CN110243790B

CN110243790B - 一种对过氧化氢特异性响应的基因编码型荧光生物探针及其构建方法和用途

Info

Publication number: CN110243790B
Application number: CN201910260413.6A
Authority: CN
Inventors: 周胜敏; 阳瑜红; 夏阳; 余海军; 周瑶; 李静怡; 吕航亚
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2019-04-02
Filing date: 2019-04-02
Publication date: 2021-06-22
Anticipated expiration: 2039-04-02
Also published as: CN110243790A

Abstract

本发明公开了一种对过氧化氢特异性响应的基因编码型荧光生物探针及其构建方法和用途，对过氧化氢具有特异性响应的基因编码型荧光探针是通过将对过氧化氢特异性敏感的PrxA和TrxA分别融合到cpYFP荧光蛋白的两端构成。本发明荧光探针对过氧化氢具有高灵敏性和选择性，在胞内和胞外均能迅速响应过氧化氢，特别是该探针是一种基因编码型探针，能够组成型表达，实现实时动态检测胞内过氧化氢浓度的变化以及用于细胞成像，对于研究氧化还原代谢相关信号通路具有广阔的应用前景。

Description

一种对过氧化氢特异性响应的基因编码型荧光生物探针及其构建方法和用途

技术领域

本发明属于荧光生物探针及其检测过氧化氢的方法领域，尤其涉及一种对过氧化氢特异性响应的基因编码型荧光生物探针及其构建方法和用途。

背景技术

活性氧(ROS)曾被认为对细胞是致死的，但是现在被认为是一种参与多种氧化还原信号传导的分子，对细胞的正常功能和疾病的发生均有贡献。胞内低水平的ROS能够作为信号分子。当胞内产生的ROS含量远超过胞内一系列抗氧化系统的抗氧化能力范围时，ROS的水平会进一步增加。后者与氧化应激和相关的信号传导的诱导有关，并且其特征在于ROS诱导的细胞内氧化还原稳态的变化和/或对生物分子(例如DNA、蛋白和脂质)的破坏作用。因为ROS的产生和除去涉及复杂的机制，以及能够对某一种类型的活性氧具有真正特异性的报告分子的缺乏，定量胞内和亚细胞结构内的ROS的水平是一项具有挑战性的工作。

ROS的一个主要成分过氧化氢，多年来被认为是好氧生物不可避免的但又是不期望的副产物，如果消耗的更快对细胞更有利。但是近来更多的被各大研讨会强调，哺乳动物能够通过产生过氧化氢介导多种不同的生理反应，比如细胞增殖、分化和迁移等。这个过程意味着“氧化还原”在细胞正常过程和疾病进展，如血管生成、氧化应激和衰老以及癌症等过程中起着信号作用。一种简单高灵敏度的过氧化氢检测方法具有广泛的分析应用价值。不论在监测食品、消费品和环境水，如雨水，中低水平的过氧化氢，还是在检测过氧化氢水平来研究其是否作为信号传导分子还是诱导很多疾病的发生方面都具有重要的地位。

荧光探针是活体细胞实时成像的一个基石以及是细胞生物学上的一个强有力的工具。源于荧光蛋白的基因编码的探针在实时观测和追踪胞内不同过程中正起着引领革命的作用。最近的一些进步，包括用于测量活体细胞中生物分子的表达和定位的“被动”标记物的不断发展，和开发的监测更复杂的胞内过程，如小分子信使的动力学变化过程、蛋白酶激活过程和蛋白-蛋白间相互作用过程等，指示器的不断出现，都推动了荧光蛋白的细胞生物学方面的发展。

为了在胞内检测过氧化氢这一重要的信号分子，相关报道的基因编码型探针也已经有被开发出来，但是响应更加快速、更灵敏以及更准确的生物探针还有待被开发，进而弥补现有过氧化氢检测方法存在的不足，以及对推动氧化还原信号传导的研究、生理和病理的研究具有重要意义。

