CN112105646A - 抗人SIRPa v1抗体的用途和生产抗SIRPa v1抗体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于免疫治疗领域。本发明提供了可用于治疗应用和诊断应用的靶向人SIRPa的抗体，所述抗体增强了抗原向T细胞的交叉呈递。本发明还提供了针对SIRPa的特定同工型并且能够破坏SIRPa的这些同工型与人CD47之间相互作用的抗体，该抗体用于治疗或预防疾病或诊断应用，以及生产和/或筛选抗人SIRPa抗体的方法，所述抗人SIRPa抗体以不同的亲和力与人SIRP成员的各种同工型结合。

Description

抗人SIRPa v1抗体的用途和生产抗SIRPa v1抗体的方法
技术领域
本发明属于免疫治疗领域。本发明提供了可用于治疗应用和诊断应用的靶向人SIRPa的抗体，所述抗体增强了抗原向T细胞的交叉呈递。本发明还提供了针对SIRPa的特定同工型(isoform)且能够破坏SIRPa的这些同工型与人CD47之间相互作用的抗体，该抗体用于治疗或预防疾病或诊断应用。本发明还涉及生产和/或筛选抗人SIRPa抗体的方法，该抗人SIRPa抗体以不同亲和力与人SIRP成员的各种同工型结合。
背景技术
适应性免疫的靶向免疫检查点已显示出抗击多种癌症的巨大治疗功效。对髓样细胞(例如巨噬细胞、树突状细胞(DC)、髓源性抑制细胞(MDSC，myeloid-derived suppressorcell)以及多形核白细胞或嗜中性粒细胞(PMN))的免疫检查点的研究仍不足，而这些细胞代表了许多实体瘤中丰度最高的免疫细胞类型且通常与不良结果有关。
信号调节蛋白α(SIRPa，也称为SIRP-α、SIRPa、CD172a或SHPS-1)在单核细胞、组织巨噬细胞的大部分亚群(subpopulation)、粒细胞、淋巴组织中DC的子集(subset)和某些骨髓祖细胞中表达，在神经元上的表达水平不同，并且在大脑的富含突触的区域(例如小脑的颗粒层和海马)中显著表达。
SIRPa是封闭的相关SIRP蛋白的SIRP配对受体家族的原型成员(prototypicmember)，SIRP蛋白包括SIRPa、SIRPg(也称为SIRP-γ、SIRPγ、CD172g或SIRPβ-2)和SIRPb(也称为SIRP-β、SIRPβ、CD172b)。信号调节蛋白(SIRP)构成细胞表面糖蛋白家族，它们在髓样细胞(包括巨噬细胞、粒细胞、髓样树突状细胞和肥大细胞)和神经元细胞中表达(总结于Barclay,A.N.和Brown,M.H.,Nat Rev Immunol 6,457-64(2006)；也参见WO97/48723)。CD47是一种广泛表达的跨膜糖蛋白，CD47充当SIRPa的细胞配体并与SIRPa的NH2末端的细胞外末端结合。就SIRPa对巨噬细胞吞噬宿主细胞的抑制作用而言，SIRPa的作用已得到最好的证明。特别地，巨噬细胞上的SIRPa与靶细胞上表达的CD47的结合产生抑制信号，该抑制信号负调控吞噬作用。然而，最近发现也证明了通过SIRPa结合介导的另外的正信号传导作用(Shultz,L.D.等J Immunol 154,180-91)。
编码SIRPa的基因是多形基因(polymorphic gene)，已知了人类群体中的几种SIRPa变体。最常见的人SIRPa变体是SIRPa v1和SIRPa v2(登录号分别为NP_542970(P78324)和CAA71403)，SIRPa家族通常分为这两个子集，即SIRPa v1同工型家族和SIRPav2同工型家族。
SIRPa由髓样细胞表达，SIRPa与遍在受体(ubiquitous receptor)CD47相互作用，此种相互作用是先天反应的重要免疫检查点，参与调节髓样功能。SIRPa和CD47之间的相互作用提供了抑制宿主细胞吞噬作用的下调信号。由于CD47在某些癌细胞中广泛地过表达，因此CD47充当包含这些细胞的某些肿瘤内的“不要吞噬我(don’t eat me)”信号，从而避免了吞噬作用。近年来，已对CD47-SIRPa相互作用在癌细胞清除中的潜在作用进行了深入研究。据显示，肿瘤中CD47受体的丰度与患者的总体生存率呈负相关，并构成了几种癌症类型的不良预后因素。
因此，对SIRPa/CD47通路进行了不同的药物开发以增强巨噬细胞的吞噬作用。已提出多种方法来破坏CD47/SIRPa相互作用，以实现生物学结果。这些方法包括使用片段化/截短的SIRPa蛋白和/或CD47蛋白及它们的抗体。即使癌细胞包被有治疗性抗体，这些癌细胞中CD47的过表达也会使它们对巨噬细胞产生抗性。据显示，通过靶向CD47的药剂阻断SIRPa/CD47通路可增强巨噬细胞的抗体依赖性吞噬作用。还描述了这些治疗与耗竭型(depleting)治疗性抗癌抗体(例如曲妥珠单抗(Trastuzumab)(抗Her2)、西妥昔单抗(Cetuximab)(抗EGFR)、利妥昔单抗(Rituximab)(抗Cd20)和阿仑妥珠单抗(Alemtuzumab)(抗CD52))协同作用。
尽管如此，最近显示抗CD47药剂显示出涉及CD47生理作用的血液学毒性。例如，这些抗CD47药剂可能引起贫血或血小板减少。此外，CD47还与SIRP家族的其他成员一起参与其他通路。实际上，CD47还与人T细胞表面存在的SIRPg结合，但不与人髓样细胞表面存在的SIRPg结合。SIRPg/CD47相互作用介导细胞-细胞粘附、增强超抗原依赖性T细胞介导的增殖并共刺激T细胞活化(Piccio等，2005)。
因此，近年来已开发出能够仅结合一种SIRP且能够破坏CD47与SIRPa的结合的抗人SIRP抗体，以避免不希望的效果(例如抑制T细胞增殖)。不幸的是，由于SIRPa蛋白家族的特性，当患者细胞表达的SIRPa蛋白为SIRPa v1或SIRPa v2时，现有技术的抗体可能无法有效治疗涉及SIRPa的疾病。一些抗体可能可用于治疗SIRPa v1患者，但对治疗SIRPa v2患者的治疗功能可能会降低，反之亦然。由于某些癌症的治疗与患者的表型密切相关，因此需要针对每个患者的细胞表达的同工型的抗体。因此，现有技术仍需要以更高的特异性靶向SIRPa的新型改良药剂(特别是抗体)。还需要生产此类特异性抗体的方法、筛选这些抗体的方法以及在接受此类治疗前确定患者是否可能对抗人SIRPa抗体的治疗产生反应的方法。
本领域还需要增强抗原呈递细胞(APC)的抗原交叉呈递。APC(特别是树突状细胞)在肿瘤发生、疾病发展、疾病进展以及对治疗的反应中起独特而多样的作用。例如，树突状细胞主动摄取肿瘤相关抗原，对肿瘤相关抗原进行加工并将抗原肽呈递给T细胞，从而诱导并维持肿瘤特异性T细胞应答。树突状细胞(DC)也称为专职性APC。树突状细胞与不同免疫效应细胞的相互作用也可以支持先天性抗肿瘤免疫力，以及还可以支持已知在某些情况下会抑制肿瘤发展的体液反应。另一方面，DC通过特异性的肿瘤来源因子和基质来源因子被募集到肿瘤部位，这可能会损害DC的成熟、分化和/或功能，从而导致抗肿瘤免疫应答的形成不足，或树突状细胞介导的耐受性和免疫抑制的发展。识别肿瘤环境中的DC刺激因子和DC抑制/极化因子以及DC调节机制对于设计有效的基于DC的疫苗以及恢复免疫缺陷的常驻型(resident)DC至关重要，这些常驻型DC负责维持癌症患者的临床相关抗肿瘤免疫力(Zong等，2016)。SIRPa阴性的树突状细胞被描述为在小鼠和人体内交叉呈递抗原的最有效的APC。已知DC SIRPa阳性的交叉呈递效率较低(Meral等，2013；Nierkens等，2015；Segura等，2015)。
癌细胞表达肿瘤抗原，包括由非同义突变产生的新抗原，但抗原呈递较差。负责维持癌症患者的临床相关抗肿瘤免疫力的免疫缺陷常驻型树突状细胞的恢复是需要考虑的重要治疗项目。用抗体增强存在于特定癌症中的肿瘤抗原或突变抗原的交叉呈递对于治疗或预防某些疾病(包括癌症)将具有重大意义。CD47/SIRPa信号通路可能对调节抗原向T细胞的交叉呈递有重要意义(Criscitiello，2012；Ilyas和Yang，2015；Vigneron，2015)。
抗原呈递的缺陷代表了癌症中的主要免疫逃逸机制，而抗原呈递的下调/缺失是癌症中的主要免疫逃逸机制(Sánchez-Paulete等，2017)。因此，需要一种在使用时能增强抗原交叉呈递的产品。
PCT/EP/2017/059071专利申请描述了新型抗SIRPa抗体，该新型抗SIRPa抗体能够特异性降低SIRPa与CD47之间的相互作用而不会影响SIRPg与CD47之间的相互作用。WO201356352专利公开描述了从称为文库F的噬菌体展示(display)文库中筛选抗SIRPa抗体(SIRP29)，该文库F用于筛选结合SIRPa v1和SIRPa v2且不结合SIRPb和SIRPg的结合物。其中公开的抗体能够识别群体中的两种变体。而且，本发明的发明人的确表明SIRP29抗体实际上能够结合SIRPg并破坏SIRPg-CD47相互作用。
WO2015138600专利公开提供了与抗SIRPa抗体有关的组合物和方法。此公开的抗体结合人SIRPa并可以阻断目标靶细胞上表达的CD47与吞噬细胞上表达的SIRP的相互作用。该抗体可用于各种治疗方法。在某些情况下，抗SIRPa抗体可与SIRPa结合，但不会刺激表达SIRPa的细胞中的SIRPa信号传导。此外，其中描述的抗体能够结合SIRPg并阻断CD47和SIRPg之间的相互作用。
因此，现有技术中描述的抗体缺乏区分SIRP家族的各个成员的能力，需要特异性更高的抗体；特别地，需要用于预防或治疗几种疾病的抗体。
发明内容
一方面，提供了抗人SIRPa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体，用于治疗接受治疗的患者为SIRPa v1阳性(即，SIRPa等位基因是纯合子(v1/v1)或SIRPa等位基因是杂合子(v1/v2))的病症。
在一个具体实施方式中，提供了抗人SIRPa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体，所述抗人SIRPa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体包括：
重链可变结构域，该重链可变结构域包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，
其中：
HCDR1包含或由SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列组成。
HCDR2包含或由SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列组成；特别地，HCDR2包含或由SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列组成。
HCDR3包含或由SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列组成；特别地，HCDR3包含或由SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列组成；特别地，HCDR3包含或由SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列组成；
以及
轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含或由选自SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17的氨基酸序列组成；特别地，该轻链可变结构域包含或由SEQ ID NO：17的氨基酸序列组成；
其中，抗人SIRPa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物抑制人CD47与人SIRPav1的结合，但不阻止或抑制人CD47与人SIRPa v2的结合；
用于预防和/或治疗SIRPa v1阳性的受试者的疾病。
在另一个实施方式中，还提供了抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体，所述抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体：
-与人SIRPa v1和/或人SIRPa v2特异性结合，特别是与人SIRPa v1和人SIRPa v2特异性结合，并且抑制人CD47分别与人SIRPa v1和/或人SIRPa v2的结合，特别是抑制人CD47与人SIRPa v1和人SIRPa v2结合；
-不阻止或抑制人CD47与人SIRPg的结合；特别是不与人SIRPg特异性结合；
用于治疗或预防疾病(特别是癌症)，或用于针对疾病(特别是癌症)的治疗性疫苗接种；其中，所述抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体增强在所述疾病(特别是癌症)中表达的抗原的交叉呈递，并且参与引发适用于治疗所述疾病的T细胞应答。
在一个具体实施方式中，根据本发明使用的抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体与人SIRPa v1特异性结合，并抑制人CD47与SIRPa v1的结合。根据本发明使用的此种抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体特别适合用于治疗或预防疾病(特别是癌症)，或用于针对SIRPa v1阳性患者的疾病(特别是癌症)的治疗性疫苗接种。
本发明还提供了抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体，所述抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体包括：
重链可变结构域，该重链可变结构域包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，
其中：
HCDR1包含或由SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列组成；
HCDR2包含或由SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列组成；特别地，HCDR2包含或由SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列组成；
HCDR3包含或由SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列组成；特别地，HCDR3包含或由SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列组成；特别地，HCDR3包含或由SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列组成；
以及
轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含或由其选自SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17的氨基酸序列组成；特别地，该轻链可变结构域包含或由SEQ ID NO：17的氨基酸序列组成；
所述抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体增强抗原呈递细胞(特别是树突状细胞)向人T细胞(特别是人CD8+ T细胞)的抗原(特别是癌症抗原)的交叉呈递；
用于治疗或预防疾病(特别是癌症)，或用于针对疾病(特别是癌症)的治疗性疫苗接种；其中，抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体增强在所述疾病(特别是癌症)中表达的抗原的交叉呈递，并参与引发适用于治疗所述疾病的T细胞应答。
在本发明的一个具体实施方式中，用于预防和/或治疗疾病(特别是本文所述的特定疾病)的抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体包括：重链可变结构域，该重链可变结构域包含或由选自SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23的氨基酸序列组成；特别地，该重链可变结构域包含或由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成。
“抗人SIRPa v1抗体”是对SIRPa v1表现出明显的结合亲和力并且对人SIRPa v2和/或人SIRPg不表现出明显的结合亲和力的抗体，在每种情况下结合亲和力均可通过本领域已知的方法检测，例如但不限于Biacore分析、Blitz分析、ELISA测定或Scatchard图。“抗SIRPa v1抗体”也可定义为对SIRPa v1表现出明显的结合亲和力并且阻断人CD47与人SIRPa v1之间的相互作用、不阻断人CD47与人SIRPa v2之间的相互作用以及在一个优选实施方式中不阻断人CD47与人SIRPg之间相互作用的抗体。应理解，“阻断相互作用”意味着抗体对CD47/SIRPa v1相互作用具有拮抗作用。以否定形式使用，该术语指抗体对CD47/SIRPav2相互作用不具有拮抗作用；在一个优选实施方式中，此外，抗体对CD47/SIRPg相互作用不具有拮抗作用。
如本文所用，术语“抗体”指任何种类的抗体，例如单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体和人源化抗体。
本发明的抗体包括单克隆和多克隆抗体。如本文所用，与包含具有不同氨基酸序列的抗体的混合物的“多克隆”抗体制剂形成对比，“单克隆抗体”意指分享共同重链氨基酸序列和共同轻链氨基酸序列的抗体分子的制剂。单克隆抗体可通过几种已知技术(例如噬菌体展示、细菌展示、酵母展示或核糖体展示)以及经典方法(以杂交瘤产生的抗体为例)来产生。因此，术语“单克隆”用于指来自一种核酸克隆的所有抗体。
本发明的抗体包括重组抗体。如本文所用，术语“重组抗体”指通过重组方式产生、表达、形成或分离的抗体，例如，使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体；从重组组合抗体文库中分离的抗体；从由人免疫球蛋白基因转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体；或以任何其他方式(特定免疫球蛋白基因序列(例如人免疫球蛋白基因序列)与其他DNA序列组装在一起)产生、表达、形成或分离的抗体。例如，重组抗体包括嵌合抗体和人源化抗体。
本发明的抗体包括嵌合抗体。如本文所用，“嵌合抗体”指一种抗体，其中源自一种哺乳动物物种(例如小鼠)的生殖系(germline)的可变结构域的序列被接枝到源自另一种哺乳动物物种(例如人类)的生殖系的恒定结构域的序列上。
本发明的抗体包括人源化抗体。如本文所用，“人源化抗体”指一种抗体，其中源自另一种哺乳动物物种(例如小鼠)的生殖系的CDR序列被接枝到人框架序列上。
如本文所用，“抗体的抗原结合片段”指抗体的一部分(即对应于本发明抗体的结构的一部分的分子)，该部分可能以其天然形式表现出对SIRPa v1的抗原结合能力；与相应的四链(four-chain)抗体的抗原结合特异性相比，此种片段尤其对所述抗原表现出相同或基本相同的抗原结合特异性。有利地，抗原结合片段具有与相应的四链抗体相似的结合亲和力。然而，本发明包括相对于相应的四链抗体抗原结合亲和力降低的抗原结合片段。抗原结合能力可通过测量抗体和靶片段之间的亲和力来确定。这些抗原结合片段也可称为抗体的“功能片段”。
抗体的抗原结合片段是这样的片段：其包含称为CDR(互补决定区)的其高变结构域或其包含抗原(即SIRPa v1的胞外域)识别位点的部分，从而明确了抗原识别特异性。
四链免疫球蛋白的每个轻链可变结构域和重链可变结构域(分别为VL和VH)具有三个CDR，分别称为VL-CDR1(或LCDR1)、VL-CDR2(或LCDR2)、VL-CDR3(或LCDR3)和VH-CDR1(或HCDR1)、VH-CDR2(或HCDR2)、VH-CDR3(或HCDR3)。
本领域技术人员能够通过参考在此方面确立的标准定义来确定抗体的各个区域/结构域的位置，所述标准定义包括参考编号系统、参考KABAT的编号系统或通过应用IMGT“Collier de Perle”算法。在此方面，关于本发明序列的定义，应注意，一个参考系统对区域/结构域的界定可能不同于另一个参考系统对区域/结构域的界定。因此，本发明所述的区域/结构域包括在抗体可变结构域的全长序列内的相关序列的长度或定位变化约+/-10％的序列。
基于四链免疫球蛋白的结构，因此，可通过与现有数据库和现有技术中的抗体序列进行比较(特别是通过比较这些序列中功能结构域的位置)来定义抗原结合片段，注意到，各种类型的抗体(特别是IgG，特别是哺乳动物IgG)的框架和恒定结构域的位置被明确定义。此种比较还涉及与抗体的三维结构有关的数据。
出于说明本发明的具体实施方式的目的，抗体的抗原结合片段包含所述抗体的可变结构域(包含CDR)，所述抗体的抗原结合片段包括Fv、dsFv、scFv、Fab、Fab’、F(ab’)2。Fv片段由通过疏水相互作用结合在一起的抗体的VL结构域和VH结构域组成；在dsFv片段中，VH：VL异二聚体通过二硫键稳定；在scFv片段中，VL结构域和VH结构域通过柔性肽接头彼此连接，从而形成单链蛋白质。Fab片段是可通过木瓜蛋白酶消化抗体获得的单体片段；Fab片段包含通过二硫键结合在一起的整个L链和H链VH-CH1片段。F(ab’)2片段可通过在铰链二硫键下用胃蛋白酶消化抗体而产生；F(ab’)2片段包含两个Fab’片段，另外还包含免疫球蛋白分子的一部分铰链区。Fab’片段可通过切割铰链区的二硫键由F(ab’)2片段获得。F(ab’)2片段是二价(即F(ab’)2片段包含两个抗原结合位点)，例如天然免疫球蛋白分子；另一方面，Fv片段(构成Fab的可变部分的VHVL二聚体)、dsFv片段、scFv片段、Fab片段和Fab’片段是单价的，即它们包含单个抗原结合位点。本发明的这些基础抗原结合片段可结合在一起以获得多价抗原结合片段，例如双抗体、三抗体或四抗体。这些多价抗原结合片段也是本发明的一部分。
如本文所用，术语“修饰的抗体(modified antibody)”包括“双特异性(bispecific)”抗体，并且指由于具有至少一个对第一抗原具有特异性的区域(例如源自第一抗体的可变区)和至少一个对第二抗原具有特异性的第二区域(例如源自第二抗体的可变区)而能识别两种不同抗原的抗体。双特异性抗体特异性结合两种靶抗原，因此是多特异性抗体的一种。识别两种以上不同抗原的多特异性抗体可通过重组DNA方法产生，或者包括但不限于通过任何便捷的化学方法产生的抗体。双特异性抗体包括能够识别两种不同抗原的所有抗体或抗体的缀合物或抗体的聚合形式。双特异性抗体包括经还原和重组以保留其二价特征的抗体，以及经化学偶联从而可对每种抗原具有多个抗原识别位点的抗体，例如BiME(双特异性巨噬细胞增强抗体，bispecific macrophage enhancing antibody)、BiTE(双特异性T细胞衔接分子，bispecific T cell engager)、DART(双亲和重新靶向，Dualaffinity retargeting)、DNL(对接和锁定，dock-and-lock)、DVD-Ig(双可变结构域免疫球蛋白，dual variable domain immunoglobulin)、HAS(人血清白蛋白，human serumalbumin)、kih(杵臼结构，knobs into holes)。
抗原结合抗体模拟物是特异性结合抗原但与抗体在结构上不相关的有机化合物。抗体模拟物通常是摩尔质量约为3kDa至20kDa的人工肽或小蛋白质。有时，核酸和小分子也被视为抗体模拟物，而不是被视为人工抗体、抗体片段和由这些组成的融合蛋白。与抗体相比，抗体模拟物的常见优势是更好的溶解度、组织渗透性、热稳定性和酶稳定性以及相对较低的生产成本。抗体模拟物被开发为治疗剂和诊断剂。抗原结合抗体模拟物也可选自：亲和体(affibody)、Affilin、亲和性多聚体(affimer)、Affitin、DARPin和单克隆抗体。
更优选地，抗原结合抗体模拟物选自Affitin和Anticalin。Affitin是具有选择性结合抗原能力的人工蛋白质。Affitin在结构上源自在嗜酸热硫化叶菌Sulfolobusacidocaldarius(属于古细菌属结构域的微生物)中发现的DNA结合蛋白Sac7d。通过随机化Sac7d结合表面上的氨基酸，例如通过生成对应于Sac7d结合界面的11个残基的随机取代的变体，可以生成Affitin文库并使所得蛋白质文库经历多轮核糖体展示，亲和力可以针对各种靶标(例如肽、蛋白质、病毒和细菌)。Affitin是抗体模拟物，正在被开发作为生物技术中的工具。Affitin还被用作各种酶的特异性抑制剂(Krehenbrink等，J.mol.Biol.,383:5,2008)。技术人员可以使用本领域已知的方法(特别是如专利申请WO2008068637和以上引用出版物中所公开的方法)容易地开发出具有所需结合特性的Affitin，特别是使用本文所公开抗原产生和筛选噬菌体展示文库和/或核糖体展示文库。Anticalin是能够结合抗原(蛋白质或小分子)的人工蛋白质。Anticalin是源自天然结合蛋白家族的人脂质运载蛋白(lipocalin)的抗体模拟物。Anticalinn小约八倍，大小为约180个氨基酸，质量为约20kDa(Skerra,Febs J.,275:11,2008)。已经产生了Anticalin噬菌体展示文库，该Anticalin噬菌体展示文库可用于筛选和选择特别是具有特定结合特性的Anticalin。技术人员可使用本领域已知的方法(特别是如EP专利EP1270725B1、US专利US8536307B2、Schlehuber和Skerra，Biophys Biophys.Chem.,96:2-3,2002以及以上引用出版物中所公开的方法)容易地开发具有所需结合特性的Anticalin，特别是使用本文所公开抗原产生和筛选噬菌体展示文库和/或核糖体展示文库。Anticalin和Affitin均可在许多表达系统(包括细菌表达系统)中产生。因此，本发明包括具有本文所述抗体的特性的Affitin、Anticalin和其他类似抗体模拟物的用途，特别是关于它们结合SIRPa v1的能力、抑制人CD47与人SIRPa v1结合以及它们对人SIRPa v2的非结合特性和/或它们缺乏阻止或抑制人CD47与人SIRPa v2结合的能力方面的用途，所有这些(即Affitin、Anticalin和其他类似抗体模拟物)均被认为是本发明的模拟物。
因此，本发明的双特异性抗体针对SIRPa v1和不存在于人SIRPa v2或人SIRPg上的第二抗原。在本发明的任何实施方式中，修饰的抗人SIRPa v1抗体可以是双特异性的，且可以被定义为修饰的抗体或其修饰的抗原结合片段或修饰的抗原结合抗体模拟物或双特异性嵌合分子。
如本文所用，“修饰的抗体”还可对应于包含抗体或其抗原结合片段的分子，其中，所述单克隆抗体或其功能片段与功能不同的分子相关。本发明的修饰的抗体可以为由任何合适的结合形式产生的融合嵌合蛋白或缀合物，所述结合形式包括共价结合、接枝、与化学基团或生物基团或与分子(例如PEG聚合物或适合在体内抵抗蛋白酶切割的另一种保护性基团或分子)化学键合，用于改善抗体或功能片段的稳定性和/或半衰期。用类似的技术(特别是通过化学偶联或接枝)，修饰的抗体可用生物活性分子来制备，例如，所述活性分子选自：毒素(特别是假单胞菌外毒素A、植物毒素蓖麻毒素A链或皂草素毒素，特别是治疗活性成分)、适用于将抗体或功能片段靶向人体特定细胞或组织的载体(特别是蛋白质载体)，或者(特别是当使用抗体片段时)所述修饰的抗体可以与标记物或接头缔结。将抗体或其功能片段PEG化(PEGylation)是特别有用的实施方式，因为特别是对于治疗应用而言，PEG化改善了向宿主递送活性物质的条件。PEG化可以为位点特异性的，以防止干扰抗体或功能片段的识别位点，PEG化可以用高分子量PEG进行。可通过存在于抗体或功能片段的序列中的游离半胱氨酸残基或通过在抗体或功能片段的氨基序列中添加的游离半胱氨酸残基来实现PEG化。根据本发明，当使用术语“抗体”时，它指抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体。
