CN110256565A

CN110256565A - 抗cd47纳米抗体突变体及其应用

Info

Publication number: CN110256565A
Application number: CN201910711603.5A
Authority: CN
Inventors: 黄鹤; 康广博; 程鑫; 胡敏; 王杰文
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2019-08-02
Filing date: 2019-08-02
Publication date: 2019-09-20
Anticipated expiration: 2039-08-02
Also published as: CN110256565B

Abstract

本发明涉及抗体领域，特别涉及抗CD47纳米抗体突变体及其应用。本发明通过对原有纳米抗体序列进行突变，得到亲和力提高的抗CD47纳米抗体序列VHH2^mut，提高其应用价值。本发明得到的突变体纳米抗体序列VHH2^mut与原生序列相比亲和力提高了87.4倍，Tm值提高7.6℃。

Description

抗CD47纳米抗体突变体及其应用

技术领域

本发明涉及抗体领域，特别涉及抗CD47纳米抗体突变体及其应用。

背景技术

CD47(Cluster of Differentiation 47)也被称为整合素相关蛋白(integrinassociated protein，IAP)，分子量约为47～55kDa，是一种高度糖基化的跨膜蛋白。CD47可与膜整合素结合，也可与血小板反应蛋白-1(TSP-1)和信号调节蛋白α(SIRPα结合，介导细胞双向信号传导进而调控免疫应答，是细胞表面至关重要的标记物。CD47参与一系列细胞过程，包括白细胞粘附和迁移、T细胞活化、细胞凋亡和吞噬作用。

CD47通过与吞噬细胞表面的SIRPα相互作用抑制细胞吞噬作用，向免疫系统中的巨噬细胞发出“不吃我”的信号；此信号可抑制后者对恶性肿瘤细胞介导的细胞毒性反应，从而导致免疫逃逸。这一现象有助于肿瘤的转移和演进，因此被认为是一种典型的肿瘤标志物，并在近几年成为某些癌症及肿瘤的潜在治疗靶点。抑制CD47信号可增强巨噬细胞的吞噬活性；在临床前模型中，可导致肿瘤生长受损，抑制转移扩散及肿瘤消退。

CD47参与调控多个信号通路，例如CD47/SIRPα信号通路、 MIAT/miR-149-5p/CD47信号通路、BRAF/MEK通路、SLAMF7/Mac-1通路及PD-1/PDL1通路。其中前者研究最为透彻，机理阐释最为清楚。 CD47/SIRPα相互作用形成双向信号传导，导致不同的细胞间反应，包括抑制吞噬、刺激细胞融合和T细胞激活，因此靶向封闭CD47/SIRPα信号通路被认为是激活巨噬细胞抗肿瘤活性的重要手段之一。

纳米抗体(Nb)因其晶体结构处于纳米级水平而得名，是天然存在的可结合抗原的最小片段。骆驼科动物体内存在天然缺失轻链和CH1 部分的重链抗体，克隆其可变区得到的抗体片段称为纳米抗体。相较于传统 IgG抗体，纳米抗体没有轻链及重链CH1区，只含有一个重链可变区构成的结构域。一般来说，其结构呈椭圆形，尺寸处于纳米级，分子质量仅为传统单抗的1/10(约12～15kDa)。基于其独特的空间结构，纳米抗体具有许多优异的特性，例如易于获得和表达、高稳定性、高水溶性、识别独特的抗原表位等，此外还有与人源IgG序列同源、亲和力高、易改造等优点。

纳米抗体首先发现于骆驼科动物体内，随后在鲨鱼、银鲛等软骨鱼中发现了类似的抗原受体(Ig new antigen receptor,IgNAR)，其中骆驼源纳米抗体应用最为广泛。骆驼源VHH结构包含4个骨架区(Frameworkregion,FR) 和3个高变区(Hypervariable region,HVR，即CDR区)。由于VHH的 CDR数量仅为传统抗体的一半，因此进化出了相对于VH更长的CDR1和 CDR3：人源VH的CDR3长度为9～12个氨基酸，驼源VHH的CDR3长度为13～18个氨基酸。更长的CDR1及CDR3保证了VHH结合抗原的有效性，甚至帮助其识别隐藏的特殊抗原结合位点。

