KR20210006338A - 항-인간 SIRPa v1 항체의 이용 및 항-SIRPa v1 항체를 생산하는 방법 - Google Patents
항-인간 SIRPa v1 항체의 이용 및 항-SIRPa v1 항체를 생산하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 면역치료의 분야에 속한다. 본 발명은 인간 SIRPa를 표적하는 치료 및 진단 응용 분야에 유용한 항체를 제공하며, 상기 항체는 T 세포에 대한 항원의 교차 전달을 향상시킨다. 본 발명은 질병의 치료 또는 예방, 또는 진단 응용 분야에 사용하기 위하여 SIRPa의 특정 이소폼에 방어적이고 SIRPa의 이소폼과 인간 CD47간의 상호작용을 방해할 수 있는 항체를 제공한다. 또한, 본 발명은 인간 SIRP 단백질군 구성원들의 여러 가지 이소폼과 각기 다른 친화력으로 결합하는 항-인간 SIRPa 항체를 생산 및/또는 선택하기 위한 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 면역치료의 분야에 속한다. 본 발명은 인간 SIRPa를 표적하는 치료 및 진단 응용 분야에 유용한 항체를 제공하며, 상기 항체는 T 세포에 대한 항원의 교차 전달을 향상시킨다. 또한, 본 발명은 질병의 치료 또는 예방, 또는 진단 응용 분야에 사용하기 위하여 SIRPa의 특정 이소폼에 방어적이고 SIRPa의 이소폼과 인간 CD47간의 상호작용을 방해할 수 있는 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 인간 SIRP 단백질군 구성원들의 여러 가지 이소폼과 각기 다른 친화력으로 결합하는 항-인간 SIRPa 항체를 생산 및/또는 선택하기 위한 방법에 관한 것이다.
적응 면역의 표적 면역 검사점은 수많은 암과 싸우는데 큰 치료 효과를 보여주었다. 대식세포, 수지상 세포(DC), 골수 유래 억제 세포(MDSC), 및 다형핵 백혈구 또는 호중구(PMN)와 같은 골수 세포에 대한 면역 검사점은 아직 제대로 연구되지 않고 있지만, 이들 골수 세포는 많은 고형 종양에서 가장 많이 존재하는 면역 세포 유형을 나타내며 결과가 좋지 않은 경우가 많다.
신호 조절 단백질 알파(SIRPa, 혹은 SIRP-알파, SIRPα, CD172a 또는 SHPS-1로도 칭함)는 단핵구, 조직 대식세포의 대부분의 하위 집단, 과립구, 림프 조직의 DC 하위 집합, 일부의 골수 전구 세포에서 발현되고 뉴런에도 다양한 수준으로 발현되는데, 소뇌 및 해마의 과립층과 같이 뇌의 시냅스가 풍부한 영역에서 뚜렷하게 발현된다.
SIRPa는 SIRPa, SIRPg (혹은 SIRP- 감마, SIRPγ, CD172g 또는 SIRP 베타 -2로도 지칭됨) 및 SIRPb (혹은 SIRP- 베타, SIRPβ, CD172b로도 지정됨)로 이루어진 폐쇄된 관련 SIRP 단백질의 SIRP 쌍 수용체군의 프로토타입 구성원이다. 신호 조절 단백질(SIRP)은 골수 세포(대식 세포, 과립구, 골수성 수지상 세포 및 비만 세포 포함) 및 신경 세포에서 발현되는 세포 표면 당단백질군을 구성한다 (Barclay, AN & Brown, MH, Nat Rev Immunol 6, 457-64 (2006)에 요약됨; 또는 WO 97/48723 참고). 광범위하게 발현되는 막관통 당단백질인 CD47은 SIRPa에 대한 세포 리간드로 기능하며 SIRPa의 NH2 말단 세포외 말단에 결합한다. SIRPa의 역할은 대식세포에 의한 숙주 세포의 식균 작용에서 억제 역할과 관련하여 가장 잘 입증되어 있다. 특히, 표적 세포에 발현된 CD47에 의하여 SIRPa가 대식 세포에 결합하면 식균 작용을 네거티브하게 조절하는 억제 신호를 생성한다. 그러나, 더 최근의 발견에 의하면 SIRPa 결합을 통해 매개되는 추가적인 긍정적 신호 효과도 있는 것으로 입증되었다 (Shultz, L.D. et al. (1995) J Immunol 154, 180-91).
SIRPa를 암호화하는 유전자는 다형성 유전자이며, 몇 가지 변종이 인간군에 형성된다. 가장 일반적인 인간 SIRPa 변종은 SIRPa v1 및 SIRPa v2 (각각 수탁 번호 NP_542970 (P78324) 및 CAA71403)이며, SIRPa 단백질군은 일반적으로 두 개의 하위 집단 즉, SIRPa v1 이소폼 단백질군과 SIRPa v2 이소폼 단백질군으로 나누어진다.
골수 세포에 의해 발현되는 SIRPa는 편재 수용체 CD47과 상호 작용하며, 이러한 상호 작용은 골수 기능 조절에 관여하는 선천성 반응의 중요한 면역 검사점이다. SIRPa와 CD47 간의 상호 작용은 숙주 세포의 식균 작용을 억제하는 하향 조절 신호를 제공한다. CD47은 일부 암세포에서 광범위하게 과발현되기 때문에, CD47은 이러한 세포로 이루어진 일부 종양 내에서 "나를 먹지 마시오" 신호로 기능하여 식균 작용을 방지한다. 암세포 제거에서 CD47-SIRPa 상호 작용의 잠재적 기여는 최근 몇 년 동안 집중적으로 조사되었다. 종양에 CD47 수용체가 풍부할수록 전체적인 생존율과 반비례하며 몇 가지 암 유형에 대해 불리한 예후 인자를 구성하는 것으로 나타났다.
따라서 SIRPa/CD47 경로는 대 식세포 식균 작용을 향상시키기 위해 여러가지 약제 학적 개발의 주제가 되어왔다. 생물학적 결과에 영향을 미치기 위한 노력으로 CD47/SIRPa 상호 작용을 방해하기 위한 다양한 접근 방법이 제안되었다. 이들 방법에는 단편/절단 SIRPa 및/또는 CD47 단백질 및 이에 대한 항체의 용도를 포함한다. 암세포에 의해 CD47이 과발현되면, 이들 세포가 치료용 항체로 코팅된 경우에도 대식세포에 대한 저항성을 가지게 된다. CD47을 표적으로하는 제제를 이용하여 SIRPa/CD47 경로를 차단하면 대식세포에 의한 항체 의존성 식세포 작용을 향상시키는 것으로 나타났다. 이러한 치료법은 또한 트라스투주맙 (Trastuzumab) (항-Her2), 세툭시맙(Cetuximab) (항-EGFR), 리툭시맙 (Rituximab) (항-Cd20) 및 알렘투주맙 (Alemtuzumab) (항-CD52)과 같은 고갈 치료용 항암 항체와 시너지 효과를 내는 것으로 설명되어 있다.
그럼에도 불구하고, 최근에는 항-CD47 제제가 CD47의 생리학적 역할과 관련된 혈액학적 독성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 이러한 항-CD47 제제는 빈혈 또는 혈소판 감소증을 유발할 수 있다. 또한 CD47은 SIRP 단백질군의 다른 구성원과 다른 경로에도 관여하고 있다. 실제로, CD47은 또한 인간 T 세포 표면에 존재하지만 인간 골수 세포에는 존재하지 않는 SIRPg와도 결합한다. SIRPg/CD47 상호 작용은 세포-세포간의 접착을 중개하고, 초항원 의존적이고 T 세포에 의한 증식을 향상시키며, T 세포의 활성화를 공동 자극한다 (Piccio et al., 2005).
따라서 최근에는 T 세포 증식의 억제와 같은 바람직하지 않은 효과를 피하기 위하여, 한 종류의 SIRP에만 결합할 수 있고 CD47이 SIRPa에 결합하는 것을 방해하는 항-인간 SIRP 항체가 개발되고 있다. 그러나 불행히도, SIRPa 단백질군의 특성으로 인해, 선행 기술의 항체는 환자의 세포에 의해 발현되는 SIRPa 단백질이 SIRPa v1이나 SIRPa v2인 경우에 SIRPa가 관련된 질병을 치료하는 데에는 효과적이지 않을 수 있다. 일부 항체는 SIRPa v1 환자를 치료하는 데 효과적일 수 있지만 SIRPa v2 환자를 치료하는 기능이 낮을 수 있고, 그 반대의 경우도 가능하다. 일부 암의 치료는 환자의 표현형과 깊은 관련이 있기 때문에 각 환자의 세포에 의해 발현되는 이소폼에 대한 항체가 필요하다. 따라서, 더 높은 특이성을 갖고 SIRPa를 표적하는 새롭고 개선된 제제, 특히 항체에 대한 선행 기술이 여전히 필요하다. 또한, 이러한 특정 항체를 생산하는 방법, 이들 항체를 선택하는 방법, 그리고 이와 같은 치료를 받기 전에 환자가 항-인간 SIRPa 항체에 의한 치료에 반응할지를 결정하는 방법이 필요하다.
또한 당 업계에서 항원 전달 세포(APC)에 의한 항원의 교차 전달을 향상시킬 필요가 있다. APC, 특히 수지상 세포는 종양 발생, 질병 발생, 질병 진행 및 치료에 대한 반응에서 독특하고 다양한 역할을 한다. 예를 들어, 수지상 세포는 종양 관련 항원을 적극적으로 흡수하고 처리하여 T 세포에 항원 펩티드를 전달함으로써 종양 특이적 T 세포 반응을 유도하고 유지한다. 수지상 세포(DC)는 전문 APC라고도 한다. 수지상 세포는 여러 가지 면역 이펙터 세포와 상호작용을 함으로써 특정한 경우에 종양 발달을 억제하는 것으로도 알려진 체액 반응뿐만 아니라 선천적 항종양 면역을 돕기도 한다. 다른 한편으로, DC는 특정 종양 유래 및 간질 유래 인자에 의해 종양 부위로 모집되는데, 이는 DC의 성숙, 분화 및/또는 기능을 손상시켜 항종양 면역 반응의 결핍 형성을 초래하거나, 수지상 세포 매개에 의한 내성 및 면역 억제를 발생시킬 수 있다. 종양 환경에서 DC 자극 및 DC 억제/분극 인자의 식별과 DC 조절 메커니즘은 효과적인 DC 기반 백신을 설계하고 암 환자에서 임상적으로 관련된 항종양 면역을 유지하는 면역 결핍 상주 DC의 회수에 중요하다 (Zong et al., 2016). 수지상 세포 (DC) SIRPa 음성은 마우스와 인간에서 항원의 교차 전달을 위한 가장 강력한 APC라고 한다. 그리고 SIRPa 양성인 수지상 세포(DC)는 교차 전달에 효과가 비교적 덜한 것으로 알려져 있다 (Meral et al., 2013; Nierkens et al., 2015; Segura et al., 2015).
암세포는 비동의 돌연변이에 의해 생성된 신생 항원을 포함하여 종양 항원을 발현하지만 항원 전달에는 약하다. 암 환자에서 임상적으로 관련된 항종양 면역 유지를 담당하는 면역 결핍 상주 수지상 세포의 회수는 고려해야 할 중요한 치료 항목이다. 항체와 특정 암에 존재하는 종양 항원 또는 돌연변이 항원의 교차 전달을 증대하는 것은 암을 포함한 일부의 질병을 치료하거나 예방하는 데 주요 관심사가 될 것이다. CD47/SIRPa 신호 전달 경로는 T 세포에 대한 항원의 교차 전달을 조절하는 데에 있어서 흥미로운 주제이다 (Criscitiello, 2012; Ilyas and Yang, 2015; Vigneron, 2015).
항원 전달에 발생하는 결함은 암의 주요 면역 탈출 메커니즘을 나타내며, 항원 전달의 하향 조절/손실은 암의 주요 면역 탈출 메커니즘이 된다 (Sαnchez-Paulete et al., 2017). 따라서, 사용시에 항원의 교차 전달을 향상시킬 제품이 필요하다.
PCT/EP/2017/059071 특허 출원은 SIRPg와 CD47의 상호 작용에 영향을 주지 않으면서 SIRPa와 CD47의 상호 작용을 특이적으로 감소시킬 수 있는 새로운 항-SIRPa 항체를 기재하고 있다. WO201356352 특허 공보는 SIRPa v1 및 v2에 대한 결합제를 선택하기 위하여 사용되고 SIRPb 및 SIRPg에 대해 음성인 라이브러리 F라는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선정된 항-SIRPa 항체(SIRP29)들을 기술하고 있다. 상기 문헌에 개시된 항체는 집단에 존재하는 두 가지 변이체를 모두 인식할 수 있다. 또한, 본 발명의 발명자들은 SIRP29 항체가 실제로 SIRPg에 결합하여 SIRPg-CD47 상호 작용을 방해할 수 있음을 보여주었다.
WO2015138600 특허 공개는 항-SIRPa 항체와 관련된 조성물 및 방법을 제공한다. 이 개시 내용의 항체는 인간 SIRPa에 결합하고 관심 표적 세포에서 발현된 CD47과 식세포에서 발현된 SIRPa의 상호 작용을 차단할 수 있다. 대상 항체는 다양한 치료 방법에 사용된다. 일부의 경우에, 항-SIRPa 항체는 SIRPa에 결합할 수 있지만 SIRPa를 발현하는 세포에서 SIRPa 신호 전달을 자극하지 않는다. 또한, 상기 문헌에 기재된 항체는 SIRPg에 결합할 수 있고 CD47과 SIRPg 사이의 상호 작용을 차단할 수 있다.
따라서, 선행 기술에 기술된 항체는 SIRP 단백질군의 다양한 구성원들을 구별하는 능력이 부족하고, 특히 여러 질병을 예방 또는 치료하기 위해 사용하기 위한 보다 구체적인 항체가 여전히 필요한 실정이다.
일 측면에 있어서, 치료중인 환자가 SIRPa v1 양성인 상태(즉, SIRPa 대립 유전자에 대한 동형 접합(v1/v1)나 이형 접합(v1/v2)를 갖고 있는 경우)를 치료하는데 사용하기 위한 항-인간 SIRPa 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체가 제공된다.
일 구현예에 있어서, (a) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 여기서 HCDR1은 서열 번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고, HCDR2는 서열 번호 10 또는 서열 번호 11로 표시되는 아미노산 서열, 특히 서열 번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고, HCDR3은 서열 번호 12 또는 서열 번호 13 또는 서열 번호 14 또는 서열 번호 15로 표시되는 아미노산 서열, 특히 서열 번호 13 또는 서열 번호 14 또는 서열 번호 15로 표시되는 아미노산 서열, 특히 서열 번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며; 및 (b) 서열 번호 16 및 서열 번호 17로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 도메인, 특히 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 도메인,을 포함하는 항-인간 SIRPa 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체를 제공한다. 상기 항-인간 SIRPa 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체는 인간 CD47이 인간 SIRPa v1와 결합하는 것을 억제하지만, 인간 CD47이 인간 SIRPa v2와 결합하는 것을 방지하거나 억제하지 않는다. 상기 항-인간 SIRPa 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체는 SIRPa v1 양성인 피험자에 발병한 질병의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 것이다.
추가의 구현예에 있어서, 항-인간 SIRPa 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체, 또는 변형 항체를 또한 제공하는데, 여기서
- 인간 SIRPa v1 및/또는 인간 SIRPa v2, 특히 인간 SIRPa v1 및 인간 SIRPa v2에 특이적으로 결합하고, 인간 CD47이 인간 SIRPa v1 및/또는 인간 SIRPa v2와 각각 결합하는 것을 억제하고, 특히 인간 CD47이 인간 SIRPa v1 및 인간 SIRPa v2에 결합하는 것을 억제하고; 그리고
- 인간 CD47이 인간 SIRPg에 결합하는 것을 방지하거나 억제하지는 않고, 특히 인간 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않으며,
상기 항-인간 SIRPa 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체, 또는 변형 항체는 질병, 특히 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위하여, 또는 질병, 특히 암에 대한 치료적 백신 접종에 사용하기 위한 것이다. 여기서, 상기 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체는 상기 질병, 특히 상기 암에 발현되는 항원의 교차 전달을 향상시키고 상기 질병의 치료에 적합한 T 세포 반응을 유도하는 데에 관여하는 것을 특징으로 한다.
일 구현예에 있어서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체는 인간 SIRPa v1에 특이적으로 결합하고, 인간 CD47이 인간 SIRPa v1와 결합하는 것을 억제한다. 이와 같이 발명에 따라 사용하기 위한 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체는 질병, 특히 암의 치료 또는 예방에 특히 적합하고, 또는 SIRPa v1 양성인 환자의 질병, 특히 암에 대한 치료적 백신 접종에 사용하기 적합하다.
본 발명은 또한 (a) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 여기서 HCDR1은 서열 번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고, HCDR2는 서열 번호 10 또는 서열 번호 11로 표시되는 아미노산 서열, 특히 서열 번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고, HCDR3은 서열 번호 12 또는 서열 번호 13 또는 서열 번호 14 또는 서열 번호 15로 표시되는 아미노산 서열, 특히 서열 번호 13 또는 서열 번호 14 또는 서열 번호 15로 표시되는 아미노산 서열, 특히 서열 번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며; 그리고 (b) 서열 번호 16 및 서열 번호 17로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는, 특히 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체를 제공한다. 여기서, 상기 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체는 항원 전달 세포, 특히 수지상 세포에 의한 인간 T 세포, 특히 인간 CD8+ T 세포에 대한 항원, 특히 암 항원의 교차 전달을 향상시킨다. 상기 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체는 질병, 특히 암의 치료 또는 예방에 특히 적합하다. 그리고, 상기 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체는 상기 질병, 특히 암에 발현되는 항원의 교차 전달을 향상시키고 상기 질병의 치료에 적합한 T 세포 반응을 유도하는 데에 관여한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 질병, 특히 본 발명에 기재된 특정 질병의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체는 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 및 서열 번호 23으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 가변 도메인, 특히 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
"항-인간 SIRPa v1 항체"는 SIRPa v1에 대해 상당한 결합 친화력을 보이는 항체이지만, 인간 SIRPa v2 및/또는 인간 SIRPg에 대해서는 상당한 결합 친화력을 보이지 않을 수도 있다. 각각의 경우, 결합 친화력은 Biacore 분석, Blitz 분석, ELISA 분석 또는 Scatchard 플롯과 같이 당 업계에 공지된 방법으로 검출할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. "항-SIRPa v1 항체"는 또한 SIRPa v1에 대해 상당한 결합 친화력을 나타내고 인간 CD47과 인간 SIRPa v1 사이의 상호 작용을 차단하지만 인간 CD47과 인간 SIRPa v2 사이의 상호 작용을 차단하지 않는 항체로 정할 수 있다. 바람직한 구현예에서, "항-SIRPa v1 항체"는 인간 CD47과 인간 SIRPg 사이의 상호 작용을 차단하지 않는다. 여기서, "상호 작용을 차단"한다는 것은, 항체가 CD47/SIRPa v1 상호 작용에 대한 길항 효과를 나타낸다는 것으로 이해되어야 한다. 네거티브한 형태로 사용되는 이 용어는 항체가 CD47/SIRPa v2 상호 작용에 대한 길항 효과를 갖지 않음을 의미하며, 바람직한 실시 예에서는 CD47/SIRPg 상호 작용에 대한 길항 효과를 추가로 갖지 않는다.
본 발명에 사용되는 용어 "항체"라 함은 단일 클론 항체, 다중 클론 항체, 재조합 항체, 키메라 항체 및 인간화 항체와 같은 모든 종류의 항체를 의미한다.
본 발명의 항체는 단일 클론 항체와 다중 클론 항체를 포함한다. 본 발명에 사용되는 "단일 클론 항체"는 서로 다른 아미노산 서열을 갖는 항체들의 혼합물을 함유하는 "다중 클론" 항체 제제와 대조적으로, 공통 중쇄 및 공통 경쇄 아미노산 서열을 공유하는 항체 분자들, 항체의 제제를 의미하는 것으로 한다. 단일 클론 항체는 하이브리도마 유래 항체로 예시되는 고전적인 방법뿐만 아니라, 파지, 박테리아, 효모 또는 리보솜 디스플레이와 같은 여러 가지 공지된 기술에 의해 생산할 수 있다. 따라서, "단일 클론"이라는 용어는 하나의 핵산 클론으로부터 유래한 모든 항체를 지칭하는데 사용된다.
본 발명의 항체는 재조합 항체를 포함한다. 본 발명에 사용된 용어 "재조합 항체"는 숙주 세포로 형질 감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현되는 항체와 같이 재조합 수단에 의해 생산, 발현, 발생 또는 분리되는 항체; 재조합 조합 항체 라이브러리에서 분리된 항체; 인간 면역 글로불린 유전자로 인해 형질 전환된 동물(예를 들면, 마우스)로부터 분리된 항체; 또는 특정 면역 글로불린 유전자 서열(예를 들면, 인간 면역 글로불린 유전자 서열)이 다른 DNA 서열과 조립되는 다른 방식으로 생산, 발현, 발생 또는 분리된 항체를 의미한다. 재조합 항체는 예를 들어 키메라 항체와 인간화 항체를 포함한다.
본 발명의 항체는 키메라 항체를 포함한다. 본 발명에서 사용하는 용어인 "키메라 항체"는 마우스와 같은 포유 동물 종의 생식선에서 유래한 가변 도메인의 서열이 인간과 같은 다른 포유류의 생식선에서 유래한 불변 도메인의 서열에 이식된 항체를 말한다.
본 발명의 항체는 인간화 항체를 포함한다. 본 발명에서 사용하는 용어인 "인간화 항체"는 마우스와 같은 다른 포유류 종의 생식선에서 유래한 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 이식된 항체를 의미한다.
본 발명에서 사용하는 용어인 "항체의 항원 결합 단편"은 본래의 형태일 수 있는 항체의 일부, 즉 SIRPa v1에 대하여 항원 결합 능력을 나타내는 본 발명에 따른 항체 구조의 일부에 해당하는 분자를 의미한다. 이러한 단편은 특히 상응하는 4 사슬 항체의 항원 결합 특이성과 비교하여 상기 항원에 대해 동일하거나 실질적으로 동일한 항원 결합 특이성을 나타낸다. 장점으로서, 항원 결합 단편은 상응하는 4 사슬 항체와 유사한 결합 친화력을 갖는다. 그러나, 상응하는 4 사슬 항체에 비해 항원 결합 친화력이 낮은 항원 결합 단편 또한 본 발명에 포함된다. 항원 결합 능력은 항체와 표적 단편 사이의 친화력을 측정하여 결정할 수 있다. 이들 항원 결합 단편은 항체의 "기능적 단편"으로도 정할 수 있다.
항체의 항원 결합 단편은 항원에 대한 인식 부위, 즉 SIRPa v1의 세포 외 도메인을 포함하는 CDR (상보적 결정 영역) 또는 그의 일부로 지정된 초가변 도메인을 포함하여 이에 따라 항원 인식 특이성이 정해지는 단편이다.
4 사슬 면역 글로불린의 각 경쇄 및 중쇄 가변 도메인(각각 VL 및 VH)은 VL-CDR1 (또는 LCDR1), VL-CDR2 (또는 LCDR2), VL-CDR3 (또는 LCDR3)으로 지정된 3 개의 CDR을 가지고 있다.
당업자는 KABAT의 넘버링 시스템에 대한 기준으로서 참조 넘버링 시스템을 포함하여 이와 관련하여 제시된 표준 정의를 참고하거나 IMGT "collier de perle" 알고리즘을 이용한 애플리케이션에 의해 여러 가지 영역/도메인의 위치를 결정할 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 서열의 정의를 위하여, 영역/도메인의 획정은 참조 시스템마다 다를 수 있다는 것에 유의해야 한다. 따라서, 본 발명에서 규정한 영역/도메인은 항체의 가변 도메인의 전장 서열 내에서 해당 서열의 길이 또는 위치 지정의 변이가 대략 ±10 %인 서열을 포함한다.
4 사슬 면역 글로불린의 구조에 기초하여, 프레임 워크와 불변 도메인의 위치는 다양한 부류의 항체, 특히 IgG, 특히 포유 동물 IgG에 대해 잘 정의되어 있기 때문에, 항원 결합 단편은 이용 가능한 데이터베이스와 선행 기술의 항체 서열과 비교하여, 특히 이들 서열에서 기능성 도메인의 위치를 비교하여 정할 수 있다. 이러한 비교에는 항체의 3 차원 구조와 관련된 데이터도 포함된다.
본 발명의 특정 구현예를 설명하기 위하여, 상기 항체의 CDR을 포함하는 가변 도메인을 가지는 항체의 항원 결합 단편은 Fv, dsFv, scFv, Fab, Fab', F(ab')2를 포함한다. Fv 단편은 소수성 상호 작용에 의해 서로 결합된 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진다. dsFv 단편에서 VH:VL 이종 이량체는 이황화 결합에 의해 안정화되어 있다. scFv 단편에서 VL 및 VH 도메인은 유연한 펩티드 링커를 통해 서로 연결되어 단일 사슬 단백질을 형성한다. Fab 단편은 항체의 파파인 분해에 의해 얻을 수 있는 단량체 단편이며, 이들은 전체 L 사슬과 이황화 결합을 통해 서로 결합된 H 사슬의 VH-CH1 단편을 포함한다. F(ab')2 단편은 힌지 디설파이드 아래에서 항체의 펩신 분해에 의해 생성될 수 있으며; 이것은 두 개의 Fab' 단편과 추가적으로 면역 글로불린 분자의 힌지 영역의 일부를 포함한다. Fab' 단편은 힌지 영역에서 이황화 결합을 절단하여 F(ab')2 단편으로부터 얻을 수 있다. F(ab') 2 단편은 2가이다. 즉, 천연 면역 글로불린 분자와 같은 2 개의 항원 결합 부위를 포함한다. 한편, Fv(Fab의 가변 부분을 구성하는 VHVL 디머), dsFv, scFv, Fab 및 Fab' 단편들은 1가이다. 즉, 단일 항원 결합 부위를 포함한다. 본 발명에서 이러한 기본 항원 결합 단편은 서로 결합되어 2가 바디, 3가 바디 또는 4가 바디와 같은 다가 항원 결합 단편을 얻을 수있다. 이들 다가 항원 결합 단편도 또한 본 발명의 일부이다.
본 발명에서 사용하는 용어 변형 항체(modified antibody)는 "이중 특이적(bispecific)" 항체를 포함하고, 제 1 항원에 특이적인 한 개 이상의 영역(예: 제 1 항체의 가변 영역으로부터 유래함)과 제 2 항원에 특이적인 한 개 이상의 영역(예: 제 2 항체의 가변 영역으로부터 유래함)을 보유함으로써 2 개 이상의 서로 다른 항원을 인식할 수 있는 항체를 의미한다. 이중 특이적 항체는 두 개의 표적 항원에 특이적으로 결합하므로 다중 특이적 항체에 속한다. 2 개 이상의 서로 다른 항원을 인식하는 다중 특이적 항체는 재조합 DNA 방법에 의해 생성되거나 임의의 편리한 방법에 의해 화학적으로 생성되는 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이중 특이적 항체에는 상이한 두 개의 항원을 인식할 수 있는 모든 항체 또는 항체의 접합체, 항체의 중합체 형태가 포함된다. 이중 특이성 항체에는 2가 특성을 유지하기 위해 감소 및 개질된 항체와 BiME (이중 특이성 대식세포 증대 항체), BiTE (이중 특이성 T 세포 참여자), DART (이중 친화성 재 타겟팅); DNL (dock-and-lock), DVD-Ig (이중 가변 도메인 면역 글로불린), HAS (인간 혈청 알부민), kih (knobs into holes)와 같은 각 항원을 인식하는 항원 인식 부위가 여러 개 있을 수 있다.
항원 결합 항체 모방체는 항원에 특이적으로 결합하지만 항체와 구조적으로 관련이 없는 유기 화합물이다. 이들은 일반적으로 약 3-20 kDa의 몰 질량을 가진 인공 펩티드 또는 소형 단백질이다. 핵산과 소분자를 항체 모방체로 간주하기도 하지만, 이들로 구성된 인공 항체, 항체 단편 및 융합 단백질은 항체 모방체가 아니다. 항체에 비해 일반적인 장점은 용해도가 더 높고, 조직 침투, 열 및 효소에 대한 안정성이 높고, 생산 비용이 비교적 낮다는 것이다. 항체 모방체는 치료제 및 진단제로 개발되고 있다. 항원 결합 항체 모방체는 또한 아피바디(affibodies), 아필린(affilins), 아피머(affimers), 아피틴(affitins), DARPin 및 모노 바디(monobodies)를 포함하는 군 중에서 선택할 수 있다.
항원 결합 항체 모방체는 아피틴(affitins) 및 안티칼린(anticalins)을 포함하는 군에서 보다 우선적으로 선택된다. 아피틴은 항원에 선택적으로 결합하는 능력을 가진 인공 단백질이다. 이들은 고세균 영역에 속하는 미생물인 Sulfolobus acidocaldarius에서 발견되는 DNA 결합 단백질 Sac7d에서 구조적으로 유래한다. 예를 들어, Sac7d의 결합 인터페이스의 11 개 잔기의 무작위 치환에 해당하는 변이체를 생성하여 Sac7d의 결합 표면에 있는 아미노산을 무작위화하면 아피틴 라이브러리가 생성될 수 있고, 그 결과로 얻은 단백질 라이브러리를 리보솜 디스플레이의 라운드에 적용하면 펩티드, 단백질, 바이러스, 및 박테리아와 같이 여러 가지 표적에 친화력을 가질 수 있다. 아피틴(affitins)은 항체 모방체이며 생명 공학 도구로 개발되고 있다. 이들은 또한 다양한 효소에 대한 특정 억제제로 사용되고 있다 (Krehenbrink et al., J. mol. Biol., 383: 5, 2008). 당업자는 특히 특허 출원 WO2008068637 및 상기 인용된 문서에 개시된 당 업계의 공지된 방법을 이용하여, 특히 본 발명에 기재된 항원을 이용하여 파지 디스플레이 및/또는 리보솜 디스플레이 라이브러리를 생성하고 및 이들의 스크리닝을 하여, 필요한 결합 특성을 갖는 아피틴을 쉽게 개발할 수 있다. 안티칼린은 단백질이나 소분자 항원에 결합할 수 있는 인공 단백질이다. 그들은 자연 결합 단백질의 계열인 인간 리포 칼린에서 유래한 항체 모방체이다. 안티칼린은 약 180 개 아미노산의 크기와 약 20kDa의 질량으로 약 8 배 더 작다 (Skerra, Febs J., 275: 11, 2008). 특히 특이적 결합 특성을 가진 안티칼린의 스크리닝 및 선택을 가능케 하는 안티칼린 파지 디스플레이 라이브러리가 생성되고 있다. 당업자는 특히 유럽 특허 EP1270725 B1, 미국 특허 US8536307 B2, Schlehuber and Skerra, Biophys에 개시된 바와 같이 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 필요한 결합 특성을 갖는 안티칼린을 쉽게 개발할 수 있다. Chem., 96: 2-3, 2002 및 상기 인용된 문헌에는 특히 본 발명에 개신된 항원을 사용하여 파지 디스플레이 및/또는 리보솜 디스플레이 라이브러리를 생성하고 이들을 스크리닝하는 것을 기술하고 있다. 안티칼린과 아피틴은 모두 박테리아 발현 시스템을 포함하는 다수의 발현 시스템에서 생성할 수 있다. 따라서, 본 발명은 SIRPa v1에 대한 결합 능력을 갖는 특성, 특히 인간 CD47의 인간 SIRPa v1에 대한 결합을 억제하는 특성, 인간 SIRPa v2에 결합하지 않는 특성, 그리고/또는 인간 CD47이 인간 SIRPa v2와 결합하는 것을 방지 또는 억제하지 못하는 특성과 관련하여 본 발명에 기술된 항체들의 특성을 갖는 아피틴, 안티칼린 및 기타 유사한 항체 모방체의 사용을 포함하며, 상기 특성들은 모두 본 발명에 따른 모방체로서 고려되는 것들이다.
