CN116724060A - 调节SIRPα介导的信号传导的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开文本总体上涉及用于通过将膜磷酸酶特异性地顺式募集到信号调节蛋白α(SIRPα)分子的空间附近来调节细胞表面受体信号传导的组合物和方法。更具体地，本公开文本提供了新型多价蛋白结合分子，其特异性结合SIRPα并通过募集磷酸酶活性以使SIRPα的细胞内结构域去磷酸化来拮抗SIRPα介导的信号传导。还提供了可用于产生此类分子的组合物和方法，用于促进树突细胞成熟和用于产生疫苗的方法，以及用于预防和/或治疗与抑制通过SIRPα和/或CD47介导的信号转导相关的健康情况的方法。

Description

调节SIRPα介导的信号传导的组合物和方法
关于联邦政府资助研发的声明
本发明是根据由美国国立卫生研究院授予的合同号CA177684在政府支持下完成的。政府享有本发明的一定权利。
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年7月24日提交的美国临时专利申请序列号63/056,156的优先权，将其公开内容通过引用以其整体并入本文，包括任何附图。
序列表的并入
本申请包含序列表，其通过引用以其整体特此并入。所附的名称为“SequenceListing_078430-523001WO_ST25.txt”的序列表文本文件创建于2021年7月19日，并且为40KB。
技术领域
本公开文本总体上涉及免疫治疗领域，并且特别地涉及多价蛋白结合分子，所述多价蛋白结合分子被设计成特异性结合信号调节蛋白α(SIRPα)分子并且通过募集磷酸酶活性来拮抗SIRPα介导的信号传导。本公开文本还提供了可用于生产此类多价多肽的组合物和方法，用于促进树突细胞成熟和用于生产疫苗的方法。还提供了可用于预防和治疗与抑制通过SIRPα和/或CD47介导的信号转导相关的健康情况的组合物和方法。
背景技术
信号调节蛋白α(SIRPα)是先天免疫检查点受体，其主要在髓样细胞(包括单核细胞、巨噬细胞、树突细胞(DC)和嗜中性粒细胞)上表达。SIRPα在与其配体CD47相互作用时抑制先天免疫。CD47在正常组织上广泛表达，并且被几乎所有人肿瘤上调，以逃避巨噬细胞识别和程序性细胞清除。据报道，这种SIRPα/CD47相互作用负面地控制先天免疫细胞的效应子功能，例如宿主细胞吞噬作用。特别地，CD47通过SIRPα递送的抑制信号减少了FcγR依赖性抗体效应子功能，包括巨噬细胞和嗜中性粒细胞介导的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，限制了抗体依赖性先天免疫的诱导并促进对抗肿瘤抗体疗法的抗性。
近年来，靶向CD47-SIRPα途径代表了通过促进先天性和适应性免疫应答来增强抗癌免疫的新治疗方法。与普遍表达的CD47不同，SIRPα表达主要限于髓样细胞。因此，与靶向CD47的疗法相比，靶向SIRPα可导致不同的安全性和功效特征，从而可能降低有效剂量以及改善药代动力学和药效学。
目前，对于SIRPα的拮抗，最普遍的策略是通过使用例如针对SIRPα的ECD的拮抗性抗体来阻断SIRPα的细胞外结构域(ECD)之间的配体结合。在这种情况下，阻断分子(例如拮抗剂抗体)通过与天然配体竞争结合SIRPα的ECD而起作用。然而，据报道，有效的SIRPα拮抗性抗体的开发是具有挑战性的并且受到SIRPα的CD47结合结构域内的多态性的限制，这需要泛等位基因反应性抗SIRPα抗体用于不同患者群体的治疗干预。此外，据报道，这些阻断抗体在许多患者中无效，并且不能消除通过磷酸化机制发信号的SIRPα的基础细胞内信号传导活性(也称为静息细胞内信号传导活性)。这种不能消除基础信号传导活性经常限制ECD配体阻断策略的有效性。因此，需要新的方法以通过除ECD配体阻断机制以外的替代机制直接减少或消除SIRPα的细胞内信号传导，所述替代机制会同时减少或消除静息和配体激活的信号传导。
因此，仍然需要除了通过抗体或其他药剂直接阻断SIRPα-配体之外的替代方法，以补充癌症和其他免疫疾病的免疫治疗的现有治疗护理标准。
发明内容
本公开文本总体上涉及免疫治疗剂，例如多价多肽、多价抗体和包含它们的药物组合物，其用于治疗各种健康情况，例如与抑制由感兴趣的细胞表面受体介导的细胞信号传导相关的那些健康情况。特别地，如下文更详细描述的，本公开文本的一些实施方案提供了用于调节SIRPα/CD47途径介导的细胞信号传导的组合物和方法，其通过例如将膜磷酸酶特异性募集到SIRPα的空间附近来进行，例如，通过使用多价蛋白结合剂直接连接来募集。更特定地，本公开文本提供了新型多价蛋白结合分子，其特异性结合SIRPα并由此通过募集磷酸酶活性完全或部分拮抗SIRPα信号传导。该方法(称为“通过磷酸酶募集的受体抑制”(RIPR))先前描述于例如WO 2019/222547 A1中。在一些特定的实施方案中，本公开文本的多价蛋白结合分子是多价多肽。在一些实施方案中，所述多价多肽是多价抗体。本公开文本还提供了可用于生产此类多价多肽的组合物和方法，用于促进树突细胞成熟和用于生产疫苗的方法。还提供了用于预防和/或治疗与抑制通过SIRPα/CD47途径介导的信号转导相关的健康情况的组合物和方法。
在一方面，本文提供了多价多肽，所述多价多肽包括：第一氨基酸序列，其包括(a)能够结合信号调节蛋白α(SIRPα)的第一多肽模块；和(b)第二氨基酸序列，其包含能够结合R1/R6亚家族的一种或多种受体蛋白酪氨酸磷酸酶(RPTP)的第二多肽模块。
本公开文本的多价多肽的非限制性示例性实施方案可包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，所述一种或多种RPTP包括CD45或其功能变体。在一些实施方案中，所述第一和第二多肽模块中的至少一个包括蛋白结合配体或抗原结合部分的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗原结合部分选自单链可变片段(scFv)、抗原结合片段(Fab)、纳米抗体、VH结构域、VL结构域、单结构域抗体(dAb)、VNAR结构域和VHH结构域、双抗体或其中任一种的功能性片段。在一些实施方案中，所述蛋白结合配体包括细胞表面受体的细胞外结构域(ECD)、或RPTP的ECD或其中任一种的功能变体。在一些实施方案中，所述蛋白结合配体包括CD47的ECD或其功能变体。在一些实施方案中，所述第一多肽模块经由多肽接头序列与所述第二多肽模块可操作地连接。在一些实施方案中，所述多肽接头序列包含甘氨酸-丝氨酸(GS)接头或3C接头。
在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽包含：(a)(i)CD47 ECD，(ii)多肽接头，和(iii)CD45 scFv；(b)(i)SIRPαscFv，(ii)多肽接头；和(iii)CD45 scFv；或(c)(i)CD45 VHH，(ii)多肽接头，和(iii)SIRPαscFv。在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽在N末端至C末端方向上包括：(a)(i)CD47 ECD，(ii)GS接头，和(iii)CD45 scFv；或(b)(i)CD47 ECD，(ii)C3接头，和(iii)CD45 scFv。在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽在N末端至C末端方向上包括：(a)(i)SIRPαscFv，(ii)GS接头，和(iii)CD45scFv；或(b)(i)SIRPαscFv，(ii)C3接头，和(iii)CD45 scFv。在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽在N末端至C末端方向上包括：(a)(i)CD45 VHH，(ii)GS接头，和(iii)SIRPαscFv；或(b)(i)CD45VHH，(ii)C3接头，和(iii)SIRPαscFv。
在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽还包括具有与选自SEQ ID NO:1-6的氨基酸序列至少80％序列同一性的氨基酸序列。
在一方面，本文提供了包含编码本公开文本的多价多肽的核苷酸序列的重组核酸分子。在一些实施方案中，所述核酸分子包括编码具有与选自SEQ ID NO:1-6的氨基酸序列至少80％序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。
在另一方面，本文公开的一些实施方案涉及一种重组细胞，所述重组细胞包含本文公开的核酸分子和/或本文公开的多价多肽。在一些实施方案中，所述重组细胞是吞噬性细胞。在一些实施方案中，所述吞噬性细胞是骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)。在一些实施方案中，所述吞噬性细胞是树突细胞。在一些实施方案中，所述树突细胞是骨髓来源的树突细胞(BMDC)。
在另一方面，本文提供了用于在体外促进未成熟树突细胞(DC)成熟的方法，所述方法包括：(a)将未成熟DC暴露于抗原；和(b)在本公开文本的多价多肽的存在下培养所述未成熟DC以诱导未成熟DC成熟为成熟DC。在相关方面，本文还提供了通过本公开文本的方法制备的成熟DC。
在另一方面，提供了用于制造疫苗的方法，所述方法包括：(a)在体外将未成熟DC暴露于抗原以产生足够数量的抗原呈递未成熟DC；和(b)在本公开文本的多价多肽的存在下促进所述抗原呈递未成熟DC的成熟以产生成熟的抗原呈递DC。因此，通过本文公开的方法制造的疫苗也在本公开文本的范围内。在一些实施方案中，本公开文本的疫苗进一步包括以下中的一种或多种：稀释剂、赋形剂、辅助佐剂、细菌佐剂和/或全身佐剂。
在另一方面，本公开文本的一些实施方案涉及药物组合物，其包括药学上可接受的赋形剂和以下中的一种或多种：(a)本公开文本的多价多肽；(b)本公开文本的重组核酸分子；(c)本公开文本的重组细胞；(d)本公开文本的成熟DC；和(e)本公开文本的疫苗。
在另一方面，本文公开了用于调节受试者中通过CD47和/或SIRPα介导的细胞信号传导的方法的实施方案，所述方法包括向所述受试者施用包括以下中的一种或多种的组合物：(a)本公开文本的多价多肽；(b)本公开文本的重组核酸分子；(c)本公开文本的重组细胞；(d)本公开文本的药物组合物；(e)本公开文本的成熟DC；和(f)本公开文本的疫苗。
在又另一方面，本文提供了用于预防或治疗有需要的受试者的健康情况的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括以下中的一种或多种的组合物：(a)本公开文本的多价多肽；(b)本公开文本的重组核酸分子；(c)本公开文本的重组细胞；(d)本公开文本的药物组合物；(e)本公开文本的成熟DC；和(f)本公开文本的疫苗。
本公开文本的方法的实施方案的非限制性示例性实施方案可以包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，所施用的组合物将RPTP活性募集到SIRPα的空间附近，增强SIRPα的去磷酸化，减少SIRPα介导的信号传导，促进巨噬细胞吞噬作用和/或促进树突细胞成熟。在一些实施方案中，施用的组合物赋予巨噬细胞介导的吞噬作用的增强。在一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，所述受试者患有或疑似患有与CD47和/或SIRPα相关的健康情况。在一些实施方案中，所述健康情况是癌症或慢性感染。
在另一方面，本文提供了用于预防或治疗有需要的受试者中的癌症的方法，所述方法包括：(i)在体外将针对抗原的未成熟DC与癌症相关抗原或感染相关抗原一起培养，以产生抗原呈递未成熟DC；(ii)在本文所述的多价多肽的存在下促进抗原呈递未成熟DC的成熟以产生成熟抗原呈递DC；和(iii)向所述受试者施用产生的成熟抗原呈递DC。
在另一方面，本文提供了用于预防或治疗感染或疑似感染寄生虫、病毒、微真菌或细菌的受试者的方法，所述方法包括：(i)将未成熟DC与源自寄生虫、病毒、微真菌或细菌的抗原一起培养以产生抗原呈递树突细胞；(ii)在本文所述的多价多肽的存在下促进树突细胞的成熟以产生成熟抗原呈递DC；和(iii)向所述受试者施用产生的成熟抗原呈递DC。在一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物受试者。在一些实施方案中，所述哺乳动物受试者是人。
在一些实施方案中，将所述组合物单独地(例如，单一疗法)或作为与第二疗法组合的第一疗法(例如，多重疗法)施用至所述受试者。在一些实施方案中，所述第二疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、毒素疗法或手术。
在另一方面，本公开文本的一些实施方案涉及用于调节受试者中的细胞信号传导和/或用于治疗有需要的受试者中的健康情况的试剂盒，其中所述试剂盒包括其使用说明书和以下中的一项或多项：(a)本公开文本的多价多肽；(b)本公开文本的重组核酸分子；(c)本公开文本的重组细胞；(d)本公开文本的药物组合物；(e)本公开文本的成熟DC；和(f)本公开文本的疫苗。
前述发明内容仅是说明性的，并不旨在以任何方式进行限制。除了本文描述的说明性实施方案和特征之外，根据附图、具体实施方式和权利要求，本公开文本的其他方面、实施方案、目的和特征将变得完全清楚。
附图说明
图1A-图1B描绘了根据本公开文本的一些实施方案通过顺式磷酸酶募集来调节细胞SIRPα介导的信号传导的非限制性例子的图示。由SIRPα的打开状态(“不要吃我”)与关闭状态(“吃我”)介导的对靶细胞的巨噬细胞吞噬作用。
图1A是SIRPα受体的配体非依赖性(强直性)信号传导和配体诱导的信号传导的示意图。预期SIRPα与CD47的相互作用的抗体阻断会减少配体诱导的信号传导而非配体非依赖性信号传导。因此，抗SIRPαAb或抗CD47 Ab增强了巨噬细胞对靶标的吞噬作用，但由于SIRPα的细胞内结构域(ICD)的残余活性而未达到最大程度。
图1B是RIPR介导的SIRPα信号传导抑制的机制基础的示意图。SIRPα-RIPR与CD45和SIRPα的结合导致CD45磷酸酶募集到巨噬细胞上的SIRPα。
图2A-图2C示意性地示出了“Velcro”SIRPα-RIPR设计和策略的非限制性例子。
图2A描述了由“Velcro”CD47 ECD(Velcro)构成的SIRPα-RIPR分子的示意图。
图2B描述了具有甘氨酸-丝氨酸(GS)接头(GGGGTGGS；SEQ ID NO:9)的“Velcro”SIRPα-RIPR的氨基酸序列，并且显示了具有3C接头(LEVLFQGP；SEQ ID NO:11)的“Velcro”SIRPα-RIPR。
图2C总结了“Velcro”设计和野生型(WT)CD47 ECD对SIRPα的结合亲和力(采用自PCT公开号WO 2016179399 A1)。
图3A-图3B示意性地总结了为证明SIRPα-RIPR设计稳健地降低SIRPα酪氨酸磷酸化而进行的实验的结果。在这些实验中，用靶受体人HA-SIRPα、Lck和人CD45瞬时转染HEK293细胞。转染后24小时，使细胞保持不处理(泳道4)或将细胞与SIRPα-RIPR(GS)(泳道1、2和3)或SIRPα-RIPR(3C)(泳道5、6和7)在37℃孵育20min以诱导将CD45细胞内结构域顺式募集到SIRPα的细胞内结构域。包括CD45磷酸酶缺陷组用于对照目的(CD45死亡；C853S)。裂解后，用直接缀合到磁珠上的抗HA抗体使嵌合受体免疫沉淀。通过蛋白质印迹探测样品的磷酸酪氨酸(pTyr)和SIRPα。数据代表三个独立的生物重复。
图4A-图4C图示说明设计用于测试SIRPα-RIPR对吞噬作用和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCP)的功能的非限制性吞噬作用测定。
图4A是巨噬细胞中CD47-SIRPα“不要吃我”信号轴的示意图。在基础状态下，通过巨噬细胞上的SIRPα将CD47募集至肿瘤细胞导致SHP1和2募集和激活，并抑制吞噬作用。
图4B是用于测试SIRPα-RIPR作用的吞噬作用测定的示意图。SIRPα-RIPR通过募集跨膜磷酸酶活性CD45使SIRPα信号传导沉默，从而解除对吞噬作用的抑制。
图4C是用于测试SIRPα-RIPR作用的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)测定的示意图。同样，SIRPα-RIPR设计可通过募集CD45来使SIRPα信号传导沉默。
图5A-图5C示意性地总结了为证明人SIRPα-RIPR配体增强利妥昔单抗介导的ADCP而进行的实验的结果。
图5A总结了为测试本公开文本的各种SIRPα-RIPR多肽而进行的吞噬作用测定的结果。在这些实验中，将5×104个人巨噬细胞用“Velcro”人SIRPα-RIPR(GS)或“Velcro”人SIRPα-RIPR(3C)在37℃预处理30分钟，将所述巨噬细胞与1×105个Raji细胞(CFSE标记的)在37℃共培养2小时。包括抗CD47用于阳性对照。
图5B总结了用于测试本公开文本的多种SIRPα-RIPR多肽的ADCP测定的结果。将5×104个人巨噬细胞用“Velcro”、人SIRPα-RIPR(GS)或SIRPα-RIPR(3C)在37℃预处理30min，将1×105个Raji细胞用或不用5μg/mL抗CD20抗体(利妥昔单抗)在37℃预处理30min，将所述巨噬细胞与Raji细胞在37℃共培养2小时。收获细胞并用CD11b在4℃染色20min。通过流式细胞术对吞噬作用进行定量。数据是来自2个独立实验的1个代表的n＝2个生物重复的平均值±SD。
图5C总结了PBMC巨噬细胞吞噬作用的结果。将人巨噬细胞在37℃下用或不用人SIRPα-RIPR预处理30min。将Raji细胞用不同浓度的利妥昔单抗(0至5μg/mL)在37℃下预处理30分钟。将所述巨噬细胞与Raji细胞在37℃共培养2小时。通过流式细胞术对吞噬作用进行定量。数据是来自2个独立实验的1个代表的n＝2个生物重复的平均值±SD。
图6A-图6B示意性说明根据本公开文本的一些实施方案的双特异性抗体SIRPα-RIPR设计的非限制性例子。
图6A总结了SIRPα抗体AB21与人SIRPα和来自不同小鼠品系的小鼠SIRPα的结合亲和力(采用自PCT公开号WO 2018057669 A1)。
图6B描述了AB21、具有GS接头(GGGGTGGS；SEQ ID NO:9)的SIRPα-RIPR、具有3C接头(LEVLFQGP；SEQ ID NO:11)的SIRPα-RIPR的氨基酸序列，以及AB21 scFv和基于AB21的人SIRPα-RIPR分子的示意图。
图7A-图7C示意性地总结了为证明上文图6A-图6B中所述的基于AB21的SIRPα-RIPR双特异性抗体可增强人SIRPα的去磷酸化而进行的实验的结果。
图7A是SIRPα-RIPR机制的示意图。
图7B是对CD45和SIRPα具有结合亲和力的双特异性双抗体的示意图。
图7C是将HEK293细胞用人HA-SIRPα、Lck和人CD45瞬时转染，转染后24小时，使细胞保持不处理(泳道1)或将细胞在37℃与Ab21(泳道2和3)或SIRPα-RIPR(GS)(泳道4、5)孵育20min以诱导将CD45磷酸酶顺式募集到SIRPα的细胞内结构域。包括CD45死亡组用于对照目的。裂解后，用直接缀合到磁珠上的抗HA抗体使嵌合受体免疫沉淀。通过蛋白质印迹探测样品的pTyr和SIRPα。数据代表三个独立的生物重复。
图8A-图8C示意性地总结了为证明AB21 SIRPα-RIPR减少SIRPα强直性信号传导并增强人巨噬细胞的ADCP而进行的实验的结果。
图8A总结了为检测从静息THP1巨噬细胞免疫沉淀后的SIRPα磷酸化而进行的实验的结果。在SIRPαIP之前，将THP1巨噬细胞与500nM AB21或SIRPα-RIPR在37℃下孵育30分钟。
图8B是说明体外抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)测定的图，其使用从人PBMC分离并与用指定浓度的利妥昔单抗预处理的Raji细胞一起孵育的巨噬细胞。将巨噬细胞与靶细胞在37℃孵育2小时。通过流式细胞术对吞噬作用进行定量。数据是来自2个独立实验的1个代表的n＝2个生物重复的平均值±SD。
图8C是说明体外抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)测定的图，其使用从人PBMC分离并与用1μg/mL利妥昔单抗预处理的Raji细胞一起孵育的巨噬细胞。将巨噬细胞与靶细胞在37℃孵育2小时。通过流式细胞术对吞噬作用进行定量。数据是来自2个独立实验的1个代表的n＝2个生物重复的平均值±SD。
图9A-图9B示意性说明根据本公开文本的一些实施方案的双特异性抗体SIRPα-RIPR设计的另一非限制性例子。
图9A描述了AB21、具有GS接头(GGGGTGGS；SEQ ID NO:9)的SIRPα-RIPR、具有3C接头(LEVLFQGP；SEQ ID NO:11)的SIRPα-RIPR的氨基酸序列，以及AB21和基于AB21的小鼠SIRPα-RIPR分子的示意图。
图9B说明通过尺寸排阻色谱法进行的蛋白质分析。使AB21和SIRPα-RIPR在Hi5细胞中表达。
图10A-图10C示意性地总结了为证明上文图9A-图9B中所述的双特异性抗体SIRPα-RIPR可减少SIRPα强直性信号传导并增强小鼠巨噬细胞的ADCP而进行的实验的结果。
图10A说明将CD45细胞内结构域顺式募集到SIRPα的细胞内结构域。将HEK293细胞用小鼠HA-SIRPα、Lck和小鼠CD45瞬时转染，转染后24小时，使细胞保持不处理(泳道1)或将细胞在37℃与Ab21(泳道2和3)或SIRPα-RIPR(GS)(泳道4、5)孵育30min，以诱导将CD45细胞内结构域顺式募集到SIRPα的细胞内结构域。包括CD45死亡组用于对照目的。裂解后，用直接缀合到磁珠上的抗HA抗体使嵌合受体免疫沉淀。通过蛋白质印迹探测样品的pTyr和SIRPα。数据代表三个独立的生物重复。
图10B说明从静息J774巨噬细胞免疫沉淀后的SIRPα磷酸化的检测。在SIRPαIP之前，将J774巨噬细胞与AB21或小鼠SIRPα-RIPR在37℃下孵育30min。
图10C是说明吞噬作用的图。将小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)细胞与用或不用2μg/mL抗TRP-1mAb(TA99)预处理的B16F10(CFSE标记的)在37℃孵育2小时。包括小鼠CD47纳米抗体A4用于对照目的。通过流式细胞术对吞噬作用进行定量。数据是来自2个独立实验的1个代表的n＝2个生物重复的平均值±SD。
图11A-图11B示意性地总结了为证明上文图9A-图9B中描述的示例性双特异性抗体SIRPα-RIPR可促进小鼠骨髓树突细胞(BMDC)的成熟而进行的实验的结果。
图11A描绘了AB21和小鼠SIRPα-RIPR的示意图。
图11B是说明对CD11c+群体上的CD86的分析的图。将BMDC细胞用200nM AB21 scFv或SIRPα-RIPR在37℃刺激24小时。通过流式细胞术分析CD11c+群体上的CD86。还包括用脂多糖(LPS，1μg/mL)处理的对照组用于对照目的。
图12A-图12D示意性地总结了为说明小鼠SIRPα-RIPR增强小鼠骨髓树突细胞(BMDC)的成熟而进行的实验的结果。图12A是BMDC分化的示意图。图12B-图12D显示对共刺激分子(CD83、CD86)、MHC分子(MHC-I、MHC-II)、趋化因子受体CCR-7和PD-L1在CD11c+群体上的表面表达的分析。将BMDC细胞用200nM AB21 scFv或SIRPα-RIPR在37℃刺激24小时。通过流式细胞术分析CD11c+群体上共刺激分子(CD83、CD86)、MHC分子(MHC-I、MHC-II)、趋化因子受体CCR-7和PD-L1的表面表达。
图13A示意性地说明测试C57BL/6脾脏中常规树突细胞(cDC2)和红髓巨噬细胞(RPM)上的SIRPα-RIPR的示例性工作流。在这些实验中，cDC1和RPM用作研究cDC2的对照。观察到cDC2和RPM比cDC1表达高得多的SIRPα水平。
图13B说明CCR-7在cDC1和cDC2上的表面表达。将C57BL/6小鼠用200μg AB21 scFv或SIRPα-RIPR处理6小时。分离脾细胞。通过流式细胞术分析CCR-7在cDC1、cDC2或RPM上的表面表达。
图13C说明CD80、CD86、MHC-I、MHC-II、PD-L1和PD-L2在cDC1、cDC2和RPM上的表面表达。将C57BL/6小鼠用200μg AB21 scFv或SIRPα-RIPR处理6小时。分离脾细胞。通过流式细胞术分析CD80、CD86、MHC-I、MHC-II、PD-L1和PD-L2在cDC1、cDC2或RPM上的表面表达。
图14说明SIRPα-RIPR增强BMDC中促炎细胞因子的产生。将100,000个BMDC细胞用200nM AB21 scFv或SIRPα-RIPR在37℃刺激24小时。通过ELISA对上清液中的IL-12和IFNγ进行定量。
图15A-图15C示意性地总结了SIRPα-RIPR增强DC的交叉呈递。
图15A是卵清蛋白肽257-264(SIINFEKL；SEQ ID NO:32)的交叉呈递的示意图。
图15B图示说明OVA257-264肽对OT-I细胞增殖的剂量反应效应。将OT-I细胞从OT-I小鼠的淋巴结中分离并通过CD8 MACS试剂盒纯化。将BMDC细胞用10pM OVA257-264肽在37℃脉冲处理3小时。将50,000个APC细胞与Cell Trace Violet(CTV)+OT-I细胞在200nMAB21 scFv或SIRPα-RIPR存在下1:1共培养5天。通过FACS对OVA257-264肽对OT-I细胞增殖的剂量反应效应进行定量。
图15C图示说明通过流式细胞术分析并对CD3+CD8+群体设门的OT-I细胞中CTV的稀释。
图16A-图16C示意性地总结了SIRPα-RIPR增强BMDC诱导OT-II细胞增殖的能力。
图16A是卵清蛋白肽323-239(ISQAVHAAHAEINEAGR；SEQ ID NO:33)的抗原呈递的示意图。
图16B图示说明OVA323-339肽对OT-II细胞增殖的剂量反应效应。将OT-II细胞从OT-II小鼠的淋巴结中分离。将BMDC细胞用1nM或100nM卵清蛋白(323-339)肽在37℃脉冲处理4小时。将50,000个APC细胞与CTV+OT-II细胞在200nM AB21 scFv或SIRPα-RIPR存在下1:1共培养5天。通过FACS计数OT-II细胞。
图16C图示说明通过流式细胞术分析并对CD3+CD4+群体设门的OT-II细胞中CTV的稀释。
