CN113025651B - 靶向HBV核心启动子的药物筛选细胞模型、Triciribine及结构类似物新应用 - Google Patents

靶向HBV核心启动子的药物筛选细胞模型、Triciribine及结构类似物新应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种质粒pcore‑HU‑SMAR，其骨架载体是质粒PCMV‑Gluc，在骨架载体中插入有：HiBiT‑unaG融合基因，HiBiT‑unaG融合基因通过T2A序列与嘌呤霉素抗性基因相连，在嘌呤霉素抗性基因和polyA序列之间插入SMAR序列，HiBiT‑unaG融合基因是荧光素酶标签HiBiT和荧光蛋白报告基因UnaG的融合基因。还公开了由质粒pcore‑HU‑SMAR转染AML12得到的靶向HBV核心启动子的药物筛选细胞模型。还公开了Triciribine及其结构类似物在制备抑制HBV核心启动子转录和/或HBV复制的药物中的应用或在制备治疗乙型肝炎的药物中的应用。

Description

靶向HBV核心启动子的药物筛选细胞模型、Triciribine及结 构类似物新应用
技术领域
本发明涉及分子生物学和生物医药技术领域，具体涉及一种靶向HBV核心启动子的药物筛选细胞模型、Triciribine及其结构类似物的新应用。
背景技术
目前，全球乙肝病毒携带者约有3.5亿患者，我国6-7％的人群(约8000万)处于病毒携带状态。病毒携带者可发展为慢性乙型肝炎，慢乙肝患者与普通人群相比，发生肝硬化、肝癌的风险更高，全球每年约100万人死于HBV感染相关的肝脏疾病。因此，治疗慢性HBV感染，阻止其致死性后果是事关公共健康的重要问题。
目前，用于乙肝治疗的药物包括α干扰素(IFN-α，PEG-IFNα)和6种核苷(酸)类似物(拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦、替诺福韦阿拉酚胺)。长效干扰素治疗48周后，仅少数患者可获得持续应答，且副作用明显。核苷(酸)类似物在大多数患者中均表现出较强的病毒抑制效果，它们可在一定时期内降低多数患者的血清HBV载量，改善转氨酶水平及肝脏组织学表现。然而，核苷(酸)类药物治疗也存在停药后反弹，长期用药可能筛选耐药突变株的问题。总之，现有治疗药物还远不足以彻底解决乙肝问题。正因为如此，开发新型抗HBV药物十分必要。
对HBV而言，有效的药物靶点应该针对病毒生活周期的关键环节。众所周知，共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)是HBV生命周期的一个关键分子。病毒感染细胞后，其松弛环状DNA(relaxed circular DNA,rcDNA)基因组转运入核，转变成游离于染色体的cccDNA。cccDNA是所有HBV病毒mRNA的转录模板，它的持续存在，也是现有抗病毒治疗后病毒持续存在或反弹的主要原因。阻断并清除细胞内cccDNA库，可以完全清除HBV，已成为领域内的普遍共识。然而，目前各种抗病毒治疗方案中，缺少以cccDNA为靶点的药物。
靶向cccDNA的药物，最终可以通过两种途径发挥作用：降低cccDNA的数量或者抑制其功能。cccDNA的主要功能，是作为所有HBV mRNA的转录模板，这些mRNA中很重要的是pgRNA，因其是子代病毒DNA合成的模板，同时也是核心蛋白和聚合酶的翻译模板。控制pgRNA转录的，是核心启动子。因此，抑制核心启动子的转录活性，即是在很大程度上抑制了cccDNA的功能。然而，目前为止，尚无能有效抑制核心启动子转录活性的药物上市。
发明内容
本发明的发明人在研究过程中，构建了一种靶向HBV核心启动子转录的抗HBV药物筛选细胞模型，然后利用该模型，进行了化合物筛选，筛选到了能抑制HBV核心启动子转录和HBV复制的化合物，这些药物具有进一步发展为乙肝治疗候选药物的潜力。基于此，本发明要求保护如下技术方案：
一种质粒pcore-HU-SMAR，其骨架载体是质粒PCMV-Gluc，在所述骨架载体中插入有：由HBV核心启动子驱动表达的HiBiT-unaG融合基因，所述HiBiT-unaG融合基因通过T2A序列与嘌呤霉素抗性基因相连，在嘌呤霉素抗性基因和polyA序列之间插入SMAR序列，所述HiBiT-unaG融合基因是荧光素酶标签HiBiT和荧光蛋白报告基因UnaG的融合基因，所述SMAR序列是位于人IFNβ基因上游的序列。
上述技术方案中，所述荧光素酶标签HiBiT和荧光蛋白报告基因UnaG通过G4S接头序列连接，所述HBV核心启动子、HiBiT、G4S接头序列、UnaG、T2A序列、嘌呤霉素抗性基因、SMAR序列和骨架载体的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～8所示；
所述质粒pcore-HU-SMAR的核苷酸序列为SEQ ID NO.1～8所示的序列依次连接得到的序列。
上述的质粒pcore-HU-SMAR的构建方法，包括以下步骤：
1)构建质粒puro-SMAR：以质粒PCH9-puro为模板，用引物R puro和F SV40GG2扩增载体片段frag1；扩增得到SMAR序列frag2，将frag1和frag2连接起来得到质粒puro-SMAR；
2)构建质粒pcore-UnaG：以质粒PCH9/3091为模板，用引物F1070GG及R1901GG扩增包含增强子I、增强子II和基本核心启动子的区域，将扩增产物回收片段命名为frag3；扩增UnaG基因片段frag4；以质粒PCMV-Gluc为模板，用引物F SV40和R CMV扩增载体片段frag5，将所述frag3、frag4、frag5连接起来得到质粒pcore-UnaG；
3)构建质粒pcore-HiBiT-UnaG：以质粒pcore-UnaG为模板，用引物F UnaG2和R1901H扩增载体片段frag6；以质粒47G4S-HBc为模板，用引物F H-GS和R GS GG扩增包含甘氨酸-丝氨酸接头序列的片段frag7，将所述frag6、frag7接起来得到质粒pcore-HiBiT-UnaG；
4)构建质粒pcore-HU-SMAR：以质粒pcore-HiBiT-UnaG为模板，用引物R UnaG-2A和F SV40GG扩增DNA片段frag8；以质粒puro-SMAR为模板，用引物F puro-2A和R SMAR 2扩增DNA片段frag9，将frag8、frag9连接起来得到质粒pcore-HU-SMAR。
一种靶向HBV核心启动子的药物筛选细胞模型，是将上述的质粒pcore-HU-SMAR转染小鼠肝细胞系AML12，通过嘌呤霉素筛选和连续传代，获得pCore-AML12细胞。
所述传代培养的传代间隔为3天，总共至少可传30代。
