CN111214496A - 一种重组溶瘤病毒在制备治疗淋巴瘤药物组合物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种重组溶瘤痘苗病毒在制备治疗淋巴瘤药物组合物中的用途，通过在溶瘤痘苗病毒上插入编码scFvCD47的外源基因获得重组溶瘤痘苗病毒(OVVscFvCD47)并用在治疗淋巴瘤药物组合物中。本发明将恶性肿瘤的基因治疗与病毒治疗有效结合起来，制备了可高效表达scFvCD47的溶瘤痘苗病毒，相对于单纯的基因疗法或病毒疗法增强了对肿瘤的杀伤能力。本发明采用了肿瘤靶向治疗策略，可以有效地靶向肿瘤细胞，并在其中特异性增殖。从而大大增强了溶瘤痘苗病毒载体的安全性。本发明采用病毒复制相关基因缺失的方式，确保病毒的肿瘤内特异性复制，大大增强了溶瘤痘苗病毒载体的安全性。本发明通过构建携带人scFvCD47编码序列的重组溶瘤痘苗病毒，发挥了较好的抗淋巴瘤的效果。

Description

一种重组溶瘤病毒在制备治疗淋巴瘤药物组合物中的用途

技术领域

本发明属于基因工程学和肿瘤学，涉及一种携带scFvCD47的编码序列的重组溶瘤痘苗病毒在制备用于治疗淋巴瘤的药物组合物、药物或试剂盒中的用途。

背景技术

淋巴瘤是一组起源于淋巴结和结外其他淋巴网状组织的恶性肿瘤，其种类繁多且发病率高。根据《2018全球癌症统计》的资料显示，全球新增癌症患者超过1800万例，淋巴癌占比3％左右。在我国，非霍奇金淋巴瘤发病总数占恶性淋巴瘤发病人数的80％左右，且具有难以治愈等特点。化疗依然是目前治疗淋巴瘤的重要手段。虽然小分子化学药具有渗透性好、细胞毒性较强的优势，但其特异性低，往往会引起严重的毒副作用，使之不能获得满意的临床收益。此外，在过去25年间，伴随着免疫学、分子生物学、基因组学、蛋白质组学等生命科学技术的进步，以及抗体人源化和优化技术的发展，单克隆抗体在淋巴瘤治疗方面的应用前景也颇受关注。但是，这些疗法都存在一定的局限性，很多时候无法取得良好的疗效，因此发展新型安全有效的治疗方法以提高淋巴瘤患者生存期具有非常重要的意义。

溶瘤病毒免疫疗法(Oncolytic Virotherapy)是近年来发展非常迅速的一种肿瘤治疗新方法，并已取得一些令人鼓舞的成果，很多产品正在国内和国际上进行I期、II期和III期临床研究。其中，美国安进公司的重组人GM-CSF溶瘤腺病毒(T-VEC)在临床试验中表现优异，已于2015年获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市，用于首次手术后复发的黑色素瘤患者不可切除的皮肤、皮下和淋巴结病灶的局部治疗。国内有重组人p53腺病毒(今又生)获得国家食品药品监督管理局颁发的新药证书，临床上用于治疗实体肿瘤患者。这些结果表明溶瘤病毒是一种非常具有前景的治疗癌症的新方法。溶瘤痘苗病毒(Oncolytic Poxvirus)是溶瘤病毒免疫疗法的新型载体，其优点在于：病毒稳定性好、致病性低、基因转染效力高、安全性良好。溶瘤痘苗病毒能够选择性感染肿瘤细胞并在细胞内复制、杀死肿瘤细胞，而对正常组织和细胞几乎没有感染性，因此毒性很小。

