CN105524175B - 一种基因编码的过氧化氢荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基因编码的过氧化氢荧光探针和制备方法及其应用，包括对H₂O₂敏感的多肽OxyR和对H₂O₂进行表现的荧光蛋白cpYFP，将荧光蛋白cpYFP插入到对H₂O₂敏感的多肽OxyR中，形成荧光探针，其特征在于：所述过氧化氢荧光探针为对荧光探针中的荧光蛋白cpYFP序列进行突变而得到的突变体。该基因编码的H₂O₂荧光探针可以在活菌、亚细胞水平检测H₂O₂；探针特异性非常好，对H₂O₂具有选择性，且对H₂O₂的动态响应变化没有因为突变位点的引入而受影响。

Description

一种基因编码的过氧化氢荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物化学、蛋白质化学及分子生物学领域，具体地涉及能够提高过氧化氢探针HyPer荧光强度的突变蛋白及基因编码核苷酸序列，还涉及该突变体蛋白及其核苷酸序列的制备方法及其在检测H₂O₂中的应用。

背景技术

活性氧(ROS)是由分子氧衍生的一系列活性分子(例如H₂O₂)、游离自由基的总称。在氧化还原代谢过程中，ROS是不同生理和病理过程的关键介质。游离的氧分子对需氧生物来说是有害的。这些分子主要是线粒体呼吸作用过程中发生电子转移产生的副产物，以及氧化还原酶、金属催化氧化过程中产生的副产物。之前的报道称只有吞噬细胞才会与ROS的产生有关，因为这种细胞含有对抗宿主细胞的防御机制。但是最近的研究已经证明，ROS对细胞信号，包括细胞凋亡、基因表达和细胞信号级联反应的激活，都起到了重要的作用。ROS还是细胞内部和细胞之间的信使。

作为活性氧(ROS)的主要家族成员之一，H₂O₂被广泛用于化学、生物、药学、临床、环境和食品等领域。H₂O₂与各种中枢神经系统的疾病相关，如阿尔茨海默氏症，帕金森氏病和肌萎缩性侧索硬化。此外H₂O₂也是酸雨形成的因素之一。因此无论在环境、临床还是药学领域，对H₂O₂进行精确检测都是非常重要的。

目前已经报道了各种检测胞内H₂O₂的方法，如滴定分析，分光光度分析法，荧光分析法，电解分析等，其中荧光分析法是一种有前景的检测方法，能够快速、高选择、实时地监测H₂O₂。目前有以下几种探针用于检测H₂O₂：

1、H₂O₂在辣根过氧化酶(HRP)的催化作用下，能够与Amplex Red进行1:1的反应，产生高荧光产物试卤灵。HRP对H₂O₂具有选择性，而Amplex Red对二者的底物具有高度的灵敏性和稳定性，产物试卤灵也是很稳定的，它的长波段会避免大多数生物体自发荧光造成的干扰。鉴于AmplexRed的高灵敏性、特异性和化学稳定性，它被广泛用于不同生物体中H₂O₂的低水平测量，然而这个反应产物试卤灵是剧毒产品，且必须避光保存，使检测方法局限性较大。

2、基于snap-tag的去保护荧光探针和基于细胞器标记的体内成像方法。这些方法可以选择性的检测H₂O₂，但是不适合检测H₂O₂浓度的动态变化。

3、利用氧化还原敏感型的绿色荧光蛋白(roGFPs),roGFP1和roGFP2检测。它们是GFP的突变体，在氧化环境中，靠近roGFP生色团的β链上的Cys147和Cys204会形成二硫键，这就会导致蛋白质的构象发生改变，从而使roGFP 400nm的激发峰上升，而490nm的激发峰下降。通过比较400nm激发产生的荧光与490nm激发产生的荧光，可以表征胞内氧化的程度。然而各种氧化剂都可以促使Cys147和Cys204之间的二硫键形成，因此roGFP探针不是H₂O₂的特异性探针，但是它能够表征细胞内的氧化还原状态。

4、为了解决roGFP的不足，一种新型的、特异性检测胞内H2O2的探针被开发，命名为HyPer。这个探针引入了循环排列的黄色荧光蛋白(cpYFP)。YFP是GFP的突变体T203Y。cpYFP是将蛋白质的氨基末端与羧基末端部分互换，再利用一段小的间隔区域将二者的起始端相连，cpYFP对蛋白质的构象变化具有高度的灵敏性，并且通过荧光的改变来表征构象的变化。OxyR是过氧化氢的传感器及其转录的调节器。它能够在原核生物中感应H₂O₂的存在，并且诱导抗氧化系统的产生。OxyR含有一个H₂O₂感应调节域(OxyR-RD，对应氨基酸80-310位)以及一个DNA结合域(对应氨基酸1-79位)。感应调节域中的残基Cys199和Cys208之间，能够形成一个胞内分子的二硫键，导致蛋白构象发生改变，从而激活OxyR的转录因子。HyPer是将cpYFP蛋白插入到OxyR-RD中，中间以一段氨基酸短链相连接。HyPer的激发峰是420nm和500nm，发射峰在516nm处。在H2O2存在的条件下，420nm处的激发峰就会下降，而500nm处的激发峰就会上升，因此HyPer是一类比率型的探针。荧光性质的改变是Oxy-RD被氧化所导致的。实验证明，将Cys199或Cys208突变为丝氨酸以后，这种荧光改变就不会发生。因此HyPer对H₂O₂具有选择性。其他的ROS分子，如一氧化氮，过氧亚硝基，超氧阴离子及氧化的谷胱甘肽都无法使HyPer的荧光发生变化。