图17A-图17C示意性地总结了SIRPα-RIPR增强BMDC诱导同种异体T细胞增殖的能力。
图17A是混合淋巴细胞反应(MLR)的示意图。
图17B图示说明MLR的结果。将来自BALB/c小鼠的BMDC与来自C57BL/6的50,000个同种异体脾T细胞在500nM AB21 scFv或SIRPα-RIPR存在下以不同比率一起孵育。通过FACS计数CD8+T细胞。
图17C说明通过流式细胞术分析并对CD3+CD8+群体设门的CD8+T细胞中CTV的稀释的图。
图18说明SIRPα-RIPR增强KP1肺癌中的抗肿瘤反应。向F1小鼠植入1×106个KP1细胞，然后从第9天开始每隔一天用200μg AB21 scFv(n＝5)、SIRPα-RIPR(n＝5)或抗CD47(n＝5)治疗。从第8天开始测量肿瘤大小。
图19A-图19B示意性地总结了SIRPα-RIPR增强KP1肿瘤中肿瘤相关巨噬细胞的浸润。
图19A图示说明通过Ficoll分离并针对泛巨噬细胞标记物F4/80和CD11b染色的肿瘤浸润淋巴细胞(n＝10)。
图19B图示说明通过FACS对CD206+肿瘤相关巨噬细胞的定量(n＝10)。
图20A-图20B示意性地总结了SIRPα-RIPR增强KP1肿瘤中的DC成熟。
图20A是说明针对DC标记物CD11c染色的肿瘤浸润淋巴细胞的图(n＝10)。
图20B图示说明通过FACS对CD86+DC的定量(n＝10)。
具体实施方式
本公开文本大体上尤其涉及通过将膜磷酸酶活性特异性募集到抑制性受体SIRPα(也称为CD172a、SHPS-1或BIT)的空间附近来调节细胞表面受体信号传导的组合物和方法。这种抑制SIRPα受体信号传导的方法代表ECD配体阻断的替代方法。更具体地，本公开文本提供新型多价蛋白结合分子，其特异性结合SIRPα受体并通过募集磷酸酶活性(例如跨膜磷酸酶)完全或部分拮抗所述受体的信号传导。该方法(称为“通过磷酸酶募集的受体抑制”(RIPR))先前描述于例如WO 2019/222547 A1中。特别地，本文呈现的实验数据表明，通过抗SIRα抗体或靶向SIRPα的RIPR构建体(“RIPR-SIRPα”)破坏SIRPα信号传导导致信号抑制和对巨噬细胞吞噬作用的促进。
如下文更详细描述的，已经设计、构建了许多能够靶向SIRPα的RIPR分子，并随后评估它们在体外增强巨噬细胞活性的能力。已显示阻断SIRPα与CD47的相互作用增强抗体依赖性吞噬作用(ADCP)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
在一些实施方案中，为了构建能够结合SIRPα的示例性RIPR分子，将先前工程化的高亲和力CD47胞外域(称为Velcro(Ho C.C.等人,J.Biol.Chem.290,12650-12663,2015))与抗CD45 scFv融合(参见例如，图2A-图2B和实施例2)。在用人巨噬细胞、Raji B细胞和利妥昔单抗(抗CD20抗体)进行的体外共培养测定中，观察到本公开文本的一些RIPR-SIRPα分子将ADCP增强到比仅含有Velcro的对照样品所实现的ADCP更高的水平。此外，发现用3C处理消除了RIPR效应。
在下文所述的一些实验中，产生了RIPR-SIRPα分子的第二示例性设计，并且其由已显示增强ADCP的抗SIRPα阻断scFv(克隆AB21；图6A-图6B)构成。该示例性RIPR-SIRPα分子能够在用SIRPα、Lck和CD45瞬时转染的HEK293细胞中的重构测定中降低SIRPα磷酸化(参见图7C)。如图7C所示，在“静息”巨噬细胞中，RIPR-SIRPα而非AB21也降低SIRPα磷酸化。此外，还观察到，在巨噬细胞和Raji B细胞与利妥昔单抗(针对CD20(主要发现于免疫系统B细胞的表面上)的嵌合单克隆抗体)共孵育后，RIPR-SIRPα在增强吞噬作用方面比AB21更有效。对于宽范围的利妥昔单抗或AB21浓度，RIPR-SIRPα诱导更高的吞噬作用(参见例如，图8A-图8C)。总之，这些结果表明，将磷酸酶CD45募集到存在于相同细胞中(即，顺式)的SIRPα分子可用于减少一种或多种感兴趣的靶标的受体信号传导。
在一些实施方案中，磷酸酶的募集通过物理连接实现。在本公开文本的一些实施方案中，多价蛋白结合分子是多价多肽(例如，二价或三价)，其包括能够结合受体蛋白酪氨酸磷酸酶(RPTP)的第一多肽片段，以及能够结合通过磷酸化机制发信号的SIRPα受体的第二多肽片段。本公开文本还涉及可用于产生此类多价蛋白结合分子的组合物和方法，以及用于治疗与抑制通过SIRPα介导的信号转导相关的健康情况的方法。
如下文更详细地描述，本公开文本尤其提供工程化多价多肽，其各自展现对以下至少两种细胞靶标的结合亲和力：RPTP和SIRPα分子。不受任何特定理论的束缚，据信本文公开的多价多肽能够将由RPTP编码的磷酸酶活性募集到SIRPα分子的空间附近，随后降低其磷酸化。还据信，所述多价分子促进对SIRPα分子活性的调节，所述多价分子通过与所述SIRPα的细胞外结构域和跨膜磷酸酶的细胞外结构域结合，使得SIRPα分子的细胞内结构域与磷酸酶的细胞内结构域充分接近，使得所述磷酸酶的细胞内结构域使所述SIRPα的细胞内结构域(或相关磷酸化分子)去磷酸化，从而降低所述SIRPα分子的活性。在RPTP是CD45的情况下，将结合SIRPα分子的细胞外结构域的模块与结合受体蛋白酪氨酸磷酸酶CD45的细胞外结构域的模块连接导致SIRPα的去磷酸化，减少SIRPα强直性信号传导，并增强巨噬细胞的ADCP。还据信，在不受任何特定理论束缚的情况下，预期降低SIRPα的活性会增强巨噬细胞的ADCP，并且可用作包括癌症和慢性感染的多种疾病的疗法。该新方法绕过了目前通过配体阻断调节细胞受体功能的传统策略，并允许通过一个或多个受体细胞内结构域的去磷酸化调节细胞受体功能。
如下文更详细讨论的，已经认识到，目前调节细胞表面受体的临床选择限于ECD阻断抗体，其阻断受体-配体相互作用在细胞表面发生。例如，在SIRPα的情况下，迄今为止，用高亲和力抗体阻断细胞外SIRPα/CD47相互作用是减少SIRPα信号传导的唯一可用手段。然而，抗体阻断不直接影响SIRPα磷酸化，并且重要的是，不逆转SIRPα的基础性、强直性磷酸化以及持续SIRPα过去与CD47的相互作用(参见例如，图1A)。如下文更详细描述的，预期SIRPα与CD47的相互作用的抗体阻断会减少配体诱导的信号传导而非配体非依赖性信号传导。因此，抗SIRPα或抗CD47抗体增强了巨噬细胞对靶标的吞噬作用，但由于SIRPα细胞内结构域(ICD)的残余活性而未达到最大程度。不受任何特定理论的束缚，据信现有的阻断抗体不能完全消除SIRPα基础信号传导以恢复完全T细胞活性。如本公开文本的一些实施方案中所述，新工程化多价抗体通过直接募集磷酸酶以使SIRPα去磷酸化来解决该问题。例如，本公开文本显示在存在或不存在CD47的情况下，CD45募集能够消除由SIRPα诱导的耗竭表型。因此，将磷酸酶(特别是CD45)募集至感兴趣的受体代表调节感兴趣的细胞表面受体的活性的新型方式。
本文公开的方法实施先前公开的RIPR技术以靶向细胞表面受体SIRPα，其为CD47的受体。CD47/SIRPα轴的拮抗剂正在进行针对癌症和其他疾病的临床试验。目前正在临床上评价针对SIRPα和CD47二者的抗体。靶向SIRPα的一个可能的优点是它仅在巨噬细胞上表达，而CD47在大多数组织上表达。
虽然SIRPα拮抗作用有效地阻断“不要吃我”信号，但出于上文解释的原因，SIRPα和其他ITAM/ITIM/ITSM具有一定水平的残余受体信号，即使在不与其配体结合时。这种现象被称为强直性信号传导。配体或受体阻断抗体不干扰该强直性信号传导。
如下所述，使用能够结合SIRPα和CD45二者的双特异性分子，采用RIPR方法将CD45活性束缚(tether)于SIRPα。发现这些新设计的SIRPα-RIPR分子抑制SIRPα强直性信号传导。特别地，在巨噬细胞吞噬作用测定中，观察到SIRPα-RIPR显示相比于SIRPα阻断抗体增加的巨噬细胞对靶细胞的吞噬作用，显示大约10-20％增强。因此，本文呈现的数据证明，这些SIRPα-RIPR分子是对“不要吃我”信号的增强抑制剂，可以用于临床应用中。
定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术术语、符号和其他科学术语或用辞都旨在具有本公开文本所属领域的技术人员通常理解的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且在本文中包含此类定义不必被解释为表示与本领域通常所理解的有实质性差异。本文描述或提及的许多技术和程序是本领域技术人员很好理解的并且通常由本领域技术人员使用常规方法加以采用。
除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述”包括复数指示物。例如，术语“细胞”包括一个或多个细胞，包括其混合物。本文中使用“A和/或B”来包括所有的以下替代形式：“A”、“B”、“A或B”以及“A和B”。
某些范围在本文中通过前面带有术语“约”的数值呈现。本文中使用术语“约”是为了对其后的精确数字以及接近或近似所述术语后的数字的数字提供文字支持。在确定数字是否接近或近似于具体列举的数字时，接近或近似的未列举的数字可以是在呈现它的上下文中提供具体列举的数字的基本等效形式的数字。如本文所用，术语“约”可具有其通常的含义，即大约。如果根据上下文原本不清楚近似程度，则“约”可意指例如在提供的值的正负10％以内，或四舍五入到最接近的有效数字，在所有情况下包括所提供的值。在提供范围的情况下，所述范围包括边界值。
如本文所用，术语“施用(administration和administering)”是指通过如下施用途径递送生物活性组合物或配制品：包括但不限于口服、静脉内、动脉内、肌内、腹膜内、皮下、肌内和外用施用或其组合。所述术语包括但不限于由医学专业人员进行的施用和自我施用。
“癌症”是指具有致癌细胞的几种典型特征(如不受控制的增殖、永生性、转移潜能、快速的生长和增殖速率，以及某些特征性的形态特征)的细胞的存在。癌细胞可以聚集成团块，例如肿瘤，或者可以单独存在于受试者体内。肿瘤可以是实体瘤、软组织瘤或转移性病变。如本文所用，术语“癌症”还包括其他类型的非肿瘤癌症。非限制性例子包括血癌或血液癌症，例如白血病。癌症可包括恶化前癌症以及恶性癌症。
术语“细胞”、“细胞培养物”和“细胞系”不仅指代特定的主题细胞、细胞培养物或细胞系，而且指代这样的细胞、细胞培养物或细胞系的后代或潜在后代，而不考虑培养中的转移或传代次数。应当理解的是，并非所有后代都与亲代细胞完全相同。这是因为某些修饰可能由于突变(例如，故意或无意的突变)或环境影响(例如，甲基化或其他表观遗传修饰)而在后代中发生，使得后代实际上可能与亲本细胞不同，但是仍被包括在如本文所用的术语的范围内，只要后代保留与原始细胞、细胞培养物或细胞系的功能相同的功能即可。
如本文所用，本文所用的术语“多价多肽”是指包含两个或更多个彼此可操作地连接的蛋白质结合模块的多肽。例如，本公开文本的“二价”多肽包括两个蛋白质结合模块，而本公开文本的“三价”多肽包括三个蛋白质结合模块。多肽模块的氨基酸序列通常可以存在于在多价多肽中结合在一起的单独蛋白质中，或者它们通常可以存在于相同的蛋白质中，但是在所述多价多肽中置于新的排列中。多价多肽可例如通过化学合成来产生，或者通过产生并翻译其中以所需关系编码肽区的多核苷酸来产生。
如本文所用并且除非另外指明，否则药剂的“治疗有效量”或“治疗有效数量”是足以在疾病(例如癌症)的治疗或管理中提供治疗益处，或足以延迟或最小化与疾病相关的一种或多种症状的量或数量。化合物的治疗有效量或数量意指单独或与其他治疗剂组合的治疗剂在疾病的治疗或管理中提供治疗益处的量或数量。术语“治疗有效量”可涵盖改善疾病的整体治疗、减少或避免疾病的症状或病因、或增强另一治疗剂的治疗功效的量或数量。“有效量”的例子是足以促成治疗、预防或减轻疾病的一种或多种症状的量，其也可以称为“治疗有效量”。症状的“减轻”意指一种或多种症状的严重程度或频率的降低或者一种或多种症状的消除。组合物的确切量(包括“治疗有效量”)将取决于治疗的目的，并且可由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见例如，Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷,2010)；Lloyd,The Art,Science and Technology of PharmaceuticalCompounding(2016)；Pickar,Dosage Calculations(2012)；以及Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy,第22版,2012,Gennaro编辑,Lippincott,Williams&Wilkins)。
如本文所用，“受试者”或“个体”包括动物，如人(例如，人受试者)和非人动物。在一些实施方案中，“受试者”或“个体”是在医生的护理下的患者。因此，所述受试者可以是患有、有风险患上或怀疑患有目的疾病(例如，癌症)和/或疾病的一种或多种症状的人患者或受试者。受试者也可以是在诊断时或之后被诊断为有目的病症的风险的受试者。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物，例如，啮齿动物，例如小鼠、非人灵长类动物和其他哺乳动物，例如像绵羊、狗、牛、鸡和非哺乳动物，诸如两栖动物、爬行动物等。
在提供了一系列值时，应理解的是每个中间值，到下限的第十个单位(除非上下文清晰地另外指示)，所述范围的上限与下限之间以及任何其他陈述的或在所述陈述范围内的中间值均被涵盖在本公开文本之内。这些更小范围的上限和下限可独立地被包括在更小范围之内，并且也被涵盖在本公开文本之内，服从于陈述的范围内的任何明确排除的界限。当陈述的范围包括一个或两个界限时，排除那些包括的界限中的任一个或两个的范围也包括在本公开文本中。
应了解，为清楚起见在单独实施方案的上下文中描述的本公开文本的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为简洁起见在单个实施方案的上下文中描述的本公开文本的各种特征也可以分开地或以任何合适的子组合提供。属于本公开文本的实施方案的所有组合都确切地被本公开文本所涵盖并且在本文中公开，如同每一个组合都单独且明确地公开一样。另外，各种实施方案及其要素的所有子组合也确切地被本公开文本所涵盖并且在本文中公开，如同每一个这样的子组合都单独且明确地在本文中公开一样。
RPTP的CD45和R1/R6亚型
可逆蛋白酪氨酸磷酸化是调节影响基础细胞事件(包括代谢、增殖、粘附、分化、迁移、通信和粘附)的细胞信号传导的主要机制。例如，蛋白酪氨酸磷酸化决定蛋白功能，包括蛋白-蛋白相互作用、构象、稳定性、酶活性和细胞定位。这种关键调节机制的破坏导致多种人类疾病，包括癌症、糖尿病和自身免疫疾病。净蛋白酪氨酸磷酸化由蛋白酪氨酸激酶(PTK)和蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)的活性的动态平衡决定。在许多人类疾病如癌症、糖尿病和自身免疫性疾病的发病机制中涉及对PTK和PTP之间的微妙平衡的异常调节。
可以基于PTP的整体结构将PTP进一步细分为跨膜受体样PTP(RPTP)和非跨膜PTP。其中，受体型蛋白酪氨酸磷酸酶(RPTP)是整合细胞表面蛋白家族，其具有细胞内PTP活性，以及具有与细胞粘附分子(CAM)的序列同源性的细胞外结构域(ECD)。大多数RPTP的细胞内结构域(ICD)含有两个串联PTP结构域，称为D1和D2。通常，膜近端PTP结构域(D1)具有大部分催化活性，而膜远端PTP结构域(D2)具有弱的(如果有的话)催化活性。RPTP的ECD含有CAM样基序组合，所述CAM样基序的序列与纤连蛋白III型(FN3)、穿膜肽酶、A5、PTPμ(MAM)、免疫球蛋白(Ig)和碳酸酐酶(CA)同源。总之，RPTP的分子结构使得细胞外粘附介导的事件能够与细胞内信号传导途径的调节直接偶联。
基于它们的ECD的结构，可以将RPTP家族分组为八个亚家族：R1/R6、R2A、R2B、R3、R4、R5、R7和R8。这些亚家族的代表性成员分别包括CD45、LAR、RPTP-κ、DEP1、RPTP-α、RPTP-ζ、PTPRR和IA2。关于定义每个亚家族的结构特征、它们的分子/生物化学结构、调节模式、底物特异性和生物功能的进一步信息已经被广泛地记载并且可以在例如Xu Y.等人(J.CellCommun.Signal.6:125,138,2012)中找到。不受任何特定理论的束缚，淋巴细胞中存在的具有细胞外区域的任何磷酸酶(RPTP)可用于RIPR技术，具有预期的不同程度的效率。
受体型蛋白酪氨酸磷酸酶CD45，也称为白细胞共同抗原(LCA)，是RPTP的R1/R6亚家族的成员。CD45是I型跨膜蛋白，其以各种形式存在于除红细胞和浆细胞外的所有分化的造血细胞上，并有助于那些细胞的激活(一种共刺激形式)。CD45在淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病和急性非淋巴细胞白血病中表达。由基因PTPRC编码的人CD45是由淋巴来源的所有细胞(包括造血细胞，血小板和红细胞除外)表达的细胞膜酪氨酸磷酸酶，并作为T细胞和B细胞信号传导的关键调节剂发挥功能。CD45由细胞外区域、短跨膜区段和胞质区中的串联PTP结构域组成。CD45的多种异形体通过分子的细胞外结构域中外显子的复杂选择性剪接产生，其根据细胞分化和激活状态以细胞类型特异性方式表达。CD45异形体的非限制性例子包括CD45RA、CD45RB、CD45RC、CD45RAB、CD45RAC、CD45RBC、CD45R0、CD45R(ABC)。CD45RA位于幼稚T细胞上，CD45R0位于记忆T细胞上。CD45R是最长的蛋白质并且当从T细胞分离时以200kDa迁移。B细胞还表达具有较重糖基化的CD45R，使分子量达到220kDa，因此命名为B220；即220kDa的B细胞异形体。B220表达不限于B细胞，并且也可以在激活的T细胞上，在树突细胞子集和其他抗原呈递细胞上表达。幼稚T淋巴细胞表达大的CD45异形体并且通常对CD45RA呈阳性。激活的和记忆T淋巴细胞表达最短的CD45异形体CD45R0，其缺乏RA、RB和RC外显子。这种最短的异形体被认为促进T细胞激活。原则上，以上讨论的所有CD45异形体都可能适用于本文公开的方法和组合物。不受任何特定理论的束缚，据信细胞内CD45磷酸酶不受不同异形体的影响，因此从细胞内观点来看，所有CD45异形体都是基本上相同的。
CD45在免疫系统发育和功能中起重要作用，并且是抗原特异性淋巴细胞刺激和增殖所必需的。CD45通过控制TCR激活阈值、调节细胞因子反应和调节淋巴细胞存活来调节免疫应答。所有这些过程都是在自身免疫性疾病和感染性疾病的发病机制中必需的。
CD45是被募集到细胞表面受体如SIRPα的合适的RPTP靶标，因为如果使它们彼此空间接近，CD45将作用于广泛的底物，例如两个RPTP结合模块和SIRPα结合模块足够接近以实现SIRPα分子的细胞内结构域的去磷酸化。CD45通过调节PTK的Src家族(SFK)如Lyn和Lck的酪氨酸磷酸化来介导T细胞和B细胞受体功能。CD45使Lyn和Lck中的抑制性C-末端磷酸化位点去磷酸化，从而增强这些SFK的活性。还报道了通过CD45介导的其他酪氨酸的去磷酸化对SFK活性的减弱。在CD45敲除小鼠中的研究表明，CD45介导的Fyn和Lck的激活在胸腺细胞发育中是重要的。在TCR连接后，激活的Fyn和Lck使TCR复合物的组分如TCR-ζ和CD3-ε磷酸化。这些酪氨酸磷酸化的蛋白质为含有Src同源性2(SH2)结构域的蛋白质提供对接位点，以传递下游信号。在CD45缺失的胸腺细胞中，TCR的连接不导致Lyn或Lck激活或随后TCR复合物的酪氨酸磷酸化。因此，下游信号传导事件都不发生；从而表明了CD45在TCR激活中的重要作用。还已经将CD45鉴定为使CD3-ζ和CD3-εITAM、Janus激酶(JAK)去磷酸化并负调节细胞因子受体激活的PTP。
信号调节蛋白α(SIRPα)和CD47
SIRPα(也称为CD172a、SHPS-1或BIT)是属于主要由巨噬细胞表达的SIRP家族的调节性膜糖蛋白。SIRPα作为抑制性受体起作用并与广泛表达的跨膜蛋白CD47相互作用，这是一种将活细胞与濒死细胞区分开的抗吞噬信号，也称为“不要吃我”信号。这种相互作用负向控制先天免疫细胞的效应子功能，例如宿主细胞吞噬作用。SIRPα与CD47之间的相互作用可以通过内吞作用、或SIRPα受体的切割、或与表面活性剂蛋白A和D的相互作用来修饰。表面活性剂蛋白A和D是在肺中高度表达的可溶性配体，其与CD47结合SIRPα的相同区域并因此可竞争性阻断结合。SIRPα在巨噬细胞膜上横向扩散并在吞噬突触处积累以结合CD47和信号“自身”，其抑制巨噬细胞吞噬的细胞骨架密集型过程。
SIRPα的胞质区在大鼠、小鼠和人之间高度保守。胞质区含有许多酪氨酸残基，它们可能充当ITIM。在CD47结合后，SIRPα被磷酸化并募集磷酸酶如SHP1和SHP2。细胞外区域含有三个免疫球蛋白超家族结构域，即单个V组和两个C1组IgSF结构域。SIRPβ和SIRPγ具有相似的细胞外结构，但具有不同的胞质区，从而提供不同类型的信号。在配体结合IgSF V组结构域中发现SIRPα多态性，但其不影响配体结合。
在SIRPα介导的信号传导中，SIRPα的细胞外结构域结合CD47并通过其胞质结构域(例如，细胞内结构域)传递细胞内信号。CD47结合通过SIRPα的NH2末端V样结构域介导。胞质区含有4个ITIM，它们在结合配体后被磷酸化。磷酸化介导酪氨酸激酶SHP2的激活。已显示SIRPα还结合磷酸酶SHP1、衔接体蛋白质SCAP2和FYN结合蛋白。将SHP磷酸酶募集至膜导致对肌球蛋白在细胞表面处的积累的抑制并导致对吞噬作用的抑制。SIRPα/CD47相互作用是不寻常的，因为它可以通过SIRPα和CD47导致双向信号传导。SIRPα与CD47的接合提供了抑制宿主细胞吞噬作用的下调信号，因此CD47作为到免疫系统巨噬细胞的“不要吃我”信号发挥功能，这使其成为一些癌症中的潜在治疗靶标，并且最近用于治疗肺纤维化。CD47参与一系列细胞过程，包括凋亡、增殖、粘附和迁移。此外，它在免疫和血管生成反应中起关键作用。CD47在人细胞中普遍表达，并且已经发现其在许多不同的肿瘤细胞中被过度表达。也已经报道在马皮肤肿瘤中的表达。
此外，SIRPα还发挥对树突细胞存活和激活中的调节性信号的抑制功能。在来自人肝癌患者的肿瘤中，浸润性DC表达升高水平的SIRPα，这与肿瘤内免疫耐受的诱导相关。SIRPα的沉默导致引流淋巴结中抗原脉冲处理的DC的寿命显著增加。此外，SIRPα控制DC的激活和输出。DC表达的SIRPα的沉默诱导IL-12和共刺激分子的自发的和增强的产生，导致更有效的细胞毒性T淋巴细胞反应，包括根除先前建立的实体瘤。SIRPα至少部分地通过PI3K的p85亚基的缔合和螯合而发挥此类作用。因此，SIRPα被广泛认为是DC寿命和活性的重要调节剂，并且其抑制可用于改善基于DC的肿瘤疫苗的临床功效。关于这一点的更多信息可以在例如Liu等人,Oncoimmunology,2016中找到。
本公开文本的组合物
如下文更详细描述的，本公开文本的一个方面涉及多价蛋白结合分子，其特异性结合SIRPα受体并通过募集RPTP活性(例如，跨膜磷酸酶CD45)拮抗所述受体的信号传导。还提供了(i)编码此类多价蛋白结合分子的重组核酸，(ii)已被工程化以表达本文公开的多价蛋白结合分子的重组细胞。
多价多肽和多价抗体
在一方面，本文公开的一些实施方案涉及一种新型嵌合多肽，其含有多个多肽模块，例如模块化蛋白结合部分，每个所述模块能够结合一种或多种靶蛋白。在一些实施方案中，所公开的嵌合多肽包括(i)第一氨基酸序列，其包括能够结合SIRPα分子的第一多肽模块，和(ii)第二氨基酸序列，其包括能够结合R1/R6亚家族的一个或多个RPTP的第二多肽模块。在一些实施方案中，所述第一多肽模块可操作地连接到所述第二多肽模块。在一些实施方案中，所公开的嵌合多肽是多价多肽。在一些实施方案中，所述多价多肽是多价抗体。第一多肽模块和第二多肽模块与其各自靶标的结合可以是与靶标的天然配体呈竞争性或非竞争性方式。因此，在本公开文本的一些实施方案中，第一多肽模块和/或第二多肽模块与其各自靶标的结合可以是配体阻断的。在一些其他实施方案中，第一多肽模块和/或第二多肽模块与其各自靶标的结合不阻断天然配体的结合。
将所述多价多肽中包括能够结合SIRPα分子的第一多肽模块的氨基酸序列命名为“第一”氨基酸序列以及将所述多价多肽中包括能够结合RPTP的多肽模块的氨基酸序列命名为“第二”氨基酸序列并不旨在暗示所述“第一”和“第二”氨基酸序列在所述多价多肽内的任何特定结构排列。作为非限制性例子，在本公开文本的一些实施方案中，所述多价多肽或多价抗体可包括能够结合SIRPα分子的N-末端多肽模块和包括能够结合RPTP的多肽的C-末端多肽模块。在其他实施方案中，所述多价多肽或多价抗体可包括能够结合RPTP的N-末端多肽模块和能够结合SIRPα分子的C-末端多肽模块。另外或替代地，所述多价多肽或多价抗体可包括多于一个能够结合SIRPα的多肽模块，和/或多于一个能够结合RPTP的多肽模块。因此，在一些实施方案中，所述多价多肽或多价抗体的第一氨基酸序列包括至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个各自能够结合SIRPα的多肽模块。在一些实施方案中，第一氨基酸序列的至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个多肽模块各自能够结合相同的RPTP。在一些实施方案中，第一氨基酸序列的至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个多肽模块各自能够结合不同的RPTP。
另外或替代地，如上文所提到的，本文公开的所述多价多肽和抗体可在影响所述多价多肽或多价抗体与一种或多种各自靶蛋白的结合亲和力的位置掺入天然和非天然氨基酸二者。因此，可以调节所述多肽模块与其各自靶标(例如，RPTP或SIRPα)的结合亲和力以实现期望的靶细胞特异性。例如，由于CD45被广泛表达，SIRPα结合模块可被配置为形成高亲和力结合模块，而CD45结合模块可被配置为具有较低结合亲和力。例如，在一些实施方案中，在与RPTP结合模块对RPTP的结合亲和力相比时，SIRPα结合模块对SIRPα的亲和力更高(Kd更低)。在一些实施方案中，亲和力的差异为至少一个数量级或至少两个数量级(例如，所述RPTP结合模块与RPTP相互作用的Kd与所述SIRPα结合模块与SIRPα相互作用的Kd之比为至少10、至少20、至少50或至少100)。本领域技术人员将理解，对RPTP或其靶受体(例如，SIRPα)具有高亲和力且对其他具有较低亲和力的多价多肽或多价抗体的这一概念可以是调节RIPR活性的靶细胞特异性的重要部分。因此，在一些实施方案中，所述RPTP结合多肽模块的结合亲和力可不同于所述SIRPα结合多肽模块的结合亲和力。例如，在一些实施方案中，所述RPTP结合多肽模块对其靶标(例如，RPTP)具有高亲和力，并且所述SIRPα结合多肽模块对其靶标(例如，SIRPα)具有低亲和力。在一些实施方案中，所述RPTP结合多肽模块对其靶标具有低亲和力，并且所述SIRPα结合多肽模块对其靶标具有高亲和力。在一些实施方案中，所述RPTP结合模块和所述SIRPα结合模块对各自靶蛋白具有相同的亲和力。
