CN107177547B - 一种有助于体外获得滤泡调节性t细胞的组合物、方法及其应用 - Google Patents

一种有助于体外获得滤泡调节性t细胞的组合物、方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种有助于体外获得滤泡调节性T细胞的组合物、方法及其应用。本发明证实了使用TGF‑β、IL‑2、抗CD3抗体、抗CD28抗体和黄芩苷刺激可有效诱导体外Tfr的分化和细胞数量的增殖，促进Tfr中Foxp3的表达。因此通过该方法扩增的Tfr细胞可用来治疗一些自身免疫性疾病，如红斑狼疮、皮肌炎、血管炎、干燥综合征、硬皮病、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎和多发性硬化、自身免疫性肝炎；慢性炎症性疾病，如糖尿病、冠心病、高脂血症、湿疹、白癜风、异位性皮炎、扁平苔藓等。

Description

一种有助于体外获得滤泡调节性T细胞的组合物、方法及其 应用
技术领域
本发明涉及在体外诱导分化获得滤泡调节性T细胞，具体地说，涉及一种有助于体外获得滤泡调节性T细胞的组合物、方法及其应用。
背景技术
滤泡调节性T细胞(Follicular regulatory T cells，Tfr)，表面标记为CD4+CXCR5+，转录因子为Foxp3和BCL-6，是一群存在于生发中心和外周血的具有免疫调节功能的T细胞。Tfr来源于Foxp3+天然型调节性T细胞(nTreg)，Tfr可通过细胞膜表面的CTLA-4发挥接触性抑制作用，也可通过分泌的细胞因子IL-10、TGF-β或穿孔素对滤泡辅助T细胞和B细胞发挥免疫抑制作用，抑制生发中心的形成、自身抗体分泌，控制体液免疫的亢进；Tfr也可抑制其他效应性T细胞的增殖和分泌，控制细胞免疫的亢进。在系统性红斑狼疮、自身免疫性肝炎、类风湿性关节炎和糖尿病等一系列自身免疫炎症性疾病外周血中Tfr的细胞数量减低或免疫抑制功能减低，进而不能有效控制亢进的体液免疫和细胞免疫。综合而言，自身免疫性疾病中Tfr数量和功能减低，通过补充Tfr具有治疗自身免疫性疾病的潜力，而通过促进体内Tfr的扩增或体外扩增Tfr后回输体内都可帮助缓解自身免疫炎症损伤。
调节性T细胞(Treg)是具有免疫抑制作用的T细胞亚群，基于Treg的细胞治疗一直是自身免疫性疾病治疗的研究热点，把体外扩增后的Treg回输体内的治疗已经应用于糖尿病和红斑狼疮等自身免疫性疾病中，通过注射低剂量IL-2促进体内Treg分化也是治疗自身免疫性疾病的一种方法。但Treg对B细胞以及B细胞介导的体液免疫的抑制作用并不明显。Tfr由Treg分化而来，同样为Foxp3+的CD4+T，不同的是Tfr膜表面表达CXCR5，故可趋化至生发中心发挥免疫抑制作用，具有抑制体液免疫的作用。但Tfr的体外诱导分化和扩增较难，目前并没有找到Tfr有效的体外扩增方法。如能找到体外扩增Tfr的方法，可帮助快捷和高效的扩增Tfr细胞，扩增后的Tfr可用于自身免疫性疾病的细胞治疗。
我们前期首次证实黄芩苷可促进Treg中Foxp3的表达，并促进Treg的分化(CN200810207294.X，公开日2009年7月29日)。然而目前未见黄芩苷促进Foxp3+Tfr分化的相关报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种有助于体外获得滤泡调节性T细胞的组合物。
本发明另一的目的是提供所述组合物的用途。
本发明再一的目的是提供一种体外获得滤泡调节性T细胞的方法。
为解决上述第一个问题，本发明采取的技术方案为：