在一个实施方式中，对抗SIRPa v1抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物进行修饰。
在本发明的一个具体实施方式中，用于预防和/或治疗SIRPa v1阳性受试者疾病的抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体包含重链链可变结构域，该重链链可变结构域包含或由选自SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23的氨基酸序列组成；特别地，该重链可变结构域包含或由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成。
在本发明的一个具体实施方式中，用于预防和/或治疗SIRPa v1阳性的人类受试者的本文所述疾病的抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体包含或由以下组成：
-重链可变结构域，该重链可变结构域包含或由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成；
-轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含或由SEQ ID NO：17的氨基酸序列组成。
因此，本发明还涉及特异性结合人SIRPa v1、抑制人CD47与人SIRPa v1结合并且不阻止或抑制人CD47与人SIRPa v2结合的抗体或其抗原结合片段，用于治疗或预防SIRPav1阳性受试者的疾病。所述抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体特异性地结合SIRPa v1，并拮抗SIRPa v1与CD47之间的相互作用。
术语“特异性结合”或任何等同术语指抗体或其抗原结合片段与人SIRPa v1相互作用并与人SIRPa v1结合的能力，而它们不结合或以显著更弱的结合亲和力与其他分子(特别是SIRPa v2，特别是人SIRPg，特别是人SIRPa v2和人SIRPg)结合。结合和特异性可通过SPR(表面等离子共振，例如Biacore)、ELISA或Western Blot分析来进行评估。在一个具体实施方式中，抗体或其抗原结合片段或包含所述抗体的嵌合分子或抗原结合抗体模拟物以至少10E-9M(特别是至少10E-10M)的亲和力(KD)靶向并结合作为分离蛋白的SIRPa v1。例如，根据本发明使用的抗体对SIRPa v1(特别是通过Blitz分析)可以显示出10E-8M至10E-11M、优选10E-9M至10E-10M的KD值。
用于预防和/或治疗疾病的抗体不阻止或抑制人CD47与人SIRPa v2的结合。换言之，与人CD47与人SIRPa v1的结合相反，此抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体对人CD47与人SIRPa v2的结合没有显著影响。特别地，在结合测定中，与阴性对照分子相比，抗体或抗原结合片段对人CD47与人SIRPa v2结合的阻止或抑制不超过70％，优选60％，优选50％和最优选25％。CD47和SIRP v2(或SIRPg)之间的结合可根据本发明的实施例中公开的方法(特别是实施例6中公开的Blitz法)进行评估，也可通过Biacore分析、ELISA测定或流式细胞术用表达SIRPa v2和/或SIRPg的细胞进行评估。当对应于CD47与SIRPa v2(或SIRPg)的亲和力的KD值超过1E-7M时，就认为结合被阻止或被抑制。
结合的阻止或抑制可通过本领域技术人员已知的各种方法来测定；这些方法包括但不限于Biacore分析、Blitz分析和Scatchard图。
人CD47与人SIRPa v1结合的降低或抑制指抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体降低SIRPa v1与CD47之间的相互作用，即抗体或其抗原结合片段部分或完全抑制人CD47与人SIRPa v1的结合，换言之，特异性结合人SIRPa v1并拮抗人SIRPav1与人CD47之间的相互作用。特别地，在结合测定中，与阴性对照分子相比，抗人SIRPa v1抗体或其抗原结合片段具有将人CD47与人SIRPa v1的结合降低或抑制至少50％、优选60％、更优选70％、更优选80％、最优选90％的能力；在一个具体实施方式中，抗人SIRPa v1抗体或其抗原结合片段将人CD47与人SIRPa v1的结合降低或抑制了100％。特别地，在结合测定中，与阴性对照分子相比，抗SIRPa v1抗体或其抗原结合片段具有将人CD47与人SIRPav1的结合降低或抑制50％至100％、更优选60％至90％的能力。
根据本发明，如果在SIRPa v2结合竞争测定(特别是Blitz测定)中，抗体(或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物)引起的人CD47的KD值的增加不超过5log(优选不超过4log、更优选不超过3log、更优选不超过2log、最优选不超过1log)，则可认为该抗体(或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体)不阻止或抑制人CD47与人SIRPa v2的结合。或者，在结合测定中，与阴性对照分子相比，如果抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物不能使人CD47与人SIRPa v2的结合降低超过25％，则可认为该抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物不阻止或抑制人CD47与人SIRPa v2的结合。
在本发明的一个具体实施方式中，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段可以表现出与SIRPa v2的过渡(transitional)结合，但不阻止或抑制人CD47与人SIRPa v2的结合。根据本发明使用的抗人抗体、其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物显著地抑制、减少、拮抗或竞争人CD47与人SIRPa v1的结合，而同一抗体、抗原结合其片段或抗原结合抗体模拟物不会降低、拮抗、抑制或竞争人CD47与人SIRPa v2的结合。可以使用如本申请的实施例中所示方法来测定拮抗作用。
SIRPa v1阳性受试者是包含至少一种SIRPa v1等位基因的人，即，SIRPa v1是杂合(包含SIRPa v1和SIRPa v2等位基因)或SIRPa v1是纯合(包含两个SIRPa v1等位基因)的人。根据本发明，人SIRPa v1可以被定义为满足以下条件的SIRPa：在SEQ ID NO：3的第44位或SEQ ID NO：24的第14位包含氨基酸残基L；或在SEQ ID NO：3的第50位或SEQ ID NO：24的第20位包含氨基酸残基T；或在SEQ ID NO：3的第52位或SEQ ID NO：24的第22位包含氨基酸残基T；或在SEQ ID NO：3的第54位或SEQ ID NO：24的第24位包含氨基酸残基R；或在SEQID NO：3的第57位或SEQ ID NO：24的第27位包含氨基酸残基A；或在SEQ ID NO：3的第75位或SEQ ID NO：24的第45位包含氨基酸残基G；或在SEQ ID NO：3的第95位或SEQ ID NO：24的第65位包含氨基酸残基D；或在SEQ ID NO：3的第96位或SEQ ID NO：24的第36位包含氨基酸残基L；或在SEQ ID NO：3的第100位或SEQ ID NO：24的第70位包含氨基酸残基N；或在SEQID NO：3的第107位或SEQ ID NO：24的第77位包含氨基酸残基R；或在SEQ ID NO：3的第109位或SEQ ID NO：24的第79位包含氨基酸残基G；或在SEQ ID NO：3的第130位或SEQ ID NO：24的第100位包含氨基酸残基D；或在SEQ ID NO：3的第132位或SEQ ID NO：24的第102位包含氨基酸残基V。在本发明的一个具体实施方式中，人SIRPa v1在SEQ ID NO：3的第132位包含氨基酸残基V且在SEQ ID NO：3的第130位上包含氨基酸残基D，或分别在SEQ ID NO：24的第100位和第102位包含氨基酸残基D和氨基酸残基V。或者，SIRPa v1可以被定义为在其氨基酸序列中包含SEQ ID NO：1的序列的SIRPa同工型，而SIRPa v2同工型可以被定义为在其氨基酸序列中包含SEQ ID NO：2的序列的SIRPa同工型。或者，SIRPa v1阳性受试者可以被定义为如下受试者：该受试者的基因组在SIRPa等位基因内包含编码SIRPa RNA的基因，该SIRPa RNA被翻译成SIRPa蛋白，该SIRPa蛋白在SEQ ID NO：3的第130位和第132位或者在SEQ ID NO：24的第100位和第102位分别具有氨基酸残基D和氨基酸残基V。
本发明基于本发明人的出乎意料的发现：某些抗人SIRPa抗体不能同等地结合SIRPa的不同同工型，某些抗体可用于治疗、预防(从而特别是包括抑制、减慢)SIRPa v1阳性受试者的疾病或病症(特别是涉及CD47和/或SIRPa的疾病，特别是SIRPa v1阳性受试者体内CD47过表达的疾病)的进展或减轻与之相关症状。
在本发明的一个具体实施方式中，抗体或其抗原结合片段用于治疗和/或预防选自下组的疾病：传染性疾病、慢性炎性疾病、自身免疫性疾病、神经系统疾病、脑损伤、神经损伤、红细胞增多症、血色素沉着病、创伤、感染性休克(sceptic shock)、慢性传染性疾病(特别是假单胞菌传染性疾病和巨细胞病毒传染性疾病)、纤维化、动脉粥样硬化、肥胖症、II型糖尿病、黑色素瘤和移植物失功(transplant dysfunction)。在一个具体实施方式中，抗体用于预防和/或治疗癌症，特别是炎性癌症和具有浸润的髓样细胞(特别是浸润的树突状细胞和/或髓源性抑制细胞(MDSC)和/或肿瘤相关的巨噬细胞(TAM))的癌症。在本发明的一个具体实施方式中，抗体用于治疗和/或预防黑色素瘤、创伤或感染性休克。在一个具体实施方式中，抗体或其抗原结合片段用于针对疾病(特别是癌症，特别是炎性癌症和具有浸润的髓样细胞的癌症，特别是具有浸润的树突状细胞和/或MDSC细胞和/或TAM细胞的癌症)的治疗性疫苗接种。在一个具体实施方式中，抗体或其抗原结合片段用于治疗和/或预防CD47过表达的疾病。在另一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段用于治疗和/或预防黑色素瘤。本发明的抗体或其抗原结合片段的使用增强了抗原呈递细胞(APC)对抗原的交叉呈递，特别是增强了APC向T细胞交叉呈递抗原，特别是增强了树突状细胞向CD8+ T细胞交叉呈递抗原。由于抗原的交叉呈递增加，因此特别是当疾病与CD47过表达有关时，更特别是当疾病与癌细胞或肿瘤细胞的CD47过表达有关时，抗体或其抗原结合片段的使用可用于针对SIRPa v1阳性受试者的所述疾病(特别是癌症)的治疗性疫苗接种。可通过比较来自同一组织的癌细胞和健康组织中的CD47表达来评估CD47的过表达。可通过本领域已知的方法(例如，通过例如RT-qPCR对mRNA进行定量，或者通过流式细胞术、Western Blot、ELISA等对蛋白质进行定量)来评估CD47表达。
在一个具体实施方式中，抗体或其抗原结合片段用于预防和/或治疗癌症，其中，至少一种选自下组的抗原被表达(特别是过表达)：人乳头状瘤病毒、爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒、梅克尔细胞多瘤病毒(Merkel cell polyomavirus)、人类免疫缺陷病毒、人T细胞白血病病毒、人类疱疹病毒8、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、巨细胞病毒；或单点突变抗原，所述单点突变抗原源自CTNNB1基因、CASP8基因、hER2基因、p53基因、KRAS基因、NRAS基因的抗原；或肿瘤抗原，特别是产生自或源自下组的肿瘤抗原：ras癌基因(oncogene)、BCR-ABL肿瘤抗原、ETV6-AML1肿瘤抗原、黑色素瘤抗原编码基因(MAGE，melanoma-antigen encoding gene)、BAGE抗原、GAGE抗原、ssx抗原、ny-eso-1抗原、周期蛋白A1(cyclin-A1)肿瘤抗原、MART-1抗原、gp100抗原、CD19抗原、前列腺特异抗原、前列腺酸性磷酸酶抗原、癌胚抗原、甲胎蛋白抗原、癌抗原125、粘蛋白16抗原、粘蛋白1抗原、人端粒酶逆转录酶抗原、EGFR抗原、MOK抗原、RAGE-1抗原、PRAME抗原、野生型p53抗原、癌基因ERBB2抗原、唾液酸Tn肿瘤抗原、肾母细胞瘤(Wilms tumor)1抗原、间皮素抗原、碳水化合物抗原、B-连环蛋白抗原、MUM-1抗原、CDK4抗原和ERBB2IP抗原，特别是Melan-A黑色素瘤肿瘤相关抗原(TAA)。作为替代或作为补充，抗体或其抗原结合片段用于针对癌症的治疗性疫苗接种，在所述癌症中至少一种选自上述抗原的抗原被表达(特别是过表达)。
在本发明的一个具体实施方式中，使用的抗人SIRPa v1抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体具有以下特性：
-它不特异性结合人SIRPa v2；
-它不抑制或阻止人CD47与人SIRPg的结合，特别是它不与人SIRPg结合。
根据本发明，如果抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体(特别是通过Blitz分析)对SIRPa v2的结合亲和力低于1E-8M(更优选低于1E-7M)，则可认为所述体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体不与人SIRPa v2特异性结合。当SIRPa v1阳性受试者是SIRPa v1杂合的时，可提高不特异性结合人SIRPa v2的抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物的生物有效性(bio-availability)。
根据本发明，如果在SIRPg结合竞争测定(例如通过Blitz分析)中，抗体(或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物)不引起人CD47与人SIRPg结合的KD值增加或引起的人CD47与人SIRPg结合的KD值的增加低于5log(优选低于4log、更优选低于3log、更优选低于2log、最优选低于1log)，则可认为该抗体(或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体)不抑制或阻止人CD47与人SIRPg的结合。在一个具体实施方式中，如果抗体或其抗原结合片段或抗原结合模拟物(特别是通过Blitz分析)对SIRPg的KD值高于10E-8M(优选高于10E-7M、更优选高于10E-6M)，则所述抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物不与人SIRPg特异性结合。
用于治疗和/或预防SIRPa v1阳性受试者的疾病的抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体还可具有以下特性中的至少一种(特别是以下特性中的至少两种、特别是以下特性中的至少三种、特别是以下所有特性)：
-它以至少10E-8M(特别是至少10E-9M、更优选至少10E-10M)的亲和力(KD)与人SIRPav1结合；和/或
-它不抑制(特别是体内)人T细胞的增殖和/或活化；和/或
-它促进巨噬细胞的活化；和/或
-它促进抗原呈递细胞向人T细胞(特别是人CD8+ T细胞)的至少一种抗原的交叉呈递。
如前所述，可通过例如SPR(表面等离子共振，例如Biacore)、ELISA、流式细胞术或Western Blot分析来评估抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体对人SIRPa v1的结合能力。
可根据本领域已知的方法(特别是在本发明的实施例中所述的方法，例如胸腺嘧啶掺入法)来评估(特别是体内)人T细胞的增殖和/或活化。在一个具体实施方式中，与阴性对照相比，使用抗SIRPa v1抗体或其抗原结合片段或其抗原结合抗体模拟物或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体不会降低或抑制T细胞增殖超过20％。与使用抗人CD47抗体相反，使用抗人SIRPa v1抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物对人T细胞增殖没有显著影响，而抗CD47抗体会抑制人T细胞的增殖。
可根据各种方法(包括本发明的实施例中所述的方法)来评估人巨噬细胞的活化。在一个具体实施方式中，当巨噬细胞的趋化因子MIP-1a/CCL-3和/或趋化因子MIP-1b/CCL4的分泌与阴性对照相比增加(特别是趋化因子MIP-1a/CCL-3和/或趋化因子MIP-1b/CCL4的分泌与阴性对照相比增加至少20％)时，则所述巨噬细胞被活化。
可通过各种方法(包括本发明的实施例中所述的方法)来评估抗原呈递细胞将至少一种抗原交叉呈递给人T细胞(特别是人CD8+ T细胞)。特别地，当T细胞分泌的IL-2增加特别是至少20％(更优选至少50％)时，则认为交叉呈递被增强。或者，当T细胞分泌的IFNg增加特别是至少20％(更优选至少50％)时，则交叉呈递被增强。
本发明还涉及多肽(特别是抗原)在生产和/或筛选用于如上所述用途的抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体中的用途。因此，本文提供了特别用于生产抗人SIRPa v1抗体和/或筛选和/或产生此种抗体和/或测试此种抗体的结合亲和力的多肽。为此，还提供了用于筛选抗体、其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物的多肽(特别是抗原)，所述多肽(特别是抗原)包含或由人SIRPa v1的表位组成，所述人SIRPa v1的表位由SEQ ID NO：1(KGSPDDV)或SEQ ID NO：4(KFRKGSPDDVE)或SEQ ID NO：25(DDVEFKSGAGTELSVR)组成，所述抗体、其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物抑制人CD47与人SIRPa v1的结合，且不阻止或减少人CD47与人SIRPa v2的结合，特别是不与人SIRPav2特异性结合。
SEQ ID NO：1对应于被抗人SIRPa抗体识别的表位序列，所述抗人SIRPa抗体具有显著的结合SIRPa v1同工型的能力、抑制人CD47与人SIRPa v1的结合并且不抑制人CD47与SIRPa v2的结合。因此，包含表位序列的多肽可用于产生可用于治疗和/或预防SIRPa v1阳性受试者的疾病的抗体，所述表位序列的氨基酸为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4或SEQ IDNO：25。抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体与表位(或包含表位的区域)之间的特异性结合表明，该抗体对特定蛋白质或抗原(此处为SIRPa v1)上的表位(包含表位的区域)显示出显著的亲和力。“显著的亲和力”或“特异性结合”或“与…特异性结合”包括以约10E-8M(KD)以上的亲和力结合。优选地，当结合亲和力为10E-8M(KD)至10E-12M(KD)(可选地为10-8M(KD)至10E-10M(KD)、特别是为至少10E-8M(KD))时，则认为结合是特异性的。通过特别是比较所述结合结构域和靶蛋白或抗原的反应与所述结合结构域和除靶蛋白之外的蛋白或抗原的反应，可容易地检测结合结构域是否特异性地与靶标反应或结合。术语“特异性结合”或“与…特异性结合”不意味着抗体识别并结合单个靶分子，而是意味着相对于其他分子，该抗体对其靶分子具有更高的结合亲和力，特别是如上所述在给定亲和力下对靶分子具有结合亲和力。以否定形式使用时，术语“特异性结合”或“与…特异性结合”指抗体以低亲和力识别靶分子或不识别靶分子，即抗体与靶分子之间的结合不具有特异性。优选地，当结合亲和力低于10-8M(KD)时，则认为结合不具有特异性。关于可被认为是特异性的结合，所比较的分子特别是SIRPg同工型和SIRPa同工型。
本发明人在本发明的实施例中证明，两种特定的单核苷酸多态性(SNP，SingleNucleotide Polymorphism)(即SNP 15和SNP 16，它们的组合对应于SNP 17)导致本发明的抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体不识别人SIRPa v2。两种SNP均编码位于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：25的表位内的氨基酸残基。由于SIRPa的此特定区域的多态性，抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体能够结合SIRPa v1并破坏人CD47与人SIRPa v1的结合，而不会损害人CD47与人SIRPa v2的结合。此外，此种抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体也不能阻止或抑制人CD47与人SIRPg的结合。特别地，此种抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体不与人SIRPg特异性结合。
包含SEQ ID NO：1的表位的多肽还可以包含至少一种其他表位，即SEQ ID NO：5(SLIPVGP)的表位和/或SEQ ID NO：6(GRELIYNQKEGH)的表位，两者均为被抗人SIRPa v1抗体、其抗原结合片段和抗原结合抗体模拟物或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体识别的线性表位。或者，该多肽还可还包含至少一种选自SEQ ID NO：7(ELIYNQKEGHFPR)和SEQ IDNO：8(RNNMDFSIRIGN)的表位，两者均为被抗人SIRPa v1抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体识别的构象表位。
包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：25的表位的多肽或抗原可用于制备(或生产)抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体，例如通过免疫非人动物(特别是非人哺乳动物)并收集所得的所述免疫的非人动物的血清或B细胞以获得针对多肽内所包含抗原的抗体。然后，可人源化或修饰回收的抗体以获得其抗原结合片段或双功能抗体或双特异性抗体。可将回收的B细胞转化为杂交瘤以产生抗人SIRPa v1抗体。可根据下文详述的筛选方法来回收和筛选产生的抗体。
本发明还涉及编码人SIRPa v1抗原的多核苷酸在生产包含SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：4或SEQ ID NO：5的表位的多肽(特别是抗原)中的用途。多核苷酸可包含SEQ ID NO：26的至少一部分，所述部分包含编码SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：25的表位的核酸残基。SEQ ID NO：26对应于编码SIRPa v1蛋白的cDNA。例如当将多核苷酸插入表达载体(例如质粒)内时，所述多核苷酸可用于生产体系中，用于生产包含SIRPa v1的表位的多肽，所述SIRPa v1的表位包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：25的氨基酸残基。在一个具体实施方式中，多核苷酸编码SEQ ID NO：26的一部分，该部分至少包含：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：25的氨基酸残基；以及SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：6的氨基酸残基；或SEQ ID NO：7和/或SEQ ID NO：8的氨基酸残基。
本发明还涉及筛选和回收(recovery)抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体的方法，所述抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体特异性结合人SIRPa v1，并且降低或抑制人CD47与人SIRPa v1结合，并且不会阻止或抑制人CD47与人SIRPa v2结合。筛选和回收的方法包括以下步骤：
a)测试化合物(即抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体)特异性结合人SIRPa v1的能力，特别是该化合物特异性结合表位的能力，该表位包含或由SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：25组成；特别是该化合物特异性结合分别位于SEQ ID NO：3的SIRPa的第130位和第132位或分别位于SEQ ID NO：24的SIRPa的第100位和第102位的氨基酸残基D和氨基酸残基V的能力；以及
b)测试化合物降低或抑制人CD47与人SIRPa v1结合的能力；以及
c)测试化合物不阻止或抑制人CD47与人SIRPa v2结合的能力；和/或
d)特别地，测试化合物不阻止或抑制人CD47与人SIRPg结合的能力；
以及可选地：
e)测试化合物不特异性结合人SIRPa v2的能力；
f)测试化合物不特异性结合人SIRPg的能力；和/或
所筛选和回收的化合物应具有以下特性：
-它特异性结合人SIRPa v1，特别是以至少1E-9M(特别是10E-9M、更优选至少1E-10M、特别是10E-10M)的亲和力特异性结合人SIRPa v1；
-它降低或抑制人CD47与人SIRPa v1的结合；
-它不阻止或抑制人CD47与人SIRPa v2的结合；
-特别地，它不与人SIRPg特异性结合。
所筛选和回收的化合物还可表现出以下特性中的至少一种(优选以下特性中的至少两种)：
-它不阻止或抑制人CD47与人SIRPg的结合；和/或
-它不与人SIRPa v2特异性结合。
