CN107446034B - 一组荧光蛋白探针及其制备方法和应用 - Google Patents

一组荧光蛋白探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一组荧光蛋白探针及其制备方法和应用，属于氧化还原的检测探针技术领域。本发明提供了一组荧光蛋白探针，所述荧光蛋白探针为含半胱氨酸对突变的鳗鱼荧光蛋白UnaG。本发明提供的荧光蛋白探针能够实现氧化还原的高特异性、高敏感性检测。

Description

一组荧光蛋白探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及氧化还原的检测探针技术领域，尤其涉及一组荧光蛋白探针及其制备方法和应用。
背景技术
活性氧(Reactive oxygen species，ROS)是一类有高活性的含氧化合物。包括过氧化物，超氧化物，羟基自由基，单线态氧等。其可以在细胞内多种细胞器中产生，如线粒体，内质网(特别是内质网应激的情况下)等，还与多种氧化酶和氧合酶相关。ROS对细胞有双重作用。一方面，其导致细胞内脂质体，蛋白和DNA的氧化，并引起有害生物分子的积累。这些损伤和被氧化的生物分子反过来促成了多种病理过程，包括恶性疾病，糖尿病，动脉硬化，缺血再灌注伤害和慢性炎症过程以及很多的神经萎缩性疾病等，且多样的活性氧源产生的氧化损伤系统性积累驱动了衰老的过程。另一方面，也有越来越多的研究表明，ROS可以在特定的信号通路，如代谢调控，天然免疫，干细胞生物学，癌症的发病机制，衰老的发生等过程中发挥一定的功能。为了更好地研究细胞内氧化还原状态与生命调控及疾病发生发展之间的关系，亟需发展高效特异性和敏感性的工具，对细胞内的氧化还原动态变化、亚细胞分布等进行精确检测。
相比于化学小分子荧光探针，基因编码的荧光蛋白探针在精确定位亚细胞结构，消除人为干扰，以及活体应用方面具有很大优势，因此基于荧光蛋白的生物传感器特别适合用于细胞内氧化还原的原位时空特异性监测。目前常用的可用于监测细胞内氧化还原水平的荧光蛋白探针包括：过氧化氢荧光蛋白探针HyPer系列和Orp1-roGFP2，巯基类氧化还原荧光蛋白探针rxYFP、roGFP家族、rxRFP以及Grx1-roGFP2等。
鳗鱼肌肉蛋白UnaG是近期在日本河鳗中发现的一种有高荧光强度的蛋白。UnaG属于脂肪酸结合蛋白家族，其在河鳗中的表达受到小直径肌纤维的限制。相比于GFP及其相关的蛋白，UnaG不依赖于分子氧来实现达到荧光状态。UnaG不能自主发挥功能，需要结合一个辅因子即胆红素Bilirubin来迅速的产生其独特的绿色荧光。Bilirubin是一种可跨膜的亚铁血红素代谢物，也是一种临床健康的生物标志。对于酵母等不能天然产生Bilirubin的微生物，UnaG的发光机制让其成为临床诊断和基本研究中的一种有高度选择性的“开关”荧光探针。
维持细胞内氧化还原状态，对于调控多种生理功能，有重要的意义。而现有的检测氧化还原的工具都有一些不足。化学探针，如Dichlorofluorescein，虽然被广泛的用于检测活细胞中的活性氧，但其受到人为干扰、体内应用、亚细胞定位等因素的限制。而前面提到的氧化还原荧光蛋白探针，如rxYFP，roGFP，HyPer等，虽然可以应用于活细胞和亚细胞水平的检测，但这些探针都基于水母荧光蛋白GFP家族，在缺氧的情况下，无法正确成熟和荧光生成，影响了其在肿瘤、组织缺血再灌注等乏氧条件下的应用。此外，基于水母荧光蛋白GFP家族发展的大部分探针易受pH波动的影响，为氧化还原状态的精准解析带来很大困难。
UnaG的荧光生成不依赖于氧气、且不受pH波动的影响，很好的克服了以上缺陷。但UnaG荧光蛋白本身对氧化还原是不敏感的，即UnaG不会受环境中的氧化还原状态波动而导致荧光强度的变化，这限制了UnaG在不同生物环境中对氧化还原状态的检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一组荧光蛋白探针及其制备方法和应用。本发明提供的荧光蛋白探针能够实现氧化还原的高特异性、高敏感性检测。
本发明提供了一组荧光蛋白探针，所述荧光蛋白探针为含半胱氨酸对突变的鳗鱼荧光蛋白UnaG。
优选的是，所述鳗鱼荧光蛋白UnaG的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的是，所述突变的半胱氨酸对的数量至少为1对。
优选的是，所述半胱氨酸对在UnaG蛋白中的突变位点包括：6/44、12/133、15/131、22/31、40/56、42/54、44/52、52/68、56/64、54/66、76/87、87/102、91/98、96/113、98/111、100/109、102/107、109/124、111/122、113/120、120/133、122/131和124/129位点中的一对或多对。
优选的是，所述荧光蛋白探针中半胱氨酸对附近的氨基酸存在侧链理性突变。
优选的是，当半胱氨酸对在UnaG蛋白中的突变位点为56/64时，第54位氨基酸K侧链理性突变为T、A、S、G、D、V、N、E、Q、L或I，对应的荧光蛋白探针分别为roUnaG 56/64 K54T、roUnaG 56/64 K54A、roUnaG 56/64 K54S、roUnaG 56/64 K54G、roUnaG 56/64 K54D、roUnaG 56/64 K54V、roUnaG 56/64 K54N、roUnaG 56/64 K54E、roUnaG 56/64 K54Q、roUnaG 56/64 K54L和roUnaG 56/64K54I，序列分别如SEQ ID NO.9-19所示。
本发明还提供了上述技术方案所述荧光蛋白探针的核苷酸序列。
本发明还提供了含上述技术方案所述核苷酸序列的表达载体，包括载体和上述技术方案所述核苷酸序列的片段。
本发明还提供了上述技术方案所述表达载体的宿主细胞。
本发明还提供了包括上述技术方案所述的荧光蛋白探针的氧化还原检测试剂盒。
本发明还提供了上述技术方案所述荧光蛋白探针在检测氧化还原中的应用。
本发明提供了一组荧光蛋白探针。本发明通过将UnaG基因的部分核苷酸用半胱氨酸对替换，通过UnaG结构的变化导致荧光蛋白荧光强度的变化，最后得到氧化还原敏感荧光探针。本发明获得的荧光蛋白探针是非氧气依赖的、可诱导荧光的、氧化还原敏感荧光蛋白，能够实现对氧化还原时空特异性检测。本发明的荧光蛋白探针能够在体内、体外、原位水平检测氧化还原，蛋白探针相对较小且易于成熟，荧光动态变化大，是一种适合于生理水平的实时检测氧化还原的探针。
附图说明
图1为本发明实施例2提供的含半胱氨酸对突变的UnaG蛋白筛选结果图；
图2为本发明实施例3提供的roUnaG 56/64的二硫键快速响应突变体的筛选结果图；
图3为本发明实施例4提供的roUnaG 56/64 K54T的工作原理和纯化的roUnaG 56/64 K54T蛋白质的SDS-PAGE结果图；
图4为本发明实施例4提供的roUnaG 56/64 K54T蛋白质的性质结果图，其中，图4A为荧光光谱性质结果图，图4B为氧化还原滴定结果图；
图5为本发明实施例5提供的roUnaG 56/64 K54T荧光探针与HyPer比较pH敏感性检测结果图；