在一些实施方案中，各自对其各自靶标的细胞外结构域具有亲和力的所述SIRPα结合模块和所述RPTP结合模块的结合亲和力独立地为Kd＝10-5至10-12M，诸如例如约10-5至约10-11M的Kd、替代地约10-5至约10-10M的Kd、替代地约10-6至约10-12M的Kd、替代地约10-7至约10-12M的Kd、替代地约10-8至约10-12M的Kd、替代地约10-9至约10-12M的Kd、替代地约10-10至约10-12M的Kd、替代地约10-11至约10-12M的Kd、替代地约10-5至约10-11M的Kd、替代地约10-5至约10-10M的Kd、替代地约10-5至约10-9M的Kd、替代地约10-5至约10-8M的Kd、替代地约10-5至约10- 7M的Kd、替代地约10-5至约10-6M的Kd。
在一些实施方案中，本文公开的多价多肽或多价抗体对RPTP(例如，CD45)具有结合亲和力，其Kd为约1,000nM、约800nM、约700nM、约600nM、约500nM、约400nM、约200nM、约100nM、约10nM、约5nM或约1nM。在一些实施方案中，本文公开的多价多肽或多价抗体对RPTP具有低结合亲和力，例如其Kd大于约10-5M，诸如例如Kd大于约10-4M、大于约10-3M、大于约10-2M或大于约10-1M。在一些实施方案中，对RPTP(例如，CD45)的结合亲和力(Kd)可为约700nM。在一些实施方案中，所述多价多肽或多价抗体对CD45的结合亲和力可为约300nM。
在一些实施方案中，本文公开的多价多肽或多价抗体可对SIRPα分子具有结合亲和力，其Kd为1,000nM、约800nM、约700nM、约600nM、约500nM、约400nM、约200nM、约150nM、约100nM、约80nM、约60nM、约40nM、约20nM、约10nM、约5nM或约1nM。在一些实施方案中，本文公开的多价多肽或多价抗体对SIRPα分子具有高结合亲和力，例如其Kd小于约10-8M、小于约10-9M、小于约10-10M、小于约10-11M或小于约10-12M。在一些实施方案中，本文公开的多价多肽或多价抗体对SIRPα分子的结合亲和力具有约7nM的Kd。在一些实施方案中，本文公开的多价多肽或多价抗体对SIRPα分子的结合亲和力具有约6nM的Kd。在一些实施方案中，对SIRPα分子的所述结合亲和力可为约5nM。
在一些实施方案中，所述多价多肽或多价抗体的第一氨基酸序列与第二氨基酸序列直接连接。在一些实施方案中，第一氨基酸序列经由至少一个共价键与第二氨基酸序列直接连接。在一些实施方案中，第一氨基酸序列经由至少一个肽键与第二氨基酸序列直接连接。在一些实施方案中，第一氨基酸序列的C-末端氨基酸可以可操作地连接到第二多肽模块的N-末端氨基酸。替代地，第一多肽模块的N-末端氨基酸可以可操作地连接到第二多肽模块的C-末端氨基酸。
在一些实施方案中，所述多价多肽或多价抗体的第一氨基酸序列经由接头可操作地连接到第二氨基酸序列。对可用于本文所述的多价多肽的接头没有特别限制。在一些实施方案中，所述接头是合成化合物接头，例如像化学交联剂。可商购的合适的交联剂的非限制性例子包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DSS)、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS3)、二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP)、二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DTSSP)、乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(EGS)、乙二醇双(磺基琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(磺基-EGS)、二琥珀酰亚胺基酒石酸酯(DST)、二磺基琥珀酰亚胺基酒石酸酯(磺基-DST)、双[2-(琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)和双[2-(磺基琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(磺基-BSOCOES)。适用于本公开文本的多价多肽和多价抗体的替代结构和连接的其他例子包括Spiess等人,Mol.Immunol.67:95-106,2015中所述的那些。
在一些实施方案中，本文公开的多价多肽或多价抗体的第一氨基酸序列经由接头多肽序列(肽连接)可操作地连接到第二氨基酸序列。原则上，对所述接头多肽序列的长度和/或氨基酸组成没有特别的限制。在一些实施方案中，包含约1至100个氨基酸残基(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等个氨基酸残基)的任何任意单链肽可用作多肽接头。在一些实施方案中，所述接头多肽序列包括约5至50、约10至60、约20至70、约30至80、约40至90、约50至100、约60至80、约70至100、约30至60、约20至80、约30至90个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述接头多肽序列包括约1至10、约5至15、约10至20、约15至25、约20至40、约30至50、约40至60、约50至70个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述接头多肽序列包括约40至70、约50至80、约60至80、约70至90或约80至100个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述接头多肽序列包含约1至10、约5至15、约10至20、约15至25个氨基酸残基。
在一些实施方案中，可以优化所述接头多肽序列的长度和氨基酸组成，以改变第一和第二多肽模块相对于彼此的取向和/或接近度，从而实现所述多价多肽的所需活性。在一些实施方案中，第一和第二多肽模块相对于彼此的取向和/或接近度可以作为“调节”工具而变化，以实现将增强或降低所述多价多肽的RPTP活性的调节作用。在一些实施方案中，可以优化第一和第二多肽模块相对于彼此的取向和/或接近度以产生双特异性多肽的部分拮抗剂至完全拮抗剂形式。在某些实施方案中，所述接头仅含有甘氨酸和/或丝氨酸残基(例如，甘氨酸-丝氨酸接头)。此类多肽接头的例子包括：Gly、Ser；Gly Ser；Gly Gly Ser；Ser Gly Gly；Gly Gly Gly Ser(SEQ ID NO:12)；Ser Gly Gly Gly(SEQ ID NO:13)；GlyGly Gly Gly Ser(SEQ ID NO:14)；Ser Gly Gly Gly Gly(SEQ ID NO:15)；Gly Gly GlyGly Gly Ser(SEQ ID NO:16)；Ser Gly Gly Gly Gly Gly(SEQ ID NO:17)；Gly Gly GlyGly Gly Gly Ser(SEQ ID NO:18)；Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly(SEQ ID NO:19)；(GlyGly Gly Gly Ser)n(SEQ ID NO:20)，其中n是一或多的整数；和(Ser Gly Gly Gly Gly)n(SEQ ID NO:21)，其中n是一或多的整数。在一些实施方案中，修饰所述接头多肽使得氨基酸序列Gly Ser Gly(GSG)(其出现在传统Gly/Ser接头多肽重复的接合处)不存在。例如，在一些实施方案中，所述多肽接头包括选自以下的氨基酸序列：(GGGXX)nGGGGS(SEQ ID NO:22)和GGGGS(XGGGS)n(SEQ ID NO:23)，其中X是可以插入所述序列中并且不产生包含序列GSG的多肽的任何氨基酸，并且n是0至4。在一些实施方案中，接头多肽的序列是(GGGX1X2)nGGGGS(SEQ ID NO:24)并且X1是P，X2是S，n是0至4。在一些实施方案中，接头多肽的序列是(GGGX1X2)nGGGGS(SEQ ID NO:25)并且X1是G，X2是Q，n是0至4。在一些其他实施方案中，接头多肽的序列是(GGGX1X2)nGGGGS(SEQ ID NO:26)并且X1是G，X2是A，n是0至4。在一些实施方案中，接头多肽的序列是GGGGS(XGGGS)n(SEQ ID NO:27)，并且X是P，n是0至4。在一些实施方案中，本公开文本的接头多肽包含氨基酸序列(GGGGA)2GGGGS(SEQ ID NO:28)或由其组成。在一些实施方案中，接头多肽包含氨基酸序列(GGGGQ)2GGGGS(SEQ ID NO:29)或由其组成。在一些实施方案中，接头多肽包含氨基酸序列(GGGPS)2GGGGS(SEQ ID NO:30)或由其组成。在一些实施方案中，接头多肽包含氨基酸序列GGGGS(PGGGS)2(SEQ ID NO:31)或由其组成。
另外或替代地，在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽和多价抗体可包括与一个或多个SIRPα结合模块化学连接的一个或多个RPTP结合模块。在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽和多价抗体可包括(i)与一个或多个SIRPα结合模块化学连接的一个或多个RPTP结合模块；和(ii)经由肽基连接与一个或多个SIRPα结合模块连接的一个或多个RPTP结合模块。
在本文公开的一些实施方案中，所公开的多价多肽或多价抗体的第一和第二多肽模块中的至少一个包括蛋白结合配体或抗原结合部分的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述第一和第二多肽模块中的至少一个包括蛋白结合配体的氨基酸序列。通常，任何合适的蛋白结合配体可用于本公开文本的组合物和方法，并且可以是例如对靶抗体或靶蛋白具有特异性结合亲和力的任何重组多肽或天然存在的多肽(例如，RPTP或SIRPα分子的重组或天然配体)(也参见Verdoliva等人,J.Immuno.Methods,2002；Naik等人,J.Chromatography,2011)。例如，磷酸酶CD45的合适配体的非限制性例子包括其天然配体，诸如例如凝集素CD22(Hermiston ML等人,Annu.Rev.Immunol.2003)和催乳素-1(WalzelH.等人,J.Immunol.Lett.1999和Nguyen JT等人J Immunol.2001)。在一些实施方案中，所公开的多价多肽或多价抗体的第一和第二多肽模块中的至少一个包括SIRPα或RPTP的一个或多个细胞外结构域(ECD)的氨基酸序列。因此，在一些实施方案中，所公开的多价多肽的第一多肽模块包括与所述多价多肽的第二模块可操作地连接的SIRPα分子的一个或多个ECD。因此，在一些实施方案中，所公开的多价多肽的第一多肽模块包括与所述多价多肽的第二模块可操作地连接的CD47的一个或多个ECD。在一些实施方案中，所公开的多价多肽的第二多肽模块包括与所述多价多肽的第一模块可操作地连接的RPTP的一个或多个ECD。
如上所述，适用于本公开文本的组合物和方法的蛋白结合配体的非限制性例子包括SIRPα的天然配体。例如，SIRPα的合适天然配体包括CD47，以及表面活性剂蛋白A和表面活性剂蛋白D或其中任一种的片段，它们是表面活性剂蛋白家族的成员。
另外或替代地，所述蛋白结合配体可以是所述靶标的天然配体的激动剂或拮抗剂形式。因此，在一些实施方案中，所述蛋白结合配体是所述RPTP或所述SIRPα的激动剂配体。在一些其他实施方案中，所述蛋白结合配体是所述RPTP或所述SIRPα的拮抗剂配体。在一些实施方案中，所述蛋白结合配体可以是合成分子，诸如例如肽或小分子。
在一些实施方案中，所公开的多价多肽或多价抗体的第一和第二多肽模块中的至少一个包括结合靶蛋白(例如，RPTP或SIRPα)的抗原结合部分的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗原结合部分包括抗体或其功能性抗原结合片段的一个或多个抗原结合决定簇。阻断抗体和非阻断抗体都是合适的。如本文所用，术语“阻断”抗体或“拮抗剂”抗体是指防止、抑制、阻断或降低其所结合的抗原的生物或功能活性的抗体。阻断抗体或拮抗剂抗体可基本上或完全防止、抑制、阻断或降低抗原的生物活性或功能。例如，阻断抗SIRPα抗体可防止、抑制、阻断或降低SIRPα与表面活性剂蛋白A之间的结合相互作用，从而防止、阻断、抑制或降低与SIRPα/CD47相互作用相关的免疫抑制功能。术语“非阻断”抗体是指不干扰、抑制、阻断或降低其所结合的抗原的生物或功能活性的抗体。
本文所用的术语“抗原结合片段”是指抗体片段，例如双抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫化物稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫化物稳定的双抗体(ds双抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(例如，二价双抗体-双scFv或二价双抗体-二scFv)、或由包括抗体的一个或多个互补决定区(CDR)的抗体部分形成的多特异性抗体。抗原结合部分可以包括天然来源的多肽、通过对非人动物的免疫产生的抗体或从其他来源(例如骆驼科动物)获得的抗原结合部分(参见例如，Bannas等人Front.Immunol.,2017年11月22日；McMahon C.等人,Nat Struct Mol Biol.25(3):289-296,2018)。可对抗原结合部分进行工程化、合成、设计、人源化(参见例如，Vincke等人,J.Biol.Chem.30；284(5):3273-84,2009)、或修饰以提供所需和/或改进的特性。
因此，在一些实施方案中，所公开的多价多肽或多价抗体的第一和第二多肽模块中的至少一个包括选自以下的抗原结合部分的氨基酸序列：抗原结合片段(Fab)、单链可变片段(scFv)、纳米抗体、VH结构域、VL结构域、单结构域抗体(dAb)、VNAR结构域和VHH结构域、双抗体或前述任一种的功能性片段。在一些实施方案中，所述抗原结合部分包括单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，所述抗原结合部分包括双抗体。在一些实施方案中，所述抗原结合部分包括双scFv或二scFv，其中两个scFv分子彼此可操作地连接。在一些实施方案中，所述双scFv或二scFv包括具有两个VH区和两个VL区的单肽链，产生串联scFv。在一些实施方案中，所述抗原结合部分包括纳米抗体。在一些实施方案中，所述抗原结合部分包括重链可变区和轻链可变区。
在一些实施方案中，所述抗原结合部分的重链可变区和轻链可变区经由位于所述重链可变区与所述轻链可变区之间的一个或多个中间氨基酸残基彼此可操作地连接。在一些实施方案中，所述一个或多个中间氨基酸残基包括接头多肽序列。原则上，对所述接头多肽序列的长度和/或氨基酸组成没有特别的限制。在一些实施方案中，包括约1至100个氨基酸残基(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等个氨基酸残基)的任何任意单链肽可用作多肽接头。在一些实施方案中，所述接头多肽序列包括约5至50、约10至60、约20至70、约30至80、约40至90、约50至100、约60至80、约70至100、约30至60、约20至80、约30至90个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述接头多肽序列包括约1至10、约5至15、约10至20、约15至25、约20至40、约30至50、约40至60、约50至70个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述接头多肽序列包括约40至70、约50至80、约60至80、约70至90或约80至100个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述接头多肽序列包含约1至10、约5至15、约10至20、约15至25个氨基酸残基。在一些实施方案中，可以优化所述接头多肽序列的长度和氨基酸组成，以改变第一和第二多肽模块相对于彼此的取向和/或接近度，从而实现所述多价多肽的所需活性。在一些实施方案中，第一和第二多肽模块相对于彼此的取向和/或接近度可以作为增强或降低所述多价多肽的RPTP活性的“调节”工具或作用而变化。在一些实施方案中，可以优化第一和第二多肽模块相对于彼此的取向和/或接近度以产生所述多价多肽的部分拮抗剂至完全拮抗剂形式。
在某些实施方案中，所述接头仅含有甘氨酸和/或丝氨酸残基(例如，甘氨酸-丝氨酸接头)。此类多肽接头的例子包括：Gly、Ser；Gly Ser；Gly Gly Ser；Ser Gly Gly；GlyGly Gly Ser(SEQ ID NO:12)；Ser Gly Gly Gly(SEQ ID NO:13)；Gly Gly Gly Gly Ser(SEQ ID NO:14)；Ser Gly Gly Gly Gly(SEQ ID NO:15)；Gly Gly Gly Gly Gly Ser(SEQID NO:16)；Ser Gly Gly Gly Gly Gly(SEQ ID NO:17)；Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser(SEQ ID NO:18)；Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly(SEQ ID NO:19)；(Gly Gly Gly GlySer)n(SEQ ID NO:20)，其中n是一或多的整数；和(Ser Gly Gly Gly Gly)n(SEQ ID NO:21)，其中n是一或多的整数。在一些实施方案中，修饰所述接头多肽使得氨基酸序列GSG(其出现在传统Gly/Ser接头多肽重复的接合处)不存在。例如，在一些实施方案中，所述多肽接头包括选自以下的氨基酸序列：(GGGXX)nGGGGS(SEQ ID NO:22)和GGGGS(XGGGS)n(SEQ IDNO:23)，其中X是可以插入到序列中并且不产生包括序列GSG的多肽的任何氨基酸，并且n是0至4。在一些实施方案中，接头多肽的序列是(GGGX1X2)nGGGGS(SEQ ID NO:24)并且X1是P，X2是S，n是0至4。在一些其他实施方案中，接头多肽的序列是(GGGX1X2)nGGGGS(SEQ ID NO:25)并且X1是G，X2是Q，n是0至4。在一些其他实施方案中，接头多肽的序列是(GGGX1X2)nGGGGS(SEQ ID NO:26)并且X1是G，X2是A，n是0至4。在又一些其他实施方案中，接头多肽的序列是GGGGS(XGGGS)n(SEQ ID NO:27)，并且X是P，n是0至4。在一些实施方案中，本公开文本的接头多肽包含氨基酸序列(GGGGA)2GGGGS(SEQ ID NO:28)或由其组成。在一些实施方案中，接头多肽包含氨基酸序列(GGGGQ)2GGGGS(SEQ ID NO:29)或由其组成。在一些实施方案中，接头多肽包含氨基酸序列(GGGPS)2GGGGS(SEQ ID NO:30)或由其组成。在一些实施方案中，接头多肽包含氨基酸序列GGGGS(PGGGS)2(SEQ ID NO:31)或由其组成。在一些实施方案中，接头多肽包括3C蛋白酶切割位点。在本公开文本的SIRPα-RIPR分子中掺入3C切割位点允许进行各种切割实验，其中SIRPα-RIPR分子可以是并被分裂成其两个组分，例如抗SIRP结合模块和抗CD45结合模块。被3C切割的SIRPα-RIPR分子不将CD45与SIRP交联，由此提供了测试RIPR概念的可能性。在又一些实施方案中，接头多肽包含序列表中SEQ ID NO:9-11所示的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本文公开的多价多肽和多价抗体的第一多肽模块包括能够结合一个或多个靶RPTP的抗原结合部分。合适的RPTP的非限制性例子包括亚家族R1/R6的成员。在一些实施方案中，本文公开的多价多肽和多价抗体的第二多肽模块包括能够结合CD45磷酸酶或其功能变体(诸如例如，其同源物)的抗原结合部分。在一些实施方案中，所述CD45磷酸酶是人CD45磷酸酶。通常，可以使用CD45的任何异形体。在一些实施方案中，所述RPTP是选自CD45RA、CD45RB、CD45RC、CD45RAB、CD45RAC、CD45RBC、CD45R0、CD45R的CD45异形体。适用于本文公开的组合物和方法的示例性CD45结合部分包括但不限于美国专利号7,825,222和9,701,756中描述的那些。
本公开文本的多价多肽的非限制性示例性实施方案可包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，所述一种或多种RPTP包括CD45或其功能变体。在一些实施方案中，所述第一和第二多肽模块中的至少一个包括蛋白结合配体或抗原结合部分的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗原结合部分选自单链可变片段(scFv)、抗原结合片段(Fab)、纳米抗体、VH结构域、VL结构域、单结构域抗体(dAb)、VNAR结构域和VHH结构域、双抗体或其中任一种的功能性片段。在一些实施方案中，所述蛋白结合配体包括SIRPα分子的细胞外结构域(ECD)、或RPTP的ECD或其中任一种的功能变体。在一些实施方案中，所述蛋白结合配体包括CD47的ECD或其功能变体。在一些实施方案中，所述蛋白结合配体包括“Velcro”，一种高亲和力CD47或其功能变体。Velcro先前描述于Ho C.C.等人,同上,2015中。在一些实施方案中，所述第一多肽模块经由多肽接头序列与所述第二多肽模块可操作地连接。在一些实施方案中，所述多肽接头序列包含甘氨酸-丝氨酸(GS)接头。在一些实施方案中，所述GS接头包含SEQ ID NO:9或由其组成。在一些实施方案中，所述多肽接头序列包含3C接头。在一些实施方案中，所述3C接头包含SEQ ID NO:11或由其组成。
在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽包括：(a)CD47 ECD，(b)多肽接头，和(c)CD45 scFv。在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽在N末端至C末端方向上包括：(a)CD47 ECD，(b)多肽接头，和(c)CD45 scFv。在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽在N末端至C末端方向上包括：(a)CD45 scFv，(b)多肽接头，和(c)CD47 ECD。
在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽包括：(a)SIRPαscFv，(b)多肽接头；和(c)CD45 scFv。在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽在N末端至C末端方向上包括：(a)SIRPαscFv，(b)多肽接头；和(c)CD45 scFv。在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽在N末端至C末端方向上包括：(a)CD45 scFv，(b)多肽接头；和(c)SIRPαscFv。
在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽包括：(a)CD45 VHH，(b)多肽接头，和(c)SIRPαscFv。在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽在N末端至C末端方向上包括：(a)CD45 VHH，(b)多肽接头，和(c)SIRPαscFv。在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽在N末端至C末端方向上包括：(a)SIRPαscFv，(b)多肽接头；和(c)CD45 VHH。
在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽在N末端至C末端方向上包括：(i)CD47ECD，(ii)GS接头，和(iii)CD45 scFv。在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽在N末端至C末端方向上包括：(i)CD47 ECD，(ii)C3接头，和(iii)CD45 scFv。
在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽在N末端至C末端方向上包括：(i)SIRPαscFv，(ii)GS接头，和(iii)CD45 scFv。在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽在N末端至C末端方向上包括：(i)SIRPαscFv，(ii)C3接头，和(iii)CD45 scFv。
在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽在N末端至C末端方向上包括：(i)CD45VHH，(ii)GS接头，和(iii)SIRPαscFv。在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽在N末端至C末端方向上包括：(i)CD45 VHH，(ii)C3接头，和(iii)SIRPαscFv。
在一些实施方案中，所述CD47 ECD是高亲和力CD47或其功能变体。在一些实施方案中，所述CD47 ECD是“Velcro”。在一些实施方案中，所述多肽接头包含Gly-Ser(GS)接头。在一些实施方案中，所述GS接头包含SEQ ID NO:9的序列。在一些实施方案中，所述多肽接头包含3C接头(LEVLFQGP；SEQ ID NO:11)。