此外，VHH与VH的FR2区也存在不同。IgG的FR2区含有4个疏水性氨基酸：V37、G44、L45和W47，这些残基参与和VL的相互作用；而在VHH的FR2区中这些位点被替换成了亲水性氨基酸：F/Y37， E/Q44，R/C45和G/F/S/L47。这一特性使得VHH的柔性变大，溶解度增强。除去FR1(Cys22)与FR3(Cys92)之间形成的二硫键外，CDR1(或 FR2)与CDR3也含有一对二硫键，进一步稳定CDR3的凸环结构。

由于利用常规展示技术筛选出的纳米抗体序列并未经过抗原驱动的体内亲和力成熟过程，故亲和力相对较低，限制了进一步开发及应用的可能性。因此有必要针对纳米抗体亲和力进行理性设计探索，以期弥补未经体内亲和力成熟的缺陷，提高其亲和力。

目前针对CD47靶标在已申请专利中大多是选择单克隆抗体来进行封闭，传统单克隆抗体分子量大，难以渗透进入组织间，并且单抗的生产周期长、人源化比较困难，因此，寻找具有更小分子量的抗体具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种抗CD47纳米抗体突变体及其应用。本发明得到的突变体纳米抗体序列VHH2^mut与原生序列相比亲和力提高了87.4倍，Tm 值提高7.6℃。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了抗CD47纳米抗体突变体，其具有：

(1)、其CDR区包括4个位点的突变：G107W，T108H，S109V，F110A；或

(2)、如(1)所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(1)所述氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或

(3)、与(1)或(2)所述氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述的抗CD47纳米抗体突变体具有：

(4)、所述抗CD47纳米抗体突变体的3个CDR区分别具有如SEQ ID No.1、2和3所示的氨基酸序列；或

(5)、如(4)所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(4)所述氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或

(6)、与(4)或(5)所述氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列。

(7)、所述抗CD47纳米抗体突变体的4个FR区分别具有如SEQ ID No.4、 5、6和7所示的氨基酸序列；或

(8)、如(7)所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(7)所述氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或

(9)、与(7)或(8)所述氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列。

(10)、其3个CDR区分别具有如SEQ ID No.1～3所示的氨基酸序列；

且

(11)、其4个FR区分别具有如SEQ ID N o.4～7所示的氨基酸序列；

或

(12)、(10)或(11)所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(10)或(11)所述氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；

或

(13)、与(10)、(11)或(12)所述氨基酸序列90％以上同源性的氨基酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述的抗CD47纳米抗体突变体具有：如SEQ IDNo.8所示的氨基酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述的抗CD47纳米抗体突变体中，所述多个为2个、3个、4个或5个。

本发明还提供了编码所述的单克隆抗体的核酸。

在本发明的一些具体实施方案中，所述核酸具有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种表达载体，包括如SEQ ID No.9所示核苷酸序列的核酸。

本发明还提供了转化或转染所述表达载体的宿主细胞。

本发明还提供了一种结合物，包含经化学标记或生物标记的所述的抗 CD47纳米抗体突变体。

本发明还提供了所述抗CD47纳米抗体突变体或所述结合物与固体介质或半固体介质偶联制得的偶联物。

本发明还提供了所述抗CD47纳米抗体突变体、所述结合物和/或所述偶联物在制备CD47的封闭剂或巨噬细胞的激活剂中的应用。

本发明还提供了所述抗CD47纳米抗体突变体、所述结合物和/或所述偶联物在制备抗肿瘤的药物中的应用。

本发明还提供了一种药物，包括所述抗CD47纳米抗体突变体、所述结合物和/或所述偶联物。

本发明还提供了所述抗CD47纳米抗体突变体、所述结合物和/或所述偶联物在制备检测CD47表达的产品中的应用。

本发明还提供了一种试剂盒，包括所述抗CD47纳米抗体突变体、所述结合物和/或所述偶联物。

本发明还提供了一种肿瘤的治疗方法，其特征在于，给予所述的药物。

其中，本发明所涉及的序列如下所示：

SEQ ID No.1(CDR1)：RSQNMG

SEQ ID No.2(CDR2)：CISSRVVECWYADSVKG

SEQ ID No.3(CDR3)：PRAITWHVAVGEHMCDY

SEQ ID No.4(FR1)： MAEVQLQASGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTNE

SEQ ID No.5(FR2)：WFRQAPGKEREGVA

SEQ ID No.6(FR3)：RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA

SEQ ID No.7(FR4)：WGQGTQVTVSSGR

SEQ ID No.8(VHH2^mut氨基酸序列)：

MAEVQLQASGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTNERSQNMGWFRQAPG KEREGVACISSRVVECWYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTA VYYCAAPRAITWHVAVGEHMCDYWGQGTQVTVSSGR