HyPer是一个可逆的H₂O₂荧光探针，能够快速、特异性的检测胞内H₂O₂。其突变体HyPer-3SEQ ID NO 4所示(在HyPer上对应的是H34Y)对H₂O₂具有更高的动态响应倍数。二者都是GFP的衍生物，但是它们的荧光比化学探针小得多，荧光强度只有EGFP的5％～7％，且在斑马鱼胚胎内只观测到微弱的荧光，这极大的限制了活体动物或亚细胞器中H₂O₂动态变化的检测。所以提高HyPer探针的荧光强度，提高H₂O₂的检测精度是非常重要的。

综上所述，我们认为对进行HyPer理性突变体能够有效的提高探针的荧光强度，满足在生理水平和亚细胞水平上检测H₂O₂的需要。

不应认为对本文所述参考文献的引用或讨论意味着承认这些参考文献是本发明的现有技术。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的第一个目的是提供一种基因编码的过氧化氢荧光探针。

本发明的第二个目的是提供编码所述过氧化氢荧光探针核苷酸序列。

本发明的第三个目的是提供所述基因编码的过氧化氢荧光探针的制备方法。

本发明的第四个目的是提供包含编码过氧化氢荧光探针核苷酸序列的表达载体。

本发明的第五个目的是提供所述基因编码的过氧化氢荧光探针在大肠杆菌表达后，对H₂O₂的检测。

本发明的第六个目的是提供所述基因编码的过氧化氢荧光探针在哺乳动物细胞中表达后，对H₂O₂的检测。

本发明的技术方案如下：

一种基因编码的过氧化氢荧光探针，包括SEQ ID NO：34所示对H₂O₂敏感的多肽OxyR和SEQ ID NO：6所示对H₂O₂进行表现的荧光蛋白cpYFP，将荧光蛋白cpYFP插入到对H₂O₂敏感的多肽OxyR中，形成荧光探针，其特征在于：所述过氧化氢荧光探针为对荧光探针中的荧光蛋白cpYFP序列进行突变而得到的突变体。

根据本发明提供的基因编码的过氧化氢荧光探针，优选的是，所述过氧化氢荧光探针为对SEQ ID NO：2所示的HyPer荧光探针的262、271、131和337位点中的1个或1个以上位点进行突变的突变体。

根据本发明提供的基因编码的过氧化氢荧光探针，优选的是，所述过氧化氢荧光探针为对SEQ ID NO：4所示的HyPer3荧光探针的262、271、131和337位点中的1个或1个以上位点进行突变的突变体；所述HyPer3荧光探针为HyPer荧光探针在34位的突变体。

根据本发明提供的基因编码的过氧化氢荧光探针，进一步优选的是，所述过氧化氢荧光探针为对SEQ ID NO：2所示的HyPer荧光探针的S262R、Y271N、Y131F和N337T位点中的1个或1个以上位点进行突变的突变体。

根据本发明提供的基因编码的过氧化氢荧光探针，进一步优选的是，所述过氧化氢荧光探针为对SEQ ID NO：4所示的HyPer3荧光探针的S262R、Y271N、Y131F和N337T位点中的1个或1个以上位点进行突变的突变体；所述HyPer3荧光探针为HyPer荧光探针的H34Y位的突变体。

根据本发明所述的基因编码的过氧化氢荧光探针，优选的，所述过氧化氢荧光探针为对SEQ ID NO：8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32所示的氨基酸序列。

根据本发明所述的基因编码的过氧化氢荧光探针，进一步优选的，所述过氧化氢荧光探针为对SEQ ID NO：8、10、12、14、16、18所示的氨基酸序列。

根据本发明所述的基因编码的过氧化氢荧光探针，最优选的，所述过氧化氢荧光探针为对 SEQ ID NO：10和12所示的氨基酸序列。

本发明还提供一种编码权利要求1所述基因编码的过氧化氢荧光探针的核苷酸序列，所述核苷酸序列为SEQ ID NO：7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、31所示。。

本发明还提供一种制备所述基因编码的过氧化氢荧光探针的方法，包括以下步骤：

1)将含有所述核苷酸序列的表达载体转移到宿主细胞中，

2)在所述宿主细胞表达的条件下培养所述宿主细胞，和

3)由所述宿主细胞分离所述荧光探针。

本发明还提供一种表达载体，所述的表达载体由载体质粒与所述的核苷酸序列操作性连接得到的。所述表达载体选自原核表达载体、真核表达载体。

本发明所述原核表达载体，优选的是，由载体质粒pRSETb与所述的核酸序列操作性连接得到的。

本发明还提供一种包含所述的表达载体的宿主细胞。

本发明还提供基因编码的过氧化氢荧光探针在检测H₂O₂中的应用，包括在大肠杆菌中的应用和在哺乳动物细胞中的应用。

编码本发明所述氧化氢荧光探针的核苷酸序列选自Seq ID NO 7所示的HyPer-N337T,Y131F,S262R，Seq ID NO 9所示的HyPer-N337T,Y131F,Y271N，Seq ID NO 11所示的HyPer-S262R,Y271N,Y131F,N337T，Seq ID NO 13所示HyPer3-N337T,Y131F,S262R，Seq IDNO 15所示的HyPer3-N337T,Y131F,Y271N，Seq ID NO 17所示的HyPer3-N337T,Y131F,S262R,Y271N。

