TW201702272A - Ｐｒａｍｅ肽專一性類ｔ細胞受體抗體 - Google Patents
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Abstract
本發明主題提供專一性結合至黑素瘤優先表現抗原(Preferentially expressed antigen of melanoma；PRAME)之抗原結合蛋白，包括針對PRAME之人類化抗體、嵌合抗體及完全人類抗體、抗體片段(例如，scFv、Fab及F(ab)2
)、嵌合抗原受體(CAR)、融合蛋白及其接合物。該等抗原結合蛋白及抗體結合至PRAME肽/I類HLA分子複合體。此類抗體、片段、融合蛋白及其接合物可用於治療PRAME相關疾病，包括例如乳癌、卵巢癌、黑素瘤、肺癌、胃腸癌症、腦腫瘤、頭頸癌、腎癌、骨髓瘤、神經母細胞瘤、套細胞淋巴瘤、慢性骨髓細胞性白血病、多發性骨髓瘤、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、急性骨髓/骨髓性白血病(AML)、非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma；NHL)及慢性淋巴細胞性白血病(CLL)。該等抗體或抗原結合蛋白可包含經設計以改善蛋白質穩定性、抗體結合及/或表現量之一或多個構架區胺基酸取代。
Description
本申請案主張2015年5月22日申請之美國臨時申請案第62/165,603號之優先權，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。
本說明書提及序列表(2016年5月19日以名為「072734.0398_ST25.txt」之.txt檔案藉由電子方式提交)。該.txt檔案係於2016年5月20日創建且大小為464,222個位元組。序列表之全部內容以引用之方式併入本文中。
本發明係依據美國國家衛生研究院(National Institutes of Health)之授與號P30 CA008748在政府支持下產生。政府享有本發明主題的某些權利。
本發明主題大體上係關於針對胞漿蛋白質之抗體。更特定言之，本發明主題係關於針對黑素瘤優先表現抗原(PRAME)之抗體，具體言之，識別PRAME肽與主要組織相容複合體(「MHC」)之組合的抗體。
對於誘導CTL反應而言，細胞內蛋白質通常經蛋白酶體或內體/
溶酶體降解，且所得肽片段結合至I類或II類MHC分子。此等肽-MHC複合體呈現於細胞表面，其中該等複合體經由肽-MHC(pMHC)-T細胞受體(TCR)相互作用提供供T細胞識別之標靶(Oka等人，The Scientific World Journal
2007；7：649-665；Kobayashi等人，Cancer Immunol.Immunother.
2006；55(7)：850-860)。
為改善功效，可用單株抗體療法靶向癌症抗原。已顯示，單株抗體(mAb)療法藉由多種機制發揮強大抗腫瘤作用，包括補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC)及針對過度表現標靶分子之腫瘤細胞的直接細胞抑制或細胞凋亡誘導作用。另外，mAb可用作載體，用以將細胞毒性部分，諸如放射性核種、細胞毒性藥物或毒素專一性遞送至腫瘤細胞(Miederer等人，Adv Drug Deliv Rev
2008；60(12)：1371-1382)。
若除細胞免疫療法方法外，亦可用體液免疫療法方法靶向非細胞表面腫瘤抗原，則將存在極大的益處。因此，模擬T細胞受體之單株抗體(mAb)由於對包含細胞內蛋白質之片段與MHC分子之組合的標靶，例如PRAME肽/HLA-A2複合體具有專一性，故將單獨作為新穎且有效之治療劑或作為能夠遞送強效抗癌試劑，諸如藥物、毒素及放射性元素之媒介物。此類mAb亦適用作診斷或預後工具。PRAME在超過80%之急性及慢性白血病、骨髓發育不良症候群(MDS)及一部分黑素瘤、肉瘤、胃腸癌症、腎癌、乳癌、肺癌等中表現。如一些系統中所記錄，PRAME在癌症幹細胞中表現。在美國，有40%的人表現HLA-A2。因此，針對此藥物之需求迫切需要滿足且存在大量患者群。
本發明主題鑑別且表徵能夠靶向胞漿/細胞內蛋白質，例如PRAME癌蛋白之抗原結合蛋白，諸如抗體。所揭示之抗體靶向肽
/MHC複合體，因為該複合體通常在細胞對PRAME蛋白質進行抗原處理及呈遞之後出現在細胞之表面上。就此點而言，該等抗體模擬T細胞受體，因為該等抗體能夠以MHC限制之方式，亦即，在肽結合至MHC抗原時，專一性識別且結合至該肽。肽/MHC複合體模仿該抗原，因為該複合體通常在PRAME蛋白質之抗原處理且呈遞至T細胞之後出現在細胞之表面上。
本文所揭示的抗體專一性識別且結合至肽/MHC複合體(例如，PRAME/HLA複合體，更特定言之，PRAME/I類HLA複合體，更特定言之PRAME/HLA-A複合體，且更特定言之，PRAME/HLA-A2複合體，甚至更特定言之，PRAME/HLA-A*0201複合體)之抗原決定基。作為MHC-肽複合體之一部分由本發明主題之抗原結合蛋白識別的PRAME肽之實例包括(但不限於)PRA100-108
(SEQ ID NO：2)、PRA142-151
(SEQ ID NO：3)、PRA300-309
(SEQ ID NO：4)、PRA425-433
(SEQ ID NO：5)及PRA435-443
(SEQ ID NO：6)。
因此，在某些實施例中，本發明主題提供結合至與MHC分子結合之PRAME肽的分離之抗體或其抗原結合部分。PRAME肽結合至MHC分子以形成PRAME/MHC複合體。在某些實施例中，MHC分子為HLA分子。在某些實施例中，HLA分子為I類HLA分子。在某些實施例中，I類HLA分子為HLA-A。在某些實施例中，HLA-A為HLA-A2。在某些實施例中，HLA-A2為HLA-A*0201。
在某一實施例中，抗體或抗原結合部分結合至PRA300-309
(SEQ ID NO：4)。在某些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含選自由以下組成之群的重鏈可變區CDR3序列及輕鏈可變區CDR3序列：(a)包含SEQ ID NO：9中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR3序列，及包含SEQ ID NO：12中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR3序列；
(b)包含SEQ ID NO：15中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR3序列，及包含SEQ ID NO：18中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR3序列；(c)包含SEQ ID NO：21中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR3序列，及包含SEQ ID NO：24中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR3序列；及(d)包含SEQ ID NO：27中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR3序列，及包含SEQ ID NO：30中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR3序列。
另外，抗體或其抗原結合部分包含選自由以下組成之群的重鏈可變區CDR2序列及輕鏈可變區CDR2序列：(a)包含SEQ ID NO：8中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR2序列，及包含SEQ ID NO：11中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR2序列；(b)包含SEQ ID NO：14中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR2序列，及包含SEQ ID NO：17中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR2序列；(c)包含SEQ ID NO：20中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR2序列，及包含SEQ ID NO：23中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR2序列；及(d)包含SEQ ID NO：26中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR2序列，及包含SEQ ID NO：29中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR2序列。
另外，抗體或其抗原結合部分包含選自由以下組成之群的重鏈可變區CDR1序列及輕鏈可變區CDR1序列：(a)包含SEQ ID NO：7中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可
變區CDR1序列，及包含SEQ ID NO：10中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR1序列；(b)包含SEQ ID NO：13中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR1序列，及包含SEQ ID NO：16中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR1序列；(c)包含SEQ ID NO：19中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR1序列，及包含SEQ ID NO：22中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR1序列；及(d)包含SEQ ID NO：25中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR1序列，及包含SEQ ID NO：28中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR1序列。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：(a)包含SEQ ID NO：7中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：8中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；包含SEQ ID NO：9中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；包含SEQ ID NO：10中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：11中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及包含SEQ ID NO：12中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3；(b)包含SEQ ID NO：13中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：14中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；包含SEQ ID NO：15中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；包含SEQ ID NO：16中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：17中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及包含SEQ ID NO：18中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3；
(c)包含SEQ ID NO：19中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：20中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；包含SEQ ID NO：21中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；包含SEQ ID NO：22中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：23中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及包含SEQ ID NO：24中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3；或(d)包含SEQ ID NO：25中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：26中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；包含SEQ ID NO：27中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；包含SEQ ID NO：28中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：29中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及包含SEQ ID NO：30中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO：7中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：8中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；包含SEQ ID NO：9中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；包含SEQ ID NO：10中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：11中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及包含SEQ ID NO：12中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含包括與選自由SEQ ID NO：49、51、53及55組成之群的序列至少80%同源之胺基酸序列的重鏈可變區。在某些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含包括SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53或SEQ ID NO：55中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含包括與選自由SEQ ID NO：50、52、54及56組成之群的序列至少80%同源之胺基酸序列的輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含包括SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54或SEQ ID NO：56中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：(a)包含SEQ ID NO：49中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：50中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區；(b)包含SEQ ID NO：51中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：52中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區；(c)包含SEQ ID NO：53中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：54所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區；或(d)包含SEQ ID NO：55中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：56中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO：49中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：50中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在某些實施例中，抗體或抗原結合部分結合至PRA435-443
(SEQ ID NO：6)。在某些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含選自由以下組成之群的重鏈可變區CDR3序列及輕鏈可變區CDR3序列：(a)包含SEQ ID NO：33中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR3序列，及包含SEQ ID NO：36中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR3序列；(b)包含SEQ ID NO：39中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR3序列，及包含SEQ ID NO：42中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR3序列；及
(c)包含SEQ ID NO：45中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR3序列，及包含SEQ ID NO：48中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR3序列。
另外，抗體或其抗原結合部分包含選自由以下組成之群的重鏈可變區CDR2序列及輕鏈可變區CDR2序列：(a)包含SEQ ID NO：32中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR2序列，及包含SEQ ID NO：35中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR2序列；(b)包含SEQ ID NO：38中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR2序列，及包含SEQ ID NO：41中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR2序列；及(c)包含SEQ ID NO：44中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR2序列，及包含SEQ ID NO：47中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR2序列。
另外，抗體或其抗原結合部分包含選自由以下組成之群的重鏈可變區CDR1序列及輕鏈可變區CDR1序列：(a)包含SEQ ID NO：31中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR1序列，及包含SEQ ID NO：34中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR1序列；(b)包含SEQ ID NO：37中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR1序列，及包含SEQ ID NO：40中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR1序列；及(c)包含SEQ ID NO：43中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR1序列，及包含SEQ ID NO：46中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR1序列。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：
(a)包含SEQ ID NO：31中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：32中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；包含SEQ ID NO：33中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；包含SEQ ID NO：34中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：35中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及包含SEQ ID NO：36中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3；(b)包含SEQ ID NO：37中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：38中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；包含SEQ ID NO：39中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；包含SEQ ID NO：40中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：41中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及包含SEQ ID NO：42中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3；或(c)包含SEQ ID NO：43中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：44中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；包含SEQ ID NO：45中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；包含SEQ ID NO：46中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：47中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及包含SEQ ID NO：48中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO：31中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：32中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；包含SEQ ID NO：33中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；包含SEQ ID NO：34中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：35中所闡述之
胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及包含SEQ ID NO：36中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含包括與選自由SEQ ID NO：57、59及61組成之群的序列至少80%同源之胺基酸序列的重鏈可變區。在某些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含包括SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：61中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含包括與選自由SEQ ID NO：58、60及62組成之群的序列至少80%同源之胺基酸序列的輕鏈可變區。在某些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含包括SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：62中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含：(a)包含SEQ ID NO：57中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：58中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區；(b)包含SEQ ID NO：59中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：60中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區；或(c)包含SEQ ID NO：61中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：62所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
修飾可為一或多個缺失、插入、取代及/或其組合。其修飾可由不超過2個、不超過3個、不超過4個或不超過5個修飾組成。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合部分結合至與MHC分子結合之PRAME肽的N末端。在某些實施例中，抗體或其抗原結合部分結合至與MHC分子結合之PRAME肽的C末端。在某些實施例中，抗體或其抗原結合部分以約1×10-7
M或更低之結合親和力(KD
)結合至與MHC分子結合之PRAME肽。在某些實施例中，抗體或其抗原結合部
分專一性結合至PRAME肽，例如以約1至5nM，例如約2.4nM之結合親和力(KD
)結合至PRAME肽。
本發明主題亦提供與參考抗體或其抗原結合部分交叉競爭結合至與MHC分子結合之PRAME肽的分離之抗體或其抗原結合部分，該參考抗體或其抗原結合部分包含：(a)包含SEQ ID NO：49中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：50中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區；(b)包含SEQ ID NO：51中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：52中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區；(c)包含SEQ ID NO：53中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：54所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區；(d)包含SEQ ID NO：55中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：56中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區；(e)包含SEQ ID NO：57中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：58中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區；(f)包含SEQ ID NO：59中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：60中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區；或(g)包含SEQ ID NO：61中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：62中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在某些實施例中，參考抗體或其抗原結合部分包括包含SEQ ID NO：49中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO：50中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在某些實施例中，MHC分子為HLA分子。在某些實施例中，HLA分子為I類HLA分子。在某些實施例中，I類HLA分子為HLA-A。在某些實施例中，HLA-A為HLA-A2。在某些實施例中，HLA-A2為HLA-A*0201。在某些實施例中，PRAME肽係選自由以下組成之群：
PRA100-108
(SEQ ID NO：2)、PRA142-151
(SEQ ID NO：3)、PRA300-309
(SEQ ID NO：4)、PRA425-433
(SEQ ID NO：5)及PRA435-443
(SEQ ID NO：6)。在某些實施例中，PRAME肽為PRA300-309
(SEQ ID NO：4)。在某些實施例中，PRAME肽為PRA435-443
(SEQ ID NO：6)。
在某些實施例中，上文所描述的抗體包含人類可變區構架區。在某些實施例中，上文所描述的抗體為完全人類抗體或其抗原結合部分。在某些實施例中，上文所描述的抗體為嵌合抗體或其抗原結合部分。在某些實施例中，上文所描述的抗體為人類化抗體或其抗原結合部分。在某些實施例中，上文所描述的抗體屬於IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。在某些實施例中，上文所描述的抗體屬於IgG1同型。
在某些實施例中，上文所描述的抗體或其抗原結合部分包含一或多個轉譯後修飾。在某些實施例中，該一或多個轉譯後修飾包含去海藻糖基化。在某些實施例中，上文所描述的抗體或其抗原結合部分包含去海藻糖基化之Fc區。
本發明主題另外提供包含上文所描述的抗體或其抗原結合部分及醫藥學上可接受之載劑的組合物。
在另一態樣中，本發明主題提供一種包含第一組分之免疫接合物，該第一組分為如本文所揭示的抗原結合蛋白、抗體或其抗原結合部分。該免疫接合物包含第二組分，其為治療部分，例如藥物、細胞毒素或放射性同位素。本發明主題另外提供包含上文所描述的免疫接合物及醫藥學上可接受之載劑的組合物。
本發明主題亦提供一種雙專一性抗體，其包含連接至第二功能性部分的上文所描述之抗體或其抗原結合部分。在某些實施例中，該第二功能性部分具有與該抗體或其抗原結合部分不同之結合專一性。在某些實施例中，該雙專一性抗體識別CD3及結合至MHC分子之PRAME肽(PRAME/MHC複合體)。本發明主題另外提供包含上文所描
述的雙專一性抗體及醫藥學上可接受之載劑的組合物。另外，本發明主題提供對結合至MHC分子之PRAME肽具有專一性之嵌合抗原受體(CAR)。在某些實施例中，CAR包含包括重鏈可變區及輕鏈可變區之抗原結合部分。在某些實施例中，CAR在重鏈可變區與輕鏈可變區之間包含連接子。在某些實施例中，連接子包含SEQ ID NO：70中所闡述之胺基酸序列。在某些實施例中，CAR包含上文所描述之抗原結合部分之一。在某些實施例中，該抗原結合部分包含單鏈可變片段(scFv)。在某些實施例中，scFv為人類scFv。在某些實施例中，人類scFv包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：63、64、65、66、67、68及69。在某些實施例中，人類scFv包含SEQ ID NO：63中所闡述之胺基酸序列。在某些實施例中，抗原結合部分包含視情況交聯之Fab。在某些實施例中，抗原結合部分包含F(ab)2
。本發明主題另外提供包含上文所描述的CAR及醫藥學上可接受之載劑的組合物。
在又一態樣中，本發明主題提供編碼對PRAME肽/HLA複合體，例如PRAME/I類HLA複合體，更特定言之，PRAME/HLA-A複合體，且更特定言之，PRAME/HLA-A2複合體，甚至更特定言之，PRAME/HLA-A*0201複合體具有專一性之抗原結合蛋白，包括抗體及嵌合抗原受體(CAR)的核酸。本發明主題亦提供包含此類核酸之載體，包括用以促進根據本發明主題之抗原結合蛋白(例如，抗體或CAR)之表現及/或分泌的載體。
在另一相關態樣中，本發明主題提供包含本文所揭示之核酸或抗原結合蛋白的細胞，包括重組免疫效應細胞，諸如經遺傳修飾成表現包含根據本發明主題之抗原結合區之CAR的T細胞。本發明主題亦涵蓋經工程改造成產生根據本發明之抗體的細胞。
在一相關態樣中，本發明主題提供醫藥組合物，其包含抗原結合蛋白、抗體、核酸、包含本文所揭示之核酸或抗原結合蛋白之載體
或細胞，以及醫藥學上可接受之載劑。
在另一態樣中，本發明主題提供一種使用本發明主題之PRAME抗體偵測細胞或組織表面上之PRAME的方法。在某些實施例中，該方法包含：(a)使細胞或組織與結合至與MHC分子結合之PRAME肽的抗體或其抗原結合部分接觸，其中該抗體或其抗原結合部分包含可偵測標記；及(b)藉由量測與細胞或組織相連之可偵測標記的量來測定結合至細胞或組織之經標記抗體或其抗原結合部分的量，其中經結合抗體或其抗原結合部分的量指示細胞或組織中PRAME的量。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合部分為上文所描述之抗體或其抗原結合部分之一。
在又一態樣中，本發明主題提供用於治療患有PRAME陽性疾病之個體的方法，其包含向該個體投與治療有效量的如上文所描述之抗原結合蛋白(例如，CAR)或包含其之組合物；如上文所描述之抗體或其抗原結合部分(包括雙專一性抗體)或包含其之組合物；如上文所描述之免疫接合物或包含其之組合物；編碼該抗原結合蛋白或抗體之核酸；或如上文所描述的包含該等核酸或蛋白質之細胞。在某些實施例中，該方法進一步包含投與選自由以下組成之群的一或多種化合物：能夠殺滅腫瘤細胞之化合物、能夠增強效應細胞之殺滅作用之化合物及能夠上調腫瘤細胞上之抗原標靶之化合物。
在又一態樣中，本發明主題提供用於治療PRAME陽性疾病之套組。在某些實施例中，該套組包含如上文所描述之抗體或抗原結合部分。在某些實施例中，該套組包含如上文所描述之CAR。在某些實施例中，該套組包含如上文所描述之雙專一性抗體。在某些實施例中，該套組進一步包含有關使用該抗體或其抗原結合部分、該CAR或該雙專一性抗體治療患有PRAME陽性疾病之個體的書面說明書。
PRAME陽性疾病係選自由以下組成之群：乳癌、卵巢癌、黑素瘤、肺癌、胃腸癌症、腦腫瘤、頭頸癌、腎癌、骨髓瘤、神經母細胞瘤、套細胞淋巴瘤、慢性骨髓細胞性白血病、多發性骨髓瘤、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、急性骨髓/骨髓性白血病(AML)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)及慢性淋巴細胞性白血病(CLL)。
圖1A至1D表示Pr300#20人類IgG1抗體與表現PRAME之腫瘤細胞株之結合。(A)Pr300-#20與PRAME+
/HLA-A*02+
癌細胞之結合。(B)Pr300-#20與PRAME300脈衝之T2細胞及未脈衝之T2細胞的結合。(C)Pr300-#20與PRAME+
/HLA-A*0201+
白血病AML14、BV173及SET2之結合以及與PRAME+
/HLA-A*0201-
白血病HL60之結合。(D)HLA-A2表現(上圖)及Pr300#20與HLA-A2+
黑素瘤細胞株SK-MEL-5之結合(下圖)。
圖2表示Pr300#20及Pr300#20-Fc之ADCC活性。
圖3A及3B表示Pr300#20-BiTE與腫瘤細胞之雙重結合。(A)Pr300#20-BiTE與PRAME+
/A02+
BV173、AML-14以及HLA-A2陰性B淋巴瘤細胞株Ramos及Jurkat T細胞之結合。對與FITC偶聯之His標籤具有專一性之二級mAb。
圖4表示Pr300#20-MAGE之ADCC活性。
圖5A至5D表示Pr300#20-MAGE之活體內抗腫瘤活性。(A)BV173對數生長曲線。(B)BV173 PRAME影像。(C)SET2對數生長曲線。(D)SET2 PRAME影像。
圖6A至6F表示Pr300#20與經丙胺酸取代之PRA300-309
或PRA300-309
脈衝之T2細胞的結合位置。(A)包括丙胺酸突變之PRAME300肽(SEQ ID NO：678-685)。(B)Pr300#20與經(A)中所列肽脈衝之T2細胞的結合。(C)HLA-A02結合。(D)Pr#20/HLA-A02比率。(E及F)Pr300#20
與經PRAME300或丙胺酸取代之PRAME300脈衝之T2細胞的結合。
圖7表示Pr300#20及Pr300#29之結合專一性。
圖8表示Pr300#20及Pr300#29之結合專一性。
圖9A至9D表示Pr300#20及Pr300#29與來自具有各種HLA-A單倍型之多個供體的正常PBMC之結合。(A)Pr300#20與HLA-A02+
/A02+
供體上之CD3+
、CD19+
及CD33+
群之結合。(B)Pr300#29與HLA-A02+
/A02+
供體上之CD3+
、CD19+
及CD33+
群之結合。(C)Pr300#20與HLA-A02-
/A02-
供體上之CD3+
、CD19+
及CD33+
群之結合。(D)Pr300#29與HLA-A02-
/A02-
供體上之CD3+
、CD19+
及CD33+
群之結合。
圖10表示藉由BB7.2染色進行之T2肽裝載之品質控制(QC)偵測之結果。
圖11A至11D表示結合至裝載有丙胺酸突變體之T2細胞之EXT009-噬菌體的直方圖。(A)EXT009-8噬菌體之噬菌體FACS直方圖。不存在與009-AAAA(陽性4-7)之結合。(B)EXT009-17噬菌體之噬菌體FACS直方圖。無與009-AAAA(陽性4-7)之結合。(C)EXT009-20噬菌體之噬菌體FACS直方圖。不存在與009-AAAA(陽性4-7)之結合。(D)EXT009-29噬菌體之噬菌體FACS直方圖。不存在與009-AAAA(陽性4-7)之結合。
除非另外定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語具有本發明所屬領域技術人員通常所理解的意義。以下參考文獻提供一般熟習此項技術者本發明主題中所使用之許多術語的一般定義：Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(第2版，1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker編，1988)；The Glossary of Genetics，第5版，R.Rieger等人(編),
Springer Verlag(1991)；及Hale & Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)；Molecular Cloning：a Laboratory Manual，第3版，J.F.Sambrook及D.W.Russell編，Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001；Recombinant Antibodies for Immunotherapy,Melvyn Little編，Cambridge University Press 2009；「Oligonucleotide Synthesis」(M.J.Gait編，1984)；「Animal Cell Culture」(R.I.Freshney編，1987)；「Methods in Enzymology」(Academic Press,Inc.)；「Current Protocols in Molecular Biology」(F.M.Ausubel等人編，1987，及定期更新)；「PCR：The Polymerase Chain Reaction」,(Mullis等人編，1994)；「A Practical Guide to Molecular Cloning」(Perbal Bernard V.,1988)；「Phage Display：A Laboratory Manual」(Barbas等人，2001)。熟習此項技術者廣泛瞭解且依賴之此等參考文獻及含有標準方案之其他參考文獻之內容，包括製造商之說明書，以引用的方式併入本文中作為本發明主題之一部分。除非另外規定，否則如本文所使用，以下術語具有以下歸屬於其之意義。
本申請案通篇使用以下縮寫：
Ab：抗體
ADCC：抗體依賴性細胞之細胞毒性
ALL：急性淋巴細胞性白血病
AML：急性骨髓白血病
APC：抗原呈遞細胞
β2M：β-2-微球蛋白
BiTE：雙專一性T細胞接合抗體
CAR：嵌合抗原受體
CDC：補體依賴性細胞毒性
CMC：補體介導之細胞毒性
CDR：互補決定區(亦參見以下HVR)
CL
：輕鏈之恆定結構域
CH1
：重鏈之第1恆定結構域
CH1,2,3
：重鏈之第1、第2及第3恆定結構域
CH2,3
：重鏈之第2及第3恆定結構域
CHO：中國倉鼠卵巢
CTL：細胞毒性T細胞
E：T比率：效應子：標靶比率
Fab：抗體結合片段
FACS：流動式細胞測量術輔助之細胞分選
FBS：胎牛血清
FR：構架區
HC：重鏈
HLA：人類白細胞抗原
HVR-H：高變區-重鏈(亦參見CDR)
HVR-L：高變區-輕鏈(亦參見CDR)
Ig：免疫球蛋白
IRES：內部核糖體進入位點
KD
：解離常數
koff
：解離速率
kon
：締合速率
MHC：主要組織相容複合體
MM：多發性骨髓瘤
scFv：單鏈可變片段
TCR：T細胞受體
VH
：可變重鏈包括重鏈高變區及重鏈可變構架區
VL
：可變輕鏈包括輕鏈高變區及輕鏈可變構架區
PRAME：黑素瘤優先表現抗原
如本文中所使用，術語「約」或「近似地」意味著在如一般熟習此項技術者所測定之特定值的可接受之誤差範圍內，其將部分取決於如何量測或測定該值，亦即，量測系統之限制。舉例而言，「約」可意謂依據此項技術中之實務，在3個或3個以上標準差之範圍內。或者，「約」可意謂在給定值之至多20%，較佳至多10%，更佳至多5%且再更佳至多1%之範圍內。或者，特別是就生物系統或方法而言，該術語可意謂在一定值之一個數量級範圍內，較佳在5倍範圍內且更佳在2倍範圍內。
如本文中所使用，術語「細胞群體」係指由表現類似或不同表型之至少兩個細胞構成之群組。在非限制性實例中，細胞群體可包括至少約10個、至少約100個、至少約200個、至少約300個、至少約400個、至少約500個、至少約600個、至少約700個、至少約800個、至少約900個、至少約1000個表現類似或不同表型之細胞。
如本文所使用，術語「抗原結合蛋白」係指包含抗原結合區或抗原結合部分，亦即，對其結合之另一分子具有較強親和力之蛋白質多肽。抗原結合蛋白涵蓋抗體、嵌合抗原受體(CAR)及融合蛋白。
術語「抗體(antibody/antibodies)」係指免疫系統之抗原結合蛋白。如本文所使用，術語「抗體」包括具有抗原結合區之完整全長抗體及其保留「抗原結合部分」或「抗原結合區」之任何片段，或其單鏈，例如單鏈可變片段(scFv)。術語「抗體」不僅意謂完整抗體分子，而且亦意謂抗體分子之保持免疫原結合能力之片段。此類片段亦為此項技術中熟知的且經常在活體外及活體內使用。因此，如本文所使用，術語「抗體」不僅意謂完整免疫球蛋白分子，而且亦意謂熟知之活性片段F(ab')2
及Fab。F(ab')2
及Fab片段缺乏完整抗體之Fc片段，
更快自循環清除，且可具有較低的完整抗體之非專一性組織結合(Wahl等人，J.Nucl.Med.
