WO2005033301A1 - 細胞活性化方法及びこれを用いる細胞製造方法並びに医薬組成物 - Google Patents

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cytotoxic
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Jun-Ichi Masuyama
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Definitions

  • the present invention is directed to cytotoxic T cells for inducing differentiation, promoting proliferation and enhancing functions of cytotoxic T cells (CD8 killer T cells, CTL) that attack tumor cells, virus-infected cells, and the like.
  • the present invention also relates to a cell activation method for activating immune cells comprising the precursor cells thereof, a cell production method using the same, and a pharmaceutical composition.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-102471
  • Examples of so-called cancer immunotherapy that treats cancer using the immune function of a living body include, for example, tumor-specific antigens, vaccines that use BCG that enhances immune ability, and monoclonals that specifically attack cancer cells.
  • a method that uses biologics that have antibody strength and so-called adoptive immunotherapy in which immunocompetent cells removed from the living body are appropriately treated to have anticancer functions, and the immunocompetent cells with anticancer functions are returned to the living body. And so on.
  • adoptive immunotherapy for example, monocytes (mononuclear cells) are taken out from the peripheral blood of a living body, and the taken out monocytes are separated to proliferate the rod cells, and the grown rod cells are treated with a tumor antigen.
  • rod-shaped cells treated with the tumor antigen are returned to the living body!
  • rod cells are thought to induce cytotoxic T cells that specifically attack tumor cells in vivo.
  • cytotoxic T cells for example, natural killer cells (hereinafter referred to as NK cells) and natural killer T cells (hereinafter referred to as NKT cells) having non-specific anti-cancer action are taken out of the living body and activated to be activated.
  • NK cells natural killer cells
  • NKT cells natural killer T cells having non-specific anti-cancer action
  • LAK lymphokine-activated killer
  • IL 2 human interleukin 2
  • LAK cells with antitumor activity which is one of the NK cells obtained by culturing in the presence of IL 2 at a concentration, are transferred into the body of cancer patients, and at the same time, a high dose of IL 2 is administered.
  • LAK therapy has been reported to be effective in 11 of 25 cases of malignant melanoma or renal cancer, no effect has been observed in the follow-up tests after that report. The therapeutic effect of LAK therapy alone is difficult to recognize due to poor medical evidence.
  • TIL lymphocytes
  • TIL therapy is effective for malignant melanoma, locally recurrent breast cancer, cancerous pleural effusion, cancerous ascites, hepatocellular carcinoma, colon cancer, non-Hodgkin's lymphoma, etc.
  • TIL requires a long-term culture for proliferation, TIL accumulation into the tumor may reduce the antitumor activity, and cells that suppress the antitumor effect have appeared. There is also a risk of it.
  • T cells as precursor cells of cytotoxic T cells and antigen-presenting cells such as rod cells are co-cultured.
  • TCR T cell receptor
  • the T cell receptor (TCR) of a T cell having a CD8 molecule recognizes an antigen peptide bound to an HLA class 1 molecule of an antigen presenting cell.
  • tumor antigen-treated rod-shaped cells and tumor antigen-specific cytotoxic ⁇ cells are induced to differentiate in large quantities in vitro.
  • Research has been done on how to return to As such a method for example, tumor-specific cytotoxic T cells or cytotoxic T cell clones are induced by culturing rod-shaped cells incorporating tumor antigens with autologous peripheral blood lymphocytes.
  • Dudley ME et al., J. Immunother. 25: 243-51, 2002
  • self-activating lymphocyte transfer therapy for cancer has been performed as a highly advanced medical treatment at some universities and private medical facilities.
  • Such self-activated lymphocyte transfer therapy includes, for example, stimulating peripheral blood lymphocytes with anti-CD3 antibody, culturing and proliferating for a long period of time with IL 2, and treating the proliferated peripheral blood lymphocytes to cancer patients.
  • V so-called CD3—LAK therapy is a relatively simple therapy.
  • Cells that are activated by CD3—LAK therapy and have antitumor activity are mainly CD8T cells. It is not activated NK cells used in therapy (Ochoa AC et al., J. Immun ol. 138: 2728, 1987).
  • CD3-LAK therapy is currently used for various cancers, and it has been reported that recurrence-suppressing effect is particularly observed after hepatocellular carcinoma healing. 3 ⁇ 4 (Takayama T et al., Lancet 356: 802, 2000).
  • the reason for the low response rate of CD3—LAK therapy to cancer is that perforin expression of the first proliferated cytotoxic T cells is low, and secondly, chemokines for migrating to lymph nodes It is thought that receptors, especially CCR7, may lose cytotoxic T cell power.
  • cytotoxic T cell or its T Progenitor cells need to receive two signals from antigen-specific T cell receptor (TCR) and costimulatory molecules (usually CD28 molecules), and cytotoxic T cells or their progenitor cells are TCR Received only one signal through
  • TCR antigen-specific T cell receptor
  • costimulatory molecules usually CD28 molecules
  • the second reason for the low response rate of CD3—LAK therapy to cancer is that cytotoxic ⁇ cells proliferated by CD3—LAK therapy migrated to peripheral lymph nodes. Because the required chemokine receptors, especially CCR7, are not very expressed, cytotoxic sputum cells administered to the body cannot reach the peripheral lymph nodes, and therefore, for cancer that has metastasized to the peripheral lymph nodes. It is considered that the effect cannot be exerted. In addition, it is considered extremely important to prevent cancer metastasis to peripheral lymph nodes that generate tumor immune responses.
  • the present inventors have shown that regulatory T cells derived from CD4 positive T cells having an inhibitory action on other T cells are induced by the action of anti-4C8 antibody (Masuyam a , J. et al., J. Immunol. 169: 3710, 2002), and the induction of such regulatory T cells is also shown in Patent Document 1.
  • anti-CD52 antibody anti-4C8 antibody
  • anti-4C8 antibody has transvascular endothelial cell migration inhibitory activity! (Masuyama, J. et al., J. Exp. Med. 189: 979, 1999; W099Zl2972).
  • cytotoxic T cells or their progenitor cells via CD52 molecules with anti-4C8 antibody etc. Research has been done to kill tumor cells, virus-infected cells, etc. based on cytotoxic ⁇ cells or progenitor cells to which costimulation has been given.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned points, and its object is to provide cytotoxicity having non-specific cytotoxic activity against various tumor cells, virus-infected cells and the like. It is an object of the present invention to provide a cell activity method that can easily obtain T cells in a short period of time, a cell production method using the same, and a pharmaceutical composition.
  • Another object of the present invention is to provide cytotoxic T cells having non-specific cytotoxic activity against various tumor cells, virus-infected cells and the like, and pharmaceutical compositions containing the same. There is.
  • a cytotoxic T cell or a progenitor cell thereof is stimulated by a CD3 agonist and a CD52 agonist.
  • cytotoxic T cells are transmitted via CD3 molecules and CD52 molecules by CD3 and CD52 agonists.
  • cytotoxic T cells or progenitor cells can be generated with a strong activity, and thus activated cytotoxic T cells Cytotoxic T cells that are able to promote proliferation by causing strong differentiation induction in cells or their progenitor cells, and thus are highly expressed by chemokine receptors, especially CCR7, and can migrate to lymph nodes
  • chemokine receptors especially CCR7
  • the cytotoxic T cells obtained by using the cell activity assay method of the first aspect can more accurately separate normal cells from tumor cells than other immune cells.
  • the cytotoxic T cells obtained based on the cell activation method of the first aspect by the cell activation method It is possible to obtain cytotoxic T cells exhibiting strong and non-specific cytotoxic activity against various tumor cells, virus-infected cells and the like.
  • the cell activation method according to the first aspect capable of exhibiting such an effect is a disease such as a malignant tumor, a virus infection or the like * directly (for example, administration of an agonist to a living body) for treatment of a disease state or It can be used indirectly (such as the production of cytotoxic T cells).
  • the present inventor has intensively studied on the cytotoxicity of CD52 antigens such as anti-4C8 antibody, etc. with respect to the effect on cells or its precursor cells, Obtained by stimulating (co-stimulating) cytotoxic CD cells or their progenitor cells via CD3 and CD52 molecules by CD3 and CD52 agonists.
  • Cytotoxicity Vaginal cells or their progenitor cell strengths When chemokine receptors, particularly CCR7, are highly expressed, they can be constructed for the first time based on the results.
  • the CD52 antigen has an anti-4C8 antibody or a fragment thereof.
  • the CD52 antigen in the cell activation method of the first or second aspect, has campus-1H or a fragment thereof.
  • cytotoxicity is induced by anti-4C8 antibody or a fragment thereof or campus 1H or a fragment thereof.
  • many cytotoxic sputum cells can express chemokine receptors, in particular CCR7, and in particular, cytotoxic sputum cells or fragments by anti-4C8 antibodies or fragments thereof.
  • costimulation to the progenitor cells, it is possible to express chemokine receptors, particularly CCR7, in more cytotoxic sputum cells.
  • the first force is the cell activity method according to any one of the third aspects.
  • the cell activity assay method of the fourth aspect is characterized in that V, and one site of the CD52 molecule of the cytotoxic epithelial cell or its progenitor cell.
  • the antibody or fragment thereof that binds to the antibody consists of an anti-4C8 antibody or fragment thereof, and Other antibodies or fragments thereof that bind to other sites of the CD52 molecule of sex T cells or their progenitor cells consist of campus 1H or fragments thereof.
  • an anti-4C8 antibody or a fragment thereof is bound to one site of the CD52 molecule.
  • the cytotoxic or progenitor cell can be suitably activated.
  • the first force in the cell activity assay method of any of the fifth aspect is a CD3 agonist is a cytotoxic cell or a cell thereof. It has an anti-CD3 antibody or a fragment thereof that binds to the CD3 molecule of progenitor cells.
  • the first force is the cell activity determination method according to any one of the sixth aspect, wherein at least one of the CD3 agonist and the CD52 agonist is
  • Having at least one of a humanized antibody and a human antibody Having at least one of a humanized antibody and a human antibody.
  • the human antibody is mouse humanized antibody or rat human antibody antibody campus-1H.
  • the CD3 agonist and the CD52 agonist in vitro or in vivo according to the cell activation method according to any one of the eighth aspect of the first force. Stimulates cytotoxic sputum cells or their progenitor cells.
  • the cell activity assay method of the tenth aspect of the present invention is the cell activity assay method according to any one of the first aspect of the ninth aspect, wherein the peripheral activity is controlled by CD3 antigen and CD52 agonist. Stimulates cytotoxic sputum cells or progenitor cells that can be present in blood, lymph nodes, thymus, bone marrow, tumor, pleural effusion, ascites or umbilical cord blood.
  • the cell production method of the present invention produces cytotoxic sputum cells using the cell activation methods of any one of the first to tenth aspects.
  • the cytotoxic sputum cell of the present invention can be obtained by the cell activity assay method of any one of the first to tenth aspects.
  • the present invention is different from the pharmaceutical composition of each aspect described later by a pharmaceutical composition containing cytotoxic ⁇ cells obtained by the method for cell activation according to any one of the first to tenth aspects. It can be configured as one aspect of.
  • the pharmaceutical composition according to the first aspect of the present invention is a method for inserting a cytotoxic sputum cell or a progenitor cell thereof. It has a CD3 attribute and a CD52 attribute.
  • the cytotoxic T cell or the CD3 molecule and the CD52 molecule via the CD3 molecule and the CD52 molecule giving the progenitor cells major and costimulatory stimuli can produce cytotoxic T cells or their progenitor cells, and thus activated cytotoxic T cells or their Proliferation can be induced in progenitor cells to promote proliferation, and thus cytotoxic T cells that express chemokine receptors, particularly CCR7, and can migrate to lymph nodes in a short period of time. Cytotoxic T cells having non-specific cytotoxic activity against various tumor cells, virus-infected cells and the like can be obtained.
  • the cytotoxic T cells obtained by using the pharmaceutical composition of the first aspect can more accurately separate normal cells from tumor cells than other immune cells.
  • the cytotoxic T cells obtained using the pharmaceutical composition of the first aspect are stimulated again with the pharmaceutical composition, so that they have a large amount of perforin and CCR7, and various tumor cells.
  • cytotoxic T cells exhibiting strong and non-specific cytotoxic activity against virus-infected cells and the like can be obtained.
  • the pharmaceutical composition of the first aspect capable of exhibiting such an effect is either directly (eg, administration of an agonist to a living body) or indirectly (cytotoxicity of a disease) such as a malignant tumor or a viral infection. For the production of sex T cells).
  • the present inventor has conducted intensive studies on the efficacy of CD52 agonists such as anti-4C8 antibody on cytotoxic T cells or their progenitor cells.
  • CD52 agonists such as anti-4C8 antibody
  • cytotoxic T cells or their progenitor cells When activated by stimulating (costimulatory) cytotoxic T cells or their progenitor cells via CD3 molecules and CD52 molecules by CD3 and CD52 agonists, Based on the results, it is possible to construct a cytotoxic T cell or progenitor cell obtained by sputum for the first time when it is newly found that a chemokine receptor, particularly CCR7, is highly expressed.
  • the D52 agonist has an anti-4C8 antibody or fragment thereof!
  • the CD52 agonist has Campus-1H or a fragment thereof.
  • the cytotoxic T cell or anti-C4C8 antibody or fragment thereof or campus 1H or fragment thereof By applying costimulation to its progenitor cells, many cytotoxic T cells can express chemokine receptors, especially CCR7, and in particular, cytotoxic T cells or their progenitor cells with anti-4C8 antibodies or fragments thereof By giving a co-stimulation to, chemokine receptors, particularly CCR7, can be expressed in more cytotoxic T cells.
  • the CD52 agonist in the pharmaceutical thread and composition according to any one of the first to third aspects, is a cytotoxic T cell or a progenitor cell thereof.
  • the antibody or the antibody thereof binds to one site of the CD52 molecule of the cytotoxic T cell or its precursor cell in the pharmaceutical composition of the fourth aspect.
  • the fragment consists of an anti-4C8 antibody or fragment thereof, and the other antibody or fragment thereof that binds to other sites of the CD52 molecule of the cytotoxic T cell or its progenitor cell consists of campus-1H or a fragment thereof.
  • an anti-4C8 antibody or a fragment thereof is bound to one site of the CD52 molecule and added.
  • Campus 1H or a fragment thereof By binding Campus 1H or a fragment thereof to other sites of the CD52 molecule, cytotoxic T cells or progenitor cells thereof can be activated appropriately.
  • the CD3 agonist in the pharmaceutical thread composition of any one of the first to fifth aspects, is a cytotoxic T cell or a progenitor cell thereof. Having an anti-CD3 antibody or fragment thereof that binds to the CD3 molecule.
  • At least one of CD3 agonist and CD52 agonist is humanized. It has at least one of an antibody and a human antibody.
  • the antibody is a mouse humanized antibody or a rat human antibody antibody campus 1H.