上述的靶向HBV核心启动子的药物筛选细胞模型的构建方法，采取前述的方法制备质粒pcore-HU-SMAR，将质粒pcore-HU-SMAR转染小鼠肝细胞系AML12获得pCore-AML12细胞，将pCore-AML12细胞在嘌呤霉素筛选下进行连续传代培养得到的稳定传代细胞。
本发明还请求保护：前述的质粒pcore-HU-SMAR，或者前述的靶向HBV核心启动子的药物筛选细胞模型，在筛选能抑制HBV核心启动子转录和/或HBV复制的化合物中的应用。
本发明还请求保护：Triciribine及其结构类似物，在制备抑制HBV核心启动子转录和/或HBV复制的药物中的应用，或在制备治疗乙型肝炎的药物中的应用。
所述Triciribine的结构类似物为5-Iodotubercidin或Tubercidin。
所述Triciribine的结构类似物为5-Iodotubercidin。
本发明的有益效果是：本发明构建的靶向HBV核心启动子转录的抗HBV药物筛选细胞模型，能够专用于筛选抑制核心启动子转录活性的药物，利用该药物筛选模型，筛选到能有效抑制核心启动子转录活性的化合物Triciribine，及其结构类似物5-Iodotubercidin和Tubercidin，从而提供了新的靶向HBV cccDNA的化合物，有望成为乙肝治疗新型药物。
附图说明
图1是pcore-HU-SMAR质粒结构示意图。
图2是pCore-AML12细胞的构建流程(图A)与鉴定结果(图B)。
图3是化合物筛选流程(图A)及3种化合物的抑制效应(图B)。
图4是3种化合物的进一步鉴定结果(图A、C)和Triciribine的结构式(图B)。
图5是Triciribine药理作用实验Southern blot检测结果。
图6是5种Triciribine的结构类似物的结构式(图A)与筛选结果(图B)。
图7是5-Iodotubercidin抑制HBV转基因小鼠体内HBV复制实验中细胞内core DNA的Southern blot检测、细胞内HBV RNA Northern blot进行检测的结果。
图8是Triciribine和5-Iodotubercidin抑制HBV复制的动物实验，其中，图A是实验流程示意图，图B是血清HBV DNA检测结果，图C是血清HBV RNA检测结果，图D是血清HBsAg检测结果，图E是血清HBeAg检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
本申请实施例所用主要试剂和材料来源：
质粒模板PCH9/3091由德国弗莱堡大学Michael Nassal构建；
质粒模板pCMV-Gluc：New England Biolabs公司，美国；
UnaG基因：由上海生工生物工程公司合成；
HepG2-NTCP细胞(厦门大学夏宁绍实验室赠送)；
2×PrimeSTAR HS Mix：Takara公司，日本；
胶回收试剂盒、基因组DNA提取试剂盒：QIAGEN公司，德国；
大肠杆菌JM109、NanoGlo Hibit Lytic Detection System:Promega公司，美国；
BsmB I、Tango buffer、DTT、Puromycin：Thermo scientific公司，美国；
化合物库(包含本发明实施例中用到的senoside C-K，Triciribine、Cycloheximide、Adenosine,Reversine,SCH58261,5-Iodotubercidin和Tubercidin等672种化合物):MCE公司，美国；
ATP、T7 DNA ligase、质粒PCMV-Gluc：New England Biolabs公司，美国；
Southern blot、Northern blot检测试剂盒、逆转录试剂盒、QPCR试剂盒：Roche公司，德国；
HBV表面抗原、E抗原检测试剂盒：上海科华生物工程公司，中国；
AML12细胞：美国模式菌种收集中心；
其余试剂如未特殊表明，均为本领域常规试剂，均可商购获得。
本发明实施例中所用扩增引物序列如下表1所示：
表1.本发明实施例中所用引物序列
Figure BDA0003002406970000051
实施例一、靶向HBV核心启动子的药物筛选细胞模型构建
1、设计思路与工作原理
HBV核心启动子发挥作用是在cccDNA上，而cccDNA以独立于细胞染色体的微染色体的形式存在于细胞中。在这一点上，所有基于转基因(整合于细胞染色体)的细胞模型都与实际情况存在差距。为了更好地模拟cccDNA转录事件，最好将核心启动子置于染色体之外。
基于质粒载体(或类质粒)转染的cccDNA模拟系统，如mcHBV-Gluc cccDNA模型，以及基于Fluc的整合缺陷的慢病毒载体系统(integration-deficient lentiviral vectorof Fluc)等，的确是位于染色外的，但其显著缺陷，是cccDNA模拟分子不能复制，而是随着细胞的分裂而逐渐丢失，无法稳定存在。这导致每次实验均需转染或者感染步骤，继而造成实验系统更不稳定，同时成本更高。
针对这些问题，我们基于SMAR序列(Nucleic Acids Res,1999,27(2):426-428.)设计构建了一种可复制的微染色体系统。SMAR是位于人IFNβ基因上游的一段长度约2k的序列，当SMAR序列插入质粒的表达基因与polyA序列之间时，所转染的质粒能在细胞中长期稳定存在(数量为2-10拷贝/细胞，与cccDNA类似)，且不整合到染色体中。我们构建的微染色体模拟分子主要结构包括：由HBV核心启动子驱动表达的荧光素酶标签HiBiT和荧光蛋白报告基因UnaG(Cell.2013,153(7),1602-1611.)，嘌呤霉素抗性基因，以及位于polyA序列之前的SMAR序列。该质粒转染后，将能长期稳定地以独立于染色体的形态存在于细胞中，同时，该质粒将表达由HBV核心启动子驱动的报告基因，能方便地用于高通量药物筛选。
2、pcore-HU-SMAR微染色体模拟分子构建
分三步构建质粒pcore-HU-SMAR，该质粒包含由HBV核心启动子驱动表达的HiBiT-unaG融合基因，该基因通过T2A序列与嘌呤霉素抗性基因相连，同时，在嘌呤霉素抗性基因和polyA序列之间，还包含SMAR序列(结构如图1所示)，以支持该质粒在细胞中的复制。具体构建过程如下：
(1)质粒puro-SMAR构建
