KR102355240B1 - 신규한 항-SIRPa 항체 및 이들의 치료학적 적용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 SIRPg과 CD47 사이의 상호작용에 영향을 미치지 않으면서, SIRPa와 CD47 사이의 상호작용을 특이적으로 길항할 수 있는 신규한 항-SIRPa 항체, 및 이의 용도를 제공한다.

Description

신규한 항-SIRPa 항체 및 이들의 치료학적 적용 방법
본 발명은 면역치료요법의 분야에 관한 것이다. 본 발명은 SIRPg와 CD47 사이의 상호작용에 영향을 미치지 않고 SIRPa와 CD47 사이의 상호작용을 특이적으로 감소시킬 수 있는 신규한 항-SIRPa 항체를 제공한다.
적응 면역성(adaptive immunity)의 면역 체크포인트(immune checkpoint)의 표적화는 다양한 암과 싸우기 위한 큰 치료학적 효능이 입증되었지만, 환자 비율이 제한된다. 골수종 세포(대식구, 수지 세포, MDSC, PMN)에서 면역 체크포인트는 많은 고형 종양에서 대부분 풍부한 면역 세포 유형을 나타내며 흔히 불량한 결과와 관련되어 있다.
시그날 조절 단백질 알파(signal regulatory protein alpha) 또는 SIRPa(또한 SIRPα, CD172a 또는 SHPS-1로 지정됨)는 골수 조직 속의 단핵세포, 조직 대식구의 대부분의 소집단, 과립세포, 림프구 조직 내의 수지 세포의 소세트, 일부 골수 선조 세포에서, 및 뉴우런에서 다양한 수준으로 발현되며, 특히, 소뇌 및 해마의 과립층과 같은, 뇌의 시냅스가 풍부한 부위에서 높게 발현된다. SIRPa는 밀접하게 관련된 SIRP 단백질의 SIRP 쌍을 이룬 수용체 계열의 단백질분해 구성원이다. 사람 SIRPa를 암호화하는 유전자는 다형성 유전자이며 수개의 변이체가 사람 집단에서 설명되었다. 대부분의 일반적인 단백질 변이체는 SIRPa v1 및 v2(수탁 번호 제NP_542970호(P78324) 및 제CAA71403호)이다. 사람 SIRP에 있어서의 다형성은 표면-노출된 아미노산에 있어서의 변화를 이끌지만, 이는 CD47에 대한 결합에 영향을 미치지 않는다.
골수 세포에 의해 발현된 SIRPa와 편재한 수용체(ubiquitous receptor) CD47은 골수 기능의 조절에 관여하는, 선천적 반응의 중요한 면역 체크포인트이다. CD47과 SIRPa의 상호작용은 많이 기술되어 있으며 숙주 세포 식세포작용을 억제하는 하향조절 시그날을 제공한다. CD47은 대부분의 건강한 세포에 의해 광범위하게 발현되지만 이는 또한 일부 암 세포에서 과발현된다. 따라서, CD47은 "나를 먹지 마세요" 시그날로서 기능한다. CD47 및 SIRPa 둘 다는 또한 많은 다른 상호작용에 관여하고 있다. CD47-SIRPa 상호작용의 가장 특성화된 생리학적 기능 중 하나는 조혈 세포, 특히 적혈구 세포 및 혈소판의 항상성에 있어서의 이의 역할이다. CD47은 "나를 먹지 마세요(don't-eat-me)" 시그날로 제공되며, 이와 같이 대식구에 의한 숙주 세포 식균 작용의 중요한 결정인자이며, 암 세포 청소(clearance)에 있어서 CD47-SIRPa 상호작용의 잠재적인 기여는 최근 몇년 동안 집중적으로 연구되어 왔다. 종양에서 CD47 수용체가 풍부한 것은 환자의 전체적인 생존과 역으로 관련되어 있으며 몇 가지 암 유형에 대한 부정적인 예후 인자를 구성한다.
SIRPa/CD47 경로는 요즘 대식구 식세포작용을 향상시키기 위한 상이한 약제학적 개발의 대상이다. 실제로, 감염된 세포와 같이, 암 세포는 비정상적인 수준의 친숙하지 않은 단백질 또는 정상 단백질과 같은 비정상적인 짐(cargo)을 운반하지만, 여전히 이들 세포는 면역조절 분자를 동시에 과-발현함으로써 선천적인 면역 조절 메카니즘을 파괴한다. 하나의 이러한 메카니즘이 정상 세포에 의해 "자가" 발현된 단백질인 CD47을 포함한다는 것은 명백해지고 있다. CD47은 SIRPa와 상호작용하여 "나를 먹지 마세요" 시그날을 식세포성 대식세포(phagocytic macrophage)에 전달하며, 이는 이후에 표적 세포가 영향을 받지 않도록 한다. 암 세포에 의한 CD47의 과-발현은 심지어 암세포가 치료학적 항체로 피복되는 경우에도 이들을 대식구에 대해 내성이 되도록 하며, 다수의 고형 및 혈액암에서 불량한 임상 결과와 관련된다. 실험 모델, 특히 면역결핍성 마우스내 사람 종양-이종이식체 모델에서, CD47을 표적화하는 제제(agent)를 통한 CD47/SIRPa 경로의 차단은 대식구에 의한 종양 제거를 증진시키고 암 세포 전파 및 전이 형성을 감소시키는데 매우 효과적이었다. 대식구에 의한 항체-의존성 식세포작용을 향상시킴으로써, CD47을 표적화하는 제제를 통한 CD47/SIRPa 경로의 차단은 트라스투주맙(항-Her2), 세툭시맙(항-EGFR), 리툭시맙(항-CD20) 및 알렘투주맙(항-CD52)과 같은 치료학적 항암 항체를 격감시키면서 상승작용하는 것으로 기술되었다.
그러나, 최근에 CD47(항-CD47 또는 SIRPa-Fc)를 표적화하는 제제는 CD47 생리학적 역할과 관련된 혈액학적 독성(빈혈 또는 혈소판감소증)을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
게다가, CD47은 또한 SIRP 계열의 다른 구성원인, 사람 T 세포의 표면에 존재하고 사람 골수 세포에는 존재하지 않는 SIRP-감마(또한 SIRPg, SIRPγ, CD172g 또는 SIRP 베타 2로 지정됨)에 관여한다. SIRPg는 대략 3500만년 전에 구 대륙 영장류에서 SIRPb 유전자의 중복(duplication)의 결과이며 이는 골수 세포에서 SIRPa 발현과는 대조적으로 T 림프구에서 제한된 방식으로 발현된다. SIRPg는 마우스에는 부재한다. SIRPg-CD47 상호작용은 세포-세포 부착을 매개하며, 초항원-의존성 T-세포 매개된 증식을 향상시키고 T-세포 활성화를 동시-자극함이 밝혀졌다(Piccio et al., Blood, 105:6, 2005).
SIRPa와 SIRPg 사이의 서열, 특히 CD47과 상호작용하는 영역내 높은 서열 유사성으로 인하여, 선행 기술에 개시된 항-SIRPa 항체는 또한 SIRPg에 결합하여 T-세포 증식의 억제 및 면역 반응의 감소와 같이 사람에서 바람직하지 않은 효과를 갖는다. 항-CD47 또는 비-선택적인 항-SIRPa 항체의 이러한 부작용은 공지된 항체의 시험이 SIRPg 유전자를 지지지 않아서 이러한 부작용이 부재하였던 마우스 모델에서 수행되기 때문에 예측될 수 없었다.
따라서, 특히 암에 대한 안전한 면역치료요법을 위한, T 세포 면역 반응에 대한 해로운 영향 없이 선천적인 면역 세포를 표적화하는 새롭고 개선된 제제, 특히 항체에 대해 당해 기술분야에서 유의적인 요구가 남아있다. 특히, SIRPg-CD47 상호작용에 영향을 미치지 않고 SIRPa-CD47 상호작용을 억제하기 위한 필요성이 존재한다. 본 발명자들은 본원에 개시된 본 발명으로 유의적인 진보 단계를 이루었다.
본 발명의 목적은 위에서 언급한 문제들 전체 또는 일부를 해결하는 것을 가능하도록 하는, 새로운 제제, 특히 항체를 제공함으로써 이러한 필요성을 충족시키는 것이다.
여기서, 본 발명자들은 SIRPa-CD47 상호작용을 길항하지만 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않음으로써 SIRPg-CD47 상호작용에 영향을 미치지 않는 신규한 항-SIRPa 항체, 특히 사람화된 항체를 제공한다.
본 발명의 항체는 특히 다음의 장점을 갖는다:
- 이들은 SIRPa의 제한된 발현으로 인하여 혈액학적 독성을 피한다(사람 적혈구 세포(RBC) 및 혈소판에 결합하지 않음);
- 이들은 종양 성장을 감소시키고 면역치료요법에서 종양 미세환경을 변경시킨다;
- 이들은 체크포인트 억제제 및 공자극제(costimulatory agent)와 상승 효과를 나타낸다;
- 이들은 내구성이 있고 풍부한 항-종양 기억 T 림프세포(lymphocyte) 반응을 유도한다;
- 이들은 SIRPa-CD47 상호작용의 선택적인 길항제이지만, CD47/SIRPg 상호작용을 방해하지 않는, 사람 T 세포 면역 반응을 가능하게 한다. 예측하지 못하게, 본 발명자들은 SIRPa와 SIRPg 서열 사이의 높은 서열 동일성(sequence identity)에도 불구하고 이러한 선택적인 항체를 제공한다.
이들 특성을 기반으로 선택된 이러한 새로운 항체는 특히 염증성 암 및 침윤된 골수 세포(특히 침윤된 MDSC 및/또는 TAM 세포)를 지닌 암을 포함하는 암의 치료를 위한 다수의 치료학적 적용에 특히 촉망된다.
SIRPa 항체( 에피토프를 지님)
일 국면에서, 본 발명은 SIRPa 내의 서열 번호: 1 (SLIPVGP), 서열 번호: 2 (G/ARELIYNQKEGH), 서열 번호: 3 (KFRKGSPD[DV]/[T]E), 서열 번호: 4 (QHTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), 서열 번호: 5 (ICEVAHVTLQG) 및 서열 번호: 6 (YPQRLQLTWLE)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 적어도 하나의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체(mimetic)에 관한 것이다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 관련 분야의 기술자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다.
편의상, 본원의 명세서, 실시예 및 청구범위에 사용된 특정 용어 및 어구의 의미가 제공된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "항체"는 폴리클로날 항체(polyclonal antibody), 모노클로날 항체 또는 재조합 항체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, "모노클로날 항체"는 상이한 아미노산 서열의 항체의 혼합물을 함유하는 "폴리클로날 항체"와는 대조적으로, 일반적인 중쇄 및 일반적인 경쇄 아미노산 서열을 공유하는 항체, 항체 분자의 제제를 지칭하는 것으로 의도된다. 모노클로날 항체는 파아지, 세균, 효모 또는 리보소옴 디스플레이(ribosomal display)과 같은 수개의 공지된 기술에 의해서 및 또한 하이브리도마-기원한 항체에 의해 예시된 전통적인 방법에 의해서 생성될 수 있다. 따라서, 용어 "모노클로날"은 하나의 핵산 클론으로부터 기원한 모든 항체를 지칭하기 위해 사용된다.
본 발명의 항체는 재조합 항체(recombinant antibody)를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "재조합 항체"는 숙주 세포내로 형질감염된 재조합체 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체; 재조합 조합 항체 라이브러리(library)로부터 분리된 항체; 사람 면역글로불린 유전자로 인하여 이식유전자성인 동물(예컨대, 마우스)로부터 분리된 항체; 또는 특수한 면역글로불린 유전자 서열(사람 면역글로불린 유전자 서열과 같은)이 다른 DNA 서열과 조립된 어떠한 다른 방식으로 생산되거나, 발현되거나, 발생되거나 분리된 항체와 같은, 재조합 수단에 의해 생산되거나, 발현되거나, 발생되거나 분리된 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, "키메라 항체(chimeric antibody)"는 마우스와 같은 포유동물 종의 배선(germline)으로부터 기원한 가변 도메인(variable domain)의 서열이 사람과 같은 다른 포유동물 종의 배선으로부터 기원한 불변 도메인(constant domain)의 서열에 이식된 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, "사람화된 항체(humanized antibody)"는 마우스와 같은 다른 포유동물 종으로부터 기원한 CDR 서열이 사람 골격 서열에 이식된 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, "항체의 항원-결합 단편"은 항체의 일부, 즉, 가능하게는 이의 천연 형태에서 SIRPa에 대해 항원-결합능을 나타내는, 본 발명의 항체의 구조의 일부에 상응하는 분자를 의미하며; 이러한 단편은 특히 상응하는 4개-쇄(four-chain) 항체의 항원-결합 특이성과 비교하여 상기 항원에 대해 동일하거나 실질적으로 동일한 항원-결합 특이성을 나타낸다. 유리하게는, 항원-결합 단편은 상응하는 4개-쇄 항체와 유사한 결합 친화성을 갖는다. 그러나, 상응하는 4개-쇄 항체와 관련하여 감소된 항원-결합 친화성을 갖는 항원-결합 단편이 또한 본 발명에 포함된다. 항원-결합능은 항체와 표적 단편 사이의 친화성을 측정함으로써 결정할 수 있다. 이러한 항원-결합 단편은 또한 항체의 "기능성 단편"으로서 지정될 수 있다.
항체의 항원-결합 단편은 CDR(상보성 결정 영역) 또는 항원에 대한 인식 부위, 즉, SIRPa의 세포외 도메인을 포함함으로써 항원 인식 특이성을 정의하는 이의 일부(들)로 지정된 이들의 초가변 도메인을 포함하는 단편이다.
4개-쇄 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인(각각 VL 및 VH)은 각각 VL-CDR1(또는 LCDR1), VL-CDR2(또는 LCDR2), VL-CDR3(또는 LCDR3) 및 VH-CDR1(또는 HCDR1), VH-CDR2(또는 HCDR2), VH-CDR3(또는 HCDR3)으로 지정된 3개의 CDR을 갖는다.
숙련가는 참고 번호매김 시스템을 포함하는, 나타낸 이러한 국면에서 표준 정의를 참고하거나, KABAT의 번호매김 시스템을 참고하거나 IMGT "콜리에 드 페를(collier de perle)" 알고리즘의 적용에 의해 항체의 다양한 영역/도메인의 위치를 측정할 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 서열의 정의를 위해, 영역/도메인의 한계는 참고 시스템마다 다양할 수 있다. 따라서, 본 발명에 정의된 영역/도메인은 대략 +/- 10%의 항체의 다양한 도메인의 완전한 길이의 서열내 관심있는 서열의 길이 또는 국지화(localization)에 있어서 변이를 나타내는 서열을 포함한다.
4개-쇄 면역글로불린의 구조를 바탕으로, 항원-결합 단편은 따라서 이용가능한 데이타베이스 및 선행 기술에서 항체의 서열을 비교함으로써, 및 특히 이들 서열의 기능성 도메인의 위치를 비교함으로써 정의될 수 있으며, 골격 및 불변 도메인의 위치는 다양한 부류의 항체, 특히 IgG, 특히 포유동물 IgG에 대해 잘 정의됨에 주목한다. 이러한 비교는 또한 항체의 3-차원 구조와 관련한 데이타를 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예의 예시 목적을 위해, 항체의 CDR을 포함하는 가변 도메인을 함유하는 항체의 항원 결합 단편은 Fv, dsFv, scFv, Fab, Fab', F(ab')2를 포함한다. Fv 단편은 소수성 상호작용에 의해 함께 회합된(associated) 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어지며; dsFv 단편에서, VH:VL 이종이량체는 이황화물 결합에 의해 안정화되고; scFv 단편에서, VL 및 VH 도메인은 굴곡성 펩타이드 링커를 통해 서로 연결됨으로써 단일-쇄 단백질을 형성한다. Fab 단편은 항체의 파파인 분해에 의해 수득가능한 단량체 단편이며; 이들은 이황화물 결합을 통해 함께 결합된, 전체 L 쇄, 및 H 쇄의 VH-CH1 단편을 포함한다. F(ab')2 단편은 힌지(hinge) 이황화물 아래의 항체의 펩신 분해에 의해 생산될 수 있으며; 이는 2개의 Fab' 단편, 및 추가로 면역글로불린 분자의 힌지 영역의 일부를 포함한다. Fab' 단편은 힌지 영역에서 이황화물 결합을 절단시킴으로써 F(ab')2 단편으로부터 수득가능하다. F(ab')2 단편은 2가인데, 즉, 이들은 천연의 면역글로불린 분자와 같이, 2개의 항원 결합 부위를 포함하고; 다른 한편으로는, Fv(Fab의 다양한 부분을 구성하는 VHVL 이량체), dsFv, scFv, Fab, 및 Fab' 단편은 1가인데, 즉, 이들은 단일의 항원-결합 부위를 포함한다. 본 발명의 이러한 기본 항원-결합 단편은 함께 결합하여 디아보디(diabody), 트리보디(tribody) 또는 테트라보디(tetrabody)와 같은 다가의 항원-결합 단편을 수득한다. 이들 다가의 항원-결합 단편은 또한 본 발명의 일부이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "이특이적(bispecific)" 항체는 제1 항원에 대해 특이적인 적어도 하나의 영역(예컨대, 제1 항체의 가변 영역으로부터 기원함), 및 제2의 항원에 대해 특이적인 적어도 하나의 제2의 영역(예컨대, 제2 항체의 가변 영역으로부터 기원함)을 지님으로써 2개의 상이한 항원을 인식하는 항체를 지칭한다. 이특이적 항체는 2개의 표적 항원에 특이적으로 결합함으로써 다중특이적 항체의 한가지 유형이다. 2개 이상의 상이한 항원을 인식하는 다중특이적(multispecific) 항체는 재조합 DNA 방법에 의해 생산될 수 있거나 어떠한 편리한 방법에 의해 화학적으로 생산된 항체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이특이적 항체는 2개의 상이한 항원을 인식할 수 있는 모든 항체 또는 항체의 접합체(conjugate) 또는 항체의 중합체 형태를 포함한다. 이특이적 항체는 이들의 2가 특성을 보유하도록 환원되어 재형성된 항체 및 화학적으로 커플링됨으로써 이들이 BiME (이특이적 대식구 향상 항체), BiTE(이특이적 T 세포 인게이저(engager)), DART(이중 친화성 재표적화); DNL(도크-앤드-록(dock-and-lock)), DVD-Ig(이중 가변 도메인 면역글로불린), HAS(사람 혈청 알부민), kih(홀내로의 놉(knobs into holes))과 같이 각각의 항원에 대해 수개의 항원 인식 부위를 가질 수 있는 항체를 포함한다.
따라서, 본 발명의 이특이적인 항체는 SIRPa 및 제2의 항원에 대해 지시된다.
일 구현예에서, 본 발명은 이특이적인 위에서 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
치료학적 항체를 개발하기 위한 수개의 연구는 Fc 영역을 가공하여 항체 특성을 최적화함으로써 이들의 요구된 약리학적 활성에 보다 잘 조절된 분자를 생성시켰다. 항체의 Fc 영역은 이의 혈청 반감기 및 상보체-의존성 세포독성(CDC), 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC) 및 항체-의존성 세포 식세포작용(ADCP)과 같은 효과기 기능(effector function)을 매개한다. T250Q/M428L 및 M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F와 같은, CH2 도메인과 CH3 도메인 사이의 계면에 위치한 수 개의 돌연변이는 생체내(in vivo)에서 FcRn에 대한 결합 친화성 및 IgG1의 반감기를 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 증가된 RcRn 결합과 개선된 반감기 사이에 항상 직접적인 관계가 있는 것은 아니다. 치료학적 항체의 효능을 증진시키기 위한 한가지 시도는 이의 혈청 지속성을 증가시킴으로써, 보다 높은 순환 수준, 덜 빈번한 투여 및 감소된 용량(dose)을 허용하는 것이다. Fc 영역의 가공은 항체의 효과기 기능을 감소시키거나 증가시키기 위해 요구될 수 있다. 세포-표면 분자, 특히 면역 세포의 분자를 표적화하는 항체의 경우, 폐기된 효과기 기능이 요구된다. 역으로, 종양학 용도로 의도된 항체의 경우, 증가된 효과기 기능은 치료학적 활성을 증진시킬 수 있다. 4개의 사람 IgG 동형은 활성화 Fcγ 수용체(FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa), 억제성 FcγRIIb 수용체, 및 상이한 친화성을 갖는 상보체의 제1 성분(C1q)에 결합하여 매우 상이한 효과기 기능을 생성한다. FcγRs 또는 C1q에 대한 IgG의 결합은 힌지 영역 및 CH2 도메인에 위치한 잔기에 의존한다. CH2 도메인의 2개의 영역은 FcγRs 및 C1q 결합에 중요하며, IgG2 및 IgG4내에 독특한 서열을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같은, "변형된 항체(modified antibody)"는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 분자에 상응하며, 여기서 상기 모노클로날 항체 또는 이의 기능적 단편은 기능적으로 상이한 분자와 회합된다. 본 발명의 변형된 항체는 융합 키메라 단백질 또는 공유 부착, 이식, 화학적 또는 생물학적 그룹 또는 PEG 중합체 또는 다른 보호 그룹과 같은 분자 또는 생체내에서 프로테아제 절단에 대한 보호, 항체 또는 기능성 단편의 안정성 및/또는 반감기의 개선에 적합한 분자와의 화학적 결합을 포함하는 어떠한 적합한 부착 형태로부터 생성되는 융합 키메라 단백질 또는 접합체일 수 있다. 유사한 기술을 사용하여, 특히 화학적 커플링 또는 이식(grafting)에 의해, 변형된 항체를 생물학적으로 활성인 분자를 사용하여 제조할 수 있으며, 이러한 활성 분자는 예를 들면, 독소, 특히 슈모모나스(Pseudomonas) 외독소 A, 식물 독소 리친(ricin)의 A-쇄 또는 사포린 독소, 특히 치료학적 활성 성분, 항체 또는 기능성 단편을 사람 신체의 특수한 세포 또는 조직에 대해 표적화하기에 적합한 벡터(특히 단백질 벡터 포함)이거나, 이는 특히 항체의 단편이 사용되는 경우, 표지 또는 링커과 회합될 수 있다. 항체 또는 이의 기능성 단편의 PEG화(PEGylation)는 특히 치료학적 적용을 위해, 숙주에 대한 활성 물질의 전달 조건을 개선시키므로 특히 흥미있는 구현예이다. PEG화는 항체 또는 기능성 단편의 인식 부위를 방해하는 것을 방지하는데 특이적인 부위일 수 있으며, 고 분자량 PEG로 수행될 수 있다. PEG화는 항체 또는 기능성 단편의 서열내에 존재하는 유리 시스테인 잔기를 통해 또는, 항체 또는 기능성 단편의 아미노산 서열내 첨가된 유리 시스테인 잔기에 의해 달성될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은, 변형된, 상기 정의된 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
본 발명의 거대분자(macromolecule)는 항체 및 이의 단편을 포함하지만 또한 항원-결합 항체 모사체로 명명된, 항체의 것을 모사하는 항원에 결합하는 능력을 지닌 인공 단백질, 펩타이드 및 어떠한 화학적 화합물을 포함한다. 이러한 단백질은 아피틴(affitin) 및 안티칼린(anticalin)을 포함한다. 아피틴은 항원에 선택적으로 결합하는 능력을 지닌 인공 단백질이다. 이들은 고세균 도메인(archaeal domain)에 속하는 미생물인 설폴로부스 악시도칼다리우스(Sulfolobus acidocaldarius)에서 발견된 DNA 결합 단백질 Sac7d로부터 구조적으로 기원한다. 예컨대, Sac7d의 결합 계면의 11번 잔기의 무작위 치환에 상응하는 변이체를 생성함으로써, Sac7d의 결합 표면에 있어서 아미노산을 무작위처리하면, 아피틴 라이브러리가 생성될 수 있으며 수득되는 단백질 라이브러리를 리보소옴 디스플레이 라운드(round)에 적용하면, 친화성은 펩타이드, 단백질, 바이러스 및 세균과 같은 다양한 표적을 향해 지시할 수 있다. 아피틴은 항체 모사체이며 생물공학에서 도구로 개발되고 있다. 이들은 또한 다양한 효소에 대한 구체적인 억제제로서 사용되어 왔다(Krehenbrink et al., J. mol. Biol., 383:5, 2008). 숙련가는 특히 특허원 제WO2008068637호 및 상술한 공보에 개시된 바와 같이, 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 필요한 결합 특성을 지닌 안티칼린, 특히 본원에 개시된 바와 같은 항원을 사용한 파아지 디스플레이 및/또는 리보소옴 디스플레이 라이브러리의 생성 및 이들의 스크리닝(screening)을 용이하게 개발할 수 있다. 안티칼린은 항원, 단백질 또는 소분자에 결합할 수 있는 인공 단백질이다. 이들은 천연 결합 단백질의 계열인 사람 리포칼린으로부터 기원한 항체 모사체이다. 안티칼린은 크기가 약 180개 아미노산이고 질량이 약 20 kDa로서 약 8배 더 작다(Skerra, Febs J., 275:11, 2008). 특히 특이적인 결합 특성을 지닌 안티칼린의 스크리닝 및 선택을 허용하는 안티칼린 파아지 디스플레이 라이브러리가 생성되었다. 기술자들은 당해 분야에 공지된 방법, 특히 유럽 특허 제EP1270725 B1호, 미국 특허 제US8536307 B2호(Schlehuber 및 Skerra, Biophys. Chem., 96:2-3, 2002) 및 상술한 공보에 개시된 바와 같은 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 필요한 결합 특성을 지닌 아피틴, 특히 본원에 개시된 항원을 사용하여 파아지 디스플레이 및/또는 리보소옴 디스플레이 라이브러리의 생성 및 이들의 스크리닝을 용이하게 개발할 수 있다. 안티칼린 및 아피틴은 둘 다 세균 발현 시스템을 포함하는 다수의 발현 시스템에서 생산될 수 있다. 따라서, 본 발명은 특히 모두 본 발명의 거대분자로서 고려되는, SIRPa에 대한 결합, SIRPa와 CD47 사이의 상호작용의 억제, SIRPg에 대한 비-결합(non-binding), T 세포에 대한 비 결합, T 세포의 증식의 비 억제, SIRPg와 CD47 사이의 상호작용의 비 억제와 관련하여, 본원에 기술된 항체의 특징을 지닌 아피틴, 안티칼린 및 다른 유사한 항체 모사체를 제공한다.