SEQ ID No.9(编码VHH2^mut所对应的核苷酸序列)：

ATGGCCGAAGTTCAGCTGCAAGCCAGTGGTGGTGGTCTGGTTCAA GCCGGTGGCAGTCTGCGTCTGAGTTGCGCCGCGAGCGGCTTTACCAATG AACGCAGCCAGAACATGGGCTGGTTTCGCCAAGCCCCGGGCAAAGAACGCGAAGGTGTGGCGTGCATCAGCAGCCGCGTTGTTGAATGCTGGTACG CGGATAGCGTGAAAGGCCGCTTTACCATCAGCCGCGATAACGCCAAGA ACACCGTGTATCTGCAGATGAACAGTCTGAAACCGGAGGATACCGCCG TGTACTATTGCGCGGCGCCACGTGCCATTACGTGGCATGTTGCCGTGGG CGAACACATGTGCGACTACTGGGGCCAAGGCACCCAAGTTACCGTTAG CAGCGGCCGC。

本发明采用体外亲和力成熟策略，在筛选得到原生序列后，可以快速实现体外亲和力成熟。本发明得到的突变体纳米抗体序列VHH2^mut与原生序列相比亲和力提高了87.4倍，Tm值提高7.6℃。

本发明提供的抗CD47纳米抗体突变体与传统的单克隆抗体相比具有组织穿透力强，水溶性高，免疫原性低等优点。在纳米抗体序列已知的情况下可以在原核宿主细胞里实现快速表达。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示重组载体构建；

图2示重组质粒pET32a-VHH菌落PCR验证结果；

图3示TransB表达纯化SDS-PAGE电泳结果；

图4示SPR测定纳米抗体亲和力常数；

图5示qPCR检测纳米抗体的熔解曲线；

图6示不同浓度梯度下纳米抗体与CD47^ext ELISA结果；

图7示不同温度下纳米抗体与CD47^ext ELISA结果。

具体实施方式

本发明公开了一种抗CD47纳米抗体突变体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明要解决的第一个技术问题是进一步提高纳米抗体的亲和力，前期通过噬菌体展示技术从合成库中筛选针对CD47胞外区域的纳米抗体VHH2，通过对原有纳米抗体序列进行突变，得到亲和力提高的抗CD47纳米抗体序列 VHH2^mut，提高其应用价值。

本发明要解决的第二个技术问题是提供编码上述突变纳米抗体的氨基酸序列及编码基因。

本发明要解决的第三个问题是提供一种纳米抗体序列在大肠杆菌工程菌中表达的构建方法。

本发明索要解决的技术问题是通过以下方案来实现的。

本发明提供了一种抗CD47纳米抗体突变体，其CDR区发生4个位点的突变，并且突变后具有如SEQ ID No.8所示的氨基酸序列组成。

本发明提供的抗CD47纳米抗体突变体，所述VHH2^mut包含互补决定区 CDR，所述的CDR包括SEQ ID No.1所示的CDR1，SEQ ID No.2所示的 CDR2，SEQ ID No.3所示的CDR3。

本发明提供的抗CD47纳米抗体突变体，所述VHH2^mut链还包括框架区FR，所述的框架区FR由SEQ ID No.4所示的FR1，SEQ ID No.5所示的FR2，SEQ ID No.6所示的FR3，SEQ IDNo.7所示的FR4。

本发明还提供了一种编码如SEQ ID No.8所示氨基酸序列的核苷酸序列，所述的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。

本发明还提供了一种表达载体宿主菌，包括如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列，在适宜纳米抗体表达的条件下重组载体能够在宿主菌中很好地表达抗CD47的纳米抗体突变体。

本发明还提供了一种宿主菌，包括如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列，在适宜纳米抗体表达的条件下重组载体能够在宿主菌中很好地表达抗CD47 的纳米抗体突变体。

本发明提供的抗CD47纳米抗体突变体及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1发酵纯化目的蛋白

原有序列VHH2及突变体序列VHH2^mut由北京金唯智公司合成，插入到 pET-32a质粒上的Xbal、Xhol位点之间，同时保留核糖体结合位点。重组载体pET-32a-VHH构建如图1所示，随后进行纳米抗体在TransB细胞(购于北京全式金公司)中的表达和纯化，具体步骤如下。

