CN113583979A

CN113583979A - 一种重组溶瘤痘苗病毒、制备方法及其用途

Info

Publication number: CN113583979A
Application number: CN202110885799.7A
Authority: CN
Inventors: 钱文斌; 王世兵; 叶倩; 陈洁
Original assignee: Hangzhou Ronggu Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Ronggu Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-08-03
Filing date: 2021-08-03
Publication date: 2021-11-02
Anticipated expiration: 2041-08-03
Also published as: CN113583979B

Abstract

本发明公开了一种重组溶瘤痘苗病毒、制备方法及其用途，所述重组溶瘤痘苗病毒可操作地插入能够表达CD47纳米抗体的外源基因，所述外源基因插入痘苗病毒TK基因中；所述外源基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；所述外源基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。重组溶瘤痘苗病毒在制备用于预防或治疗肿瘤或/和癌症的药物中的用途。所述肿瘤或/和癌症包括乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌、结肠腺癌。本申请创造性地将CD47纳米抗体基因插入溶瘤痘苗病毒，使得溶瘤痘苗病毒在肿瘤细胞中复制并裂解细胞，杀死肿瘤细胞的同时，表达CD47纳米抗体，促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，从而提高了治疗效果。

Description

一种重组溶瘤痘苗病毒、制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及溶瘤痘苗病毒技术领域，具体为一种重组溶瘤痘苗病毒、制备方法及其用途。

背景技术

CD47也称整合素相关蛋白(integrin-associated protein，IAP)，是一种细胞膜表面广泛表达的五跨膜受体，属于免疫球蛋白超家族。CD47与巨噬细胞表面的SIRPα(signal regulatory protein alpha)结合，激活酪氨酸磷酸化酶，抑制肌球蛋白在巨噬细胞突触膜下装配位点的聚集，发出“别吃我”的信号，CD47在正常细胞的上的表达水平较低，而在多种肿瘤，包括淋巴瘤和白血病、肉瘤以及几乎所有实体瘤，高水平表达CD47促使肿瘤细胞逃避巨噬细胞的吞噬作用。因此，可以通过CD47抗体阻断肿瘤细胞上的CD47与吞噬细胞上的SIRPα的结合，促进吞噬作用，达到清除肿瘤的目的。

溶瘤免疫治疗(oncolytic virotherapy)是当前治疗癌症的有效手段之一，溶瘤病毒成为肿瘤免疫治疗领域里的一大热点。溶瘤病毒的抗肿瘤作用体现在以下几点：溶瘤病毒能直接感染并裂解肿瘤细胞，即溶瘤(oncolysis)，导致肿瘤抗原和危险信号的释放，激活抗病毒反应，即固有免疫，进而激活适应性免疫，导致肿瘤的清除；插入外源基因的溶瘤病毒通过在肿瘤细胞内复制，来表达各种外源基因，这也是现有较为常规的治疗癌症的方法。

基于上述情况，我们公开了一种重组溶瘤痘苗病毒、制备方法及其用途，并针对性陈述其应用，以公开一种用于治疗癌症或/和肿瘤的重组溶瘤痘苗病毒，解决上述技术问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组溶瘤痘苗病毒、制备方法及其用途，以解决上述背景技术中提出的问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

一种重组溶瘤痘苗病毒，所述重组溶瘤痘苗病毒可操作地插入能够表达CD47纳米抗体的外源基因。

较优化的方案，所述外源基因插入痘苗病毒TK基因中。

较优化的方案，所述外源基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

较优化的方案，所述外源基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

较优化的方案，所述外源基因通过IRES序列连接。所述IRES序列如SEQ ID NO.4所示。

较优化的方案，一种重组溶瘤痘苗病毒的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)基因合成方法合成外源基因序列，所述外源基因能够表达CD47纳米抗体；

(2)将外源基因序列装载于pCB穿梭质粒上，得到pCB-nanoCD47质粒；

(3)将pCB-nanoCD47质粒、野生型痘苗病毒转入HEK293细胞中，在HEK293细胞中，pCB-nanoCD47质粒与野生型痘苗病毒发生同源重组，外源基因序列插入野生型痘苗病毒TK基因中，得到重组溶瘤痘苗病毒；

(4)通过黄嘌呤、次黄嘌呤和霉酚酸依次进行痘苗病毒筛选，得到纯化后的重组溶瘤痘苗病毒。

较优化的方案，一种药物组合物，所述药物组合物包括如上任一项所述的重组溶瘤痘苗病毒、药学上可接受的载体和药物辅料。

较优化的方案，所述药物辅料为紫杉醇。

本发明中所公开的药物组合物包括嵌入能够表达CD47纳米抗体的外源基因的重组溶瘤痘苗病毒、药学上可接受的载体和药物辅料，其中药学上可接受的载体可根据药物组合物的制剂形态进行选择，药物辅料包括可用于治疗癌症的其他活性成分、加工助剂等药物组合物加工合成中可接受添加的成分；实际操作时活性成分可选择为紫杉醇。

