CN105646716A - 一种基因编码的环腺苷酸荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基因编码的cAMP荧光探针，其内含有荧光蛋白序列或其衍生物和对cAMP敏感的多肽，其中所述对cAMP敏感的多肽，(1)具有cAMP结合特性的CNBD结构域；和/或(2)来源于对cAMP敏感的被cAMP直接活化调节的鸟嘌呤核苷酸交换因子Epac家族蛋白。本发明还提供一种基因编码的cAMP荧光探针的制备方法。本发明提供的荧光探针在检测cAMP中具有较好的应用，其能够在生理水平和亚细胞水平上检测cAMP，并具有较优异的特异性、直观性和灵敏性。

Description

一种基因编码的环腺苷酸荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种基因编码的环腺苷酸荧光探针及其制备方法和应用，具体涉及一种基因编码的环腺苷酸荧光探针、环腺苷酸(cAMP)检测探针的制备方法和上述探针在检测活细胞内(包括大肠杆菌原核细胞及哺乳动物真核细胞)cAMP水平中的应用。

背景技术

cAMP作为一种信号小分子，广泛存在于从低等微生物到高等哺乳动物的细胞组织中，由三磷酸腺苷活化腺苷环化酶生成，然后通过激活cAMP依赖性蛋白激酶PKA使靶细胞蛋白磷酸化，进而调节下游连续性的特异性信号级联反应，从而在细胞内起传递激素和递质的中介作用，被称为细胞内生命信息传递的的“第二信使”。cAMP在体内的作用几乎遍及各个组织器官，能够广泛参于包括激素分泌、肌肉收缩、离子通透等在内的细胞代谢活动，另外在细胞生长与分裂、分化调节、炎症反应、免疫反应、前列腺素作用中都起着重要作用，因此cAMP本身及其代谢调节所涉及的众多酶类成为了药物设计的靶标。

在哺乳动物除红细胞外，所有组织中都有cAMP的分布，但是正常情况下细胞内cAMP浓度一般低于10-6mol/L，而且在激素或应激作用下腺苷酸环化酶被激活会使cAMP水平发生急剧变化，变化比例也会随细胞状态不同而有所差异，因此这给cAMP的测定带来极大不便。较传统的检测手段主要是免疫学方法，最早出现的是放射免疫法(RIA)，利用同位素标记的与未标记的抗原同cAMP抗体发生竞争性抑制反应，通过研究机体对抗原物质反应的发生、发展和转化规律进而标定cAMP水平。但该方法存在一个最大的缺陷：其严重的放射性。之后出现的酶联免疫法(ELISA)缺陷则在于：1、操作步骤较多；2、当使用的cAMP抗体未经过亲和纯化时其特异性不是很理想；3、在一些组织中，cAMP的含量不是很高，使用传统的显色或发光方法，最终检测的灵敏度不理想。其他如纸层析法、HPLC分析、荧光成像等方法也常见于各类文献报道中。然而，大部分方法都存在一定不足，包括检测仪器及试剂的复杂与昂贵，方法本身的污染性，检测步骤的繁琐等，特别需要指出的是，大部分方法对单个细胞中靶标分子的灵敏度不足或者是不能进行亚细胞定位，而且最大的缺陷在于检测时需要对样品进行裂解、分离、纯化等操作，而在一系列繁琐操作中极易引入误差最终显示的结果与实际存在出入。另外，现有用于活体动物或细胞检测的cAMP探针有以下几种类型，各自都存在严重缺陷：首先是化学染料荧光探针，此类探针在透膜方面有很大障碍，大大降低了其利用范围，且其激发波长一般位于紫外区，带来的细胞损伤较大，而且可能会受到生物样品自发荧光的影响；其次是生物合成荧光探针，此类探针在现有研究报道中主要表现为FERT模型，个体较为庞大在蛋白表达中易出现折叠问题，同时检测过程中要涉及双荧光蛋白空间距离的变化，探针的灵敏度及检测限也不理想。

因此，本领域亟需发展一种特异性、直观性和灵敏性的cAMP检测技术，特别是一种适合生物体生理水平和亚细胞水平的特异性cAMP检测技术。

相对于传统的小分子化学探针而言，荧光蛋白探针在大多数的活体细胞中实现了对靶标蛋白在细胞内的定位、分布和运动以及与其他细胞内分子的相互作用的标记和分析，成为许多细胞内分子事件检测的首选模型。