可根据上文所述方法，例如通过SPR(表面等离子共振，例如Biacore)、ELISA或Western Blot分析来评估化合物的结合特异性。特别地，当结合亲和力为至少10E-8M(更优选为至少10E-9M)或者当结合亲和力为10E-8M至10E-11M(更优选为10E-9M至10E-10M)时，该化合物与SIRPa v1特异性结合。当结合亲和力低于1E-8M时，该化合物不特异性结合人SIRPa v2或SIRPg。可通过本文所述方法(特别是竞争性测定，特别是通过Blitz测定)来评估对CD47与人SIRPa v1、人SIRPa v2和人SIRPg的结合的阻止或抑制。如果在SIRPa v1、SIRPa v2或SIRPg结合竞争测定(特别是Blitz测定)中，化合物引起人CD47的KD值的增加不超过5log(优选不超过4log、更优选不超过3log、更优选不超过2log、最优选不超过1log)，则可认为所述化合物不阻止或抑制人CD47与人SIRPa v1、SIRPa v2或SIRPg的结合。相反，如果在SIRPa v1、SIRPa v2或SIRPg结合竞争测定(特别是Blitz测定)中，化合物引起人CD47的KD值的增加超过1log(优选超过2log、更优选超过3log、更优选超过4log、最优选超过5log)，则可认为所述化合物阻止或抑制人CD47与人SIRPa v1、SIRPa v2或SIRPg的结合。
在一个具体方面，筛选化合物的方法可包括以下步骤中的至少一个(特别是以下步骤中的至少两个、特别是以下步骤中的至少三个、特别是以下四个步骤)：
i)在该化合物的存在下测试T细胞的增殖；和/或
ii)在该化合物的存在下测试T细胞的活化；和/或
iii)在该化合物的存在下测试巨噬细胞的活化；和/或
iv)在该化合物的存在下，测试抗原呈递细胞(特别是树突状细胞)向人T细胞交叉呈递抗原(特别是肿瘤抗原、特别是Melan-A黑色素瘤肿瘤相关抗原(TAA))，特别是树突状细胞向CD8+ T细胞交叉呈递抗原。
根据该具体实施方式，所筛选的化合物可表现出以下特性中的至少一种(优选至少两种、更优选至少三种、最优选四种)：
-它不抑制人T细胞的增殖；和/或
-它不抑制人T细胞的活化；和/或
-它促进巨噬细胞的活化；和/或
-它促进抗原呈递细胞向人T细胞(特别是人CD8+ T细胞)交叉呈递抗原。
T细胞增殖和T细胞活化可通过各种方法测定。例如，可通过掺入H3-胸腺嘧啶来测量T细胞的增殖。特别地，当T细胞的增殖与阴性对照相比减少不超过20％时，则认为化合物不抑制T细胞的增殖。例如，T细胞活化可通过流式细胞术、Western Blot、ELISA等通过分析CD25和/或CD69的表达和/或如本发明的实施例中所述地通过评估IFNg和/或IL2的分泌来评估。交叉呈递可根据各种方法(特别是通过本发明的实施例中所述的方法)来评估。特别地，当T细胞分泌的IL-2与阴性对照相比增加至少20％(更优选至少50％)时，则认为交叉呈递被增强。或者，当T细胞的IFNg分泌与阴性对照相比增加至少20％(更优选至少50％)时，交叉呈递被增强。巨噬细胞的活化可通过各种方法(特别是通过本发明的实施例中所述的方法)来评估。特别地，巨噬细胞的活化可通过趋化因子分泌的剂量来评估。特别地，当趋化因子MIP-1a/CCL-3和/或趋化因子MIP-1b/CCL4的分泌与阴性对照相比增加时，特别是当趋化因子的分泌与阴性对照相比增加超过20％时，巨噬细胞被活化。
还提供了一种方法。本文还提供了评估治疗有效性的可能性的体外方法或离体方法；其中，特别是当化合物是抗人SIRPa v1化合物时，将抗人SIRPa化合物(即抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体)施用给人类受试者。该方法包括测定先前从受试者获得的生物样品(例如血液、细胞、活检等)中SIRPa v1的存在。SIRPa v1的存在可通过使用本文所述的抗SIRPa v1化合物或根据本文所述的方法生产的抗SIRPa v1化合物或根据本文所述的方法筛选的抗SIRPa v1化合物进行测定。样品中SIRPa v1的检测表明，用抗人SIRPa v1化合物进行的治疗可能有效。换言之，本发明提供了鉴定可能被抗SIRPa化合物有效治疗的患者的体外方法或离体方法，所述方法包括鉴定SIRPa v1/v1患者、v1/v2患者和v2/v2患者中的所述患者的状况，其中，被分类到v1/v1组或v1/v2组的患者可能被本发明所用的抗SIRPa化合物有效治疗；特别地，向SIRPa v1/v1患者施用的抗SIRPa化合物的治疗剂量可以与向SIRPa v1/v2患者施用的治疗剂量不同(即不太重要)。或者，该方法可包括检测编码SIRPa v1蛋白的基因产物(RNA或DNA)。更特别地，该方法包括确定受试者的SIRPa等位基因(v1等位基因或v2等位基因)的步骤。或者，如果至少一种SIRPa等位基因包含编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：25的氨基酸残基的核酸序列，则认为人类受试者为SIRPa v1阳性。或者，如果至少一种SIRPa等位基因在其外显子3内包含由SIRPa v1 SNP15(rs115287948)和SIRPa v1 SNP 16(rs114499682)或SIRPa v1 SNP 17组成的突变，所述突变在SEQ ID NO：3的第132位或SEQ ID NO：24的第102位编码氨基酸残基V或编码SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：4的氨基酸残基V或SEQ ID NO：25的第一个氨基酸残基V；并且如果至少一种SIRPa等位基因在其外显子3内包含编码SIRPa内的5'DDV 3'氨基酸残基的核酸序列，则认为受试者为SIRPa v1阳性。SIRPa的SNP有据可查且可在Genbank等在线数据库中获得。参考SNP ID号S或“rs”可在NCBI数据库中获得。SIRPa v1 SNP 15和SIRPa v1 SNP 16分别对应于本发明实施例中详述的核酸残基g和t。因此，该方法可包括例如通过聚合酶链反应测定SIRPa等位基因；其中，测定SIRPa v1阳性受试者包括检测SIRPa序列，该SIRPa序列包含对应于人SIRPa外显子3的至少一部分的核酸残基；其中，如上文详述，测定至少一种SIRPa等位基因(特别是两种SIRPa等位基因)内的SIRPa SNP 15和SIRPa SNP 16。
为此，本发明还涉及测定受试者的SIRPa状态的试剂盒，所述试剂盒包含适用于(特别是通过聚合酶链反应(PCR)或特别是通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR))扩增的成对引物、至少一部分SIRPa基因(例如gDNA)或SIRPa转录本(例如mRNA或cDNA)，特别地，所述部分包含SIRPa外显子3的至少一部分，所述部分至少包含如上文或本发明实施例中所述的SIRPa SNP 15和SIRPa SNP 16的定位或如上文或本发明实施例中所述的SIRPa SNP 17的定位以及编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：25的SIRPa v1表位内的第一个氨基酸残基D的密码子的定位。编码SIRPa v2的核酸序列中缺失密码子的定位可通过比对SEQID NO：27(SIRPa v1外显子3)和SEQ ID NO：31(SIRPa v2外显子3)来评估。因此，该成对引物可包括：能与编码SIRPa v1和SIRPa v2的两种核酸序列退火的第一引物；和仅能与SIRPav1的核酸序列退火的第二引物。此类引物的核酸序列可由本领域技术人员通过比对SEQ IDNO：27(SIRPa v1外显子3)和SEQ ID NO：31(SIRPa v2外显子3)来确定。在一个具体实施方式中，能与编码SIRPa v1的核酸序列退火而不能与编码SIRPa v2的核酸序列退火的引物可根据SIRPa v1 SNP的定位来确定，该引物可包括多个SIRPa v1 SNP。在一个具体实施方式中，SIRPa v1特异性引物(特别是在严格条件下)能在核酸序列内退火，所述核酸序列至少编码SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：25的SIRPa v1表位内的氨基酸残基5'DDV3'。或者，该试剂盒包含能与编码SIRPa v1或SIRPa v2的核酸序列退火的一对引物，从而允许扩增基因或转录本的一部分，所述部分包含至少一部分SIRPa外显子3，所述部分至少包含如上文或本发明实施例中所述的SIRPa SNP 15和SIRPa SNP 16的定位或如上文或本发明实施例中所述的SIRPa SNP 17的定位以及编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：25的SIRPa v1表位内的第一个氨基酸残基D的密码子的定位；所述试剂盒还包含探针(即核酸酸探针)、特别是带标记物的探针，该探针能用核酸序列退火，该核酸序列至少编码SEQID NO：1或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：25的SIRPa v1表位内的氨基酸残基5'DDV 3'。
还提供了诊断疾病严重程度的体外方法或离体方法，所述方法特别是适合用于个性化用药(personalized medicine)的诊断方法；其中，根据本文所述方法生产或根据本文所述方法筛选的抗人SIRPa v1化合物(即抗体、其抗原结合片段、抗原结合模拟物或修饰的抗体)用于检测先前从受试者获得的样品中的SIRPa v1阳性细胞，所述方法包括定量SIRPav1的表达。SIRPa v1表达的定量可根据本领域已知的方法来评估，例如通过定量靶蛋白上结合的抗体。
还提供了协助临床医生决定用抗人SIRPa抗体、抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体治疗患者的方法，所述方法包括特别是通过使用本文所公开的抗SIRPa化合物或通过基因分型(genotyping)来测定患者的SIRPa等位基因；其中，用第一治疗剂量的本发明的抗SIRPa v1化合物进行治疗可能对SIRPa v1纯合子患者有效；其中，用本发明的抗SIRPa v1化合物进行治疗可能对SIRPa v2纯合子患者不太有效；其中，用第二治疗剂量的本发明的抗SIRPa v1化合物进行治疗可能对SIRPa v1/v2杂合子患者有效，特别地，第二治疗剂量高于第一治疗剂量。
还提供了协助临床医生决定用抗人SIRPa抗体、抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体治疗患者的方法；其中，如果患者是SIRPa v1/v1纯合子或SIRPa v1/v2杂合子，则用抗人SIRPa化合物治疗患者所需的治疗剂量是不同的。
还提供了化合物组合，所述化合物组合包含抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体(特别是用于本文所述任何用途的抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体，或根据本文所述任何方法生产的抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体，或根据本文所述任何方法筛选的抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体)和至少一种第二治疗剂。第二治疗剂可选自化学治疗剂、放射治疗剂、免疫治疗剂、细胞治疗剂、抗生素和益生菌，特别是免疫治疗剂，该免疫治疗剂选自检查点阻断剂或适应性免疫细胞活化剂，特别选自：抗PDL1、抗PD1、抗CTLA4、抗CD137、抗CD2、抗CD28、抗CD40、抗HVEM、抗BTLA、抗CD160、抗TIGIT、抗TIM-1/3、抗LAG-3、抗2B4、抗VISTA、抗OX40、抗CD40激动剂、CD40-L、TLR激动剂、抗ICOS、ICOS-L、STING激动剂、IDO抑制剂、溶瘤病毒激动剂和B细胞受体激动剂。产品组合用于治疗或预防SIRPa v1阳性受试者的疾病。特别地，组合物可以为药物组合物。当用于全身施用或局部施用时，此种组合物可以包含药学上可接受的组分，例如但不限于药学上合适的赋形剂或载体或媒介物。药学上适合的载体或媒介物指无毒的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、封囊材料和制剂，例如磷酸盐缓冲盐溶液、蒸馏水、乳剂(例如油/水乳剂)、润湿剂等、葡萄糖、盐水、乙醇及它们的组合。
本发明还涉及化合物组合，该化合物组合包含：
(i)抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体，其满足：
-特异性结合人SIRPa v1和/或人SIRPa v2(特别是人SIRPa v1和人SIRPa v2)并且抑制人CD47与SIRPa v1和/或SIRPa v2的结合，特别是抑制人CD47与SIRPa v1和SIRPa v2的结合；
-不阻止或抑制人CD47与人SIRPg的结合；特别是不与人SIRPg特异性结合；
-增强抗原呈递细胞(特别是树突状细胞)向人T细胞(特别是人CD8+ T细胞)交叉呈递抗原(特别是癌症抗原)；
(ii)至少一种第二治疗剂，该第二治疗剂选自化学治疗剂、放射治疗剂、免疫治疗剂、细胞治疗剂、抗生素和益生菌，特别是免疫治疗剂，该免疫治疗剂选自检查点阻断剂或适应性免疫细胞活化剂，特别选自：抗PDL1、抗PD1、抗CTLA4、抗CD137、抗CD2、抗CD28、抗CD40、抗HVEM、抗BTLA、抗CD160、抗TIGIT、抗TIM-1/3、抗LAG-3、抗2B4、抗VISTA、抗OX40、抗CD40激动剂、CD40-L、TLR激动剂、抗ICOS、ICOS-L、STING激动剂、IDO抑制剂、溶瘤病毒激动剂和B细胞受体激动剂；
该化合物组合用于治疗或预防疾病(特别是癌症)，或用于针对疾病(特别是癌症)的治疗性疫苗接种。
在一个具体实施方式中，抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体与人SIRPa v1特异性结合且抑制人CD47与SIRPa v1的结合。
本发明还涉及化合物组合，所述化合物组合包含：抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体(特别是用于本文所述任何用途的抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体，或根据本文所述任何方法生产的抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体，或根据本文所述任何方法筛选的抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体)以及至少一种抗原，所述抗原产生自或源自：人乳头状瘤病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、梅克尔细胞多瘤病毒、人类免疫缺陷病毒、人T细胞白血病病毒、人类疱疹病毒8、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、巨细胞病毒的抗原；或单点突变抗原，所述单点突变抗原源自CTNNB1基因、CASP8基因、hER2基因、p53基因、KRAS基因、NRAS基因的抗原；或肿瘤抗原，特别是产生自或源自下组的的肿瘤抗原：ras癌基因、BCR-ABL肿瘤抗原、ETV6-AML1肿瘤抗原、黑色素瘤抗原编码基因(MAGE)、BAGE抗原、GAGE抗原、ssx抗原、ny-eso-1抗原、周期蛋白A1肿瘤抗原、MART-1抗原、gp100抗原、CD19抗原、前列腺特异抗原、前列腺酸性磷酸酶抗原、癌胚抗原、甲胎蛋白抗原、癌抗原125、粘蛋白16抗原、粘蛋白1抗原、人端粒酶逆转录酶抗原、EGFR抗原、MOK抗原、RAGE-1抗原、PRAME抗原、野生型p53型抗原、癌基因ERBB2抗原、唾液酸Tn肿瘤抗原、肾母细胞瘤1抗原、间皮素抗原、碳水化合物抗原、B-连环蛋白抗原、MUM-1抗原、CDK4抗原和ERBB2IP抗原，特别是Melan-A黑色素瘤肿瘤相关抗原(TAA)。此类化合物组合可用作药物或疫苗组合物，或用于治疗或预防SIRPa v1阳性受试者的疾病。
本发明还提供了化合物组合，该化合物组合包含：
(i)抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体，其包含：
重链可变结构域，该重链可变结构域包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，
其中：
HCDR1包含或由SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列组成；
HCDR2包含或由SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列组成，特别是HCDR2包含或由SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列组成；
HCDR3包含或由SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列组成；特别是HCDR3包含或由SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列组成，特别是HCDR3包含或由SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列组成；
以及
轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含或由其选自SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17的氨基酸序列组成；特别是该轻链可变结构域包含或由SEQ ID NO：17的氨基酸序列组成；
所述抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体增强抗原呈递细胞(特别是树突状细胞)向人T细胞(特别是人CD8+ T细胞)交叉呈递抗原(特别是癌症抗原)；
(ii)至少一种抗原，该抗原选自来自下组的抗原：人乳头状瘤病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、梅克尔细胞多瘤病毒、人类免疫缺陷病毒、人T细胞白血病病毒、人类疱疹病毒8、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HCV、HBC、巨细胞病毒的抗原；或单点突变抗原，所述组抗原源自CTNNB1基因、CASP8基因、hER2基因、p53基因、KRAS基因、NRAS基因的抗原；或肿瘤抗原，特别是产生自或源自下组的肿瘤抗原：ras癌基因、BCR-ABL肿瘤抗原、ETV6-AML1肿瘤抗原、黑色素瘤抗原编码基因(MAGE)、BAGE抗原、GAGE抗原、ssx抗原、ny-eso-1抗原、周期蛋白A1肿瘤抗原、MART-1抗原、gp100抗原、CD19抗原、前列腺特异抗原、前列腺酸性磷酸酶抗原、癌胚抗原、甲胎蛋白抗原、癌抗原125、粘蛋白16抗原、粘蛋白1抗原、人端粒酶逆转录酶抗原、EGFR抗原、MOK抗原、RAGE-1抗原、PRAME抗原、野生型p53抗原、癌基因ERBB2抗原、唾液酸Tn肿瘤抗原、肾母细胞瘤1抗原、间皮素抗原、碳水化合物抗原、B-连环蛋白抗原、MUM-1抗原、CDK4抗原和ERBB2IP抗原，特别是Melan-A黑色素瘤肿瘤相关抗原(TAA)或任何特定的突变抗原(新抗原(neo-antigen)或新表位(neo-epitope))；
所述化合物组合用于治疗或预防疾病(特别是癌症)，或用于针对疾病(特别是癌症)的治疗性疫苗接种；其中，抗原呈递细胞(特别是树突状细胞)向T细胞(特别是CD8+ T细胞)交叉呈递至少一种抗原被增强。
特别地，该疾病选自传染性疾病、慢性炎性疾病、自身免疫性疾病、神经系统疾病、脑损伤、神经损伤、红细胞增多症、血色素沉着病、创伤、感染性休克、慢性传染性疾病(特别是假单胞菌传染性疾病和巨细胞病毒传染性疾病)、纤维化、动脉粥样硬化、肥胖症、II型糖尿病和移植物失功。该疾病也可选自癌症，特别是炎性癌症和具有浸润的髓样细胞(特别是浸润的MDSC细胞和/或TAM细胞)的癌症、癌症转移(特别是乳腺癌转移)、黑色素瘤。在一个具体实施方式中，该疾病是癌症，该癌症具有表达至少一种抗原的癌细胞。
在本发明的一个具体实施方式中，所述组合包含抗体、其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体，用于预防和/或治疗疾病(特别是癌症)，或用于针对疾病(特别是癌症)的治疗性疫苗接种；其中，该抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体增强在所述疾病(特别是癌症)中表达的抗原的交叉呈递，参与引发适用于治疗所述疾病的T细胞应答。
在本发明的一个具体实施方式中，该组合包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含或由选自SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：22和SEQ ID NO：23的氨基酸序列组成；特别地，该重链可变结构域包含或由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成。
在本发明的一个具体实施方式中，该组合包含用于预防和/或治疗疾病的抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体，其包含或由以下组成：
-重链可变结构域，该重链可变结构域包含或由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成；
-轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含或由SEQ ID NO：17的氨基酸序列组成。
DNA和RNA病毒均已证明能在人类中引起癌症。爱泼斯坦-巴尔病毒、人乳头状瘤病毒、乙型肝炎病毒和人类疱疹病毒8(HHV-8，也称为卡波西肉瘤疱疹病毒)是能够引起人类癌症发展的DNA病毒。人类嗜T淋巴细胞病毒I型和丙型肝炎病毒是两种导致人类癌症的RNA病毒。因此，施用包含抗人SIRPa v1化合物和产生自或源自这些病毒的抗原的化合物组合可导致增强这些抗原向人T细胞的交叉呈递，因此可增强针对呈现此种抗原的癌细胞的应答。
特别是当在例如宫颈癌、鼻咽癌、肝癌、卡波西肉瘤和某些白血病中表达病毒抗原(Liao，2006)时，该化合物组合也可用于治疗癌症(carcinoma)。化合物组合也可用于治疗表达巨细胞病毒蛋白的胶质母细胞瘤的用途。例如，梅克尔细胞癌(MCC)是皮肤上越来越常见的神经内分泌癌症，它是非黑色素瘤皮肤癌死亡的主要原因，并与梅克尔细胞多瘤病毒(MCV)有关，这是第一种与人类癌症直接相关的多瘤病毒(Chang和Moore，2012)。化合物组合也可用于治疗表达乙型肝炎病毒蛋白的宫颈癌，和/或颈部肿瘤、皮肤癌，特别是在免疫抑制患者中，和/或肛门生殖器癌。化合物组合还可用于治疗爱泼斯坦-巴尔病毒相关恶性肿瘤，例如B细胞淋巴瘤和T细胞淋巴瘤，例如伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、霍奇金病(Hodgkin’s disease)、移植后淋巴细胞增殖性疾病、平滑肌肉肉瘤和鼻咽癌以及某些情况下的胃癌。化合物组合也可用于治疗HIV感染相关癌症，包括肛门癌、霍奇金病、肺癌、口腔癌、咽喉癌、某些类型的皮肤癌以及和肝癌。
化合物组合也可用于治疗一些抗原性肽由致癌突变产生的癌症。特别地，由CTNNB1基因、CASP8基因和HER2基因产生的抗原可能包含点突变。发现于大肠癌中的高突变率的肿瘤(例如黑色素瘤、肺癌或微卫星不稳定性(MSI))预期会携带更多的突变抗原。其他癌基因(P53、KRAS或NRAS)也与各种癌症相关。还鉴定了血液癌症或ETV6-AML1中源自染色体易位的肽或肿瘤抗原(例如BCR-ABL)。据发现，在所有人类肿瘤中永久活化Ras癌基因的突变为20％至25％，在某些类型的癌症(例如胰腺癌)中，永久活化Ras癌基因的突变高达90％。化合物组合也可用于治疗抗原由癌症生殖系细胞编码的癌症。与癌症生殖系细胞有关的肿瘤抗原是黑色素瘤抗原编码基因(MAGE)。X染色体上有超过25个功能基因被定义为MAGE基因(MAGEA、MAGGE和MAGEC)，MAGEA1、MAGEA2和MAGEA3参与多种癌症。与X染色体也相关的其他基因(例如BAGE、GAGE、LAGE/NY-ESO1、SSX)在多种癌症中表达，但不在正常组织(除生殖系细胞和滋养细胞之外)中表达。据报道，NY-ESO-1在约80％的滑膜细胞肉瘤以及10％至50％的转移性黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌和肺癌中表达。MAGEA3是多种肿瘤(包括黑色素瘤)中最频繁表达的TAA(肿瘤相关抗原)之一。鉴定出源自周期蛋白A1(具有促增殖特性和抗凋亡特性的蛋白)的肽或肿瘤抗原。这些抗原在睾丸和急性髓性白血病中表达。
化合物组合也可用于治疗癌细胞表达低肿瘤特异性的抗原的癌症。大多数鉴定出的分化抗原存在于黑色素瘤细胞，但也存在于健康细胞。源自蛋白质(例如酪氨酸酶，gp100/pmel17、Melan-A/MART-1、gp75/TRP1或TRP2)的肽或肿瘤抗原在黑色素瘤患者和健康志愿者中很常见。MART-1、gp100、CEA、CD19是组织分化抗原，CD19是仅在正常B细胞和恶性B细胞上表达的肿瘤抗原。还从前列腺特异抗原(PSA)和前列腺酸性磷酸酶(PAP)(在正常前列腺组织和肿瘤前列腺组织中表达的两种蛋白质)中鉴定出肽或肿瘤抗原。癌胚抗原(CEA，carcinoembryonic antigen)通常在结直肠癌和其他上皮肿瘤中高表达，但也以低水平存在于肠道的多种正常上皮细胞中以及结直肠癌、胃癌、胰腺癌、非小细胞肺癌和乳腺癌中。甲胎蛋白(AFP)和CEA是在胚胎发育的早期阶段产生的癌胚胎抗原(oncofetalantigen)，在正常情况下在免疫系统发育后消失，但在某些癌症(例如肝细胞癌)中异常存在。CA-125(癌抗原125或MUC16，称为粘蛋白16)在上皮性卵巢癌中升高，但可在多种妇科癌症(子宫内膜癌、输卵管癌)和非妇科癌症(胰腺癌、乳腺癌、乳腺癌、结肠癌和肺癌)中表达。MUC1(粘蛋白1，细胞表面相关蛋白)过表达通常与结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃肠道癌和胰腺癌有关。
化合物组合也可用于治疗癌细胞过表达肿瘤抗原的癌症。过表达的抗原被许多类型的肿瘤所共有。hTERT、EGFR、间皮素是癌细胞过表达的正常蛋白质。hTERT(人类端粒酶逆转录酶)是一种常见的肿瘤抗原，在所有癌症中有约85％癌症表达hTERT。据报道许多抗原性肽或肿瘤抗原被“过表达”，过表达的抗原的一个有用的实例是肾细胞癌上由基因MOK-RAGE-1编码的肽。RAGE-1也在不同组织学类型的肿瘤中表达。PRAME基因产生的抗原也在多种肿瘤类型中过表达，但在各种正常组织中却低水平表达。其他过表达的基因包括那些来自凋亡蛋白存活抑制剂、野生型p53蛋白或癌基因和生长因子ERBB2(HER2/NEU)的基因，这些基因在许多上皮性肿瘤(例如卵巢癌和乳腺癌)中过表达。HER2在许多上皮肿瘤中表达，在所有原发性乳腺癌中有约25％过表达HER2，其中HER2的过表达与预后不良有关。在转移性乳腺癌和其他癌症中发现了唾液酸Tn(STn)肿瘤抗原(核心区碳水化合物抗原)。还鉴定出了源自蛋白质肾母细胞瘤1(WT1最初描述于肾母细胞瘤的遗传病例)的肽或肿瘤抗原。它是一种转录因子，在白血病细胞中的表达水平比正常细胞高10至1000倍，在急性白血病、慢性粒细胞性白血病和骨髓增生异常综合症中也过表达。间皮素是一种细胞表面糖蛋白，仅在胸膜、腹膜和心包膜内的间皮细胞中表达正常，但也在许多癌症(包括恶性间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、肺腺癌、子宫内膜癌、胆道癌、胃癌和小儿急性髓性白血病)中过表达(Hassan等，2016)。