在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽包括具有与选自SEQ ID NO:1-6的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽包括具有与SEQID NO:1的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽包括具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽包括具有与SEQ ID NO:3的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽包括具有与SEQ ID NO:4的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽包括具有与SEQ ID NO:5的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽包括具有与SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽包括具有与选自SEQ ID NO:1-6的氨基酸序列100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽包括具有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽包括具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽包括具有与SEQ ID NO:3的氨基酸序列100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽包括具有与SEQ ID NO:4的氨基酸序列100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽包括具有与SEQ ID NO:5的氨基酸序列100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽包括具有与SEQ ID NO:6的氨基酸序列100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些特定实施方案中，本公开文本的多价多肽可以是多价抗体(例如，二价抗体或三价抗体)，其包括至少两个抗原结合部分，各自具有对靶蛋白的特异性结合。在一些实施方案中，所述至少两个抗原结合部分具有对相同靶蛋白的特异性结合。这样的抗体是多价、单特异性抗体。在一些实施方案中，所述至少两个抗原结合部分具有对至少两个不同靶蛋白的特异性结合。这样的抗体是多价、多特异性抗体(例如，双特异性、三特异性等)。因此，本文公开的一些实施方案涉及多价抗体或其功能片段，其包括(i)对一种或多种RPTP具有特异性的第一多肽模块，和(ii)对SIRPα具有特异性的第二多肽模块，其中所述第一多肽模块可操作地连接到所述第二多肽模块。因此，在一些实施方案中，所公开的多价抗体可以是二价、单特异性抗体。在一些实施方案中，所公开的多价抗体可以是三价、单特异性抗体。在一些实施方案中，所公开的多价抗体可以是二价、双特异性抗体。在一些实施方案中，所公开的多价抗体可以是三价、三特异性抗体。
本领域技术人员将理解，可以使用完整氨基酸序列来构建反向翻译基因。例如，可以合成含有编码给定多肽的核苷酸序列的DNA寡聚物。例如，可以合成编码所需多肽的部分的几个小寡核苷酸，然后将其连接。单个寡核苷酸通常含有用于互补组装的5'或3'单链突出端。
除了通过表达已经通过重组分子生物学技术改变的核酸分子来产生多价多肽外，还可以化学合成根据本公开文本的主题多价多肽或多价抗体。化学合成的多肽由本领域技术人员以常规方式产生。
一旦组装(通过合成、定点诱变或另一种方法)，将编码本文公开的多价多肽或多价抗体的DNA序列插入到表达载体中，并可操作地连接到适于在所需转化宿主中表达所述多价多肽或多价抗体的表达控制序列。可以通过核苷酸测序、限制性酶切作图和生物活性多肽在合适宿主中的表达来证实正确组装。如本领域已知的，为了获得转染基因在宿主中的高表达水平，必须将所述基因可操作地连接到在所选表达宿主中起作用的转录和翻译表达控制序列。
本公开文本的多价多肽和多价抗体的结合活性可通过本领域已知的任何合适的方法测定。例如，本公开文本的多价多肽和多价抗体的结合活性可通过例如Scatchard分析(Munsen等人1980Analyt.Biochem.107:220-239)来确定。可以使用本领域已知的技术(包括但不限于竞争性ELISA、测定和/或/>测定)评估特异性结合。与靶蛋白或靶表位“优先结合”或“特异性结合”(在本文中可互换使用)的抗体或多肽是本领域熟知的术语，并且确定这种特异性或优先结合的方法也是本领域已知的。如果抗体或多肽与特定蛋白质或表位的反应或缔合比其与替代蛋白质或表位的反应或缔合更频繁、更快速、持续时间更长和/或亲和力更大，则称所述抗体或多肽展现出“特异性结合”或“优先结合”。如果抗体或多肽与靶标的结合比其与其他物质的结合亲和力更大、亲合力更大、更容易和/或持续时间更长，则所述抗体或多肽与所述靶标“特异性结合”或“优先结合”。此外，如果抗体或多肽与样品中靶标的结合比其与所述样品中存在的其他物质的结合亲和力更大、亲合力更大、更容易和/或持续时间更长，则所述抗体或多肽与该靶标“特异性结合”或“优先结合”。例如，特异性或优先结合SIRPα表位的抗体或多肽是与该表位的结合比其与其他SIRPα表位或非SIRPα表位的结合亲和力更大、亲合力更大、更容易和/或持续时间更长的抗体或多肽。通过阅读该定义还可以理解，例如，特异性或优先结合第一靶标的抗体或多肽(或部分或表位)可以或可以不特异性或优先结合第二靶标。因此，“特异性结合”或“优先结合”不一定需要(尽管其可包括)排他性结合。
多种测定形式可用于选择特异性结合感兴趣的分子的抗体或多肽。例如，许多可用于鉴定与特异性结合同源配体或结合配偶体的抗原或受体(或其配体结合部分)特异性反应的抗体的测定包括固相ELISA免疫测定、免疫沉淀、BiacoreTM(GE Healthcare,新泽西州皮斯卡塔韦)、KinExA、荧光激活细胞分选(FACS)、OctetTM(ForteBio,Inc.,加利福尼亚州门洛帕克)和蛋白质印迹分析。通常，特异性或选择性反应将是背景信号或噪声的至少两倍，更典型地是背景的超过10倍，甚至更典型地，是背景的超过50倍，更典型地，是背景的超过100倍，还更典型地，是背景的超过500倍，甚至更典型地，是背景的超过1000倍，甚至更典型地，是背景的超过10,000倍。此外，当平衡解离常数(KD)<7nM时，称抗体“特异性结合”抗原。
术语“结合亲和力”在本文中用作两个分子(例如，抗体或其部分与抗原)之间非共价相互作用的强度的量度。术语“结合亲和力”用于描述单价相互作用(内在活性)。两个分子之间的结合亲和力可以通过确定解离常数(KD)来定量。继而，可以通过使用例如表面等离子体共振(SPR)方法(Biacore)测量复合物形成和解离的动力学来确定KD。对应于单价复合物的缔合和解离的速率常数分别称为缔合速率常数ka(或kon)和解离速率常数kd(或koff)。KD通过等式KD＝kd/ka与ka和kd相关联。解离常数的值可以通过熟知的方法直接确定，并且对于复杂混合物甚至可以通过诸如Caceci等人(1984,Byte9:340-362)中所述的那些方法来计算。例如，KD可以使用双滤膜硝酸纤维素滤膜结合测定来建立，诸如Wong和Lohman(1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5428-5432)中所披露。用于评价本公开文本的抗体或多肽对靶抗原的结合能力的其他标准测定是本领域已知的，包括例如ELISA、蛋白质印迹、RIA和流式细胞术分析以及本文别处例示的其他测定。抗体的结合动力学和结合亲和力也可以通过本领域已知的标准测定(如表面等离子体共振(SPR))来评估，例如，通过使用BiacoreTM系统或KinExA来评估。
核酸分子
在一个方面，本文公开的一些实施方案涉及编码本公开文本的多价多肽和多价抗体的重组核酸分子、含有这些核酸分子的表达盒和表达载体，所述核酸分子可操作地连接到允许所述多价多肽和多价抗体在宿主细胞或离体无细胞表达系统中表达的调节序列。
术语“核酸分子”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，并且是指RNA分子和DNA分子两者，包括包含以下的核酸分子：cDNA、基因组DNA、合成DNA、以及含有核酸类似物的DNA或RNA分子。核酸分子可以是双链或单链的(例如，有义链或反义链)。核酸分子可以含有非常规或经修饰的核苷酸。如本文所用的术语“多核苷酸序列”和“核酸序列”可互换地指多核苷酸分子的序列。本文使用37CFR§1.822中所述的核苷酸碱基命名法。
本公开文本的核酸分子可以是任何长度的核酸分子，包括通常在约0.5Kb与约20Kb之间，例如在约0.5Kb与约20Kb之间、在约1Kb与约15Kb之间、在约2Kb与约10Kb之间，或在约5Kb与约25Kb之间，例如在约10Kb与15Kb之间、约15Kb与约20Kb之间、约5Kb与约20Kb之间、约5Kb与约10Kb之间，或约10Kb与约25Kb之间的核酸分子。
在本文公开的一些实施方案中，本公开文本的核酸分子包括编码多价多肽的核苷酸序列，所述多价多肽包括(i)第一氨基酸序列，其包括能够结合RPTP的第一多肽模块，和(ii)第二氨基酸序列，其包括能够结合通过磷酸化机制发信号的一种或多种SIRPα分子的第二多肽模块，其中所述第一多肽模块可操作地连接到所述第二多肽模块。在一些实施方案中，本公开文本的核酸分子包括编码多价抗体的核苷酸序列，所述多价抗体包括(i)对一种或多种RPTP具有特异性的第一多肽模块，和(ii)对通过磷酸化机制发信号的一种或多种SIRPα分子具有特异性的第二多肽模块。
在本文公开的一些实施方案中，核酸分子包括编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括(i)具有与本文公开的多价多肽或其功能片段的氨基酸序列至少80％序列同一性的氨基酸序列；或(ii)具有与本文公开的多价抗体或其功能片段至少80％序列同一性的氨基酸序列。核酸分子包括编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包括(i)具有与本文公开的多价多肽或其功能片段的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；或(ii)具有与本文公开的多价抗体或其功能片段至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述核酸分子包括编码具有与选自SEQ ID NO:1-6或其功能片段的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述核酸分子包括编码具有与SEQ ID NO:1或其功能片段至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述核酸分子包括编码具有与SEQ ID NO:2或其功能片段至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述核酸分子包括编码具有与SEQ ID NO:3或其功能片段至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述核酸分子包括编码具有与SEQ ID NO:4或其功能片段至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述核酸分子包括编码具有与SEQ ID NO:5或其功能片段至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述核酸分子包括编码具有与SEQ ID NO:6或其功能片段至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。
在一些实施方案中，可将本文公开的重组核酸分子掺入表达盒或表达载体中。因此，本文公开的一些实施方案涉及包括本文公开的重组核酸分子的载体或表达盒。应理解，表达盒通常包含遗传物质的构建体，所述构建体含有编码序列和足以引导所述编码序列在受体细胞中、在体内和/或离体的正确转录和/或翻译的调控信息。通常，可以将所述表达盒插入用于靶向期望的宿主细胞的载体中和/或个体中。因此，在一些实施方案中，本公开文本的表达盒包含如本文公开的多价多肽的编码序列，所述编码序列可操作地连接至表达控制元件诸如启动子，以及任选地影响所述编码序列的转录或翻译的任何其他核酸序列或其组合。
在一些实施方案中，可将本公开文本的核酸分子掺入表达载体中。本领域技术人员将理解，术语“载体”通常是指如下重组多核苷酸构建体，其被设计用于在宿主细胞之间转移并且可用于转化的目的，例如将异源DNA引入宿主细胞中。因此，在一些实施方案中，所述载体可以是复制子，如质粒、噬菌体或粘粒，可以在其中插入另一个DNA区段以引起插入区段的复制。在一些实施方案中，所述表达载体可以是整合载体。因此，本文还提供了含有编码本文公开的任何多价多肽和多价抗体的一种或多种核酸分子的载体、质粒或病毒。上述核酸分子可以包含在载体内，所述载体能够引导所述核酸分子在例如已经用载体转导的细胞中的表达。用于真核细胞和原核细胞的合适载体是本领域已知的并且是可商购的或容易由熟练技术人员制备的。其他载体也可以在例如Ausubel,F.M.等人Current Protocolsin Molecular Biology,(Current Protocol,1994)和Sambrook等人“Molecular Cloning:A Laboratory Manual,”第二版(1989)中找到。
应当理解，不是所有的载体和表达控制序列都能同样好地发挥作用以表达本文所述的DNA序列。对于相同的表达系统，也不是所有宿主都能同样好地起作用。然而，本领域技术人员可以在不进行过度实验的情况下在这些载体、表达控制序列和宿主中进行选择。例如，在选择载体时，必须考虑宿主，因为载体必须在宿主中复制。也应考虑载体的拷贝数、控制该拷贝数的能力以及所述载体编码的任何其他蛋白质如抗生素标记物的表达。例如，可使用的载体包括允许编码本公开文本的多价多肽和多价抗体的DNA以拷贝数扩增的那些。这样的可扩增的载体是本领域已知的。它们包括例如能够通过DHFR扩增(参见例如，Kaufman,美国专利号4,470,461)或谷氨酰胺合成酶(“GS”)扩增(参见例如，美国专利号5,122,464和欧洲公开申请EP 338,841)扩增的载体。
因此，在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽和多价抗体可由载体(通常是表达载体)表达。所述载体可用于在宿主细胞中自主复制，或者可在引入宿主细胞后整合到所述宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制(例如，非附加型哺乳动物载体)。表达载体能够指导与其可操作连接的编码序列的表达。通常，用于重组DNA技术的表达载体通常呈质粒(载体)的形式。然而，也包括其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
示例性重组表达载体可包括基于待用于表达的宿主细胞选择的一个或多个调节序列，所述调节序列可操作地连接到待表达的核酸序列。
可以通过常规转化或转染技术将DNA载体引入原核或真核细胞中。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可在Sambrook等人(1989)Molecular Cloning:A LaboratoryManual(第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,N.Y.)和其他标准分子生物学实验室手册中找到。
编码本公开文本的多价多肽和多价抗体的核酸序列可被优化用于在感兴趣的宿主细胞中表达。例如，可将所述序列的G-C含量调节至给定细胞宿主的平均水平，如参考宿主细胞中表达的已知基因计算的。密码子优化的方法是本领域已知的。本文公开的多价多肽和多价抗体的编码序列内的密码子使用可被优化以增强在宿主细胞中的表达，使得所述编码序列内的约1％、约5％、约10％、约25％、约50％、约75％或至多100％的密码子已被优化用于在特定宿主细胞中表达。
适合使用的载体包括用于细菌的基于T7的载体、用于哺乳动物细胞的pMSXND表达载体和用于昆虫细胞的杆状病毒来源的载体。在一些实施方案中，在这样的载体中编码主题多价多肽或多价抗体的核酸插入物可以可操作地连接到启动子，所述启动子基于例如寻求表达的细胞类型来选择。
在选择表达控制序列时，还应该考虑多种因素。这些因素包括例如所述序列的相对强度、其可控性及其与编码主题多价多肽或多价抗体的实际DNA序列的相容性，特别是关于潜在的二级结构。宿主的选择应考虑它们与所选载体的相容性、由本公开文本的DNA序列编码的产物的毒性、它们的分泌特征、它们正确折叠多肽的能力、它们的发酵或培养要求以及纯化由所述DNA序列编码的产物的容易性。
在这些参数内，本领域技术人员可以选择各种载体/表达控制序列/宿主组合，所述组合将在发酵或大规模动物培养中表达期望的DNA序列，例如使用CHO细胞或COS 7细胞。
在一些实施方案中，表达控制序列和表达载体的选择将取决于宿主的选择。可以使用多种表达宿主/载体组合。用于真核宿主的有用表达载体的非限制性例子包括例如具有来自SV40、牛乳头状瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达控制序列的载体。用于细菌宿主的有用表达载体的非限制性例子包括已知的细菌质粒，例如来自大肠杆菌的质粒，包括colEl、pCRI、pER32z、pMB9和它们的衍生物，更宽宿主范围的质粒，例如RP4，噬菌体DNA，例如噬菌体λ的多种衍生物，例如NM989，和其他DNA噬菌体，例如M13和丝状单链DNA噬菌体。用于酵母细胞的有用表达载体的非限制性例子包括2μ质粒及其衍生物。用于昆虫细胞的有用载体的非限制性例子包括pVL941和pFastBacTM 1。
另外，多种表达控制序列中的任一种可用于这些载体中。这样的有用的表达控制序列包括与前述表达载体的结构基因相关的表达控制序列。有用的表达控制序列的例子包括例如SV40或腺病毒的早期和晚期启动子、lac系统、trp系统、TAC或TRC系统、噬菌体λ的主要操纵基因和启动子区(例如PL)、fd外壳蛋白的控制区、3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶的启动子、酸性磷酸酶的启动子(例如PhoA)、酵母a-交配系统的启动子、杆状病毒的多角体启动子、和已知控制原核或真核细胞或其病毒的基因表达的其他序列、及其各种组合。
T7启动子可用于细菌，多角体蛋白启动子可用于昆虫细胞，巨细胞病毒或金属硫蛋白启动子可用于哺乳动物细胞。此外，在高等真核生物的情况下，组织特异性和细胞类型特异性启动子是广泛可用的。这些启动子的命名是针对它们指导核酸分子在体内给定组织或细胞类型中表达的能力。本领域技术人员将容易地得知可用于指导核酸表达的许多启动子和其他调节元件。
除了促进插入的核酸分子转录的序列之外，载体还可以含有复制起点和编码选择标记物的其他基因。例如，新霉素抗性(neoR)基因赋予表达它的细胞G418抗性，并因此允许对转染细胞进行表型选择。本领域技术人员可以容易地确定给定的调节元件或选择标记物是否适用于特定的实验环境。
可用于本公开文本的病毒载体包括例如逆转录病毒、腺病毒和腺相关载体、疱疹病毒、猿猴病毒40(SV40)和牛乳头状瘤病毒载体(参见例如，Gluzman(编辑),EukaryoticViral Vectors,CSH Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)。
在选择表达系统时，应谨慎确保组分彼此相容。例如，本文公开的多价多肽或多价抗体可在原核宿主如细菌大肠杆菌中，或在真核宿主如昆虫细胞(例如，Sf21细胞)或哺乳动物细胞(例如，COS细胞、NIH 3T3细胞或HeLa细胞)中产生。这些细胞可从包括美国典型培养物保藏中心(弗吉尼亚州马纳萨斯)在内的许多来源获得。在选择表达系统时，重要的只是组分彼此相容。技术人员或普通技术人员能够做出这样的决定。此外，如果在选择表达系统时需要指导，本领域技术人员可以咨询Ausubel等人(Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley and Sons,New York,N.Y.,1993)和Pouwels等人(Cloning Vectors:A Laboratory Manual,1985Suppl.1987)。
表达的多价多肽或多价抗体可以使用常规生物化学程序从表达系统中纯化，并且可以如本文所述用作例如治疗剂。
在一些实施方案中，所获得的多价多肽或多价抗体将是糖基化的或非糖基化的，这取决于用于产生所述多价多肽或多价抗体的宿主生物体。如果选择细菌作为宿主，则产生的多价多肽或多价抗体将是非糖基化的。另一方面，真核细胞将使所述多价多肽或多价抗体糖基化，但是可能与天然多肽糖基化的方式不同。由转化宿主产生的多价多肽或多价抗体可根据本领域已知的任何合适方法纯化。产生的多价多肽或多价抗体可以使用阳离子交换、凝胶过滤和/或反相液相色谱从细菌如大肠杆菌中产生的包涵体分离，或者从产生给定多价多肽或多价抗体的哺乳动物或酵母培养物的条件培养基分离。
另外或替代地，构建编码本公开文本的多价多肽或多价抗体的DNA序列的另一种示例性方法是通过化学合成。这包括通过化学手段直接合成编码展现出所述特性的多价多肽或多价抗体的蛋白质序列的肽。该方法可在影响所述多价多肽或多价抗体与靶蛋白的结合亲和力的位置处掺入天然和非天然氨基酸二者。替代地，编码所需多价多肽或多价抗体的基因可使用寡核苷酸合成器通过化学方法合成。这样的寡核苷酸是基于所需多价多肽或多价抗体的氨基酸序列设计的，并且通常选择在将要产生重组多价多肽或多价抗体的宿主细胞中有利的那些密码子。在这方面，本领域公知遗传密码是简并的，即一个氨基酸可以由超过一个密码子编码。例如，Phe(F)由两个密码子TIC或TTT编码，Tyr(Y)由TAC或TAT编码，his(H)由CAC或CAT编码。Trp(W)由单个密码子TGG编码。因此，本领域技术人员将理解，对于编码特定多价多肽或多价抗体的给定DNA序列，将有许多编码该多价多肽或多价抗体的DNA简并序列。例如，应当理解，除了序列表中提供的多价多肽或多价抗体的DNA序列外，还有许多编码本文公开的多价多肽或多价抗体的简并DNA序列。这些简并DNA序列被认为在本公开文本的范围内。因此，在本公开文本的上下文中，“其简并变体”是指编码特定多价多肽或多价抗体并由此使得能够表达所述多价多肽或多价抗体的所有DNA序列。
无论是通过定点诱变、化学合成还是其他方法制备的，编码主题多价多肽或多价抗体的DNA序列也可包括编码信号序列的DNA序列。这种信号序列(如果存在的话)应该是被选择用于表达所述多价多肽或多价抗体的细胞识别的信号序列。它可以是原核的、真核的或两者的组合。通常，信号序列的包含取决于是否期望从制备本文公开的多价多肽或多价抗体的重组细胞中将其分泌。如果选择的细胞是原核细胞，DNA序列通常不编码信号序列。如果选择的细胞是真核细胞，通常包括信号序列。
所提供的核酸分子可以含有天然存在的序列，或与天然存在的那些序列不同，但是由于遗传密码的简并性而编码相同多肽的序列。这些核酸分子可以由RNA或DNA(例如，基因组DNA、cDNA或合成DNA(诸如通过基于亚磷酰胺的合成产生者))或这些类型的核酸内的核苷酸的组合或修饰组成。此外，所述核酸分子可以是双链或单链的(例如，有义链或反义链)。
所述核酸分子不限于编码多肽的序列；也可以包含位于编码序列(例如，本公开文本的SIRPα或RIPR-SIRPα分子的编码序列)上游或下游的一些或全部非编码序列。分子生物学领域的普通技术人员熟悉用于分离核酸分子的常规程序。它们可以例如通过用限制性核酸内切酶处理基因组DNA或通过进行聚合酶链式反应(PCR)来产生。在核酸分子是核糖核酸(RNA)的情况下，分子可以例如通过体外转录产生。
本公开文本的示例性核酸分子可包括本身在天然状态下未被发现的片段。因此，本公开文本涵盖重组核酸分子，诸如其中核酸序列(例如，编码本公开文本的RIPR-SIRPα分子的序列)引入载体(例如，质粒或病毒载体)中或引入异源细胞的基因组(或同源细胞的基因组，在除天然染色体位置外的位置处)中的那些。
重组细胞和细胞培养物
可将本公开文本的多价多肽和重组核酸引入细胞，例如人吞噬性细胞，以产生重组细胞，例如工程化细胞。在一些实施方案中，所述细胞在体内。在一些实施方案中，所述细胞是离体的。在一些实施方案中，所述细胞在体外。在一些实施方案中，所述重组细胞是真核细胞。在一些实施方案中，所述重组细胞是动物细胞。在一些实施方案中，所述动物细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述动物细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述细胞是非人灵长类动物细胞。
例如，本文公开的多价多肽和/或重组核酸可在原核宿主如细菌大肠杆菌中，或在真核宿主如昆虫细胞(例如，Sf21细胞)或哺乳动物细胞(例如，COS细胞、NIH 3T3细胞或HeLa细胞)中产生。在一些实施方案中，所述重组细胞是吞噬性细胞，例如吞噬细胞。专职吞噬细胞和非专职吞噬细胞都是合适的。在一些实施方案中，所述吞噬性细胞是专职吞噬细胞。在一些实施方案中，所述吞噬性细胞是非专职吞噬细胞。在一些实施方案中，所述吞噬性细胞选自巨噬细胞、树突细胞、肥大细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞。在一些实施方案中，所述吞噬性细胞是树突细胞。在一些实施方案中，所述吞噬性细胞是骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)或骨髓来源的树突细胞(BMDC)。这些细胞可从包括美国典型培养物保藏中心(弗吉尼亚州马纳萨斯)在内的许多来源获得。
因此，本公开文本的一些实施方案涉及制备重组细胞的方法，所述方法包括(a)提供能够表达蛋白质的宿主细胞；并且用本公开文本的重组核酸分子转导所提供的宿主细胞以产生重组细胞。将本公开文本的核酸分子引入细胞可以通过本领域技术人员已知的方法进行，所述方法例如病毒感染、转染、缀合、原生质体融合、脂质体转染、电穿孔、核转染、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射、纳米颗粒介导的核酸递送等。