绿色荧光蛋白是一类存在于腔肠动物体内的生物发光蛋白，最早于名为Aequoreavictoria的水母中发现，是由238个氨基酸残基组成的单链多肽，基因长达2.6kD，由3个外显子组成，分别编码69、98和71个氨基酸，天然GFP蛋白中第65-67位的三个氨基酸Ser-Tyr-Gly能够自发形成一个荧光生色基团。

尽管对野生型GFP的生色团及其发光原理都有了一定程度研究，但其结构及光谱性质等仍存在较多缺陷，随着对GFP蛋白突变研究的逐渐深入，目前已经发展出许多表现突出的GFP衍生物，优化后的GFP吸收光谱发生迁移，不但亮度提高，蛋白成熟速度也获得增加。借助于对GFP蛋白序列的重新排列，将原第145-238位氨基酸部分作为新蛋白的N端，原1-144位氨基酸部分作为新蛋白的C端，两片段之间通过一小段柔性的短肽链相连，形成一个对空间变化敏感的环状排列荧光蛋白，在此基础上对原蛋白进行点突变就形成了环状排列的黄色荧光蛋白cpYFP。

随着荧光蛋白应用日益广泛，相关的一些基于荧光的分析检测方法也得到进一步发展。例如FRET作为一种荧光能量转移的现象，对于距离和荧光基团的空间取向高度敏感，很多研究中通过FRET效率的测量来观察一些生物分子的相互作用。现有研究报道利用基因工程重组数段将期望研究的蛋白基因两端分别于CFP与YFP融合来表达一个新的融合蛋白，通过荧光的变化直观的表现该蛋白与专一性的靶标分子结合所产生的空间变化。

因此，本文所用的荧光蛋白序列可以来自于avGFP及其衍生物，包括但不局限于这些突变体：黄色荧光蛋白(YFP)，绿色荧光蛋白(GFP)等的序列，其中优选环状排列的黄色荧光蛋白cpYFP的序列。

本文涉及的另一种蛋白，Epac蛋白是一种本领域已知的被cAMP直接激活的交换蛋白，由881个氨基酸组成，普遍存在于人体各组织中，最早在研究小分子G蛋白Rap1的活化机制时被发现并分离，可在不同的亚细胞器如细胞核，细胞质，核膜等区域进行表达，其具体定位主要取决于细胞的类型和细胞周期。Epac结构域包括一个调控区和催化区，除含有既往GEFs的3个保守区域外，还含有REM和DEP功能区。REM对稳定GEFs结构有重要作用，DEP功能区参与膜附着。其中关键的是Epac存在一个cAMP结合的疏水性口袋结构域，该区域存在一些高度保守的序列，可以与cAMP的磷酸基团和核糖基团相互作用。

虽然Epac蛋白在结合cAMP分子后其自身会发生明显的构象变化，但该变化并不能直观的显示出并被外界所捕获，而借助于荧光蛋白这一工具，我们可以很好的融合二者获得一个全新的基因编码荧光探针，利用Epac蛋白感受生理环境中cAMP水平的变化并将这一变化传递到荧光蛋白，通过荧光蛋白产生荧光与否及荧光强弱，对机体或者细胞生理状态进行实时描述。

综上所述，我们认为，利用包含Epac蛋白的重组荧光融合蛋白能够满足在生理水平和亚细胞水平上检测cAMP的急切需要。

本文所述参考文献均引入本文。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种基因编码的cAMP荧光探针。