  • the pharmaceutical composition according to the ninth aspect of the present invention comprises a CD52 agonist that provides stimulation to cytotoxic T cells or their progenitor cells.
  • the CD52 agonist gives a costimulation to the cytotoxic T cell or its precursor cell via the CD52 molecule.
  • a cytotoxic T cell or its progenitor cell is given a major stimulus via a CD3 molecule based on the binding of MHC-1 molecule to the T cell receptor of the cytotoxic T cell or its progenitor cell, etc. It is possible to produce a strong activity in cytotoxic T cells or their progenitor cells, and to induce strong differentiation of cytotoxic T cells or their progenitor cells thus activated.
  • cytotoxic T cells that express chemokine receptors, especially CCR7, and can migrate to the lymph nodes can be easily increased in a short period of time.
  • chemokine receptors especially CCR7
  • cytotoxic T cells having non-specific cytotoxic activity can be obtained.
  • the pharmaceutical composition of the ninth aspect capable of exhibiting such an effect is related to the effect of the present inventor on the cytotoxic T cell or its progenitor cell of CD52 agonist such as anti-4C8 antibody as described above. It can be configured for the first time based on the results obtained through intensive studies.
  • the CD52 agonist has an anti-4C8 antibody or a fragment thereof!
  • the CD52 agonist has Campus-1H or a fragment thereof.
  • a method for cell activity that can easily obtain cytotoxic T cells having non-specific cytotoxic activity against various tumor cells, virus-infected cells and the like in a short period of time. And a method for producing cells and a pharmaceutical composition using the same. Furthermore, according to the present invention, it is possible to provide cytotoxic ⁇ cells having non-specific cytotoxic activity against various tumor cells, virus-infected cells and the like, and pharmaceutical compositions containing the same.
  • the pharmaceutical composition of this example is used to bind cytotoxic T cells or progenitor cells via CD3 molecules of cytotoxic T cells or progenitor cells of cytotoxic T cells (hereinafter referred to as progenitor cells).
  • CD3 molecules of cytotoxic T cells or progenitor cells of cytotoxic T cells hereinafter referred to as progenitor cells.
  • the cytotoxic T cell or progenitor cell to which stimulation (costimulation) by CD3 agonist and CD52 agonist is given has at least CD8 molecule, CD3 molecule and CD52 molecule in this example.
  • Cytotoxic T cells or progenitor cells consist of mononuclear cells that can be present in peripheral blood, lymph nodes, thymus, bone marrow, tumor, pleural effusion, ascites or umbilical cord blood, preferably peripheral blood that can be present in peripheral blood Also mononuclear ball power.
  • the progenitor cells are embodied by, for example, CD8T cells (including CD8 + CD28 ⁇ T cells etc.) before activation.
  • the CD3 agonist in this example acts on a CD3 molecule expressed on the surface of a cytotoxic T cell or progenitor cell, and transmits a signal into the cytotoxic T cell or progenitor cell via this CD3 molecule. By doing so, it also becomes a material force that causes main stimuli.
  • the CD52 agonist in this example acts on the CD52 molecule expressed on the cell surface of cytotoxic T cells or progenitor cells, and transmits signals into the cytotoxic T cells or progenitor cells via this CD52 molecule. By doing so, it also becomes a material force that causes a secondary stimulus.
  • the CD3 antigen contains an anti-CD3 antibody as a main active ingredient.
  • the anti-CD3 antibody is recognized by the cytotoxic T cell or progenitor cell by binding to the CD3 molecule of the cytotoxic T cell or progenitor cell.
  • the CD3 antigen contains an anti-CD3 antibody fragment that binds to and is recognized as an active ingredient in the same manner as the anti-CD3 antibody, instead of or in addition to the anti-CD3 antibody. It is preferable that such a fragment consists of a Fab fragment having an antigen recognition site.
  • the anti-CD3 antibody may be configured as a humanized antibody (including mouse humanized antibody, rat humanized antibody, etc.) or a human antibody.
  • Anti-CD3 antibodies that are agonistic to the CD3 molecule include, for example, OKT3 (ATCC CRL—8001), UCHT1 (BD Pharmingen), and HIT3a (BD Pharmingen).
  • the CD3 antigen may contain any molecule that can be a natural or synthetic ligand for the CD3 molecule in addition to the anti-CD3 antibody described above.
  • the T3 antigen receptor and the CD3 may contain various substances that can lead to the formation of a complex consisting of molecules and signal transduction to cytotoxic T cells or progenitor cells via CD3 molecules, in particular, antibodies having an agonist action or fragments thereof.
  • Such an antibody or a fragment thereof is, for example, OT145 (Posnett et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 83: 7888-92, which is an antibody against the human T cell antigen receptor Vbeta6.7. ) May be specified.
  • the CD3 antigen can be used in combination with the above-mentioned anti-CD3 antibody and a T cell antigen receptor such as an HLA molecule as a soluble MHC-1 molecule, a tetramer molecule having an HLA molecule and an antigen peptide. It may contain substances that can recognize and produce an agonist action!
  • the CD52 antigen contains an anti-4C8 antibody as one of the anti-CD52 antibodies as a main active ingredient.
  • the anti-4C8 antibody is recognized by the cytotoxic T cell or progenitor cell by binding to the CD52 molecule of the cytotoxic T cell or precursor cell.
  • the CD52 antigen may contain a fragment of the recognized anti-4C8 antibody that binds to and recognizes the CD52 molecule in the same manner as the anti-4C8 antibody instead of or in addition to the anti-4C8 antibody.
  • a fragment preferably comprises a Fab fragment having an antigen recognition site.
  • cytotoxic T cells or progenitor cells that are co-stimulated by anti-4C8 antibody or a fragment thereof have strong production of cytoforce-ins such as interferon ⁇ (IFN- ⁇ ) and IL-2, which have antitumor effects. Can be induced.
  • IFN- ⁇ interferon ⁇
  • IL-2 interferon ⁇
  • the class of anti-4C8 antibodies is IgG3.
  • the anti-4C8 antibody may be configured as a humanized antibody (including a mouse human antibody, a rat humanized antibody, etc.) or a human antibody.
  • a humanized antibody can be obtained, for example, by transplanting the variable region of an anti-CD52 antibody produced by Hypridoma JM-1 into a human antibody framework.
  • the human antibody is, for example, rearranged !, a mouse that retains the human antibody gene and produces a human antibody specific to the antigen by auditing the antigen (for example, Tomizuka et al., 2000). , Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 97: 722).
  • the CD52 antigen is a natural or synthetic ligand that binds to the CD52 molecule instead of or in addition to the anti-4C8 antibody, in other words, any molecule or antigen that induces a signal through the CD52 molecule.
  • a molecule or antibody which may contain an antibody against the CD52 molecule, may recognize any part of the CD52 molecule. Any device can be used as long as it can transmit a signal.
  • the CD52 antigen is, for example, a campus 1H that may contain as an active ingredient Campus 1H (Campath-1H) or a fragment thereof that binds to the CD52 molecule instead of or in addition to the anti-4C8 antibody.
  • the fragment preferably consists of a Fab fragment having an antigen recognition site.
  • Campus 1H means, in this example, rat humanized antibody campus 1H (rat human antibody Campath-1H) that binds to the CD52 molecule.
  • Campus-1H is known, for example, as a therapeutic agent for B cell lymphoma patients and as an antibody that removes peripheral blood lymphocytes. In this example, however, costimulation is performed on cytotoxic T cells or progenitor cells. Used as one of the antibodies to give.
  • CD52 antigens contact cells expressing a CD52 molecule with a candidate compound, and detect the interaction or CD52 stimulation response. Screening using the interaction with CD52 as an index. Obtained by doing.
  • the CD52 antigen may contain any molecule that can be a natural or synthetic ligand for the CD52 molecule in addition to the anti-4C8 antibody described above.
  • Anti-4C8 antibodies and molecules that can be ligands are reported by Masuyama et al. (Masuyama, J. et al., 1999, J. Exp. Med. 189: 979-989; W099 / 12972) It can be obtained by selecting, from the monoclonal antibody obtained from an animal immunized with human T-filament cysts, using as an index the inhibition of in vitro extravasation of T cells.
  • An anti-CD52 antibody capable of binding to an anti-4C8 antibody or a CD52 molecule other than the anti-4C8 antibody is obtained by adding human T cells to human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) cultured in a monolayer on a collagen gel. It can be obtained by using T cells migrated under HUVEC as an antigen after a certain period of time.
  • Preferred antibodies and the like contained in the CD52 antigen include an antibody selection step that recognizes the same epitope as the anti-4C8 antibody, and a step of evaluating the differentiation-inducing ability of cytotoxic T cells. It can be easily obtained by combining the above.
  • the CD3 agonist gives the main stimuli to the progenitor cells via the CD3 molecule of the progenitor cells, and the CD3 agonist Along with this main stimulation, the CD52 antigen gives a costimulation to the progenitor cell via the CD52 molecule of the progenitor cell.
  • the primary stimulation of cytotoxic T cells or progenitor cells by CD3 agonists occurs through the main stimulus transmission pathways involved in the differentiation of cytotoxic T cells or progenitor cells. Primary stimulation by CD3 agonists triggers a response when promoting differentiation of cytotoxic T cells or progenitor cells.
  • Costimulation of cytotoxic T cells or progenitor cells by CD52 agonists occurs through other stimulus transmission pathways.
  • the CD52 antigen co-stimulates cytotoxic T cells or progenitor cells at the same time as or before or after the main stimulation by the CD3 antigen.
  • Progenitor cells given major and minor stimuli by CD3 and CD52 agonists are induced based on these stimuli to differentiate and proliferate into cytotoxic T cells with cytotoxic activity. .
  • Such cytotoxic T cells as shown in the Examples below, are highly expressed by chemokine receptors, particularly CCR7, and thus migrate to organs and lymph nodes subordinate to the organs. It has such a high degree of mobility as to be able to be performed, and also has a high killing ability against tumor cells, virus-infected cells and the like.
  • the cytotoxic T cell having na ⁇ ve T cell or memory T cell power is activated using the pharmaceutical composition of this example
  • the cytotoxic T cell is activated in the same manner as in the case of activating the progenitor cell. Giving cells primary and secondary stimuli. Cytotoxic T cells given primary and secondary stimuli are induced to differentiate and proliferate based on these stimuli.
  • cells that have been activated and proliferated using the pharmaceutical composition of this example proliferate upon stimulation by a CD52 agonist and a CD52 agonist having an anti-4C8 antibody or an anti-4C8 antibody fragment.
  • a cytotoxic T cell a cytotoxic T cell having a large amount of perforin and CCR7 can be obtained. With high amounts of perforin and CCR7, cytotoxic T cells are highly chemotactic for CCR7 ligand and tumor cells, viruses It can show a higher killing ability against infected cells and the like.
  • the pharmaceutical composition of this example may be used by being contained in a drug such as a buffer solution, capsule, granule, powder, syrup or the like that is orally administered into a living body.
  • a pharmaceutical composition administered in vivo which may be used by being contained in a medicine comprising an injection, infusion, suppository, etc. administered parenterally into a living body by intramuscular injection, intravenous injection, etc. It may be used in a drug together with various additives such as carriers, pH buffers, stabilizers, and excipients that may be lyophilized and acceptable for therapeutic effects.
  • the drug containing the pharmaceutical composition preferably further contains a physiologically acceptable diluent or carrier.
  • Such carriers may be, for example, physiological saline, phosphate buffered physiological It may be specified by using saline, phosphate buffered saline glucose solution, buffered saline, or a combination thereof.
  • the pharmaceutical composition also includes immune cells such as cytotoxic T cells and progenitor cells collected from patients or humans other than patients, particularly T cells and peripheral blood, lymphocytes, lymph node cells, and thymus containing these cells.
  • cytotoxic T cells activated in vitro, differentiated, proliferated, or enhanced in function may be used for cells, umbilical cord blood, tumor tissue, etc. Or it is transferred into the living body of another family.
  • the administration method and dosage of the pharmaceutical composition are appropriately determined in relation to the preclinical test and the clinical trial process.
  • the dose is usually about 0. Olmg to lOOOmg per day for an adult, and such oral administration is performed once or divided into several times.
  • the dose is usually about 0. Olmg to lOOOmg per adult.
  • the dose of the pharmaceutical composition by oral administration or parenteral administration is determined according to age, body weight, and disease symptoms.
  • the medicinal thread and adult product can be reproduced as the experimental system developed in the field of basic research almost as it is in the field of therapy! Ex vivo) may be used. Since the etas vivo method activates cytotoxic T cells or progenitor cells in vitro, administration of the pharmaceutical composition in vivo is absorbed in the body, metabolized, or interfered by unknown factors. In view of the fact that the expected therapeutic effect may not be achieved due to factors such as the above, it is considered a relatively low-risk method for practical application.
  • the hybridoma that produces the monoclonal antibody is according to Hypridoma JM-1 (deposited with the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology as of September 26, 2001 under the accession number FERMBP-7757).
  • Hypridoma JM-1 deposited with the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology as of September 26, 2001 under the accession number FERMBP-7757.
  • the anti-4C8 antibody produced as a competitive reagent T cell staining by the test antibody is suppressed, in other words, recognizing the same epitope as the anti-CD52 antibody produced by Hypridoma JM-1. Can be easily obtained by combining these as indicators.
  • the cytotoxic T cells activated by the pharmaceutical composition of this example proliferate more easily in the presence of IL2. Cytotoxic T cells proliferated in the presence of IL-2 induce more perforin when re-stimulated with anti-4C8 antibody, resulting in higher killing ability against tumor cells, virus-infected cells, etc. .
  • the second costimulation with the anti-4C8 antibody or a fragment thereof against the cytotoxic T cell is given together with the main stimulation with the CD3 antigen.
  • the CD3 molecule and the CD52 molecule are used as the CD3 molecule and the CD52 molecule.
  • main and accessory stimuli to cytotoxic T cells or their progenitor cells via the cell, it is possible to generate a strong activity in the cytotoxic T cells or their progenitor cells.
  • cytotoxic T cells obtained by using the pharmaceutical composition of this example can more accurately separate normal cells from tumor cells than other immune cells.
  • the tumor composition has a large amount of perforin and CCR7, and various tumor cells, It is possible to obtain cytotoxic T cells that exhibit strong and non-specific cytotoxic activity against virus-infected cells and the like.
  • the CD52 antigen has an anti-4C8 antibody or fragment thereof, or campus 1H or a fragment thereof
  • the anti-4C8 antibody or fragment or
  • many cytotoxic sputum cells can express chemokine receptors, especially CCR7, especially anti-4C8 antibodies
  • a chemokine receptor, particularly CCR7 can be expressed in a larger number of cytotoxic sputum cells by co-stimulating the cytotoxic sputum cells or progenitor cells thereof with a fragment thereof.