항체 또는 이의 단편에 대한 본원에 개시된 모든 구현예는 본 발명의 거대분자, 특히 항원-결합 항체 모사체(mimetics)에 대해 필요한 부분에 대해(mutatis mutandis ) 변경된다(transposed).
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "에피토프(epitope)"는 항체가 결합하는 항원의 부분을 의미한다. 단백질 항원의 에피토프는 2개의 범주인, 구조적 에피토프 및 선형 에피토프로 구분될 수 있다. 구조적 에피토프는 항원의 아미노산 서열의 불연속 절편에 상응한다. 선형 에피토프는 항원으로부터 아미노산의 연속 서열에 상응한다.
본 발명에서, SIRPa 내의 존재하고 항-SIRPa 항체에 의해 결합되는 펩타이드는 이들 항체에 의해 특이적으로 인식된 에피토프를 구성한다.
일 구현예에서, 본 발명은 SIRPa 내의 서열 번호: 1 (SLIPVGP), 서열 번호: 2 (G/ARELIYNQKEGH), 서열 번호: 3 (KFRKGSPD[DV]/[T]E), 서열 번호: 4 (QHTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), 서열 번호: 5 (ICEVAHVTLQG) 및 서열 번호: 6 (YPQRLQLTWLE)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진 적어도 2개, 3개, 4개 또는 5개의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 SIRPa 내의 아미노산 서열, 서열 번호: 3 (KFRKGSPD[DV]/[T]E)을 포함하거나 이로 이루어진 펩타이드에, 및 SIPRa내에서 서열 번호: 1 (SLIPVGP), 서열 번호: 2 (G/ARELIYNQKEGH), 서열 번호: 4 (QHTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), 서열 번호: 5 (ICEVAHVTLQG) 및 서열 번호: 6 (YPQRLQLTWLE)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 SIRPa 내의 아미노산 서열 서열 번호: 1 (SLIPVGP), 서열 번호: 2 (G/ARELIYNQKEGH), 서열 번호: 3 (KFRKGSPD[DV]/[T]E), 서열 번호: 4 (QHTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), 서열 번호: 5 (ICEVAHVTLQG) 및 서열 번호: 6 (YPQRLQLTWLE)을 포함하거나 이로 이루어진 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 SIRPa 내의 서열 번호: 1 (SLIPVGP), 서열 번호: 7 (GRELIYNQKEGH), 서열 번호: 8 (KFRKGSPDDVE), 서열 번호: 4 (QHTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), 서열 번호: 5 (ICEVAHVTLQG) 및 서열 번호: 6 (YPQRLQLTWLE)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 적어도 하나의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 SIRPa 내의 서열 번호: 1 (SLIPVGP), 서열 번호: 7 (GRELIYNQKEGH), 서열 번호: 8 (KFRKGSPDDVE), 서열 번호: 4 (QHTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), 서열 번호: 5 (ICEVAHVTLQG) 및 서열 번호: 6 (YPQRLQLTWLE)의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 서열 번호: 1 (SLIPVGP), 서열 번호: 9 (ARELIYNQKEGH), 서열 번호: 10 (KFRKGSPDTE), 서열 번호: 4 (QHTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), 서열 번호: 5 (ICEVAHVTLQG) 및 서열 번호: 6 (YPQRLQLTWLE)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 적어도 하나의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 SIRPa 내의 서열 번호: 1 (SLIPVGP), 서열 번호: 9 (ARELIYNQKEGH), 서열 번호: 10 (KFRKGSPDTE), 서열 번호: 4 (QHTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), 서열 번호: 5 (ICEVAHVTLQG) 및 서열 번호: 6 (YPQRLQLTWLE)의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 위에서 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 SIRPa 내의 서열 번호: 1 (SLIPVGP), 서열 번호: 11 (GRELIYN), DVE, 서열 번호: 12 (HTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), 서열 번호: 5 (ICEVAHVTLQG) 및 서열 번호: 6 (YPQRLQLTWLE)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 적어도 하나의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다
일 구현예에서, 본 발명은 SIRPa 내의 서열 번호: 1 (SLIPVGP), 서열 번호: 11 (GRELIYN), DVE, 서열 번호: 12 (HTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), 서열 번호: 5 (ICEVAHVTLQG) 및 서열 번호: 6 (YPQRLQLTWLE)의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 위에서 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 SIRPa 내의 서열 번호: 1 (SLIPVGP), 서열 번호: 13 (ARELIYN), 서열 번호: 12 (HTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), 서열 번호: 5 (ICEVAHVTLQG) 및 서열 번호: 6 (YPQRLQLTWLE)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 적어도 하나의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 SIRPa 내의 서열 번호: 1 (SLIPVGP), 서열 번호: 13 (ARELIYN), 서열 번호: 12 (HTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), 서열 번호: 5 (ICEVAHVTLQG) 및 서열 번호: 6 (YPQRLQLTWLE)의 펩타이드에 특이적으로 결합된 상기 정의된 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12 및 서열 번호: 13의 펩타이드는 선형 에피토프에 상응한다.
이들 선형 에피토프는 배열-기반 올리고펩타이드 스캐닝(때때로 오버랩핑(overlapping) 펩타이드 스캔 또는 펩스칸 분석(pepscan analysis)으로 불림)에 의해 본 발명자들에 의해 확인되었다. 이러한 기술은 표적 단백질의 오버랩핑 및 비-오버랩핑 분절로부터의 올리고-펩타이드 서열의 라이브러리를 사용하며 목적한 항체에 결합하는 이들의 능력에 대해 시험한다. 표적 단백질의 상이한 부분으로부터의 인접하지 않은 펩타이드 서열 및 강화된 배좌 강성률(conformational rigidity)을 이의 조합된 펩타이드에 조합함으로써(CLIPS 스캐폴드를 사용하는 것과 같이)(Timmerman et al., 2007, J Mol Recognit., Sep-Oct;20(5):283-99), 불연속 에피토프를 매우 높은 신뢰성 및 예측으로 맵핑(mapping)할 수 있다(Gaseitsiwe et al., 2010 - Clin Vaccine Immunol. Jan; 17(1): 168-175). HEFLB를 포함하는, 본 발명의 시험한 항체 모두는 상기 에피토프에 특이적으로 결합한다.
일 구현예에서, 본 발명은 SIRPa 내의 서열 번호: 70 (ELIYNQKEGHFPR), 서열 번호: 71 (RNNMDFSIRIGN) 및 서열 번호: 72 (SPRDITLKW)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 펩타이드를 포함하는 구조적 에피토프(conformational epitope)에 특이적으로 결합하는 위에서 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 SIRPa 내의 서열 번호: 70 (ELIYNQKEGHFPR), 서열 번호: 71 (RNNMDFSIRIGN) 및 서열 번호: 72 (SPRDITLKW)의 펩타이드를 포함하거나 이로 이루어진 구조적 에피토프에 특이적으로 결합하는 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 서열 번호: 70 (ELIYNQKEGHFPR) 및 서열 번호: 71 (RNNMDFSIRIGN)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 펩타이드를 포함하는 구조적 에피토프에 특이적으로 결합하는 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 SIRPa 내의 서열 번호: 70 (ELIYNQKEGHFPR) 및 서열 번호: 71 (RNNMDFSIRIGN)의 펩타이드를 포함하거나 이로 이루어진 구조적 에피토프에 특이적으로 결합하는 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 SIRPa 내의 서열 번호: 73 (YNQK) 및 "SIR"로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 펩타이드를 포함하는 구조적 에피토프에 특이적으로 결합하는 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체 펩타이드에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 SIRPa 내의 서열 번호: 73 (YNQK)에서 설정된 아미노산 서열의 펩타이드 및 SIR 아미노산 서열의 펩타이드를 포함하거나 이로 이루어진 구조적 에피토프에 특이적으로 결합하는 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
서열 번호: 70, 서열 번호: 71, 서열 번호: 72, 서열 번호: 73 및 SIRP의 펩타이드는 구조적 에피토프에 상응한다. 이들 구조적 에피토프는 단백질 분해 보호 과정(효소 분해: 키모트립신, 친화성 크로마토그래피에 고정된 항체-항원 복합체의 트립신)에 이은 질량 분광법 분석(MALDI-TOF/TOF)에 의해 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지된 바와 같이, 목적한 이러한 펩타이드의 서열을 검출하기 위해 본 발명자들에 의해 측정되었다(Van de Water et al., Clinical Immunology 및 Immunopathology, 1997, vol. 85). 사용된 항원은 사람 SIRPa(수탁 번호 제NP_542970호)이었으며 사용된 본 발명의 항체중 하나는 HEFLB 변이체(varient)였다.
본 발명에 따른 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체는 천연의 SIRPa 내의서 구조적 정렬 내 상기 펩타이드를 포함하거나 이로 이루어진 구조적 에피토프에 특이적으로 결합한다.
서열 번호: 73 (YNQK)에서 설정된 아미노산 서열의 펩타이드는 수탁 번호 제NP_542970호로 지칭된 사람 SIRPa 아미노산 서열에서 80 내지 83번 위치의 아미노산으로 이루어진 펩타이드에 상응한다.
SIR 아미노산 서열의 펩타이드, SIR 펩타이드는 수탁 번호 제NP_542970호로 지칭된 사람 SIRPa 아미노산 서열 내 105 내지 107번 위치에서의 아미노산으로 이루어진 펩타이드에 상응한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "SIRPa"는 포유동물 종, 바람직하게는 사람 SIRPa(예컨대, 수탁번호 제NP_542970호(P78324) 및 CAA71403)으로부터의 SIRPa 단백질을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "항-SIRPa 항체"는 SIRPa, 특히 사람 SIRPa에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 에피토프(또는 에피토프를 포함하는 영역) 사이의 특이적인 결합은 특수한 단백질 또는 항원(여기서 SIRPa)에서 에피토프에 대해 인식가능한 친화성을 나타냄을 내포한다. "인식가능한 친화성"은 친화성이 약 10-9 M (KD) 이상 강한 결합을 포함한다. 바람직하게는, 결합은 결합 친화성이 10-9 M 내지 10-12 M, 임의로 10-9 M 내지 10-10 M, 특히 10-10 M인 경우 특이적인 것으로 고려된다. 결합 도메인이 표적과 특이적으로 반응하는지의 여부 또는 이에 결합되는지의 여부는 특히 상기 결합 도메인과 표적 단백질 또는 항원의 반응을 상기 결합 도메인과 표적 단백질 이외의 단백질 또는 항원의 반응을 비교함으로서 용이하게 시험할 수 있다.
친화성은 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지된 다양한 방법으로 측정할 수 있다. 이들 방법은 비아코어 분석(Biacore Analysis), 블리츠 분석(Blitz analysis) 및 스캐챠드 플롯(Scatchard plot)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일 구현예에서, 본 발명은 특히 비아코어 분석에 의해 KD 값이 10-9 M 이하, 바람직하게는 SIRPa에 대해 10-10 M 이하, 보다 바람직하게는 1.10-11 M 이하인 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 SIRPa와 CD47 사이의 상호작용을 감소시키는 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 SIRPa에 대한 CD47의 결합, 특히 사람 SIRPa에 대한 사람 CD47의 결합을 부분적으로 또는 완전히, 특히 완전히 억제하는 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
본 발명의 이러한 항체는 SIRPa에 특이적으로 결합하여 SIRPa와 CD47 사이의 상호작용을 길항한다.
특히, 본 발명의 항-SIRPa 길항제 항체는 결합 검정에서 음성 대조군 분자와 비교하는 경우, SIRPa에 대한 CD47의 결합을 적어도 50%, 60%, 70%, 바람직하게는 80%, 보다 바람직하게는 90% 또는 가장 바람직하게는 100% 감소시키거나 억제할 수 있다.
특히, 본 발명의 항-SIRPa 길항제 항체는 결합 검정에서 음성 대조군 분자와 비교하는 경우, SIRPa에 대한 CD47의 결합을 50% 내지 100%, 바람직하게는 60% 내지 90%, 보다 바람직하게는 70% 내지 80% 감소시키거나 억제할 수 있다.
경쟁적 억제에 의해 항체 특이성 및 친화성을 측정하는 방법은 당해 분야(참고: 예컨대, Harlow et al., Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1998 ); Colligan et al., Current Protocols in Immunology, Green Publishing Assoc., NY (1992; 1993 ); Muller, Meth. Enzym., 92:589-601 (1983))에 공지되고 하기 실시예에 기술되어 있다.
이들 방법은 비아코어 분석, 블리츠 분석, 유동 세포분석법 및 ELISA 검정을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일 구현예에서, 본 발명은 ELISA에 의한 CD47과 항-SIRPa 항체 사이의 경쟁적 SIRPa 결합 검정에서 측정하는 경우, IC50이 500 ng/ml 미만, 특히 400 ng/ml 미만, 300 ng/ml, 보다 특히 200 ng/ml 미만인 위에서 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 CD47과 항-SIRPa 항체 사이의 사람 단핵세포에서 경쟁적 세포계산 검정에 의해 측정하는 경우, IC50이 500 ng/ml 미만, 특히 400 ng/ml 미만, 300 ng/ml, 보다 특히 200 ng/ml 미만, 150 ng/ml 미만 및 심지어 특히 100 ng/ml 미만인 위에서 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 SIRPg, 바람직하게는 사람 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않는 위에서 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
본 발명의 이러한 항체는 SIRPg와 CD47 사이의 상호작용에 영향을 미치지 않거나 방지하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "SIRPg"는 포유동물 종, 바람직하게는 사람 SIRPg로부터 시그날 조절 단백질 감마(또한 SIRP 감마, CD172g 또는 SIRP 베타 2로 지칭됨)에 관한 것이다.
본 출원의 실시예에 사용된 사람 SIRPg 단백질의 참고 서열은 수탁 번호 제Q9P1W8호와 관련된 서열에 상응한다.
일 구현예에서, 본 발명은 특히 블리츠 분석에 의해 SIRPg에 대해 KD 값이 10-9 M 초과, 바람직하게는 10-8 M 초과, 보다 바람직하게는 10-7 M 초과인 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 SIRP-g에 대한 CD47의 결합의 억제를 유의적으로 억제하거나 길항하지 않고, SIRPg에 대한 CD47의 결합과 유의적으로 경쟁하지 않는 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
이러한 길항 효과는 본 출원의 실시예에 정의된 바와 같은 방법을 사용하여 측정할 수 있다.
본 발명에서, 항체(또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체)는 상기 항체(또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체)가 블리츠에 의한 SIRPg 결합 경쟁 검정에서 CD47의 KD 값의 1 log 미만의 증가를 유도하지 않거나 유도하는 경우 SIRPg에 대한 CD47의 결합을 길항하지 않는다.
일 구현예에서, 본 발명은 T-세포, 특히 CD3+ T-세포에 특이적으로 결합하지 않는 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
특히, 본 발명의 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체는 포유동물 종으로부터의 T-세포, 특히 사람 T-세포에 결합하지 않는다.
특히, 항-SIRPa 항체(또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체)는 건강한 공여자로부터의 PBMC로부터 분리된 사람 T 세포의 집단에서, 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만, 보다 바람직하게는 2% 미만, 가장 바람직하게는 1% 미만의 사람 T 세포 집단이 상기 항-SIRPa 항체(또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체)에 의해 인지되는 경우, 사람 T 세포에 특이적으로 결합하지 않는 것으로 고려된다.
이러한 효과는 본 출원의 실시예에 기술된 바와 같은 방법에 의해 측정될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 바람직하게는 포유동물 종 및 보다 바람직하게는 사람 T 세포로부터의 T-세포, 특히 CD3+ T-세포의 증식을 유의적으로 억제하지 않는 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
특히, 항-SIRPa 항체는 음성 대조군과 비교하여 T-세포의 집단이 30% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 보다 바람직하게는 10% 미만, 가장 바람직하게는 5% 미만까지 감소되는 경우 T-세포의 증식을 유의적으로 억제하지 않는다.
T-세포의 증식은 다양한 방법으로 측정할 수 있다. 예를 들면, T-세포의 증식은 본 출원의 실시예에 기술된 바와 같이 H3-티미딘의 혼입으로 측정할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 SIRPa에 대한 계면활성제 단백질의 결합과 유의적으로 결합하지 않는, SIRP-a에 대한 계면활성제 단백질의 결합을 유의적으로 억제하거나, 길항하는 위에서 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, "계면활성제 단백질"은 계면활성제 항상성 및 폐 면역성에 유의적으로 기여하는 콜라겐-함유 C-형(칼슘 의존성) 렉틴이다(고찰을 위한 참고: Kishore et al., Surfactant proteins SP-A and SP-D: structure, function 및 receptors, Mol Immunol, 43(9), 1293-315, 2006).
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "계면활성제 단백질"은 포유동물 종, 바람직하게는 사람 계면활성제 단백질로부터의 계면활성제 단백질을 지칭한다.
일 구현예에서, 본 발명은 SIRPa에 대한 사람 계면활성제 단백질 D (SP-D)의 결합을 억제하지 않는 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 SIRPa에 대한 사람 계면활성제 단백질 A (SP-A)의 결합을 억제하지 않는 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 계면활성제 단백질과 SIRPa 사이의 상호작용을 길항하지 않는 위에서 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
SIRPa와 계면활성제 단백질 사이의 경쟁은 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지된 방법을 사용하여 경쟁적 검정으로 측정할 수 있다. 이들 방법은 비아코어 분석, 블리츠 분석 및 ELISA 검정을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서, 항체(또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체)는 상기 항체(또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체)가 블리츠에 의한 SIRPa 결합 경쟁 검정에서 계면활성제 단백질의 KD 값의 1 log 미만을 증가시키지 않거나, 증가를 유도하지 않는 경우 SIRPa에 대한 계면활성제 단백질의 결합을 길항하지 않는다.
일 구현예에서, 본 발명은 SIRPb에 약하게 결합하거나, 특이적으로 결합하지 않는 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "SIRPb"는 포유동물 종, 바람직하게는 사람 SIRPb로부터의 SIRPb 단백질(또한 SIRPb, 시그날-조절 단백질 베타-1, SIRP-베타-1, CD172 항원-유사 계열 구성원 B 또는 CD172b), 바람직하게는 사람 SIRPb를 지칭한다.
본 출원의 실시예에 사용된, 사람 SIRPb 단백질의 참고 서열은 수탁 번호 제Q5TFQ8-1호와 관련된 서열에 상응한다.
일 구현예에서, 본 발명은 특히 블리츠 분석에 의해 SIRPb에 대한 KD 값이 10-9 M 초과, 바람직하게는 10-8 M 초과인 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다:
a) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄, 및/또는
b) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄,
여기서 상기 CDR은 다음과 같이 정의된다:
- 서열 번호: 14 (SYWVH)에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 HCDR1,
- 서열 번호: 15 (NIDPSDSDTHYNQKFKD) 또는 서열 번호: 16 (NIDPSDSDTHYSPSFQG)에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 HCDR2,
- 서열 번호: 17 (GGTGTMAWFAY) 서열 번호: 18 (GGTGTLAWFAY), 서열 번호: 19 (GGTGTMAYFAY) 또는 서열 번호: 20 (GGTGTLAYFAY)에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 HCDR3,
- 서열 번호: 21 (RSSQSLVHSYGNTYLY)에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 LCDR1,
- 서열 번호: 22 (RVSNRFS)에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 LCDR2, 및
- 서열 번호: 23 (FQGTHVPYT)에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 LCDR3.