本发明的第二个目的是提供一种包含编码基因编码的cAMP荧光探针的核苷酸序列。

本发明的第三个目的是提供一种基因编码的cAMP荧光探针的制备方法。

本发明的第四个目的是提供一种包含基因编码的cAMP荧光探针的融合蛋白。

本发明的第五个目的是提供一种包含编码含有cAMP荧光探针的融合蛋白的核苷酸序列。

本发明的第六个目的是提供一种包含编码cAMP荧光探针核苷酸序列的表达载体。

本发明的第七个目的是提供一种包含本发明所述表达载体的宿主细胞。

本发明的第八个目的是提供一种基因编码的cAMP荧光探针在检测cAMP中的应用。

本发明的第九个目的是提供一种所述的荧光探针在监测活细胞内环核苷酸的变化的应用。

本发明的第十个目的是提供一种所述的荧光探针在高通量筛选过程中的检测方法。

本发明的第十一个目的是提供一种试剂盒，其包含本发明所述的基因编码的cAMP荧光探针和说明书。

本发明的技术方案如下：

一种基因编码的cAMP荧光探针，其内含有荧光蛋白序列或其衍生物和对cAMP敏感的多肽，其中所述对cAMP敏感的多肽，

(1)具有cAMP结合特性的CNBD结构域；和/或

(2)来源于对cAMP敏感的被cAMP直接活化调节的鸟嘌呤核苷酸交换因子Epac家族蛋白。

所述具有cAMP结合特性的CNBD结构域为序列表所示Epac1-CNBD氨基酸序列或Epac2B-CNBD氨基酸序列。

根据本发明所述基因编码的cAMP荧光探针，所述对cAMP敏感的多肽为来自于真核生物的交换因子Epac蛋白基因的多肽，该多肽的序列选自SEQIDNO：1、2、3和4。

根据本发明所述基因编码的cAMP荧光探针，所述荧光蛋白序列为环状排列的黄色荧光蛋白cpYFP如SEQIDNO：21所示。

根据本发明所述基因编码的cAMP荧光探针，所述荧光探针所包含的荧光蛋白序列B和对cAMP敏感的多肽中具有cAMP结合特性的CNBD结构域A，所述B为序列表所示B1和/或B2氨基酸序列，所述A为序列表所示A1和/或A2氨基酸序列；所述荧光探针的组合形式是：

(1)A-B-A，其中B插入A的柔性区域内，将A分割成A的第一部分和A的第二部分，A的第一部分和A的第二部分共同构成完整的A结构域；

(2)A1-B-A2，其中A1和A2分别串联在B两端，A1和A2前后顺序可变换；A1是来自于人体或小鼠组织器官的交换蛋白或其衍生物的氨基酸序列，A2是来自于人体或小鼠组织器官的另一交换蛋白或其衍生物的氨基酸序列。

根据本发明所述基因编码的cAMP荧光探针，优选的是，将cpYFP插入到Epac2B，插入位点分别为P/D(23/24)、H/L(58/59)、N/T(162/163)或Q/D(171/172)；将cpYFP插入到Epac1，插入位点为K/T(162/163)。

所述的cAMP荧光探针优选SEQIDNO：5、6、7、8、39、40、41、42、67所示的蛋白序列。

根据本发明所述基因编码的cAMP荧光探针，所述荧光探针为具有以下结构：

A₁-A₂-LK₁-FP-LK₂-A₃-A₄，

其中，A₁是Epac蛋白的第一结构域，优选来源于人体组织的Epac1蛋白的氨基酸序列的氨基酸110-186如SEQIDNO:13所示或人体组织的Epac2蛋白的氨基酸序列的氨基酸216-291如SEQIDNO:14所示；

A₂是Epac蛋白的第二结构域，优选Epac1蛋白的氨基酸序列的氨基酸245-363，如SEQIDNO:15所示或Epac2蛋白的氨基酸序列的氨基酸356-476，如SEQIDNO:16所示；

A₃是Epac蛋白的第三结构域，优选Epac1蛋白的氨基酸序列的氨基酸384-518，如SEQIDNO:17所示或Epac2蛋白的氨基酸序列的氨基酸496-634，如SEQIDNO:18所示；

A₄是Epac蛋白的第四结构域，优选Epac1蛋白的氨基酸序列的氨基酸662-889，如SEQIDNO:19所示或Epac2蛋白的氨基酸序列的氨基酸772-1009，如SEQIDNO:20所示；

FP是荧光蛋白，选自GFP，YFP，CFP以及基于这些蛋白的变异体，优选YFP，更优选cpYFP如SEQIDNO:21所示；

LK₁可以存在或不存在，存在时，LK₁为T、A、S、G中一种或一种以上氨基酸；

LK₂可以存在或不存在，存在时，LK₂为G、S、T中一种或一种以上氨基酸。

根据本发明所述基因编码的cAMP荧光探针，优选的是，所述cAMP荧光探针为对荧光蛋白序列和对cAMP敏感的多肽的连接处氨基酸肽段YNSD和LEYN进行截短的突变体。