  • the CD52 antigen has an anti-4C8 antibody or a fragment thereof and cannos 1H or a fragment thereof
  • the anti-4C8 antibody or a fragment thereof is linked to one site of the CD52 molecule.
  • the cytotoxic or progenitor cell can be activated appropriately.
  • the pharmaceutical composition of this example can be used directly (for example, administration of an agonist to a living body) or indirectly (for example, production of cytotoxic vaginal cells) for the treatment of diseases and pathological conditions such as malignant tumors and viral infections. .
  • the pharmaceutical composition of the present example capable of exhibiting such effects was studied by the present inventor with regard to the efficacy of CD52 agonists such as anti-4C8 antibody on cytotoxic T cells or their progenitor cells. Cytotoxicity obtained by stimulating (co-stimulating) cytotoxic T cells or their progenitor cells via CD3 molecules and CD52 molecules by activation and CD52 agonist If it is newly found that sex T cells or their progenitor cells express high levels of chemokine receptors, particularly CCR7, they can be constructed based on the results.
  • the other pharmaceutical composition of this example contains a CD52 agonist having an anti-4C8 antibody or a fragment thereof as a main active ingredient.
  • a pharmaceutical composition for example, by giving a costimulation to a cytotoxic T cell or a progenitor cell thereof via a CD52 molecule by a CD52 agonist, When a major stimulus via CD3 molecule is applied based on the binding of MHC-1 molecule to the T cell receptor of T cell or its progenitor cell, it has a strong activity on cytotoxic T cell or its progenitor cell.
  • Cytotoxic T cells having non-specific cytotoxic activity against cells and the like can be obtained.
  • Example 1 a test is performed on the expression of CCR7 and perforin in cytotoxic sputum cells induced by costimulation with CD52 agonist.
  • peripheral blood mononuclear cells of healthy individuals were separated by density gradient centrifugation using Ficoll-Paque Plus (Amersham Pharmacia), and the separated mononuclear cells were passed through a nylon wool column, and the flow-through fraction was separated. Harvested to obtain T cells.
  • CD8 T cells having CD8 molecules were isolated from T cells by negative selection using MACS CD8 + T cell Isolation Kit (Milteny Biotec).
  • MACS CD8 + T cell Isolation Kit MACS CD8 + T cell Isolation Kit (Milteny Biotec).
  • MACS CD8 + T cell Isolation Kit MACS CD8 + T cell Isolation Kit (Milteny Biotec).
  • phosphate buffer (PBS) phosphate buffer
  • the isolated CD8T cells were suspended in RPMI1640 medium (10% FCS + 15 mM HEPES + 1% penicillin + 1% streptomycin) at a concentration of 1 X 10 6 Zml, and anti-CD3 antibody and anti-4C8 antibody or campus 1 ⁇ 10 6 pieces of 0.5 force were also added to each hole of the 48-well plate treated with 1H. After culturing for 4 days at 37 ° C using a CO incubator,
  • the solution was adjusted to X 10 6 Zml and transferred to another culture vessel, and IL 2 (20 UZml) was added to continue the culture.
  • the culture medium was changed by half every other day, and IL 2 (20 UZml) was added every time the medium was changed.
  • T cells were collected and washed. Over 99% of the collected T cells were CD8 positive and TCR a ⁇ positive.
  • the second costimulation was given to CD8T cells via the CD52 molecule.
  • Anti-CD3 antibody and anti-4C8 antibody were immobilized. 1 ⁇ 10 7 collected T cells were added to the well plate and cultured in a CO incubator. culture
  • CD8T cells were recovered after 4 days from the start, and the CD8T cells were used for the experiment.
  • CD3-LAK cells to be compared were obtained by the following general method.
  • an anti-CD3 antibody 5 gZml
  • 1 ⁇ 10 6 T cells which are nylon wool column passage fractions of peripheral blood mononuclear cells, were seeded.
  • IL-2 100 UZml was added 24 hours and 72 hours after seeding, and cultured for a total of 5 days.
  • the plates were then transferred and the cells were grown for about 10 days with IL 2 (20 U / ml) added every other day for growth.
  • CD52—CTL 3 x 10 5 CD8T cells (hereinafter referred to as CD52—CTL) treated with costimulation of CD52 molecules were suspended in 50 ⁇ l of the culture solution, and then FITC-labeled anti-CCR7 antibody (Dako) ) Was placed on ice and in the dark for 30 minutes. After standing, the cells were washed twice with PBS supplemented with 0.1% ushi serum albumin, fixed with l% paraformaldehyde, and the expression of CCR7 (positive) on the living cell surface was examined by FACScan.
  • CTL CD8T cells
  • CD3- LAK cells CCR 7+ expression (%), since the front is below CCR 7+ expression CD8T cells (%), CD3-LAK cells force be suggested to CCR7 + is disappeared Yes.
  • C As shown in Fig. 2, the average fluorescence intensity of D52—CTL perforin in cells is significantly higher in CD52—CTL after the second stimulation than in CD52—CTL before the second stimulation. It has also been suggested that CD52-CTL intracellular perforin increases markedly after the second stimulation.
  • Example 2 a test on chemotaxis (chemotaxis) reaction to CCR7 ligand was performed, and CD52—CTL with high expression of CCR7 reacted to CCR7 ligand, and chemotaxis was enhanced! / Consider whether or not.
  • Chemotaxis assembly was performed using Transwell S ⁇ um pore, polycarbonate, Costar) for 24-well plates.
  • the CCR7 ligand chemokine CCL21 (R & D) was added to the lower chamber of Transwell at concentrations of 10 ngZml, lOOngZml and lOOOngZml, respectively.
  • CCL20 (R & D) which is a ligand of CCR6 that is not expressed in CD52-CTL and CD3-LAK, was used.
  • 5 ⁇ 10 5 CD52-CTL or CD3 LAK were added and cultured at 37 ° C. After 90 minutes from the start of the culture, the cells that migrated to the lower chamber were counted.
  • the chemotaxis activity (%) was determined using the following formula (1).
  • Chemotaxis activity Number of cells moving in the lower chamber Z Number of cells added in the upper chamber ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ (1)
  • CD52-CTLs are found to move actively due to the chemotaxis reaction of CCR7 and CCL21.
  • CD52-CTLs are administered in vivo, the majority of the CD52-CTLs are Suggested that can reach the lymph nodes It is.
  • Example 3 a test for the cytotoxic activity of CD52-CTL against cancer cells and normal cells is performed.
  • cytotoxic activity For analysis of cytotoxic activity, a standard 4 hour 51 Cr release assay was used. The target cells were labeled with 51 Cr 100 Ci and washed, and 1 x 10 4 washed target cells were placed in each well of a 96-well round bottom plate (ICN), with an E / T ratio (effector of 6 to 50). CD52-CTL was added at a cell / target cell ratio. Incubate at 37 ° C for 4 hours in a CO incubator.
  • the 51 Cr radioactivity released into the supernatant 100 1 was measured with a gamma counter.
  • the cytotoxic activity (%) was determined using the following formula (2).
  • KatoIII gastric cancer
  • TE11 esophageal cancer
  • Daudi Backitt lymphoma
  • CD52—CTL is cytotoxic against KatoIII and TE11 depending on the CD52—CTLZ target cell ratio (EZT ratio). (%).
  • CD52-CTL suggested cytotoxic activity (%) against Daudi independent of the CD52-CTLZ target cell ratio.
  • CD52-CTL showed no cytotoxic activity (%) against ConA-Blasts (Con-A) as normal cells.
  • Example 4 a test is conducted on the cytotoxic activity of CD52-CTL cultured for 24 hours against tumor cells.
  • Tumor cell lines include KatoIII (gastric cancer), TE11 (esophageal cancer), TE2 (esophageal cancer), WiDr—TC (colorectal cancer), SK-MEL-28 (malignant melanoma), LCSC # 1 (lung) Adenocarcinoma), LU65 (small cell lung cancer) ) was used.
  • Target tumor cells 1 X lOVml (SK MEL-28 only 0.5 X lO ml) is seeded 100 1 in each well of a 96-well flat-bottom plate, and tumors are cultured in a 5% CO incubator at 37 ° C for 3 hours.
  • the cells were cultured until the tumor cells fully adhered to the 96-well flat bottom plate. This CD52-CTL was added at a predetermined EZT ratio of 100 1 and cultured at 37 ° C for 24 hours in a 5% CO incubator. Culture
  • cytotoxic activity (%) was measured by adding 10% of WST-1 (Roche's Diagnostic Status) and culturing for 2 hours, using an ELISA plate reader at 2 wavelengths of A49 2nmZA620nm. Obtained using (3).
  • TS means target cells only
  • BGO means background of culture medium only
  • E means target cells and CD52-CTL (effector cells)
  • BGEC means background of effector cells only means.
  • the cytotoxic activity (%) depending on the EZT ratio of CD52-CTL induced by costimulation via CD52 molecule with anti-4C8 antibody is It is potent against each of the six types of tumor cells and shows a non-specific tendency towards these tumor cells.
  • Example 5 a test for the enhancing action of IL2 on CD52-CTL is performed.
  • Example 6 the cytotoxic activity (%) of CD52—CTL given costimulation by anti-4C8 antibody and the cytotoxic activity of CD52—CTL given costimulation by campus 1H (%) %) Is compared.
  • CD52-CTL which is co-stimulated by Karasu Campus 1H, can have a sufficient antitumor effect even when used for the treatment of tumor cells.
  • Example 7 CD3— LAK cells and CD52— CTL cells for monolayer culture LCSC # 1 (obtained from Medical Cell Resource Center, Tohoku University Institute of Medical Research, including lung adenocarcinoma and other cancer cells) And a test for comparison of cytotoxic activity.
  • LCSC # 1 was cultured in RPMI 1640 supplemented with 10% FCS in a 24-well plate (coning) until it became a monolayer.
  • T cells were obtained by separating peripheral blood mononuclear cells (PBM C) from healthy individuals and further passing through a nylon wool column.
  • the T cell antibody stimulation obtained in this way has a range of solid-phase antibody concentrations effective for T cell stimulation (anti-CD3 antibody lOOngZml 5 ⁇ g / ml, anti-4C8 antibody and campus— 1H 1-50 ⁇ gZ ml), an antibody amount different from that in Example 1 was used.
  • CD3-LAK cells were induced by stimulation for 3 days using a 48-well plate with anti-CD3 antibody (lOOngZml) immobilized on it, and the addition of IL 2 (lOOUZml) was repeated every 3 days. The culture was grown for 2 weeks while replacing with a new plate.
  • the first CD52 costimulation of CD52—CTL cells was performed on T cells using a plate with anti-CD3 antibody (lOOngZml) and anti-4C8 antibody (5 ⁇ g / ml) immobilized. For 3 days, and then IL-2 (100 UZml) was collected every 3 days and grown for 2 weeks in place of a large plate. Double-stimulated CD52—CTL cells are as described 1 This was obtained by culturing a part of the T cells given the second CD52 costimulation with a second CD52 costimulation for 3 days. In this culture method, ⁇ cells proliferated 100 to 1000 times. In addition, in this culture method, CD8 + T cells accounted for about 80%.
  • LCSC # 1 was cultured and monolayered in the same manner as in Example 7, and then treated with trypsin for a short time. After separation by trypsin treatment, washed and suspended in PBS was used. T cell culture medium is AIM-V (Invitrogen) with 5% autologous plasma in consideration of actual clinical use. The thing which added was used.
  • AIM-V Invitrogen
  • T cells were obtained from healthy individuals in the same manner as in Example 7.
  • CD3-LAK cells were induced by stimulating for 3 days using a 48-well plate with anti-CD3 antibody (lOOngZml) immobilized, and then supplemented with IL-2 (100 UZml) every 3 days. The ones grown in culture for 2 weeks while using large plates were used.
  • CD52—CTL cells can be obtained from the first round of T cells using a plate with anti-CD3 antibody (100 ⁇ g / ml) and 1H (20 ⁇ g / ml) immobilized on campus instead of anti-4C8 antibody.
  • SCID mice 7 weeks old, female, obtained from CLEA Japan
  • anti-asharo GM1 antibody (Wako Pure Chemical) 100 gZ mice
  • Three SCID mice were divided into 3 groups (Group A, Group B and Group C).
  • Group A consisted of 3 SCID mice that were intraperitoneally transferred with LCSC # 1 (1 X 10 7 mice / mouse) only.
  • Group B LCSC # 1 (1 X 10 7 Z mice) was transferred intraperitoneally, and CD3 LAK cells (4 X 10 7 Z mice) were injected intraperitoneally on the 3rd and 5th day after the transfer.
  • group C LCSC # 1 (1 X 10 7 Z mice) was transferred intraperitoneally, and CD52-CTL (4 X 10 7 Z mice) was injected intraperitoneally on the 3rd and 5th day after the transfer.
  • FIG. 1 is an explanatory diagram relating to test results in Example 1.
  • FIG. 1 is an explanatory diagram relating to test results in Example 1.
  • FIG. 2 is an explanatory diagram relating to test results in Example 1.
  • FIG. 3 (a) and (b) are explanatory diagrams relating to test results in Example 2.
  • FIG. 3 (a) and (b) are explanatory diagrams relating to test results in Example 2.
  • FIG. 4 is an explanatory diagram regarding test results in Example 3.
  • FIG. 5 is an explanatory diagram regarding test results in Example 4.
  • FIG. 6 is an explanatory diagram relating to test results in Example 5.
  • FIG. 7 is an explanatory diagram relating to test results in Example 6.
  • FIG. 8 is an explanatory diagram relating to test results in Example 7.
  • FIG. 9 is an explanatory diagram relating to test results in Example 8.