因此，在一些实施方案中，可以将所述核酸分子通过本领域已知的病毒或非病毒递送媒介物引入宿主细胞中以产生重组细胞。例如，所述核酸分子可以稳定地整合在重组细胞的基因组中，或者可以以附加体复制，或者作为微环表达载体存在于重组细胞中以用于瞬时表达。因此，在一些实施方案中，所述核酸分子在重组宿主细胞中作为附加体单元维持和复制。在一些实施方案中，所述核酸分子作为微环表达载体存在于重组细胞中以用于瞬时表达。在一些实施方案中，所述核酸分子稳定地整合到重组细胞的基因组中。稳定整合可以使用经典的随机基因组重组技术或使用更精确的技术来实现，所述更精确的技术诸如指导RNA引导的CRISPR/Cas9基因组编辑，或用NgAgo(格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacteriumgregoryi)Argonaute)进行的DNA指导的核酸内切酶基因组编辑，或TALEN基因组编辑(转录激活因子样效应物核酸酶)。
所述核酸分子可以被包封在病毒衣壳或脂质纳米颗粒中，或者可以通过本领域已知的病毒或非病毒递送手段和方法(诸如电穿孔)来递送。例如，可以通过病毒转导实现将核酸引入细胞中。在非限制性例子中，可以将杆状病毒或腺相关病毒(AAV)工程化以通过病毒转导将核酸递送至靶细胞。已经描述了几种AAV血清型，并且所有已知的血清型都可以感染来自多种不同组织类型的细胞。AAV能够在体内转导广泛的物种和组织而没有明显毒性，并且它产生相对温和的先天性和适应性免疫应答。
慢病毒来源的载体系统也可用于经由病毒转导进行核酸递送和基因疗法。慢病毒载体作为基因递送媒介物提供了几种有吸引力的特性，包括：(i)通过将载体稳定整合到宿主基因组中进行持续的基因递送；(ii)能够感染分裂细胞和非分裂细胞二者；(iii)具有广泛的组织嗜性，包括重要的基因疗法靶细胞类型和细胞疗法靶细胞类型；(iv)在载体转导后不表达病毒蛋白；(v)能够递送复杂遗传元件，诸如多顺反子序列或含内含子的序列；(vi)具有可能更安全的整合位点特征；以及(vii)为相对容易的用于载体操纵和产生的系统。
在一些实施方案中，可以用例如本公开文本的载体构建体对宿主细胞进行基因工程化(例如，转导或转化或转染)，所述载体构建体可以是例如病毒载体或用于同源重组的载体(包含与宿主细胞基因组的一部分同源的核酸序列)，或者可以是用于表达目的多肽的表达载体。宿主细胞可以是未转化的细胞或已经用至少一种核酸分子转染的细胞。
在另一个方面，本文提供了包括至少一种如本文公开的重组细胞和培养基的细胞培养物。通常，所述培养基可以是用于培养本文所述的细胞的任何合适的培养基。如上所述，用于转化多种多样的上述细胞和物种的技术是本领域已知的并且描述于技术和科学文献中。因此，包括至少一种如本文公开的重组细胞的细胞培养物也在本申请的范围内。适合于产生和维持细胞培养物的方法和系统是本领域已知的。
促进未成熟树突细胞(DC)成熟的方法
如下文更详细讨论的，本公开文本的一些实施方案涉及用于在体外促进未成熟树突细胞(DC)成熟的方法。DC专门用于将抗原呈递给幼稚或静止T细胞。因此，DC在体内调节免疫中起重要作用。使用负载有选定抗原的DC进行免疫代表了诱导针对病原体或肿瘤的免疫的有效方法。在适当的条件下，DC也可以使T细胞耐受并因此抑制针对特定抗原的免疫应答。
DC诱导免疫应答的能力需要抗原摄取，其主要发生在非淋巴器官中，随后发生抗原呈递和淋巴系统中T细胞的激活。这些单独的功能作用分别由未成熟DC和成熟DC执行。
用于引发CD8+细胞毒性T细胞(CTL)和CD4+辅助T细胞(Th1)应答的最有力的抗原呈递细胞包括DC。它们能够捕获和加工抗原并迁移到局部淋巴结以诱导CD8+T细胞应答。它们具有在存在于细胞表面上的MHC I类分子的情况下交叉呈递外源抗原的能力。这些特征一起使得树突细胞能够以能够引发CD8+和CD4+T细胞应答二者的方式呈递抗原，从而为使用DC作为细胞疫苗提供理论基础。
在一些实施方案中，本文提供了用于在体外促进未成熟树突细胞(DC)成熟的方法，所述方法包括：(a)将未成熟DC暴露于抗原；和(b)在本公开文本的多价多肽的存在下培养所述未成熟DC以诱导未成熟DC成熟为成熟DC。
可以使所述未成熟DC暴露于所述抗原足够的时间，以诱导所述树突细胞捕获和加工所述抗原。在一些实施方案中，与在不存在本公开文本的多价多肽的情况下培养的参考成熟DC相比，所述成熟DC具有升高的CD86表达水平。在一些实施方案中，所述未成熟DC从分离自哺乳动物如小鼠、人或非人灵长类动物的外周血单个核细胞培养。在一些实施方案中，使未成熟DC暴露于抗原产生抗原呈递未成熟DC。在一些实施方案中，在本公开文本的多价多肽的存在下培养产生的抗原呈递未成熟DC促进所述抗原呈递未成熟DC的成熟以产生成熟的抗原呈递DC。
所述抗原通常可以是任何抗原，例如，癌抗原，例如，肿瘤相关抗原。替代地，所述抗原可以是源自人寄生虫、病毒或微生物的抗原。因此，在一些实施方案中，所述方法包括将未成熟DC暴露于抗原，其中所述抗原选自人寄生虫抗原、动物寄生虫抗原、人病毒抗原、动物病毒抗原、人微生物抗原和微生物抗原。在一些实施方案中，所述抗原是癌症相关抗原。在一些实施方案中，所述抗原是癌症特有抗原。因此，通过本公开文本的方法制备的成熟DC也在本公开文本的范围内。
在另一方面，提供了用于制造疫苗的方法，所述方法包括：(a)在体外将未成熟DC暴露于抗原以产生足够数量的抗原呈递未成熟DC；和(b)在本公开文本的多价多肽的存在下促进所述抗原呈递未成熟DC的成熟以产生成熟的抗原呈递DC。在一些实施方案中，所述抗原选自人寄生虫抗原、动物寄生虫抗原、人病毒抗原、动物病毒抗原、人微生物抗原和动物微生物抗原。在一些实施方案中，所述抗原是癌症相关抗原。在一些实施方案中，所述抗原是癌症特有抗原。如本文所述产生的成熟抗原呈递DC适用于疫苗。例如，可以产生用于刺激被诊断患有健康情况(例如癌症)的受试者的细胞免疫应答的疫苗。在这个产生疫苗的示例性方法中，将未成熟DC暴露于所述受试者的肿瘤相关抗原以产生肿瘤抗原呈递未成熟DC。然后根据本文所述的方法在多价多肽的存在下使所述抗原呈递树突细胞成熟，然后将其包括于呈疫苗形式的药物配制品中。然后可以将所述疫苗注射到所述受试者中，由此预期所述成熟DC将迁移到所述受试者的局部淋巴结以诱导CTL(细胞毒性CD8+T细胞淋巴细胞)应答。
因此，通过本文公开的制造疫苗的方法制造的疫苗也在本公开文本的范围内。在一些实施方案中，所述疫苗可用于预防或治疗患有健康情况如增殖性疾病(例如，癌症)或被诊断患有微生物感染(例如，病毒、微真菌或细菌)或寄生虫感染的受试者的方法中。在一些实施方案中，本公开文本的疫苗还包括一种或多种合适的稀释剂、赋形剂或助剂。在一些实施方案中，本公开文本的疫苗还包括一种或多种合适的细菌佐剂和全身佐剂。在一些实施方案中，本公开文本的疫苗还包括以下中的一种或多种：稀释剂、赋形剂、辅助佐剂、细菌佐剂和全身佐剂。
组合物和药物组合物
在一些实施方案中，可以将本公开文本的多价多肽、多价抗体、核酸、成熟DC和疫苗掺入组合物(包括药物组合物)中。此类组合物通常包括本公开文本的多价多肽、多价抗体、核酸、成熟DC和疫苗中的一种或多种。在一些实施方案中，所述组合物是药物组合物。在一些实施方案中，本公开文本的药物组合物包括药学上可接受的赋形剂和以下中的一种或多种：本公开文本的多价多肽、多价抗体、核酸、成熟DC和疫苗。
适合于注射使用的药物组合物包括无菌水性溶液(在水溶性的情况下)或分散体，以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF新泽西州帕西帕尼)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物应是无菌的并且应是易于注射的程度的流体。其在制造和储存条件下应是稳定的并且必须抵抗微生物(诸如细菌和真菌)的污染作用而保存。载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，可以通过使用包衣诸如卵磷脂、通过在分散液的情况下维持所需的粒度、以及通过使用表面活性剂(例如，十二烷基硫酸钠)，维持适当的流动性。防止微生物的作用可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，通常在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。通过在组合物中包括延迟吸收的药剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)，可以实现可注射组合物的延长吸收。
无菌可注射溶液可以通过以下方式制备：将活性化合物以所需量掺入视需要具有上文所列举成分中的一种或组合的适当溶剂中，然后过滤灭菌。通常，通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备分散体，所述无菌媒介物含有基础分散介质和来自以上列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，常见的制备方法为真空干燥和冷冻干燥，这些方法由先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何另外的所需成分的粉末。
口服组合物(如果使用)通常包括惰性稀释剂或可食用载体。出于口服治疗性施用的目的，可将活性化合物(例如，本公开文本的多价多肽、多价抗体、核酸分子和/或疫苗)与赋形剂一起掺入，并以片剂、锭剂或胶囊剂(例如，明胶胶囊剂)的形式使用。也可以使用流体载体制备口服组合物用作漱口剂。可以包括药学上相容的粘合剂和/或辅助材料作为组合物的一部分。所述片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可含有以下成分中的任一种或具有类似性质的化合物：粘合剂，如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖，崩解剂，如藻酸、PrimogelTM或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或SterotesTM；助流剂，如二氧化硅胶体；甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂，如薄荷、水杨酸甲酯或橙味剂。
在通过吸入施用的情况下，本公开文本的主题多价多肽、多价抗体、核酸、成熟DC和疫苗从加压容器或分配器(其含有合适的推进剂，例如气体(如二氧化碳))或者喷雾器以气溶胶喷雾剂形式递送。这样的方法包括在美国专利号6,468,798中描述的那些。
本公开文本的主题多价多肽、多价抗体、核酸、成熟DC和疫苗的全身施用也可以通过经粘膜或透皮方式进行。对于经粘膜或透皮施用，在配制品中使用适于待渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂在本领域通常是已知的，并且例如就经粘膜施用而言，包括洗涤剂、胆盐和梭链孢酸衍生物。经粘膜施用可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂来完成。对于透皮施用，将活性化合物配制成如本领域通常已知的软膏、油膏、凝胶或乳膏。
在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽、多价抗体、核酸、成熟DC和疫苗还可以制备成栓剂(例如，用常规栓剂基质，如可可脂和其他甘油酯)或保留灌肠剂的形式用于直肠递送。
在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽、多价抗体、核酸、成熟DC和疫苗也可使用本领域已知的方法通过转染或感染施用，所述方法包括但不限于McCaffrey等人(Nature 418:6893,2002)、Xia等人(Nature Biotechnol.20:1006-1010,2002)或Putnam(Am.J.Health Syst.Pharm.53:151-160,1996,勘误于Am.J.Health Syst.Pharm.53:325,1996)中所述的方法。
在一些实施方案中，本公开文本的主题多价多肽、多价抗体、核酸、成熟DC和疫苗用如下载体制备，所述载体将保护所述多价多肽、多价抗体、核酸、成熟DC和疫苗免于从体内快速消除，例如控释配制品，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。此类配制品可以使用标准技术来制备。所述材料也可以从Alza Corporation和NovaPharmaceuticals,Inc.商购获得。还可以使用脂质体悬浮液(包括具有针对病毒抗原的单克隆抗体的靶向感染细胞的脂质体)作为药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法来制备，所述方法例如在美国专利号4,522,811中所述。
如下文更详细地描述的，本公开文本的多价多肽和多价抗体也可以被修饰以实现延长的作用持续时间，诸如通过聚乙二醇化、酰化、Fc融合、与诸如白蛋白的分子连接等。在一些实施方案中，所述多价多肽或多价抗体可以被进一步修饰以延长其体内和/或离体半衰期。适于修饰本公开文本的多价多肽或多价抗体的已知策略和方法的非限制性例子包括(1)将本文所述的多价多肽或多价抗体用高度可溶的大分子诸如聚乙二醇(PEG)进行化学修饰，从而防止所述多价多肽或多价抗体与蛋白酶接触；和(2)将本文所述的多价多肽或多价抗体与稳定的蛋白质(例如像白蛋白)共价连接或缀合。因此，在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽或多价抗体可以与稳定的蛋白质(诸如白蛋白)融合。例如，已知人白蛋白是用于增强与之融合的多肽的稳定性的最有效的蛋白质之一，并且已经报道了许多此类融合蛋白。
在一些实施方案中，本公开文本的药物组合物包含一种或多种聚乙二醇化试剂。如本文所用，术语“聚乙二醇化”是指通过将聚乙二醇(PEG)共价附接至蛋白质来修饰所述蛋白质，而“聚乙二醇化的”是指附接有PEG的蛋白质。可以使用多种化学将大小在从约10,000道尔顿至约40,000道尔顿的任选范围内的一系列PEG或PEG衍生物附接至本公开文本的多价多肽或多价抗体。在一些实施方案中，所述聚乙二醇化试剂选自甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酯(mPEG-SPA)、mPEG-琥珀酰亚胺丁酸酯(mPEG-SBA)、mPEG-琥珀酰亚胺琥珀酸酯(mPEG-SS)、mPEG-琥珀酰亚胺碳酸酯(mPEG-SC)、mPEG-琥珀酰亚胺戊二酸酯(mPEG-SG)、mPEG-N-羟基-琥珀酰亚胺(mPEG-NHS)、mPEG-三氟乙基磺酸酯(mPEG-tresylate)和mPEG-醛。在一些实施方案中，所述聚乙二醇化试剂是聚乙二醇；例如所述聚乙二醇化试剂是与本公开文本的多价多肽和多价抗体的N末端甲硫氨酸残基共价结合的平均分子量为20,000道尔顿的聚乙二醇。
因此，在一些实施方案中，将本公开文本的多价多肽和多价抗体用一个或多个聚乙二醇部分进行化学修饰，例如，聚乙二醇化；或进行类似的修饰，例如PAS化。在一些实施方案中，将PEG分子或PAS分子与所述多价多肽或多价抗体的一个或多个氨基酸侧链缀合。在一些实施方案中，聚乙二醇化或PAS化多价多肽或多价抗体仅在一个氨基酸上含有PEG或PAS部分。在其他实施方案中，聚乙二醇化或PAS化多价多肽或多价抗体在两个或更多个氨基酸上含有PEG或PAS部分，例如所述PEG或PAS部分附接至两个或更多个、五个或更多个、十个或更多个、十五个或更多个、或二十个或更多个不同的氨基酸残基。在一些实施方案中，PEG或PAS链为2000Da、大于2000Da、5000Da、大于5,000Da、10,000Da、大于10,000Da、大于10,000Da、20,000Da、大于20,000Da和30,000Da。PAS化多价多肽或多价抗体可以通过氨基、巯基、羟基或羧基直接偶联至PEG或PAS(例如，没有连接基团)。在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽或多价抗体共价结合至平均分子量为20,000道尔顿的聚乙二醇。
在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽或多价抗体可被进一步修饰以延长它们的体内和/或离体半衰期。适于修饰本公开文本的多价多肽或多价抗体的已知策略和方法的非限制性例子包括(1)将本文所述的多价多肽或多价抗体用高度可溶的大分子诸如聚乙二醇(“PEG”)进行化学修饰，从而防止所述多价多肽或多价抗体与蛋白酶接触；和(2)将本文所述的多价多肽或多价抗体与稳定的蛋白质(例如像白蛋白)共价连接或缀合。因此，在一些实施方案中，本公开文本的多价多肽或多价抗体可以与稳定的蛋白质(诸如白蛋白)融合。例如，已知人白蛋白是用于增强与之融合的多肽的稳定性的最有效的蛋白质之一，并且已经报道了许多此类融合蛋白。
本公开文本的方法
任一种本文所述的治疗组合物(例如多价多肽、多价抗体、核酸、重组细胞、细胞培养物、疫苗和药物组合物)的施用可用于预防或治疗相关的健康情况，例如增殖性疾病(例如，癌症)、自身免疫性疾病和微生物感染(例如，细菌感染或病毒感染)。在一些实施方案中，所述感染是慢性感染。在一些实施方案中，可以将如本文所述的多价多肽、多价抗体、核酸、重组细胞、细胞培养物、疫苗和/或药物组合物掺入治疗剂中，用于治疗患有、疑似患有或有高风险患上与通过CD47和/或SIRPα介导的细胞信号传导相关的一种或多种健康情况或疾病的个体的方法。示例性健康情况或疾病可包括但不限于癌症和慢性感染。在一些实施方案中，所述个体是处在医生护理下的患者。
因此，在一方面，本公开文本的一些实施方案涉及用于调节通过CD47和/或SIRPα介导的细胞信号传导的方法，所述方法包括向受试者施用包含以下中的一种或多种的组合物：(i)本公开文本的多价多肽，(ii)本公开文本的多价抗体，(iii)本公开文本的重组核酸分子，(iv)本公开文本的重组细胞，(v)本公开文本的成熟DC；和(vi)本公开文本的疫苗。在另一方面，本公开文本的一些实施方案涉及用于预防或治疗有需要的受试者的健康情况的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含以下中的一种或多种的组合物：(i)本公开文本的多价多肽，(ii)本公开文本的多价抗体，(iii)本公开文本的重组核酸分子，(iv)本公开文本的重组细胞，(v)本公开文本的成熟DC；和(vi)本公开文本的疫苗。在一些实施方案中，所述方法包括施用治疗有效量的(i)本公开文本的多价多肽，(ii)本公开文本的多价抗体，(iii)本公开文本的重组核酸分子，(iv)本公开文本的重组细胞，(v)本公开文本的成熟DC；和(vi)本公开文本的疫苗。
本文所述的预防或治疗健康情况的方法的非限制性示例性实施方案可包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，所述健康情况是增殖性疾病或感染。示例性增殖性疾病可以包括而不限于血管生成性疾病、转移性疾病、致瘤性疾病、肿瘤性疾病和癌症。在一些实施方案中，所述增殖性疾病是癌症。在一些实施方案中，所述癌症是儿科癌症。在一些实施方案中，所述癌症是胰腺癌、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、间皮瘤、乳腺癌、尿道上皮癌、肝癌、头颈癌、肉瘤、宫颈癌、胃癌、胃癌、黑素瘤、葡萄膜黑素瘤、胆管癌、多发性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤和成胶质细胞瘤。
在一些实施方案中，所述癌症是多药耐药性癌症或复发性癌症。考虑此处公开的组合物和方法适用于非转移性癌症和转移性癌症二者。因此，在一些实施方案中，所述癌症是非转移性癌症。在一些其他实施方案中，所述癌症是转移性癌症。在一些实施方案中，施用于受试者的组合物抑制所述受试者的癌症的转移。在一些实施方案中，施用的组合物抑制所述受试者的肿瘤生长。
示例性增殖性疾病可以包括而不限于血管生成性疾病、转移性疾病、致瘤性疾病、肿瘤性疾病和癌症。在一些实施方案中，所述增殖性疾病是癌症。术语“癌症”通常是指以异常细胞的快速和不受控制的生长为特征的疾病。所述异常细胞可形成实体瘤或构成血液恶性肿瘤。癌细胞可以局部扩散或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部分。对于可通过本公开文本的组合物和方法治疗的癌症没有具体限制。合适的癌症的非限制性例子包括卵巢癌、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肺癌等。在一些实施方案中，所述癌症是肺癌。在一些实施方案中，所述肺癌是小细胞肺癌(SCLC)。在一些实施方案中，所述SCLC是KP1小细胞肺癌。在一些实施方案中，所述SCLC是KP2小细胞肺癌。
可适合使用本公开文本的组合物和方法治疗的其他癌症包括但不限于急性髓细胞性白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性粒细胞白血病(CML)、肾上腺皮质癌、肛门癌、再生障碍性贫血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨转移、脑癌、中枢神经系统(CNS)癌、外周神经系统(PNS)癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌和直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、尤因氏家族肿瘤(例如尤因氏肉瘤)、眼癌、移行细胞癌、阴道癌、骨髓增生性疾病、鼻腔和鼻旁癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、口腔和口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、成视网膜细胞瘤、胆囊癌、胃肠类癌肿瘤、胃肠基质肿瘤、妊娠滋养细胞疾病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、儿童非霍奇金淋巴瘤、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌和下咽癌、肝癌、肺癌、肺类癌瘤、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、黑素瘤皮肤癌、非黑素瘤皮肤癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫癌(例如，子宫肉瘤)、移行细胞癌、阴道癌、外阴癌、间皮瘤、鳞状细胞或表皮样癌、支气管腺瘤、恶性蜕膜瘤、头颈癌、畸胎癌或瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。
特别合适的癌症包括但不限于乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、间皮瘤、白血病、淋巴瘤、脑癌、前列腺癌、多发性骨髓瘤、黑素瘤、膀胱癌、骨肉瘤、软组织肉瘤、成视网膜细胞瘤、肾肿瘤、成神经细胞瘤和癌。
在一些实施方案中，所述癌症是多药耐药性癌症或复发性癌症。考虑此处公开的组合物和方法适用于非转移性癌症和转移性癌症二者。因此，在一些实施方案中，所述癌症是非转移性癌症。在一些其他实施方案中，所述癌症是转移性癌症。在一些实施方案中，施用于受试者的组合物抑制所述受试者的癌症的转移。例如，在一些实施方案中，施用于受试者的组合物可减少所述受试者中的转移性结节。在一些实施方案中，施用的组合物抑制所述受试者的肿瘤生长。
在一些实施方案中，所述增殖性疾病是自身免疫性疾病。在一些实施方案中，所述自身免疫性疾病选自类风湿性关节炎、胰岛素依赖性糖尿病、溶血性贫血、风湿热、甲状腺炎、克罗恩病、重症肌无力、肾小球肾炎、自身免疫性肝炎、多发性硬化、斑秃、银屑病、白癜风、营养不良性大疱性表皮松解症、系统性红斑狼疮、中度至重度斑块状银屑病、银屑病关节炎、溃疡性结肠炎、移植物抗宿主病和糖尿病足溃疡。
在一些实施方案中，施用的组合物抑制受试者中靶癌细胞的增殖，和/或抑制癌症的肿瘤生长。例如，如果靶细胞的增殖减少，如果靶细胞的病理性或致病行为减少，如果靶细胞被破坏或杀死等，则所述靶细胞可能被抑制。抑制包括将所测量的病理性或致病行为减少至少约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。
在一些实施方案中，所公开的治疗组合物被配制为与其预期的施用途径相容。例如，本公开的多价多肽、多价抗体和疫苗可以口服给予或通过吸入给予，但是它们更可能将通过肠胃外途径施用。肠胃外施用途径的例子包括例如静脉内、皮内、皮下、透皮(外用)、经粘膜和直肠施用。用于肠胃外应用的溶液或悬浮液可以包含以下组分：无菌稀释剂，诸如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲液，诸如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的试剂，诸如氯化钠或右旋糖。pH可以用酸或碱来调节，诸如磷酸二氢钠和/或磷酸氢二钠、盐酸或氢氧化钠(例如，调节至约7.2-7.8，例如7.5的pH)。肠胃外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
可以在细胞培养物或实验动物中通过例如用于确定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)的标准药学程序来确定本公开文本的此类主题多价多肽和多价抗体的剂量、毒性和治疗功效。在毒性与治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并且其可表示为比率LD50/ED50。展现高治疗指数的化合物通常是合适的。尽管可以使用展现毒性副作用的化合物，但是应谨慎设计将这样的化合物靶向至受影响组织部位的递送系统，以使对未感染细胞的潜在损伤降至最低，并且由此减小副作用。
例如，从细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于配制用于人的剂量范围。此类化合物的剂量通常在包括具有很小或没有毒性的ED50的循环浓度的范围内。所述剂量可以在此范围内变化，根据所采用的剂型和所用施用途径而定。对于在本公开文本的方法中使用的任何化合物，治疗有效剂量可以首先根据细胞培养测定来估计。可以在动物模型中配制剂量以实现循环血浆浓度范围，所述循环血浆浓度范围包括如在细胞培养中确定的IC50(例如，实现对症状的半最大抑制的测试化合物浓度)。这样的信息可以用于更准确地确定在人中的有用剂量。可以例如通过高效液相色谱测量血浆中的水平。