따라서, 본 발명의 이중 특이적 항체는 SIRPa v1 및 인간 SIRPa v2나 인간 SIRPg에 존재하지 않는 제 2 항원에 대한 것이다. 본 발명에 따른 임의의 구현예에서, 변형된 항-인간 SIRPa v1 항체는 이중 특이적일 수 있고 변형 항체 또는 그의 변형된 항원 결합 단편 또는 변형된 항원 결합 항체 모방체 또는 이중 특이적 키메라 분자로 정의할 수 있다.
또한, 본 발영에서 사용하는 용어 "변형 항체"는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 분자에 해당할 수 있으며, 여기서 상기 단일 클론 항체 또는 그의 기능적 단편은 기능적으로 다른 분자와 연관된다. 본 발명의 변형 항체는 융합 키메라 단백질이거나, 항체나 기능성 단편의 안정성 및/또는 반감기를 개선하기 위하여 체내 프로테아제 절단에 대한 보호에 적합한 PEG 중합체와 같은 분자나 기타 화학적 또는 생물학적 그룹 또는 분자와의 공유 결합, 그래프팅, 화학적 결합을 포함하는 적합한 부착 형태로부터 얻어지는 융합 키메라 단백질이거나 접합체일 수 있다. 특히 화학적 커플링이나 그래프팅을 이용한 유사한 기술에 의하여, 변형 항체는 생물학적 활성 분자로 제조할 수 있으며, 상기 활성 분자는 예를 들어, 독소 특히 슈도모나스 외독소 A, 식물 독소 리신의 A-사슬 또는 사포린 독소, 특히 항체나 기능성 단편을 인체의 특정 세포나 조직에 표적하기에 적합한 치료 활성 성분인 벡터(특히 단백질 벡터) 중에서 선택된다. 변형 항체는 특히 항체의 단편이 사용될 때 레이블(label)이나 링커와 연관된다. 항체나 이의 기능성 단편의 PEG화는 특히 치료 제품에서 숙주에 활성 성분의 전달 상태를 개선해주므로 특히 흥미로운 구현예이다. PEG화는 항체나 기능성 단편의 인식 부위와의 간섭을 방지하기 위해 부위 특이적일 수 있으며, 고 분자량 PEG를 가지고 수행할 수 있다. PEG화는 항체나 기능적 단편의 서열에 존재하는 유리 시스테인 잔기 또는 항체나 기능적 단편의 아미노 서열에 추가된 유리 시스테인 잔기를 통해 달성될 수 있다. 본 발명에서 "항체"라는 용어를 사용하는 경우에는 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체를 의미한다.
일 구현예에서, 항-SIRPa v1 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체는 변형된다.
본 발명의 특정 구현예에서, SIRPa v1 양성인 피험자에서 질병의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체는 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 및 서열 번호 23으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 특히 상기 중쇄 가변 도메인은 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
본 발명의 특정 구현예에서, SIRPa v1 양성인 인간 피험자에서 본 발명에 기술된 질병의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체는:
- 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 도메인과;
- 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 도메인을 포함하거나 이로 구성된다.
따라서 본 발명은 또한 인간 SIRPa v1에 특이적으로 결합하고, 인간 CD47의 인간 SIRPa v1에 대한 결합을 억제하고, 인간 CD47의 인간 SIRPa v2에 대한 결합은 방지하거나 억제하지 않고, SIRPa v1 양성인 피험자 내에서 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체는 SIRPa v1에 특이적으로 결합하고 SIRPa v1과 CD47 사이의 상호 작용을 길항한다.
"특이적으로 결합한다"라는 표현 또는 임의의 동등한 용어는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 인간 SIRPa v1과 상호 작용하고 인간 SIRPa v1에 결합하는 반면, 다른 분자, 특히 SIRPa v2, 특히 인간 SIRPg, 특히 인간 SIRPa v2 및 SIRPg에 결합하지 않거나 상당히 약한 결합 친화력으로 결합하는 능력을 말한다. 결합 및 특이성은 SPR (Surface Plasmon Resonance, 예: Biacore), ELISA 또는 Western Blot 분석으로 평가할 수 있다. 일 구현예에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 상기 항체 또는 항원 결합 항체 모방체를 포함하는 키메라 분자는 10E-9 M 이상, 특히 10E-10 M 이상의 친화성(KD)을 갖는 분리된 단백질로서 SIRPa v1에 표적하여 결합한다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 항체는 특히 Blitz 분석에 의하면 SIRPa v1에 대하여 10E-8 M 내지 10E-11 M, 바람직하게는 10E-9 M 내지 10E-10 M을 포함하는 KD 값을 나타낼 수 있다.
질병의 예방 및/또는 치료에 사용되는 항체는 인간 CD47이 인간 SIRPa v2와 결합하는 것을 예방하거나 억제하지 않는다. 즉, 이 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체는 인간 CD47이 인간 SIRPa v1에 결합하는 것과는 반대로 인간 CD47이 인간 SIRPa v2에 결합하는 데에는 유의한 영향을 미치지 않는다. 특히, 항체 또는 항원 결합 단편은 결합 분석에 있어서 음성 대조군 분자와 비교하여 인간 CD47의 인간 SIRPa v2에 대한 결합을 70 %, 바람직하게는 60 %, 바람직하게는 50 % 및 가장 바람직하게는 25 % 이상으로 예방하거나 억제하지 않는다. CD47과 SIRP v2 (또는 SIRPg) 사이의 결합은 SIRPa v2 및/또는 SIRPg를 발현하는 세포를 가지고 본 발명의 실시예에 개시된 방법, 특히 실시예 6에 개시된 Blitz 방법에 따라 평가할 수 있지만, Biacore 분석, ELISA 분석 또는 유동 세포 분석법을 이용하여 평가할 수도 있다. 결합은 CD47의 SIRPa v2 (또는 SIRPg)에 대한 친화력에 해당하는 KD 값이 1E-7 M 이상일 때 방지되거나 억제되는 것으로 간주된다.
결합의 예방 또는 억제는 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 결정할 수 있다. 이러한 방법에는 Biacore 분석, Blitz 분석 및 Scatchard 플롯이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 인간 CD47의 인간 SIRPa v1에 대한 결합의 감소 또는 억제는 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체가 SIRPa v1과 CD47 사이의 상호작용을 감소시키는 것을 의미한다. 다시 말하면, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 인간 CD47의 인간 SIRPa v1에 대한 결합을 부분적으로 또는 완전히 억제하거나, 즉 인간 SIRPa v1에 특이적으로 결합하고 인간 SIRPa v1과 인간 CD47 사이의 상호 작용을 길항하는 것을 의미한다. 특히, 항-인간 SIRPa v1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 결합 분석에 있어서 음성 대조군 분자와 비교하여 인간 CD47의 인간 SIRPa v1에 대한 결합을 적어도 50 %, 바람직하게는 60 %, 더 바람직하게는 70 %, 더 바람직하게는 80 %, 가장 바람직하게는 90 %, 일 구현예에서는 100 % 감소시키거나 억제하는 능력을 갖는다. 특히, 항-SIRPa v1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 CD47의 인간 SIRPa v1에 대한 결합을 50 % 내지 100 %, 보다 바람직하게는 60 % 내지 90 %로 감소시키거나 억제하는 능력을 갖는다.
본 발명에 따르면, 항체(또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체)가 특히 Blitz 분석에 의한 SIRPa v2 결합 경쟁 분석에서 인간 CD47의 KD 값을 5 log보다 높게, 바람직하게는 4 log보다 높게, 더 바람직하게는 3 log보다 높게, 더 바람직하게는 2 log보다 높게, 가장 바람직하게는 1 log보다 높게 증가시키지 않는 경우, 인간 CD47의 인간 SIRPa v2에 대한 결합을 방지하거나 억제하지 않는다고 간주할 수 있다. 다른 방안으로는, 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체가 결합 분석에서 음성 대조군 분자와 비교하여 인간 CD47과 인간 SIRPa v2의 결합을 25 % 이상 감소시키지 않는 경우에, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체는 인간 CD47의 인간 SIRPa v2에 대한 결합을 예방하거나 억제하지 않는 것으로 간주할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 SIRPa v2에 대한 전이적 결합을 나타낼 수 있지만, 인간 CD47이 인간 SIRPa v2에 결합하는 것을 방지하거나 억제하지 않는다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 항-인간 항체, 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체는 인간 CD47의 인간 SIRPa v1에 대한 결합을 상당히 억제, 감소, 길항 또는 경쟁하는 반면에, 인간 CD47과 인간 SIRPa v2의 결합을 감소, 길항, 억제 또는 경쟁하지 않는다. 길항 효과는 본 출원의 실시예에 예시된 방법을 사용하여 결정할 수 있다.
SIRPa v1 양성인 피험자는 적어도 하나의 SIRPa v1 대립 유전자를 포함하는 인간, 즉 SIRPa v1에 대한 이형 접합체(SIRPa v1 및 SIRPa v2 대립 유전자 포함)나 동형 접합체(2 개의 SIRPa 포함)를 갖고 있는 인간이다. 본 발명에 따르면, 인간 SIRPa v1은 서열 번호 3의 44 번 위치 또는 서열 번호 24의 14 번 위치에 아미노산 잔기 L을 포함하거나, 서열 번호 3의 50 번 위치 또는 서열 번호 24의 20 번 위치에 아미노산 잔기 T를 포함하거나, 서열 번호 3의 52 번 위치 또는 서열 번호 24의 22 번 위치에 아미노산 잔기 T를 포함하거나, 서열 번호 3의 54 번 위치 또는 서열 번호 24의 24 번 위치에 아미노산 잔기 R을 포함하거나, 서열 번호 3의 57 번 위치 또는 서열 번호 24의 27 번 위치에 아미노산 잔기 A를 포함하거나, 서열 번호 3의 75 번 위치 또는 서열 번호 24의 45 번 위치에 아미노산 잔기 G를 포함하거나, 서열 번호 3의 95 번 위치 또는 서열 번호 24의 65 번 위치에 아미노산 잔기 D를 포함하거나, 서열 번호 3의 96 번 위치 또는 서열 번호 24의 36 번 위치에 아미노산 잔기 L을 포함하거나, 서열 번호 3의 100 번 위치 또는 서열 번호 24의 70 번 위치에 아미노산 잔기 N을 포함하거나, 서열 번호 3의 107 번 위치 또는 서열 번호 24의 77 번 위치에 아미노산 잔기 R을 포함하거나, 서열 번호 3의 109 번 위치 또는 서열 번호 24의 79 번 위치에 아미노산 잔기 G를 포함하거나, 서열 번호 3의 130 번 위치 또는 서열 번호 24의 100 번 위치에 아미노산 잔기 D를 포함하거나, 서열 번호 3의 132 번 위치 또는 서열 번호 24의 102 번 위치에 아미노산 잔기 V를 포함하는 SIRPa로 정의 할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 인간 SIRPa v1은 서열 번호 132의 132 번 위치에 아미노산 잔기 V와 서열 번호 3의 130 번 위치에 아미노산 잔기 D를 포함하거나, 서열 번호 24의 100 번 위치와 102 번 위치에 아이노산 잔기 D와 아미노산 잔기 V를 각각 포함한다. 다른 방안으로, SIRPa v1은 아미노산 서열에 서열 번호 1의 서열을 포함하는 SIRPa 이소 폼으로 정의할 수 있는 반면, SIRPa v2 이소 폼은 아미노산 서열에 서열 번호 1의 서열을 포함하는 SIRPa 이소 폼으로 정의할 수 있다. 또 다른 방안으로, SIRPa v1 양성인 피험자는 게놈이 SIRPa 대립 유전자 내에 서열 번호 3의 130 번 위치와 132 번 위치에, 또는 서열 번호 24의 100 번 위치와 102 번 위치에 각각 아미노산 잔기 D와 아미노산 잔기 V를 갖는 SIRPa 단백질로 번역되는 SIRPa RNA를 암호화하는 유전자를 포함하는 개체로 정의할 수 있다.
본 발명의 발명자들은 일부 항-인간 SIRPa 항체가 SIRPa의 서로 상이한 이소폼에 동일하게 결합하지 않으며, 특히 일부 항체가 SIRPa v1 양성인 피험자에게 발병한 질병 또는 질환, 특히 CD47 및/또는 SIRPa가 관련된 질병, 특히 CD47이 SIRPa v1 양성인 피험자에 과다 발현되는 질병의 치료 및 예방에 유용하여 해당 질병을 억제하거나 질병의 진행을 늦추거나 그 질병과 관련된 증상을 감소시킬 수 있다는 사실을 예기치 않게 관찰하였고 이를 바탕으로 본 발명을 착안하였다.
본 발명의 일 구현예에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 감염성 질환, 만성 염증성 질환, 자가 면역 질환, 신경 질환, 뇌 손상, 신경 손상, 적혈구 증가증, 혈색소 침착증, 외상, 패혈성 쇼크, 만성 감염성 질환, 특히 슈도모나스 및 CMV (거대 세포 바이러스) 감염성 질환, 섬유증, 죽상 경화증, 비만, 2형 당뇨병, 흑색종, 및 이식 기능 장애로 이루어진 군에서 선택되는 질병의 치료 및/또는 예방에 이용된다. 일 구현예에서, 상기 항체는 암, 특히 염증성 암과 침윤성 골수 세포를 갖는 암, 특히 침윤된 수지상 세포 및/또는 골수 유래 억제 세포(MDSC) 및/또는 종양 관련 대식 세포(TAM)를 갖는 암의 예방 및/또는 치료에 이용된다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 항체는 흑색종, 외상 또는 패혈성 쇼크의 치료 및/또는 예방에 이용된다. 일 구현예에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 질병, 특히 암, 특히 염증성 암과 침윤된 골수 세포를 갖는 암, 특히 침윤된 수지상 세포 및/또는 MDSC 및/또는 TAM 세포를 갖는 암에 대한 치료적 백신 접종에 이용된다. 일 구현예에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 CD47이 과발현되는 질병의 치료 및/또는 예방에 이용된다. 다른 구현예에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 흑색종의 치료 및/또는 예방에 이용된다. 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 이용함으로써 항원 전달 세포(APC)에 의한 항원의 교차 전달, 특히 APC에 의한 T 세포에 대한 항원의 교차 전달, 특히 수지상 세포에 의한 CD8 + T 세포에 대한 항원의 교차 전달을 향상시킬 수 있다. 항원의 교차 전달이 증가하기 때문에, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 상기 기재된 질병, 특히 SIRPa v1 양성인 피험자에 발병한 암, 특히 CD47의 과발현과 관련된 질병, 보다 특별히는 암 세포나 종양 세포에 의한 CD47의 과발현과 관련된 질병에 대한 치료적 백신 접종에 유용하다. CD47의 과발현은 암 세포의 CD47 발현과 동일한 조직에서 얻은 건강한 세포의 CD47 발현을 비교하여 평가할 수 있다. CD47 발현은 RT-qPCR를 이용한 mRNA의 정량 또는 유동 세포 분석, 웨스턴 블롯, ELISA 등에 의한 단백질 정량과 같은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 평가할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 유두종 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 메르켈 세포 폴리오마 바이러스, 인간 면역 결핍 바이러스, 인간 T-세포 백혈병 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스 8, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 및 세포 거대 바이러스로 이루어진 군, 또는 CTNNB1 유전자, CASP8 유전자, HER2 유전자, P53 유전자, KRAS 유전자, NRAS 유전자의 항원으로 이루어진 군에서 유래한 단일점 돌연변이된 항원의 군, 또는 종양 항원, 특히 RAS 종양 유전자, BCR-ABL 종양 항원, ETV6-AML1 종양 항원, 흑색종 항원 암호화 유전자(MAGE), BAGE 항원, GAGE 항원, ssx 항원, ny-eso-1 항원, cyclin-A1 종양 항원, MART-1 항원, gp100 항원 , CD19 항원, 전립선 특이 항원, 전립선 산성 포스파타제 항원, 암 배아 항원, 알파 태아 단백 항원, 암종 항원 125, 뮤신 16 항원, 뮤신 1 항원, 인간 텔로머라제 역전사 효소 항원, EGFR 항원, MOK 항원, RAGE-1 항원, PRAME 항원, 야생형 p53 항원 , 종양 유전자 ERBB2 항원, 시알릴-Tn 종양 항원, Wilms 종양 1 항원, 메조텔린 항원, 탄수화물 항원, B-카테닌 항원, MUM-1 항원, CDK4 항원, 및 ERBB2IP 항원, 특히 멜란-A 흑색종 종양 관련 항원(TAA)으로 이루어진 군에서 발생하거나 유래한 종양 항원으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 항원이 발현되었거나 과발현된 암의 예방 및/또는 치료에 이용된다. 이에 대안적으로 또는 보완적으로, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 상기 기재된 항원으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 항원이 발현된, 특히 과발현된 암에 대한 치료적 백신 접종에 이용된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 항-인간 SIRPa v1 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체는 다음과 같은 특성을 갖는다:
(a) 인간 SIRPa v2에 특이적으로 결하지 않는다; 및
(b) 인간 CD47이 인간 SIRPg에 결합하는 것을 억제하거나 방지하지 않으며, 특히 인간 SIRPg에 결합하지 않는다.
본 발명에 따르면, 상기 항체 또는 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체는 특히 Blitz 분석에 의해 측정된 SIRPa v2에 대한 결합 친화력이 1E-8 M 미만, 보다 바람직하게는 1E-7 M 미만인 경우에, 인간 SIRPa v2에 특이적으로 결합하지 않는다고 간주할 수 있다. 인간 SIRPa v2에 특이적으로 결합하지 않는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체의 생체 이용률은 SIRPa v1 양성인 피험자가 SIRPa v1에 대한 이형 접합체를 가질 때 향상 될 수 있다.
본 발명에 따르면, 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체가 특히 Blitz 분석을 이용한 SIRPg 결합 경쟁 분석에서 인간 SIRPg에 대한 인간 CD47의 KD 값을 5 log보다 낮게, 바람직하게는 4 log보다 낮게, 더 바람직하게는 3 log보다 낮게, 더욱 바람직하게는 2 log보다 낮게, 가장 바람직하게는 1 log보다 낮게 증가를 유도하지 않거나 유도하는 경우, 인간 CD47이 인간 SIRPg에 결합하는 것을 방지하거나 억제하지 않는다고 간주할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체가 특히 Blitz 분석에 따른 SIRPg에 대한 KD 값이 10E-8 M 초과, 바람직하게는 10E-7 M 초과, 보다 바람직하게는 10E-6 M 초과인 경우에 인간 SIRPg에 대해 특이적으로 결합하지 않는다.
SIRPa v1 양성인 피험자에서 발병하는 질병의 치료 및/또는 예방에 사용하기위한 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체는 또한 다음 특성 중 1 개 이상, 특히 2 개 이상, 특히 3 개 이상의 특성을 갖는다:
(a) 10E-8 M 이상, 특히 10E-9 M 이상, 더 바람직하게 10E-10 M 이상의 친화력 (KD)으로 인간 SIRPa v1과 결합한다; 그리고/또는
(b) 특히 체내에서 인간 T 세포의 증식 및/또는 활성화를 억제하지 않는다; 그리고/또는
(c) 대식 세포의 활성화를 향상시킨다; 그리고/또는
(d) 인간 T 세포, 특히 인간 CD8+ T 세포에 대하여 항원 전달 세포에 의한 적어도 하나의 항원의 교차 전달을 향상시킨다.
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체의 인간 SIRPa v1에 대한 결합 능력은 예를 들어 SPR (Surface Plasmon Resonance, (예) Biacore), ELISA, 유동 세포 분석, 또는 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 앞서 설명한 바와 같이 평가할 수 있다.
특히 체내 인간 T 세포의 증식 및/또는 활성화는 당 업계에 공지된 방법, 특히 티미딘 혼입(incorporation) 방법과 같은 본 발명의 실시예에서 기술된 방법에 따라 평가할 수 있다. 일 구현예에서, 항-SIRPa v1 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 이의 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체를 사용함으로써 음성 대조군과 비교하여 T 세포의 증식을 20% 이상 감소시키거나 억제하지 않는다. 항 인간 CD47 항체의 사용과는 반대로, 항-인간 SIRPa v1 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체의 사용은 인간 T 세포의 증식에 유의미한 영향을 주지 않으나, 항-CD47 항체는 인간 T 세포의 증식을 억제한다.
인간 대식 세포의 활성화는 본 발명의 실시예에 기술된 방법을 포함하여 다양한 방법에 따라 평가할 수 있다. 일 구현예에서, 대식 세포는 음성 대조군과 비교하여 케모카인 MIP-1a / CCL-3 및/또는 케모카인 MIP-1b / CCL4의 분비가 증가할 때, 특히 케모카인 MIP-1a / CCL-3 및/또는 케모카인 MIP-1b / CCL4의 분비가 음성 대조군에 비해 20 % 이상 증가할 때 활성화 된다.
인간 T 세포, 특히 인간 CD8+ T 세포에 대하여 항원 전달 세포에 의한 적어도 하나의 항원의 교차 전달은 본 발명의 실시예에 기재된 방법을 포함하여 다양한 방법에 따라 평가할 수 있다. 특히, T 세포에 의한 IL-2의 분비가 특히 20 % 이상, 보다 바람직하게는 50 % 이상 증가하면 교차 전달이 향상되었다고 간주한다. 대안적으로, 교차 전달은 T 세포에 의한 IFNg의 분비가 특히 20 % 이상, 더욱 바람직하게는 50 % 이상 증가할 때 향상되었다고 본다.
본 발명은 또한 앞서 상세히 설명한 바와 같은 사용을 위한 항체 또는 그의 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체의 생산 및/또는 선택하기 위한 폴리펩티드, 특히 항원의 이용에 관한 것이다. 따라서, 본 발명에서는 특히 항-인간 SIRPa v1 항체의 생산, 및/또는 이러한 항체의 선택 및/또는 생산, 및/또는 이러한 항체의 결합 친화력 시험에 유용한 폴리펩티드를 제공한다. 이를 위해, 본 발명은 또한 인간 CD47이 인간 SIRPa v1에 결합하는 것을 억제하고 인간 CD47이 인간 SIRPa v2에 결합하는 것을 방지하거나 감소시키지 않고, 특히 인간 SIRPa v2에 특이적으로 결합하지 않는 항체, 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체의 선택에 사용하기 위하여, 서열 번호 1 (KGSPDDV) 또는 서열 번호 4 (KFRKGSPDDVE) 또는 서열 번호 25 (DDVEFKSGAGTELSVR)로 구성된 인간 SIRPa v1의 에피토프를 포함하거나 이로 구성된 폴리펩티드, 특히 항원을 제공한다.
서열 번호 1은 인간 CD47이 인간 SIRPa v1에 결합하는 것은 억제하고 인간 CD47이 SIRPa v2에 결합하는 것을 억제하지 않는 SIRPa v1 이소폼에 대하여 상당한 결합 능력을 가진 항-인간 SIRPa 항체에 의해 인식되는 에피토프 서열에 해당한다. 따라서, 서열 번호 1, 서열 번호 4 또는 서열 번호 25의 아미노산 인 에피토프 서열을 포함하는 폴리펩티드는 SIRPa v1 양성인 피험자의 질병의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있는 항체의 생산에 유용할 수 있다. 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체와 에피토프(또는 에피토프를 포함하는 영역) 사이의 특이적 결합은 항체가 특정 단백질 또는 항원(여기서는 SIRPa v1)에서 에피토프(에피토프를 포함하는 영역)에 대해 상당한 친화력을 나타낸다는 것을 의미한다. "상당한 친화력(appreciable affinity)" 또는 "특이적 결합(specific binding)" 또는 "특이적으로 결합(specifically bind to)" 은 약 10E-8 M (KD) 이상의 친화력을 갖는 결합을 포함한다. 바람직하게는, 결합 친화력이 10E-8 M (KD) 내지 10E-12 M (KD), 선택적으로 10E-8 M (KD) 내지 10E-10 M (KD), 특히 10E-8 M (KD) 이상인 경우에 결합이 특이적이라고 할 수 있다. 결합 도메인이 표적과 특이적으로 반응하거나 결합하는지 여부는 특히 상기 결합 도메인과 표적 단백질 또는 항원과의 반응을 상기 결합 도메인과 표적 단백질이 아닌 다른 단백질이나 항원과의 반응과 비교함으로써 간단히 결정할 수 있다. 상기 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"은 항체가 단일 표적 분자를 인식하고 이에 결합한다는 것을 의미하지 않고, 항체가 다른 분자에 비해 표적 분자에 대해 더 높은 결합 친화력을 가지며 특히 앞서 상술한 바와 같이 표적 분자에 대하여 소정의 친화력 이상의 결합 친화력을 갖는 것을 의미한다. 네거티브한 형태로 사용되는 경우, 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합"은 항체가 낮은 친화력을 가지고 표적 분자를 인식하거나, 표적 분자를 인식하지 않는 것을 의미하고, 즉 항체와 표적 분자 사이의 결합이 특이적이지 않다는 것을 의미한다. 바람직하게는, 결합 친화도가 10E-8 M (KD) 미만인 경우 결합이 특이적이지 않은 것으로 인식된다. 특이적이라고 여겨지는 결합에 관련된 분자들은 특히 SIRPg 및 SIRPa 이소폼이다.
본 발명자들은 본 발명의 실시예에서 2 개의 특정 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) (즉, SNP 15 및 SNP 16, SNP 17에 해당하는 이들의 조합)이 본 발명에 따라 사용되는 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체가 인간 SIRPa v2를 인식하지 못하는 이유라는 것을 입증하였다. 두 SNP는 모두 서열 번호 1, 서열 번호 4 및 서열 번호 25의 에피토프 내에 위치한 아미노산 잔기를 암호화한다. 이와 같은 SIRPa의 특정 영역의 다형성으로 인해, 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체는SIRPa v1에 결합할 수 있고, 인간 CD47과 인간 SIRPa v2의 결합을 손상시키지 않으면서 인간 CD47과 인간 SIRPa v1의 결합을 방해할 수 있다. 더욱이, 이러한 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체는 또한 인간 CD47이 인간 SIRPg에 결합하는 것을 방지하거나 억제할 수 없다. 특히, 이러한 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체는 인간 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않는다.
서열 번호 1의 에피토프를 포함하는 폴리펩티드는 또한 적어도 하나의 다른 에피토프, 서열 번호 5의 에피토프 (SLIPVGP) 및/또는 서열 번호 6의 에피토프 (GRELIYNQKEGH)를 포함할 수 있으며, 이 두 가지 에피토프는 항-인간 SIRPa v1 항체, 그의 항원 결합 단편 및 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체에 의해 인식되는 선형 에피토프들이다. 대안적으로, 폴리펩티드는 또한 서열 번호 7 (ELIYNQKEGHFPR) 및 서열 번호 8 (RNNMDFSIRIGN)을 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 에피토프를 추가로 포함 할 수 있으며, 둘 다 항-인간 SIRPa v1 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체 및 변형 항체에 의해 인식되는 형태(conformational) 에피토프이다.
서열 번호 1 또는 서열 번호 4 또는 서열 번호 25의 에피토프를 포함하는 폴리펩티드 또는 항원은, 예를 들어, 비인간 동물, 특히 비인간 포유 동물을 면역화하고 상기 면역화된 비인간 동물의 생성된 혈청 또는 B 세포를 수집하여 폴리펩티드 내에 포함된 항원 (들)에 대한 항체를 얻음으로써 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체의 제조(또는 생산)에 사용될 수 있다. 회수된 항체는 인간화되거나 변형되어 그의 항원 결합 단편, 또는 이중 기능성 또는 이중 특이적 항체를 얻을 수있다. 회수된 B 세포는 항-인간 SIRPa v1 항체 생산을 위해 하이브리도마로 형질 전환될 수 있다. 생성된 항체는 하기에 상세히 설명된 선택 방법에 따라 회수 및 선택할 수 있다.
본 발명은 또한 서열 번호 1 또는 서열 번호 4 또는 서열 번호 25의 에피토프를 포함하는 폴리 펩티드, 특히 항원의 생산을 위한 인간 SIRPa v1의 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 이용에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 26의 적어도 일부를 포함할 수 있고, 상기 부분은 서열 번호 1 또는 서열 번호 4 또는 서열 번호 25의 에피토프를 암호화하는 핵산 잔기를 포함하는 상기 부분은 SIRPa v1 단백질을 암호화하는 cDNA에 해당한다. 폴리뉴클레오티드가 서열 번호 1, 서열 번호 4 또는 서열 번호 25의 아미노산 잔기를 포함하는SIRPa v1의 에피토프를 포함하는 폴리 펩티드를 생산하기 위해 플라스미드와 같은 발현 벡터 내에 삽입되는 경우, 상기 폴리뉴클레이티드를 생산 시스템에 사용할 수 있다. 일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 적어도 서열 번호 1 또는 서열 번호 4 또는 서열 번호 25의 아미노산 잔기와, 서열 번호 5 및/또는 서열 번호 6의 아미노산 잔기, 또는 서열 번호 7 및/또는 서열 번호 8의 아미노산 잔기를 포함하는 서열 번호 26의 부분을 암호화한다.
