JP2003102471A - 調節性ｔ細胞の分化誘導・増殖促進方法 - Google Patents

調節性ｔ細胞の分化誘導・増殖促進方法

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 調節性T細胞の分化誘導・増殖促進方法の提
供。 【解決手段】 CD3及び4C8抗原を発現する免疫細胞に、
CD3アゴニスト及び4C8抗原アゴニストを作用させること
を特徴とする、調節性T細胞の分化誘導及び／又は増殖
を促進する方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、調節性T細胞の分
化誘導・増殖促進方法、及び該方法に使用するための医
薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】１．調節性T細胞 種々の病原体に対する生体防御のシステムとしての免疫
系の中心的役割を担う細胞群の一つにT 細胞がある。T
細胞は大別してCD4陽性のヘルパー T 細胞とCD8陽性の
細胞傷害性 T 細胞に分けられるが、前者は特に抗原刺
激後の特定の分化成熟段階でのサイトカイン産生パター
ンによって、主にIFN-γを産生するTh1 細胞、IL-4を産
生するTh2 細胞などに分類可能である。一般的に前者は
細胞性免疫、後者は液性免疫として生体防御に深く関与
している。免疫応答はこのような性質の異なるT 細胞の
働きによって巧妙なバランスのもとに病原体の排除や感
染抵抗性の獲得に深く関与している。通常健全な免疫応
答においては外来の非自己抗原に対してはそれらを排除
する機構が働き、生体を形成する自己抗原に対しては免
疫学的寛容が成立しており排除機構が働かないことが知
られている。しかしながら自己抗原に対する過剰な免疫
応答が働く事によって所謂自己免疫疾患が生ずる。この
ように自己抗原に対する免疫学的寛容は絶対的なもので
はないが、T 細胞レベルにおいても種々の免疫学的寛容
が誘導される仕組みが分かっている。一つは、中枢寛容
（central tolerance）と呼ばれる胸腺における自己反
応性T 細胞クローンの排除の機構（Kisielow, P.et a
l., 1988. Nature. 333:742-746.）、他方は末梢寛容
（peripheral tolerance）と呼ばれる機構による自己反
応性T細胞の胸腺外での制御である。後者には、細胞死
の誘導あるいは自己抗原に対する不応答性（anergy）の
誘導（Rocha, B., and H. von Boehmer. 1991. Scienc
e. 251:1225-1228.; Jenkins, M.K., and R. H. Schwar
tz. 1987. J. Exp. Med.165:302-319.）と共に、調節性
T細胞（regulatory T cell） による能動的な抑制（She
vach, E.M. 2000. Annu. Rev. Immunol. 18:423-449.）
の機構が知られている。調節性T細胞とは、近年提唱さ
れたT細胞の新たな概念であり、他のT細胞に対して抑制
的な作用を有するということによって定義付けられる。
免疫応答は巧妙なバランスのもとに成り立っており、例
えば上述のTh1 細胞及びTh2 細胞はお互いに夫々の免疫
応答に拮抗的に働き、一方が他方に対する調節性T細胞
として作用することが知られるようになって来た。反
面、調節性T細胞としての細胞集団の存在の検証とその
性状解析については免疫学の近年の歴史においても多く
の議論があるところである。このような調節性T細胞はi
n vitro又はin vivoにおいて特定の免疫応答を抑制又は
調節する機能を有する細胞として研究され、細胞表面マ
ーカー、産生するサイトカインの種類や抑制・調節の機
構などによって種々の細胞集団として報告されてきてい
る（Roncarolo, M.G., and M.K. Levings. 2000. Curr.
Opinion. Immunol. 12:676-683.）。
【０００３】これらの調節性T細胞の中でも最もよく研
究されている細胞集団は、以下に述べるCD4陽性CD25陽
性であることをマーカーとするT 細胞集団であり、おも
にマウス・ラットなどのヒト以外の生物種で研究されて
きた。これらのT 細胞集団は、特定の細胞表面分子の発
現を指標にそれらを除いたT 細胞を例えばT 細胞及びB
細胞不全のSCIDマウス又はラットに移入することで臓器
特異的自己免疫疾患（甲状腺炎、インシュリン依存性自
己免疫糖尿病、大腸炎など）が誘導されることを指標に
性状解析が進んできた（Sakaguchi, S., et al., 1985.
J. Exp. Med.161:72; Itoh, M.,et al., 1999. J. Imm
unol. 162:5317-5326.）。即ち、正常マウス又はラッ
トのCD4陽性脾臓細胞からCD25陽性、RT6.1陽性（ラット
の成熟T細胞の大部分に発現）、CD5強陽性、又はCD45RB
弱陽性（マウス）若しくはCD45RC弱陽性（ラット）の細
胞を除去して、残りのT 細胞をT 細胞及びB 細胞不全の
SCIDマウス又はラットに移入する事で臓器特異的自己免
疫疾患が誘導された。これまでこのような調節性T細胞
特異的なマーカーは見出されておらず、上記のマーカー
は調節性T細胞の機能とは直接関連付けられない、細胞
が活性化されている状態、抗原刺激を受けた状態、免疫
学的記憶状態にあることを表すマーカーにしか過ぎな
い。しかしながら、免疫不全動物に臓器特異的自己免疫
疾患を誘導する機能のみならず、逆に特定の細胞集団を
移入することで自己免疫疾患及び自己免疫性炎症を抑制
する機能を有する事を指標として調節性T細胞集団の解
析が進み（Itoh, M., et al., 1999. J. Immunol. 162:
5317-5326; Sakaguchi. S.et al., 1995. J. Immunol.
155:1151-1164; Asano, M. et al., 1996. J. Exp. Me
d. 184:387-396; Read, S.et al., 2000. J. Exp. Med.
192:295-302; Salomon,B. et al., 2000. Immunity. 1
2:431-440; Stephens, L. A., and D. Mason. 2000.