化合物组合也可用于治疗表达肿瘤特异性突变抗原的癌症。可通过鉴定方法(基于外显子组测序或质谱法)来描述突变抗原，并将其分类为个性化的肿瘤抗原。突变抗原也是本发明化合物组合的特异性靶标，本发明化合物组合促进这些抗原的交叉呈递。最初描述于黑色素瘤、B-连环蛋白、CDK4、ERBB2IP的MUM-1是肿瘤特异性突变抗原的实例。CEA、HER2、MUC-1、碳水化合物抗原(Tn、TF、STn)、p53(在癌症中突变的肿瘤抑制基因)、hTERT和WT1是与乳腺癌有关的肿瘤特异性突变抗原。
另一方面，本发明涉及本文以上所述化合物的任何组合，其用于同时、分别或依次地用于易于改善或预防的任何病症或疾病的预防或治疗或预防或疫苗接种。特别地，易于改善的病症或疾病是涉及CD47(特别是CD47过表达)的病症或疾病，所述病症或疾病特别地选自癌症，特别是炎性癌症以及具有浸润的髓样细胞(特别是浸润的MDSC细胞和/或TAM细胞)的癌症、传染性疾病、慢性炎性疾病、自身免疫性疾病、神经系统疾病、脑损伤、神经损伤、红细胞增多症、血色素沉着病、创伤、感染性休克、慢性传染性疾病(特别是假单胞菌和CMV传染性疾病)、纤维化、动脉粥样硬化、肥胖症、II型糖尿病、黑色素瘤和移植物失功，特别是黑色素瘤，特别是癌细胞过表达CD47的癌症。
一方面，本发明涉及如上所述的组合产品，用于通过使单核样髓源性抑制细胞(Mo-MDSC)分化为非抑制性细胞，同时、分别或依次治疗易于改善或预防的任何病症。
在一个实施方式中，本发明涉及通过使单核样髓源性抑制细胞(Mo-MDSC)分化为非抑制性细胞在有需要的受试者中治疗易于改善或预防的任何病症的方法，该方法包括向所述受试者同时、分别或依次施用有效量的如上所述的组合产物，所述受试者为SIRPa v1阳性。
在一个实施方式中，本发明涉及如上所述的组合产品在制备药物中的用途，用于通过使单核样髓源性抑制细胞(Mo-MDSC)分化为非抑制性细胞来治疗易于改善或预防的任何病症，所述受试者为SIRPa v1阳性。
一方面，本发明涉及如上所述的组合产品，用于通过将巨噬细胞极化修饰为促炎性巨噬细胞，同时、分别或依次地治疗易于改善或预防的任何病症。
在一个实施方式中，本发明涉及通过将巨噬细胞极化修饰为促炎性巨噬细胞在有需要的受试者中治疗易于改善或预防的任何病症的方法，该方法包括向所述受试者同时、分别或依次施用有效量的如上所述的组合产品，所述受试者为SIRPa v1阳性。
在一个实施方式中，本发明涉及如上所述的组合产品在制备药物中的用途，用于通过将巨噬细胞极化修饰为促炎性巨噬细胞来治疗易于改善或预防的任何病症。
一方面，本发明涉及如上所述的组合产品，用于同时、分别或依次地用于治疗病理学类型或用于疫苗接种，所述病理学类型选自：癌症、传染性疾病、慢性炎性疾病、自身免疫性疾病、神经系统疾病、脑损伤、神经损伤、红细胞增多症、血色素沉着病、创伤、感染性休克、慢性传染性疾病(例如假单胞菌或CMV)、纤维化、动脉粥样硬化、肥胖症、II型糖尿病和移植物失功。
在一个实施方式中，本发明涉及治疗有需要的患者的病理学类型的方法，所述病理学类型选自：癌症、传染性疾病、慢性炎性疾病、自身免疫性疾病、神经系统疾病、脑损伤、神经损伤、红细胞增多症、血色素沉着病、创伤、感染性休克、慢性传染性疾病(例如假单胞菌或CMV)、纤维化、动脉粥样硬化、肥胖症、II型糖尿病和移植物失功，所述方法包括向所述受试者同时、分别或依次施用有效量的如上所述的组合产品。
在一个实施方式中，本发明涉及如上所述的组合产品在制备用于治疗病理学类型或用于疫苗接种的药物中的用途，所述病理学类型选自：癌症、传染性疾病、慢性炎性疾病、自身免疫性疾病、神经系统疾病、脑损伤、神经损伤、红细胞增多症、血色素沉着病、创伤、感染性休克、慢性传染性疾病(例如假单胞菌或CMV)、纤维化、动脉粥样硬化、肥胖症、II型糖尿病和移植物失功。
本发明还涉及本文所述的化合物的任何组合。
本发明还涉及协助临床医生决定用抗人SIRPa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体治疗患者的体外方法或离体方法；更具体地，其中，向患者施用抗人SIRPa v1抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体，所述方法包括测定先前从患者获得的生物样品中SIRPa v1的存在，特别地，所述SIRPa v1通过本文所述的抗人SIRPa v1抗体或如本文所述生产的抗人SIRPa v1抗体或根据本文所公开方法筛选的化合物进行检测；其中，生物样品中SIRPa v1的存在表明该治疗可能有效。
本发明还涉及用于治疗或预防病症的抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体(其中，接受治疗的患者为SIRPa v2阳性)，以及生产和/或筛选抗SIRPa v2抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体的方法。使用的此种抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体，抑制人CD47与人SIRPa v2结合，不阻止或抑制人CD47与人SIRPa v1结合，并且特别是不阻止或抑制人CD47与人SIRPg结合。此种抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体可以具有与本发明所述的抗人SIRPa v1化合物相同的结合能力，除非这些能力与其结合人SIRPa v2有关。此外，此种抗人SIRPa v2化合物可具有以下特性中的至少一种(特别是多种特征，特别是所有以下特征)：
-它以至少10E-8M(特别是至少10E-9M、更优选至少10E-10M)的亲和力(KD)与人SIRPav2结合；和/或
-它降低或抑制人CD47与人SIRPa v2的结合；和/或
-它不阻止或抑制人CD47与人SIRPa v1的结合；和/或
-它不抑制人T细胞的增殖；和/或
-它不抑制人T细胞的活化；和/或
-它促进巨噬细胞的活化；和/或
-它促进抗原呈递细胞向人T细胞(特别是人CD8+ T细胞)交叉呈递至少一种抗原。
本发明还涉及多肽(特别是抗原)在生产和/或筛选抗人SIRPa v2抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体中的用途。因此，本文提供了多肽，该多肽特别是用于生产抗人SIRPa v2抗体和/或筛选和/或生产此种抗体和/或检测此种抗体的结合亲和力。为此，还提供了多肽(特别是抗原)，该多肽(特别是抗原)包含或由人SIRPa v1表位组成，该人SIRPa v1表位由SEQ ID NO：2(KGSPDT)或SEQ ID NO：29(KFRKGSPDTE)或SEQ IDNO：30(TEFKSGAGTELSVR)组成，该多肽(特别是抗原)用于筛选抗体、其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，该抗体、其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物抑制人CD47与人SIRPav2结合，且不阻止或减少人CD47与人SIRPa v1结合，特别是不与人SIRPa v1特异性结合，特别是不与人SIRPg特异性结合。
此种多肽可与包含人SIRPa v1表位的多肽一样使用，用于生产和/或筛选抗人SIRPa v2化合物。如关于SIRPa v1所详述的，本发明还涉及编码此种多肽的多核苷酸。化合物组合可包含此种抗人SIRPa v2化合物而不是抗人SIRPa v1化合物。评估治疗有效性的可能性的离体方法或体内方法可涉及例如通过使用抗人SIRPa v2化合物或通过检测本文所述的SIRPa v2等位基因，来检测SIRPa-v2阳性受试者或检测SIRPa v2。
本发明还涉及药物组合物，所述药物组合物包含根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体(也称为抗人SIRPa化合物)，或包含本文所述抗SIRPa化合物的化合物组合；所述药物组合物包含药物媒介物，其中，所述药物组合物可选地还包含不同的活性成分。因此，还提供了药物组合物，所述药物组合物至少包含抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体以及至少一种药学上可接受或相容的成分。术语“药学上可接受的或相容的成分”指药学上可接受的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物，抗人SIRPa抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体可以与它们一起施用。所述药物组合物可通过局部施用(特别是皮下施用、肿瘤内施用)来施用。
根据本发明使用的抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体可通过注射、通过导管、通过栓剂或通过植入物来施用，该植入物是有孔、无孔或凝胶状的材料(包括膜，例如sialastic膜或纤维)，特别是用于长期递送。在其他实施方式中，根据本发明使用的抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体可通过用控释系统来递送。在其他实施方式中，根据本发明使用的抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体可以作为药物组合物施用，所述药物组合物包含治疗有效量的结合剂和一种以上药学上相容的成分。例如，药物组合物通常包含一种以上药物载体(例如无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等)。当药物组合物静脉内施用时，水是更典型的载体。盐溶液以及葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于注射溶液。合适的药物赋形剂包括例如淀粉，葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果需要，该组合物还可包含少量的湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、缓释制剂等形式。该组合物可以与传统的粘合剂和载体(例如甘油三酸酯)一起配制成栓剂。口服制剂可包含标准载体，例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例描述于E.W.Martin的“Remington's PharmaceuticalSciences”。此种组合物将包含治疗有效量的化合物(通常为纯化形式)以及合适量的载体，以提供向患者适当施用的形式。
在典型实施方式中，按照常规程序将药物组合物配制成适于静脉内施用于人的药物组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，药物还可包括增溶剂和局部麻醉剂(例如利多卡因)，以减轻注射部位的疼痛。通常，成分以单位剂型单独提供或混合在一起提供，例如，所述成分作为干燥的冻干粉末或无水浓缩物装在表明活性剂含量的密闭容器(例如安瓿瓶)中。如果药物通过输注施用，该药物可以放在装有无菌药物级水或盐水的输液瓶中。如果药物通过注射施用，可以提供装有无菌注射用水或盐水安瓿瓶，以便可以在施用前将成分混合。
此外，可将药物组合物作为药物试剂盒提供，该药物试剂盒包括：(a)容器，该容器含有冻干形式的抗人SIRPa v1结合化合物(例如抗体或衍生物)；和(b)第二容器，该第二容器含有注射用的药学上可接受的稀释剂(例如无菌水)。药学上可接受的稀释剂可用于冻干的抗人SIRPa v1化合物的重构或稀释。可选地，此种容器可以随附由政府机构规定的规范药品或生物制品生产、使用或销售的通知，该通知反映了机构对用于人类施用的生产、使用或销售机构对人类管理的批准。或者，该试剂盒可适合于局部施用(特别是皮下施用或口服施用)，因此特别是当组合物分别用于皮下或口服施用时，该试剂盒包括预装填的容器(例如预装填的注射器或无针装置，例如小瓶)。
在疾病的治疗或预防或针对疾病进行的疫苗接种中，抗人SIRPa化合物(例如抗体或衍生物)的有效量可通过标准临床技术确定。
本发明还涉及根据本发明使用的抗SIRPa化合物与另一种治疗性治疗或预防性治疗(特别是放射治疗、化学治疗、免疫治疗，吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)刺激剂或抑制剂、干扰素基因刺激因子(STING)激动剂、促凋亡抗癌药、抗血管生成抗癌药)组合使用。
在本发明的一个具体实施方式中，根据本发明使用的抗SIRPa化合物与新抗原或新表位组合提供，其中，该抗SIRPa化合物增强抗原呈递细胞向人T细胞(特别是人CD8+ T细胞)交叉呈递所述新抗原或所述新表位。可通过本领域已知的方法鉴定或检测肿瘤的新抗原和新表位。
本发明还涉及在人类受试者中评估施用抗人SIRPa v1抗体或其抗原结合片段或其修饰的抗体的治疗有效性的可能性的方法，所述方法包括：
-当人类受试者为SIRPa v1阳性时，测定先前从人类受试者获得的生物样品中人SIRPav1的存在；
-施用治疗量的本文公开的抗SIRPa抗体或其抗原结合片段或其修饰的抗体，或本文公开的任何组合，或本文公开的任何化合物。
当人类受试者被诊断出患有癌症或可能发展为癌症时，此种方法特别有用。在一个优选实施方式中，当人类受试者具有至少一个SIRPa v1等位基因(即来自人类受试者的生物样品为SIRPa v1阳性)时，使用抗SIRPa抗体或其抗原结合片段或修饰的抗体的治疗可能有效。
受试者生物样品中SIRPa v1的存在可通过本领域已知的允许测定人类受试者中编码SIRPa的等位基因的任何方法来测定。此类方法例如但不限于细胞分选，例如FACS、基因分型、基因测序、原位杂交、Western Blot、ELISA等。
本发明还涉及以下实施方式：
1.抗人SIRPa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体，其包含：
a)重链可变结构域，所述重链可变结构域包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，
其中：
HCDR1包含或由SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列组成；
HCDR2包含或由SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列组成；
HCDR3包含或由SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列组成；
以及
b)轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列；
其中，所述抗人SIRPa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物抑制人CD47与人SIRPa v1的结合，并且不阻止或抑制人CD47与人SIRPa v2的结合；
所述抗人SIRPa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体用于预防和/或治疗SIRPa v1阳性受试者的疾病。
2.根据实施方式1使用的抗人SIRPa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其中：
所述重链可变结构域包含或由SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20或SEQID NO：21或SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列组成；特别地，所述重链可变结构域包含或由SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列组成；
所述轻链可变结构域包含或由SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列组成。
3.根据实施方式1或2使用的抗人SIRPa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体，其中，所述疾病选自：传染性疾病、慢性炎性疾病、自身免疫性疾病、神经系统疾病、脑损伤、神经损伤、红细胞增多症、血色素沉着病、创伤、感染性休克、慢性传染性疾病(特别是假单胞菌传染性疾病和巨细胞病毒传染性疾病)、纤维化、动脉粥样硬化、肥胖症、II型糖尿病和移植物失功。
4.根据实施方式1或2使用的抗人SIRPa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体，其中，所述疾病选自癌症，特别是炎性癌症和具有浸润的髓样细胞(特别是浸润的MDSC细胞和/或TAM细胞)的癌症、黑色素瘤；或者，根据权利要求1或2使用的抗人SIRPa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体用于针对这些疾病之一的治疗性疫苗接种，特别是针对黑色素瘤的治疗性疫苗接种。
5.根据实施方式4使用的抗人抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体，其中，所述疾病是癌症，并且，受试者中表达或检测到至少一种抗原，所述抗原选自：来自人乳头状瘤病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、梅克尔细胞多瘤病毒、人类免疫缺陷病毒、人T细胞白血病病毒、人类疱疹病毒8、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HCV、HBC、巨细胞病毒的抗原；或单组点突变抗原，所述单组点突变抗原源自CTNNB1基因、CASP8基因、hER2基因、p53基因、KRAS基因、NRAS基因的抗原；或肿瘤抗原，特别是产生自或源自下组的肿瘤抗原：ras癌基因、BCR-ABL肿瘤抗原、ETV6-AML1肿瘤抗原、黑色素瘤抗原编码基因(MAGE)、BAGE抗原、GAGE抗原、ssx抗原、ny-eso-1抗原、周期蛋白A1肿瘤抗原、MART-1抗原、gp100抗原、CD19抗原、前列腺特异抗原、前列腺酸性磷酸酶抗原、癌胚抗原、甲胎蛋白抗原、癌抗原125、粘蛋白16抗原、粘蛋白1抗原、人端粒酶逆转录酶抗原、EGFR抗原、MOK抗原、RAGE-1抗原、PRAME抗原、野生型p53抗原、癌基因ERBB2抗原、唾液酸Tn肿瘤抗原、肾母细胞瘤1抗原、间皮素抗原、碳水化合物抗原、B-连环蛋白抗原、MUM-1抗原、CDK4抗原和ERBB2IP抗原，特别是Melan-A黑色素瘤肿瘤相关抗原(TAA)。
6.根据实施方式1至5中任一项使用的人抗SIRPa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其中，所述抗体施用于表现出疾病的SIRPa v1阳性受试者，其中，在所述疾病中CD47在细胞(特别是癌细胞)中过表达，特别是在癌细胞过表达CD47的癌症中过表达。
7.根据实施方式1至6中任一项使用的人抗SIRPa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，其具有以下特性：
-它不与人SIRPa v2特异性结合；
-它不抑制人CD47与人SIRPg的结合；
以及可选地，所述人抗SIRPa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物具有以下特性中的至少一种：
-它以至少1E-9M的亲和力与人SIRPa v1结合；和/或
-它不与人SIRPg特异性结合；和/或
-它不抑制人T细胞的体内活化和/或增殖；和/或
-它促进巨噬细胞的活化；和/或
-它促进抗原呈递细胞向人T细胞(特别是人CD8+ T细胞)交叉呈递至少一种抗原。
8.多肽(特别是抗原)在生产或筛选抗人SIRPa v1抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体中的用途，所述抗原包含或由人SIRPa v1的表位组成，所述人SIRPa v1的表位由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：25组成，特别地，所述抗原还包含至少一种人SIRPa v1的表位，其由SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：6[线性表位]和/或SEQ ID NO：7和/或SEQ ID No：8[构象表位])组成，所述抗人SIRPa v1抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体与人SIRPa v1特异性结合，并且抑制人CD47与人SIRPa v1的结合，并且不阻止或抑制人CD47与人SIRPa v2的结合。
9.编码人SIRPa v1的抗原的多核苷酸用于生产根据实施方式8的多肽(特别是抗原)的用途，其中，所述分离的多核苷酸编码人SIRPa v1的表位，所述人SIRPa v1的表位包含SEQID NO：1、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：25的氨基酸残基，特别是还包含至少一种人SIRPa v1的表位，其包含或由SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：6[线性表位]和/或SEQ ID NO：7和/或SEQ ID NO：8[构象表位]的氨基酸残基组成。
10.制备抗人SIRPa v1抗体的方法，其中，所述方法包括：
用实施方式9中所述的至少一种抗原或至少一种包含或由人SIRPa v1的表位组成的抗原来免疫非人动物(特别是非人哺乳动物)，所述人SIRPa v1的表位由SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：4或SEQ ID NO：25组成；以及
特别地，从所述免疫的非人动物中收集所得的血清或B细胞，获得针对所述抗原的抗体；特别地，其中，所述抗原包含或由由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：25组成的人SIRPa v1的表位以及由SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：6和/或SEQ ID NO：7和/或SEQ IDNO：8组成的至少一种人SIRPa v1的表位组成。
11.增强抗原呈递细胞(特别是树突状细胞)向T细胞(特别是CD8+ T细胞)交叉呈递抗原的方法，其中，所述方法包括向受试者施用选自人抗SIRPa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体的化合物，所述化合物至少具有以下特性：
1.它不特异性结合人SIRPa v2；
2.它以至少1E-9M的亲和力与人SIRPa v1结合；
3.它降低或抑制人CD47与人SIRPa v1的结合；
4.它不阻止或抑制人CD47与SIRPa v2的结合；
可选地，所述化合物可选地具有以下特性中的至少一种：
i)它不抑制T细胞的增殖；和/或
ii)它不抑制T细胞的活化；和/或
iii)它增强巨噬细胞的活化；和/或
iv)它不阻止或抑制人CD47与人SIRPg的结合。
12.协助临床医生决定用抗人SIRPa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体治疗患者的体外方法或离体方法，更具体地，其中，向患者施用抗人SIRPa v1抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体，所述方法包括测定先前从患者获得的生物样品中SIRPa v1的存在，特别是通过本发明所述的抗人SIRPa v1抗体或如本发明所述生产的抗人SIRPa v1抗体或根据本发明筛选的化合物检测所述SIRPa v1，其中，生物样品中SIRPa v1的存在表明所述治疗可能有效。
13.根据实施方式10所述的方法，其中，回收的抗人SIRPa v1抗体以至少1E-9M的亲和力与人SIRPa v1特异性结合，并且不与人SIRPa v2特异性结合，特别是回收的抗人SIRPav1抗体是人CD47与人SIRPa v1结合的拮抗剂，并且不阻止或抑制人CD47与人SIRPa v2和人SIRPg结合。
14.从抗体、其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体中筛选和回收化合物的方法，其中，所述方法至少包括以下步骤：
a)检测所述化合物特异性结合人SIRPa v1的能力；
b)检测所述化合物降低或抑制人CD47与人SIRPa v1结合的能力；
c)检测所述化合物不阻止或抑制人CD47与人SIRPa v2结合的能力；
d)检测所述化合物结合分别位于SEQ ID NO：3的SIRPa的第130位和第132位或分别位于SEQ ID NO：25的SIRPa的第100位和第102位的氨基酸残基D和V的能力；
以及，可选地：
e)检测所述化合物不特异性结合人SIRPa v2的能力；和/或
f)检测所述化合物不特异性结合人SIRPg的能力；和/或
g)检测所述化合物不阻止或抑制人CD47与人SIRPg结合的能力，
其中，回收的化合物具有以下特性：
1.它与人SIRPa v1特异性结合；
2.它降低或抑制人CD47与人SIRPa v1的结合；
3.它不阻止或抑制人CD47与人SIRPa v2的结合；
以及，可选地，回收的化合物具有以下特性中的至少一种：
4.它不阻止或抑制人CD47与人SIRPg的结合；和/或
5.它以至少1E-9M的亲和力与人SIRPa v1结合；和/或
6.它不与人SIRPg特异性结合；和/或
7.它不与人SIRPa v2特异性结合。
15.根据实施方式14所述的筛选和回收化合物的方法，其中，所述方法还包括以下步骤中的至少一个：
v)在所述化合物存在下检测T细胞的增殖；和/或
vi)在所述化合物存在下检测T细胞的活化；和/或
vii)在所述化合物存在下检测巨噬细胞的活化；和/或
viii)在该化合物的存在下，测试抗原呈递细胞(特别是树突状细胞)向人T细胞交叉呈递抗原(特别是肿瘤抗原、特别是Melan-A黑色素瘤肿瘤相关抗原(TAA))，特别是树突状细胞向CD8+ T细胞交叉呈递抗原，
其中，回收的化合物具有以下特性中的至少一种：
1.它不抑制人T细胞的增殖；和/或
2.它不抑制人T细胞的活化；和/或
3.它促进巨噬细胞的活化；和/或
4.它促进抗原呈递细胞向人T细胞交叉呈递抗原。
16.诊断人类受试者的疾病严重程度的体外方法或离体方法，所述方法特别是适合用于个性化用药的诊断方法，其中，如本发明的任何实施方式所述或如本发明所述地生产的抗人SIRPa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，或根据本发明筛选的化合物，用于检测先前从受试者获得的生物样品中的SIRPa阳性细胞，其中，可选地对SIRPa v1的表达进行定量。
17.诊断人类受试者的疾病严重程度的体外方法或离体方法，所述方法特别是适合用于个性化用药的诊断方法，其中，如本发明的任何实施方式所述或如本发明的任何实施方式所述地生产的抗人SIRPa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物，或根据本发明的任何实施方式筛选的化合物，用于检测先前从受试者获得的生物样品中的SIRPa阳性细胞，其中，可选地对SIRPa v1的表达进行定量。