根据本发明所述基因编码的cAMP荧光探针，进一步优选的是SEQIDNO:51-66和SEQIDNO:68-83所示的氨基酸序列。

根据本发明所述基因编码的cAMP荧光探针，优选的是，所述cAMP荧光探针为对cAMP荧光探针进行定点突变的突变体，所述突变为在Epac2B-CNBD氨基酸序列的93位、105位、122位、123位、132位、133位、152位、156位、160位、412位上突变。

根据本发明所述基因编码的cAMP荧光探针，进一步优选的是SEQIDNO:110-126所示的氨基酸序列。

本发明还提供一种编码所述荧光探针的核苷酸序列，包括编码对cAMP敏感的蛋白质的核苷酸序列和编码荧光蛋白的核苷酸序列。

根据本发明所述的核酸序列，优选的是，所述核酸序列选自核苷酸序列SEQIDNO：9、10、11或12。

本发明还提供一种制备所述荧光探针的方法，包括以下步骤：

(1)将含有所述的核苷酸序列的表达载体转移至宿主细胞中，

(2)在所述宿主细胞表达的条件下培养所述宿主细胞，和

(3)由所述宿主细胞分离所述荧光探针。

本发明还提供一种融合蛋白，其包含所述的荧光探针；所述融合蛋白是所述荧光探针与特异性亚细胞定位信号融合而成的，所述定位信号可将目标蛋白定位于指定的亚细胞器内。

本发明还提供一种编码所述融合蛋白的核苷酸序列。

本发明还提供一种表达载体，所述的表达载体由载体质粒pRSETb与所述的核酸序列操作性连接得到的。

本发明还提供一种包含所述的表达载体的宿主细胞。

本发明还提供所述的荧光探针在检测cAMP中的应用。

本发明还提供所述的荧光探针在监测活细胞内环核苷酸的变化的应用。

本发明还提供所述的荧光探针在高通量筛选过程中的检测方法：

以pRSETb空菌作为空白对照，cpYFP作为阴性对照，cAMP荧光探针进行小量表达，收菌后用Hepes缓冲液重悬，稀释至相同OD，然后进行超声破碎，冷冻离心并将蛋白上清转移至新的Ep管，置于冰上保存；取适量体积上清至96孔酶标检测板黑板内，读取荧光值，根据荧光高低来调整检测的灵敏度，进行滴定检测实验。

本发明还提供一种试剂盒，所述的试剂盒包含说明书和所述的荧光探针。

发明详述：

本文所用术语“荧光探针”是指与荧光蛋白相融合的对环境cAMP敏感的多肽，所述对环境中cAMP敏感的多肽具体可以是Epac蛋白，利用Epac中特异性的cAMP结合结构域与cAMP结合后产生的构象变化引起荧光蛋白的构象变化，从而导致产生的荧光发生改变，通过不同cAMP浓度下测定的荧光蛋白的荧光来绘制标准曲线，进而用于检测并分析细胞内cAMP的存在水平。