본 발명은 또한 인간 SIRPa v1에 특이적으로 결합하고 인간 CD47이인간 SIRPa v1에 결합하는 것을 감소 또는 억제하고, 인간 CD47이인간 SIRPa v2에 결합하는 것을 방지하거나 억제하지 않는 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체를 선택 및 회수하는 방법에 관한 것이다. 상기 선택 및 회수 방법은 다음 단계를 포함한다:
(a) 화합물(즉, 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체)이 인간 SIRPa v1에 특이적으로 결합하는 능력, 특히 화합물이 서열 번호 1, 서열 번호 4 또는 서열 번호 25를 포함하거나 이로 구성된 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력, 특히 화합물이 서열 번호 3의 130 번 위치와 132 번 위치에 각각 위치하거나 서열 번호 24의 100 번 위치와 102 번 위치에 각각 위치한 아미노산 잔기 D 및 아미노산 잔기 V에 특이적으로 결합하는 능력을 시험하는 단계; 및
(b) 화합물이 인간 SIRPa v1에 대한 인간 CD47의 결합을 감소 또는 억제하는 능력을 시험하는 단계; 및
(c) 화합물이 인간 SIRPa v2에 대한 인간 CD47의 결합을 방지하거나 억제하지 않는 능력을 시험하는 단계; 및/또는
(d) 특히 화합물이 인간 SIRPg에 대한 인간 CD47의 결합을 방지하거나 억제하지 않는 능력을 시험하는 단계;
그리고 선택적으로:
(e) 화합물이 인간 SIRPa v2에 특이적으로 결합하지 않는 능력을 시험하는 단계;
(f) 화합물이 인간 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않는 능력을 시험하는 단계.
선택 및 회수된 화합물은 다음과 같은 특성을 가져야 한다:
- 특히 적어도 1E-9 M, 특히 10E-9 M의 친화력을 가지고, 더 바람직하게는 적어도 1E-10 M, 특히 10E-10 M의 친화력을 가지고 인간 SIRPa v1에 특이적으로 결합한다;
- 인간 CD47이 인간 SIRPa v1에 결합하는 것을 감소시키거나 억제한다;
- 인간 CD47이 인간 SIRPa v2에 결합하는 것을 방지하거나 억제하지 않는다; 그리고
- 특히 인간 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않는다.
선택 및 회수된 화합물은 또한 다음 특성 중 적어도 하나, 바람직하게는 다음 특성 중 2 개 이상의 특성을 가질 수 있다:
- 인간 SIRPg에 대한 인간 CD47의 결합을 방지하거나 억제하지 않는다; 그리고/또는
- 인간 SIRPa v2에 특이적으로 결합하지 않는다.
화합물의 결합 특이성은 예를 들어 SPR (Surface Plasmon Resonance, e.g. Biacore), ELISA 또는 Western Blot 분석에 의해 위에서 이미 설명된 방법에 따라 평가할 수 있다. 특히, 결합 친화도가 10E-8 M 이상, 보다 바람직하게는 10E-9 M 이상이거나, 결합 친화도가 10E-8 M과 10E-11 M 사이, 보다 바람직하게는 10E-9 M 내지 10E-10 M 사이에 포함될 때, 화합물은 SIRPa v1에 특이적으로 결합한다. 결합 친화도가 1E-8 M보다 낮을 때에는 화합물은 인간 SIRPa v2 또는 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않는다. 인간 SIRPa v1, SIRPa v2 및 SIRPg에 대한 CD47의 결합의 방지 또는 억제는 본 발명에 이미 설명한 방법, 특히 경쟁 분석, 특히 Blitz 분석에 의해 평가할 수 있다. 특히 Blitz 분석에 의한 SIRPa v1, SIRPA v2 또는 SIRPg 결합 경쟁 분석에서 인간 CD47의 KD 값을 5 log보다 높게, 바람직하게는 4 log보다 높게, 더 바람직하게는 3 log보다 높게, 더욱 바람직하게는 2 log보다 높게, 가장 바람직하게는 1 log보다 높게 증가시키지 않으면, 상기 화합물은 인간 CD47이 인간 SIRPa v1, SIRPa v2 또는 SIRPg에 결합하는 것을 방지하거나 억제하지 않는 것으로 간주할 수 있다. 이와 반대로, 특히 Blitz 분석에 의한 SIRPa v1, SIRPA v2 또는 SIRPg 결합 경쟁 분석에서 인간 CD47의 KD 값을 1 log보다 높게, 바람직하게는 2 log보다 높게, 더 바람직하게는 3 log보다 높게, 더욱 바람직하게는 4 log보다 높게, 가장 바람직하게는 5 log보다 높게 증가시키면, 상기 화합물은 인간 CD47이 인간 SIRPa v1, SIRPa v2 또는 SIRPg에 결합하는 것을 방지하거나 억제하는 것으로 간주할 수 있다.
일 측면에 있어서, 화합물을 선택하는 방법은 하기의 단계 중 하나 이상, 특히 하기의 단계 중 2 가지 이상, 특히 하기의 단계 중 3 가지 이상, 특히 하기의 단계 중 4 가지 이상 포함 할 수 있다:
(i) 화합물의 존재하에 T 세포 증식을 시험하는 단계; 및/또는
(ii) 화합물의 존재하에 T 세포 활성화를 시험하는 단계; 및/또는
(iii) 화합물의 존재하에 대식 세포 활성화를 시험하는 단계; 및/또는
(iv) 항원 전달 세포, 특히 수지상 세포에 의한 항원, 특히 종양 항원, 특히 멜란-A 흑색종 종양 관련 항원 (TAA)의 인간 T 세포, 특히 CD8+ T 세포로의 교차 전달을 화합물의 존재하에 시험하는 단계.
이 구현예에 따르면, 선택된 화합물은 하기의 특성 중에 하나 이상, 바람직하게는 2 개 이상, 더 바람직하게는 3 개 이상, 가장 바람직하게는 4 개 이상을 나타낼 수 있다:
- 인간 T 세포 증식을 억제하지 않는다; 및/또는
- 인간 T 세포 활성화를 억제하지 않는다; 및/또는
- 대식 세포의 활성화를 향상시킨다; 및/또는
- 항원 전달 세포에 의한 인간 T 세포로 항원의 교차 전달을 향상시킨다.
T 세포 증식 및 T 세포 활성화는 다양한 방법에 의해 판단할 수 있다. 예를 들어, T 세포의 증식은 H3-티미딘의 혼입을 이용하여 측정할 수 있다. 특히 음성 대조군에 비해 T 세포의 증식이 20 % 이하로 감소하면 화합물이 T 세포의 증식을 억제하지 않는 것으로 판단된다. T 세포 활성화는 예를 들어, 유동 세포 분석, 웨스턴 블롯, ELISA 등을 이용하여, 그리고/또는 본 발명의 실시예에 기재된 것과 같이 IFNg 및/또는 IL2의 분비를 평가하여 CD25 및/또는 CD69의 발현을 분석함으로써 평가할 수 있다. 교차 전달은 다양한 방법, 특히 본 발명의 실시예에서 설명한 방법에 의해 평가할 수 있다. 특히, T 세포에 의한 IL-2의 분비가 음성 대조군에 비해 20 % 이상, 보다 바람직하게는 50 % 이상 증가하면, 교차 전달이 향상된 것으로 간주한다. 대안적으로, T 세포에 의한 IFNg의 분비가 음성 대조군과 비교하여 20 % 이상, 보다 바람직하게는 50 % 이상 증가하면, 교차 전달이 향상된 것이다. 대식 세포의 활성화는 다양한 방법, 특히 본 발명의 실시예에 기재된 방법에 따라 평가할 수 있다. 특히, 대식 세포의 활성화는 케모카인 분비량에 의해 평가할 수 있다. 특히, 케모카인 MIP-1a/CCL-3 및/또는 케모카인 MIP-1b/CCL4의 분비가 음성 대조군에 비해 증가하면, 특히 케모카인 분비의 증가가 음성 대조군에 비하여 20 % 이상이면, 대식 세포가 활성화된 것이다.
또한, 본 발명은 특히 화합물이 항-인간 SIRPa 화합물인 경우, 항-인간 SIRPa 화합물(즉, 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체)을 인간 피험자에 투여하는 치료에서 화합물의 효과의 가능성을 평가하기 위한 시험관내 또는 체외 방법을 제공한다. 이 방법은 혈액, 세포, 생체 조직 등과 같이 피험자로부터 사전에 획득한 생물학적 샘플에서 SIRPa v1의 존재 여부를 결정하는 것을 포함한다. SIRPa v1의 존재 여부는 본 발명에서 정하였거나, 본 발명에 기재된 방법에 의해 생산되거나, 본 발명에 기재된 방법에 따라 선택되는 항-SIRPa v1 화합물을 사용하여 결정한다. 샘플 내 SIRPa v1이 검출되면 항-인간 SIRPa v1 화합물을 사용한 치료가 효과적일 가능성이 있음을 나타낸다. 다시 말하면, 본 발명은 항-SIRPa 화합물로 효과적으로 치료될 가능성이 있는 환자를 확인하기 위한 시험관내 또는 체외 방법을 제공하며, 상기 방법은 SIRPa v1/v1 환자, v1/v2 환자 및 v2/v2 환자로 이루어진 군에서 환자의 상태를 확인하는 단계를 포함한다. 여기서, v1/v1 그룹 또는 v1/v2 그룹으로 분류된 환자는 본 발명에 따라 사용되는 항-SIRPa 화합물에 의해 효과적으로 치료될 가능성이 높다. 특히 SIRPa v1/v1 환자에게 투여되는 항-SIRPa 화합물의 치료 용량은 SIRPa v1/v2 환자에게 투여되는 치료 용량과 다를(즉, 덜 중요 할) 수 있다. 대안적으로, 상기 방법은 SIRPa v1 단백질을 암호화하는 유전자 산물(RNA 또는 DNA)의 검출을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 방법은 피험자의 SIRPa 대립 유전자(v1 대립 유전자 또는 v2 대립 유전자)를 결정하는 단계를 포함한다. 적어도 하나의 SIRPa 대립 유전자가 서열 번호 1 또는 서열 번호 4 또는 서열 번호 25의 아미노산 잔기를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 경우, 인간 피험자는 SIRPa v1- 양성으로 간주한다. 대안적으로, 인간 피험자의 SIRPa 대립 유전자들 중에 하나 이상이 엑손 3 내에 서열 번호 3의 132 번 위치 또는 서열 번호 24의 102 번 위치, 또는 서열 번호 1의 1 번 또는 4 번 위치에 있는 아미노산 잔기 V, 또는 서열 번호 25의 첫 번째 아미노산 잔기 V를 암호화하는 SIRPa v1 SNP 15 (rs115287948) 및 16 (rs114499682)로 구성된 돌연변이 또는 SIRPa v1 SNP 17을 포함하거나, SIRPa 대립 유전자들 중에 하나 이상이 SIRPa 내에 아미노산 잔기 5' DDV 3'을 암호화하는 핵산 서열을 엑손 3 내에 포함하는 경우, 인간 피험자는 SIRPa v1- 양성으로 간주한다.
SIRPa의 SNP는 문서로 잘 입증되어 있으며 Genbank와 같은 온라인 데이터베이스에서 정보를 얻을 수 있다. 참조 SNP ID 번호 S 또는 "rs"는 NCBI 데이터베이스에서 사용할 수 있다. SIRPa v1 SNP 15 및 16은 본 발명의 실시예에 상세히 설명된 바와 같이 각각 핵산 잔기 g 및 t에 상응한다. 따라서, 상기 방법은 예를 들어 중합 효소 연쇄 반응에 의한 SIRPa 대립 유전자의 결정을 포함할 수 있으며, 여기서 SIRPa v1- 양성 피험자의 판단 여부는 인간 SIRPa 엑손 3의 적어도 일부에 상등하는 핵산을 포함하는 SIRP 서열을 검출하는 것을 포함한다. 여기서, SIRPa v1 SNP 15 및 16은 앞서 상세히 설명한 바와 같이 적어도 하나의 SIRPa 대립 유전자, 특히 두 개의 SIRPa 대립 유전자 내에서 결정된다.
이를 위하여, 본 발명은 또한 피험자의 SIRPa 상태를 결정하기 위한 부품 키트에 관한 것으로, 상기 키트는 특히 중합 효소 연쇄 반응 (PCR), 특히 역방향 전사 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR)을 이용하여 SIRPa 유전자(예: gDNA) 또는 SIRPa 전사체(예: mRNA 또는 cDNA)의 적어도 한 부분을 증폭하기에 적합한 한 쌍의 프라이머를 포함한다. 여기서, 특히 상기 부분은 SIRPa 엑손 3의 적어도 일부를 포함한다. 상기 부분은 적어도 상기에 규정하였거나 본 발명의 실시예에서 설명된 바와 같은 SIRPa SNP 15 및 SNP 16의 위치(localization), 또는 상기에 규정되었거나 본 발명의 실시예에서 설명된 바와 같은 SIRPa SNP 17의 위치(localization), 그리고 서열 번호 1 또는 서열 번호 4 또는 서열 번호 25의 SIRPa v1 에피토프 내에서 첫 번째 아미노산 잔기 D를 암호화하는 코돈의 위치(localization)를 포함한다. SIRPa v2를 암호화하는 핵산 서열 내에 누락된 코돈의 위치(localization)는 서열 번호 27(SIRPa v1 엑손 3) 및 서열 번호 31(SIRPa v2 엑손 3)을 정렬함으로써 평가할 수 있다. 따라서, 프라이머 쌍은 SIRPa v1 및 SIRPa v2를 암호화하는 두 개의 핵산 서열 모두를 가지고 어닐링 할 수 있는 제 1 프라이머와 SIRPa v1의 핵산 서열로만 어닐링 할 수 있는 제 2 프라이머를 포함할 수 있다. 이러한 프라이머의 핵산 서열은 서열 번호 27(SIRPa v1 엑손 3)과 서열 번호 31(SIRPa v2 엑손 3)을 정렬함으로써 당업자에 의해 결정될 수 있다. 일 구현예에서, SIRPa v1을 암호화하는 핵산 서열과 어닐링 할 수 있지만 SIRPa v2를 암호화하는 핵산 서열과는 어닐링 할 수 없는 프라이머는 SIRPa v1 SNP의 위치(localization)에 따라 결정될 수 있으며, 복수의 SIRPa v1 SNP를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, SIRPa v1 특이적 프라이머는 서열 번호 1 또는 서열 번호 4 또는 서열 번호 25의 SIRPa v1의 에피토프 내에서 적어도 아미노산 자기 5'DDV 3'을 암호화하는 핵산 서열 내에서 특히 엄격한 조건에서 어닐링 할 수 있다. 대안으로서, 상기 키트는 두 개 모두 SIRPa v1이나 SIRPa v2 중에 어느 하나를 암호화하는 핵산 서열과 어닐링할 수 있는 한 쌍의 프라이머를 포함하며, 따라서 유전자의 부분 또는 SIRPa 엑손 3의 적어도 일부를 포함하는 전사체의 부분을 증폭시킬 수 있다. 여기서, 상기 부분은 적어도 상기에 규정되었거나 본 발명의 실시예에서 설명된 바와 같은 SIRPa SNP 15 및 SNP 16의 위치(localization), 또는 상기에 규정되었거나 본 발명의 실시예에서 설명된 바와 같은 SIRPa SNP 17의 위치(localization), 그리고 서열 번호 1 또는 서열 번호 4 또는 서열 번호 25의 SIRPa v1 에피토프 내에서 첫 번째 아미노산 잔기 D를 암호화하는 코돈의 위치(localization)를 포함한다. 여기서, 상기 키트는 서열 번호 1 또는 서열 번호 4 또는 서열 번호 25의 SIRPa v1의 에피토프 내에서 적어도 아미노산 잔기 5' DDV 3'을 코딩하는 핵산 서열과 어닐링 할 수 있는 프로브(즉, 핵산 산 프로브), 특히 태그가 부착된 프로브이다.
또한, 본 발명은 질병의 중증도를 진단하는 시험관내 또는 체외 방법, 특히 개인 맞춤 의약품에 사용하기에 적합한 진단 방법을 제공하며, 여기서 본 발명에 기재된 방법에 따라 생산되거나 본 발명에 기재된 방법에 따라 선택되는 항-인간 SIRPa v1 화합물(즉, 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 모방체 또는 변형 항체)은 피험자로부터 사전에 획득한 샘플에서 SIRPa v1 양성인 세포를 검출하는데 사용된다. 이 때, 상기 방법은 SIRPa v1의 발현을 정량화하는 것을 포함한다. SIRPa v1 발현의 정량화는 예를 들어, 표적 단백질에 결합된 항체의 정량화에 의해 당 업계에 공지된 방법에 따라 평가할 수 있다.
또한, 본 발명은 항-인간 SIRPa 항체, 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체를 이용하여 환자를 치료할지의 여부를 임상의가 결정하는 것에 지원하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 특히 본 발명에 개시된 항-SIRPa 화합물을 사용하거나 유전형 분석을 이용하여 환자의 SIRPa 대립 유전자를 결정하는 것을 포함한다. 여기서, 본 발명에 따른 항-SIRPa v1 화합물의 제 1 치료 용량을 사용하는 치료는 SIRPa v1 동형 접합체를 갖고 있는 환자에게 효과적일 가능성이 크고, 본 발명에 따른 항-SIRPa v1 화합물을 사용하는 치료는 SIRPa v2 동형 접합체를 갖고 있는 환자에게 효과적일 가능성이 적다. 그리고, 본 발명에 따른 항-SIRPa v1 화합물의 제 2 치료 용량을 사용하는 치료는 SIRPa v1/v2 이형 접합체를 갖고 있는 환자에서 효과적일 가능성이 크다. 이 때, 특히 제 2 치료 용량이 제 1 치료 용량보다 많다.
또한, 본 발명은 항-인간 SIRPa 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체를 이용하여 환자를 치료할지의 여부를 임사의가 결정하는 것을 지원하는 방법이 제공하며, 여기서 항-인간 SIRPa 화합물을 이용하여 환자를 치료하는 데에 필요한 치료 용량은 환자가 SIRPa v1/v1 동형 접합체를 가지고 있는지 또는 SIRPa v1/v2 이형 접합체를 가지고 있는지에 따라 달라진다.
또한, 본 발명은 적어도 하나의 제 2 치료 약제와 조합되는 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체, 특히 본 발명에 기재된 사용을 위한 항체, 이의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체, 또는 본 발명에 기술된 방법에 따라 생산된 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체, 또는 본 발명에 기술된 방법에 따라 선택된 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체를 포함하는 화합물의 조합을 제공한다. 상기 제 2 치료 약제는 화학 치료제, 방사선 치료제, 면역 치료제, 세포 치료제, 항생제, 및 프로바이오틱스로 구성된 군에서 선택할 수 있다. 특히, 상기 면역 치료제는 적응 면역 세포의 검사점 차단제 또는 활성화제로 이루어진 군에서 선택할 수 있고, 특히 항-PDL1, 항-PD1, 항-CTLA4, 항-CD137, 항-CD2, 항-CD28, 항-CD40, 항-HVEM, 항-BTLA, 항-CD160, 항-TIGIT, 항-TIM-1/3, 항-LAG-3, 항-2B4, 항-VISTA, 항-OX40, 항-CD40 작용제, CD40-L, TLR 작용제, 항-ICOS, ICOS-L, STING 작용제 , IDO 억제제, 종양 용해성 바이러스 및 B 세포 수용체 작용제로 이루어진 군에서 선택할 수 있다. 상기 제품의 조합은 SIRPa v1 양성인 피험자에 발병된 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다. 상기 조성물은 특히 약제학적 조성물일 수 있다. 이러한 조성물은 전신 또는 국소 투여에 사용시, 특별히 제한적이지 않지만 약제학적으로 적합한 부형제 또는 담체 또는 기제와 같은 약제학적으로 허용되는 성분을 포함할 수 있다. 약제학적으로 적합한 담체 또는 기제는 무독성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질 및 인산염 완충 식염수 용액과 같은 제형, 증류수, 오일/물 에멀젼과 같은 에멀젼, 습윤제, 덱스트로스, 식염수, 에탄올, 및 이들의 조합을 말한다.
또한, 본 발명은 (i) 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체, 그리고 (ii) 적어도 하나의 제 2 치료 약제를 포함하고, 질병, 특히 암의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한, 또는 질병, 특히 암에 대한 치료적 백신 접종에 사용하기 위한 화합물의 조합에 관한 것이다. 여기서, 상기 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체는 인간 SIRPa v1 및/또는 SIRPa v2, 특히 인간 SIRPa v1과 인간 SIRPa v2에 특이 적으로 결합하고, 인간 CD47이 SIRPA v1 및/또는 SIRPA v2에 결합하는 것을 억제하고, 특히 인간 CD47이 SIRPA v1과 SIRPA v2에 결합하는 것을 억제하고; 인간 CD47이 인간 SIRPg에 결합하는 것을 방지하거나 억제하지 않고, 특히 인간 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않고; 또는 항원 전달 세포, 특히 수지상 세포에 의한, 인간 T 세포, 특히 인간 CD8+ T 세포로의 항원, 특히 암 항원의 교차 전달을 향상시킨다. 여기서, 상기 제 2 치료 약제는 화학 치료제, 방사선 치료제, 면역 치료제, 세포 치료제, 항생제, 및 프로바이오틱스로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 제 2 치료 약제이다. 특히, 상기 면역 치료제는 적응 면역 세포의 검사점 차단제 또는 활성화제로 이루어진 군에서 선택되고, 특히 항-PDL1, 항-PD1, 항-CTLA4, 항-CD137, 항-CD2, 항-CD28, 항-CD40, 항-HVEM, 항-BTLA, 항-CD160, 항-TIGIT, 항-TIM-1/3, 항-LAG-3, 항-2B4, 항-VISTA, 항-OX40, 항-CD40 작용제, CD40-L, TLR 작용제, 항-ICOS, ICOS-L, STING 작용제 , IDO 억제제, 종양 용해성 바이러스 및 B 세포 수용체 작용제로 이루어진 군에서 선택된다.
일 구현예에서, 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체는 인간 SIRPa v1에 특이적으로 결합하고 인간 CD47이 SIRPA v1에 결합하는 것을 억제한다.
또한, 본 발명은 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체, 특히 본 발명에 기재된 사용을 위한 항체, 이의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체, 또는 본 발명에 기술된 방법에 따라 생산된 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체, 또는 본 발명에 기술된 방법에 따라 선택된 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체와 적어도 하나의 항원를 포함하는 화합물의 조합을 제공한다. 여기서, 상기 적어도 하나의 항원은 인간 유두종 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 메르켈 세포 폴리오마 바이러스, 인간 면역 결핍 바이러스, 인간 T-세포 백혈병 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스 8, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, HCV, HBC, 및 세포 거대 바이러스의 항원으로 이루어진 군, 또는CTNNB1 유전자, CASP8 유전자, HER2 유전자, P53 유전자, KRAS 유전자, NRAS 유전자의 항원으로 이루어진 군에서 유래한 단일점 돌연변이된 항원의 군, 또는 종양 항원, 특히 RAS 종양 유전자, BCR-ABL 종양 항원, ETV6-AML1 종양 항원, 흑색종 항원 암호화 유전자(MAGE), BAGE 항원, GAGE 항원, ssx 항원, ny-eso-1 항원, cyclin-A1 종양 항원, MART-1 항원, gp100 항원 , CD19 항원, 전립선 특이 항원, 전립선 산성 포스파타제 항원, 암 배아 항원, 알파 태아 단백 항원, 암종 항원 125, 뮤신 16 항원, 뮤신 1 항원, 인간 텔로머라제 역전사 효소 항원, EGFR 항원, MOK 항원, RAGE-1 항원, PRAME 항원, 야생형 p53 항원 , 종양 유전자 ERBB2 항원, 시알릴-Tn 종양 항원, Wilms 종양 1 항원, 메조텔린 항원, 탄수화물 항원, B- 카테닌 항원, MUM-1 항원, CDK4 항원, 및 ERBB2IP 항원, 특히 멜란-A 흑색종 종양 관련 항원(TAA)으로 이루어진 군에서 발생하거나 유래한 것이다. 이와 같은 화합물의 조합은 약제 또는 백신 조성물로 사용하거나, SIRPa v1 양성 피험자에 발병한 질병의 치료 또는 예방에 사용하는 데 유용 할 수 있다.
또한, 본 발명은 (i) 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체, 그리고 (ii) 적어도 하나의 항원을 포함하는 화합물의 조합을 제공한다. 여기서, 상기 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체는 중쇄 가변 도메인과 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 상기 중쇄 가변 도메인은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 여기서 HCDR1은 서열 번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고; HCDR2는 서열 번호 10 또는 서열 번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 특히 HCDR2는 서열 번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고; 그리고 HCDR3은 서열 번호 12 또는 서열 번호 13 또는 서열 번호 14 또는 서열 번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 특히 HCDR3은 서열 번호 13 또는 서열 번호 14 또는 서열 번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 특히 HCDR3은 서열 번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 상기 경쇄 가변 도메인은 서열 번호 16 번과 서열 번호 17 번으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 특히, 상기 경쇄 가변 도메인은 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 그리고, 상기 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체는 항원 전달 세포, 특히 수지상 세포에 의한 인간 T 세포, 특히 인간 CD8+ T 세포에 대한 상기 적어도 하나의 항원의 교차 전달을 향상시킨다. 그리고, 상기 적어도 하나의 항원은 인간 유두종 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 메르켈 세포 폴리오마 바이러스, 인간 면역 결핍 바이러스, 인간 T-세포 백혈병 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스 8, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, HCV, HBC, 및 세포 거대 바이러스의 항원으로 이루어진 군, 또는 CTNNB1 유전자, CASP8 유전자, HER2 유전자, P53 유전자, KRAS 유전자, NRAS 유전자의 항원으로 이루어진 군에서 유래한 단일점 돌연변이된 항원의 군, 또는 종양 항원, 특히 RAS 종양 유전자, BCR-ABL 종양 항원, ETV6-AML1 종양 항원, 흑색종 항원 암호화 유전자(MAGE), BAGE 항원, GAGE 항원, ssx 항원, ny-eso-1 항원, cyclin-A1 종양 항원, MART-1 항원, gp100 항원 , CD19 항원, 전립선 특이 항원, 전립선 산성 포스파타제 항원, 암 배아 항원, 알파 태아 단백 항원, 암종 항원 125, 뮤신 16 항원, 뮤신 1 항원, 인간 텔로머라제 역전사 효소 항원, EGFR 항원, MOK 항원, RAGE-1 항원, PRAME 항원, 야생형 p53 항원 , 종양 유전자 ERBB2 항원, 시알릴-Tn 종양 항원, Wilms 종양 1 항원, 메조텔린 항원, 탄수화물 항원, B- 카테닌 항원, MUM-1 항원, CDK4 항원, 및 ERBB2IP 항원, 특히 멜란-A 흑색종 종양 관련 항원(TAA), 또는 임의의 특정 변이 항원(신생 항원 또는 신생 에피토프)으로 이루어진 군에서 발생하거나 유래한 종양 항원으로 이루어진 군에서 선택된다. 상기 화합물의 조합은 질병, 특히 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 또는 질병, 특히 암에 대한 치료적 백신 접종에 사용하기 위한 것으로서, 여기서 항원 전달 세포, 특히 수지상 세포에 의한 인간 T 세포, 특히 인간 CD8+ T 세포에 대한 상기 적어도 하나의 항원의 교차 전달이 향상된다.
상기 질병은 특히 감염성 질환, 만성 염증성 질환, 자가 면역 질환, 신경 질환, 뇌 손상, 신경 손상, 적혈구 증가증, 혈색소 침착증, 외상, 패혈성 쇼크, 만성 감염성 질환, 특히 슈도모나스 및 거대 세포 바이러스(CMV) 감염성 질환, 섬유증, 죽상 경화증, 비만, 2형 당뇨병, 흑색종, 및 이식 기능 장애로 이루어진 군에서 선택된다. 또한, 상기 상기 질병은 암, 특히 염증성 암과 침윤된 골수 세포를 가진 암, 특히 MDSC 및/또는 TAM 세포를 가진 암, 암 전이, 특히 유방암 전이, 흑색종으로 이루어진 군에서 선택된다. 일 구현예에서, 상기 질병은 적어도 하나의 항원을 발현하는 암 세포를 포함하는 암이다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 조합은 질병, 특히 암의 치료 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 또는 질병, 특히 암에 대한 치료적 백신 접종에 사용하기 위한 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체를 포함하고, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체는 상기 질병, 특히 암에 발현된 항원의 교차 전달을 향상시키고, 상기 질병의 치료에 적합한 T 세포 반응을 유도하는데 관여한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 조합은 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 및 서열 번호 23으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 도메인을 포함하고; 특히 상기 중쇄 가변 도메인은 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 조합은 질병의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체를 포함하고, 또는 상기 조합은 (i) 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 도메인과 (ii) 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 도메인을 포함하거나 이로 구성된다.
DNA와 RNA 바이러스는 모두 인간에게 암을 유발할 수있는 것으로 밝혀졌다. Epstein-Barr 바이러스, 인간 유두종 바이러스, B 형 간염 바이러스, 및 인간 헤르페스 바이러스-8 (HHV-8, 혹은 카포시 육종 헤르페스 바이러스라고도 함)은 인간에 암을 유발할 수 있는 DNA 바이러스이다. 인간 T 림프 친화성 바이러스 1 형 및 C 형 간염 바이러스는 인간의 암에 기여하는 두 가지 RNA 바이러스이다. 따라서, 항-인간 SIRPa v1 화합물과 이들 바이러스로부터 발생하거나 유래한 항원을 포함하는 화합물의 조합을 투여하면 이들 항원의 인간 T 세포에 대한 교차 전달을 증가시킬 수 있고, 따라서 이러한 항원들을 나타내는 암 세포에 대한 반응을 향상시킬 수있다.
상기 화합물의 조합은 특히 자궁 경부암, 비인 두암, 간암 종, 카포시 육종 및 일부 백혈병에서와 같이 바이러스 항원이 발현될 때 암종의 치료에 사용하는데 유용하다 (Liao, 2006). 상기 화합물의 조합은 또한 거대 세포 바이러스 단백질이 발현되는 교모세포종의 치료에 사용하는데 유용하다. 예를 들어, 메르켈 세포 암종(MCC)은 점점 더 흔해지고 있는 피부 신경 내분비 암이며 비흑색종 피부암 사망의 주요 원인이고 인간의 암과 직접적으로 연결된 최초의 폴리오마 바이러스인 메르켈 세포 폴리오마 바이러스(MCV)와 관련되어 있다 (Chang and Moore, 2012). 상기 화합물의 조합은 또한 B 형 간염 바이러스 단백질이 발현되는 자궁 경부암 및/또는 목 종양, 피부암, 특히 면역 억제 환자 및/또는 항문암의 치료에 사용하는데 유용하다. 상기 화합물의 조합은 또한 B 세포 및 버킷 림프종, 호지킨 병, 이식 후 림프 증식성 질병, 평활근 육종, 비인두 암종 및 일부 위암과 같은 B 세포 및 T 세포 림프종과 같이 Epstein-Barr 바이러스와 관련된 악성 종양의 치료에 유용하다. 상기 화합물의 조합은 또한 항문암, 호지킨 병, 폐암, 구강암, 인후암, 일부 유형의 피부암 및 간암을 포함하여 HIV 감염과 관련된 암의 치료에 유용하다.