18D5 / 변이체 A / 변이체 B
일 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다:
a) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄, 및/또는
b) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄,
여기서 상기 CDR은 다음과 같이 정의된다:
- 서열 번호: 14 (SYWVH)에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 HCDR1,
- 서열 번호: 15 (NIDPSDSDTHYNQKFKD)에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 HCDR2,
- 서열 번호: 17 (GGTGTMAWFAY)에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 HCDR3,
- 서열 번호: 21 (RSSQSLVHSYGNTYLY)에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 LCDR1,
- 서열 번호: 22 (RVSNRFS)에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 LCDR2, 및
- 서열 번호: 23 (FQGTHVPYT)에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 LCDR3.
변이체 C(variant C)
일 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다:
a) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄, 및/또는
b) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄,
여기서 상기 CDR은 다음과 같이 정의된다:
- 서열 번호: 14 (SYWVH)에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 HCDR1,
- 서열 번호: 16 (NIDPSDSDTHYSPSFQG)에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 HCDR2,
- 서열 번호: 17 (GGTGTMAWFAY)에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 HCDR3,
- 서열 번호: 21 (RSSQSLVHSYGNTYLY)에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 LCDR1,
- 서열 번호: 22 (RVSNRFS)에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 LCDR2, 및
- 서열 번호: 23 (FQGTHVPYT)에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 LCDR3.
변이체 E
일 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다:
a) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄, 및/또는
b) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄,
여기서 상기 CDR은 다음과 같이 정의된다:
- 서열 번호: 14 (SYWVH)에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 HCDR1,
- 서열 번호: 16 (NIDPSDSDTHYSPSFQG)에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 HCDR2,
- 서열 번호: 18 (GGTGTLAWFAY)에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 HCDR3,
- 서열 번호: 21 (RSSQSLVHSYGNTYLY)에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 LCDR1,
- 서열 번호: 22 (RVSNRFS)에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 LCDR2, 및
- 서열 번호: 23 (FQGTHVPYT)에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 LCDR3.
변이체 F
일 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다:
a) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄, 및/또는
b) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄,
여기서 상기 CDR은 하기 정의한 바와 같다:
- 서열 번호: 14 (SYWVH)에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 HCDR1,
- 서열 번호: 16 (NIDPSDSDTHYSPSFQG)에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 HCDR2,
- 서열 번호: 19 (GGTGTMAYFAY)에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 HCDR3,
- 서열 번호: 21 (RSSQSLVHSYGNTYLY)에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 LCDR1,
- 서열 번호: 22 (RVSNRFS)에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 LCDR2, 및
- 서열 번호: 23 (FQGTHVPYT)에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 LCDR3.
변이체 EF
일 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다:
a) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄, 및/또는
b) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄,
여기서 상기 CDR은 하기 정의한 바와 같다:
- 서열 번호: 14 (SYWVH)에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 HCDR1,
- 서열 번호: 16 (NIDPSDSDTHYSPSFQG)에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 HCDR2,
- 서열 번호: 20 (GGTGTLAYFAY)에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 HCDR3,
- 서열 번호: 21 (RSSQSLVHSYGNTYLY)에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 LCDR1,
- 서열 번호: 22 (RVSNRFS)에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 LCDR2, 및
- 서열 번호: 23 (FQGTHVPYT)에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 LCDR3.
본 발명의 항-SIRPa 항체는 본원에 제공된 바와 같은 사람 항체의 HCDR1 및/또는 HCDR2 및/또는 HCDR3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 본원에 제공된 바와 같은 사람 항체의 LCDR1 및/또는 LCDR2 및/또는 LCDR3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 가질 수 있다.
일 구현예에서, 항체는 제공된 사람 항체의 하나 이상의 CDR의 아미노산 서열 변이체를 포함하고, 상기 변이체는 CDR 잔기 내에 또는 이에 인접한 하나 이상의 아미노산 삽입물(들) 및/또는 CDR 잔기(들)의 CDR 잔기의 치환(들)(치환(들)은 이러한 변이체를 생성하기 위한 아미노산 변경의 바람직한 유형이다)을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다:
- 서열 번호: 24, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26, 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29 및 서열 번호: 30으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인, 및/또는
- 서열 번호: 31, 서열 번호: 32 및 서열 번호: 33으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인.
일 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다:
- 서열 번호: 24, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26, 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29 및 서열 번호: 30으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인, 및
- 서열 번호: 31, 서열 번호: 32 및 서열 번호: 33으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인.
구체적인 가변 도메인의 서열은 하기 표 1에 제공된다.
Figure 112018113083852-pct00001
표 1. 본 발명에 따른 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인의 예
본 발명에 예시된 항체의 가변 도메인의 서열은 표 2에 나타낸 서열의 조합으로부터 유추될 수 있다.
Figure 112018113083852-pct00002
표 2. 본 발명에 따른 구체적인 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인
일 구현예에서, 본 발명은 아미노산 서열 서열 번호: 33을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함하는 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다:
- 아미노산 서열 서열 번호: 33을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인, 및
- 서열 번호: 24, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26, 서열 번호:27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29 및 서열 번호: 30으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인,
바람직하게는
- 서열 번호: 29 및 서열 번호: 30으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인,
보다 바람직하게는
- 서열 번호: 30으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인.
일 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다:
- 서열 번호: 24에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인, 및
- 서열 번호: 31에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인,
또는
- 서열 번호: 25에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인, 및
- 서열 번호: 32에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인,
또는
- 서열 번호: 25에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인, 및
- 서열 번호: 33에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인,
또는
- 서열 번호: 26에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인, 및
- 서열 번호: 32에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인,
또는
- 서열 번호: 26에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인, 및
- 서열 번호: 33에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인,
또는
- 서열 번호: 27에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인, 및
- 서열 번호: 32에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인,
또는
- 서열 번호: 27에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인, 및
- 서열 번호: 33에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인,
또는
- 서열 번호: 28에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인, 및
- 서열 번호: 32에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인,
또는
- 서열 번호: 28에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인, 및
- 서열 번호: 33에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인,
또는
- 서열 번호: 29에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인, 및
- 서열 번호: 32에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인,
또는
- 서열 번호: 29에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인, 및
- 서열 번호: 33에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인,
또는
- 서열 번호: 30에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인, 및
- 서열 번호: 32에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인,
또는
- 서열 번호: 30에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인, 및
- 서열 번호: 33에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인.
일 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체는 중쇄 가변 도메인내 33번 위치에서 아미노산 W(W33)의 치환을 가지지 않으며, 상기 위치는 서열 번호: 24, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26, 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29 또는 서열 번호: 30과 관련하여 확인되고/되거나, 경쇄 가변 도메인내 39번 위치에서 아미노산 Y(Y39) 55번 위치에서 R(R55) 및/또는 60번 위치에서 F(F60)의 치환이 없고, 상기 위치는 서열 번호: 31, 서열 번호: 32 또는 서열 번호: 33과 관련하여 확인되며, 특히 중쇄 가변 도메인내 W33 위치에서 치환이 없고 경쇄 가변 도메인내 Y39, R55 및 F60 위치에서 치환이 없다.
본 발명에서, 항체는 어떠한 중쇄 및 경쇄 도메인으로도 생산될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 항-사람 SIRPa 항체는 사람화된 모노클로날 항체이고, 특히 여기서 항체 경쇄 불변 도메인은 사람 카파 경쇄 불변 도메인으로부터 기원하고, 보다 특히 여기서 경쇄 불변 도메인은 서열 번호: 35의 서열로 이루어져 있으며, 여기서 항체 중쇄 불변 도메인은 사람 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4(야생형 또는 돌연변이된) 중쇄 불변 도메인으로부터, 특히 사람 IgG4 중쇄 불변 도메인으로부터 기원하며, 보다 특히 여기서 항체 중쇄 불변 도메인은 서열 번호: 34로 이루어진다.
당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있는 바와 같이, 중쇄 불변 도메인의 IgG 동형(isotype)의 선택은 특이적인 기능이 요구되는지의 여부 및 적합한 생체내 반감기에 대한 필요성을 중점으로 한다. 예를 들면, 암세포의 선택적인 근절을 위해 설계된 항체는 전형적으로 항체-의존성 세포-매개된 세포독성에 의한 경쟁적 활성화 및 효과기-매개된 세포 사멸을 허용하는 활성 동형을 필요로 한다. 사람 IgG1 및 IgG3(보다 짧은 반감기) 동형, 특히 사람 IgG1 동형(야생형 및 변이체)은 이러한 범주를 충족한다. 특히, 중쇄 불변 도메인의 IgG 동형(특히 사람 야생형 및 변이체 IgG1 동형)에 따라서, 본 발명의 항-사람 SIRPa 항체는 CDC, ADCC 및/또는 ADCP 메카니즘을 통해 SIRPa를 발현하는 세포에 대해 세포독성일 수 있다(Salfeld, nature biotechnology, vol. 25, N°12, 2007; Irani et al. Molecular Immunology, vol. 67, issue 2, part A, 2015). 실제로, 단편 결정화가능한(Fc) 영역은 다양한 보조 분자와 상호작용하여 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC), 항체-의존성 세포 식세포작용(ADCP) 및 상보체-의존성 세포독성(CDC)과 같은 간접적인 효과기 기능을 매개한다.
Figure 112018113083852-pct00003
표 3. 본 발명에 따른 항체에 적합한 중쇄 불변 도메인 및 경쇄 불변 도메인의 예
일 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체에 관한 것이다:
- 아미노산 서열 서열 번호: 56을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄,
- 아미노산 서열 서열 번호: 57를 포함하거나 이로 이루어진 경쇄,
또는
- 아미노산 서열 서열 번호: 36을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄,
- 아미노산 서열 서열 번호: 43을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄,
또는
- 아미노산 서열 서열 번호: 37을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄,
- 아미노산 서열 서열 번호: 44를 포함하거나 이로 이루어진 경쇄,
또는
- 아미노산 서열 서열 번호: 37을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄,
- 아미노산 서열 서열 번호: 45를 포함하거나 이로 이루어진 경쇄,
또는
- 아미노산 서열 서열 번호: 38을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄,
- 아미노산 서열 서열 번호: 44를 포함하거나 이로 이루어진 경쇄,
또는
- 아미노산 서열 서열 번호: 38을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄,
- 아미노산 서열 서열 번호: 45를 포함하거나 이로 이루어진 경쇄,
또는
- 아미노산 서열 서열 번호: 39를 포함하거나 이로 이루어진 중쇄,
- 아미노산 서열 서열 번호: 44를 포함하거나 이로 이루어진 경쇄,
또는
- 아미노산 서열 서열 번호: 39를 포함하거나 이로 이루어진 중쇄,
- 아미노산 서열 서열 번호: 45를 포함하거나 이로 이루어진 경쇄,
또는
- 아미노산 서열 서열 번호: 40을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄,
- 아미노산 서열 서열 번호: 44를 포함하거나 이로 이루어진 경쇄,
또는
- 아미노산 서열 서열 번호: 40을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄,
- 아미노산 서열 서열 번호: 45를 포함하거나 이로 이루어진 경쇄,
또는
- 아미노산 서열 서열 번호: 41을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄,
- 아미노산 서열 서열 번호: 44를 포함하거나 이로 이루어진 경쇄,
또는
- 아미노산 서열 서열 번호: 41을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄,
- 아미노산 서열 서열 번호: 45를 포함하거나 이로 이루어진 경쇄,
또는
- 아미노산 서열 서열 번호: 42를 포함하거나 이로 이루어진 중쇄,
- 아미노산 서열 서열 번호: 44를 포함하거나 이로 이루어진 경쇄,
또는
- 아미노산 서열 서열 번호: 42를 포함하거나 이로 이루어진 중쇄,
- 아미노산 서열 서열 번호: 45를 포함하거나 이로 이루어진 경쇄.
Figure 112018113083852-pct00004
Figure 112018113083852-pct00005
Figure 112018113083852-pct00006
표 4. 본 발명에 따른 특이적인 항체의 중쇄 및 경쇄 서열
일 구현예에서, 본 발명은 비억제 세포내로 단핵세포성 골수종-기원한 억제 세포(Mo-MDSC)의 분화를 유도할 수 있는 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 위에서 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이며, 여기서 상기 비 억제 세포는 IL6, IL12 및 TNF와 같은 전-염증성 사이토킨을 분비하고, IL10 및 TGFβ와 같은 항-염증성 사이토킨을 분비하지 않거나 저 수준으로 분비한다
일 구현예에서, 본 발명은 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이며, 여기서 상기 비 억제 세포는 iNOS를 발현한다.
일 구현예에서, 본 발명은 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이며, 여기서 상기 비 억제 세포는 MHC 제II 부류 마커를 발현하지 않고 마커 CD80-CD86을 발현한다.
일 구현예에서, 본 발명은 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이며, 여기서 상기 비 억제 세포는 천연 킬러(NK) 세포의 적어도 하나의 마커를 발현한다.
일 구현예에서, 본 발명은 위에서 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이며, 여기서 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 대식구의 M2 편향(polarization)을 억제할 수 있고/있거나 전-염증성 M1-유형 대식구를 선호한다.
본 발명의 항체는 전-염증성 환경을 유도하기 위하여 대식구 편향을 변경시킬 수 있는데, 즉, 이들은 M2-유형 대식구에 의해 제공된 항-염증성 시그날을 억제할 수 있고/있거나 M1-유형 대식구에 의해 제공된 전-염증성 시그날을 선호한다. 이러한 시도는 염증성 환경을 특히 암 세포를 제거하는데 있어서 T 효과기 세포의 작용에 대해 재확립시킨다.
SIRPa 항체
상기 정의된 바와 같은 항체에 대해 인용된 구현예는 본 발명의 다른 국면에서 인용된 항체에 대해 약간 수정하여 반복된다.
다른 국면에서, 본 발명은 SIRPa 내에서 서열 번호: 70 (ELIYNQKEGHFPR), 서열 번호: 71 (RNNMDFSIRIGN) 및 서열 번호: 72 (SPRDITLKW)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 펩타이드를 포함하는 구조적 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
다른 국면에서, 본 발명은 SIRPa 내에서 서열 번호: 70 (ELIYNQKEGHFPR), 서열 번호: 71 (RNNMDFSIRIGN) 및 서열 번호: 72 (SPRDITLKW)의 펩타이드를 포함하거나 이로 이루어진 구조적 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
다른 국면에서, 본 발명은 서열 번호: 70 (ELIYNQKEGHFPR) 및 서열 번호: 71 (RNNMDFSIRIGN)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 펩타이드를 포함하는 구조적 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
다른 국면에서, 본 발명은 SIRPa 내의 서열 번호: 70 (ELIYNQKEGHFPR) 및 서열 번호: 71 (RNNMDFSIRIGN)의 펩타이드를 포함하거나 이로 이루어진 구조적 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
다른 국면에서, 본 발명은 서열 번호: 73 (YNQK) 및 SIR로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 펩타이드를 포함하는 구조적 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
다른 국면에서, 본 발명은 SIRPa 내의 서열 번호: 73 (YNQK) 및 SIR의 펩타이드를 포함하거나 이로 이루어진 구조적 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
다른 국면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다:
a) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄, 및/또는
b) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄,
여기서 상기 CDR은 다음과 같이 정의된다:
- 아미노산 서열 서열 번호: 14 (SYWVH)의 펩타이드를 포함하거나 이로 이루어진 HCDR1,
- 아미노산 서열 서열 번호: 15 (NIDPSDSDTHYNQKFKD) 또는 서열 번호: 16 (NIDPSDSDTHYSPSFQG)의 펩타이드를 포함하거나 이로 이루어진 HCDR2,
- 아미노산 서열 서열 번호: 17 (GGTGTMAWFAY), 서열 번호: 18 (GGTGTLAWFAY), 서열 번호: 19 (GGTGTMAYFAY) 또는 서열 번호: 20 (GGTGTLAYFAY)의 펩타이드를 포함하거나 이로 이루어진 HCDR3,
- 아미노산 서열 서열 번호: 21 (RSSQSLVHSYGNTYLY)의 펩타이드를 포함하거나 이로 이루어진 LCDR1,
- 아미노산 서열 서열 번호: 22 (RVSNRFS)의 펩타이드를 포함하거나 이로 이루어진 LCDR2, 및
- 아미노산 서열 서열 번호: 23 (FQGTHVPYT)의 펩타이드를 포함하거나 이로 이루어진 LCDR3.
본 발명은 또한 SIRPa에 대한 CD47의 결합을 억제하고 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 T-세포에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 T-세포의 증식을 억제하지 않고/않거나 SIRPg에 대한 CD47의 결합을 억제하지 않고, 특히 SIRPa에 대한 CD47의 결합을 억제하며 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않고 T-세포에 특이적으로 결합하지 않으며 T-세포의 증식을 억제하지 않고 SIRPg에 대한 CD47의 결합을 억제하지 않는 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
응용
다른 국면에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한:
- 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체, 또는
- SIRPa에 대한 CD47의 결합을 억제하고 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 T 세포에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 T 세포의 증식을 억제하지 않고/않거나 SIRPg에 대한 CD47의 결합을 억제하지 않고,
특히 SIRPa에 대한 CD47의 결합을 억제하고 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않으며 T 세포에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 T 세포의 증식을 억제하지 않고/않거나 SIRPg에 대한 CD47의 결합을 억제하지 않는 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
본 발명은 유효량의:
- 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체, 또는
- SIRPa에 대한 CD47의 결합을 억제하고 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 T 세포에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 T 세포의 증식을 억제하지 않고/않거나 SIRPg에 대한 CD47의 결합을 억제하지 않는,
특히, SIRPa에 대한 CD47의 결합을 억제하고 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않으며 T 세포에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 및 T 세포의 증식을 억제하지 않고/않거나 및 SIRPg에 대한 CD47의 결합을 억제하지 않는 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하는 상기 대상체에서의 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 의약의 제조시:
- 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체, 또는
- SIRPa에 대한 CD47의 결합을 억제하고 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않으며 T 세포에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 T 세포의 증식을 억제하지 않고/않거나 SIRPg에 대한 CD47의 결합을 억제하지 않는,
특히, SIRPa에 대한 CD47의 결합을 억제하고 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않으며 T 세포에 특이적으로 결합하지 않고 T 세포의 증식을 억제하지 않고 SIRPg에 대한 CD47의 결합을 억제하지 않는 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체의 용도에 관한 것이다.
다른 국면에서, 본 발명은 단핵세포 골수-기원한 억제 세포(Mo-MDSC)를 비 억제 세포로 분화시킴으로써 개선되거나 예방되기 쉬운 임의의 상태의 치료시 사용하기 위한:
- 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체, 또는
- SIRPa에 대한 CD47의 결합을 억제하고 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 T 세포에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 T 세포의 증식을 억제하지 않고/않거나 SIRPg에 대한 CD47의 결합을 억제하지 않는,
특히, SIRPa에 대한 CD47의 결합을 억제하고 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않으며 T 세포에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 및 T 세포의 증식을 억제하지 않고/않거나 SIRPg에 대한 CD47의 결합을 억제하지 않는 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
본원에 정의한 바와 같은, "비 억제 세포내로 단핵세포 골수-기원한 억제 세포(Mo-MDSC)를 분화시킴으로써 개선되거나 예방하기 쉬운 상태"는 염증성 암 및 침윤된 골수 세포(특히 침윤된 MDSC 및/또는 TAM 세포)를 지닌 암, 감염성 질환, 외상, 자가-면역 질환(예를 들면, 류마티스 관절염, 제1형 당뇨병, 루푸스, 건선), 백신화, 만성 염증성 질환(예를 들면, 크론병(Crohn disease) 및 궤양성 결장염을 포함하는 염증성 창자병), 패혈성 쇼크, 만성 감염성 질환(예를 들면, 슈도모나스 또는 CMV), 섬유증, 죽상경화증 또는 이식 기능장애를 포함하는 암에 상응한다.
본 발명은 또한 유효량의:
- 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체, 또는
- SIRPa에 대한 CD47의 결합을 억제하고 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 T 세포에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 T 세포의 증식을 억제하지 않고/않거나 SIRPg에 대한 CD47의 결합을 억제하지 않는,
특히, SIRPa에 대한 CD47의 결합을 억제하고 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않으며 T 세포에 특이적으로 결합하지 않고 T 세포의 증식을 억제하지 않고 SIRPg에 대한 CD47의 결합을 억제하지 않는 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체를 이를 필요로 하는 대상체에서 단핵세포 골수-기원한 억제 세포 (Mo-MDSC)를 이를 필요로 하는 비 억제 세포로 분화시킴으로써 개선되거나 예방되기 쉬운 임의의 상태의 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 단핵세포 골수-기원한 억제 세포 (Mo-MDSC)를 비 억제 세포로 분화시킴에 의해 개선되거나 예방되기 쉬운 어떠한 조건의 치료를 위한 의약의 제조시의,
- 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체, 또는
- SIRPa에 대한 CD47의 결합을 억제하고 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 T 세포에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 T 세포의 증식을 억제하지 않고/않거나 SIRPg에 대한 CD47의 결합을 억제하지 않는,
특히, SIRPa에 대한 CD47의 결합을 억제하고 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않으며 T 세포에 특이적으로 결합하지 않고 T 세포의 증식을 억제하지 않고/않거나 및 SIRPg에 대한 CD47의 결합을 억제하지 않는 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체의 용도에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 대식구 편향(macrophage polarization)을 전-염증성 대식구로 변형시킴으로써 개선하거나 예방하기 쉬운 임의의 상태의 치료시 사용하기 위한,
- 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체, 또는
- SIRPa에 대한 CD47의 결합을 억제하고 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 T 세포에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 T 세포의 증식을 억제하지 않고/않거나 SIRPg에 대한 CD47의 결합을 억제하지 않는,
특히, SIRPa에 대한 CD47의 결합을 억제하고 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않으며 T 세포에 특이적으로 결합하지 않고 T 세포의 증식을 억제하지 않고/않거나 및 SIRPg에 대한 CD47의 결합을 억제하지 않는 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
실제로, SIRPa는 체크포인트 억제제(checkpoint inhibitor)로 작용하며 대식구 편향에 관여한다. 특히, 대식구의 전-염증성 프로파일은 제2형 대식구(M2형 높은 대식구 활성 = M(IL4))의 소비로 수득되므로, SIRPa의 차단은 제1형 대식구(M1 전-염증성 = M (IFNg))와 관련된 대식구의 전-염증성 기능을 유도하며 종양에서 대식구의 억제 활성을 억제한다. 따라서, SIRPa의 길항제는 대식구의 M2 표현형 편향을 억제할 수 있고/있거나 전-염증성 M1-유형 대식구 기능을 선호하여 치료제에서 사용될 수 있다.
본원에 정의된 바와 같은, "대식구 편향을 변형시켜서 전-염증성 대식구를 선호하도록 함으로써 개선하거나 예방하기 쉬운 상태"는 예를 들면, 고형 암, 액체 암, 감염성 질환, 외상, 자가-면역 질환, 백신화, 뇌 손상, 신경 손상, 적혈구 증가증, 혈색소침착증 또는 만성 염증성 질환에 상응한다.