较优化的方案，所述药物组合物通过瘤内注射给药、腹膜内给药、蛛网膜下腔内给药或静脉给药。

较优化的方案，根据以上所述的重组溶瘤痘苗病毒在制备用于预防或治疗肿瘤或/和癌症的药物中的用途。

较优化的方案，根据以上所述的一种药物组合物在制备用于预防或治疗肿瘤或/和癌症的药物中的用途。

较优化的方案，所述肿瘤或/和癌症包括乳腺癌，结肠癌，胰腺癌，胃癌，结肠腺癌，弥漫大B细胞淋巴瘤，头颈部肿瘤，滑膜癌，肾癌，结缔组织癌，黑色素瘤，肺癌，食管癌，直肠癌，脑癌，肝癌，骨癌，绒毛膜癌，胃泌素瘤，嗜铬细胞瘤，催乳素瘤，von Hippel-Lindau病，Zollinger-Ellison综合征，肛门癌，胆管癌，膀胱癌，输尿管癌，神经胶质瘤，神经母细胞瘤，脑膜瘤，脊髓肿瘤，骨软骨瘤，软骨肉瘤，尤文氏肉瘤，原发部位不明癌，类癌，纤维肉瘤，佩吉特病，宫颈癌，胆囊癌，眼癌，卡波西氏肉瘤，前列腺癌，睾丸癌，皮肤鳞状细胞癌，间皮瘤，多尖端骨髓瘤，卵巢癌，胰腺内分泌瘤，胰高血糖素瘤，阴茎癌，垂体癌，软组织肉瘤，视网膜母细胞瘤，小肠癌，胸腺癌，滋养细胞癌，葡萄胎，子宫内膜癌，阴道癌，外阴癌，蕈样真菌病，胰岛素瘤，心脏癌，脑膜癌，血液癌，腹膜癌和胸膜癌。

本发明制备的重组溶瘤痘苗病毒可用于预防或治疗肿瘤/癌症的药物的制备，所针对的肿瘤/癌症包括乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌、结肠腺癌、弥漫大B细胞淋巴瘤等，还包括头颈部肿瘤，滑膜癌，肾癌，结缔组织癌，黑色素瘤，肺癌，食管癌，直肠癌，脑癌，肝癌，骨癌，绒毛膜癌，胃泌素瘤，嗜铬细胞瘤，催乳素瘤，von Hippel-Lindau病，Zollinger-Ellison综合征，肛门癌，胆管癌，膀胱癌，输尿管癌，神经胶质瘤，神经母细胞瘤，脑膜瘤，脊髓肿瘤，骨软骨瘤，软骨肉瘤，尤文氏肉瘤，原发部位不明癌，类癌，纤维肉瘤，佩吉特病，宫颈癌，胆囊癌，眼癌，卡波西氏肉瘤，前列腺癌，睾丸癌，皮肤鳞状细胞癌，间皮瘤，多尖端骨髓瘤，卵巢癌，胰腺内分泌瘤，胰高血糖素瘤，阴茎癌，垂体癌，软组织肉瘤，视网膜母细胞瘤，小肠癌，胸腺癌，滋养细胞癌，葡萄胎，子宫内膜癌，阴道癌，外阴癌，蕈样真菌病，胰岛素瘤，心脏癌，脑膜癌，血液癌，腹膜癌和胸膜癌。

较优化的方案，根据以上所述的用途，本申请制备重组溶瘤痘苗病毒可重点针对于乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌、结肠腺癌、弥漫大B细胞淋巴瘤作用。

与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：

纳米抗体(Nanobody，Nb)是1993年发现的一种仅存在于骆驼科动物中的天然重链抗体的可变区结构(variable domains of the HCAb，简称为VHH)，分子量为15kDa，仅为全分子抗体的1/10，分子大小在纳米级，是具有完整抗体功能的最小分子片段。这种纳米抗体的抗原结合区具有与常规单抗不同的结构，在空间上呈突出的指状结构，因此可以结合一些常规抗体无法接近的抗原表位，因其具有分子小、组织穿透能力强、易于结合蛋白裂隙表位、能够偶联其他分子和生产成本低等优点，已经成为开发新一代治疗抗体很有希望的候选分子，但由于纳米抗体蛋白尺寸减小，通常会迅速从体内清除，导致其血浆半衰期缩短，而治疗性应用通常需要缓慢的药物清除速率，避免高剂量和频繁给药对病人带来的生理上的病痛及经济上的负担。

本申请创造性地将CD47纳米抗体基因插入溶瘤痘苗病毒，使得溶瘤痘苗病毒在肿瘤细胞中复制并裂解细胞，杀死肿瘤细胞的同时表达CD47纳米抗体，促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，从而提高了治疗效果。

同时，通过上述方案制备得到的重组溶瘤痘苗病毒可在293A细胞中稳定表达CD47纳米抗体，并在细胞上清中稳定分泌CD47纳米抗体；该细胞上清能够与多种肿瘤细胞特异性结合，能够特异性介导巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬功能，并且调动T细胞和巨噬细胞，抑制肿瘤生长，提高肿瘤/癌症的吞噬治疗效果。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是本发明的实施例3的293A细胞中CD47纳米抗体的表达检测示意图；

图2是本发明的实施例4中Western Blot检测示意图；

图3是本发明的实施例5中的流式检测示意图；

图4是本发明的实施例6中鼠源肿瘤细胞的流式检测示意图；

图5是本发明的实施例6中人源肿瘤细胞的流式检测示意图；

图6是本发明的实施例8中实验组、对照组的用量时间与剂量示意图；

图7是本发明的实施例8中实验组、对照组的肿瘤体积变化示意图；

图8是本发明的实施例9中实验组、对照组的用量时间与剂量示意图；

图9是本发明的实施例9中实验组、对照组的小鼠脾脏中的免疫细胞表达示意图；

图10是本发明的实施例9中实验组、对照组的肿瘤体积变化示意图；

图11是本发明的实施例10中实验组、对照组的用量时间与剂量示意图；

图12是本发明的实施例10中实验组、对照组的肿瘤体积变化示意图；

图13是本发明的实施例11中实验组、对照组的用量时间与剂量示意图；

图14是本发明的实施例11中实验组、对照组的肿瘤体积变化示意图；

图15是本发明的实施例12中实验组、对照组的用量时间与剂量示意图；

图16是本发明的实施例12中实验组、对照组的肿瘤体积变化示意图；

图17是本发明的实施例13中实验组、对照组的用量时间与剂量示意图；

图18是本发明的实施例13中实验组、对照组的肿瘤体积变化示意图；

图19是本发明的实施例14中实验组、对照组的肿瘤体积变化示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