发明内容

本发明的目的就是针对现有过氧化氢检测方法的不足，通过基因融合的手段构建一种能在体内、体外均对过氧化氢具有高灵敏性和高选择性的基因编码型荧光生物探针的构建方法。

本发明的第二个目的在于提供一种对过氧化氢特异性响应的基因编码型荧光生物探针。

本发明的第三个目的在于提供一种多核苷酸分子。

本发明的第四个目的在于提供一种重组质粒。

本发明的第五个目的在于提供对过氧化氢特异性响应的基因编码型荧光生物探针的应用。

为了实现上述目的，本发明提供了一种对过氧化氢特异性响应的基因编码型荧光生物探针的构建方法，其特征在于，所述构建方法为将对过氧化氢特异性敏感的PrxA和TrxA分别融合到cpYFP荧光蛋白的两端。

作为一个优选方案，先将TrxA氨基酸序列的半胱氨酸替换为极性氨基酸，得到TrxA突变体再进行融合。

作为一个优选方案，所述极性氨基酸包括谷氨酰胺，天门冬酰胺，丝氨酸，络氨酸，精氨酸，组氨酸，赖氨酸，天门冬氨酸和谷氨酸中的任意一种。

作为一个优选方案，所述构建方法包括如下具体步骤：

步骤1：将SEQ ID NO.1所示的TrxA氨基酸序列的第39位半胱氨酸替换为极性氨基酸，得到TrxA突变体；

步骤2：将SEQ ID NO.2所示的编码PrxA的核酸序列、步骤1中所得的TrxA突变体的核酸序列和SEQ ID NO.3所示的编码cpYFP的核酸序列进行融合，得到过氧化氢特异性响应的基因编码型荧光生物探针。

作为一个优选方案，TrxA突变体位于cpYFP的氮端或碳端，中间插入连接肽X1，所述X1是GGGS，GGGGS，SAG，GT，LAEAAAKEAA，TSGSPGLQEFGT中的任意一种。

作为一个优选方案，PrxA位于cpYFP的碳端或氮端，中间插入连接肽X2，所述X2是GGGS，GGGGS，SAG，GT，LAEAAAKEAA，TSGSPGLQEFGT中的任意一种。

为了实现本发明第二个目的，本发明提供了利用上述构建方法制备获得的对过氧化氢特异性响应的基因编码型荧光生物探针。

为了实现本发明第三个目的，本发明提供了一种多核苷酸分子，其特征在于，所述多核苷酸分子的核酸编码上述对过氧化氢特异性响应的基因编码型荧光生物探针。

为了实现本发明第四个目的，本发明提供了一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒表达载体包含编码上述多核苷酸分子基因。

为了实现本发明第五个目的，本发明提供了上述对过氧化氢特异性响应的基因编码型荧光生物探针在过氧化氢或有机过氧化物的检测中的应用。

利用本发明基因编码型荧光生物探针进行体外过氧化氢的定性或定量检测的方法为，将上述编码荧光生物探针的基因克隆到表达载体上，转化到大肠杆菌E.coli DH5α中，筛选阳性克隆，并抽提阳性重组质粒，转化到表达菌株E.coli BL21(DE3)中，蛋白表达后进行纯化。纯化的蛋白稀释到一定浓度检测过氧化氢。

基因编码型荧光生物探针进行体外过氧化氢的定性或定量检测具体包含如下优选方式：

(1)所述荧光生物探针的表达载体为pET28a。

(2)所述荧光生物探针蛋白表达的条件为，表达菌株在37℃培养，浓度达到OD₆₀₀在0.4-0.6左右时，添加0.1-0.3mM IPTG进行诱导，表达蛋白的温度为16-20℃，表达时间为15-24h。

(3)所述荧光生物探针蛋白纯化的条件为，利用添加有2-10mM巯基乙醇的缓冲液A(20mM NaH₂PO₄，0.5M NaCl，pH7.0)悬浮细胞，超声破碎，9000-12000g离心10-20分钟，上清通过0.45μm的过滤器，再用镍柱进行纯化。洗脱液为添加有2-10mM巯基乙醇的缓冲液B(20mM NaH₂PO₄，0.5M NaCl，0.5M咪唑，pH7.0)。纯化后的蛋白利用15mL超滤管进行超滤，超滤转速为4680～5000rpm。最终将蛋白超滤除咪唑保存在含有1～2mM DTT的50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)中。

(4)体外检测过氧化氢的所述荧光生物探针在50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)中，在530nm激发下，在410-420nm和495-505nm处有两个激发峰。在485nm激发条件下，在515-525nm处有激发峰。