图6为本发明实施例6提供的roUnaG 56/64 K54T荧光探针与其他氧化还原荧光蛋白探针在正常氧及乏氧条件下对氧化剂或还原剂响应情况比较的结果图，其中，图6A为表达roUnaG 56/64 K54T、roGFP1、HyPer以及rxRFP的BL21细胞在正常氧及乏氧条件下的荧光值对比图，图6B-D分别为BL21细胞表达roUnaG 56/64 K54T、roGFP1、HyPer以及rxRFP后在正常氧和乏氧条件下对氧化剂或还原剂刺激的响应情况；
图7为实施例7提供的roUnaG 56/64 K54T对大肠杆菌氧化还原势进行原位实时检测结果图，其中，图7A为表达roUnaG 56/64 K54T的大肠杆菌对胆红素Bilirubin的依赖性结果图，图7B为原位实时检测大肠杆菌中表达的roUnaG 56/64 K54T荧光变化结果图；
图8为本发明实施例7提供的roUnaG 56/64 K54T对哺乳动物细胞HeLa中的氧化还原势进行时空特异性检测结果图，其中，图8A为roUnaG 56/64 K54T在HeLa细胞中不同亚细胞器定位结果图，图8B为细胞质定位和线粒体定位的roUnaG 56/64 K54T对氧化剂Diamide和还原剂DTT加入的荧光强度变化的响应结果图；
图9为本发明实施例8提供的roUnaG/mCherry比率型氧化还原敏感探针对哺乳动物细胞HeLa中的氧化还原势进行时空特异性检测结果图，其中图9A为细胞浆中表达roUnaG/mCherry的HeLa细胞在依次加入胆红素Bilirubin，氧化剂Diamide，还原剂DTT的荧光成像图，图9B为图9A中的成像图片中按照左上标记，分别圈定整个细胞、细胞浆和细胞核的ROI(Region of Interest，感兴趣的区域)，获得ROI的roUnaG的绿色荧光比mCherry的红色荧光比值时间序列图。
具体实施方式
本发明提供了一组荧光蛋白探针，所述荧光蛋白探针为含半胱氨酸对突变的鳗鱼荧光蛋白UnaG。
在本发明中，所述突变指将编码UnaG荧光蛋白的相邻氨基酸残基对应的核苷酸转变为编码半胱氨酸的密码子。本发明对所述转变的方法没有特殊的限定，可以是采用分子生物学的方法，如本发明优选采用反向PCR方法来实现氨基酸的突变，即通过一对特异性的引物与突变位点的蛋白序列两端匹配，这样通过反向PCR扩增就可以产生含有突变位点核苷酸的线性化质粒，之后形成的重组质粒编码产生的蛋白就含有特定突变的氨基酸。或者可以采用物理诱变或化学诱变方法，如辐射或添加诱变剂。
在本发明中，所述半胱氨酸对是指在蛋白质高级结构中存在的，蛋白质表面上的空间上相邻的两个半胱氨酸。这两个半胱氨酸的巯基在氧化还原作用下形成可逆二硫键，在二硫键形成的前后，蛋白质空间结构构象可能会产生动态变化。本发明所述半胱氨酸对突变主要指：UnaG蛋白不同β折叠片上的，侧链处于β-桶状结构外侧的两个氨基酸残基，通过将符合上述条件的两个相邻氨基酸残基定向突变为半胱氨酸对，得到半胱氨酸对突变。具体地，所述半胱氨酸优选引入到UnaG的β-桶状结构表面。本发明通过将临近的处于不同β折叠片上的，处于β桶外侧的两个氨基酸残基同时突变为半胱氨酸，形成能够形成可逆二硫键的半胱氨酸对。在本发明中，所述突变产生的突变体为具有所述蛋白相同功能、但序列不同的变异体。在本发明中，所述半胱氨酸对突变能够导致蛋白结构变化，进而改变蛋白与配体分子胆红素的结合，最后导致荧光强度发生改变。
在本发明中，所述的UnaG蛋白为日本鳗鱼肌肉中发现的属于脂肪酸结合蛋白(fatty acid binding protein，FABP)家族的绿色荧光蛋白UnaG，所述鳗鱼荧光蛋白UnaG的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述鳗鱼荧光蛋白UnaG的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明中，所述突变的半胱氨酸对的数量至少为1对。本发明优选保持所述含半胱氨酸对突变的UnaG蛋白与UnaG蛋白的同源性为90％以上。
在本发明中，所述半胱氨酸对在UnaG蛋白中的突变位点包括：6/44、12/133、15/131、22/31、40/56、42/54、44/52、52/68、56/64、54/66、76/87、87/102、91/98、96/113、98/111、100/109、102/107、109/124、111/122、113/120、120/133、122/131和124/129位点中的一对或多对。
在本发明中，所述半胱氨酸对的突变位点优选为40/56、56/64、87/102、98/111，100/109和109/124中的一种或多种，所述半胱氨酸对的突变位点40/56、56/64、87/102、98/111，100/109和109/124分别对应的荧光蛋白探针的氨基酸序列如SEQ ID NO.3-8所示。
在本发明中，所述半胱氨酸对的突变位点更优选为56/64。
在本发明中，所述荧光蛋白探针中半胱氨酸对附近的氨基酸存在侧链理性突变。在本发明中，当半胱氨酸对在UnaG蛋白中的突变位点为56/64时，第54位氨基酸K侧链优选理性突变成较原氨基酸(K)短小的氨基酸即可。在本发明中，第54位氨基酸K侧链优选理性突变为T、A、S、G、D、V、N、E、Q、L或I。当半胱氨酸对在UnaG蛋白中的突变位点为56/64时，第54位氨基酸K侧链理性突变为T、A、S、G、D、V、N、E、Q、L或I，对应的荧光蛋白探针分别为roUnaG56/64 K54T、roUnaG 56/64 K54A、roUnaG 56/64 K54S、roUnaG 56/64 K54G、roUnaG 56/64K54D、roUnaG 56/64 K54V、roUnaG 56/64 K54N、roUnaG 56/64 K54E、roUnaG 56/64 K54Q、roUnaG 56/64 K54L和roUnaG 56/64 K54I，序列分别如SEQ ID NO.9-19所示。本发明中，第54位氨基酸K侧链理性突变为T时，得到的荧光蛋白探针为roUnaG 56/64 K54T，所述roUnaG56/64 K54T的序列如SEQ ID NO.9所示。在本发明中，所述roUnaG 56/64 K54T为非氧气依赖的可诱导荧光的氧化还原敏感荧光探针，对氧化还原变化响应速度极快。
本发明还提供了上述技术方案所述荧光蛋白探针的核苷酸序列。
本发明还提供了含上述技术方案所述核苷酸序列的表达载体，包括载体和上述技术方案所述核苷酸序列的片段。在本发明中，所述载体的表达控制序列和上述技术方案所述核苷酸序列优选操作性连接，本发明对所述质粒的种类没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的表达载体即可。在本发明中，所述表达控制序列包括复制起点、启动子、增强子、操纵子、终止子或核糖体结合位点。在本发明中，所述核苷酸序列优选与pRSETb载体连接。在本发明中，所述操作性连接是指目的核苷酸序列与表达控制序列以允许核苷酸序列表达的方式连接。本领域的技术人员熟知能用于构建含本发明融合蛋白编码序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体的方法，这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