J. Immunol. 165:3105-3110.）、CD4, CD25共に陽性で
あるT 細胞集団が慣習的に調節性T細胞のマーカーとな
り得ることが知られるに至った。
【０００４】上記のようにマウス及びラットにおいて、
CD4陽性CD25陽性の調節性T細胞が同定された一方で、ヒ
トにおける同様の細胞の存在はようやく2001年になって
複数のグループから報告されたに過ぎない（Jonuleit,
H.et al., 2001. J. Exp. Med. 193:1285-1294; Leving
s, M. K. et al., 2001. J. Exp. Med. 193:1295-1301;
Dieckmann, D. et al., 2001. J. Exp. Med. 193:130
3-1310; Taama, L. S.et al., 2001. Eur. J. Immunol.
31:1122-1131; Stephens, L. A. et al., 2001. Eur.
J. Immunol. 31:1247-1245; Baecher-Allan, C. et a
l., 2001. J. Immunol. 167:1245-1253.）。これらの報
告はマウスで知られているCD4及びCD25の発現を指標に
ヒト末梢血から分離された細胞集団を用いて種々の細胞
表面マーカー、細胞の活性化刺激に対する不応答性（an
ergy）、産生されるサイトカインの種類、in vitroにお
ける通常T 細胞の増殖抑制機能及びその機構などの点に
おいてマウスでの報告と同等であることを根拠としてい
る。即ち、ヒト末梢血から分離されたCD4陽性CD25陽性T
細胞は、CD45RO陽性のメモリーT 細胞マーカーを発現
しており、CD4陽性CD25陰性T 細胞と比較してHLA-DRな
どの活性化マーカーの発現が高い。また細胞内には定常
的にCTLA-4を発現しており、刺激によりその発現が上昇
する。更に抗CD3抗体刺激、抗CD3抗体と抗CD28抗体によ
る刺激、同種異系の成熟樹状細胞（allogeneic mature
DC）による刺激などでは、CD4陽性CD25陽性 調節性T細
胞のDNA合成及びサイトカインの産生は見られず、抗原
刺激に対する不応答状態（anergy）となっている。抗CD
3抗体と抗CD28抗体による刺激にIL-2, IL-4, IL-15など
のサイトカインを加えることで、CD4陽性CD25陽性 調節
性T細胞のDNA合成能は高まるが、CD4陽性CD25陰性T 細
胞のそれには及ばない。CD4陽性CD25陽性 調節性T細胞
存在下にCD4陽性CD25陰性T 細胞を抗CD3抗体又は同種異
系の成熟樹状細胞（allogeneic mature DC）によって刺
激した場合、CD4陽性CD25陽性 調節性T細胞非存在下と
比較してCD4陽性CD25陽性 調節性T細胞細胞数依存的な
増殖抑制作用が見られる。マウスに比較して低いもの
の、CD4陽性CD25陽性 調節性T細胞はIL-10, TGFβ1のよ
うな抑制性のサイトカインを産生する能力があるが、CD
4陽性CD25陰性T 細胞に対する増殖抑制作用は、これら
サイトカインに対する中和抗体では解除されないこと、
抑制作用にはCD4陽性CD25陰性T 細胞とCD4陽性CD25陽性
調節性T細胞の直接的細胞間接触が必要であることが報
告されている。マウス、ラット、ヒトにおいてCD4陽性C
D25陽性 調節性T細胞の存在が報告され性状解析が進ん
ではいるものの、これら細胞の詳細な分化機構、抑制作
用機構の解明は途上にあり、特異的なマーカーも見出さ
れていないのが現状である。
【０００５】またマウス及びヒトにおいて、IL-10存在
下での同種異系の（allogeneic）抗原刺激や同種異系の
未成熟樹状細胞（allogeneic immature DC）による繰り
返し刺激によって誘導される調節性T細胞についても報
告されている（Groux, H. etal., 1997. Nature. 389:
737-742; Jonuliet, H. et al., 2000. J. Exp. Med.19
2:1213-1222.）。これらの細胞は、Th1, Th2 細胞とは
異なり大量のIL-10を産生するものの、TGF-β1, IFN-
γ, IL-5の産生は高くなく、低レベルのIL-2を産生し、
IL-4を産生しないことを特徴としており、Tr1 細胞と呼
ばれている。Tr1 細胞もCD4陽性CD25陽性 調節性T細胞
と同様にanergicであるが、T 細胞抑制機構は産生され
るIL-10やTGF-β1によって一部説明可能である。しかし
ながら、Tr1 細胞とCD4陽性CD25陽性 調節性T細胞が全
く異なるT 細胞 サブセットであるのか、或いは分化活
性化段階の異なる同一の細胞であるかについては不明な
点が多い。
【０００６】マウスやラットで知られている調節性T細
胞マーカーであるCD4, CD25の発現を指標として、ヒト
においても末梢血などからCD4陽性、CD25陽性のT細胞を
分離して見たところ、マウスやラットで知られているそ
の他の細胞表面マーカーや機能と照らし合わせて同様で
あることが確認された。このことから、ヒトにおけるCD
4陽性、CD25陽性の調節性T細胞の存在が示唆された。
【０００７】これら細胞は、末梢血CD4陽性T 細胞の5〜
10 %を占めるに過ぎない希少細胞集団である上に、活性
化・増殖刺激に対して不応答状態である。この場合、抗
CD3抗体と抗CD28抗体による刺激にIL-2, IL-4, IL-15な
どのサイトカインを加えることで細胞増殖を促す事は可
能である。しかしながら、細胞数を増幅させヒトに移入
するなどの臨床応用には十分なレベルではない。
【０００８】調節性T細胞は、動物実験ではそれら細胞
を移入することによって自己免疫疾患に抑制的に働くこ
と、移植拒絶反応や移植片対宿主病（GvHD）に抑制的に
働くこと（Hara, M. et al., 2001. J. Immunol. 166:3
789-3796; Taylor, P. A. etal., 2001. J. Exp. Med.