CD47属于免疫球蛋白超家族，其是人类、猪和啮齿动物信号调节蛋白α(SIRP-α)的主要配体，在体内所有正常细胞上均有表达。CD47作为正常细胞表面的“自我”标记物，与巨噬细胞表达的SIRP-α相互作用，发送“Do Not Eat Me”的信号。之前有研究表明，在急性髓细胞白血病(AML)、B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)等多种血液肿瘤中，CD47蛋白表达增加，并通过CD47–SIRP-α相互作用抑制吞噬作用，因而成为肿瘤细胞免疫逃逸最重要的机制之一。Chao¹等发现，阻断CD47与SIRP-α的结合使得巨噬细胞增强了对非霍奇金淋巴瘤细胞的吞噬能力。Lin²等也发现利用抗体阻断这两者的结合使得巨噬细胞能够吞噬急性髓系白血病细胞。因此，抑制CD47与SIRP-α的结合可以使巨噬细胞重新获得吞噬肿瘤细胞的能力，从而获得更强的肿瘤杀伤效果。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种重组溶瘤痘苗病毒在制备用于治疗癌症的药物组合物中的用途。具体而言，将携带CD47单链可变区抗体(scFvCD47)的重组溶瘤痘苗病毒OVVscFvCD47施用于受试者。

本发明一方面提供了重组溶瘤痘苗病毒在制备用于治疗癌症的药物组合物中的用途，其中所述重组溶瘤痘苗病毒上携带CD47单链可变区抗体(scFvCD47)。

进一步地，重组溶瘤痘苗病毒上携带CD47单链可变区抗体(scFvCD47)编码序列通过可操作地在溶瘤痘苗病毒上插入能够编码scFvCD47的外源基因实现。编码scFvCD47的外源基因序列可为在严紧条件下与scFvCD47的核苷酸序列进行杂交、且编码具有抑制淋巴瘤细胞增值活性的scFvCD47的多核苷酸序列或其互补序列；

优选地，编码scFvCD47的外源基因序列可为如SEQ ID NO.1所示的序列。

另一方面，本发明所述的重组溶瘤痘苗病毒可被进一步修饰，以表达治疗淋巴瘤的蛋白活性成分。示例性地，本发明中用于表达的治疗癌症的蛋白活性成分是p53。

再一方面，本发明中所述药物组合物可含有用于治疗癌症的其他活性成分。示例性地，其中所述的其他活性成分是紫杉醇。

又一方面，本发明的用途中所涉及的药物组合物含有药学上可接受的载体。示例性地，所述的药物组合物是固体或注射液的形式。优选的，所述的药物组合物是包装在药盒中的；更优选的，所述药盒还含有所述药物组合物的使用说明书。

本发明的有益效果是：

1、本发明将恶性肿瘤的基因治疗与病毒治疗有效结合起来，制备了可高效表达scFvCD47的重组溶瘤痘苗病毒，相对于单纯的基因疗法或病毒疗法增强了对肿瘤的杀伤能力。

2、本发明采用了肿瘤靶向治疗策略，可以有效地靶向肿瘤细胞，并在其中特异性增殖。从而大大增强了溶瘤痘苗病毒载体的安全性。

3、本发明采用病毒复制相关基因缺失的方式，确保病毒的肿瘤内特异性复制，大大增强了溶瘤痘苗病毒载体的安全性。

4、本发明通过构建携带scFvCD47的重组溶瘤痘苗病毒，发挥了较好的抗淋巴瘤的效果。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是流式细胞仪检测携带GFP的重组溶瘤痘苗病毒感染Raji、SUDHL-4细胞中GFP的表达水平。

图2是RT-PCR检测携带scFvCD47的重组溶瘤痘苗病毒感染Raji、SUDHL-4细胞，scFvCD47的表达水平。

图3-1和图3-2是MTT法检测细胞存活率分析图，数据以剂量梯度相对于PBS组的百分率表示。

图4是OVV和对Raji、SUDHL-4细胞荷瘤小鼠的肿瘤大小随时间变化图。

具体实施方式

本发明提供了重组溶瘤痘苗病毒在制备用于治疗癌症的药物组合物中的用途，其中所述重组溶瘤痘苗病毒OVVscFvCD47上携带CD47单链可变区抗体(scFvCD47)的编码基因。其中重组溶瘤痘苗病毒OVVscFvCD47上携带CD47单链可变区抗体(scFvCD47)的编码基因通过可操作地在溶瘤痘苗病毒上插入能够编码人scFvCD47的外源基因实现。具体而言，本发明所述的人scFvCD47的编码序列是任何能够编码人scFvCD47的任何DNA序列，优选地，该序列为如SEQ ID NO.1所示的序列或其互补序列。另一方面，本发明所述的人scFvCD47的编码序列可为在严紧条件下与人scFvCD47的核苷酸序列进行杂交的、且编码具有抑制淋巴瘤细胞增值活性的人scFvCD47的多核苷酸或其互补序列；