一种重组溶瘤痘苗病毒的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)基因合成方法合成外源基因序列，所述外源基因能够表达CD47纳米抗体；所述外源基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；所述外源基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

(2)将外源基因序列装载于pCB穿梭质粒上，得到pCB-nanoCD47质粒；所述pCB穿梭质粒参考以下文献制备：房有荣，李红玉，陈科达，周文硕，阎辉.Zeocin和GFP双筛选标记重组痘苗病毒载体的构建，国际流行雪传染病学杂志，2012年6月第39卷第3期；Panicali D,PaolettiE.Construction of Poxviruses as cloning vectors；insertion of thethymidine kinase gene from herpes simplex virus info the DNA of infectiousvaccinia virus.Proc Nail Acad sci USA,1982,79(16)；4927-4931；

(3)将pCB-nanoCD47质粒、野生型痘苗病毒转入HEK293细胞中，在HEK293细胞中，pCB-nanoCD47质粒与野生型痘苗病毒发生同源重组，外源基因序列插入野生型痘苗病毒TK基因中，得到重组溶瘤痘苗病毒(OVV-nanoCD47)；其中野生型痘苗病毒选择经过减毒后的野生型痘苗病；

(4)通过黄嘌呤，次黄嘌呤和霉酚酸依次进行痘苗病毒筛选，得到纯化后的重组溶瘤痘苗病毒。

实施例2：

一种重组溶瘤痘苗病毒的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)基因合成方法合成外源基因序列，所述外源基因能够表达CD47抗体；所述外源基因的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；

(2)将外源基因序列装载于pCB穿梭质粒上，得到pCB-CD47质粒；所述pCB穿梭质粒参考以下文献制备：房有荣，李红玉，陈科达，周文硕，阎辉.Zeocin和GFP双筛选标记重组痘苗病毒载体的构建，国际流行雪传染病学杂志，2012年6月第39卷第3期；Panicali D,PaolettiE.Construction of Poxviruses as cloning vectors；insertion of thethymidine kinase gene from herpes simplex virus info the DNA of infectiousvaccinia virus.Proc Nail Acad sci USA,1982,79(16)；4927-4931；

(3)将pCB-CD47质粒、野生型痘苗病毒转入HEK293细胞中，在HEK293细胞中，pCB-CD47质粒与野生型痘苗病毒发生同源重组，外源基因序列插入野生型痘苗病毒TK基因中，得到重组溶瘤痘苗病毒(OVV-scFvCD47)；其中野生型痘苗病毒选择经过减毒后的野生型痘苗病；

实施例3：

实验组：六孔板中分别接种1×10⁶个/mL的293A细胞，取纯化后的重组溶瘤痘苗病毒(OVV-nanoCD47)，以1MOI的剂量感染293A细胞，37℃，5％CO₂条件下培养48h，收集细胞，提取RNA进行逆转录和QPCR，以检测293A细胞中CD47纳米抗体的表达。

对照组一：等量的PBS(Medium)；

对照组二：在病毒TK区插入EGFP基因(增强型绿色荧光蛋白)的重组溶瘤痘苗病毒(OVV-EGFP)；

对照组三：实施例2制备的纯化后的重组溶瘤痘苗病毒(OVV-scFvCD47)；

结论：检测结果如图1所示；

1、由图可知，其中OVV-nanoCD47组为实验组，Medium组为对照组一，OVV-EGFP组为对照组二，OVV-scFvCD47组为对照组三，数据对比可知：

293A细胞感染重组溶瘤痘苗病毒(OVV-nanoCD47)后，在mRNA水平上，CD47纳米抗体的表达明显增加，表明重组溶瘤痘苗病毒可在293A细胞中稳定表达CD47纳米抗体。

2、由图可知：对照组三中，293A细胞感染重组溶瘤痘苗病毒(OVV-scFvCD47)后，在mRNA水平上，CD47抗体的表达明显增加，表明OVV-scFvCD47能够在293A细胞中稳定表达，但其表达量低于OVV-nanoCD47。

实施例4：

利用WB法检测重组溶瘤痘苗病毒(OVV-nanoCD47)感染293A细胞后上清中CD47纳米抗体的表达水平。

具体步骤为：

六孔板中分别接种1×10⁶个/mL的293A细胞，分别加入0.5MOI的重组溶瘤痘苗病毒(OVV-nanoCD47)，37℃，5％CO₂条件下培养48h，收集细胞上清。浓缩后跑电泳，使用标签抗体anti-Flag做Western-Blot，以检测上清中CD47纳米抗体的表达。