상기 화합물의 조합은 또한 일부 항원 성 펩티드가 발암 성 돌연변이로 인해 발생하는 암 치료에 사용하기에 유용하다. 특히 CTNNB1, CASP8 및 HER2 유전자에서 발생된 항원은 점 돌연변이를 포함할 수 있다. 흑색종, 폐암, 또는 대장암에서 보이는 미세 위성 불안정성(MSI)과 같이 돌연변이율이 높은 종양은 더 많은 돌연변이 항원을 보유할 것으로 예상된다. 다른 종양 유전자도 P53, KRAS 또는 NRAS와 같은 여러가지 암과 관련이 있다. 혈액암의 BCR-ABL 또는 ETV6-AML1과 같은 염색체 전위에서 파생된 펩티드 또는 종양 항원도 확인된다. RAS 종양 유전자를 영구적으로 활성화하는 돌연변이는 모든 인간 종양의 20 ~ 25 %에서 발견되며 췌장암과 같은 특정 유형의 암에서는 최대 90 %까지 발견된다. 상기 화합물의 조합은 또한 항원이 암-배선 세포에 의해 암호화되는 암 치료에 사용하는데 유용하다. 암 생식 세포와 관련된 종양 항원은 흑색종 항원 암호화 유전자 (MAGE)이다. X 염색체에서 25 개 이상의 기능성 유전자는 MAGE 유전자(MAGEA, MAGEB 및 MAGEC)로 정의되며, MAGEA1, MAGEA2 및 MAGEA3는 다양한 암에 관여한다. X 염색체와도 관련된 BAGE, GAGE, LAGE/NY-ESO1, SSX와 같은 다른 유전자는 다양한 암에서 발현되며 생식 계열 세포와 영양 모세포를 제외한 정상 조직에서는 발현되지 않는다. NY-ESO-1은 전이성 흑색종, 유방암, 난소암 및 폐암의 10-50%뿐만 아니라, 활막 세포 육종의 약 80%에서 발현되는 것으로 보고되었다. MAGEA3는 흑색종을 포함한 다양한 종양에서 더 자주 발현되는 TAA (종양 관련 항원) 중 하나이다. pro-proliferative 및 anti-apoptotic 속성을 가진 단백질인 cyclin-A1에서 파생된 펩티드 또는 종양 항원이 확인되었다. 이 항원은 고환과 급성 골수성 백혈병에서 발현된다.
상기 화합물의 조합은 또한 암세포가 종양 특이성이 낮은 항원을 발현하는 암 치료에 사용하는데 유용하다. 대부분의 확인된 분화 항원은 흑색종 세포뿐만 아니라 건강한 세포에도 존재한다. 티로시나아제, gp100/pmel17, Melan-A/MART-1, gp75/TRP1 또는 TRP2와 같은 단백질에서 파생된 펩티드 또는 종양 항원은 흑색종 환자 및 건강한 지원자에게도 빈번하게 나타난다. MART-1, gp100, CEA, CD19는 조직 분화 항원이고 CD19는 정상 및 악성 B 세포에서만 발현되는 종양 항원이다. 펩티드 또는 종양 항원은 또한 전립선 특이 항원(PSA) 및 전립선 산성 포스파타제(PAP)에서 확인되었으며, 이는 정상 전립선 및 종양 전립선 조직에서 발현되는 두 가지 단백질이다. 암 배아 항원 (CEA)은 종종 대장암 및 기타 상피 종양에서 고도로 발현되지만 장의 다양한 정상 상피 세포뿐만 아니라 대장, 위, 췌장, 비-소세포 폐에서도 낮은 수준으로 존재한다. 유방 암종. 알파 태아 단백(AFP) 및 CEA는 배아 발달 초기 단계에서 생성되고 면역 체계가 발달하면 정상적으로 사라지는 종양 태아 항원이지만, 일부 암에서는 간세포 암종으로 비정상적으로 존재한다. CA-125 (뮤신 16으로 알려진 암종 항원 125 또는 MUC16)는 상피 난소 암에서 증가하지만 여러 산부인과(내막, 나팔관)와 비 부인과(췌장, 유방, 대장, 및 폐) 암에서 발현될 수 있다. MUC1 (Mucin 1, 세포 표면 관련 단백질) 과발현은 종종 대장암, 유방암, 난소암, 폐암, 위장관암 및 췌장암과 관련이 있다.
상기 화합물의 조합은 또한 암세포가 종양 항원을 과발현하는 암의 치료에 사용하는데 유용하다. 과발현된 항원은 수많은 종양 유형에 의해 공유된다. hTERT, EGFR, mesothelin은 암세포에 의해 과발현되는 정상 단백질이다. hTERT(인간 텔로머라아제 역전사 효소; human telomerase reverse transcriptase)는 모든 암의 약 85 %에서 발현되는 일반적인 종양 항원이다. 다수의 항원성 펩티드 또는 종양 항원이 "과발현"된 것으로 보고되었으며, 과발현된 항원의 흥미로운 예는 신세포 암종에서 유전자 MOK-RAGE-1에 의해 암호화된 펩티드이다. RAGE-1은 다른 조직학적 유형의 종양에서도 발현된다. PRAME 유전자에서 생성된 항원도 여러 종양 유형에서 과발현되지만 다양한 정상 조직에서는 낮은 수준으로 발현된다. 다른 과발현된 유전자들은 생존하는 세포 자멸사 단백질의 억제제, 야생형 p53 단백질, 또는 난소 및 유방암과 같은 많은 상피 종양에서 과발현되는 종양 유전자 및 성장 인자 ERBB2 (HER2/NEU)로부터 유래된 유전자를 포함한다. HER2는 많은 상피 종양에서 발현되며 HER2의 과발현이 불량한 예후와 관련된 모든 원발성 유방암의 약 25 %에서 과발현된다. Sialyl-Tn (STn) 종양 항원(핵심 영역 탄수화물 항원)은 전이성 유방암 및 기타 암에서 발견된다. 단백질 Wilms 종양 1(Wilms 종양의 유전성 사례에서 처음에 설명된 WT1)에서 파생된 펩티드 또는 종양 항원도 확인되었다. 이는 정상 세포 대비 백혈병에서 10 ~ 1000 배 더 높은 수준으로 발현되는 전사 인자이며 급성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 및 골수이형성 증후군에서도 과발현된다. Mesothelin은 늑막, 복막 및 심낭을 감싸는 중피 세포로 제한되는 정상 발현을 갖는 세포 표면 당 단백질이지만 악성 중피종, 췌장암, 난소암, 폐선 암종, 자궁 내막암, 담즙암, 위암 및 소아 급성 골수성 백혈병을 비롯한 많은 암에서 높은 수준으로 발현된다 (Hassan et al., 2016).
상기 화합물의 조합은 또한 종양 특이적 돌연변이 항원이 발현되는 암 치료에 사용하는데 유용하다. 돌연변이된 항원은 식별 접근법(엑솜 시퀀싱 또는 질량 분석법을 기반으로 함)에 의해 설명되며 개인화된 종양 항원으로 분류될 수 있다. 이들은 또한 이들 항원의 교차 전달을 증가시키는 본 발명에 따른 화합물의 조합에 대한 특정 표적이다. 흑색종에서 처음 설명된 MUM-1, B-카테닌, CDK4, ERBB2IP는 종양 특이적 돌연변이 항원의 예이다. CEA, HER2, MUC-1, 탄수화물 항원(Tn, TF, STn), p53 - 암에서 돌연변이 된 종양 억제 유전자, hTERT 및 WT1은 유방암과 관련된 종양 특이적 돌연변이 항원이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개선 또는 예방될 수있는 임의의 상태 또는 임의의 질병의 예방 또는 치료 또는 백신 접종에 동시, 개별 또는 순차적으로 사용하기 위한 상기 규정한 화합물의 임의의 조합에 관한 것이다. 특히, 개선될 수 있는 상태 또는 질병은 CD47과 연관되고, 특히CD47이 과다 발현되는 상태 또는 질병이다. 여기서, 상기 상태 또는 질병은 암, 특히 염증성 암과 침윤된 골수 세포를 갖는 암, 특히 침윤된 MDSC 및/또는 TAM 세포를 갖는 암, 감염성 질환, 만성 염증성 질환, 자가 면역 질환, 신경 질환, 뇌 손상, 신경 손상, 적혈구 증가증, 혈색소 침착증, 외상, 패혈증 쇼크, 만성 감염성 질환, 특히 슈도모나스 및 거대 세포 바이러스(CMV) 감염성 질환, 섬유증, 죽상 경화증, 비만, 2형 당뇨병, 흑색종 및 이식 기능 장애로 이루어진 군에서 선택되고, 특히 암 세포가 CD47을 과발현하는 암에서 발생하는 흑색종이다.
일 측면에서, 본 발명은 단핵구 골수 유래 억제 세포 (Mo-MDSC)를 분화함으로써 개선하거나 예방할 수 있는 임의의 상태의 치료에 동시, 개별 또는 순차적으로 사용하기 위한 상기에 규정한 조합 제품에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 치료를 요하는 피험자를 대상으로 단핵구 골수-유래 억제 세포(Mo-MDSC)를 비 억제 세포로 분화함으로써 개선 또는 예방될 수 있는 임의의 상태의 치료 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 상기에 규정한 조합 제품의 유효량을 상기 피험자에게 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 투여하는 단계를 포함하고, 상기 피험자는 SIRPa v1 양성인 것을 특징으로 한다.
일 구현예에서, 본 발명은 단핵구 골수-유래 억제 세포(Mo-MDSC)를 비 억제 세포로 분화함으로써 개선하거나 예방할 수 있는 임의의 상태를 치료하기 위한 약제의 제조에서 상기에 규정한 조합 제품의 이용에 관한 것이다, 여기서 상기 피험자는 SIRPa v1 양성이다.
일 측면에서, 본 발명은 대식 세포 분극을 염증 촉진성 대식 세포로 변형함으로써 개선하거나 예방할 수 있는 임의의 상태의 치료에 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 사용하기 위한 앞서 규정한 조합 제품에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 치료를 요하는 피험자에 대하여 대식 세포 분극을 염증 촉진성 대식 세포로 변형함으로써 개선하거나 예방할 수 있는 임의의 상태의 치료 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기에 규정한 조합 생성물의 유효량을 상기 피험자에게 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 대상체는 SIRPa v1 양성이다.
일 구현예에서, 본 발명은 대식세포 분극을 염증 촉진성 대식 세포로 변형시킴으로써 개선하거나 예방할 수 있는 임의의 상태를 치료하기 위한 약제의 제조에서 상기에 규정한 조합 제품의 이용에 관한 것이다. 일 측면에서, 본 발명은 암, 감염성 질환, 만성 염증성 질환, 만성 염증성 질환, 자가 면역 질환, 신경 질환, 뇌 손상, 신경 손상, 적혈구 증가증, 혈색소 침착증, 외상, 패혈성 쇼크, 만성 감염성 질환(예: 슈도모나스 또는 CMV), 섬유증, 죽상 경화증, 비만, 2형 당뇨, 및 이식 기능 장애로 이루어진 군으로부터 선택된 병리의 치료에 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위한 또는 백신 접종에 사용하기 위한 상기에 규정한 조합 제품에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 치료를 요하는 피험자의 암, 감염성 질환, 만성 염증성 질환, 자가 면역 질환, 신경 질환, 뇌 손상, 신경 손상, 적혈구 증가증, 혈색소 침착증, 외상, 패혈성 쇼크, 만성 감염성 질환(예: 슈도모나스 또는 CMV), 섬유증, 죽상 동맥 경화증, 비만, 2형 당뇨 및 이식 기능 장애로 이루어진 군으로부터 선택된 병리를 치료하는 방법에 관한 것이고, 상기 치료 방법은 상기에 규정한 조합 제품의 치료 유효량을 상기 피험자에게 이식 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 투여하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 암, 감염성 질환, 만성 염증성 질환, 자가 면역 질환, 신경 질환, 뇌 손상, 신경 손상, 적혈구 증가증, 혈색소 침착증, 외상, 패혈성 쇼크, 만성 감염성 질환(예: 슈도모나스 또는 CMV), 섬유증, 죽상 동맥 경화증, 비만, 2형 당뇨 및 이식 기능 장애로 이루어진 군으로부터 선택된 병리의 치료를 위한 또는 백신 접종을 위한 약제의 제조에 있어서 상기에 규정한 조합 제품의 이용에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 화합물의 임의의 조합에 관한 것이다.
본 발명은 또한 항-인간 SIRPa 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체로 환자를 치료할지의 여부를 결정하는데 임상의를 지원하는 시험관내 또는 체외 방법에 관한 것이며, 보다 구체적으로, 항-인간 SIRPa v1 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체를 환자에게 투여한다. 여기서, 상기 방법은 환자로부터 사전에 획득한 생물학적 샘플에 SIRPa v1의 존재 여부를 확인하는 것을 포함한다. 여기서, 상기 SIRPa v1은 특히 본 발명에 규정한 바와 같이 항-인간 SIRPa v1 항체에 의해 검출되거나, 본 발명에 규정한 바와 같이 생성되거나, 본 발명에 개시된 방법에 따라 선택된 화합물이고, 여기서 생물학적 샘플에 SIRPa v1이 존재하면 치료가 효과적일 가능성이 있음을 나타낸다.
본 발명은 또한 치료를 받는 환자가 SIRPa v2 양성인 상태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체, 또는 변형 항체, 및 항-SIRPa v2 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체, 또는 변형 항체를 생산 및/또는 선택하기 위한 방법에 관한 것이다. 이와 같은 사용을 위한 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체, 또는 변형 항체는 인간 CD47이 인간 SIRPa v2에 결합하는 것을 억제하지만 인간 CD47이 인간 SIRPa v1에 결합하는 것을 방지하거나 억제하지 않으며, 특히 인간 CD47이 인간 SIRPg에 결합하는 것을 방지하거나 억제하지 않는다. 이러한 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체는 인간 SIRPa v2에 대한 결합과 관련된 능력을 제외하고는 본 발명에 기재된 항-인간 SIRPa v1 화합물과 같은 결합 능력을 가질 수 있다. 더욱이, 이러한 항-인간 SIRPa v2 화합물은 다음 특성 중 하나 이상의 특성, 특히 복수 개의 특성, 특히 다음의 특성을 모두 가질 수있다:
(a) 10E-8 M 이상, 특히 10E-9 M 이상, 더 바람직하게 10E-10 M 이상의 친화력 (KD)으로 인간 SIRPa v2와 결합한다; 및/또는
(b) 인간 CD47이 인간 SIRPa v2에 결합하는 것을 감소시키거나 억제한다; 및/또는
(c) 인간 CD47이 인간 SIRPa v1에 결합하는 것을 방지하거나 억제하지 않는다; 및/또는
(d) 인간 T 세포 증식을 억제하지 않는다; 및/또는
(e) 인간 T 세포 활성화를 억제하지 않는다; 및/또는
(f) 대식 세포의 활성화를 향상시킨다; 및/또는
(g) 인간 T 세포, 특히 인간 CD8+ T 세포에 대하여 항원 전달 세포에 의해 적어도 하나의 항원의 교차 전달을 향상시킨다.
본 발명은 또한 사용하고자 하는 항-인간 SIRPa v2 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체의 생산 및/또는 선택을 위한 폴리펩티드, 특히 항원의 이용에 관한 것이다. 따라서, 본 발명에서는 특히 항-인간 SIRPa v2 항체의 생산, 및/또는 이러한 항체의 선택 및/또는 생산, 그리고/또는 이러한 항체의 결합 친화력을 시험하기에 유용한 폴리펩티드가 제공된다. 이를 위하여, 인간 CD47이 인간 SIRPa v2에 결합하는 것을 억제하지만 인간 CD47이 인간 SIRPa v1에 결합하는 것을 방지하거나 감소시키지 않으며, 특히 인간 SIRPa v1에 특이적으로 결합하지 않고, 특히 인간 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않는 것을 특징으로 하는 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체를 선택하는데 사용하기 위한 서열 번호 2 (KGSPDT) 또는 서열 번호 29 (KFRKGSPDTE) 또는 서열 번호 30 (TEFKSGAGTELSVR)으로 구성된 인간 SIRPa v1의 에피토프를 포함하거나 이로 구성된 폴리펩티드, 특히 항원을 제공한다.
이러한 폴리펩티드는 항-인간 SIRPa v2 화합물의 생산 및/또는 선택을 위하여 인간 SIRPa v1의 에피토프를 포함하는 폴리펩티드처럼 사용할 수 있다. 본 발명은 또한 SIRPa v1에 대해 상술한 바와 같이 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 상기 화합물의 조합은 항-인간 SIRPa v1 화합물 대신에 이러한 항-인간 SIRPa v2 화합물을 포함할 수 있다. 치료 효과의 가능성을 평가하는 체외 또는 체내 평가 방법은 SIRPa-v2 양성 피험자를 검출하고 또는 예를 들어 항-인간 SIRPa v2 화합물을 사용하거나 본 발명에 규정한 바와 같이 SIRPa v2 대립 유전자를 검출하여 SIRPa v2을 검출하는 것일 수도 있다.
본 발명은 또한 발명에 따라 사용하기 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체(항-인간 SIRPa 화합물로도 칭함)를 포함하는 약제학적 조성물, 또는 본 명세서에 기재한 항-SIRPa 화합물을 포함하는 화합물의 조합에 관한 것이다. 여기서, 약제학적 조성물은 약제학적 기제(vehicle)를 포함하고, 상기 약제학적 조성물은 또다른 유효 성분을 선택적으로 더 포함한다. 그러므로, 본 발명은 약제학적 조성물도 제공하는데, 상기 약제학적 조성물은 적어도 하나의 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체와 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 또는 적합한 성분을 포함한다. 상기 용어 "약제학적으로 허용되는 또는 적합한 성분"은 항-인간 SIRPa 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체와 함께 투여할 수 있는 약제학적으로 허용된 희석제, 보조제, 부형제 또는 기제를 의미한다. 상기 약제학적 조성물은 국소 투여, 특히 피하 투여, 종양 내 투여에 의해 투여할 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체는 주사, 카테터, 좌약 또는 이식의 수단을 이용하여 투여할 수 있다. 이식의 경우, 이식은 다공성 물질, 비다공성 물질 또는 젤라틴 물질의 것일 수 있고, 특히 장기적인 약물 전달을 위한 시알라스틱(sialastic) 막과 같은 막 또는 섬유를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체는 제어 방출 시스템으로 전달되는 것일 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체는 치료 유효량의 결합제와 하나 이상의 약제학적으로 양용이 가능한 성분들을 포함하는 약제학적 조성물로서 투여할 수 있다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 전형적으로 하나 이상의 약제학적 담체(예를 들어, 석유, 동물, 식물성 또는 합성 유래의 것을 포함하는 물 및 오일과 같은 멸균 액체, 예컨대 땅콩 유, 대두유, 광유, 참기름 등.)을 포함한다. 약제학적 조성물이 정맥 내로 투여되는 경우에 물은 보다 전형적인 담체이다. 식염수 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 특히 주사 용액의 액체 담체로 사용된다. 적합한 약제학적 부형제는 예를 들어 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 분필, 실리카겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 원한다면, 조성물은 또한 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 서방형 제형 등의 형태를 가질 수 있다. 조성물은 전통적인 결합제 및 트리글리세리드와 같은 담체와 함께 좌약으로 제형화할 수 있다. 경구 제형은 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 탄산 마그네슘 등과 같은 표준 담체를 포함할 수 있다. 적합한 제약 담체의 예로는 E. W. Martin의 "Remington 's Pharmaceutical Sciences"에 기재되어 있다. 이러한 조성물은 환자에게 적절한 투여를 위한 형태를 제공하기 위해 적절한 양의 담체와 함께 전형적으로 정제된 형태의 치료적 유효량의 화합물을 함유할 것이다.
전형적인 구현예에서, 약제학적 조성물은 인간에게 정맥 내 투여하도록 적응된 약제학적 조성물로서 일상적인 절차에 따라 제형화된다. 일반적으로, 정맥 내 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액 중의 용액이다. 필요한 경우, 약제는 또한 가용화제 및 주사 부위의 통증을 완화하기 위해 리그노카인과 같은 국소 마취제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분은 활성제의 양을 표시하는 앰플과 같은 밀폐된 용기에 건조 동결 건조 분말 또는 물이 없는 농축물과 같이 단위 투여 형태로 별도로 공급되거나 함께 혼합된다. 약제가 주입으로 투여되는 경우, 멸균된 약제 등급의 물 또는 식염수가 들어있는 주입 병으로 조제할 수 있다. 약제가 주사로 투여되는 경우, 주사용 멸균수 또는 식염수 앰플을 제공하여 투여 전에 성분을 혼합할 수 있다.
또한, 약제학적 조성물은 (a) 동결 건조된 형태의 항-인간 SIRPa v1 결합 화합물(예를 들어, 항체 또는 유도체)을 함유하는 용기 및 (b) 주사용의 약제학적으로 허용되는 희석제(예: 멸균수)를 함유하는 또다른 용기를 포함하는 약제학적 키트로 제공할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 희석제는 동결 건조된 항-인간 SIRPa v1 화합물의 재구성 또는 희석에 사용할 수 있다. 선택적으로, 이러한 용기와 관련하여 의약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관이 규정한 형식의 안내문이 있을 수 있으며, 이 안내문은 인간에 투여를 하기 위한 제조, 사용 또는 판매 기관의 승인을 반영한다. 대안적으로, 키트는 국소 투여, 특히 피하 투여 또는 경구 투여에 적합할 수 있으며, 따라서 사전에 충전된 주사기와 같은 사전에 충전된 용기 또는 바이알과 같은 바늘없는 장치를 포함하며, 특히 조성물은 각각 피하 또는 경구로 투여된다.
질병의 치료나 예방 또는 질병에 대한 백신 접종에 효과적인 항-인간 SIRPa 화합물(예를 들어, 항체 또는 유도체)의 양은 표준 임상 기술에 따라 결정할 수 있다.
본 발명은 또한 특히 방사선 요법, 화학 요법, 면역 요법, 인돌 아민 2,3-디옥시게나제(IDO) 자극제 또는 억제제, INterferon 유전자의 STimulator (STING) 작용제, pro-apoptotic 암 약제, 항혈관형성 암 약제와 함께 다른 치료 또는 예방 치료를 조합하여 본 발명에 따라 사용하기 위한 항-SIRPa 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 항-SIRPa 화합물은 신생 항원 또는 신생 에피토프와 조합하여 제공되며, 여기서 항-SIRPa 화합물은 항원 전달 세포, 특히 수지상 세포에 의한 인간 T 세포, 인간 CD8+ T 세포에 대한 상기 신생 항원 또는 상기 신생 에피토프의 교차 전달을 향상시킨다. 신생 항원 및 신생 에피토프는 당 업계에 공지된 방법에 의해 종양 내에서 확인하거나 검출할 수 있다.
본 발명은 또한 인간 피험자 내에서 항-인간 SIRPa v1 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 그의 변형 항체를 사용한 치료의 효과 가능성을 평가하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은: (a) 인간 피험자로부터 사전에 얻은 생물학적 샘플에서 인간 SIRPa v1의 존재 여부를 결정하는 단계; 그리고 (b) 인간 피험자가 SIRPa v1 양성이면, 본 발명에 개시된 항-SIRPa 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 그의 변형 항체, 또는 본 발명에 개시된 임의의 조합, 또는 본 발명에 개시된 임의의 화합물의 치료량을 투여하는 단계를 포함한다.
이러한 방법은 인간 피험자가 암 진단을 받았거나 암에 걸릴 가능성이 있는 경우에 특히 중요하다. 바람직한 구현예에서, 항-SIRPa 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 그의 변형 항체를 이용한 치료는 인간 피험자가 적어도 하나의 SIRPa v1 대립 유전자를 갖는 경우, 즉 인간 피험자의 생물학적 샘플이 SIRPa v1 양성인 경우에 효과적일 가능성이 있다.
피험자로부터의 획득한 생물학적 샘플에서 SIRPa v1의 존재 여부를 결정하는 것은 인간 피험자에서 SIRPa를 암호화하는 대립 유전자의 존재 여부를 결정하도록 하는 당 업계에 공지된 임의의 방법에 따라 수행할 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어 FACS, 유전형 분석, 유전자 시퀀싱, 현장(in situ) 혼성화, 웨스턴 블롯, ELISA 등과 같은 세포 분류법이지만 이에 국한되지 않는다.
또한, 본 발명은 다음과 같은 구현예에 관한 것이다:
구현예 1
(a) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 여기서 HCDR1은 서열 번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고, HCDR2는 서열 번호 10 또는 서열 번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고, HCDR3은 서열 번호 12 또는 서열 번호 13 또는 서열 번호 14 또는 서열 번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며; 및 (b) 서열 번호 16 또는 서열 번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인,을 포함하는 항-인간 SIRPa 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체로, 여기서, 상기 항-인간 SIRPa 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체는 인간 CD47이 인간 SIRPa v1와 결합하는 것을 억제하고, 인간 CD47이 인간 SIRPa v2와 결합하는 것을 방지하거나 억제하지 않는, SIRPa v1 양성인 피험자 내에 발병한 질병을 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 항-인간 SIRPa 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체.
구현예 2
구현예 1에 따라 사용하기 위한 항-인간 SIRPa 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체에 있어서, 상기 중쇄 가변 도메인은 서열 번호 18, 또는 서열 번호 19, 또는 서열 번호 20, 또는 서열 번호 21, 또는 서열 번호 22, 또는 서열 번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 특히 서열 번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고; 그리고 상기 경쇄 가변 도메인은 서열 번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
구현예 3
구현예 1 또는 2에 따라 사용하기 위한 항-인간 SIRPa 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체에 있어서, 상기 질병은 감염성 질환, 만성 염증성 질환, 자가 면역 질환, 신경 질환, 뇌 손상, 신경 손상, 적혈구 증가증, 혈색소 침착증, 외상, 패혈성 쇼크, 만성 감염성 질환, 특히 슈도모나스 및 거대 세포 바이러스(CMV) 감염성 질환, 섬유증, 죽상 경화증, 비만, 2형 당뇨, 흑색종, 및 이식 기능 장애로 이루어진 군에서 선택된다.
구현예 4
구현예 1 또는 2에 따라 사용하기 위한 항-인간 SIRPa 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체에 있어서,
상기 질병은 암, 특히 염증성 암과 침윤된 골수 세포를 갖는 암, 특히 침윤된 MDSC 및/또는 TAM 세포를 갖는 암, 흑색종으로 이루어진 군에서 선택되고, 상기의 이용은 이들 질병 중에 어느 하나에 대한 치료적 백신 접종, 특히 흑색종에 대한 치료적 백신 접종을 위한 것이다.
구현예 5
구현예 4에 따라 사용하기 위한 항-인간 SIRPa 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체에 있어서, 상기 질병은 암이고, 인간 유두종 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 메르켈 세포 폴리오마 바이러스, 인간 면역 결핍 바이러스, 인간 T-세포 백혈병 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스 8, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, HCV, HBC, 및 세포 거대 바이러스의 항원으로 이루어진 군, 또는 CTNNB1 유전자, CASP8 유전자, HER2 유전자, P53 유전자, KRAS 유전자, NRAS 유전자의 항원으로 이루어진 군에서 유래한 단일점 돌연변이된 항원의 군, 또는 종양 항원, 특히 RAS 종양 유전자, BCR-ABL 종양 항원, ETV6-AML1 종양 항원, 흑색종 항원 암호화 유전자(MAGE), BAGE 항원, GAGE 항원, ssx 항원, ny-eso-1 항원, cyclin-A1 종양 항원, MART-1 항원, gp100 항원 , CD19 항원, 전립선 특이 항원, 전립선 산성 포스파타제 항원, 암 배아 항원, 알파 태아 단백 항원, 암종 항원 125, 뮤신 16 항원, 뮤신 1 항원, 인간 텔로머라제 역전사 효소 항원, EGFR 항원, MOK 항원, RAGE-1 항원, PRAME 항원, 야생형 p53 항원 , 종양 유전자 ERBB2 항원, 시알릴-Tn 종양 항원, Wilms 종양 1 항원, 메조텔린 항원, 탄수화물 항원, B- 카테닌 항원, MUM-1 항원, CDK4 항원, 및 ERBB2IP 항원, 특히 멜란-A 흑색종 종양 관련 항원(TAA)으로 이루어진 군에서 발생하거나 유래한 종양 항원으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 항원이 피험자에서 발현되거나 검출되었던 것을 특징으로 한다.
구현예 6
구현예 1 내지 5 중에 어느 한 구현예에 따라 사용하기 위한 항-인간 SIRPa 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체에 있어서, 상기 항체는 특히 암 세포에 의해 CD47이 과발현되는 암에 대하여 CD47이 세포에, 특히 암 세포에 과발현되는 질병을 갖는 SIRPa v1 양성인 피험자에게 투여되는 것을 특징으로 한다.
구현예 7
구현예 1 내지 6 중에 어느 한 구현예에 따라 사용하기 위한 항-인간 SIRPa 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체는,
- 인간 SIRPa v2에 특이적으로 결합하지 않음; 및
- 인간 CD47이 인간 SIRPg에 결합하는 것을 억제하지 않음;
의 특성을 가지고, 선택적으로:
- 1E-9 M 이상의 친화력으로 인간 SIRPa v1과 결합함, 및/또는
- 인간 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않음, 및/또는
- 체내(in vivo) 인간 T 세포의 활성화 및/또는 증식을 억제하지 않음; 및/또는
- 대식 세포의 활성화를 향상시킴, 및/또는
- 항원 전달 세포에 의한 인간 T 세포, 특히 인간 CD8+ T 세포에 대하여 적어도 하나의 항원의 교차 전달을 향상시킴
의 특성 중에 하나 이상을 가지는 것을 특징으로 한다.
구현예 8
인간 SIRPa v1에 특이적으로 결합하고, 인간 CD47이 인간 SIRPa v1와 결합하는 것을 억제하지만, 인간 CD47이 인간 SIRPa v2에 결합하는 것을 방지하거나 억제하지는 않는 것을 특징으로 하는 항-인간 SIRPa v1 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체를 생산 또는 선택함에 있어서의, 폴리펩티드, 특히 항원의 용도에 관한 것이다. 이 때, 상기 폴리펩티드, 특히 항원은, 특히 서열 번호 5 및/또는 서열 번호 6의 에피토프[선형 에피토프], 및/또는 서열 번호 7 및/또는 서열 번호 8의 에피토프[입체형태 에피토프]로 구성된 하나 이상의 인간 SIRPa v1의 에피토프를 추가적으로 포함하는, 서열 번호 1, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 25로 이루어진 인간 SIRPa v1의 에피토프를 포함하거나 이로 구성된다.