1)将合成的质粒按步骤如说明书所述，转化TransB感受态细胞，步骤如下：

2)取感受态细胞置于冰水浴上化冻；待其刚融化时(15～30min)，加入 3μL质粒，轻轻吹打混匀，冰水浴中静置30min。

3)在水浴锅中42℃热击60s，之后迅速转移至冰水浴上，静置2min。

4)加入500μL无抗生素的LB培养基，轻轻吹打混匀；置于37℃摇床中， 180rpm震荡复苏60min。

5)取100μL复苏后菌液涂布含Amp抗性的LB平板，37℃培养12～14h。

6)挑取单克隆进行菌落PCR验证，结果如图2所示。并保存测序正确菌株甘油菌。

7)接种测序正确菌液于5mlTB培养基中，37℃过夜培养；以1:100比例转接至4瓶200ml的TB培养基中(含Amp抗性)，37℃、220rpm培养至OD600＝0.6～0.8；加入终浓度为1mM的IPTG，18℃、220rpm诱导18h。(TB 培养基：A液：12g胰蛋白胨，24g酵母提取物，4ml甘油溶于900mL去离子水中；B液：将2.25g KH₂PO₄和12.46g K₂HPO₄溶解于100mL去离子水中；高温灭菌，当溶液冷却至60℃以下时混合使用。)

8)4℃、10,000rpm离心10min收集菌体，并用PBS溶液洗涤沉淀2～3 次。

9)对离心收集的菌体加入1：30的PBS溶液进行重悬，并进行超声破碎；破碎条件为：破2s停3s，共破碎35min。

10)4℃、10,000rpm离心30min收集破碎溶液上清，过0.45μm滤膜后进行亲和纯化；

具体步骤如下，

11)开机，选择AKTA prime plus机器自带的SystemWash程序，采用去离子水冲洗机器内的乙醇。

12)程序结束后，将5ml镍柱安装到机器上，用30ml的去离子水冲洗柱内的乙醇至基线平衡；流速设为5ml/min，压强上限设为0.5MPa。

13)换上平衡缓冲液冲洗平衡柱子；流速设为3ml/min。

14)待基线平衡后开始上样，流速为0.8～1.0ml/min；上样完成后先用10ml 平衡缓冲液缓慢冲洗(流速同上样)，再用3ml/min流速冲洗至基线平衡。

15)换洗脱缓冲液进行洗脱，接取洗脱峰蛋白，流速设为3ml/min；待所有蛋白被完全洗脱后，用去离子水冲洗镍柱至离子浓度基线为零，流速设为5 ml/min。

16)用50ml20％的乙醇溶液继续冲洗，使镍柱完全浸泡在乙醇中，之后关机。对洗脱峰蛋白进行SDS-PAGE电泳，结果见图3。

实施例2表面等离子体共振验证纳米抗体的抗原结合活性

SPR实验常用于准确测定抗原抗体反应的亲和力常数KD。本实验所用仪器为GE公司生产的BIAcore 3000，芯片型号为CM-5。具体步骤如下，

1)包被抗原：将抗原稀释至终浓度30μg/mL，0.22μm滤膜过滤；芯片安装完成后，先用PBS溶液冲洗至基线平衡；设定抗原目的包被量为350RU 后，依次通入10mM乙醇胺(pH8.5)、CD47抗原、10mM甘氨酸溶液(pH 2.5)，进行抗原的共价包被。

2)抗体结合：设定纳米抗体浓度梯度为100μg/mL～6.25μg/mL的5个倍数稀释浓度，并选择一个浓度设置重复实验；设置程序进行上样。芯片再生液为10mM甘氨酸溶液(pH2.5)。

3)数据分析：实验结束后下机，将所得数据导入仪器配套软件进行分析，数据拟合后计算亲和力常数KD值。具体结果见图4。

实施例3荧光实时定量PCR验证纳米抗体的热稳定性

通过设定温度梯度，检测蛋白质羟基的暴露程度，分析蛋白质空间结构随温度改变而产生的变化，从而评估蛋白质的热稳定性。本实验对纳米抗体的热稳定性评价通过实时荧光定量PCR完成，所用仪器为Roche公司生产的 Roche LightCycler 480II。反应体系如下表1所示，具体步骤如下，