本发明还提供了含有上述技术方案所述表达载体的宿主细胞。在本发明中，所述宿主细胞包括原核细胞和真核细胞，具体包括细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。本发明所述宿主细胞优选为大肠杆菌。
在本发明中，所述荧光蛋白探针的制备方法，包括以下步骤：
a.将上述技术方案所述表达载体转化到宿主细胞中；
b.培养所述宿主细胞；
c.从宿主细胞中分离得到所述荧光蛋白探针。
在本发明中，所述转化意指本领域内公知的各种将外源核酸(例如，线性DNA或RNA(例如，线性化载体或无载体的单独的基因构建体))或载体形式的核酸(例如，质粒、粘粒、噬菌体、噬粒、噬菌粒、转座子或其它DNA)导入宿主细胞的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-甘露聚糖-介导的转染、脂转染、天然感受态、化学介导的转移或电穿孔。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主细胞是真核细胞时，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。本发明优选采用大肠杆菌作为宿主细胞，利用化学转化的方法将载体转入大肠杆菌。本发明对所述宿主细胞的培养、分离过程没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的宿主细胞相应的常规培养、分离方法即可。本发明分离宿主细胞表达的蛋白后，优选对蛋白进行纯化，本发明对所述蛋白的纯化没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的蛋白纯化方法即可，如采用镍柱亲和层析法进行纯化。
本发明还提供了上述技术方案所述的荧光蛋白探针的氧化还原检测试剂盒。在本发明中，所述检测可以在体内、体外或原位水平进行。本发明所述检测试剂盒优选包括本领域熟知的与鳗鱼荧光蛋白UnaG配合使用的胆红素(Bilirubin)。本发明对胆红素的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的胆红素的常规市售产品即可。
本发明还提供了上述技术方案所述荧光蛋白探针在检测氧化还原中的应用。在一个实施方式中，本发明提供所述荧光蛋白探针在体外或体内检测氧化还原中的应用。在另一个实施方式中，本发明提供所述荧光蛋白探针在原位检测氧化还原中的应用。本发明所述荧光蛋白探针在生理状态下、亚细胞水平、原位的氧化还原检测，药物筛选，与氧化还原水平有关的疾病的诊断等情况中都有很好的应用。
在本发明中，所述荧光探针的使用方法包括以下步骤：对于溶液、细胞、组织和体内氧化还原状态的检测，将roUnaG加入或导入待检测样品内，加入胆红素Bilirubin后，通过测定roUnaG的荧光变化即可表征待测样品的氧化还原状态。本发明所述检测方法与常规的UnaG荧光探针的常规使用方法相同，没有特殊限制。
下面结合具体实施例对本发明提供的一组荧光蛋白探针及其制备方法和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
I.实验材料和试剂
以下用实施例对本发明作进一步阐述。这些实施例仅仅用于举例说明，而不对本发明的范围构成任何限制。实施例中主要采用常规的基因工程分子生物学克隆方法和细胞培养以及成像方法等，这些方法是本领域普通技术人员所熟知的，例如：简·罗斯凯姆斯等的《分子生物学实验参考手册》；J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》(第三版，2002年8月，科学出版社出版，北京)；费雷谢尼等著，章静波，徐存拴等译的《动物细胞培养：基本技术指南》(第五版)；J.S.博尼费斯农，M.达索等著，章静波等译的《精编细胞生物学实验指南》。本领域普通技术人员按照以下实施例，不难根据具体情况略作修改和变换而成功实施本发明，这些修改和变换均落在本申请权利要求的范围内。
实施例中所用的基于pRSETb-UnaG质粒由华东理工大学蛋白质实验室构建，pRSETb质粒载体购自Invitrogen公司。所有用于PCR的引物均由上海捷瑞生物工程技术有限公司合成、纯化和经质谱法鉴定正确。实施例中构建的表达质粒都经过序列测定，序列测定由华大基因公司和杰李测序公司完成。各实施例所用的Taq DNA聚合酶购自东盛生物，pfu DNA聚合酶购自天根生化科技(北京)有限公司，primeSTAR DNA聚合酶购自TaKaRa公司，三种聚合酶购买时都附带赠送对应聚合酶缓冲液和dNTP。BamHI、BglII、HindIII、NdeI、XhoI、EcoRI、SpeI等限制性内切酶、T4连接酶、T4磷酸化酶(T4 PNK)购自Fermentas公司，购买时附带有相对应的缓冲液等。除非特别声明，无机盐类等化学试剂均购自Sigma-Aldrich公司。HEPES盐，氨苄青霉素(Amp)和嘌呤霉素购自Ameresco公司；96孔荧光检测黑板、384孔荧光检测黑板购目Greiner公司。
实施例中所用的DNA纯化试剂盒购自BBI公司(加拿大)，普通质粒小抽试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。克隆菌株Mach I购自Invitrogen公司。镍柱亲和层析柱和脱盐柱填料均来自GE Healthcare公司。
实施例中用到的主要仪器：Biotek Synergy 2多功能酶标仪(美国Bio-Tek公司)，X-15R高速冷冻离心机(美国Beckman公司)，Microfuge22R台式高速冷冻离心机(美国Beckman公司)，PCR扩增仪(德国Biometra公司)，超声破碎仪(宁波新芝公司)，核酸电泳仪(申能博彩公司)，荧光分光光度计(美国Varian公司)，CO2恒温细胞培养箱(日本SANYO公司)，倒置荧光显微镜(日本尼康公司)，活体成像系统(美国Kodak公司)。
II.实施例中用到的常规分子生物学方法和细胞实验方法
(一)聚合酶链式反应(PCR)：
1.目的片段扩增PCR：
该方法主要用于基因片段扩增和菌落PCR鉴定阳性克隆。
Figure BDA0001400222790000091
扩增步骤(bp表示扩增片段的核苷酸数量)：
Figure BDA0001400222790000092
Figure BDA0001400222790000101
2.长片段(＞2500bp)扩增PCR：
本发明中使用的长片段扩增，主要是反向PCR扩增载体，在下述实施例中用于获得定点突变的一种技术。在变异部位设计反向PCR引物，其中一条引物的5’端包含变异的核苷酸序列。扩增后的产物就含有相应的突变位点。
Figure BDA0001400222790000102
扩增步骤(bp表示扩增片段的核苷酸数量)：
Figure BDA0001400222790000103
或者
Figure BDA0001400222790000104
(二)核酸内切酶酶切反应：
对质粒载体进行双酶切的体系(n代表使体系达到总体积所需要加入的灭菌超纯水量)：
Figure BDA0001400222790000111