구현예 9
구현예 8에 따른 폴리펩티드, 특히 항원의 생산에 있어서의, 인간 SIRPa v1의 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 용도에 관한 것으로, 여기서, 인간 SIRPa v1의 에피토프를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드는, 특히 서열 번호 5 및/또는 서열 번호 6의 에피토프[선형 에피토프] 및/또는 서열 번호 7 및/또는 서열 번호 8의 에피토프[입체형태 에피토프]의 아미노산 잔기를 포함하거나 이로 구성되는 적어도 하나의 인간 SIRPa v1의 에피토프를 추가적으로 포함하는, 서열 번호 1, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 25의 아미노산 잔기를 포함한다.
구현예 10
항-인간 SIRPa v1 항체를 제조하는 방법에 있어서, 상기 방법은 구현에 9에 규정한 적어도 하나의 항원 또는 서열 번호 1, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 25로 이루어진 인간 SIRPa v1의 에피토프를 포함하거나 이로 구성된 적어도 하나의 항원을 가지고 비인간 동물, 특히 비인간 포유 동물을 면역화하는 단계; 및 상기 면역화된 비인간 동물로부터 결과적으로 얻은 혈청 또는 B 세포를 채취하여 상기 항원에 대한 항체를 얻는 단계를 포함한다. 특히, 상기 항원은 서열 번호 1 또는 서열 번호 4 또는 서열 번호 25로 이루어진 인간 SIRPa v1의 에피토프, 그리고 서열 번호 5의 에피토프 및/또는 서열 번호 6의 에피토프 및/또는 서열 번호 7의 에피토프 및/또는 서열 번호 8의 에피토프 중에서 하나 이상의 에피터프를 포함하거나 이로 구성된다.
구현예 11
항원 전달 세포, 특히 수지상 세포에 의한 T 세포, 특히 CD8+ T 세포에 대한 항원의 교차 전달을 증가시키기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은 항-인간 SIRPa 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 그의 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체로 이루어진 군에서 선택된 화합물을 피험자에 투여하는 단계를 포함한다. 여기서, 상기 화합물은, (1) 인간 SIRPa v2에 특이적으로 결합하지 않는 특성; (2) 1E-9 M 이상의 친화력으로 인간 SIRPa v1과 결합하는 특성; 및 (3) 인간 CD47이 인간 SIRPa v1에 결합하는 것을 감소시키거나 억제하는 특성; 및 (4) 인간 CD47이 SIRPa v2에 결합하는 것을 방지하거나 억제하지 않는 특성 중에서 적어도 하나의 특성을 가진다. 또한, 상기 화합물은 (i) T 세포의 증식을 억제하지 않는 특성; 및/또는 (ii) T 세포의 활성화를 억제하지 않는 특성; 및/또는 (iii) 대식 세포의 활성화를 향상시키는 특성; 및/또는 (iv) 인간 CD47이 인간 SIRPg에 결합하는 것을 방지하거나 억제하지 않는 특성 중에 하나 이상의 특성을 선택적으로 가지는 것을 특징으로 한다.
구현예 12
항-인간 SIRPa 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체로 환자를 치료할지의 여부를 결정하는데 임상의를 지원하는 시험관내 또는 체외 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 항-인간 SIRPa v1 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체를 환자에게 투여한다. 여기서, 상기 방법은 환자로부터 사전에 획득한 생물학적 샘플에 SIRPa v1의 존재 여부를 확인하는 것을 포함한다. 상기 SIRPa v1은 특히 본 발명에 규정한 바와 같이 항-인간 SIRPa v1 항체에 의해 검출되거나, 본 발명에 규정한 바와 같이 생성되거나, 본 발명에 개시된 방법에 따라 선택된 화합물이고, 여기서 생물학적 샘플에 SIRPa v1이 존재하면 치료가 효과적일 가능성이 있음을 나타낸다.
구현예 13
구현예 10에 따른 방법에 있어서, 상기 회수된 항-인간 SIRPa v1 항체는 1E-9 M 이상의 친화력을 가지고 인간 SIRPa v1에 특이적으로 결합하고, 인간 SIRPa v2에는 특이적으로 결합하지 않는다. 특히, 상기 회수된 항-인간 SIRPa v1 항체는 인간 CD47이 인간 SIRPa v1에 결합하는 것에 길항제로 작용하고, 인간 CD47이 인간 SIRPa v2와 인간 SIRPg에 결합하는 것을 방지하거나 억제하지 않는다.
구현예 14
항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체로 이루어진 군에서 화합물을 선택하고 회수하는 방법에 있어서, 상기 방법은 다음 단계로 이루어진다:
(a) 화합물이 인간 SIRPa v1에 특이적으로 결합하는 능력을 시험하는 단계; 및
(b) 화합물이 인간 SIRPa v1에 대한 인간 CD47의 결합을 감소 또는 억제하는 능력을 시험하는 단계; 및
(c) 화합물이 인간 SIRPa v2에 대한 인간 CD47의 결합을 방지하거나 억제하지 않는 능력을 시험하는 단계; 및
(d) 화합물이 서열 번호 3의 SIRPa의 130 번 위치와 132 번 위치에 각각 위치한 아미노산 잔기 D와 아미노산 잔기 V에 결합하는 능력, 또는 서열 번호 25의 SIRPa의 100 번 위치와 102 번 위치에 각각 위치한 아미노산 잔기 D와 아미노산 잔기 V에 결합하는 능력을 시험하는 단계; 그리고 선택적으로
(e) 화합물이 인간 SIRPa v2에 특이적으로 결합하지 않는 능력을 시험하는 단계; 및/또는
(f) 화합물이 인간 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않는 능력을 시험하는 단계; 및/또는
(g) 화합물이 인간 CD47이 인간 SIRPg에 결합하는 것을 방지하거나 억제하지 않는 능력을 시험하는 단계.
여기서, 상기 회수된 화합물은 다음과 같은 특성을 가진다:
1. 인간 SIRPa v1에 특이적으로 결합한다; 그리고
2. 인간 CD47이 인간 SIRPa v1에 결합하는 것을 감소시키거나 억제한다; 그리고
3. 인간 CD47이 인간 SIRPa v2에 결합하는 것을 방지하거나 억제하지 않는다. 그리고 상기 회수된 화합물은 다음의 특성 중에 하나 이상을 선택적으로 가진다:
4. 인간 CD47이 인간 SIRPg에 결합하는 것을 방지하거나 억제하지 않는다.
5. 1E-9 M 이상의 친화력으로 인간 SIRPa v1과 결합한다; 및/또는
6. 인간 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않는다; 및/또는
7. 인간 SIRPa v2에 특이적으로 결합하지 않는다.
구현예 15
구현예 14에 따라 화합물을 선택 및 회수하는 방법은 하기의 단계 중 적어도 하나의 단계를 포함할 수있다:
(v) 화합물의 존재하에 T 세포 증식을 시험하는 단계; 및/또는
(vi) 화합물의 존재하에 T 세포 활성화를 시험하는 단계; 및/또는
(vii) 화합물의 존재하에 대식 세포 활성화를 시험하는 단계; 및/또는
(viii) 항원 전달 세포, 특히 수지상 세포에 의한 항원, 특히 종양 항원, 특히 멜란-A 흑색종 종양 관련 항원 (TAA)의 인간 T 세포, 특히 CD8+ T 세포로의 교차 전달을 화합물의 존재하에 시험하는 단계.
여기서, 상기 회수된 화합물은 하기의 특성 중에 하나 이상의 특성을 나타낼 수 있다:
1. 인간 T 세포 증식을 억제하지 않는다; 및/또는
2. 인간 T 세포 활성화를 억제하지 않는다; 및/또는
3. 대식 세포의 활성화를 향상시킨다; 및/또는
4. 항원 전달 세포에 의한 인간 T 세포로 항원의 교차 전달을 향상시킨다.
구현예 16
질병의 중증도를 진단하는 시험관내 또는 체외 방법, 특히 개인 맞춤 의약품에 사용하기에 적합한 진단 방법에 있어서, 본 발명의 임의의 구현예에 규정되었거나 본 발명에 기재된 방법에 따라 생산되거나 본 발명에 규정된 방법에 따라 선택되는 화합물인 항-인간 SIRPa v1 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 모방체 또는 변형 항체는 피험자로부터 사전에 획득한 샘플에서 SIRPa v1 양성인 세포를 검출하는데 사용된다. 선택적으로는, SIRPa v1의 발현을 정량화한다.
구현예 17
질병의 중증도를 진단하는 시험관내 또는 체외 방법, 특히 개인 맞춤 의약품에 사용하기에 적합한 진단 방법에 있어서, 본 발명의 임의의 구현예에 규정되었거나 본 발명의 임의의 구현예에 규정된 방법에 따라 생산되거나 본 발명의 임의의 구현예에 규정된 방법에 따라 선택되는 화합물인 항-인간 SIRPa v1 항체, 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 모방체 또는 변형 항체는 피험자로부터 사전에 획득한 샘플에서 SIRPa v1 양성인 세포를 검출하는데 사용된다. 선택적으로는, SIRPa v1의 발현을 정량화한다.
구현예 18
구현예 1 내지 7 중에 어느 하나에 따라 사용하기 위한 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체, 또는 변형 항체; 및 적어도 하나의 약제학적 기제(vehicle)를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물에 관한 것이다.
구현예 19
구현예 1 내지 7 및 구현예 18 중에 어느 하나에 따라 사용하기 위한 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 항원 결합 항체 모방체, 또는 변형 항체; 및 국소 투여에 적합한 장치, 특히 피하 또는 경구 전달 장치, 특히 사전에 충전된 주사기나 바늘없는 장치를 포함하는 장치를 포함하는 키트에 관한 것이다.
구현예 20
구현에 1 내지 7 중에서 임의의 한 구현예에 따르거나, 본 발명에 속한 임의의 구현예에 따라 생산되거나 본 발명에 속한 임의의 구현예에 따라 선택되는 화합물인 항체를 포함하는 화합물의 조합에 있어서, 상기 조합은 상기 항체와, 인간 유두종 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 메르켈 세포 폴리오마 바이러스, 인간 면역 결핍 바이러스, 인간 T-세포 백혈병 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스 8, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, HCV, HBC, 및 세포 거대 바이러스의 항원으로 이루어진 군, 또는CTNNB1 유전자, CASP8 유전자, HER2 유전자, P53 유전자, KRAS 유전자, NRAS 유전자의 항원으로 이루어진 군에서 유래한 단일점 돌연변이된 항원의 군, 또는 종양 항원, 특히 RAS 종양 유전자, BCR-ABL 종양 항원, ETV6-AML1 종양 항원, 흑색종 항원 암호화 유전자(MAGE), BAGE 항원, GAGE 항원, ssx 항원, ny-eso-1 항원, cyclin-A1 종양 항원, MART-1 항원, gp100 항원 , CD19 항원, 전립선 특이 항원, 전립선 산성 포스파타제 항원, 암 배아 항원, 알파 태아 단백 항원, 암종 항원 125, 뮤신 16 항원, 뮤신 1 항원, 인간 텔로머라제 역전사 효소 항원, EGFR 항원, MOK 항원, RAGE-1 항원, PRAME 항원, 야생형 p53 항원 , 종양 유전자 ERBB2 항원, 시알릴-Tn 종양 항원, Wilms 종양 1 항원, 메조텔린 항원, 탄수화물 항원, B- 카테닌 항원, MUM-1 항원, CDK4 항원, 및 ERBB2IP 항원, 특히 멜란-A 흑색종 종양 관련 항원(TAA), 또는 임의의 특정 변이 항원(신생 항원 또는 신생 에피토프)으로 이루어진 군에서 발생하거나 유래한 종양 항원으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 항원을 포함한다. 여기서, 상기 화합물의 조합은 SIRPa v1 양성인 피험자에 대한 질병의 치료 또는 예방에 사용되는 약제 또는 백신 조성물로 사용하기 위한 것이다.
구현예 21
(a) 인간 SIRPa v1에 특이적으로 결합하고, 인간 CD47이 인간 SIRPa v1에 결합하는 것을 감소시키거나 억제하고; 그리고 (b) 인간 CD47이 인간 SIRP에 결합하는 것을 방지하거나 억제하지 않고, 특히 인간 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않는 특성을 갖는 항원 결합 항체 모방체에 관한 것이다. 여기서, 항원 결합 항체 모방체는 질병, 특히 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위하여, 또는 질병, 특히 암에 대한 치료적 백신 접종에 사용하기 위한 것이다. 여기서, 상기 항원 결합 항체 모방체는 상기 질병, 특히 상기 암에 발현되는 항원의 교차 전달을 향상시키고, 상기 질병의 치료에 적합한 T 세포 반응을 유도하는 데에 관여하는 것을 특징으로 한다.
구현예 22
구현예 21에 따라 사용하기 위한 항원 결합 항체 모방체는 SIRPa v1 양성인 피험자에 발병한 질병의 예방 및/또는 치료에 이용된다.
구현예 23
구현예 21 또는 22에 따라 사용하기 위한 항원 결합 항체 모방체에 있어서, 상기 질병은 암, 특히 염증성 암과 침윤된 골수 세포를 갖는 암, 더욱 구체적으로는 침윤된 수지상 세포 및/또는 MDSC 및/또는 TAM 세포를 갖는 암, 암 전이, 특히 유방암 전이, 흑색종이다. 또한, 상기 구현예 21 또는 22에 따른 사용은 이들 질병 중에 어느 하나에 대한 치료적 백신 접종, 특히 흑색종에 대한 치료적 백신 접종을 위한 것이다.
구현예 24
구현예 21, 22, 23 중에서 어느 하나의 구현예에 따라 사용하기 위한 항원 결합 항체 모방체는 다음과 같은 특성을 갖는다:
- 인간 SIRPa v2에 특이적으로 결합하지 않는다;
- 인간 CD47이 인간 SIRPg에 결합하는 것을 억제하지 않고, 특히 인간 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않는다;
- 10E-9 M 이상의 친화력으로 인간 SIRPa v1과 결합한다; 그리고
- 항원 전달 세포, 특히 수지상 세포에 의한 인간 T 세포, 특히 인간 CD8+ T 세포에 대한 적어도 하나의 항원의 교차 전달을 향상시킨다.
구현예 25
구현예 24에 따라 사용하기 위한 항원 결합 항체 모방체는 다음과 같은 특성 중에 적어도 하나의 특성을 갖는다:
- 체내 인간 T 세포의 활성화 및/또는 증식을 억제하지 않는다; 그리고/또는
- 대식 세포의 활성화를 향상시킨다.
구현예 26
구현예 21 내지 25 중에 어느 하나의 구현예에 따라 사용하기 위한 항원 결합 항체 모방체는 적어도 하나의 약제학적 기제(vehicle)를 추가로 포함한다.
구현예 27
구현예 21 내지 26 중에 어느 하나의 구현예에 따라 사용하기 위한 항원 결합 항체 모방체에 있어서, 상기 질병은 암이다. 여기서, 인간 유두종 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 메르켈 세포 폴리오마 바이러스, 인간 면역 결핍 바이러스, 인간 T-세포 백혈병 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스 8, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, HCV, HBC, 및 세포 거대 바이러스의 항원으로 이루어진 군, 또는 CTNNB1 유전자, CASP8 유전자, HER2 유전자, P53 유전자, KRAS 유전자, NRAS 유전자의 항원으로 이루어진 군에서 유래한 단일점 돌연변이된 항원의 군, 또는 종양 항원, 특히 RAS 종양 유전자, BCR-ABL 종양 항원, ETV6-AML1 종양 항원, 흑색종 항원 암호화 유전자(MAGE), BAGE 항원, GAGE 항원, ssx 항원, ny-eso-1 항원, cyclin-A1 종양 항원, MART-1 항원, gp100 항원 , CD19 항원, 전립선 특이 항원, 전립선 산성 포스파타제 항원, 암 배아 항원, 알파 태아 단백 항원, 암종 항원 125, 뮤신 16 항원, 뮤신 1 항원, 인간 텔로머라제 역전사 효소 항원, EGFR 항원, MOK 항원, RAGE-1 항원, PRAME 항원, 야생형 p53 항원 , 종양 유전자 ERBB2 항원, 시알릴-Tn 종양 항원, Wilms 종양 1 항원, 메조텔린 항원, 탄수화물 항원, B- 카테닌 항원, MUM-1 항원, CDK4 항원, 및 ERBB2IP 항원, 특히 멜란-A 흑색종 종양 관련 항원(TAA)으로 이루어진 군에서 발생하거나 유래한 종양 항원으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 항원이 피험자에서 발현되거나 검출되었던 것을 특징으로 한다.
구현예 28
구현예 21 내지 27 중에 어느 하나의 구현예에 따라 사용하기 위한 항원 결합 항체 모방체는, 인간 유두종 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 메르켈 세포 폴리오마 바이러스, 인간 면역 결핍 바이러스, 인간 T-세포 백혈병 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스 8, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, HCV, HBC, 및 세포 거대 바이러스의 항원으로 이루어진 군, 또는 CTNNB1 유전자, CASP8 유전자, HER2 유전자, P53 유전자, KRAS 유전자, NRAS 유전자의 항원으로 이루어진 군에서 유래한 단일점 돌연변이된 항원의 군, 또는 종양 항원, 특히 RAS 종양 유전자, BCR-ABL 종양 항원, ETV6-AML1 종양 항원, 흑색종 항원 암호화 유전자(MAGE), BAGE 항원, GAGE 항원, ssx 항원, ny-eso-1 항원, cyclin-A1 종양 항원, MART-1 항원, gp100 항원 , CD19 항원, 전립선 특이 항원, 전립선 산성 포스파타제 항원, 암 배아 항원, 알파 태아 단백 항원, 암종 항원 125, 뮤신 16 항원, 뮤신 1 항원, 인간 텔로머라제 역전사 효소 항원, EGFR 항원, MOK 항원, RAGE-1 항원, PRAME 항원, 야생형 p53 항원 , 종양 유전자 ERBB2 항원, 시알릴-Tn 종양 항원, Wilms 종양 1 항원, 메조텔린 항원, 탄수화물 항원, B- 카테닌 항원, MUM-1 항원, CDK4 항원, 및 ERBB2IP 항원, 특히 멜란-A 흑색종 종양 관련 항원(TAA), 또는 임의의 특정 변이 항원(신생 항원 또는 신생 에피토프)으로 이루어진 군에서 발생하거나 유래한 적어도 하나의 항원을 추가로 포함한다. 여기서, 상기 항원 결합 항체 모방체는 SIRPa v1 양성인 피험자에 발병한 질병의 치료 또는 예방에 이용하기 위한 것이다.
도 1. SIRP 단백질군의 서열 정렬.
SIRPa 변이체 v1 및 v2, SIRPb 및 SIRPg의 막 원위 도메인 단백질 서열 정렬 및 단백질 서열로의 SNP의 위치측정(localization) (1에서 16까지 번호가 매겨진 화살표). 도면에서 회색 직사각형은 펩티드 신호 서열에 해당하고, 굵은 밑줄은 항-인간 SIRPa 항체에 의해 인식되는 선형 에피토프를 나타내며, 회색 파선의 직사각형은 항-인간 SIRPa v1 항체에 의해 인식되는 입체형태 에피토프를 나타낸다. 서열 번호 32 내지 35는 각각 도 1에 "P78328_SIRPA_HUMAN_Variant1", "SIRPA_HUMAN_Variant", "O00241_SIRPB_HUMAN" 및 "Q9P1W8_SIRPG_HUMAN"으로 기재된 서열이다.
도 2. 혈액 단핵구에 의해 발현된 인간 SIRPa 변이체 V1 및 V2에 대한 SIRPa 항체의 결합.
SIRPa 엑손 3에 대해 이미 시퀀싱된 건강한 도너(donor)가 선택되었다. 형광물질-활성 세포 분석 (florescce-activated cell sorting, FACS)을 이용하여, SIRPa V1/V1 및 SIRPa V2/V2 동형 접합체와 SIRPa V1/V2 이형 접합체로부터 선택된 도너의 혈액 단핵구 상에서 자가제조(in-house) 항-SIRPa 항체(도면에서 좌측의 항-SIRPa v1-FITC)와 상용 SE7C2(도면에서 우측)의 결합을 시험하였다.
도 3. SIRPa v1/v1 동형 접합 도너, SIRPa v1/v2 이형 접합 도너 또는 SIRPa v2/v2 동형 접합 도너의 혈액 단핵구에 대한 항 인간 SIRPa v1 항체의 길항 활성.
동형 접합 또는 이형 접합 도너 세포를 사용하여 SIRPa-CD47의 상호 작용에 대한 항-인간 SIRPa v1 항체의 FACS에 의한 경쟁 분석.
항-인간 SIRPa v1 항체의 용량 반응을 사용하여 서로 상이한 도너로부터 얻은 SIRPa 변이체에 대한 CD47의 결합과 경쟁하였다. CD47 결합의 백분율은 대조군에 대하여 정규화되고, 결과는 각 세포 도너하여 나타낸다: V2/V2 동형 접합(삼각형), V1/V2 이형 접합(정사각형), 및 동형 접합 V1/V1 (원형).
도 4. Elisa에 의한 항-인간 SIRPa v1 항체 및 Kwar 항체를 사용한 SIRPa 변이체 결합에 관한 연구.
마우스 Fc 도메인에 연결된 고정시킨 SIRPa 돌연변이 변이체(v1에서 v8까지의 SIRPa, 실시예 1의 표 2 참조)에 대한 ELISA에 의한 결합 평가.항-인간 SIRPa v1 항체 및 Kwar 항체(SIRPa v1과 SIRPa v2 모두에 결합하는 것으로 알려짐)가 서로 상이한 SIRPa 돌연변이 변이체에 결합하는 능력을 비교하였다. 이는, 당나귀 항-인간 항체를 가지고 수행하였으며, TMB 기질을 이용하여 450nm 파장에서 측정하는 비색계에 의해 밝혀졌다. 본 분석에서, ED50 (ng/ml)은 신호의 50 %에 도달할 때 표시된 항체의 농도이다.
도 5. 수지상 세포(DC)에 의한 마우스 항원의 교차 전달.
마우스 DC에 Ovalbumin 항원을 미리 충전하고 OTI 또는 OTII 마우스 (OVA MHC I 또는 II 전용 TCR 발현을 위한 유전자 이식 동물)의 유전자 이식 T 세포와 함께 배양하였다. T 세포 증식은 티미딘 혼입(OTI CD8 + T 세포, 또는 OTII CD4 + T 세포)을 이용하여 여러가지 조건에서 측정하였다: 항원(Ag) 없는 대조군(텅빈 원형) 또는 동기준 항체 대조군(십자표), 쥐의 항-SIRPa 항체 P84 (정사각형) 및 MY1 (원형) 또는 항-CD47 항체(삼각형). A: OTI CD8 양성 T 세포에서 얻은 결과. B: OT-II CD4 양성 T 세포에서 얻은 결과.
도 6. 수지상 세포에 의한 인간 항원의 교차 전달.
HLA-A2 + HV의 단핵구를 SIRPa에 대하여 표현형 지정을 하였고, 동형 접합(v1/v1) 단핵구와 이형 접합(v1/v2) 단핵구를 모두 두 가지 유형의 실험에 사용하였다. A. CD8 + T 세포에서 IL-2 발현. SIRPa v1 동형 접합 미성숙 DC를 가지고 얻은 결과는 원형으로 표시하고, SIRPa v1/v2 이형 접합 미성숙 DC를 가지고 얻은 결과는 정사각형으로 표시한다. Melan-A 적재된 미성숙 DC를 사용하여 Melan-A/HLA-A2+ 특이적 흉선종 클론을 활성화시켰고, 이는 배양 48 시간 후 IL-2 분비에 의해 측정되었다. B. Melan-A 로딩된 iDC로 자극된 CD8 + T 세포에서의 IFNg 발현. iDC는 이전에 loading phase에서 여러가지 항체와 함께 배양되었다. 이 때 사용한 항체들은 항-SIRPa v1 (원형), 항-SIRPa/g (정사각형), 항-SIRPa v1 + 항-SIRPa/g (다이아몬드), B6H12 (역삼각형) 및 CC2C6 (삼각형)이다. IFNg의 발현은 유동 세포 분석를 이용하여 평가하였다.
도 7. 수지상 세포의 존재하에 항-인간 SIRPa v1 및 항-인간 CD47 항체에 대한 T 세포(CD4 및 CD8 양성 세포)의 동종 반응.
건강한 지원자로부터 말초 혈액 단핵 세포에서 분리된 인간 T 세포를 5 일 동안 DC 세포 하나 당 T 세포 5의 비율로 동종 수지상 세포(DC)로 자극하였다. 항체는 배양 0 일에 첨가하였다. A: 배양 마지막 12 시간 동안 H3-티미딘의 혼입(incorporation)에 의해 측정된 증식. B: ELISA에 의해 측정된 IFNg 분비량의 백분율. 결과를 대조군 조건으로 정규화하였다. 항-SIRPa v1 (정사각형)은 SIRPa v2 및 SIRPg에 결합하지 않는 SIRPa v1에 특이적인 자가제조(in-house) 항체로 처리된 세포에 해당한다. CD47 mAb (삼각형)는 CD47에 결합하는 항체로 처리된 세포에 해당한다.
도 8. 항-SIRPa v1 항체로 처리된 V1/V1 및 V1/V2 공여 단핵구를 비교하는 대식 세포 분극 생물 검정법.
MIP-1a/CCL-3 및 MIP-1b/CCL-4 분비는 무처리 세포(원형) 또는 항-인간 SIRPa v1 항체로 처리한 세포(사각형)의 상등액에서 ELISA를 이용하여 측정하였다. A: 동형 접합 도너 V1/V1의 세포를 가지고 얻은 결과. B: 이형 접합 도너 V1/V2의 세포를 가지고 얻은 결과.
도 9. FACS에 의한 SIRPa v2에 대한 인간 단핵구 동형 접합체상의 항-SIRPa 항체의 결합 분석 및 ELISA에 의한 SIRPa v2에 대한 항체의 ED50 측정.
키메라 18D5 항체 또는 SIRP29 항체 또는 다른 인간화 항-SIRPa 항체의 인간 단핵구 v2/v2 (이전에 인간 Fc 수용체 결합 억제제로 염색되었음)에 대한 세포 형광 측정법을 이용한 평가. Cantoll 세포 측정기에서 PE 표지된 마우스 항-인간 Fc mAb를 사용하여 수행하였다. ED50은 신호의 50%에 도달하는 표시된 항체의 농도이다. A: 염색된 양성 세포 v2/v2의 형광 강도의 평균치. B: 각 항체에 대한 ELISA에 의한 ED50 존재 여부의 결정. ED50은 대부분의 인간화 18D5 항체에서 검출되지 않았다.
도 10. 항-SIRP 항체와 함께 사전 배양된 인간 SIRPg 재조합 단백질에 대한 CD47의 Blitz에 의한 경쟁 분석.
SIRPg-His 재조합 단백질을 NINTA 바이오 센서에 10 μg/ml로 고정하고 표시된 항체를 20μg/ml (포화 농도)로 첨가하였다. 그 다음, CD47Fc를 100 μg/ml로 첨가하고 120 초의 결합 기간(ka)에 이어 120 초(kd)의 해리 기간 후에 친화력 값을 추론하여 친화성 상수(KD)를 결정하였다. SIRPg에 대한 CD47의 KD 친화력은 여러 가지 조건에서 결정하였다: LSB2.20 항체(SIRPg에 특이적으로 결합하는 항체); kwar 항체 및 SIRP29 항체.
도 11. 유방암의 마우스 전이 모델에 대한 항-SIRPa 항체의 효과.
4T1 유방암 모델은 폐 전이에 대한 마우스 항-SIRPa (p84 항체 및 MY-1 항체)의 효율성 연구에 사용하였다. 도면은 항-SIRPa 항체로 치료하였거나 치료하지 않은 마우스에서 폐 전이 결절의 수를 나타낸다. 동위 원소 대조군으로 처리한 마우스는 다이아몬드로 표시하고, p84 항체로 처리한 마우스는 원형으로 표시하고, MY-1 항체로 처리한 마우스는 사각형으로 표시된다. 대조군과 각 항-SIRPa 항체간에 유의미한 결과가 나왔다.
SIRPa 변이체 v1 및 v2, SIRPb 및 SIRPg의 막 원위 도메인 단백질 서열 정렬 및 단백질 서열로의 SNP의 위치측정(localization) (1에서 16까지 번호가 매겨진 화살표). 도면에서 회색 직사각형은 펩티드 신호 서열에 해당하고, 굵은 밑줄은 항-인간 SIRPa 항체에 의해 인식되는 선형 에피토프를 나타내며, 회색 파선의 직사각형은 항-인간 SIRPa v1 항체에 의해 인식되는 입체형태 에피토프를 나타낸다. 서열 번호 32 내지 35는 각각 도 1에 "P78328_SIRPA_HUMAN_Variant1", "SIRPA_HUMAN_Variant", "O00241_SIRPB_HUMAN" 및 "Q9P1W8_SIRPG_HUMAN"으로 기재된 서열이다.
도 2. 혈액 단핵구에 의해 발현된 인간 SIRPa 변이체 V1 및 V2에 대한 SIRPa 항체의 결합.
SIRPa 엑손 3에 대해 이미 시퀀싱된 건강한 도너(donor)가 선택되었다. 형광물질-활성 세포 분석 (florescce-activated cell sorting, FACS)을 이용하여, SIRPa V1/V1 및 SIRPa V2/V2 동형 접합체와 SIRPa V1/V2 이형 접합체로부터 선택된 도너의 혈액 단핵구 상에서 자가제조(in-house) 항-SIRPa 항체(도면에서 좌측의 항-SIRPa v1-FITC)와 상용 SE7C2(도면에서 우측)의 결합을 시험하였다.
도 3. SIRPa v1/v1 동형 접합 도너, SIRPa v1/v2 이형 접합 도너 또는 SIRPa v2/v2 동형 접합 도너의 혈액 단핵구에 대한 항 인간 SIRPa v1 항체의 길항 활성.
동형 접합 또는 이형 접합 도너 세포를 사용하여 SIRPa-CD47의 상호 작용에 대한 항-인간 SIRPa v1 항체의 FACS에 의한 경쟁 분석.
항-인간 SIRPa v1 항체의 용량 반응을 사용하여 서로 상이한 도너로부터 얻은 SIRPa 변이체에 대한 CD47의 결합과 경쟁하였다. CD47 결합의 백분율은 대조군에 대하여 정규화되고, 결과는 각 세포 도너하여 나타낸다: V2/V2 동형 접합(삼각형), V1/V2 이형 접합(정사각형), 및 동형 접합 V1/V1 (원형).