本发明所用的用于对H₂O₂进行表现的荧光蛋白序列可以来自于维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)的荧光蛋白及其衍生物，主要指的是环状重排黄色荧光蛋白(cpYFP)如SEQ ID NO：5所示。

本发明提供的表达载体，其包含与表达控制序列操作性连接的本发明核酸序列。所述表达控制序列可以是复制起点、启动子、增强子、操纵子、终止子、核糖体结合位点等。

本发明提供的制备本发明荧光探针或融合蛋白的方法，包括以下步骤：

a.将本发明表达载体转移到宿主细胞中，

b.在适合所述宿主细胞表达的条件下培养所述宿主细胞，和

c.由所述宿主细胞分离所述荧光探针或融合蛋白。

本发明还提供所述荧光探针在检测H₂O₂中的应用。在一个实施方式中，本发明提供所述荧光探针在活菌中检测H₂O₂中的应用。在一个实施方式中，本发明提供所述荧光探针在亚细胞水平检测H₂O₂中的应用。

发明详述

I.定义：

在给出数值或范围时，本文所用术语“约”指该数值或范围在给定数值或范围的20％以内、10％以内和5％以内。

本文所用术语“包含”、“包括”和其等同形式包括“含有”以及“由……组成”的含义，例如“包含”X的组合物可仅由X组成或可含有其它物质，例如X+Y。

在本发明中，术语“HyPer”指的是已报道一种遗传编码的的过氧化氢荧光探针，是将cpYFP蛋白插入到OxyR-RD中，中间以一段氨基酸短链相连接。

本文所用术语“HyPer蛋白突变体”或“HyPer突变体”或“理性设计的HyPer突变体”是指将HyPer探针cpYFP元件上的相应位点处，先是分别引入一个突变体位点，在荧光增强的突变体中继续引入，直至获得荧光强度最高的突变体。本发明中所涉及的“HyPer突变体”可以包含氨基酸序列SEQ ID NO：8,10,12,14,16,18。

本发明所述S262R为将第262位的氨基酸“S”突变为“R”，Y271N为将第271位的氨基酸“Y”突变为“N”、Y131F为将第131位的氨基酸“Y”突变为“F”和N337T为将第337位的氨基酸“N”突变为“T”。

本发明对HyPer过氧化氢荧光探针做了很多突变体，筛选出可以在活菌、亚细胞水平检测H₂O₂，探针特异性好，荧光强度较强的部分探针进行专利申请，该探针克服了由于探针荧光强度微弱而限制胞内H₂O₂精确检测的问题。

本文所用术语“GFP”指绿色荧光蛋白，最初是从维多利亚发光水母(Aequoreavictoria)中提取出来的，由238个氨基酸构成，分子量约为26kDa。GFP是由12条β-折叠链形成了独特的桶状结构，其内包裹着生色三肽(Ser65-Tyr66-Gly67)。当在氧气存在下，它会自发形成对-羟基苯亚甲基咪唑啉酮的生色团结构而产生荧光。GFP产生荧光不需要辅因子，而且荧光非常稳定，是一种良好的成像工具。GFP有两个激发峰，395nm的主峰可产生508nm的发射光，而肩峰475nm的激发光照射则会产生的503nm的发射光。

本文所用术语“cpFP”指环状重排的荧光蛋白，该蛋白最早衍生自绿色荧光蛋白GFP，其氨基酸序列与GFP同源性高达90％以上。它是将GFP的原始N端和C端通过一段柔性的短肽链连接，而在野生型GFP近生色团位置(如Y144和N145位氨基酸)制造一个新的N端和C端，将原第145-238位氨基酸部分作为新蛋白的N端，原第1-144位氨基酸作为新蛋白的C端，两片段间通过5～9个具有柔性的短肽链，如VDGGSGGTG或GGSGG等连接，形成一个对空间变化敏感的环状排列黄色荧光蛋白cpGFP(SEQ ID NO 5)。目前已经创造了多种环状重排的荧光蛋白(cpFP)用于荧光探针 的构建，其中应用最广泛一种是cpYFP，cpYFP对蛋白质的构象变化具有高度的灵敏性，并且通过荧光的改变来表征构象的变化。本发明中所涉及的“cpYFP”可以包含核苷酸序列SEQ ID NO:5编码的氨基酸序列。