本文所述的治疗组合物，例如多价多肽、多价抗体、核酸、重组细胞、细胞培养物、疫苗和药物组合物，可以每天一次或多次至每周一次或多次施用；包括每隔一天一次。本领域技术人员将理解，某些因素可能影响有效治疗受试者所需的剂量和时程，这些因素包括但不限于疾病的严重性、先前的治疗、受试者的一般健康状况和/或年龄、以及存在的其他疾病。此外，使用治疗有效量的本公开文本的主题多价多肽和多价抗体治疗受试者可以包括单一治疗，或者可以包括一系列治疗。在一些实施方案中，每8小时施用组合物持续五天，随后是2至14天(例如，9天)的停药期，之后是另外五天的每8小时施用。关于多价多肽或多价抗体，本公开文本的多价多肽或多价抗体的治疗有效量(例如，有效剂量)取决于所选的多价多肽或多价抗体。例如，可以施用在大约0.001mg/kg患者体重至0.1mg/kg患者体重的范围内的单一剂量；在一些实施方案中，可以施用约0.005mg/kg、0.01mg/kg、0.05mg/kg。
如上所述，本公开文本的一些实施方案涉及用于调节通过CD47和/或SIRPα介导的细胞信号传导的方法。所述方法通过向受试者施用包含以下中的一种或多种的组合物来进行：(i)本公开文本的多价多肽，(ii)本公开文本的多价抗体，(iii)本公开文本的重组核酸分子，和(iv)和/或本公开文本的重组细胞。在另一方面，本公开文本的一些实施方案涉及用于治疗有需要的受试者的健康情况的方法。所述方法通过向受试者施用包含以下中的一种或多种的组合物来进行：(i)本公开文本的多价多肽，(ii)本公开文本的多价抗体，(iii)本公开文本的重组核酸分子，和(iv)和/或本公开文本的重组细胞。在一些实施方案中，所述方法通过向受试者施用有效量的本文所公开的治疗组合物来进行。
如上所述，治疗有效量包括治疗组合物在被施用于受试者时足以促进特定效果的量，所述受试者例如患有健康情况如疾病、疑似患有所述健康情况或处于所述健康情况的风险中的受试者。在一些实施方案中，有效量包括足以预防或延迟疾病的症状的发展、改变疾病的症状的进程(例如但不限于，减缓疾病的症状的进展)或逆转疾病的症状的量。应当理解，对于任何给定的病例，本领域普通技术人员使用常规实验可以确定适当的有效量。
熟练的临床医生可以确定包括所公开的治疗组合物的治疗对疾病治疗的功效。然而，如果疾病的体征或症状中的至少任一个或全部得到改善或缓解，则认为治疗是有效的治疗。还可以通过如按照住院或需要医疗干预所评估的个体恶化的失败(例如，疾病进展停止或至少减缓)来测量功效。测量这些指示物的方法是本领域技术人员已知的和/或在本文中描述。治疗包括对个体或动物(一些非限制性例子包括人或哺乳动物)的疾病的任何治疗并且包括：(1)抑制疾病，例如，停止或减缓症状的进展；或(2)缓解疾病，例如，导致症状消退；以及(3)预防症状发展或降低症状发展的可能性。
在所公开的方法的一些实施方案中，所施用的组合物(例如，本公开文本的多价多肽或多价抗体或编码它们的核酸)将RPTP活性募集到存在于细胞表面上的SIRPα分子的空间附近，从而引起降低SIRPα分子的磷酸化水平的磷酸酶活性。在一些实施方案中，所施用的多价多肽将RPTP募集到与所述RPTP存在于同一细胞表面上的SIRPα分子的空间附近，例如，呈顺式(例如，RPTP和SIRPα分子存在于同一细胞中)的RPTP的细胞内结构域与SIRPα分子的细胞内结构域之间的距离小于约500埃，诸如例如距离为约5埃至约500埃。在一些实施方案中，所述空间附近总计小于约5埃、小于约20埃、小于约50埃、小于约75埃、小于约100埃、小于约150埃、小于约250埃、小于约300埃、小于约350埃、小于约400埃、小于约450埃或小于约500埃。在一些实施方案中，所述空间附近总计小于约100埃。在一些实施方案中，所述空间附近总计小于约50埃。在一些实施方案中，所述空间附近总计小于约20埃。在一些实施方案中，所述空间附近总计小于约10埃。在一些实施方案中，所述空间附近的范围为约10至100埃、约50至150埃、约100至200埃、约150至250埃、约200至300埃、约250至350埃、约300至400埃、约350至450埃或约400至500埃。在一些实施方案中，所施用的多价多肽或多价抗体将RPTP募集到空间邻近，使得RPTP距SIRPα分子约10至100埃。在一些实施方案中，所述空间附近总计小于约100埃。在一些实施方案中，呈顺式的RPTP的细胞内结构域与SIRPα分子的细胞内结构域之间的距离小于约250埃、替代地小于约200埃、替代地小于约150埃、替代地小于约120埃、替代地小于约100埃、替代地小于约80埃、替代地小于约70埃、或替代地小于约50埃。
与通过CD47和/或SIRPα介导的细胞信号传导途径相关的术语“调节”是指所述细胞信号传导途径的改变。调节包括增加(例如，促进、增强、诱导、刺激)和减少(例如，降低、抑制、阻遏)，或以其他方式影响所述细胞信号传导途径。在所公开方法的一些实施方案中，所施用的组合物(例如，本公开文本的多价多肽或多价抗体或编码它们的核酸)将RPTP活性募集到SIRPα的空间附近，增强SIRPα的去磷酸化，减少SIRPα介导的信号传导，促进巨噬细胞吞噬作用和/或促进树突细胞成熟。
在一些实施方案中，与类似条件下未治疗的受试者中SIRPα分子的磷酸化水平相比，当使RPTP分子和SIRPα分子彼此空间接近时，SIRPα分子的磷酸化水平可被降低至少或至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％，或任两个前述值的范围，例如约20％至约60％(包括这些百分比之间的值)。
在一些实施方案中，本公开文本的组合物(例如，多价多肽或多价抗体或编码它们的核酸)的施用赋予受试者降低的SIRPα介导的信号传导活性。与类似条件下未治疗的受试者中SIRPα介导的信号传导的活性相比，SIRPα介导的信号传导的活性的降低可降低至少或至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％，或任两个前述值的范围，例如约20％至约60％(包括这些百分比之间的值)。
在所公开方法的一些实施方案中，所述多价多肽或所述多价抗体的施用赋予受试者的巨噬细胞活性的增强。与类似条件下未治疗的受试者的巨噬细胞活性相比，所述巨噬细胞活性可增强至少或至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％，或任两个前述值的范围，例如约20％至约60％(包括这些百分比之间的值)。
在所公开的方法的一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。在一些实施方案中，所述受试者患有或疑似患有与通过CD47和/或SIRPα介导的细胞信号传导的抑制相关的健康情况。适于通过本公开文本的组合物和方法治疗的健康情况包括但不限于癌症、自身免疫性疾病、炎性疾病和感染性疾病。在一些实施方案中，所述疾病是癌症或慢性感染。
根据本公开文本的又另一方面，提供了一种预防或治疗受试者的健康情况(例如癌症)的方法，所述方法包括以下步骤：(i)将未成熟DC与癌症相关抗原一起培养以产生肿瘤抗原呈递树突细胞；(ii)根据基本上如上所述的过程使所述树突细胞成熟以产生成熟DC；和(iii)向所述受试者施用成熟的抗原呈递树突细胞。在一些实施方案中，所述树突细胞是骨髓来源的树突细胞(BMDC)。
根据本公开文本的又另一方面，提供了一种预防或治疗受试者中寄生虫、病毒、微真菌、细菌感染的方法，所述方法包括以下步骤：(i)将未成熟DC与寄生虫相关抗原、病毒相关抗原、微真菌相关抗原、细菌相关抗原一起培养以产生抗原呈递树突细胞；(ii)根据基本上如上所述的过程使所述树突细胞成熟以产生成熟DC；和(iii)向所述受试者施用成熟的抗原呈递树突细胞。在一些实施方案中，所述树突细胞是骨髓来源的树突细胞(BMDC)。
另外的疗法
如上所述，本文所公开的组合物中的任一种(例如本文所述的多价多肽、多价抗体、核酸、重组细胞、细胞培养物和/或药物组合物)可作为单药疗法(例如单一疗法)施用至有需要的受试者。另外或替代地，在本公开文本的一些实施方案中，本文所述的多价多肽、多价抗体、核酸、重组细胞、细胞培养物和/或药物组合物可以与一种或多种另外的疗法(例如，至少一种、两种、三种、四种或五种另外的疗法)组合施用至受试者。有待与本公开文本的组合物组合施用的合适疗法包括但不限于化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、毒素疗法、靶向疗法和手术。其他合适的疗法包括治疗剂如化疗剂、抗癌剂和抗癌疗法。
与一种或多种另外的治疗剂“组合”施用包括同时(并行)施用和以任何顺序连续施用。在一些实施方案中，一种或多种另外的疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、毒素疗法和手术。本文所用的术语化学疗法包括抗癌剂。各类抗癌剂可适用于本文公开的方法。抗癌剂的非限制性例子包括：烷化剂、抗代谢物、蒽环类、植物生物碱、拓扑异构酶抑制剂、鬼臼毒素、抗体(例如，单克隆或多克隆)、酪氨酸激酶抑制剂(例如，甲磺酸伊马替尼(或/>))、激素治疗、可溶性受体和其他抗肿瘤药。
拓扑异构酶抑制剂也是可用于本文的另一类抗癌剂。拓扑异构酶是维持DNA拓扑结构的必需酶。I型或II型拓扑异构酶的抑制通过扰乱适当的DNA超螺旋而干扰DNA的转录和复制。一些I型拓扑异构酶抑制剂包括喜树碱如伊立替康和拓扑替康。II型抑制剂的例子包括安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷和替尼泊苷。这些是表鬼臼毒素的半合成衍生物，表鬼臼毒素是在美洲鬼臼(盾叶鬼臼(Podophyllum peltatum))根中天然存在的生物碱。
抗肿瘤药包括免疫抑制剂放线菌素D、多柔比星、表柔比星、博来霉素、氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺。所述抗肿瘤化合物通常通过化学修饰细胞的DNA起作用。
烷基化剂可以在细胞中存在的条件下使许多亲核官能团烷基化。顺铂和卡铂以及奥沙利铂是烷基化剂。它们通过与生物重要分子中的氨基、羧基、巯基和磷酸基团形成共价键而损害细胞功能。
长春花生物碱与微管蛋白上的特定位点结合，从而抑制微管蛋白组装成微管(细胞周期的M期)。长春花生物碱包括：长春新碱、长春碱、长春瑞滨和长春地辛。
抗代谢物类似于嘌呤(硫唑嘌呤、巯基嘌呤)或嘧啶，并防止这些物质在细胞周期的“S”期期间被整合到DNA中，从而停止正常发育和分裂。抗代谢物也影响RNA合成。
植物生物碱和萜类化合物获自植物并通过阻止微管功能而阻断细胞分裂。由于微管对于细胞分裂是至关重要的，没有它们，细胞分裂不能发生。主要的例子是长春花生物碱和紫杉烷。
鬼臼毒素是植物来源的化合物，据报道其有助于消化以及用于产生两种其他细胞抑制药物依托泊苷和替尼泊苷。它们阻止细胞进入G1期(DNA复制的开始)和DNA的复制(S期)。
紫杉烷类包括紫杉醇和多西他赛。紫杉醇是一种天然产物，最初称为泰素(Taxol)，首先来源于太平洋紫杉树的树皮。多西他赛是紫杉醇的半合成类似物。紫杉烷增强微管的稳定性，防止染色体在后期分离。
在一些实施方案中，抗癌剂可选自英夫利昔单抗、多西他赛、塞来昔布、美法仑、地塞米松类固醇、吉西他滨、顺铂、替莫唑胺、依托泊苷、环磷酰胺、替莫达、卡铂、丙卡巴肼、卡莫司汀、他莫昔芬、拓扑替康、甲氨蝶呤、吉非替尼/>紫杉醇、泰索帝、氟尿嘧啶、亚叶酸、伊立替康、希罗达、CPT-11、干扰素α、聚乙二醇化干扰素α(例如，PEGINTRON-A)、卡培他滨、顺铂、噻替派、氟达拉滨、卡铂、脂质体柔红霉素、阿糖胞苷、多西他赛、紫杉醇、长春碱、白介素2(IL-2)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、达卡巴嗪、长春瑞滨、唑来膦酸、palmitronate、克拉霉素、白消安、泼尼松、硼替佐米/>二膦酸盐、三氧化二砷、长春新碱、多柔比星/>紫杉醇、更昔洛韦、阿霉素、雌莫司汀磷酸钠/>舒林酸、依托泊苷及其中任一种的组合。
在其他实施方案中，抗癌剂可以选自硼替佐米、环磷酰胺、地塞米松、多柔比星、干扰素-α、来那度胺、美法仑、聚乙二醇化干扰素-α、泼尼松、沙利度胺或长春新碱。
在一些实施方案中，本文所述的治疗方法还包括免疫疗法。在一些实施方案中，所述免疫疗法包括施用一种或多种检查点抑制剂。因此，本文所述的治疗方法的一些实施方案包括进一步施用抑制一种或多种免疫检查点分子的化合物。免疫检查点分子的非限制性例子包括CTLA4、PD-1、PD-L1、A2AR、B7-H3、B7-H4、TIM3及其中任一种的组合。在一些实施方案中，抑制一种或多种免疫检查点分子的所述化合物包括拮抗性抗体。适用于本文公开的组合物和方法的拮抗性抗体的例子包括但不限于伊匹单抗、纳武单抗、派姆单抗、德瓦鲁单抗、阿特珠单抗、替西木单抗和阿维单抗。
在一些方面，一种或多种抗癌疗法是辐射疗法。在一些实施方案中，所述辐射疗法可包括施用辐射以杀死癌细胞。辐射与细胞中的分子如DNA相互作用以诱导细胞死亡。辐射也可损伤细胞膜和核膜以及其他细胞器。根据辐射类型，DNA损伤的机制可能随着相对生物有效性而变化。例如，重粒子(即质子、中子)直接损伤DNA并具有更大的相对生物有效性。电磁辐射导致间接电离，其通过主要由细胞水的电离产生的短寿命羟基自由基起作用。辐射的临床应用由外射束辐射(来自外源)和近距离放射治疗(使用植入或插入患者体内的辐射源)组成。外射束辐射由X射线和/或γ射线组成，而近距离放射治疗使用衰变并发射α粒子或β粒子以及γ射线的放射性核。本文还考虑的辐射包括例如将放射性同位素定向递送到癌细胞。本文还考虑了其他形式的DNA损伤因子，例如微波和UV辐照。
辐射可以单剂量或按剂量分割方案以一系列小剂量给予。本文考虑的辐射量的范围为约1至约100Gy，包括例如约5至约80Gy、约10至约50Gy或约10Gy。总剂量可以分割方案施用。例如，所述方案可包括2Gy的分割单个剂量。放射性同位素的剂量范围变化很大，并且取决于所述同位素的半衰期和发射的辐射的强度和类型。当辐射包括使用放射性同位素时，所述同位素可以缀合至靶向剂，例如治疗性抗体，其将放射性核苷酸携带到靶组织(例如，肿瘤组织)。
本文所述的手术包括切除，其中癌组织的全部或部分被物理去除、切除和/或破坏。肿瘤切除是指至少部分肿瘤的物理去除。除肿瘤切除外，手术治疗还包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和显微镜控制手术(Mohs手术)。本文还考虑去除癌前组织或正常组织。
因此，在一些实施方案中，本公开文本的方法包括将本文公开的组合物作为单药疗法(例如，单一疗法)单独施用至受试者。在一些实施方案中，将本公开文本的组合物作为与第二疗法组合的第一疗法施用至受试者。在一些实施方案中，所述第二疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、毒素疗法和手术。在一些实施方案中，将所述第一疗法和所述第二疗法伴随施用。在一些实施方案中，将所述第一疗法与所述第二疗法同时施用。在一些实施方案中，将所述第一疗法和所述第二疗法依序施用。在一些实施方案中，在所述第二疗法之前施用所述第一疗法。在一些实施方案中，在所述第二疗法之后施用所述第一疗法。在一些实施方案中，在所述第二疗法之前和/或之后施用所述第一疗法。在一些实施方案中，将所述第一疗法和所述第二疗法轮流施用。在一些实施方案中，将所述第一疗法和所述第二疗法以单一配制品一起施用。
试剂盒
本文还提供了用于实践本文所述方法的试剂盒。试剂盒可包括其使用说明书和如本文所述和提供的本文公开的多价多肽、多价抗体、核酸、重组细胞和药物组合物中的一种或多种。例如，在一些实施方案中，本文提供了试剂盒，所述试剂盒包括本公开文本的一种或多种多价多肽和/或多价抗体及其使用说明书。在一些实施方案中，本文提供了试剂盒，其包括一种或多种本公开文本的核酸、重组细胞和/或药物组合物；及其使用说明书。在一些实施方案中，本公开文本的试剂盒还包括用于制备本公开文本的多价多肽、多价抗体、核酸、重组细胞和药物组合物以及使用它们的书面说明书。
在一些实施方案中，本公开文本的试剂盒进一步包含一个或多个注射器(包括预填充注射器)和/或导管(包括预填充注射器)，用于向有需要的受试者施用所提供的免疫细胞、核酸和药物组合物中的任一种。在一些实施方案中，试剂盒可以具有一种或多种另外的治疗剂，所述一种或多种另外的治疗剂可与其他试剂盒组分同时或依序施用以用于期望目的，例如用于调节通过CD47和/或SIRPα介导的细胞信号传导，或预防或治疗有需要的受试者的健康情况。
例如，任何上述试剂盒还可以包含一种或多种另外的试剂，其中此类另外的试剂可以选自：稀释缓冲液、重构溶液、洗涤缓冲液、对照试剂、对照表达载体、阴性对照T细胞群体、阳性对照T细胞群体、用于离体产生T细胞群体的试剂。
在一些实施方案中，试剂盒的组分可以在单独容器中。在一些其他实施方案中，试剂盒的组分可以在单个容器中合并。例如，在本公开文本的一些实施方案中，所述试剂盒包含在一个容器中(例如，在无菌玻璃或塑料小瓶中)的本文公开的多价多肽、多价抗体、核酸、重组细胞和药物组合物中的一种或多种以及在另一个容器中(例如，在无菌玻璃或塑料小瓶中)的另一治疗剂。
在一些实施方案中，试剂盒还可以包含用于使用所述试剂盒的组分来实践本文所述的方法的说明书。例如，所述试剂盒可以包含包括关于所述试剂盒中的药物组合物和剂型的信息的包装插页。通常，这样的信息帮助患者和医师有效且安全地使用封装的药物组合物和剂型。例如，关于本公开文本的组合的以下信息可以在药品说明书中提供：药代动力学、药效学、临床研究、功效参数、适应症和用法、禁忌证、警告、注意事项、不良反应、过量用药、适当的剂量和施用、如何供应、适当的储存条件、参考文献、制造商/经销商信息以及知识产权信息。
在一些实施方案中，试剂盒可以进一步包含用于使用所述试剂盒的组分来实践所述方法的说明书。用于实践所述方法的说明书通常记录在合适的记录介质上。例如，所述说明书可以印刷在基材上，诸如纸或塑料等。所述说明书可以作为包装插页存在于试剂盒中、试剂盒的容器或其组分的标签中(例如，与包装或分包装相关联)等。所述说明书可以作为存在于合适的计算机可读存储介质(例如，CD-ROM、软盘、闪存驱动器等)上的电子存储数据文件而存在。在一些情形下，实际说明书不存在于所述试剂盒中，而是可以提供用于从远程源(例如，经由互联网)获得所述说明书的手段。此实施方案的例子是包括网址的试剂盒，在所述网址中可以查看说明书和/或可以从其下载说明书。与说明书一样，可以将这种用于获得说明书的手段记录在合适的基材上。
将本公开文本中提到的所有出版物和专利申请都通过引用并入本文，并入程度如同确切且单独地指示每个单独出版物或专利申请都通过引用并入一般。
不承认本文引用的任何参考文献构成现有技术。参考文献的讨论内容陈述了其作者所主张的观点，并且本申请人保留对所引用文件的准确性和针对性提出质疑的权利。应清楚地理解的是，尽管在本文中提及许多信息源，包括科学期刊文章、专利文件和教科书；但此提及并不构成承认任何这些文件构成本领域公知常识的一部分。
本文给出的一般方法的讨论仅旨在用于说明目的。在审阅本公开文本后，其他替代方法和替代方案对于本领域技术人员而言将是清楚的，并且将被包括在本申请的精神和范围内。
实施例
除非另有说明，否则本发明的实践将采用本领域技术人员熟知的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学和免疫学的常规技术。这样的技术充分解释于文献中，如Sambrook,J.,&Russell,D.W.(2012).Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第4版).Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring Harbor Laboratory以及Sambrook,J.和Russel,D.W.(2001).Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版).Cold SpringHarbor,NY:Cold Spring Harbor Laboratory(在本文中统称为“Sambrook”)；Ausubel,F.M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology.New York,NY:Wiley(包括至2014年的补充)；Bollag,D.M.等人(1996).Protein Methods.New York,NY:Wiley-Liss；Huang,L.等人(2005).Nonviral Vectors for Gene Therapy.San Diego:AcademicPress；Kaplitt,M.G.等人(1995).Viral Vectors:Gene Therapy and NeuroscienceApplications.San Diego,CA:Academic Press；Lefkovits,I.(1997).The ImmunologyMethods Manual:The Comprehensive Sourcebook of Techniques.San Diego,CA:Academic Press；Doyle,A.等人(1998).Cell and Tissue Culture:LaboratoryProcedures in Biotechnology.New York,NY:Wiley；Mullis,K.B.,Ferré,F.和Gibbs,R.(1994).PCR:The Polymerase Chain Reaction.Boston:Birkhauser Publisher；Greenfield,E.A.(2014).Antibodies:A Laboratory Manual(第2版).New York,NY:ColdSpring Harbor Laboratory Press；Beaucage,S.L.等人(2000).Current Protocols inNucleic Acid Chemistry.New York,NY:Wiley,(包括至2014年的补充)；以及Makrides,S.C.(2003).Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells.Amsterdam,NL:Elsevier Sciences B.V.，将所述文献的公开内容通过引用并入本文。
在以下实施例中进一步详细公开了另外的实施方案，所述实施例仅以说明方式提供，而并非旨在以任何方式限制本公开文本或权利要求的范围。
实施例1.通用实验程序
细胞系
除非另有说明，否则将细胞系保存在37℃，5％ CO2的加湿培养箱中。使HEK293T(LentiX)细胞(雌性来源的肾细胞系)在补充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺和50U/ml青霉素和链霉素的DMEM完全培养基(Thermo Fisher)中生长。MC38购自Kerafast，并在含有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、0.1mM NEAA、1mM NaPyr、10mM HEPES、50U/ml P/S、50μg/ml硫酸庆大霉素的DMEM完全培养基中培养。
动物
根据实验室动物护理管理小组(APLAC)批准的方案和指南，所有动物均圈养在斯坦福大学。C57BL/6J小鼠购自Jackson Labs(目录号000664)。B6.Cg-Foxp3tm2Tch/J(B6.FoxP3GFP，目录号006772)和B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J(pmel-1TCR tg小鼠，目录号005023)购自Jackson Labs并内部饲养。
蛋白质表达
使昆虫Tni细胞(Expression Systems，目录号94-002S)在27℃和大气CO2下在具有10mg/L终浓度的硫酸庆大霉素(Thermo Fisher)的昆虫X-press培养基(Lonza)或ESF921培养基(Expression Systems)中生长。使SF9细胞(Thermo Fisher Scientific)在27℃和大气CO2下在具有10％FBS和10mg/L终浓度的硫酸庆大霉素和2mM Glutamax的SF900-III或SF900-II无血清培养基(Thermo Fisher)中生长。使用P1或P2病毒以约2×106个细胞/ml感染体积为1-3L的Hi5细胞。新的P1或P2制剂以常规方式从新鲜的P0批次制备。感染后2-3天收获上清液并以8000rpm旋转沉降15分钟。将含有所表达蛋白质的上清液处理到100mMTris pH 8.0、2mM NiCl2和10mM CaCl2中以使污染物沉淀。将上清液和沉淀物混合物在4℃下以8000rpm旋转沉降20分钟以去除沉淀物。将上清液与Ni-NTA树脂(QIAGEN)在室温下孵育>3小时。收集Ni-NTA珠并在布氏漏斗中用在1×HBS pH 7.2中的20mM咪唑洗涤，并用在1×HBS pH 7.2中的200mM咪唑洗脱。将蛋白质在10kDa过滤器(Millipore，UFC903024)中浓缩至约1mL或直至10mg/ml。适当时，在4℃下用BirA连接酶、100μM生物素、40mM Bicine pH8.3、10mM ATP和10mM乙酸镁将蛋白质生物素化过夜。根据需要，使用Superdex IncreaseS200或S75(GE Healthcare)通过尺寸排阻色谱法进一步纯化所有蛋白质。清除用于体内研究的所有蛋白质中的内毒素。最终内毒素水平使用显色内毒素定量试剂盒(ThermoFisher)来确定，并且决不超过1个内毒素单位/mg纯化蛋白。将RIPR蛋白保持在4℃长达2周以防止冷冻/解冻循环。
PBMC刺激
PBMC从斯坦福血库获得。在血小板去除术后尽快地且不晚于18小时处理来自健康血小板供体的去识别的白细胞去除室中的细胞。用板结合的OKT3和CD28(如上所述)或用20μM来自PepMixTM肽库系列(JPT Peptide Technologies GmbH，德国)的CEFX UltraSuperStim库刺激PBMC。对于肽刺激，在第一次孵育后24小时用第二剂量的20μM CEFXUltra SuperStim库处理细胞。在该时间点，将细胞与抗体或RIPR或CD45双抗体或适当的对照一起孵育。在与抗体、RIPR或适当分子一起孵育后24、48和72小时收集细胞和上清液。
实施例2.RIPR-SIRPα设计和表达
开发了两种RIPR-SIRPα分子。第一代RIPR-SIRPα由与“Velcro”融合的抗CD45scFv(克隆#4，如先前在WO 2005/026210中所述)构成，“Velcro”是高亲和力CD47变体分子(参见例如，图2A-图2C)。据报道，高亲和力变体Velcro-CD47以相对于野生型CD47大大增加的亲和力结合两种最主要的人SIRPα等位基因，并且有效地拮抗CD47与人巨噬细胞上SIRPα的结合(Ho C.C.等人,2015)。在这些构建体中，将Gly-Ser接头序列或编码3C切割位点的GGSLEVLFQGPGSGS(SEQ ID NO:10)插入抗CD45 scFv序列与Velcro之间。