表1.qPCR反应体系

1)每个样品设置5个重复。在冰水浴上将各组分按顺序加入到EP管中，轻轻吹打混匀；在避光条件下分装于96孔PCR板上。

2)4℃、1000×g低速离心1min去除气泡；

3)开机并进行仪器自检；完成后进入“New Experiment”界面设定参数：激发和发射光波长分别设为465nm和580nm；温度梯度设定为25℃～95℃，变化率为0.01℃/s。

4)设定完成后启动程序，反应时间约3h；PCR完成后将数据导入仪器配套的软件分析计算纳米抗体的Tm值，结果见图5、表2。

表2图5对应的实验数据

样品检测完成所得数据利用Exor4和LightCycler ThermalShift Analysis插件进行处理，获得纳米抗体的Melting peak曲线(图5)，并计算纳米抗体的 Tm值，分析其Tm值可知，VHH2的Tm值为43.38℃，VHH2^mut Tm值50.74℃。

实施例4间接法ELISA验证纳米抗体的结合活性

以CD47胞外段为抗原，VHHs为一抗，带HRP标记的anti-His鼠源单抗为二抗，利用间接法ELISA验证纳米抗体的结合活性。具体步骤如下，

1)包被：将CD47^ext稀释至终浓度为30μg/mL，向96孔板每孔加入100μL，置于4℃冰箱过夜包被；阴性对照为BSA。

2)洗涤：次日，弃去包被液；向每孔加入200μL PBST溶液，轻轻摇晃 3min，弃去溶液；共洗涤三次。

3)封闭：向每孔加入200μL封闭液，置于37℃烘箱孵育2.5h。

4)洗涤：弃去封闭液；加入PBST溶液洗涤，步骤同2)。

5)加一抗：设定纳米抗体浓度梯度为180μg/mL～5.625μg/mL的六个倍数稀释浓度，向每孔依次加入100μL纳米抗体溶液，且每孔设置三个平行；置于37℃烘箱孵育2.5h。

6)洗涤：弃去孔内液体；加入PBST溶液，轻轻摇晃5min，弃去溶液；共洗涤五次。

7)加二抗：将二抗按1:1000的比例稀释后加入96孔板，每孔100μL；置于37℃烘箱孵育1h。

8)显色：弃去孔内液体；加入PBST溶液洗涤，步骤同6)；用力甩尽孔内液体后，每孔加入100μL TMB显色液；37℃烘箱避光孵育20min。

9)终止反应及测定：向每孔加入100μL终止液终止反应；测定每孔的 OD₄₅₀值，结果见图6、表3。

表3浓度梯度下纳米抗体与CD47^ext ELISA

当浓度为180ug/mL时吸光度值最大，分别为2.552和2.839，当浓度为 5.625μg/mL时吸光度值最小，分别为0.917和1.444；阴性对照为0.294和0.304. 由表中数据可知，随着浓度降低，吸光度值OD₄₅₀下降，显著性差异且与浓度呈正相关。

实施例5间接法ELISA验证纳米抗体的热稳定性

3)封闭：向每孔加入200μL封闭液，置于37℃烘箱孵育2.5h。

4)洗涤：弃去封闭液；加入PBST溶液洗涤，步骤同2)。

5)加入纳米抗体：将纳米抗体稀释至终浓度为30μg/mL，在温度梯度(4℃、25℃、37℃、50℃、60℃、70℃、)下处理10min；每个温度设置三个平行，向每孔加入100μL纳米抗体溶液；置于37℃烘箱孵育1.5～2.5h。

6)其余步骤同4.4的6)～9)，结果见图7、表4。

表4温度梯度下纳米抗体与CD47^ext ELISA

由表中数据可知VHH2和VHH2^mut经不同温度处理后仍然具有良好的结合活性，绝大部分OD₄₅₀吸光度值均大于1.0，说明二者热稳定性较好。其中，4℃低温保存纳米抗体活性最高。即使在70℃时，VHH2^mut亲和力(与4℃处理相比)依然保持在45％以上，相对的VHH2仅为32.7％.