193:1311-1317.）から、調節性T細胞の免疫抑制作用を
利用した細胞医療による自己免疫疾患、移植などにおけ
る治療への応用が考えられる。調節性T細胞の増殖を促
進する医薬組成物、あるいは患者又はボランティアから
採取した末梢血、骨髄細胞を生体外で処理することによ
り、調節性T細胞を増殖させ、患者の体内に戻す療法の
開発が期待されている。
【０００９】２．4C8抗原 4C8抗原は元々ヒトT 細胞が血管内皮細胞に接着した後
の内皮下への遊走に関与する分子を同定する目的で発見
された、免疫系細胞の一部に発現する膜蛋白質である。
ヒトT 細胞をマウスに免疫することによって得られたモ
ノクローナル抗体を、T 細胞のインビトロ血管外遊走を
抑制することを指標にスクリーニングすることにより、
4C8抗原を認識するモノクローナル抗体が取得された（M
asuyama,J. et al., 1999. J. Exp. Med. 189:979-989;
WO99/12972号公報）。T 細胞が炎症局所などの末梢組
織に移行するためには、血管内皮細胞にインテグリン分
子を介して強固に接着した後に細胞運動に適した形態に
変化し、血管内皮細胞間間隙をすり抜けて遊走する過程
が必要である。血管内皮細胞に接着したT 細胞全てが内
皮下へ遊走するのではなく、CD4陽性CD45RO陽性CD26強
陽性の活性化メモリーT 細胞が選択的に遊走することが
知られている。即ち抗4C8 モノクローナル抗体（mAb）
はT 細胞の血管内皮細胞への接着は抑制せずに、T 細胞
サブセット選択的な内皮下への遊走を特異的に抑制す
るmAbであり、4C8抗原はこのような遊走に必須の機能分
子であると考えられる。抗4C8 mAbにより4C8抗原の発現
を検証したところ、4C8抗原はCD3陽性T 細胞に強く発現
する他、B 細胞, NK 細胞, 単球、好酸球にも発現する
が、好中球や内皮細胞には発現しない。抗4C8 mAbによ
る架橋はT 細胞のアクチン重合を促進し細胞形態に極性
をもたせるのみならず、細胞運動を刺激する。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、調節性T細
胞の分化誘導・増殖促進方法を提供することを目的とす
る。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するため鋭意研究を行った結果、4C8抗原と抗4C8mA
bの相互作用の解明を進める過程において、上述したT
細胞の遊走阻害という既存の知見からは予想できない新
規な機能、すなわちCD3アゴニストによる刺激下におい
て、抗4C8 mAbが4C8抗原を発現する免疫細胞に作用する
ことにより副刺激(costimulation)をもたらし、調節性T
細胞の分化誘導と増殖が促進されることを発見し、本発
明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下の通
りである。
【００１２】１.CD3及び4C8抗原を発現する免疫細胞
に、CD3アゴニスト及び4C8抗原アゴニストを作用させる
ことを特徴とする、調節性T細胞の分化誘導及び／又は
増殖を促進する方法。 ２. CD3及び4C8抗原を発現する免疫細胞が、末梢血、
リンパ節又は胸腺に含まれるものである１の方法。 ３. CD3及び4C8抗原を発現する免疫細胞が、T細胞であ
る１の方法。
【００１３】４．CD3及び4C8抗原を発現する免疫細胞
が、末梢血単核球である１の方法。 ５．CD3アゴニストが、抗CD3抗体である１の方法。 ６. 4C8抗原アゴニストが、抗4C8 抗体である１の方
法。 ７. 抗4C8 抗体が、ヒト化抗体又はヒト抗体である６の
方法。
【００１４】８. CD3及び4C8抗原を発現する免疫細胞
へのCD3アゴニスト及び4C8抗原アゴニストの作用が、生
体内で行われるものである１の方法。 ９. CD3及び4C8抗原を発現する免疫細胞へのCD3アゴニ
スト及び4C8抗原アゴニストの作用が、生体外で行われ
るものである１の方法。 １０.分化誘導された調節性T細胞が、CD25及びCD152を
発現し、かつ、IL-10を産生するものである１の方法。
【００１５】１１．分化誘導された調節性T細胞が他のT
細胞のサイトカイン産生、増殖及び／又は活性化を抑制
するものである１の方法。 １２. 4C8抗原アゴニストを有効成分として含有する、
調節性T細胞の分化誘導及び／又は増殖を促進するため
の医薬組成物。 １３．4C8抗原アゴニストが、抗4C8 抗体である12の医
薬組成物。 １４．抗4C8 抗体が、ヒト化抗体又はヒト抗体である13
の医薬組成物。
【００１６】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書において、4C8抗原アゴニストとは、免疫細胞
表面に発現した4C8抗原に作用することにより、4C8抗原
を介した細胞内への副刺激信号伝達により、当該細胞
が調節性T細胞へ分化し、当該細胞が調節性T細胞とし
ての特性を保持した状態で増殖するという2つの反応の
いずれか一方又は双方を惹起しうる物質を意味する。4C
8抗原アゴニストは4C8抗原に対する天然のリガンド、お
よび4C8抗原に対する抗体を包含する。抗体の具体的例
は独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託セン
ター（茨城県つくば市１丁目１番地１）に平成１３年
（2001年）9月26日付けにて寄託されたハイブリドーマJ
M-1（寄託番号FERM BP‐7757）の産生する抗4C8 抗体
である。本発明において使用される抗体は、上述の抗4C
8抗体に限定されるものではない。益山らの報告（Masuy
ama, J. et al., 1999.J. Exp. Med. 189:979-989; WO
99/12972号公報）に従い、ヒトT 細胞を免疫した動物よ
り得られたモノクローナル抗体から、T 細胞のインビト
ロ血管外遊走を抑制することを指標に選抜することによ
り、4C8抗原アゴニスト機能を有する抗体を取得するこ
とができる。
【００１７】抗原として使用されるT細胞は、ヒトから
採取された末梢血単核球画分を、コラーゲンゲル上で単
層に培養されたヒト臍帯静脈血管内皮細胞（HUVEC）と
共培養した後、該単層を通過して遊走した単核球を用い
ることにより、効率的に所望の抗体を取得しうる。ハイ
ブリドーマの選抜にあたっては、ハイブリドーマJM-1に
より産生される抗4C8抗体を競合試薬として用いること
により、被検抗体によるT 細胞染色が抑制されること
（すなわちハイブリドーマJM-1により産生される抗4C8
抗体と同一エピトープを認識すること）を指標にした選
抜を組み合わせることにより、取得はさらに容易とな
る。また、抗4C8 抗体と同一エピトープを認識する抗体
の選抜工程と、本発明の実施例に記載した調節性T細胞
の分化・増殖誘導能を評価する工程を組み合わせること
によっても、本発明に使用する抗体を容易に取得するこ
とができる。また、例えばハイブリドーマJM-1により産
生される抗4C抗体の可変領域をヒト抗体のフレームワー
クに移植することにより、本発明に使用する抗体として
いわゆるヒト化抗体を取得することも可能である。ま
た、再配列されていないヒト抗体遺伝子を保持し、抗原
の感作により当該抗原に特異的なヒト抗体を産生するマ
ウス（例えばTomizuka et al., 2000. Proc,Natl.Acad.