本文所用术语“荧光动态变化”或“荧光变化”或“荧光变化倍数”指的的是荧光蛋白探针在结合配体后的荧光强度的变化，这种荧光变化可以根据荧光蛋白探针的光谱性质分为单通道变化或者双通道变化。单通道荧光变化的探针如基于cpBFP，cpGFP，cpTFP，cpRFP的探针，当这些探针和配体结合，它们的发射光荧光强度会增加或者降低，而这种增加或者降低的倍数就可以称为“荧光变化”。如果荧光探针蛋白是基于cpYFP的就可能拥有两个激发峰，当这种探针和配体结合，它们的不同激发光下的发射光荧光强度都有可能会增加或者降低，而将双通道的荧光变化相除得到的比值变化，也称为“荧光变化”。荧光变化越大，说明这个探针的性质越优良，更有可能用于细胞内检测。

本文所用术语“实时检测”或“时空特异性的检测”指的是荧光蛋白探针可以对细胞内特定空间进行实时追踪。当含有特定定位信号的荧光蛋白探针的质粒导入到细胞中后，就可以在细胞的特定区域中表达并驻留。在荧光显微镜等观察手段下对细胞进行连续成像，将获得的图片转化为细胞内的配体信号，就可以对细胞内的检测物进行时空特异性的检测。

本发明所用术语“变异体”，“突变体”或“衍生突变体”包括具有所述多肽或蛋白相同功能、但序列不同的变异体。这些变异体包括(但并不限于)：在所述多肽或蛋白的序列中缺失、插入和/或取代一个或多个(通常为1-30个，较佳地1-20个，更佳地1-10个，最佳地1-5个)氨基酸，以及在其羧基末端和/或氨基末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸获得的序列。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变多肽或蛋白的功能。在本领域中，性能相似的氨基酸往往指具有相似侧链的氨基酸家族，在本领域已有明确定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

本文所用术语“功能片段”、“衍生物”、“突变体”和“类似物”是指基本上保持与本发明理性突变产生的“HyPer突变体”相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的理性突变产生的“HyPer突变体”的功能片段、衍生物、突变体或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白。根据本文的教导，这些功能片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

所述类似物与理性突变产生的“HyPer突变体”的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术得到。

本发明所用术语“核酸”可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。提到核酸时，本文所用术语“变异体”可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括简并变异体、取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个核酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的蛋白的功能。本发明核酸可包含与所述核酸序列的序列相同性为至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％的核苷酸序列。

本发明荧光探针或融合蛋白的全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离和纯化得到有关多肽或蛋白。

本文所用的术语“质粒”，“重组质粒”，“载体”和“重组载体”等可互换使用，指本领域熟知的原核或真核载体，例如细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体，这些载体能够在宿主体内复制和稳定，这些重组载体的一个重要特征是通常含有表达控制序列。在本发明中适用的重组载体包括但不限于细菌质粒。在重组表达载体中，“操作性连接”是指目的的核苷酸序列与调节序列以允许核苷酸序列表达的方式连接。本领域的技术人员熟知能用于构建含本发明融合蛋白编码序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体的方法。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTR和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

本领域普通技术人员将理解重组表达载体的设计可取决于如欲转化的宿主细胞的选择、所需的蛋白质表达水平等因素。此外，重组表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于 选择转化的宿主细胞的表型性状，如用于真核细胞的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

在一种实施方式中，将本发明荧光探针的编码序列经BamHI和HindIII双酶切后与BamHI和HindIII双酶切的pRSETb载体连接，得到大肠杆菌重组表达载体。可以将本发明的表达载体转移到宿主细胞中，以产生包括融合蛋白的蛋白或肽。此种转移过程可用转化或转染等本领域技术人员熟知的常规技术进行。

本文在所用术语“宿主细胞”又称为受体细胞，是指能够接收和容纳重组DNA分子的细胞，是重组基因扩增的场所，理想的受体细胞应该满足易于获取和增殖两个条件。本发明的“宿主细胞”可包括原核细胞和真核细胞，具体包括细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。

本发明的表达载体可用于在原核或真核细胞中表达本发明荧光探针。从而，本发明涉及已导入本发明表达载体的宿主细胞、优选大肠杆菌。宿主细胞可为任何原核或真核细胞，代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属，鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞，真菌细胞如酵母，植物细胞，果蝇S2或Sf9的昆虫细胞，CHO、COS、HEK293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等，其中包括但不限于上述的那些宿主细胞。所述宿主细胞优选各种利于基因产物表达或发酵生产的细胞，此类细胞已为本领域熟知并常用，例如各种大肠杆菌细胞和酵母细胞。在本发明的一个实施方式中，选用大肠杆菌JM109本发明融合蛋白的宿主细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

本文所用术语“转化”和“转染”、“接合”和“转导”意指本领域内公知的各种将外源核酸(例如，线性DNA或RNA(例如，线性化载体或无载体的单独的基因构建体))或载体形式的核酸(例如，质粒、粘粒、噬菌体、噬粒、噬菌粒、转座子或其它DNA)导入宿主细胞的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-甘露聚糖-介导的转染、脂转染、天然感受态、化学介导的转移或电穿孔。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主细胞是真核细胞时，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

可以用适合所述宿主细胞表达的常规方法培养获得的转化细胞，表达本发明融合蛋白。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可以是各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组蛋白可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离或纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技 术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明荧光探针的用途包括但不限于：检测H₂O₂、在生理状态下检测H₂O₂、在亚细胞水平检测H₂O₂、原位检测H₂O₂、诊断与与H₂O₂水平有关的疾病等。