第二代RIPR-SIRPα由与抗SIRPαscFv融合的相同抗CD45 scFv构成，所述抗SIRPαscFv是Sim J.等人MAbs,2019,第6卷,第1036-1052页中描述的克隆AB21。如图2B中所示，将3C切割位点插入连接抗CD45与抗SIRPα臂的接头区中。RIPR-SIRPα蛋白在Tni细胞中产生，如先前在WO 2019222547 A1中所述。Velcro如前所述(Ho C.C.等人,同上,2015)产生。将对应于AB21 Fab的序列按gblock排序，克隆于用于在Expi293细胞中表达蛋白质的适当质粒中。
使用Ni-NTA纯化所有蛋白质，合并并浓缩SEC后对应于单分散峰的级分。通过还原和非还原SDS-PAGE电泳和之后的考马斯蓝染色进一步证实蛋白质完整性。将蛋白质保持在4℃以供立即使用，或在-80℃冷冻储存。
实施例3.SIRPα磷酸化和吞噬作用测定
为了重建SIRPα磷酸化，用编码全长人Lck、CD45、CD45死亡或SIRPα的质粒以优化比率瞬时转染大约4×106个HEK293细胞。转染后24小时，在37℃用RIPR-SIRPα处理细胞30min。作为对照，将RIPR-SIRPα用3C酶(100μg/mL)在4℃处理14小时。在SDS-PAGE电泳后通过考马斯蓝染色分析切割。将切割的RIPR-SIRPα加入细胞在37℃持续30min。处理后，收获细胞并将细胞裂解物与抗HA磁珠(Pierce，Thermo Fisher Scientific)一起孵育用于免疫沉淀。通过蛋白质印迹分析细胞裂解物的HA、SIRPα和磷酸酪氨酸。为了对内源性SIRPα磷酸化水平进行定量，将大约1×107个THP-1巨噬细胞与100nM AB21 Fab或RIPR-SIRPα在37℃下孵育30分钟，之后收获细胞，并将细胞裂解物与5μg抗SIRPα抗体在4℃下孵育1小时，并与30μL蛋白A/G磁珠(Pierce，Thermo Fisher Scientific)孵育过夜。将所有细胞在PierceIP裂解缓冲液(Pierce Thermo Fisher Scientific，#87787)中裂解，所述裂解缓冲液补充有2X磷酸酶抑制剂混合物(Abcam和Promega)、蛋白酶抑制剂混合物片剂(Roche)、正钒酸盐(NEB)、2mM EDTA和1％(w/v)正十二烷基β-D-麦芽糖苷(Anatrace)。免疫沉淀后，通过蛋白质印迹分析SIRPα磷酸化。对于吞噬作用测定，将大约5×104个人PBMC巨噬细胞用或不用人RIPR-SIRPα、Velcro或抗SIRPαFab、克隆AB21在37℃预处理30min，并将约1×105个人肿瘤Raji B细胞用不同利妥昔单抗(0至5μg/mL)在37℃预处理30min。孵育后，将所述巨噬细胞与1×104个CFSE标记的Raji B细胞在37℃共培养2小时。收获细胞并用巨噬细胞标记物CD11b在4℃染色20min，并通过CytoFLEX流式细胞仪进行分析。
实施例4.“Vecro”SIRPα-RIPR可以稳健地降低SIRPα酪氨酸磷酸化
该实施例描述了为证明
根据本公开文本的一些实施方案设计的“Vecro”SIRPα-RIPR多价多肽可以稳健地降低SIRPα酪氨酸磷酸化而进行的实验的结果。如图3B中所示，在这些实验中，将HEK293细胞用靶受体人HA-SIRPα、Lck和人CD45瞬时转染，转染后24小时，使细胞保持不处理(泳道4)或将细胞在37℃与SIRPα-RIPR(GS)(泳道1、2和3)或SIRPα-RIPR(3C)(泳道5、6和7)孵育20min以诱导将CD45细胞内结构域顺式募集到SIRPα的细胞内结构域(例如，RPTP和SIRPα分子存在于同一细胞中)。包括CD45磷酸酶缺陷组用于对照目的(CD45死亡；C853S)。裂解后，用直接缀合到磁珠上的抗HA抗体使嵌合受体免疫沉淀。通过蛋白质印迹探测样品的磷酸酪氨酸(pTyr)和SIRPα。数据代表三个独立的生物重复。
实施例5.人SIRPα-RIPR配体增强利妥昔单抗介导的ADCP
本实施例描述了为证明根据本公开文本的一些实施方案设计的SIRPα-RIPR多价多肽可以抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCP)而进行的实验。设计非限制性吞噬作用测定以测试SIRPα-RIPR对吞噬作用和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCP)的功能(图4A-图4C)。图4A显示了巨噬细胞中CD47-SIRPα“不要吃我”信号轴的示意图。在基础状态下，通过巨噬细胞上的SIRPα将CD47募集至肿瘤细胞导致SHP1和2募集和激活，并抑制吞噬作用。图4B显示了用于测试SIRPα-RIPR作用的吞噬作用测定的示意图。SIRPα-RIPR通过募集CD45使SIRP信号传导沉默，从而解除对吞噬作用的抑制。图4C显示了用于测试SIRPα-RIPR作用的抗体依赖性细胞吞噬作用测定的示意图。SIRPα-RIPR通过募集CD45使SIRPα信号传导沉默。
为证明人SIRPα-RIPR配体增强利妥昔单抗介导的ADCP而进行的实验的结果示于图5A-图5C中。人SIRPα-RIPR配体增强利妥昔单抗介导的ADCP。用于测试SIRPα-RIPR的吞噬作用测定。将5×104个人巨噬细胞用“Velcro”、人SIRPα-RIPR(GS)或SIRPα-RIPR(3C)在37℃预处理30min，将所述巨噬细胞与1×105个Raji细胞(CFSE标记的)在37℃共培养2小时。包括抗CD47用于阳性对照(图5A)。用于测试SIRPα-RIPR的ADCP测定示于图5B中。将5×104个人巨噬细胞用“Velcro”、人SIRPα-RIPR(GS)或SIRPα-RIPR(3C)在37℃预处理30min，将1×105个Raji细胞用或不用5μg/mL抗CD20抗体(利妥昔单抗)在37℃预处理30min，将所述巨噬细胞与Raji细胞在37℃共培养2小时。收获细胞并用CD11b在4℃染色20min。通过流式细胞术对吞噬作用进行定量。数据是来自2个独立实验的1个代表的n＝2个生物重复的平均值±SD。在图5C中，将人巨噬细胞用或不用人SIRPα-RIPR在37℃预处理30分钟，将Raji细胞用不同的利妥昔单抗(0至5μg/mL)在37℃预处理30分钟，将所述巨噬细胞与Raji细胞在37℃共培养2小时。通过流式细胞术对吞噬作用进行定量。数据是来自2个独立实验的1个代表的n＝2个生物重复的平均值±SD。
实施例6.SIRPα-RIPR双特异性抗体增强人SIRPα的去磷酸化
该实施例描述了为证明根据本公开文本的一些实施方案的示例性SIRPα-RIPR双特异性抗体可增强人SIRPα的去磷酸化而进行的实验。
根据本公开文本的一些实施方案的双特异性抗体SIRPα-RIPR设计的非限制性例子示于图6B中。图6B还显示了AB21和基于AB21的人SIRPα-RIPR分子的示意图，以及AB21、具有GS接头(例如GGGGTGGS；SEQ ID NO:9)的SIRPα-RIPR、具有3C接头(LEVLFQGP；SEQ ID NO:11)的SIRPα-RIPR的氨基酸序列。抗体AB21与人SIRPα和来自不同小鼠品系(PCT公开号WO2018057669 A1)的小鼠SIRPα的亲和力结合示于图6A中。
为证明AB21 SIRPα-RIPR增强人SIRPα的去磷酸化而进行的实验的结果。AB21SIRPα-RIPR增强人S SIRPα的去磷酸化示于图7A-图7C中。SIRPα-RIPR机制的示意图示于图7A中。针对CD45和SIRPα的双特异性双抗体的示意图示于图7B中。将HEK293细胞用人HA-SIRPα、Lck和人CD45瞬时转染，转染后24小时，使细胞保持不处理(泳道1)或将细胞在37℃与Ab21(泳道2和3)或SIRPα-RIPR(GS)(泳道4、5)孵育20min，以诱导将CD45磷酸酶顺式募集到SIRPα的细胞内结构域。包括CD45死亡组用于对照目的。裂解后，用直接缀合到磁珠上的抗HA抗体使嵌合受体免疫沉淀。通过蛋白质印迹探测样品的pTyr和SIRPα(图7C)。数据代表三个独立的生物重复。
实施例7.SIRPα-RIPR减少SIRPα强直性信号传导并增强人巨噬细胞的ADCP
本实施例描述了为证明SIRPα-RIPR减少SIRPα信号传导并增强人巨噬细胞的ADCP而进行的实验的结果。检测到来自静息THP1巨噬细胞的免疫沉淀后的SIRPα磷酸化(图8A)。在SIRPαIP之前，将THP1巨噬细胞与500nM AB21或SIRPα-RIPR在37℃下孵育30分钟。使用从人PBMC分离并与Raji细胞一起孵育的巨噬细胞进行体外吞噬作用测定(ADCP)，所述Raji细胞用指定浓度(图8B)或1μg/mL(图8C)的利妥昔单抗预处理。将巨噬细胞与靶细胞在37℃孵育2小时。通过流式细胞术对吞噬作用进行定量。数据是来自2个独立实验的1个代表的n＝2个生物重复的平均值±SD。
实施例8.SIRPα-RIPR减少SIRPα强直性信号传导并增强鼠巨噬细胞的ADCP
本实施例描述了为证明SIRPα-RIPR减少SIRPα强直性信号传导并增强鼠巨噬细胞的ADCP而进行的实验的结果。根据本公开文本的一些实施方案的双特异性抗体SIRPα-RIPR设计的另一非限制性例子说明于图9A-图9B中。AB21和基于AB21的鼠SIRPα-RIPR分子的示意图，以及AB21、具有GS接头的SIRPα-RIPR、具有3C接头(LEVLFQGP；SEQ ID NO:11)的SIRPα-RIPR的氨基酸序列示于图9A中。使AB21和SIRPα-RIPR在Hi5细胞中表达。通过尺寸排阻色谱法分析蛋白质(图9B)。
为证明上文图9A-图9B中所述的双特异性抗体SIRPα-RIPR可减少SIRPα强直性信号传导并增强小鼠巨噬细胞的ADCP而进行的实验的结果总结于图10A-图10C中。如图10A-图10C中所示，SIRPα-RIPR减少SIRPα信号传导并增强小鼠巨噬细胞的ADCP。将HEK293细胞用小鼠HA-SIRPα、Lck和小鼠CD45瞬时转染，转染后24小时，使细胞保持不处理(泳道1)或将细胞在37℃与Ab21(泳道2和3)或SIRPα-RIPR(GS)(泳道4、5)孵育30min，以诱导将CD45细胞内结构域顺式募集到SIRPα的细胞内结构域。包括CD45死亡组用于对照目的。裂解后，用直接缀合到磁珠上的抗HA抗体使嵌合受体免疫沉淀。通过蛋白质印迹探测样品的pTyr和SIRPα。数据代表三个独立的生物重复(图10A)。检测到来自静息J774巨噬细胞的免疫沉淀后的SIRPα磷酸化的检测。在SIRPαIP之前，将J774巨噬细胞与AB21或小鼠SIRPα-RIPR在37℃下孵育30min(图10B)。将小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)细胞与用或不用2μg/mL抗TRP-1mAb(TA99)预处理的B16F10(CFSE标记的)在37℃孵育2小时。包括小鼠CD47纳米抗体A4用于对照目的。通过流式细胞术对吞噬作用进行定量。数据是来自2个独立实验的1个代表的n＝2个生物重复的平均值±SD(图10C)。
实施例9.SIRPα-RIPR增强骨髓来源的树突细胞(BMDC)的成熟
该实施例描述了为证明SIRPα-RIPR促进骨髓树突细胞(BMDC)成熟而进行的实验的结果。在这些实验中，将鼠BMDC在补充有20ng/mL GM-CSF的完全RPMI1640培养基中培养。培养基在第3天更换一半，在第6天完全更换。收获所述细胞并在第7天用SIRPα-RIPR配体处理。在这些实验中，使用实施例8和图9A-图9B中描述的双特异性抗体SIRPα-RIPR。如图11B中所示，将所述BMDC细胞用200nM AB21 scFv或SIRPα-RIPR在37℃刺激24小时。通过流式细胞术分析CD11c+群体上的CD86。还包括用脂多糖(LPS，1μg/mL)处理的对照组用于对照目的。
已知CD86在暴露于LPS的BMDC中上调。CD86与T细胞中存在的CD28相互作用并增强T细胞应答。BMDC的有效成熟与增强的T细胞溶细胞活性相关。CD86上调是BMDC成熟过程的一部分，通常也称为BMDC“引发”。在这些实验中，观察到CD86在用SIRPα-RIPR处理的BMDC中也高度上调，表明SIRPα-RIPR促进处理的BMDC的成熟。
实施例10.SIRPα-RIPR增强小鼠骨髓树突细胞(BMDC)的成熟
本实施例描述了为证明小鼠SIRPα-RIPR增强小鼠骨髓树突细胞(BMDC)的成熟而进行的实验的结果。树突细胞(DC)是专职抗原呈递细胞(APC)，其主要作用是加工抗原并将抗原呈递给T淋巴细胞以诱导适应性免疫。DC是由不同种类组成的。人DC亚型包括常规DC(cDC)、浆细胞样DC(pDC)和单核细胞来源的DC(moDC)，它们都来自单独的造血前体细胞。BMDC和moDC通常用于研究炎症状态下的DC。pDC、cDC1和cDC2是人和小鼠二者中稳态DC群体的三个子集。
图12A显示了BMDC分化的示意图。对共刺激分子(CD83、CD86)、MHC分子(MHC-I、MHC-II)、趋化因子受体CCR-7和PD-L1在CD11c+群体上的表面表达的分析示于图12B-图12D中。在这些实验中，将BMDC细胞用200nM AB21 scFv或SIRPα-RIPR在37℃刺激24小时。通常，在补充有20ng/mL GM-CSF的完全RPMI1640培养基中培养鼠BMDC。培养基在第3天更换一半，在第6天完全更换。收获所述细胞并在第7天用SIRPα-RIPR配体处理。
通过流式细胞术分析共刺激分子(CD83、CD86)、MHC分子(MHC-I、MHC-II)、趋化因子受体CCR-7和PD-L1在CD11c+群体上的表面表达。通常，将BMDC细胞用针对CD83、CD86、MHC-I、MHC-II、CCR-7和PD-L1的抗体染色并通过FACS测量，通过FlowJo分析结果。
实施例11.SIRPα-RIPR增强cDC2细胞的成熟
该实施例描述了为证明SIRPα-RIPR增强cDC2细胞的成熟而进行的实验的结果。测试C57BL/6脾脏中常规树突细胞和红髓巨噬细胞(RPM)上的SIRPα-RIPR的一般工作流示于图13A中。观察到cDC2和RPM比cDC1表达高得多的SIRPα水平。在这些实验中，cDC1和RPM用作研究cDC2的对照。将C57BL/6小鼠用200μg AB21 scFv或SIRPα-RIPR腹膜内处理6小时。分离脾细胞。通过流式细胞术分析CD80、CD86、MHC-I、MHC-II、CCR-7、PD-L1和PD-L2在cDC1、cDC2或RPM上的表面表达，并且结果示于图13B-图13B中。通常，将分离的脾细胞用针对CD83、CD86、MHC-I、MHC-II、CCR-7、PD-L1、CD11b、CD11c和/或XCR-1的抗体染色。将CDC1细胞设门为CD11c+、CD11b+XCR1+。将CDC2细胞设门为CD11c+、CD11b+XCR1-。通过FACS测量后，通过FlowJo分析结果。
实施例12.SIRPα-RIPR增强BMDC中的促炎细胞因子产生
本实施例描述了为证明SIRPα-RIPR增强BMDC中的促炎细胞因子产生而进行的实验的结果。如图14中所示，将100,000个BMDC细胞用200nM AB21 scFv或SIRPα-RIPR在37℃刺激24小时。通过ELISA对上清液中的IL-12和IFNγ进行定量。通常，将鼠BMDC在补充有20ng/mL GM-CSF的完全RPMI1640培养基中培养。培养基在第3天更换一半，在第6天完全更换。收获培养的细胞并在第7天用SIRPα-RIPR配体处理。将约100,000个BMDC细胞接种在96孔板中且在37℃下用200nM AB21 scFv或SIRPα-RIPR刺激24小时。以1600rpm离心4分钟后，收集上清液。根据制造商的说明书(ELISA试剂盒，BioLegend)通过IL-12和IFNγELISA确定上清液样品中IL-12、IFNγ的水平。在SpectraMax i3x读板器中测量结果并在GraphpadPrism中绘图。
本实施例中描述的实验结果表明，IL-12是对Th1细胞的诱导重要的促炎细胞因子。IFNγ的产生也反映了DC细胞的激活。特别地，在该研究中，观察到SIRPα-RIPR诱导IL-12或IFNγ的产生比AB21高3-4倍。SIRPα-RIPR介导的SIRP沉默导致DC激活。
实施例13.SIRPα-RIPR增强DC的交叉呈递
该实施例描述了为证明SIRPα-RIPR增强DC的交叉呈递而进行的实验的结果。卵清蛋白肽257-264(SIINFEKL；SEQ ID NO:32)的交叉呈递的示意图示于图15A中。研究了OVA257-264肽对OT-I细胞增殖的剂量反应效应。将OT-I细胞从OT-I小鼠的淋巴结中分离并通过CD8 MACS试剂盒纯化。将BMDC细胞用10pM OVA257-264肽在37℃脉冲处理3小时。将50,000个APC细胞与CTV+OT-I细胞在200nM AB21 scFv或SIRPα-RIPR存在下1:1共培养5天。通过FACS对OVA257-264肽对OT-I细胞增殖的剂量反应效应进行定量(图15B)。通过流式细胞术分析Cell Trace Violet(CTV)在OT-I细胞中的稀释并对CD3+CD8+群体设门(图15C)。
IL-12由DC细胞响应于病毒或细菌病原体的感染而产生，其衔接DC成熟与细胞毒性T细胞应答。在SIRPα-RIPR处理的DC中检测到高水平的IL-12，这表明SIRPα-RIPR可能促进抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。因此，进行本实施例中描述的实验，以在体外通过CFSE标记来评价CD8+OT-I T细胞对卵清蛋白(OVA)脉冲处理的DC的增殖反应。如预期的，发现AB21和SIRPα-RIPR都促进CD8+T细胞的增殖。令人惊讶地，如与AB21相比，SIRPα-RIPR诱导高2-3倍的CD8+T细胞。不受任何特定理论的束缚，这些结果表明SIRPα-RIPR介导的SIRP沉默在增强CTL应答中是有效的，这可能是诱导抗肿瘤反应的有效手段。
实施例14.SIRPα-RIPR增强BMDC诱导OT-II细胞增殖的能力
本实施例描述了为证明SIRPα-RIPR增强BMDC诱导OT-II细胞增殖的能力而进行的实验的结果。卵清蛋白肽323-239(ISQAVHAAHAEINEAGR；SEQ ID NO:33)的抗原呈递的示意图示于图16A中。研究了OVA323-339肽对OT-II细胞增殖的剂量反应效应。将OT-II细胞从OT-II小鼠的淋巴结中分离。将BMDC细胞用1nM或100nM卵清蛋白(323-339)肽在37℃脉冲处理4小时。将50,000个APC细胞与CTV+OT-II细胞在200nM AB21 scFv或SIRPα-RIPR存在下1:1共培养5天。通过FACS计数OT-II细胞(图16B)。通过流式细胞术分析CTV在OT-II细胞中的稀释并对CD3+CD4+群体设门(图16C)。
据报道，cDC2负责引发CD4 T细胞。因此，通过SIRPα-RIPR增强的cDC2的激活导致了如下假设：SIRPα-LIPR可能增强OT-II T细胞激活。因此，进行本实施例中描述的实验，以通过与SIRPα-RIPR或Ab对照处理的BMDC细胞共培养来评价抗原特异性CD4+OT-II增殖。观察到与AB21相比，SIRPα-RIPR诱导更高水平的OT-II增殖。该结果表明SIRP信号传导负调节DC中的CD4 T细胞引发活性。因此，通过SIRPα-RIPR减少SIRP信号传导可增强CD4 T细胞引发。
实施例15.SIRPα-RIPR增强BMDC诱导同种异体T细胞增殖的能力
本实施例描述了为证明SIRPα-RIPR增强BMDC诱导同种异体T细胞增殖的能力而进行的实验的结果。在这些实验中，进行同种异体混合淋巴细胞反应(MLR)，以通过评估T淋巴细胞的功能和增殖能力来评价通过BMDC中的SIRPα-RIPR使SIRP信号传导沉默是否影响与T淋巴细胞的相互作用。可以通过用CTV标记MLR培养物中的细胞来区分T细胞。通过分析T细胞增殖，观察到SIRPα-RIPR处理中的T细胞增殖多于AB21。
混合淋巴细胞反应(MLR)的示意图示于图17A中。将来自BALB/c小鼠的BMDC与来自C57BL/6的50,000个同种异体脾T细胞在500nM AB21 scFv或SIRPα-RIPR存在下以不同比率一起孵育。通过FACS计数CD8+T细胞。MLR结果示于图17B中。通过流式细胞术分析CTV在CD8+T细胞中的稀释并对CD3+CD8+群体设门(图17C)。
实施例16.SIRPα-RIPR增强抗肿瘤反应
本实施例描述了为证明SIRPα-RIPR增强KP1肺癌中的抗肿瘤反应而进行的实验的结果。向F1小鼠植入1×106个KP1细胞，然后从第9天开始每隔一天用200μg AB21scFv(n＝5)、SIRPα-RIPR(n＝5)或抗CD47(n＝5)治疗。从第8天开始测量肿瘤大小。如图18中所示，SIRPα-RIPR增强KP1肺癌中的抗肿瘤反应。
实施例17.SIRPα-RIPR增强肿瘤相关巨噬细胞的浸润
本实施例描述了为证明SIRPα-RIPR增强KP1肿瘤中肿瘤相关巨噬细胞的浸润而进行的实验的结果。通过Ficoll分离肿瘤浸润淋巴细胞，并针对泛巨噬细胞标记物F4/80和CD11b进行染色(n＝10)(图19A)。通过FACS对CD206+肿瘤相关的巨噬细胞进行定量(n＝10)(图19B)。在这些实验中，在SIRPα-RIPR治疗后第5天的肿瘤描述于图18中。对于小鼠肿瘤，首先根据斯坦福大学批准的方案将小鼠安乐死，并用70％乙醇喷洒肿瘤区域。使用无菌剪刀和镊子切除肿瘤。切除并切碎小鼠肿瘤。使细胞悬浮液通过细胞粗滤器。将30ml细胞悬浮液与20ml Ficoll-Paque培养基混合，在20℃下以1025×g离心20min，缓慢加速并关闭制动器。将单个核细胞层转移到无菌管中。然后洗涤细胞并用针对CD45、CD11b、CD206、CD86、CD11c、F4/80、CD19、NK1.1、CD3、CD19和Live/Dead的抗体染色。通过FACS测量后，通过FlowJo分析结果。图19A-图19B中描述的实验结果一起说明，SIRPα-RIPR增强KP1肿瘤中肿瘤相关巨噬细胞的浸润。
实施例18.SIRPα-RIPR增强DC成熟
本实施例描述了为证明SIRPα-RIPR增强KP1肿瘤中的DC成熟而进行的实验的结果。针对DC标记物CD11c对肿瘤浸润淋巴细胞进行染色(n＝10)(图20A)。通过FACS对CD86+DC进行定量(n＝10)(图20B)。
在这些实验中，在SIRPα-RIPR治疗后第5天的肿瘤描述于图18中。对于小鼠肿瘤，首先根据斯坦福大学批准的方案将小鼠进行安乐死，并用70％乙醇喷洒肿瘤区域。使用无菌剪刀和镊子切除肿瘤。切除并切碎小鼠肿瘤。使细胞悬浮液通过细胞粗滤器。将30ml细胞悬浮液与20ml Ficoll-Paque培养基混合，在20℃下以1025×g离心20min，缓慢加速并关闭制动器。将单个核细胞层转移到无菌管中。然后洗涤细胞并用针对CD45、CD11b、CD206、CD86、CD11c、F4/80、CD19、NK1.1、CD3、CD19和Live/Dead的抗体染色。通过FACS测量后，通过FlowJo分析结果。图20A-图20B中描述的实验结果一起说明，SIRPα-RIPR增强KP1肿瘤中的DC成熟。
虽然已经公开了本公开文本的特定替代方案，但应理解的是，各种修改和组合是可能的并且被考虑在所附权利要求的真实精神和范围内。因此，不旨在限制于本文呈现的确切摘要和公开文本。
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Velcro SIRP-RIPR(GS)
<400> 1
Trp Gln Pro Pro Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr
1 5 10 15
Phe Gly Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu
20 25 30
Ala Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg
35 40 45
Asp Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Gln Ala Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr
50 55 60
Asp Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp
65 70 75 80
Ala Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn
85 90 95
Tyr Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile
100 105 110
Glu Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly
115 120 125
Ser Glu Val Gln Leu Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val
130 135 140
Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
145 150 155 160
Thr Phe Thr Asn Tyr Ile Ile His Trp Val Lys Gln Glu Pro Gly Gln
165 170 175
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Phe Asn Pro Tyr Asn His Gly Thr Lys
180 185 190
Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser
195 200 205
Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr
210 215 220
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Pro Tyr Ala Trp Phe Asp Thr
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Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Thr Arg