18.组合物，其中，所述组合物包含根据实施方式1至7中任一项使用的抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体，以及至少一种药物媒介物。
19.试剂盒，其中，所述试剂盒包含根据实施方式1至7和18中任一项使用的抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体，以及适合于局部施用的装置，特别是皮下递送装置或或口服递送装置，特别是包括预装填注射器的装置或特别是无针装置。
20.化合物组合，其中，所述化合物组合包含根据实施方式1至7中任一项所述的抗体或根据本文公开的任何实施方式生产的抗体或根据本文公开的任何实施方式筛选的化合物，以及至少一种抗原，所述抗原产生自或源自：人乳头状瘤病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、梅克尔细胞多瘤病毒、人类免疫缺陷病毒、人T细胞白血病病毒、人类疱疹病毒8、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HCV、HBC、巨细胞病毒的抗原；或单点突变抗原，所述单点突变抗原选自源自CTNNB1基因、CASP8基因、hER2基因、p53基因、KRAS基因、NRAS基因的抗原；或肿瘤抗原，特别是产生自或源自下组的肿瘤抗原：ras癌基因、BCR-ABL肿瘤抗原、ETV6-AML1肿瘤抗原、黑色素瘤抗原编码基因(MAGE)、BAGE抗原、GAGE抗原、ssx抗原、ny-eso-1抗原、周期蛋白A1肿瘤抗原、MART-1抗原、gp1 00抗原、CD19抗原、前列腺特异抗原、前列腺酸性磷酸酶抗原、癌胚抗原、甲胎蛋白抗原、癌抗原125、粘蛋白16抗原、粘蛋白1抗原、人端粒酶逆转录酶抗原、EGFR抗原、MOK抗原、RAGE-1抗原、PRAME抗原、野生型p53抗原、癌基因ERBB2抗原、唾液酸Tn肿瘤抗原、肾母细胞瘤1抗原、间皮素抗原、碳水化合物抗原、B-连环蛋白抗原、MUM-1抗原、CDK4抗原和ERBB2IP抗原，特别是Melan-A黑色素瘤肿瘤相关抗原(TAA)，所述化合物组合用作药物或疫苗组合物，用于治疗或预防SIRPa v1阳性受试者的疾病。
21.抗原结合抗体模拟物，其中，
-所述抗原结合抗体模拟物与人SIRPa v1特异性结合并且抑制人CD47与人SIRPa v1结合；
-所述抗原结合抗体模拟物不阻止或抑制人CD47与人SIRP的结合，特别是不与人SIRPg特异性结合；
所述抗原结合抗体模拟物用于治疗或预防疾病(特别是癌症)，或用于针对疾病(特别是癌症)的治疗性疫苗接种；其中，所述抗原结合抗体模拟物增强了在所述疾病(特别是所述癌症)中表达的抗原的交叉呈递，并且参与引发适用于治疗所述疾病的T细胞应答。
22.根据实施方式21使用的抗原结合抗体模拟物，其中，所述抗原结合抗体模拟物用于预防和/或治疗SIRPa v1阳性受试者的疾病。
23.根据实施方式21或22使用的抗原结合抗体模拟物，其中，所述疾病是癌症，特别是炎性癌症、具有浸润的髓样细胞(特别是浸润的树突状细胞和/或MDSC细胞和/或TAM细胞)的癌症、癌症转移(特别是乳腺癌转移)、黑色素瘤；或者，其中，根据实施方式21或22的用途是针对这些疾病之一的治疗性疫苗接种，特别是针对黑色素瘤的治疗性疫苗接种。
24.根据实施方式21至23中任一项使用的抗原结合抗体模拟物，其中，所述抗原结合抗体模拟物具有以下特性：
-它不与人SIRPa v2特异性结合；
-它不抑制人CD47与人SIRPg的结合，特别是它不与人SIRPg特异性结合；
-它以至少10E-9M的亲和力与人SIRPa v1结合；
-它促进抗原呈递细胞(特别是树突状细胞)向人T细胞(特别是人CD8+ T细胞)交叉呈递至少一种抗原。
25.根据实施方式24使用的抗原结合抗体模拟物，其中，所述抗原结合抗体模拟物还具有以下特性中的至少一种：
-它在不抑制人T细胞的体内活化和/或增殖；和/或
-它促进巨噬细胞的活化。
26.根据实施方式21至25中任一项使用的抗原结合抗体模拟物，其中，所述抗原结合抗体模拟物还包含至少一种药物媒介物。
27.根据实施方式21至26中任一项使用的抗原结合抗体模拟物，其中，所述疾病是癌症，其中，受试者中表达或检测到至少一种抗原，所述抗原选自：来自人乳头状瘤病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、梅克尔细胞多瘤病毒、人类免疫缺陷病毒、人T细胞白血病病毒、人类疱疹病毒8、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HCV、HBC、巨细胞病毒的抗原；或单点突变抗原，所述单点突变抗原源自CTNNB1基因、CASP8基因、hER2基因、p53基因、KRAS基因、NRAS基因的抗原；或肿瘤抗原，特别是产生自或源自下组的肿瘤抗原：ras癌基因、BCR-ABL肿瘤抗原、ETV6-AML1肿瘤抗原、黑色素瘤抗原编码基因(MAGE)、BAGE抗原、GAGE抗原、ssx抗原、ny-eso-1抗原、周期蛋白A1肿瘤抗原、MART-1抗原、gp100抗原、CD19抗原、前列腺特异抗原、前列腺酸性磷酸酶抗原、癌胚抗原、甲胎蛋白抗原、癌抗原125、粘蛋白16抗原、粘蛋白1抗原、人端粒酶逆转录酶抗原、EGFR抗原、MOK抗原、RAGE-1抗原、PRAME抗原、野生型p53抗原、癌基因ERBB2抗原、唾液酸-Tn肿瘤抗原、肾母细胞瘤1抗原、间皮素抗原、碳水化合物抗原、B-连环蛋白抗原、MUM-1抗原、CDK4抗原和ERBB2IP抗原，特别是Melan-A黑色素瘤肿瘤相关抗原(TAA)。
28.根据实施方式21至27中任一项使用的抗原结合抗体模拟物，其中，所述抗原结合抗体模拟物还包含至少一种抗原，所述抗原产生自或源自：人乳头状瘤病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、梅克尔细胞多瘤病毒、人类免疫缺陷病毒、人T细胞白血病病毒、人类疱疹病毒8、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HCV、HBC、巨细胞病毒的抗原；或单点突变抗原，所述单点突变抗原源自CTNNB1基因、CASP8基因、hER2基因、p53基因、KRAS基因、NRAS基因的抗原；或肿瘤抗原，特别是产生自或源自下组的肿瘤抗原：ras癌基因、BCR-ABL肿瘤抗原、ETV6-AML1肿瘤抗原、黑色素瘤抗原编码基因(MAGE)、BAGE抗原、GAGE抗原、ssx抗原、ny-eso-1抗原、周期蛋白A1肿瘤抗原、MART-1抗原、gp100抗原、CD19抗原、前列腺特异抗原、前列腺酸性磷酸酶抗原、癌胚抗原、甲胎蛋白抗原、癌抗原125、粘蛋白16抗原、粘蛋白1抗原、人端粒酶逆转录酶抗原、EGFR抗原、MOK抗原、RAGE-1抗原、PRAME抗原、野生型p53抗原、癌基因ERBB2抗原、唾液酸Tn肿瘤抗原、肾母细胞瘤1抗原、间皮素抗原、碳水化合物抗原、B-连环蛋白抗原、MUM-1抗原、CDK4抗原和ERBB2IP抗原，特别是Melan-A黑色素瘤肿瘤相关抗原(TAA)，用作药物或作为疫苗组合物，用于治疗或预防SIRPa v1阳性受试者的疾病。
附图说明
图1：SIRP家族序列比对。SIRPa变体v1和v2，SIRPb和SIRPg的膜远端结构域蛋白质序列的比对以及SNP在蛋白质序列中的定位(箭头编号为1至16)。灰色矩形对应于肽信号序列，粗体下划线表示由抗人SIRPa抗体识别的线性表位，灰色虚线矩形代表由抗人SIRPa v1抗体识别的构象表位。SEQ ID NO：32至35分别对应于图1中称为“P78328_SIRPa_人_变体1”、“SIRPa_人_变体”、“O00241_SIRPB_人”和“Q9P1W8_SIRPG_人”的序列。
图2：SIRPa抗体与血单核细胞表达的人SIRPa变体V1和V2的结合。筛选已对SIRPa外显子3测序的健康供体。通过荧光活化细胞分选(FACS)，对供体(选自SIRPa V1/V1纯合子和SIRPa V2/V2纯合子以及SIRPa V1/V2杂合子)的血液单核细胞中自身(in-house)抗SIRPa抗体(左图的抗-SIRPa v1-FITC)与市售SE7C2(右图)的结合进行检测。
图3：抗人SIRPa v1抗体对供体(SIRPa v1/v1纯合子、SIRPa v1/v2杂合子或SIRPa v2/v2纯合子)的血液单核细胞的拮抗活性。通过FACS使用纯合子或杂合子供体细胞对一种抗人SIRPa v1抗体对SIRPa-CD47的相互作用进行竞争测定。使用抗人SIRPa v1抗体的剂量反应来竞争CD47与不同供体的SIRPa变体的结合。相对于对照，将CD47结合百分比进行归一化，显示了每个细胞供体的结果：V2/V2纯合子(三角形)、V1/V2杂合子(正方形)和纯合子V1/V1(圆圈)。
图4：通过ELISA使用抗人SIRPa v1抗体和Kwar抗体进行SIRPa变体结合研究。通过ELISA评估与小鼠Fc结构域连接的固定化的SIRPa突变变体(SIRPa v1至v8，参见实施例1中的表2)的结合。比较了抗人SIRPa v1抗体和Kwar抗体(已知与SIRPa v1和SIRPa v2均结合)结合不同SIRPa突变变体的能力。用驴抗人抗体并使用TMB底物在450nm处通过比色法显示来进行显色。ED50(ng/ml)是该测定中达到50％信号的所示抗体浓度。
图5：树突状细胞(DC)对小鼠抗原的交叉呈递。使小鼠DC预先负载(preload)卵白蛋白抗原，然后用来自OTI小鼠或OTII小鼠(经转基因以使TCR表达主要为OVA MHC I或OVA MHCII)的转基因T细胞进行培养。在不同条件下，通过胸腺嘧啶掺入法(OTI CD8+ T细胞或OTIICD4+ T细胞)测量T细胞增殖：无Ag的对照(空心圆)或同种型(isotype)抗体对照(十字)、小鼠抗SIRPa抗体P84(正方形)和MY1(圆形)或抗CD47抗体(三角形)。A：OTI CD8阳性T细胞获得的结果。B：OT-II CD4阳性T细胞获得的结果。
图6：树突状细胞对人抗原的交叉呈递。对HLA-A2+HV的单核细胞进行SIRPa表型分析，在两种类型的实验中均使用了纯合(v1/v1)单核细胞和杂合(v1/v2)单核细胞。A：CD8+ T细胞中的IL-2表达。用SIRPa v1纯合未成熟DC获得的结果以圆形表示，用SIRPa v1/v2杂合未成熟DC获得的结果用正方形表示。负载Melan-A的未成熟DC用于活化Melan-A/HLA-A2+特异性胸腺瘤克隆，该克隆在培养48小时后通过IL-2分泌来检测。B：用负载Melan-A的iDC刺激的CD8+ T细胞中的IFNg表达。iDC先前已在负载期间与不同抗体一起孵育：抗SIRPa v1(圆形)、抗SIRPa/g(方形)、抗SIRPa v1+抗SIRPa/g(菱形)、B6H12(倒三角形)和CC2C6(三角形)。通过流式细胞术评估IFNg的表达。
图7：在树突状细胞的存在下，T细胞(CD4阳性细胞和CD8阳性细胞)对抗人SIRPa v1抗体和抗人CD47抗体的同种异体反应。以5个T细胞：1个DC的比率，用同种异体树突状细胞(DC)刺激从健康志愿者的外周血单核细胞中分离得到的人T细胞5天。在培养的第0天添加抗体。A：通过在培养的最后12小时期间掺入H3-胸腺嘧啶来测量增殖。B：通过ELISA测量IFNg分泌百分比。相对于对照条件，对结果进行归一化。抗SIRPa v1(正方形)对应于用对SIRPa v1具有特异性的自身抗体处理的细胞，该抗体不结合SIRPa v2和SIRPg。CD47 mAb(三角形)对应于用结合CD47的抗体处理的细胞。
图8：比较用抗SIRPa v1抗体处理的V1/V1供体单核细胞和V1/V2供体单核细胞的巨噬细胞极化生物测定。通过ELISA，检测未处理细胞(圆形)或用抗人SIRPa v1抗体处理的细胞(正方形)的上清液中MIP-1a/CCL-3和MIP-1b/CCL-4的分泌。A：由纯合子供体V1/V1的细胞获得的结果。B：由杂合子供体V1/V2的细胞获得的结果。
图9：通过FACS对抗SIRPa抗体在人单核细胞纯合子上对SIRPa v2的结合分析，通过ELISA测定抗体对SIRPa v2的ED50。通过细胞荧光术，对嵌合18D5抗体或SIRP29抗体或其他人源化抗SIRPa抗体的人单核细胞v2/v2(先前用人Fc受体结合抑制剂染色)进行评估。在Cantoll细胞仪上用PE标记的小鼠抗人Fc mAb进行显色。ED50是达到信号50％的所示抗体浓度。A：染色的阳性细胞v2/v2的荧光强度的平均值。B：通过ELISA确定每种抗体的ED50。大多数人源化18D5抗体检测不到ED50。
图10：通过Blitz进行CD47对人SIRPg重组蛋白(预孵育有抗SIRP抗体)的竞争分析。将SIRPg-His重组蛋白以10μg/mL固定在NINTA生物传感器上，以20μg/mL(饱和浓度)添加所示抗体。然后以100μg/mL添加CD47Fc，在120s的缔合期(ka)之后进行120s的解离期(kd)之后，推导亲和力值，确定亲和常数(KD)。在不同条件下确定CD47对SIRPg的KD亲和力：在LSB2.20抗体(特异性结合SIRPg的抗体)、kwar抗体和SIRP29抗体的存在下。
图11：抗SIRPa抗体对乳腺癌的小鼠转移模型的影响。使用4T1乳腺癌模型研究小鼠抗SIRPa(p84抗体和MY-1抗体)对肺转移的有效性。该图显示了用或未用抗SIRPa抗体治疗的小鼠中肺转移结节的数量。用同位素对照处理的小鼠用菱形表示，用p84抗体处理的小鼠用圆形表示，用MY-1抗体处理的小鼠用正方形表示。对照与每种抗SIRPa抗体之间的结果显著。
具体实施方式
实施例1：能产生抗人SIRPa v1抗体的表位的鉴定
先前描述了人SIRPa在与CD47相互作用的IgV结构域1中表现出一定程度的多态性。该多态性主要位于SIRPa基因的外显子3(SEQ ID NO：27)(Takenaka等，2007)。Takenaka等在来自不同来源的37个不同供体的基因组序列中鉴定出10种不同的序列/等位基因，其中包括2个主要等位基因：变体1(v1)和变体2(v2)。其他等位基因与V1或V2序列仅相差1或2个SNP。因此，SIRPa家族可细分为两个子家族：SIRPa v1同工型和SIRPa v2同工型。这些不同的等位基因导致蛋白质略有不同，但所有变体均相似地结合CD47配体。在Takenaka等的文章中，v1等位基因频率为78％(V1和V1类似(V1-like)为89％)，而纯合V1/V1类似供体的基因型频率为65％。他们的37个供体中有24％呈现杂合基因型。
SIRPa V1和SIRPa V2的编码DNA和蛋白质序列：
人SIRPa的V1序列在NCBI中获得(基因ID：140885)。
SIRPa v1外显子3的基因组DNA参考序列(转录本SIRPa-201 ID：ENST00000400068.7)(SEQ ID NO：27)：
GAGTGGCGGGTGAGGAGGAGCTGCAGGTGATTCAGCCTGACAAGTCCGTGTTGGTTGCAGCTGGAGAGACAGCCACTCTGCGCTGCACTGCGACCTCTCTGATCCCTGTGGGGCCCATCCAGTGGTTCAGAGGAGCTGGACCAGGCCGGGAATTAATCTACAATCAAAAAGAAGGCCACTTCCCCCGGGTAACAACTGTTTCAGACCTCACAAAGAGAAACAACATGGACTTTTCCATCCGCATCGGTAACATCACCCCAGCAGATGCCGGCACCTACTACTGTGTGAAGTTCCGGAAAGGGAGCCCCGATGACGTGGAGTTTAAGTCTGGAGCAGGCACTGAGCTGTCTGTGCGCG
一种SIRPa v1的氨基酸序列(Genbank参考号NP_001035111.1)(UniProtKB：P78324)(SEQ ID NO：3)：
MEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAARATPQHTVSFTCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESVSYSIHSTAKVVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVPPTLEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVSRTETASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVEHDGQPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAAENTGSNERNIYIVVGVVCTLLVALLMAALYLVRIRQKKAQGSTSSTRLHEPEKNAREITQDTNDITYADLNLPKGKKPAPQAAEPNNHTEYASIQTSPQPASEDTLTYADLDMVHLNRTPKQPAPKPEPSFSEYASVQVPRK
一种SIRPa v2的氨基酸序列(SEQ ID NO：28)：
Takenaka等(2007)引用了变体2蛋白序列。在NCBI中获得编码DNA序列(GenBank：BC075849.1)。在NCBI数据库中找不到该变体的基因序列。
MEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAARATPQHTVSFTCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESVSYSIHSTAKVVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVPPTLEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVSRTETASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVEHDGQPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAAENTGSNERNIYIVVGVVCTLLVALLMAALYLVRIRQKKAQGSTSSTRLHEPEKNAREITQDTNDITYADLNLPKGKKPAPQAAEPNNHTEYASIQTSPQPASEDTLTYADLDMVHLNRTPKQPAPKPEPSFSEYASVQVPRK
SIRPa v2外显子3的基因组DNA参考序列(SEQ ID NO：31)：
GAGTGGCGGGTGAGGAGGAGCTGCAGGTGATTCAGCCTGACAAGTCCGTATCAGTTGCAGCTGGAGAGTCGGCCATTCTGCACTGCACTGTGACCTCCCTGATCCCTGTGGGGCCCATCCAGTGGTTCAGAGGAGCTGGACCAGCCCGGGAATTAATCTACAATCAAAAAGAAGGCCACTTCCCCCGGGTAACAACTGTTTCAGAGTCCACAAAGAGAGAAAACATGGACTTTTCCATCAGCATCAGTAACATCACCCCAGCAGATGCCGGCACCTACTACTGTGTGAAGTTCCGGAAAGGGAGCCCTGACACGGAGTTTAAGTCTGGAGCAGGCACTGAGCTGTCTGTGCGTGC
如图1所示，对SIRPa v1、SIRPa v2、SIRPb和SIRPg的D1结构域的氨基酸序列进行比对。
通过生物信息学进行基因型频率分析
为研究有关人类的SIRPa多态性的更多数据，使用来自“千人基因组计划(1000Genomesproject)”(1KG，>2500个不同的人类基因组)的数据鉴定人SIRPa外显子3中的相关SNP。发明人发现，使用Haploview将SIRPa SNP分离为2个单倍型域(haplotype block)(数据未显示)。
为研究基因型频率并分析纯合子和杂合子供体之间的差异，发明人首先在人SIRPa外显子3(文献中已知的多态外显子，负责与配体结合的外显子)中鉴定出了18个SNP(表1)，保留与密码子改变(氨基酸序列改变)有关的SNP。SNP编号为1至18。由于文献中未记载，因此1个SNP未进行分析。未对SNP7和SNP18进行基因型频率分析，因为二者均对应于同义密码子(蛋白质水平无变化)。然后，发明人用千人基因组第3期项目鉴定了SNP等位基因和基因型频率，该项目包括来自5个超总体的超过5000名捐献者：n＝1030东亚(EAS)，n＝1010欧洲(EUR)，n＝1338非洲(AFR)，n＝704Ad混合美洲(AMR)和n＝988南亚(SAS)。来自千人基因组第3期项目的所有个体均被研究。
表1：SIRPa变体的SNP鉴定及其氨基酸位置
Figure BDA0002770050700000451
然后，发明人以大致相似的频率(相差<1％)将物理上相邻的SNP聚类，根据群体遗传学以饼图绘制这些聚类SNP的平均频率。他们最终比较了通过两种方法(线性方法或构象方法)测定的自身抗人SIRPa v1抗体表位(由于其对V2/V2供体显示出低结合且很难阻断CD47结合V2/V2，因此数据未显示)的相关性。他们还考虑了与SIRPγ突变相关的SNP(由于自身抗体不结合SIRPγ)。最后，发明人还通过比较人SIRPa V1、人SIRPa V2以及食蟹猴(Macacafascicularis)或恒河猴(Macaca mulatta)中发现的突变之间的序列差异来加强此种分析，因为自身抗体与猴没有交叉反应。
抗SIRPa与SNP的结合关系：
方法：通过ELISA法评估抗SIRPa抗体的结合活性。对于ELISA测定，检测8种不同突变hSIRPa的自身抗人SIRPa v1抗体和Kwar抗体(SIRPa v1至v8；参见表2)。将突变hSIRPa的不同变体(SIRPa v1-v8)以碳酸盐缓冲液(pH 9.2)中0.5μg/ml的浓度固定在塑料上，加入纯化的抗体以测量结合。孵育和洗涤后，加入过氧化物酶标记的驴抗人IgG(JacksonImmunoresearch；美国；参考号709-035-149)，通过常规方法显色。
结果：为了评估人SIRPa SNP对自身抗人SIRPa v1抗体结合能力的影响，产生了8种不同的重组人SIRPa蛋白(表2)。将这些SIRPa蛋白的胞外结构域与IgG2a的小鼠Fc融合，评估自身抗人SIRPa v1抗体对那些SIRPa变体的结合能力(图4)。当SNP 15+16的V1序列突变时，在ELISA中自身抗体失去其结合特性(图4A)。在本申请公开的实验中，所用抗人SIRPa v1抗体对应于具有重链可变结构域(包含或由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成)和轻链可变结构域(包含或由SEQ ID NO：17的氨基酸序列组成)的抗体。其他SNP突变没有改变自身抗体的结合特性。相比之下，KWAR23(据描述，其与V1和V2均结合)的结合特性没有被任何一种SNP突变所改变(图4B)，这证明SIRPa V8(SNP15+16)蛋白是功能性的，包含位于SNP 15+16周围的表位的抗原能产生抗SIRPa v1抗体，该SIRPa v1抗体不识别或特异性结合SIRPav2。
表2：SIRPa重组蛋白
SIRPa V1
SIRPa V2
SIRPa V3(SNP1+2+3+4+5+6)
SIRPa V4(SNP8)
SIRPa V5(SNP9+10+11)
SIRPa V6(SNP12+13)
SIRPa V7(SNP14+？)
SIRPa V8(SNP15+16)
SIRPa多态性对抗体特性的影响(通过FACS测定单核细胞的SIRPa-CD47拮抗)
方法：在40mL完全RPMI培养基中解冻人单核细胞(在Nantes的DTC平台上淘洗纯化人PBMC，用DMSO以10M/ml冷冻于-80℃或液氮中)。然后在10分钟内立即以1000rpm离心。将细胞重悬于10mL RPMI培养基中，对Malassez细胞计数。将冷冻的人单核细胞进行解冻，加入稀释的样品，然后加入生物素化(biotinylated)的CD47Fc。然后用链霉亲和素-PE对生物素化的CD47Fc进行显色，通过流式细胞术测量荧光。应用以下方案：-在V型底P96板上的每孔中加入100,000个人单核细胞；-以2500rpm离心1分钟，轻弹孔板以清空孔；-用200μL PSE洗涤细胞2次(以2500rpm离心1分钟，清空孔)；-制备样品的8种稀释液，以10μg/mL开始(浓缩2x，最终浓度5μg/mL)，以3步稀释；-往细胞加入12.5μL样品/孔，混合；-在冰上孵育15分钟；-制备CD47Fc生物素化溶液，浓缩2倍，根据段的功能测定，往细胞中加入12.5μL的此溶液/孔，混合；-在冰上孵育30分钟；-添加175μLPSE/w；-以2500rpm离心1min，清空孔；-用200μL PSE洗涤细胞2次(以2500rpm离心1分钟，清空孔)。选择生物素化的CD47Fc的中间浓度。此处，将5μg/mL生物素化的CD47Fc用于拮抗测定。每次均必须执行此步骤，因为CD47阳性细胞的百分比取决于各个供体。-以1/1000稀释链霉亲和素-PE；-加入25μL/w；-在冰上孵育15分钟；-添加175μL PSE/w；-以2500rpm的速度离心1分钟，清空孔；-用200μL PSE洗涤细胞2次(以2500rpm离心1分钟，清空孔)；-转移V底P96 Canto板中的染色的细胞，用BD canto II读数。
结果：发明人通过流式细胞术分析了自身抗SIRPa v1抗体对来自健康供体(已对SIRPa外显子3测序)的血液单核细胞的结合特性(图2)。他们筛选了V1/V1纯合子、V2/V2纯合子和V1/V2杂合子。图3显示，抗人SIRPa v1抗体对V2/V2供体的结合显著更少。相比之下，发明人发现市售抗SIRPa mAb(克隆SE7C2)仅结合V2蛋白。SE7C2数据显示，与V1/V2供体相比，V2/V2供体在其表面表达的SIRPa蛋白水平相似，这证实了抗人SIRPa v1抗体对V2/V2的结合减少不是由于表达降低，而是由于此抗体对此SIRPa v2蛋白的结合降低(图2)。
然后，发明人通过流式细胞术分析了自身抗人SIRPa v1抗体防止重组人CD47蛋白结合在健康供体的血液单核细胞上的拮抗剂特性(图3)。为研究SIRPa多态性对CD47-Fc结合拮抗作用的影响，对基因分型为SIRPa的冷冻人单核细胞进行拮抗测定。图3所示的数据显示，抗人SIRPa v1抗体极大地拮抗了V1/V1供体(n＝3)与CD47结合，而仅使CD47与杂合V1/V2供体(n＝5)的结合降低一半。观察到抗人SIRPa v1抗体在纯合V2/V2供体上(n＝3)有弱(25％)拮抗作用。如图3所示，自身抗体识别SIRPa V1，非常弱地识别SIRPa V2。这表明，该自身抗体对CD47-Fc与人单核细胞(SIRPa V1/V1纯合)的结合具有强烈的拮抗作用，对纯合V2/V2人单核细胞具有非常弱的拮抗作用，对杂合V1/V2人单核细胞具有中等的拮抗作用。
结论
未发现SIRPa的多态性会影响CD47结合，但会影响抗人SIRPa单克隆抗体的识别。Takenaka等已确定了与V1序列或V2序列具有高度同源性的多种变体。其他变体代表了V1序列和V2序列的不同组合，根据其主要基因型可被视为V1类似变体或V2类似变体。这些结果被千人基因组的数据证实，该数据显示SIRPa有两个主要变体：V1和V2。变体1在全球人群中频率最高，但在东亚超总体中除外。本发明中的SNP分析表明，在US和EU，与允许产生和/或筛选抗人SIRPa v1抗体的表位相关的SIRPa V1等位基因频率(V1/V1和V1/V2)为76％至86％，V1/V1纯合患者占US和EU人群的40％至50％(基于SNP 15和SNP 16频率)。发明人对n＝184个供体的分析表明，自身抗人SIRPa v1抗体与83至％86％的v1供体(V1/V1和V1/V2)强烈结合。V1/V1纯合子供体占分析队列(cohort)的40％至50％。尽管CD47拮抗测定以有趣的方式表明自身抗体仅阻止一半的结合，但图8所示的巨噬细胞极化的功能测定和图6所示的人树突状细胞的肿瘤抗原交叉呈递表明，自身抗人SIRPa v1抗体对V1/V1供体和V1/V2供体具有相同的生物学功效。