在本文中，浓度、含量、百分数和其它数值均可用范围的形式表示。也应理解，使用这种范围形式只是为了方便和简洁，应该被弹性地借读为包括范围上下限所明确提及的数值，还应包括该范围内包括的所有单个数值或子范围，就好像明确提及各个数值和子范围那样。

本发明的荧光探针突变体在哺乳动物中成熟性很好，有利于在细胞质膜，线粒体等亚细胞器的表达。结构示意图见图1所示。

有益技术效果：

本发明提供的基因编码的H₂O₂荧光探针及其制备方法和应用，该基因编码的H₂O₂荧光探针可以在活菌、亚细胞水平检测H₂O₂；探针特异性非常好，对H₂O₂具有选择性，且对H₂O₂的动态响应变化没有因为突变位点的引入而受影响。其他的ROS分子，如一氧化氮，过氧亚硝基，超氧阴离子及氧化的谷胱甘肽都无法使其荧光发生变化。突变体蛋白易于成熟，其荧光动态变化大，是一种适合于生理水平和亚细胞特异性的实时检测H₂O₂的技术。

本发明克服了现有技术H₂O₂探针在检测中荧光强度过低的问题，在大肠杆菌中表达的优选突变体，其荧光强度与已有的HyPer探针相比，在485nm激发下的荧光增加了近4倍；而在哺乳动物细胞中表达的优选突变体，其荧光强度与已有的HyPer探针相比，在485nm激发下的荧光强度增加了近5倍。本技术克服了由于探针荧光强度微弱而限制胞内H₂O₂精确检测的问题。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1遗传编码的H₂O₂荧光探针HyPer突变体的设计示意图

图2不同HyPer突变体在大肠杆菌中诱导表达的荧光强度比较

图3在HEK293细胞中表达的基因编码的H₂O₂荧光探针HyPer的突变体，在亚细胞器定位表达的荧光强度比较。

图4在HEK293细胞中表达的基因编码的H₂O₂荧光探针HyPer的突变体，实时测定外源H₂O₂加入对细胞内H₂O₂水平变化的影响。

图4-A在HEK293细胞中表达的优选突变体pCDNA3.1-HyPer-N337T,Y131F,Y271N,S262R对H₂O₂的动态响应变化

图4-B在HEK293细胞中表达的优选突变体pCDNA3.1-HyPer3-N337T,Y131F,S262R

对H₂O₂的动态响应变化

图4-C在HEK293细胞中表达的阴性对照pCDNA3.1-HyPer3-C199S对H₂O₂的动态响应变化

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

I.实验材料和试剂

以下用实施例对本发明作进一步阐述。这些实施例仅仅用于举例说明，而不对本发明的范围构成任何限制。实施例中主要采用常规的基因工程分子生物学克隆方法和细胞培养以及成像方法等，这些方法是本领域普通技术人员所熟知的，例如：简·罗斯凯姆斯等的《分子生物学实验参考手册》，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著,黄培堂等译：《分子克隆实验指南》(第三版，2002年8月，科学出版社出版，北京)；费雷谢尼等的《动物细胞培养:基本技术指南》(第五版)，章静波，徐存拴等译；J.S.博尼费斯农，M.达索等的《精编细胞生物学实验指南》，章静波等译。本领域普通技术人员按照以下实施例，不难根据具体情况略作修改和变换而成功实施本发明，这些修改和变换均落在本申请权利要求的范围内。

实施例中所用的基于pcDNA3.1的不同定位信号的质粒，pRSETb-HyPer质粒由华东理工大学蛋白质实验室构建，pRSETb，pBad-myc-HisB，pDisplay，pcDNA3.1-flag等质粒载体购自Invitrogen公司。所有用于PCR的引物均由上海捷瑞生物工程技术有限公司合成、纯化和经质谱法鉴定正确。实施例中构建的表达质粒都经过序列测定，序列测定由华大基因公司和杰李测序公司完成。各实施例所用的Taq DNA聚合酶购自东盛生物，pfu DNA聚合酶购自天根生化科技(北京)有限公司，primeSTAR DNA聚合酶购自TaKaRa公司，三种聚合酶购买时都附带赠送对应聚合酶缓冲液和dNTP。BamHI、BglII、HindIII、NdeI、XhoI、EcoRI、SpeI等限制性内切酶、T4连接酶、T4磷酸化酶(T4PNK)购自Fermentas公司，购买时附带有相对应的缓冲液等。H2O2购自Merck公司。除非特别声明，无机盐类等化学试剂均购自sigma-aldrich公司。HEPES盐，氨苄青霉素(Amp)和嘌呤霉素购自Ameresco公司；96孔检测黑板、384孔荧光检测黑板购自Grenier公司。

实施例中所用的DNA纯化试剂盒购自BBI公司(加拿大)，普通质粒小抽试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，转染级别质粒小抽试剂盒购自OMEGA公司。克隆菌株JM109(DE3)，MachI购自Invitrogen公司。

实施例中所用的HEK293等细胞购自ATCC细胞保藏库，磷酸盐缓冲液(PBS)，胰酶，澳洲特级胎牛血清，lipofectamine 2000，DMEM培养基都是购自美国invitrogen公司，小干扰RNA(siRNA) 由上海吉玛公司合成。