(三)DNA片段5’端磷酸化反应
从微生物中抽提出的质粒或者基因组末端都含有磷酸基团，而PCR产物没有，故需对PCR产物的5’端碱基进行磷酸基团加成反应，只有末端含有磷酸基团DNA分子才能发生连接反应。
Figure BDA0001400222790000112
T4 PNK为T4多聚核苷酸激酶的简写，用于对DNA分子的5’端磷酸基团的加成反应。
(四)目的片段和载体的连接反应
不同的片段和载体之间的连接方法有所差异，本发明中使用了两种连接方法
1.含有粘性末端的DNA片段和含有粘性末端载体片段的连接
通过限制性内切酶切割的DNA片段通常会产生突出的粘性末端，因此可以和含有序列互补的粘性末端载体片段连接，形成重组质粒。
Figure BDA0001400222790000121
注：PCR产物片段与载体双酶切产物的质量比大致在2∶1-6∶1之间。
2.反向PCR引入定点突变后5’端磷酸化的DNA片段产物自身环化的连接反应
将5’端磷酸化的DNA片段通过自身环化连接反应将线性化载体的3’端和5’端连接反应得到重组质粒。
Figure BDA0001400222790000122
(五)感受态细胞的制备与转化
感受态细胞的制备：
1.挑取单菌落(如Mach I)接种于5mL LB培养基中，37℃摇床过夜。
2.取0.5-1mL过夜培养的菌液转种到50mL LB培养基中，37℃，220rpm培养3至5h，直到OD600达到0.5。
3.冰浴预冷细胞2h。
4.4℃，4000rpm离心10min。
5.弃上清，用5mL预冷的重悬缓冲液悬浮细胞，待均匀后再加入重悬缓冲液至终体积为50mL。
6.冰浴45min。
7.4℃，4000rpm离心10min，用5mL冰预冷的储存缓冲液重悬细菌。
8.每个离心管中放100μL菌液，-80℃或液氮冻存。
重悬缓冲液：CaCl2(100 mM)、MgCl2(70mM)、NaAc(40mM)
储存缓冲液：0.5mL DMSO、1.9mL 80％甘油、1mL 10×CaCl2(1M)、1mL10×MgCl2(700mM)、1mL 10×NaAc(400mM)、4.6mL ddH2O
转化：
1.取100μL感受态细胞于冰浴上融化。
2.加入适当体积的连接产物，轻轻吹打混匀，冰浴30min。通常加入的连接产物的体积少于感受态细胞体积的1/10。
3.将菌液放入42℃水浴中热激90s，迅速转移至冰浴中放置5min。
4.加入500μL LB培养基，于37℃恒温摇床上200rpm培养1h。
5.将菌液4000rpm离心3min，留200μL上清将菌体吹匀，均匀涂布于含适当抗生素的琼脂平板表面，平板于37℃恒温培养箱内倒置过夜。
(六)蛋白质的表达，纯化和荧光检测
1.将pRSETb为基础的氧化还原探针质粒转化到感受态JM109(DE3)中，倒置培养过夜，从平板上挑取克隆到250mL锥形瓶中，置于37℃摇床，220rpm培养至OD＝0.4～0.8，加入1/1000(v/v)的IPTG(1M)，18℃诱导表达24～36h。
2.诱导表达完成后，4000rpm，30min离心收菌，加入50mM的磷酸盐缓冲液重悬菌体沉淀，超声破碎至菌体澄清。9600rpm，4℃离心20min。
3.离心上清通过自装的镍柱亲和层析柱纯化获得蛋白，镍柱亲和层析后的蛋白经过10mM DTT处理1h后再通过自装的脱盐柱获得溶解在20mM MOPS缓冲液(pH 7.4)或者磷酸盐缓冲液PBS中的蛋白。
4.纯化的UnaG突变蛋白经过SDS-PAGE鉴定后，使用测定缓冲液(100mM HEPES，100mM NaCl，pH 7.4)或者磷酸盐缓冲液PBS稀释探针成终浓度为5～10μM的蛋白溶液。
5.纯化的探针蛋白鉴定后，使用测定缓冲液(20mM MOPS，pH 7.4)或者磷酸盐缓冲液PBS稀释探针终浓度为1μM的蛋白溶液。
取100μL 1μM的荧光探针溶液，37℃温育胆红素Bilirubin 10μM处理30min，加入氧化与还原DTT按比例混合的终浓度为1mM的DTT进行滴定，测定蛋白的485nm处激发528nm处发射的荧光强度。对样品的荧光激发、发射测定利用多功能荧光酶标仪完成。
取100μL 1μM的荧光探针溶液，37℃温育胆红素Bilirubin 10μM处理30min，加入10 mM DTT和1mM Diamide处理1h后测定探针蛋白的吸收光谱和荧光光谱。对样品的吸收光谱和荧光光谱的测定通过分光光度计和荧光分光光度计完成。
(七)大肠杆菌荧光检测
1.将pRSETb为基础的氧化还原探针质粒转化到感受态JM109(DE3)中，倒置培养过夜，从平板上挑取克隆到250mL锥形瓶中，置于37℃摇床，220rpm培养至OD＝0.4～0.8，加入1/1000(v/v)的IPTG(1M)，18℃诱导表达24～36h。
2.诱导表达完成后，取5mL诱导培养物4000rpm，5min离心收菌，用M9mini培养基(Na2HPO4 6g/L，KH2PO4 3g/L，NaCl 0.5g/L，NH4Cl 1g/L，HEPES 100mM)冲洗三次，再用5mLM9mini培养基进行重悬。将所有样品用M9mini培养基稀释到OD 0.5。
3.酶标仪荧光检测：稀释到OD 0.5后铺板到96孔不透明黑色荧光检测板，加入胆红素Bilirubin 10μM处理30min。分别依次使用氧化剂和还原剂进行处理。
(八)哺乳动物细胞荧光检测
1.将pcDNA3.1(+)为基础的氧化还原探针质粒通过转染试剂Lip2000(Invitrogen)转染到哺乳动物细胞中，置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。待外源基因充分表达24～36h后进行荧光检测。
2.诱导表达完成后，使用胰酶消化处理获得悬浮的细胞。使用HBSS溶液对样品进行离心冲洗两次，之后用HBSS溶液进行重悬。置于96孔不透明黑色荧光检测板中使用酶标仪检测。
3.诱导表达完成后，将贴壁的哺乳动物细胞，用PBS冲洗三次，置于HBSS溶液中进行荧光显微镜检测。
实施例1
pRSETb-UnaG质粒的构建
通过PCR扩增UnaG基因，PCR产物凝胶电泳回收后用BamHI和HindIII酶切，同时对pRSETb载体进行相同的双酶切。用T4DNA连接酶连接后，连接产物转化入感受态Mach I，将转化的Mach I涂布于LB平板(氨苄青霉素100μg/mL)，置于37℃培养过夜。将生长Mach I转化子进行质粒抽提后，进行PCR鉴定。阳性质粒经过测序正确后进行后续的质粒构建。
pRSETb-UnaG质粒的构建引物：SEQ ID NO.20-21。
实施例2
pRSETb-UnaG不同位点的半胱氨酸对引入的质粒构建和检测
本实施例中，我们以pRSETb-UnaG为基础质粒根据UnaG晶体结构选择了6/44，12/133，15/131，22/31，40/56，42/54，44/52，52/68，56/64，54/66，76/87，87/102，91/98，96/113，98/111，100/109，102/107，109/124，111/122，113/120，120/133，122/131，124/129共23个半胱氨酸对。对氧化还原敏感的样品有40/56，56/64，87/102，98/111，100/109，109/124(如SEQ ID NO.3-8所示)。