实施例2：比较小鼠和人类之间SIRPa-CD47相互作用的阻断对免疫交叉呈递的影响
小鼠交叉呈递(图5)
药物：从杂交瘤中纯化靶向小鼠SIRPa结构域2的变构拮抗单克隆抗体(P84克隆–大鼠IgG1)。将靶向小鼠SIRPa结构域1的正构拮抗单克隆抗体(MY-1克隆–小鼠IgG2a)(Garcia等，2011)重新改造为亲本杂交瘤的IgG1 Fc结构域。两种抗SIRPa抗体均阻断髓样细胞中通过SIRPa的信号传导。纯化同种型对照小鼠IgG1(3G8克隆)。替代拮抗抗小鼠CD47单克隆抗体(MIAP410克隆)购自BioXCell(#BE0283)。
通过脾脏DC表达小鼠SIRPa：通过CD11c阳性磁选从幼稚小鼠的脾脏中分离出天然DC，通过BD FACS ARIA II细胞分选分离出它们的CD8α表达。如文献所述，CD8α+/+DC是交叉呈递的最佳抗原呈递细胞(APC)，表达低至负水平的SIRPa，而CD8α-/-DC则表达SIRPa(已知为效率较低的交叉呈递抗原)。
脾脏DC的抗原呈递功能：根据文献，与CD8α-/-DC(表达高水平的SIRPa)相比，SIRPa低/阴CD8α+/+DC是抗原(Ag)交叉呈递的最佳抗原呈递细胞(APC)。然而，DC的两个亚型同等地负载并向MHC II类分子呈递外源A。发明人表明，用于评估SIRPa对用OVA细胞和OT-IT细胞交叉呈递Ag中的作用的实验重现了这些DC的特性(数据未显示)。实际上，与CD8α-/-DC相比，CD8α+/+DC诱导OT-I T细胞(来自CD8+卵清蛋白特异性TCR转基因小鼠)更好地增殖，表明对MHC I类分子具有更好的Ag加工、负载和呈递，如他们用OT-II T细胞(来自CD4+卵清蛋白特异性TCR转基因小鼠)增殖所观察到的，脾脏DC的两种亚型的外源抗原呈递均很高。因此，SIRPa的表达与树突状细胞向CD8+ T细胞交叉呈递抗原的能力成反比，这表明SIRPa抑制了小鼠中的交叉呈递。
小鼠抗原的交叉呈递：在GM-CSF的存在下，使CD8α+/+和CD8α-/-DC负载卵清蛋白(OVA)过夜。然后，将从OT-I转基因小鼠的脾脏分离的CD8+ T细胞和从OT-II转基因小鼠的脾脏分离的CD4+ T细胞与负载OVA的DC亚型一起培养3天。转基因小鼠表达OVA MHC I(OT-I)和OVAMHCII(OT-II)特异性的TCR。在培养的最后16小时内通过掺入H3-胸腺嘧啶来评估增殖。在用OVA蛋白孵育DC的期间以及在载有OVA的DC增殖T细胞的期间，以10μg/mL的量加入抗SIRPa mAb。该实验允许评估DC进行蛋白质加工期间SIRPa阻断的影响，然后通过MHC I类分子将OVA肽呈递给DC然后呈递给CD8 OT-I T细胞，然后通过MHC II类分子将OVA肽呈递给CD4OT-II T细胞，其分别突出了抗原交叉呈递和外源性抗原呈递。
发明人表明，小鼠中SIRPa或CD47的阻断增强了SIRPa+脾树突状细胞的抗原呈递。CD8α+/+DC(SIRPa低/阴)不受SIRPa/CD47通路阻断的影响，因为它们能够将OVA交叉呈递给OT-IT细胞(未显示)。但是，P84或MY-1阻断抗体对SIRPa的阻断或MIAP410对CD47的阻断增强了CD8α-/-SIRPa+DC的Ag交叉呈递，这由CD8+OT-I增殖增加反映(图5A)。
外源抗原的呈递：发明人分析了SIRPa/CD47阻断对外源Ag呈递的影响，他们发现SIRPa低/阴-CD8α+/+DC的Ag呈递并未被SIRPa/CD47通路的阻断所改变(未显示)。与交叉呈递过程相似，对SIRPa阳性CD8α-/-DC的SIRPa/CD47阻断增加了外源抗原加工和对MHC II类分子的呈递(通过CD4+OT-II细胞增殖来进行测量)(图5B)。
结论
发明人证明，(用抗SIRPa或抗CD47mAb)阻断小鼠中的SIRPa/CD47通路可增加MHC-1抗原交叉呈递(T CD8应答)和MHC-II抗原呈递(T CD4应答)。这些结果与其他人如(Liu等，2016，2015；Xu等，2017)的结果相符。
人类交叉呈递(图6)
药物：发明人制备并纯化了靶向人SIRPa的拮抗性单克隆抗体(自身抗人SIRPa v1抗体–人IgG4)。同种型对照人IgG4购自Biolegend(QA16A15克隆)。靶向人CD47的拮抗性单克隆抗体(B6H12克隆)购自BioXCell(#BE0019-1)，使用购自BioLegend的CC2C6克隆(#TBD2)。在一些实验中，抗SIRPa:g抗体(WO201356352的克隆SIRP29)单独使用或与自身抗SIRPa V1抗体组合使用。
MELAN-A特异性应答：人类细胞的交叉呈递通过HLA-A2+DC将Melan-A黑色素瘤肿瘤相关抗原(TAA)的长肽(25聚体，这表明该肽不能“对接(dock)”到I类MHC分子上)呈递给的TCR特异性T细胞(特异性识别HLA-A2/Melan-A复合物)来评估。使用两种不同的TCR特异性T细胞来评估抗原交叉呈递。第一种克隆是来自黑色素瘤患者的T淋巴细胞克隆，其对这些HLA-A2/Melan-A复合物(来自法国南特大学N.Labarrière博士的友善馈赠，Vignard等，J.Immunol 2005)具有特异性。第二种克隆是转基因鼠胸腺瘤细胞系，该细胞被同一黑色素瘤患者的T细胞克隆的TCR转导并被人CD8辅助受体(co-receptor)转染。DC由HLA-A2+健康志愿者(HV；南特Etablissement
Figure BDA0002770050700000501
de Sang的志愿者)的血液单核细胞体外产生。同时，对单核细胞进行SIRPa多态性表型分析。用GM-CSF和IL-4培养7天后，诱导出未成熟的DC(iDC)。然后，在靶向SIRPa/CD47途径的拮抗性抗体存在下，将用长25聚体肽的Melan-A装载iDC过夜，最后分别与两种不同的Melan-A/HLA-A2特异性T细胞克隆进行独立培养。将来自黑色素瘤患者的人T细胞克隆与负载Melan-A的iDC培养5小时，通过流式细胞术通过IFNg的细胞内染色评估T细胞活化。
负载Melan-A的iDC培养TCR转基因胸腺瘤克隆48小时，通过ELISA评估T细胞活化的IL-2分泌。
为验证实验，将来自HLA-A2阴性供体的负载Melan-A的iDC以及来自HLA-A2+HV的未负载iDC用作阴性对照。结果(未显示)表明，仅HLA-A2+Melan-A负载的iDC能够诱导人T细胞克隆的IFNg分泌。仅在HLA-A2阳性供体中检测到鼠胸腺瘤细胞分泌的IL-2，与HLA-A2-Melan-A负载的DC进行比较(数据未显示)，证明了两种不同的HLA-A2/Melan-A的特异性T细胞克隆的特异性。
对HLA-A2+HV的单核细胞进行SIRPa表型分析，V1纯合和V1/V2杂合单核细胞均包括在2个不同的实验中。
体外改造的胸腺瘤细胞克隆：用载有Melan-A的人iDC刺激TCR转基因胸腺瘤细胞克隆48小时后，测量IL-2的分泌。在抗原交叉呈递的首次读数中，发明人观察到，在Melan-A的装载期间和刺激测定期间(图6A)，当在SIRPa被特异性抗SIRPa抗体(自身抗人SIRPa v1)阻断时，大多数供体中胸腺瘤克隆分泌的IL-2增多。DC的V1纯合子和V1/V2杂合子供体之间未观察到差异。
黑色素瘤患者的人T细胞克隆：用负载Melan-A的人iDC刺激CD8人T细胞克隆5小时后，通过流式细胞术评估IFNg的表达。图6B显示了CD8+ T细胞中IFNg的表达。在装载Melan-A期间和在T细胞刺激期间，SIRPa或CD47被阻断。测试了各种抗体：抗人SIRPa v1、抗SIRPa/g(SIRP29)、抗CD47(B6H16和CC2C6)。图6B显示，自身抗人SIRPa v1抗体对SIRPa的阻断导致由纯合子或杂合子供体的iDC诱导的肿瘤抗原特异性人T细胞的IFNg表达增加。值得注意的是，发明人显示，SIRPa阻断对Ag呈递的积极影响并不限于SIRPa v1纯合iDC，因为在大多数V1/V2杂合供体中观察到相似的增加。出乎意料地，发明人发现，与小鼠交叉呈递相反，在人类中，两种抗CD47 mAb对大多数供体的IFNg分泌没有积极影响，最坏的情况是在大多数供体中强烈抑制了T细胞活化的基础水平。更令人惊讶地，抗SIRPa(其不是SIRPa特异性的，而是还结合SIRPg并抑制CD47与SIRPg结合)不会诱导T细胞表达IFNg，这表明iDC向T细胞的交叉呈递对自身抗人SIRPa v1抗体具有特异性。不寻常地，向选择性自身SIRPa v1抗体中添加非选择性SIRPa/g抗体通过选择性阻断SIRPa而不是SIRPγ来阻止IFNg分泌增加。在人类中用不同的抗CD47抗体和抗SIRPa/g抗体获得的这些结果是小鼠模型的结果不可预测的，可以解释发明人的一些有趣结果：在人类中多克隆人T细胞增殖和人混合淋巴细胞反应受到不同的抗CD47 mAb和抗SIRPg的强烈抑制(Piccio等，2005)，而不受本发明的特异性抗SIRPa v1抗体的抑制。
结论
在Ag装载和向T细胞的Ag呈递期间，用于评估抗原交叉呈递的两种不同克隆对iDC的SIRPa阻断显示出相似的结果。发明人首次表明，人SIRPa对抗原交叉呈递具有抑制作用，可通过IFNg或IL2分泌来测定，这可通过选择性抗SIRPa mAb缓解。这是不可预测的，因为用不同的抗CD47抗体或非选择性抗SIRPa/g抗体阻断CD47不会对人T细胞产生此种作用，这可通过考虑先前在人类中(而非在小鼠中)观察到的抗CD47mAb的免疫抑制特性来解释。现有技术显示SIRPa抑制小鼠DC成熟。发明人首次公开了特异性抗SIRPa抗体可以是增强人类的Ag交叉呈递的治疗性化合物。虽然小鼠中的抗CD47 mAb与小鼠抗SIRPa具有相似的增强作用，但无法预测人抗SIRPa对人DC交叉呈递的影响。我们对SIRPa-CD47相互作用介导的免疫机制的理解使我们推测，抗CD47在人体内的免疫抑制特性是由于其与SIRPg(其未在小鼠中表达)的相互作用。令人惊讶地，关于DC供体的SIRPa V1纯合子或杂合子的遗传法规在人T细胞活化方面没有显示出任何差异。
实施例3：SIRP/CD47阻断对多克隆刺激的影响
方法：从健康志愿者的血沉棕黄层(buffy coat)中分离出hPBMC。通过使用AutoMACS(Miltenyi)进行阳性筛选，筛选出CD4或CD8 T细胞，将其铺在96轮孔板中(50000个细胞/孔)。增殖信号由抗CD3/抗CD28包被的微珠(Life Technologies)(以1微珠：1T细胞的比率)在3天的时间内提供，或由体外产生的同种异体成熟树突状细胞(5T细胞：1mDC)在5天的时间内提供。从增殖试验开始，以饱和浓度(10μg/mL)添加靶向SIRPa/CD47和/或SIRPg/CD47途径的抗体。通过在培养的最后12小时内掺入H3-胸腺嘧啶来测量增殖。抗CD47抗体(市售参考号：B6H12)，抗SIRPa抗体(HEFLB，如专利WO2017178653中所述)。
结果：为研究CD47阻断对人T淋巴细胞的免疫抑制作用，从3名不同健康志愿者中分离出PBMC，照射(35Gy)一部分细胞。每个供体(响应者)与剩下两个供体(经辐照的刺激物)中的每一个包括在混合淋巴细胞反应中。在MLR开始时添加阻断抗体，在五天培养的最后16小时通过胸腺嘧啶掺入法来测量T细胞增殖。发明人发现，抗CD47mAb强烈抑制了人T细胞的增殖，而抗SIRPa(自身抗人SIRPa v1抗体)与对照条件没有显著差异(图7)。在4天培养物的上清液中计量IFNg分泌(其也反映T细胞活化)。发明人还观察到抗CD47mAb(B6H12)显著抑制了细胞因子分泌，表明并证实了发明人和其他小组的先前结果：CD47对于人体内T细胞活化很重要。
实施例4：使用来自健康供体的单核细胞，研究抗SIRPa抗体对巨噬细胞极化生物测定 的影响：测量趋化因子产生的生物测定：MIP-1a/CCL-3和MIP-1b/CCL-4
为研究自身抗人SIRPa v1抗体对巨噬细胞极化和活化的影响，检测了新鲜或冷冻的人单核细胞的上清液中某些趋化因子(特别是MIP-1a/CCL-3和MIP-1b/CCL-4)的分泌，该人单核细胞被基因分型为纯合SIRPa V1或杂合SIRPa V1/V2，并与GM-CSF培养以诱导未极化的未成熟巨噬细胞(图8)。以10μg/mL测试了两种来源的重组CD47-Fc：SinoBiological#12283-H02H和R&D系统#4670-CD-050。通过ELISA定量培养物上清液中的MIP-1a/CCL-3和MIP-1b/CCL4(R&D系统：人CCL3/MIP-1αDuoSet ELISA#DY270和人CCL4/MIP-1βDuoSetELISA#DY271)。总之，结果表明，在包被的CD47-Fc的存在下，自身抗人SIRPa v1抗体显著增加了纯合V1 SIRPa(图8A)供体或杂合(V1/V2基因型)供体(图8B)的MIP-1a和MIP-1b的分泌。
结论
发明人发现，在包被的重组CD47-Fc的存在下，自身抗人SIRPa v1抗体可显著增加M1相关趋化因子MIP-1a/CCL-3和MIP-1b/CCL-4的分泌。CD47-Fc诱导人髓样细胞的功能抑制，特别是通过减少MIP-1a/CCL-3和MIP-1b/CCL-4基础分泌。如上清液中MIP-1a和MIP-1b的分泌所示，通过抗SIRPa抗体阻断SIRPa-CD47相互作用可恢复髓样功能。有关SIRPa V1等位基因表达的供体基因型对那些趋化因子的诱导没有影响，表明对SIRPa阻断有阈值作用以观察功能作用。
实施例5：通过细胞荧光测定术进行人单核细胞v2/v2的SIRPa结合测定
方法：为测定抗SIRPa抗体与人单核细胞的结合，首先在室温下加入人Fc受体结合抑制剂(BD pharmingen；美国；参考号564220)30分钟以阻断人单核细胞上的人Fc受体，减少背景。然后，将抗体在4℃下孵育30mm，然后洗涤，然后在4℃下用PE标记的抗人IgG Fc(Biolegend；美国；参考号409303)染色30分钟。对于小鼠抗体，使用了PE标记的抗小鼠igG(Jackson Immunoresearch；参考号715-116-151)。在BD LSRII或Canto II细胞荧光仪上分析样品。
结果：如图9所示，结果表明SIRP29抗体和嵌合18D5抗体(本发明的亲本抗体)与人单核细胞SIRPa v2/v2结合，并且不与所有人源化抗SIRPa抗体结合(如MFI(中值荧光强度)所测量的)，表明抗体的人源化引起了SIRPa v2特异性的丧失。
实施例6：通过Blitz进行抗SIRPa抗体对CD47-SIRPg相互作用的竞争分析
方法：用Blitz(FortéBio；美国；参考号C22-2 No 61010-1)进行此测定。第一步，通过组氨酸尾巴以10μg/ml浓度将hSIRPg-His(中国北京Sino Biologicals；参考号11828-H08H)固定在Ni-NTA生物传感器(FortéBio；美国；参考文献18-0029)30秒。第二步，以120μg/mL(饱和浓度)添加抗体120秒。然后，以100μg/mL浓度使人CD47Fc(中国北京SinoBiologicals，参考号12283-H02H)缔合120秒，与不同的抗体(LSB2.20、Kwar或SIRP29抗体)竞争。在动力学缓冲液中缔合120秒，用Blitz pro 1.2软件获得分析数据，计算缔合常数(ka)和解离常数(kd)，确定亲和常数KD(ka/kd)。
结果：如图10所示，在正常情况下，CD47对SIRPg的亲和力为约6.10-8M，Kwar23和SIRP29显著降低了CD47与SIRPg的结合，而市售抗SIRPg抗体LSB2.20不破坏CD47-SIRPg的相互作用。这些结果强调了，与现有技术的抗体相比，本发明的自身抗SIRPa v1抗体对SIRPa具有特异性。
实施例7：乳腺癌4T1临床前模型：转移模型
此原位同基因4T1临床前模型用于评估两种不同的特异性抗小鼠SIRPa单一治疗在模型(其中髓样细胞浸润非常重要且被充分描述)中的效果。实际上，先前报道4T1模型主要被CD11b+髓样细胞浸润(DuPré等，2007)，特别是被MDSC浸润(Markowitz等，2013)。
已知该模型可引起转移。因此，本发明人收集了肝脏和肺，对用或未用小鼠抗SIRPa抗体治疗的小鼠的转移进行了编号。从第4天至第28天(3次/周)，以8mg/kg使用同种型对照抗体和抗SIRPa抗体。两种特异性靶向SIRPa的不同抗体对SIRPa的阻断(以及破坏CD47与SIRPa结合)证明了在单一治疗中对TNBC侵袭性模型的肿瘤发展的有效临床作用。发明人还通过比较P84(参考：MABS164抗SHPS-1抗体，购自Merck Millipore的克隆P84)和MY1-mG1(描述于Yanagita等)替代物，分析了处死后的肺转移和肝转移。对照小鼠发生了肺转移，而没有用MY1-mG1或P84治疗的小鼠发生了肺转移。图11显示了P84和MY-1抗SIRPa mAb的肺转移结果，两者均对肺转移显示出相同功效。
这些在小鼠模型(其细胞不表达SIRPg)中的结果强调了特异性靶向SIRPa对于癌症应用(特别是癌症转移治疗或预防)的重要性。在细胞表达SIRPg的人类中，特异性靶向SIRPa而不破坏CD47-SIRPg相互作用将很有用(例如本发明的抗体)。
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Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu
20 25 30
Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly
35 40 45
Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly
50 55 60
Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu
85 90 95
Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr
100 105 110
Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser
115 120 125
Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val
130 135 140
Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala
145 150 155 160
Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser
165 170 175
Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser
180 185 190
Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser
195 200 205
Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His Ser
210 215 220
Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu
225 230 235 240
Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu
245 250 255
Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val Thr
260 265 270
Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp Leu
275 280 285
Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr Glu
290 295 300
Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn Val
305 310 315 320
Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His Asp
325 330 335
Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala His
340 345 350
Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly Ser Asn
355 360 365
Glu Arg Asn Ile Tyr Ile Val Val Gly Val Val Cys Thr Leu Leu Val
370 375 380
Ala Leu Leu Met Ala Ala Leu Tyr Leu Val Arg Ile Arg Gln Lys Lys
385 390 395 400
Ala Gln Gly Ser Thr Ser Ser Thr Arg Leu His Glu Pro Glu Lys Asn
405 410 415
Ala Arg Glu Ile Thr Gln Asp Thr Asn Asp Ile Thr Tyr Ala Asp Leu
420 425 430
Asn Leu Pro Lys Gly Lys Lys Pro Ala Pro Gln Ala Ala Glu Pro Asn
435 440 445
Asn His Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Gln Thr Ser Pro Gln Pro Ala Ser
450 455 460
Glu Asp Thr Leu Thr Tyr Ala Asp Leu Asp Met Val His Leu Asn Arg
465 470 475 480
Thr Pro Lys Gln Pro Ala Pro Lys Pro Glu Pro Ser Phe Ser Glu Tyr
485 490 495
Ala Ser Val Gln Val Pro Arg Lys
500
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 表位 SIRPa v1 长版本
<400> 4
Lys Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 线性表位 SIRPa v1 /1
<400> 5
Ser Leu Ile Pro Val Gly Pro
1 5
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 线性表位 SIRPa v1 /2
<400> 6
Gly Arg Glu Leu Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His
1 5 10
<210> 7
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 构象表位 SIRPa v1 /1
<400> 7
Glu Leu Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg
1 5 10
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 构象表位 SIRPa v1 /2
<400> 8
Arg Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn
1 5 10
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> HCDR1
<400> 9
Ser Tyr Trp Val His
1 5
<210> 10
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> HCDR2 1
<400> 10
Asn Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
<210> 11
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> HCDR2 2
<400> 11
Asn Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr His Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> HCDR3 1
<400> 12
Gly Gly Thr Gly Thr Met Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> HCDR3 2
<400> 13
Gly Gly Thr Gly Thr Leu Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> HCDR3 3
<400> 14
Gly Gly Thr Gly Thr Met Ala Tyr Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> HCDR3 4
<400> 15
Gly Gly Thr Gly Thr Leu Ala Tyr Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 16
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 轻链可变结构域 /1
<400> 16
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Tyr Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 17
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 轻链可变结构域 /2
<400> 17
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Tyr Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 18
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 重链可变结构域 /1
<400> 18
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Val His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr His Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly His Val Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Gly Gly Thr Gly Thr Leu Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 19
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 重链可变结构域 /2