对照组一：在病毒TK区插入EGFP基因的重组溶瘤痘苗病毒(OVV-EGFP)感染工具细胞293A后分泌的上清；

结论：检测结果如图2所示；nanoCD47浓缩后10ul、nanoCD47浓缩后15ul均为实验组，EGFP浓缩后10ul、EGFP浓缩后15ul均为对照组一；具体浓缩操作本领域技术人员按照现有技术进行。

由图可知：293A细胞感染重组溶瘤痘苗病毒(OVV-nanoCD47)后，能够分泌CD47纳米抗体到细胞上清中，且得到17KD附近特异性条带。

实施例5：利用流式检测多种肿瘤细胞表面CD47的表达。

6孔板铺1×10⁵个肿瘤细胞，与CD47抗体(biolegend，127514)在4℃孵育30min，加入2ml PBS洗涤两次(500g，5min)，最后用100ul PBS重悬，上机检测。

肿瘤细胞分别为小鼠乳腺癌细胞(4T1组)、人结肠癌细胞(Colo 205组)、小鼠结肠癌细胞(CT26组)、小鼠胰腺癌细胞(Panc02组)、人胃癌细胞(BGC-823组)、人胰腺腺癌细胞(Bxpc-3组)、人胃癌细胞(HGC-27组)、人慢性髓原白血病细胞(K562组)、人弥漫性大细胞淋巴瘤B淋巴细胞(Pfeiffer组)、人结直肠腺癌细胞(Sw620组)、人结直肠腺癌细胞(Sw480组)、人胰腺癌细胞(Sw1990组)、人组织细胞淋巴瘤细胞(U-937组)；

结论：检测结果如图3所示；

由图可知：小鼠乳腺癌细胞(4T1组)、小鼠结肠癌细胞(CT26组)、小鼠胰腺癌细胞(Panc02组)、人胃癌细胞(BGC-823组)、人胰腺腺癌细胞(Bxpc-3组)、人胃癌细胞(HGC-27组)、人慢性髓原白血病细胞(K562组)、人结直肠腺癌细胞(Sw620组)、人结直肠腺癌细胞(Sw480组)均为细胞表面CD47高水平表达的肿瘤细胞；而且CD47抗体能够针对性地阻断肿瘤细胞上的CD47与吞噬细胞上的SIRPα的结合。

实施例6：流式检测重组溶瘤痘苗病毒(OVV-nanoCD47)上清与CD47阳性细胞的结合能力。

6孔板铺1×10⁵个肿瘤细胞，分别与不同体积的OVV-nanoCD47上清(实施例4制得)在4℃孵育30min，加入FLAG-APC流式抗体(biolegend,637308),4℃孵育30min；加入2mlPBS洗涤两次(500g，5min)，最后用100ul PBS重悬，上机检测。

肿瘤细胞分别为小鼠乳腺癌细胞(4T1)、小鼠结肠癌细胞(CT26)、小鼠胰腺癌细胞(Panc02)、人胃癌细胞(BGC-823)、人胰腺腺癌细胞(Bxpc-3)、人胃癌细胞(HGC-27)、人慢性髓原白血病细胞(K562)、人结直肠腺癌细胞(Sw620)、人结直肠腺癌细胞(Sw480)；

结论：检测结果如图4、图5所示；

由图可知：从流式结果看出重组溶瘤痘苗病毒(OVV-nanoCD47)上清中的CD47纳米抗体与鼠源细胞均有较好的结合能力，且上清不需要浓缩也可到达较高的结合率；

重组溶瘤痘苗病毒(OVV-nanoCD47)上清中的CD47纳米抗体与部分的人源肿瘤细胞也具有一定的结合能力，人源细胞中K562的结合率较高。

即：重组溶瘤痘苗病毒(OVV-nanoCD47)上清能够与多种肿瘤细胞特异性结合。

实施例7：利用荧光显微镜和流式检测重组溶瘤痘苗病毒(OVV-nanoCD47)上清促进巨噬细胞的吞噬作用。

材料：

动物：小鼠-C57BL/6雄性4-6w

RPMI 1640液体培养基(美国Hyclone，CAS No:SH30809.01)、胎牛血清(以色列BI，CAS No:04-001-1ACS)、PBS缓冲液(1X)(吉诺生物，CAS No:GNM20012)、0.25％Trpsin0.02％EDTA(吉诺生物，CAS No:GNM25200)、Pen Strep(gibco，CAS No:15140-122)、APCanti-mouse CD11b(BioLegendm，CAS No:101212)、PE anti-mouse F4/80(BioLegendm，CASNo:123109)、重组小鼠M-CSF(上海生工，CAS No:C600234)、重组小鼠IFN-γ(上海生工，CASNo:C600059)、脂多糖LPS(SIMGA，CAS No:L4391)

具体方法：

(1)小鼠骨髓细胞提取：

将一块浸有酒精的棉花沿着老鼠的腹部摩擦。在腹部做一个切口，用剪刀或从骨头上移除肌肉，以暴露股骨头。将清洗干净的骨头浸泡在冰冷的PBS中。

从这一步开始，工作须在安全柜中完成。将骨头浸泡在酒精中10秒，然后放入冰冷的无菌PBS中；小心地用镊子和剪刀拿起骨头，在骨头顶端剪去一小块。使用1mL注射器，用冷PBS冲洗骨头，重复冲洗，直到骨头变成白色。

用10mL吸管，上下移动以溶解聚集的细胞，将细胞悬液通过70μm细胞滤器得到单个细胞悬液，用5ml冷PBS冲洗细胞滤网，补充PBS至40mL，300g离心10min，将细胞用15％血清的RPMI 1640培养液重悬，计数并调节细胞浓度至1*10⁷个/mL；将细胞悬液加入到培养皿中，补加小鼠M-CSF浓度定为40ng/mL，后放入培养箱，37℃，5％CO₂培养。