以质粒PCH9-puro(见文献Antimicrob Agents Chemother.2018,62(12)Nov 26；62(12):e01302-18.)为模板，用引物R puro+F SV40GG2扩增载体片段，反应体系为：质粒PCH9-puro 10ng，引物Rpuro(10μM)及F SV40GG2(10μM)各1μl，2×PrimeSTAR HS Mix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃ 15s，58℃ 15s，72℃1m30s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag1。以HepG2细胞基因组DNA为模板，用引物F SMAR+R SMAR扩增SMAR序列。反应体系为：基因组DNA 1μg，引物F SMAR(10μM)及R SMAR(10μM)各1μl，2×PrimeSTAR HS Mix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性5min；94℃ 20s，56℃ 15s，72℃ 45s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag2。
将以上得到的两个片段frag1、frag2做Golden gate连接反应，反应体系为：
Figure BDA0003002406970000061
Figure BDA0003002406970000071
反应条件：37℃ 5min，20℃ 5min，循环25次。80℃ 20min灭活反应。
Golden gate产物转化JM109感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定，正确的克隆命名为质粒puro-SMAR。
(2)质粒pcore-UnaG构建
以质粒PCH9/3091(J Virol.1992,66:4107-16.)为模板，扩增包含增强子I，增强子II(CURS)和基本核心启动子(BCP)的区域。反应体系为：质粒PCH9/3091 10ng，引物F1070GG(10μM)及R1901GG(10μM)各1μl，2×PrimeSTAR HS Mix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃ 15s，58℃ 15s，72℃ 30s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag3。
以合成的UnaG基因(上海生工生物工程公司合成)为模板，用引物F UnaG+R UnaG扩增UnaG基因片段。反应体系为：含UnaG基因的质粒10ng，引物F UnaG(10μM)及R UnaG(10μM)各1μl，2×PrimeSTAR HS Mix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃ 15s，55℃ 15s，72℃ 15s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag4。
以质粒PCMV-Gluc为模板，用引物F SV40+R CMV扩增载体片段。反应体系为：质粒PCMV-Gluc 10ng，引物F SV40(10μM)及R CMV(10μM)各1μl，2×PrimeSTAR HS Mix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃ 15s，58℃ 15s，72℃ 1m，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag5。
将以上得到的三个片段frag3、frag4、frag5做Golden gate连接反应，反应体系为：
Figure BDA0003002406970000072
Figure BDA0003002406970000081
反应条件：37℃ 5min，20℃ 5min，循环25次。80℃ 20min灭活反应。
Golden gate产物转化JM109感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定，正确的克隆命名为质粒pcore-UnaG。
(3)质粒pcore-HiBiT-UnaG构建
以质粒pcore-UnaG为模板，用引物F UnaG2+R 1901H扩增载体片段。反应体系为：质粒pcore-UnaG 10ng，引物F UnaG2(10μM)及R 1901H(10μM)各1μl，2×PrimeSTARHS Mix25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃ 15s，58℃ 15s，72℃30s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag6。
以质粒RFP-47G4S-HBc(即为中国专利ZL 201510075723.2中的质粒RFP-47G4S-HBc)为模板，用引物F H-GS+R GS GG扩增包含甘氨酸-丝氨酸接头序列的片段。反应体系为：质粒RFP-47G4S-HBc 10ng，引物F H-GS(10μM)及R GS GG(10μM)各1μl，2×PrimeSTARHS Mix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃ 15s，58℃15s，72℃ 30s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag7。
将以上得到的两个片段frag6、frag7做Golden gate连接反应，反应体系为：
H<sub>2</sub>O 2μl
BsmB I酶 0.75μl
Tango buffer 1μl
DTT 1μl
T7 DNA ligase 0.25μl
ATP 1μl
Frag6 2μl(50ng)
Frag7 2μl(20ng)
总体积 10μl
反应条件：37℃ 5min，20℃ 5min，循环25次。80℃ 20min灭活反应。
Golden gate产物转化JM109感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定，正确的克隆命名为质粒pcore-HiBiT-UnaG。
(4)质粒pcore-HU-SMAR构建
以质粒pcore-HiBit-UnaG为模板，用引物R UnaG-2A+F SV40GG扩增DNA片段。反应体系为：质粒pcore-UnaG 10ng，引物R UnaG-2A(10μM)及F SV40GG(10μM)各1μl，2×PrimeSTAR HS Mix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，58℃ 15s，72℃ 1m30s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag8。