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Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Asp Ile Leu
260 265 270
Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala
275 280 285
Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Thr Ser Ile Gln Trp
290 295 300
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Arg Ser Ser
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Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Ser Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
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<220>
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245 250 255
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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115 120 125
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260 265 270
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325 330 335
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<220>
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<223> Synthetic construct
<220>
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Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Asp Val Gln Leu
245 250 255
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260 265 270
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305 310 315 320
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
325 330 335
Thr Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Thr
340 345 350
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<220>
<223> Synthetic construct
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<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
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Tyr Gln Gln Lys Ala Pro Gly Ser Ala Leu Val Thr Val Ile Tyr Ser
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50 55 60
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Asn Ala Met Ser
145 150 155 160
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala Gly Ile
165 170 175
Ser Ala Gly Gly Ser Asp Thr Tyr Tyr Pro Ala Ser Val Lys Gly Arg
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195 200 205
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<210> 10
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
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1 5
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 12
Gly Gly Gly Ser
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic construct
<400> 13
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1
<210> 14
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 14
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 15
Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 16
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 16
Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 17
Ser Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 18
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 19
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 20
<211> 250
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Bases 1-250 may be present or absent
<400> 20
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
180 185 190
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250
<210> 21
<211> 250
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Bases 1-250 may be present or absent
<400> 21
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
165 170 175
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
180 185 190
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
195 200 205
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
245 250
<210> 22
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Bases 1-20 may be present or absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(22)
<223> X is any amino acid that can be inserted into the sequence and
not result in a polypeptide comprising the sequence GSG
<400> 22
Gly Gly Gly Xaa Xaa Gly Gly Gly Xaa Xaa Gly Gly Gly Xaa Xaa Gly
1 5 10 15
Gly Gly Xaa Xaa Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 23
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Bases 6-25 may be present or absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(25)
<223> X is any amino acid that can be inserted into the sequence and
not result in a polypeptide comprising the sequence GSG
<400> 23
Gly Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 24
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Bases 1-20 may be present or absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa is proline
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa is serine
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Xaa is proline
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa is serine
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Xaa is proline
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> Xaa is serine
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> Xaa is proline
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> Xaa is serine
<400> 24
Gly Gly Gly Xaa Xaa Gly Gly Gly Xaa Xaa Gly Gly Gly Xaa Xaa Gly
1 5 10 15
Gly Gly Xaa Xaa Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 25
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Bases 1-20 may be present or absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa is glycine
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa is glutamine
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Xaa is glycine
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa is glutamine
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Xaa is glycine
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> Xaa is glutamine
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> Xaa is glycine
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> Xaa is glutamine
<400> 25
Gly Gly Gly Xaa Xaa Gly Gly Gly Xaa Xaa Gly Gly Gly Xaa Xaa Gly
1 5 10 15
Gly Gly Xaa Xaa Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 26
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Bases 1-20 may be present or absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa is glycine
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa is alanine
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Xaa is glycine
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa is alanine
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Xaa is glycine
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> Xaa is alanine
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> Xaa is glycine
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> Xaa is alanine
<400> 26
Gly Gly Gly Xaa Xaa Gly Gly Gly Xaa Xaa Gly Gly Gly Xaa Xaa Gly
1 5 10 15
Gly Gly Xaa Xaa Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 27
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Bases 6-25 may be present or absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(21)
<223> Xaa is proline
<400> 27
Gly Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 28
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 28
Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 29
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 29
Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 30
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 30
Gly Gly Gly Pro Ser Gly Gly Gly Pro Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 31
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 31
Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Gly Gly Ser Pro Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Ovalbumin peptide 257-264
<400> 32
Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu
1 5
<210> 33
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Ovalbumin peptide 323-239
<400> 33
Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly
1 5 10 15
Arg
<210> 34
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 34
Ala Ala Ala His His His His His His His His
1 5 10

Claims (37)

1.一种多价多肽，所述多价多肽包含：
第一氨基酸序列，其包含能够结合信号调节蛋白α(SIRPα)的第一多肽模块；和
第二氨基酸序列，其包含能够结合R1/R6亚家族的一种或多种受体蛋白酪氨酸磷酸酶(RPTP)的第二多肽模块。
2.根据权利要求1所述的多价多肽，其中所述一种或多种RPTP包含CD45或其功能变体。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的多价多肽，其中所述第一和第二多肽模块中的至少一个包含蛋白结合配体或抗原结合部分的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的多价多肽，其中所述抗原结合部分选自单链可变片段(scFv)、抗原结合片段(Fab)、纳米抗体、VH结构域、VL结构域、单结构域抗体(dAb)、VNAR结构域和VHH结构域、双抗体或其中任一种的功能性片段。
5.根据权利要求3所述的多价多肽，其中所述蛋白结合配体包含细胞表面受体的细胞外结构域(ECD)、或RPTP的ECD或其中任一种的功能变体。
6.根据权利要求5所述的多价多肽，其中所述蛋白结合配体包含CD47的ECD或其功能变体。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的多价多肽，其中所述第一多肽模块经由多肽接头序列与所述第二多肽模块可操作地连接。
8.根据权利要求7所述的多价多肽，其中所述多肽接头序列包含甘氨酸-丝氨酸(GS)接头或3C接头。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的多价多肽，其包含：
(a)(i)CD47 ECD，(ii)多肽接头，和(iii)CD45 scFv；
(b)(i)SIRPαscFv，(ii)多肽接头；和(iii)CD45 scFv；或
(c)(i)CD45 VHH，(ii)多肽接头，和(iii)SIRPαscFv。
10.根据权利要求9所述的多价多肽，其在N末端至C末端方向上包含：
(a)(i)CD47 ECD，(ii)GS接头，和(iii)CD45 scFv；或
(b)(i)CD47 ECD，(ii)C3接头，和(iii)CD45 scFv。
11.根据权利要求9所述的多价多肽，其在N末端至C末端方向上包含：
(a)(i)SIRPαscFv，(ii)GS接头，和(iii)CD45 scFv；或
(b)(i)SIRPαscFv，(ii)C3接头，和(iii)CD45 scFv。
12.根据权利要求9所述的多价多肽，其在N末端至C末端方向上包含：
(a)(i)CD45 VHH，(ii)GS接头，和(iii)SIRPαscFv；或
(b)(i)CD45 VHH，(ii)C3接头，和(iii)SIRPαscFv。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的多价多肽，其中所述多价多肽包含具有与选自SEQ ID NO:1-6的氨基酸序列至少80％序列同一性的氨基酸序列。
14.一种重组核酸分子，所述重组核酸分子包含编码根据权利要求1-13中任一项所述的多价多肽的核苷酸序列。
15.根据权利要求14所述的重组核酸分子，其中所述核苷酸序列编码具有与选自SEQID NO:1-6的氨基酸序列至少80％序列同一性的氨基酸序列。
16.一种重组细胞，所述重组细胞包含：
(a)根据权利要求1-13中任一项所述的多价多肽，和/或
(b)根据权利要求14-15中任一项所述的重组核酸分子。
17.根据权利要求16所述的重组细胞，其中所述重组细胞是吞噬性细胞。
18.根据权利要求17所述的重组细胞，其中所述吞噬性细胞是树突细胞。
19.一种用于在体外促进未成熟树突细胞(DC)成熟的方法，所述方法包括：
(a)将未成熟DC暴露于抗原；以及
(b)在根据权利要求1-13中任一项所述的多价多肽存在下培养所述未成熟DC以诱导未成熟DC成熟为成熟DC。
20.一种通过根据权利要求19所述的方法制备的成熟树突细胞。
21.一种用于制造疫苗的方法，所述方法包括：
(a)在体外将未成熟DC暴露于抗原以产生足够数量的抗原呈递未成熟DC；以及
(b)在根据权利要求1-13中任一项所述的多价多肽存在下促进所述抗原呈递未成熟DC的成熟以产生成熟的抗原呈递DC。
22.一种通过根据权利要求21所述的方法制造的疫苗。
23.根据权利要求22所述的疫苗，其还包含稀释剂、赋形剂、辅助佐剂、细菌佐剂和/或全身佐剂。
24.一种药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的赋形剂，和以下：
(a)根据权利要求1-13中任一项所述的多价多肽；
(b)根据权利要求14-15中任一项所述的重组核酸分子；和/或
(c)根据权利要求16-17中任一项所述的重组细胞；
(d)根据权利要求20所述的成熟树突细胞；和/或
(e)根据权利要求22-23中任一项所述的疫苗。
25.一种用于调节受试者中通过CD47和/或SIRPα介导的细胞信号传导的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含以下的组合物：
(a)根据权利要求1-13中任一项所述的多价多肽；
(b)根据权利要求14-15中任一项所述的重组核酸分子；
(c)根据权利要求16-17中任一项所述的重组细胞；
(d)根据权利要求20所述的成熟树突细胞；
(e)根据权利要求22-23中任一项所述的疫苗；和/或
(f)根据权利要求24所述的药物组合物。
26.一种用于预防或治疗有需要的受试者的健康情况的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含以下的组合物：
(a)根据权利要求1-13中任一项所述的多价多肽；
(b)根据权利要求14-15中任一项所述的重组核酸分子；
(c)根据权利要求16-17中任一项所述的重组细胞；
(d)根据权利要求20所述的成熟树突细胞；
(e)根据权利要求22-23中任一项所述的疫苗；和/或
(f)根据权利要求24所述的药物组合物。
27.根据权利要求25-26中任一项所述的方法，其中所施用的组合物将RPTP活性募集到SIRPα的空间附近，增强SIRPα的去磷酸化，减少SIRPα介导的信号传导，促进树突细胞成熟和/或促进巨噬细胞吞噬作用。
28.根据权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所施用的组合物赋予巨噬细胞介导的吞噬作用的增强。
29.根据权利要求25-28中任一项所述的方法，其中所述受试者患有或疑似患有与CD47和/或SIRPα相关的健康情况。
30.根据权利要求25-29中任一项所述的方法，其中所述健康情况是癌症或慢性感染。
31.一种用于预防或治疗有需要的受试者中的癌症的方法，所述方法包括：
在体外将针对抗原的未成熟DC与癌症相关抗原或感染相关抗原一起培养，以产生抗原呈递未成熟DC；
在根据权利要求1-13中任一项所述的多价多肽存在下促进抗原呈递未成熟DC的成熟以产生成熟的抗原呈递DC；以及
向所述受试者施用产生的成熟抗原呈递DC。
32.一种预防或治疗感染或疑似感染寄生虫、病毒、微真菌或细菌的受试者的方法，所述方法包括：
将未成熟DC与源自寄生虫、病毒、微真菌或细菌的抗原一起培养以产生抗原呈递树突细胞；
在根据权利要求1-13中任一项所述的多价多肽存在下促进树突细胞的成熟以产生成熟的抗原呈递DC；以及
向所述受试者施用产生的成熟抗原呈递DC。
33.根据权利要求25-32中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物受试者。
34.根据权利要求33所述的方法，所述哺乳动物受试者是人。
35.根据权利要求26-34中任一项所述的方法，将所述组合物单独地或作为与第二疗法组合的第一疗法施用于所述受试者。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述第二疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、毒素疗法或手术，进一步包括对所述受试者施用第二疗法。
37.一种用于调节受试者中的细胞信号传导或用于预防或用于治疗有需要的受试者中的健康情况的试剂盒，所述试剂盒包含其使用说明书和以下中的一项或多项：
(a)根据权利要求1-13中任一项所述的多价多肽；
(b)根据权利要求14-15中任一项所述的重组核酸分子；
(c)根据权利要求16-17中任一项所述的重组细胞；
(d)根据权利要求20所述的成熟树突细胞；
(e)根据权利要求22-23中任一项所述的疫苗；和
(f)根据权利要求24所述的药物组合物。
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