利用PCR产生含有半胱氨酸突变的UnaG DNA片段，对该DNA片段使用5’末端的加磷操作后灭活，同时通过反向PCR扩增产生含有不同断裂位点的pRSETb-UnaG线性化载体，将线性化的pRSETb-UnaG和5’末端磷酸化的含有半胱氨酸突变的UnaG片段在PEG4000和T4DNA连接酶的作用下连接产生重组质粒，将这些平板使用胆红素喷雾处理后，利用Kodak多功能活体成像系统观察荧光，挑取在FITC通道激发下有黄色荧光的克隆，由北京六合华大基因科技股份有限公司上海分公司完成测序。
对氧化还原敏感的样品有40/56，56/64，87/102，98/111，100/109，109/124。反向扩增产生线性化载体所用引物如下：SEQ ID NO.22-33。
经过测序正确后，将重组质粒转化到感受态JM109(DE3)中诱导表达，并纯化蛋白质，检测它们对于氧化剂和还原剂的响应，含半胱氨酸对突变的UnaG蛋白筛选结果图如图1所示。
检测结果显示40/56，56/64，87/102，98/111，100/109，109/124的半胱氨酸对引入位点构建的氧化还原探针的荧光动态变化，其中56/64较其他样品氧化和还原两种状态下荧光强度变化最大达到10倍荧光降低。但是56/64在氧化剂的作用下形成二硫键的速度较慢导致荧光强度变化不及时，所以我们选择56/64用于后续的进一步优化实验。
实施例3
pRSETb-roUnaG 56/64进行荧光探针质粒的半胱氨酸对附近氨基酸残基优化和检测
因为UnaG突变体56/64含有的由E56C/D64C突变形成的半胱氨酸对可能在形成二硫键时受到K54氨基酸残基侧链的空间阻碍作用，因此可能通过改变K54氨基酸残基侧链来减少其对E56C/D64C半胱氨酸对形成二硫键的速度的影响。我们以pRSETb-roUnaG 56/64为基础质粒，将K54位氨基酸残基突变为较K氨基酸短小的氨基酸如T、A、S、G、D、V、N、E、Q、L和I，相应荧光蛋白探针氨基酸序列分别如SEQ ID NO.9-19所示。
以pRSETb-roUnaG 56/64基础质粒为模板，参照定点突变原理进行衍生系列探针的构建。
其中roUnaG 56/64K54T引物：SEQ ID NO.34-35。
PCR获得线性化DNA和通过T4 PNK磷酸化的线性DNA，在T4 DNA连接酶的作用下连接产生重组质粒。将这些平板利用Kodak多功能活体成像系统观察荧光，挑取在FITC通道激发下有黄色荧光的克隆，由北京六合华大基因科技股份有限公司上海分公司完成测序。
经过测序正确后，将重组质粒转化到感受态JM109(DE3)中诱导表达，并纯化蛋白质，检测探针对于氧化剂和还原剂的响应，roUnaG 56/64的二硫键快速响应突变体的筛选结果图如图2所示。
结果显示，roUnaG 56/64 K54T相对于原始探针roUnaG 56/64显示出荧光强度降低到～30％。但是roUnaG 56/64 K54T较其他突变保持了较高的氧化还原响应变化近～8倍，以及较快的对氧化剂的响应速度，即在氧化作用下形成二硫键的速度。
实施例4
roUnaG 56/64 K54T荧光探针性质检测
本实施例中，我们选择对氧化还原响应最大的roUnaG 56/64 K54T性质进一步研究。
将纯化的roUnaG 56/64 K54T通过SDS-PAGE电泳鉴定其大小在20kDa附近。该大小符合pRSETb-roUnaG表达出的含His-tag纯化标签的roUnaG 56/64 K54T蛋白质的大小。roUnaG 56/64 K54T的工作原理和纯化的roUnaG 56/64 K54T蛋白质的SDS-PAGE结果图如图3所示。
roUnaG蛋白质的性质结果图如图4所示。我们将纯化的roUnaG 56/64 K54T，分别用氧化剂Diamide 1mM和还原剂DDT 10mM处理1h后，使用荧光分光光度计进行荧光谱的检测。固定发射在530nm处，进行380～510nm区间的激发谱检测和固定激发在485nm处，进行495～550nm区间的发射谱检测，荧光光谱性质结果如图4A所示。roUnaG的光谱与野生型的UnaG的类似，同时还原状态和氧化状态的光谱不会发生任何迁移，只是荧光强度发生变化。
另外使用将氧化与还原DTT按比例混合的终浓度为1mM的DTT对纯化的roUnaG 56/64 K54T处理1h后，检测495nm激发528nm发射处荧光强度的变化并进行标准化处理，氧化还原滴定结果如图4B所示。roUnaG的荧光强度呈现出对氧化还原电势的依赖性。随着氧化还原电势的增大，roUnaG荧光强度依次递减。
实施例5
roUnaG 56/64 K54T荧光探针pH敏感性检测
本实施例中，我们选择对氧化还原响应最大的roUnaG 56/64 K54T在不同pH环境中的检测能力进行进一步研究。
我们将纯化的roUnaG 56/64 K54T和HyPer探针蛋白，分别用pH 7.0-8.0的缓冲液稀释，使用酶标仪记录485nm激发528nm发射处荧光强度变化。如图5所示，roUnaG在pH 7.0-8.0的范围中，荧光强度变化很小，在10％以内，而在以cpYFP基础改造的HyPer探针的荧光随着环境pH升高，荧光强度升高6.7倍。这说明roUnaG能够在细菌及活细胞内的不同pH环境下工作，且其检测结果不受pH扰动的影响。该性质优于以HyPer为代表的以对pH敏感的荧光蛋白，如cpYFP，为基础构建的荧光探针。
实施例6
roUnaG 56/64 K54T荧光探针与其他氧化还原探针在正常氧及无氧条件下对氧化剂或还原剂响应情况比较
本实施例中，我们分别在正常氧和无氧条件下，将roUnaG探针和其他已报道的氧化还原荧光蛋白探针：roGFP1、HyPer以及rxRFP进行比较。
分别将已转化roUnaG 56/64 K54T、roGFP1、HyPer以及rxRFP基因的BL21细胞用M9培养基冲洗，置于含10μM胆红素Bilirubin的M9培养基中处理30min，依次使用氧化剂和还原剂处理10min。使用酶标仪记录485nm激发528nm发射和590nm激发645nm发射处荧光强度变化并进行标准化处理。roUnaG 56/64 K54T、roGFP1、HyPer以及rxRFP对BL21细胞的氧化还原势进行原位实时检测结果图如图6所示。图6A为表达roUnaG 56/64 K54T、roGFP1、HyPer以及rxRFP的BL21细胞在正常氧及乏氧条件下的荧光值对比图。roUnaG 56/64 K54T在正常氧和乏氧条件下495nm激发528nm发射处荧光基本相同，而roGFP1、HyPer以及rxRFP仅在正常氧条件下能够正常表达荧光，在乏氧条件下几乎没有荧光。
图6B-D分别为BL21细胞表达roUnaG 56/64 K54T、roGFP1、HyPer以及rxRFP后在正常氧和乏氧条件下对氧化剂和还原剂刺激的响应情况。将已转化roUnaG 56/64 K54T基因的BL21细胞，用M9培养基冲洗，并使用含胆红素Bilirubin的M9培养基处理30 min后，分别依次加入氧化剂和还原剂，使用酶标仪记录485nm激发528nm发射处荧光强度变化并做标准化处理。roUnaG 56/64 K54T在正常氧和乏氧条件下对氧化剂(Diamide)、过氧化氢和还原剂(DTT)加入的荧光强度变化的响应结果如图6B-D所示。表达roUnaG的BL21细胞的荧光强度会受到氧化剂或者还原剂加入的影响，导致减弱或增强。这说明roUnaG能够对活细胞内的氧化还原动态变化进行时空特异性检测，且不受氧气存在与否的影响。而基于GFP家族发展的氧化还原荧光蛋白探针roGFP1、HyPer和rxRFP仅能在正常氧条件下工作，无法在具有重要生理病理意义的乏氧条件下工作。