以质粒puro-SMAR为模板，用引物F puro-2A+R SMAR 2扩增DNA片段。反应体系为：质粒puro-SMAR 10ng，引物F puro-2A(10μM)及R SMAR 2(10μM)各1μl，2×PrimeSTAR HSMix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃ 15s，56℃ 15s，72℃ 1m，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag9。
将以上得到的两个片段frag8、frag9做Golden gate连接反应，反应体系为：
H<sub>2</sub>O 3μl
BsmB I酶 0.75μl
Tango buffer 1μl
DTT 1μl
T7 DNA ligase 0.25μl
ATP 1μl
Frag8 1μl(50ng)
Frag9 2μl(30ng)
总体积 10μl
反应条件：37℃ 5min，20℃ 5min，循环25次。80℃ 20min灭活反应。
Golden gate产物转化JM109感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定，正确的克隆命名为质粒pcore-HU-SMAR。
3、pcore-HU-SMAR稳定传代细胞构建与鉴定
将构建好的质粒pcore-HU-SMAR分别转染人肝癌细胞系HepG2和永生化小鼠肝细胞系AML12，转染后48小时，开始用0.4μg/ml嘌呤霉素进行筛选(流程见图2A)。筛选约2周后，具有抗性的AML12细胞增殖较好，而HepG2细胞尽管存在具有抗性的细胞，但几乎不再增殖。我们将获得的AML12细胞命名为pCore-AML12，并对其作进一步鉴定。
将pCore-AML12细胞进行连续传代培养，传代间隔为3天，总共传40代，每传代5次后，在荧光显微镜下观察细胞中荧光蛋白UnaG表达情况，同时，取数量约为105的细胞，检测其HiBiT标签融合蛋白表达情况。结果显示，在30代以内，无论是UnaG还是HiBiT都得到了稳定表达(结果如图2B)，提示稳定传代细胞构建成功。
实施例二、靶向HBV转录的化合物筛选
1、化合物初筛
在获得稳定传代细胞pCore-AML12后，即将其用于化合物筛选。筛选流程如下：复苏pCore-AML12细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养于10cm培养皿中(采用常规方法培养)。细胞传代3次后，生长状态较佳时，将细胞消化并接种到96孔板。细胞接种后第二天，将待测化合物分别加入96孔板中，终浓度为5μM，每种化合物做2个复孔。加药后约48小时，吸去培养基，每孔加入细胞裂解液，室温摇动孵育20min，然后取裂解液用HiBiT检测试剂进行检测(流程如图3A所示)。
我们首先对672种化合物进行初筛，发现能使HiBiT活性降低2倍或以上，且表现出剂量依赖性的化合物共有3种，分别是：senoside C-K，Triciribine(曲西瑞宾)和Cycloheximide(环己酰亚胺)。这三种化合物抑制荧光素酶活性的EC50(图3B)分别为17.1±5.1μM，2.1±1.2μM和9.9±0.75μM。为进一步鉴定，将这三种化合物分别用不同浓度处理HepG2.2.15细胞，处理5天后，提取细胞内核心颗粒HBV DNA(core DNA)，并用Southernblot检测。结果(图4A)显示，这三种化合物中，Triciribine(结构式如图4B)表现出较好的抑制HBV DNA复制的趋势，且该效应与细胞毒性能明显区分开，CC50＝55.9μM(图4C)。
2、Triciribine药理作用的进一步鉴定
为了进一步确认Triciribine作用环节，首先用不同浓度药物处理HepG2.2.15细胞，处理5天后，提取细胞内core DNA，并用Southern blot方法进行检测；同时，提取细胞内总RNA，并用Northern blot方法进行检测。结果显示，随着Triciribine浓度增加，细胞内core DNA逐渐降低(图5A)，同时细胞内HBV RNA水平也逐渐降低(图5C)。接下来，我们在HBV感染后的HepG2-NTCP细胞(厦门大学夏宁绍实验室赠送)中进行类似实验，同样发现Triciribine能剂量依赖性地降低细胞内core DNA水平(图5B)，同时也能降低细胞内HBVRNA水平和培养上清中的HBeAg水平(图5D)。这些结果提示，Triciribine在细胞模型的确能抑制HBV DNA复制，且可能通过抑制HBV RNA来发挥作用。
3、Triciribine的结构类似物5-Iodotubercidin能抑制pcore转录活性
为了获得活性更高的化合物，我们对5种Triciribine的结构类似物进行了测试，这几种化合物分别是Adenosine,Reversine,SCH58261,5-Iodotubercidin和Tubercidin(图6A)。测试过程如下：将质粒pCMV-HiBiT-GFP和pCore-3xFlag-HBc共转染HepG2细胞，转染后第二天开始，用不同浓度药物处理细胞，3天后，收集和裂解细胞，然后用Western blot检测裂解液中的3xFlag-HBc(见文献Antimicrob Agents Chemother.2018,62(12)Nov26；62(12):e01302-18.)，同时用HiBiT-GFP(见文献Antimicrob Agents Chemother.2018,62(12)Nov 26；62(12):e01302-18.)作为参照。结果显示，在这几种药物中，5-Iodotubercidin和Tubercidin能较特异性地降低由pCore(核心启动子)驱动的3xFlag-HBc的表达，而不显著影响由pCMV驱动的HiBiT-GFP的表达。二者中，以5-Iodotubercidin的活性更强(图6B)。
4、5-Iodotubercidin通过抑制HBV RNA来抑制HBV DNA复制
为了进一步评价5-Iodotubercidin的作用，首先用不同浓度药物处理HepG2.2.15细胞，处理5天后，提取细胞内core DNA，并用Southern blot进行检测；同时，提取细胞内总RNA，并用Northern blot进行检测。结果显示，随着5-Iodotubercidin浓度增加，细胞内core DNA逐渐降低(图7A)，同时细胞内HBV RNA水平也逐渐降低(图7B)。在HBV感染后的HepG2-NTCP细胞中进行类似实验，同样发现5-Iodotubercidin能剂量依赖性地降低细胞内core DNA水平，同时也能降低细胞内HBV RNA水平和培养上清中的HBeAg水平(图7C、7D)。这些结果提示，5-Iodotubercidin通过抑制HBV RNA来发挥抑制HBV DNA复制的作用。
5、Triciribine和5-Iodotubercidin抑制HBV转基因小鼠体内HBV复制