本文所述的“严紧条件”，可以为低严紧条件、中严紧条件、高严紧条件中的任一种，优选为高严紧条件。示例性地，“低严紧条件”可为30℃、5×SSC、5×Denhardt液、0.5％SDS、52％甲酰胺的条件；“中严紧条件”可为40℃、5×SSC、5×Denhardt液、0.5％SDS、52％甲酰胺的条件；“高严紧条件”可为50℃、5×SSC、5×Denhardt液、0.5％SDS、52％甲酰胺的条件。本领域技术人员应当理解温度越高越能得到高同源性的多核苷酸。另外，本领域技术人员可以选择影响杂交的严紧度的温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多个因素形成的综合结果来实现相应的的严紧度。

除此之外可杂交的多核苷酸还可以为，通过FASTA、BLAST等同源性检索软件用系统设定的默认参数进行计算时，与编码序列号6的多核苷酸具有约60％或以上、约70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1或以上、99.2或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上同一性的多核苷酸。

核苷酸序列的同一性，可以使用Karlin及Altschul的算法规则BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268,1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873,1993)来确定。基于BLAST算法规则的程序BLASTN、BLASTX已被开发(Altschul SF,et al:JMol Biol 215:403,1990)。使用BLASTN分析碱基序列时，如使参数为score＝100、wordlength＝12；此外使用BLASTX分析氨基酸序列时，如使参数为score＝50、wordlength＝3；使用BLAST和Gapped BLAST程序时，采用各程序的系统可设定默认参数值。

任选地，本发明的重组病毒还表达已知能抑制淋巴瘤细胞增殖的其他蛋白，例如p53。本发明的药物组合物还可以含有其他治疗淋巴瘤的活性成分，例如紫杉醇。

本发明的作为活性成分的携带scFvCD47编码基因的重组溶瘤痘苗病毒OVVscFvCD47可以连同药学上可接受的载体一起使用。除活性成分外，本发明的方法、用途和产品还可以包含合适的药学上可接受的载体，包括促进本发明的重组病毒加工成制剂的赋形剂和助剂。

例如适于注射或输注的制剂包括水性和非水性无菌注射液和水性和非水性无菌混悬剂，所述无菌注射液可任选地包含抗氧剂、缓冲剂、抑菌剂和能使制剂与目的接收者的血液等压的溶质，所述无菌混悬剂可包括悬浮剂和增稠剂。所述制剂可存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿，并且可以保存在冻结干燥的(冻干)条件，在立即使用前仅需要加入无菌液体载体，例如注射用水。

本发明的活性成分任选地可与固体赋形剂相组合，并且需要时，在加入合适的助剂后，加工颗粒的混合物，以获得所需剂型。合适的赋形剂特别是填充剂例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；纤维素或淀粉制剂、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。需要时，可以加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐例如海藻酸钠。

本发明的活性成分的有效量可为治疗淋巴瘤，或缓解上述三种癌症症状或抑制上述三种癌症细胞的任何量，其可以是相当于约1x10¹¹-1x10¹²v.p重组病毒。有效量的测定在本领域技术人员的能力内，特别是根据本文提供的公开内容的启示下。

根据本发明，本发明的药学产品(药物、药剂)或药物组合物可以以任意有效剂量数施用给药受试者。优选地，本发明的药学产品(药物、药剂)或药物组合物可以以多次剂量给药，例如从约2至约15次剂量，更优选从约4-10次剂量，最优选约6次剂量。在特别优选的实施方案，在给药过程中，以每三周给药约一次的频率将本发明的药学产品(药物、药剂)或药物组合物给药至受试者，例如注射、输注或口服。在特别优选的实施方案，给药为通过注射施用至荷瘤部位。

应当理解本发明的药学产品(药物、药剂)或药物组合物可以按用于通过任意适宜的途径给药的任意适宜的方式配制。

本发明的药学产品(药物、药剂)或药物组合物的剂量单位是基于常规进行给药受试者。例如，剂量单位可以给药多于每日一次、每周一次、每月一次等。剂量单位可以是以两次/周为基础给药，即每周两次，例如每三天一次。