본 발명은 또한 유효량의: - 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체, 또는
- SIRPa에 대한 CD47의 결합을 억제하고 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 T 세포에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 T 세포의 증식을 억제하지 않고/않거나 SIRPg에 대한 CD47의 결합을 억제하지 않는,
특히, SIRPa에 대한 CD47의 결합을 억제하고 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않으며 T 세포에 특이적으로 결합하지 않고 T 세포의 증식을 억제하지 않고 SIRPg에 대한 CD47의 결합을 억제하지 않는 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하여 상기 대상체에서 전-염증성 대식구로의 대식구 편향을 변형시킴에 의해 개선하거나 예방하기 쉬운 임의의 상태의 치료 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 또한 전-염증성 대식구로의 대식구 편향을 변형시킴으로써 개선하거나 예방하기 쉬운 임의의 상태의 치료용 의약의 제조시의,
- 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체, 또는
- SIRPa에 대한 CD47의 결합을 억제하고 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 T 세포에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 T 세포의 증식을 억제하지 않고/않거나 SIRPg에 대한 CD47의 결합을 억제하지 않는,
특히, SIRPa에 대한 CD47의 결합을 억제하고 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않으며 T 세포에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 및 T 세포의 증식을 억제하지 않고 SIRPg에 대한 CD47의 결합을 억제하지 않는 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체의 용도에 관한 것이다.
대식구의 편향을 변형시켜 전-염증성 세포를 선호하도록 하는 것은 다수의 병리학 또는 상황에서 유용할 수 있다. 상기 기술한 바와 같이, 이러한 변형은 암과 관련하여, 대식구의 항-종양 활성을 보유하고/하거나 M2-유형 대식구의 전-종양 활성을 예방하는데 특히 유용하다. 과도한 M2-유형 대식구 편향으로 인한 부적절한 면역 반응은 또한 감염성 질환, 섬유증, 백신화, 외상 및 만성 염증성 질환에서 발생한다.
따라서, 특수한 구현예에 따라서, 항-SIRPa 항체를 사용하여 폐암, 중피종, 난소 암, 간암, 방광암, 뇌암, 유방암, 결장암, 육종, 췌장암, 두경부암, 신장암, 가슴샘종, 신경교종, 흑색종 및 림프종(호지킨 림프종 및 비-호지킨 림프종)과 같은 혈액암, T 및 B 급성 또는 만성 림프모구 백혈병(ALL 또는 CLL) 또는 급성 또는 만성 골수 백혈병(AML 또는 CML) 및 골수종과 같은 백혈병으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 암을 가진 개인을 치료할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 암(특히 염증성 암 및 침윤된 골수 세포, 특히 침윤된 MDSC 및/또는 TAM 세포를 지닌 암), 감염성 질환, 만성 염증성 질환, 자가-면역 질환, 신경 질환, 뇌 손상, 신경 손상, 적혈구증가증, 혈색소침착증, 외상, 패혈성 쇼크, 만성 감염성 질환(예를 들면, 슈도모나스 또는 CMV), 섬유증, 죽상경화증, 비만, 제II형 당뇨병 및 이식 기능장애로 이루어진 그룹으로부터 선택된 병리의 치료시 사용하기 위한,
- 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체, 또는
- SIRPa에 대한 CD47의 결합을 억제하고 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 T 세포에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 T 세포의 증식을 억제하지 않고/않거나 SIRPg에 대한 CD47의 결합을 억제하지 않는,
특히, SIRPa에 대한 CD47의 결합을 억제하고 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않으며 T 세포에 특이적으로 결합하지 않고 T 세포의 증식을 억제하지 않고 SIRPg에 대한 CD47의 결합을 억제하지 않는 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 유효량의:
- 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체, 또는
- SIRPa에 대한 CD47의 결합을 억제하고 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 T 세포에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 T 세포의 증식을 억제하지 않고/않거나 SIRPg에 대한 CD47의 결합을 억제하지 않는,
특히, SIRPa에 대한 CD47의 결합을 억제하고 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않으며 T 세포에 특이적으로 결합하지 않고 T 세포의 증식을 억제하지 않고 SIRPg에 대한 CD47의 결합을 억제하지 않는 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하여, 상기 대상체에서 암(특히 염증성 암 및 침윤된 골수 세포, 특히 침윤된 MDSC 및/또는 TAM 세포를 지닌 암), 감염성 질환, 만성 염증성 질환, 자가-면역 질환, 신경 질환, 뇌 손상, 신경 손상, 적혈구증가증, 혈색소침착증, 외상, 패혈성 쇼크, 만성 감염성 질환(예를 들면, 슈도모나스 또는 CMV), 섬유증, 죽상경화증, 비만, 제II형 당뇨병 및 이식 기능장애로 이루어진 그룹으로부터 선택된 병리의 치료에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 암(특히 염증성 암 및 침윤된 골수 세포, 특히 침윤된 MDSC 및/또는 TAM 세포를 지닌 암), 감염성 질환, 만성 염증성 질환, 자가-면역 질환, 신경 질환, 뇌 손상, 신경 손상, 적혈구증가증, 혈색소침착증, 외상, 패혈성 쇼크, 만성 감염성 질환(예를 들면, 슈도모나스 또는 CMV), 섬유증, 죽상경화증, 비만, 제II형 당뇨병 및 이식 기능장애로 이루어진 그룹으로부터 선택된 병리의 치료용 의약의 제조시의,
- 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체, 또는
- SIRPa에 대한 CD47의 결합을 억제하고 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 T 세포에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 T 세포의 증식을 억제하지 않고/않거나 SIRPg에 대한 CD47의 결합을 억제하지 않는,
특히, SIRPa에 대한 CD47의 결합을 억제하고 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않으며 T 세포에 특이적으로 결합하지 않고 T 세포의 증식을 억제하지 않고 SIRPg에 대한 CD47의 결합을 억제하지 않는 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체의 용도에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 상기 정의한 바와 같은 이의 용도를 위한, 상기 정의한 바와 같은 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이며, 여기서 본 발명의 상기 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체는 SIRPa-양성 종양을 나타내는 환자에게 투여된다.
일 구현예에서, 본 발명은 백신화에 사용하기 위한,
- 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체, 또는
- SIRPa에 대한 CD47의 결합을 억제하고 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 T 세포에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 T 세포의 증식을 억제하지 않고/않거나 SIRPg에 대한 CD47의 결합을 억제하지 않는,
특히, SIRPa에 대한 CD47의 결합을 억제하고 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않으며 T 세포에 특이적으로 결합하지 않고 T 세포의 증식을 억제하지 않고 SIRPg에 대한 CD47의 결합을 억제하지 않는 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 대상체에게 유효량의:
- 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체, 또는
- SIRPa에 대한 CD47의 결합을 억제하고 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 T 세포에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 T 세포의 증식을 억제하지 않고/않거나 SIRPg에 대한 CD47의 결합을 억제하지 않는,
특히, SIRPa에 대한 CD47의 결합을 억제하고 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않으며 T 세포에 특이적으로 결합하지 않고 T 세포의 증식을 억제하지 않고 SIRPg에 대한 CD47의 결합을 억제하지 않는 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체를 투여함을 포함하는 상기 대상체의 백신화 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 백신의 제조를 위한
- 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체, 또는
- SIRPa에 대한 CD47의 결합을 억제하고 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 T 세포에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 T 세포의 증식을 억제하지 않고/않거나 SIRPg에 대한 CD47의 결합을 억제하지 않는,
특히, SIRPa에 대한 CD47의 결합을 억제하고 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않으며 T 세포에 특이적으로 결합하지 않고 T 세포의 증식을 억제하지 않고 SIRPg에 대한 CD47의 결합을 억제하지 않는 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체의 용도에 관한 것이다.
억제성 골수 세포는 특히 어린이에서 백신화의 효능을 제한한다. 따라서, 항-SIRPa/g는 백신 반응에 있어서 항-SIRPa에 의해 제공된 이점을 제한하고, T 림프구가 백신화에 대해 반응하는 것을 방지할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다양한 적합한 경로, 예컨대, 정맥내(IV), 피하(SC), 또는 근육내(IM)로 대상체에게 투여될 수 있다.
항체 또는 이의 항원-결합 단편은 단독으로, 또는 다른 치료제와 함께, 예컨대, 제2의 사람 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 함께 투여될 수 있다. 다른 예에서, 항체는 다른 제제, 예를 들면, 면역억제제, 적혈구생성-자극제(ESA)와 함께, 치료학적 세포 조성물 등과 함께 투여된다.
일 구현예에서, 본 발명은 상기 정의한 바와 같이 사용하기 위한 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이며, 여기서 항-SIRPa 항체 또는 항원-결합 단편은 제2의 치료제와 조합된다.
특히, 본 발명의 항-SIRPa 항체는 임상 개발중이거나 이미 시판되고 있는 제제를 사용하여 종양 면역 침입 메카니즘을 극복하기 위한 일부 다른 잠재적인 전략과 조합될 수 있다(참고: Antonia et al. Immuno-oncology combinations: a review of clinical experience로부터의 표 1 및 future prospects. Clin. Cancer Res. Off. J. Am. Assoc. Cancer Res. 20, 6258-6268, 2014):
1- 예를 들면, 항-CTLA4, 항-PD1 또는 항-PD-L1 분자를 사용함으로써 적응 면역성(adaptive immunity)의 억제(T-세포 체크포인트 경로의 차단)를 역전시킴;
2- 예를 들면, 작용제 항-CD137 (항-4-1BB) 항체 또는 CD137 (4-1BB) 리간드를 포함하는 작용제 분자를 사용하여 CD137 (항-4-1BB)를 표적화시킴에 의한 적응 면역성의 스위칭(switching)(작용제 분자, 특히 항체를 사용한 T-세포 공자극 수용체 시그날링의 촉진);
3- 선천성 면역 세포의 기능의 개선;
4- 예를 들면, 백신-기반 전략을 통한 면역계의 활성화(면역-세포 효과기 기능의 강화).
제2 치료제의 투여는 항-SIRPa 항체의 투여와 동시일 수 있거나 아닐 수 있다. 제2 제제의 특성에 따라, 동시 투여는 "콤보(combo)"로 또한 알려진 조합 약물(생성물)의 형태로 제조될 수 있다. 콤보는 고정 투여량으로 제조되고 분포된, 단일 투여량 형태로 조합된 2개 이상의 활성 약제학적 성분을 포함하는 고정된-용량의 조합물이다. 그러나, 용량 섭생(dose regimen) 및/또는 투여 경로는 또한 상이할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 이러한 제2 치료제는 화학치료제, 방사선치료제, 면역치료제, 세포 치료요법 제제(예를 들면, CAR-T 세포), 항생제 및 프로바이오틱스(probiotics)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특히, 본 발명의 맥락에서 유용한 면역치료제는 치료학적 백신(DNA, RNA 또는 펩타이드 백신), 면역 체크포인트 차단제(checkpoint blocker) 또는 활성화제(activators), 특히 적응 면역성 세포(T 또는 B 림프구) 또는 항체-약물 접합체와 같은 면역접합체(immunoconjugates)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "면역치료제"는 특히 다음을 포함하는 유효 치료제에 대한 관심 있는 생물학적 현상으로부터 암 백신을 취할 수 있는 제제를 지칭한다: 나이브(naive) T 세포의 수 및 레퍼토리를 증가시키는 T-세포 성장 인자, 수지 세포(CD)의 수를 증가시키는 성장 인자, DC 및 다른 항원-제시 세포(APC)를 활성화시키는 작용제, 암 백신을 허용하고 증강시키는 보조제, T 세포를 활성화시키고 자극하는 작용제, T-세포 체크포인트 차단의 억제제, 면역 T 세포의 성장 및 생존을 증가시키는 T-세포 성장 인자 암 세포 및 면역 세포-기원한 면역억제성 사이토킨을 억제하거나, 차단하거나 중화시키는 제제.
다수의 면역 체크포인트 차단제 또는 활성화제는 당해 분야에 공지되어 있다. 본 발명의 맥락에서, 유용할 수 있는 적응 면역 세포(B 또는 T 림프구)의 면역 체크포인트 차단제 또는 활성화제의 예는 항-PDL1, 항-PD1, 항-CTLA4, 항-CD137, 항-CD2, 항-CD28, 항-CD40, 항-HVEM, 항-BTLA, 항-CD160, 항-TIGIT, 항-TIM-1/3, 항-LAG-3, 항-2B4, 및 항-OX40, 항-CD40 작용제, CD40-L, TLR 작용제, 항-ICOS, ICOS-L 및 B-세포 수용체 작용제, 특히 항-PDL1, 항-PD1, 항-CD137이다.
상기 면역치료제는 또한 특히 항-Her2, 항-EGFR, 항-CD20, 항-CD19, 항-CD52로 이루어진 그룹으로부터 선택된 종양 항원을 표적화하는 항체일 수 있다.
항체는 약 1 ng/kg의 체중 내지 약 30 mg/kg의 체중 이상의 유효 용량으로 제공될 수 있다. 구체적인 구현예에서, 투여량은 1 μg/kg 내지 약 20 mg/kg, 임의로 10 μg/kg 내지 10 mg/kg 또는 100 μg/kg 내지 5 mg/kg의 범위일 수 있다.
용어 "유효 용량" 또는 "유효 투여량" 또는 "유효량"은 바람직한 효과를 달성하기에 또는 적어도 부분적으로 달성하기에 충분한 양으로 정의된다. 용어 "유효량'은 질환 및 이러한 질환을 앓는 환자에서 이의 합병증을 치유하거나 적어도 부분적으로 정지시키기에 충분한 양을 포함함을 의미한다. 이러한 사용을 위한 유효량 또는 유효 용량은 치료되는 상태, 전달된 항체 작제물, 치료 내용 및 대상, 질환의 중증도, 선행 치료요법, 환자의 임상 병력 및 치료제에 대한 반응, 투여 경로, 환자의 체격(체중, 체 표면적 또는 기관 크기) 및/또는 상태(연령 및 일반적인 건강), 및 환자 자신의 면역계의 일반적인 상태에 의존할 것이다. 적절한 용량은 이것이 환자에게 1회 또는 일련의 투여로 투여될 수 있고, 최적의 치료학적 효과를 수득할 수 있도록 조절될 수 있다.
이러한 목적을 위한 투여는 예를 들면, 매일, 1/2 주마다, 매주, 1/2 개월마다, 매월, 또는 재발 동안 필요한 경우 반복될 수 있다.
일 국면에서, 본 발명은 또한 진단 시험, 특히 개별화된 의약, 보다 특히 동반 진단 시험에서 사용하기 위한
- 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체, 또는
- SIRPa에 대한 CD47의 결합을 억제하고 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 T 세포에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 T 세포의 증식을 억제하지 않고/않거나 SIRPg에 대한 CD47의 결합을 억제하지 않는,
특히, SIRPa에 대한 CD47의 결합을 억제하고 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않으며 T 세포에 특이적으로 결합하지 않고 T 세포의 증식을 억제하지 않고 SIRPg에 대한 CD47의 결합을 억제하지 않는 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은
- 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체, 또는
- SIRPa에 대한 CD47의 결합을 억제하고 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 T 세포에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 T 세포의 증식을 억제하지 않고/않거나 SIRPg에 대한 CD47의 결합을 억제하지 않는,
특히, SIRPa에 대한 CD47의 결합을 억제하고 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않으며 T 세포에 특이적으로 결합하지 않고 T 세포의 증식을 억제하지 않고 SIRPg에 대한 CD47의 결합을 억제하지 않는 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체를 사용하는 진단 방법, 특히 개별화된 의약, 보다 특히 동반 진단 시험에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 진단 시험, 특히 개별화된 의약, 보다 특히 동반 진단 시험용 의약의 제조시의
- 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체, 또는
- SIRPa에 대한 CD47의 결합을 억제하고 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 T 세포에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 T 세포의 증식을 억제하지 않고/않거나 SIRPg에 대한 CD47의 결합을 억제하지 않는,
특히, SIRPa에 대한 CD47의 결합을 억제하고 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않으며 T 세포에 특이적으로 결합하지 않고 T 세포의 증식을 억제하지 않고 SIRPg에 대한 CD47의 결합을 억제하지 않는 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체의 용도에 관한 것이다.
일 국면에서, 본 발명은 또한 진단의 시험관내(in vitro) 또는 생체외(ex vivo) 방법, 특히 개별화된 의약(personalized medicine), 보다 특히 동반 진단(companion diagnostic test)에서 사용하기에 적합한 진단 방법에 관한 것이며, 여기서 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 모사체는 대상체로부터 미리 수득된 샘플에서 SIRPa+ 세포의 검출, 및 임의로 SIRPa의 발현의 정량화에 사용된다.
일 국면에서, 본 발명은 또한 진단 시험에 사용하기에, 특히 개별화된 의약, 또는 동반 진단 시험에서 사용하기에 적합한 의약의 제조시, 본 발명의 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 모사체의 용도에 관한 것이다.
일 국면에서, 본 발명은 개인으로부터 이미 수득한 SIRPa의 발현 및/또는 발현 수준의 측정 수단으로서, 본 발명의 적어도 하나의 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체의 용도에 관한 것이다.
일 국면에서, 본 발명은 i) 본 발명의 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체를 사용하여 상기 대상체로부터 이미 수득된 생물학적 샘플에서 SIRPa의 발현 및/또는 발현 수준을 시험관내 측정하는 단계를 포함하여, 상기 대상체로부터 이미 수득된 생물학적 샘플로부터 대상체 내의 SIRPa 양성 세포를 측정하기 위한 시험관내 또는 생체외 방법에 관한 것이다.
일 국면에서, 본 발명은 또한 SIRPa가 대상체, 특히 암 대상체에서 치료에 대한 반응의 예측인 생물마커(biomarker)로서 사용되는 방법에서 본 발명의 적어도 하나의 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체의 특히 시험관내 또는 생체외 용도에 관한 것이다.
일 국면에서, 본 발명은 또한
- 대상체로부터 이미 수득한 종양 샘플에서, 특히 본 발명의 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체를 사용하여 SIRPa의 발현 수준을 측정하는 단계, 및
- SIRPa의 발현 수준을 비-반응성 대상체 집단에서 SIRPa의 발현 수준을 대표하는 값과 비교하는 단계를 포함하는, 특히 본 발명의 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체를 사용하여, 치료에 대한 암 대상체의 반응을 예측하는 시험관내 또는 생체외 방법에 관한 것이며,
여기서 대상체의 종양 샘플 속의 SIRPa의 보다 높은 발현 수준은 치료에 대해 반응할 대상체에 대한 지표이다.
일 국면에서, 본 발명은 또한 치료에 대한 대상체의 반응, 특히 암으로 진단된 대상체의 반응에 대한 예측인 생물 마커로서 SIRPa의 존재를 측정함을 포함하여 대상체로부터 이미 수득된 샘플에서 SIRPa+ 세포의 존재를 측정하는 시험관내 또는 생체외 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 방법은:
　　 - 대상체로부터 이미 수득된 샘플 속에서, 특히 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 한 항에서 정의한 바와 같은 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체를 사용하여, SIRPa의 발현 수준을 측정하는 단계, 및
　　 - SIRPa의 발현 수준을 비-반응 대상체 집단에서의 SIRPa의 발현 수준을 대표하는 값과 비교하는 단계를 포함하며,
여기서 대상체의 종양 샘플 속의 보다 높은 발현 수준의 SIRPa는 치료에 대해 반응할 환자에 대한 지표이다.
조성물
다른 국면에서, 본 발명은 상기 정의한 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, "약제학적 조성물"은 포유동물, 특히 사람과 같은 대상체 또는 환자에게 투여하기에 적합한 조성물을 포함함을 의미한다. 일반적으로, "약제학적 조성물"은 멸균성이며 대상체 내에서 바람직하지 않은 반응(예컨대, 약제학적 조성물 속의 화합물(들)은 약제학적 등급이다)을 유발할 수 있는 오염물을 함유하지 않는다. 약제학적 조성물은 이를 필요로 하는 대상체 또는 환자에게 경구, 볼내, 직장, 비경구, 복강내, 피내, 기관내 등을 포함하는 다수의 상이한 투여 경로를 통해 투여되도록 설계할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "약제학적으로 허용되는 담체"는 일반적으로 안전하고, 무독성이며 생물학적으로 또는 그렇지 않으면 바람직한 약제학적 조성물을 제조하는데 유용한 부형제, 희석제, 담체, 및 보조제를 포함함을 의미하며, 수의학적 용도 뿐만 아니라 사람 약제학적 용도를 위해 허용되는 부형제, 희석제, 담체, 및 보조제를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, "약제학적으로 허용되는 담체"는 하나 및 하나 이상의 이러한 부형제, 희석제, 담체, 및 보조제를 포함한다.
특히, 본 발명은 활성 성분으로서 상기 정의한 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
조합 생성물(combination products)
다른 국면에서, 본 발명은 활성 성분으로서: 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체 및 제2 치료제를 포함하는, 치료학적 수단, 특히 조합 생성물 수단에 관한 것이며, 여기서 상기 활성 성분은 특히 조합된 또는 연속 사용을 위해 별도로, 순차적으로 또는 조합된 치료요법을 위해 제형화된다.
특히, 본 발명은 상기 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모사체 및 제2 치료제를 포함하는, 의약의 동시, 별도 또는 순차적인 사용을 위한 조합 생성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 상기 정의한 바와 같은 조합 생성물에 관한 것이며, 여기서 상기 제2 치료제는 화학치료제, 방사선치료요법제, 세포 치료요법제, 면역치료요법제, 항생제 및 프로바이오틱스로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 본 발명은 상기 정의한 바와 같은 조합 생성물에 관한 것이며, 여기서 상기 면역치료제는 치료학적 백신, 면역 체크포인트 차단제 또는 활성화제, 특히 적응 면역 세포(T 및 B 림프구) 및 항체-약물 접합체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 본 발명은 상기 정의한 바와 같은 조합 생성물에 관한 것이며, 여기서 적응 면역 세포(T 및 B 림프구)의 상기 면역 체크포인트 차단제 또는 활성화제는 항-PDL1, 항-PD1, 항-CTLA4, 항-CD137, 항-CD2, 항-CD28, 항-CD40, 항-HVEM, 항-BTLA, 항-CD160, 항-TIGIT, 항-TIM-1/3, 항-LAG-3, 항-2B4, 및 항-OX40, 항-CD40 작용제, CD40-L, TLR 작용제, 항-ICOS, ICOS-L 및 B-세포 수용체 작용제로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 특히 항-PDL1, 항-PD1 및 항-CD137로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 상기 면역치료제는 특히 항-Her2, 항-EGFR, 항-CD20, 항-CD19, 항-CD52로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 종양 항원을 표적화하는 항체이다.