Abstract

　医薬組成物は、細胞傷害性Ｔ細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞の前駆細胞（以下、前駆細胞と称する）のＣＤ３分子を介して当該細胞傷害性Ｔ細胞又は前駆細胞に刺激（主刺激）を与えるＣＤ３アゴニストと、細胞傷害性Ｔ細胞又は前駆細胞のＣＤ５２分子を介して当該細胞傷害性Ｔ細胞又は前駆細胞に刺激（副刺激）を与えるＣＤ５２アゴニストとを有している。

Description

明 細 書
細胞活性化方法及びこれを用いる細胞製造方法並びに医薬組成物 技術分野
[0001] 本発明は、腫瘍細胞、ウィルス感染細胞等を攻撃する細胞傷害性 T細胞 (CD8キ ラー T細胞、 CTL)の分化誘導、増殖促進及び機能増強のために、細胞傷害性 T細 胞又はその前駆細胞からなる免疫細胞を活性化させる細胞活性化方法及びこれを 用いた細胞製造方法並びに医薬組成物に関する。
背景技術
[0002] 特許文献 1：特開 2003— 102471号公報
[0003] 生体の持つ免疫機能を利用して癌を治療するいわゆる癌免疫療法としては、例え ば、腫瘍特異的抗原、免疫能を高める BCG等を用いるワクチンや癌細胞を特異的 に攻撃するモノクローナル抗体力 なる生物製剤を使用する方法と、生体から取り出 した免疫担当細胞に適当な処理をして抗癌機能をもたせ、抗癌機能を有した免疫担 当細胞を生体に戻すいわゆる養子免疫療法とが挙げられる。養子免疫療法としては 、例えば、生体の末梢血から単球 (単核球)を取り出し、取り出した単球を分ィ匕させて 榭状細胞を増殖し、増殖した榭状細胞に腫瘍抗原を処理し、腫瘍抗原が処理された 榭状細胞を生体に戻す!、わゆる榭状細胞療法が挙げられる。斯かる榭状細胞療法 では、生体内で腫瘍細胞を特異的に攻撃する細胞傷害性 T細胞を榭状細胞が誘導 すると考えられている。また、例えば、非特異的な抗癌作用を持つナチュラルキラー 細胞（以下、 NK細胞と称する）やナチュラルキラー T細胞（以下、 NKT細胞と称する )を生体外に取り出して活性化させ、活性化された NK細胞や NKT細胞が増殖した 後に生体内に戻す方法も養子免疫療法の一つとして考えられて!/、る。
[0004] 細胞を体外で活性化させて体内に戻す養子免疫療法の先駆的な療法としては、例 えば、 、わゆる LAK (lymphokine— activated killer)療法が挙げられる（Lotze M et al. , Cancer Res. 41 :4420, 1981)。 LAK療法は、リンパ球増殖因子で あるリコンビナントヒトインターロイキン 2 (以下、 IL 2と称する）が使用可能となった 19 80年代から利用することができるようになり、癌患者力も採取した末梢血リンパ球を高 濃度の IL 2存在下で培養して得た NK細胞の一つである抗腫瘍活性を有する LAK 細胞を癌患者の体内に移入し、この移入と同時に高用量の IL 2を投与する療法で ある。斯カる LAK療法については、悪性黒色腫ゃ腎癌で 25例中 11例に対して効果 を奏するとの報告もされたが、当該報告以後の追試での効果は認められておらず、 従って、 LAK療法のみによる治療効果は、医学的根拠に乏しいことから認め難い。
[0005] LAK細胞が使用可能となった後も腫瘍組織に浸潤した免疫担当細胞に関する研 究が進められ、その結果、腫瘍細胞の抗原を認識して当該腫瘍細胞に対して特異的 な細胞傷害活性を示す細胞が細胞傷害性 T細胞であることが発見されたことから、末 梢血ではなぐ腫瘍組織に浸潤したリンパ球 (TIL)を採取し、採取した TILを IL 2を 用いて増殖させて生体内に戻すと 、ぅ 、わゆる TIL療法が試みられた。 TIL療法は、 悪性黒色腫、局所再発乳癌、癌性胸水、癌性腹水、肝細胞癌、大腸癌、非ホジキン リンパ腫等に対して有効であるとの報告もあるが、 TILの採取が煩雑であると共に、 T ILの増殖に長期間の培養を要するために TILの腫瘍への集積性ゃ抗腫瘍活性が低 下してしまう虞があり、また、抗腫瘍効果を抑制する細胞が出現してしまう虞もある。
[0006] また、腫瘍細胞に対する強力な活性を有する細胞傷害性 T細胞を誘導させるため には、細胞傷害性 T細胞の前駆細胞としての T細胞と榭状細胞等の抗原提示細胞と を共培養して当該 τ細胞を刺激することが必要であるとされている。即ち、細胞傷害 性 T細胞を誘導させるためには、 CD8分子を有する T細胞の T細胞受容体 (TCR)に 、抗原提示細胞の HLAクラス 1分子に結合した抗原ペプチドを認識させることにより T細胞に主刺激を与え、この主刺激に加えて、 T細胞の CD28分子等を介して当該 CD8T細胞に副刺激を与えることが必要とされている。このため、腫瘍細胞にのみ発 現する特異抗原及びそのェピトープの研究が進められ、新たな腫瘍抗原が次々に発 見されつつある。
[0007] 上述のような研究により発見された新たな腫瘍抗原を手掛かりに、腫瘍抗原を処理 した榭状細胞や腫瘍抗原特異的細胞傷害性 τ細胞を生体外で大量に分化誘導して 生体内に戻す方法が研究されている。斯カる方法としては、例えば、腫瘍抗原を取り 込ませた榭状細胞を自己末梢血リンパ球と共に培養することで腫瘍特異的な細胞傷 害性 T細胞や細胞傷害性 T細胞のクローンを誘導、増殖させる方法がある（Dudley ME, et al. , J. Immunother. 25 : 243—51, 2002, Yee C, et al. , Pro. N atl. Acad. Sci. USA. , 99 : 16168—73, 2002)。
[0008] 我国では、上述のような方法に加えて、癌に対する自己活性化リンパ球移入療法 が高度先進医療として一部の大学や民間医療施設で行われてきた。斯カる自己活 性化リンパ球移入療法としては、例えば、末梢血リンパ球を抗 CD3抗体で刺激し、 IL 2で長期間培養して増殖させ、増殖させた末梢血リンパ球を癌患者の体内に戻す V、わゆる CD3— LAK療法が比較的簡単な療法として挙げられ、 CD3— LAK療法に より活性ィ匕されて抗腫瘍活性を有することとなる細胞は、主として CD8T細胞であり、 LAK療法で利用される活性化 NK細胞ではない（Ochoa AC et al. , J. Immun ol. 138 : 2728, 1987)。 CD3— LAK療法は、現在種々の癌に対して利用されてお り、肝細胞癌の治癒切術後の再発抑制効果が特に認められるとの報告がなされてい ¾ (Takayama T et al. , Lancet 356 : 802, 2000)。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0009] し力しながら、上述のような CD3— LAK療法では、生体内に戻された活性化 T細胞 の抗腫瘍活性が低く（Geller RL et al. , J. Immunol. 146 : 3280, 1991)、こ の CD3— LAK療法により実際に癌を縮小させた奏功率（complete response +pa rtial response)は、 10%前後とされている（Goto S et al. , Anticancer Res . 22 : 2461, 2002)。
[0010] CD3— LAK療法の癌に対する奏功率が低い理由としては、第一に増殖した細胞 傷害性 T細胞のパーフォリン (perforin)発現が低 、こと、第二にリンパ節に移動する ためのケモカイン受容体、特に CCR7が細胞傷害性 T細胞力 消失してしまうことが 考えられる。
[0011] CD3— LAK療法の癌に対する奏功率が低い第一の理由に関しては、標的腫瘍細 胞の細胞膜に孔を穿つ機能を有するパーフォリンを多く発現させるためには、細胞 傷害性 T細胞又はその前駆細胞が抗原特異的な T細胞受容体 (TCR)及び副刺激 分子 (通常 CD28分子)からの二つのシグナルを受けることが必要であると考えられ、 細胞傷害性 T細胞又はその前駆細胞が TCRを介する一つのシグナルのみを受けた 場合には、増殖した細胞傷害性 τ細胞内のパーフォリンが十分に増加しないと考えら れる。斯カるパーフォリンが少ない場合には、細胞傷害性 τ細胞は、癌細胞の表面組 織に孔を穿つ機能が著しく低減することから癌細胞に対して強力な攻撃を行うことが できないことが考えられる。
[0012] CD3— LAK療法の癌に対する奏功率が低い第二の理由に関しては、 CD3— LAK 療法により増殖した細胞傷害性 Τ細胞では、細胞傷害性 Τ細胞が末梢リンパ節に移 動するのに必要とされるケモカイン受容体、特に CCR7があまり発現しな 、ために、 生体に投与した細胞傷害性 Τ細胞が末梢リンパ節に到達し得ず、従って、末梢リン パ節に転移した癌に対して効果を発揮し得ないことが考えられる。尚、腫瘍免疫反応 を生じる末梢リンパ節に対する癌の転移を防止することは極めて重要であると考えら れている。
[0013] また、以上に述べたような免疫療法を実用的な治療として利用する場合には、次の ようないくつかの問題点がある。斯カる問題点としては、腫瘍特異的な細胞傷害性 Τ 細胞を誘導し、治療効果を奏し得る程度にまで細胞傷害性 Τ細胞を増殖させるのに 煩雑な操作及び多大な時間を要してしまい、短期間で簡単に細胞傷害性 Τ細胞を 増殖させることが困難である点、既知の腫瘍抗原は未だ少ないために腫瘍特異的な 細胞傷害性 Τ細胞を多種多様の癌に対応させることが困難である点、生体から取り 出した腫瘍のリンパ球 (TIL)をあらゆる患者に対応させることが困難である点及び抗 CD3抗体のみによる刺激により活性ィ匕されたリンパ球では、パーフォリン発現が低く 、また CCR7も消失しているために、癌に対する奏功率を高めることが困難である点 が挙げられる。
[0014] 一方、本発明者は、抗 4C8抗体の作用により他の T細胞に対して抑制的な作用を 有する CD4陽性 T細胞由来の調節性 T細胞を誘導することを示しており（Masuyam a, J. et al. , J. Immunol. 169 : 3710, 2002)、斯かる調節性 T細胞の誘導に関 しては、特許文献 1においても示されている。また、本発明者は、抗 CD52抗体 (抗 4 C8抗体）が経血管内皮細胞遊走抑制活性を有することも発見して!/、る (Masuyama , J. et al. , J. Exp. Med. 189 : 979, 1999 ;W099Zl2972号公報）。し力しな がら、抗 4C8抗体等により CD52分子を介して細胞傷害性 T細胞又はその前駆細胞 に副刺激を与え、副刺激が与えられた細胞傷害性 τ細胞又は前駆細胞に基づ 、て 腫瘍細胞、ウィルス感染細胞等を殺傷するような研究はなされて ヽな ヽ。
[0015] 本発明は、前記諸点に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、種々の 腫瘍細胞、ウィルス感染細胞等に対して非特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷 害性 T細胞を短期間で簡単に得ることのできる細胞活性ィ匕方法及びこれを用いる細 胞製造方法並びに医薬組成物を提供することにある。
[0016] 本発明の他の目的とするところは、種々の腫瘍細胞、ウィルス感染細胞等に対して 非特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性 T細胞及びこれを含む医薬組成物を 提供することにある。
課題を解決するための手段
[0017] 本発明の第一の態様の細胞活性ィ匕方法は、 CD3ァゴ-スト及び CD52ァゴニスト により細胞傷害性 T細胞又はその前駆細胞に刺激を与える。
[0018] 第一の態様の細胞活性ィ匕方法によれば、上述の構成を具備しているために、 CD3 ァゴ-スト及び CD52ァゴニストにより CD3分子及び CD52分子を介して細胞傷害性 T細胞又はその前駆細胞に主刺激及び副刺激を与えることで、細胞傷害性 T細胞又 はその前駆細胞に強力な活性ィ匕を生じさせることができ、このように活性化された細 胞傷害性 T細胞又はその前駆細胞に強力な分化誘導を生じさせて増殖を促進させ ることができ、従って、ケモカイン受容体、特に CCR7を高発現してリンパ節に移動可 能となった細胞傷害性 T細胞を短期間で簡単に増加させることができ、而して、種々 の腫瘍細胞、ウィルス感染細胞等に対して非特異的な細胞傷害活性を有する細胞 傷害性 T細胞を得ることができる。また、第一の態様の細胞活性ィ匕方法を用いること によって得られる細胞傷害性 T細胞は、正常細胞と腫瘍細胞等との分別を他の免疫 細胞よりも正確に行い得る。カロえて、第一の態様の細胞活性化方法に基づいて得ら れた細胞傷害性 T細胞を当該細胞活性化方法により再度刺激することで、多量のパ ーフォリン及び CCR7を有していると共に、種々の腫瘍細胞、ウィルス感染細胞等に 対して強力かつ非特異的な細胞傷害活性を示す細胞傷害性 T細胞を得ることができ る。このような効果を奏し得る第一の態様の細胞活性ィ匕方法は、悪性腫瘍、ウィルス 感染症等の疾患 *病態の治療に関して直接的（生体へのァゴニスト投与等）に又は 間接的 (細胞傷害性 T細胞の製造等）に利用され得る。斯かる効果を奏し得る第一の 態様の細胞活性ィ匕方法は、本発明者が抗 4C8抗体等の CD52ァゴ-ストの細胞傷 害性 Τ細胞又はその前駆細胞に対する効能に関して鋭意検討し、 CD3ァゴ-スト及 び CD52ァゴニストにより CD3分子及び CD52分子を介して細胞傷害性 Τ細胞又は その前駆細胞に刺激 (共刺激)を与えて活性化させた場合に、当該活性ィ匕によって 得られた細胞傷害性 Τ細胞又はその前駆細胞力 ケモカイン受容体、特に CCR7を 高発現して 、ることを新たに見出したと 、う結果に基づ 、て初めて構成し得るのであ る。
[0019] 本発明の第二の態様の細胞活性ィ匕方法では、第一の態様の細胞活性ィ匕方法にお いて、 CD52ァゴ-ストは、抗 4C8抗体又はそのフラグメントを有している。
[0020] 本発明の第三の態様の細胞活性化方法では、第一又は第二の態様の細胞活性化 方法において、 CD52ァゴ-ストは、キャンパス— 1H又はそのフラグメントを有してい る。
[0021] 第二又は第三の態様の細胞活性ィ匕方法によれば、上述の構成を具備しているた めに、抗 4C8抗体若しくはそのフラグメント又はキャンパス 1H若しくはそのフラグメ ントにより細胞傷害性 Τ細胞又はその前駆細胞に副刺激を与えることで、多くの細胞 傷害性 Τ細胞にケモカイン受容体、特に CCR7を発現させることができ、特に、抗 4C 8抗体又はそのフラグメントにより細胞傷害性 Τ細胞又はその前駆細胞に副刺激を与 えることで、より多くの細胞傷害性 Τ細胞にケモカイン受容体、特に CCR7を発現させ ることがでさる。
