に CD3ァゴニス トを作用させるこ とをさらに含む、 請求 1 2記載の方法。
1 8 . CD3ァゴニストが抗 CD3抗体またはそのフラグメントである、 請求項 1 7記載の方法。
1 9 . 抗 CD3抗体がヒ ト化抗体またはヒ ト抗体である、 請求項 1 8記載の方 法。
2 0 . 上記免疫細胞が、末梢血、 リンパ節または胸腺に含まれるものである、 請求項 1 2〜 1 9のいずれか 1項記載の方法。
2 1 . 上記免疫細胞が T細胞である、 請求項 2 0記載の方法。
2 2 . 上記免疫細胞が末梢血単核球である、 請求項 2 1記載の方法。
2 3 . 免疫細胞への CD3ァゴニス ト刺激および CD52 ァゴニス ト刺激が、生体 外で行われるものである請求項 1 2〜2 2のいずれか 1項記載の方法。
2 4 . 免疫細胞への CD3ァゴニスト刺激および CD52ァゴニスト刺激が、生体 内で行われるものである請求項 1 2〜2 2のいずれか 1項記載の方法。
2 5 . 免疫抑制効果、調節性 T細胞の分化誘導および/もしくは増殖促進なら びに/または免疫細胞の経血管内皮細胞遊走抑制効果を有する薬剤となる、 抗 CD52 ヒ ト化抗体またはヒ ト抗体を作製する方法。
2 6 . 免疫抑制効果、調節性 T細胞の分化誘導および/もしくは増殖促進なら びに/または免疫細胞の経血管内皮細胞遊走抑制効果を有する薬剤を、 CD52 との 相互作用を指標にスクリーニングする方法。
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