24：316-325(1983)。在某些實施例中，抗體為包含經二硫鍵相互連接之至少兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈的醣蛋白。每一重鏈包含重鏈可變區(本文縮寫為VH
)及重鏈恆定(CH
)區。重鏈恆定區包含三個結構域，即，CH1、CH2及CH3。每一輕鏈包含輕鏈可變區(本文縮寫為VL
)及輕鏈恆定CL
區。輕鏈恆定區包含一個結構域CL
。VH
及VL
區可進一步再分成高變區，稱為互補決定區(CDR)，其中散佈有稱為構架區(FR)之更保守區域。每一VH
及VL
由自胺基末端至接基羧基依以下次序佈置之三個CDR及四個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合結構域。抗體恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子，包括免疫系統之各種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組分(C1q)的結合。
如本文所使用，術語抗體之「抗原結合部分」、「抗原結合片段」或「抗原結合區」係指抗體結合至抗原且賦予抗體抗原專一性之區域或部分；抗原結合蛋白之片段，例如，抗體包括抗體的保持專一性結合至抗原(例如，肽/HLA複合體)之能力的一或多個片段。經顯示，抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段來進行。術語抗體之「抗原結合片段」內涵蓋的抗原結合部分之實例包括Fab片段，一種由VL
、VH
、CL
及CH1結構域組成之單價片段；F(ab)2
片段，一種包含在鉸鏈區藉由二硫橋連接之兩個Fab片段的二價片段；由VH
及CH1結構域組成之Fd片段；由抗體單一臂之VL
及VH
結構域組成之Fv片段；由VH
結構域組成之dAb片段(Ward等人，1989 Nature 341：544-546)；及經分離之互補決定區(CDR)。
此外，儘管Fv片段之兩個結構域VL
及VH
係由各別基因編碼，但其可使用重組方法由合成連接子接合，該連接子能夠使其成為單一蛋
白質鏈，其中VL
及VH
區配對形成單價分子。此等單一蛋白質鏈稱為單鏈Fv(scFv)，參見例如，Bird等人，1988 Science 242：423-426；及Huston等人，1988 Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-5883。此等抗體片段係使用一般熟習此項技術者已知之習知技術獲得，且以與完整抗體相同之方式來篩選供使用的片段。
「分離之抗體」或「分離之抗原結合蛋白」為已經鑑別且自其天然環境之組分分離及/或回收之抗體或蛋白質。「合成抗體」或「重組抗體」一般係使用重組技術或使用熟習此項技術者已知之肽合成技術產生。
如本文所使用，術語「單鏈可變片段」或「scFv」為共價連接形成VH
：：VL
雜二聚體的免疫球蛋白(例如，小鼠或人類)之重鏈(VH
)及輕鏈(VL
)之可變區的融合蛋白。重鏈(VH
)及輕鏈(VL
)係直接地接合或藉由編碼肽之連接子(例如，10、15、20、25個胺基酸)接合，該連接子連接VH
之N末端與VL
之C末端，或連接VH
之C末端與VL
之N末端。該連接子通常富含甘胺酸用於可撓性，且富含絲胺酸或蘇胺酸用於溶解度。儘管移除恆定區且引入連接子，但scFv蛋白質保持原始免疫球蛋白之專一性。單鏈Fv多肽抗體可由包含VH
及VL
編碼序列之核酸表現，如Huston等人(Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85：5879-5883,1988)所描述。亦參見美國專利第5,091,513號、第5,132,405號及第4,956,778號；及美國專利公開案第20050196754號及第20050196754號。已描述具有抑制活性之拮抗性scFv(參見例如，Zhao等人，Hyrbidoma(Larchmt)2008 27(6)：455-51；Peter等人，J Cachexia Sarcopenia Muscle 2012年8月12日；Shieh等人，J Imunol2009 183(4)：2277-85；Giomarelli等人，Thromb Haemost 2007 97(6)：955-63；Fife等人，J Clin Invst 2006 116(8)：2252-61；Brocks等人，Immunotechnology 1997 3(3)：173-84；Moosmayer等人，Ther Immunol 1995 2(10：31-40)。已描
述具有刺激活性之促效性scFv(參見例如，Peter等人，J Bioi Chern 2003 25278(38)：36740-7；Xie等人，Nat Biotech 1997 15(8)：768-71；Ledbetter等人，Crit Rev Immunol1997 17(5-6)：427-55；Ho等人，BioChim Biophys Acta 2003 1638(3)：257-66)。
如本文所使用，「F(ab)」係指結合至抗原但為單價的，且不具有Fc部分的抗體結構之片段，例如抗體經酶木瓜蛋白酶消化得到兩個F(ab)片段及一個Fc片段(例如，重(H)鏈恆定區；不結合至抗原之Fc區)。
如本文所使用，「F(ab')2
」係指藉由胃蛋白酶消化完整IgG抗體產生的抗體片段，其中此片段具有兩個抗原結合(ab')(二價)區域，其中每一(ab')區域包含兩條獨立的胺基酸鏈，即，用於結合抗原的藉由S-S鍵連接之H鏈及輕鏈(L)鏈之一部分且其中其餘H鏈部分連接在一起。「F(ab')2」片段可分成兩個個別的Fab'片段。
如本文所使用，術語「載體」係指當與適當控制元件締合時能夠複製且可將基因序列轉移至細胞中的任何遺傳元件，諸如質體、噬菌體、轉座子、黏質體、染色體、病毒、病毒粒子等。因此，該術語包括選殖及表現媒介物，以及病毒載體及質體載體。
如本文所使用，術語「表現載體」係指含有所需編碼序列及在特定宿主生物體中表現可操作地連接之編碼序列所需之適當核酸序列的重組核酸序列，例如重組DNA分子。在原核生物中表現所需之核酸序列通常包括啟動子、操縱子(可選)及核糖體結合位點，以及通常存在之其他序列。已知真核細胞可利用啟動子、強化子以及終止及聚腺苷酸化信號。
如本文所使用，「CDR」定義為抗體之互補決定區胺基酸序列，其為免疫球蛋白重鏈及輕鏈之高變區。參見例如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,4th U.S.Department of
Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)。一般而言，抗體在可變區中包含三個重鏈CDR及三個輕鏈CDR或CDR區。CDR提供用於抗體與抗原或抗原決定基結合之大部分接觸殘基。在某些實施例中，CDR區域係使用Kabat系統描繪(Kabat,E.A.等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)。
如本文所使用，術語「親和力」意謂結合強度之量度。在不受理論束縛情況下，親和力取決於抗體組合位點與抗原決定子之間之立體化學配合的接近性、其間接觸面積之大小以及帶電基團及疏水性基團之分佈。親和力亦包括術語「親合力」，其係指在形成可逆複合體之後抗原-抗體鍵之強度。此項技術中已知用於計算抗體對抗原之親和力的方法，其包含使用結合實驗計算親和力。在功能分析(例如，流動式細胞測量術分析)中之抗體活性亦反映抗體親和力。抗體及親和力可使用功能分析(例如，流動式細胞測量術分析)以表型表徵及比較。
可用於本發明主題中的核酸分子包括編碼抗體或其抗原結合部分之任何核酸分子。此類核酸分子不必與內源性核酸序列100%一致，但通常會展現相當大的一致性。與內源性序列具有「相當大同源性」或「相當大一致性」的多核苷酸通常能夠與雙股核酸分子之至少一股雜交。「雜交」意謂互補多核苷酸序列(例如，本文所描述之基因)或其部分在各種嚴格度條件下配對形成雙股分子。(參見例如，Wahl,G.M.及S.L.Berger(1987)Methods Enzymol.152：399；Kimmel,A.R.(1987)Methods Enzymol.152：507)。
舉例而言，嚴格的鹽濃度通常將低於約750mM NaCl及75mM檸檬酸三鈉，較佳低於約500mM NaCl及50mM檸檬酸三鈉且更佳低於
約250mM NaCl及25mM檸檬酸三鈉。低嚴格度雜交可在不存在有機溶劑，例如甲醯胺之情況下實現，而高嚴格度雜交可在至少約35%甲醯胺且更佳至少約50%甲醯胺存在下實現。嚴格的溫度條件通常將包括至少約30℃，更佳至少約37℃且最佳至少約42℃之溫度。改變另外的參數，諸如雜交時間、清潔劑(例如十二烷基硫酸鈉(SDS))之濃度及包括或不包括載體DNA係熟習此項技術者熟知的。各種嚴格度水準係藉由視需要組合此等各種條件實現。在較佳實施例中，雜交將在30℃下於750mM NaCl、75mM檸檬酸三鈉及1% SDS中發生。在一個更佳實施例中，雜交將在37℃下於500mM NaCl、50mM檸檬酸三鈉、1% SDS、35%甲醯胺及100μg/ml變性鮭魚精DNA(ssDNA)中發生。在一個最佳實施例中，雜交將在42℃下於250mM NaCl、25mM檸檬酸三鈉、1% SDS、50%甲醯胺及200μg/ml ssDNA中發生。對此等條件之有用改變將為熟習此項技術者顯而易知。
對於大部分應用，雜交之後的洗滌步驟之嚴格度亦不同。洗滌嚴格度條件可藉由鹽濃度及溫度界定。如上所述，可藉由降低鹽濃度或藉由增加溫度來增加洗滌嚴格度。舉例而言，洗滌步驟之嚴格鹽濃度較佳將低於約30mM NaCl及3mM檸檬酸三鈉且最佳低於約15mM NaCl及1.5mM檸檬酸三鈉。洗滌步驟之嚴格溫度條件通常將包括至少約25℃、更佳至少約42℃且甚至更佳至少約68℃之溫度。在一個較佳實施例中，洗滌步驟將在25℃下於30mM NaCl、3mM檸檬酸三鈉及0.1% SDS中進行。在一個更佳實施例中，洗滌步驟將在42℃下於15mM NaCl、1.5mM檸檬酸三鈉及0.1% SDS中進行。在一個更佳實施例中，洗滌步驟將在68℃下於15mM NaCl、1.5mM檸檬酸三鈉及0.1% SDS中進行。對此等條件之另外的改變將為熟習此項技術者顯而易知。雜交技術為熟習此項技術者所熟知且描述於例如Benton及Davis(Science 196：180,1977)；Grunstein及Rogness(Proc.Natl.Acad.
Sci.,USA 72：3961,1975)；Ausubel等人(Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience,New York,2001)；Berger及Kimmel(Guide to Molecular Cloning Techniques,1987,Academic Press,New York)；及Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York中。
如本文所使用，術語「交叉競爭」或「競爭」係指本發明之抗體或其抗原結合部分結合至給定抗原，例如PRAME肽或PRAME/I類HLA複合體(例如，PRAME/HLA-A複合體，例如PRAME/HLA-A2複合體，例如PRAME/HLA-A*0201複合體)減少或降低例如包含本發明抗體或其抗原結合部分中之任一者之VH
及VL
CDR1、CDR2及CDR3序列或VH
及VL
序列的參考抗體或其抗原結合部分與同一抗原之結合的情形。術語「交叉競爭」或「競爭」亦指參考抗體或其抗原結合部分結合至給定抗原，例如PRAME肽或PRAME/I類HLA複合體(例如，PRAME/HLA-A複合體，例如PRAME/HLA-A2複合體，例如PRAME/HLA-A*0201複合體)減少或降低本發明抗體或其抗原結合部分與同一抗原之結合的情形。「交叉競爭」或「競爭」抗體或其抗原結合部分結合至抗原(例如，PRAME肽或PRAME/I類HLA複合體(例如，PRAME/HLA-A複合體，例如PRAME/HLA-A2複合體，例如PRAME/HLA-A*0201複合體))上與參考抗體或其抗原結合部分所結合相同或實質上相同之抗原決定基、重疊抗原決定基或鄰近抗原決定基。
如本文所使用，「有效量」或「治療有效量」為足以影響治療後之有益或所需臨床結果的量。有效量可以一或多次劑量投與個體。就治療而言，有效量為足以緩和、改善、穩定、逆轉或減慢疾病之發展，或以其他方式減輕疾病之病理結果的量。有效量一般由醫師基於病例確定且在熟習此項技術者之技能範圍內。當確定達到有效量之適
當劑量時，通常考慮若干因素。此等因素包括個體之年齡、性別及體重、所治療之病狀、該病狀之嚴重程度，及投與之免疫反應性細胞之形式及有效濃度。
如本文所使用，術語「異源核酸分子或多肽」係指通常不存在於細胞或自細胞獲得之樣品中的核酸分子(例如，cDNA、DNA或RNA分子)或多肽。此核酸可以來自另一生物體，或其可以例如為細胞或樣品中通常不表現之mRNA分子。
如本文所使用，術語「增加」係指正向地改變至少約5%，包括(但不限於)正向地改變約5%、約10%、約25%、約30%、約50%、約75%或約100%。
如本文所使用，術語「降低」係指負向地改變至少約5%，包括(但不限於)負向地改變約5%、約10%、約25%、約30%、約50%、約75%或約100%。
如本文所使用，術語「分離」、「純化」或「生物純」係指物質在不同程度上不含在其天然狀態下所發現的通常與其一起存在之組分。「分離」表示與原始來源或環境分開之程度。「純化」表示高於分離之分開程度。「純化」或「生物純」蛋白質充分不含其他材料以致任何雜質不會實質上影響蛋白質之生物特性或引起其他不良結果。亦即，若本發明主題之核酸或多肽實質上不含細胞材料、病毒材料，或當藉由重組DNA技術製備時不含培養基，或當以化學方式合成時不含化學前驅物或其他化學物質，則其為純化的。純度及均質性通常使用例如聚丙烯醯胺凝膠電泳或高效液相層析之分析化學技術來測定。術語「純化」可表示核酸或蛋白質在電泳凝膠中基本上產生一個譜帶。對於可經歷修飾，例如磷酸化或糖基化之蛋白質而言，不同修飾可產生不同的分離蛋白質，其可分別純化。
如本文所使用，術語「專一性結合」或「專一性結合至」或
「專一性靶向」意謂多肽或其片段(包括抗體或其抗原結合部分)識別及結合所關注的生物分子(例如，PRAME/MHC複合體(例如，PRAME/HLA複合體，更特定言之，PRAME/I類HLA複合體，更特定言之，PRAME/HLA-A複合體，更特定言之，PRAME/HLA-A2複合體，且更特定言之，PRAME/HLA-A*0201複合體)，但實質上不識別及結合樣品(例如生物樣品)中之其他分子。在某些實施例中，「專一性結合至PRAME/MHC複合體」之抗體或其抗原結合部分係指以5×10-7
M或更低、1×10-7
M或更低、5×10-8
M或更低、1×10-8
M或更低、5×10-9
M或更低、1×10-9
M或更低、5×10-10
M或更低，或1×10-10
M或更低之KD
結合至PRAME/MHC複合體的抗體或其抗原結合部分。
如本文所使用，術語「治療(treating/treatment)係指嘗試改變所治療之個體或細胞之疾病病程的臨床干預，且可用於預防或在臨床病理學病程期間進行。治療之治療作用包括(但不限於)防止疾病之發生或復發、緩解症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理性結果、防止癌轉移、降低疾病進展速率、改善或緩和疾病狀態，及緩解或改善預後。藉由防止疾病或病症之進展，治療可防止由受影響或經診斷個體，或者懷疑患有病症之個體之病症引起的惡化，而且治療亦可防止有患病症之風險或懷疑患有病症之個體之病症或該病症之症狀的發作。
如本文所使用，術語「個體」係指任何動物(例如，哺乳動物)，包括(但不限於)人類、非人類靈長類動物、嚙齒動物及類似動物(例如，其將為特定治療之接受者，或自其收集細胞)。
PRAME為癌症-睪丸抗原(CTA)，其在成體組織(除睪丸之外)中不表現1
，但在許多不同類型之癌症(例如，腎癌、乳癌、肺癌、胃腸癌症、腦腫瘤、骨髓瘤、慢性骨髓性白血病(CML)、急性骨髓白血病
(AML)、非霍奇金淋巴瘤(亦稱為非霍奇金氏淋巴瘤、NHL或淋巴瘤)、黑素瘤、卵巢癌、神經管母細胞瘤、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、套細胞淋巴瘤、頭頸癌、神經母細胞瘤等)中通常在約>80-90%之試樣中廣泛表現1-12
。表1列出某些關鍵特徵，該等關鍵特徵使PRAME成為引人注目之標靶。
舉例而言，PRAME之關鍵特徵包括其在正常細胞上之有限表現，但重要的是，其存在於白血病幹細胞上3,13,14
及其參與致癌過程3,14-16
。PRAME調控視黃酸受體路徑且經顯示，其影響白血病、實體腫瘤及造血細胞在若干系統中之生長及分化。FDA批准之去甲基試劑可上調PRAME1,12,17
。若干研究已描述PRAME之多個不同的肽抗原決定基，該等抗原決定基引起能夠殺滅新鮮癌細胞之專一性人類CTL，由此驗證該蛋白質大量表現，經處理且呈遞於細胞表面上達到適於識別之程度14,18-22
。PRAME亦經鑑別為預後標記物1,12,23,24
。此外，健康供體及患者帶有PRAME反應性CTL，顯示該抗原為不耐受的，由此證實PRAME不太可能見於成體組織14,18,25
。以此方式，針對此抗原之細胞毒性劑可提供廣泛的癌症選擇性應用。
PRAME為一種核蛋白質且不能應用經典抗體療法，且為T細胞療法之對象15-22
。其他研究已充分研究兩種PRAME衍生肽(PRA300-309
及
PRA435-443
)，經顯示，其可經處理且藉由HLA-A*0201分子呈遞以誘導能夠殺滅PRAME陽性腫瘤細胞之細胞毒性CD8 T細胞18-22
。經顯示，PRAME肽疫苗能夠在較高比例之AML患者中誘導CD8 T細胞反應，此與一些患者中之臨床益處相關21
。此等結果提供有關白血病及眾多人類癌症之PRAME源性T細胞抗原決定基之治療標靶的有力證據及合理解釋。
本發明主題採用一種獲得針對任何蛋白質，包括由於不在細胞表面上表現而無法獲得的該等蛋白質之治療性抗體的方法。
為了靶向來源於細胞內之腫瘤抗原或核蛋白質，需要開發一種治療性抗體，此為不常見之方法。此方法將產生以與T細胞受體(TCR)相同之專一性識別在細胞表面上表現之肽/MHC複合體的重組mAb。此類mAb在標靶識別方面與TCR共有功能同源性，但賦予較高親和力及提供作為抗體特徵之強效細胞毒性劑之能力。技術上，可藉由習知融合瘤技術或藉由熟習此項技術者已知之活體外抗體庫技術產生人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體，由此產生類TCR mAb。
僅10%之細胞蛋白質指定在細胞表面上表現；較少蛋白質仍為含有惡性細胞選擇性抗原決定基之細胞表面蛋白質。因此，不存在針對絕大部分蛋白質，尤其僅由癌細胞表現之該等蛋白質的單株抗體。相比之下，細胞內幾乎所有蛋白質均經處理且在MHC分子情形內以肽形式呈遞於細胞表面上以供T細胞受體識別。傳統上，MHC-肽複合體只能由T細胞受體(TCR)識別，限制了使用基於T細胞之讀出分析偵測所關注之抗原決定基的能力。噬菌體呈現方法現能夠可靠地產生針對此等獨特抗原決定基之單株抗體，由此為先前不可獲得之一系列新抗原創造條件。此等抗原決定基中有許多可能為真正地腫瘤專一性的且大部分不存在於正常組織上。使用噬菌體呈現庫使得有可能選出針
對極其確定之抗原決定基之獨特且罕見抗體的大量抗體譜系(關於噬菌體呈現之更多詳情(參見McCafferty等人，Nature
,348：552-554)。對腫瘤抗原源性肽-MHC複合體分子具有極高專一性之人類Fab或scFv片段的快速鑑別因此變得可能(Noy,Expert Rev Anticancer Ther
2005：5(3)：523-536；Chames等人，Proc Nalt Acad Sci USA
2000；97：7969-7974；Held等人，Eur J.Immunol.