一种有助于体外获得滤泡调节性T细胞的组合物，所述组合物含有抗CD3抗体、抗CD28抗体、TGF-β、IL-2和黄芩苷。
优选地，所述抗CD3抗体、抗CD28抗体、TGF-β、IL-2和黄芩苷的比例为：抗CD3抗体(40-60)ng/ml︰抗CD28抗体(30-60)ng/ml︰TGF-β(4-6)ng/ml︰IL-2(15-40)U/ml︰黄芩苷(5-60)μM。
优选地，所述抗CD3抗体、抗CD28抗体、TGF-β、IL-2和黄芩苷的比例为：抗CD3抗体(45-55)ng/ml︰抗CD28抗体(45-55)ng/ml︰TGF-β(4.5-5.5)ng/ml︰IL-2(25-35)U/ml︰黄芩苷(30-50)μM。
更优选地，所述的抗CD3抗体、抗CD28抗体、TGF-β、IL-2和黄芩苷的比例为：抗CD3抗体50ng/ml︰抗CD28抗体50ng/ml︰TGF-β5ng/ml︰IL-230U/ml︰黄芩苷40μM。
为解决上述第二个问题，本发明采取的技术方案为：
如上任一所述的组合物在用于体外获得滤泡调节性T细胞中的用途。
为解决上述第三个问题，本发明采取的技术方案为：
第一种方案为：一种体外获得滤泡调节性T细胞的方法，所述的方法包括以下步骤：向幼稚性T细胞的培养液中加入如上任一所述的组合物进行诱导分化。
另一种方案为：一种体外获得滤泡调节性T细胞的方法，所述的方法包括以下步骤：向幼稚性T细胞的培养液中加入抗CD3抗体、抗CD28抗体、TGF-β、IL-2和黄芩苷进行诱导分化。
优选地，所述抗CD3抗体、抗CD28抗体、TGF-β、IL-2和黄芩苷的比例为：抗CD3抗体(40-60)ng/ml︰抗CD28抗体(30-60)ng/ml︰TGF-β(4-6)ng/ml︰IL-2(15-40)U/ml︰黄芩苷(5-60)μM。
更优选地，所述抗CD3抗体、抗CD28抗体、TGF-β、IL-2和黄芩苷的比例为：抗CD3抗体(45-55)ng/ml︰抗CD28抗体(45-55)ng/ml︰TGF-β(4.5-5.5)ng/ml︰IL-2(25-35)U/ml︰黄芩苷(30-50)μM。
优选地，所述抗CD3抗体、抗CD28抗体、TGF-β、IL-2和黄芩苷的终浓度为：抗CD3抗体(40-60)ng/ml、抗CD28抗体(40-60)ng/ml、TGF-β(4-6)ng/ml、IL-2(15-40)U/ml、黄芩苷(5-60)μM。
本发明以Tfr为靶点，发现一种体外促进幼稚性T细胞向Tfr分化的新方法，即黄芩苷联合细胞因子刺激可有效促进Tfr的分化和具有免疫抑制作用的细胞因子的分泌。体外扩增的Tfr可通过回输的方式用于自身免疫性疾病的治疗。其具体优点如下：
1)新颖：本发明中我们使用黄芩苷联合细胞因子TGF-β+IL-2，以及抗CD3抗体和抗CD28抗体体外可有效促进CD4+CXCR5+Foxp3+Tfr的分化和扩增。与细胞因子TGF-β+IL-2比较，黄芩苷联合TGF-β+IL-2扩大了Tfr细胞的增殖、Foxp3的表达，以及TGF-β和IL-10的分泌。该方法可开发用于体外Tfr细胞的扩增。TGF-β+IL-2可促进Treg的分化，但Tfr与Treg属于不同的细胞亚群，具有不同的功能特点。即便根据现有的技术很难想到将抗CD3抗体、抗CD28抗体、TGF-β、IL-2和黄芩苷组化起来诱导Tfr的分化。此外，不同抗体、细胞因子和药物配伍比例可能诱导出不同的结果。本发明创新性发现合适的抗体、细胞因子和药物组合，恰当的配伍比例可有效的诱导出大量的Tfr细胞。