[0022] 本発明の第四の態様の細胞活性ィ匕方法では、第一力 第三のいずれかの態様の 細胞活性ィ匕方法において、 CD52ァゴ-ストは、細胞傷害性 Τ細胞又はその前駆細 胞の CD52分子の一の部位に結合する抗体又はそのフラグメントと、当該細胞傷害 性 Τ細胞又はその前駆細胞の CD52分子の他の部位に結合する他の抗体又はその フラグメントとを有している。
[0023] 本発明の第五の態様の細胞活性ィ匕方法では、第四の態様の細胞活性ィ匕方法にお V、て、細胞傷害性 Τ細胞又はその前駆細胞の CD52分子の一の部位に結合する抗 体又はそのフラグメントは、抗 4C8抗体又はそのフラグメントからなり、当該細胞傷害 性 T細胞又はその前駆細胞の CD52分子の他の部位に結合する他の抗体又はその フラグメントは、キャンパス一 1H又はそのフラグメントからなる。
[0024] 第四又は第五の態様の細胞活性ィ匕方法によれば、上述の構成を具備しているた めに、例えば、抗 4C8抗体又はそのフラグメントを CD52分子の一の部位に結合させ
、カロえて、キャンパス 1H又はそのフラグメントを CD52分子の他の部位に結合させ ることで、細胞傷害性 Τ細胞又はその前駆細胞を好適に活性ィ匕させ得る。
[0025] 本発明の第六の態様の細胞活性ィ匕方法では、第一力 第五のいずれかの態様の 細胞活性ィ匕方法において、 CD3ァゴ-ストは、細胞傷害性 Τ細胞又はその前駆細胞 の CD3分子に結合する抗 CD3抗体又はそのフラグメントを有している。
[0026] 本発明の第七の態様の細胞活性ィ匕方法では、第一力 第六のいずれかの態様の 細胞活性ィ匕方法において、 CD3ァゴ-スト及び CD52ァゴニストの少なくとも一方は
、ヒト化抗体及びヒト抗体の少なくとも一方を有して 、る。
[0027] 本発明の第八の態様の細胞活性ィ匕方法では、第七の態様の細胞活性ィ匕方法にお いて、ヒトイ匕抗体は、マウスヒト化抗体又はラットヒトイ匕抗体キャンパス- 1Hである。
[0028] 本発明の第九の態様の細胞活性ィ匕方法では、第一力 第八のいずれかの態様の 細胞活性化方法にぉ 、て、生体外又は生体内で CD3ァゴニスト及び CD52ァゴニス トにより細胞傷害性 Τ細胞又はその前駆細胞に刺激を与える。
[0029] 本発明の第十の態様の細胞活性ィ匕方法は、第一力 第九のいずれかの態様の細 胞活性ィ匕方法において、 CD3ァゴ-スト及び CD52ァゴ-ストにより末梢血、リンパ 節、胸腺、骨髄、腫瘍、胸水、腹水又は臍帯血に存在可能な細胞傷害性 Τ細胞又は その前駆細胞に刺激を与える。
[0030] 本発明の細胞製造方法は、第一から第十の 、ずれかの態様の細胞活性化方法を 用いて細胞傷害性 Τ細胞を製造する。また、本発明の細胞傷害性 Τ細胞は、第一か ら第十のいずれかの態様の細胞活性ィ匕方法によって得られる。更に、本発明は、第 一から第十のいずれかの態様の細胞活性ィ匕方法によって得られた細胞傷害性 τ細 胞を含む医薬組成物によっても後述の各態様の医薬組成物と異なる他の一態様とし て構成され得る。
[0031] 本発明の第一の態様の医薬組成物は、細胞傷害性 Τ細胞又はその前駆細胞に刺 激を与える CD3ァゴ-スト及び CD52ァゴ-ストを有している。
[0032] 第一の態様の医薬組成物によれば、上述の構成を具備しているために、 CD3ァゴ 二スト及び CD52ァゴニストにより CD3分子及び CD52分子を介して細胞傷害性 T細 胞又はその前駆細胞に主刺激及び副刺激を与えることで、細胞傷害性 T細胞又は その前駆細胞に強力な活性ィ匕を生じさせることができ、このように活性化された細胞 傷害性 T細胞又はその前駆細胞に強力な分化誘導を生じさせて増殖を促進させるこ とができ、従って、ケモカイン受容体、特に CCR7を高発現してリンパ節に移動可能と なった細胞傷害性 T細胞を短期間で簡単に増加させることができ、而して、種々の腫 瘍細胞、ウィルス感染細胞等に対して非特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害 性 T細胞を得ることができる。また、第一の態様の医薬組成物を用いることによって得 られる細胞傷害性 T細胞は、正常細胞と腫瘍細胞等との分別を他の免疫細胞よりも 正確に行い得る。カロえて、第一の態様の医薬組成物を用いて得られた細胞傷害性 T 細胞を当該医薬組成物により再度刺激することで、多量のパーフォリン及び CCR7を 有していると共に、種々の腫瘍細胞、ウィルス感染細胞等に対して強力かつ非特異 的な細胞傷害活性を示す細胞傷害性 T細胞を得ることができる。このような効果を奏 し得る第一の態様の医薬組成物は、悪性腫瘍、ウィルス感染症等の疾患'病態の治 療に関して直接的（生体へのァゴニスト投与等）に又は間接的 (細胞傷害性 T細胞の 製造等）に利用され得る。斯カゝる効果を奏し得る第一の態様の医薬組成物は、本発 明者が抗 4C8抗体等の CD52ァゴ-ストの細胞傷害性 T細胞又はその前駆細胞に 対する効能に関して鋭意検討し、 CD3ァゴ-スト及び CD52ァゴ-ストにより CD3分 子及び CD52分子を介して細胞傷害性 T細胞又はその前駆細胞に刺激 (共刺激)を 与えて活性化させた場合に、当該活性ィ匕によって得られた細胞傷害性 T細胞又はそ の前駆細胞が、ケモカイン受容体、特に CCR7を高発現していることを新たに見出し たと 、う結果に基づ 、て初めて構成し得るのである。
[0033] 本発明の第二の態様の医薬組成物では、第一の態様の医薬組成物において、 C
D52ァゴ-ストは、抗 4C8抗体又はそのフラグメントを有して!/、る。
[0034] 本発明の第三の態様の医薬組成物では、第一又は第二の態様の医薬組成物にお いて、 CD52ァゴニストは、キャンパス— 1H又はそのフラグメントを有している。 [0035] 第二又は第三の態様の医薬組成物によれば、上述の構成を具備しているために、 抗 4C8抗体若しくはそのフラグメント又はキャンパス 1H若しくはそのフラグメントによ り細胞傷害性 T細胞又はその前駆細胞に副刺激を与えることで、多くの細胞傷害性 T細胞にケモカイン受容体、特に CCR7を発現させることができ、特に、抗 4C8抗体 又はそのフラグメントにより細胞傷害性 T細胞又はその前駆細胞に副刺激を与えるこ とで、より多くの細胞傷害性 T細胞にケモカイン受容体、特に CCR7を発現させること ができる。
[0036] 本発明の第四の態様の医薬組成物では、第一から第三のいずれかの態様の医薬 糸且成物において、 CD52ァゴ-ストは、細胞傷害性 T細胞又はその前駆細胞の CD5 2分子の一の部位に結合する抗体又はそのフラグメントと、当該細胞傷害性 T細胞又 はその前駆細胞の CD52分子の他の部位に結合する他の抗体又はそのフラグメント とを有している。
[0037] 本発明の第五の態様の医薬組成物では、第四の態様の医薬組成物において、細 胞傷害性 T細胞又はその前駆細胞の CD52分子の一の部位に結合する抗体又はそ のフラグメントは、抗 4C8抗体又はそのフラグメントからなり、当該細胞傷害性 T細胞 又はその前駆細胞の CD52分子の他の部位に結合する他の抗体又はそのフラグメ ントは、キャンパス— 1H又はそのフラグメントからなる。
[0038] 第四又は第五の態様の医薬組成物によれば、上述の構成を具備しているために、 例えば、抗 4C8抗体又はそのフラグメントを CD52分子の一の部位に結合させ、加え て、キャンパス 1H又はそのフラグメントを CD52分子の他の部位に結合させること で、細胞傷害性 T細胞又はその前駆細胞を好適に活性ィ匕させ得る。
[0039] 本発明の第六の態様の医薬組成物では、第一から第五のいずれかの態様の医薬 糸且成物において、 CD3ァゴ-ストは、細胞傷害性 T細胞又はその前駆細胞の CD3 分子に結合する抗 CD3抗体又はそのフラグメントを有している。
[0040] 本発明の第七の態様の医薬組成物では、第一から第六のいずれかの態様の医薬 組成物において、 CD3ァゴ-スト及び CD52ァゴ-ストの少なくとも一方は、ヒト化抗 体及びヒト抗体の少なくとも一方を有して 、る。
[0041] 本発明の第八の態様の医薬組成物では、第七の態様の医薬組成物において、ヒト 化抗体は、マウスヒト化抗体又はラットヒトイ匕抗体キャンパス 1Hである。
[0042] 本発明の第九の態様の医薬組成物は、細胞傷害性 T細胞又はその前駆細胞に刺 激を与える CD52ァゴ-ストを有して 、る。
[0043] 第九の態様の医薬組成物によれば、上述の構成を具備しているために、 CD52ァ ゴニストにより CD52分子を介して細胞傷害性 T細胞又はその前駆細胞に副刺激を 与えることで、細胞傷害性 T細胞又はその前駆細胞に、細胞傷害性 T細胞又はその 前駆細胞の T細胞受容体に対する MHC— 1分子の結合等に基づいて CD3分子を 介する主刺激が与えられた場合に、細胞傷害性 T細胞又はその前駆細胞に強力な 活性ィ匕を生じさせることができ、このように活性化された細胞傷害性 T細胞又はその 前駆細胞の強力な分ィ匕誘導を生じさせて増殖を促進させることができ、ケモカイン受 容体、特に CCR7を高発現してリンパ節に移動可能となった細胞傷害性 T細胞を短 期間で簡単に増加させることができ、而して、種々の腫瘍細胞、ウィルス感染細胞等 に対して非特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性 T細胞を得ることができる。 斯カる効果を奏し得る第九の態様の医薬組成物は、本発明者が上述のように抗 4C8 抗体等の CD52ァゴ-ストの細胞傷害性 T細胞又はその前駆細胞に対する効能に 関して鋭意検討をして得られた結果に基づいて初めて構成し得るのである。
[0044] 本発明の第十の態様の医薬組成物では、第九の態様の医薬組成物において、 C D52ァゴ-ストは、抗 4C8抗体又はそのフラグメントを有して!/、る。
[0045] 本発明の第十一の態様の医薬組成物では、第九又は第十の態様の医薬組成物に おいて、 CD52ァゴニストは、キャンパス—1H又はそのフラグメントを有している 発明の効果
[0046] 本発明によれば、種々の腫瘍細胞、ウィルス感染細胞等に対して非特異的な細胞 傷害活性を有する細胞傷害性 T細胞を短期間で簡単に得ることのできる細胞活性ィ匕 方法及びこれを用いる細胞製造方法並びに医薬組成物を提供し得る。また、本発明 によれば、種々の腫瘍細胞、ウィルス感染細胞等に対して非特異的な細胞傷害活性 を有する細胞傷害性 τ細胞及びこれを含む医薬組成物を提供し得る。
発明を実施するための最良の形態
[0047] 次に、本発明の実施の形態の例について更に詳細に説明する。尚、本発明はこれ ら例に何等限定されな 、のである。
[0048] 本例の医薬組成物は、細胞傷害性 T細胞又は細胞傷害性 T細胞の前駆細胞（以 下、前駆細胞と称する）の CD3分子を介して当該細胞傷害性 T細胞又は前駆細胞 に刺激 (主刺激)を与える CD3ァゴニストと、細胞傷害性 T細胞又は前駆細胞の CD5 2分子を介して当該細胞傷害性 T細胞又は前駆細胞に刺激 (副刺激)を与える CD5 2ァゴ-ストとを有して 、る。
[0049] CD3ァゴ-スト及び CD52ァゴニストによる刺激 (共刺激）が与えられる細胞傷害性 T細胞又は前駆細胞は、本例では、少なくとも CD8分子、 CD3分子及び CD52分子 を有している。細胞傷害性 T細胞又は前駆細胞は、末梢血、リンパ節、胸腺、骨髄、 腫瘍、胸水、腹水又は臍帯血に存在可能な単核球からなり、好ましくは、末梢血に存 在可能な末梢血単核球力もなる。前駆細胞は、例えば、活性ィ匕前の CD8T細胞 (C D8+CD28— T細胞等を含む）によって具体化される。
[0050] 本例における CD3ァゴニストは、細胞傷害性 T細胞又は前駆細胞の表面に発現す る CD3分子に作用し、この CD3分子を介して当該細胞傷害性 T細胞又は前駆細胞 内にシグナルを伝達することによって主刺激を生じさせる物質力もなる。本例におけ る CD52ァゴニストは、細胞傷害性 T細胞又は前駆細胞の細胞表面に発現する CD5 2分子に作用し、この CD52分子を介して当該細胞傷害性 T細胞又は前駆細胞内に シグナルを伝達することによって副刺激を生じさせる物質力もなる。
[0051] CD3ァゴ-ストは、本例では、抗 CD3抗体を主たる有効成分として含有して 、る。
抗 CD3抗体は、細胞傷害性 T細胞又は前駆細胞の CD3分子に結合することによつ て当該細胞傷害性 T細胞又は前駆細胞に認識されるようになっている。ここで、 CD3 ァゴ-ストは、抗 CD3抗体に代えて又はカ卩えて、抗 CD3抗体と同様に CD3分子に 結合し、認識される抗 CD3抗体のフラグメントを有効成分として含有して 、てもよく、 斯カゝるフラグメントは、抗原認識部位を有して ヽる Fabフラグメントからなるのが好まし い。
[0052] 抗 CD3抗体は、ヒト化抗体 (マウスヒト化抗体、ラットヒト化抗体等を含む)又はヒト抗 体として構成されて 、てもよ 、。
[0053] CD3分子に対してァゴ-スティックである抗 CD3抗体は、例えば、 OKT3 (ATCC CRL— 8001)、 UCHT1 (B. D. Pharmingen)、 HIT3a (B. D. Pharmingen)に よって具体化される。
[0054] CD3ァゴ-ストは、上述の抗 CD3抗体にカ卩えて、 CD3分子に対する天然又は合 成のリガンドとなり得るあらゆる分子を含有していてもよぐ例えば、 T細胞抗原受容 体と CD3分子とからなる複合体の形成や CD3分子を介する細胞傷害性 T細胞又は 前駆細胞への信号伝達をもたらし得る種々の物質、特にァゴニスト作用を有する抗 体又はそのフラグメントを含有していてもよぐ斯カる抗体又はそのフラグメントは、例 えば、ヒト T細胞抗原受容体 Vbeta6. 7に対する抗体である OT145 (Posnett et al. , 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 83 : 7888— 92)によって具体ィ匕され てもよい。また、 CD3ァゴ-ストは、上述の抗 CD3抗体にカ卩えて、可溶性を有する M HC— 1分子としての HLA分子、 HLA分子及び抗原ペプチドを有するテトラマー分 子等の T細胞抗原受容体を認識してァゴニスト作用をもたらし得る物質を含有して!/ヽ てもよい。
[0055] CD52ァゴ-ストは、本例では、抗 CD52抗体の一つとしての抗 4C8抗体を主たる 有効成分として含有している。抗 4C8抗体は、本例では、細胞傷害性 T細胞又は前 駆細胞の CD52分子に結合することによって当該細胞傷害性 T細胞又は前駆細胞 に認識されるようになっている。ここで、 CD52ァゴ-ストは、抗 4C8抗体に代えて又 は加えて、抗 4C8抗体と同様に CD52分子に結合し、認識される抗 4C8抗体のフラ グメントを含有していてもよぐ斯カるフラグメントは、抗原認識部位を有している Fab フラグメントからなるのが好ましい。尚、抗 4C8抗体又はそのフラグメントにより副刺激 が与えられる細胞傷害性 T細胞又は前駆細胞には、抗腫瘍効果を有するインターフ ェロン γ (IFN- γ )や IL—2等のサイト力イン産生が強く誘導され得る。