实施例7
基于roUnaG 56/64 K54T荧光探针对活细胞以及亚细胞器内的氧化还原变化进行动态检测
本实施例中，我们使用氧化还原探针roUnaG 56/64 K54T对大肠杆菌细胞内的氧化还原进行动态检测分析。
将经过转化roUnaG 56/64 K54T基因的大肠杆菌，使用M9培养基冲洗，置于M9培养基中使用10μM胆红素Bilirubin处理30min后，依次使用氧化剂和还原剂处理10min。使用酶标仪记录485nm激发528nm发射处荧光强度变化并进行标准化处理。roUnaG 56/64 K54T对大肠杆菌氧化还原势进行原位实时检测结果图如图7所示。其中，图7A为表达roUnaG 56/64K54T的大肠杆菌对胆红素Bilirubin的依赖性结果图，图7B为原位实时检测大肠杆菌中表达的roUnaG 56/64 K54T荧光变化结果图。细菌中roUnaG需要加入外源胆红素Bilirubin诱导荧光强度的升高。同时外源的氧化剂和还原剂的滴加会相应的导致表达roUnaG的细菌的荧光强度的减弱和加强。
本实施例中，我们使用不同的定位信号肽与roUnaG 56/64 K54T进行融合将roUnaG 56/64 K54T荧光蛋白探针定位到不同的细胞器中。利用roUnaG 56/64 K54T对哺乳动物细胞HeLa中的氧化还原势进行时空特异性检测结果如图8所示。
将融合不同定位信号肽的roUnaG 56/64 K54T基因的质粒转入HeLa细胞36h后，使用PBS冲洗，置于HBSS溶液中使用倒置荧光显微镜在FITC通道下进行荧光检测。我们发现roUnaG 56/64 K54T通过与不同的特异定位信号肽融合能够定位到包括细胞浆，线粒体，细胞核，内质网，肌动蛋白，高尔基体等亚细胞器中。roUnaG 56/64 K54T在HeLa细胞中不同亚细胞器定位结果如图8A所示。本实施例中，我们使用氧化还原探针roUnaG 56/64 K54T分别对细胞胞浆和线粒体内的氧化还原进行动态检测分析。
将经过转染roUnaG 56/64 K54T基因的HeLa细胞，使用PBS冲洗之后，置于HBSS溶液中使用胆红素Bilirubin处理30min后，分别依次滴加氧化剂和还原剂。使用倒置荧光显微镜记录495nm激发528nm发射处荧光强度变化并进行标准化处理。细胞胞浆定位和线粒体定位的roUnaG 56/64 K54T对氧化剂(Diamide)和还原剂(DTT)加入的荧光强度变化的响应结果如图8B所示。氧化剂或者还原剂的加入会导致表达roUnaG的HeLa细胞的荧光强度的减弱或增强。这说明roUnaG能够对活细胞内的氧化还原动态变化进行时空特异性检测。
实施例8
基于roUnaG/mCherry比率型氧化还原敏感探针对哺乳动物细胞HeLa中的氧化还原势进行时空特异性检测
通过编码(GGSGG)6氨基酸残基多肽铰链的DNA将roUnaG和mCherry基因DNA进行串联融合，将得到的roUnaG-(GGSGG)6-mCherry转染到HeLa细胞中，使用PBS冲洗之后，置于HBSS溶液中使用胆红素Bilirubin处理30min后，分别依次滴加氧化剂和还原剂。使用倒置荧光显微镜记录590nm激发645nm发射处荧光强度(mCherry的红色通道荧光)和495nm激发528nm发射处荧光强度(roUnaG的绿色通道荧光)比值变化。roUnaG/mCherry比率型氧化还原敏感探针对哺乳动物细胞HeLa中的氧化还原势进行时空特异性检测结果如图9所示。图9A为细胞浆中表达roUnaG/mCherry的HeLa细胞依次加入胆红素Bilirubin，氧化剂Diamide，还原剂DTT的荧光成像图，上面系列图片是roUnaG的绿色通道(Green Channel)荧光，中间系列图片是mCherry的红色通道(Red Channel)荧光，底部系列图片是绿色荧光比红色荧光比值。roUnaG绿色荧光成像结果显示，roUnaG的荧光强度受到氧化剂和还原剂加入影响，引起荧光强度的变化，但是mCherry通道的荧光强度在整个过程中变化极小(图9A)。roUnaG成像图与mCherry成像图按照相应的像素点进行比值获得的绿色荧光比红色荧光比值的成像图(图9A)，这说明通过roUnaG/mCherry可以对细胞内的氧化还原动态变化进行比率型成像分析。将图9A按左上标记的整个细胞，细胞浆和细胞核分别圈定ROI(Regionof Interest，感兴趣的区域)，将roUnaG的绿色荧光比mCherry的红色荧光比值按时间序列作图，能够获得绿色荧光比红色荧光比值的变化(图9B为图9A中的成像图片中如左上标记分别圈定整个细胞，细胞浆和细胞核的ROI区域，获得roUnaG的绿色荧光比mCherry的红色荧光比值时间序列图)。
以上结果说明roUnaG能够与其绿色荧光探针互不干扰的其他荧光通道诸如红色荧光通道的荧光蛋白进行融合获得能够消除蛋白表达导致的荧光强度差异的比率型氧化还原敏感的荧光探针。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 华东理工大学
<120> 一组荧光蛋白探针及其制备方法和应用
<130> 2017
<160> 35
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 420
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
atggtcgaga aatttgttgg cacctggaag atcgcagaca gccataattt tggtgaatac 60
ctgaaagcta tcggagcccc aaaggaatta agcgatggtg gggatgccac gacgccgaca 120
ttgtacatct cccagaagga cggagacaaa atgacagtga aaatagagaa tggacctcct 180
acgttccttg acactcaagt aaagttcaaa ttaggggagg agttcgacga atttccttct 240
gatcgaagaa aaggcgtaaa atctgtcgtg aacttggtgg gagagaagct ggtgtacgta 300
caaaagtggg acggcaagga gacgacgtat gtccgagaga taaaggacgg taaactggtc 360
gtgacactta cgatgggaga cgtcgtggct gtgcgcagct accggagggc gacggaatga 420
<210> 2
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
Met Val Glu Lys Phe Val Gly Thr Trp Lys Ile Ala Asp Ser His Asn