2004：34：2919-2929；Lev等人，Cancer Res
2002；62：3184-3194)。經顯示，藉由將對黑素瘤Ag MART-1 26-35/A2或gp100 280-288/A2具有專一性之類TCR Fab與截短形式之假單胞菌內毒素融合而產生的免疫毒素可在活體外及活體內抑制人類黑素瘤生長(Klechevsky等人，Cancer Res
2008；68(15)：6360-6367)。本發明主題涉及開發識別例如PRAME肽/HLA-A2複合體之類TCR完全人類mAb用於癌症療法。因此，本發明主題提供用於構建噬菌體-抗體試劑之方法及組合物，該等試劑將識別細胞表面上之專一性MHC/肽複合體，以便大幅擴充腫瘤相關標靶且可能更重要的是，擴充腫瘤專一性標靶之譜系。本發明主題提供針對由原型細胞內腫瘤抗原PRAME得到之肽/MHC複合體之新生抗原決定基的抗體(例如，單株抗體)。
在某些實施例中，本發明之抗體或其抗原結合部分以高親和力，例如以1×10-7
M或更低，例如約1×10-8
M或更低、約1×10-9
M或更低或約1×10-10
M或更低之KD
結合至PRAME/MHC複合體。在某些實施例中，本發明之抗體或其抗原結合部分以約1×10-10
M至約1×10-7
M，例如約自約1×10-10
M至約1×10-9
M、1×10-9
M至約1×10-8
M或約1×10-8
M至約1×10-7
M之KD
結合至PRAME/MHC複合體。在某些實施例中，本發明之抗體或其抗原結合部分以約1至10nM，例如約1至9nM、約1至8nM、約1至7nM、約1至6nM、約1至5nM、約1至4nM、約1至3nM、約1至2nM、約2至3nM、約2至4nM、約2至5
nM、約2至6nM、約2至7nM、約2至8nM、約2至9nM、約2至10nM、約3至4nM、約3至5nM、約3至6nM、約3至7nM、約3至8nM、約3至9nM、約3至10nM、約4至5nM、約4至6nM、約4至7nM、約4至8nM、約4至9nM、約4至10nM、約5至6nM、約5至7nM、約5至8nM、約5至9nM、約5至10nM、約6至7nM、約6至8nM、約6至9nM、約6至10nM、約7至8nM、約7至9nM、約7至10nM、約8至9nM、約8至10nM或約9至10nM之KD
結合至PRAME/MHC複合體。在一個非限制性實施例中，KD
為2.4nM。
在本發明主題中，描述具有基於scFv之抗原結合區的抗原結合蛋白，包括抗體，該等scFv係使用重組HLA-肽複合體自人類scFv噬菌體呈現庫選出。此等分子展示敏銳的專一性，例如，如用僅識別PRAME/MHC複合體(例如，PRAME/HLA複合體，更特定言之，PRAME/I類HLA複合體，更特定言之，PRAME/HLA-A複合體，更特定言之，PRAME/HLA-A2複合體，且更特定言之，PRAME/HLA-A*0201複合體)之抗PRAME抗體所顯示。此外，除無法結合至含有其他肽之MHC複合體外，該等分子亦無法結合至該等肽本身，進一步證實其類TCR專一性。
具有類TCR專一性之重組抗體代表用於腫瘤免疫學及免疫療法中之研究及治療應用的可貴新工具。PRAME為公認且經驗證之腫瘤抗原，已將其作為標記物、預後因子及治療標靶進行研究。
本發明之抗原結合部分可為Fab、Fab'、F(ab')2
、Fv或單鏈可變片段(scFv)。在某些非限制性實施例中，本發明之其抗原結合部分為scFv。在某些實施例中，scFv為人類scFv。首先測試藉由噬菌體呈現而選擇的本發明主題之scFv結合至HLA陽性細胞表面上呈遞之肽的能力。在肽存在下培育T2細胞之後，可使用螢光標記之抗體，使用流動式細胞測量術選擇性識別抗原脈衝之細胞。
在某些實施例中，本發明主題提供抗體，該等抗體具有scFv序列與抗體重鏈或輕鏈可變區之一或多個恆定結構域融合以形成具有人類免疫球蛋白Fc區之抗體，由此得到二價蛋白質，從而增加該抗體之總體親合力及穩定性。此外，Fc部分允許其他分子，包括(但不限於)螢光染料、細胞毒素、放射性同位素等直接偶聯至抗體以例如用於抗原定量研究；固定抗體以用於親和力量測；用於靶向遞送治療劑；及/或使用免疫效應細胞測試Fc介導之細胞毒性；及許多其他應用。
本發明主題之分子係基於使用噬菌體呈現鑑別及選擇scFv，其胺基酸序列賦予該等分子針對所關注之MHC限制性肽的專一性且形成本發明之所有抗原結合蛋白之基礎。因此，可使用scFv設計一系列不同的「抗體」分子，包括例如全長抗體、其片段，諸如Fab及F(ab')2
；微型抗體；融合蛋白(包括scFv-Fc融合物)；多價抗體，亦即，對於相同抗原或不同抗原具有超過一種專一性之抗體，例如雙專一性T細胞接合抗體(BiTe)、三功能抗體等(參見Cuesta等人，Multivalent antibodies：when design surpasses evolution.Trends in Biotechnology
28：355-362 2010)。
在構建重組免疫球蛋白時，各種免疫球蛋白同型之恆定區之適當胺基酸序列及用於製備一系列抗體之方法係熟習此項技術者所知的。
噬菌體呈現技術允許快速選擇及產生抗原專一性scFv及Fab片段，就其自身而言，其為有用的，或其可進一步開發以提供完整抗體、抗原結合蛋白其抗原結合片段。相較於scFv及Fab抗體，具有Fc結構域之完整mAb具有多種優勢。第一，僅全長Ab發揮免疫功能，諸如經由Fc結構域介導之CDC及ADCC。第二，二價mAb提供的抗原結合親和力比單體Fab Ab強。第三，Fab與二價mAb之血漿半衰期及腎清除率將不同。其各自之特定特徵及優勢可與計劃之效應子策略相
配。第四，二價mAb可以不同於scFv及Fab之速率內化，從而改變免疫功能或載體功能。舉例而言，α發射體不需要內化以殺滅標靶，但許多藥物及毒素將得益於免疫複合體之內化。因此，在一個實施例中，一旦自噬菌體呈現庫獲得對PRAME肽-HLA複合體具有專一性之scFv純系，即使用scFv片段產生全長IgG mAb。
為了在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中產生重組人類單株IgG，可基於熟習此項技術者已知之方法對全長IgG mAb進行工程改造(Tomomatsu等人，Production of human monoclonal antibodies against FceRIa by a method combining in vitro immunization with phage display.Biosci Biotechnol Biochem 73(7)：1465-1469 2009)。簡言之，可將抗體可變區次選殖至具有相配之λ或κ輕鏈恆定序列及IgG1子類Fc(例如)之哺乳動物表現載體中(Lidija P等人，An integrated vector system for the eukaryotic expression of antibodies or their fragments after selection from phage display libraries.Gene 1997；187(1)：9-18；Lisa JH等人，Crystallographic structure of an intact lgG1 monoclonal antibody.Journal of Molecular Biology 1998；275(5)：861-872)。可使用動力學結合分析(Yasmina NA等人，Probing the binding mechanism and affinity of tanezumab,a recombinant humanized anti-NGF monoclonal antibody,using a repertoire of biosensors.Protein Science 2008；17(8)：1326-1335)確定全長IgG以奈莫耳濃度範圍之KD
專一性結合至PRAME/I類HLA複合體。
在某些實施例中，本發明主題提供一種抗原結合蛋白，其為全長抗體(抗PRAME抗體)，本發明主題之抗體的重鏈及輕鏈可為全長的(例如，包括至少一個且較佳兩個完整重鏈及至少一個且較佳兩個完整輕鏈之抗體)。該抗體可屬於IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD或IgE同型。在某些實施例中，該抗體屬於IgG1、
IgG2、IgG3或IgG4同型。在一個非限制性實施例中，抗體屬於IgG1同型(例如，人類IgG1抗體)。抗體類型之選擇可取決於抗體經設計以引起之免疫效應功能。輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區，較佳為κ恆定區。
在某些實施例中，本發明之抗體或其他抗原結合蛋白專一性結合至與MHC分子，例如HLA分子，更特定言之，I類HLA分子，更特定言之，HLA-A分子，更特定言之，HLA-A2，甚至更特定言之，HLA-A*0201結合之PRAME肽。PRAME肽可包括8-11個，例如8個、9個、10個及11個胺基酸。在某一實施例中，PRAME肽為9聚體肽。在某些實施例中，PRAME肽為10聚體肽。PRAME肽可為此項技術中已知之肽，包括(但不限於)PRA100-108
(SEQ ID NO：2)、PRA142-151
(SEQ ID NO：3)、PRA300-309
(SEQ ID NO：4)、PRA425-433
(SEQ ID NO：5)及PRA435-443
(SEQ ID NO：6)。18-22
以下提供SEQ ID NO：2至6之序列。
VLDGLDVLL(SEQ ID NO：2)
SLYSFPEPEA(SEQ ID NO：3)
ALYVDSLFFL(SEQ ID NO：4)
SLLQHLIGL(SEQ ID NO：5)
NLTHVLYPV(SEQ ID NO：6)。
在某些實施例中，PRAME肽為PRA300-309
。在某些實施例中，PRAME肽為PRA435-443
。在某些實施例中，抗體或其他抗原結合蛋白結合至PRAME/MHC複合體中PRAME肽之C末端。在某些實施例中，抗體或其他抗原結合蛋白結合至PRAME/MHC複合體中PRAME肽之N末端。
在某些實施例中，抗體或其他抗原結合蛋白結合至PRA300-309
與HLA-A*0201之組合。結合至PRA300-309
之scFv之非限制性實例包括EXT009-01、EXT009-03、EXT009-04、EXT009-05、EXT009-07、
EXT009-08、EXT009-09、EXT009-10、EXT009-12、EXT009-13、EXT009-14、EXT009-15、EXT009-17、EXT009-18、EXT009-19、EXT009-20、EXT009-21、EXT009-23、EXT009-25、EXT009-27、EXT009-29、EXT009-30、EXT009-31、EXT009-32及EXT009-33。EXT009-08、EXT009-17、EXT009-20及EXT009-29之重鏈及輕鏈可變區CDR1、CD22及CDR3序列顯示於下表2中。CDR區係使用Kabat系統描繪(Kabat,E.A.等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)。EXT009-08、EXT009-17、EXT009-20及EXT009-29之全長胺基酸序列及編碼其之核苷酸、重鏈可變區序列及編碼其之核苷酸，以及輕鏈可變區序列及編碼其之核苷酸示於附錄A中。
EXT009-01、EXT009-03、EXT009-04、EXT009-05、EXT009-07、EXT009-09、EXT009-10、EXT009-12、EXT009-13、EXT009-14、EXT009-15、EXT009-18、EXT009-19、EXT009-21、EXT009-23、EXT009-25、EXT009-27、EXT009-30、EXT009-31、EXT009-32及EXT009-33之重鏈及輕鏈可變區CDR1、CD22及CDR3序列示於附錄B中。EXT009-01、EXT009-03、EXT009-04、EXT009-05、EXT009-07、EXT009-09、EXT009-10、EXT009-12、EXT009-13、EXT009-
14、EXT009-15、EXT009-18、EXT009-19、EXT009-21、EXT009-23、EXT009-25、EXT009-27、EXT009-30、EXT009-31、EXT009-32及EXT009-33之全長胺基酸序列及編碼其之核苷酸、重鏈可變區序列及編碼其之核苷酸，以及輕鏈可變區序列及編碼其之核苷酸示於附錄C中。
在某些實施例中，抗體或其他抗原結合蛋白結合至PRA435-443
與HLA-A*0201之組合。結合至PRA435-443
之scFv之非限制性實例包括EXT010-01、EXT010-03、EXT010-04、EXT010-06、EXT010-07、EXT010-08、EXT010-10、EXT010-12、EXT010-13、EXT010-15、EXT010-17、EXT010-23、EXT010-24、EXT010-25、EXT010-26、EXT010-27、EXT010-28、EXT010-29、EXT010-30、EXT010-31、EXT010-32、EXT010-33、EXT010-34、EXT010-37、EXT010-40、EXT010-42、EXT010-44、EXT010-47、EXT010-48、EXT010-49、EXT010-55、EXT010-56、EXT010-59及EXT010-60。EXT010-12、EXT010-37及EXT010-40之重鏈及輕鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3序列示於下表3中。EXT010-12、EXT010-37及EXT010-40之全長胺基酸序列及編碼其之核苷酸、重鏈可變區序列及編碼其之核苷酸，以及輕鏈可變區序列及編碼其之核苷酸示於附錄A中。
EXT010-01、EXT010-03、EXT010-04、EXT010-06、EXT010-07、EXT010-08、EXT010-10、EXT010-13、EXT010-15、EXT010-
17、EXT010-23、EXT010-24、EXT010-25、EXT010-26、EXT010-27、EXT010-28、EXT010-29、EXT010-30、EXT010-31、EXT010-32、EXT010-33、EXT010-34、EXT010-42、EXT010-44、EXT010-47、EXT010-48、EXT010-49、EXT010-55、EXT010-56、EXT010-59及EXT010-60之重鏈及輕鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3序列示於附錄D中。EXT010-01、EXT010-03、EXT010-04、EXT010-06、EXT010-07、EXT010-08、EXT010-10、EXT010-13、EXT010-15、EXT010-17、EXT010-23、EXT010-24、EXT010-25、EXT010-26、EXT010-27、EXT010-28、EXT010-29、EXT010-30、EXT010-31、EXT010-32、EXT010-33、EXT010-34、EXT010-42、EXT010-44、EXT010-47、EXT010-48、EXT010-49、EXT010-55、EXT010-56、EXT010-59及EXT010-60之全長胺基酸序列及編碼其之核苷酸、重鏈可變區序列及編碼其之核苷酸以及輕鏈可變區序列及編碼其之核苷酸示於附錄C中。
鑒於EXT009-01、EXT009-03、EXT009-04、EXT009-05、EXT009-07、EXT009-08、EXT009-09、EXT009-10、EXT009-12、EXT009-13、EXT009-14、EXT009-15、EXT009-17、EXT009-18、EXT009-19、EXT009-20、EXT009-21、EXT009-23、EXT009-25、EXT009-27、EXT009-29、EXT009-30、EXT009-31、EXT009-32及EXT009-33各自可結合至PRA300-309
與HLA-A*0201之組合，故EXT009-01、EXT009-03、EXT009-04、EXT009-05、EXT009-07、EXT009-08、EXT009-09、EXT009-10、EXT009-12、EXT009-13、EXT009-14、EXT009-15、EXT009-17、EXT009-18、EXT009-19、EXT009-20、EXT009-21、EXT009-23、EXT009-25、EXT009-27、EXT009-29、EXT009-30、EXT009-31、EXT009-32及EXT009-33之VH
及VL
序列可「經混合及匹配」以產生結合至PRA300-309
與HLA-A*0201
之組合的其他抗體或其他抗原結合蛋白。
類似地，鑒於EXT010-01、EXT010-03、EXT010-04、EXT010-06、EXT010-07、EXT010-08、EXT010-10、EXT010-12、EXT010-13、EXT010-15、EXT010-17、EXT010-23、EXT010-24、EXT010-25、EXT010-26、EXT010-27、EXT010-28、EXT010-29、EXT010-30、EXT010-31、EXT010-32、EXT010-33、EXT010-34、EXT010-37、EXT010-40、EXT010-42、EXT010-44、EXT010-47、EXT010-48、EXT010-49、EXT010-55、EXT010-56、EXT010-59及EXT010-60各自可結合至PRA435-443
與HLA-A*0201之組合，故EXT010-01、EXT010-03、EXT010-04、EXT010-06、EXT010-07、EXT010-08、EXT010-10、EXT010-12、EXT010-13、EXT010-15、EXT010-17、EXT010-23、EXT010-24、EXT010-25、EXT010-26、EXT010-27、EXT010-28、EXT010-29、EXT010-30、EXT010-31、EXT010-32、EXT010-33、EXT010-34、EXT010-37、EXT010-40、EXT010-42、EXT010-44、EXT010-47、EXT010-48、EXT010-49、EXT010-55、EXT010-56、EXT010-59及EXT010-60之VH
及VL
序列可「經混合及匹配」以產生結合至PRA435-443
與HLA-A*0201之組合的其他抗體或其他抗原結合蛋白。
此類「經混合及匹配」之抗體可使用此項技術中已知之結合分析，包括例如ELISA、西方墨點法、RIA、Biacore分析進行測試。較佳地，當VH
及VL
鏈經混合及匹配時，來自特定VH
/VL
對的VH
序列經結構類似之VH
序列替換。同樣，來自特定VH
/VL
對之VL
序列經結構類似之VL
序列置換。
在某些實施例中，本發明之抗體或其他抗原結合蛋白包含：(a)如附錄A及C中所示的EXT009-01、EXT009-03、EXT009-04、EXT009-05、EXT009-07、EXT009-08、EXT009-09、EXT009-10、
EXT009-12、EXT009-13、EXT009-14、EXT009-15、EXT009-17、EXT009-18、EXT009-19、EXT009-20、EXT009-21、EXT009-23、EXT009-25、EXT009-27、EXT009-29、EXT009-30、EXT009-31、EXT009-32或EXT009-33之VH
，及/或(b)如附錄A及C中所示的EXT009-01、EXT009-03、EXT009-04、EXT009-05、EXT009-07、EXT009-08、EXT009-09、EXT009-10、EXT009-12、EXT009-13、EXT009-14、EXT009-15、EXT009-17、EXT009-18、EXT009-19、EXT009-20、EXT009-21、EXT009-23、EXT009-25、EXT009-27、EXT009-29、EXT009-30、EXT009-31、EXT009-32或EXT009-33之VL
。
舉例而言，抗體或其他抗原結合蛋白包含：(a)包含選自由SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53或SEQ ID NO：55組成之群之胺基酸序列的VH
；及/或(b)包含選自由SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54或SEQ ID NO：56組成之群之胺基酸序列的VL
。
較佳之重鏈及輕鏈組合包括：(a)包含SEQ ID NO：49中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：50中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區；(b)包含SEQ ID NO：51中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：52中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區；(c)包含SEQ ID NO：53中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：54所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區；或(d)包含SEQ ID NO：55中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：56中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在某些實施例中，本發明之抗體或其他抗原結合蛋白包含：(a)如附錄A及C中所示的EXT010-01、EXT010-03、EXT010-04、EXT010-06、EXT010-07、EXT010-08、EXT010-10、EXT010-12、
EXT010-13、EXT010-15、EXT010-17、EXT010-23、EXT010-24、EXT010-25、EXT010-26、EXT010-27、EXT010-28、EXT010-29、EXT010-30、EXT010-31、EXT010-32、EXT010-33、EXT010-34、EXT010-37、EXT010-40、EXT010-42、EXT010-44、EXT010-47、EXT010-48、EXT010-49、EXT010-55、EXT010-56、EXT010-59或EXT010-60之VH
，及/或(b)如附錄A及C中所示的EXT010-01、EXT010-03、EXT010-04、EXT010-06、EXT010-07、EXT010-08、EXT010-10、EXT010-12、EXT010-13、EXT010-15、EXT010-17、EXT010-23、EXT010-24、EXT010-25、EXT010-26、EXT010-27、EXT010-28、EXT010-29、EXT010-30、EXT010-31、EXT010-32、EXT010-33、EXT010-34、EXT010-37、EXT010-40、EXT010-42、EXT010-44、EXT010-47、EXT010-48、EXT010-49、EXT010-55、EXT010-56、EXT010-59或EXT010-60之VL
。
舉例而言，抗體或其他抗原結合蛋白包含：(a)包含選自由SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：61組成之群之胺基酸序列的VH
；及/或(b)包含選自由SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：62組成之群之胺基酸序列的VL
。
較佳之重鏈及輕鏈組合包括：(a)包含SEQ ID NO：57中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：58中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區；(b)包含SEQ ID NO：59中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：60中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區；或(c)包含SEQ ID NO：61中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：62所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在某些實施例中，本發明之抗體或其他抗原結合蛋白包含如表2及3以及附錄B及D中所示的EXT009-01、EXT009-03、EXT009-04、
EXT009-05、EXT009-07、EXT009-08、EXT009-09、EXT009-10、EXT009-12、EXT009-13、EXT009-14、EXT009-15、EXT009-17、EXT009-18、EXT009-19、EXT009-20、EXT009-21、EXT009-23、EXT009-25、EXT009-27、EXT009-29、EXT009-30、EXT009-31、EXT009-32、EXT009-33、EXT010-01、EXT010-03、EXT010-04、EXT010-06、EXT010-07、EXT010-08、EXT010-10、EXT010-12、EXT010-13、EXT010-15、EXT010-17、EXT010-23、EXT010-24、EXT010-25、EXT010-26、EXT010-27、EXT010-28、EXT010-29、EXT010-30、EXT010-31、EXT010-32、EXT010-33、EXT010-34、EXT010-37、EXT010-40、EXT010-42、EXT010-44、EXT010-47、EXT010-48、EXT010-49、EXT010-55、EXT010-56、EXT010-59或EXT010-60之重鏈及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3。
鑒於EXT009-01、EXT009-03、EXT009-04、EXT009-05、EXT009-07、EXT009-08、EXT009-09、EXT009-10、EXT009-12、EXT009-13、EXT009-14、EXT009-15、EXT009-17、EXT009-18、EXT009-19、EXT009-20、EXT009-21、EXT009-23、EXT009-25、EXT009-27、EXT009-29、EXT009-30、EXT009-31、EXT009-32及EXT009-33各自可結合至PRA300-309
與HLA-A*0201之組合且抗原結合專一性主要由CDR1、CDR2及CDR3區域提供，故XT009-01、EXT009-03、EXT009-04、EXT009-05、EXT009-07、EXT009-08、EXT009-09、EXT009-10、EXT009-12、EXT009-13、EXT009-14、EXT009-15、EXT009-17、EXT009-18、EXT009-19、EXT009-20、EXT009-21、EXT009-23、EXT009-25、EXT009-27、EXT009-29、EXT009-30、EXT009-31、EXT009-32及EXT009-33各自之VH
CDR1、CDR2及CDR3序列以及VL
CDR1、CDR2及CDR3序列可「經混合及匹配」(亦即，可混合及匹配來自不同抗體之CDR，不過每一抗體必須
含有VH
CDR1、CDR2及CDR3以及VL
CDR1、CDR2及CDR3)以產生結合至PRA300-309
與HLA-A*0201之組合的其他抗體或其他抗原結合蛋白。
類似地，鑒於EXT010-01、EXT010-03、EXT010-04、EXT010-06、EXT010-07、EXT010-08、EXT010-10、EXT010-12、EXT010-13、EXT010-15、EXT010-17、EXT010-23、EXT010-24、EXT010-25、EXT010-26、EXT010-27、EXT010-28、EXT010-29、EXT010-30、EXT010-31、EXT010-32、EXT010-33、EXT010-34、EXT010-37、EXT010-40、EXT010-42、EXT010-44、EXT010-47、EXT010-48、EXT010-49、EXT010-55、EXT010-56、EXT010-59及EXT010-60各自可結合至PRA435-443
與HLA-A*0201之組合且抗原結合專一性主要由CDR1、CDR2及CDR3區域提供，故EXT010-01、EXT010-03、EXT010-04、EXT010-06、EXT010-07、EXT010-08、EXT010-10、EXT010-12、EXT010-13、EXT010-15、EXT010-17、EXT010-23、EXT010-24、EXT010-25、EXT010-26、EXT010-27、EXT010-28、EXT010-29、EXT010-30、EXT010-31、EXT010-32、EXT010-33、EXT010-34、EXT010-37、EXT010-40、EXT010-42、EXT010-44、EXT010-47、EXT010-48、EXT010-49、EXT010-55、EXT010-56、EXT010-59及EXT010-60各自之VH
CDR1、CDR2及CDR3序列以及VL
CDR1、CDR2及CDR3序列可「經混合及匹配」以產生結合至PRA435-443
與HLA-A*0201之組合的其他抗體或其他抗原結合蛋白。此類「經混合及匹配」之抗體可使用以上描述的結合分析進行測試。
當VH
CDR序列經混合及匹配時，來自特定VH
序列之CDR1、CDR2及/或CDR3序列經結構類似之CDR序列置換。同樣，當VL
CDR序列經混合及匹配時，來自特定VL
序列之CDR1、CDR2及/或CDR3序列較佳經結構類似之CDR序列置換。一般熟習此項技術者將顯而易
知，新穎的VH
及VL
序列可藉由用來自本文所揭示之抗體或其抗原結合部分之CDR序列之結構類似序列取代一或多個VH
及/或VL
CDR區序列產生。
在某些實施例中，本發明之抗體或其抗原結合部分包含：(a)如表2及附錄B中所示的EXT009-01、EXT009-03、EXT009-04、EXT009-05、EXT009-07、EXT009-08、EXT009-09、EXT009-10、EXT009-12、EXT009-13、EXT009-14、EXT009-15、EXT009-17、EXT009-18、EXT009-19、EXT009-20、EXT009-21、EXT009-23、EXT009-25、EXT009-27、EXT009-29、EXT009-30、EXT009-31、EXT009-32或EXT009-33之VH
CDR1；(b)如表2及附錄B中所示的EXT009-01、EXT009-03、EXT009-04、EXT009-05、EXT009-07、EXT009-08、EXT009-09、EXT009-10、EXT009-12、EXT009-13、EXT009-14、EXT009-15、EXT009-17、EXT009-18、EXT009-19、EXT009-20、EXT009-21、EXT009-23、EXT009-25、EXT009-27、EXT009-29、EXT009-30、EXT009-31、EXT009-32或EXT009-33之VH
CDR2；(c)如表2及附錄B中所示的EXT009-01、EXT009-03、EXT009-04、EXT009-05、EXT009-07、EXT009-08、EXT009-09、EXT009-10、EXT009-12、EXT009-13、EXT009-14、EXT009-15、EXT009-17、EXT009-18、EXT009-19、EXT009-20、EXT009-21、EXT009-23、EXT009-25、EXT009-27、EXT009-29、EXT009-30、EXT009-31、EXT009-32或EXT009-33之VH
CDR3；(d)如表2及附錄B中所示的EXT009-01、EXT009-03、EXT009-04、EXT009-05、EXT009-07、EXT009-08、EXT009-09、EXT009-10、EXT009-12、EXT009-13、EXT009-14、EXT009-15、EXT009-17、EXT009-18、EXT009-19、EXT009-20、EXT009-21、EXT009-
23、EXT009-25、EXT009-27、EXT009-29、EXT009-30、EXT009-31、EXT009-32或EXT009-33之VL
CDR1；(e)如表2及附錄B中所示的EXT009-01、EXT009-03、EXT009-04、EXT009-05、EXT009-07、EXT009-08、EXT009-09、EXT009-10、EXT009-12、EXT009-13、EXT009-14、EXT009-15、EXT009-17、EXT009-18、EXT009-19、EXT009-20、EXT009-21、EXT009-23、EXT009-25、EXT009-27、EXT009-29、EXT009-30、EXT009-31、EXT009-32或EXT009-33之VL
CDR2；及(f)如表2及附錄B中所示的EXT009-01、EXT009-03、EXT009-04、EXT009-05、EXT009-07、EXT009-08、EXT009-09、EXT009-10、EXT009-12、EXT009-13、EXT009-14、EXT009-15、EXT009-17、EXT009-18、EXT009-19、EXT009-20、EXT009-21、EXT009-23、EXT009-25、EXT009-27、EXT009-29、EXT009-30、EXT009-31、EXT009-32或EXT009-33之VL
CDR3。
舉例而言，本發明之抗體或其抗原結合部分包含：(a)包含選自由SEQ ID NO：7、13、19及25組成之群之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；(b)包含選自由SEQ ID NO：8、14、20及26組成之群之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；(c)包含選自由SEQ ID NO：9、15、21及27組成之群之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；(d)包含選自由SEQ ID NO：10、16、22及28組成之群之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；(e)包含選自由SEQ ID NO：11、17、23及29組成之群之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及(f)包含選自由SEQ ID NO：12、18、24及30組成之群之胺基酸序
列的輕鏈可變區CDR3。
在一個實施例中，本發明之抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO：7中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：8中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；包含SEQ ID NO：9中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；包含SEQ ID NO：10中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：11中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及包含SEQ ID NO：12中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。包含此CDR1、CDR2及CDR3之組合的抗體稱為「Pr300#20」或「Pr#20」。
在一個實施例中，本發明之抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO：13中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：14中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；包含SEQ ID NO：15中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；包含SEQ ID NO：16中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：17中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及包含SEQ ID NO：18中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。包含此CDR1、CDR2及CDR3之組合的抗體稱為「Pr300#8」。
在一個實施例中，本發明之抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO：19中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：20中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；包含SEQ ID NO：21中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；包含SEQ ID NO：22中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：23中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及包含SEQ ID NO：24中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。包含此CDR1、CDR2及CDR3之組合的抗體稱為「Pr300#17」。
在一個實施例中，本發明之抗體或其抗原結合部分包含：包含
SEQ ID NO：25中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：26中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；包含SEQ ID NO：27中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；包含SEQ ID NO：28中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：29中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及包含SEQ ID NO：30中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。包含此CDR1、CDR2及CDR3之組合的抗體稱為「Pr300#29」。