[0056] 抗 4C8抗体のクラスは、 IgG3である。抗 4C8抗体は、ヒト化抗体（マウスヒトイ匕抗体 、ラットヒト化抗体等を含む)又はヒト抗体として構成されて 、てもよ 、。
[0057] ヒト化抗体は、例えば、ハイプリドーマ JM— 1により産生される抗 CD52抗体の可変 領域をヒト抗体のフレームワークに移植することによって得られる。
[0058] ヒト抗体は、例えば、再配列されて!、な 、ヒト抗体遺伝子を保持し、抗原の監査によ り当該抗原に特異的なヒト抗体を産生するマウス（例えば Tomizuka et al. , 2000 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 97 : 722)を使用することによって得られる。
[0059] CD52ァゴ-ストは、抗 4C8抗体に代えて又はカ卩えて、 CD52分子に結合する天然 又は合成のリガンド、換言すれば、 CD52分子を介してシグナルを誘導するあらゆる 分子又は抗原としての CD52分子に対する抗体を含有していてもよぐ斯かる分子又 は抗体は、 CD52分子のいずれの部位を認識するものであってもよぐ CD52分子を 介して細胞傷害性 T細胞又は前駆細胞にシグナルを伝達することができるものであ ればよい。 CD52ァゴ-ストは、例えば、抗 4C8抗体に代えて又は加えて、 CD52分 子に結合するキャンパス 1H (Campath-1H)又はそのフラグメントを有効成分とし て含有していてもよぐキャンパス 1Hのフラグメントは、抗原認識部位を有している F abフラグメントからなるのが好ましい。
[0060] キャンパス 1Hは、本例では、 CD52分子に結合するラットヒト化抗体キャンパス 1 H (ラットヒトイ匕抗体 Campath— 1H)を意味する。尚、キャンパス— 1Hは、例えば、 B 細胞リンパ腫患者の治療薬として、また末梢血リンパ球を除去する抗体として知られ ているが、本例では、細胞傷害性 T細胞又は前駆細胞に副刺激を与えるための抗体 の一つとして用いる。
[0061] CD52ァゴ-ストは、 CD52分子を発現している細胞と候補化合物を接触させて、 その相互作用又は CD52刺激応答を検出する CD52との相互作用を指標にしたスク リー-ングを行うことによって得られる。
[0062] CD52ァゴ-ストは、上述の抗 4C8抗体に加えて、 CD52分子に対する天然又は 合成のリガンドとなり得るあらゆる分子を含有して 、てもよ 、。抗 4C8抗体及びリガン ドとなり得る分子は、益山らの報告（Masuyama, J. et al. , 1999, J. Exp. Med. 189 : 979— 989 ; W099/12972号公報）【こ従!/、、ヒト T糸田胞を免疫した動物より得 られたモノクローナル抗体から T細胞の in vitro血管外遊走を抑制することを指標に 選別することによって得ることが可能である。
[0063] 抗 4C8抗体又は抗 4C8抗体以外の CD52分子に結合する抗体力 なる抗 CD52 抗体は、コラーゲンゲル上に単層培養したヒト臍帯静脈血管内皮細胞 (HUVEC)に ヒト T細胞を添加培養し、一定時間後、 HUVEC下に遊走した T細胞を抗原として用 いることによって取得することが可能である。 [0064] CD52ァゴ-ストに含有されて好適な抗体等は、抗 4C8抗体と同一ェピトープを認 識する抗体の選抜工程と、細胞傷害性 T細胞の分化'増殖誘導能を評価する工程と を組み合わせることによつても容易に得られる。
[0065] 本例の医薬組成物を用いて前駆細胞を活性ィ匕させる場合は、 CD3ァゴニストによ り前駆細胞の CD3分子を介して当該前駆細胞に主刺激を与え、 CD3ァゴ-ストによ る主刺激と共に、 CD52ァゴ-ストにより前駆細胞の CD52分子を介して当該前駆細 胞に副刺激を与える。 CD3ァゴニストによる細胞傷害性 T細胞又は前駆細胞への主 刺激は、細胞傷害性 T細胞又は前駆細胞の分化に関わる主たる刺激伝達経路を通 じてなされる。 CD3ァゴニストによる主刺激は、細胞傷害性 T細胞又は前駆細胞の分 化を促進すると!ヽぅ反応を惹起する。 CD52ァゴニストによる細胞傷害性 T細胞又は 前駆細胞への副刺激は、主たる刺激伝達経路とは他の刺激伝達経路を通じてなさ れる。 CD52ァゴ-ストは、 CD3ァゴ-ストによる主刺激と同時に又は主刺激の前若 しくは後に、細胞傷害性 T細胞又は前駆細胞に副刺激を与える。 CD3ァゴ-スト及 び CD52ァゴニストにより主刺激及び副刺激が与えられた前駆細胞は、これらの刺激 に基づいて誘導されて分化、増殖し、細胞傷害活性を有する細胞傷害性 T細胞とな る。斯カる細胞傷害性 T細胞は、後述の各実施例で示しているように、ケモカイン受 容体、特に CCR7を高発現していることから、臓器及び臓器に従属している各リンパ 節まで移動することができる程度の高 、走ィ匕性を有して 、ると共に腫瘍細胞、ウィル ス感染細胞等に対する高 、殺傷能力を有して 、る。
[0066] また、本例の医薬組成物を用いてナイーブ T細胞又はメモリー T細胞力もなる細胞 傷害性 T細胞を活性化させる場合も、前駆細胞を活性化させる場合と同様に、細胞 傷害性 T細胞に主刺激及び副刺激を与える。主刺激及び副刺激が与えられた細胞 傷害性 T細胞は、これらの刺激に基づいて分化誘導して増殖する。ここで、本例の医 薬組成物を用いて活性ィ匕されて増殖した細胞が CD3ァゴ-スト及び抗 4C8抗体若 しくは抗 4C8抗体のフラグメントを有する CD52ァゴニストによる刺激を受けて増殖し た細胞傷害性 T細胞である場合には、多量のパーフォリン及び CCR7を有して 、る 細胞傷害性 T細胞を得ることができる。多量のパーフォリン及び CCR7を有して 、る 細胞傷害性 T細胞は、 CCR7リガンドに対する高い走化性及び腫瘍細胞、ウィルス 感染細胞等に対するより高い殺傷能力を示し得る。
[0067] 本例の医薬組成物は、生体内に経口投与される緩衝水剤、カプセル剤、顆粒剤、 散剤、シロップ剤等カゝらなる薬剤に含有されて用いられてもよぐ皮下注射、筋肉注 射、静脈注射等により生体内に非経口投与される注射剤、点滴剤、座剤等からなる 薬剤に含有されて用いられてもよぐ生体内に投与される医薬組成物は、凍結乾燥さ れていてもよぐ治療効果上許容される担体、 pH緩衝剤、安定化剤、賦形等の種々 の添加物と共に薬剤に含有されて用いられてもよい。ここで、医薬組成物を含有する 薬剤は、生理学的に許容され得る希釈剤又はキャリアを更に含有しているのが好ま しぐ斯カるキャリアは、例えば、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝 生理食塩水グルコース液、緩衝生理食塩水又はこれらを適宜組み合わせたものによ つて具体ィ匕されてもよい。また、医薬組成物は、患者又は患者以外の人力も採取した 細胞傷害性 T細胞、前駆細胞等の免疫細胞、特に T細胞やこれらの細胞を含む末 梢血、リンパ球、リンパ節細胞、胸腺細胞、臍帯血、腫瘍組織等に対して生体外で用 いられてもよぐこの場合には、生体外で活性化されて分化し、増殖し又は機能増強 した細胞傷害性 T細胞は、自家又は他家の生体内に移入される。
[0068] 医薬組成物の投与法及び投与量は、前臨床試験や臨床試験の過程との関連にお いて適宜決定される。医薬組成物を経口投与する場合には、投与量は、通常、成人 に対して 1日当たり約 0. Olmgから lOOOmgであり、斯カる経口投与を 1回又は数回 に分けて行う。また、医薬組成物を非経口投与する場合には、投与量は、通常、成 人に対して 1回当たり約 0. Olmgから lOOOmgである。尚、経口投与又は非経口投 与による医薬組成物の投与量は、年齢、体重及び病気の症状に応じて決定される。
[0069] また、医薬糸且成物は、基礎研究の場において開発された実験系をほぼそのまま治 療の場にぉ 、て再現するものであるとも!/ヽえる!/、わゆるエタスビボ（ex vivo)の方法 に用いられてもよい。エタスビボの方法は、生体外で細胞傷害性 T細胞又は前駆細 胞を活性化させることとなることから、医薬組成物の生体内への投与が体内吸収、代 謝、または未知の因子による干渉作用等により期待した程度の治療効果を奏さない 場合があり得ることに鑑みれば、比較的実用化におけるリスクの低い方法と考えられ る。 [0070] 尚、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、ハイプリドーマ JM— 1 (独立行 政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに 2001年 9月 26日付けで受託 番号 FERMBP-7757で寄託）により作られる抗 4C8抗体を競合試薬として用いて、 被検抗体による T細胞染色が抑制されること、換言すれば、ハイプリドーマ JM— 1によ り産生される抗 CD52抗体と同一ェピトープを認識することを指標として組み合わせ ることにより容易に取得することが可能である。
[0071] 本例の医薬組成物により活性ィ匕される細胞傷害性 T細胞は、 IL 2存在下で更に 容易に増殖する。 IL - 2存在下で増殖した細胞傷害性 T細胞は、抗 4C8抗体により 副刺激を再度与えられることによってより多くのパーフォリンを誘導し、腫瘍細胞、ウイ ルス感染細胞等に対する殺傷能力がより高められる。尚、細胞傷害性 T細胞に対す る抗 4C8抗体又はそのフラグメントによる再度の副刺激は、 CD3ァゴ-ストによる主 刺激と共に与えるのが好まし 、。
[0072] 以上のような医薬組成物によれば、 CD3ァゴ-スト及び CD52ァゴ-ストを有してい るために、 CD3ァゴ-スト及び CD52ァゴ-ストにより CD3分子及び CD52分子を介 して細胞傷害性 T細胞又はその前駆細胞に主刺激及び副刺激を与えることで、細胞 傷害性 T細胞又はその前駆細胞に強力な活性ィ匕を生じさせることができ、このように 活性化された細胞傷害性 T細胞又はその前駆細胞に強力な分化誘導を生じさせて 増殖を促進させることができ、従って、ケモカイン受容体、特に CCR7を高発現してリ ンパ節に移動可能となった細胞傷害性 T細胞を短期間で簡単に増加させることがで き、而して、種々の腫瘍細胞、ウィルス感染細胞等に対して非特異的な細胞傷害活 性を有する細胞傷害性 T細胞を得ることができる。また、本例の医薬組成物を用いる ことによって得られる細胞傷害性 T細胞は、正常細胞と腫瘍細胞等との分別を他の 免疫細胞よりも正確に行い得る。力 tlえて、本例の医薬組成物を用いて得られた細胞 傷害性 T細胞を当該医薬組成物により再度刺激することで、多量のパーフォリン及び CCR7を有していると共に、種々の腫瘍細胞、ウィルス感染細胞等に対して強力か つ非特異的な細胞傷害活性を示す細胞傷害性 T細胞を得ることができる。更に、 CD 52ァゴ-ストが抗 4C8抗体若しくはそのフラグメント又はキャンパス 1H若しくはその フラグメントを有して ヽる場合には、抗 4C8抗体若しくはそのフラグメント又はキャンパ スー 1H若しくはそのフラグメントにより細胞傷害性 T細胞又はその前駆細胞に副刺激 を与えることで、多くの細胞傷害性 Τ細胞にケモカイン受容体、特に CCR7を発現さ せることができ、特に、抗 4C8抗体又はそのフラグメントにより細胞傷害性 Τ細胞又は その前駆細胞に副刺激を与えることで、より多くの細胞傷害性 Τ細胞にケモカイン受 容体、特に CCR7を発現させることができる。更にまた、 CD52ァゴ-ストが抗 4C8抗 体若しくはそのフラグメント及びキャンノ ス 1H若しくはそのフラグメントを有して 、る 場合には、例えば、抗 4C8抗体又はそのフラグメントを CD52分子の一の部位に結 合させ、キャンパス 1H又はそのフラグメントを当該 CD52分子の他の部位に結合さ せることで、細胞傷害性 Τ細胞又はその前駆細胞を好適に活性ィ匕させ得る。本例の 医薬組成物は、悪性腫瘍、ウィルス感染症等の疾患，病態の治療に関して直接的（ 生体へのァゴニスト投与等）に又は間接的 (細胞傷害性 Τ細胞の製造等）に利用され 得る。斯カゝる効果を奏し得る本例の医薬組成物は、本発明者が抗 4C8抗体等の CD 52ァゴニストの細胞傷害性 T細胞又はその前駆細胞に対する効能に関して鋭意検 討し、 CD3ァゴ-スト及び CD52ァゴ-ストにより CD3分子及び CD52分子を介して 細胞傷害性 T細胞又はその前駆細胞に刺激 (共刺激)を与えて活性化させた場合に 、当該活性化によって得られた細胞傷害性 T細胞又はその前駆細胞が、ケモカイン 受容体、特に CCR7を高発現して 、ることを新たに見出したと!、う結果に基づ 、て初 めて構成し得るのである。
本例の他の医薬組成物は、抗 4C8抗体又はそのフラグメントを有している CD52ァ ゴニストを主たる有効成分として含有している。斯かる医薬組成物によれば、例えば、 CD52ァゴニストにより CD52分子を介して細胞傷害性 T細胞又はその前駆細胞に 副刺激を与えることで、細胞傷害性 T細胞又はその前駆細胞に、細胞傷害性 T細胞 又はその前駆細胞の T細胞受容体に対する MHC— 1分子の結合等に基づいて CD 3分子を介する主刺激が与えられた場合に、細胞傷害性 T細胞又はその前駆細胞に 強力な活性ィ匕を生じさせることができ、このように活性化された細胞傷害性 T細胞又 はその前駆細胞の強力な分ィ匕誘導を生じさせて増殖を促進させることができ、ケモカ イン受容体、特に CCR7を高発現してリンパ節に移動可能となった細胞傷害性 T細 胞を短期間で簡単に増カロさせることができ、而して、種々の腫瘍細胞、ウィルス感染 細胞等に対して非特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性 T細胞を得ることがで きる。
実施例 1
[0074] 実施例 1では、 CD52ァゴニストによる副刺激により誘導される細胞傷害性 Τ細胞の CCR7及びパーフォリンの発現に関する試験を行う。
[0075] まず、 Ficoll— Paque Plus (Amersham Pharmacia)を用いた密度勾配遠心法 により健常人の末梢血力 単核球を分離し、分離した単核球をナイロンウールカラム に通し、素通り分画を採取して T細胞を得た。次に、 MACS CD8+ T cell Isola tion Kit (Milteny Biotec)を用いたネガティブセレクションにより T細胞から CD8 分子を有している CD8T細胞を単離した。また、抗 CD3抗体及び抗 4C8抗体若しく はキャンパス— 1H (Alemtuzumab)のプレートへの固相化は、 48穴プレート（Costa r)の各穴にリン酸緩衝液 (PBS)で lOOngZmlに希釈した抗 CD3抗体（ORTHOC LONE OKT3, Ortho Biotec)を 330 1添カ卩し、 4°Cで 24時間処理し、処理後、 抗 CD3抗体を各穴から取り出し、 PBSで 5 /z gZmlに調整した抗 4C8抗体又はキヤ ンパス 1H (CAMPATH, Berlex)を 330 μ 1加えて、 4°Cで 24時間静置して行った