2)可靠：本发明中Tfr主要由幼稚性T细胞诱导分化而来，而幼稚性T细胞可由脾脏和外周血通过免疫磁珠分选获得，分选方式方便快捷，分选可获得大量幼稚性T细胞，为后续Tfr诱导分化提供保障。本发明中Tfr的诱导分化，只需要在幼稚性T细胞中加入细胞因子TGF-β和IL-2，抗CD3抗体和抗CD28抗体，以及黄芩苷体外培养，方法和步骤简单可行，为大量的扩增Tfr提供保障。
3)方便快捷：临床应用过程中只需要抽取患者外周血，免疫磁珠分选幼稚性T细胞，体外诱导向Tfr分化，然后将扩增的Tfr细胞回输到患者体内即可。
4)应用范围广：Tfr具有免疫抑制作用，可对B细胞介导的体液免疫和T细胞介导的细胞免疫发挥免疫抑制作用。因此通过该方法体外扩增的Tfr细胞可广泛应用于治疗自身免疫性疾病或免疫炎症性疾病，如红斑狼疮、皮肌炎、血管炎、干燥综合征、硬皮病、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、多发性硬化和自身免疫性肝炎；慢性炎症性疾病，如糖尿病、冠心病、高脂血症、湿疹、白癜风、异位性皮炎等。
附图说明
图1：黄芩苷联合细胞因子促进Tfr细胞数量的扩增。
图2：流式检测黄芩苷联合细胞因子促进Tfr的分化。
图3：黄芩苷联合细胞因子促进Tfr中Foxp3的表达。
图4：黄芩苷联合细胞因子促进Tfr分泌TGF-β和IL-10。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
一、材料
MRL/lpr狼疮鼠：购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。
anti-CD3/CD28活化磁珠：购自Peprotech公司。
TGF-β：购自Peprotech公司，货号AF-100-21C。
IL-2：购自Peprotech公司，货号AF-212-12。
黄芩苷：购自同田生物，使用DMSO溶解后配制成10μM、20μM和40μM不同浓度的溶液。
二、方法和结果
1、黄芩苷联合细胞因子促进Tfr细胞数量的增殖：
从MRL/lpr狼疮鼠脾脏中分选单个核细胞，通过免疫磁珠分选幼稚性T细胞进行体外培养。第0天，将分选到的2×106幼稚性CD4+T细胞重悬于24孔板中，培养液为含10％胎牛血清的RPMI1640培养基，加入anti-CD3/CD28活化磁珠(25μl，抗CD3抗体和抗CD28抗体终浓度均为50ng/ml)、TGF-β(终浓度5ng/ml)、IL-2(终浓度30U/ml)进行诱导分化5天。黄芩苷干预组在培养的第0天除了加入上述细胞因子和抗体外，再加入10μM、20μM和40μM不同剂量的黄芩苷。检测CD4+CXCR5+Foxp3+Tfr的数量。结果如图1所示。该图说明了黄芩苷可联合细胞因子有效诱导CD4+CXCR5+Foxp3+Tfr细胞数量的增殖。
2、黄芩苷联合细胞因子促进幼稚性T细胞向Tfr分化：
第0天，将分选到的幼稚性CD4+T细胞重悬于含10％胎牛血清的RPMI1640培养基，加入anti-CD3/CD28活化磁珠(25μl，抗CD3抗体和抗CD28抗体终浓度均为50ng/ml)、TGF-β(终浓度5ng/ml)、IL-2(终浓度30U/ml)进行诱导分化5天。黄芩苷干预组在培养的第0天除了加入上述细胞因子和抗体外，再加入40μM的黄芩苷。通过流式细胞技术检测CD4+CXCR5+Foxp3+Tfr的比例。结果如图2所示。该图说明了黄芩苷可联合细胞因子有效诱导CD4+CXCR5+Foxp3+Tfr的分化。
3、黄芩苷联合细胞因子促进Tfr中Foxp3的表达：