在某些實施例中，本發明之抗體或其抗原結合部分包含：(a)如表3及附錄D中所示的EXT010-01、EXT010-03、EXT010-04、EXT010-06、EXT010-07、EXT010-08、EXT010-10、EXT010-12、EXT010-13、EXT010-15、EXT010-17、EXT010-23、EXT010-24、EXT010-25、EXT010-26、EXT010-27、EXT010-28、EXT010-29、EXT010-30、EXT010-31、EXT010-32、EXT010-33、EXT010-34、EXT010-37、EXT010-40、EXT010-42、EXT010-44、EXT010-47、EXT010-48、EXT010-49、EXT010-55、EXT010-56、EXT010-59或EXT010-60之VH
CDR1；(b)如表3及附錄D中所示的EXT010-01、EXT010-03、EXT010-04、EXT010-06、EXT010-07、EXT010-08、EXT010-10、EXT010-12、EXT010-13、EXT010-15、EXT010-17、EXT010-23、EXT010-24、EXT010-25、EXT010-26、EXT010-27、EXT010-28、EXT010-29、EXT010-30、EXT010-31、EXT010-32、EXT010-33、EXT010-34、EXT010-37、EXT010-40、EXT010-42、EXT010-44、EXT010-47、EXT010-48、EXT010-49、EXT010-55、EXT010-56、EXT010-59或EXT010-60之VH
CDR2；(c)如表3及附錄D中所示的EXT010-01、EXT010-03、EXT010-04、EXT010-06、EXT010-07、EXT010-08、EXT010-10、EXT010-
12、EXT010-13、EXT010-15、EXT010-17、EXT010-23、EXT010-24、EXT010-25、EXT010-26、EXT010-27、EXT010-28、EXT010-29、EXT010-30、EXT010-31、EXT010-32、EXT010-33、EXT010-34、EXT010-37、EXT010-40、EXT010-42、EXT010-44、EXT010-47、EXT010-48、EXT010-49、EXT010-55、EXT010-56、EXT010-59或EXT010-60或EXT009-33之VH
CDR3；(d)如表3及附錄D中所示的EXT010-01、EXT010-03、EXT010-04、EXT010-06、EXT010-07、EXT010-08、EXT010-10、EXT010-12、EXT010-13、EXT010-15、EXT010-17、EXT010-23、EXT010-24、EXT010-25、EXT010-26、EXT010-27、EXT010-28、EXT010-29、EXT010-30、EXT010-31、EXT010-32、EXT010-33、EXT010-34、EXT010-37、EXT010-40、EXT010-42、EXT010-44、EXT010-47、EXT010-48、EXT010-49、EXT010-55、EXT010-56、EXT010-59或EXT010-60之VL
CDR1；(e)如表3及附錄D中所示的EXT010-01、EXT010-03、EXT010-04、EXT010-06、EXT010-07、EXT010-08、EXT010-10、EXT010-12、EXT010-13、EXT010-15、EXT010-17、EXT010-23、EXT010-24、EXT010-25、EXT010-26、EXT010-27、EXT010-28、EXT010-29、EXT010-30、EXT010-31、EXT010-32、EXT010-33、EXT010-34、EXT010-37、EXT010-40、EXT010-42、EXT010-44、EXT010-47、EXT010-48、EXT010-49、EXT010-55、EXT010-56、EXT010-59或EXT010-60之VL
CDR2；及(f)如表3及附錄D中所示的EXT010-01、EXT010-03、EXT010-04、EXT010-06、EXT010-07、EXT010-08、EXT010-10、EXT010-12、EXT010-13、EXT010-15、EXT010-17、EXT010-23、EXT010-24、EXT010-25、EXT010-26、EXT010-27、EXT010-28、EXT010-
29、EXT010-30、EXT010-31、EXT010-32、EXT010-33、EXT010-34、EXT010-37、EXT010-40、EXT010-42、EXT010-44、EXT010-47、EXT010-48、EXT010-49、EXT010-55、EXT010-56、EXT010-59或EXT010-60之VL
CDR3。
舉例而言，本發明之抗體或其抗原結合部分包含：(a)包含選自由SEQ ID NO：31、37及43組成之群之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；(b)包含選自由SEQ ID NO：32、38及44組成之群之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；(c)包含選自由SEQ ID NO：33、39及45組成之群之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；(d)包含選自由SEQ ID NO：34、40及46組成之群之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；(e)包含選自由SEQ ID NO：35、41及47組成之群之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及(f)包含選自由SEQ ID NO：36、42及48組成之群之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。
在一個實施例中，本發明之抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO：31中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：32中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；包含SEQ ID NO：33中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；包含SEQ ID NO：34中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：35中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及包含SEQ ID NO：36中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。包含此CDR1、CDR2及CDR3之組合的抗體稱為「Pr4350#12」。
在一個實施例中，本發明之抗體或其抗原結合部分包含：包含
SEQ ID NO：37中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：38中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；包含SEQ ID NO：39中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；包含SEQ ID NO：40中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：41中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及包含SEQ ID NO：42中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。包含此CDR1、CDR2及CDR3之組合的抗體稱為「Pr4350#37」。
在一個實施例中，本發明之抗體或其抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO：43中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：44中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；包含SEQ ID NO：45中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；包含SEQ ID NO：46中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：47中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及包含SEQ ID NO：48中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。包含此CDR1、CDR2及CDR3之組合的抗體稱為「Pr4350#40」。
本發明之抗體之恆定區/構架區可例如藉由胺基酸取代而變化，以改變抗體之特性(例如，增加或降低以下一或多者：抗原結合親和力；Fc受體結合；抗體碳水化合物，例如糖基化、海藻糖基化等；半胱胺酸殘基之數量；效應細胞功能；效應細胞功能；補體功能；或引入偶聯位點)。
在某些實施例中，本發明之抗體為完全人類抗體。完全人類mAb較佳用於人類治療用途，因為鼠類抗體當投與人類時引起稱為HAMA(人類抗小鼠抗體)反應之免疫原性反應(Azinovic I等人，Survival benefit associated with human anti-mouse antibody(HAMA)in patients with B-cell malignancies.Cancer Immunol Immunother 2006；55(12)：1451-8；Tjandra JJ等人，Development of human anti-murine
antibody(HAMA)response in patients.Immunol Cell Biol 1990；68(6)：367-76)，從而引起嚴重副作用，包括全身性過敏反應及超敏反應。此免疫原性反應係由人類免疫系統因與天然人類抗體略微不同之胺基酸序列而將鼠類抗體識別為外來物所觸發。可採用此項技術中已知之人類化方法(Riechmann L等人，Reshaping human antibodies for therapy.Nature 1988；332(6162)：332：323；Queen C等人，A humanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor.Proc Natl Acad Sci USA 1989；86(24)：10029-33)降低鼠類源性抗體之免疫原性(Gerd R等人，Serological Analysis of Human Anti-Human Antibody Responses in Colon Cancer Patients Treated with Repeated Doses of Humanized Monoclonal Antibody A33.Cancer Res 2001；61,6851-6859)。
噬菌體呈現庫之使用使得有可能選擇針對極其確定之抗原決定基之獨特且罕見抗體之大量抗體譜系(關於噬菌體呈現之更多詳情，參見McCafferty等人，Phage antibodies：filamentous phage displaying antibody variable domains.Nature,348：552-554)。對腫瘤抗原源性肽-MHC複合體分子具有極高專一性之人類Fab或scFv的快速鑑別因此變得可能。經顯示，藉由將對黑素瘤Ag MART-1 26-35/A2或gp100 280-288/A2具有專一性之類TCR Fab與截短形式之假單胞菌內毒素融合而產生的免疫毒素可在活體外及活體內抑制人類黑素瘤生長(Klechevsky E等人，Antitumor activity of immunotoxins with T-cell receptor-like specificity against human melanoma xenografts.Cancer Res 2008；68(15)：6360-6367)。此外，藉由使用Fab片段對全長單株抗體(mAb)進行工程改造，有可能直接產生治療性人類mAb，略過開發例如治療癌症之治療性mAb通常需要的耗時數月之研究。
同源抗體
在某些實施例中，本發明主題之抗體包含包括與本文所描述之
抗體或其抗原結合部分(例如，scFv)(例如，EXT009-01、EXT009-03、EXT009-04、EXT009-05、EXT009-07、EXT009-08、EXT009-09、EXT009-10、EXT009-12、EXT009-13、EXT009-14、EXT009-15、EXT009-17、EXT009-18、EXT009-19、EXT009-20、EXT009-21、EXT009-23、EXT009-25、EXT009-27、EXT009-29、EXT009-30、EXT009-31、EXT009-32、EXT009-33、EXT010-01、EXT010-03、EXT010-04、EXT010-06、EXT010-07、EXT010-08、EXT010-10、EXT010-12、EXT010-13、EXT010-15、EXT010-17、EXT010-23、EXT010-24、EXT010-25、EXT010-26、EXT010-27、EXT010-28、EXT010-29、EXT010-30、EXT010-31、EXT010-32、EXT010-33、EXT010-34、EXT010-37、EXT010-40、EXT010-42、EXT010-44、EXT010-47、EXT010-48、EXT010-49、EXT010-55、EXT010-56、EXT010-59或EXT010-60)之胺基酸序列同源之胺基酸序列的重鏈及輕鏈可變區，並且其中該等抗體或其抗原結合部分保持本發明主題之抗PRAME抗體或其抗原結合部分之所需功能特性。
舉例而言，本發明之抗體或其抗原結合部分包含：包含與EXT009-01、EXT009-03、EXT009-04、EXT009-05、EXT009-07、EXT009-08、EXT009-09、EXT009-10、EXT009-12、EXT009-13、EXT009-14、EXT009-15、EXT009-17、EXT009-18、EXT009-19、EXT009-20、EXT009-21、EXT009-23、EXT009-25、EXT009-27、EXT009-29、EXT009-30、EXT009-31、EXT009-32、EXT009-33、EXT010-01、EXT010-03、EXT010-04、EXT010-06、EXT010-07、EXT010-08、EXT010-10、EXT010-12、EXT010-13、EXT010-15、EXT010-17、EXT010-23、EXT010-24、EXT010-25、EXT010-26、EXT010-27、EXT010-28、EXT010-29、EXT010-30、EXT010-31、EXT010-32、EXT010-33、EXT010-34、EXT010-37、EXT010-40、
EXT010-42、EXT010-44、EXT010-47、EXT010-48、EXT010-49、EXT010-55、EXT010-56、EXT010-59或EXT010-60(如附錄B及C中所示)之VH
序列至少80%同源之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含與EXT009-01、EXT009-03、EXT009-04、EXT009-05、EXT009-07、EXT009-08、EXT009-09、EXT009-10、EXT009-12、EXT009-13、EXT009-14、EXT009-15、EXT009-17、EXT009-18、EXT009-19、EXT009-20、EXT009-21、EXT009-23、EXT009-25、EXT009-27、EXT009-29、EXT009-30、EXT009-31、EXT009-32、EXT009-33、EXT010-01、EXT010-03、EXT010-04、EXT010-06、EXT010-07、EXT010-08、EXT010-10、EXT010-12、EXT010-13、EXT010-15、EXT010-17、EXT010-23、EXT010-24、EXT010-25、EXT010-26、EXT010-27、EXT010-28、EXT010-29、EXT010-30、EXT010-31、EXT010-32、EXT010-33、EXT010-34、EXT010-37、EXT010-40、EXT010-42、EXT010-44、EXT010-47、EXT010-48、EXT010-49、EXT010-55、EXT010-56、EXT010-59或EXT010-60(如附錄B及C中所示)之VL
序列至少80%同源之胺基酸序列的輕鏈可變區，且該抗體或其抗原結合部分以約1×10-7
M或更低之KD
結合至PRAME肽與HLA-A*0201之組合。
舉例而言，本發明之抗體或其抗原結合部分包含：(a)包含與選自由SEQ ID NO：49、51、53、55、57、59及61組成之群的胺基酸序列至少80%同源之胺基酸序列的重鏈可變區；(b)包含與選自由SEQ ID NO：50、52、54、56、58、60及62組成之群的胺基酸序列至少80%同源之胺基酸序列的輕鏈可變區；且其中該抗體或其抗原結合部分以約1×10-7
M或更低之KD
結合至PRAME肽與HLA-A*0201之組合。
在某些實施例中，VH
及/或VL
胺基酸序列可與上述序列80%、
81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源。具有與上述序列之VH
區及VL
區高度(亦即，80%或更高)同源之VH
區及VL
區的抗體可藉由突變誘發(例如，定點突變誘發或PCR介導之突變誘發)，隨後使用本文所描述之結合分析測試所編碼之經改變抗體的保留功能(亦即，結合親和力)來獲得。
如本文所使用，兩個胺基酸序列之間的同源性百分比相當於兩個序列之間的一致性百分比。在考慮為達成兩個序列之最佳比對而需要引入之空位數目及每一空位之長度的情況下，兩個序列之間的一致性百分比隨該等序列共有之一致位置之數目而變化(亦即，同源性%=一致位置之數目/位置總數×100)。如以下非限制性實例中所述，兩個序列之間的序列比較及一致性百分比之測定可使用數學演算法完成。
兩個胺基酸序列之間之同源性百分比可使用併入ALIGN程式(2.0版)中之E.Meyers及W.Miller(Comput.Appl.Biosci.,4：11-17(1988))之演算法，使用PAM120權數殘基表、12之空位長度罰分及4之空位罰分測定。此外，兩個胺基酸序列之間的同源性百分比可使用已併入GCG套裝軟體(可在www.gcg.com獲得)中之GAP程式中的Needleman及Wunsch(J.Mol.Biol.48：444-453(1970))演算法，使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣，及空位權數16、14、12、10、8、6或4及長度權數1、2、3、4、5或6來測定。
或者或另外，本發明主題之蛋白質序列可另外用作「查詢序列」以針對公共資料庫進行檢索，從而例如鑑別相關序列。此等檢索可使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-10之XBLAST程式(2.0版)進行。BLAST蛋白質檢索可用XBLAST程式(評分=50，字長=3)進行，從而獲得與本發明之抗體分子同源的胺基酸序列。為使空位比對達成比較目的，可如Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.
25(17)：3389-3402中所述使用空位BLAST。當利用BLAST及空位BLAST程式時，可使用各別程式(例如XBLAST及NBLAST)之預設參數。(參見www.ncbi.nlm.nih.gov)。
抗體及修飾
在某些實施例中，本發明之抗體或其抗原結合部分包含包括CDR1、CDR2及CDR3序列之重鏈可變區及包括CDR1、CDR2及CDR3序列之輕鏈可變區，其中此等CDR序列中之一或多個包含基於本文所描述之抗體或其抗原結合部分(例如，scFv)(例如，如表2及3以及附錄D中所示的EXT009-01、EXT009-03、EXT009-04、EXT009-05、EXT009-07、EXT009-08、EXT009-09、EXT009-10、EXT009-12、EXT009-13、EXT009-14、EXT009-15、EXT009-17、EXT009-18、EXT009-19、EXT009-20、EXT009-21、EXT009-23、EXT009-25、EXT009-27、EXT009-29、EXT009-30、EXT009-31、EXT009-32、EXT009-33、EXT010-01、EXT010-03、EXT010-04、EXT010-06、EXT010-07、EXT010-08、EXT010-10、EXT010-12、EXT010-13、EXT010-15、EXT010-17、EXT010-23、EXT010-24、EXT010-25、EXT010-26、EXT010-27、EXT010-28、EXT010-29、EXT010-30、EXT010-31、EXT010-32、EXT010-33、EXT010-34、EXT010-37、EXT010-40、EXT010-42、EXT010-44、EXT010-47、EXT010-48、EXT010-49、EXT010-55、EXT010-56、EXT010-59或EXT010-60)的指定胺基酸序列或其修飾，並且其中該等抗體或其抗原結合部分保持本發明主題之抗PRAME抗體或其抗原結合部分之所需功能特性。
修飾不會顯著影響或改變含有胺基酸序列之抗體之結合特徵。此類修飾包括胺基酸取代、添加及缺失。可藉由此項技術中已知之標準技術，諸如定點突變誘發及PCR介導之突變誘發將修飾引入本發明之抗體或抗原結合部分中。
修飾可為保守修飾、非保守修飾、或保守修飾與非保守修飾之混合。保守胺基酸取代為胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基置換的取代。此項技術中已確定具有類似側鏈之胺基酸殘基家族。例示性保守胺基酸取代示於表4中。胺基酸取代可引入所關注的抗體中且針對所需活性，例如保留/改善之抗原結合、降低之免疫原性或改善之ADCC或CDC篩選產物。
胺基酸可根據共有側鏈之特性進行分組：˙疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；˙中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；˙酸性：Asp、Glu；˙鹼性：His、Lys、Arg；˙影響鏈定向之殘基：Gly、Pro；
˙芳族：Trp、Tyr、Phe。
因此，CDR區內之一或多個胺基酸殘基可用同一組中之其他胺基酸殘基置換且可使用本文所描述之功能分析測試改變之抗體之保留功能。
非保守性取代必然伴有此等類別之一之成員換成另一個類別。
在某些實施例中，指定序列或CDR區內不超過一個、不超過兩個、不超過三個、不超過四個、不超過五個殘基改變。
交叉競爭抗體
本發明主題提供與本發明主題之抗PRAME抗體或其抗原結合部分(例如，scFv)(例如，EXT009-01、EXT009-03、EXT009-04、EXT009-05、EXT009-07、EXT009-08、EXT009-09、EXT009-10、EXT009-12、EXT009-13、EXT009-14、EXT009-15、EXT009-17、EXT009-18、EXT009-19、EXT009-20、EXT009-21、EXT009-23、EXT009-25、EXT009-27、EXT009-29、EXT009-30、EXT009-31、EXT009-32、EXT009-33、EXT010-01、EXT010-03、EXT010-04、EXT010-06、EXT010-07、EXT010-08、EXT010-10、EXT010-12、EXT010-13、EXT010-15、EXT010-17、EXT010-23、EXT010-24、EXT010-25、EXT010-26、EXT010-27、EXT010-28、EXT010-29、EXT010-30、EXT010-31、EXT010-32、EXT010-33、EXT010-34、EXT010-37、EXT010-40、EXT010-42、EXT010-44、EXT010-47、EXT010-48、EXT010-49、EXT010-55、EXT010-56、EXT010-59及EXT010-60)中之任一者交叉競爭結合至PRAME肽/HLA複合體(例如，PRAME肽/I類HLA複合體、PRAME肽/HLA-A2複合體或PRAME肽/HLA-A*0201複合體)的抗體或其抗原結合部分。交叉競爭抗體或其抗原結合部分結合至與本文所描述之抗PRAME抗體其抗原結合部分中之任一者相同的抗原決定基區域，例如相同抗原決定基、鄰近抗原
決定基或重疊。
此類交叉競爭抗體可基於其在標準PRAME結合分析中與本發明之抗PRAME抗體或其抗原結合部分中之任一者交叉競爭的能力進行鑑別。舉例而言，可使用Biacore分析、ELISA分析或流動式細胞測量術展示與本發明主題之抗體或其抗原結合部分之交叉競爭。測試抗體抑制例如本發明之抗PRAME抗體或其抗原結合部分中之任一者與PRAME肽/MHC(例如，PRAME/HLA複合體，更特定言之，PRAME/I類HLA複合體，更特定言之，PRAME/HLA-A2複合體，且更特定言之，PRAME/HLA-A*0201複合體)之結合的能力證實，該測試抗體可與本發明之抗PRAME抗體或其抗原結合部分中之任一者競爭結合至此類PRAME肽/MHC複合體。
抗體與抗原之結合的表徵
可藉由例如標準ELISA測試本發明主題之抗體與PRAME肽/HLA複合體之結合。為測定純化抗體之同型，可使用對特定同型之抗體具有專一性之試劑進行同型ELISA。可藉由西方墨點法進一步測試抗PRAME人類IgG與PRAME肽/MHC複合體之反應性。
在某些實施例中，藉由放射性標記之抗原結合分析(RIA)量測KD
。在某些實施例中，RIA係用所關注抗體之Fab型式及其抗原進行。舉例而言，Fab對抗原之溶液結合親和力係藉由在滴定之一系列未標記抗原存在下使Fab與最低濃度之(125
I)標記抗原平衡，接著用抗Fab抗體塗佈之盤捕捉經結合抗原來量測(參見例如，Chen等人，J.Mol.Biol.
293：865-881(1999))。
在某些實施例中，KD
係使用BIACORE®
表面電漿子共振分析量測。舉例而言，使用BIACORE®
-2000或BIACORE®
-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)之分析。
免疫接合物
本發明主題提供與治療部分，諸如細胞毒素、藥物(例如，免疫抑制劑)或放射性毒素偶聯之抗PRAME抗體或其抗原結合部分。此類接合物在本文中稱為「免疫接合物」。包括一或多種細胞毒素之免疫接合物稱為「免疫毒素」。細胞毒素或細胞毒性劑包括對細胞有害(例如，殺死細胞)之任何藥劑。實例包括毒素(諸如蓖麻毒素、白喉毒素、白樹素)及藥物(諸如細胞遲緩素B、短桿菌素D(gramicidin D)、溴化乙錠、吐根素、絲裂黴素(mitomycin)、依託泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、秋水仙鹼(colchicin)、多柔比星(doxorubicin)、道諾黴素(daunorubicin)、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神黴素(mithramycin)、1-去氫睪固酮、糖皮質激素、普魯卡因(procaine)、四卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)及嘌呤黴素(puromycin)，及其類似物或同系物)。治療劑亦包括例如卡奇黴素(calecheamicin)、奧瑞他汀(aureastatin)、抗代謝物類(例如甲胺喋呤(methotrexate)、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶達卡巴嗪(5-fluorouracil decarbazine))、烷基化劑類(例如氮芥(mechlorethamine)、噻替派苯丁酸氮芥(thiotepa chlorambucil)、美法蘭(meiphalan)、卡莫司汀(carmustine，BSNU)及洛莫司汀(lomustine，CCNU)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、鏈佐黴素(streptozotocin)、絲裂黴素C(mitomycin C)，及順二氯二胺鉑(II)(DDP)順鉑)、蒽環黴素類(anthracyclines)(例如道諾黴素(先前為柔紅黴素(daunomycin))及多柔比星)、抗生素類(例如放線菌素D(先前為放線菌素)、博萊黴素(bleomycin)、光神黴素(mithramycin)及安麯黴素(anthramycin，AMC))，及抗有絲分裂劑類(例如長春新鹼(vincristine)及長春鹼(vinblastine))。
可與本文所揭示之抗PRAME抗體或其抗原結合部分偶聯的治療
性細胞毒素之其他實例包括倍癌黴素(duocarmycins)、卡奇黴素、美登素及奧瑞他汀，及其衍生物。卡奇黴素抗體接合物之實例為可商購的(MylotargTM
；Wyeth-Ayerst)。
細胞毒素可使用此項技術中可用之連接子技術與本文所揭示之抗PRAME抗體或其抗原結合部分偶聯。用於將細胞毒素偶聯至抗體之連接子類型之實例包括(但不限於)腙、硫醚、酯、二硫化物及含肽連接子。選擇之連接子可例如易於藉由溶酶體隔室內之低pH值裂解或易於藉由蛋白酶，諸如優先在腫瘤組織中表現之蛋白酶，諸如組織蛋白酶(例如，組織蛋白酶B、C、D)裂解。有關細胞毒素、連接子之類型及用於將治療劑偶聯至抗體之方法的進一步論述，亦參見Saito,G.等人(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55：199-215；Trail,P.A.等人(2003)Cancer Immunol.Immunother.52：328-337；Payne,G.(2003)Cancer Cell 3：207-212；Allen,T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer 2：750-763；Pastan,I.及Kreitman,R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3：1089-1091；Senter,P.D.及Springer,C.J.(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.53：247-264。
本發明主題之抗PRAME抗體亦可偶聯至放射性同位素以產生細胞毒性放射性藥劑，又稱放射性免疫接合物。可偶聯至抗體以用於診斷或治療應用之放射性同位素的實例包括(但不限於)90
Y、131
I、225
Ac、213
Bi、223
Ra、177
Lu及227
Th。用於製備放射性免疫接合物之方法係此項技術中確定的。放射性免疫接合物之實例為可商購的，包括ZevalinTM
(IDEC Pharmaceuticals)及BexxarTM
(Corixa Pharmaceuticals)，且可使用類似方法，使用本發明抗體製備放射性免疫接合物。
可使用本發明主題之抗體接合物改變給定生物反應，且藥物部分不應解釋為侷限於經典的化學治療劑。舉例而言，藥物部分可為具有所需生物活性之蛋白質或多肽。此類蛋白質可包括例如酶活性毒素
或其活性片段，諸如相思子素(abrin)、蓖麻毒素A、假單孢菌外毒素(pseudomonas exotoxin)或白喉毒素；蛋白質，諸如腫瘤壞死因子(TNF)或干擾素-γ；或生物反應調節劑，諸如淋巴因子、介白素-1(「IL-1」)介白素-2(「IL-2」)、介白素-6(「IL-6」)、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(「GM-CSF」)、顆粒球群落刺激因子(「G-CSF」)或其他生長因子。
用於將此類治療部分偶聯至抗體之技術係熟知的，參見例如，Arnon等人，「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」,Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等人(編)，第243-56頁(Alan R.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等人，「Antibodies For Drug Delivery」,Controlled Drug Delivery(第2版),Robinson等人(編)，第623-53頁(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe,「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review」,Monoclonal Antibodies '84：Biological And Clinical Applications,Pinchera等人(編)，第475-506頁(1985)；「Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」,Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin等人(編)，第303-16頁(Academic Press 1985)；及Thorpe等人，「The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates」,Immunol.Rev.,62：119-58(1982)。
雙專一性分子
本發明主題提供包含本文所揭示之抗PRAME抗體或其抗原結合部分之雙專一性分子。本發明主題之抗體或其抗原結合部分可經衍生化或連接至另一功能分子，例如另一肽或蛋白質(例如另一抗體或受體配位體)，以產生結合到至少兩個不同結合位點或標靶分子之雙專
一性分子。本發明主題之抗體實際上可經衍生化或連接至超過一個其他功能分子以產生結合至超過兩個不同結合位點及/或標靶分子之多專一性分子；此類多專一性分子亦意欲涵蓋在如本文所使用之術語「雙專一性分子」內。為了產生雙專一性分子，本發明之抗PRAME抗體或其抗原結合部分可以官能基連接(例如，藉由化學偶合、基因融合、非共價締合或其他方式)至一或多個其他結合分子，諸如另一抗體、抗體片段、肽或結合模擬物，由此產生雙專一性分子。
本發明主題提供雙專一性分子，其包含對第一標靶抗原決定基或抗原之至少一種第一結合專一性及對第二標靶抗原決定基或抗原之第二結合專一性。第二標靶抗原決定基或抗原可不同於第一抗原決定基或抗原。在某些實施例中，雙專一性分子為多專一性的，該分子可進一步包括第三結合專一性。在雙專一性抗體之第一部分結合至例如腫瘤細胞上之抗原，且雙專一性抗體之第二部分識別人類免疫效應細胞表面上之抗原時，該抗體能夠藉由專一性結合至人類免疫效應細胞上之效應子抗原募集該效應細胞之活性。因此，在某些實施例中，雙專一性抗體能夠在效應細胞，例如T細胞與腫瘤細胞之間形成連接，由此增強效應功能。
本發明主題之雙專一性分子可藉由使用此項技術中已知之方法偶聯各組成結合專一性來製備。舉例而言，雙專一性分子之每一結合專一性可分別產生，且隨後彼此偶聯。當結合專一性為蛋白質或肽時，可使用多種偶合劑或交聯劑進行共價偶聯。交聯劑之實例包括蛋白質A、碳化二亞胺、N-丁二醯亞胺基-S-乙醯基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、鄰伸苯基二順丁烯二醯亞胺(oPDM)、N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)及磺基丁二醯亞胺基4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(磺基-SMCC)(參見例如，Karpovsky等人(1984)J.Exp.Med.160：1686；
Liu,MA等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其他方法包括Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.第78號，118-132；Brennan等人(1985)Science 229：81-83)及Glennie等人(1987)J.Immunol.139：2367-2375中所描述之方法。較佳偶聯劑為SATA及磺基-SMCC，二者均購自Pierce Chemical Co.(Rockford,IL)。
當結合專一性為抗體時，其可經由兩條重鏈之C末端鉸鏈區之硫氫基鍵結來偶聯。在一個非限制性實施例中，在偶聯之前，鉸鏈區經修飾成含有奇數個，較佳一個硫氫基殘基。
或者，兩種結合專一性可在同一載體中編碼，且在同一宿主細胞中表現及組裝。此方法尤其適用於雙專一性分子為mAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab')2
或配位體×Fab融合蛋白之情況。
雙專一性分子與其專一性標靶之結合可藉由例如酶連免疫吸附劑分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、FACS分析、生物分析(例如生長抑制)或西方墨點分析來確定。此等分析各自一般藉由採用對所關注之複合體具有專一性之經標記試劑(例如，抗體)來偵測備受關注之蛋白質-抗體複合體的存在。或者，可使用多種其他免疫分析中之任一種偵測該等複合體。舉例而言，抗體可經放射性標記且用於放射免疫分析(RIA)中(參見例如，Weintraub,B.,Principles of Radioimmunoassays,Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques,The Endocrine Society,1986年3月，以引用之方式併入本文中)。放射性同位素可藉由諸如使用γ計數器或閃爍計數器之方式或藉由自動放射照像術偵測。
在某些實施例中，雙專一性抗體同時識別具有人類IgG1 Fc之免疫T細胞上之PRAME/MHC複合體及CD3，如所描述(Yan等人，J.Biol.Chem.