(2)骨髓细胞诱导为巨噬细胞：

骨髓细胞培养2天和4天后更换含15％血清的RPMI 1640培养基并补加小鼠M-CSF；第6天时，细胞已经分化成贴壁的巨噬细胞。

更换新鲜的含10％血清的RPMI 1640培养基；诱导M1型：10 ng/mL LPS和5μ/mL重组IFN-gamma；加入上述细胞因子处理24h；吸掉上清，更换为含5％血清的RPMI 1640培养基，培养24h；

(3)巨噬细胞铺板：6孔板铺1×10⁵个细胞，过夜培养；培养肿瘤细胞，使用2.5uM的CFSE预标记，计数后加4×105到巨噬细胞中，加入OVV-nanoCD47上清(实施例4制得)，孵育2h；PBS清洗2次后，收集细胞，流式检测。

试验中肿瘤细胞分别为小鼠乳腺癌细胞(4T1)、小鼠胰腺癌细胞(Panc02)、人慢性髓原白血病细胞(K562)；

对照组一：等量的PBS(Medium)；

对照组二：加入在病毒TK区插入EGFP基因的重组溶瘤痘苗病毒(OVV-EGFP)感染工具细胞293A后分泌的上清；

对照组三：实施例2制备的纯化后的重组溶瘤痘苗病毒(OVV-SCFVCD47)感染工具细胞293A后分泌的上清；

对照组四：商品化CD47抗体Hu5F9

结论：具体为实验组(OVV-nanoCD47组)、对照组一(Medium组)、对照组二(OVV-EGFP组)、对照组三(SCFVCD47组)、对照组四(Hu5F9组)。

其中流式检测数据如下表所示：

吞噬指数	OVV-EGFP	OVV-nanoCD47	scfvCD47	Hu5F9	Medium
						4T1	8.75％	41.63％	35.26％	47.75％	7.83％
k562	9.09％	27.07％	21.33％	31.12％	8.23％
						panc02	10.43％	42.32％	36.74％	48.93％	9.11％
CT26	6.21％	42.32％	/	46.44％	5.67％

由此可知：重组溶瘤痘苗病毒(OVV-nanoCD47)上清能够促进促进巨噬细胞的吞噬作用。

OVV-nanoCD47体内疗效动物实验设计；

其中通过cell-free系统表达的nanoCD47蛋白，具体制备步骤如下：

(1)实验材料与试剂：

ProteinFactory Fast(12)：闻博生物，货号profac-fast1210000；

蛋白marker：索莱宝，货号PR1910-50T；

NaCl：四SIGMA公司，货号S5886-10KG；

KCl：SIGAMA公司，货号P5405-500G；

KH2PO4：SIGAMA公司，货号P5655-500G；

Na2HPO4：SIGAMA公司，货号P5136-100KG；

Protein Sample Loading Buffer for SDS-PAGE,5X(DTT)：EZBiolab，ES003-5；

GLYCINE(甘氨酸)：AMRESCO公司，货号0167-1KG；

APS：ACROS ORGANICS公司，货号327081000

TEMED：sigma公司，货号0T9281-25mlL；

Albumin Bovine：biofroxx公司，货号4240GR100；

(2)实验仪器

生化培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂，SPX-150B-Z型；

电泳系统：Mini-Proten Tetra System，BIO-RAD公司；

凝胶成像仪：ChemiDoc XRS+System，BIO-RAD公司；

电子天平：梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；

T100^TM PCR仪：Bio-Rad公司型号：T100^TM

(3)Fusion PCR模板构建法

①5'seq,3'seq,Target ORF三片段制备

A：5'seq制备引物

D2P_1.08e_F:GGTGATGTCGGCGATATAGG

GSG-8HIS_R:ACCAGAACCGTGGTGGTGG

以pD2P质粒为模板常规PCR扩增5'seq片段；

B：3'seq制备引物(不含eGFP)

D2P_3'UTR_F:TAAATAAGGATTAATTACTTGGATGCC

D2P_1.08e_R:TTATTGCTCAGCGGTGGC

A步骤、B步骤的PCR反应条件：PCR循环数35，预变性95℃3min，变性95℃15s，退火温度55℃15s，延伸温度72℃30s，72℃5min，4℃保存。

C：nanoCD47制备引物

F:CACCACCATCACGGGAGCGGC ATGGAGTTCGGACTTTCTTG

R:GGCATCCAAGTAATTAATCC TTACTTATCGTCATCGTCCT

PCR反应条件：PCR循环数35，预变性95℃3min，变性95℃15s，退火温度65℃15s，延伸温度72℃1min，72℃5min，4℃保存。

②5'seq、3'seq、Target ORF三片段PCR Fusion

PCR反应体系(50μL)：5'seq、3'seq及Target ORF片段的纯化产物各2μL，利用如下引物进行Fusion PCR扩增反应：

D2P_1.08e_F:GGTGATGTCGGCGATATAGG

D2P_1.08e_R:TTATTGCTCAGCGGTGGC

PCR反应条件：PCR循环数35，预变性95℃3min，变性95℃15s，退火温度55℃15s，延伸温度72℃1min 30s，72℃5min，4℃保存。

③蛋白表达：Fusion PCR模板以1/45v/v加入至加水溶解的ProteinFactory Rxn反应体系，混匀并调整总反应体系为10mL。将上述反应液置于一次性摇瓶中混匀，透气膜封口或盖上盖子(不可完全封闭)，30℃220rpm摇床上反应3h；