1 5 10 15
Phe Gly Glu Tyr Leu Lys Ala Ile Gly Ala Pro Lys Glu Leu Ser Asp
20 25 30
Gly Gly Asp Ala Thr Thr Pro Thr Leu Tyr Ile Ser Gln Lys Asp Gly
35 40 45
Asp Lys Met Thr Val Lys Ile Glu Asn Gly Pro Pro Thr Phe Leu Asp
50 55 60
Thr Gln Val Lys Phe Lys Leu Gly Glu Glu Phe Asp Glu Phe Pro Ser
65 70 75 80
Asp Arg Arg Lys Gly Val Lys Ser Val Val Asn Leu Val Gly Glu Lys
85 90 95
Leu Val Tyr Val Gln Lys Trp Asp Gly Lys Glu Thr Thr Tyr Val Arg
100 105 110
Glu Ile Lys Asp Gly Lys Leu Val Val Thr Leu Thr Met Gly Asp Val
115 120 125
Val Ala Val Arg Ser Tyr Arg Arg Ala Thr Glu
130 135
<210> 3
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
Met Val Glu Lys Phe Val Gly Thr Trp Lys Ile Ala Asp Ser His Asn
1 5 10 15
Phe Gly Glu Tyr Leu Lys Ala Ile Gly Ala Pro Lys Glu Leu Ser Asp
20 25 30
Gly Gly Asp Ala Thr Thr Pro Cys Leu Tyr Ile Ser Gln Lys Asp Gly
35 40 45
Asp Lys Met Thr Val Lys Ile Cys Asn Gly Pro Pro Thr Phe Leu Asp
50 55 60
Thr Gln Val Lys Phe Lys Leu Gly Glu Glu Phe Asp Glu Phe Pro Ser
65 70 75 80
Asp Arg Arg Lys Gly Val Lys Ser Val Val Asn Leu Val Gly Glu Lys
85 90 95
Leu Val Tyr Val Gln Lys Trp Asp Gly Lys Glu Thr Thr Tyr Val Arg
100 105 110
Glu Ile Lys Asp Gly Lys Leu Val Val Thr Leu Thr Met Gly Asp Val
115 120 125
Val Ala Val Arg Ser Tyr Arg Arg Ala Thr Glu
130 135
<210> 4
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 4
Met Val Glu Lys Phe Val Gly Thr Trp Lys Ile Ala Asp Ser His Asn
1 5 10 15
Phe Gly Glu Tyr Leu Lys Ala Ile Gly Ala Pro Lys Glu Leu Ser Asp
20 25 30
Gly Gly Asp Ala Thr Thr Pro Thr Leu Tyr Ile Ser Gln Lys Asp Gly
35 40 45
Asp Lys Met Thr Val Lys Ile Cys Asn Gly Pro Pro Thr Phe Leu Cys
50 55 60
Thr Gln Val Lys Phe Lys Leu Gly Glu Glu Phe Asp Glu Phe Pro Ser
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Glu Ile Lys Asp Gly Lys Leu Val Val Thr Leu Thr Met Gly Asp Val
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Val Ala Val Arg Ser Tyr Arg Arg Ala Thr Glu
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<210> 5
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 5
Met Val Glu Lys Phe Val Gly Thr Trp Lys Ile Ala Asp Ser His Asn
1 5 10 15
Phe Gly Glu Tyr Leu Lys Ala Ile Gly Ala Pro Lys Glu Leu Ser Asp
20 25 30
Gly Gly Asp Ala Thr Thr Pro Thr Leu Tyr Ile Ser Gln Lys Asp Gly
35 40 45
Asp Lys Met Thr Val Lys Ile Glu Asn Gly Pro Pro Thr Phe Leu Asp
50 55 60
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65 70 75 80
Asp Arg Arg Lys Gly Val Cys Ser Val Val Asn Leu Val Gly Glu Lys
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Leu Val Tyr Val Gln Cys Trp Asp Gly Lys Glu Thr Thr Tyr Val Arg
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Glu Ile Lys Asp Gly Lys Leu Val Val Thr Leu Thr Met Gly Asp Val
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Val Ala Val Arg Ser Tyr Arg Arg Ala Thr Glu
130 135
<210> 6
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 6
Met Val Glu Lys Phe Val Gly Thr Trp Lys Ile Ala Asp Ser His Asn
1 5 10 15
Phe Gly Glu Tyr Leu Lys Ala Ile Gly Ala Pro Lys Glu Leu Ser Asp
20 25 30
Gly Gly Asp Ala Thr Thr Pro Thr Leu Tyr Ile Ser Gln Lys Asp Gly
35 40 45