Sci. USA,97:722）を使用することにより、本発明に使
用する抗体としてヒト抗体を取得することも可能であ
る。
【００１８】本発明の方法において、4C8抗原を発現す
る免疫細胞に対して、4C8抗原アゴニストを作用させる
ことに加えて、CD3アゴニストを作用させることが必要
である。T細胞の分化に関わる主たる刺激伝達経路であ
るCD3分子を介した信号伝達系を主刺激経路とすれば、4
C8抗原を介した経路がいわゆる副刺激経路となる。本明
細書において、CD3分子を介した刺激に加えて4C8抗原を
介した刺激をもたらすことを、4C8副刺激と称すること
がある。本明細書においてCD3アゴニストとは、免疫細
胞の表面に発現したCD3分子に作用し、CD3を介した細胞
内への信号伝達により、当該細胞の分化が促進されると
いう反応を惹起しうる物質を意味する。CD3アゴニスト
の例としてアゴニスティックな抗CD3抗体、例えばOKT3
（ATCC CRL-8001）、UCHT1（B.D.PharMingen）、HIT3a
（B.D.PharMingen）が挙げられる。また、種々のT細胞
抗原受容体に対するアゴニスト、特にアゴニスト作用を
有する抗体も、T細胞抗原受容体とCD3の複合体形成をも
たらし、CD3を介した細胞内への信号伝達をもたらすの
で、本発明におけるCD3アゴニストとして使用すること
ができる。具体的には、ヒトT細胞抗原受容体Ｖbeta6.7
に対する抗体であるOT145（Posnett et al., 1986, Pro
c Natl Acad Sci U S A.,83(20):7888-92）などが挙げ
られる。
【００１９】本発明によって、4C8抗原アゴニストを有
効成分とする、調節性T細胞の分化誘導及び／又は増殖
を促進するための医薬組成物が提供される。本発明の医
薬組成物は、生体内に投与されるものであってもよい
し、患者又はボランティアから採取した免疫細胞、ある
いは免疫細胞を含む末梢血、リンパ液、リンパ節細胞、
胸腺細胞を生体外で処理するためのものであっても良
い。本発明の医薬組成物は、周知慣用の方法で製剤化さ
れうる。すなわち治療効果上許容される種々の添加物、
例えば担体、pH緩衝剤、安定化剤、附形剤等を添加した
医薬製剤が製造される。このような製剤は、好ましく
は、生理学的に許容され得る希釈剤又はキャリアを含ん
でおり、適切なキャリアには、生理的食塩水、リン酸緩
衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、及
び緩衝生理食塩水が含まれるが、これらに限定されるも
のではない。或いは、4C8抗原アゴニストは凍結乾燥
（フリーズドライ）し、必要とされるときに上記の緩衝
水溶液を添加することにより再構成して使用してもよ
い。上記製剤の投与形態としては、錠剤、カプセル剤、
顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、又は、注
射剤、点滴剤、坐薬等による非経口投与を挙げることが
できる。
【００２０】 投与方法、投与量は前臨床試験、臨床試験
の過程において適宜決定されうる。例えば、症状、年
齢、体重などによって異なるが、通常、経口投与では、
成人に対して、1日約0.01 mg〜1000 mgであり、これら
を1回、又は数回に分けて投与することができる。ま
た、非経口投与では、1回約0.01 mg〜1000 mgを皮下注
射、筋肉注射又は静脈注射によって投与することができ
る。
【００２１】治療の対象となる疾患は、免疫抑制効果を
もたらす処置が必要とされる疾患であり、具体的には移
植片対宿主病（GvHD）の治療又は予防を目的とした臓器
移植前後における処置、リウマチなどの自己免疫疾患の
治療又は予防が挙げられる。
【００２２】本発明において、患者又はボランティアか
ら採取した免疫細胞、あるいは免疫細胞を含む末梢血、
リンパ液、リンパ節細胞、胸腺細胞を生体外で処理する
ことにより、調節性T細胞を増殖させ、患者の体内に戻
す療法を採用することができる。末梢血又は骨髄細胞を
生体より採取し、患者の体内に戻す幹細胞移植療法はす
でに実施されている。また、免疫細胞の一種である樹状
細胞（dendritic cell）に人為的処理を施し、患者の体
内に戻す癌治療も行われている（M. Jefford,et al., T
he Lancet Oncology, 2: 343-353, June, 2001)。採取
された免疫細胞に、4C8抗原アゴニスト及びCD3アゴニス
トを添加し、調節性T細胞を増殖させた後に患者の体内
に戻すことにより治療又は予防効果を奏することができ
る。このようないわゆるエクスビボ（ex vivo）の方法
は、基礎研究の場において開発された実験系をほぼその
まま治療の場において再現するものであるとも言える。
薬剤の生体内への投与が、体内吸収、代謝、又は未知の
因子による干渉作用などの影響により、期待した治療効
果を奏しえない場合がありうることと比較すると、より
実用化へのリスクの低い方法であるといえる。
【００２３】
【実施例】以下に本発明の具体的態様と効果を例示した
実施例を記載する。但し、本発明はこれら実施例にその
技術的範囲が限定されるものではない。
【００２４】（実施例１：抗4C8 mAbのT 細胞活性化に
対する副刺激能）抗4C8 mAbのT 細胞活性化における副
刺激能を見るために、至適濃度以下の抗CD3抗体存在下
で固相化抗4C8 mAbで刺激した場合のヒト末梢血由来ナ
イーブ（naive） T 細胞（CD3陽性CD45RA陽性細胞）と
メモリー（memory） T 細胞（CD3陽性、CD45RO陽性細
胞）の増殖能（DNA合成能）、IL-2産生能、T 細胞活性
化マーカー（CD25）の発現、生細胞数増加を指標に抗4C
8 mAbの影響を調べた。比較対照としてはT 細胞活性化
における副刺激受容体として広く認知されているCD28か
らの刺激（抗CD28抗体）を加えた群と比較した。
【００２５】ヘパリン加ヒト末梢血からFicoll-Hypaque
による密度勾配遠心法により末梢血単核球を分離した。