本文所用术语“融合蛋白”与“荧光融合蛋白”和“重组荧光融合蛋白”意义相同，指包含特异性结合结构域的多肽或其片段、衍生物或类似物的氨基酸序列。

在本发明中，术语“Epac蛋白”指Epac蛋白(exchangeproteinactivatedbycAMP)，是一种本领域已知的可被cAMP直接激活的交换蛋白，它由881个氨基酸组成，普遍存在于人体各组织中，且在肾与心脏组织中特别丰富，最早在研究小分子G蛋白Rap1的活化机制时被发现并分离，小分子G蛋白Rap1在细胞生长、分化及恶性转化中起着重要的调节作用，而Epac/Rap1途径主要参与整合素介导控制的细胞粘附作用，随着一些可高度选择性的结合Epac蛋白的cAMP类似物的出现，Epac蛋白被证明在细胞分裂、分化、分泌和生长等过程中都起着重要作用。Epac可在不同的亚细胞器如细胞核，细胞质，核膜等区域进行表达，而它们具体定位主要取决于细胞的类型和细胞周期。Epac结构域包括一个调控区和催化区，除含有既往GEFs的3个保守区域外，还含有REM和DEP功能区。REM对稳定GEFs结构有重要作用，DEP功能区参与膜附着。其中关键的是Epac存在一个cAMP结合的疏水性口袋结构域，该区域存在一些高度保守的序列，可以与cAMP的磷酸基团和核糖基团相互作用，当与cAMP结合时，Epac自身抑制作用被破坏从而使其催化区暴露出来，利于Rap的结合(deRooijJeta1.Nature.1998；396：474)。本发明荧光探针利用Epac在被cAMP激活时能发生形变这一信息，将荧光蛋白与Epac蛋白柔性区域相融合，通过检测这一动态变化过程中探针的荧光变化来判断cAMP的水平变化。本发明中所涉及的“柔性区域”是指蛋白质结构中存在的一些特定结构，这些结构具有较高的柔性和可移动性，蛋白质在这些区域存在较大地发生空间构象改变的趋势。

在本发明中，与荧光基团融合的Epac蛋白可以是在人体或小鼠组织器官内分离的天然Epac蛋白的全长或其片段，优选是Epac1蛋白的氨基酸245-363(SEQIDNO:15)或Epac2蛋白的氨基酸序列的氨基酸356-476(SEQIDNO:16)。

本文所用术语“功能片段”、“类似物”、“衍生物”是指基本上与本发明中天然Epac具有相同的生物学活性的蛋白。本发明的Epac的功能片段、类似物或衍生物可以是：

(1)有一个或多个保守或非保守的氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样被取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传编码的，或

(2)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或

(3)附加氨基酸序列与此蛋白序列融合形成的蛋白，或

(4)成熟蛋白与另一个化合物融合形成的蛋白。

这些功能片段、类似物和衍生物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，所用术语“荧光团”与“荧光蛋白”同义，指自身发出荧光或在照射下发出荧光的蛋白质，荧光蛋白经常被用作检测手段。

本文所用术语“YFP”指黄色荧光蛋白，该蛋白由绿色荧光蛋白GFP衍生而来，其氨基酸序列与GFP同源性高达90％以上，关键差异在于YFP的第203位氨基酸由苏氨酸突变为酪氨酸，在此基础上对YFP第65位氨基酸定点突变可获得荧光增强型YFP(称为EYFP)，而对EYFP蛋白序列重新排列，将原145-238位氨基酸部分作为新蛋白的N端，而原1-144位氨基酸作为新蛋白的C端，两片段通过一小段柔性的短肽连接，形成一个对空间变化极度敏感的环状排列黄色荧光蛋白cpYFP，典型的cpYFP氨基酸序列为SEQIDNO：21，由核苷酸序列SEQIDNO：22所编码。

本发明所述两种或多种多肽或核酸分子序列的“相同性”或“相同性百分数”是在指定区域或比较窗口上，利用本领域已知的序列比较算法，通过人工目测比对来分析两个或多个序列的最大对应性时，其中部分序列在指定区域内有一定百分比的氨基酸残基或核苷酸相同(如35％、50％、70％、85％、90％、95％或100％相同)，适合于测定序列相似性和相同性百分数的优选算法是BLAST算法，具体可参见ALtschul等(1977)NucleicAcidsRes.25:3389.

本发明中所述“LK”指本荧光探针的蛋白质或核酸中连接两个部分的氨基酸或核酸序列，该LK的长度不大于6个氨基酸，更优选是3个氨基酸，在本发明的核酸中连接时，LK的长度通常不大于18个核苷酸，更优选是9个核苷酸。

提到某多肽或蛋白时，本发明所用术语“变异体”包括具有所述多肽或蛋白相同功能但序列不同的变异体。这些变异体包括但不限于：在所述多肽或蛋白序列中缺失、插入和/或取代一个或多个(通常为1-30个，较佳为1-5个)氨基酸，以及再起N端和/或C端添加一个或多个(通常为20个之内)氨基酸获得的序列。在本领域内，用性能相似或相近的氨基酸进行取代时，通常不会改变多肽或蛋白的功能。在本领域内，性能相似的氨基酸往往指具有相似侧链的氨基酸家族。本领域技术人员公知，在基因克隆实验操作时，通常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的多肽或蛋白末端引入了一个或多个不相干的残基，但这并不影响目的多肽或蛋白的活性。