如本文所使用的，“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包括在内的或开放性的，并且不排除另外的未陈述的元件或方法步骤。术语“包含”在本文中的任何表述，特别是在描述本发明的方法、用途或产品时，应理解为包括基本上由所述组分或元件或步骤组成和由所述组分或元件或步骤组成的那些产品、方法和用途。本文示例性描述的本发明适当地可以在不存在本文未具体公开的任何一种或多种元件、一种或多种限制的情况下进行实践。

本发明的药学产品中所包含的涉及该药学产品的说明书可以含有如下内容：适应症(例如Burkitt’淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤)、施用剂量(例如上述所示例性说明的)以及可能产生的副作用等等。

本文已采用的术语和表述用作描述性而不是限制性术语，并且在此种术语和表述的使用中不预期排除所示和所述特征或其部分的任何等价物，但应认识到各种修饰在请求保护的本发明的范围内是可能的。因此，应当理解尽管本发明已通过优选实施方案和任选特征具体公开，但本领域技术人员可以采用本文公开的概念的修饰和变化，并且此类修饰和变化被视为在如由附加权利要求定义的本发明的范围内。

为更清楚地说明本发明，现结合如下实施例进行详细说明，但这些实施例仅仅是对本发明的示例性描述，并不能解释为对本申请的限制；其中所使用的细胞、培养基等来源附注与相对应的细胞、培养基后的括号中，但不限于此。除特别说明外，本发明可采用本领域常规技术。

实施例1、制备重组溶瘤痘苗病毒OVVscFvCD47

依次进行以下步骤：

1)、通过基因合成方法，得到编码scFvCD47的DNA序列(SEQ ID NO.1)；

2)、将编码scFvCD47的DNA序列装载于穿梭质粒pCB上，得到pCB-scFvCD47(SEQ IDNO.2)，其中所述的穿梭质粒pCB根据如下文献制备：房有荣，李红玉，陈科达，周文硕，阎辉.Zeocin和GFP双筛选标记重组痘苗病毒载体的构建，国际流行病学传染病学杂志，2012年6月第39卷第3期；需要说明的是，本发明也可用其他的pCB，例如没有选择标记的穿梭质粒pCB。

3)、将质粒pCB-scFvCD47与野生型痘苗病毒(购自美国ATCC公司)转入HEK293细胞，在HEK293细胞(人肾胚细胞株，购自中国科学院细胞库)中，质粒pCB-scFvCD47与野生型痘苗病毒发生同源重组，编码scFvCD47的DNA序列插入野生型痘苗病毒胸苷激酶(TK)基因中；

4)、经霉酚酸药物筛选后，得到纯化的重组溶瘤痘苗病毒OVVscFvCD47。

实施例2：流式细胞仪检测携带GFP(绿色荧光蛋白)的重组溶瘤痘苗病毒分别感染人Raji、SUDHL-4细胞来源(分别为人Burkitt’淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系，购自中国科学院细胞库)中GFP的表达水平。

六孔板中接种2×10⁵个/mL的Raji、SUDHL-4细胞，分别加入0.1MOI、0.5MOI、1MOI、5MOI和10MOI的携带GFP的重组溶瘤痘苗病毒(OVVscFvCD47-GFP)，对照组中加入等量的PBS，37℃、5％CO₂培养。12h、24h、48h后分别收集细胞，采用流式细胞仪(BioRad)分析各组样品的GFP表达率。结果见图1，随着剂量的增加，GFP表达水平随之增加，表明重组溶瘤痘苗病毒OVVscFvCD47对淋巴瘤细胞可有效侵袭。

实施例3：PCR检测携带scFvCD47编码基因的重组溶瘤痘苗病毒感染人Raji、SUDHL-4细胞中scFvCD47的表达水平。

携带scFvCD47的重组溶瘤痘苗病毒(OVVscFvCD47)以4MOI的剂量感染Raji、SUDHL-4细胞，37℃，5％CO₂条件下培养24小时。按TRIZOL法提取细胞总RNA，以抽提的总RNA为模板逆转录成cDNA，使用Primer 5.0软件设计引物序列(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)。cDNA通过SYBR qPCR Mix进行荧光定量PCR，扩增体系为20μL。