도 4. Elisa에 의한 항-인간 SIRPa v1 항체 및 Kwar 항체를 사용한 SIRPa 변이체 결합에 관한 연구.
마우스 Fc 도메인에 연결된 고정시킨 SIRPa 돌연변이 변이체(v1에서 v8까지의 SIRPa, 실시예 1의 표 2 참조)에 대한 ELISA에 의한 결합 평가.항-인간 SIRPa v1 항체 및 Kwar 항체(SIRPa v1과 SIRPa v2 모두에 결합하는 것으로 알려짐)가 서로 상이한 SIRPa 돌연변이 변이체에 결합하는 능력을 비교하였다. 이는, 당나귀 항-인간 항체를 가지고 수행하였으며, TMB 기질을 이용하여 450nm 파장에서 측정하는 비색계에 의해 밝혀졌다. 본 분석에서, ED50 (ng/ml)은 신호의 50 %에 도달할 때 표시된 항체의 농도이다.
도 5. 수지상 세포(DC)에 의한 마우스 항원의 교차 전달.
마우스 DC에 Ovalbumin 항원을 미리 충전하고 OTI 또는 OTII 마우스 (OVA MHC I 또는 II 전용 TCR 발현을 위한 유전자 이식 동물)의 유전자 이식 T 세포와 함께 배양하였다. T 세포 증식은 티미딘 혼입(OTI CD8 + T 세포, 또는 OTII CD4 + T 세포)을 이용하여 여러가지 조건에서 측정하였다: 항원(Ag) 없는 대조군(텅빈 원형) 또는 동기준 항체 대조군(십자표), 쥐의 항-SIRPa 항체 P84 (정사각형) 및 MY1 (원형) 또는 항-CD47 항체(삼각형). A: OTI CD8 양성 T 세포에서 얻은 결과. B: OT-II CD4 양성 T 세포에서 얻은 결과.
도 6. 수지상 세포에 의한 인간 항원의 교차 전달.
HLA-A2 + HV의 단핵구를 SIRPa에 대하여 표현형 지정을 하였고, 동형 접합(v1/v1) 단핵구와 이형 접합(v1/v2) 단핵구를 모두 두 가지 유형의 실험에 사용하였다. A. CD8 + T 세포에서 IL-2 발현. SIRPa v1 동형 접합 미성숙 DC를 가지고 얻은 결과는 원형으로 표시하고, SIRPa v1/v2 이형 접합 미성숙 DC를 가지고 얻은 결과는 정사각형으로 표시한다. Melan-A 적재된 미성숙 DC를 사용하여 Melan-A/HLA-A2+ 특이적 흉선종 클론을 활성화시켰고, 이는 배양 48 시간 후 IL-2 분비에 의해 측정되었다. B. Melan-A 로딩된 iDC로 자극된 CD8 + T 세포에서의 IFNg 발현. iDC는 이전에 loading phase에서 여러가지 항체와 함께 배양되었다. 이 때 사용한 항체들은 항-SIRPa v1 (원형), 항-SIRPa/g (정사각형), 항-SIRPa v1 + 항-SIRPa/g (다이아몬드), B6H12 (역삼각형) 및 CC2C6 (삼각형)이다. IFNg의 발현은 유동 세포 분석를 이용하여 평가하였다.
도 7. 수지상 세포의 존재하에 항-인간 SIRPa v1 및 항-인간 CD47 항체에 대한 T 세포(CD4 및 CD8 양성 세포)의 동종 반응.
건강한 지원자로부터 말초 혈액 단핵 세포에서 분리된 인간 T 세포를 5 일 동안 DC 세포 하나 당 T 세포 5의 비율로 동종 수지상 세포(DC)로 자극하였다. 항체는 배양 0 일에 첨가하였다. A: 배양 마지막 12 시간 동안 H3-티미딘의 혼입(incorporation)에 의해 측정된 증식. B: ELISA에 의해 측정된 IFNg 분비량의 백분율. 결과를 대조군 조건으로 정규화하였다. 항-SIRPa v1 (정사각형)은 SIRPa v2 및 SIRPg에 결합하지 않는 SIRPa v1에 특이적인 자가제조(in-house) 항체로 처리된 세포에 해당한다. CD47 mAb (삼각형)는 CD47에 결합하는 항체로 처리된 세포에 해당한다.
도 8. 항-SIRPa v1 항체로 처리된 V1/V1 및 V1/V2 공여 단핵구를 비교하는 대식 세포 분극 생물 검정법.
MIP-1a/CCL-3 및 MIP-1b/CCL-4 분비는 무처리 세포(원형) 또는 항-인간 SIRPa v1 항체로 처리한 세포(사각형)의 상등액에서 ELISA를 이용하여 측정하였다. A: 동형 접합 도너 V1/V1의 세포를 가지고 얻은 결과. B: 이형 접합 도너 V1/V2의 세포를 가지고 얻은 결과.
도 9. FACS에 의한 SIRPa v2에 대한 인간 단핵구 동형 접합체상의 항-SIRPa 항체의 결합 분석 및 ELISA에 의한 SIRPa v2에 대한 항체의 ED50 측정.
키메라 18D5 항체 또는 SIRP29 항체 또는 다른 인간화 항-SIRPa 항체의 인간 단핵구 v2/v2 (이전에 인간 Fc 수용체 결합 억제제로 염색되었음)에 대한 세포 형광 측정법을 이용한 평가. Cantoll 세포 측정기에서 PE 표지된 마우스 항-인간 Fc mAb를 사용하여 수행하였다. ED50은 신호의 50%에 도달하는 표시된 항체의 농도이다. A: 염색된 양성 세포 v2/v2의 형광 강도의 평균치. B: 각 항체에 대한 ELISA에 의한 ED50 존재 여부의 결정. ED50은 대부분의 인간화 18D5 항체에서 검출되지 않았다.
도 10. 항-SIRP 항체와 함께 사전 배양된 인간 SIRPg 재조합 단백질에 대한 CD47의 Blitz에 의한 경쟁 분석.
SIRPg-His 재조합 단백질을 NINTA 바이오 센서에 10 μg/ml로 고정하고 표시된 항체를 20μg/ml (포화 농도)로 첨가하였다. 그 다음, CD47Fc를 100 μg/ml로 첨가하고 120 초의 결합 기간(ka)에 이어 120 초(kd)의 해리 기간 후에 친화력 값을 추론하여 친화성 상수(KD)를 결정하였다. SIRPg에 대한 CD47의 KD 친화력은 여러 가지 조건에서 결정하였다: LSB2.20 항체(SIRPg에 특이적으로 결합하는 항체); kwar 항체 및 SIRP29 항체.
도 11. 유방암의 마우스 전이 모델에 대한 항-SIRPa 항체의 효과.
4T1 유방암 모델은 폐 전이에 대한 마우스 항-SIRPa (p84 항체 및 MY-1 항체)의 효율성 연구에 사용하였다. 도면은 항-SIRPa 항체로 치료하였거나 치료하지 않은 마우스에서 폐 전이 결절의 수를 나타낸다. 동위 원소 대조군으로 처리한 마우스는 다이아몬드로 표시하고, p84 항체로 처리한 마우스는 원형으로 표시하고, MY-1 항체로 처리한 마우스는 사각형으로 표시된다. 대조군과 각 항-SIRPa 항체간에 유의미한 결과가 나왔다.
실시예 1: 항-인간 SIRPa v1 항체의 생산을 가능하게 하는 에피토프의 확인
인간 SIRPa는 CD47과 상호 작용하는 IgV 도메인 1에서 일정 수준의 다형성을 나타내는 것으로 앞서 설명하였다. 이 다형성은 주로 SIRPa 유전자의 엑손 3(서열 번호 27)에 위치한다 (Takenaka et al., 2007). Takenaka 등의 연구자들은 기원이 다른 37 개 도너의 게놈 서열에 대하여 2 개의 주요 대립 유전자인 변이 1 (v1) 및 변이 2 (v2)와 함께 10 개의 서로 다른 서열/대립 유전자를 확인하였다. 다른 대립 유전자들은 V1 또는 V2 서열과 1 개 또는 2 개의 SNP만 다르다. 따라서 SIRPa 제품군은 SIRPa v1 이소폼 및 SIRPa v2 이소폼의 두 개의 하위 단백질군으로 세분된다. 이러한 다른 대립 유전자는 약간 다른 단백질을 생성하지만 모든 변이체는 유사하게 CD47 리간드에 결합한다. Takenaka et al.에서 v1의 대립 유전자 빈도가 78 % (V1 및 V1 유사의 경우 89 %)인 반면, 동형의 V1/V1 유사 도너의 유전자형 빈도는 65 %이다. 37 명의 도너 중 24 %가 이형 접합형을 나타냈다.
SIRPA V1 및 V2의 암호화 DNA 및 단백질 서열:
인간 SIRPa 서열의 V1은 ncbi (유전자 ID: 140885)에서 얻었다.
SIRPa v1 엑손 3의 게놈 DNA 참조 서열 (전사체 SIRPA-201 ID ENST00000400068.7) (서열 번호 27):
GAGTGGCGGGTGAGGAGGAGCTGCAGGTGATTCAGCCTGACAAGTCCGTGTTGGTTGCAGCTGGAGAGACAGCCACTCTGCGCTGCACTGCGACCTCTCTGATCCCTGTGGGGCCCATCCAGTGGTTCAGAGGAGCTGGACCAGGCCGGGAATTAATCTACAATCAAAAAGAAGGCCACTTCCCCCGGGTAACAACTGTTTCAGACCTCACAAAGAGAAACAACATGGACTTTTCCATCCGCATCGGTAACATCACCCCAGCAGATGCCGGCACCTACTACTGTGTGAAGTTCCGGAAAGGGAGCCCCGATGACGTGGAGTTTAAGTCTGGAGCAGGCACTGAGCTGTCTGTGCGCG
SIRPa v1의 아미노산 서열 (Genbank reference NP_001035111.1 (UniProtKB: P78324) (서열 번호 3):
MEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAARATPQHTVSFTCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESVSYSIHSTAKVVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVPPTLEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVSRTETASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVEHDGQPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAAENTGSNERNIYIVVGVVCTLLVALLMAALYLVRIRQKKAQGSTSSTRLHEPEKNAREITQDTNDITYADLNLPKGKKPAPQAAEPNNHTEYASIQTSPQPASEDTLTYADLDMVHLNRTPKQPAPKPEPSFSEYASVQVPRK
SIRPa v2의 아미노산 서열 (서열 번호 28):
변이체 2 단백질 서열은 Takenaka et al., 2007에서 참고하였다. 암호화 DNA 서열은 ncbi에서 얻었다 (GenBank: BC075849.1). ncbi 데이터베이스에서 이 변이체에 대한 유전자 서열은 발견되지 않았다.
MEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAARATPQHTVSFTCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESVSYSIHSTAKVVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVPPTLEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVSRTETASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVEHDGQPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAAENTGSNERNIYIVVGVVCTLLVALLMAALYLVRIRQKKAQGSTSSTRLHEPEKNAREITQDTNDITYADLNLPKGKKPAPQAAEPNNHTEYASIQTSPQPASEDTLTYADLDMVHLNRTPKQPAPKPEPSFSEYASVQVPRK
SIRPa v2 exon 3의 게놈 DNA 참조 번호 (서열 번호 31):
GAGTGGCGGGTGAGGAGGAGCTGCAGGTGATTCAGCCTGACAAGTCCGTATCAGTTGCAGCTGGAGAGTCGGCCATTCTGCACTGCACTGTGACCTCCCTGATCCCTGTGGGGCCCATCCAGTGGTTCAGAGGAGCTGGACCAGCCCGGGAATTAATCTACAATCAAAAAGAAGGCCACTTCCCCCGGGTAACAACTGTTTCAGAGTCCACAAAGAGAGAAAACATGGACTTTTCCATCAGCATCAGTAACATCACCCCAGCAGATGCCGGCACCTACTACTGTGTGAAGTTCCGGAAAGGGAGCCCTGACACGGAGTTTAAGTCTGGAGCAGGCACTGAGCTGTCTGTGCGTGCa
SIRPa v1, SIRPa v2, SIRPb 및 SIRPg의 D1 도메인의 아미노산 서열은 도면 1에 나타낸 바와 같이 정렬되었다.
생물 정보학에 의한 유전자형 주파수 분석
인간의 SIRPa 다형성에 대한 보다 많은 데이터를 탐색하기 위하여 "1000 게놈 프로젝트"(1KG, > 2500 개의 다른 인간 게놈)의 데이터를 사용하여 인간 SIRPa 엑손 3에서 관련 SNP를 확인하였다. 본 발명의 발명자들는 Haploview를 사용하여 SIRPa SNP가 2 개의 일배 체형 블록으로 분리되었음을 확인하였다 (데이터는 표시되지 않음).
유전자형 빈도를 조사하고 동형 접합의 도너와 이형 접합의 도너의 차이를 분석하기 위하여, 발명자들은 먼저 인간 SIRPa 엑손 3(문헌에서 알려진 다형성 엑손 및 리간드와의 결합을 담당하는 엑손) 내에서 18 개의 SNP (표 1)를 확인하고 코돈 변화 (아미노산 서열의 변화)와 연관된 SNP를 유지하였다. SNP는 1 번부터 18 번까지 번호가 부여되었다. 1 SNP는 문헌에 알려지지 않았기 때문에 분석하지 않았다. SNP7 및 SNP18은 둘 다 동의 코돈에 해당하기 때문에 유전자형 빈도 측면에서 분석하지 않았다 (단백질 수준에서 변화 없음). 그런 다음, 발명자는 5 개의 슈퍼 인구에서 5000 명 이상의 도너를 포함하는 1000 개의 게놈 3 단계 프로젝트를 통해 SNP 대립 유전자 및 유전자형 빈도를 확인하였다: n = 1030 동아시아 (EAS), n = 1010 유럽 (EUR), n = 1338 아프리카 (AFR), n = 704 AMR (Ad Mixed American), 및 n = 988 남아시아 (SAS). 1000 개의 게놈 3 단계 프로젝트의 모든 개별 도너들이 고려되고 있다.
표 1: SIRPa 변이와 그 아미노산 위치에서 SNP의 확인
| 뉴클레오티드 변이(SIRPa v1 - SIRPA v2) | 아미노산 위치 및 변이 (SIRPA v1 - SIRPA v2) | Rs 번호 | |
| SNP1 | g-a | 44 L-S | rs386811660 |
| SNP2 | a-t | 50 T-S | rs17855609 |
| SNP3 | a-g | 51 A | rs17853846 |
| SNP4 | c-t | 52 T-I | rs17855610 |
| SNP5 | g-a | 54 R-H | rs17855611 |
| SNP6 | c-t | 57 A-V | rs17855612 |
| SNP7 | t-c | 60 L | rS17853847 |
| SNP8 | g-c | 75 G-A | rs1057114 (=rs72620874) |
| SNP9 | c-g | 95 D-E | rs138283486 |
| SNP10 | c-t | 96 L-S | rs149634649 |
| SNP11 | t-c | 97 T | rs146163282 |
| SNP12 | a-g | 100 N-E | rs17855613 |
| SNP13 | c-a | 101 N | rs17855614 |
| SNP14 | c-a | 107 R-S | rs17855615 |
| SNP? | g-a | 109 G-S | |
| SNP15+ SNP16 | gt - ac | 132 V - T | rs115287948 rs114499682 |
| SNP17 =(SNP15 + SNP16) | gt - ac | 132 V - T | s386811663 |
| SNP18 | c - t | 145 R | rs6136375 |
그런 다음, 발명자들은 대략 비슷한 빈도(<1 % 차이)로 물리적으로 인접한 SN를 클러스터링하고 인구 유전학에 따라 이러한 클러스터링된 SN의 평균 빈도를 원형 차트에 플로팅하였다. 최종적으로 두 가지 방법(선형 또는 형태적 방법)에 의해 결정된 자가제조(in-house) 항-인간 SIRPa v1 항체 에피토프와의 상관 관계를 수행하였다 (V2/V2 도너에 대한 낮은 결합을 표시하고, V2/V2에 대한 CD47 결합을 제대로 차단하지 않기 때문). 또한, SIRP 감마의 돌연변이와 관련된 SNP를 고려하였다 (자가제조(in-house) 항체가 SIRP 감마에 결합하지 않기 때문). 마지막으로, 본 발명자들은 자가제조(in-house) 항체가 원숭이와 교차 반응하지 않기 때문에 인간 SIRPa V1, 인간 SIRPa V2 및 사이 노몰 구스(Macaca fascicularis) 또는 붉은털 원숭이 (Macaca mulatta)에서 발견되는 돌연변이간의 서열 차이를 비교하여 이 분석을 강화하였다.
SNP와의 Anti-SIRPa 결합 관계:
방법: 항-SIRPa 항체의 결합 활성을 ELISA로 평가하였다. ELISA 분석의 경우, 자가제조(in-house) 항-인간 SIRPa v1 항체 및 Kwar 항체를 8 개의 서로 다른 돌연변이 hSIRPa (SIRPA v1 ~ v8, 표 2 참조) 상에서 시험하였다. 돌연변이된 hSIRPa (SIRPa v1 ~ v8)의 다양한 변이체를 탄산염 완충액 (pH9.2)에서 0.5 μg/ml로 플라스틱에 고정하고 정제된 항체를 추가하여 결합을 측정하였다. 배양 및 세척 후, 과산화효소 표지된 당나귀 항-인간 IgG (Jackson Immunoresearch; USA; 참조 번호 709-035-149)를 첨가하고 통상적인 방법으로 밝혀내었다.
결과: 자가제조(in-house) 항-인간 SIRPa v1 항체 결합 능력에 대한 인간 SIRPa SNP의 영향을 평가하기 위하여 8 개의 서로 상이한 재조합 인간 SIRPa 단백질을 생성하였다 (표 2). 이러한 SIRPa 단백질의 세포 외 도메인은 IgG2a의 마우스 Fc와 융합되었고, 이러한 SIRPa 변이체에 대한 자가제조(in-house) 항-인간 SIRPA v1 항체의 결합 능력이 평가되었다 (그림 4). 자가제조(in-house) 항체는 SNP 15 + 16이 V1 서열에서 돌연변이 될때 ELISA에서 결합 특성을 잃는다 (그림 4A). 본 출원에 개시된 실험에서, 사용된 항-인간 SIRPa v1 항체는 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 도메인과, 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 도메인을 갖는 항체에 해당한다. 다른 SNP 돌연변이는 자가제조(in-house) 항체 결합 특성을 변경하지 않았다. 이와 비교하여, KWAR23 (V1 및 V2 모두에 결합하는 것으로 설명되는) 결합 특성은 SNP 돌연변이 중 어느 하나로 변형되지 않았다 (도 4B). 이로써, SIRPa V8 (SNPs15 + 16) 단백질이 작동한다는 것과, SNP 15 + 16의 주변으로 위치측정된 에피토프를 포함하는 항체를 이용하면 SIRPa v2를 인식하거나 특이적으로 결합하지 않는 항-SIRPa v1 항체의 생산이 가능하다는 것을 확인하였다.
표 2: SIRPa 재조합 단백질
| SIRPa V1 |
| SIRPa V2 |
| SIRPa V3 (SNP1+2+3+4+5+6) |
| SIRPa V4 (SNP8) |
| SIRPa V5 (SNP9+10+11) |
| SIRPa V6 (SNP12+13) |
| SIRPa V7 (SNP14+?) |
| SIRPa V8 (SNP15+16) |
항체 특성에 대한 SIRPA 다형성의 영향 - 단핵구에 대한 FACS에 의한 길항제 분석SIRPA-CD47
방법: 인간 단핵구(DTC 플랫폼, 낭트(Nantes)에서 인간 PBMC로부터 용출에 의해 정제되고 -80 ℃ 또는 액체 질소에서 10M/ml 농도의 DMSO에서 동결됨)를 40 mL의 완전 RPMI 배지에서 해동시켰다. 그런 다음, 즉시 1000rpm의 속도로 10 분 동안 원심 분리하였다. 세포를 10mL의 RPMI 배지에 재현탁하고 Malassez 세포에서 카운트하였다. 냉동 인간 단핵구를 해동하고 희석된 샘플을 추가한 다음, 비오틴화된 CD47Fc를 첨가하였다. 비오틴화된 CD47Fc는 스트렙타비딘-PE (streptavidin-PE)를 이용하여 밝혀내고, 유동 세포 분석을 이용하여 형광도를 측정한다. 다음의 프로토콜이 적용되었다: V-bottom P96 플레이트에 웰당 100,000 개의 인간 단핵구를 넣는다; 2500 rpm의 속도로 1 분 동안 원심 분리하고 플레이트를 튕겨 웰을 비운다; 200μL의 PSE로 세포를 2 회 세척한다 (2500rpm에서 1 분 동안 원심 분리하고 웰을 비운다); 10 μg/mL (농도 2 배, 최종 농도 5μg / mL)로 시작하여 3 단계로 희석하여 샘플의 8 가지 희석물을 준비한다; 세포에 12.5μL의 샘플/웰을 첨가하고 혼합한다; 얼음 위에서 15 분 배양한다; 2 배 농축 된 CD47Fc 비오틴화 용액을 준비하고 paragraph의 기능에 따라 결정하고 이 용액/웰의 12.5μL을 세포에 첨가하고 혼합한다; 얼음 위에서 30 분 동안 배양한다; 175μL의 PSE 을 첨가한다(2500rpm에서 1 분 동안 원심 분리하고 웰을 비운다);. 200μL의 PSE로 세포를 2 회 세척한다(2500rpm에서 1 분 동안 원심 분리하고 웰을 비운다). CD47Fc 비오틴화를 위하여 중간 농도를 선택한다. 여기에서, 비오틴화된 5 μg/mL의 CD47Fc를 길항제 시험에 사용한다. 이 단계는 CD47 양성 세포의 비율이 개별 도너에 따라 다르기 때문에 매번 이루어져야 한다: streptavidin-PE를 1/1000으로 희석하고, 웰당 25 μL를 첨가하고 얼음 위에서 15 분 동안 배양한다; 웰당 175 μL PSE를 첨가한다; 2500rpm 속도로 1 분 동안 원심 분리하고 웰을 비운다; 200 μL의 PSE로 세포를 2 회 세척한다 (2500rpm에서 1 분 동안 원심 분리하고 웰을 비운다); 염색된 세포를 V-bottom P96 canto plate에 옮기고 BD canto II에서 분석한다.
결과: 발명자들은 사전에 SIRPa 엑손 3에 대해 시퀀싱된 건강한 도너의 혈액 단핵구에 대한 유세포 분석을 통하여 자가제조(in-house) 항-SIRPa v1 항체의 결합 특성을 분석하였다 (도 2). V1/V1 동형 접합 도너, V2/V2 동형 접합 도너 및 V1/V2 이형 접합 도너를 선택하였다. 도 3은 항-인간 SIRPa v1 항체가 V2/V2 도너에 훨씬 덜 결합하는 것을 나타낸다. 이에 비해, 본 발명자들은 상용 항-SIRPa mAb (클론 SE7C2)가 V2 단백질에만 결합한다는 것을 발견하였다. SE7C2 데이터는 V2/V2 도너가 V1/V2 도너와 비교하여 표면에서 유사한 수준의 SIRPa 단백질을 발현하는 것을 나타낸다. 이는, V2/V2에 대한 항-인간 SIRPa v1 항체의 결합이 감소된 것은 발현 수준이 감소해서가 아니라 낮은 것 때문이 아니라SIRPa v2 단백질에 대한 항체의 결합이 감소하기 때문임을 확인한 것이다 (도 2).
그런 다음, 본 발명자들은 건강한 도너에서 얻은 혈액 단핵구에 결합하는 재조합 인간 CD47 단백질의 결합을 방지하기 위여 자가제조(in-house) 항-인간 SIRPA v1 항체의 길항제 특성을 유동 세포 분석법으로 분석하였다 (도 3). CD47-Fc의 결합에 대한 길항 효과에 미치는 SIRPa 다형성의 영향을 연구하기 위하여, SIRPa에 대하여 유전자형화된 냉동 인간 단핵구에 대해 길항 분석을 수행하였다. 도 3에 나타낸 데이터는 항-인간 SIRPa v1 항체가 V1/V1 도너(n = 3)에 대한 CD47의 결합을 크게 억제하는 반면, 이형 접합 V1/V2 도너(n = 5)에 대한 CD47의 결합은 절반만 감소시킨다는 것을 보여준다. 항-인간 SIRPa v1 항체의 약한(25 %) 길항제 작용이 동형 접합 V2/V2 도너(n = 3)에서 관찰된다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 자가제조(in-house) 항체는 SIRPa V1을 인식하고 SIRPa V2는 매우 약하게 인식하였다. 즉, 자가제조(in-house) 항체는 SIRPa에 대해 동형 접합 V1/V1 인 인간 단핵구에 대해서는 CD47-Fc 결합에 강한 길항 효과를 나타내고, 동형 접합 V2/V2 인간 단핵구에 대해서는CD47-Fc 결합에 매우 약한 길항 효과를 나타내고, 이형 접합 V1 / V2 인간 단핵구에 대해서는 CD47-Fc 결합에 중간 정도의 길항 효과를 나타낸다.
결론
SIRPa의 다형성은 CD47 결합에 영향을 미치는 것으로 설명되지 않았지만 항-인간 SIRPa 단일 클론 항체에 의한 인식에 영향을 미칠 수 있다. Takenaka et al.에 의해 여러 변종이V1 또는 V2 서열과 높은 서열 상동성을 가지는 것으로 결정되었다. 다른 변이체는 V1과 V2 서열 사이의 다른 조합을 나타내며 대부분의 유전자형에 따라 V1 유사 또는 V2 유사 변이체로 간주될 수 있다. 이 결과는 SIRPa에 대한 두 가지 주요 변이인 V1과 V2가 있음을 보여주는 1000 개의 게놈 데이터로 확인되었다. 변이 1은 동아시아 슈퍼 인구를 제외한 전 세계 인구에서 가장 빈번하게 나타난다. 본 발명의 SNP 분석에 따르면, 에피토프와 관련된 SIRPa V1 대립 유전자 빈도 (V1/V1 및 V1/V2)로 인하여 항-인간 SIRPa v1 항체의 생산 및/또는 선택이 미국과 유럽에서 76-86%가 가능하고, V1/V1 동형 접합 환자는 미국 및 EU 인구의 40-50 %를 차지한다 (SNP 15 및 16 빈도 기준). n = 184 도너에 대한 발명자 분석에 의하면, 자가제조(in-house) 항-인간 SIRPa v1 항체가 v1 도너 (V1/V1 및 V1/V2)의 83-86 %에 강하게 결합하는 것으로 나타났다. V1/V1 동형 접합 도너는 분석된 코호트의 40 ~ 50 %를 차지한다. CD47 길항 분석은 자가제조(in-house) 항체가 결합의 절반 만 방지한다는 것을 흥미롭게 보여주고 있지만, 도 8에 나타낸 대식 세포 분극 및 도 6에 나타낸 인간 수지상 세포에 의한 종양-항원 교차 전달에 대한 기능적 분석에 의하면, 자가제조(in-house) 항-인간 SIRPa v1 항체는 V1/V1 도너와 V1/V2 도너 모두에서 동일한 생물학적 효능을 나타낸다.
실시 예 2: 마우스와 인간 사이의 면역 교차 전달에 대한 SIRPa-CD47 상호 작용 차단의 비교.
마우스 교차 전달 (도 5)
약제: 마우스 SIRPα (P84 클론 -rat IgG1)의 도메인 2를 표적으로하는 알로스테 릭 길항성 단일 클론 항체를 하이브리도마로부터 정제하였다. 마우스 SIRPa의 도메인 1을 표적으로하는 오르소스테릭 길항성 단일 클론 항체(MY-1 클론 - 마우스 IgG2a) (Garcia et al., 2011)는 모 하이브리도마로부터 IgG1 Fc 도메인으로 재설계하였다. 두 개의 항-SIRPa 항체 모두가 골수 세포에서 SIRPa를 통한 신호 전달을 차단한다. 동기준 대조군 마우스 IgG1 (3G8 클론)을 정제하였다. 대용의 길항성 항-마우스 CD47 단일 클론 항체 (MIAP410 클론)는 BioXCell (# BE0283)에서 구입하였다.
비장 DC에 의한 마우스 SIRPa 발현:
CD11c 양성 자기(magnetic) 선택법을 이용하여 나이브 마우스의 비장으로부터 천연 DC를 분리하고 BD FACS ARIA II를 사용한 세포 분류(cell sorting)을 이용하여 CD8α 발현을 위하여 분리하였다. 문헌에 기재된 바와 같이, CD8α-/-DC (SIRP의 발현 수준이 높음)와 비교하여SIRPa log/neg CD8α+/+DC는 항원(Ag) 교차 전달에 있어서 최고의 항원 전달 세포(APC)이다 (Haan et al., 2000; Hochrein et al., 2001). 그러나 DC의 두 가지 하위 유형은 MHC 클래스 II 분자에 동등하게 외인성 항원(Ag)를 적재하고 전달하였다. 발명자들은, OVA 및 OT-IT 세포를 가지고 항원(Ag) 교차 전달에 대한 SIRPa의 역할을 평가하는 데 사용된 프로토콜이 이러한 DC의 특성을 재현한다는 것을 보여주었다 (데이터는 표시되지 않음). 실제로, OT-II 세포(CD4+ Ovalbumin 특이적 TCR-형질 전환 마우스로부터 얻음)의 증식으로 나타난 바와 같이외인성 항원 전달이 비장 DC의 두 가지 하위 유형에 모두 높게 나타나는 반면에, 실제로는 MHC 클래스 I 분자 상에서 항원 처리, 적재 및 전달이 우월하게 나타나는CD8α-/-DC 보다 CD8α+/+DC가 OT-I T 세포(CD8+ Ovalbumin 특이적 TCR-형질 전환 마우스로부터)의 증식을 더 크게 유도한 것으로 관찰되었다. 따라서, SIRPa의 발현은 항원을 CD8+ T 세포에 교차 전달하는 수지상 세포의 능력과 역 상관되며, 이는 SIRPa가 마우스에서 교차 전달을 억제하고 있음을 시사한다.