2010；285：19637-19646；Rossi等人，Proc Natl Aca Sci USA
2006；103：6841-6)。雙專一性抗體募集細胞毒性T細胞且使其靶
向PRAME/MHC陽性癌細胞，同時在活體內維持Fc效應功能及長半衰期。雙專一性抗體介導的對癌細胞之專一性殺滅作用涉及三個機制：i)藉由活化T細胞殺滅；ii)ADCC活性；iii)CDC活性。可構建其他形式之雙專一性抗體，諸如串聯scFv分子(taFv)、雙功能抗體(Db)或單鏈雙功能抗體(scDb)，及含人類血清白蛋白之融合蛋白(Ryutaro等人，J Biol Chem
2011；286：1812-1818；Anja等人，Blood
2000；95(6)：2098-2103；Weiner等人，J.Immunology
1994；152(5)：2385-2392；Dafne等人，J Biol Chem
2007；282：12650-12660)，但其缺乏具有不同藥物動力學曲線之Fc效應功能。
經工程改造及修飾之抗體
本發明主題之抗體另外可使用具有一或多個本文所揭示之VH
及/或VL
序列之抗體或其抗原結合部分作為起始物質，工程改造經修飾抗體來製備，該經修飾抗體相對於起始抗體可具有改變之特性。抗體可藉由修飾一個或兩個可變區(亦即，VH
及/或VL
)內，例如一或多個CDR區內及/或在一或多個構架區內的一或多個殘基來進行工程改造。或者或另外，抗體可藉由修飾恆定區內之殘基來進行工程改造，例如以改變抗體之效應功能。
可進行之可變區工程改造的一種類型為CDR移植。抗體主要經由位於六個重鏈及輕鏈CDR中之胺基酸殘基與標靶抗原相互作用。出於此原因，與CDR外部之序列相比，CDR內之胺基酸序列在個別抗體間更多樣化。因為CDR序列負責大部分抗體-抗原相互作用，所以可藉由構建包括移植至來自具有不同特性之不同抗體之構架序列上的來自特定天然存在之抗體之CDR序列的表現載體表現模擬特定天然存在之抗體之特性的重組抗體(參見例如，Riechmann,L.等人(1998)Nature332
：323-327；Jones,P.等人(1986)Nature321
：522-525；Queen,C.等人(1989)Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.86
：10029-10033；頒予Winter之美
國專利第5,225,539號；及頒予Queen等人之美國專利第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,762號及第6,180,370號)。
構架序列可自公共DNA資料庫或包括生殖系抗體基因序列之公開文獻獲得。舉例而言，人類重鏈及輕鏈可變區基因之生殖系DNA序列可見於「VBase」人類生殖系序列資料庫(可見於互聯網www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)，以及Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242；Tomlinson,I.M.,等人(1992)「The Repertoire of Human Germline VH
Sequences Reveals about Fifty Groups of VH
Segments with Different Hypervariable Loops」J.Mol.Biol.227
：776-798；及Cox,J.P.L.等人(1994)「A Directory of Human Germ-line VH
Segments Reveals a Strong Bias in their Usage」Eur.J.Immunol.24
：827-836中，其各自之內容以引用之方式清楚地併入本文中。作為另一實例，人類重鏈及輕鏈可變區基因之生殖系DNA序列可見於GenBank資料庫。
VH
CDR1、CDR2及CDR3序列以及VL
CDR1、CDR2及CDR3序列可移植至具有與得到構架序列之生殖系免疫球蛋白基因中所發現相同之序列的構架區上，或CDR序列可移植至相較於生殖系序列含有一或多個突變之構架區上。舉例而言，已發現，在某些情況下，使構架區內之殘基突變以維持或增加抗體之抗原結合能力係有益的(參見例如，頒予Queen等人之美國專利第5,530,101號；第5,585,089號；第5,693,762號及第6,180,370號)。
另一類可變區修飾係使VH
及/或VL
CDR1、CDR2及/或CDR3區域內之胺基酸殘基突變，由此改善所關注抗體之一或多種結合特性(例如，親和力)。可進行定點突變誘發或PCR介導之突變誘發以引入突變且可在活體外或活體內分析中評價對抗體結合或其他所關注之功能
特性的影響。較佳引入保守修飾(如上文所論述)。突變可為胺基酸取代、添加或缺失。舉例而言，使CDR區域內不超過一個、兩個、三個、四個或五個殘基改變。
因此，本發明主題提供分離之抗PRAME單株抗體或其抗原結合部分，其包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含：(a)本文所揭示之抗體及其抗原結合部分(例如，scFv)(例如，EXT009-01、EXT009-03、EXT009-04、EXT009-05、EXT009-07、EXT009-08、EXT009-09、EXT009-10、EXT009-12、EXT009-13、EXT009-14、EXT009-15、EXT009-17、EXT009-18、EXT009-19、EXT009-20、EXT009-21、EXT009-23、EXT009-25、EXT009-27、EXT009-29、EXT009-30、EXT009-31、EXT009-32、EXT009-33、EXT010-01、EXT010-03、EXT010-04、EXT010-06、EXT010-07、EXT010-08、EXT010-10、EXT010-12、EXT010-13、EXT010-15、EXT010-17、EXT010-23、EXT010-24、EXT010-25、EXT010-26、EXT010-27、EXT010-28、EXT010-29、EXT010-30、EXT010-31、EXT010-32、EXT010-33、EXT010-34、EXT010-37、EXT010-40、EXT010-42、EXT010-44、EXT010-47、EXT010-48、EXT010-49、EXT010-55、EXT010-56、EXT010-59或EXT010-60)之VH
CDR1序列，或相較於本文所揭示之抗體或其抗原結合部分中之任一者之VH
CDR1序列具有至少一個(例如，不超過一個、不超過兩個、不超過三個、不超過四個或不超過五個)胺基酸修飾(例如，取代、缺失及/或添加)的胺基酸序列；(b)本文所揭示之抗體或其抗原結合部分中之任一者之VH
CDR2序列，或相較於本文所揭示之抗體或其抗原結合部分中之任一者之VH
CDR2具有至少一個(例如，不超過一個、不超過兩個、不超過三個、不超過四個或不超過五個)胺基酸修飾(例如，取代、缺失及/或添加)的胺基酸序列；(c)本文所揭示之抗體或其抗原結合部分中之任一者之VH
CDR3序
列，或相較於本文所揭示之抗體或其抗原結合部分中之任一者之CDR3具有至少一個(例如，不超過一個、不超過兩個、不超過三個、不超過四個或不超過五個)胺基酸修飾(例如，取代、缺失及/或添加)的胺基酸序列；(d)本文所揭示之抗體或其抗原結合部分中之任一者之VL
CDR1序列，或相較於本文所揭示之抗體或其抗原結合部分中之任一者之VL
CDR1具有至少一個(例如，不超過一個、不超過兩個、不超過三個、不超過四個或不超過五個)胺基酸修飾(例如，取代、缺失及/或添加)的胺基酸序列；(e)本文所揭示之抗體或其抗原結合部分中之任一者之VL
CDR2序列，或相較於本文所揭示之抗體或其抗原結合部分中之任一者之VL
CDR2具有至少一個(例如，不超過一個、不超過兩個、不超過三個、不超過四個或不超過五個)胺基酸修飾(例如，取代缺失及/或添加)之胺基酸序列；及(f)本文所揭示之抗體或其抗原結合部分中之任一者之VL
CDR3序列，或相較於本文所揭示之抗體或其抗原結合部分中之任一者之VL
CDR3具有至少一個(例如，不超過一個、不超過兩個、不超過三個、不超過四個或不超過五個)胺基酸修飾(例如，取代、缺失及/或添加)之胺基酸序列。
舉例而言，本發明主題提供分離之抗PRAME單株抗體或其抗原結合部分，其包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含：(a)包含SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：43中所闡述之胺基酸序列，或相較於SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：43具有至少一個(例如，不超過一個、不超過兩個、不超過三個、不超過四個或不超過五個)胺基酸修飾(例如，取代、缺失及/或添加)之胺基酸序列的VH
CDR1區；(b)包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：38或SEQ ID
NO：44中所闡述之胺基酸序列，或相較於SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：44具有至少一個(例如，不超過一個、不超過兩個、不超過三個、不超過四個或不超過五個)胺基酸修飾(例如，取代、缺失及/或添加)之胺基酸序列的VH
CDR2區；(c)包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：15、SEQ ID NQ：21、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：45中所闡述之胺基酸序列，或相較於SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：45具有至少一個(例如，不超過一個、不超過兩個、不超過三個、不超過四個或不超過五個)胺基酸修飾(例如，取代、缺失及/或添加)之胺基酸序列的VH
CDR3區；(d)包含SEQ ID NQ：10、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：46中所闡述之胺基酸序列，或相較於SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：46具有至少一個(例如，不超過一個、不超過兩個、不超過三個、不超過四個或不超過五個)胺基酸修飾(例如，取代、缺失及/或添加)之胺基酸序列的VL
CDR1區；(e)包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：47中所闡述之胺基酸序列，或相較於SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：47具有至少一個(例如，不超過一個、不超過兩個、不超過三個、不超過四個或不超過五個)胺基酸修飾(例如，取代、缺失及/或添加)之胺基酸序列的VL
CDR2區；及(f)包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：48中所闡述之胺基
酸序列，或相較於SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：48具有至少一個(例如，不超過一個、不超過兩個、不超過三個、不超過四個或不超過五個)胺基酸修飾(例如，取代、缺失及/或添加)之胺基酸序列的VL
CDR3區。
本發明主題之經工程改造抗體包括對VH
及/或VK
內之構架殘基進行修飾例如以改善抗體之特性的抗體。通常進行此類構架修飾以降低抗體之免疫原性。舉例而言，一種方法係使一或多個構架殘基「回復突變」成相應生殖系序列。更特定言之，已經歷體細胞突變之抗體可含有不同於獲得該抗體之生殖系序列的構架殘基。此類殘基可藉由比較抗體構架序列與獲得抗體之生殖系序列來鑑別。
構架修飾之另一類型涉及使構架區內或甚至一或多個CDR區內之一或多個殘基突變，以移除T細胞抗原決定基，藉此降低抗體之潛在免疫原性。此方法亦稱為「去免疫」，且進一步詳細描述於Carr等人之美國專利公開案第20030153043號中。
除在構架區或CDR區內進行修飾外或作為替代，本發明主題之抗PRAME抗體或其抗原結合部分可以經工程改造以在Fc區內包括修飾，通常由此改變抗體之一或多種功能特性，諸如血清半衰期、補體結合、Fc受體結合及/或抗原依賴性細胞之細胞毒性。另外，本發明之抗PRAME抗體可經化學修飾(例如，可將一或多個化學部分附接至抗體上)，或經修飾以改變其糖基化，再改變該抗體之一個多種功能特性。CH1之鉸鏈區可經修飾，以使得鉸鏈區中半胱胺酸殘基之數量改變，例如增加或減少。此方法進一步描述於Bodmer等人之美國專利第5,677,425號中。CH1鉸鏈區中半胱胺酸殘基之數量經改變以例如促進輕鏈與重鏈之組裝或者增加或降低抗體之穩定性。抗體之Fc鉸鏈區可經突變以降低抗體之生物半衰期。更特定言之，將一或多個胺基
酸突變引入Fc-鉸鏈片段之CH2-CH3結構域界面區中以使得抗體與葡萄球菌蛋白A(Staphylococcyl protein A；SpA)之結合相對於天然Fc-鉸鏈結構域SpA結合減弱。此方法進一步詳細描述於Ward等人之美國專利第6,165,745號中。該抗體可經修飾以增加其生物半衰期，例如該抗體可在CH1或CL區內改變以含有自IgG Fc區之CH2結構域之兩個環獲得的救助受體結合抗原決定基，如Presta等人之美國專利第5,869,046號及第6,121,022號中所描述。另外，Fc區可藉由用不同胺基酸殘基置換至少一個胺基酸殘基來改變，以改變抗體之效應功能。Fc區可經修飾以增加抗體介導抗體依賴性細胞之細胞毒性(ADCC)的能力及/或增加抗體對Fcγ受體之親和力，例如，如Presta之WO 00/42072中所描述。在某些實施例中，本發明之抗PRAME抗體包含去海藻糖基化之Fc區。自免疫球蛋白G(IgG)之Fc部分的N
-聚糖移除海藻糖殘基可經由對Fcγ受體IIIa(FcγRIIIa)之親和力之改善使ADCC大幅增加。
或者或另外，抗體之糖基化可經改變。舉例而言，可製得去糖基化抗體(亦即，缺乏糖基化之抗體)。可改變糖基化以例如增加抗體對抗原之親和力，參見例如美國專利第5,714,350號及第6,350,861號。此類碳水化合物修飾可藉由例如改變抗體序列內之一或多個糖基化位點來完成。舉例而言，可進行一或多個胺基酸取代，以消除一或多個可變區構架糖基化位點，藉此消除該位點之糖基化。
或者或另外，可製備糖基化類型改變之抗體，諸如海藻糖基殘基量減少之低海藻糖基化抗體或二分GlcNac結構增加之抗體。已證明此類改變之糖基化模式可增加抗體之ADCC能力。此類碳水化合物修飾可藉由例如在糖基化機制改變之宿主細胞中表現抗體來實現。
抗體之另一修飾可為聚乙二醇化。抗體可經聚乙二醇化以例如增加抗體之生物(例如，血清)半衰期。為將抗體聚乙二醇化，通常使
抗體或其片段與聚乙二醇(PEG)，諸如PEG之反應性酯或醛衍生物在使得一或多個PEG基團附接至抗體或抗體片段之條件下反應。聚乙二醇化可經由與反應性PEG分子(或類似反應性水溶聚合物)之醯化反應或烷基化反應來進行。如本文所使用，術語「聚乙二醇」意欲涵蓋用於使其他蛋白質衍生化之任何PEG形式，諸如單(C1
-C10
)烷氧基或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-順丁烯二醯亞胺。欲聚乙二醇化之抗體可為去糖基化抗體。用於使蛋白質聚乙二醇化之方法為此項技術中已知的且可應用於本文所揭示之抗體，參見例如EP 0 154 316及EP 0 401 384。
1. 與MHC分子具有高預測性結合之肽的鑑別
本發明主題提供一種用於產生專一性結合至MHC限制性肽之抗體的方法，當作為肽/MHC複合體之一部分呈遞時，該等肽能夠引起專一性細胞毒性T細胞反應。I類HLA分子將長度為約8-12個胺基酸之內源性衍生肽呈遞至CD8+
細胞毒性T淋巴細胞。欲用於本發明方法中之肽的長度一般為約6-22個胺基酸，且在一些實施例中，介於約9與20個胺基酸之間(更特定言之，介於8-11個胺基酸之間，較佳為9或10個胺基酸)且包含來源於所關注之蛋白質，例如人類PRAME蛋白質(Genbank寄存編號NP_001278644版：NP_001278644.1，提供於下)或其類似物之胺基酸序列。
[SEQ ID NO：1]
適用於根據本發明之方法產生抗體的肽可使用熟習此項技術者已知之電腦預測模型，基於MHC分子(例如，HLA分子，更特定言之，I類HLA分子，更特定言之，HLA-A，更特定言之，HLA-A2，且更特定言之，HLA-A*0201)結合基元以及蛋白酶體及免疫蛋白酶體裂解位點之存在來確定。為了預測I類MHC結合位點，此類模型包括(但不限於)ProPred1(更詳細地描述於Singh及Raghava,Bioinformatics
17(12)：1236-1237 2001)及SYFPEITHI(參見Schuler等人，Immunoinformatics Methods in Molecular Biology
，第409(1)卷：75-93 2007)、Net MHC(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)。
所有白種人中有39-46%的人表現HLA-A*0201且因此表示用於本發明方法中之MHC抗原之適合選擇。為了製備PRAME肽抗原之一個實施例，使用SYFPEITHI資料庫之預測演算法鑑別推定的PRAME之胺基酸序列及其抗原決定基與HLA-A*0201分子之預測結合(參見Schuler(2007))。
一旦鑑別出適當肽，即可根據一般熟習此項技術者熟知之方案完成肽合成。本發明主題之肽由於尺寸相對較小，故其可以根據習知肽合成技術在溶液中或在固體支撐物上直接合成。各種自動合成器為可商購的且可根據已知方案使用。溶液相中肽之合成為用於大規模製造合成肽之公認程序，且因此為用於製備本發明之肽之適合替代方法。(參見例如，Stewart等人，Tetrahedron Letters
第39卷，第1517-1520頁，1998。)
本文所描述之方案中使用的肽各自係購買的且由Elim Biopharm,Inc.(Hayward,CA.)使用茀基甲氧基羰基化學方法及固相合成法進行合成，並藉由高壓液相層析法純化。藉由高效液相層析分析評估肽之品質且使用基質輔助雷射脫附質譜法觀察預期分子量。肽為無菌的且純度超過90%。將肽溶解於DMSO中且在-80℃儲存。
在選擇肽之後，使用抗原處理缺陷型T2細胞株測試所選肽之結合活性，當在抗原呈遞槽中藉由肽穩定時，該細胞株增加HLA-A之表現。簡言之，用肽對T2細胞脈衝一段足以誘導HLA-A表現之時間。接著藉由用對HLA-A具有專一性之螢光標記之單株抗體(例如BB7.2)進行免疫染色及流動式細胞測量術來量測T2細胞之HLA-A表現。螢光指數(FI)係以使用式FI=(MFI[含肽之T2細胞]/MFI[不含肽之T2細胞]-1，藉由螢光活化細胞分選分析測定的T2細胞上HLA-A0201之平均螢光強度(MFI)來計算。
使用本文所揭示之方法產生針對PRAME的完全人類類T細胞受體(TCR)抗體。與誘導HLA限制性細胞毒性CD8 T細胞之抗體類似，由噬菌體呈現技術產生的類TCR抗PRAME抗體對PRAME肽/HLA複合體具有專一性。
使用SYFPEITHI演算法篩選PRAME蛋白質序列且鑑別出以預測的高親和力結合至在白種人群中高度表現之多個HLA分子的PRAME肽(例如，PRA100-108
、PRA142-151
、PRA300-309
、PRA425-433
及PRA435-443
)。PRA100-108
跨越PRAME胺基酸100-108，PRA142-151
橫跨PRAME胺基酸142-151，PRA300-309
橫跨PRAME胺基酸300-309，PRA425-433
橫跨PRAME胺基酸425-433，且PRA435-443
橫跨PRAME胺基酸435-443。
一旦鑑別出適合肽，即藉由將該肽及組織相容性抗原一起放入溶液中以形成複合體來製備欲用於噬菌體呈現庫篩選之標靶抗原，亦即，肽/MHC複合體(例如，PRAME/HLA複合體，例如PRAME肽/HLA-A*0201)。
2. 選擇針對PRAME肽具有高親和力之scFv
下一步驟係自不結合或以較低親和力結合之人類噬菌體呈現庫中之噬菌體選擇以高親和力結合至所關注之標靶抗原的噬菌體。此係藉由使噬菌體反覆結合至與固體支撐物(例如珠粒)或哺乳動物細胞結
合之抗原，隨後移除未結合之噬菌體且藉由溶離專一性結合之噬菌體實現。在某些實施例中，首先使抗原生物素化以固定至例如抗生蛋白鏈菌素偶聯之Dynabeads M-280上。將噬菌體庫與細胞、珠粒或其他固體支撐物一起培育且藉由洗滌移除未結合之噬菌體。選擇且測試結合之純系。
一旦選擇，即藉由間接流動式細胞測量術測試陽性scFv純系與存活T2細胞表面上HLA-A2/肽複合體之結合。簡言之，將噬菌體純系與已經用PRAME肽或不相關肽(對照物)脈衝之T2細胞一起培育。洗滌細胞且接著用小鼠抗M13外殼蛋白mAb標記。再次洗滌細胞且用FITC-山羊(Fab)2抗小鼠Ig標記，隨後進行流動式細胞測量術。
在其他實施例中，抗PRAME抗體可包含經設計以改善蛋白質穩定性、抗體結合、表現量或引入用於偶聯治療劑之位點的一或多個構架區胺基酸取代。接著根據熟習此項技術者已知之方法，使用此等scFv製造重組人類單株Ig。
亦包括用於降低白血病細胞之增殖之方法，其包含使白血病細胞與本發明之PRAME抗體接觸。在一相關態樣中，本發明之抗體可以用於預防或治療白血病。治療性抗體之投與係此項技術中已知的。
嵌合抗原受體(CAR)為經工程改造之受體，其將所關注之專一性移植至或賦予免疫效應細胞。可使用CAR將單株抗體之專一性移植至T細胞上；其中反轉錄病毒載體促進其編碼序列之轉移。
存在三代CAR。「第一代」CAR通常由細胞外抗原結合結構域(例如，scFv)融合至與T細胞受體鏈之細胞質/細胞內結構域融合之跨膜結構域構成。「第一代」CAR通常具有來自CD3ξ鏈之細胞內結構域，其為內源性TCR中之信號的主要發射器。「第一代」CAR可提供從頭抗原識別且經由其在單一融合分子中之CD3ζ鏈信號傳導結構域引起
CD4+
及CD8+
T細胞之活化，與HLA介導之抗原呈遞無關。「第二代」CAR將來自各種共刺激分子(例如，CD28、4-1BB、ICOS、OX40)之細胞內結構域添加至CAR之細胞質尾中以向T細胞提供另外的信號。「第二代」CAR包含同時提供共刺激作用(例如，CD28或4-1BB)及活化作用(CD3ζ)之CAR。臨床前研究指出，「第二代」CAR可改善T細胞之抗腫瘤活性。舉例而言，「第二代」CAR修飾之T細胞之穩定功效在靶向慢性淋巴母細胞白血病(CLL)及急性淋巴母細胞白血病(ALL)患者體內之CD19分子的臨床試驗中得到證實。「第三代」CAR包含提供多種共刺激作用(例如，CD28及4-1BB)及活化作用(CD3ζ)之CAR。
根據本發明之主題，CAR包含細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域及細胞內結構域，其中細胞外抗原結合結構域結合至與MHC分子(例如，HLA分子，更特定言之，I類HLA分子)結合之PRAME肽。在某些實施例中，細胞外抗原結合結構域為scFv。在某些實施例中，scFv為人類scFv。scFv之非限制性實例包括EXT009-01、EXT009-03、EXT009-04、EXT009-05、EXT009-07、EXT009-08、EXT009-09、EXT009-10、EXT009-12、EXT009-13、EXT009-14、EXT009-15、EXT009-17、EXT009-18、EXT009-19、EXT009-20、EXT009-21、EXT009-23、EXT009-25、EXT009-27、EXT009-29、EXT009-30、EXT009-31、EXT009-32、EXT009-33、EXT010-01、EXT010-03、EXT010-04、EXT010-06、EXT010-07、EXT010-08、EXT010-10、EXT010-12、EXT010-13、EXT010-15、EXT010-17、EXT010-23、EXT010-24、EXT010-25、EXT010-26、EXT010-27、EXT010-28、EXT010-29、EXT010-30、EXT010-31、EXT010-32、EXT010-33、EXT010-34、EXT010-37、EXT010-40、EXT010-42、EXT010-44、EXT010-47、EXT010-48、EXT010-49、EXT010-55、EXT010-56、EXT010-59及EXT010-60。