④His-Monster Beads磁珠纯化法

Rxn：1.5mL ProteinFactory反应液，4℃4000rpm离心3min，收集上清；

Binding：取1000μL His-Monster beads，用5mL Binding Buffer洗涤两次，磁吸收集beads，备用。向上述上清液中加入洗涤好的His-Monster beads，充分震荡30s，置于4℃旋转混合1h；Binding buffer:20mM Tris-HCl,500mM NaCl,pH 8.0；

Wash：将孵育后的上述样品，磁吸收集beads，吸弃上清；再加入1000μL Washingbuffer，充分震荡30sec，磁吸收集beads，吸弃上清；重复Wash共5次；Washing buffer:20mMTris-HCl,500mM NaCl,20mM Imidazole,pH 8.0；

Elution：向beads中加入500μL Elution buffer，用枪头吸吹至混匀，静置1min后，磁吸beads，收集Elution上清，即为目标蛋白，重复5-8次。Elution buffer:20mM Tris-HCl,500mM NaCl,250mM Imidazole,pH 8.

通过该方案制备的目标蛋白为通过cell-free系统表达的nanoCD47蛋白，并以此进行对照试验，具体如下：

实施例8：(4T1乳腺癌模型)

BALB/c小鼠皮下成瘤(4T1，1e5)，大概13天后肿瘤大小在50-100mm²左右，随机分成4组，进行溶瘤病毒治疗(OVV-nanoCD47剂量为1*10^8pfu，瘤内注射；每隔3天治疗一次，4次)。之后对这些小鼠的肿瘤进行测量。

对照组一：等量的PBS；

对照组二：通过cell-free系统表达的nanoCD47蛋白；剂量为0.25mg/kg，腹腔注射；

对照组三：在病毒TK区插入EGFP基因的重组溶瘤痘苗病毒(OVV-EGFP)；剂量为1*10^8pfu，瘤内注射；

具体用药时间与剂量如图6所示。

结论：检测结果如图7所示，具体为实验组(OVV-nanoCD47组)、对照组一(PBS组)、对照组二(nanoCD47组)、对照组三(OVV-GFP组)；

由图可知：与对照组相比，OVV-nanoCD47具有明显的抑制肿瘤的效果。

实施例9：

BALB/c小鼠背部成瘤(4T1，1e5)，大概7天后肿瘤大小在50-100mm²左右，进行溶瘤病毒治疗(OVV-nanoCD47剂量为1*10^7pfu，瘤内注射，只治疗一次)。于治疗后第12天，取小鼠脾脏检测相关免疫细胞的表达。

对照组一：等量的PBS；

对照组二：在病毒TK区插入EGFP基因的重组溶瘤痘苗病毒(OVV-EGFP)；1*10^7pfu，瘤内注射；

具体用药时间与剂量如图8所示。

结论：检测结果如图9、图10所示；具体为实验组(OVV-nanoCD47组)、对照组一(PBS组)、对照组二(OVV-EGFP组)；

由图可知：与对照组相比，OVV-nanoCD47组中小鼠脾脏中的CD8+T，巨噬细胞的表达远远高于对照组，具有统计学意义；如图9所示。

与对照组相比，小鼠的肿瘤得到抑制，但由于只治疗一次，抑制效果不明显；具体肿瘤体积可如图10所示。

实施例10：(CT26结肠癌模型)

BALB/c小鼠皮下成瘤(CT26，1e5)，大概10天后肿瘤大小在50-100mm²左右，随机分成4组，进行溶瘤病毒治疗(OVV-nanoCD47剂量为2*10^7pfu，瘤内注射；每隔3天治疗一次，3次)。之后对这些小鼠的肿瘤进行测量。

对照组一：等量的PBS；

对照组三：在病毒TK区插入EGFP基因的重组溶瘤痘苗病毒(OVV-EGFP)；剂量为2*10^7pfu，瘤内注射；

具体用药时间与剂量如图11所示。

结论：检测结果如图12所示；具体为实验组(OVV-nanoCD47组)、对照组一(PBS组)、对照组二(nanoCD47组)、对照组三(OVV-GFP组)；

由图可知：与对照组相比，OVV-nanoCD47具有明显的抑制肿瘤的效果，与对照组相比肿瘤体积明显得到抑制。

实施例11：(Panc02胰腺癌模型)

BALB/c小鼠皮下成瘤(Panc02，1e5)，大概10天后肿瘤大小在50-100mm²左右，随机分成4组，进行溶瘤病毒治疗(OVV-nanoCD47剂量为2*10^7pfu，瘤内注射；每隔3天治疗一次，3次)。之后对这些小鼠的肿瘤进行测量。

对照组一：等量的PBS；

对照组三：在病毒TK区插入EGFP基因的重组溶瘤痘苗病毒(OVV-EGFP)；剂量为2*10^7pfu，瘤内注射

具体用药时间与剂量如图13所示。

结论：检测结果如图14所示；具体为实验组(OVV-nanoCD47组)、对照组一(PBS组)、对照组二(nanoCD47组)、对照组三(OVV-GFP组)；

由图可知：与对照组相比，OVV-nanoCD47具有明显的抑制肿瘤的效果。延长小鼠的生存期，并且OVV-nanoCD47组有3只小鼠肿瘤完全消除。

实施例12：

BALB/c小鼠皮下成瘤(Hepa1-6，5e5)，大概7天后肿瘤大小在50-100mm²左右，随机分成4组，进行溶瘤病毒治疗(OVV-nanoCD47剂量为5*10^7pfu，瘤内注射；每隔3天治疗一次，3次)。之后对这些小鼠的肿瘤进行测量。