扩增参数为：95℃ 1min，95℃ 15s，60℃ 1min，40个循环。结果由AppliedBiosystems 7300real-time PCR仪软件分析。结果见图2，OVVscFvCD47处理Raji、SUDHL-4细胞后，在mRNA水平上，scFvCD47表达水平显著增高，表明OVVscFvCD47能在淋巴瘤细胞中稳定表达scFvCD47。

实施例4：携带scFvCD47编码基因的重组溶瘤痘苗病毒对淋巴瘤细胞Raji、SUDHL-4增殖活性的影响。

Raji、SUDHL-4细胞在含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640(购自Gibco)中培养(37℃、5％CO₂、饱和湿度)，取第四代细胞按1×10⁴/ml的浓度接种100μl于96孔培养板。设定溶瘤痘苗病毒组(OVV)、携带scFvCD47的重组溶瘤痘苗病毒组(OVVscFvCD47)，每组均做3复孔。待细胞生长密度达60-70％，分别加入OVV(0.1MOI、0.5MOI、1MOI、5MOI、10MOI)和OVVscFvCD47(0.1MOI、0.5MOI、1MOI、5MOI、10MOI)，继续培养72小时后，加入5mg/ml的四甲基偶氮唑盐(MTT)20μl溶液，继续培养4小时后，终止培养，离心去除培养液，每孔加入150μlDMSO，振荡l0 min后，在Thermo Varioskan Flash全自动酶标仪上选择波长490nm测定各孔吸光值(A值)，上述实验重复3次。根据A值计算细胞抑制率，计算公式为：细胞抑制率(％)＝(阴性对照组A值-加药组A值)/阴性对照组A值×100％。

结果见图3-1，随着剂量的增加，OVV和OVVscFvCD47对淋巴瘤细胞Raji、SUDHL-4增殖抑制效应愈加显著，且OVVscFvCD47对Raji、SUDHL-4增殖抑制效应强于OVV。

实施例5：携带scFvCD47编码基因的重组溶瘤痘苗病毒对人正常细胞增殖活性的影响。

人肝正常细胞QSG-7701(购自中国科学院细胞库)在含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640(购自Gibco)中培养(37℃、5％CO₂、饱和湿度)，取第四代细胞按1×10⁴/ml的浓度接种100μl于96孔培养板。设定对照组、溶瘤痘苗病毒组(OVV)和携带scFvCD47的重组溶瘤痘苗病毒组(OVVscFvCD47)，每组均做3复孔。待细胞生长密度达60-70％，分别加入OVV(0.1MOI、0.5MOI、1MOI、5MOI、10MOI)和OVVscFvCD47(0.1MOI、0.5MOI、1MOI、5MOI、10MOI)，继续培养72小时后，加入5mg/ml的四甲基偶氮唑盐(MTT)20μl溶液，继续培养4小时后，终止培养，离心去除培养液，每孔加入150μl DMSO，振荡l0 min后，在Thermo Varioskan Flash全自动酶标仪上选择波长490nm测定各孔吸光值(A值)，上述实验重3次。根据A值计算细胞抑制率，计算公式为：细胞抑制率(％)＝(阴性对照组A值-加药组A值)/阴性对照组A值×100％。

结果见图3-2，随着剂量的增加，OVV和OVVscFvCD47对人肝正常细胞QSG-7701均无明显抑制效应。

实施例6：携带scFvCD47编码基因的重组溶瘤痘苗病毒(OVVscFvCD47)和溶瘤痘苗病毒OVV对淋巴瘤细胞荷瘤模型动物肿瘤大小的影响。

使用4-6w BALB/c裸鼠，分别进行皮下接种5*10⁶个SUDHL-4细胞和Raji细胞，待肿瘤体积成长至150mm³左右后分别向实验组瘤内注射1*10⁷pfu的OVV和OVVscFvCD47及等体积的PBS，并于0、3、7、14、21天使用游标卡尺测量肿瘤大小并计算体积。体积计算公式为Volume＝(length×Width²)/2，其中Length为肿瘤长径，Width为肿瘤短径。结果见图4，OVVscFvCD47和OVV处理组均能强烈抑制肿瘤生长，且OVVscFvCD47处理组在注射后肿瘤不再生长，其抑制肿瘤生长作用更加显著。

虽然用上述实施方式描述了本发明，应当理解的是，在不背离本发明的精神的前提下，本发明可进行进一步的修饰和变动，且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种重组溶瘤病毒在制备治疗淋巴瘤药物组合物中的用途