<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Val His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr His Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly His Val Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Gly Gly Thr Gly Thr Met Ala Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 20
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 重链可变结构域 /3
<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Val His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr His Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly His Val Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Gly Gly Thr Gly Thr Leu Ala Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 21
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 重链可变结构域 /4
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Val His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp His Val Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Gly Gly Thr Gly Thr Met Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 22
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 重链可变结构域 /5
<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Val His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp His Val Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Gly Gly Thr Gly Thr Met Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 23
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 重链可变结构域 /6
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Val His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr His Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly His Val Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Gly Gly Thr Gly Thr Met Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 24
<211> 474
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> SIRPa V1 (无SP)
<400> 24
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu
100 105 110
Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala
115 120 125
Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly
130 135 140
Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu
145 150 155 160
Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser
165 170 175
Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val
180 185 190
His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp
195 200 205
Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro
210 215 220
Thr Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn
225 230 235 240
Val Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr
245 250 255
Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val
260 265 270
Thr Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val
275 280 285
Asn Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu
290 295 300
His Asp Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser
305 310 315 320
Ala His Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly
325 330 335
Ser Asn Glu Arg Asn Ile Tyr Ile Val Val Gly Val Val Cys Thr Leu
340 345 350
Leu Val Ala Leu Leu Met Ala Ala Leu Tyr Leu Val Arg Ile Arg Gln
355 360 365
Lys Lys Ala Gln Gly Ser Thr Ser Ser Thr Arg Leu His Glu Pro Glu
370 375 380
Lys Asn Ala Arg Glu Ile Thr Gln Asp Thr Asn Asp Ile Thr Tyr Ala
385 390 395 400
Asp Leu Asn Leu Pro Lys Gly Lys Lys Pro Ala Pro Gln Ala Ala Glu
405 410 415
Pro Asn Asn His Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Gln Thr Ser Pro Gln Pro
420 425 430
Ala Ser Glu Asp Thr Leu Thr Tyr Ala Asp Leu Asp Met Val His Leu
435 440 445
Asn Arg Thr Pro Lys Gln Pro Ala Pro Lys Pro Glu Pro Ser Phe Ser
450 455 460
Glu Tyr Ala Ser Val Gln Val Pro Arg Lys
465 470
<210> 25
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 表位 SIRPa v1 右
<400> 25
Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg
1 5 10 15
<210> 26
<211> 4201
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> cDNA 完整 SIRPa v1
<400> 26
tccggcccgc acccaccccc aagaggggcc ttcagctttg gggctcagag gcacgacctc 60
ctggggaggg ttaaaaggca gacgcccccc cgccccccgc gcccccgcgc cccgactcct 120
tcgccgcctc cagcctctcg ccagtgggaa gcggggagca gccgcgcggc cggagtccgg 180
aggcgagggg aggtcggccg caacttcccc ggtccacctt aagaggacga tgtagccagc 240
tcgcagcgct gaccttagaa aaacaagttt gcgcaaagtg gagcggggac ccggcctctg 300
ggcagccccg gcggcgcttc cagtgccttc cagccctcgc gggcggcgca gccgcggccc 360
atggagcccg ccggcccggc ccccggccgc ctcgggccgc tgctctgcct gctgctcgcc 420
gcgtcctgcg cctggtcagg agtggcgggt gaggaggagc tgcaggtgat tcagcctgac 480
aagtccgtgt tggttgcagc tggagagaca gccactctgc gctgcactgc gacctctctg 540
atccctgtgg ggcccatcca gtggttcaga ggagctggac caggccggga attaatctac 600
aatcaaaaag aaggccactt cccccgggta acaactgttt cagacctcac aaagagaaac 660
aacatggact tttccatccg catcggtaac atcaccccag cagatgccgg cacctactac 720
tgtgtgaagt tccggaaagg gagccccgat gacgtggagt ttaagtctgg agcaggcact 780
gagctgtctg tgcgcgccaa accctctgcc cccgtggtat cgggccctgc ggcgagggcc 840
acacctcagc acacagtgag cttcacctgc gagtcccacg gcttctcacc cagagacatc 900
accctgaaat ggttcaaaaa tgggaatgag ctctcagact tccagaccaa cgtggacccc 960
gtaggagaga gcgtgtccta cagcatccac agcacagcca aggtggtgct gacccgcgag 1020
gacgttcact ctcaagtcat ctgcgaggtg gcccacgtca ccttgcaggg ggaccctctt 1080
cgtgggactg ccaacttgtc tgagaccatc cgagttccac ccaccttgga ggttactcaa 1140
cagcccgtga gggcagagaa ccaggtgaat gtcacctgcc aggtgaggaa gttctacccc 1200
cagagactac agctgacctg gttggagaat ggaaacgtgt cccggacaga aacggcctca 1260
accgttacag agaacaagga tggtacctac aactggatga gctggctcct ggtgaatgta 1320
tctgcccaca gggatgatgt gaagctcacc tgccaggtgg agcatgacgg gcagccagcg 1380
gtcagcaaaa gccatgacct gaaggtctca gcccacccga aggagcaggg ctcaaatacc 1440
gccgctgaga acactggatc taatgaacgg aacatctata ttgtggtggg tgtggtgtgc 1500
accttgctgg tggccctact gatggcggcc ctctacctcg tccgaatcag acagaagaaa 1560
gcccagggct ccacttcttc tacaaggttg catgagcccg agaagaatgc cagagaaata 1620
acacaggaca caaatgatat cacatatgca gacctgaacc tgcccaaggg gaagaagcct 1680
gctccccagg ctgcggagcc caacaaccac acggagtatg ccagcattca gaccagcccg 1740
cagcccgcgt cggaggacac cctcacctat gctgacctgg acatggtcca cctcaaccgg 1800
acccccaagc agccggcccc caagcctgag ccgtccttct cagagtacgc cagcgtccag 1860
gtcccgagga agtgaatggg accgtggttt gctctagcac ccatctctac gcgctttctt 1920
gtcccacagg gagccgccgt gatgagcaca gccaacccag ttcccggagg gctggggcgg 1980
tgcaggctct gggacccagg ggccagggtg gctcttctct ccccacccct ccttggctct 2040
ccagcacttc ctgggcagcc acggccccct ccccccacat tgccacatac ctggaggctg 2100
acgttgccaa accagccagg gaaccaacct gggaagtggc cagaactgcc tggggtccaa 2160
gaactcttgt gcctccgtcc atcaccatgt gggttttgaa gaccctcgac tgcctccccg 2220
atgctccgaa gcctgatctt ccagggtggg gaggagaaaa tcccacctcc cctgacctcc 2280
accacctcca ccaccaccac caccaccacc accaccacta ccaccaccac ccaactgggg 2340
ctagagtggg gaagatttcc cctttagatc aaactgcccc ttccatggaa aagctggaaa 2400
aaaactctgg aacccatatc caggcttggt gaggttgctg ccaacagtcc tggcctcccc 2460
catccctagg ctaaagagcc atgagtcctg gaggaggaga ggacccctcc caaaggactg 2520
gagacaaaac cctctgcttc cttgggtccc tccaagactc cctggggccc aactgtgttg 2580
ctccacccgg acccatctct cccttctaga cctgagcttg cccctccagc tagcactaag 2640
caacatctcg ctgtggacgc ctgtaaatta ctgagaaatg tgaaacgtgc aatcttgaaa 2700
ctgaggtgtt agaaaacttg atctgtggtg ttttgttttg ttttttttct taaaacaaca 2760
gcaacgtgat cttggctgtc tgtcatgtgt tgaagtccat ggttgggtct tgtgaagtct 2820
gaggtttaac agtttgttgt cctggaggga ttttcttaca gcgaagactt gagttcctcc 2880
aagtcccaga accccaagaa tgggcaagaa ggatcaggtc agccactccc tggagacaca 2940
gccttctggc tgggactgac ttggccatgt tctcagctga gccacgcggc tggtagtgca 3000
gccttctgtg accccgctgt ggtaagtcca gcctgcccag ggctgctgag ggctgcctct 3060
tgacagtgca gtcttatcga gacccaatgc ctcagtctgc tcatccgtaa agtggggata 3120
gtgaagatga cacccctccc caccacctct cataagcact ttaggaacac acagagggta 3180
gggatagtgg ccctggccgt ctatcctacc cctttagtga ccgcccccat cccggctttc 3240
tgagctgatc cttgaagaag aaatcttcca tttctgctct caaaccctac tgggatcaaa 3300
ctggaataaa ttgaagacag ccagggggat ggtgcagctg tgaagctcgg gctgattccc 3360
cctctgtccc agaaggttgg ccagagggtg tgacccagtt accctttaac ccccaccctt 3420
ccagtcgggt gtgagggcct gaccgggccc agggcaagca gatgtcgcaa gccctattta 3480
ttcagtcttc actataactc ttagagttga gacgctaatg ttcatgactc ctggccttgg 3540
gatgcccaag ggatttctgg ctcaggctgt aaaagtagct gagccatcct gcccattcct 3600
ggaggtccta caggtgaaac tgcaggagct cagcatagac ccagctctct gggggatggt 3660
cacctggtga tttcaatgat ggcatccagg aattagctga gccaacagac catgtggaca 3720
gctttggcca gagctcccgt gtggcatctg ggagccacag tgacccagcc acctggctca 3780
ggctagttcc aaattccaaa agattggctt gtaaaccttc gtctccctct cttttaccca 3840
gagacagcac atacgtgtgc acacgcatgc acacacacat tcagtatttt aaaagaatgt 3900
tttcttggtg ccattttcat tttattttat tttttaattc ttggaggggg aaataaggga 3960
ataaggccaa ggaagatgta tagctttagc tttagcctgg caacctggag aatccacata 4020
ccttgtgtat tgaaccccag gaaaaggaag aggtcgaacc aaccctgcgg aaggagcatg 4080
gtttcaggag tttattttaa gactgctggg aaggaaacag gccccatttt gtatatagtt 4140
gcaacttaaa ctttttggct tgcaaaatat ttttgtaata aagatttctg ggtaataatg 4200
a 4201
<210> 27
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> cDNA 外显子3 SIRPa v1
<400> 27
gagtggcggg tgaggaggag ctgcaggtga ttcagcctga caagtccgtg ttggttgcag 60
ctggagagac agccactctg cgctgcactg cgacctctct gatccctgtg gggcccatcc 120
agtggttcag aggagctgga ccaggccggg aattaatcta caatcaaaaa gaaggccact 180
tcccccgggt aacaactgtt tcagacctca caaagagaaa caacatggac ttttccatcc 240
gcatcggtaa catcacccca gcagatgccg gcacctacta ctgtgtgaag ttccggaaag 300
ggagccccga tgacgtggag tttaagtctg gagcaggcac tgagctgtct gtgcgcg 357
<210> 28
<211> 503
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> SIRPa v2 (有SP)
<400> 28
Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu
20 25 30
Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala Ala Gly
35 40 45
Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly
50 55 60
Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Glu Ser
85 90 95
Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn Ile Thr
100 105 110
Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser
115 120 125
Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg
130 135 140
Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala Thr
145 150 155 160
Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser Pro
165 170 175
Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser Asp
180 185 190
Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser Ile
195 200 205
His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His Ser Gln
210 215 220
Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu Arg
225 230 235 240
Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu Glu
245 250 255
Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val Thr Cys
260 265 270
Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp Leu Glu
275 280 285
Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr Glu Asn
290 295 300
Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn Val Ser
305 310 315 320
Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His Asp Gly
325 330 335
Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala His Pro
340 345 350
Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly Ser Asn Glu
355 360 365
Arg Asn Ile Tyr Ile Val Val Gly Val Val Cys Thr Leu Leu Val Ala
370 375 380
Leu Leu Met Ala Ala Leu Tyr Leu Val Arg Ile Arg Gln Lys Lys Ala
385 390 395 400
Gln Gly Ser Thr Ser Ser Thr Arg Leu His Glu Pro Glu Lys Asn Ala
405 410 415
Arg Glu Ile Thr Gln Asp Thr Asn Asp Ile Thr Tyr Ala Asp Leu Asn
420 425 430
Leu Pro Lys Gly Lys Lys Pro Ala Pro Gln Ala Ala Glu Pro Asn Asn
435 440 445
His Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Gln Thr Ser Pro Gln Pro Ala Ser Glu
450 455 460
Asp Thr Leu Thr Tyr Ala Asp Leu Asp Met Val His Leu Asn Arg Thr
465 470 475 480
Pro Lys Gln Pro Ala Pro Lys Pro Glu Pro Ser Phe Ser Glu Tyr Ala
485 490 495
Ser Val Gln Val Pro Arg Lys
500
<210> 29
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 表位 SIRPa v2 长版本
<400> 29
Lys Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Thr Glu
1 5 10
<210> 30
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 表位 SIRPa v2 右
<400> 30
Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg
1 5 10
<210> 31
<211> 355
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> cDNA 外显子3 SIRPa v2
<400> 31
gagtggcggg tgaggaggag ctgcaggtga ttcagcctga caagtccgta tcagttgcag 60
ctggagagtc ggccattctg cactgcactg tgacctccct gatccctgtg gggcccatcc 120