本发明所用术语“核酸”可以是DNA形式或是RNA形式，DNA包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟蛋白的编码区序列也可以是简并变体。

提到核酸时，本文所用术语“变异体”可以是天然或非天然发生的等位变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、插入变异体和缺失变异体。等位变异体是一种替换形式，可以是一个或多个核苷酸的取代、插入或缺失，但不会从实质上改变所编码的蛋白的功能特性。

本发明荧光探针或融合蛋白的全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法或人工合成法来获得。对于PCR扩增，可根据本发明公开的有关核苷酸序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的方法制备cDNA库作为模板，扩增得到有关序列。一旦获得有关序列，就可以用重组法来大批量获得有关序列，通常是将其克隆至载体，再转入细胞通过常规方法从宿主细胞中分离和纯化得到有关融合蛋白。

目前，可以完全通过化学合成方法来得到编码本发明蛋白或其片段或其类似物、衍生物、变异体的DNA序列，进而将其引入本研究领域已知的各种现有载体或细胞中。另一方面，可以通过化学合成或突变PCR等方法将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明的表达载体可用于在原核或真核细胞中表达本发明的荧光探针或融合蛋白，因而本发明涉及已导入本发明表达载体的宿主细胞，宿主细胞可为任何原核或真核细胞，优选各种利于基因产物表达或发酵生产的细胞，且已被本研究领域熟知并常用，例如各种大肠杆菌细胞核酵母细胞。在一个实施方式中，选用了大肠杆菌BL21-plys构建表达了本发明融合蛋白的宿主细胞。可以用适合所述宿主细胞表达的常规方法培养获得转化细胞，表达本发明荧光探针蛋白。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基为各种常规培养基，然后在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。但宿主细胞生长到适当的细胞密度后，可以用合适的方法如化学剂诱导进行诱导选择的启动子，之后将细胞继续培养一段时间。

在上述方法中的重组融合蛋白可以在细胞内、或在细胞膜上表达、或者分泌到细胞外。根据需要，可以利用其物理、化学和其他特性通过不同分离方法对重组目的蛋白进行分离或纯化。这些方法包括但不局限于：常规的离心、超声破碎处理或渗透压法处理、复性处理、蛋白沉淀剂处理法、亲和层析、离子交换层析、分子筛层析、高效液相层析等技术以及这些方法的结合。

在一个实施方式中，通过包含本发明融合蛋白编码序列的大肠杆菌发酵生产本发明荧光探针或融合蛋白，并通过亲和层析和凝胶层析纯化得到了纯形式的本发明荧光探针或融合蛋白。本发明荧光探针的用途包括但不局限于：检测生理状态下cAMP的水平、筛选药物、诊断与cAMP水平相关的疾病等。

一方面，本发明提供一种遗传编码的cAMP荧光探针，其内含有对环境中cAMP敏感的多肽和通过光谱性质的改变对环境中cAMP进行表现的部分。在一个实施方式中，所述通过光谱性质的改变对环境中cAMP进行表现的部分是荧光蛋白序列或其衍生物。在一个实施方式中，所述对cAMP敏感的多肽是具有以下特征的多肽，或其功能片段或cAMP结合结构域：