我们进一步在HBV转基因小鼠中评价了Triciribine和5-Iodotubercidin对HBV复制的影响。将20只C57/HBV1.2转基因小鼠(厦门大学夏宁绍实验室赠送)随机分为4组，分别3种药物和对照处理：恩替卡韦(每日灌胃给药0.05mg/kg)、Triciribine(每日腹腔注射给药2mg/kg)、5-Iodotubercidin(每日腹腔注射给药2mg/kg)、DMSO(等体积每日腹腔注射)。总共处理15天，期间每隔5天采血，测量血清HBsAg和HBeAg的变化情况，最后一次血清样本检测HBV DNA和HBV RNA(流程见图8A)。结果(图8B)显示，处理15天后，与对照组相比，恩替卡韦，Triciribine和5-Iodotubercidin处理组，HBV DNA均显著降低，降低幅度恩替卡韦>5-Iodotubercidin>Triciribine。恩替卡韦不能显著降低血清HBV RNA水平，但Triciribine和5-Iodotubercidin均能减少HBV RNA(图8C)。此外，与阴性对照和恩替卡韦相比，Triciribine和5-Iodotubercidin还能显著降低血清HBsAg和HBeAg水平(图8D、8E)。这些结果提示，Triciribine和5-Iodotubercidin能抑制HBV转基因小鼠模型中HBV的复制，且与核苷类似物相比，还能降低血清HBV RNA、HBsAg和HBeAg，因而具有较好的潜在应用价值。
序列表
<110> 重庆医科大学
<120> 靶向HBV核心启动子的药物筛选细胞模型、Triciribine及结构类似物新应用
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 852
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> HBV核心启动子序列
<400> 1
cgttgatgcc tttgtatgca tgtattcaat ctaagcaggc tttcactttc tcgccaactt 60
acaaggcctt tctgtgtaaa caatacctga acctttaccc cgttgcccgg caacggccag 120
gtctgtgcca agtgtttgct gacgcaaccc ccactggctg gggcttggtc atgggccatc 180
agcgcatgcg tggaaccttt tcggctcctc tgccgatcca tactgcggaa ctcctagccg 240
cttgttttgc tcgcagcagg tctggagcaa acattatcgg gactgataac tctgttgtcc 300
tatcccgcaa atatacatcg tttccatggc tgctaggctg tgctgccaac tggatcctgc 360
gcgggacgtc ctttgtttac gtcccgtcgg cgctgaatcc tgcggacgac ccttctcggg 420
gtcgcttggg actctctcgt ccccttctcc gtctgccgtt ccgaccgacc acggggcgca 480
cctctcttta cgcggactcc ccgtctgtgc cttctcatct gccggaccgt gtgcacttcg 540
cttcacctct gcacgtcgca tggagaccac cgtgaacgcc caccaaatat tgcccaaggt 600
cttacataag aggactcttg gactctcagc aatgtcaacg accgaccttg aggcatactt 660
caaagactgt ttgtttaaag actgggagga gttgggggag gagattaggt taaaggtctt 720
tgtactagga ggctgtaggc ataaattggt ctgcgcacca gcaccatgca actttttcac 780
ctctgcctaa tcatctcttg ttcgagtcct actgttcaag cctccaagct gtgccttggg 840
tggctttggg gc 852
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> HiBiT序列
<400> 2
atggtgagcg gctggcggct gttcaagaag attagc 36
<210> 3
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> G4S接头序列
<400> 3
cgttcgtctg gatcaggcgg tggcggttca ggaggtggtg gctcaggcgg aggaggttcc 60
ggtggcggcg gcagtggtgg tggaggctct ggtggtggag gctctggagg cggaggatct 120
ggaggaggtg gatct 135
<210> 4
<211> 417
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> UnaG序列
<400> 4
atgctggaaa aattcgtcgg cacttggaag atcgccgaca gccacaactt cggcgagtac 60
ctgaaggcca tcggcgcccc caaggagctg tctgacggcg gcgacgccac cactcccacc 120
ctgtatatct cccagaaaga cggcgacaag atgaccgtga agatcgagaa cggccccccc 180
actttcctgg acacccaggt aaagttcaag ctgggcgagg agttcgacga gttccccagc 240
gaccgccgca agggcgtgaa gagcgtcgtg aacctggtgg gggaaaagct ggtgtatgtg 300
caaaagtggg atgggaagga gaccacctac gtgcgcgaga tcaaggatgg caagctggtc 360
gtgaccctca ccatgggcga cgtggtggcc gtccgcagct accgtcgcgc caccgag 417
<210> 5
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> T2A序列
<400> 5
gattctggca gtggagaggg cagaggaagt ctgctaacat gcggtgacgt cgaggagaat 60
cctggccca 69
<210> 6
<211> 600
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 嘌呤霉素抗性基因序列