일 국면에서, 본 발명은 단핵세포 골수-기원한 억제 세포 (Mo-MDSC)를 비 억제 세포로 분화시킴으로써 개선되거나 예방되기 쉬운 임의의 상태의 치료시 동시, 별도 또는 순차적 사용을 위한, 상기 정의한 바와 같은 조합 생성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 상기 정의한 바와 같은 조합 생성물의 유효량을 상기 대상체에게 동시에, 별도로 또는 순차적으로 투여함을 포함하여, 이를 필요로 하는 대상체에서 단핵세포 골수-기원한 억제 세포(Mo-MDSC)를 비 억제 세포로 분화시킴으로써 개선하거나 예방하기 쉬한 임의의 상태의 치료 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 단핵세포 골수-기원한 억제 세포(Mo-MDSC)를 비 억제 세포로 분화시킴으로써 개선하거나 예방하기 쉬한 임의의 상태의 치료용 의약의 제조시 상기 정의한 바와 같은 조합 생성물의 용도에 관한 것이다.
일 국면에서, 본 발명은 대식구 편향을 전-염증성 대식구로 변형시킴으로써 개선하거나 예방하기 쉬운 임의의 상태의 치료시 동시, 별도 또는 순차적 사용을 위한, 상기 정의한 바와 같은 조합 생성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 유효량의 상기 정의한 바와 같은 조합 생성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 동시에, 별도로 또는 순차적으로 투여함을 포함하여, 상기 대상체에서 대식구 편향을 전-염증성 대식구로 변형시킴으로써 개선하거나 예방하기 쉬운 임의의 상태의 치료 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 대식구 편향을 전-염증성 대식구로 변형시킴으로써 개선하거나 예방하기 쉬운 어떠한 조건의 치료를 위한 의약의 제조시 상기 정의한 바와 같은 조합 생성물의 용도에 관한 것이다.
일 국면에서, 본 발명은 암, 감염성 질환, 만성 염증성 질환, 자가-면역 질환, 신경 질환, 뇌 손상, 신경 손상, 적혈구증가증, 혈색소침착증, 외상, 패혈성 쇼크, 만성 감염성 질환(예를 들면, 슈도모나스 또는 CMV), 섬유증, 죽상경화증, 비만, 제II형 당뇨병 및 이식 기능장애로 이루어진 그룹으로부터 선택된 병리의 치료시 동시, 별도 또는 연속 사용을 위한 또는 백신화에 사용하기 위한, 상기 정의한 바와 같은 조합 생성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 유효량의 상기 정의한 바와 같은 조합 생성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 동시에, 별도로 또는 순차적으로 투여함을 포함하여, 상기 대상체에서 암, 감염성 질환, 만성 염증성 질환, 자가-면역 질환, 신경 질환, 뇌 손상, 신경 손상, 적혈구증가증, 혈색소침착증, 외상, 패혈성 쇼크, 만성 감염성 질환(예를 들면, 슈도모나스 또는 CMV), 섬유증, 죽상경화증, 비만, 제II형 당뇨병 및 이식 기능장애로 이루어진 그룹으로부터 선택된 병리의 치료 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 암, 감염성 질환, 만성 염증성 질환, 자가-면역 질환, 신경 질환, 뇌 손상, 신경 손상, 적혈구증가증, 혈색소침착증, 외상, 패혈성 쇼크, 만성 감염성 질환(예를 들면, 슈도모나스 또는 CMV), 섬유증, 죽상경화증, 비만, 제II형 당뇨병 및 이식 기능장애로 이루어진 그룹으로부터 선택된 병리학을 치료하기 위한 또는 백신화에 사용하기 위한 의약의 제조시, 상기 정의한 바와 같은 조합 생성물의 용도에 관한 것이다.
핵산
다른 국면에서, 본 발명은 상기 정의한 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화(encoding)하는 분리된 핵산에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, 핵산 분자는 이중 가닥 및 단일 가닥, 선형 및 환형일 수 있다. 이는 숙주 세포 내에 바람직하게는 포함되는 벡터에 바람직하게 포함된다.
일 구현예에서, 본 발명은 상기 정의한 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이며, 상기 핵산 분자는 정의한 바와 같이, 서열 번호: 58, 서열 번호: 59, 서열 번호: 60, 서열 번호: 61, 서열 번호: 62, 서열 번호: 63, 서열 번호: 64, 서열 번호: 65, 서열 번호: 66, 서열 번호: 67, 서열 번호: 68 및 서열 번호: 69로부터 선택된 적어도 하나의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, 본 발명은 상기 정의한 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이며, 상기 핵산 분자는:
- 바람직하게는:
- 서열 번호: 58, 서열 번호: 59 또는 서열 번호: 60,
- 서열 번호: 61 또는 서열 번호: 62, 및
- 서열 번호: 63, 서열 번호: 64, 서열 번호: 65 또는 서열 번호: 66을 포함하는, 상기 항체의 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 서열,
및/또는
- 바람직하게는:
- 서열 번호: 67,
- 서열 번호: 68, 및
- 서열 번호: 69를 포함하는, 상기 항체의 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 서열을 포함한다.
Figure 112018113083852-pct00007
표 5. 본 발명에 따른 항체의 중쇄 가변 도메인의 CDR 및 경쇄 가변 도메인의 CDR을 암호화하는 서열
특히, 본 발명은 서열 번호: 46, 서열 번호: 47, 서열 번호: 48, 서열 번호: 49, 서열 번호: 50, 서열 번호: 51, 서열 번호: 52, 서열 번호: 53, 서열 번호: 54 및 서열 번호: 55로부터 선택된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 분자에 관한 것이다.
Figure 112018113083852-pct00008
Figure 112018113083852-pct00009
Figure 112018113083852-pct00010
표 6. 본 발명에 따른 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 서열
벡터
다른 국면에서, 본 발명은 상기 정의한 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, "벡터"는 유전 물질을 세포내로 전달하기 위한 비히클(vehicle)로서 사용된 핵산 분자이다. 용어 "벡터"는 플라스미드, 바이러스, 코스미드 및 인공 염색체를 포함한다. 일반적으로, 가공된 벡터는 복제 오리진(orignin of replication), 다중클로닝 부위 및 선택가능한 마커를 포함한다. 벡터 자체는 일반적으로 뉴클레오타이드 서열, 일반적으로 DNA 서열이며, 이는 삽입체(전이유전자) 및 벡터의 "골격"으로서 제공하는 보다 큰 서열을 포함한다. 현대의 벡터는 전이유전자 삽입 및 골격 외에 추가의 특징을 포함할 수 있다: 프로모터(promoter), 유전 마커, 항생제 내성, 리포터 유전자, 표적화 서열, 단백질 정제 태그(tag). 구체적으로 발현 벡터(발현 카세트)로 불리는 벡터는 표적 세포내에서 전이유전자의 발현을 위한 것이며, 일반적으로 조절 서열을 갖는다.
숙주 세포
다른 국면에서, 본 발명은 상기 정의한 바와 같은 벡터를 포함하는 분리된 숙주 세포에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "숙주 세포"는 벡터, 외인성 핵산 분자, 및 본 발명의 항체 작제물(construct)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 수용체; 및/또는 항체 작제물 자체의 수용체일 수 있거나 이러한 수용체이었던 어떠한 개개 세포 또는 세포 배양물을 포함하는 것으로 의도된다. 각각의 물질의 세포내로의 도입은 형질전환, 형질감염 등의 방식으로 수행될 수 있다. 용어 "숙주 세포"는 또한 단일 세포의 자손 또는 잠재적인 자손을 포함하는 것으로 의도된다. 적합한 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포를 포함할 수 있으며, 또한 세균, 효모 세포, 진균 세포, 식물 세포, 및 곤충 세포 및 포유동물 세포, 예컨대, 쥐, 랫트, 토끼, 마카크(macaque) 또는 사람과 같은 동물 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
키트 (kit)
다른 국면에서, 본 발명은:
- 상기 정의한 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편,
- 상기 항체 또는 항원-결합을 암호화하는 핵산 분자,
- 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 및/또는
- 상기 벡터를 포함하는 세포를 포함하는 키트에 관한 것이다.
편의성의 문제로서, 본 발명의 항체는 키트, 즉, 시약의 포장된 조합(packaged combination)으로 제공될 수 있다.
본 발명의 내용에서, 용어 "키트"는 용기, 수용체 또는 기타와 함께 포장된 2개 이상의 성분(이들 중 하나는 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합, 핵산 분자, 벡터 또는 세포에 상응한다)을 의미한다. 따라서 키트는 특정 목적을 달성하기에 충분한 생성물 및/또는 우텐실(utensil)의 세트로서 기술될 수 있으며, 이는 단일 단위로서 시판될 수 있다.
키트는 투여용으로 적절한 용량으로 본 발명의 항체 작제물을 함유하는 어떠한 적절한 형태, 크기 및 물질의 하나 이상의 수용체(예를 들면, 바이알(vial), 앰플, 용기, 주사기, 병, 백(bag))를 포함할 수 있다. 키트는 또한 사용을 위한 지시사항(예컨대, 전단 또는 지시 매뉴얼의 형태), 주사기, 펌프, 주입기 등과 같은 본 발명의 항체 작제물을 투여하기 위한 수단, 본 발명의 항체 작제물을 재구성하기 위한 수단 및/또는 본 발명의 항체 작제물을 희석하기 위한 수단을 함유한다.
일 구현예에서, 본 발명은 단일-용량 투여 단위를 위한 상기 정의한 바와 같은 키트에 관한 것이다. 본 발명의 키트는 또한 건조된/동결건조된 항체 작제물을 포함하는 제1의 수용체 및 수성 제형을 포함하는 제2의 수용체를 또한 함유할 수 있다. 본 발명의 특정의 구현예에서, 단일 챔버화된(chambered) 및 다중-챔버화된 예비 충전된 주사기(예컨대, 액체 주사기 및 동결주사기)를 함유하는 키트가 제공된다.
항원
일 국면에서, 본 발명은 서열 번호: 3 (KFRKGSPD[DV]/[T]E)으로 이루어진 사람 SIRPa의 에피토프 서열(epitope sequence)을 포함하거나 이로 이루어진, 폴리펩타이드, 특히 항원에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 서열 번호: 3 (KFRKGSPD[DV]/[T]E)으로 이루어진 사람 SIRPa의 에피토프 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩타이드, 특히 항원에 관한 것이고, 상기 폴리펩타이드는 길이가 300개 이하의 아미노산이다.
일 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 크기가 50 내지 300, 바람직하게는 100 내지 250개 아미노산이다.
일 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 크기가 50, 100, 150, 200, 250 또는 300개 이하의 아미노산이다.
일 구현예에서, 본 발명은 서열 번호: 3 (KFRKGSPD[DV]/[T]E)으로 이루어진 사람 SIRPa의 에피토프 서열 및 서열 번호: 1 (SLIPVGP), 서열 번호: 2 (G/ARELIYNQKEGH), 서열 번호: 4 (QHTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), 서열 번호: 5 (ICEVAHVTLQG) 또는 서열 번호: 6 (YPQRLQLTWLE)으로 이루어진 사람 SIRPa의 적어도 하나의 에피토프 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩타이드, 특히 항원에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 서열 번호: 1 (SLIPVGP), 서열 번호: 2 (G/ARELIYNQKEGH), 서열 번호: 3 (KFRKGSPD[DV]/[T]E), 서열 번호: 4 (QHTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), 서열 번호: 5 (ICEVAHVTLQG) 및 서열 번호: 6 (YPQRLQLTWLE)으로 이루어진 사람 SIRPa의 에피토프 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩타이드, 특히 항원에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 서열 번호: 70, 서열 번호: 71 및 서열 번호: 72로 이루어진 그룹으로부터 선택된 사람 SIRPa의 적어도 하나의 에피토프를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩타이드, 특히 항원에 관한 것이며, 상기 폴리펩타이드는 300개 이하의 아미노산의 서열로 이루어진다.
일 구현예에서, 본 발명은 서열 번호: 73 (YNQK)에서 설정된 아미노산 서열의 펩타이드 및/또는 SIRPa내 SIR 아미노산 서열의 펩타이드를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩타이드, 특히 항원에 관한 것이며, 상기 폴리펩타이드는 300개 이하의 아미노산의 서열로 이루어진다.
항체의 제조 방법
일 국면에서, 본 발명은 또한 비-사람 동물, 특히 비-사람 포유동물을 상기 정의한 바와 같은 적어도 하나의 항원에 대해 면역화하고, 특히 상기 면역화된 비-사람 동물로부터 수득되는 혈청을 수집하여 상기 항원에 대해 지시된 항체를 수득하는 단계를 포함하는, 항체, 특히 본 발명의 항체의 제조 방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 또한 비-사람 동물을 서열 번호: 3 (KFRKGSPD[DV]/[T]E)으로 이루어진 사람 SIRPa의 에피토프 서열을 포함하거나 이로 이루어진 항원에 대해 면역화시키는 단계, 및 특히 상기 면역화된 비-사람 동물로부터 수득되는 혈청을 수집하여 상기 항원에 대해 지시된 항체를 수득하는 단계를 포함하는, 항체, 특히 본 발명의 항체의 제조 방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 또한 비-사람 동물을 서열 번호: 3 (KFRKGSPD[DV]/[T]E)으로 이루어진 사람 SIRPa의 에피토프 서열 및 서열 번호: 1 (SLIPVGP), 서열 번호: 2 (G/ARELIYNQKEGH), 서열 번호: 4 (QHTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), 서열 번호: 5 (ICEVAHVTLQG) 또는 서열 번호: 6 (YPQRLQLTWLE)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 사람 SIRPa의 적어도 하나의 에피토프 서열을 포함하거나 이로 이루어진 항원에 대해 면역화하는 단계, 및 특히 상기 면역화된 비-사람 동물로부터 수득되는 혈청을 수집하여 상기 항원에 대해 지시된 항체를 수득하는 단계를 포함하는, 항체의 제조 방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 또한 비-사람 동물을 서열 번호: 1 (SLIPVGP), 서열 번호: 2 (G/ARELIYNQKEGH), 서열 번호: 3 (KFRKGSPD[DV]/[T]E), 서열 번호: 4 (QHTVSFTCESHGFSPRDITLKWF), 서열 번호: 5 (ICEVAHVTLQG) 및 서열 번호: 6 (YPQRLQLTWLE)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 사람 SIRPa의 에피토프 서열을 포함하거나 이로 이루어진 항원에 대해 면역화하는 단계, 및 특히 상기 면역화된 비-사람 동물로부터 수득되는 혈청을 수집하여 상기 항원에 대해 지시된 항체를 수득하는 단계를 포함하는, 항체의 제조 방법에 관한 것이다.
항체의 선택 방법
일 국면에서, 본 발명은:
a. SIRPa, 특히 상기 정의한 바와 같은 항원에 결합하는 항체, 이러한 항체의 항원-결합 단편 또는 모사체의 능력을 시험하는 단계(예컨대, 실시예 1, 2, 및 3에 기술된 방법에 따름),
b. SIRPb에 결합하는 항체, 이러한 항체의 항원-결합 단편 또는 모사체의 능력을 시험하는 단계(예컨대, 실시예 7 및 8에 기술된 방법에 따름),
c. SIRPg에 결합하는 항체, 이러한 항체의 항원-결합 단편 또는 모사체의 능력을 시험하는 단계(예컨대, 실시예 9 및 10에 기술된 방법에 따라서),
d. 사람 SIRPa에 대한 사람 CD47의 결합을 억제하는 항체, 이러한 항체의 항원-결합 단편 또는 모사체의 능력을 시험하는 단계(예컨대, 실시예 4 및 5에 기술된 방법에 따름);
e. T 세포에 결합하는 항체, 이러한 항체의 항원-결합 단편 또는 모사체의 능력을 시험하는 단계(예컨대, 실시예 12에 기술된 방법에 따름);
f. T 세포 증식을 억제하는 항체, 이러한 항체의 항원-결합 단편 또는 모사체의 능력을 시험하는 단계(예컨대, 실시예 13에 기술된 방법에 따라서);
g. 사람 SIRPg에 대한 사람 CD47의 결합을 억제하는 항체, 이러한 항체의 항원-결합 단편 또는 모사체의 능력을 시험하는 단계(예컨대, 실시예 11에 기술된 방법에 따름)중 적어도 하나를 포함하거나, 이로 이루어지고, 임의로:
- SIRPa, 특히 상기 정의한 바와 같은 항원에 특이적으로 결합하고, SIRPa에 대한 CD47의 결합을 유의적으로 억제하며, 사람 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않고/않거나 사람 T-세포에 특이적으로 결합하지 않고/않거나, 사람 T-세포의 증식을 유의적으로 억제하지 않고/않거나, 사람 SIRPg에 대한 사람 CD47의 결합을 유의적으로 억제하지 않고; 보다 특히 SIRPa, 특히 상기 정의한 바와 같은 항원에 특이적으로 결합하며, SIRPa에 대한 CD47의 결합을 유의적으로 억제하고, 사람 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않으며, 사람 T-세포에 특이적으로 결합하지 않고, 사람 T-세포의 증식을 유의적으로 억제하지 않으며, 사람 SIRPg에 대한 사람 CD47의 결합을 유의적으로 억제하지 않는 항체, 이러한 항체의 항원-결합 단편 또는 모사체를 선택하는 단계를 포함하는, 본 발명의 항체, 이러한 항체의 항원-결합 단편 또는 모사체를 선택하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 항체를 선택하는 방법은 본 발명에 따른 항체의 제조 방법에 따라 추가로 유리하게 수행될 수 있다.
다음의 도면 및 실시예는 완전한 개시내용 및 본 발명의 제조 및 사용 방법의 설명을 당해 분야의 통상의 기술자에게 제공하기 위해 제공되며, 본 발명자가 이들의 발명으로서 고려하는 본 발명의 영역을 한정하는 것으로 의도되지 않으며 이들이 하기 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험임을 나타냄을 의도하지 않는다. 본 발명을 이의 구체적인 구현예와 함께 기술하였지만, 이는 당해 분야의 기술자에 의해 다양한 변화가 이루어질 수 있고 등가물이 본 발명의 실제 취지 및 영역에 벗어나지 않고 대체될 수 있음이 이해되어야 한다. 또한, 많은 변형이 본 발명의 목적, 취지 및 영역에 대해 특수한 상황, 물질, 물질의 조성, 공정, 공정 단계 또는 단계들을 채택하기 위해 이루어질 수 있다. 모든 이러한 변형은 여기에 첨부된 청구범위의 영역내에 있는 것으로 의도된다.
도면
도 1. ELISA 검정에 의한 항-SIRPa 항체의 결합 검정(사람 SIRPa-His 피복 및 항-사람 카파 검출).
도 A에서 키메라(◆), HALA (), HFLA (*), HFLB (+), HEFLA (▲), HEFLB (■), SIRP29 (△), Kwar23(o)의; 도 B에서 HCLA (
Figure 112018113083852-pct00011
), HCLB (x), HELA (◇), HELB (-)의; 도 C에서 HALB (-), HBLA (_), HBLB (■)의 고정된 SIRPa-His에서 ELISA에 의한 조립. 발견은 당나귀 항-사람 항체에서 수행하였고 450nm에서 TMB 기질을 사용하여 비색법으로 나타내었다. ED50은 이러한 검정에서 시그날의 50%에 이르는 나타낸 항체의 농도이다. 도 D에서 m18D5 클론(■) (n=4), SE5A5 시판 클론(▲) (n=7), 6G10 클론(▽) (n=3) 및 12D7 클론() (n=4)의 결합
도 2. 사람 SIRPa 재조합 단백질에서 항-SIRP 항체의 비아코어에 의한 친화성 검정.
SIRPa-His 재조합 단백질을 CM5 칩(chip)에 5μg/ml(500RU)에서 고정시키고 나타낸 항체를 상이한 농도에서 가하였다. 값을 3분의 회합 기간(ka) 후에 이어 10 분(kd)의 해리 기간으로 측정하여 친화성 상수(KD)를 측정하였다.
도 3. 사람 단핵세포(SIRPa 변이체 1(v1/v1)에 대한 동형접합체)에 있어서 항-SIRPa 항체의 결합 분석.
(A, B) 키메라(◆), HALA (), HFLA (*), HFLB (+), HEFLA (▲), HEFLB (■), SIRP29 (
Figure 112018113083852-pct00012
), Kwar23 (o)의 사람 단핵세포 v1/v1 (사람 Fc 수용체 결합 억제제 항체로 미리 염색됨(stained))에서 세포 유동분석법(cytofluorometry)에 의한 평가. 발견은 Canto II 세포계산기에서 PE 표지된(labeled) 마우스 항-사람 Fc mAb를 사용하여 측정하였고, 값은 염색된 단핵세포의 퍼센트에 상응한다. ED50은 이러한 검정에서 시그날의 50%에 이르는 나타낸 항체의 농도이다. 도 A는 염색된 단핵세포 v1/v1의 퍼센트에 상응한다. 도 B는 단핵세포 v1/v1의 형광성 강도의 평균(MFI)에 상응한다.
(C, D) 유동 세포측정법(FACS)에 의한 사람 단핵세포에서 SIRPa 항체의 결합 연구: 상이한 항-SIRPa 항체를 시험하였다: m18D5 (■) (n=1), SE7C2 (▲)(n=2), 12D7 ()(n=2), 6G10 (
Figure 112018113083852-pct00013
) (n=4): 도 C는 투여량 반응에 걸친 상이한 항체의 평균 형광성 강도(MFI)를 나타낸다. 도 D는 항체 투여량 반응에 걸친 염색된 단핵 세포의 퍼센트를 나타낸다. 통계 분석은 이것이 가능한 경우 수행하였다.
(E, F, G) 항-h SIRPa 항체에 의한 집단에서 SIRPa 변이체 결합: 32명의 자원자에서 SIRPa 변이체에 결합하는 상이한 항-hSIRPa 항체의 능력을 PE-항 마우스 IgG를 사용하여 FACS로 측정하였다. 모든 클론(clone)을 10 μg/ml에서 측정하였다: m18D5 (■), 12D7 (▼), 6G10 (
Figure 112018113083852-pct00014
) 및 시판 항체 SE5A5 (), SE7C2 (
Figure 112018113083852-pct00015
). 도 E는 동종접합체 변이체 1 자원자(n=16)를 나타낸다. 도 F는 동종접합체 변이체 2 자원자(n=8)를 나타낸다. 도 G는 이형접합체 V1/V2 자원자 (n=8)를 나타낸다.
도 4. SIRPa에서 항-SIRPa 항체과 CD47의 경쟁.
(A) 바이오티닐화된 CD47-Fc(6μg/ml)의 고정 농도로 항온처리된 상이한 농도에서 키메라(◆), HFLA (*), HFLB (+), HEFLA (▲), HEFLB (■), SIRP29 (
Figure 112018113083852-pct00016
), Kwar23 (o)의 고정된 SIRPa-His에서 ELISA에 의한 평가. 발견은 CD47 분자를 검출하기 위해 스트렙타비딘 퍼옥시다제를 사용하여 수행하였으며 TMB 기질을 사용하여 450nm에서 비색법으로 나타내었다. 제2 실험의 결과는 IC50 값으로 제공된다. IC50은 이러한 검정에서 시그날의 50%를 억제하는 나타낸 항체의 농도이다.