在某些實施例中，細胞外抗原結合結構域為視情況交聯之Fab。在某些實施例中，細胞外結合結構域為F(ab)2
。在某些實施例中，所包含的前述分子中之任一者可為與異源序列形成細胞外抗原結合結構域之融合蛋白形式。
在某些非限制性實施例中，本發明之CAR之細胞外抗原結合結構域可包含連接細胞外抗原結合結構域之重鏈可變區及輕鏈可變區的連接子。如本文所使用，術語「連接子」係指共價附接兩種或兩種以上多肽或核酸以使其彼此連接的官能基(例如，化學試劑或多肽)。如本文所使用，「肽連接子」係指用於將兩種蛋白質偶合在一起(例如，用於偶合VH
及VL
結構域)的一或多個胺基酸。在一個非限制性實例中，連接子包含具有以下提供之SEQ ID NO：70中闡述之序列的胺基酸。
在一個實施例中，編碼胺基酸序列SEQ ID NO：70之核苷酸序列闡述於以下提供之SEQ ID NO：71中。
GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：70)
GGTGGTGGTGGTAGCGGCGGCGGCGGCTCTGGTGGTGGTGGATCC(SEQ ID NO：71)
在某些實施例中，細胞外抗原結合結構域為scFv，其包含：包含選自由SEQ ID NO：49、51、53、55、57、59及61組成之群之胺基酸序列的VH
，及包含選自由SEQ ID NO：50、52、54、56、58、60及62組成之群之胺基酸序列的VL
，及視情況存在的包含SEQ ID NO：70中所闡述之胺基酸序列的連接子。在某些實施例中，細胞外抗原結合結構域為scFv，其包含選自由SEQ ID NO：63、64、65、66、67、68及69組成之群之胺基酸序列。在一個非限制性實施例中，細胞外抗原結合結構域為包含SEQ ID NO：63中所闡述之胺基酸序列之scFv，其包含：包含SEQ ID NO：49中所闡述之胺基酸序列的VH
、包含SEQ ID NO：50中所闡述之胺基酸序列的VL
及包含SEQ ID NO：70中所闡述之胺基酸
序列的連接子。
此外，細胞外抗原結合結構域可包含將新生蛋白質引導至內質網中的前導序列或信號肽。若欲將CAR糖基化且錨定於細胞膜中，則信號肽或前導序列可為必不可少的。信號序列或前導序列可為存在於新合成蛋白質之N末端處用於引導其進入分泌路徑之肽序列(約5個、約10個、約15個、約20個、約25個或約30個胺基酸長)。在非限制性實例中，信號肽共價接合至細胞外抗原結合結構域之5'末端。
在某些非限制性實施例中，CAR之跨膜結構域包含跨越至少一部分膜的疏水性α螺旋。不同跨膜結構域引起不同受體穩定性。在抗原識別之後，受體群集且信號傳輸至細胞。根據本發明之主題，CAR之跨膜結構域可包含CD8多肽、CD28多肽、CD3ζ多肽、CD4多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、ICOS多肽、CTLA-4多肽、PD-1多肽、LAG-3多肽、2B4多肽、BTLA多肽、合成肽(並非基於與免疫反應有關之蛋白質)或其組合。
在某些實施例中，本發明之CAR之跨膜結構域包含CD28多肽。
在某些非限制性實施例中，CAR之細胞內結構域可包含CD3ζ多肽，其可活化或刺激細胞(例如，淋巴譜系細胞，例如T細胞)。CD3ζ包含3個ITAM，且在結合抗原之後將活化信號傳輸至細胞(例如，淋巴譜系細胞，例如T細胞)。CD3ζ多肽可具有與NCBI參考號：NP_932170(SEQ ID NO：72)之序列至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%同源之胺基酸序列或其片段，及/或可視情況包含至多一個或至多兩個或至多三個保守胺基酸取代。在非限制性實施例中，CD3ζ多肽具有的胺基酸序列可為SEQ ID NO：25之連續部分，其長度為至少20個，或至少30個，或至少40個，或至少50個及至多164個胺基酸。或者或另外，在各種非限制性實施例中，CD3ζ多肽具有含SEQ ID NO：72之胺基酸1至164、1至50、
50至100、100至150或150至164的胺基酸序列。在某些實施例中，CD3ζ多肽具有含SEQ ID NO：72之胺基酸52至121的胺基酸序列。
SEQ ID NO：72提供於下： [SEQ ID NO：72]
在某些實施例中，CD3ζ多肽具有以下提供之SEQ ID NO：73中所闡述之胺基酸序列。
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR[SEQ ID NO：73]
在某些非限制性實施例中，CAR之細胞內結構域進一步包含包括至少一個共刺激分子之至少一個共刺激信號傳導區，其可提供最佳淋巴細胞活化。如本文所使用，「共刺激分子」係指淋巴細胞對抗原之高效反應所需的除抗原受體或其配位體以外之細胞表面分子。至少一個共刺激信號傳導區可包括CD28多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、ICOS多肽、PD-1多肽、CTLA-4多肽、LAG-3多肽、2B4多肽、BTLA多肽、合成肽(並非基於與免疫反應有關之蛋白質)或其組合。共刺激分子可結合至共刺激配位體，其為在細胞表面上表現的一種蛋白質，在結合至其受體時產生共刺激反應，亦即，當抗原結合至其CAR分子時所提供的實現刺激作用的細胞內反應。在某些實施例中，CAR之細胞內結構域包含包括CD28多肽之共刺激信號傳導區。在一個非限制性實施例中，CAR包含CD28跨膜結構域及CD28共刺激信號傳導結構域，其中跨膜結構域及共刺激信號傳導區中所包含之CD28多肽具有以下提供之SEQ ID NO：74中所闡述之胺基酸序列。
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO：74)
此外，本發明主題提供表現本發明之CAR之免疫反應性細胞。免疫反應性細胞可用本發明之CAR轉導以使得該等細胞表現CAR。本發明之主題亦提供使用此類細胞治療腫瘤或PRAME相關病理性病狀之
方法。本發明主題之免疫反應性細胞可為淋巴譜系細胞。淋巴譜系，包含B細胞、T細胞及自然殺傷(NK)細胞，用於產生抗體、調控細胞免疫系統、偵測血液中之外來物、偵測對於宿主而言為外來物的細胞及類似情形。淋巴譜系免疫反應性細胞之非限制性實例包括T細胞、自然殺傷(NK)細胞、胚胎幹細胞及多能幹細胞(例如，可分化出淋巴細胞之細胞)。T細胞可為在胸腺中成熟且主要引起細胞介導之免疫的淋巴細胞。T細胞包含在適應性免疫系統中。本發明主題之T細胞可為任何類型之T細胞，包括(但不限於)T輔助細胞、細胞毒性T細胞、記憶T細胞(包括中央型記憶T細胞、類幹細胞記憶T細胞(stem-cell-like memory T cell/stem-like memory T cell)，及兩種類型之效應子記憶T細胞：例如TEM
細胞及TEMRA
細胞)、調控性T細胞(亦稱為抑制性T細胞)、自然殺傷T細胞、黏膜相關恆定T細胞及γδ T細胞。細胞毒性T細胞(CTL或殺傷T細胞)為能夠誘導受感染之體細胞或腫瘤細胞死亡的一小組T淋巴細胞。在某些實施例中，表現CAR之T細胞表現Foxp3以實現並維持T調控表型。
自然殺傷(NK)細胞可為作為細胞介導之免疫之一部分且在先天性免疫反應期間起作用的淋巴細胞。NK細胞不需要事先活化來執行其對標靶細胞之細胞毒性作用。
免疫反應性細胞(例如，T細胞、NK細胞)之基因修飾可藉由用重組DNA或RNA構建體轉導實質上均質之細胞組合物來實現。載體可為反轉錄病毒載體(例如，γ反轉錄病毒)，其用於將DNA或RNA構建體引入宿主細胞基因組中。舉例而言，可將編碼本發明之CAR之多核苷酸選殖至反轉錄病毒載體中且可由其內源性啟動子、由反轉錄病毒之長末端重複序列或由替代性內部啟動子驅動表現。
亦可使用非病毒載體或RNA。可使用隨機染色體整合或靶向整合(例如，使用核酸酶、類轉錄活化因子效應物核酸酶(TALEN)、鋅
指核酸酶(ZFN)及/或成簇規律間隔短回文重複序列(CRISPR)或轉殖基因表現(例如，使用天然或化學修飾之RNA)。
對於初始基因修飾細胞以提供表現本發明之CAR之細胞，一般採用反轉錄病毒載體進行轉導，不過亦可使用任何其他適合的病毒載體或非病毒遞送系統。對於後續基因修飾細胞以提供包括含至少兩種共刺激配位體之抗原呈遞複合體的細胞，反轉錄病毒基因轉移(轉導)同樣證明有效。反轉錄病毒載體與適當包裝細胞株的組合亦為適合的，其中衣殼蛋白將用於使人類細胞感染。已知各種雙嗜性產病毒細胞株，包括(但不限於)PA12(Miller等人(1985)Mol.Cell.Biol.
5：431-437)；PA317(Miller等人(1986)Mol.Cell.Biol.
6：2895-2902)；及CRIP(Danos等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 85：6460-6464)。非雙嗜性粒子亦為適合的，例如用VSVG、RD114、或GALV包膜假型化之粒子及此項技術中已知之任何其他粒子。
可能的轉導方法亦包括例如藉由Bregni等人(1992)Blood
80：1418-1422之方法直接共培養細胞與生產細胞；或例如藉由Xu等人(1994)Exp.Hemat.
22：223-230；及Hughes等人(1992)J Clin.Invest.
89：1817之方法，在存在或不存在適當生長因子及聚陽離子情況下，與單獨病毒上清液或濃載體儲備液一起培養。
亦可採用非病毒方法在細胞中表現蛋白質。舉例而言，可藉由在脂質體轉染劑存在下投與核酸(Feigner等人，Proc.Nat！.Acad.Sci.U.S.A.84：7413,1987；Ono等人，Neuroscience Letters 17：259,1990；Brigham等人，Am.J.Med.Sci.298：278,1989；Staubinger等人，Methods in Enzymology 101：512,1983)、脫唾液酸血清類黏蛋白-聚離胺酸偶聯(Wu等人，Journal of Biological Chemistry 263：14621,1988；Wu等人，Journal of Biological Chemistry 264：16985,1989)或藉由在手術條件下進行顯微注射(Wolff等人，Science 247：1465,1990)，將核酸
分子引入細胞中。其他非病毒基因轉移方式包括在活體外使用磷酸鈣、DEAE葡聚糖、電穿孔及原生質體融合進行轉染。脂質體亦可潛在地有益於細胞中DNA之遞送。亦可藉由將正常核酸離體轉移至可培養細胞類型(例如，自體或異源原代細胞或其後代)中，隨後將細胞(或其後代)注射至標靶組織中或全身注射，由此將正常基因移植至個體之受感染組織中。亦可使用轉座酶或靶向性核酸酶(例如，鋅指核酸酶、大範圍核酸酶或TALE核酸酶)得到或獲得重組受體。可藉由RNA電穿孔獲得短暫表現。
用於多核苷酸治療方法中之cDNA表現可由任何適合啟動子(例如，人類巨細胞病毒(CMV)、猴病毒40 SV40)或金屬硫蛋白啟動子)引導，且藉由任何適當哺乳動物調控元件或內含子(例如，延伸因子1α強化子/啟動子/內含子結構)調控。舉例而言，必要時，可使用已知優先在特定細胞類型中引導基因表現之強化子引導核酸之表現。所用強化子可包括(但不限於)表徵為組織專一性或細胞專一性強化子的該等強化子。或者，若使用基因組純系作為治療構建體，則可藉由同源調控序列，或必要時，藉由來源於異源來源之調控序列，包括以上描述的啟動子或調控元件中之任一者，來介導調控。
所得細胞可在類似於未修飾細胞之條件下生長，藉此可使經修飾之細胞擴增並用於多種目的。
可投與足以預防、抑制或減慢腫瘤或病理性病狀進展之量的本發明主題之抗體及抗原結合蛋白(例如，CAR)用於治療性治療患有腫瘤或PRAME相關病理性病狀之患者。進展包括例如腫瘤或病理性病狀之生長、侵襲、轉移及/或復發。有效用於此用途之量將取決於疾病之嚴重程度及患者自身免疫系統之一般狀態。給藥時程亦將隨疾病狀態及患者之狀況而變化且其範圍通常將為單次快速注射劑量或連續
輸注至每天多次投藥(例如，每4至6小時)，或如治療醫師及患者之狀況所指示。
可藉由本發明主題之抗體及抗原結合蛋白(例如，CAR)治療的醫學病狀之鑑別正好在熟習此項技術者之能力及知識範圍內。舉例而言，患有臨床上顯著之白血病或有發展臨床上顯著之症狀風險的人類個體適於投與本發明之抗體或抗原結合蛋白。熟習此項技術之臨床醫師可例如藉由使用臨床測試、體檢及醫療史/家族史容易地確定個體是否為此類治療之候選者。
以PRAME表現為特徵之病理性病狀之非限制性實例包括慢性骨髓細胞性白血病(CML)、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、急性骨髓/骨髓性白血病(AML)、骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤(亦稱為非霍奇金氏淋巴瘤、NHL或淋巴瘤)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、套細胞淋巴瘤及多發性骨髓瘤(MM)。另外，實體腫瘤，大體而言且特定言之，黑素瘤、卵巢癌、頭頸癌、乳癌腎癌、肺癌、胃腸癌症、腦腫瘤及神經母細胞瘤，能夠使用本發明之抗體及抗原結合蛋白(例如，CAR)治療。
在某些非限制性實施例中，本發明主題提供一種藉由投與本發明之PRAME抗體或抗原結合蛋白(例如，CAR)與一或多種其他藥劑之組合來治療醫學病狀之方法。舉例而言，本發明主題之一實施例提供一種藉由投與本發明之抗體或抗原結合蛋白與抗腫瘤劑或抗血管生成劑來治療醫學病狀的方法。抗體或抗原結合蛋白可以化學方式或以生物合成方式連接至一或多種抗腫瘤或抗血管生成劑。
可使用任何適合方法或途徑投與本發明之抗體或抗原結合蛋白(例如，CAR)且視情況共投與抗腫瘤劑及/或其他受體拮抗劑。投與途徑包括例如經口、靜脈內、腹膜內、皮下或肌肉內投與。然而，應強調的是，本發明之主題不限於任何特定投與方法或途徑。
應注意，本發明之抗體或抗原結合蛋白(例如，CAR)可以接合物形式投與，該接合物專一性結合至受體並在配位體-毒素內化之後遞送有毒、致死性有效負載。
在某些實施例中，本發明之抗體或抗原結合蛋白(例如，CAR)係與一或多種選自由以下組成之群的化合物一起投與：能夠殺滅標靶細胞之化合物、能夠增強效應細胞之殺滅作用之化合物及能夠上調癌細胞自身上之抗原標靶之化合物。
能夠殺滅標靶細胞之化合物的非限制性實例包括如本文所揭示之化學治療劑及細胞毒素。能夠增強效應細胞之殺滅作用之化合物的非限制性實例包括抗體(例如，檢查點阻斷抗體及抗CD47抗體)、干擾素(例如，干擾素-γ)、細胞因子(例如，IL-2)及生長因子(例如，GM-CSF)。能夠上調癌細胞自身上之抗原標靶之化合物的非限制性實例包括酪胺酸激酶抑制劑(例如，MEK抑制劑)、干擾素(例如，干擾素-γ)、組蛋白脫乙醯基酶抑制劑(HDAC抑制劑，例如伏立諾他(vorinostat)、羅米地辛(romidepsin)、西達本胺(chidamide)、帕比司他(panobinostat)及貝林諾他(belinostat)及甲基化調節劑(例如，氮胞苷及地西他濱(decitabine))。
應瞭解，本發明主題之抗體或抗原結合蛋白(例如，CAR)將以另外包含醫藥學上可接受之載劑之組合物形式投與。適合醫藥學上可接受之載劑包括例如以下一或多種：水、生理食鹽水、磷酸鹽緩衝生理食鹽水、右旋糖、甘油、乙醇及類似物，以及其組合。醫藥學上可接受之載劑可進一步包含極少量之輔助物質，諸如濕潤劑或乳化劑、防腐劑或緩衝劑，其可增加結合蛋白之存放期或有效性。如此項技術中所熟知，注射用組合物可經調配以在投與哺乳動物之後提供活性成分之快速釋放、持續釋放或延遲釋放。
本發明主題之其他態樣包括(但不限於)抗體及編碼其之核酸的用
途，其係用於治療PRAME相關疾病、用於診斷及預後應用以及用作偵測細胞及組織中之PRAME的研究工具。包含所揭示之抗體及核酸的醫藥組合物涵蓋於本發明之主題內。藉由載體免疫療法進行基於抗體之治療的包含本發明主題之核酸之載體亦涵蓋在本發明之主題內。載體包括能夠表現及分泌抗體之表現載體，以及引導諸如嵌合抗原受體之抗原結合蛋白之細胞表面表現的載體。
包含核酸之細胞，例如用本發明主題之載體轉染之細胞亦涵蓋於本發明內。
對於診斷及研究應用，亦提供含有本發明之抗PRAME抗體或本發明主題之核酸、分析試劑、緩衝劑及類似物之套組。
本發明主題提供用於治療或預防PRAME陽性疾病之套組。在一個實施例中，該套組包括呈單位劑型形式之治療性組合物，其含有效量之抗體或抗原結合蛋白(例如，CAR)。在一些實施例中，該套組包含無菌容器，其含有治療性或預防性疫苗；此類容器可為盒、安瓿、瓶子、小瓶、管、袋、小袋、泡殼包裝或此項技術中已知之其他合適容器形式。此類容器可由塑膠、玻璃、層壓紙、金屬箔或適合於保存藥劑之其他材料製成。
必要時，本發明之抗體或抗原結合蛋白(例如，CAR)係與有關向患有PRAME陽性疾病或有發展PRAME陽性疾病之風險的個體投與細胞的說明一起提供。該等說明一般將包括關於使用該組合物治療或預防PRAME陽性疾病的資訊。在其他實施例中，該等說明包括以下至少一者：治療劑之說明；有關治療或預防PRAME陽性疾病或其症狀之劑量時程及投藥；注意事項；警告；適應症；禁忌症；過量劑量資訊；不良反應；動物藥理學；臨床研究；及/或參考文獻。該等說明可直接印刷在容器(當存在時)上，或作為標籤施加至容器上，或作為
單獨的紙片、小冊子、卡片或資料夾供應於容器中或與容器一起供應。
1. 流動式細胞測量術分析.
對於細胞表面染色，將細胞與適當mAb一起在冰上培育30分鐘，洗滌，且必要時與二級抗體試劑一起培育。流動式細胞測量術資料係收集在FACS Calibur(Becton Dickinson)或LSRFortessa(BD Biosciences)上且用FlowJo V8.7.1及9.4.8軟體分析。
2. 對PRAME肽/HLA-A0201複合體具有專一性之scFv之選擇及表徵.
使用人類scFv抗體噬菌體呈現庫選擇mAb純系。為了減少由固定至塑料表面上引入之MHC1複合體之構形變化，使用溶液淘選方法代替習知板淘選。簡言之，首先將生物素化抗原與人類scFv噬菌體庫混合，接著藉由抗生蛋白鏈菌素偶聯之Dynabeads M-280經磁性機架下拉抗原-scFv抗體複合體。接著溶離結合之純系並用於感染大腸桿菌XL1-Blue。純化在細菌中表現之scFv噬菌體純系(Yasmina等人，Protein Science
2008；17(8)：1326-1335；Roberts等人，Blood
2002：99(10)：3748-3755)。進行3至4輪淘選以富集專一性結合至HLA-A0201/PRAME複合體之scFv噬菌體純系。藉由標準ELISA方法，確定針對生物素化單鏈HLA-A0201/PRAME肽複合體之陽性純系。使用TAP缺陷型HLA-A0201+細胞株T2，藉由流動式細胞測量術進一步測試陽性純系與存活細胞上HLA-A2/肽複合體之結合。在無血清RPMI1640培養基中，在20μg/mL β2 M存在下用肽(50μg/mL)脈衝T2細胞隔夜。洗滌細胞並在後續步驟中進行染色。
首先用純化之scFv噬菌體純系對細胞染色，隨後用小鼠抗M13 mAb染色，且最後用山羊F(ab)2抗小鼠Ig與FITC之接合物染色。每一染色步驟在冰上進行30至60分鐘且在每一染色步驟之間洗滌細胞兩
次。
3. 使用所選ScFv片段對全長mAb進行工程改造.
如所描述(Caron等人，J Exp Med
176：1191-1195.1992)，在HEK293及中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株中產生所選噬菌體純系之全長人類IgG1。簡言之，將抗體可變區次選殖至具有相配之人類λ或κ輕鏈恆定區及人類IgG1恆定區序列的哺乳動物表現載體中。在還原及非還原條件下，藉由電泳量測純化之全長IgG抗體的分子量。
4. 對嵌合抗原受體及免疫效應細胞進行工程改造.
可使用編碼本文中鑑別之抗體及抗原結合蛋白之核酸對重組免疫效應細胞進行工程改造。用以產生遺傳修飾之T細胞的方法及載體例如為此項技術中已知的(參見Brentjens等人，Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD
19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias in Blood
118(18)：4817-4828,2011年11月)。
5. 針對PRAME/A2複合體之全長人類IgG1之表徵.
首先，藉由對利用或不利用PRAME肽(例如，PRA100-108
、PRA142-151
、PRA300-309
、RRA425-433
及PRA435-443
)或RHAMM-R3對照肽脈衝之T2細胞染色，隨後用二級山羊F(ab)2抗人類IgG mAb與PE或FITC之接合物染色，來確定完全人類IgG1 mAb對PRAME肽/A2複合體之專一性。藉由流動式細胞量測術量測螢光強度。使用相同方法確定mAb與新鮮腫瘤細胞及細胞株之結合。
6. 放射免疫分析.
使用氯胺-T方法(38)，用125-I(PerkinElmer)標記PRAME抗體(例如，Pr300-#20)。使100μg抗體與1mCi 125-I及20μg氯胺-T反應，用200μg偏亞硫酸氫鈉淬滅，接著使用以含2%牛血清白蛋白之PBS平衡的10DG管柱(公司)與游離125-I分離。產物之比活性在7至8mCi/mg範
圍內。
如所描述，獲得來自正常供者及AML患者之造血細胞株、黏附細胞株(用非酶細胞剝離劑(名稱)收集)、PBMC。在0℃下，用PBS洗滌細胞一次且將其以107
個細胞/毫升再懸浮於含2%人類血清之PBS中。將細胞(106
個/管，一式兩份)與125-I標記之PRAME抗體(例如，Pr300-#20)(1μg/mL)一起在冰上培育45分鐘，接著在0℃下，用含1%牛血清白蛋白之PBS充分洗滌。為測定專一性結合，在50倍過量之未標記PRAME抗體(例如，Pr300-#20)存在下在冰上預培育20分鐘之後，分析一組一式兩份的細胞。藉由γ計數器量測結合放射能，測定專一性結合且由比活性計算每個細胞結合之抗體之數量。
7. 抗體依賴性細胞之細胞毒性(ADCC).
用於ADCC之標靶細胞為利用或不利用PRAME肽脈衝之T2細胞及不用肽脈衝之腫瘤細胞株。將各種濃度之PRAME抗體(例如，Pr300-#20)或其同型對照人類IgG1與標靶細胞及新鮮PBMC一起以不同的效應子：標靶(E：T)比率培育16小時。收集上清液且使用來自Promega之Cytotox 96非放射性套組，遵循其說明，藉由LDH釋放分析量測細胞毒性。亦藉由標準4小時51Cr釋放分析量測細胞毒性。
8. 螢光素酶/GFP陽性細胞之轉導及選擇.
對BV173細胞進行工程改造以使用含有編碼luc/GFP之質體的慢病毒載體高水準表現GFP-螢光素酶融合蛋白(39)。使用單細胞選殖，藉由流動式細胞測量術分析選出僅顯示高水準GFP表現之細胞且維持該等細胞並用於動物研究。
9. 抗PRAME抗體在人類白血病異種移植物NSG模型中進行的治療試驗.
將BV173人類白血病細胞及SET2人類AM細胞靜脈內注射至NSG小鼠中。第5天，藉由在欲治療之所有小鼠中進行螢火蟲螢光素酶成
像來確定腫瘤移植；接著將小鼠隨機分入不同治療組。自第6天開始，每週兩次用50μg抗PRAME(例如，Pr300-#20)或對照物(無抗體)治療小鼠兩週。在亦接受具有或不具有mAb之人類效應細胞的動物中，在注射mAb之前4小時，將細胞(CD34及CD3耗盡之健康供者人類PBMC)靜脈內注射至小鼠(107
個細胞/小鼠)中。一週一次至兩次藉由發光成像評估腫瘤生長且每天評估臨床活動性。
10. 對PRAME肽/HLA-A0201複合體具有專一性之scFv之選擇及表徵.