实施例中用到的主要仪器：Biotek Synergy 2多功能酶标仪(美国Bio-Tek公司)，X-15R高速冷冻离心机(美国Beckman公司)，Microfuge22R台式高速冷冻离心机(美国Beckman公司)，PCR扩增仪(德国Biometra公司)，超声破碎仪(宁波新芝公司)，核酸电泳仪(申能博彩公司)，荧光分光光度计(美国Varian公司)，CO2恒温细胞培养箱(SANYO)，倒置荧光显微镜(日本尼康公司)，活体成像系统(美国Kodak公司)，Aria II流式细胞仪(美国BD公司)。

II.实施例中用到的常规分子生物学方法和细胞实验方法

(一)聚合酶链式反应(PCR)：

1.目的片段扩增PCR：

该方法主要用于基因片段扩增和菌落PCR鉴定阳性克隆。

扩增步骤(bp表示扩增片段的核苷酸数量)：

2.长片段(>2500bp)扩增PCR：

本发明中使用的长片段扩增，主要是反向PCR扩增载体，在下述实施例中用于获得定点突变的一种技术。在变异部位设计反向PCR引物，其中一条引物的5’端包含变异的核苷酸序列。扩增后的产物就含有相应的突变位点。

扩增步骤(bp表示扩增片段的核苷酸数量)：

或者

(二)核酸内切酶酶切反应：

对质粒载体进行双酶切的体系(n代表使体系达到总体积所需要加入的灭菌超纯水μL量)：

(三)DNA片段5’端磷酸化反应

从微生物中抽提出的质粒或者基因组末端都含有磷酸基团，而PCR产物没有，故需对PCR产物的5’端碱基进行磷酸基团加成反应，只有末端含有磷酸基团DNA分子才能发生连接反应。

T4PNK为T4多聚核苷酸激酶的简写，用于对DNA分子的5’端磷酸基团的加成反应。

(四)目的片段和载体的连接反应

不同的片段和载体之间的连接方法有所差异，本发明中使用了三种连接方法

1.平末端短片段和线性化载体的平末端连接

该方法的原理是PCR获得的平末端产物在T4PNK作用下对DNA片段的5’末端进行磷酸化反应后，与线性化的载体在PEG4000和T4DNA连接酶的作用下连接获得重组质粒。

2.含有粘性末端的DNA片段和含有粘性末端载体片段的连接

通过限制性内切酶切割的DNA片段通常会产生突出的粘性末端，因此可以和含有序列互补的粘性末端载体片段连接，形成重组质粒。

注：PCR产物片段与载体双酶切产物的质量比大致在2:1—6:1之间。

3.反向PCR引入定点突变后5’端磷酸化的DNA片段产物自身环化的连接反应

将5’端磷酸化的DNA片段通过自身环化连接反应将线性化载体的3’端和5’端连接反应得到重组质粒。

(五)感受态细胞的制备与转化

感受态细胞的制备：

1.挑取单菌落(如Mach1)接种于5mL LB培养基中，37℃摇床过夜。

2.取0.5-1ml过夜培养的菌液转种到50mL LB培养基中，37℃，220rpm培养3至5h，直到OD600达到0.5。

3.冰浴预冷细胞2h。

4.4℃4000rpm离心10min。

5.弃上清，用5ml预冷的重悬缓冲液悬浮细胞，待均匀后再加入重悬缓冲液至终体积为50mL。

6.冰浴45min。

7.4℃4000rpm离心10min，用5mL冰预冷的储存缓冲液重悬细菌。

8.每个EP管中放100μL菌液，-80℃或液氮冻存。

重悬缓冲液:CaCl2(100mM)、MgCl2(70mM)、NaAc(40mM)

储存缓冲液:0.5mL DMSO、1.9mL 80％甘油、1mL 10×CaCl2(1M)、1mL 10×MgCl2(700mM)、1mL 10×NaAc(400mM)、4.6mL ddH2O

转化：

1.取100μl感受态细胞于冰浴上融化。

2.加入适当体积的连接产物，轻轻吹打混匀，冰浴30min。通常加入的连接产物的体积少于感受态细胞体积的1/10。

3.将菌液放入42℃水浴中热激90秒，迅速转移至冰浴中放置5min。

4.加入500μl LB，于37℃恒温摇床上200转培养1h。

5.将菌液4000rpm离心3min，留200μl上清将菌体吹匀，均匀涂布于含适当抗生素的琼脂平板表面，平板于37℃恒温培养箱内倒置过夜。

(六)原核表达HyPer突变体的荧光检测

1.将pRSETb为基础的HyPer探针及其突变体质粒转化到JM109(DE3)中，倒置培养过夜，从平板上挑取克隆到5ml试管中，置于37℃摇床，220rpm培养至OD＝0.4～0.8，加入1/1000(v/v)的IPTG(1M)，18℃诱导表达24～36h。