(5)体外检测过氧化氢的所述荧光生物探针的浓度为0.4-1μM。

(6)体外检测过氧化氢的检测限为0.1-1μM。

(7)对过氧化氢的响应具有高选择性。

利用本发明基因编码型荧光生物探针进行体内过氧化氢的定性或定量检测的方法。表达上述基因编码型荧光生物探针的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)经离心、洗涤后稀释在检测缓冲液中进行过氧化氢检测。

基因编码型荧光生物探针进行体内过氧化氢的定性或定量检测具体包含如下优选方式：

(1)表达上述基因编码型荧光生物探针的大肠杆菌稀释后浓度在OD₆₀₀为0.1～0.4之间。

(2)表达上述基因编码型荧光生物探针的大肠杆菌洗涤以及稀释液均为50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)

(3)表达上述基因编码型荧光生物探针的大肠杆菌能够快速响应外源添加的过氧化氢，时间不超过30s。

(4)上述基因编码型荧光生物探针在体内可用于活体细胞成像。

(5)表达上述基因编码型荧光生物探针的大肠杆菌响应外源添加的过氧化氢的检测限为0.5-5μM。

本发明的优点在于，(1)本发明中该类探针分子的构建方法提供了一种构建响应不同底物的基因编码型荧光探针的方法和思路。(2)该类荧光生物探针在胞内和胞外均能迅速、高灵敏和高选择性地响应过氧化氢，且在胞内响应外源添加的过氧化氢的检测限明显低于同等条件下有关研究报道的检测限，是一个超灵敏的过氧化氢响应型荧光生物探针。(3)该类荧光生物探针能够用于大肠杆菌响应过氧化氢的细胞成像。(4)不论在胞外还是在胞内，该类荧光生物探针对过氧化氢的快速响应、高灵敏性和高选择性均能极大地推动过氧化氢参与的信号通路的研究的发展，为氧化还原有关的生理和病理的研究奠定基础。

附图说明

图1为纯化的本发明基因编码型荧光生物探针响应不同浓度过氧化氢时，荧光谱图的变化，横坐标为激发光的波长(nm)，纵坐标为以还原型上述荧光生物探针的荧光进行规整化的荧光强度。在发射波长为530nm条件检测。上述荧光生物探针蛋白在响应过氧化氢后，415nm处峰值会下降，500nm处峰值会上升，随着过氧化氢浓度的不同，415nm和500nm处峰值变化程度不同，即F_500nm/F_415nm比值变化不同。

图2为纯化的本发明基因编码型荧光生物探针响应不同氧化剂的荧光变化，横坐标为不同氧化物质，纵坐标为氧化型比率R(F_500nm/F_415nm)除以还原型比率R₀的值。发生氧化后，R/R₀增大，氧化程度越大，R/R₀越大，若不响应R/R₀则为1。其中所添加的氧化物分别为10μM过氧化氢、1μM叔丁基过氧化氢、1mM氧化型谷胱甘肽、40μM 1-(羟基-NNO-氮氧基)-L-脯氨酸二钠盐(一氧化氮供体)、10μM半胱氨酸和10μM的3-吗啉基-斯德亚胺(SIN-1，过氧化亚硝酸盐供体)。

图3为表达本发明荧光生物探针的大肠杆菌响应过氧化氢前(图3A)和后(图3B)在488nm激光条件下检测的细胞成像图。

图4为本发明荧光生物探针在大肠杆菌胞内响应不同浓度的过氧化氢的情况。图4A为表达本发明荧光生物探针的大肠杆菌在0.5μM和5μM过氧化氢的刺激下的R/R₀随时间变化图，横坐标为时间，纵坐标为氧化型比率R(F_500nm/F_415nm)除以还原型比率R₀的值。图4B为表达本发明荧光生物探针的大肠杆菌在不同浓度过氧化氢的刺激下的R/R₀的变化的柱状图，横坐标为过氧化氢的浓度，纵坐标为氧化型比率R(F_500nm/F_415nm)除以还原型比率R₀的值。

具体实施方式

以下，结合具体实施方式对本发明的技术进行详细描述。应当知道的是，以下具体实施方式仅用于帮助本领域技术人员理解本发明，而非对本发明的限制。

下列实施例中的材料来源为：

质粒载体pET28a购自Novagen公司。

限制性内切酶EcoR I、Hind III和primeSTAR均为Takara公司的市售产品。

多片段同源重组一步克隆试剂盒购自Vazyme公司。

cpYFP基因序列由上海睿迪生物科技公司合成并连接在pET28a的BamH I/Xho I酶切位点中间。带有PrxA和TrxA片段的质粒由本实验室构建并分别作为PrxA和TrxA基因扩增的模板。