Asp Lys Met Thr Val Lys Ile Glu Asn Gly Pro Pro Thr Phe Leu Asp
50 55 60
Thr Gln Val Lys Phe Lys Leu Gly Glu Glu Phe Asp Glu Phe Pro Ser
65 70 75 80
Asp Arg Arg Lys Gly Val Lys Ser Val Val Asn Leu Val Gly Glu Lys
85 90 95
Leu Cys Tyr Val Gln Lys Trp Asp Gly Lys Glu Thr Thr Tyr Cys Arg
100 105 110
Glu Ile Lys Asp Gly Lys Leu Val Val Thr Leu Thr Met Gly Asp Val
115 120 125
Val Ala Val Arg Ser Tyr Arg Arg Ala Thr Glu
130 135
<210> 7
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 7
Met Val Glu Lys Phe Val Gly Thr Trp Lys Ile Ala Asp Ser His Asn
1 5 10 15
Phe Gly Glu Tyr Leu Lys Ala Ile Gly Ala Pro Lys Glu Leu Ser Asp
20 25 30
Gly Gly Asp Ala Thr Thr Pro Thr Leu Tyr Ile Ser Gln Lys Asp Gly
35 40 45
Asp Lys Met Thr Val Lys Ile Glu Asn Gly Pro Pro Thr Phe Leu Asp
50 55 60
Thr Gln Val Lys Phe Lys Leu Gly Glu Glu Phe Asp Glu Phe Pro Ser
65 70 75 80
Asp Arg Arg Lys Gly Val Lys Ser Val Val Asn Leu Val Gly Glu Lys
85 90 95
Leu Val Tyr Cys Gln Lys Trp Asp Gly Lys Glu Thr Cys Tyr Val Arg
100 105 110
Glu Ile Lys Asp Gly Lys Leu Val Val Thr Leu Thr Met Gly Asp Val
115 120 125
Val Ala Val Arg Ser Tyr Arg Arg Ala Thr Glu
130 135
<210> 8
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 8
Met Val Glu Lys Phe Val Gly Thr Trp Lys Ile Ala Asp Ser His Asn
1 5 10 15
Phe Gly Glu Tyr Leu Lys Ala Ile Gly Ala Pro Lys Glu Leu Ser Asp
20 25 30
Gly Gly Asp Ala Thr Thr Pro Thr Leu Tyr Ile Ser Gln Lys Asp Gly
35 40 45
Asp Lys Met Thr Val Lys Ile Glu Asn Gly Pro Pro Thr Phe Leu Asp
50 55 60
Thr Gln Val Lys Phe Lys Leu Gly Glu Glu Phe Asp Glu Phe Pro Ser
65 70 75 80
Asp Arg Arg Lys Gly Val Lys Ser Val Val Asn Leu Val Gly Glu Lys
85 90 95
Leu Val Tyr Val Gln Lys Trp Asp Gly Lys Glu Thr Cys Tyr Val Arg
100 105 110
Glu Ile Lys Asp Gly Lys Leu Val Val Thr Leu Cys Met Gly Asp Val
115 120 125
Val Ala Val Arg Ser Tyr Arg Arg Ala Thr Glu
130 135
<210> 9
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 9
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ggtaaactgg tcgtgacact ttgcatggga 30
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cactgtcatt ttgtctc 17
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<211> 20
<212> DNA
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<400> 35
accatatgca atggacctcc 20

Claims (8)

1. 一组荧光蛋白探针，其特征在于，所述荧光蛋白探针为含半胱氨酸对突变的鳗鱼荧光蛋白UnaG；所述半胱氨酸对在UnaG蛋白中的突变位点为56/64；所述鳗鱼荧光蛋白UnaG的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的荧光蛋白探针，其特征在于，所述荧光蛋白探针中半胱氨酸对附近的氨基酸存在侧链理性突变。
3.根据权利要求2所述的荧光蛋白探针，其特征在于，当半胱氨酸对在UnaG蛋白中的突变位点为56/64时，第54位氨基酸K侧链理性突变为T、A、S、G、D、V、N、E、Q、L或I，对应的荧光蛋白探针分别为roUnaG 56/64 K54T、roUnaG 56/64 K54A、roUnaG 56/64 K54S、roUnaG56/64 K54G、roUnaG 56/64 K54D、roUnaG 56/64 K54V、roUnaG 56/64 K54N、roUnaG 56/64K54E、roUnaG 56/64 K54Q、roUnaG 56/64 K54L和roUnaG 56/64 K54I，序列分别如SEQ IDNO.9-19所示。
4.编码权利要求1~3任意一项所述荧光蛋白探针的多核苷酸。
5.含有权利要求4所述多核苷酸的表达载体，包括载体和权利要求4所述的多核苷酸。
6.含有权利要求5所述表达载体的宿主细胞。
7.一种包括权利要求1~3任意一项所述的荧光蛋白探针的氧化还原检测试剂盒。
8.权利要求1~3任意一项所述荧光蛋白探针在非诊断为目的的检测非体内氧化还原中的应用。
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日本鳗鲡绿色荧光蛋白基因的克隆与表达;陈佩林等;《生物技术》;20160831;第26卷(第4期);第331页第1段，第333页图2，第334页第3节 *

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