对照组一：等量的PBS；

对照组三：在病毒TK区插入EGFP基因的重组溶瘤痘苗病毒(OVV-EGFP)；剂量为5*10^7pfu，瘤内注射；

具体用药时间与剂量如图15所示。

结论：检测结果如图16所示；具体为实验组(OVV-nanoCD47组)、对照组一(PBS组)、对照组二(nanoCD47组)、对照组三(OVV-GFP组)；

实施例13：

ALB/c小鼠皮下成瘤(MFC，5e5)，大概7天后肿瘤大小在50-100mm²左右，随机分成4组，进行溶瘤病毒治疗(OVV-nanoCD47剂量为5*10^7pfu，瘤内注射；每隔3天治疗一次，3次)。之后对这些小鼠的肿瘤进行测量。

对照组一：等量的PBS；

具体用药时间与剂量如图17所示。

结论：检测结果如图18所示；具体为实验组(OVV-nanoCD47组)、对照组一(PBS组)、对照组二(nanoCD47组)、对照组三(OVV-GFP组)；

实施例14：

按照上述方法建立MC38结肠癌模型，随机分成4组，进行溶瘤病毒治疗(OVV-nanoCD47剂量为5*10^7pfu，瘤内注射；每隔3天治疗一次，3次)。之后对这些小鼠的肿瘤进行测量。

对照组一：等量的PBS；

结论：检测结果如图19所示；具体为实验组(OVV-nanoCD47组)、对照组一(PBS组)、对照组二(nanoCD47组)、对照组三(OVV-GFP组)；

由上图可知：与对照组相比，OVV-nanoCD47具有明显的抑制肿瘤的效果。

综上可知：通过上述方案制备得到的重组溶瘤痘苗病毒可在293A细胞中稳定表达CD47纳米抗体，并在细胞上清中稳定分泌CD47纳米抗体；该细胞上清能够与多种肿瘤细胞特异性结合，能够特异性介导巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬功能，并且调动T细胞和巨噬细胞，抑制肿瘤生长，提高肿瘤/癌症的吞噬治疗效果。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 杭州荣谷生物科技有限公司

<120> 一种重组溶瘤痘苗病毒、制备方法及其用途

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 447

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggagttcg gactttcttg ggtattcttg gtggctcttt ttaggggcgt gcagtgccag 60

gtgcagctgg tggagagcgg aggaggactg gtggagcctg gaggctccct gaggctgtct 120

tgcgcagcca gcggcatcat cttcaagatc aacgacatgg gatggtacag gcaggcacca 180

ggcaagagga gagagtgggt ggcagccagc acaggaggcg atgaggccat ctatcgggac 240

tccgtgaagg atcggttcac catctccaga gacgccaaga acagcgtgtt cctgcagatg 300

aattccctga agcccgagga taccgccgtg tactattgta ccgccgtgat ctctacagac 360

cgggatggca ccgagtggag gcgctactgg ggacagggaa cccaggtgac agtgagctcc 420

gattacaagg acgatgacga taagtaa 447

<210> 2

<211> 148

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Phe Arg Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Glu

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Ile Phe

35 40 45

Lys Ile Asn Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg

50 55 60

Glu Trp Val Ala Ala Ser Thr Gly Gly Asp Glu Ala Ile Tyr Arg Asp

65 70 75 80

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ala Lys Asn Ser Val

85 90 95

Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

100 105 110

Cys Thr Ala Val Ile Ser Thr Asp Arg Asp Gly Thr Glu Trp Arg Arg

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Asp Tyr Lys Asp

130 135 140

Asp Asp Asp Lys

145

<210> 3

<211> 1515

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaattcatga aatgggtgac ctttattagc ctgctgtttc tgtttagcag cgcctatagc 60