除非另有说明，下列实施例中的具体实验按照本领域常规方法和条件进行，或遵照试剂盒的商品说明书。以下实施案例中的定量实验，均设置三次重复试验，结果为平均值±标准差。

实施例1过氧化氢特异性响应基因编码型荧光生物探针的构建

1、TrxA(C39E)基因片段的扩增

PrxA和TrxA之间形成稳定的二硫键需要将TrxA的C_P(即39位半胱氨酸)突变掉。本实验选用将TrxA39位半光氨酸突变为谷氨酸。设计上游引物TrxA-C39E-F：5’-GACATGGTGCGGTCCCGAAAAGGCCATTGCGC-3’和下游引物TrxA-C39E-R：5’-TGGGCGCAATGGCCTTTTCGGGACCGCACCATGTCG-3’，利用本实验室构建的带有TrxA基因的质粒为模板进行定点突变，并筛选到成功突变体重组质粒，其中下划线所示序列为突变位点。以产生的突变体重组质粒为模板，设计上游引物TrxA-F：5’-ATGGGTGCCTCTGAACACGTCC-3’和下游引物TrxA-pET28a-R：

将TrxA(C39E)基因片段扩增出来，其中加粗部分为与pET28a质粒载体同源的同源臂部分，下划线所示部分为HindIII酶切位点。PCR产物进行纯化回收。

2、PrxA和cpYFP基因片段的扩增

利用带有本实验室构建的带有PrxA的重组质粒和合成的带有cpYFP基因的质粒为模板，分别设计引物将PrxA和cpYFP基因片段扩增出来。设计上游引物pET28a-PrxA-F：

和下游引物PrxA-R：5’-CAGGTGCTTGATGACAGTCTCGG-3’进行PrxA的扩增，其中加粗部分为与pET28a质粒载体同源的同源臂部分，下划线所示序列为EcoRI酶切位点。设计上游引物PrxA-X1-cpYFP-F：

TACAACAGCCACAACGTCTATATC-3’和下游引物cpYFP-X2-TrxA-R：

进行cpYFP的扩增。其中上游引物加粗部分为与PrxA同源的同源臂部分，下划线所示序列为X1连接肽为SAG的编码序列。下游引物加粗部分为与TrxA同源的同源臂部分，下划线所示序列为X2连接肽为GT的编码序列。PCR产物进行纯化回收。

3、过氧化氢特异性响应基因编码型荧光生物探针的构建和重组质粒的构建

利用EcoR I和Hind III对pET28a质粒进行双酶切，酶切产物纯化回收。将上述纯化回收的TrxA、PrxA和cpYFP片段与酶切的pET28a载体按照如表一在冰浴上配制连接体系。

表一多片段一步克隆连接反应液的配制

其中：

X/Y的量根据公式：

每个片段最适使用量＝[0.02×片段碱基数]ng(0.03pmol)

计算得到。

上述反应体系利用移液枪轻轻混匀后，37℃恒温水浴锅中反应30min，立即冰上冷却，取10μL上述反应体系混合液转化到DH5α感受态菌株中，挑选单菌落进行阳性克隆筛选以及核酸测序验证。验证成功的质粒即为带有对过氧化氢特异性响应基因编码型荧光生物探针的重组质粒。

实施例2过氧化氢特异性响应基因编码型荧光生物探针的表达和纯化

取1uL测序正确的上述对过氧化氢特异性响应基因编码型荧光生物探针的重组质粒通过感受态转化的方法，转化到表达菌株E.coil BL21(DE3)中，进行各重组蛋白的表达。具体的表达步骤为：

1、挑取转化于表达菌株E.coil BL21(DE3)的LB(Kan⁺抗性)平板上的单菌落，接种到含100μg/μL Kan⁺的5mL的液体LB试管中，37℃，200rpm培养过夜。

2、按照1％接种量，将1mL前培养的菌液加入到250mL含100mL的LB培养基的三角瓶中，加入终浓度为100μg/μL Kan⁺，37℃，200rpm，振荡培养2-3小时，直至菌液的OD值达到0.4-0.6。