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 天津大学

<120> 抗CD47纳米抗体突变体及其应用

<130> MP1913699

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> CDR1

<400> 1

Arg Ser Gln Asn Met Gly

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> CDR2

<400> 2

Cys Ile Ser Ser Arg Val Val Glu Cys Trp Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> CDR3

<400> 3

Pro Arg Ala Ile Thr Trp His Val Ala Val Gly Glu His Met Cys Asp

1 5 10 15

Tyr

<210> 4

<211> 32

<212> PRT

<213> FR1

<400> 4

Met Ala Glu Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Asn Glu

20 25 30

<210> 5

<211> 14

<212> PRT

<213> FR2

<400> 5

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala

1 5 10

<210> 6

<211> 32

<212> PRT

<213> FR3

<400> 6

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala

20 25 30

<210> 7

<211> 13

<212> PRT

<213> FR4

<400> 7

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Arg

1 5 10

<210> 8

<211> 131

<212> PRT

<213> VHH2mut

<400> 8

Met Ala Glu Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Asn Glu

20 25 30

Arg Ser Gln Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg

35 40 45

Glu Gly Val Ala Cys Ile Ser Ser Arg Val Val Glu Cys Trp Tyr Ala

50 55 60

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

65 70 75 80

Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val

85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Ala Pro Arg Ala Ile Thr Trp His Val Ala Val Gly

100 105 110

Glu His Met Cys Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser Gly Arg

130

<210> 9

<211> 393

<212> DNA

<213> VHH2mut

<400> 9

atggccgaag ttcagctgca agccagtggt ggtggtctgg ttcaagccgg tggcagtctg 60

cgtctgagtt gcgccgcgag cggctttacc aatgaacgca gccagaacat gggctggttt 120

cgccaagccc cgggcaaaga acgcgaaggt gtggcgtgca tcagcagccg cgttgttgaa 180

tgctggtacg cggatagcgt gaaaggccgc tttaccatca gccgcgataa cgccaagaac 240

accgtgtatc tgcagatgaa cagtctgaaa ccggaggata ccgccgtgta ctattgcgcg 300

gcgccacgtg ccattacgtg gcatgttgcc gtgggcgaac acatgtgcga ctactggggc 360

caaggcaccc aagttaccgt tagcagcggc cgc 393

Claims

1.抗CD47纳米抗体突变体，其特征在于，

(1)、其CDR区包括4个位点的突变：G107W，T108H，S109V，F110A；或

2.如权利要求1所述的抗CD47纳米抗体突变体，其特征在于，

3.如权利要求1或2所述的抗CD47纳米抗体突变体，其特征在于，

(7)、所述抗CD47纳米抗体突变体的4个FR区分别具有如SEQ ID No.4、5、6和7所示的氨基酸序列；或

4.如权利要求1至3任一项所述的抗CD47纳米抗体突变体，其特征在于，

(10)、其3个CDR区分别具有如SEQ ID No.1～3所示的氨基酸序列；且

(11)、其4个FR区分别具有如SEQ ID N o.4～7所示的氨基酸序列；

或

5.如权利要求1至4任一项所述的抗CD47纳米抗体突变体，其特征在于，具有如SEQ IDNo.8所示的氨基酸序列。

6.如权利要求1至5任一项所述的抗CD47纳米抗体突变体，其特征在于，所述多个为2个、3个、4个或5个。

7.编码如权利要求1～6任一项所述的单克隆抗体的核酸。

8.如权利要求7所述的核酸，其特征在于，其具有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列。

9.一种表达载体，其特征在于，包括如SEQ ID No.9所示核苷酸序列的核酸。

10.转化或转染如权利要求9所述的表达载体的宿主细胞。

11.结合物，其特征在于，包含经化学标记或生物标记的如权利要求1～6任一项所述的抗CD47纳米抗体突变体。

12.如权利要求1～6任一项所述的抗CD47纳米抗体突变体或如权利要求11所述的结合物与固体介质或半固体介质偶联制得的偶联物。

13.如权利要求1～6任一项所述的抗CD47纳米抗体突变体、如权利要求11所述的结合物和/或如权利要求12所述的偶联物在制备CD47的封闭剂或巨噬细胞的激活剂中的应用。

14.如权利要求1～6任一项所述的抗CD47纳米抗体突变体、如权利要求11所述的结合物和/或如权利要求12所述的偶联物在制备抗肿瘤的药物中的应用。

15.药物，其特征在于，包括如权利要求1～6任一项所述的抗CD47纳米抗体突变体、如权利要求11所述的结合物和/或如权利要求12所述的偶联物。

16.如权利要求1～6任一项所述的抗CD47纳米抗体突变体、如权利要求11所述的结合物和/或如权利要求12所述的偶联物在制备检测CD47表达的产品中的应用。

17.试剂盒，包括如权利要求1～6任一项所述的抗CD47纳米抗体突变体、如权利要求11所述的结合物和/或如权利要求12所述的偶联物。

18.肿瘤的治疗方法，其特征在于，给予如权利要求15所述的药物。