[0076] 次に、単離した CD8T細胞を RPMI1640培地（10% FCS + 15mM HEPES + 1% penicillin+ 1% streptomycin)に 1 X 106Zmlの濃度で浮遊させ、抗 CD3 抗体及び抗 4C8抗体若しくはキャンパス 1Hを処理した 48穴プレートの各穴に 0. 5 力も 1 X 106個添加した。 CO培養器を用いて 37°Cで 3日力も 4日間培養した後、 1
2
X 106Zmlに調整して別の培養容器に移し、 IL 2(20UZml)を添加して更に培養 を続けた。培養液は隔日ごとに半分ずつ交換し、交換する毎に IL 2(20UZml)を 添加した。培養開始から 14日経過した後に、 T細胞を回収、洗浄した。回収した T細 胞は、 99%以上が CD8陽性、 TCR a β陽性であった。
[0077] CD8T細胞に一回目の副刺激を与えた後、 CD52分子を介して CD8T細胞に二 回目の副刺激を与えた。まず、 PBSで lOOngZmlに希釈した抗 CD3抗体 2mlを 24 時間処理し、処理後、抗 CD52抗体 (抗 4C8抗体（5 /z gZml)又はキャンパス 1H ( 50 μ g/ml) ) 2mlを 24時間処理して抗 CD3抗体及び抗 4C8抗体が固相化された 6 穴プレートに、前記回収した T細胞を 1 X 107個加えて CO培養器で培養した。培養
2
開始から 3日力も 4日経過した後に CD8T細胞を回収し、斯カる CD8T細胞を実験に 供した。
[0078] 比較対象となる CD3— LAK細胞（CD3— LAK)は、次のような一般的な方法によつ て得た。抗 CD3抗体（5 gZml)で固相化した 48穴プレートの各穴に、末梢血単核 球のナイロンウールカラム素通り分画である T細胞を 1 X 106個播種した。播種してか ら 24時間経過後及び 72時間経過後に IL-2 (100UZml)を添加し、計 5日間培養 した。次に、プレートを移して隔日毎に IL 2 (20U/ml)を加えながら細胞を約 10日 間培養し、増殖させた。
[0079] CD52分子が副刺激処理された 3 X 105個の CD8T細胞（以下、 CD52— CTLと称 する）を培養液 50 μ 1〖こ浮遊させた後、 FITC標識抗 CCR7抗体 (Dako社)を 3 μ 1カロ えて、氷上及び暗所で 30分静置した。静置後、 0. 1%ゥシ血清アルブミン添加 PBS で二回洗浄して、 l%paraformaldehydeで固定し、 FACScanで生細胞の細胞表 面 CCR7 (陽性)の発現を検討した。一方、 3 X 105個の CD3T-LAK細胞を培養液 50 μ 1に浮遊させた後、 FITC標識抗 CCR7抗体 (Dako社)を 3 μ 1加えて、氷上及び 暗所で 30分静置した。静置後、 0. 1%ゥシ血清アルブミン添加 PBSで二回洗浄して 、 l%paraformaldehydeで固定し、 FACScanで生細胞の細胞表面 CCR7の発現 を検討した。各細胞内のパーフォリンは、 CytofixZCytoperm Kit (Pharmingen )で細胞を処理することにより FITC標識抗 perforin抗体 (Ancell)で染色した。
[0080] 以上のように試験を行った結果、図 1に示すように、前 CD8T細胞の CCR7の約 18 %が陽性であるのに対して、 CD3— LAK細胞の CCR7の約 5%、キャンパス 1 Hに 刺激された CD52— CTLの CCR7の約 70%及び抗 4C8抗体に刺激された CD52— CTLの CCR7の約 80%が陽性であった。抗 4C8抗体又はキャンパス 1 Hが用いら れて副刺激処理された CD52— CTLの CCR7+発現（％)は、刺激処理前の CD8T 細胞（前 CD8T細胞）の CCR7+発現（％)を大きく上回っており、このことから、 CD5 2— CTLの大多数に CCR7+が発現して!/、ることが示唆されて!、る。 CD3— LAK細胞 の CCR7+発現（％)は、前 CD8T細胞の CCR7+発現（％)を下回っていることから、 CD3-LAK細胞力も CCR7+が消失してしまっていることが示唆されている。また、 C D52— CTLの細胞内のパーフォリンの平均蛍光強度は、図 2に示すように、 2回目の 刺激前の CD52— CTLよりも 2回目の刺激後の CD52— CTLの方で著しく増しており 、このこと力も CD52— CTLの細胞内のパーフォリンは、 2回目の刺激後に著しく増加 することが示唆されている。
実施例 2
[0081] 実施例 2では、 CCR7リガンドに対する走ィ匕性 (ケモタキシス)反応に関する試験を 行い、 CCR7が高発現した CD52— CTLが CCR7リガンドに対して反応して、走化性 が亢進して！/、るか否かを検討する。
[0082] ケモタキシスアツセィは、 24穴プレート用 Transwel S ^u m pore, polycarbonat e, Costar社）を用いて行った。 Transwellの下室に CCR7リガンドであるケモカイン CCL21 (R&D社）を 10ngZml、 lOOngZml及び lOOOngZmlの濃度で夫々添 カロした。陰性コントロールとしては、 CD52— CTL及び CD3— LAKには発現しない C CR6のリガンドである CCL20 (R&D社）を用いた。上室には CD52— CTL又は CD3 LAKを 5 X 105個加えて 37°Cで培養した。培養開始から 90分経過した後に、下室 に移動した細胞を数えた。ケモタキシス活性（％)は、次の数式（1)を用いて求めた。
[0083] (数 1) ケモタキシス活性 =下室移動細胞数 Z上室添加細胞数 · · ·（1)
[0084] 以上のように試験を行った結果、図 3の（b)〖こ示すように、 CD52— CTLの CCR7に 対する CCL21のケモタキシス活性（％)は、ケモカイン濃度 lOOngZmlから lOOOng /mlで著しく上昇している一方、 CD52— CTLの CCR6に対する CCL20のケモタキ シス活性（％)の上昇は特に見受けられな力つた。また、図 3の（a)に示すように、 CD 3— LAKの CCR7に対する CCL21のケモカイン濃度に対するケモタキシス活性（％) には、 CD52— CTLの CCR7に対する CCL21のケモタキシス活性（％)を上回るよう な上昇反応は一切みられなかった。従って、 CD52— CTLは、 CCR7及び CCL21の 走ィ匕性反応により活発に移動することが見受けられ、斯カる CD52— CTLが生体投 与された際には、当該 CD52— CTLの大多数は、リンパ節に到達し得ることが示唆さ れている。
実施例 3
[0085] 実施例 3では、癌細胞及び正常細胞に対する CD52— CTLの細胞傷害活性に関 する試験を行う。
[0086] 細胞傷害活性の分析には、標準的な 4時間の51 Cr放出アツセィ法を用いた。標的 細胞を51 Cr 100 Ciで標識した後に洗浄し、洗浄した標的細胞を 96穴丸底プレート (ICN)の各穴に 1 X 104個入れ、これに 6から 50の E/T比（エフェクター細胞/標 的細胞比）で CD52— CTLを加えた。 CO培養器で 37°Cで 4時間培養し、培養後に
2
上清 100 1に放出された51 Cr放射能活性をガンマカウンターで測定した。細胞傷害 活性（％)は、次の数式（2)を用いて求めた。
[0087] (数 2) 細胞傷害活性 = (試験放出-自然放出) Z (最大放出-自然放出） X 100· · · (2)
[0088] 標的細胞の51 Crの自然放出は、常に最大放出の 20%以下であった。
[0089] 標的腫瘍細胞には、 KatoIII (胃癌）、 TE11 (食道癌)及び Daudi (バーキットリンパ 腫)を用い、正常細胞コントロールとして Con— A(10 gZml)で 3日間刺激したヒト 末梢血単核球を用いた。
[0090] 以上のように試験を行った結果、図 4に示すように、 CD52— CTLは、 KatoIII, TE 11に対しては、 CD52— CTLZ標的細胞比 (EZT比）に依存する細胞傷害活性（％ )を示唆した。また、 CD52— CTLは、 Daudiに対しては、 CD52— CTLZ標的細胞 比に依存しない細胞傷害活性（％)を示唆した。尚、 CD52— CTLは、正常細胞とし ての ConA— Blasts (Con-A)に対しては、細胞傷害活性（％)を全く示さなカゝつた。 実施例 4
[0091] 実施例 4では、 24時間培養した CD52— CTLの腫瘍細胞に対する細胞傷害活性 に関する試験を行う。
[0092] 腫瘍細胞株には、 KatoIII (胃癌）、 TE11 (食道癌）、 TE2 (食道癌）、 WiDr—TC ( 大腸癌）、 SK-MEL-28 (悪性黒色腫)、 LCSC # 1 (肺腺癌）、 LU65 (肺小細胞癌 )を用いた。標的腫瘍細胞 1 X lOVml (SK MEL—28のみ0. 5 X lO ml)を 96 穴平底プレートの各穴に 100 1ずつ播種し、 37°Cで 3時間、 5%CO培養器で、腫
2
瘍細胞が 96穴平底プレートに十分に接着するまで培養した。これ〖こ CD52— CTLを 所定の EZT比で 100 1加えて、 37°Cで 24時間、 5%CO培養器で培養した。培養
2
後、生細胞の代謝活性を反映するフオルマザン変換能を調べて、 CD52— CTLの細 胞傷害活性を算出した。斯カる細胞傷害活性 (％)は、 WST-1 (ロシュ'ダイァグノス テイツタス）を培養液の 10%量加えて 2時間培養し、 ELISAプレートリーダーで A49 2nmZA620nmの 2波長で測定し、次の数式（3)を用いて求めた。尚、 TSは標的 細胞のみを意味し、 BGOは培養液のみのバックグラウンドを意味し、 Eは標的細胞及 び CD52— CTL (エフェクター細胞）を意味し、 BGECは、エフェクター細胞のみのバ ックグラウンドを意味する。
[0093] (数 3) 細胞傷害活性 =〔{ (TS-BGO)-(E-BGEC) }Z (TS BGO)〕 X 100· · · (3)
[0094] 以上のように試験を行った結果、図 5に示すように、抗 4C8抗体による CD52分子 を介する副刺激により誘導される CD52— CTLの EZT比に依存する細胞傷害活性（ %)は、 6種類の腫瘍細胞の夫々に対して強力であり、また、これらの腫瘍細胞に対 して非特異的な傾向を示して 、る。
実施例 5
[0095] 実施例 5では、 CD52— CTLに対する IL 2の増強作用に関する試験を行う。
[0096] CD52—CTLの SK— MEL—28に対する細胞傷害活性を、 2. 5、 5、 10及び 20の EZT比で 24時間培養した後、夫々測定した。このように測定した結果、図 6に示す ように、 IL-2 (100UZml)添カ卩により EZT比に依存する細胞傷害活性（％)が高ま ることが示された。
実施例 6
[0097] 実施例 6では、抗 4C8抗体により副刺激が与えられた CD52— CTLの細胞傷害活 性（％)とキャンパス 1Hにより副刺激が与えられた CD52— CTLの細胞傷害活性 ( %)とを比較する試験を行う。
[0098] 抗 4C8抗体により副刺激が与えられた CD52— CTLの腫瘍細胞に対する細胞傷害 活性とキャンノ ス 1Hにより副刺激が与えられた CD52— CTLの腫瘍細胞に対する 細胞傷害活性とを、 5、 10、 20、 40の EZT比で夫々測定した。このように測定した 結果、図 7に示すように、抗 4C8抗体により副刺激が与えられた CD52— CTLの EZ T比に依存する細胞傷害活性（％)は、キャンパス 1Hにより副刺激が与えられた C D52— CTLの EZT比に依存する細胞傷害活性 (%)よりも高 、ことが示唆された。尚 、キャンノ ス 1Hにより副刺激が与えられた CD52— CTLの EZT比に依存する細胞 傷害活性 (％)は、抗 4C8抗体により副刺激が与えられた CD52— CTLよりも若干劣 つている力 斯カるキャンパス 1Hにより副刺激が与えられた CD52— CTLを腫瘍細 胞等の治療に用いても十分な抗腫瘍効果を奏し得ると考えられる。
実施例 7
[0099] 実施例 7では、単層培養 LCSC # 1 (肺腺癌、その他の癌細胞を含め東北大学力口 齢医学研究所医用細胞資源センターより入手）に対する CD3— LAK細胞と CD52— CTL細胞との細胞傷害活性の比較に関する試験を行う。
[0100] LCSC # 1は、 10%FCS添加 RPMI1640で 24穴プレート（コ一-ング）に単層に なるまで培養した。 T細胞は、実施例 1と同様に、健常人から末梢血単核細胞 (PBM C)を分離し、さらにナイロンウールカラムを通して得た。このようにして得た T細胞の 抗体による刺激には、 T細胞の刺激に有効な固相化抗体濃度に幅があるため（抗 C D3抗体 lOOngZml 5 μ g/ml,抗 4C8抗体及びキャンパス—1H 1—50 μ gZ ml)、実施例 1とは異なる抗体量を用いた。
[0101] CD3— LAK細胞は、抗 CD3抗体（lOOngZml)を固相化した 48穴プレートを用い て 3日間刺激して誘導し、その後 IL 2 (lOOUZml)の添加を 3日ごとに繰り返し、大 きなプレートに代えながら 2週間培養増殖させた。
[0102] 1回刺激の CD52— CTL細胞は、抗 CD3抗体（lOOngZml)と抗 4C8抗体（5 μ g /ml)とを固相化したプレートを用いて、 T細胞に 1回目の CD52副刺激を 3日間与 え、その後 IL-2 (100UZml)を 3日ごとにカ卩えて、大きなプレートに代えながら 2週 間培養増殖させることによって得た。 2回刺激の CD52— CTL細胞は、上述のように 1 回目の CD52副刺激が与えられた T細胞のうちの一部の T細胞に対して、さらに 2回 目の CD52副刺激を 3日間与えて培養することによって得た。斯カる培養法では、 Τ 細胞は 100倍から 1000倍に増殖した。また、斯カる培養法では、 CD8+T細胞が 80 %前後を占めた。