(B) ELISA에 의한 SIRPa-CD47 상호작용에서 항-SIRPa 항체의 길항제 활성 연구: 상이한 항-SIRPa 항체를 투여량 반응에 걸쳐 시험하였다: m18D5 클론 (■)(n=1), 시판 항체 SE5A5 (▲)(n=2) 및 m12D7 ()(n=2). 도면은 항-hSIRPa 항체의 용량 반응 동안 ELISA에 의해 측정된 CD47 양성 SIRPa-CD47 상호작용의 퍼센트를 나타낸다.
도 5. 사람 단핵세포에서 항-SIRPa 항체와 CD47의 경쟁.
(A, B) 바이오티닐화된 CD47-Fc (10 μg/ml)의 고정 농도와 항온처리된 상이한 농도에서 키메라(◆), HFLA (*), HFLB (+), HEFLA (▲), HEFLB (■)의 사람 단핵세포(v1/v1)에서 세포측정법에 의한 평가. 발견은 CD47 분자를 검출하기 위해 피코에리트린-스트렙타비딘을 사용하여 수행하였고 Canto II 세포측정법로 나타내었다. IC50은 이러한 검정에서 시그날의 50%를 억제하는 나타낸 항체의 농도이다. 도 A는 양성 세포의 퍼센트에 상응한다. 도 B는 형광성 강도의 평균에 상응한다.
(C) FACS에 의한 Sirpa-CD47 상호작용에서 항-SIRPa 항체의 길항제 활성 연구: 상이한 항-SIRPa 항체를 용량 반응에 걸쳐 시험하였다: m18D5 클론 (■)(n=1), 시판 항체 SE7C2 (▲) (n=2) 및 m12D7 ()(n=2). 도 C는 항-hSIRPa 항체와의 경쟁 후 FACS에 의해 측정된 CD47 양성 세포의 퍼센트를 나타낸다.
도 6. (A) SP-D 리간드의 존재 또는 부재하에 예비-항온처리된 사람 SIRPa에서 항-SIRP 항체의 블리츠에 의한 친화성 분석. SIRPa-His 재조합 단백질을 NINTA 바이오센서에 10 ㎍/ml에서 고정시키고 SP-D 리간드를 100 ㎍/ml(포화 농도)에서 가하였다. 이후에, 항-SIRPa 항체를 20㎍/ml에서 가하고 친화성 값을 120sec의 회합 기간(ka)에 이은 120sec(kd)의 해리 기간 후 유추하여 친화성 상수(KD)를 측정하였다. (B) 마우스 18D5 항체로 예비-항온처리된 사람 SIRPa 재조합 단백질에서 항-SIRP 항체의 블리츠에 의한 친화성 분석. SIRPa-His 재조합 단백질을 NINTA 바이오센서에 10 ㎍/ml로 고정시키고 항-SIRPa 항체를 20㎍/ml(포화 농도)에서 가하였다. 이후에, SP-D 리간드를 100 ㎍/ml에서 가하고 친화성 값을 120sec의 회합 기간(ka)에 이어 120sec(kd)의 해리 기간 후 유추하여 친화성 상수(KD)를 측정하였다.
도 7. (A) 사람 SIRPb 재조합 단백질에서 항-SIRP 항체의 블리츠에 의한 친화성 분석.
SIRPb-His 재조합 단백질을 NINTA 바이오센서에 고정시키고 나타낸 항체를 20㎍/ml에서 가하였다. 값을 120sec의 회합 기간(ka)에 이어 120sec(kd)의 해리 기간 후 유추하여 친화성 상수(KD)를 측정하였다. (B) 항-SIRP 항체(사람 SIRPb-His 피복 및 항-사람 카파 검출)의 결합 분석. HEFLB (■), SIRP29 (
Figure 112018113083852-pct00017
), Kwar23 (o), B4B6 (
Figure 112018113083852-pct00018
) 및 IgG4 Ab 대조군(■)의 고정된 SIRPb-His에서 ELISA에 의한 평가. 발견은 마우스 항체로 나타낸 B4B6을 제외하고는 당나귀 항-사람 항체로 수행하고 TMB 기질을 사용하여 450nm에서 비색법으로 나타내었다.
도 8. (A) 사람 SIRPg 재조합 단백질에서 항-SIRP 항체의 블리츠에 의한 친화성 분석.
SIRPg-His 재조합 단백질을 NINTA 바이오센서에 고정시키고 나타낸 항체를 10 ㎍/ml에서 가하였다. 값을 120sec의 회합 기간(ka)에 이어 120sec(kd)의 해리 기간 후 유추하여 친화성 상수(KD)를 측정하였다. (B) SIRPg에서 항-SIRP 항체의 ELISA 검정에 의한 결합 분석(사람 SIRPg-His 피복 및 항-사람 카파 검출). HEFLB (■), SIRP29 (
Figure 112018113083852-pct00019
), Kwar23 (o), LSB2-20 (●) 및 IgG Ab 대조군(■)의 SIRPg-His에서 ELISA에 의한 평가. 발견은 당나귀 항-사람 항체로 수행하고 TMB 기질을 사용하여 450nm에서 비색법으로 나타내었다.
도 9. 항-SIRP 항체로 예비-배양된 사람 SIRPg 재조합 단백질에서 CD47의 블리츠에 의한 친화성 분석. SIRPg-His 재조합 단백질을 NINTA 바이오센서에 10 ㎍/ml에서 고정시키고 나타낸 항체를 20㎍/ml(포화 농도)에서 가하였다. 이후에, CD47Fc를 100 ㎍/ml에서 가하고 친화성 값을 120sec의 회합 기간(ka)에 이어 120sec(kd)의 해리 기간 후 유추하여 친화성 상수(KD)를 측정하였다.
도 10. 상이한 모노클로날 항체로 염색하고 제2의 항-IgG 형광 항체로 나타낸 후 (A) 말초 사람 CD3+ T 세포, (B) 적혈구 또는 (C) 혈소판에서 유동 세포측정법에 의해 측정된 기하학적 평균 형광성 강도.
도 11. 상이한 모노클로날 항체로 염색 후 양성 말초 사람 CD3+ T 세포의 퍼센트. 표는 2회 실험에서 양성 세포의 %의 값을 나타낸다.
도 12. 건강한 자원자로부터의 말초 혈액 단핵 세포로부터 분리한 사람 T 세포를 (A) (C) 항-CD3+ 항-CD28 비드(bead)로 1:1 비에서 3일 동안 또는 (B) (D) 동종이계성 수지 세포 (DC)로 5 T 세포 : 1 DC 비에서 5일 동안 또는 (E) 상이한 농도의 투베르쿨린 비정제된 단백질 유도체(PPD)로 5일 동안 자극하였다. 항체를 배양 0일째에 가하였다. 증식을 마지막 12시간의 배양 동안 H3-티미딘의 혼입으로 측정하였다.
도 13. 마우스 CD8+ T 세포를 나이브 마우스(naive mouse)의 비장세포로부터 분리하였다. CD8 T 세포를 항-CD3+ 항-CD28 비드로 1:1 비에서 3일 동안 자극하였다. 항체를 배양 0일째에 가하였다. 증식을 마지막 12시간의 배양 동안 H3-티미딘의 혼입으로 측정하였다.
도 14. 건강한 자원자로부터의 말초 혈액 단핵 세포로부터 분리한 사람 T 세포를 동종이계성 수지 세포 (DC)로 5 T 세포 : 1 DC 비에서 5일 동안 자극하였다. 항체를 배양 0일째에 가하였다. 증식을 마지막 12시간의 배양 동안 H3-티미딘의 혼입으로 측정하였다.
도 15. (A) 쥐 간 종양의 동소이식 모델(0일째에 간문맥을 통해 주사된 2.5.10^6의 Hepa 1.6 세포)에서 함께 또는 항-4-1-BB mAb (3H3 클론, 100 ㎍/주사)의 2회 주사(4일 및 8일째) 없이 또는 항-PDL-1 (10F.9G2 클론, 200 ㎍/주사, 4주 동안 치료)의 주사로 4주(300㎍/주사) 동안 주당 3회 복강내 투여한 항-SIRPa (P84 클론)의 항-종양 효과. 마우스는 모든 대조군 마우스가 죽는데 필요한 시간보다 3배 더 길게 생존하는 경우 치유된 것으로 고려하였다. (B) 종양 침윤 세포를 종양 접종 후 13일째에 분석하였다. (C) 종양 침윤 세포 및 비장 세포를 종양 접종 후 13일째에 분석하였다. (D) 항-SIRPa + 항-4-1BB 주사에 의한 간 종양 모델에서 이미 치유된 마우스 또는 항-4-1BB로 치료된 SIRPa 돌연변이체 마우스를 비장에서 Hepa 1.6 세포 주사(2.5.10^6개 세포/마우스)에 의해 재챌린지(rechallenge)하였다. 나이브 마우스에 동일한 경로로 동시에 주사하여 재챌린지된 마우스와 종양 발달을 비교하였다. 이후에, 마우스를 치료하지 않고 두었다. (E) 항-SIRPa + 항-4-1BB에 의해 간종양 모델에서 이미 치료된 마우스를 비장내 Hepa 1.6 세포 주사(2.5.10^6개 세포/마우스)로 재챌린지하고 이들의 비장을 재챌린지 후 30일째에 수거하였다. 비장세포 및 T-세포 비장세포를 분리하였다. 나이브 마우스에 비히클, 전체 비장 세포(10.10^6/마우스) 또는 비장 세포로부터 정제된 T-세포(2.5.10^6/마우스)를 정맥내 주사하고 모두에게 비장내 Hepa1.6 세포 주사(2.5.10^6개 세포/마우스)를 제공하였다. 이후에,마우스를 치료하지 않고 두었으며 마우스가 모든 대조군 마우스가 죽는데 필요한 시간보다 3배 더 길게 생존한 경우 치유된 것으로 고려하였다.
도 16. 항-SIRPa + 항-PDL1 주사에 의한 간 종양 모델에서 이미 치유된 마우스를 비장내 Hepa 1.6 세포 주사(2.5.10^6개 세포/마우스)에 의해 재챌린지하였다. 나이브 마우스에 동일한 경로로 동시에 주사하여 재챌린지된 마우스와 종양 발달을 비교하였다. 이후에, 마우스를 치료하지 않고 두었다.
도 17. 쥐 유방 암종(유선내에 주사된 0.25.10^6의 4T1 세포)의 동소이식 모델(orthotopic model)에서 4주 동안 주당 3회 복강내 투여된 항-SIRPa (P84 클론)의 항-종양 효과. 종양 발달을 종양의 직경을 측정하여 평가하고 하기 식에 따라 계산하였다: =(0,52*(d2))^1.5. 마우스를 종양 발달이 윤리적 가이드라인에 따라 거의 1000 mm3에 이른 경우 안락사시켰다.
도 18. 쥐 유방 암종(0.25.10^6개의 4T1 세포를 유선내에 주사함)의 동소 이식 모델에서 항-SIRPa (P84 클론) 또는 대조군 mAb를 2주 동안 주당 3회(200㎍/주사) 복강내로 처리한 비장, 종양 및 림프절내 면역 세포 표현형 분석. 면역 세포 분석을 종양 접종 후 2주째에 수행하였다.
도 19. 항-SIRPa (P84 클론), 항-CD47 (MIAP410 클론) 및 비관련 동형 대조군을 C57Bl/6 마우스에서 12mg/kg으로 0일 및 2일째에 복강내 투여하였다. 혈액 샘플을 0일 및 3일째에 EDTA를 함유하는 튜브에 수집하고 혈액 계수를 XS-800i 혈액학 분석기(Sysmex)로 수행하였다. 헤모글로빈의 수준(좌측) 및 헤마토그릿의 퍼센트(우측)를 3일째에 평가하였다. 점선은 각각의 매개변수에 대한 C57Bl/6 마우스에서 정상 범위 값을 나타낸다.
도 20. (상단) 건강한 공여자의 혈액으로부터 새로이 분리한 사람 혈소판에서 대조군 mAb(점선)와 비교하는 경우, 항-SIRPa(HEFLB, 회색) 및 항-CD47(B6H12, 검정색) mAb의 유동 세포측정법 분석. (하단) 50 μg/ml의 대조군 mAb, 항-SIRPa (HEFLB), 항-CD47 (B6H12) 또는 응집물의 양성 대조군으로서 항-인테그린 αIIb의 존재하에서 광학 응집측정기를 사용한 사람 혈소판 응집 측정. 항체를 비-활성화된 및 ADP-활성화된 혈소판에서 평가하였다.
도 21. 동종이계 CD4+ T 세포를 10 μg/ml의 대조군 항체(백색), 항-SIRPa HEFLB(검정색) 또는 항-CD47 mAb(회색)이 들어있는 (A) 신선한 또는 (B)동결된 난소암 복수로부터 추출한 CD14+ 골수 세포와 1:1 비로 배양하였다. 증식을 5일째에 3H-티미딘 혼입으로 측정하였다. (C) 대안적으로, 동종이계 T 세포를 동종이계 수지 세포와 5:1의 비로 배양하고 상이한 비의 CD14+ 골수 세포를 (A)에서와 같이 10μg/ml의 항체의 존재하에서 난소암 복수액으로부터 추출하였다.
실시예
다음의 실시예에서, 항체 "18D5"(또는 "m18D5")는 마우스 항체 18D5에 상응하며, "키메라" 항체는 키메라 마우스/사람 18D5 항체에 상응하고, 항체 "HALA, HALB, HBLA, HBLB, HCLA, HCLB, HELA, HELB, HFLA, HFLB, HEFLA 및 HEFLB"는 특이적인 사람화된 18D5 변이체에 상응한다. 항체 6G10 및 12D7은 본 출원인에 속하며; 이들 항체는 m18D5보다 동일한 방법으로 수득되었으며 대조군으로 사용되었다. 이들 대조군 항체는 IgG2a 마우스 모노클로날 항-사람 SIRPa 항체이다.
또한, 시판 항체를 비교용으로 사용하였다. 첫번째 것은 SE7C2(Santa Cruz sc-23863)로 명명된 항-SIRPa 항체이고; 두번째 항체는 SIRP α/β 둘 다를 인식할 수 있는 항체이며 SE5A5(BioLegend BLE323802)로 명명되었고; 세번째 것은 Kwar23 (Creative Biolabs)로 명명된 항-사람 SIRPa 항체이다. PCT 출원 제WO2013056352호에 기술된 토론토 대학(University of Toronto)으로부터 SIRP29로 명명된 항-사람 SIRPa 항체를 또한 비교용으로 사용하였다.
실시예 1. ELISA에 의한 SIRPa에서 항- SIRPa 항체의 결합 검정
방법: 항-SIRPa 항체의 결합 활성을 ELISA로 평가하였다. 키메라 항체, 사람화된 항체, SIRP29 및 Kwar23를 사용한 ELISA 검정을 위해, 재조합 hSIRPa(Sino Biologicals, 중국 베이징 소재; 참고 11612-H08H)를 플라스틱에 탄산염 완충액(pH 9.2) 중 0.5μg/ml에서 고정시키고 정제된 항체를 가하여 결합을 측정하였다. 항온처리 및 세척 후, 퍼옥시다제-표지된 당나귀 항-사람 IgG(Jackson Immunoresearch; USA; 참고 709-035-149)을 가하고 통상의 방법으로 나타내었다.
마우스 항체를 사용한 ELISA 검정을 위해, 재조합 hSIRPa(Sino Biologicals, 중국 베이징 소재; 참고 10975-H08H)을 플라스틱에 탄산염 완충액(pH 9.2) 중 0.5μg/ml에서 고정시키고 정제된 항체를 가하여 결합을 측정하였다. 항온처리 및 세척 후, 퍼옥시다제-표지된 염소 항-마우스 Fc 쇄(Jackson Immunoresearch; 참고 115-036-071)를 가하고 통상의 방법으로 나타내었다.
결과: 도 1a, 1b 및 1c에 나타낸 바와 같이, ELISA에 의해 측정하는 경우, SIRPa에서 상이한 항-SIRPa 항체의 결합 활성은 첫번째 실험에서 키메라 항체의 경우 2.9 ng/ml, HALA의 경우 3.9 ng/ml, HFLA의 경우 5.1 ng/ml, HFLB의 경우 4.0 ng/ml, HEFLA의 경우 7.1 ng/ml, HEFLB의 경우 4.4 ng/ml, 제2 실험에서 키메라 항체의 경우 4.06 ng/ml, HCLA의 경우 5.60 ng/ml, HCLB의 경우 5.59 ng/ml, HELA의 경우 4.61 ng/ml, HELB의 경우 4.13 ng/ml, 및 제3 실험에서 키메라 항체의 경우 2.74 ng/ml, HALB의 경우 2.53 ng/ml, HBLA의 경우 2.68 ng/ml, HBLB의 경우 2.95 ng/ml의 유효 농도(EC50)를 나타내었다. 이러한 결과는 시험한 본 발명의 항체가 ELISA에 의해 다른 공지된 항-SIRPa 항체 SIRP29 (3.7 ng/ml) 및 Kwar23 (3.3 ng/ml)와 비교하여 우수한 SIRPa 결합제임을 나타낸다. 이들 결과는 본 발명의 항체 모두에 의해 인식된 에피토프가, SIRPa이 플라스텍 웰(plastic well)에서 피복되는 경우 접근가능함을 나타낸다.
도 1d에 나타낸 바와 같이 ELISA에 의해 측정하는 경우, 상이한 항-SIRPa 항체의 결합 활성은 SE5A5의 경우 0.16nM (24ng/ml) 및 클론 m18D5의 경우 0.06nM (9ng/ml)의 유효 용량(ED50)을 나타내었다. 클론 6G10 및 12D7는 ELISA 검정에 의해 SIRPa에 결합하는 것으로 여겨지지 않았다. 이들 결과는 클론 m18D5가 시판 항체와 비교하여 ELISA에 의해 우수한 SIRPa 결합제임을 나타내며 이러한 클론에 의해 인식된 에피토프가, SIRPa이 플라스틱 웰에 피복되는 경우 클론 6G10 및 12D7와 비교하여 접근가능함을 나타낸다.
실시예 2. SIRPa에 대한 항- SIRPa 항체의 바이오센서 친화성 측정
방법: 재조합 hSIRPa(Sino Biologicals, 중국 베이징 소재; 참고 11612-H08H)를 CM5 센서 칩(GeHealthcare; France) 위에 5μg/ml (500RU)에서 고정시키고 항체를 상이한 농도에서 40μl/min의 유동 속도로 적용시켰다. 분석을 BIAcore 3000(Biacore, GeHealthcare)으로 수행하였다. 값을 3min의 회합 기간(ka)에 이은 10 min (kd)의 해리 기간 후 측정하여 친화성 상수(KD)를 측정하였다.
결과: 도 2에 나타나는 바와 같이, 본 발명의 항체는 SIRPa에 대해 강한 친화성(KD)(1.93e-10M 내지 3.67e-10M)을 가지며, 이는 공지된 항-SIRPa 항체 SIRP29 및 Kwar23의 친화성과 동일하고 시판 항-SIRPa 항체 SE7C2 및 SE5A5의 친화성보다 더 우수하다.
실시예 3. 세포형광분석법에 의한 사람 단핵세포에서 SIRPa 결합 검정
방법: 사람 단핵세포에서 항-SIRPa 항체의 결합을 측정하기 위하여, 사람 Fc 수용체 결합 억제제(BD pharmingen; USA; 참고 564220)를 먼저 실온에서 30분 동안 가하여 사람 단핵세포에서 사람 Fc 수용체를 차단하여 배경을 감소시켰다. 이후에, 항체를 4℃에서 30분 동안 항온처리하고, 4℃에서 30분 동안 PE-표지된 항-사람 IgG Fc(Biolegend; USA; 참고 409303)로 염색하기 전에 세척하였다. 마우스 항체의 경우, PE-표지된 항-마우스 IgG(Jackson Immunoresearch; 참고 715-116-151)를 사용하였다. 샘플을 BD LSRII 또는 Canto II 세포형광분석기에서 분석하였다.
결과: 도 3에 나타나 있는 바와 같이, 결과는 사람 단핵세포 및 결합제 결합(MFI(중간 형광성 강도)로 측정하는 경우)에 있어서 공지된 항-SIRPa 항체 Kwar23, SE7C2 및 SE5A5보다 본 발명의 항-SIRPa 항체의 강력한 결합을 나타낸다.
실시예 4. 길항제 ELISA 검정에 의한 CD47과 항- SIRPa 항체 사이의 경쟁적 분석
방법: 경쟁적 ELISA 분석을 위해, 재조합 hSIRPa(Sino Biologicals, 중국 베이징 소재; 참고 11612-H08H)를 플라스틱 위에 탄산염 완충액(pH9.2) 중 0.5μg/ml에서 고정시켰다. 키메라 항체, 사람화된 항체, SIRP29 및 Kwar23의 경우, 정제된 항체(상이한 농도에서)를 6μg/ml의 최종(고정 농도)의 바이오티닐화된 사람 CD47Fc(AcroBiosystems interchim; 프랑스; 참고: #CD7-H82F6)과 혼합하여 37℃에서 2h 동안 경쟁적 결합을 측정하였다. 항온처리 및 세척 후, 퍼옥시다제-표지된 스트렙타비딘(Vector laboratoring; USA; 참고 SA-5004)을 가하여 바이오틴-CD47Fc 결합을 검출하고 통상의 방법으로 나타내었다.
마우스 항체의 경우, 정제된 항체(상이한 농도에서)를 0.04μg/ml의 CD47Fc(Sino Biologicals, 중국 베이징 소재; 참고 12283-H02H)와 혼합하여 37℃에서 2h 동안 경쟁적 결합을 측정하였다. 항온처리 및 세척 후, 퍼옥시다제-표지된 당나귀 항-사람 Fc 쇄(Jackson Immunoresearch; 참고 709-035-149)를 가하여 CD47Fc 결합을 검출하고 통상의 방법으로 나타내었다.
결과: 도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항체는 SIRPa-CD47 상호작용에서 길항제 활성을 갖는다. 특히, 키메라 항체, HFLA, HFLB, HEFLA 및 HEFLB는 SIRP29 및 시판 항-SIRPa 항체 SE5A5와 비교하여 보다 우수한 길항 활성을 갖는 것이 관찰된다.