CD4陽性T 細胞を用いる場合は以下のように調製した。
ナイロンウールカラム非吸着画分としてT 細胞濃縮画分
を調製した。本画分はフローサイトメーター（FACScan,
Becton-Dickinson, Mountain View, CA）解析により90
%以上のCD3陽性細胞を含んでいた。フローサイトメー
ター解析では5 x 103イベントを集め、細胞クエストソ
フトウエアー（Becton-Dickinson）を用いて実施した。
本画分より、試薬製造者の操作手順書（Stem Cell Tech
nologies Inc., Vancouver, Canada）に従いCD4陽性T細
胞をネガティブセレクション（negative selection）に
よって調製した。ヒト末梢血由来T 細胞 サブセットを
用いる場合は以下の方法により調製した。CD3陽性CD45R
A陽性細胞とCD3陽性、CD45RO陽性細胞は、それぞれ末梢
血単核球から細胞ectTM plus Human CD3+CD45RO- / CD3
+CD45RA- kit (Cytovax Biotechnologies Inc., Edmont
on, Canada)によって調製した。各細胞画分の純度はフ
ローサイトメーター（FACScan, Becton-Dickinson, Mou
ntain View, CA）解析により91 %〜96 %であった。
【００２６】各T 細胞 サブセットに対する抗4C8 mAbの
副刺激能は以下の方法により測定した。96-well平底マ
イクロタイタープレート (Falcon, Becton-Dickinson)
に抗CD3mAb (OKT3, Dr. S. Kashiwagi, Japan Immunore
search Laboratories Co., Ltd, Gunma, Japanより供
与) 0.1μg/ml濃度含有PBS（100μl）を添加して4℃で2
4時間インキュベーションし固相化後、精製抗4C8 mAb
（10μg/ml：100μl）を同様に固相化した。PBSて2回洗
浄後、1 % BSA/PBS (100 μl)を添加して37℃１時間イ
ンキュベーションして、アッセイに供した。抗CD28 mAb
（clone CD28.2, PharMingen, San Diego, CA）は最終
濃度5μg/mlでアッセイ培養開始時に添加した。細胞
は、RPMI 1640（Sigma）/ 10 % FCS / ペニシリン (100
U/ml) / ストレプトマイシン(100μg/ml) / 2 mM グル
タミン培地に懸濁して、2 x 105 細胞/well/200μlとな
るよう添加してアッセイした。37℃、5 % CO2存在下で
３日間培養し、細胞回収前８〜16時間に0.2μCiの3H-th
ymidine (New England Nuclear, Boston, MA)を添加し
て培養を継続した。細胞をガラスフィルター上に回収
し、液体シンチレーションカウンターにて細胞に取り込
まれた3H-thymidineを測定した。一群３wellでアッセイ
し平均値とSD値を算出した。
【００２７】その結果を図１Ａに示す。抗CD3 mAb単独
と比較して、抗4C8 mAb共存下ではT細胞への3H-thymidi
ne取込み能は強力に増強された。抗4C8 mAb単独では全
く影響を与えないことから、抗4C8 mAbはT 細胞増殖に
おいて副刺激として作用することが示された。対照群で
ある抗CD3 mAbと抗CD28 mAb添加群でも強い3H-thymidin
e取込みが見られたが、本実験条件下では抗4C8 mAbの方
が抗CD28 mAbと比較してより強い副刺激能を有してい
た。またナイーブ T 細胞（CD3陽性CD45RA陽性細胞）と
メモリー T 細胞（CD3陽性、CD45RO陽性細胞）両方に対
して抗4C8 mAbが作用すること、メモリー T 細胞の方が
ナイーブT 細胞に比較して抗4C8 mAb及び抗CD28 mAb何
れに対しても増殖能が高いことが示された。
【００２８】CD28以外のT 細胞に定常的に発現している
分子、例えばCD2, CD9, CD11aなどを介した副刺激で
も、CD28からの刺激と同等にT 細胞の3H-thymidine取込
みが増強されるが、CD28からの刺激とは異なりIL-2産生
誘導能が低いためにT 細胞増殖を維持することが出来
ず、活性化されたT 細胞はアポトーシスをおこすことが
知られている。そこでCD3+ T 細胞を用いて3H-thymidin
e取込み実験と同様の条件下で刺激24時間後の培養上清
中のIL-2濃度をELISA kit (Biosource)により測定した
（図１Ｂ）。大量のIL-2産生が4C8副刺激、CD28副刺激
の両方において誘導されたが、前者は後者と比較して約
50 %以上高いIL-2産生を誘導した。但し、両者において
培養上清中のIL-2は培養時間と共に急速に減少し、培養
3日目では検出限界以下までに減少した。IL-2受容体で
あるCD25が高発現していることが、副刺激を受けたT 細
胞が継続的な増殖を続けるために必要であることから、
4C8副刺激、CD28副刺激を受けた培養24時間後のT 細胞
でのCD25の発現を比較した。CD25の発現は、2-3 x 105
細胞をFITC標識抗CD25 mAb (クローンM-A261, PharMing
en, San Diego, CA)と共に20分間0.05 % アジ化ナトリ
ウム存在下氷中でインキュベートして1 mlのPBS / 0.1
% BSA / 0.05 % アジ化ナトリウムにて2回洗浄後、0.5
ml PBS/ 1 % パラホルムアルデヒドで固定した後FACSca
n（Becton-Dickinson, Mountain View, CA）にて解析し
た。図１Ｃに示すように、4C8副刺激はCD28副刺激と比
較して、CD25発現T 細胞の割合が顕著に高い（4C8: 98
%, CD28: 25%）。
【００２９】4C8副刺激では、培養後24時間で75 %の細
胞がCD25を発現するという急速な発現細胞増加誘導であ
るのに対して、CD28副刺激では培養時間に伴い徐々にCD