[0103] 1 X 106/mlの細胞数の CD3 LAK細胞、 1 X 106/mlの細胞数の 1回刺激の C D52— CTL細胞及び 1 X 106Zmlの細胞数の 2回刺激の CD52— CTL細胞の夫々 が浮遊する各 10%FCS添加 RPMI1640を、 LCSC # 1が単層化された 24穴プレ 一トの各穴に 2mlずつ添カ卩し、 IL— 2(100UZml)存在下で共培養した。共培養 7日 目に、 LCSC # 1をトリプシン処理で分離した後にトリパンブルー染色で直接顕鏡し て当該 LCSC # 1の生細胞数を数えた。実験はトリプリケートで行った。
[0104] 実施例 7における試験では、図 8に示すような結果が得られた。斯かる結果によれ ば、 CD3— LAK細胞による LCSC # 1に対する細胞傷害活性は 8%であり、 1回刺激 の CD52— CTL細胞による LCSC # 1に対する細胞傷害活性は 38%であり、 2回刺 激の CD52— CTL細胞〖こよる LCSC # 1に対する細胞傷害活性は 80%であった。
[0105] 実施例 7における試験の結果によれば、 1回刺激の CD52— CTL細胞の細胞傷害 活性は、 CD3— LAK細胞の細胞傷害活性と比較して大幅に上昇して ヽることが認め られ、また、 2回刺激の CD52— CTL細胞の細胞傷害活性は、 CD3— LAK細胞の細 胞傷害活性と比較して更に大幅に上昇していることが認められる。また、実施例 7に おける試験の結果によれば、 CD52— CTL細胞は、癌細胞 LCSC # 1に対して CD3 LAK細胞よりも強 、殺傷効果を有して!/、ることが認められる。
実施例 8
[0106] 実施例 8では、 LCSC # 1の SCIDマウス腹腔内投与による致死効果に対する CD5
2— CTL細胞の延命効果に関する試験を行う。
[0107] ここでは、 LCSC # 1を腹腔内に実際に移入した担癌動物を使って、 CD52— CTL 細胞の投与が CD3— LAK細胞に比べて高い延命効果を示すカゝ否かを調べた。
[0108] LCSC # 1は、実施例 7と同様に培養されて単層化されたところで短時間トリプシン 処理し、トリプシン処理による分離後に PBSで洗浄 ·浮遊させたものを用いた。 T細胞 培養液は、実際の臨床使用を考慮して、 AIM-V (インビトロジ ン）に自己血漿 5% を加えたものを用いた。
[0109] T細胞は、実施例 7と同様にして健常人力 得た。 CD3— LAK細胞は、抗 CD3抗 体（lOOngZml)を固相化した 48穴プレートを用いて 3日間刺激して誘導し、その後 IL-2 (100UZml)の添カ卩を 3日ごとに繰り返し、大きなプレートに代えながら 2週間 培養増殖させたものを用いた。 CD52— CTL細胞は、 T細胞を、抗 CD3抗体（100η g/ml)と抗 4C8抗体の代わりのキャンパス—1H (20 μ g/ml)とを固相化したプレー トを用いて 1回目の刺激を 3日間行い、 IL-2 (100UZml)を 3日ごとにカ卩えて、大き なプレートに代えながら 2週間培養増殖させ、増殖後さらに 2回目の同刺激を 3日間 行い、最後の 24時間は IL 2 (100UZml)存在下で行ったものを用いた。このように して得られた CD3— LAK細胞及び CD52— CTL細胞の夫々は、後述のようにマウス 腹腔内に 4 X 107個ずつ投与された。
[0110] LCSC # 1の投与前日、非特異的抗腫瘍活性のある NK細胞の活性を抑えるため 、 SCIDマウス（7週齢、メス、 日本クレアより入手）に抗ァシァロ GM1抗体（和光純薬 、 100 gZマウス）を腹腔内に投与した。 SCIDマウスを 3匹ずつ 3群 (A群、 B群及 び C群）に分けた。
[0111] A群は、 LCSC # 1 (1 X 107個/マウス）のみを腹腔内移入した 3匹の SCIDマウス によって構成した。 B群は、 LCSC # 1 (1 X 107個 Zマウス）を腹腔内に移入し、当該 移入後から 3日目及び 5日目に CD3 LAK細胞 (4 X 107個 Zマウス）を腹腔内に投 与した 3匹の SCIDマウスによって構成した。 C群は、 LCSC # 1 (1 X 107個 Zマウス） を腹腔内に移入し、当該移入後から 3日目及び 5日目に CD52-CTL (4 X 107個 Z マウス）を腹腔内に投与した 3匹の SCIDマウスによって構成した。尚、 B群及び C群 の SCIDマウスの夫々の腰部皮下には、 CD3— LAK細胞及び CD52— CTL細胞の 夫々の腹腔内投与と同時にヒ HL— 2 (5000U)が注射された。コントロールとして A群 にも同量のヒト IL 2 (5000U)が注射された。
[0112] 実施例 8における試験では、図 9に示すような結果が得られた。斯かる結果によれ ば、 LCSC # 1のみを単独投与した A群の SCIDマウスは、癌細胞が腹腔内多臓器 に播種した癌性腹膜炎を呈して 40日目に最後の 1匹が死亡しており、また、 A群の S CIDマウスの平均生存日数は 31. 3日であった。また、斯カる結果によれば、 B群及 び C群の SCIDマウスは最終的にはすべて死亡しており、 B群の SCIDマウスの平均 生存日数は 38. 3日であり、 C群の SCIDマウスの平均生存日数は 47. 6日であった
[0113] 実施例 8における試験の結果によれば、 B群及び C群の SCIDマウスの平均生存日 数は、 A群の SCIDマウスの平均生存日数と比較すれば、夫々延長されたことが認め られる。また、斯カる結果によれば、 CD52— CTL細胞を投与した C群（p = 0. 025、 Logrank test)には、 A群と比較して、統計学的に有意な延命効果が認められるが 、 B群には、 A群と比較して、統計学的に有意な延命効果が認められず、また、 C群 には、 B群と比較しても統計学的に有意な延命効果が認められる (p = 0. 025、 Logr ank test)。
図面の簡単な説明
[0114] [図 1]実施例 1における試験結果に関する説明図である。
[図 2]実施例 1における試験結果に関する説明図である。
[図 3] (a)及び (b)は、実施例 2における試験結果に関する説明図である。
[図 4]実施例 3における試験結果に関する説明図である。
[図 5]実施例 4における試験結果に関する説明図である。
[図 6]実施例 5における試験結果に関する説明図である。
[図 7]実施例 6における試験結果に関する説明図である。
[図 8]実施例 7における試験結果に関する説明図である。
[図 9]実施例 8における試験結果に関する説明図である。

Claims

請求の範囲
[1] CD3ァゴ-スト及び CD52ァゴニストにより細胞傷害性 T細胞又はその前駆細胞に 刺激を与える細胞活性化方法。
[2] CD52ァゴ-ストは、抗 4C8抗体又はそのフラグメントを有して 、る請求項 1に記載 の細胞活性化方法。
[3] CD52ァゴ-ストは、キャンパス— 1H又はそのフラグメントを有している請求項 1又 は 2に記載の細胞活性ィ匕方法。
[4] CD52ァゴ-ストは、細胞傷害性 Τ細胞又はその前駆細胞の CD52分子の一の部 位に結合する抗体又はそのフラグメントと、当該細胞傷害性 Τ細胞又はその前駆細 胞の CD52分子の他の部位に結合する他の抗体又はそのフラグメントとを有している 請求項 1から 3のいずれか一項に記載の細胞活性ィ匕方法。
[5] 細胞傷害性 Τ細胞又はその前駆細胞の CD52分子の一の部位に結合する抗体又 はそのフラグメントは、抗 4C8抗体又はそのフラグメントからなり、当該細胞傷害性 Τ 細胞又はその前駆細胞の CD52分子の他の部位に結合する他の抗体又はそのフラ グメントは、キャンノ ス 1H又はそのフラグメントからなる請求項 4に記載の細胞活性 化方法。
[6] CD3ァゴ-ストは、細胞傷害性 Τ細胞又はその前駆細胞の CD3分子に結合する 抗 CD3抗体又はそのフラグメントを有して 、る請求項 1から 5の 、ずれか一項に記載 の細胞活性化方法。
[7] CD3ァゴ-スト及び CD52ァゴ-ストの少なくとも一方は、ヒト化抗体及びヒト抗体の 少なくとも一方を有している請求項 1から 6のいずれか一項に記載の細胞活性ィ匕方 法。
[8] ヒト化抗体は、マウスヒト化抗体又はラットヒトイ匕抗体キャンノ ス 1Hである請求項 7 に記載の細胞活性化方法。
[9] 生体外又は生体内で CD3ァゴニスト及び CD52ァゴ-ストにより細胞傷害性 Τ細胞 又はその前駆細胞に刺激を与える請求項 1から 8のいずれか一項に記載の細胞活 性化方法。
[10] CD3ァゴ-スト及び CD52ァゴ-ストにより末梢血、リンパ節、胸腺、骨髄、腫瘍、胸 水、腹水又は臍帯血に存在可能な細胞傷害性 T細胞又はその前駆細胞に刺激を与 える請求項 1から 9のいずれか一項に記載の細胞活性ィ匕方法。
[11] 請求項 1から 10のいずれか一項に記載の細胞活性ィ匕方法を用いて細胞傷害性 Τ 細胞を製造する細胞製造方法。
[12] 請求項 1から 10のいずれか一項に記載の細胞活性ィ匕方法によって得られた細胞 傷害性 Τ細胞。
[13] 請求項 12に記載の細胞傷害性 Τ細胞を含む医薬組成物。
[14] 細胞傷害性 Τ細胞又はその前駆細胞に刺激を与える CD3ァゴニスト及び CD52ァ ゴニストを有して 、る医薬組成物。
[15] CD52ァゴ-ストは、抗 4C8抗体又はそのフラグメントを有している請求項 14に記 載の医薬組成物。
[16] CD52ァゴ-ストは、キャンパス— 1H又はそのフラグメントを有している請求項 14又 は 15に記載の医薬組成物。
[17] CD52ァゴ-ストは、細胞傷害性 Τ細胞又はその前駆細胞の CD52分子の一の部 位に結合する抗体又はそのフラグメントと、当該細胞傷害性 Τ細胞又はその前駆細 胞の CD52分子の他の部位に結合する他の抗体又はそのフラグメントとを有している 請求項 14から 16のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[18] 細胞傷害性 Τ細胞又はその前駆細胞の CD52分子の一の部位に結合する抗体又 はそのフラグメントは、抗 4C8抗体又はそのフラグメントからなり、当該細胞傷害性 Τ 細胞又はその前駆細胞の CD52分子の他の部位に結合する他の抗体又はそのフラ グメントは、キャンノ ス 1H又はそのフラグメントからなる請求項 17に記載の医薬組 成物。
[19] CD3ァゴ-ストは、細胞傷害性 Τ細胞又はその前駆細胞の CD3分子に結合する 抗 CD3抗体又はそのフラグメントを有している請求項 14から 18のいずれか一項に記 載の医薬組成物。
[20] CD3ァゴ-スト及び CD52ァゴ-ストの少なくとも一方は、ヒト化抗体及びヒト抗体の 少なくとも一方を有している請求項 14から 19のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[21] ヒト化抗体は、マウスヒト化抗体又はラットヒトイ匕抗体キャンパス 1Hである請求項 2 0に記載の医薬組成物。
[22] 細胞傷害性 T細胞又はその前駆細胞に刺激を与える CD52ァゴニストを有して 、る 医薬組成物。
[23] CD52ァゴ-ストは、抗 4C8抗体又はそのフラグメントを有している請求項 22に記 載の医薬組成物。
[24] CD52ァゴ-ストは、キャンパス— 1H又はそのフラグメントを有している請求項 22又 は 23に記載の医薬組成物。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006340698A (ja) * 2005-06-10 2006-12-21 Cellex:Kk Ｎｋ細胞活性化方法、これを用いたｎｋ細胞増殖方法及び細胞製造方法並びにｎｋ細胞を含む単核球
JP2010239972A (ja) * 2010-07-22 2010-10-28 Cellex:Kk Ｎｋ細胞活性化方法、これを用いたｎｋ細胞増殖方法及び細胞製造方法並びにｎｋ細胞を含む単核球
JP2013143970A (ja) * 2013-05-01 2013-07-25 Cellex:Kk Ｎｋ細胞活性化方法、これを用いたｎｋ細胞増殖方法及び細胞製造方法並びにｎｋ細胞を含む単核球

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011001315A (ja) * 2009-06-19 2011-01-06 Cellex Corp 膵臓癌の免疫療法剤
SG11202100829SA (en) * 2018-08-10 2021-03-30 Univ Kyoto Method for producing cd3-positive cell

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ROWAN W. ET AL.: "Cross-linking of the CAMPATH-1 antigen (CD52) mediates growth inhibition in human B- and T-lymphoma cell lines, and subsequent emergence of CD52-deficient cells", IMMUNOLOGY, vol. 95, no. 3, 1998, pages 427 - 436, XP000942636 *
WALDMANN T.A. ET AL.: "Emerging therapies: spectrum of applications of monoclonal antibody therapy", HEMATOLOGY (AM- SOC. HEMATOL. EDUC. PROGRAM), 2000, pages 394 - 408, XP002984219 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006340698A (ja) * 2005-06-10 2006-12-21 Cellex:Kk Ｎｋ細胞活性化方法、これを用いたｎｋ細胞増殖方法及び細胞製造方法並びにｎｋ細胞を含む単核球
JP4645312B2 (ja) * 2005-06-10 2011-03-09 株式会社セレックス Ｎｋ細胞活性化方法、これを用いたｎｋ細胞増殖方法及び細胞製造方法並びにｎｋ細胞を含む単核球
JP2010239972A (ja) * 2010-07-22 2010-10-28 Cellex:Kk Ｎｋ細胞活性化方法、これを用いたｎｋ細胞増殖方法及び細胞製造方法並びにｎｋ細胞を含む単核球
JP2013143970A (ja) * 2013-05-01 2013-07-25 Cellex:Kk Ｎｋ細胞活性化方法、これを用いたｎｋ細胞増殖方法及び細胞製造方法並びにｎｋ細胞を含む単核球

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