마우스 항원 교차 전달:
CD8α+/+DC 및 CD8α-/-DC에 GM-CSF의 존재하에 밤새 오발부민 (OVA)을 적재하였다. 이후, OT-I 형질 전환 마우스의 비장에서 분리한 CD8+ T 세포와 OT-II 형질 전환 마우스의 비장에서 분리한 CD4+ T 세포를 OVA가 적재된 DC 아형과 함께 3 일 동안 배양하였다. 형질전환 마우스는 OVA MHC I (OT-I) 및 II (OT-II)에 특이적인 TCR을 발현한다. 증식은 마지막 16 시간의 배양 과정에서 H3-티미딘 혼입(incorporation) 방법을 이용하여 평가하였다. 항-SIRPa mAb는 DC를 OVA 단백질과 함께 배양하는 단계와 OVA가 적재된 DC를 사용한 T 세포 증식 단계에서 10 μg/ml만큼 첨가하였다. 이 프로토콜에 따르면, DC에 의한 단백질 처리 단계에서의 SIRPa의 차단과 그 다음 DC에 의한 MHC 클래스 I 분자에 의한 CD8 OT-I T 세포로의 OVA 펩티드 전달과 MHC 클래스 II 분자에 의한 CD4 OT-II T 세포로의 OVA 펩티드 전달(각각 항원 교차 전달과 외인성 항원 전달을 나타냄)의 영향을 평가할 수 있다.
발명자들은 마우스에서 SIRPa 또는 CD47의 차단이 SIRPa + 비장 수지상 세포에 의한 항원 전달을 증대시켰음을 보여준다. CD8α +/+ DC (SIRPa low/neg)는 OVA를 OT-I T 세포로 교차 전달하는 능력과 관련하여 SIRPa/CD47 경로의 차단으로부터 영향을 받지 않았다 (표시되지 않음). 그러나 P84 또는 MY-1 차단 항체를 이용하여 SIRPa를 차단하거나 MIAP410을 이용하여 CD47을 차단하면 CD8 + OT-I 증식 증가로 반영된 바와 같이 CD8α-/-SIRPa + DC에 의한 항원(Ag) 교차 전달을 향상시킨다 (도 5A).
외인성 항원 전달:
본 발명자들은 외인성 항원(Ag) 전달에 대한 SIRPa/CD47 차단의 효과를 분석한 결과, SIRPa low/neg-CD8α +/+ DC에 의한 Ag 전달이 SIRPa/CD47 경로의 차단에 의해 변형되지 않음을 발견하였다 (표시되지 않음). 교차 전달 과정과 유사하게, SIRPa 양성 CD8α-/-DC에 대한 SIRPa/CD47 차단은 CD4 + OT-II 세포 증식에 의해 측정된 MHC 클래스 II 분자에 대한 외인성 항원의 처리 및 전달을 증대시켰다 (도 5B).
결론
발명자들은, 마우스에서 SIRPa/CD47 경로 (항-SIRPa 또는 항-CD47 mAb 사용)를 차단하면 MHC-I 항원 교차 전달(T CD8 반응) 및 MHC-II 항원 전달(T CD4 반응)이 모두 증가함을 증명하였다. 이러한 결과는 다른 연구자들(Liu et al., 2016, 2015; Xu et al., 2017)의 주장을 확인한 것이다.
인간 교차 전달 (도 6)
약물: 본 발명의 발명자들은 인간 SIRPα (자가제조(in-house) 항-인간 SIRPA v1 항체 - 인간 IgG4)를 표적으로하는 길항성 단일 클론 항체를 생성하고 정제하였다. 동기준 대조군 인간 IgG4는 Biolegend (QA16A15 클론)에서 구입하였다. 인간 CD47 (B6H12 클론)을 표적으로 하는 길항성 모노클론 항체는 BioXCell (# BE0019-1)에서 구입하였으며, BioLegend (# TBD2)에서 얻은 CC2C6 클론을 사용하였다. 일부 실험에서, 항-SIRPa : g 항체 (WO201356352의 클론 SIRP29)는 단독으로 또는 자가제조(in-house) 항-SIRPa V1 항체와 조합하여 사용하였다.
MELAN-A 특이적 반응:
인간 세포에 의한 교차 전달은HLA-A2 / Melan-A 복합체를 특이 적으로 인식하는 TCR-특이적 T 세포로 흑색종 종양 관련 항원 (TAA)의 Melan-A의 긴 펩티드(25-mer, 이는 펩티드가 프로세싱되지 않고 Class I MHC 분자에 "도킹"할 수 없음을 의미함)이 HLA-A2 + DC에 의하여 전달되는 것으로 평가하였다. 두 개의 서로 상이한 TCR-특이적 T 세포를 이용하여 항원 교차 전달을 평가하였다. 첫 번째 클론은 HLA-A2/Melan-A 복합체에 특이적인 흑색종 환자의 T 림프구 클론이었다 (프랑스 낭트 대학교, N. Labarri
re 박사, Vignard at al., J. Immunol 2005). 두 번째 클론은 동일한 흑색종 환자의 T-세포 클론의 TCR로 형질 도입되고 인간 CD8 공동 수용체로 형질 감염된 형질 전환 쥐 흉선종 세포주였다. DC는 HLA-A2 + 건강한 도너 (HV; Etablissement Franηais de Sang, Nantes의 도너)의 혈액 단핵구에서 시험관 내 생성되었다. 한편, 단핵구는 SIRPa의 다형성에 대해 표현형이 지정되었다. GM-CSF 및 IL-4를 사용하여 7 일 동안 배양한 후, 미성숙 DC (iDC)가 유도되었다. 그런 다음, iDC를 SIRPa/CD47 경로를 표적으로하는 길항성 항체의 존재하에 Melan-A의 긴 25-mer 펩티드로 하룻밤 동안 적재하고 마지막으로 두 개의 서로 상이한 Melan-A/HLA-A2 특이적 T 세포 클론과 함께 독립적으로 배양하였다. 흑색종 환자의 인간 T 세포 클론은 Melan-A-loaded iDC와 함께 5 시간 동안 배양하고 T 세포 활성화를 IFNg의 세포 내 염색에 의해 유동 세포 분석법을 이용하여 평가하였다.
TCR 형질전환 흉선종 클론은 Melan-A-적재된 iDC와 함께 48 시간 동안 배양하였고 T 세포 활성화는 IL-2 분비에 대해 ELISA를 이용하여 평가하였다.
프로토콜을 검증하기 위하여, HLA-A2 음성 도너의 Melan-A-적재된 iDC를 음성 대조군으로 사용하고 HLA-A2 + HV에서 언로드된 iDC를 사용했습니다. 결과(미도시)는 HLA-A2 + Melan-A-적재 iDC만이 인간 T 세포 클론에 의해 IFNg 분비를 유도할 수 있음을 보여주었다. 뮤린 흉선종 세포에 의한 IL-2의 분비는 HLA-A2 양성 도너에서만 측정되고, HLA-A2-Melan-A 적재된 DC (데이터는 표시되지 않음)와 비교하여 두 가지 서로 상이한 HLA-A2/Melan-A 특이적 T 세포 클론들의 특이성을 입증하였다.
HLA-A2 + HV의 단핵구는 SIRPa에 대해 표현형이 지정되었고 V1 동형 접합 및 V1/V2 이형 접합 단핵구 모두 두 가지 상이한 실험에 사용되었다.
시험관 내 조작된 흉선 세포 클론:
Melan-A 적재된 인간 iDC로 TCR- 형질 전환 흉선종 세포 클론을 48 시간 자극시킨 후 IL-2 분비량을 측정하였다. 항원 교차 전달의 첫 번째 판독에서, 발명자들은 SIRPa가멜란-A의 적재 및 자극 분석 단계에서 특정의 항-SIRPa 항체(자가제조(in-house) 항-인간 SIRPa v1 항체)에 의해 차단되었을 때 대부분의 도너에서 흉선종 클론에 의한 IL-2 분비의 증가를 관찰하였다 (도 6A). DC의 V1 동형 접합 도너와 V1/V2 이형 접합 도너의 차이는 관찰되지 않았다.
흑색종 환자로부터 얻은 인간 T 세포 클론:
멜란-A 적재된 인간 iDC로 CD8 인간 T 세포 클론을 5 시간 자극한 후, IFNg의 발현을 유동 세포 분석법을 이용하여 평가하였다. 도 6B는 CD8 + T 세포의 IFNg 발현을 나타낸 것이다. SIRPa 또는 CD47은 Melan-A 적재 및 T 세포 자극 과정 중에 차단되었다. 다양한 항체가 시험에 사용되었다: 항-인간 SIRPa v1; 항-SIRPa/g (SIRP29), 항-CD47 (B6H16 및 CC2C6). 도 6B는 자가제조(in-house) 항-인간 SIRPa v1 항체에 의한 SIRPa 차단으로 동형 접합 도너나 이형 접합 도너로부터 얻은 iDC에 의해 유도된 종양-항원 특이적 인간 T- 세포에 의한 IFNg 발현이 증가되었음을 보여준다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 대부분의 V1/V2 이형 접합 도너에서 유사한 증가가 관찰되었기 때문에 항원(Ag) 전달에 대한 SIRPa 차단의 긍정적인 효과가 SIRPa v1 동형 접합 iDC에만 제한되지 않음을 보여주었다. 예기치 않게, 마우스 교차 전달과는 대조적으로, 인간에서 얻은 2 개의 항-CD47 mAb가 대부분의 도너 IFNg 분비에 긍정적인 영향을 끼치지 않고 대부분의 도너에서 T-세포 활성화의 기저 수준을 가장 강하게 억제한다는 것을 발견하였다. 더욱 놀랍게도, SIRPa에 특이적이지 않지만 SIRPg와 결합하고 CD47과 SIRPg의 결합을 억제하는 항-SIRPa는 T 세포에 의한 IFNg 발현을 유도하지 않는다. 이는, iDC에 의한 T 세포에 대한 교차 전달이 자가제조(in-house) 항-인간 SIRPa v1 항체에 특이적으로 이루어지는 것을 나타낸다. 일반적으로, 비선택적 SIRPa/g 항체를 선택적 자가제조(in-house) SIRPa v1 항체에 추가하면 SIRP 감마가 아닌 SIRP 알파를 선택적으로 차단하여 IFNg 분비 증가를 방지한다. 여러 가지 항-CD47 항체 및 항-SIRPa/g 항체를 갖는 인간에서 얻은 이러한 결과는 마우스 모델에서의 결과와 관련하여 예측할 수 없었으며, 인간에서 본 발명의 특정한 항-SIRPa v1 항체가 아닌 여러 가지 항-CD47 mAb 및 항-SIRPg (Piccio et al., 2005)에 의해 다중 클론 인간 T-세포 증식 및 인간 혼합 림프구 반응이 강하게 억제되었음을 보여주는 발명자들의 흥미로운 결과를 설명할 수 있다.
결론
항원 교차 전달의 평가에 사용된 두 개의 서로 상이한 클론은 항원(Ag) 적재 및 T 세포에 대한 Ag 전달 과정 중에 iDC에서 SIRPa 차단으로 유사한 결과가 나왔다. 본 출원의 발명자들은 인간 SIRPa가 IFNg 또는 IL2 분비(선택적 항-SIRPa mAb에 의해 완화될 수 있음)에 의해 측정되는 항원 교차 전달을 억제하는 역할을 하는 것을 처음으로 보여주는 것이다. 이러한 결과는 예측할 수 없었는데, 그 이유는 서로 상이한 항-CD47 항체 또는 비선택적 항-SIRPa/g 항체를 사용하여 CD47을 차단하였을 때 마우스가 아닌 사람에게 나타났던 항-CD47 mAb의 면역 억제 특성에 대한 이전의 관찰 결과를 고려하면 설명이 가능한 인간 T 세포에 대한 이같은 효과가 나타나지 않았기 때문이다. 종래의 기술은 SIRPa가 마우스 DC 성숙을 억제한다는 것을 보여준다. 최초로, 본 발명자들은 특정 항-SIRPa 항체가 인간에서 항원(Ag) 교차 전달을 증대하는 치료 화합물이 될 수 있음을 밝혔다. 마우스의 항-CD47 mAb는 마우스 항-SIRPa와 유사한 증대 효과를 갖지만, 인간 DC 교차 전달에 대한 인간 항-SIRPa의 효과는 예측할 수 없었다. SIRPa-CD47 상호 작용에 의해 매개되는 면역 메커니즘을 이해하면서 인간에서 항-CD47의 면역 억제 특성이 마우스에서 발현되지 않는 SIRPg와의 상호 작용 때문이라고 추정하게 되었다. 놀랍게도, SIRPa V1 동형 접합 또는 이형 접합에 대한 DC 도너의 유전법은 인간 T 세포 활성화에도 다른점에 없었다
실시 예 3 : 다중 클론 자극에 대한 SIRP / CD47 차단의 영향:
방법: 건강한 지원자의 연막으로부터 hPBMC를 분리하였다. CD4 T 세포 또는 CD8 T 세포는 AutoMACS (Miltenyi)를 이용한 양성 선택법에 의해 선택되고 96-라운드 웰 플레이트(50,000 세포/웰)에 담았다. 증식 신호는 3 일 동안 T 세포 하나 당 1 개 비드의 비율로 항-CD3/항-CD28 코팅된 마이크로 비드(Life Technologies)에 의해 제공되거나, 1 mDC 하나 당 5 개 T 세포의 비율로 시험관 내에서 생성된 동종 이계 성숙 수지상 세포에 의해 5 일 동안 제공되었다. SIRPa/CD47 및/또는 SIRPg/CD47 경로를 표적으로 하는 항체는 포화 농도 (10 μg/mL)로 증식 테스트의 시작부터 첨가되었다. 증식은 배양의 마지막 12 시간 동안 H3-티미딘의 혼입(incorporation) 방법을 이요하여 측정하였다. 항-CD47 항체(상업적 참조: B6H12), 항-SIRPa 항체(특허 (WO2017178653)에 기재된 HEFLB).
결과: 인간 T 림프구에 대한 CD47 차단의 면역 억제 효과를 조사하기 위하여 3 명의 건강한 지원자로부터 PBMC를 분리하고 일부 세포를 조사(35 Gy)하였다. 각 도너 (응답자)는 나머지 두 도너(조사된 자극제) 각각과 함께 Mixte Lymphocyte Reaction에 포함되었다. 차단 항체는 MLR이 시작될 때 첨가되었고, T 세포 증식은 5 일 배양의 마지막 16 시간 동안 티미딘 혼입 방법을 이용하여 측정하였다. 발명자들은 항-CD47 mAb를 사용하였을 때 인간 T 세포 증식이 강하게 억제되는 반면, 항-SIRPa (자가제조(in-house) 항-인간 SIRPa v1 항체)는 대조군 조건과 크게 다르지 않음을 발견하였다 (도 7). 또한, T 세포의 활성화를 반영하는 IFNg 분비물을 4 일 배양 배지의 상등액에 투여하였다. 발명자들은 또한 항-CD47mAb (B6H12)에 의한 사이토카인 분비의 극적인 억제를 관찰하였고, CD47이 인간의 T 세포 활성화에 중요하다는 본 발명자 및 다른 연구 그룹의 이전 결과를 확인하였다.
실시예 4: 건강한 도너로부터 얻은 단핵구를 사용한 대식 세포 분극 생물 검정에 대한 항-SIRPa 항체의 영향: 케모카인 생산을 측정하는 생물 검정: MIP-1a/CCL-3 및 MIP-1b/CCL-4
방법: 자가제조(in-house) 항-인간 SIRPa v1 항체가 대식 세포 분극 및 활성화에 미치는 영향을 조사하기 위하여 일부 케모카인, 보다 특히 MIP-1a/CCL-3 및 MIP-1b/CCL-4의 분비는, GM-CSF와 함께 배양되어 비분극 미성숙 대식 세포를 유도한 SIRPa에 대한 동형 접합 V1이나 이형 접합 V1/V2으로 유전자형이 조사된 신선한 또는 동결된 인간 단핵구의 상등액에서 측정하였다 (도 8). 재조합 CD47-Fc의 두 가지 소스를 10μg/ml 농도에서 시험하였다: SinoBiological # 12283-H02Hand R & D 시스템 # 4670-CD-050. MIP-1a/CCL-3 및 MIP-1b/CCL4의 정량화는 배양 상등액에서 ELISA를 이용하여 실현하였다 (R & D 시스템: 인간 CCL3/MIP-1 알파 DuoSet ELISA # DY270 및 인간 CCL4/MIP-1 betaDuoSet ELISA # DY271). 전체적으로, 결과는 코팅된 CD47-Fc, 자가제조(in-house) 항-인간 SIRPa v1 항체의 존재하에 V1 SIRPa에 대한 동형 접합 도너 (도 8A) 또는 이형 접합(V1/V2 유전자형) 도너 (도 8B) 모두에서 MIP-1a와 MIP-1b의 분비가 유의미하게 증가되었음을 보여준 것이다.
결론
발명자들은 코팅된 재조합 CD47-Fc의 존재하에 자가제조(in-house) 항-인간 SIRPa v1 항체를 사용하면 M1 관련 케모카인 MIP-1a/CCL-3 및 MIP-1b/CCL-4 분비가 현저하게 증가함을 확인하였다. CD47-Fc는 특히 MIP-1a/CCL-3 및 MIP-1b/CCL-4 기저 분비를 감소시킴으로써 인간 골수 세포의 기능적 억제를 유도한다. 항-SIRPa 항체에 의하여 SIRPa-CD47 상호 작용을 차단하면 상등액에서 MIP-1a 및 MIP-1b의 분비로 나타난 바와 같이 골수 기능이 회복된다. SIRPa V1 대립 유전자 발현에 관한 도너의 유전자형은 이러한 케모카인의 유도에 영향을 미치지 않으며, 기능적 효과를 관찰하기 위해 SIRPa 차단에 대한 역치 효과를 시사한다.
실시예 5 : 세포 형광 측정법에 의한 인간 단핵구 v2/v2에 대한 SIRPa 결합 분석
방법: 인간 단핵구에 대한 항-SIRPa 항체의 결합을 측정하기 위하여, 인간 Fc 수용체 결합 억제제(BD pharmingen; USA; 참조 564220)를 먼저 실온에서 30 첨가하여 인간 단핵구에서 인간 Fc 수용체를 차단하여 배경을 줄였다. 그런 다음, 항체를 4℃에서 30mm 동안 배양하고, 세척한 후에 PE 표지된 항-인간 IgG Fc (Biolegend; USA; 참조 409303)로 4 ℃에서 30 분 동안 염색하였다. 마우스 항체의 경우, PE- 표지된 항-마우스 igG (Jackson immunoresearch; 참조 715-116-151)를 사용하였다. 샘플은 BD LSRII 또는 Canto II 세포 형광 측정기로 분석하였다.
결과: 도 9에 나타낸 바와 같이, 시험 결과상으로는 인간 단핵구 SIRPa v2/v2에 본 발명의 SIRP29 항체 및 키메라 18D5 항체 모 항체가 결합하고, 모든 인간화 항-SIRPa 항체에 대해서는 결합하지 않는 것으로 나타났다(MFI (중간 형광 강도). 이는 항체의 인간화가 SIRPa v2 특이성의 손실을 유도한다는 것을 보여준다.
실시예 6: Blitz를 이용한 CD47-SIRPg 상호 작용에 대한 항-SIRPa 항체의 경쟁 분석
방법: 이 분석은 Blitz (Fortι Bio; USA; 참조 C22-2 No 61010-1)를 이용하여 수행하였다. 첫 번째 단계에서 hSIRPg-His (Sino Biologicals, 중국 베이징, 참조 11828-H08H)는 히스티딘 테일에 의해 Ni-NTA 바이오 센서(Fortι Bio, 미국, 참조 18-0029)에 10 μg/ml로 30 초 동안 고정되었다. 두 번째 단계에서, 120 초 동안 20 μg/mL (포화 농도)의 항체를 첨가하였다. 그 후, 인간 CD47Fc (Sino Biologicals, Beijing, China; reference 12283-H02H)는 120 초 동안 여러 가지 항체(LSB2.20, Kwar 또는 SIRP29 항체)와 경쟁하여 100 μg/mL에서 연결되었다. 그리고 CD47Fc는 120 초 동안 동역학 버퍼에서 해리되었다. 연관 상수(ka)와 해리 상수(kd)를 계산하고 친화력 상수 KD (ka/kd)를 결정하는 Blitz pro 1.2 소프트웨어를 이용하여 분석 데이터를 얻었다.
결과: 도 10에 나타낸 바와 같이, 정상적인 조건에서 SIRPg에 대한 CD47의 친화력은 약 6.10-8 M이고, Kwar23 및 SIRP29은 CD47과 SIRPg의 결합을 현저하게 감소시키는 반면, 상업용 항-SIRPg 항체인 LSB2.20은 CD47-SIRPg의 상호작용을 방해한다. 이러한 결과는 선행 기술의 항체와 비교하여 SIRPa에 대한 본 발명의 자가제조(in-house) 항-SIRPa v1 항체의 특이성을 분명히 보여준다.
실시예 7: 유방 4T1 임상전 모델: 전이 모델
이 정위(orthotopic) 및 동계(syngeneic) 4T1 임상전 모델은 골수 세포 침윤이 중요하고 잘 나타난 모델에서 두 가지 서로 상이한 특정 항-마우스 SIRPa를 이용한 단일 요법의 효과를 평가하는 데 사용되었다. 실제로, 4T1 모델은 주로 CD11b + 골수 세포 (DuPrι et al., 2007), 특히 MDSC에 의해 침윤되는 것으로 보고되었다(Markowitz et al., 2013).
이 모델은 전이를 유도하는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명자들은 간 및 폐를 채집하고 마우스 항-SIRPa 항체로 치료하거나 치료하지 않은 마우스의 전이에 번호를 매겼다. 동기준 대조군 및 항-SIRPa 항체를 D4에서 D28까지 8 mg/kg씩 사용하였다(주 3회). 특히 SIRPa를 표적으로하는 두 개의 서로 상이한 항체에 의한 SIRPa의 차단(및 SIRPa에 대한CD47의 결합 방해)은 공격적인 TNBC 모델의 종양 발달에 대한 단일 요법에서 높은 임상 효과를 입증하였다. 발명자들은 또한 P84 (참조: MABS164 항-SHPS-1 항체, Merck Millipore의 클론 P84)와 MY1-mG1 (Yanagita et al.) 대리물을 비교하여 마우스를 죽인 후 폐 전이와 간 전이를 분석하였다. 대조군 마우스에서 폐 전이가 발견되었지만, MY1-mG1 또는 P84를 처리한 마우스에서는 폐 전이가 발견되지 않았다. 도 11은 P84 및 MY-1 항-SIRPa mAb 처리에 대한 폐 전이의 결과를 보여주고 있는데, 두 가지 모두 폐 전이에 대해 효능이 동일하다.
세포에서 SIRPg를 발현하지 않는 마우스 모델에서 이와 같은 결과는 암 처리, 특히 암 전이의 치료나 예방을 위해 특이적으로 SIRPa를 표적화하는 것이 중요함을 분명히 나타내는 것이다. 세포가 SIRPg를 발현하는 인간에서는, 본 발명의 항체와 같이 CD47-SIRPg간의 상호 작용을 방해하지 않고 특이적으로 SIRPa를 표적화하는 것이 유용할 것이다.