第0天，将分选到的2×106幼稚性CD4+T细胞重悬于24孔板中，培养液为含10％胎牛血清的RPMI1640培养基，加入anti-CD3/CD28活化磁珠(25μl，抗CD3抗体和抗CD28抗体终浓度均为50ng/ml)、TGF-β(终浓度5ng/ml)、IL-2(终浓度30U/ml)进行诱导分化5天。黄芩苷干预组在培养的第0天除了加入上述细胞因子和抗体外，再加入10μM、20μM和40μM不同剂量的黄芩苷。通过流式细胞技术检测检测Foxp3的表达，通过实时荧光定量PCR检测Foxp3基因的表达。结果如图3所示。该图说明了黄芩苷可联合细胞因子有效诱导Foxp3基因和蛋白的表达。
4、黄芩苷联合细胞因子促进Tfr中TGF-β和IL-10的分泌：
第0天，将分选到的2×106幼稚性CD4+T细胞重悬于24孔板中，培养液为含10％胎牛血清的RPMI1640培养基，加入anti-CD3/CD28活化磁珠(25μl，抗CD3抗体和抗CD28抗体终浓度均为50ng/ml)、TGF-β(终浓度5ng/ml)、IL-2(终浓度30U/ml)进行诱导分化5天。黄芩苷干预组在培养的第0天除了加入上述细胞因子和抗体外，再加入10μM、20μM和40μM不同剂量的黄芩苷。通过酶联免疫吸附试验检测培养上清中TGF-β和IL-10的分泌。结果如图4所示。该图说明了黄芩苷可联合细胞因子有效诱导Tfr分泌具有免疫抑制作用的细胞因子TGF-β和IL-10。
实施例2
考察不同的诱导条件对于Tfr细胞数量的增殖和幼稚性T细胞向Tfr分化的影响。
一、材料
MRL/lpr狼疮鼠：购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。
anti-CD3/CD28活化磁珠：购自Peprotech公司。
TGF-β：购自Peprotech公司，货号AF-100-21C。
IL-2：购自Peprotech公司，货号AF-212-12。
黄芩苷：购自同田生物，使用DMSO溶解后配制成相应浓度的溶液。
二、方法
1、组别设置
分组如表1所示。
表1实验分组
组别 抗CD3抗体、抗CD28抗体、TGF-β、IL-2和黄芩苷的终浓度
实验组1 50ng/ml，50ng/ml，5ng/ml，30U/ml，40μM
实验组2 60ng/ml，30ng/ml，6ng/ml，15U/ml，60μM
实验组3 40ng/ml，60ng/ml，4ng/ml，40U/ml，5μM
实验组4 40ng/ml，30ng/ml，6ng/ml，40U/ml，40μM
实验组5 45ng/ml，55ng/ml，4.5ng/ml，35U/ml，30μM
实验组6 55ng/ml，45ng/ml，5.5ng/ml，25U/ml，50μM
实验组7 60ng/ml，30ng/ml，6ng/ml，15U/ml，65μM
实验组8 40ng/ml，60ng/ml，4ng/ml，45U/ml，5μM
实验组9 70ng/ml，70ng/ml，7ng/ml，42U/ml，56μM
2、不同组别Tfr细胞数量增殖的情况
从MRL/lpr狼疮鼠脾脏中分选单个核细胞，通过免疫磁珠分选幼稚性T细胞进行体外培养。第0天，将分选到的2×106幼稚性CD4+T细胞重悬于24孔板中，培养液为含10％胎牛血清的RPMI1640培养基，加入anti-CD3/CD28活化磁珠、TGF-β、IL-2、黄芩苷进行诱导分化5天。检测CD4+CXCR5+Foxp3+Tfr的数量。
3、不同组别幼稚性T细胞向Tfr的分化情况
第0天，将分选到的幼稚性CD4+T细胞重悬于含10％胎牛血清的RPMI1640培养基，加入anti-CD3/CD28活化磁珠、TGF-β、IL-2、黄芩苷进行诱导分化5天。通过流式细胞技术检测CD4+CXCR5+Foxp3+Tfr的比例。
三、结果