agtggttcag aggagctgga ccagcccggg aattaatcta caatcaaaaa gaaggccact 180
tcccccgggt aacaactgtt tcagagtcca caaagagaga aaacatggac ttttccatca 240
gcatcagtaa catcacccca gcagatgccg gcacctacta ctgtgtgaag ttccggaaag 300
ggagccctga cacggagttt aagtctggag caggcactga gctgtctgtg cgtgc 355
<210> 32
<211> 180
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> SIRPa 人 变体1
<400> 32
Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu
20 25 30
Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly
35 40 45
Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly
50 55 60
Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu
85 90 95
Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr
100 105 110
Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser
115 120 125
Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val
130 135 140
Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala
145 150 155 160
Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser
165 170 175
Pro Arg Asp Ile
180
<210> 33
<211> 179
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> SIRPa 人 变体2
<400> 33
Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu
20 25 30
Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly
35 40 45
Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly
50 55 60
Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu
85 90 95
Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr
100 105 110
Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser
115 120 125
Pro Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg
130 135 140
Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala Thr
145 150 155 160
Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser Pro
165 170 175
Arg Asp Ile
<210> 34
<211> 179
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> SIRPb 人
<400> 34
Met Pro Val Pro Ala Ser Trp Pro His Leu Pro Ser Pro Phe Leu Leu
1 5 10 15
Met Thr Leu Leu Leu Gly Arg Leu Thr Gly Val Ala Gly Glu Asp Glu
20 25 30
Leu Gln Val Ile Gln Pro Glu Lys Ser Val Ser Val Ala Ala Gly Glu
35 40 45
Ser Ala Thr Leu Arg Cys Ala Met Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly Pro
50 55 60
Ile Met Trp Phe Arg Gly Ala Gly Ala Gly Arg Glu Leu Ile Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Glu Leu Thr
85 90 95
Lys Arg Asn Asn Leu Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn Ile Thr Pro
100 105 110
Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser Pro
115 120 125
Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg
130 135 140
Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Val Arg Ala Thr
145 150 155 160
Pro Glu His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser Pro
165 170 175
Arg Asp Ile
<210> 35
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> SIRPg 人 /1
<400> 35
Met Pro Val Pro Ala Ser Trp Pro His Pro Pro Gly Pro Phe Leu Leu
1 5 10 15
Leu Thr Leu Leu Leu Gly Leu Thr Glu Val Ala Gly Glu Glu Glu Leu
20 25 30
Gln Met Ile Gln Pro Glu Lys Leu Leu Leu Val Thr Val Gly Lys Thr
35 40 45
Ala Thr Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Leu Pro Val Gly Pro Val
50 55 60
Leu Trp Phe Arg Gly Val Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr Asn Gln
65 70 75 80
Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu Thr Lys
85 90 95
Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Ser Ser Ile Thr Pro Ala
100 105 110
Asp Val Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser Pro Glu
115 120 125
Asn Val Glu Phe Lys Ser Gly Pro Gly Thr Glu Met Ala Leu Gly Ala
130 135 140
Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Leu Gly Pro Ala Ala Arg Thr Thr Pro
145 150 155 160
Glu His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser Pro Arg
165 170 175
Asp Ile

Claims (23)

1.抗人SIRPa抗体、其抗原结合片段或其修饰的抗体，其中，所述抗人SIRPa抗体、其抗原结合片段或其修饰的抗体包含：
(a)重链可变结构域，所述重链可变结构域包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，
其中：
HCDR1包含或由SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列组成；
HCDR2包含或由SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列组成；
HCDR3包含或由SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列组成；
以及
(b)轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列；
所述抗人SIRPa抗体、其抗原结合片段或其修饰的抗体用于治疗或预防疾病，特别是癌症，或用于针对疾病特别是癌症的治疗性疫苗接种；所述抗体、其抗原结合片段或其修饰的抗体增强在所述疾病特别是所述癌症中表达的抗原的交叉呈递，并参与引发适用于治疗所述疾病的T细胞应答。
2.根据权利要求1所述的抗人SIRPa抗体或其抗原结合片段或其修饰的抗体，其中，所述抗人SIRPa抗体或其抗原结合片段或其修饰的抗体：
-与人SIRPa v1特异性结合并抑制人CD47与人SIRPa v1的结合、不阻止或抑制人CD47与人SIRPg的结合；特别是不与人SIRPg特异性结合。
3.抗人SIRPa抗体或其抗原结合片段或其修饰的抗体，其中，所述抗人SIRPa抗体或其抗原结合片段或其修饰的抗体包含：
a)重链可变结构域，所述重链可变结构域包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，
其中：
HCDR1包含或由SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列组成；
HCDR2包含或由SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列组成；
HCDR3包含或由SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列组成；
以及
b)轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列；
其中，所述抗人SIRPa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物抑制人CD47与人SIRPa v1的结合，并且不阻止或抑制人CD47与人SIRPa v2的结合；
所述抗人SIRPa抗体或其抗原结合片段或其修饰的抗体用于预防和/或治疗SIRPa v1阳性受试者的疾病。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗人SIRPa抗体或其抗原结合片段或其修饰的抗体，其中，
所述重链可变结构域包含或由SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20或SEQID NO：21或SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列组成；特别地，所述重链可变结构域包含或由SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列组成；
所述轻链可变结构域包含或由SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列组成。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗人SIRPa抗体或其抗原结合片段或其修饰的抗体，其中，所述疾病选自癌症，特别是炎性癌症和具有浸润的髓样细胞，特别是浸润的树突状细胞和/或MDSC细胞和/或TAM细胞的癌症、癌症转移，特别是乳腺癌转移、黑色素瘤；或者权利要求1或4所述的用途是针对这些疾病之一的治疗性疫苗接种，特别是针对黑色素瘤的治疗性疫苗接种。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗人SIRPa抗体或其抗原结合片段或其修饰的抗体，其中，所述抗人SIRPa抗体或其抗原结合片段或其修饰的抗体具有以下特性：
-它不特异性结合人SIRPa v2；
-它不抑制人CD47与人SIRPg的结合，特别是它不与人SIRPg特异性结合；
-它以至少10E-9M的亲和力与人SIRPa v1结合；以及
-它促进抗原呈递细胞特别是树突状细胞对人T细胞特别是人CD8+T细胞交叉呈递至少一种抗原；
可选地，所述抗人SIRPa抗体或其抗原结合片段或其修饰的抗体具有以下特性中的至少一种：
-它不抑制人T细胞的体内活化和/或增殖；和/或
-它促进巨噬细胞的活化。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗人SIRPa抗体或其抗原结合片段或其修饰的抗体，其中，所述疾病是癌症；并且受试者中表达或检测到至少一种抗原，所述抗原选自：来自人乳头状瘤病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、梅克尔细胞多瘤病毒、人类免疫缺陷病毒、人T细胞白血病病毒、人类疱疹病毒8、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HCV、HBC、巨细胞病毒的抗原；或单点突变抗原，所述单点突变抗原选自CTNNB1基因、CASP8基因、hER2基因、p53基因、KRAS基因、NRAS基因的抗原；或肿瘤抗原，特别是产生自或源自下组的肿瘤抗原：ras癌基因、BCR-ABL肿瘤抗原、ETV6-AML1肿瘤抗原、黑色素瘤抗原编码基因(MAGE)、BAGE抗原、GAGE抗原、ssx抗原、ny-eso-1抗原、周期蛋白A1肿瘤抗原、MART-1抗原、gp100抗原、CD19抗原、前列腺特异抗原、前列腺酸性磷酸酶抗原、癌胚抗原、甲胎蛋白抗原、癌抗原125、粘蛋白16抗原、粘蛋白1抗原、人端粒酶逆转录酶抗原、EGFR抗原、MOK抗原、RAGE-1抗原、PRAME抗原、野生型p53抗原、癌基因ERBB2抗原、唾液酸Tn肿瘤抗原、肾母细胞瘤1抗原、间皮素抗原、碳水化合物抗原、B-连环蛋白抗原、MUM-1抗原、CDK4抗原和ERBB2IP抗原，特别是Melan-A黑色素瘤肿瘤相关抗原(TAA)。
8.药物组合物，其中，所述药物组合物包含权利要求1至7中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或其修饰的抗体，还包含至少一种药物媒介物。
9.多肽(特别是抗原)在生产或筛选抗人SIRPa v1抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或其修饰的抗体中的用途，其中，所述多肽或抗原包含或由人SIRPa v1的表位组成，所述人SIRPa v1的表位由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：25组成，所述抗人SIRPa v1抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或其修饰的抗体特异性结合人SIRPa v1、抑制人CD47与人SIRPa v1的结合，并且不阻止或抑制人CD47与人SIRPa v2和人SIRPg的结合，特别地，所述抗人SIRPa v1抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或其修饰的抗体增强抗原呈递细胞特别是树突状细胞向人T细胞特别是CD8+T细胞交叉呈递抗原。
10.制备抗人SIRPa v1抗体的方法，其中，所述方法包括用权利要求9所述的至少一种抗原或至少一种包含或由人SIRPa v1的表位组成的抗原免疫非人动物，特别是非人哺乳动物，所述人SIRPa v1的表位由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：25组成；特别地，从所述免疫的非人动物中收集所得的血清或B细胞，获得针对所述抗原的抗体。
11.根据权利要求9所述的用途或根据权利要求所述10的方法，其中，所述用途或方法还包括筛选和回收抗人SIRPa v1抗体的步骤，所述筛选步骤包括以下步骤中的至少一个：
a.检测抗体与人SIRPa v1的结合能力，特别是抗体与权利要求7中所述的抗原的结合能力；和/或
b.检测抗体降低或抑制人CD47与人SIRPa v1结合的能力；和/或
c.检测抗体阻止或抑制人CD47与人SIRPa v2结合的能力；和/或
d.检测抗体阻止或抑制人CD47与人SIRPg结合的能力；
以及，可选地：
e.检测抗体结合分别位于SEQ ID NO：3的SIRPa的第130位和第132位或分别位于SEQID NO：24的SIRPa的第100位和第102位的氨基酸残基D和氨基酸残基V的能力；
f.检测抗体与人SIRPa v2结合的能力；和/或
g.检测抗体与人SIRPg结合的能力；
其中，回收的抗体具有以下特性：
1.它与人SIRPa v1特异性结合；
2.它降低或抑制人CD47与人SIRPa v1的结合；
3.它不降低或抑制人CD47与人SIRPg的结合；
以及可选地，回收的抗体具有以下特性中的至少一种：
4.它以至少10E-9M的亲和力结合人SIRPa v1；和/或
5.它结合分别位于SEQ ID NO：3的SIRPa的第130位和第132位或分别位于SEQ ID NO：24的SIRPa的第100位和第102位的氨基酸残基D和V；和/或
6.它不与人SIRPg特异性结合；和/或
7.它不与人SIRPa v2特异性结合。
12.根据权利要求9所述的用途或根据权利要求10或11所述的方法，其中，所获得的抗体以至少1E-9M的亲和力与人SIRPa v1特异性结合，且不与人SIRPa v2特异性结合，特别地，回收的抗人SIRPa v1抗体是人CD47与人SIRPa v1结合的拮抗剂。
13.评估抗人SIRPa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或其修饰的抗体在人类受试者中治疗有效性的可能性的体外方法或离体方法，更具体地，向人类受试者施用抗人SIRPa v1抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体，所述方法包括测定先前从受试者获得的生物样品中SIRPa v1的存在，特别地，通过权利要求1至7中任一项所述的抗人SIRPa v1抗体、权利要求8所述的组合物或如权利要求9所述制备的抗人SIRPa v1抗体或如权利要求10或11所述筛选的化合物检测所述SIRPa v1；其中，所述生物样品中SIRPa v1的存在表明所述治疗可能有效。
14.评估抗人SIRPa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体在人类受试者中治疗有效性的可能性的体外方法或离体方法，更具体地，其中，向人类受试者施用抗人SIRPa v1抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体，所述方法包括测定受试者的SIRPa等位基因，特别是测定所述受试者的至少一种SIRPa等位基因是否包含编码SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：25的氨基酸残基的核酸序列；其中，先前从受试者获得的生物样品的SIRPa等位基因中存在编码SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4或SEQID NO：25的氨基酸残基的核酸序列表明所述治疗可能有效，特别地，使用适用于扩增SIRPa基因或SIRPa转录本的一部分和/或包含核酸序列的一部分的引物，通过聚合酶链反应测定生物样品的SIRPa等位基因，所述SIRPa基因或SIRPa转录本的一部分包含人SIRPa的SNP 15和SNP 16或包含人SIRPa的SNP 17，所述包含核酸序列的一部分编码SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：4或SEQ ID NO：25内的氨基酸残基DDV。
15.化合物组合，其中，所述化合物组合包含：
(i)权利要求1至7中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或其修饰的抗体；和/或权利要求8所述的组合物；以及
(ii)至少一种抗原，所述抗原选自：来自人乳头状瘤病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、梅克尔细胞多瘤病毒、人类免疫缺陷病毒、人T细胞白血病病毒、人类疱疹病毒8、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HCV、HBC、巨细胞病毒的抗原；或单点突变抗原，所述单点突变抗原源自CTNNB1基因、CASP8基因、hER2基因、p53基因、KRAS基因、NRAS基因的抗原；或肿瘤抗原，特别是产生自或源自下组的肿瘤抗原：ras癌基因、BCR-ABL肿瘤抗原、ETV6-AML1肿瘤抗原、黑色素瘤抗原编码基因(MAGE)、BAGE抗原、GAGE抗原、ssx抗原、ny-eso-1抗原、周期蛋白A1肿瘤抗原、MART-1抗原、gp100抗原、CD19抗原、前列腺特异抗原、前列腺酸性磷酸酶抗原、癌胚抗原、甲胎蛋白抗原、癌抗原125、粘蛋白16抗原、粘蛋白1抗原、人端粒酶逆转录酶抗原、EGFR抗原、MOK抗原、RAGE-1抗原、PRAME抗原、野生型p53抗原、癌基因ERBB2抗原、唾液酸Tn肿瘤抗原、肾母细胞瘤1抗原、间皮素抗原、碳水化合物抗原、B-连环蛋白抗原、MUM-1抗原、CDK4抗原和ERBB2IP抗原，特别是Melan-A黑色素瘤肿瘤相关抗原(TAA)或任何特定的突变抗原(新抗原或新表位)；
所述化合物组合用于治疗或预防疾病，特别是癌症，或用于针对疾病特别是癌症的治疗性疫苗接种；其中，所述抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体增强在所述疾病特别是癌症中表达的抗原的交叉呈递，并参与引发适用于治疗所述疾病的T细胞应答，特别是用于治疗SIRPa v1阳性受试者的疾病，特别是用于治疗或预防CD47过表达的疾病。
16.化合物组合，其中，所述化合物组合包含：
(i)权利要求1至7中任一项所述的抗体、其抗原结合片段、抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体；和/或权利要求8所述的组合物；以及
(ii)至少一种第二治疗剂，所述第二治疗剂选自化学治疗剂、放射治疗剂、免疫治疗剂、细胞治疗剂、抗生素和益生菌，特别是免疫治疗剂，所述免疫治疗剂选自检查点阻断剂或适应性免疫细胞活化剂，特别选自：抗PDL1、抗PD1、抗CTLA4、抗CD137、抗CD2、抗CD28、抗CD40、抗HVEM、抗BTLA、抗CD160、抗TIGIT、抗TIM-1/3、抗LAG-3、抗2B4、抗VISTA、抗OX40、抗CD40激动剂、CD40-L、TLR激动剂、抗ICOS、ICOS-L、STING激动剂、IDO抑制剂、溶瘤病毒激动剂和B细胞受体激动剂；
所述化合物组合用于治疗或预防疾病，特别是癌症，或用于针对疾病特别是癌症的治疗性疫苗接种，特别是在SIRPa v1阳性受试者中，特别是用于治疗或预防CD47过表达的疾病。
17.根据权利要求15或16所述的化合物组合，其中，所述化合物组合适合引起受试者的免疫应答，特别是所述化合物组合引起适用于治疗所述疾病的T细胞应答，所述活化包括：(i)活化T细胞，特别是CD8+T细胞；和/或(ii)增强树突状细胞向CD8+T细胞交叉呈递至少一种抗原；和/或(iii)增强巨噬细胞极化，特别是M1巨噬细胞极化；或(i)、(ii)和(iii)。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的化合物组合，其中，所述疾病选自：癌症，特别是炎性癌症和具有浸润的髓样细胞特别是浸润的树突状细胞或MDSC细胞和/或TAM细胞的癌症、传染性疾病、慢性炎性疾病、自身免疫性疾病、神经系统疾病、脑损伤、神经损伤、红细胞增多症、血色素沉着病、创伤、感染性休克、慢性传染性疾病，特别是假单胞菌和CMV传染性疾病、纤维化、动脉粥样硬化、肥胖症、II型糖尿病、黑色素瘤和移植物失功，特别是黑色素瘤。
19.增强抗原呈递细胞特别是树突状细胞向T细胞特别是CD8+T细胞交叉呈递抗原的方法，其中，所述方法包括向受试者施用化合物，所述化合物选自抗人SIRPa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物或修饰的抗体，所述化合物至少具有以下特性：
1.它不与人SIRPa v2特异性结合；
2.它以至少1E-9M的亲和力与人SIRPa v1结合；
3.它降低或抑制人CD47与人SIRPa v1的结合；
4.它不阻止或抑制人CD47与人SIRPg的结合；
所述化合物可选地具有以下特性中的至少一种：
i)它不抑制T细胞增殖；和/或
ii)它不抑制T细胞活化；和/或
iii)它增强巨噬细胞的活化。
20.根据权利要求19所述的增加抗原的交叉呈递的方法，其中，施用的化合物是抗人SIRPa抗体或其抗原结合片段或其修饰的抗体，所述抗人SIRPa抗体或其抗原结合片段或其修饰的抗体包含：
(a)重链可变结构域，所述重链可变结构域包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，
其中：
HCDR1包含或由SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列组成；
HCDR2包含或由SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列组成；
HCDR3包含或由SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列组成；
以及
(b)轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列。
21.评估抗人SIRPa v1抗体或其抗原结合片段或其修饰的抗体在人类受试者中治疗有效性的可能性的方法，其中，所述方法包括：
-当人类受试者为SIRPa v1阳性时，测定先前从人类受试者获得的生物样品中人SIRPav1的存在；
-施用治疗量的权利要求1至8中任一项所述的抗SIRPa抗体或其抗原结合片段或其修饰的抗体；或权利要求15至18中任一项所述的化合物组合；或如权利要求11或12所述筛选的化合物。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述生物样品中SIRPa v1的存在表明所述治疗可能在所述人类受试者中是有效的。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中，待治疗的人类受试者患有癌症或可能发展为癌症。
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