실시예 5. 길항제 세포형광분석법 검정에 의한 사람 단핵세포에서 CD47과 사람화된 항- SIRPa 항체 사이의 경쟁적 분석
방법: 사람 단핵세포에서 CD47과 사람화된 항-SIRPa 항체 사이의 경쟁을 측정하기 위하여, 정제된 항체를 단핵세포에서 15분 동안 4℃에서 가한 후, 5μg/ml의 최종의 바이오티닐화된 사람 CD47Fc(AcroBiosystems interchim; 프랑스 소재; 참고: #CD7-H82F6)와 혼합하고 4℃에서 30분 동안 항온처리하여 경쟁적 결합 항체를 측정하였다. 항온처리 및 세척 후, PE-표지된 스트렙타비딘(BDBiosciences; USA; 참고 554061)을 4℃에서 15분 동안 가하여 바이오틴-CD47Fc 결합을 검출하고 BD LSRII 또는 Canto II 세포형광분석기에서 분석하였다.
사람 단핵세포에서 CD47와 마우스 항-hSIRPa 항체 사이의 경쟁을 측정하기 위하여, 정제된 항체를 단핵세포에 4℃에서 15분 동안 가한 후, 5μg/ml의 최종의 CD47Fc(Sino Biologicals, 중국 베이징 소재; 참고 12283-H02H)와 혼합하고 4℃에서 15분 동안 항온처리하여 경쟁적 결합 항체를 측정하였다. 항온처리 및 세척 후, FITC-표지된 항-사람 Fc (Beckman Coulter; 참고 IM1627)를 4℃에서 15분 동안 가하여 CD47Fc 결합을 검출하고 BD LSRII 또는 Canto II 세포형광분석기로 분석하였다.
결과: 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항체는 사람 단핵세포에서 SIRPa-CD47 상호작용에 있어서 길항제 활성을 갖는다.
실시예 6. SP -D를 사용한 블리츠 방법 경쟁
방법: 본 방법을 블리츠(ForteBio; USA; 참고 C22-2 No 61010-1)를 사용하여 수행하였다.
조건 A: SIRPa + 항-SIRPa 항체 + 계면활성제 단백질 D (SP-D). 제1 단계에서, SIRPa (His) 재조합 단백질(Sino Biologicals, 중국 베이징 소재; 참고 11612-H08H)을 10 μg/ml에서 히스티딘 테일(histidine tail)에 의해 Ni-NTA 바이오센서(ForteBio; USA; 참고 18-0029) 내로 30초 동안 고정시켰다. 제2 단계에서, 항-SIRPa 항체를 20μg/mL (포화 농도)에서 120초 동안 가하였다. 이후에, 사람 SP-D (R et D Systems; USA; 참고 1920-SP-050)를 100 μg/mL에서, 항-SIRPa 항체와 경쟁시키면서, 120초 동안 회합시켰다. SP-D의 해리는 동역학 완충액 속에서 120초 동안 이루었다. 데이타의 분석은 Blitz pro 1.2 소프트웨어로 수행하였으며, 이는 회합 상수(ka) 및 해리 상수(kd)를 계산하고 친화성 상수 KD (ka/kd)를 측정하였다.
조건 B: SIRPa + 계면활성제 단백질 D (SP-D) + 항-SIRPa 항체. 제1 단계에서, Sirp-a (His) 재조합 단백질(Sino Biologicals, 중국 베이징 소재; 참고 11612-H08H)을 10 μg/ml에서 히스티딘 테일에 의해 Ni-NTA 바이오센서(ForteBio; USA; 참고 18-0029)내로 30초 동안 고정시켰다. 제2 단계에서, 사람 SP-D (R et D Systems; USA; 참고 1920-SP-050)를 100 μg/mL에서 120초 동안 가하였다. 이후에, 항-SIRPa 항체를 20μg/mL(포화 농도)에서 120초 동안 회합시켰다. 항-SIRPa 항체의 해리는 동력학 완충액 속에서 120초 동안 수행하였다. 데이타의 분석은 Blitz pro 1.2 소프트웨어로 수행하였으며, 이는 회합 상수(ka) 및 해리 상수(kd)를 계산하고 친화성 상수 KD (ka/kd)를 측정하였다.
결과: 도 6에 나타낸 바와 같이, 항-SIRPa 항체 18D5의 결합은 SP-D의 SIRPa에 대한 결합을 차단하지 않으며 SP-D의 결합은 18D5의 SIRPa에 대한 결합을 차단하지 않는다. 따라서, 본 발명의 항체는 SIRPa와 SP-D 사이의 상호작용을 차단하지 않는다.
실시예 7. 블리츠 방법에 의한 SIRPb에 대한 항- SIRPa 항체의 친화성
방법: 본 방법은 블리츠(Forte Bio; USA; 참고 C22-2 No 61010-1)를 사용하여 수행하였다. 재조합 hSIRPb-His(항체-온라인; USA; 참고 ABIN3077231)를 10 μg/ml에서 히스티딘 테일에 의해 Ni-NTA 바이오센서(Forte Bio; USA; 참고 18-0029)내로 30초 동안 고정시켰다. 이후에, 항-SIRPa 항체를 20μg/mL에서 120초 동안 회합시켰다. 항-SIRPa 항체의 해리는 동력학 완충액 속에서 120초 동안 수행하였다. 데이타의 분석은 Blitz pro 1.2 소프트웨어로 수행하였으며, 이는 이는 회합 상수(ka) 및 해리 상수(kd)를 계산하고 친화성 상수 KD (ka/kd)를 측정하였다.
결과: 도 7a에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항체는 SIRPa와 비교하여 SIRPb에 대해 보다 낮은 친화성을 갖는다. 특히, 키메라 항체, HFLA, HFLB, HEFLA, HEFLB는 SIRP29 및 Kwar23과 비교하여 SIRPb에 대해 감소된 친화성을 가짐이 주목된다.
실시예 8. SIRPb에서 항- SIRP 항체의 ELISA 결합
방법: 활성 ELISA 검정을 위해서, 재조합 hSIRPb-His(항체-온라인; USA; 참고 ABIN1466557)를 플라스틱 위에 1μg/ml에서 탄산염 완충액(pH9.2) 속에서 고정시키고 정제된 항체를 가하여 결합을 측정하였다. 항온처리 및 세척 후, 퍼옥시다제-표지된 당나귀 항-사람 IgG(Jackson Immunoresearch; USA; 참고 709-035-149)를 가하고 통상의 방법에 의해 나타내었다.
결과: 도 7b에 나타낸 바와 같이, 항-SIRPa 항체는 SIRPb에 대해 낮은 친화성을 갖는다. 발견은 B4B6(마우스 항체를 사용하여 나타냄)를 제외하고는 모든 항체에 대해 당나귀 항-사람 항체를 사용하여 수행하였으며, 이는 항-SIRPb 항체 B4B6에 대해 수득된 시그날이 항-SIRPa 항체에 대해 수득된 시그날보다 더 낮음을 설명할 수 있다.
실시예 9. 블리츠 방법에 의한 SIRPg에 대한 친화성 분석
방법: 본 발명은 블리츠(Forte Bio; USA; 참고 C22-2 No 61010-1)를 사용하여 수행하였다. 재조합 hSIRPg-His(Sino Biologicals, 중국 베이징 소재; 참고 11828-H08H)을 10 μg/ml에서 히스티딘 테일에 의해 Ni-NTA 바이오센서(Forte Bio; USA; 참고 18-0029)내로 30초 동안 고정시켰다. 이후에, 항-SIRPa 항체를 20μg/mL에서 120초 동안 회합시켰다. 항-SIRPa 항체의 해리는 동력학 완충액 속에서 120초 동안 수행하였다. 데이타의 분석은 Blitz pro 1.2 소프트웨어로 수행하였으며, 이는 회합 상수(ka) 및 해리 상수(kd)를 계산하고 친화성 상수 KD (ka/kd)를 측정하였다.
결과: 도 8a에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항-SIRPa 항체는 SIRPg에 대해 낮은 친화성을 갖는다. 본 친화성은 공지된 항-SIRPa 항체 SIRP29 및 Kwar23의 친화성보다 약간 더 낮다. 그러나, 동력학 특성은 항-SIRPa 항체인, SIRP29와 Kwar23 사이에서 상이하며, 항-SIRPa 항체의 경우 SIRP29 및 Kwar23와 비교하여 높은 해리율 상수(Kd)를 갖는다. 특히, HFLB는 SIRPg에 대해 KD 값이 1.036e-7M인 최저 친화성을 가지며, 이는 SIRP29 및 Kwar23의 KD 값과 비교하여 2-log 차이와 동일하다.
실시예 10. SIRPg에서 항- SIRP 항체의 ELISA 결합
방법: 활성 ELISA 검정을 위해, hSIRPg-His(Sino Biologicals, 중국 베이징 소재; 참고 11828-H08H)를 플라스틱 위에 1μg/ml에서 탄산염 완충액(pH 9.2) 속에서 고정시키고 정제된 항체를 가하여 결합을 측정하였다. 항온처리 및 세척 후, 퍼옥시다제-표지된 당나귀 항-사람 IgG(Jackson Immunoresearch; USA; 참고 709-035-149)를 가하고 통상의 방법으로 나타내었다.
결과: 도 8b에 나타낸 바와 같이, 항-SIRPa 항체 HEFLB는 SIRPg에 결합하지 않는 반면 공지된 항-SIRPa 항체 SIRP29 및 Kwar23는 SIRPg에 대해 유의적인 결합을 나타낸다.
실시예 11. SIRPg에 대해 CD47을 사용한 블리츠 방법 경쟁: SIRPg + 항-SIRPa 항체 + CD47
방법: 본 방법은 블리츠(Forte Bio; USA; 참고 C22-2 No 61010-1)를 사용하여 수행하였다. 제1 단계에서, hSIRPg-His (Sino Biologicals, 중국 베이징 소재; 참고 11828-H08H)를 10 μg/ml에서 히스티딘 테일에 의해 Ni-NTA 바이오센서(Forte Bio; USA; 참고 18-0029)내로 30초 동안 고정시켰다. 제2 단계에서, 항-SIRPa 항체를 20μg/mL(포화 농도)에서 120초 동안 가하였다. 이후에, 사람 CD47Fc((Sino Biologicals, 중국 베이징 소재; 참고 12283-H02H)을 100 μg/mL에서 항-SIRPa 항체와 경쟁시키면서 회합시켰다. CD47Fc의 해리는 동력학 완충액 속에서 120초 동안 수행하였다. 분석 데이타는 Blitz pro 1.2 소프트웨어로 수행하였고, 이는 회합 상수(ka) 및 해리 상수(kd)를 계산하고 및 친화성 상수 KD (ka/kd)를 측정하였다.
결과: 도 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항-SIRPa HEFLB는 SIRPg에 대한 CD47의 결합과 경쟁하지 않는다. 반대로, 다른 공지된 항체 SIRP29 및, 특히, kwar23은 SIRPg에 대한 CD47의 결합과 경쟁한다.
실시예 12. 유동 세포측정법에 의한 혈액 세포에 대한 결합
방법: 실험을 실현시켜 사람 혈액 세포에서 항-SIRPa 항체의 결합을 분석하였다. CD3-양성 T 림프구, 적혈구 및 혈소판을 건강한 자원자로부터 정제된 혈액으로부터 추출하였다. 이후에, 세포를 30분 동안 4℃에서 10 마이크로그램/ml의 각각의 시험된 항체로 염색시키고, 세척한 후 제2의 형광성 항-IgG 항체로 다른 30min 동안 4℃에서 염색하였다. 세척 후, 세포를 CANTO II (BD Bioscience) 유동 세포계산기에서 분석하였다.
결과: 도 10에 나타낸 바와 같이, T 세포, 적혈구 및 혈소판은 편재하여 발현되는, CD47에 대해 양성이며, 이들은 B6H12 항체로 염색하였다. SIRP29 및 Kwar23 항체는, LSB2.20(특이적인 항-SIRPg 항체)과 같이, SIRPγ를 발현하는 것으로 공지된 T 세포에 결합한다. 그러나, 항-SIRPa 사람화된 18D5 항체는 T 세포(동일한 결과가 시험한 4개의 상이한 18D5 사람화된 변이체로 수득된다)에 결합하지 않는다. 적혈구 및 혈소판은 SIRPa를 발현하지 않으므로, 이들은 사람화된 18D5 항체 및 다른 항-SIRPa 항체를 나타내지 않았다. 본 결과는 공지된 항-SIRPa 항체와 비교하여 살아있는 세포에 대한 SIRPa의 사람화된 18D5 항체의 특이성을 나타낸다.
도 11에 나타낸 바와 같이, T-세포는 사람화된 18D5 항체(동일한 결과가 시험된 5개의 상이한 18D5 사람화된 변이체로 수득된다) 및 키메라 18D5(데이타는 나타내지 않음)에 의해 염색되지 않으나 70% 이상의 T 세포는 SIRP29 및 Kwar23에 의해 염색된다.
실시예 13. 사람 CD3+ T 세포 증식
방법: hPBMC를 건강한 자원자의 연막(buffy coat)으로부터 분리하였다. CD4 또는 CD8 T 세포를 AutoMACS (Miltenyi)를 사용하여 양성 선택으로 선택하고 96-둥근 웰 플레이트(50 000개의 세포/웰) 속에 플레이팅하였다. 증식 시그날은 항-CD3/항-CD28 피복된 미세비드(LifeTechnologies)에 의해 3일 동안 1개 T 세포 비에 대해 1개 비드에서, 또는 시험관내에서 5일 동안 1 mDC에 대해 5개의 T 세포에서 또는 상이한 농도의 투베르쿨린 정제되지 않은 단백질 유도체(PPD)를 사용하여 생성된 동종이계 성숙한 수지 세포에 의해 제공되었다. SIRPa/CD47 경로를 표적화하는 항체를 포화 농도(10 μg/mL)에서 증식 시험의 개시로부터 가하였다. 증식은 배양 마지막 12시간 동안 H3-티미딘을 혼입하여 측정하였다.
결과: 도 12에 나타낸 바와 같이, 항-SIRPa 항체 HALA 및 HEFLB 변이체는 T 세포가 항-CD3+ 항-CD28 비드 (A) (C)로 또는 동종이계 수지 세포 (B) (D)로 또는 PPD (E)로 자극되는 경우 T 세포 증식을 억제하지 않은 반면, 항-SIRPa Kwar23은 T 세포가 동종이계 수지 세포로 자극된 경우 T 세포 증식을 억제한다. 예측한 바와 같이, 항-CD47 항체 및 항-SIRPg 항체는 T 세포 증식의 억제제이다.
실시예 14. 마우스 CD8+ T 세포 증식
방법: 비장세포를 나이브 마우스로부터 분리하였다. CD8 T 세포를 AutoMACS (Miltenyi)를 사용하여 양성 선택에 의해 선택하고 96-둥근 웰 플레이트(50 000개의 세포/웰) 속에 플레이팅하였다. 증식 시그날은 항-CD3/항-CD28 피복된 미세비드(LifeTechnologies)에 의해 3일 동안 1개의 T 세포 비에 대해 1개의 비드에서 제공되었다. SIRPa/CD47 경로를 표적화하는 마우스 항-SIRPa 항체 (P84) 및 항-CD47 항체(MIAP310)를 증식 시험의 개시로부터 포화 농도(10 μg/mL)에서 가하였다. 증식은 마지막 12시간 배양 동안 H3-티미딘의 혼입에 의해 측정하였다.
결과: 도 13에 나타난 바와 같이, 마우스 T 세포의 증식에 있어서의 항-SIRPa 또는 항-CD47 항체의 억제는 없었다. 이러한 결과는 마우스가 SIRPg 유전자를 발현하지 않는다는 사실에 의해 설명된다. 따라서, 마우스는 SIRPg에 결합하지 않는 특이적인 항-SIRPa 항체의 생체내 효과를 예측하기 위한 모델로서 사용될 수 있다. 대조적으로, 생체내 전임상 효능, 특히 기억 T 림프구의 적응 면역성 및 생성에 있어서 항-CD47 또는 비-선택적인 항-SIRPa 항체는 사람 상황의 예측성(predictive)이지 않다.
실시예 15. 사람 T 세포 증식
방법: hPBMC를 건강한 자원자의 연막(buffy coat)으로부터 분리하였다. CD4 또는 CD8 T 세포를 AutoMACS (Miltenyi)를 사용하여 양성 선택으로 선택하고 96-둥근 웰 플레이트(50 000개의 세포/웰) 속에 플레이팅하였다. 증식 시그날은 항-CD3/항-CD28 피복된 미세비드(LifeTechnologies)에 의해 3일 동안 1개 T 세포 비에 대해 1개 비드에서, 또는 시험관내에서 5일 동안 1 mDC에 대해 5개의 T 세포에서 생성된 동종이계 성숙한 수지 세포에 의해 제공되었다. 항체를 포화 농도(항-CD47 및 항-SIRPa 항체의 경우 5μg/mL 및 항-PD-1/PD-L1 항체 및 재조합 4-1BBL의 경우 2.5μg/mL)에서 증식 시험의 개시로부터 가하였다. 증식을 배양의 마지막 12시간 동안 H3-티미딘을 혼입하여 측정하였다.
결과: 도 14에 나타낸 바와 같이, 항-PD-1/PD-L1 항체 및 재조합 4-1BBL은 사람 T 세포의 증식에 있어서 증강 효과(boost effect)를 가지는 반면, 항-CD47은 사람 T 세포의 증식에 있어서 부정적인 효과를 갖는다. 특히, 항-CD47 항체는 항-PD-1/PD-L1 또는 4-1BB 효능제 제제의 사람 T-세포 면역자극 효능을 방지한다. 항-SIRPa HEFLB는 T 세포의 증식에서 유의적인 효과를 가지지 않는다.
실시예 16. 마우스에서 항-종양 효과
방법: 마우스를 크실라진/케타민의 칵테일(cocktail)로 마취시켰다. 개복수술 후, 종양성 Hepa 1.6 세포를 간문맥을 통해 주사하였다(PBS중 2,5.106개의 세포/100 μL). 치료는 종양 주사 후 4일째에 시작하였다. 작용성 항-4-1BB 모노클로날 항체 (3H3)를 Hepa 1.6 세포(간암종 세포, HCC)를 PBS(100 ㎍/주사) 속에서 복강내 주사한 후 4일 및 8일째에 2회 주사하였다. 항-PDL1 모노클로날 항체를 PBS (200㎍/주사) 속에서 4주 동안 주당 2회씩 복강내 주사하였다. 길항성 항-SIRPa 항체(P84)를 PBS(300㎍/주사) 속에서 4주 동안 주당 3회 복강내 주사하였다. 항-종양 반응을 종양 접종 후 13일째에 HCC의 동소 모델에서 평가하였다. 이때, 종양 및 비장을 수집하여 종양을 또는 전신계 방법으로 침윤한 면역 세포를 표현형화하였다. 침윤 면역 세포인 간의 비장세포 및 비-실질 세포(NPC)를 유동 세포분석법 획득을 위해 4개의 상이한 혼합물을 사용하여 염색하였다.
결과: 도 15a에 나타낸 바와 같이, 항-SIRPa 항체 만이 마우스의 분획에서 유의적으로 생존을 연장시킨다(28%). 항-4-1BB 또는 항-PDL1 항체와의 조합에서 , 항-SIRPa 항체는 치료를 포기한 후에도 생존하는 마우스의 매우 높은 반응율을 허용한다.
도 15b에 나타낸 바와 같이, 항-SIRPa와 공-자극제(예컨대, 항-4-1BB) 또는 T-세포 체크포인트 억제제(예컨대, 항-PDL1)의 조합은 항-4-1BB와 함께 효과기 기억 CD8+ T 세포의 축적을 증가시키면서 조절 및 면역억제성 면역 세포(Tregs, Mo-MDSC)를 감소시킴으로써 종양 미세환경을 변형시킨다. Mo-MDSC는 CD11b 양성- 및 MHC 제II 음성-집단 중에서 Ly6C의 높은 발현 및 Ly6G의 비 발현으로 특징지워진다.
도 15c에 나타낸 바와 같이, 항-SIRPa와 공-자극 인자(예컨대, 항-4-1BB) 또는 T-세포 체크포인트 억제제(예컨대, 항-PDL1)의 조합은 미성숙 및 나이브 B 세포의 빈도를 감소시키는 한편 기억 및 형질모세포의 축적을 증가시킴으로써, 종양 미세환경의 및 비장내 주변에서, 세포 조성을 변형시킨다. 유사하게, 세포분해성(CD27-음성) NK 세포의 축적은 항-41BB 또는 항-PDL1과의 항-SIRPa 조합에 의해 종양 및 주변에서 유도된다.
종합하면, 항-SIRPa는 종양 및 주변 면역성, 특히 적응(T-세포, Tregs, B-세포) 및 선천적(MDSC, 대식구, NK 세포) 면역 세포를 변형시켜 종양 제거 및 장기간 보호에 기여한다.
실시예 17. 이미 치유된 마우스에서 항-종양 효과
방법: 항-SIRPa + 항-4-1BB 주사에 의한 간 종양 모델에서 이미 치유된 마우스 또는 항-4-1BB로 치료된 SIRPa 돌연변이체 마우스를 비장내에 Hepa 1.6 세포 주사(2.5.10^6개의 세포/마우스)에 의해 재챌린지하였다. 마우스를 공기 속에서 3%의 이소플루란으로 마취시켰다. 마우스의 옆구리를 절개하여 비장을 분리한 후, 종양성 Hepa 1.6 세포를 PBS 중 비장(2,5.106개의 세포/50μL)내로 주사하였다. 나이브 마우스에게 동일한 경로로 동시에 주사하여 재챌린지된 마우스를 사용한 종양 발달을 비교하였다.
결과: 도 15d에 나타낸 바와 같이, 재챌린지한 경우 모든 치유된 마우스가 생존한 반면 모든 나이브 마우스는 죽었다. 이러한 결과는 기억 T 세포가 항-SIRPa 치료요법 하에 또는 SIRPa 시그날(SIRPa 돌연변이체 마우스)의 부재 하에 유도되었으며 치유된 마우스에서 장기간 여전히 지속함을 입증한다.
실시예 18. 이미 치유된 마우스로부터 수집한 T-세포 비장 세포 또는 전체 비장세포의 항-종양 효과
방법: 치유된 항-SIRPa + 항-4-1BB 재챌린지된 마우스를 안락사시키고 비장을 수집하였다. 적혈구 분해 후, 비장세포를 추출하고 CD3 양성 T 세포를 AutoMACS를 사용하여 비장세포의 일부로부터 분리하였다. 마취 후, 마우스에게 T-세포 비장세포(2,5.106개의 세포/100 μL) 또는 전체 비장세포(10.106개의 세포/100 μL) 또는 부형제만(PBS)을 정맥내 주사하였다. 모든 마우스에게 앞서 기술한 바와 같이 간문맥을 통해 Hepa 1.6 세포를 제공하였다.
결과: 도 15e에 나타낸 바와 같이, 치유된 마우스로부터 수집된 비장 세포 및 분리된 T 림프구는 마우스의 생존에 있어서 높은 양성 효과를 갖는다. 이러한 결과는 기억 T 세포가 간종양의 치료 후 치유된 마우스의 비장세포에 존재하며 장기간 적응 면역 기억에 관여함을 나타낸다.