<400> 6
atgaccgagt acaagcccac ggtgcgcctc gccacccgcg acgacgtccc cagggccgta 60
cgcaccctcg ccgccgcgtt cgccgactac cccgccacgc gccacaccgt cgatccggac 120
cgccacatcg agcgggtcac cgagctgcaa gaactcttcc tcacgcgcgt cgggctcgac 180
atcggcaagg tgtgggtcgc ggacgacggc gccgcggtgg cggtctggac cacgccggag 240
agcgtcgaag cgggggcggt gttcgccgag atcggcccgc gcatggccga gttgagcggt 300
tcccggctgg ccgcgcagca acagatggaa ggcctcctgg cgccgcaccg gcccaaggag 360
cccgcgtggt tcctggccac cgtcggagtc tcgcccgacc accagggcaa gggtctgggc 420
agcgccgtcg tgctccccgg agtggaggcg gccgagcgcg ccggggtgcc cgccttcctg 480
gagacctccg cgccccgcaa cctccccttc tacgagcggc tcggcttcac cgtcaccgcc 540
gacgtcgagg tgcccgaagg accgcgcacc tggtgcatga cccgcaagcc cggtgcctga 600
<210> 7
<211> 2227
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> SMAR序列
<400> 7
cagcaaggtc gccacgcaca agatcaatat taacaatcag tcatctctct ttagcaataa 60
aaaggtgaaa aattacattt taaaaatgac accatagacg atgtatgaaa ataatctact 120
tggaaataaa tctaggcaaa gaagtgcaag actgttaccc agaaaactta caaattgtaa 180
atgagaggtt agtgaagatt taaatgaatg aagatctaaa taaacttata aattgtgaga 240
gaaattaatg aatgtctaag ttaatgcaga aacggagaga catactatat tcatgaacta 300
aaagacttaa tattgtgaag gtatactttc tttccacata aatttgtagt caatatgttc 360
accccaaaaa agctgtttgt taacttgcca acctcattct aaaatgtata tagaagccca 420
aaagacaata acaaaaatat tcttgtagaa caaaatggga aagaatgttc cactaaatat 480
caagatttag agcaaagcat gagatgtgtg gggatagaca gtgaggctga taaaatagag 540
tagagctcag aaacagaccc attgatatat gtaagtgacc tatgaaaaaa atatggcatt 600
ttacaatggg aaaatgatga tctttttctt ttttagaaaa acagggaaat atatttatat 660
gtaaaaaata aaagggaacc catatgtcat accatacaca caaaaaaatt ccagtgaatt 720
ataagtctaa atggagaagg caaaacttta aatcttttag aaaataatat agaagcatgc 780
catcatgact tcagtgtaga gaaaaatttc ttatgactca aagtcctaac cacaaagaaa 840
agattgttaa ttagattgca tgaatattaa gacttatttt taaaattaaa aaaccattaa 900
gaaaagtcag gccatagaat gacagaaaat atttgcaaca ccccagtaaa gagaattgta 960
atatgcagat tataaaaaga agtcttacaa atcagtaaaa aataaaacta gacaaaaatt 1020
tgaacagatg aaagagaaac tctaaataat cattacacat gagaaactca atctcagaaa 1080
tcagagaact atcattgcat atacactaaa ttagagaaat attaaaaggc taagtaacat 1140
ctgtggcaat attgatggta tataaccttg atatgatgtg atgagaacag tactttaccc 1200
catgggcttc ctccccaaac ccttacccca gtataaatca tgacaaatat actttaaaaa 1260
ccattaccct atatctaacc agtactcctc aaaactgtca aggtcatcaa aaataagaaa 1320
agtctgagga actgtcaaaa ctaagaggaa cccaaggaga catgagaatt atatgtaatg 1380
tggcattctg aatgagatcc cagaacagaa aaagaacagt agctaaaaaa ctaatgaaat 1440
ataaataaag tttgaacttt agtttttttt aaaaaagagt agcattaaca cggcaaagcc 1500
attttcatat ttttcttgaa cattaagtac aagtctataa ttaaaaattt tttaaatgta 1560
gtctggaaca ttgccagaaa cagaagtaca acagctatct gtgctgtcgc ctaactatcc 1620
atagctgatt ggtctaaaat gagatacatc aacgctcctc catgtttttt gttttctttt 1680
taaatgaaaa actttatttt ttaagaggag tttcaggttc atagcaaaat tgagaggaag 1740
gtacattcaa gctgaggaag ttttcctcta ttcctagttt actgagagat tgcatcatga 1800