25陽性細胞が出現するに過ぎない。
【００３０】更に培養後2〜5日後の生細胞数を、培養前
の細胞数を100 %として、4C8副刺激とCD28副刺激で比較
した（図１Ｄ）。生細胞数は、上記刺激条件下に培養
後、96well マイクロタイタープレートの同一群の3 wel
lから回収した細胞をトリパンブルー色素排除法（trypa
n blue dye exclusion法）にてカウントした。CD28副刺
激では、培養3日後から徐々に細胞数が増加して培養後5
日目で細胞数が2倍となる。4C8副刺激でもほぼ同様の細
胞数増加が見られたが、培養2日目で一過的に僅かな細
胞数の減少の後急速に細胞数が増加してCD28副刺激より
も多い細胞数増加を誘導した。一方、抗CD3 mAb単独及
び抗4C8 mAb単独の刺激では細胞数の増加はなく培養5日
目では減少する。
【００３１】抗アポトーシス遺伝子産物であるBcl-xLの
誘導はCD28副刺激においてT 細胞抗原受容体からの刺激
によるアポトーシスを抑制しT 細胞細胞数の増加におい
て重要な役割を担っている。事実、CD28以外の副刺激で
はT 細胞細胞数の増加が誘導されないが、IL-2産生と同
様Bcl-xLの誘導が起こらない。そこで、細胞数増加を誘
導する4C8副刺激においてBcl-xLが誘導されるかどうか
をウエスタンブロットにより確認した。上記の方法で活
性化したT 細胞を、刺激して24時間後に5 x 10 5個の生
細胞を回収しPBSで洗浄後、細胞溶解緩衝液（1 % Nonid
et P-40, 0.1 %SDS, 1 % デオキシコール酸ナトリウム,
30 μg/ml アプロチニン, 50μg/mlロイペプチン, 100
μg/ml PMSF, 1 mM オルトバナジル酸ナトリウム（sodi
um orthivanadate）にて溶解後、SDSサンプル緩衝液で
煮沸し、12 % SDS-PAGEに供し、ゲルからニトロセルロ
ース膜に転写した。ニトロセルロース膜は5 % スキムミ
ルク含有Tris緩衝液（10 mM Tris-HCL, pH 7.5, 150 mM
NaCl, 0.05 % Tween 20）でブロッキング後に1 % スキ
ムミルク含有Tris緩衝液中にて抗Bcl-xLポリクローナル
抗体（Santa Cruz Biotechnology）と反応させた。ニト
ロセルロース膜を洗浄後西洋ワサビペルオキシダーゼ標
識2次抗体（1/10,000希釈）と反応させECL chemilumine
scence試薬（Amersham）にて現像した。培養3日目にCD2
8副刺激と同様4C8副刺激でもBcl-xL発現が確認され
た）。
【００３２】以上の結果により、4C8抗原からの抗4C8 m
Abによる刺激はCD3からの同時刺激によってT 細胞にIL-
2産生誘導、CD25発現誘導、Bcl-xL発現誘導を伴うT 細
胞細胞数増加を誘導することが示された。4C8抗原は最
大限のT 細胞活性化を誘導する副刺激分子である。
【００３３】（実施例２：4C8副刺激により誘導されたC
D4陽性T 細胞からのサイトカイン産生パターン）ナイー
ブT 細胞は特定の条件で活性化された（一次刺激）後
に、再び刺激を受けた（二次刺激）際にTh1 細胞やTh2
細胞と呼ばれるサイトカイン産生パターンの偏りを持つ
分化したT 細胞が誘導されることが知られている（Th
細胞 の分極化（polarization））。4C8副刺激がこのよ
うなT 細胞 polarizationを誘導するかどうかを、IL-2,
IL-10の産生を指標に検討した。T 細胞調製方法及び一
次刺激における4C8副刺激、CD28副刺激を含むT 細胞刺
激は実施例１の方法と同様である。一次刺激培養3日後
に細胞を回収し洗浄後、無刺激下に4〜6日間培養して休
止状態にした後に、図２に示す方法で二次刺激を行っ
た。即ち、二次刺激は、0.1μg/ml抗CD3 mAbを平底96穴
プレートに固相化し、これに1 x 105個の細胞をいれ、
抗CD28 mAb 5μg/mlを添加、未添加で培養した。IL-2は
24時間後、IL-10は48時間後の培養液を取り、ELISA kit
(Biosource)にて測定した。二次刺激時の対照群とし
て、新たに調製した無刺激のT 細胞を用いた。図２Ａに
示すように、4C8副刺激後のT 細胞は抗CD3 mAbと抗CD28
mAbの二次刺激によって大量のIL-10を産生する。一
方、新たに調製したT 細胞及びCD28副刺激後のT 細胞は
抗CD3 mAbと抗CD28 mAb刺激では夫々少量及び極微量のI
L-10しか産生しなかった。一方、IL-2産生は、4C8副刺
激後のT 細胞では抗CD3 mAbと抗CD28 mAbの二次刺激で
は検出限界以下であったのに対して、新たに調製したT
細胞及びCD28副刺激後のT細胞では後者は前者に比較し
て低いレベルであったが有意な産生が見られた（図２
Ｂ）。抗CD3 mAb単独での刺激では何れの群においても
サイトカイン産生は誘導されなかった。サイトカイン産
生パターンにおいて4C8副刺激とCD28副刺激で誘導され
るT 細胞には明らかな差異がみられた。4C8副刺激によ
って誘導されるT細胞は、主にIL-10を大量に産生し、IL
-2を産生しない点において調節性T細胞と同様であるこ
とが示唆された。
【００３４】（実施例３：4C8副刺激によって誘導され
たCD4陽性T 細胞は抗CD3刺激に低応答性である）調節性
T細胞は、ポリクローナルな或いは抗原特異的な刺激に
対して低応答性又は不応答性（anergy）であることが知
られている。そこで、4C8副刺激で誘導されたT 細胞の
抗CD3 mAb刺激に対する増殖能を見た。実施例１と同様
の方法で刺激した4C8副刺激及びCD28副刺激して誘導さ
れた培養3日目の細胞を回収し洗浄後、無刺激下に4〜6
日間培養して休止状態にした後に、1 x 105 細胞/well,
200μl/wellでU底96 wellマイクロタイタープレートに
まき、放射線照射（6,000 rads）末梢血単核球（4 x 10
5 細胞/well）存在下に可溶性抗CD3 mAb (10 ng/ml)を