caggtgcagc tggtgcagtc cggcgctgaa gtaaagaagc ctggagcctc tgtgaaagtg 120

agctgtaagg ctagcggcta taccttcact aattataata tgcactgggt gagacaggcc 180

ccaggacaga gactggagtg gatgggcaca atctaccccg gaaatgatga tacctcttat 240

aaccagaagt ttaaagatag ggtgacaatt acagctgata caagcgccag cacagcctat 300

atggagctga gctctctgcg gagcgaagac actgctgtgt attattgtgc cagaggcggc 360

tatagagcca tggactactg gggacagggc acactggtta cagtgtctag tggaggagga 420

ggcagcggag gcggcggatc tggcggcgga ggctctgata ttgtgatgac acagagcccc 480

ctgtctctgc cagtgacacc aggtgagcct gcatccatca gctgcagatc ctcccagtcc 540

atcgtgtaca gcaacggcaa cacatacctg ggctggtacc tgcagaagcc cggtcagtcc 600

ccccagctgc tgatctacaa ggtgagcaac cgcttcagcg gcgtgcccga ccggttcagc 660

ggcagcggct ccggcaccga ctttaccctg aagatcagca gagtggaggc cgaggacgtg 720

ggcgtgtact actgcttcca gggcagccac gtgccctaca cattcggcca gggcaccaag 780

ctggagatca agggcggagg cggcagcggc ggcggcggct ccgggggagg cggctccccc 840

ccctgccccc cttgccccgc ccgcgagttc ctgggcggcc ctagcgtgtt cctgttcccc 900

cccaagccta aggacacact gatgatcagc aggacccctg aggtgacctg cgtggtggtg 960

gacgtgagcc aggaggaccc tgaggtgcag ttcaactggt acgtggatgg cgttgaggtg 1020

cacaacgcca agaccaagcc cagggaggag cagtttaact ccacctatag ggtggtgagc 1080

gtgctgaccg tgctgcacca ggactggctg aatggcaaag agtacaagtg caaggtgagc 1140

aataagggcc tgcccagcag cattgagaag accatcagca aggccaaggg ccagccccgc 1200

gagccccagg tgtacaccct gcctcccagc caggaggaga tgaccaagaa ccaggtgagc 1260

ctgacctgtc tggtgaaggg cttctaccct tccgacatcg ccgtggagtg ggagagcaac 1320

ggccagcccg agaataacta caagaccacc ccccccgtgc tggatagcga cggcagcttc 1380

ttcctgtaca gcagactgac cgtggacaag agcagatggc aggagggcaa cgtgttcagc 1440

tgtagcgtga tgcacgaggc cctgcacaac cactacaccc agaagagcct gagcctgagc 1500

ctgggcaagt ctaga 1515

<210> 4

<211> 608

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggaaggtcgt ctccttgtgg gttgtggcaa gcttatcatc gtgtttttca aaggaaaacc 60

acgtccccgt ggttcggggg gcctagacgt ttttttaacc tcgactaaac acatgtaaag 120

catgtgcacc gaggccccag atcagatccc atacaatggg gtaccttctg ggcatccttc 180

agccccttgt tgaatacgct tgaggagagc catttgactc tttccacaac tatccaactc 240

acaacgtggc actggggttg tgccgccttt gcaggtgtat cttatacacg tggcttttgg 300

ccgcagaggc acctgtcgcc aggtgggggg ttccgctgcc tgcaaagggt cgctacagac 360

gttgtttgtc ttcaagaagc ttccagagga actgcttcct tcacgacatt caacagacct 420

tgcattcctt tggcgagagg ggaaagaccc ctaggaatgc tcgtcaagaa gacagggcca 480

ggtttccggg ccctcacatt gccaaaagac ggcaatatgg tggaaaataa catatagaca 540

aacgcacacc ggccttattc caagcggctt cggccagtaa cgttaggggg gggggaggga 600

gaggggcg 608

Claims

1.一种重组溶瘤痘苗病毒，其特征在于：所述重组溶瘤痘苗病毒可操作地插入能够表达CD47纳米抗体的外源基因。

2.根据权利要求1所述的一种重组溶瘤痘苗病毒，其特征在于：所述外源基因插入痘苗病毒TK基因中。

3.根据权利要求1所述的一种重组溶瘤痘苗病毒，其特征在于：所述外源基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

4.根据权利要求1所述的一种重组溶瘤痘苗病毒，其特征在于：所述外源基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.根据权利要求1所述的一种重组溶瘤痘苗病毒，其特征在于：所述外源基因通过IRES序列连接。

6.根据权利要求5所述的一种重组溶瘤痘苗病毒，其特征在于：所述IRES序列如SEQ IDNO.4所示。

7.一种重组溶瘤痘苗病毒的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求1-6中任一项所述的重组溶瘤痘苗病毒、药学上可接受的载体和药物辅料。

9.根据权利要求8所述的一种药物组合物，其特征在于，所述药物辅料为紫杉醇。

10.根据权利要求8所述的一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物通过瘤内注射给药、腹膜内给药、蛛网膜下腔内给药或静脉给药。

11.根据权利要求1-6中任一项所述的重组溶瘤痘苗病毒在制备用于预防或治疗肿瘤或/和癌症的药物中的用途。

12.根据权利要求8-10中任一项所述的一种药物组合物在制备用于预防或治疗肿瘤或/和癌症的药物中的用途。

13.根据权利要求11所述的用途，其特征在于：所述肿瘤或/和癌症包括乳腺癌，结肠癌，胰腺癌，胃癌，结肠腺癌，弥漫大B细胞淋巴瘤，头颈部肿瘤，滑膜癌，肾癌，结缔组织癌，黑色素瘤，肺癌，食管癌，直肠癌，脑癌，肝癌，骨癌，绒毛膜癌，胃泌素瘤，嗜铬细胞瘤，催乳素瘤，von Hippel-Lindau病，Zollinger-Ellison综合征，肛门癌，胆管癌，膀胱癌，输尿管癌，神经胶质瘤，神经母细胞瘤，脑膜瘤，脊髓肿瘤，骨软骨瘤，软骨肉瘤，尤文氏肉瘤，原发部位不明癌，类癌，纤维肉瘤，佩吉特病，宫颈癌，胆囊癌，眼癌，卡波西氏肉瘤，前列腺癌，睾丸癌，皮肤鳞状细胞癌，间皮瘤，多尖端骨髓瘤，卵巢癌，胰腺内分泌瘤，胰高血糖素瘤，阴茎癌，垂体癌，软组织肉瘤，视网膜母细胞瘤，小肠癌，胸腺癌，滋养细胞癌，葡萄胎，子宫内膜癌，阴道癌，外阴癌，蕈样真菌病，胰岛素瘤，心脏癌，脑膜癌，血液癌，腹膜癌和胸膜癌。