(1)具有cAMP结合特性的CNBD结构域；和/或

(2)来源于对cAMP敏感的被cAMP直接活化调节的鸟嘌呤核苷酸交换因子Epac家族蛋白。

在一个优选实施方式中，所述对cAMP敏感的多肽可具有以下特征：

(1)来自于真核生物的交换蛋白Epac蛋白基因的多肽，该多肽可以由SEQIDNO：1、2、3或4编码；

(2)在至少90个氨基酸残基内任何与(1)所述序列具有95％相同性的同源或非同源序列；

(3)在90个氨基酸残基内任何与(1)所述序列具有90％相同性的同源或非同源序列；

(4)在至少90个氨基酸残基内任何与(1)所述序列具有70％相同性的同源或非同源序列；

(5)在至少90个氨基酸残基内任何与(1)所述序列具有50％相同性的同源或非同源序列；

(6)在至少90个氨基酸残基内任何与(1)所述序列具有40％相同性的同源或非同源序列；

(7)在至少90个氨基酸残基内任何与(1)所述序列具有35％相同性的同源或非同源序列。

在另一实施方式中，本发明荧光探针可以包含具有cAMP结合特性的CNBD结构域A(A1和/或A2)以及荧光蛋白序列B(B1和/或B2)，其组合形式可以是：

(1)A-B-A，其中B插入A的柔性区域内，将A分割成A的第一部分和A的第二部分，A的第一部分和A的第二部分共同构成完整的A结构域；

(2)A1-B-A2，其中A1和A2分别串联在B两端，A1和A2前后顺序可变换；A1是来自于人体或小鼠组织器官的交换蛋白或其衍生物的氨基酸序列，A2是来自于人体或小鼠组织器官的另一交换蛋白或其衍生物的氨基酸序列；和

(3)B1-A-B2，其中B1和B2分别串联在A两端，B1和B2前后顺序可变换；B1是来自于维多利亚多管发光水母的荧光蛋白或其衍生物的氨基酸序列，B2是来自于维多利亚多管发光水母的另一荧光蛋白或其衍生物的氨基酸序。

(4)A的第一部分-B-A的第二部分：其中B插入A的柔性区域内，因而将A分割成A的第一部分和A的第二部分，A的第一部分和A的第二部分共同构成完整的A结构域。

再又一实施方式中，本发明荧光探针也可以具有以下结构：

A₁-A₂-LK₁-FP-LK₂-A₃-A₄，

其中，A₁是Epac蛋白的第一结构域，优选来源于人体组织的Epac1蛋白的氨基酸序列的氨基酸110-186(SEQIDNO:13)或人体组织的Epac2蛋白的氨基酸序列的氨基酸216-291(SEQIDNO:14)；A₂是Epac蛋白的第二结构域，优选Epac1蛋白的氨基酸序列的氨基酸245-363(SEQIDNO:15)或Epac2蛋白的氨基酸序列的氨基酸356-476(SEQIDNO:16)；A₃是Epac蛋白的第三结构域，优选Epac1蛋白的氨基酸序列的氨基酸384-518(SEQIDNO:17)或Epac2蛋白的氨基酸序列的氨基酸496-634(SEQIDNO:18)；A₄是Epac蛋白的第四结构域，优选Epac1蛋白的氨基酸序列的氨基酸662-889(SEQIDNO:19)或Epac2蛋白的氨基酸序列的氨基酸772-1009(SEQIDNO:20)；FP是荧光团，可以是GFP，YFP，CFP等以及基于这些蛋白的变异体，优选YFP，更优选cpYFP(SEQIDNO:21)；

LK₁可以存在或不存在，存在时，LK1可以是任何氨基酸序列，优选长度不超过4个氨基酸，例如包含氨基酸T、A、S、G或由这四个氨基酸中任意1至4个组成的任意组合，但不限于此类组合；

LK₂可以存在或不存在，存在时，LK2可以是任何氨基酸序列，优选长度不超过3个氨基酸，例如包含氨基酸G、S、T或由这四个氨基酸中任意1至3个组成的任意组合，但不限于此类组合。

本发明所述Epac2的cAMP-B结构域对cAMP尤其敏感并产生明显的构象变化,故命名为Epac2B，是Epac2蛋白的一部分。

所述CNBD的结构序列：

Epac1-CNBD序列：

PVGTHEMEEELAEAVALLSQRGPDALLTVALRKPPGQRTDEELDLIFEELLHIKAVAHLSNSVKRELAAVLLFEPHSKAGTVLFSQGDKGTSWYIIWKGSVNVVTHGKGLVTTLHEGDDFGQLALVNDAPRAATIILREDNCHFLRVDKQDFNRIIKDVEAKTMRLEEHGKVVLVLERASQGAGPSRPPTPGRNRYTVMSGTPEKILELLLEAMGPDSSAHDPTETFLSDFLLT

Epac2B-CNBD序列：

EEEKKECDEELQDTMLLLSQMDPDAHMRMILRKPPGQRTVDDLEIIYEELLHIKALSHLSTTVKRELAGVLIFESHAKGGTVLFNQGEEGTSWYIILKGSVNVVIYGKGVVCTLHEGDDFGKLALVNDAPRAASIVLREDNCHFLRVDKEDFNRILRDVEANTVRLKEHDQDVLVLEKV