2.诱导表达完成后，4000rpm，30min离心收菌，使用测定缓冲液(100mM HEPES，100mM NaCl，pH 7.3)或者磷酸盐缓冲液PBS稀释探针成OD约为0.05～0.1。用测定缓冲液(100mM HEPES，100mM NaCl，pH 7.3)或者磷酸盐缓冲液PBS将H2O2配制成终浓度为10mM的储液，在测定前配置成为不同浓度梯度储液待用。

3.取95μl菌液，37℃温育5min，利用多功能荧光酶标仪测定HyPer突变体在大肠杆菌中表达的荧光强度，设置参数为485nm和420nm激发，528nm发射。随后分别加入不同浓度的H₂O₂，混匀后至终浓度依次为0，0.001,0.01,1,10,50μM，利用多功能酶标仪在485nm和420nm激发，528nm发射条件下，检测突变体对H₂O₂的荧光响应变化。

(七)哺乳动物细胞的转染和荧光检测

1.取对数生长期的细胞，吸出细胞培养板中的旧培养液，用磷酸盐缓冲液PBS洗涤细胞一次

2.加入0.5ml胰酶，37℃或者常温作用数分钟，于光学显微镜下进行观察，当细胞呈现圆粒状将要离壁时，就可以终止消化。

3.加入无抗生素的含有胎牛血清的培养基，轻拍培养板使细胞脱落，用吸管轻轻吹匀打散细胞团，将单细胞悬液铺板到24孔培养板或者35毫米玻璃底培养板。

4.约12小时候转染，使用lipofectamine 2000将合适量的质粒或者siRNA转染到细胞中，4-6小时候更换培养基。

5..酶标仪荧光检测：消化细胞后铺板到96孔黑底的荧光检测板，放入酶标仪进行荧光检测，比较不同突变体的荧光差异。随后加入不同浓度的H₂O₂，混匀后至终浓度依次为0,50μM，100μM,150μM检测突变体对H₂O₂的动态响应变化。

实施例1.pRSETb-HyPer突变体质粒的构建和检测

我们在华东理工大学蛋白质技术实验室已经按上述II.实施例中用到的常规分子生物学方法和细胞实验方法构建了pRSETb-HyPer，以该质粒为模板，通过反向PCR扩增线性化载体，T4PNK 加磷后载体自连，引入上述N337T,Y131F,S262R,Y271N四个位点的突变。使用通用引物T7正向测序，其中部分HyPer蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:8,10,12,14,16,18,20,22,24,26,28,30,32所示。

所用引物为：

P1:HyPer-Y131F-fw CAGCGACAACGTCTATATCATGGCCG

P2:HyPer-Y131F-rv TTGAAGCCGGCGGACATTGCCTGAT

P3:HyPer-S262R-fw CAGCGTGCGTGGCGAGGGCGAGG

P4:HyPer-S262R-rv AACTTGTGGCCGTTTACGTC

P5:HyPer-Y271N-fw CACCAACGGCAAGCTGACCCTGAAG

P6:HyPer-Y271N-rv GCATCGCCCTCGCCCTCGCCGGACAC

P7:HyPer-N337T-fw GGCACTTACAAGACCCGCGCCG

P8:HyPer-N337T-rv GTCGTCCTTGAAGAAGATGGT

经过测序正确后，将重组质粒转化到JM109(DE3)中诱导表达，利用活菌进行检测。利用酶标仪检测突变样品在大肠杆菌中表达的荧光强度(420nmEX,485nmEX,528nmEM)。结果如表1所示，结果显示：

本发明首先在pRSETb-HyPer上分别引入1个突变位点，如表1-step1所示，得到突变体N337T荧光增加明显，于是以pRSETb-HyPer-N337T为模板，依次引入其他三个突变位点，得到突变体pRSETb-HyPer-N337T,Y131F荧光增加明显。Step3是以pRSETb-HyPer-N337T,Y131F为模板，依次引入突变位点S262R和Y271N，得到的突变体pRSETb-HyPer-N337T,Y131F,Y271N,pRSETb-HyPer-N337T,Y131F,S262R和pRSETb-HyPer-N337T,Y131F,Y271N,S262R荧光都有所增加。其中最优的是突变体pRSETb-HyPer-N337T,Y131F,Y271N，在485nm EX检测条件下，荧光强度是HyPer的5倍，在420nm EX检测条件下，荧光强度是HyPer的2.75倍。485nm EX检测条件下，HyPer-N,337T,Y131F,S262R,Y271N的荧光强度是HyPer的3.5倍。

表1

说明：+表征荧光强度，+越多荧光越强

实施例2 pCDNA3.1-HyPer和pCDNA3.1-HyPer-3突变体质粒的构建和检测

突变体pRSETb-HyPer-N337T,Y131F,Y271N，pRSETb-HyPer-N337T,Y131F,S262R和pRSETb-HyPer-N337T,Y131F,Y271N,S262R荧光都有所增加。于是将三个突变体蛋白在哺乳动物细胞中表达，在细胞中检测探针的荧光强度

此外，据文献报道，HyPer与HyPer-3的荧光强度近似，但HyPer-3对H₂O₂具有较高的动态响应变化，于是将实施例1中的导致HyPer探针荧光增强的三个突变体对应的位点引入HyPer-3中。构建质粒所用引物如下：