添加し、抗CD28 mAb (5μg/ml)又はIL-2 (100 U/ml)の
存在下又は非存在下で3日間培養して、3H-thymidineの
取込みを、実施例１と同様の方法にて測定した。この
時、実施例２と同様に新たに調製したT 細胞を用いた。
【００３５】図３に示すように、新たに調製したT 細胞
及びCD28副刺激して誘導されたT 細胞は、抗CD3 mAb刺
激により強い増殖反応が見られ、これはIL-2又は抗CD28
mAbによる刺激を加えることで更に増強された。一方、
4C8副刺激で誘導されたT 細胞は、抗CD3 mAb刺激により
僅かな増殖反応しか示さなかったが、IL-2又は抗CD28 m
Abによる刺激を加えることで増殖反応は強く増強され
た。特にIL-2を添加した場合は、新たに調製したT 細胞
及びCD28副刺激して誘導されたT 細胞に比べて常に高い
反応性を示した。これらのことより、4C8副刺激で誘導
されたT 細胞は調節性T細胞と同様に抗CD3 mAbによる刺
激には低応答性であるが、IL-2又はCD28副刺激により低
応答性が解除されることが示された。
【００３６】（実施例４：4C8副刺激で誘導されたCD4陽
性T 細胞は、他のT 細胞のポリクローナルな刺激での活
性化を抑制する）調節性T細胞は、他のT 細胞の増殖反
応を抑制することが知られていることから、4C8副刺激
で誘導されたT 細胞の抑制能を検討した。実施例３と同
様に調製した放射線照射（6000 rads）済みの4C8副刺激
後のT 細胞、CD28副刺激後のT 細胞及び新たに調製した
T 細胞（対照群）を、新たに調製したCD4陽性T 細胞（1
x105 細胞/well）と1:1の細胞数比で混合し、放射線照
射（6,000 rads）末梢血単核球（4 x 105 細胞/well）
存在下に可溶性抗CD3 mAb (10 ng/ml)を添加し、3日間
培養して、3H-thymidineの取込みを測定した。ここで用
いた細胞の組み合わせは同一提供者由来である。図４Ａ
に示すように、4C8副刺激後の細胞と共培養した群は、
新たに調製したT 細胞と共培養した対照群と比較して、
約80 %の増殖抑制が見られたのに対して、CD28副刺激後
の細胞と共培養した群では約25 %の抑制しか見られなか
った。このアッセイ系にIL-2 (100 U/ml)を添加した場
合には、4C8副刺激後の細胞と共培養した群ではIL-2非
存在下の場合と比較して増殖反応は約2倍になったが、
対照群と比較して抑制効果は解除されなかった。調節性
T細胞の抑制作用は、他のT 細胞からのIL-2産生を抑制
することによることが報告されていることから、上記と
同様の系において、添加する細胞の比を図４Ｂに示すよ
うに変えて、共培養後24時間後の培養上清中のIL-2をEL
ISAにて測定した。
【００３７】CD28副刺激後のT 細胞（○）は添加細胞数
が多くなると新たに調製したT 細胞を添加した対照群
（●）に比較して僅かにIL-2産生を増加させる傾向がみ
られたが、何れの細胞比においても対照群との差は見ら
れなかった。しかしながら、4C8副刺激後のT 細胞
（□）は、添加細胞数に依存的にIL-2産生を阻害し、反
応細胞数の2倍を添加した場合ではIL-2産生は検出限界
以下となった。これらの結果は、4C8副刺激は、CD28副
刺激とは異なり、他のT 細胞の増殖反応をIL-2産生を阻
害することで抑制する機能を有する調節性 CD4陽性T 細
胞を誘導することを示す。
【００３８】（実施例５：4C8副刺激で誘導されるCD4陽
性T 細胞は、細胞表面のCD25及び細胞内のCD152の高発
現を維持する）CD4陽性調節性T細胞は、細胞表面でCD25
及び細胞内でCD152 (CTLA-4)を高発現することから、4C
8副刺激及びCD28副刺激3日目の細胞と、その後細胞を回
収し洗浄後、無刺激下に更に3日間又は6日間培養したと
きの、細胞表面でCD25及びCD152（PE標識抗CD152 mAb
(Sigma Chemical Co.)）を発現する細胞の割合をFACSca
nにて解析した（実施例１と同様の方法）。
【００３９】4C8副刺激した細胞（□）は、刺激後の休
止培養期間においてもCD28副刺激後の細胞（○）と比較
して高い割合の細胞がCD25の発現を維持していた（図５
Ａ上パネル）。一方、細胞表面にCD152を発現する細胞
の割合は、4C8副刺激3日目の細胞ではCD28副刺激細胞と
比較して非常に高く、4C8副刺激及びCD28副刺激した細
胞何れにおいても刺激後の休止培養3日目でバックグラ
ウンドレベルに落ちた（（図５Ａ下パネル）。細胞内CD
152の発現を、細胞表面での発現が見られない副刺激後
の休止培養４日目の細胞で解析した。細胞内CD152の発
現は、細胞をはじめにQuantum RedTM標識 抗CD4 mAb (S
igma Chemical Co.)で染色後に細胞をPermeaFix (Ortho
Diagnostics, Raritan, NJ)で固定、透過処理後に、PE
標識抗CD152 mAb (Sigma Chemical Co.)で染色した。4C
8副刺激後の細胞では、大分部の細胞が細胞内にCD152を
発現しているのに対して（図５Ｂ右パネル）、CD28副刺
激後の細胞では僅かな細胞集団のみに発現が見られた
（図５Ｂ左パネル）。
【００４０】（適応症の例示）4C8副刺激によってヒト
末梢血T 細胞から誘導されるT 細胞は、CD25, CD152を
高発現しIL-10を高産生し、他のT 細胞の増殖応答を抑
制する機能を有する細胞であり、これまで動物及びヒト
で報告されてきた抑制性のCD4陽性調節性T細胞と同様の
性状を有している。本発明において、4C8副刺激でこの
ようなT 細胞は細胞数増加を伴い増殖することが明らか
にされた。更に別の刺激やIL-2などのサイトカインなど
とのコンビネーションにより、ex vivoにおいて大量の
細胞を増幅することが可能であることが示唆される、調
節性T細胞は、動物実験ではそれら細胞を移入すること
によって自己免疫疾患に抑制的に働くこと、移植拒絶反
応やGvHDに抑制的に働くこと（Hara, M. et al., 2001.