3、添加0.1mM IPTG诱导蛋白表达，蛋白表达温度为20℃，220rpm培养14-20h。

4、培养结束后，菌液一部分倒入50mL离心管中，10000rpm离心15分钟收集菌体。一部分新鲜菌液用于过氧化氢的响应测定。

上述对过氧化氢特异性响应基因编码型荧光生物探针的蛋白纯化步骤具体为：

1、菌体破碎：利用加有5mM巯基乙醇的缓冲液A(20mM NaH₂PO₄，0.5M NaCl，pH7.0)将收集于离心管底部的菌体悬浮(100mL菌体悬浮在20-30mL缓冲液中)。提前将高压破碎匀浆机预冷至4℃，除去保存用的20％乙醇，用去离子水清洗机器1-2遍，再用溶解菌体的缓冲液清洗机器1-2遍。将机器的压力调至1000bar左右，上样，用干净的离心管收集破碎液，再重复加入到样品杯中，重复破碎2-3次，直至溶液变得粘稠澄清。

2、菌体沉淀：将收集有破碎好的液体的离心管中放入4℃预冷离心机中，12000rpm离心15min，使菌体沉淀在离心管底部，将上清倒入干净的离心管中。

3、过滤：利用0.45μm的过滤器过滤上清，防止杂质堵塞柱子。

4、上柱和纯化：上述荧光生物探针蛋白为黄色，可直接用镍的自装柱进行蛋白的纯化。在上样之前，利用缓冲液A(20mM NaH₂PO₄，0.5M NaCl，pH7.0)将柱子平衡。将上清直接加入到自装柱中，利用重力沉降的作用，流过自装柱，使蛋白和镍柱结合。再用缓冲液A(20mM NaH₂PO₄，0.5M NaCl，pH7.0)将不与镍离子特异性结合的杂质蛋白洗涤下来。再直接用100％的缓冲液B(20mM NaH₂PO₄，0.5M NaCl，0.5M咪唑，pH7.0)进行洗脱，收集有颜色的洗脱液。

5、蛋白浓缩：纯化出来的蛋白倒入15mL截留分子量为10kDa的超滤管中，用含有1mM DTT的磷酸钠缓冲液(pH7.0)作为稀释洗涤液，使最后除去咪唑的蛋白保留在含DTT的磷酸缓冲液中(pH7.0)。(若保存蛋白，则添加甘油，使甘油终浓度为20％，-20℃保存。)

实施例3过氧化氢特异性响应基因编码型荧光生物探针体外响应过氧化氢检测

首先将母液浓度为10M的过氧化氢以10倍的稀释倍数，分别稀释成浓度为1M，100mM，10mM，1mM，100μM，10μM的过氧化氢。由于过氧化氢不稳定，每次实验前，现配现用。利用核酸/蛋白检测仪测定纯化浓缩的上述荧光生物探针蛋白的浓度。因为蛋白纯化后为保持其还原性，储存在含有DTT的溶液中。每次实验前利用Bio-Rad的一款P6脱盐柱将DTT出去。每次胞外实验之前使用，蛋白现除DTT现用。测定上述荧光生物探针蛋白响应过氧化氢的实验中，浓缩的上述荧光生物探针蛋白添加到加有1mL 50mM的磷酸缓冲液(pH 7.0)的比色皿中，终浓度稀释为1μM左右。将日立F-4600荧光分光光度计打开，放入比色皿，利用日立F-4600荧光光度计记录发射光为530nm条件下，380nm到515nm范围内激发光的荧光强度。再记录激发光为485nm条件下，505nm到600nm范围内发射光的荧光强度，做为实验的本底。之后，向比色皿中添加不同浓度的过氧化氢，再记录与本底同等条件下激发光和发射光的荧光强度。激发和发射光的狭缝均为5nm，波长扫描的速度为2400nm/min，光电倍增管(PMT)电压为700V，实验的对照组为添加同等体积的去离子水。附图1显示体外检测过氧化氢的上述荧光生物探针在50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)中，在530nm激发下，在410-420nm和495-505nm处有两个激发峰。在485nm激发条件下，在515-525nm处有激发峰，响应过氧化氢的检测限为0.1-1μM。将不同的氧化物质配制成相应的你浓度后，按照和过氧化氢相同的反式添加并测定上述荧光生物探针的选择性。附图2显示上述荧光生物探针除了响应过氧化氢和有机过氧化物之外(两者都住Prx的天然底物)对其他测试的氧化物均不响应，说明上述荧光生物探针对过氧化氢的响应具有高选择性。