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1506

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaagtggg tgaccttcat cagcctgctg ttcctgttca gcagcgccta cagccaggtg 60

cagctggtgc agagcggcgc cgaggtgaag aagcccggcg ccagcgtgaa ggtgagctgc 120

aaggccagcg gctacacctt caccaactac aacatgcact gggtgaggca ggcccccggc 180

cagaggctgg agtggatggg caccatctac cccggcaacg acgacaccag ctacaaccag 240

aagttcaagg acagggtgac catcaccgcc gacaccagcg ccagcaccgc ctacatggag 300

ctgagcagcc tgaggagcga ggacaccgcc gtgtactact gcgccagggg cggctacagg 360

gccatggact actggggcca gggcaccctg gtgaccgtga gcagcggcgg cggcggcagc 420

ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc gacatcgtga tgacccagag ccccctgagc 480

ctgcccgtga cccccggcga gcccgccagc atcagctgca ggagcagcca gagcatcgtg 540

tacagcaacg gcaacaccta cctgggctgg tacctgcaga agcccggcca gagcccccag 600

ctgctgatct acaaggtgag caacaggttc agcggcgtgc ccgacaggtt cagcggcagc 660

ggcagcggca ccgacttcac cctgaagatc agcagggtgg aggccgagga cgtgggcgtg 720

tactactgct tccagggcag ccacgtgccc tacaccttcg gccagggcac caagctggag 780

atcaagggcg gcggcggcag cggcggcggc ggcagcggcg gcggcggcag ccccccctgc 840

cccccctgcc ccgccaggga gttcctgggc ggccccagcg tgttcctgtt cccccccaag 900

cccaaggaca ccctgatgat cagcaggacc cccgaggtga cctgcgtggt ggtggacgtg 960

agccaggagg accccgaggt gcagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaac 1020

gccaagacca agcccaggga ggagcagttc aacagcacct acagggtggt gagcgtgctg 1080

accgtgctgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaggt gagcaacaag 1140

ggcctgccca gcagcatcga gaagaccatc agcaaggcca agggccagcc cagggagccc 1200

caggtgtaca ccctgccccc cagccaggag gagatgacca agaaccaggt gagcctgacc 1260

tgcctggtga agggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caacggccag 1320

cccgagaaca actacaagac cacccccccc gtgctggaca gcgacggcag cttcttcctg 1380

tacagcaggc tgaccgtgga caagagcagg tggcaggagg gcaacgtgtt cagctgcagc 1440

gtgatgcacg aggccctgca caaccactac acccagaaga gcctgagcct gagcctgggc 1500

aagtaa 1506

<210> 2

<211> 6355

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgcgcgtaat acgactcact atagggcgaa ttggagctct ttttatctgc gcggttaacc 60

gcctttttat ccatcaggtg atctgttttt attgtggagt ctagaatgaa gtgggtgacc 120

ttcatcagcc tgctgttcct gttcagcagc gcctacagcc aggtgcagct ggtgcagagc 180

ggcgccgagg tgaagaagcc cggcgccagc gtgaaggtga gctgcaaggc cagcggctac 240

accttcacca actacaacat gcactgggtg aggcaggccc ccggccagag gctggagtgg 300

atgggcacca tctaccccgg caacgacgac accagctaca accagaagtt caaggacagg 360

gtgaccatca ccgccgacac cagcgccagc accgcctaca tggagctgag cagcctgagg 420

agcgaggaca ccgccgtgta ctactgcgcc aggggcggct acagggccat ggactactgg 480

ggccagggca ccctggtgac cgtgagcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc 540

ggcggcggcg gcagcgacat cgtgatgacc cagagccccc tgagcctgcc cgtgaccccc 600

ggcgagcccg ccagcatcag ctgcaggagc agccagagca tcgtgtacag caacggcaac 660

acctacctgg gctggtacct gcagaagccc ggccagagcc cccagctgct gatctacaag 720

gtgagcaaca ggttcagcgg cgtgcccgac aggttcagcg gcagcggcag cggcaccgac 780

ttcaccctga agatcagcag ggtggaggcc gaggacgtgg gcgtgtacta ctgcttccag 840

ggcagccacg tgccctacac cttcggccag ggcaccaagc tggagatcaa gggcggcggc 900

ggcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc ggcagccccc cctgcccccc ctgccccgcc 960