J. Immunol. 166:3789-3796.; Taylor, P. A. et a
l., 2001. J. Exp. Med. 193:1311-1317）から、調節
性T細胞の免疫抑制作用を利用した細胞医療によるリウ
マチなどの自己免疫疾患、移植などにおける治療への応
用が考えられる。
【００４１】
【発明の効果】本発明により、調節性T細胞の分化誘導
・増殖促進方法、及び該方法に使用する医薬組成物が提
供される。本発明の医薬組成物は、調節性T細胞の免疫
抑制作用を利用した細胞医療による自己免疫疾患、移植
などにおける治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】各T 細胞 サブセットに対する抗4C8 mAbの副
刺激能を測定した結果を示す図である。
【図１Ｂ】CD3+ T 細胞を用いて刺激24時間後の培養上
清中のIL-2濃度をELISAにより測定した結果を示す図で
ある。
【図１Ｃ】4C8副刺激、CD28副刺激を受けた培養3日目の
T 細胞におけるCD25の発現を比較した結果を示す図であ
る。4C8副刺激後のCD25陽性細胞は太実線、CD28副刺激
後のCD25陽性細胞は細実線で示されている。破線は、陰
性対照群（抗CD25抗体のアイソタイプ一致抗体コントロ
ール）である。
【図１Ｄ】培養後2〜5日後の生細胞数を、培養前の細胞
数を100 %として、4C8副刺激とCD28副刺激で比較したと
きの結果を示す図である。
【図２Ａ】4C8副刺激がT 細胞 polarizationを誘導する
かどうかを、IL-10の産生を指標に検討した結果を示す
図である。
【図２Ｂ】4C8副刺激がT 細胞 polarizationを誘導する
かどうかを、IL-2の産生を指標に検討した結果を示す図
である。
【図３】4C8副刺激で誘導されたT 細胞の抗CD3 mAb刺激
に対する増殖能を調べた結果を示す図である。
【図４Ａ】4C8副刺激で誘導されたT 細胞の他のT細胞に
対する増殖抑制効果を検討した結果を示す図である。
【図４Ｂ】4C8副刺激後の細胞と新たに調製したT細胞と
を抗CD3抗体刺激下で共培養した後24時間後の培養上清
中のIL-2をELISAにて測定した結果を示す図である。●
は新たに調製したT細胞と共培養した時のIL-2産生を、
○はCD28副刺激後のT細胞と共培養した時のIL-2産生
を、□は4C8副刺激後のT細胞と共培養した時のIL-2産生
を表わす。
【図５Ａ】4C8副刺激及びCD28副刺激3日目の細胞と、そ
の後細胞を回収し洗浄後、無刺激下に更に3日間又は6日
間培養したときの、細胞表面でCD25及びCD152を発現す
る細胞の割合をFACScanにて解析した結果を示す図であ
る。
【図５Ｂ】4C8副刺激及びCD28副刺激3日目の細胞と、そ
の後細胞を回収し洗浄後、無刺激下に更に４日間培養し
たときの、細胞表面でCD４及び細胞内でCD152を発現す
る細胞の割合をFACScanにて解析した結果を示す図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/06 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＺＮＡＥ

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 CD3及び4C8抗原を発現する免疫細胞に、
    CD3アゴニスト及び4C8抗原アゴニストを作用させること
    を特徴とする、調節性T細胞の分化誘導及び／又は増殖
    を促進する方法。
  2. 【請求項２】 CD3及び4C8抗原を発現する免疫細胞が、
    末梢血、リンパ節又は胸腺に含まれるものである請求項
    １記載の方法。
  3. 【請求項３】 CD3及び4C8抗原を発現する免疫細胞が、
    T細胞である請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 CD3及び4C8抗原を発現する免疫細胞が、
    末梢血単核球である請求項1記載の方法。
  5. 【請求項５】 CD3アゴニストが、抗CD3抗体である請求
    項1記載の方法。
  6. 【請求項６】 4C8抗原アゴニストが、抗4C8 抗体であ
    る請求項1記載の方法。
  7. 【請求項７】 抗4C8 抗体が、ヒト化抗体又はヒト抗体
    である請求項6記載の方法。
  8. 【請求項８】 CD3及び4C8抗原を発現する免疫細胞への
    CD3アゴニスト及び4C8抗原アゴニストの作用が、生体内
    で行われるものである請求項1記載の方法。
  9. 【請求項９】 CD3及び4C8抗原を発現する免疫細胞への
    CD3アゴニスト及び4C8抗原アゴニストの作用が、生体外
    で行われるものである請求項1記載の方法。
  10. 【請求項１０】 分化誘導された調節性T細胞が、CD25
    及びCD152を発現し、かつIL-10を産生するものである請
    求項1記載の方法。
  11. 【請求項１１】 分化誘導された調節性T細胞が、他のT
    細胞のサイトカイン産生、増殖及び／又は活性化を抑制
    するものである請求項1記載の方法。
  12. 【請求項１２】 4C8抗原アゴニストを有効成分として
    含有する、調節性T細胞の分化誘導及び／又は増殖を促
    進するための医薬組成物。
  13. 【請求項１３】 4C8抗原アゴニストが、抗4C8 抗体で
    ある請求項12記載の医薬組成物。
  14. 【請求項１４】 抗4C8 抗体が、ヒト化抗体又はヒト抗
    体である請求項13記載の医薬組成物。
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