1、不同组别Tfr细胞数量的增殖
结果见表2。在促进Tfr细胞数量的增殖方面，实验组1效果最为突出。组间比较，实验组1-6之间差异无统计学意义(P>0.05)，而实验组7-9的Tfr细胞数相比于其他各组差异均具有统计学意义(P＜0.05)。
表2不同组别Tfr细胞数量的增殖比较
组别 Tfr细胞数(×10<sup>5</sup>)
实验组1 32.8
实验组2 30.9
实验组3 28.7
实验组4 31.2
实验组5 31.5
实验组6 31.2
实验组7 21.1
实验组8 23.4
实验组9 20.9
2、不同组别幼稚性T细胞向Tfr的分化
结果见表2。在促进幼稚性T细胞向Tfr的分化方面，实验组1效果最为突出。组间比较，实验组1-6之间差异无统计学意义(P>0.05)，而实验组7-9的Tfr细胞数相比于其他各组差异均具有统计学意义(P＜0.05)。
表3不同组别Tfr细胞的比例
组别 Tfr细胞比例(％)
实验组1 16.10
实验组2 15.49
实验组3 14.95
实验组4 15.73
实验组5 15.88
实验组6 15.93
实验组7 7.45
实验组8 8.07
实验组9 7.22
结合经验，并经实验验证，得到合理的抗CD3抗体、抗CD28抗体、TGF-β、IL-2和黄芩苷的终浓度为：抗CD3抗体(40-60)ng/ml、抗CD28抗体(40-60)ng/ml、TGF-β(4-6)ng/ml、IL-2(15-40)U/ml、黄芩苷(5-60)μM。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种有助于体外获得滤泡调节性T细胞的组合物，其特征在于，所述组合物含有抗CD3抗体、抗CD28抗体、TGF-β、IL-2和黄芩苷；所述抗CD3抗体、抗CD28抗体、TGF-β、IL-2和黄芩苷的终浓度为：抗CD3抗体40-60ng/ml，抗CD28抗体30-60ng/ml，TGF-β 4-6ng/ml，IL-215-40U/ml，黄芩苷5-60 μM。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述抗CD3抗体、抗CD28抗体、TGF-β、IL-2和黄芩苷的终浓度为：抗CD3抗体45-55ng/ml，抗CD28抗体45-55ng/ml，TGF-β 4.5-5.5ng/ml，IL-2 25-35U/ml，黄芩苷30-50 μM。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述的抗CD3抗体、抗CD28抗体、TGF-β、IL-2和黄芩苷的终浓度为：抗CD3抗体50ng/ml，抗CD28抗体50ng/ml，TGF-β 5ng/ml，IL-230U/ml，黄芩苷40μM。
4.权利要求1-3任一所述的组合物在用于制备体外获得滤泡调节性T细胞的试剂中的用途。
5.一种体外获得的滤泡调节性T细胞，其特征在于，所述滤泡调节性T细胞的制备方法包括以下步骤：向幼稚性T细胞的培养液中加入权利要求1-3任一所述的组合物进行诱导分化。
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CN101126076A (zh) * 2007-07-12 2008-02-20 郑颂国 TGF-β诱导的调节T细胞及其形成方法和应用
CN101491533A (zh) * 2008-12-18 2009-07-29 复旦大学附属中山医院 黄芩苷在制药中的应用

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