使用9聚體PRAME源性肽(例如，PRA100-108
、PRA425-433
或PRA435-443
)、10聚體PRAME源性肽(PRA142-151
或PRA300-309
)選擇PRAME專一性scFV。經顯示，此等肽經處理且藉由HLA-A0201呈遞以誘導能夠殺滅PRAME陽性腫瘤細胞之細胞毒性CD8+
T細胞。
使用熟習此項技術者已知的沿用已久之噬菌體呈現庫及篩選方法選擇對PRAME肽/HLA-A2複合體具有高專一性之scFv片段。在一個實施例中，使用人類scFv抗體噬菌體呈現庫(7×1010
個純系)選擇mAb純系。為了減少由固定至塑料表面上引入之MHC1複合體之構形變化，使用溶液淘選方法代替習知板淘選。簡言之，首先將生物素化抗原與人類scFv噬菌體庫混合，接著藉由抗生蛋白鏈菌素偶聯之Dynabeads M-280經磁性機架下拉抗原-scFv噬菌體抗體複合體。
接著溶離結合之純系並用於感染大腸桿菌XL1-Blue。純化在細菌中表現之scFv噬菌體純系(Yasmina等人，Protein Science
2008；17(8)：1326-1335；Roberts等人，Blood
2002：99(10)：3748-3755)。進行3至4輪淘選以富集專一性結合至HLA-A0201/PRAME複合體之scFv噬菌體純系。藉由標準ELISA方法，確定針對生物素化單鏈HLA-A0201/PRAME肽複合體之陽性純系。使用TAP缺陷型HLA-A0201+
細胞株T2，藉由流動式細胞測量術進一步測試陽性純系與存活細胞上HLA-A2/肽複合體之結合。在無血清RPMI1640培養基中，在20
μg/mL β2 M存在下用肽(50μg/mL)脈衝T2細胞隔夜。洗滌細胞並如下進行染色。
首先用純化之scFv噬菌體純系對細胞染色，隨後用小鼠抗M13 mAb染色，且最後用山羊F(ab)2
抗小鼠Ig與FITC之接合物染色。每一染色步驟在冰上進行30至60分鐘。在每一染色步驟之間洗滌細胞兩次。經顯示，抗PRAME抗體之噬菌體純系可結合至僅用PRA300-309
脈衝之T2細胞，而不結合至單獨T2細胞、用對照EW肽脈衝之T2細胞或異質肽PRAME。
藉由指定濃度之抗PRAME抗體(例如，Pr300-#20)之滴定來測試PRAME抗體之全長IgG1與肽/HLA-A*0201複合體之結合親和力。用50μg/mL或10μg/mL，隨後二級山羊F(ab)抗人類IgG/PE脈衝T2細胞。
藉由間接流動式細胞測量術針對以下測試陽性scFv純系與存活細胞表面上HLA-A2/肽複合體之結合：(i)用PRAME肽或不相關肽脈衝之TAP缺陷型HLA-A*0201+
T2細胞；(ii)未用肽脈衝之PRAME+HLA-A*0201+
細胞株，諸如BV173、SET-2-及對照PRAME-
HLA-A*0201+
細胞株SUDHL-1，或PRAME+
HLA-A*0201-
細胞株HL-60。後者確定scFv對腫瘤細胞上經天然處理之PRAME/A2複合體之識別及結合親和力。
針對產生對PRAME肽/A2複合體具有專一性之mAb的能力篩選總計59個噬菌體純系。藉由噬菌體scFv與經PRAME肽及另一HLA-A2結合肽(50μg/mL)脈衝之T2細胞的結合量測存活細胞上PRAME肽/A2複合體之識別。
11. 使用所選ScFv片段對全長mAb進行工程改造.
噬菌體呈現技術允許快速選擇及產生抗原專一性acFv及Fab片段，就其自身而言，其為有用的，或其可進一步開發以提供完整抗
體、抗原結合蛋白或其抗原結合部分。相較於scFv及Fab抗體，具有Fc結構域之完整mAb具有多種優勢。第一，僅全長Ab發揮免疫功能，諸如經由Fc結構域介導之CDC及ADCC。第二，二價mAb提供的抗原結合親和力比單體Fab Ab強。第三，Fab與二價mAb之血漿半衰期及腎清除率將不同。其各自之特定特徵及優勢可與計劃之效應子策略相配。第四，二價mAb可以不同於scFv及Fab之速率內化，從而改變免疫功能或載體功能。舉例而言，α發射體不需要內化以殺滅標靶，但許多藥物及毒素將得益於免疫複合體之內化。因此，在一個實施例中，一旦自噬菌體呈現庫獲得對PRAME/HLA-A2具有專一性之scFv純系，即使用scFv片段產生全長IgG mAb。
為了在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中產生重組人類單株IgG，基於熟習此項技術者已知之方法對全長IgG mAb進行工程改造(Tomomatsu等人，Production of human monoclonal antibodies against FceRla by a method combining in vitro immunization with phage display.Biosci Biotechnol Biochem 73(7)：1465-1469 2009)。簡言之，將抗體可變區次選殖至具有相配λ或κ輕鏈恆定序列及IgG1子類Fc之哺乳動物表現載體中。動力學結合分析(Yasmina等人，Protein Science
2008；17(8)：1326-1335)確定全長IgG與PRAME/HLA-A2之專一性結合，且KD
在奈莫耳濃度範圍內。
例示性實施例
1.一種分離之抗體或其抗原結合部分，其結合至與主要組織相容複合體(MHC)分子結合之PRAME肽。
2.如實施例1之抗體或其抗原結合部分，其中該MHC分子為HLA分子。
3.如實施例2之抗體或其抗原結合部分，其中該HLA分子為I類HLA分子。
4.如實施例3之抗體或其抗原結合部分，其中該I類HLA分子為HLA-A。
5.如實施例4之抗體或其抗原結合部分，其中該HLA-A為HLA-A2。
6.如實施例5之抗體或其抗原結合部分，其中該HLA-A2為HLA-A*0201。
7.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合部分，其中該PRAME肽係選自由以下組成之群：PRA100-108
(SEQ ID NO：2)、PRA142-151
(SEQ ID NO：3)、PRA300-309
(SEQ ID NO：4)、PRA425-433
(SEQ ID NO：5)及PRA435-443
(SEQ ID NO：6)。
8.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合部分，其中該PRAME肽為PRA300-309
(SEQ ID NO：4)。
9.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含選自由以下組成之群的重鏈可變區CDR3序列及輕鏈可變區CDR3序列：(a)包含SEQ ID NO：9中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR3序列，及包含SEQ ID NO：12中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR3序列；(b)包含SEQ ID NO：15中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR3序列，及包含SEQ ID NO：18中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR3序列；(c)包含SEQ ID NO：21中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR3序列，及包含SEQ ID NO：24中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR3序列；及(d)包含SEQ ID NO：27中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR3序列，及包含SEQ ID NO：30中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR3序列。
10.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含選自由以下組成之群的重鏈可變區CDR2序列及輕鏈可變區CDR2序列：(a)包含SEQ ID NO：8中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR2序列，及包含SEQ ID NO：11中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR2序列；(b)包含SEQ ID NO：14中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR2序列，及包含SEQ ID NO：17中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR2序列；(c)包含SEQ ID NO：20中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR2序列，及包含SEQ ID NO：23中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR2序列；及(d)包含SEQ ID NO：26中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR2序列，及包含SEQ ID NO：29中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR2序列。
11.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含選自由以下組成之群的重鏈可變區CDR1序列及輕鏈可變區CDR1序列：(a)包含SEQ ID NO：7中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR1序列，及包含SEQ ID NO：10中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR1序列；(b)包含SEQ ID NO：13中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR1序列，及包含SEQ ID NO：16中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR1序列；(c)包含SEQ ID NO：19中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR1序列，及包含SEQ ID NO：22中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR1序列；及(d)包含SEQ ID NO：25中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可
變區CDR1序列，及包含SEQ ID NO：28中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR1序列。
12.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含：(a)包含SEQ ID NO：7中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：8中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；包含SEQ ID NO：9中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；包含SEQ ID NO：10中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：11中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及包含SEQ ID NO：12中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3；(b)包含SEQ ID NO：13中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：14中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；包含SEQ ID NO：15中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；包含SEQ ID NO：16中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：17中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及包含SEQ ID NO：18中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3；(c)包含SEQ ID NO：19中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：20中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；包含SEQ ID NO：21中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；包含SEQ ID NO：22中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：23中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及包含SEQ ID NO：24中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3；或(d)包含SEQ ID NO：25中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：26中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區
CDR2；包含SEQ ID NO：27中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；包含SEQ ID NO：28中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：29中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及包含SEQ ID NO：30中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。
13.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含：包含SEQ ID NO：7中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：8中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；包含SEQ ID NO：9中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；包含SEQ ID NO：10中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：11中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及包含SEQ ID NO：12中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。
14.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含包括與選自由SEQ ID NO：49、51、53及55組成之群的序列至少80%同源之胺基酸序列的重鏈可變區。
15.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含包括SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53或SEQ ID NO：55中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區。
16.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含包括與選自由SEQ ID NO：50、52、54及56組成之群的序列至少80%同源之胺基酸序列的輕鏈可變區。
17.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含包括SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54或SEQ ID NO：56中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
18.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含：(a)包含SEQ ID NO：49中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及
包含SEQ ID NO：50中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區；(b)包含SEQ ID NO：51中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：52中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區；(c)包含SEQ ID NO：53中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：54中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區；或(d)包含SEQ ID NO：55中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：56中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
19.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含：包含SEQ ID NO：49中所闡述之胺基酸序列之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：50中所闡述之胺基酸序列之輕鏈可變區。
20.如實施例1至7及9至19中任一項之抗體或其抗原結合部分，其中該PRAME肽為PRA435-443
(SEQ ID NO：6)。
21.如實施例1至7及20中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含選自由以下組成之群的重鏈可變區CDR3序列及輕鏈可變區CDR3序列：(a)包含SEQ ID NO：33中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR3序列，及包含SEQ ID NO：36中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR3序列；(b)包含SEQ ID NO：39中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR3序列，及包含SEQ ID NO：42中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR3序列；及(c)包含SEQ ID NO：45中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR3序列，及包含SEQ ID NO：48中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR3序列。
22.如實施例1至7、20及21中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含選自由以下組成之群的重鏈可變區CDR2序列及輕鏈可變區
CDR2序列：(a)包含SEQ ID NO：32中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR2序列，及包含SEQ ID NO：35中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR2序列；(b)包含SEQ ID NO：38中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR2序列，及包含SEQ ID NO：41中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR2序列；及(c)包含SEQ ID NO：44中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR2序列，及包含SEQ ID NO：47中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR2序列。
23.如實施例1至7及20至22中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含選自由以下組成之群的重鏈可變區CDR1序列及輕鏈可變區CDR1序列：(a)包含SEQ ID NO：31中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR1序列，及包含SEQ ID NO：34中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR1序列；(b)包含SEQ ID NO：37中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR1序列，及包含SEQ ID NO：40中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR1序列；及(c)包含SEQ ID NO：43中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR1序列，及包含SEQ ID NO：46中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR1序列。
24.如實施例1至7及20至23中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含：(a)包含SEQ ID NO：31中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：32中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區
CDR2；包含SEQ ID NO：33中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；包含SEQ ID NO：34中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：35中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及包含SEQ ID NO：36中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3；(b)包含SEQ ID NO：37中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：38中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；包含SEQ ID NO：39中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；包含SEQ ID NO：40中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：41中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及包含SEQ ID NO：42中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3；或(c)包含SEQ ID NO：43中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：44中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；包含SEQ ID NO：45中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；包含SEQ ID NO：46中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：47中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及包含SEQ ID NO：48中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。
25.如實施例1至7及20至24中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含：包含SEQ ID NO：31中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：32中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；包含SEQ ID NO：33中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；包含SEQ ID NO：34中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：35中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及包含SEQ ID NO：36中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區
CDR3。
26.如實施例1至7及20至25中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含包括與選自由SEQ ID NO：57、59及61組成之群的序列至少80%同源之胺基酸序列的重鏈可變區。
27.如實施例1至7及20至26中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含包括SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：61中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區。
28.如實施例1至7及20至27中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含包括與選自由SEQ ID NO：58、60及62組成之群的序列至少80%同源之胺基酸序列的輕鏈可變區。
29.如實施例1至7及20至28中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含包括SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：62中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
30.如實施例1至7及20至29中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含：(a)包含SEQ ID NO：57中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：58中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區；(b)包含SEQ ID NO：59中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：60中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區；或(c)包含SEQ ID NO：61中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：62所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
31.如實施例1至7及20至30中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含：包含SEQ ID NO：57中所闡述之胺基酸序列之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：58中所闡述之胺基酸序列之輕鏈可變區。
32.如實施例9至11及21至23中任一項之抗體或其抗原結合部分，其中該修飾係選自缺失、插入、取代及其組合。
33.如實施例9至11、21至23及32中任一項之抗體或其抗原結合部分，其中該其修飾由不超過2個、不超過3個、不超過4個或不超過5個修飾組成。
34.如實施例1至33中任一項之抗體或其抗原結合部分，其結合至與該MHC分子結合之該PRAME肽的N末端。
35.如實施例1至33中任一項之抗體或其抗原結合部分，其結合至與該MHC分子結合之該PRAME肽的C末端。
36.如實施例1至35中任一項之抗體或其抗原結合部分，其以約1×10-7
M或更低結合親和力(KD
)結合至與該MHC分子結合之該PRAME肽。
37.如實施例1至36之抗體或其抗原結合部分，其以約2.4nM之結合親和力(KD
)結合至與該MHC分子結合之該PRAME肽。
38.一種分離之抗體或其抗原結合部分，其與參考抗體或抗原結合部分交叉競爭結合至與MHC分子結合之PRAME肽，該參考抗體或抗原結合部分包含：(a)包含SEQ ID NO：49中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：50中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區；(b)包含SEQ ID NO：51中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：52中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區；(c)包含SEQ ID NO：53中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：54所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區；(d)包含SEQ ID NO：55中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：56中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區；(e)包含SEQ ID NO：57中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：58中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區；(f)包含SEQ ID NO：59中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及
包含SEQ ID NO：60中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區；或(g)包含SEQ ID NO：61中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：62中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
39.如實施例38之抗體或其抗原結合部分，其中該參考抗體或其抗原結合部分包括包含SEQ ID NO：49中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：50中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
40.如實施例38或39之抗體或其抗原結合部分，其中該MHC分子為HLA分子。
41.如實施例40之抗體或其抗原結合部分，其中該HLA分子為I類HLA分子。
42.如實施例41之抗體或其抗原結合部分，其中該I類HLA分子為HLA-A。
43.如實施例42之抗體或其抗原結合部分，其中該HLA-A為HLA-A2。
44.如實施例43之抗體或其抗原結合部分，其中該HLA-A2為HLA-A*0201。
45.如實施例38至44中任一項之抗體或其抗原結合部分，其中該PRAME肽係選自由以下組成之群：PRA100-108
(SEQ ID NO：2)、PRA142-151
(SEQ ID NO：3)、PRA300-309
(SEQ ID NO：4)、PRA425-433
(SEQ ID NO：5)及PRA435-443
(SEQ ID NO：6)。
46.如實施例38至45中任一項之抗體或其抗原結合部分，其中該PRAME肽為PRA300-309
(SEQ ID NO：4)。
47.如實施例38至45中任一項之抗體或其抗原結合部分，其中該PRAME肽為PRA435-443
(SEQ ID NO：6)。
48.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合部分，其中該抗
體包含人類可變區構架區。
49.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合部分，其為完全人類抗體或其抗原結合部分。
50.如實施例1至48中任一項之抗體或其抗原結合部分，其為嵌合抗體或其抗原結合部分。
51.如實施例1至48中任一項之抗體或其抗原結合部分，其為人類化抗體或其抗原結合部分。
52.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體之抗原結合部分為Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或單鏈Fv(scFv)。
53.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合部分，其屬於IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。
54.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合部分，其屬於IgG1同型。
55.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含一或多個轉譯後修飾。
56.如實施例55之抗體或其抗原結合部分，其中該一或多個轉譯後修飾包含去海藻糖基化。
57.如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含去海藻糖基化之Fc區。
58.一種組合物，其包含如前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合部分及醫藥學上可接受之載劑。
59.一種免疫接合物，其包含連接至治療劑的如實施例1至57中任一項之抗體或其抗原結合部分。
60.如實施例59之免疫接合物，其中該治療劑為藥物、細胞毒素或放射性同位素。
61.一種組合物，其包含如實施例59或60之免疫接合物及醫藥學
上可接受之載劑。
62.一種雙專一性分子，其包含連接至第二功能性部分的如實施例1至57中任一項之抗體或其抗原結合部分。
63.如實施例62之雙專一性分子，其中該第二功能性部分具有與該抗體或其抗原結合部分不同之結合專一性。
64.如實施例62或63之雙專一性分子，其識別CD3及結合至該MHC分子之PRAME肽。
65.一種組合物，其包含如實施例62至64中任一項之雙專一性分子及醫藥學上可接受之載劑。
66.一種分離之核酸，其編碼如實施例1至57中任一項之抗體或其抗原結合部分。
67.一種表現載體，其包含如實施例66之核酸分子。
68.一種宿主細胞，其包含如實施例67之表現載體。
69.一種用於偵測全細胞或組織中之PRAME的方法，其包含：(a)使細胞或組織與結合至與MHC分子結合之PRAME肽的抗體或其抗原結合部分接觸，其中該抗體或其抗原結合部分包含可偵測標記；及(b)藉由量測與該細胞或組織相連之可偵測標記的量來測定結合至該細胞或組織之該經標記抗體或其抗原結合部分的量，其中該經結合抗體或其抗原結合部分的量指示該細胞或組織中PRAME的量。
70.如實施例69之方法，其中該MHC分子為HLA分子。
71.如實施例70之方法，其中該HLA分子為I類HLA分子。
72.如實施例71之方法，其中該I類HLA分子為HLA-A。
73.如實施例72之方法，其中該HLA-A為HLA-A2。
74.如實施例73之方法，其中該HLA-A2為HLA-A*0201。
75.如實施例69至75中任一項之方法，其中該PRAME肽係選自
由以下組成之群：PRA100-108
(SEQ ID NO：2)、PRA142-151
(SEQ ID NO：3)、PRA300-309
(SEQ ID NO：4)、PRA425-433
(SEQ ID NO：5)及PRA435-443
(SEQ ID NO：6)。
76.如實施例69至75中任一項之方法，其中該PRAME肽為PRA300-309
(SEQ ID NO：4)。
77.如實施例69至75中任一項之方法，其中該PRAME肽為PRA435-443
(SEQ ID NO：6)。
78.如實施例69至77中任一項之方法，其中該抗體或其抗原結合部分為如實施例1至57中任一項之抗體或其抗原結合部分。
79.一種對結合至MHC分子之PRAME肽具有專一性之嵌合抗原受體(CAR)。
80.如實施例79之CAR，其中該MHC分子為HLA分子。
81.如實施例80之CAR，其中該HLA分子為I類HLA分子。
82.如實施例81之CAR，其中該I類HLA分子為HLA-A。
83.如實施例82之CAR，其中該HLA-A為HLA-A2。
84.如實施例83之CAR，其中該HLA-A2為HLA-A*0201。
85.如實施例79至84中任一項之CAR，其中該PRAME肽係選自由以下組成之群：PRA100-108
(SEQ ID NO：2)、PRA142-151
(SEQ ID NO：3)、PRA300-309
(SEQ ID NO：4)、PRA425-433
(SEQ ID NO：5)及PRA435-443
(SEQ ID NO：6)。
86.如實施例79至85中任一項之CAR，其中該PRAME肽為PRA300-309
(SEQ ID NO：4)。
87.如實施例79至85中任一項之CAR，其中該PRAME肽為PRA435-443
(SEQ ID NO：6)。
88.如實施例79至87中任一項之CAR，其中該CAR包含包括重鏈可變區及輕鏈可變區之抗原結合部分。
89.如實施例88之CAR，其中該CAR在重鏈可變區與輕鏈可變區之間包含連接子。
90.如實施例89之CAR，其中該連接子包含SEQ ID NO：70中所闡述之胺基酸序列。
91.實施例79至90中任一項之CAR，其中該CAR包含如實施例1至57中任一項之抗原結合部分。
92.如實施例88至91中任一項之CAR，其中該抗原結合部分包含單鏈可變片段(scFv)。
93.如實施例92之CAR，其中該scFv為人類scFv。
94.如實施例93之CAR，其中該人類scFv包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：63、64、65、66、67、68及69。
95.如實施例93或94之CAR，其中該人類scFv包含SEQ ID NO：63中所闡述之胺基酸序列。
96.如實施例88至91中任一項之CAR，其中該抗原結合部分包含視情況交聯之Fab。
97.如實施例88至91中任一項之CAR，其中該抗原結合部分包含F(ab)2
。
98.一種治療患有PRAME陽性疾病之個體的方法，其包含向該個體投與有效量的如實施例1至57中任一項之抗體或其抗原結合部分，由此誘導該個體中之腫瘤細胞死亡。
99.一種治療患有PRAME陽性疾病之個體的方法，其包含向該個體投與有效量的如實施例79至97中任一項之CAR，由此誘導該個體中之腫瘤細胞死亡。
100.一種治療患有PRAME陽性疾病之個體的方法，其包含向該個體投與有效量的如實施例62至64中任一項之雙專一性抗體，由此誘導該個體中之腫瘤細胞死亡。
101.如實施例98至100中任一項之方法，其中該PRAME陽性疾病係選自由以下組成之群：乳癌、卵巢癌、黑素瘤、肺癌、胃腸癌症、腦腫瘤、頭頸癌、腎癌、骨髓瘤、神經母細胞瘤、套細胞淋巴瘤、慢性骨髓細胞性白血病、多發性骨髓瘤、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、急性骨髓/骨髓性白血病(AML)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)及慢性淋巴細胞性白血病(CLL)。
102.如實施例98至101中任一項之方法，其中該個體為人類。
103.如實施例98至102中任一項之方法，其進一步包含投與選自由以下組成之群的一或多種化合物：能夠殺滅腫瘤細胞之化合物、能夠增強效應細胞之殺滅作用之化合物及能夠上調腫瘤細胞上之抗原標靶之化合物。
104.一種如實施例1至57中任一項之抗體或其抗原結合部分的用途，其係用於治療PRAME陽性疾病。
105.一種如實施例79至97中任一項之CAR之用途，其係用於治療PRAME陽性疾病。
106.一種如實施例62至64中任一項之雙專一性抗體之用途，其係用於治療PRAME陽性疾病。
107.如實施例104至106中任一項之用途，其中該PRAME陽性疾病係選自由以下組成之群：乳癌、卵巢癌、黑素瘤、肺癌、胃腸癌症、腦腫瘤、頭頸癌、腎癌、骨髓瘤、神經母細胞瘤、套細胞淋巴瘤、慢性骨髓細胞性白血病、多發性骨髓瘤、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、急性骨髓/骨髓性白血病(AML)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)及慢性淋巴細胞性白血病(CLL)。
108.如實施例1至57中任一項之抗體或其抗原結合部分，其係用於治療個體之PRAME陽性疾病。
109.如實施例108之抗體或其抗原結合部分，其中該PRAME陽
性疾病係選自由以下組成之群：乳癌、卵巢癌、黑素瘤、肺癌、胃腸癌症、腦腫瘤、頭頸癌、腎癌、骨髓瘤、神經母細胞瘤、套細胞淋巴瘤、慢性骨髓細胞性白血病、多發性骨髓瘤、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、急性骨髓/骨髓性白血病(AML)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)及慢性淋巴細胞性白血病(CLL)。
110.如實施例79至97中任一項之CAR，其係用於治療個體之PRAME陽性疾病。
111.如實施例110之CAR，其中該PRAME陽性疾病係選自由以下組成之群：乳癌、卵巢癌、黑素瘤、肺癌、胃腸癌症、腦腫瘤、頭頸癌、腎癌、骨髓瘤、神經母細胞瘤、套細胞淋巴瘤、慢性骨髓細胞性白血病、多發性骨髓瘤、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、急性骨髓/骨髓性白血病(AML)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)及慢性淋巴細胞性白血病(CLL)。
112.如實施例62至64中任一項之雙專一性抗體，其係用於治療個體之PRAME陽性疾病。