实施例4过氧化氢特异性响应基因编码型荧光生物探针体内响应过氧化氢的活体细胞成像

新鲜的菌液表达后，取5mL左右菌液离心，离心去掉培养基。利用pH 7.0磷酸缓冲液洗涤两次，并悬浮于同样的缓冲液中。菌体细胞悬浮液的终浓度为OD₆₀₀值为1.26。荧光拍照用到的是Nikon Eclipse Ti-E自动显微镜，Photomertrics Evolve 512EMCCD，和高稳定型的Sutter Lambda XL光源。用到的是一款Plan Apo VC 100×1.4NA的油镜。荧光倒置显微镜拍摄中，添加3μL细胞悬浮液与载玻片上，然后用盖玻片盖住，倒置放置于载物台上。利用488nm激发光，在500-550nm范围内检测，曝光时间为1000ms。然后从盖玻片伸出载玻片的一角滴加4μL 10μM过氧化氢。然后在同样的条件下检测并进行拍照。附图3A显示未添加过氧化氢的表达上述荧光生物探针的大肠细胞图。附图3B显示在响应过氧化氢之后，488nm激发光下，细胞的荧光明显增强。上述荧光生物探针能够用于活体细胞成像。

实施例5过氧化氢特异性响应基因编码型荧光生物探针体内响应过氧化氢的检测

首先将母液浓度为10M的过氧化氢以10倍的稀释倍数，分别稀释成浓度为1M，100mM，10mM，1mM，100μM，10μM的过氧化氢。由于过氧化氢不稳定，每次实验前，现配现用。新鲜的菌体培养基离心收集菌体，并在pH7.0的磷酸缓冲液中洗涤1-2次，重新悬浮于同样的缓冲液中。实验中添加8-15μL稀释的菌体悬浮液于含有1mL同样的磷酸缓冲液的比色皿中进行测定。将日立F-4600荧光分光光度计打开，放入比色皿，利用日立F-4600荧光光度计记录发射光为530nm条件下，380nm到515nm范围内激发光的荧光强度。再记录激发光为485nm条件下，505nm到600nm范围内发射光的荧光强度，做为实验的本底。之后，向比色皿中添加不同浓度的过氧化氢，再记录与本底同等条件下激发光和发射光的荧光强度。激发和发射光的狭缝均为5nm，波长扫描的速度为2400nm/min，光电倍增管(PMT)电压为700V，实验的对照组为添加同等体积的去离子水。附图4A显示表达上述荧光生物探针蛋白的大肠杆菌E.coil BL21(DE3)不论响应低浓度的过氧化氢害死高浓度的过氧化氢，均能在30s内达到稳定，上述荧光生物探针能快速响应过氧化氢。附图4B显示，测定0.2-30μM浓度范围的过氧化氢，探针响应过氧化氢的最低限为0.5μM，当浓度超过5μM之后，探针的荧光就不再变化，说明上述探针胞内响应过氧化氢的检测限为0.5-5μM，能够很好地应用在体内氧化还原信号通路的研究中，为生理和病理的研究奠定基础。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华东理工大学