실시예 19. 이미 치유된 마우스에서 항-종양 효과
방법: 항-SIRPa + 항-PDL-1 주사에 의해 간 종양 모델에서 이미 치유된 마우스를 비장내에 Hepa 1.6 세포 주사로 재챌린지하였다(2.5.10^6개의 세포/마우스). 마우스를 공기 속에서 3%의 이소플루란으로 마취시켰다. 마우스의 옆구리를 절개하여 비장을 분리한 후, 종양성 Hepa 1.6 세포를 PBS 중 비장(2,5.106개의 세포/50μL)내로 주사하였다. 나이브 마우스를 동일한 경로로 동시에 주사하여 재챌린지된 마우스를 사용한 종양 발달을 비교하였다.
결과: 도 16에 나타낸 바와 같이, 모든 치유된 마우스는 재챌린지하는 경우 생존하였고, 반대로, 모든 나이브 마우스는 죽었다. 이러한 결과는 기억 T 세포가 치유된 마우스에서 여전히 존재함을 시사한다. 이러한 결과는 기억 T 세포가 항-SIRPa 치료요법 하에 유도되었으며 치유된 마우스에서 장기간 여전히 지속함을 입증한다.
실시예 20. 유선 암종 모델(mammary carcinoma model)에서 종양의 성장 효과
방법: 마우스를 공기 중에서 3%의 이소플루란으로 마취시켰다. 마우스를 복부를 면도하고 4T1 세포를 50μL의 PBS 속에서 인슐린 주사기(30 가이지(Gauge))를 사용하여 유선에 주사하였다. 길항성 항-SIRPa 항체(P84) 또는 대조군 항체를 PBS(200㎍/주사) 중에서 복강내로 4주 동안 주당 3회 주사하였다.
결과: 도 17에 나타낸 바와 같이, 항-SIRPa 항체는 대조군 항체와 비교하여 유선 암종 모델에서 종양의 성장을 유의적으로(p<0.01) 감소시킨다.
도 18은 접종 후 2주째에 면역 세포 분석을 나타낸다. 항-SIRPa는 Tregs의 현저한 감소 및 기억 T 세포의 축적과 함께 종양 및 주변(비장) 둘 다에서 골수 및 비-골수 세포(T 및 NK 세포)에 있어 긍정적인 효과를 갖는다.
실시예 21. 해모글로빈의 농도 및 헤마토크릿에 대한 SIRPa 항체의 효과
방법: 항-SIRPa(P84 클론), 항-CD47 (MIAP410 클론) 및 관련되지 않은 동형 대조군을 0일 및 2일째에 12mg/kg으로 C57Bl/6 마우스에서 복강내 투여하였다. 혈액 샘플을 0일 및 3일째에 튜브를 함유하는 EDTA 속에서 수집하고 혈액 계수를 XS-800i 혈액학 분석기(Sysmex)를 사용하여 수행하였다. 헤모글로빈의 수준(좌측) 및 헤마토크릿의 퍼센트(우측)을 3일째에 평가하였다.
결과: 도 19에 나타낸 바와 같이, 항-SIRPa 항체는 헤모글로민의 농도 및 헤마토크릿에 대한 독성 효과를 가지지 않는다. 대조적으로, 항-CD47 항체는 남성에서 제1상 동안 관찰된 빈혈에 따른 헤모글로빈의 농도 및 헤마토크릿의 감소를 유도한다.
실시예 22. 혈소판 응집
방법: 혈액을 건강한 공여자 자원자로부터 시트르산나트륨으로 완충된 바큐에트 수집 튜브(Vacuette collection tube)(Greiner Bio-One) 내로 수집하였다. 혈소판이 풍부한 혈장(PPP)을 10분 동안 200g 및 15분 동안 3　500g에서 각각 원심분리하여 수득하였다. 작업 PRP를 3.108개의 혈소판.L- 1으로 조절하였다. 억제 검정: mAb를 PRP와 함께 40 또는 50μg.mL-1의 시험 항체의 최종 농도에 대해 예비-항온처리하였다. 교반없이 3분 후, 혈소판 응집을 ADP 5μM 첨가로 개시하였다. 응집은 표준 광학 응집기(standard optical aggregometer)(TA-8V Thrombo-Aggregometer, SD Innovation SAS, 프랑스 프오와르 소재)를 사용하여 연속적으로 교반하면서 37℃에서 샘플을 통과하는 광의 투과를 측정함으로써 측정하였다. PPP 투과는 100%로 설정하였다. 응집은 총 5분 동안 교반하에 기록하였다. 유도 검정: 혈소판 응징은 mAb 첨가(50μg.mL- 1)하여 직접 개시하였다. 응집은 총 최대 10분 동안 교반 하에서 기록하였다.
결과: 도 20에 나타낸 바와 같이, 항-CD47 항체와는 대조적으로, 항-SIRPa 항체는 사람 적혈구 또는 혈소판에 결합하지 않는다. 결과적으로, 항-CD47은 시험관내 사람 혈소판 응집을 유도하나 항-SIRPa 항체는 유도하지 않는다. 유사하게, 항-SIRPa 항체는 가역성 ADP-유도된 사람 혈소판 응집을 파괴하지 않으나 항-인테그린 알파 2b는 이를 완전히 무효화한다.
실시예 23. 난소암 복수액으로부터 SIRPa -차단 CD14+ 세포에 의한 동종이계 T 세포의 증식
방법: 동종이계 CD4 T 세포를 건강한 자원자의 연막의 hPBMC로부터 AutoMACS (Miltenyi)를 사용한 양성 선택에 의해 분리하였다. CD4를 96-둥근 웰 플레이트(50 000개의 세포/웰)에 플레이팅하였다. CD14+ 세포를 난소암 환자의 복수로부터 동일한 방법으로 분리하였다. CD14+ 세포를 동종이계 CD4 T 세포와 함께 1:1 비에서 5일 동안 플레이팅하였다. 일부 조건에서, 사람 LPS-성숙된 동종이계 단핵세포-기원한 수지 세포(moDC)를 1:5의 비로 가하여 T 세포를 자극시키고 복수로부터 정제한 CD14+ MDSC의 상이한 비의 면역억제 작용을 분석하였다. SIRPa/CD47 경로를 표적화하는 항체를 포화 농도(10㎍/mL)에서 증식 시험의 개시로부터 가하였다. 증식은 마지막 12시간의 배양 동안 H3-티미딘의 혼입으로 측정하였다.
결과: 도 21a 및 21b에 나타낸 바와 같이, 난소암 복수액으로부터 정제된 신선한 및 동결된 사람 골수 세포(TAM)는 저-자극(hypo-stimulating) 동종이계 사람 T 림프구이다. 항-CD47 항체와는 대조적으로, 항-SIRPa 항체는 골수 세포 특성을 변형시켜 사람 T-세포 활성화 및 증식을 허용한다.
도 21c에 나타낸 바와 같이, 난소암 복수로부터 정제된 사람 골수 세포 (MDSC)는 동종이계 moDC에 의해 유도된 사람 T-세포 증식을 1:1 및 2:1의 골수 대 T-세포 비에서 억제할 수 있다. 항-CD47 항체와는 대조적으로, 항-SIRPa 항체는 사람 MDSC에 의해 유도된 면역억제를 효능화하지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> OSE IMMUNOTHERAPEUTICS <120> NEW ANTI-SIRPa ANTIBODIES AND THEIR THERAPEUTIC APPLICATIONS <130> IP20183522FR <150> US 62/322,707 <151> 2016-04-14 <150> EP 17305182.2 <151> 2017-02-17 <160> 73 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Leu Ile Pro Val Gly Pro 1 5 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = G or A <400> 2 Xaa Arg Glu Leu Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Xaa = DV or T <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 3 Lys Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Xaa Glu 1 5 10 <210> 4 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser Pro Arg 1 5 10 15 Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe 20 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly 1 5 10 <210> 6 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Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable domain <400> 25 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Val His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp His Val Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Gly Gly Thr Gly Thr Met Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 26 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable domain <400> 26 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Val His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr His Tyr 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Sequence <220> <223> Heavy chain variable domain <400> 28 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Val His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr His Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly His Val Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Gly Gly Thr Gly Thr Leu Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 29 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable domain <400> 29 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Val His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr His Tyr Ser Pro Ser 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ccatgtgcca 300 tacacatttg gcggcggcac caaggtggag atcaag 336 <210> 55 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence coding the light chain variable domain LB <400> 55 gacgtggtca tgacacagag cccactgtct ctgcctgtga ccctgggaca gccagcctct 60 atctcctgca ggtccagcca gtccctggtg cacagctacg gcaacacata cctgtattgg 120 ttccagcaga ggcccggaca gagcccaagg ctgctgatct atagggtgtc taatcggttc 180 tccggcgtgc ctgacaggtt tagcggatct ggatccggaa ccgacttcac cctgaagatc 240 tctagagtgg aggctgagga tgtgggcgtg tactattgtt tccagggcac ccatgtgcca 300 tacacatttg gcggcggcac caaggtggag atcaag 336 <210> 56 <211> 456 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 56 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Val His Trp Val Lys Gln Arg Pro Ile Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Gly Gly Thr Gly Thr Met Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val 115 120 125 Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Ser Val Thr Val Thr 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Ser Val His Thr Phe Pro Ala Leu 165 170 175 Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Met Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala 195 200 205 Ser Ser Thr Thr Val Asp Lys Lys Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser 210 215 220 Thr Ile Asn Pro Cys Pro Pro Cys Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala 225 230 235 240 Pro Asn Leu Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile 245 250 255 Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val 260 265 270 Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val 275 280 285 Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp 290 295 300 Tyr Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Gln His Gln 305 310 315 320 Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp 325 330 335 Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val 340 345 350 Arg Ala Pro Gln Val Tyr Ile Leu Pro Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser 355 360 365 Arg Lys Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Val Gly Phe Asn Pro Gly 370 375 380 Asp Ile Ser Val Glu Trp Thr Ser Asn Gly His Thr Glu Glu Asn Tyr 385 390 395 400 Lys Asp Thr Ala Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr 405 410 415 Ser Lys Leu Asn Met Lys Thr Ser Lys Trp Glu Lys Thr Asp Ser Phe 420 425 430 Ser Cys Asn Val Arg His Glu Gly Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys 435 440 445 Thr Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 57 <211> 219 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 57 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Tyr Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125 Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 145 150 155 160 Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 180 185 190 Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 195 200 205 Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 215 <210> 58 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence coding HCDR1 <400> 58 agctattggg tgcac 15 <210> 59 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence coding HCDR1 <400> 59 tcttattggg tgcac 15 <210> 60 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence coding HCDR1 <400> 60 tcctattggg tgcac 15 <210> 61 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence coding HCDR2 <400> 61 aacatcgacc ccagcgactc tgatacccat tacaatcaga agtttaagga c 51 <210> 62 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence coding HCDR2 <400> 62 aacatcgacc ccagcgactc tgatacacac tactccccta gctttcaggg c 51 <210> 63 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence coding HCDR3 <400> 63 ggaggaaccg gaacaatggc ttggtttgct tac 33 <210> 64 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence coding HCDR3 <400> 64 ggaggaaccg gcacactggc ttggttcgct tac 33 <210> 65 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence coding HCDR3 <400> 65 ggaggaaccg gaacaatggc ttacttcgct tat 33 <210> 66 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence coding HCDR3 <400> 66 ggaggaaccg gcacactggc ttacttcgct tat 33 <210> 67 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence coding LCDR1 <400> 67 aggtccagcc agtccctggt gcacagctat ggcaacacat acctgtat 48 <210> 68 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence coding LCDR2 <400> 68 agggtgtcta atcggttctc c 21 <210> 69 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence coding LCDR3 <400> 69 tttcagggca cccatgtgcc atacaca 27 <210> 70 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Glu Leu Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg 1 5 10 <210> 71 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn 1 5 10 <210> 72 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp 1 5 <210> 73 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Tyr Asn Gln Lys 1

Claims (40)

  1. 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로,
    a) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및
    b) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하고,
    상기에서:
    a) - HCDR1은 서열 번호: 14에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, - HCDR2은 서열 번호: 15에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, - HCDR3은 서열 번호: 17에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,- LCDR1은 서열 번호: 21에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, - LCDR2은 서열 번호: 22에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 및 - LCDR3은 서열 번호: 23에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나; 또는
    b) - HCDR1은 서열 번호: 14에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, - HCDR2은 서열 번호: 16에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, - HCDR3은 서열 번호: 17에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,- LCDR1은 서열 번호: 21에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, - LCDR2은 서열 번호: 22에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 및 - LCDR3은 서열 번호: 23에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나; 또는
    c) - HCDR1은 서열 번호: 14에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, - HCDR2은 서열 번호: 16에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, - HCDR3은 서열 번호: 18에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,- LCDR1은 서열 번호: 21에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, - LCDR2은 서열 번호: 22에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 및 - LCDR3은 서열 번호: 23에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나; 또는
    d) - HCDR1은 서열 번호: 14에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, - HCDR2은 서열 번호: 16에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, - HCDR3은 서열 번호: 19에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,- LCDR1은 서열 번호: 21에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, - LCDR2은 서열 번호: 22에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 및 - LCDR3은 서열 번호: 23에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나; 또는
    e) - HCDR1은 서열 번호: 14에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, - HCDR2은 서열 번호: 16에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, - HCDR3은 서열 번호: 20에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,- LCDR1은 서열 번호: 21에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, - LCDR2은 서열 번호: 22에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 및 - LCDR3은 서열 번호: 23에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  2. 청구항 1에 있어서,
    사람 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않는, 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 청구항 1에 있어서,
    - 서열 번호: 24, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26, 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29 및 서열 번호: 30으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인, 및
    - 서열 번호: 31, 서열 번호: 32 및 서열 번호: 33으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인,을 포함하는, 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 청구항 3에 있어서,
    - 서열 번호: 33에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인, 및
    - 서열 번호: 24, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26, 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29 및 서열 번호: 30으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인,을 포함하는, 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. 청구항 4에 있어서,
    중쇄 가변 도메인이 서열 번호: 29 또는 서열 번호: 30으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    - 서열 번호: 24에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인, 및
    - 서열 번호: 31에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함하거나;
    또는
    - 서열 번호: 25에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인, 및
    - 서열 번호: 32에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함하거나;
    또는
    - 서열 번호: 25에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인, 및
    - 서열 번호: 33에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함하거나;
    또는
    - 서열 번호: 26에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인, 및
    - 서열 번호: 32에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함하거나;
    또는
    - 서열 번호: 26에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인, 및
    - 서열 번호: 33에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함하거나;
    또는
    - 서열 번호: 27에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인, 및
    - 서열 번호: 32에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함하거나;
    또는
    - 서열 번호: 27에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인, 및
    - 서열 번호: 33에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함하거나;
    또는
    - 서열 번호: 28에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인, 및
    - 서열 번호: 32에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함하거나;
    또는
    - 서열 번호: 28에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인, 및
    - 서열 번호: 33에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함하거나;
    또는
    - 서열 번호: 29에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인, 및
    - 서열 번호: 32에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함하거나;
    또는
    - 서열 번호: 29에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인, 및
    - 서열 번호: 33에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함하거나;
    또는
    - 서열 번호: 30에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인, 및
    - 서열 번호: 32에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함하거나;
    또는
    - 서열 번호: 30에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인, 및
    - 서열 번호: 33에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  7. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    - 서열 번호: 30에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인, 및
    - 서열 번호: 33에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인,을 포함하는, 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    - 서열 번호: 30에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인, 및
    - 서열 번호: 32에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인,을 포함하는, 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  9. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    - 서열 번호: 29에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 도메인, 및
    - 서열 번호: 32에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 도메인,을 포함하는, 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  10. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체가 사람화된 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  11. 청구항 10에 있어서,
    항체 경쇄 불변 도메인이 사람 카파 경쇄 불변 도메인으로부터 기원하는, 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  12. 청구항 11에 있어서,
    경쇄 불변 도메인이 서열 번호: 35의 서열로 이루어지는, 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  13. 청구항 10에 있어서,
    항체 중쇄 불변 도메인은 사람 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 중쇄 불변 도메인으로부터 기원하는, 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  14. 청구항 13에 있어서,
    항체 중쇄 불변 도메인이 서열 번호: 34의 서열로 이루어지는, 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  15. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 항-SIRPa의 길항제이고 사람 SIRPa의 사람 CD47에의 결합을 억제하는, 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  16. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    사람 T-세포에 특이적으로 결합하지 않는, 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  17. 청구항 16에 있어서,
    CD3+ T-세포에 특이적으로 결합하지 않는, 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  18. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    사람 T-세포의 증식을 억제하지 않는, 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  19. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    사람 SIRPg에 대한 사람 CD47의 결합을 억제하지 않는, 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  20. 약제로서 사용하기 위한,
    청구항 1에 따른 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는
    사람 SIRPa에 대한 사람 CD47의 결합을 억제하고, 사람 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않는, 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  21. 암, 감염성 질환, 만성 염증성 질환, 자가-면역 질환, 신경 질환, 뇌 손상, 신경 손상, 적혈구증가증, 혈색소침착증, 외상, 패혈성 쇼크, 만성 감염성 질환, 섬유증, 죽상경화증, 비만, 제II형 당뇨병 및 이식 기능장애로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질환의 예방 또는 치료시 사용하기 위한, 또는 백신화에 사용하기 위한,
    청구항 1에 따른 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 사람 SIRPa에 대한 사람 CD47의 결합을 억제하고, 사람 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않는, 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  22. 청구항 20 또는 청구항 21에 있어서,
    상기 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SIRPa-양성 종양을 나타내는 환자에게 투여되는, 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  23. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에서 정의한 바와 같은 적어도 하나의 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물로,
    암, 감염성 질환, 만성 염증성 질환, 자가-면역 질환, 신경 질환, 뇌 손상, 신경 손상, 적혈구증가증, 혈색소침착증, 외상, 패혈성 쇼크, 만성 감염성 질환, 섬유증, 죽상경화증, 비만, 제II형 당뇨병 및 이식 기능장애로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질환의 예방 또는 치료시 사용하기 위한, 또는 백신화에 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
  24. 의약으로서 동시에, 별도로 또는 순차적 사용을 위한,
    - 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에서 정의한 바와 같은 적어도 하나의 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및
    화학치료제, 방사선치료제, 면역치료제, 세포 치료요법 제제, 항생제 및 프로바이오틱스(probiotics)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 제2 치료제를 포함하는 조합 생성물(combination product)로,
    암, 감염성 질환, 만성 염증성 질환, 자가-면역 질환, 신경 질환, 뇌 손상, 신경 손상, 적혈구증가증, 혈색소침착증, 외상, 패혈성 쇼크, 만성 감염성 질환, 섬유증, 죽상경화증, 비만, 제II형 당뇨병 및 이식 기능장애로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질환의 예방 또는 치료시 사용하기 위한, 또는 백신화에 사용하기 위한, 조합 생성물.
  25. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 분리된 핵산 분자.
  26. 청구항 25에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  27. 청구항 25에 따른 핵산 분자를 포함하거나; 또는 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하거나; 또는 상기 핵산 분자와 상기 벡터를 모두 포함하는, 분리된 숙주 세포(isolated host cell).
  28. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에서 정의한 바와 같은 항체의 제조 방법으로,
    서열 번호: 3으로 이루어진 사람 SIRPa의 에피토프 서열, 및 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5 또는 서열 번호: 6으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 사람 SIRPa의 적어도 하나의 에피토프 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 적어도 하나의 항원에 대해, 또는 서열 번호: 70, 서열 번호: 71, 서열 번호: 72, 서열 번호: 73 및 SIR 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 펩타이드 포함하는 구조 에피토프를 포함하거나 이로 이루어진 적어도 하나의 항원에 대해, 비-사람 동물을 면역화시키는 단계로 상기 항원이 300개 이하의 아미노산의 서열로 이루어지는 단계, 및
    상기 면역화된 비-사람 동물로부터 생성되는 혈청을 수집하여 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 따른 항체를 수득하는 단계를 포함하는, 제조 방법.
  29. i) 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에서 정의한 바와 같은 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편를 사용하여 대상체로부터 이미 수득된 생물학적 샘플 내 SIRPa의 발현을 또는 SIRPa의 발현 수준을 또는 SIRPa의 발현과 발현 수준 모두를 시험관내(in vitro) 측정하는 단계를 포함하는, 대상체로부터 이미 수득된 생물학적 샘플로부터 상기 대상체 내의 SIRPa 양성 세포를 측정하기 위한 시험관 내 또는 생체외(ex vivo) 방법.
  30. 진단에 사용하기 위한 정보를 수집하는 시험관내 또는 생체외 방법으로,
    청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에서 정의한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 대상체로부터 이미 수득된 샘플 속에서 SIRPa+ 세포를 검출하기 위해 및 임의로 SIRPa의 발현을 정량화하기 위해 사용되는, 방법.
  31. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    진단 시험에서 사용하기 위한, 항-SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  32. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체에서의 치료에 대한 반응에 대해 예측성인 생물 마커로서 SIRPa가 사용되는 방법에서 사용되기 위한, 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  33. - 대상체로부터 이미 수득된 종양 샘플에서 SIRPa의 발현 수준을 측정하는 단계, 및
    - SIRPa의 발현 수준을 비-반응성 대상체 집단에서의 SIRPa의 발현 수준을 대표하는 값과 비교하는 단계를 포함하는,
    청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에서 정의한 바와 같은 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하여 치료에 대한 암 대상체의 반응을 예측하는 시험관내 또는 생체외 방법으로,
    상기 대상체의 종양 샘플 속의 SIRPa의 더 높은 발현 수준이 치료에 대해 반응할 환자에 대한 지표인 것인, 방법.
  34. 청구항 1에 있어서,
    - 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄, 및
    - 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄를 포함하는, 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  35. 청구항 1에 있어서,
    - 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄, 및
    - 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄를 포함하는, 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  36. 청구항 1에 있어서,
    - 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄, 및
    - 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄를 포함하는, 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  37. 청구항 24에 있어서,
    상기 적어도 하나의 제2 치료제가 항-PDL1, 항-PD1, 항-CTLA4, 항-CD137, 항-CD2, 항-CD28, 항-CD40, 항-HVEM, 항-BTLA, 항-CD160, 항-TIGIT, 항-TIM-1/3, 항-LAG-3, 항-2B4, 및 항-OX40, 항-CD40 작용제, CD40-L, TLR 작용제, 항-ICOS, ICOS-L 및 B-세포 수용체 작용제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 조합 생성물.
  38. 청구항 20 또는 청구항 21에 있어서.
    사람 T-세포에 특이적으로 결합하지 않는, 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  39. 청구항 20 또는 청구항 21에 있어서.
    사람 T-세포의 증식을 억제하지 않는, 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  40. 청구항 20 또는 청구항 21에 있어서.
    사람 SIRPg에 대한 사람 CD47의 결합을 억제하지 않는, 항-사람 SIRPa 항체 또는 이의 항원-결합 단편.



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