113.如實施例112之雙專一性抗體，其中該PRAME陽性疾病係選自由以下組成之群：乳癌、卵巢癌、黑素瘤、肺癌、胃腸癌症、腦腫瘤、頭頸癌、腎癌、骨髓瘤、神經母細胞瘤、套細胞淋巴瘤、慢性骨髓細胞性白血病、多發性骨髓瘤、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、急性骨髓/骨髓性白血病(AML)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)及慢性淋巴細胞性白血病(CLL)。
114.一種用於治療PRAME陽性疾病之套組，其包含如實施例1至57中任一項之抗體或其抗原結合部分。
115.一種用於治療PRAME陽性疾病之套組，其包含如實施例79至97中任一項之CAR。
116.一種用於治療PRAME陽性疾病之套組，其包含如實施例62
至64中任一項之雙專一性抗體。
117.如實施例114至116中任一項之套組，其中該套組進一步包含關於使用該抗體抗體其抗原結合部分、該CAR或該雙專一性抗體治療患有PRAME陽性疾病之個體的書面說明書。
118.如實施例114至117中任一項之套組，其中該PRAME陽性疾病係選自由以下組成之群：乳癌、卵巢癌、黑素瘤、肺癌、胃腸癌症、腦腫瘤、頭頸癌、腎癌、骨髓瘤、神經母細胞瘤、套細胞淋巴瘤、慢性骨髓細胞性白血病、多發性骨髓瘤、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、急性骨髓/骨髓性白血病(AML)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)及慢性淋巴細胞性白血病(CLL)。
實例
提出以下實例以便向一般熟習此項技術者提供如何製備及使用本發明主題之抗體、雙專一性抗體、包含其之組合物、篩選及治療方法的完整揭示內容及說明且不意圖限制本發明人視為其目前所揭示之主題的範疇。應理解，鑒於上文所提供之一般說明，可實行各種其他實施例。
實例1-使用完全人類噬菌體呈現庫選擇對PRAME肽/A2複合體具有專一性之ScFv
對於針對HLA-A*0201/PRAME肽複合體之噬菌體呈現進行3至4輪淘選以富集專一性結合至HLA-A*0201/PRAME肽複合體之scFv噬菌體純系。由於兩種PRAME肽(PRA300-309
及PRA435-443
)侷限於在包括(但不限於)AML、ALL、CML、黑素瘤、乳癌及結腸癌等HLA-A*0201+
腫瘤細胞中表現且以足量呈遞於細胞表面上，由此可靠地引起針對原生癌細胞的基於T細胞之細胞溶解反應，故使用該兩種肽。藉由ELISA確定對PRAME肽/A2複合體呈陽性之個別scFv噬菌體純系且對具有獨特DNA編碼序列之純系進行進一步表徵。為了測試ScFv是否
結合至存活細胞上之PRAME肽/A2複合體，測試陽性噬菌體純系與TAP缺陷型HLA-A*0201陽性細胞株T2之結合。T2細胞只能呈遞外源肽且因此廣泛用於偵測藉由HLA-A2分子呈遞之專一性抗原決定基。在T2細胞上篩選出總計25個噬菌體純系且4個純系顯示良好專一性結合至與僅用PRAME P300肽脈衝之T2細胞之；在T2細胞上篩選出總計34個噬菌體純系且3個純系顯示良好專一性結合至僅用PRAME P435肽脈衝之T2細胞，但不結合至單獨T2細胞或用對照RHAMM-3肽脈衝之T2細胞。
實例2-產生全長人類IgG1
免疫功能，諸如CDC及ADCC取決於二價IgG之Fc結構域。此外，二價mAb提供的抗原結合親合力比單體scFv Ab強。因此，選出59個陽性噬菌體純系中之7個ScFv噬菌體純系在HEK293及中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中產生全長人類單株IgG1。簡言之，將mAb之可變區次選殖至具有相配之人類λ或κ輕鏈恆定區及人類IgG1恆定區序列的哺乳動物表現載體中。純化之全長IgG抗體在還原及非還原條件下顯示預期之分子量。七個純系成功地經工程改造至人類IgG1中。
實例3-PRAME抗體與癌細胞之結合
測試Pr300-#20(亦稱為「Pr#20」；包含EXT009-20 scFv之重鏈及輕鏈可變區序列)與PRAME+/HLA-A*02+
癌細胞之結合專一性。用3μg/ml偶聯至APC之Pr#20 mAb或同型對照對HLA-A2+
AML細胞株AML-14及SET-20、Ph'+
ALL細胞株BV173及骨髓瘤細胞株U266染色且藉由流動式細胞測量術測定結合。使用HLA-A2陰性細胞株HL-60作為陰性對照物且如圖1A中所示，未偵測到結合。因此，Pr300#20專一性結合至PRAME+/HLA-A*02+
癌細胞。其他抗體，例如Pr435#12抗體(包含EXT010-12之重鏈及輕鏈可變區序列)及Pr435#37抗體(包含EXT010-37之重鏈及輕鏈可變區序列)亦結合至多種癌細胞，例如
U266及BV173(資料未示出)。
如圖1B中所示，在含有20μg/mL B-2微球蛋白之無血清培養基中，用50μg/mL PRAME300肽對TAP缺陷型T2細胞脈衝隔夜。使用流動式細胞測量術在未經脈衝及經脈衝之T2細胞上量測Pr300#20結合。如圖1C中所示，Pr300#20結合至PRAME+
/HLA-A*0201+
白血病AML14、BV173及SET2，但不結合至PRAME+/HLA-A*0201-
白血病HL60。
藉由用3μg/ml APC偶聯之mAb對細胞直接染色來測定Pr300#20與HLA-A2+黑素瘤細胞株SK-MEL-5之結合(圖1D，下圖)。平行測定HLA-A2之表現(圖1D，上圖)。使用對PRAME/HLA-A2具有專一性之類TCR mAb ESK1作為陽性對照物。
實例4-對於抗體進行工程改造以增強其細胞毒性能力
對於一種形式，添加經修飾之去海藻糖基化Fc官能基以改善效力，且製備呈具有與CD3交叉反應之ScFv之BiTE形式的第二種形式，其顯示更高效力。在存在或不存在連續稀釋之Pr#20、Pr#20-Fc增強抗體(又稱「Pr300-#20-MAGE」或「Pr20M」)或同型對照情況下，將PRAME+HLA-A2+細胞株AML-14或對照細胞株HL-60與PBMC以50：1之E：T比率一起培育5小時且藉由51Cr釋放量測標靶細胞之殺滅情況。如圖2中所示，Pr300#20-MAGE增強ADCC活性。
早期在開發靶向PRAME/HLA-A*0201之治療性mAb中的關鍵方面取決於癌細胞表面上之獨特新抗原決定基之相對表現密度。其決定哪種形式能夠在此種低密度下在活體外及活體內選擇性殺滅癌症標靶。
測試PRAME-BiTE針對人類癌細胞之活體外抗腫瘤活性。首先評價PRAME-BiTE與一組人類癌細胞及T細胞之雙重結合。在N末端使用PRAME mAb之scFv且在C末端使用帶有His標籤的抗人類CD3ε小鼠單
株抗體之scFv對PRAME-BiTE進行工程改造。藉由流動式細胞測量術測試PRAME-BiTE與腫瘤細胞株(及另一臂與純化之人類CD3+T細胞，以及人類T細胞株，諸如Jurkat)之結合。用濃度為10μg/ml或1μg/ml之Pr#20-BiTE或對照BiTE，隨後用對偶聯至FITC之His標籤具有專一性之二級mAb對PRAME+/A02+ BV173、AML-14與HLA-A2陰性B淋巴瘤細胞株Ramos或Jurkat T細胞進行染色，並加以比較。正如預期的，Jurkat T細胞經由第二臂結合對照BiTE及專一性BiTE。
另外，評估Pr300#20-BiTE針對來源於HLA-A2+患者之原代卵巢癌細胞之結合。在冰上，用10μg/ml及1μg/ml Pr300#20-BiTE或對照BiTE對細胞染色，保持30分鐘，洗滌，隨後用針對His標籤之二級小鼠mAb染色。如圖3A及3B中所示，偵測Pr300#20-BiTE與腫瘤細胞及人類T細胞之雙重結合。
實例5-PRAME抗體之ADCC活性
標靶PRAME+/HLA-A*0201+
細胞藉由在37℃下與每10×105
個細胞100μCi51
Cr一起培育1小時來進行標記。洗滌細胞且在37℃下與指定濃度之Pr300#20-MAGE(又稱「Pr20M」)或同型對照物及完整健康人類PBMC效應子一起培育6小時。對於所有條件使用50：1之效應子：標靶比率。使用以下標準51
Cr釋放分析式測定上清液中之比溶胞率百分比：[(實驗-自發釋放)/(最大裝載量-自發釋放)×100]。如圖4中所示，Pr300#20-MAGE經由ADCC介導人類PBMC在活體外針對三種人類PRAME+
/HLA-A*02：01+
白血病之殺滅作用：AML-14及SET-2，其為AML；及BV173，其為Ph+
ALL。EC50為2至3nM；且KD
為3至4nM。
實例6-PRAME Fc增強之mAb在人類PRAME癌細胞小鼠模型中之活體內抗腫瘤活性
向NSG小鼠靜脈內注射BV173Ph+人類ALL(圖5A及5B)或SET2人
類AML(圖5C及5D)。跟蹤小鼠中兩種白血病之總負荷且使用螢光素酶在細胞中以生物發光成像(BLI)定量。在第6天對獲取小鼠影像以確定所有小鼠均移植人類癌症。第6天開始，用每週兩次50微克Pr300#20-MAGE或對照物(無抗體)處理小鼠2週。藉由BLI進行之生長定量示於圖5A及5C中。BLI之原始影像示於圖5B及5D中。在兩個模型中，Pr300#20-MAGE抗體使腫瘤生長減小56-8倍。
實例7-PR#20結合至PRA
300-309
/MHC複合體之C末端
如圖6A中所示，合成肽以用丙胺酸置換每一非錨定殘基。將在含20μg/mL B-2微球蛋白之無血清培養基中50μg/mL之肽脈衝添加至T2細胞上，保持隔夜。使用流動式細胞測量術定量Pr#20結合以及如藉由脈衝後表面HLA-A*02含量所量測的肽/HLA-A*02穩定性。丙胺酸掃描結果示於圖6B至6D中。Pr#20 mAb與用在多個位置處經修飾之肽脈衝之T2細胞的結合示於x軸中。如圖6A中所示，「300」為天然序列陽性對照物。使用Prame序列。如圖6B中所示，在304至308位之胺基酸改變之後發現結合減少。如圖6C及6D中所示，304位及305位之變化使HLA-A02結合減少。306至308位保持更低結合。因此，Pr#20 mAb在PRA300-309
/MHC複合體之C末端處結合。
圖6E及6F亦顯示Pr300#20與用Pr 300或經丙胺酸取代之Pr 300脈衝之T2細胞的結合。與APC偶聯之Pr#20不結合至單獨T2細胞(中值螢光強度MFI：324)，但強烈結合至Pr300肽(MFI：68351)。結合不受4位處丙胺酸取代(pr 303A肽)之影響，但以Pr306A、305A、302A、307A、304A及308A之次序部分降低(上圖)。為了測試HLA-A2表現是否與Pr300丙胺酸肽之結合減少有關，平行使用抗HLA-A2 mAb純系BB7對細胞染色。相較於與單獨T2細胞之結合，如由MFI自2986增加至8849所示，藉由用pr300肽脈衝使HLA-A2表現明顯增加(下圖)。如圖6F中所示，同型對照人類IgG(hIgG)對所有測試肽之結合呈陰性。
實例8-PRAME抗體之結合位置
藉由冷mAb阻斷進一步確定Pr300#20 mAb及Pr300#29 mAb(包含EXT009-29之重鏈及輕鏈可變區序列)之結合專一性。將五十倍過量之冷mAb Pr300#20或Pr300#29添加至AML-14、SET-2、BV173(均對Pr300#20 mAb結合呈陽性)或HL-60細胞(陰性對照細胞)中，在冰上保持20分鐘，且接著使用3μg/ml APC偶聯之Pr300#20mAb對細胞染色。有趣的是，Pr300#20 mAb結合明顯(AML-14，圖7上圖；及SET-2，圖7下圖)或幾乎完全(BV173；圖8上圖)經冷mAb Pr300#20阻斷，但不被mAb Pr300#29阻斷。此等結果展示mAb Pr300#20之專一性且亦表明，mAb Pr300#20及Pr300#29可識別PRA300-309
/HLA-A2複合體之不同位置。
在具有各種HLA-A單倍型之多個供體上測試Pr300#20及Pr300#29 mAb與標準PBMC之結合。由HLA-A02+
/+
純合供體得到的代表性資料示於圖9A及9B中。首先使用Fc受體(FcR)阻斷試劑阻斷非專一性FcR結合，且隨後用APC偶聯之Pr300#20或Pr300#29，或對照hIgG1對比與各種螢光團偶聯之CD3、CD19或CD33對PBMC染色。相較於對照mAb，在CD3+
、CD19+
或CD33+
群上未發現mAb Pr300#20之顯著結合(圖9A)；在HLA-A2+
供體中存在極少CD19+
及CD33+
細胞與mAb Pr300#29之結合(圖9B)。由HLA-A02-/-
供體得到的代表性資料示於圖9C及9D中。在HLA-A2-
供體中存在極少mAb Pr300#20與CD19+
群之結合(圖9C)。未發現mAb Pr300#29與CD3+
、CD19+
或CD33+
群之顯著結合(圖9D)。
實例9-在NSG異種移植物中靶向PRAME/MHC複合體之PRAME BiTE及CAR之活體內細胞毒性
對於BiTe治療劑，使用活體外擴增之人類EBV專一性T細胞效應子避免小鼠中可能發生之GVHD。以1：1至5：1範圍內之E：T比率給與
PRAME BiTE或對照BiTE以及EBV-T細胞。向小鼠連續靜脈內注射(iv)BiTE且一週兩次靜脈內注射EBV-T細胞。一週兩次藉由BLI監測腫瘤生長情況。實驗組包括：1.異種移植之生長對照組。2.僅EBV專一性T細胞對照組。3.MPRAME-BiTE及T細胞。4.對照-BiTE及T細胞。每組十隻小鼠。使用類似組測試靶向PRAME/MHC複合體之CAR。
實例10-針對PRAME噬菌體純系之肽抗原決定基定位
對針對PRA300-309
與HLA-A*0201之組合的四種EXT009抗體(EXT009-8、EXT009-17、EXT009-20及EXT009-29)進行抗原決定基定位以測定抗原決定基結合。簡言之，藉由丙胺酸取代產生突變EXT009肽且將此等肽獨立地脈衝添加至T2細胞之表面上。T2細胞分別裝載EXT009、EXT009-mut2(「009-mut2」)、EXT009-mut3(「009-mut3」)、EXT009-mut4(「009-mut4」)、EXT009-mut5(「009-mut5」)、EXT009-mut6(「009-mut6」)、EXT009-mut7(「009-mut7」)、EXT009-mut8(「009-mut8」)、EXT009-mut9(「009-mut9」)以及EXT009-AAAA(「009-AAAA」)。EXT009-AAAA用作對照物；009-mut2用於錨定位置。表5顯示肽序列。
接著藉由用對HLA-A具有專一性之螢光標記之小鼠BB7.2抗體(4μg/mL)進行免疫染色以及流動式細胞測量術來量測T2細胞之HLA-A
表現。藉由BB7.2染色進行的T2肽裝載之品質控制(QC)偵測的結果示於圖10中。如圖10中所示，所有經裝載之T2細胞在BB7.2染色之後顯示的MFI均高於T2細胞。EXT009僅顯示比T2細胞略高之MFI。參見圖10。009mut3、mut4、mut5、mut6、mut7、mut8以及009-AAAA顯示之MFI高於EXT009。
用EXT009-噬菌體(EXT009-8、EXT009-17、EXT009-20及EXT009-29)對裝載肽之T2細胞染色，隨後用小鼠抗M13 mAb染色，且最後用FITC-山羊(Fab)2
抗小鼠Ig染色，隨後進行流動式細胞測量術。藉由流動式細胞測量術量測結合。螢光指數(FI)係以使用式FI=(MFI[含肽之T2細胞]/MFI[不含肽之T2細胞]-1，藉由螢光活化細胞分選分析測定的T2細胞上HLA-A*0201之平均螢光強度(MFI)來計算。表6概述針對裝載有表5中所示之丙胺酸突變體組的T2細胞染色的EXT009-噬菌體FACS的MFI值。四種EXT009-噬菌體與裝載有丙胺酸突變體組之T2細胞之結合的直方圖示於圖11A至11D中。
相較於其他兩個純系，009-8及009-17對更多的位置顯示敏感性。009-20僅對8位、9位及10位顯示敏感性。因此，結合抗原決定基位於肽之C末端。全部4個純系顯示對裝載009-AAAA肽之T2細胞無結合。
附錄A
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附錄D
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Claims (44)
- 一種分離之抗體或其抗原結合部分，其結合至與主要組織相容複合體(MHC)分子結合之PRAME肽。
- 如請求項1之抗體或其抗原結合部分，其中該MHC分子為HLA分子。
- 如請求項2之抗體或其抗原結合部分，其中該HLA分子為I類HLA分子。
- 如請求項3之抗體或其抗原結合部分，其中該I類HLA分子為HLA-A。
- 如請求項4之抗體或其抗原結合部分，其中該HLA-A為HLA-A2。
- 如請求項5之抗體或其抗原結合部分，其中該HLA-A2為HLA-A*0201。
- 如請求項1至6中任一項之抗體或其抗原結合部分，其中該PRAME肽係選自由以下組成之群：PRA100-108 (SEQ ID NO：2)、PRA142-151 (SEQ ID NO：3)、PRA300-309 (SEQ ID NO：4)、PRA425-433 (SEQ ID NO：5)及PRA435-443 (SEQ ID NO：6)。
- 如請求項1至7中任一項之抗體或其抗原結合部分，其中該PRAME肽為PRA300-309 (SEQ ID NO：4)。
- 如請求項1至8中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含選自由以下組成之群的重鏈可變區CDR3序列及輕鏈可變區CDR3序列：(a)包含SEQ ID NO：9中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR3序列，及包含SEQ ID NO：12中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR3序列； (b)包含SEQ ID NO：15中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR3序列，及包含SEQ ID NO：18中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR3序列；(c)包含SEQ ID NO：21中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR3序列，及包含SEQ ID NO：24中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR3序列；及(d)包含SEQ ID NO：27中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR3序列，及包含SEQ ID NO：30中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR3序列。
- 如請求項1至9中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含選自由以下組成之群的重鏈可變區CDR2序列及輕鏈可變區CDR2序列：(a)包含SEQ ID NO：8中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR2序列，及包含SEQ ID NO：11中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR2序列；(b)包含SEQ ID NO：14中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR2序列，及包含SEQ ID NO：17中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR2序列；(c)包含SEQ ID NO：20中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR2序列，及包含SEQ ID NO：23中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR2序列；及(d)包含SEQ ID NO：26中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR2序列，及包含SEQ ID NO：29中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR2序列。
- 如請求項1至10中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含選自由以下組成之群的重鏈可變區CDR1序列及輕鏈可變區CDR1序 列：(a)包含SEQ ID NO：7中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR1序列，及包含SEQ ID NO：10中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR1序列；(b)包含SEQ ID NO：13中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR1序列，及包含SEQ ID NO：16中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR1序列；(c)包含SEQ ID NO：19中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR1序列，及包含SEQ ID NO：22中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR1序列；及(d)包含SEQ ID NO：25中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR1序列，及包含SEQ ID NO：28中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR1序列。
- 如請求項1至11中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含：(a)包含SEQ ID NO：7中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：8中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；包含SEQ ID NO：9中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；包含SEQ ID NO：10中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：11中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及包含SEQ ID NO：12中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3；(b)包含SEQ ID NO：13中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：14中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；包含SEQ ID NO：15中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；包含SEQ ID NO：16中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：17中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區 CDR2；及包含SEQ ID NO：18中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3；(c)包含SEQ ID NO：19中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：20中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；包含SEQ ID NO：21中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；包含SEQ ID NO：22中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：23中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及包含SEQ ID NO：24中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3；或(d)包含SEQ ID NO：25中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：26中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；包含SEQ ID NO：27中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；包含SEQ ID NO：28中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：29中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及包含SEQ ID NO：30中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。
- 如請求項1至12中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含：包含SEQ ID NO：7中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：8中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；包含SEQ ID NO：9中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；包含SEQ ID NO：10中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：11中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及包含SEQ ID NO：12中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。
- 如請求項1至13中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含包括與選自由SEQ ID NO：49、51、53及55組成之群的序列至少80%同源之胺基酸序列的重鏈可變區。
- 如請求項1至14中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含包括SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53或SEQ ID NO：55中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區。
- 如請求項1至15中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含包括與選自由SEQ ID NO：50、52、54及56組成之群的序列至少80%同源之胺基酸序列的輕鏈可變區。
- 如請求項1至16中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含包括SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54或SEQ ID NO：56中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
- 如請求項1至17中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含：(a)包含SEQ ID NO：49中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：50中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區；(b)包含SEQ ID NO：51中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：52中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區；(c)包含SEQ ID NO：53中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：54所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區；或(d)包含SEQ ID NO：55中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：56中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
- 如請求項1至18中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含：包含SEQ ID NO：49中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：50中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
- 如請求項1至7及9至19中任一項之抗體或其抗原結合部分，其中該PRAME肽為PRA435-443 (SEQ ID NO：6)。
- 如請求項1至7及20中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含選自由以下組成之群的重鏈可變區CDR3序列及輕鏈可變區CDR3序列： (a)包含SEQ ID NO：33中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR3序列，及包含SEQ ID NO：36中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR3序列；(b)包含SEQ ID NO：39中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR3序列，及包含SEQ ID NO：42中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR3序列；及(c)包含SEQ ID NO：45中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR3序列，及包含SEQ ID NO：48中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR3序列。
- 如請求項1至7、20及21中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含選自由以下組成之群的重鏈可變區CDR2序列及輕鏈可變區CDR2序列：(a)包含SEQ ID NO：32中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR2序列，及包含SEQ ID NO：35中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR2序列；(b)包含SEQ ID NO：38中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR2序列，及包含SEQ ID NO：41中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR2序列；及(c)包含SEQ ID NO：44中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR2序列，及包含SEQ ID NO：47中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR2序列。
- 如請求項1至7及20至22中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含選自由以下組成之群的重鏈可變區CDR1序列及輕鏈可變區CDR1序列：(a)包含SEQ ID NO：31中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR1序列，及包含SEQ ID NO：34中所闡述之胺基酸序列 或其修飾的輕鏈可變區CDR1序列；(b)包含SEQ ID NO：37中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR1序列，及包含SEQ ID NO：40中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR1序列；及(c)包含SEQ ID NO：43中所闡述之胺基酸序列或其修飾的重鏈可變區CDR1序列，及包含SEQ ID NO：46中所闡述之胺基酸序列或其修飾的輕鏈可變區CDR1序列。
- 如請求項1至7及20至23中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含：(a)包含SEQ ID NO：31中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：32中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；包含SEQ ID NO：33中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；包含SEQ ID NO：34中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：35中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及包含SEQ ID NO：36中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3；(b)包含SEQ ID NO：37中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：38中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；包含SEQ ID NO：39中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；包含SEQ ID NO：40中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：41中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及包含SEQ ID NO：42中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3；或(c)包含SEQ ID NO：43中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：44中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；包含SEQ ID NO：45中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區 CDR3；包含SEQ ID NO：46中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：47中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及包含SEQ ID NO：48中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。
- 如請求項1至7及20至24中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含：包含SEQ ID NO：31中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：32中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；包含SEQ ID NO：33中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；包含SEQ ID NO：34中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；包含SEQ ID NO：35中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及包含SEQ ID NO：36中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。
- 如請求項1至7及20至25中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含包括與選自由SEQ ID NO：57、59及61組成之群的序列至少80%同源之胺基酸序列的重鏈可變區。
- 如請求項1至7及20至26中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含包括SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：61中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區。
- 如請求項1至7及20至27中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含包括與選自由SEQ ID NO：58、60及62組成之群的序列至少80%同源之胺基酸序列的輕鏈可變區。
- 如請求項1至7及20至28中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含包括SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：62中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
- 如請求項1至7及20至29中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含： (a)包含SEQ ID NO：57中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：58中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區；(b)包含SEQ ID NO：59中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：60中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區；或(c)包含SEQ ID NO：61中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：62所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
- 如請求項20至30中任一項之抗體或其抗原結合部分，其包含：包含SEQ ID NO：57中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：58中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
- 一種分離之抗體或其抗原結合部分，其與參考抗體或抗原結合部分交叉競爭結合至與MHC分子結合之PRAME肽，該參考抗體或抗原結合部分包含：(a)包含SEQ ID NO：49中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：50中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區；(b)包含SEQ ID NO：51中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：52中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區；(c)包含SEQ ID NO：53中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：54所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區；(d)包含SEQ ID NO：55中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：56中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區；(e)包含SEQ ID NO：57中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：58中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區；(f)包含SEQ ID NO：59中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：60中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區；或(g)包含SEQ ID NO：61中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：62中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
- 如請求項32之抗體或其抗原結合部分，其中該參考抗體或其抗原結合部分包含包括SEQ ID NO：49中所闡述之胺基酸序列的重鏈可變區，及包括SEQ ID NO：50中所闡述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
- 一種免疫接合物，其包含連接至治療劑的如請求項1至33中任一項之抗體或其抗原結合部分。
- 一種雙專一性分子，其包含連接至第二功能性部分的如請求項1至33中任一項之抗體或其抗原結合部分。
- 一種分離之核酸，其編碼如請求項1至33中任一項之抗體或其抗原結合部分。
- 一種表現載體，其包含如請求項36之核酸分子。
- 一種宿主細胞，其包含如請求項37之表現載體。
- 一種用於偵測全細胞或組織中之PRAME的方法，其包含：(a)使細胞或組織與結合至與MHC分子結合之PRAME肽的抗體或其抗原結合部分接觸，其中該抗體或其抗原結合部分包含可偵測標記；及(b)藉由量測與該細胞或組織相連之可偵測標記的量來測定結合至該細胞或組織之該經標記抗體或其抗原結合部分的量，其中該經結合抗體或其抗原結合部分的量指示該細胞或組織中PRAME的量。
- 一種對結合至MHC分子之PRAME肽具有專一性之嵌合抗原受體(CAR)。
- 如請求項40之CAR，其中該CAR包含如請求項1至33中任一項之抗原結合部分。
- 一種組合物，其包含如請求項1至33中任一項之抗體或其抗原結合部分、如請求項34之免疫接合物、如請求項35之雙專一性分 子或如請求項40或41之CAR，及醫藥學上可接受之載劑。
- 如請求項1至33中任一項之抗體或其抗原結合部分、如請求項40或41之CAR、如請求項35之雙專一性抗體或如請求項42之組合物，其係用於治療個體之PRAME陽性疾病。
- 如請求項43使用之抗體或其抗原結合部分、CAR、雙專一性抗體或組合物，其中該PRAME陽性疾病係選自由以下組成之群：乳癌、卵巢癌、黑素瘤、肺癌、胃腸癌症、腦腫瘤、頭頸癌、腎癌、骨髓瘤、神經母細胞瘤、套細胞淋巴瘤、慢性骨髓細胞性白血病、多發性骨髓瘤、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、急性骨髓/骨髓性白血病(AML)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)及慢性淋巴細胞性白血病(CLL)。
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