<120> 一种对过氧化氢特异性响应的基因编码型荧光生物探针及其构建方法和用途

<130> /

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 110

<212> PRT

<213> Aspergillus nidulans

<400> 1

Met Gly Ala Ser Glu His Val Pro Pro Ile Thr Ser Lys Ala Glu Phe

1 5 10 15

Gln Glu Lys Val Leu Asn Ala Lys Gly Phe Val Val Val Asp Cys Phe

20 25 30

Ala Thr Trp Cys Gly Pro Cys Lys Ala Ile Ala Pro Thr Val Glu Lys

35 40 45

Phe Ala Gln Thr Tyr Thr Asp Ala Ser Phe Tyr Gln Ile Asp Val Asp

50 55 60

Glu Leu Ser Glu Val Ala Ala Glu Leu Gly Ile Arg Ala Met Pro Thr

65 70 75 80

Phe Leu Leu Phe Lys Asp Gly Gln Lys Val Ser Asp Val Val Gly Ala

85 90 95

Asn Pro Gly Ala Leu Glu Ala Gly Ile Lys Ala Leu Leu Ala

100 105 110

<210> 2

<211> 507

<212> DNA

<213> Aspergillus nidulans

<400> 2

atgtctggac ttaaggccgg tgacagcttc cccgctgacg ttgtcttctc ctacattccc 60

tggactgagg agaagggcga gatcacctct tgcggtatcc ccattaacta ctacgcttcc 120

aaggagtggg ccgacaagaa ggtcatcctc ttcgccctcc ccggtgcctt cacccccgtc 180

tgctctgctc gccacgtccc tgagtacatc gagcgcctcc ccgagatccg cgccaagggt 240

gtcgatgttg ttgccgtcct tgcctacaac gatgctttcg tcatgagtgc ctggggtaag 300

gccaacggtg ttaagaacga cgacattctc ttcctttccg accccgaggc caagttctcc 360

aagagcatcg gctgggccga cgaggagggc cgtaccaagc gttatgccat cgtcctcgac 420

cacggcaagg tcacctacgc tgctctggag cccgccaaga accaccttga gttctccagc 480

gccgagactg tcatcaagca cctgtaa 507

<210> 3

<211> 741

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggccaac 60

ttcaagatcc gccacaacgt cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag 120

aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcttccag 180

tccgtcctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg 240

accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca acgtggatgg cggtagcggt 300

ggcaccggca gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg 360

gacggcgacg taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc 420

tacggcaagc tgaccctgaa gctgatctgc accaccggca agctgcccgt gccctggccc 480

accctcgtga ccaccctcgg ctacggcctg aagtgcttcg cccgctaccc cgaccacatg 540

aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc 600

ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc 660

ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc ggcttcaagg aggacggcaa catcctgggg 720

cacaagctgg agtacaacta a 741

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gacatggtgc ggtcccgaaa aggccattgc gc 32

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgggcgcaat ggccttttcg ggaccgcacc atgtcg 36

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgggtgcct ctgaacacgt cc 22

<210> 7

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gctcgagtgc ggccgcaagc ttctaagcaa gcagagcctt gataccg 47

<210> 8

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

caaatgggtc gcggatccga attcatgtct ggacttaagg ccggtg 46

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

caggtgcttg atgacagtct cgg 23

<210> 10

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gagactgtca tcaagcacct gagcgccggc tacaacagcc acaacgtcta tatc 54

<210> 11

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggacgtgttc agaggcaccc atggtgccgt tgtactccag cttgtgcccc 50

Claims

1.一种对过氧化氢特异性响应的基因编码型荧光生物探针的构建方法，其特征在于，所述构建方法为将对过氧化氢特异性敏感的PrxA和TrxA分别融合到cpYFP荧光蛋白的两端，具体包括：

步骤1：将SEQ ID NO. 1所示的TrxA氨基酸序列的第39位半胱氨酸替换为极性氨基酸，得到TrxA突变体；

步骤2：将SEQ ID NO. 2所示的编码PrxA的核酸序列、步骤1中所得的TrxA突变体的核酸序列和SEQ ID NO. 3所示的编码cpYFP的核酸序列进行融合，得到过氧化氢特异性响应的基因编码型荧光生物探针；

所述TrxA突变体位于cpYFP的氮端或碳端，中间插入连接肽X1，所述X1是GGGS，GGGGS，SAG，GT，LAEAAAKEAA，TSGSPGLQEFGT中的任意一种；

所述PrxA位于cpYFP的碳端或氮端，中间插入连接肽X2，所述X2是GGGS，GGGGS，SAG，GT，LAEAAAKEAA，TSGSPGLQEFGT中的任意一种。

2.利用权利要求1所述构建方法制备获得的对过氧化氢特异性响应的基因编码型荧光生物探针。

3.一种多核苷酸分子，其特征在于，所述多核苷酸分子的核酸编码如权利要求2所述的对过氧化氢特异性响应的基因编码型荧光生物探针。

4.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒表达载体包含编码权利要求3所述的多核苷酸分子基因。

5.权利要求2所述的对过氧化氢特异性响应的基因编码型荧光生物探针在过氧化氢或有机过氧化物的检测中的应用。