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SEQUENCE LISTING
<110> OSE IMMUNOTHERAPEUTICS
<120> USE OF ANTI-HUMAN SIRPA V1 ANTIBODIES AND METHOD FOR PRODUCING
ANTI-SIRPA V1 ANTIBODIES
<130> IP20203879FR
<140> PCT/EPXX XXX XXX
<141> 2019-03-13
<150> EP18305271.1
<151> 2018-03-13
<160> 35
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50 55 60
Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu
85 90 95
Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr
100 105 110
Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser
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Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val
130 135 140
Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala
145 150 155 160
Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser
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Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser
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Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser
195 200 205
Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His Ser
210 215 220
Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu
225 230 235 240
Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu
245 250 255
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Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn Val
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Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His Asp
325 330 335
Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala His
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Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly Ser Asn
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Glu Arg Asn Ile Tyr Ile Val Val Gly Val Val Cys Thr Leu Leu Val
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Ala Leu Leu Met Ala Ala Leu Tyr Leu Val Arg Ile Arg Gln Lys Lys
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<223> Linear epitope SIRPa v1 /2
<400> 6
Gly Arg Glu Leu Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His
1 5 10
<210> 7
<211> 13
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Conformational epitope SIRPa v1 /1
<400> 7
Glu Leu Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg
1 5 10
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Conformational epitope SIRPa v1 /2
<400> 8
Arg Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn
1 5 10
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> HCDR1
<400> 9
Ser Tyr Trp Val His
1 5
<210> 10
<211> 16
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> HCDR2 1
<400> 10
Asn Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
<210> 11
<211> 16
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> HCDR2 2
<400> 11
Asn Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr His Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> HCDR3 1
<400> 12
Gly Gly Thr Gly Thr Met Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> HCDR3 2
<400> 13
Gly Gly Thr Gly Thr Leu Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> HCDR3 3
<400> 14
Gly Gly Thr Gly Thr Met Ala Tyr Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> HCDR3 4
<400> 15
Gly Gly Thr Gly Thr Leu Ala Tyr Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 16
<211> 112
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Light chain variable domain /1
<400> 16
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Tyr Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 17
<211> 112
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Light chain variable domain /2
<400> 17
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Tyr Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 18
<211> 120
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Heavy chain variable domain /1
<400> 18
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Val His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr His Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly His Val Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Gly Gly Thr Gly Thr Leu Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 19
<211> 120
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Heavy chain variable domain /2
<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Val His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr His Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly His Val Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Gly Gly Thr Gly Thr Met Ala Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 20
<211> 120
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Heavy chain variable domain /3
<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Val His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr His Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly His Val Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Gly Gly Thr Gly Thr Leu Ala Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 21
<211> 120
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Heavy chain variable domain /4
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Val His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp His Val Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Gly Gly Thr Gly Thr Met Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 22
<211> 120
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Heavy chain variable domain /5
<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Val His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp His Val Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Gly Gly Thr Gly Thr Met Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 23
<211> 120
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Heavy chain variable domain /6
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Val His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr His Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly His Val Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Gly Gly Thr Gly Thr Met Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 24
<211> 474
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> SIRPa V1 (without SP)
<400> 24
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu
100 105 110
Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala
115 120 125
Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly
130 135 140
Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu
145 150 155 160
Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser
165 170 175
Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val
180 185 190
His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp
195 200 205
Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro
210 215 220
Thr Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn
225 230 235 240
Val Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr
245 250 255
Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val
260 265 270
Thr Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val
275 280 285
Asn Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu
290 295 300
His Asp Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser
305 310 315 320
Ala His Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly
325 330 335
Ser Asn Glu Arg Asn Ile Tyr Ile Val Val Gly Val Val Cys Thr Leu
340 345 350
Leu Val Ala Leu Leu Met Ala Ala Leu Tyr Leu Val Arg Ile Arg Gln
355 360 365
Lys Lys Ala Gln Gly Ser Thr Ser Ser Thr Arg Leu His Glu Pro Glu
370 375 380
Lys Asn Ala Arg Glu Ile Thr Gln Asp Thr Asn Asp Ile Thr Tyr Ala
385 390 395 400
Asp Leu Asn Leu Pro Lys Gly Lys Lys Pro Ala Pro Gln Ala Ala Glu
405 410 415
Pro Asn Asn His Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Gln Thr Ser Pro Gln Pro
420 425 430
Ala Ser Glu Asp Thr Leu Thr Tyr Ala Asp Leu Asp Met Val His Leu
435 440 445
Asn Arg Thr Pro Lys Gln Pro Ala Pro Lys Pro Glu Pro Ser Phe Ser
450 455 460
Glu Tyr Ala Ser Val Gln Val Pro Arg Lys
465 470
<210> 25
<211> 16
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Epitope SIRPa v1 right
<400> 25
Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg
1 5 10 15
<210> 26
<211> 4201
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> cDNA complete SIRPa v1
<400> 26
tccggcccgc acccaccccc aagaggggcc ttcagctttg gggctcagag gcacgacctc 60
ctggggaggg ttaaaaggca gacgcccccc cgccccccgc gcccccgcgc cccgactcct 120
tcgccgcctc cagcctctcg ccagtgggaa gcggggagca gccgcgcggc cggagtccgg 180
aggcgagggg aggtcggccg caacttcccc ggtccacctt aagaggacga tgtagccagc 240
tcgcagcgct gaccttagaa aaacaagttt gcgcaaagtg gagcggggac ccggcctctg 300
ggcagccccg gcggcgcttc cagtgccttc cagccctcgc gggcggcgca gccgcggccc 360
atggagcccg ccggcccggc ccccggccgc ctcgggccgc tgctctgcct gctgctcgcc 420
gcgtcctgcg cctggtcagg agtggcgggt gaggaggagc tgcaggtgat tcagcctgac 480
aagtccgtgt tggttgcagc tggagagaca gccactctgc gctgcactgc gacctctctg 540
atccctgtgg ggcccatcca gtggttcaga ggagctggac caggccggga attaatctac 600
aatcaaaaag aaggccactt cccccgggta acaactgttt cagacctcac aaagagaaac 660
aacatggact tttccatccg catcggtaac atcaccccag cagatgccgg cacctactac 720
tgtgtgaagt tccggaaagg gagccccgat gacgtggagt ttaagtctgg agcaggcact 780
gagctgtctg tgcgcgccaa accctctgcc cccgtggtat cgggccctgc ggcgagggcc 840
acacctcagc acacagtgag cttcacctgc gagtcccacg gcttctcacc cagagacatc 900
accctgaaat ggttcaaaaa tgggaatgag ctctcagact tccagaccaa cgtggacccc 960
gtaggagaga gcgtgtccta cagcatccac agcacagcca aggtggtgct gacccgcgag 1020
gacgttcact ctcaagtcat ctgcgaggtg gcccacgtca ccttgcaggg ggaccctctt 1080
cgtgggactg ccaacttgtc tgagaccatc cgagttccac ccaccttgga ggttactcaa 1140
cagcccgtga gggcagagaa ccaggtgaat gtcacctgcc aggtgaggaa gttctacccc 1200
cagagactac agctgacctg gttggagaat ggaaacgtgt cccggacaga aacggcctca 1260
accgttacag agaacaagga tggtacctac aactggatga gctggctcct ggtgaatgta 1320
tctgcccaca gggatgatgt gaagctcacc tgccaggtgg agcatgacgg gcagccagcg 1380
gtcagcaaaa gccatgacct gaaggtctca gcccacccga aggagcaggg ctcaaatacc 1440
gccgctgaga acactggatc taatgaacgg aacatctata ttgtggtggg tgtggtgtgc 1500
accttgctgg tggccctact gatggcggcc ctctacctcg tccgaatcag acagaagaaa 1560
gcccagggct ccacttcttc tacaaggttg catgagcccg agaagaatgc cagagaaata 1620
acacaggaca caaatgatat cacatatgca gacctgaacc tgcccaaggg gaagaagcct 1680
gctccccagg ctgcggagcc caacaaccac acggagtatg ccagcattca gaccagcccg 1740
cagcccgcgt cggaggacac cctcacctat gctgacctgg acatggtcca cctcaaccgg 1800
acccccaagc agccggcccc caagcctgag ccgtccttct cagagtacgc cagcgtccag 1860
gtcccgagga agtgaatggg accgtggttt gctctagcac ccatctctac gcgctttctt 1920
gtcccacagg gagccgccgt gatgagcaca gccaacccag ttcccggagg gctggggcgg 1980
tgcaggctct gggacccagg ggccagggtg gctcttctct ccccacccct ccttggctct 2040
ccagcacttc ctgggcagcc acggccccct ccccccacat tgccacatac ctggaggctg 2100
acgttgccaa accagccagg gaaccaacct gggaagtggc cagaactgcc tggggtccaa 2160
gaactcttgt gcctccgtcc atcaccatgt gggttttgaa gaccctcgac tgcctccccg 2220
atgctccgaa gcctgatctt ccagggtggg gaggagaaaa tcccacctcc cctgacctcc 2280
accacctcca ccaccaccac caccaccacc accaccacta ccaccaccac ccaactgggg 2340
ctagagtggg gaagatttcc cctttagatc aaactgcccc ttccatggaa aagctggaaa 2400
aaaactctgg aacccatatc caggcttggt gaggttgctg ccaacagtcc tggcctcccc 2460
catccctagg ctaaagagcc atgagtcctg gaggaggaga ggacccctcc caaaggactg 2520
gagacaaaac cctctgcttc cttgggtccc tccaagactc cctggggccc aactgtgttg 2580
ctccacccgg acccatctct cccttctaga cctgagcttg cccctccagc tagcactaag 2640
caacatctcg ctgtggacgc ctgtaaatta ctgagaaatg tgaaacgtgc aatcttgaaa 2700
ctgaggtgtt agaaaacttg atctgtggtg ttttgttttg ttttttttct taaaacaaca 2760
gcaacgtgat cttggctgtc tgtcatgtgt tgaagtccat ggttgggtct tgtgaagtct 2820
gaggtttaac agtttgttgt cctggaggga ttttcttaca gcgaagactt gagttcctcc 2880
aagtcccaga accccaagaa tgggcaagaa ggatcaggtc agccactccc tggagacaca 2940
gccttctggc tgggactgac ttggccatgt tctcagctga gccacgcggc tggtagtgca 3000
gccttctgtg accccgctgt ggtaagtcca gcctgcccag ggctgctgag ggctgcctct 3060
tgacagtgca gtcttatcga gacccaatgc ctcagtctgc tcatccgtaa agtggggata 3120
gtgaagatga cacccctccc caccacctct cataagcact ttaggaacac acagagggta 3180
gggatagtgg ccctggccgt ctatcctacc cctttagtga ccgcccccat cccggctttc 3240
tgagctgatc cttgaagaag aaatcttcca tttctgctct caaaccctac tgggatcaaa 3300
ctggaataaa ttgaagacag ccagggggat ggtgcagctg tgaagctcgg gctgattccc 3360
cctctgtccc agaaggttgg ccagagggtg tgacccagtt accctttaac ccccaccctt 3420
ccagtcgggt gtgagggcct gaccgggccc agggcaagca gatgtcgcaa gccctattta 3480
ttcagtcttc actataactc ttagagttga gacgctaatg ttcatgactc ctggccttgg 3540
gatgcccaag ggatttctgg ctcaggctgt aaaagtagct gagccatcct gcccattcct 3600
ggaggtccta caggtgaaac tgcaggagct cagcatagac ccagctctct gggggatggt 3660
cacctggtga tttcaatgat ggcatccagg aattagctga gccaacagac catgtggaca 3720
gctttggcca gagctcccgt gtggcatctg ggagccacag tgacccagcc acctggctca 3780
ggctagttcc aaattccaaa agattggctt gtaaaccttc gtctccctct cttttaccca 3840
gagacagcac atacgtgtgc acacgcatgc acacacacat tcagtatttt aaaagaatgt 3900
tttcttggtg ccattttcat tttattttat tttttaattc ttggaggggg aaataaggga 3960
ataaggccaa ggaagatgta tagctttagc tttagcctgg caacctggag aatccacata 4020
ccttgtgtat tgaaccccag gaaaaggaag aggtcgaacc aaccctgcgg aaggagcatg 4080
gtttcaggag tttattttaa gactgctggg aaggaaacag gccccatttt gtatatagtt 4140
gcaacttaaa ctttttggct tgcaaaatat ttttgtaata aagatttctg ggtaataatg 4200
a 4201
<210> 27
<211> 357
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> cDNA exon 3 SIRPa v1
<400> 27
gagtggcggg tgaggaggag ctgcaggtga ttcagcctga caagtccgtg ttggttgcag 60
ctggagagac agccactctg cgctgcactg cgacctctct gatccctgtg gggcccatcc 120
agtggttcag aggagctgga ccaggccggg aattaatcta caatcaaaaa gaaggccact 180
tcccccgggt aacaactgtt tcagacctca caaagagaaa caacatggac ttttccatcc 240
gcatcggtaa catcacccca gcagatgccg gcacctacta ctgtgtgaag ttccggaaag 300
ggagccccga tgacgtggag tttaagtctg gagcaggcac tgagctgtct gtgcgcg 357
<210> 28
<211> 503
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> SIRPa v2 (with SP)
<400> 28
Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu
20 25 30
Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala Ala Gly
35 40 45
Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly
50 55 60
Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Glu Ser
85 90 95
Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn Ile Thr
100 105 110
Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser
115 120 125
Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg
130 135 140
Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala Thr
145 150 155 160
Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser Pro
165 170 175
Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser Asp
180 185 190
Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser Ile
195 200 205
His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His Ser Gln
210 215 220
Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu Arg
225 230 235 240
Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu Glu
245 250 255
Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val Thr Cys
260 265 270
Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp Leu Glu
275 280 285
Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr Glu Asn
290 295 300
Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn Val Ser
305 310 315 320
Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His Asp Gly
325 330 335
Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala His Pro
340 345 350
Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly Ser Asn Glu
355 360 365
Arg Asn Ile Tyr Ile Val Val Gly Val Val Cys Thr Leu Leu Val Ala
370 375 380
Leu Leu Met Ala Ala Leu Tyr Leu Val Arg Ile Arg Gln Lys Lys Ala
385 390 395 400
Gln Gly Ser Thr Ser Ser Thr Arg Leu His Glu Pro Glu Lys Asn Ala
405 410 415
Arg Glu Ile Thr Gln Asp Thr Asn Asp Ile Thr Tyr Ala Asp Leu Asn
420 425 430
Leu Pro Lys Gly Lys Lys Pro Ala Pro Gln Ala Ala Glu Pro Asn Asn
435 440 445
His Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Gln Thr Ser Pro Gln Pro Ala Ser Glu
450 455 460
Asp Thr Leu Thr Tyr Ala Asp Leu Asp Met Val His Leu Asn Arg Thr
465 470 475 480
Pro Lys Gln Pro Ala Pro Lys Pro Glu Pro Ser Phe Ser Glu Tyr Ala
485 490 495
Ser Val Gln Val Pro Arg Lys
500
<210> 29
<211> 10
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Epitope SIRPa v2 long version
<400> 29
Lys Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Thr Glu
1 5 10
<210> 30
<211> 14
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Epitope SIRPa v2 right
<400> 30
Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg
1 5 10
<210> 31
<211> 355
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> cDNA exon 3 SIRPa v2
<400> 31
gagtggcggg tgaggaggag ctgcaggtga ttcagcctga caagtccgta tcagttgcag 60
ctggagagtc ggccattctg cactgcactg tgacctccct gatccctgtg gggcccatcc 120
agtggttcag aggagctgga ccagcccggg aattaatcta caatcaaaaa gaaggccact 180
tcccccgggt aacaactgtt tcagagtcca caaagagaga aaacatggac ttttccatca 240
gcatcagtaa catcacccca gcagatgccg gcacctacta ctgtgtgaag ttccggaaag 300
ggagccctga cacggagttt aagtctggag caggcactga gctgtctgtg cgtgc 355
<210> 32
<211> 180
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> SIRPa human variant 1
<400> 32
Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu
20 25 30
Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly
35 40 45
Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly
50 55 60
Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu
85 90 95
Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr
100 105 110
Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser
115 120 125
Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val
130 135 140
Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala
145 150 155 160
Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser
165 170 175
Pro Arg Asp Ile
180
<210> 33
<211> 179
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> SIRPa human variant 2
<400> 33
Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu
20 25 30
Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly
35 40 45
Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly
50 55 60
Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu
85 90 95
Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr
100 105 110
Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser
115 120 125
Pro Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg
130 135 140
Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala Thr
145 150 155 160
Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser Pro
165 170 175
Arg Asp Ile
<210> 34
<211> 179
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> SIRPb human
<400> 34
Met Pro Val Pro Ala Ser Trp Pro His Leu Pro Ser Pro Phe Leu Leu
1 5 10 15
Met Thr Leu Leu Leu Gly Arg Leu Thr Gly Val Ala Gly Glu Asp Glu
20 25 30
Leu Gln Val Ile Gln Pro Glu Lys Ser Val Ser Val Ala Ala Gly Glu
35 40 45
Ser Ala Thr Leu Arg Cys Ala Met Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly Pro
50 55 60
Ile Met Trp Phe Arg Gly Ala Gly Ala Gly Arg Glu Leu Ile Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Glu Leu Thr
85 90 95
Lys Arg Asn Asn Leu Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn Ile Thr Pro
100 105 110
Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser Pro
115 120 125
Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg
130 135 140
Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Val Arg Ala Thr
145 150 155 160
Pro Glu His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser Pro
165 170 175
Arg Asp Ile
<210> 35
<211> 178
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> SIRPg human /1
<400> 35
Met Pro Val Pro Ala Ser Trp Pro His Pro Pro Gly Pro Phe Leu Leu
1 5 10 15
Leu Thr Leu Leu Leu Gly Leu Thr Glu Val Ala Gly Glu Glu Glu Leu
20 25 30
Gln Met Ile Gln Pro Glu Lys Leu Leu Leu Val Thr Val Gly Lys Thr
35 40 45
Ala Thr Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Leu Pro Val Gly Pro Val
50 55 60
Leu Trp Phe Arg Gly Val Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr Asn Gln
65 70 75 80
Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu Thr Lys
85 90 95
Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Ser Ser Ile Thr Pro Ala
100 105 110
Asp Val Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser Pro Glu
115 120 125
Asn Val Glu Phe Lys Ser Gly Pro Gly Thr Glu Met Ala Leu Gly Ala
130 135 140
Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Leu Gly Pro Ala Ala Arg Thr Thr Pro
145 150 155 160
Glu His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser Pro Arg
165 170 175
Asp Ile
Claims (23)
- (a) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인으로, 여기서 HCDR1은 서열 번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고, HCDR2는 서열 번호 10 또는 서열 번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고, HCDR3은 서열 번호 12 또는 서열 번호 13 또는 서열 번호 14 또는 서열 번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는, 중쇄 가변 도메인; 및
(b) 서열 번호 16 또는 서열 번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인,
을 포함하는 항-인간 SIRPa 항체, 그의 항원 결합 단편, 또는 그의 변형(modified) 항체에 있어서,
질병, 특히 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위하여, 또는 질병, 특히 암에 대한 치료적 백신 접종에 사용하기 위한 것으로서, 여기서 상기 항체, 그의 항원 결합 단편, 또는 그의 변형 항체는 상기 질병, 특히 상기 암에 발현되는 항원의 교차 전달을 향상시키고 상기 질병의 치료에 적합한 T 세포 반응을 유도하는 데에 관여하는 것을 특징으로 하는, 항-인간 SIRPa 항체, 그의 항원 결합 단편, 또는 그의 변형 항체. - 제 1 항에 있어서,
- 인간 SIRPa v1에 특이적으로 결합하고, 인간 CD47이 인간 SIRPa v1와 결합하는 것을 억제하지만, 인간 CD47이 인간 SIRPg에 결합하는 것을 방지하거나 억제하지는 않고; 특히 인간 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않는 것을 특징으로 하는, 항-인간 SIRPa 항체, 그의 항원 결합 단편, 또는 그의 변형 항체. - 항-인간 SIRPa 항체, 그의 항원 결합 단편, 또는 그의 변형 항체로,
(a) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 여기서 HCDR1은 서열 번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고, HCDR2는 서열 번호 10 또는 서열 번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고, HCDR3은 서열 번호 12 또는 서열 번호 13 또는 서열 번호 14 또는 서열 번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며; 및
(b) 서열 번호 16 또는 서열 번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하고,
상기 항-인간 SIRPa 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체는 인간 CD47이 인간 SIRPa v1에 결합하는 것을 억제하지만 인간 CD47이 인간 SIRPa v2에 결합하는 것을 방지하거나 억제하지 않으며;
SIRPa v1 양성인 피험자에 대하여 질병의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 것을 특징으로 하는, 항-인간 SIRPa 항체, 그의 항원 결합 단편, 또는 그의 변형 항체. - 제 1 항 내지 제 3 항 중에서 어느 한 항에 있어서,
상기 중쇄 가변 도메인은 서열 번호 18, 또는 서열 번호 19, 또는 서열 번호 20, 또는 서열 번호 21, 또는 서열 번호 22, 또는 서열 번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 특히 중쇄 가변 도메인은 서열 번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고; 상기 경쇄 가변 도메인은 서열 번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 것을 특징으로 하는, 항-인간 SIRPa 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 그의 변형 항체. - 제 1 항 내지 제 4 항 중에서 어느 한 항에 있어서,
상기 질병은 암, 특히 염증성 암과 침윤된 골수 세포를 가진 암, 특히 침윤된 수지상 세포 및/또는 MDSC 및/또는 TAM 세포를 가진 암, 암 전이, 특히 유방암 전이, 흑색종으로 이루어진 군에서 선택되고,
제 1 항 내지 제 4 항 중에서 어느 한 항에 따른 사용이 이들 질병 중에 어느 하나에 대한 치료적 백신 접종, 특히 흑색종에 대한 치료적 백신 접종을 위한 것을 특징으로 하는, 항-인간 SIRPa 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 그의 변형 항체. - 제 1 항 내지 제 5 항 중에서 어느 한 항에 있어서,
- 인간 SIRPa v2에 특이적으로 결합하지 않음; 및
- 인간 CD47이 인간 SIRPg에 결합하는 것을 억제하지 않음, 특히 인간 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않음; 및
- 10E-9 M 이상의 친화력으로 인간 SIRPa v1과 결합함; 및
- 항원 전달 세포(Antigen Presenting Cells)에 의한, 특히 수지상 세포에 의한, 인간 T 세포에 대한, 특히 인간 CD8+ T 세포에 대한, 적어도 하나의 항원의 교차 전달을 향상시킴,
의 특성을 가지고,
선택적으로,
- 체내 인간 T 세포의 활성화 및/또는 증식을 억제하지 않음; 및/또는
- 대식 세포의 활성화를 향상시킴,
의 특성들 중 적어도 하나를 갖는 것을 특징으로 하는, 항-인간 SIRPa 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 그의 변형 항체. - 제 1 항 내지 제 6 항 중에서 어느 한 항에 있어서,
상기 질병은 암이고,
인간 유두종 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 메르켈 세포 폴리오마 바이러스, 인간 면역 결핍 바이러스, 인간 T-세포 백혈병 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스 8, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, HCV, HBC, 및 세포 거대 바이러스의 항원으로 이루어진 군, 또는 CTNNB1 유전자, CASP8 유전자, HER2 유전자, P53 유전자, KRAS 유전자, NRAS 유전자의 항원으로 이루어진 군에서 유래한 단일점 돌연변이된 항원의 군에서 선택되는 적어도 하나의 항원이, 또는 종양 항원, 특히 RAS 종양 유전자, BCR-ABL 종양 항원, ETV6-AML1 종양 항원, 흑색종 항원 암호화 유전자(MAGE), BAGE 항원, GAGE 항원, ssx 항원, ny-eso-1 항원, cyclin-A1 종양 항원, MART-1 항원, gp100 항원 , CD19 항원, 전립선 특이 항원, 전립선 산성 포스파타제 항원, 암 배아 항원, 알파 태아 단백 항원, 암종 항원 125, 뮤신 16 항원, 뮤신 1 항원, 인간 텔로머라제 역전사 효소 항원, EGFR 항원, MOK 항원, RAGE-1 항원, PRAME 항원, 야생형 p53 항원 , 종양 유전자 ERBB2 항원, 시알릴-Tn 종양 항원, Wilms 종양 1 항원, 메조텔린 항원, 탄수화물 항원, B- 카테닌 항원, MUM-1 항원, CDK4 항원, 및 ERBB2IP 항원, 특히 멜란-A 흑색종 종양 관련 항원(TAA)으로 이루어진 군에서 발생하거나 유래한 종양 항원이, 피험자(subject)에서 발현되거나 검출되었던 것을 특징으로 하는, 항-인간 SIRPa 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 그의 변형 항체. - 제 1 항 내지 제 7 항 중에서 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 그의 변형 항체를 포함하고, 적어도 하나의 약제학적 기제(vehicle)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- 인간 SIRPa v1에 특이적으로 결합하고, 인간 CD47이 인간 SIRPa v1와 결합하는 것을 억제하지만, 인간 CD47이 인간 SIRPa v2와 인간 SIRPg에 결합하는 것을 방지하거나 억제하지는 않고, 항원 전달 세포, 특히 수지상 세포에 의한 인간 T 세포, 특히 인간 CD8+ T 세포에 대한 항원의 교차 전달을 향상시키는 항-인간 SIRPa v1 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체를 생산 또는 선택하는 데에 있어서의, 서열 번호 1, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 25로 이루어진 인간 SIRPa v1의 에피토프를 포함하거나 이로 구성된 폴리펩티드, 특히 항원의 용도.
- 제 9 항에 규정된 적어도 하나의 항원 또는 서열 번호 1, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 25로 이루어진 인간 SIRPa v1의 에피토프를 포함하거나 이로 구성된 적어도 하나의 항원을 가지고 비인간 동물, 특히 비인간 포유 동물을 면역화하는 단계; 및 상기 면역화된 비인간 동물로부터 결과적으로 얻은 혈청 또는 B 세포를 채취(collecting)하여 상기 항원에 대한 항체를 얻는 단계를 포함하는, 항-인간 SIRPa v1 항체를 제조하는, 방법.
- 제 9 항에 따른 용도 또는 제 10 항에 따른 방법에 있어서,
항-인간 SIRPa v1 항체를 선택하고 회수하는 단계를 더 포함하고,
상기 선택하는 단계는, 하기의 단계 중 적어도 하나를 포함하며:
(a) 인간 SIRPa v1에 대한 항체의 결합 능력, 특히 제 7 항에 기재된 항원에 대한 항체의 결합 능력을 시험하는 단계; 및/또는
(b) 인간 CD47이 인간 SIRPa v1에 결합하는 것을 감소시키거나 억제하는 항체의 능력을 시험하는 단계; 및/또는
(c) 인간 CD47이 인간 SIRPa v2에 결합하는 것을 방지하거나 억제하는 항체의 능력을 시험하는 단계; 및/또는
(d) 인간 CD47이 인간 SIRPg에 결합하는 것을 방지하거나 억제하는 항체의 능력을 시험하는 단계,
및 선택적으로:
(e) 서열 번호 3의 SIRPa의 130 번 및 132 번에 각각 위치; 또는 서열 번호 24의 SIRPa의 100 번 및 102 번 위치에 각각 위치한 아미노산 잔기 D 및 V에 결합하는 항체의 능력을 시험하는 단계;
(f) 인간 SIRPa v2에 대한 항체의 결합 능력을 시험하는 단계; 및/또는
(g) 인간 SIRPg에 대한 항체의 결합 능력을 시험하는 단계,
상기 회수된 항체는,
(1) 인간 SIRPa v1에 특이적으로 결합함;
(2) 인간 CD47이 인간 SIRPa v1에 결합하는 것을 감소시키거나 억제함; 및
(3) 인간 CD47이 인간 SIRPg에 결합하는 것을 감소시키거나 억제하지 않음의 특성을 가지고,
및 선택적으로,
(4) 10E-9 M 이상의 친화력으로 인간 SIRPa v1과 결합함; 및/또는
(5) 서열 번호 3의 SIRPa의 130 번 및 132 번에 각각 위치된 또는 서열 번호 24의 SIRPa의 100 번 및 102 번 위치에 각각 위치된 아미노산 잔기 D 및 V와 결합함; 및/또는
(6) 인간 SIRPg에 특이적으로 결합하지 않음; 및/또는
(7) 인간 SIRPa v2에 특이적으로 결합하지 않음
의 특성들 중에서 적어도 하나의 특성을 갖는, 용도 또는 방법. - 제 9 항에 따른 용도 또는 제 10 항 또는 제 11 항에 따른 방법에 있어서,
상기 획득한 항체는 1E-9 M 이상의 친화력으로 인간 SIRPa v1에 특이적으로 결합하지만 인간 SIRPa v2에는 특이적으로 결합하지 않고,
특히 여기서 회수한 항-인간 SIRPa v1 항체는 인간 CD47d이 인간 SIRPa v1에 결합하는 것에 대한 길항제인, 용도 또는 방법. - 인간 피험자에 대하여 항-인간 SIRPa 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 그의 변형 항체를 이용한 치료의 효과 가능성을 평가하는 시험관내 또는 체외 방법에 있어서,
보다 특히, 항-인간 SIRPa v1 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체는 인간 피험자에게 투여될 것이고,
상기 방법은 상기 피험자로부터 사전에 획득한 생물학적 샘플에서 SIRPa v1의 존재 여부를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 SIRPa v1은 특히 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 하나에서 규정한 바와 같은 항-인간 SIRPa v1 항체, 제 8 항에 따른 조성물이나 제 9 항에서 규정한 바와 같이 생산된 조성물, 또는 제 10 항 또는 제 11 항에 따라 선택된 조성물에 의해 검출되고, 상기 생물학적 샘플에 SIRPa v1이 존재하면 상기 치료가 효과적일 가능성이 있음을 나타내는 것을 특징으로 하는, 시험관내 또는 체외 방법. - 인간 피험자에 대하여 항-인간 SIRPa 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 그의 변형 항체를 이용한 치료의 효과 가능성을 평가하는 시험관내 또는 체외 방법에 있어서,
보다 특히, 항-인간 SIRPa v1 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체는 인간 피험자에게 투여될 것이고,
상기 방법은, 피험자의 SIRPa 대립 유전자를 결정하는 단계, 특히 피험자의 적어도 하나의 SIRPa 대립 유전자가 서열 번호 1 또는 서열 번호 4 또는 서열 번호 25의 아미노산 잔기를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하며, 상기 피험자로부터 사전에 획득한 생물학적 샘플에서의 SIRPa 대립 유전자 내 서열 번호 1 또는 서열 번호 4 또는 서열 번호 25의 아미노산 잔기를 암호화하는 핵산 서열의 존재가, 상기 치료가 효과적일 가능성이 있는 것을 나타내는 것이고, 특히, SIRPa 대립 유전자의 결정은, 상기 생물학적 샘플에서 인간 SIRPa의 SNP 15 및 SNP 16을 포함하거나 인간 SIRPa의 SNP 17을 포함하는 SIRPa 유전자 또는 SIRPa 전사물의 부분을, 및/또는 서열 번호 1, 서열 번호 4 또는 서열 번호 25에 아미노산 잔기 DDV를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 부분을, 증폭시키기에 적합한 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 실시하여 수행하는 것을 특징으로 하는, 시험관내 또는 체외 방법. - (i) 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에서 규정한 항체, 그의 항원 결합 단편 또는 그의 변형 항체; 및/또는 제 8 항에 따른 조성물; 및
(ii) 인간 유두종 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 메르켈 세포 폴리오마 바이러스, 인간 면역 결핍 바이러스, 인간 T-세포 백혈병 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스 8, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, HCV, HBC, 및 세포 거대 바이러스로부터의 항원으로 이루어진 군, 또는 CTNNB1 유전자, CASP8 유전자, HER2 유전자, P53 유전자, KRAS 유전자, NRAS 유전자의 항원으로 이루어진 군에서 유래한 단일점 돌연변이된 항원의 군, 또는 종양 항원, 특히 RAS 종양 유전자, BCR-ABL 종양 항원, ETV6-AML1 종양 항원, 흑색종 항원 암호화 유전자(MAGE), BAGE 항원, GAGE 항원, ssx 항원, ny-eso-1 항원, cyclin-A1 종양 항원, MART-1 항원, gp100 항원 , CD19 항원, 전립선 특이 항원, 전립선 산성 포스파타제 항원, 암 배아 항원, 알파 태아 단백 항원, 암종 항원 125, 뮤신 16 항원, 뮤신 1 항원, 인간 텔로머라제 역전사 효소 항원, EGFR 항원, MOK 항원, RAGE-1 항원, PRAME 항원, 야생형 p53 항원 , 종양 유전자 ERBB2 항원, 시알릴-Tn 종양 항원, Wilms 종양 1 항원, 메조텔린 항원, 탄수화물 항원, B- 카테닌 항원, MUM-1 항원, CDK4 항원, 및 ERBB2IP 항원, 특히 멜란-A 흑색종 종양 관련 항원(TAA), 또는 임의의 특정 변이 항원(신생 항원 또는 신생 에피토프)으로 이루어진 군에서 발생하거나 유래한 종양 항원으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 항원을 포함하고,
질병, 특히 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위하여, 또는 질병, 특히 암에 대한 치료적 백신 접종에 사용하기 위한 것으로서, 여기서 상기 항체, 그의 항원 결합 단편, 또는 그의 변형 항체는, 상기 질병, 특히 상기 암에 발현되는 항원의 교차 전달을 향상시키고, 상기 질병의 치료, 특히 SIRPa v1 양성 피험자에 대한 질병의 치료에 적합한, 특히 CD47이 과발현되고 있는 질병을 치료 또는 예방하는데 적합한 T 세포 반응을 유도하는 데에 관여하는, 화합물의 조합. - (i) 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에서 규정한 항체, 그의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 모방체 또는 그의 변형 항체; 및/또는 제 8 항에 따른 조성물; 및
(ii) 화학 치료제, 방사선 치료제, 면역 치료제, 세포 치료제, 항생제 및 프로바이오틱스로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나의 제 2 치료제, 특히 적응 면역 세포의 검사점 차단제 또는 활성화제로 이루어진 군, 특히 항-PDL1, 항-PD1, 항-CTLA4, 항-CD137, 항-CD2, 항-CD28, 항-CD40, 항-HVEM, 항-BTLA, 항-CD160, 항-TIGIT, 항-TIM-1/3, 항-LAG-3, 항-2B4, 항-VISTA, 항-OX40, 항-CD40 작용제, CD40-L, TLR 작용제, 항-ICOS, ICOS-L, STING 작용제, IDO 억제제, 종양 용해성 바이러스 및 B 세포 수용체 작용제로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 제 2 면역제를 포함하고,
질병, 특히 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위하여, 또는 질병, 특히 CD47이 과별현되고 있는 질병을 치료 또는 예방하기 위하여 특히 SIRPa v1 양성인 피험자에게서 발병된 암에 대한 치료적 백신 접종에 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 화합물의 조합. - 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서,
상기 조합은 피험자에 면역 반응을 유도하는데 적합하고,
특히 상기 조합은 질병을 치료하는데 적합한 T 세포 반응을 유도하고,
상기 활성화는, (i) T 세포, 특히 CD8+ T 세포를 활성화하는 것; 및/또는, (ii) 수지상 세포에 의한 CD8+ T 세포에 대한 적어도 하나의 항원의 교차 전달을 향상시키는 것; 및/또는 (iii) 대식세포 분극화, 특히 M1 대식세포 분극화를 향상시키는 것을 포함하거나; 또는 (i), (ii) 및 (iii)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 화합물의 조합. - 제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 질병은 암, 특히 염증성 암과 침윤된 골수 세포를 가진 암, 특히 침윤된 수지상 세포 또는 MDSC 및/또는 TAM 세포를 가진 암, 감염성 질환, 만성 염증성 질환, 자가 면역 질환, 신경 질환, 뇌 손상, 신경 손상, 적혈구 증가증, 혈색소 침착증, 외상, 패혈성 쇼크, 만성 감염성 질환, 특히 슈도모나스 및 거대 세포 바이러스(CMV) 감염성 질환, 섬유증, 죽상 경화증, 비만, 2형 당뇨병, 흑색종, 및 이식 기능 장애로 이루어진 군에서 선택되고 특히 흑색종인 것을 특징으로 하는, 화합물의 조합. - 항원 전달 세포, 특히 수지상 세포에 의한, T 세포, 특히 CD8+ T 세포에 대한 항원의 교차 전달을 증가시키기 위한 방법에 있어서,
상기 방법은 항-인간 SIRPa 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 그의 항원 결합 항체 모방체 또는 변형 항체로 이루어진 군에서 선택된 화합물을 피험자에 투여하는 단계를 포함하고,
상기 화합물은,
(1) 인간 SIRPa v2에 특이적으로 결합하지 않음;
(2) 1E-9 M 이상의 친화력으로 인간 SIRPa v1과 결합함; 및
(3) 인간 CD47이 인간 SIRPa v1에 결합하는 것을 감소시키거나 억제함; 및
(4) 인간 CD47이 인간 SIRPg에 결합하는 것을 방지하거나 억제하지 않음,의 특성들 중에서 적어도 하나의 특성을 가지고,
상기 화합물은, 선택적으로,
(i) T 세포의 증식을 억제하지 않음; 및/또는
(ii) T 세포의 활성화를 억제하지 않음; 및/또는
(iii) 대식 세포의 활성화를 향상시킴의 특성들 중에 적어도 하나의 특성을 가지는 것을 특징으로 하는, 방법. - 제 19 항에 있어서,
상기 투여한 화합물은 항-인간 SIRPa 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 그의 변형 항체이고, 상기 항-인간 SIRPa 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 그의 변형 항체는,
(a) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인으로, HCDR1은 서열 번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고, HCDR2는 서열 번호 10 또는 서열 번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고, HCDR3은 서열 번호 12 또는 서열 번호 13 또는 서열 번호 14 또는 서열 번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는, 중쇄 가변 도메인; 및
(b) 서열 번호 16 또는 서열 번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인,을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법. - 인간 피험자에 대하여 항-인간 SIRPa v1 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 그의 변형 항체를 이용한 치료의 효과 가능성을 평가하는 방법에 있어서,
상기 방법은 상기 인간 피험자로부터 사전에 획득한 생물학적 샘플에서 인간 SIRPa v1의 존재 여부를 결정하는 단계; 및
상기 인간 피험자가 SIRPa v1 양성으로 판명되면, 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 규정한 바와 같은 항-SIRPa 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 그의 변형 항체; 또는 제 15 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 조합; 또는 제 11 항 또는 제 12 항에 따라 선택된 화합물의 치료량을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법. - 제 21 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플에의 SIRPa v1의 존재가, 상기 치료가 인간 피험자에 효과적일 가능성이 있음을 나타내는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서, 상기 치료받을 인간 피험자는 암이 발병하였거나 암이 발병할 가능성이 있는 것을 특징으로 하는, 방법.
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