P9:HyPer-BamHI-fw CATGGATCCGATGGAGATGGCAAG

P10:HyPer-HindIII-rv AAGCTTAACCGCCTGTTTTAAAAC

经过测序正确后(如表2所示)将重组质粒在293细胞中进行转染，使六个突变体探针在哺乳动物细胞中表达。

表2

以pCDNA3.1-HyPer的荧光为标准，将所有样品的荧光值标准化。如图3所示，荧光最高的样品是pCDNA3.1-HyPer3-N337T,Y131F,S262R(H3-NYS)的荧光强度最高，485nm激发条件下，荧光强度 是原始探针pCDNA3.1-HyPer的6.3倍。其次是pCDNA3.1-HyPer3-N337T,Y131F,S262R,Y271N(H-NYYS)，在485nm激发条件下，其荧光强度是原始探针pCDNA3.1-HyPer的4.7倍。可见这四个突变位点的引入，对HyPer探针荧光强度的增加有所帮助。

实施例3HyPer突变体探针对H₂O₂动态响应变化检测

除了使突变体pCDNA3.1-HyPer3-N337T,Y131F,S262R和pCDNA3.1-HyPer-N337T,Y131F,S262R,Y271N的荧光强度有明显的增加，还要保证突变位点的引入不会影响探针对H₂O₂的动态响应变化。因此将两个突变体及阴性对照质粒pCDNA3.1-HyPer-3-C199S在293细胞中转染，消化细胞后铺板到96孔黑底的荧光检测板。随后加入不同浓度的H₂O₂，混匀后至终浓度依次为0，50μM，100μM，150μM检测突变体对H₂O₂的动态响应变化。结果如图4所示。

结果表明，在50μM的H₂O₂浓度下，突变体pCDNA3.1-HyPer-N337T,Y131F,S262R,Y271N(图4-A)的对H₂O₂的动态响应倍数与HyPer的理论值近似，约为3.5倍。而pCDNA3.1-HyPer3-N337T,Y131F,S262R(图4-B)对H₂O₂的动态响应变化略低于HyPer3理论值(约6倍)，约为4.5倍，而阴性对照C199S对H₂O₂没有响应。H₂O₂浓度超过50μM，对细胞环境的pH有影响，对检测有干扰。

综上所述，对过氧化氢探针HyPer和HyPer3的基因中引入突变位点N337T,Y131F,S262R,Y271N可以提高HyPer探针(包括HyPer和HyPer3)的荧光强度，且不影响探针对H₂O₂的动态响应变化。通过对HyPer荧光的优化，可以在细胞检测中降低探针的表达量，减少蛋白生物合成中产生的H₂O₂对检测造成的干扰，为进一步研究H₂O₂的动态变化提供了有效的工具。

其它实施方式

本说明书描述了许多实施方式。然而应理解，本领域技术人员通过阅读本说明书获知不背离本发明的构思和范围的各种改进。因此，这些其他实施方式也应包括在所附权利要求书的范围内。

Claims (7)

1.一种基因编码的过氧化氢荧光探针，包括SEQ ID NO:34所示对H₂O₂敏感的多肽OxyR和SEQ ID NO:6所示对H₂O₂进行表现的荧光蛋白cpYFP，将荧光蛋白cpYFP插入到对H₂O₂敏感的多肽OxyR中，形成荧光探针，其特征在于：所述过氧化氢荧光探针为对荧光探针中的荧光蛋白cpYFP序列进行突变而得到的突变体；

所述过氧化氢荧光探针为对SEQ ID NO：2所示的HyPer荧光探针的S262R、Y271N、Y131F和N337T位点中的1个或1个以上位点进行突变的突变体；所述过氧化氢荧光探针为HyPer-N337T,Y131F,Y271N、HyPer-N337T,Y131F,S262R,Y271N、HyPer-N337T或HyPer-N337T,Y131F；

或者所述过氧化氢荧光探针为对SEQ ID NO：4所示的HyPer3荧光探针的S262R、Y271N、Y131F和N337T位点中的1个或1个以上位点进行突变的突变体；所述HyPer3荧光探针为HyPer荧光探针的H34Y位的突变体；所述过氧化氢荧光探针为HyPer3-N337T,Y131F,S262R、HyPer3-N337T,Y131F,Y271N或HyPer3-N337T,Y131F,S262R,Y271N。

2.根据权利要求1所述的基因编码的过氧化氢荧光探针，其特征在于，所述过氧化氢荧光探针为SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、28所示的氨基酸序列。

3.一种编码权利要求1所述基因编码的过氧化氢荧光探针的核苷酸，所述核苷酸序列为SEQ ID NO：9、11、13、15、17、19、27所示。

4.一种制备权利要求1-2任一项所述基因编码的过氧化氢荧光探针的方法，包括以下步骤：

1)将含有权利要求3所述核苷酸序列的表达载体转移到宿主细胞中，

2)在所述宿主细胞表达的条件下培养所述宿主细胞，和

3)由所述宿主细胞分离所述荧光探针。

5.一种表达载体，所述的表达载体由载体质粒与权利要求3所述的核苷酸序列操作性连接得到的。

6.一种包含权利要求5所述的表达载体的宿主细胞。

7.权利要求1-2任一项所述基因编码的过氧化氢荧光探针在检测H₂O₂中的应用。