agggagttcc tgggcggccc cagcgtgttc ctgttccccc ccaagcccaa ggacaccctg 1020

atgatcagca ggacccccga ggtgacctgc gtggtggtgg acgtgagcca ggaggacccc 1080

gaggtgcagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc acaacgccaa gaccaagccc 1140

agggaggagc agttcaacag cacctacagg gtggtgagcg tgctgaccgt gctgcaccag 1200

gactggctga acggcaagga gtacaagtgc aaggtgagca acaagggcct gcccagcagc 1260

atcgagaaga ccatcagcaa ggccaagggc cagcccaggg agccccaggt gtacaccctg 1320

ccccccagcc aggaggagat gaccaagaac caggtgagcc tgacctgcct ggtgaagggc 1380

ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaacg gccagcccga gaacaactac 1440

aagaccaccc cccccgtgct ggacagcgac ggcagcttct tcctgtacag caggctgacc 1500

gtggacaaga gcaggtggca ggagggcaac gtgttcagct gcagcgtgat gcacgaggcc 1560

ctgcacaacc actacaccca gaagagcctg agcctgagcc tgggcaagta aagatctgtc 1620

gacttcgagc ttatttatat tccaaaaaaa aaaaataaaa tttcaatttt taagctttca 1680

ctaattccaa acccacccgc tttttatagt aagtttttca cccataaata ataaatacaa 1740

taattaattt ctcgtaaaag tagaaaatat attctaattt attgcacggt aaggaagtag 1800

atcataacga tctctataat ctcgcgcaac ctattttccc ctcgaacact ttttaagccg 1860

tagataaaca ggctgggaca cttcacatga gcgaaaaata catcgtcacc tgggacatgt 1920

tgcagatcca tgcacgtaaa ctcgcaagcc gactgatgcc ttctgaacaa tggaaaggca 1980

ttattgccgt aagccgtggc ggtctggtac cgggtgcgtt actggcgcgt gaactgggta 2040

ttcgtcatgt cgataccgtt tgtatttcca gctacgatca cgacaaccag cgcgagctta 2100

aagtgctgaa acgcgcagaa ggcgatggcg aaggcttcat cgttattgat gacctggtgg 2160

ataccggtgg tactgcggtt gcgattcgtg aaatgtatcc aaaagcgcac tttgtcacca 2220

tcttcgcaaa accggctggt cgtccgctgg ttgatgacta tgttgttgat atcccgcaag 2280

atacctggat tgaacagccg tgggatatgg gcgtcgtatt cgtcccgcca atctccggtc 2340

gctaatcttt tcaacgcctg gcactgccgg gcgttgttct ttttaacttc aggcgggtta 2400

caatagtttc cagtaagtat tctggaggct gcatccatga cacaggcaaa cctgcggatc 2460

ccagcttttg ttccctttag tgagggttaa ttgcgcgcag ttatagtagc cgcactcgat 2520

gggacatttc aacgtaaacc gtttaataat attttgaatc ttattccatt atctgaaatg 2580

gtggtaaaac taactgctgt gtgtatgaaa tgctttaagg aggcttcctt ttctaaacga 2640

ttgggtgagg aaaccgagat agaaataata ggaggtaatg atatgtatca atcggtgtgt 2700

agaaagtgtt acatcgactc ataatattat attttttatc taaaaaacta aaaataaaca 2760

ttgattaaat tttaatataa tacttaaaaa tggatgttgt gtcgttagat aaaccgttta 2820

tgtattttga ggaaattgat aatgagttag attacgaacc agaaagtgca aatgaggtcg 2880

caaaaaaact gccgtatcaa ggacagttaa aactattact aggagaatta ttttttctta 2940

gtaagttaca gcgacacggt atattagatg gtgccaccgt agtgtatata ggatctgctc 3000

ccggtacaca tatacgttat ttgagagatc atttctataa tttaggagtg atcatcaaat 3060

ggatgctaat tgacggccgc catcatgatc ctattttaaa tggattgcgt gatgtgactc 3120

tagtgactcg gttcgttgat gaggaatatc tacgatccat caaaaaacaa ctgcatcctt 3180

ctaagattat tttaatttct gatgtgagat ccaaacgagg aggaaatgaa cctagtacgg 3240

cggatttact aagtaattac gctctacaaa atgtcatgat tagtatttta aaccccgtgg 3300

cgtctagtct taaatggaga tgcccgtttc cagatcaatg gatcaaggac ttttatatcc 3360

cacacggtaa taaaatgtta caaccttttg ctccttcata ttcagctgaa atgagattat 3420

taagtattta taccggtgag aacatgagac tgactcgggc cgcgttgctg gcgtttttcc 3480

ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa 3540

acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc 3600

ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg 3660

cgctttctca atgctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc 3720

tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc 3780

gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca 3840

ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact 3900

acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg 3960

gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt 4020

ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct 4080

tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga 4140

gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa 4200

tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac 4260

ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga 4320

taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc 4380

cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca 4440

gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta 4500

gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct gcaggcatcg 4560

tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc 4620

gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg 4680

ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt 4740

ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt 4800

cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca acacgggata 4860

ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc 4920

gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac 4980

ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa 5040

ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct 5100

tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat 5160

ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc 5220

cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca 5280

cgaggccctt tcgtcttcga ataaatacct gtgacggaag atcacttcgc agaataaata 5340

aatcctggtg tccctgttga taccgggaag ccctgggcca acttttggcg aaaatgagac 5400

gttgatcggc acgtaagagg ttccaacttt caccataatg aaataagatc actaccgggc 5460

gtattttttg agttatcgag attttcagga gctaaggaag ctaaaatgga gaaaaaaatc 5520

actggatata ccaccgttga tatatcccaa tggcatcgta aagaacattt tgaggcattt 5580

cagtcagttg ctcaatgtac ctataaccag accgttcaga gcttttggga tcaataaatg 5640

gatcacaacc agtatctctt aacgatgttc ttcgcagatg atgattcatt ttttaagtat 5700

ttggctagtc aagatgatga atcttcatta tctgatatat tgcaaatcac tcaatatgta 5760

gctagacttt ctgttattat tattgatcca atcaaaaaat aaattagaag ccgtgggtca 5820

ttgttatgaa tctctttcag aggaatacag acaattgaca aaattcacag actttcaaga 5880

ttttaaaaaa ctgtttaaca aggtccctat tgacagatgg aagggtcaaa cttaataaag 5940

gatatttgtt cgactttgtg attagtttga tgcgattcaa aaaagaatcc tctctagcta 6000

ccaccgcaat agatcctgtt agatacatag atcctcgtcg caatatcgca ttttctaacg 6060

tgatggatat attaaagtcg aataaagtga acaataatta attctttatt gtcatcatga 6120

acggcggaca tattcagttg ataatcggcc ccatgttttc aggtaaaagt acagaattaa 6180

ttagacgagt tagacgttat caaatagctc aatataaatg cgtgactata aaatattcta 6240

acgataatag atacggaacg ggactatgga cgcatgataa gaataatttt gaagcattgg 6300

aagcaactaa actatgtgat ctcttggaat caattacaga tttctccgtg atagg 6355

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttcaactggt acgtggacgg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggccttgctg atggtcttct 20

Claims (10)

1.一种重组溶瘤痘苗病毒在制备用于治疗淋巴瘤的药物组合物中的用途，其特征在于，所述重组溶瘤痘苗病毒上携带CD47单链可变区抗体序列(scFvCD47)的编码序列。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述重组溶瘤痘苗病毒通过在溶瘤痘苗病毒中插入编码scFvCD47的外源基因获得。编码scFvCD47的外源基因序列可为在严紧条件下与scFvCD47的核苷酸序列进行杂交、且编码具有抑制淋巴瘤细胞增值活性的scFvCD47的多核苷酸序列或其互补序列。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的编码scFvCD47的外源基因序列可为如SEQ ID NO.1所示。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其特征在于，所述重组溶瘤痘苗病毒还携带有用于表达治疗淋巴瘤的蛋白活性成分。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的蛋白活性成分是p53。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物组合物还包括用于治疗癌症的其他活性成分。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的其他活性成分是紫杉醇。

8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物还含有载体。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的药学上可接受的载体包括促进重组溶瘤痘苗病毒加工成制剂的赋形剂和助剂。

10.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物是固体或注射液的形式。

Images