atgggtgtta aattttgtca aatgcttttt ctgtgtctat caatatgacc atgtgatttt 1860
cttctttaac ctgttgatgg gacaaattac gttaattgat tttcaaacgt tgaaccaccc 1920
ttacatatct ggaataaatt ctacttggtt gtggtgtata ttttttgata cattcttgga 1980
ttctttttgc taatattttg ttgaaaatgt ttgtatcttt gttcatgaga gatattggtc 2040
tgttgttttc ttttcttgta atgtcatttt ctagttccgg tattaaggta atgctggcct 2100
agttgaatga tttaggaagt attccctctg cttctgtctt ctgaaagaga ttgtagaaag 2160
ttgatacaat ttttttttct ttaaatattt gatagaattc actagtgaac ccatctgggc 2220
attgtgc 2227
<210> 8
<211> 2710
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 载体骨架序列
<400> 8
gcgggactct ggggttcgaa atgaccgacc aagcgacgcc caacctgcca tcacgagatt 60
tcgattccac cgccgccttc tatgaaaggt tgggcttcgg aatcgttttc cgggacgccg 120
gctggatgat cctccagcgc ggggatctca tgctggagtt cttcgcccac cccaacttgt 180
ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag 240
catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg 300
tctgtatacc gtcgacctct agctagagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg 360
tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta 420
aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg 480
ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga 540
gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg 600
tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag 660
aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc 720
gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca 780
aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt 840
ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc 900
tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca atgctcacgc tgtaggtatc 960
tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc 1020
ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact 1080
tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg 1140
ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta 1200
tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca 1260
aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa 1320
aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg 1380
aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc 1440
ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg 1500
acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat 1560
ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg 1620
gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa 1680
taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca 1740
tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc 1800
gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt 1860
cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa 1920
aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat 1980
cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct 2040
tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga 2100
gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag 2160
tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga 2220
gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca 2280
ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg 2340
cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc 2400
agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag 2460
gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt cgacggatcg ggagatctcc 2520
cgatccccta tggtcgactc tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt taagccagta 2580
tctgctccct gcttgtgtgt tggaggtcgc tgagtagtgc gcgagcaaaa tttaagctac 2640
aacaaggcaa ggcttgaccg acaattgcat gaagaatctg cttagggtta ggcgttttgc 2700
gctgcttcgc 2710
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物
<400> 9
tcgtctcagc tgtcaggcac cgggcttgcg ggt 33
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物
<400> 10
acgtctctgt gcctggccgc gactctagat cat 33
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物
<400> 11
tcgtctcaca gcaaggtcgc cacgcac 27
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物
<400> 12
tcgtctcagc acaatgccca gatgggttc 29
<210> 13
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物
<400> 13
gctgaccgtc tcccgttgat gcctttgtat gcatgt 36
<210> 14
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物
<400> 14
tcgtctcaag atgccccaaa gccacccaag gca 33
<210> 15
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物
<400> 15
cgtctcaatc tatgctggaa aaattcgtcg gcac 34
<210> 16
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物
<400> 16
tcgtctcaaa tcctcggtgg cgcgac 26
<210> 17
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物
<400> 17
tcgtctcaga ttgcgggact ctggggttcg a 31
<210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物
<400> 18
tcgtctcaaa cggcgaagca gcgcaaaacg cct 33
<210> 19
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物
<400> 19
tcgtctcaat ctatgctgga aaaattcgtc ggca 34
<210> 20
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物
<400> 20
acgtctcaaa cagccgccag ccgctcacca tgccccaaag ccacccaagg ca 52
<210> 21
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物
<400> 21
tcgtctcatg ttcaagaaga ttagccgttc gtctggatca ggcggtg 47
<210> 22
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物
<400> 22
acgtctcaag atccacctcc tccagatcct c 31
<210> 23
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物
<400> 23
acgtctcata gcagacttcc tctgccctct ccactgccag aatcctcggt ggcgcgacgg 60
tagctg 66
<210> 24
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物
<400> 24
tcgtctcagt gcgcgggact ctggggttcg aaatg 35
<210> 25
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物
<400> 25
tcgtctcagc taacatgcgg tgacgtcgag gagaatcctg gcccaatgac cgagtacaag 60
cccacg 66
<210> 26
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物
<400> 26
acgtctcagc acaatgccca gatgggttca c 31

Claims (2)

1.Triciribine及其结构类似物在制备抑制HBV核心启动子转录和/或HBV复制的药物中的应用，或在制备治疗乙型肝炎的药物中的应用，所述Triciribine的结构类似物为5-Iodotubercidin或Tubercidin。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述Triciribine的结构类似物为5-Iodotubercidin。
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