在一个实施方式中，本发明提供一种荧光探针，其包含荧光团及Epac蛋白或Epac蛋白的任何片段、衍生物或类似物。在另一实施方式中，本发明还提供一种荧光探针，其包含荧光团及Epac蛋白的变异体或是Epac蛋白的可溶性片段。

在一个实施方式中，本发明还提供一种荧光探针，其包含氨基酸序列SEQIDNO:5、6、7或8或其变异体、衍生物。在优选实施方式中，本发明提供一种荧光探针，在至少90个氨基酸残基内任何与氨基酸序列SEQIDNO：5、6、7或8具有99％、90％、80％、70％、50％相同性或实质上相似的同源或非同源序列。

本发明提供一种融合蛋白，其包含本发明荧光探针，在一个实施方式中，所述融合蛋白包含本发明荧光探针和各种特异性亚细胞定位信号，所述定位信号可以将目标蛋白定位于指定的亚细胞器内。

本发明提供一种核酸序列，其包含编码本发明荧光探针或融合蛋白的核苷酸序列。在一个实施方式中，本发明提供一种核酸序列，其包含编码荧光蛋白的核苷酸序列和编码对cAMP敏感的蛋白质的核苷酸序列。

在一个优选实施方式中，所述编码对cAMP敏感的蛋白质的核苷酸序列是编码具有如下特征的多肽或功能片段或cAMP结合结构域的核苷酸序列：

具有cAMP结合特性的CNBD结构域；和/或

来源于对cAMP敏感的被cAMP直接活化调节的鸟嘌呤核苷酸交换因子Epac家族蛋白。

在另一个优选实施方式中，本发明核酸序列可以包含具有cAMP结合特性的CNBD(cAMP-binding)结构域a(a1和/或a2)以及荧光蛋白序列b(b1和/或b2)，其组合形式可以是：

(1)a-b-a；

(2)a1-b-a2，其中a1和a2可以相同或不同；a1可以是来自于人体或小鼠组织器官的交换蛋白或其衍生物的编码序列，a2可以是来自于人体或小鼠组织器官的另一交换蛋白或其衍生物的编码序列；

(3)b1-a-b2，其中b1和b2可以相同或不同，b1可以是来自于维多利亚多管发光水母的荧光蛋白或其衍生物的编码序列，b2可以是来自于维多利亚多管发光水母的另一荧光蛋白或其衍生物的编码序列；

(4)a的第一部分-b-a的第二部分：其中b插入a的柔性区域内，因而将a分割成a的第一部分和a的第二部分，a的第一部分和a的第二部分共同构成完整的a结构域。

在另一个优选实施方式中，本发明提供一种核酸序列，其包含核苷酸序列SEQIDNO:9、10、11或12或其变异体、衍生物。在优选实施方式中，本发明提供一种核酸序列，在至少90个碱基长度内任何与核苷酸序列SEQIDNO：9、10、11或12具有99％、90％、80％、70％、50％相同性或实质上相似的同源或非同源序列。

本发明还涉及上述核酸序列的互补序列和变异体，其包含编码本发明荧光探针或融合蛋白的片段、类似物、衍生物和变异体的核酸序列或其互补序列。

在又一方面，本发明还提供一种表达载体，其包含与表达控制序列操作性连接的本发明核酸序列，所述表达控制序列可以是复制起点、启动子、操纵子、终止子、增强子等。

在又一方面，本发明还提供一种宿主细胞，其包含本发明的上述表达载体。

再又一方面，本发明还提供一种制备本发明探针或融合蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)将本发明表达载体转移至宿主细胞内，

(2)在适合所述宿主细胞表达的条件下培养所述宿主细胞，

(3)由所述宿主细胞分离所述荧光探针或融合蛋白。

本发明还提供本发明荧光探针或融合蛋白在检测cAMP中的应用。在一个实施方式中，本发明提供本发明荧光探针或融合蛋白在体外或体内检测cAMP中的应用，在一个实施方式中，本发明提供本发明荧光探针或融合蛋白在亚细胞水平检测cAMP中的应用。在一个实施方式中，本发明提供本发明荧光探针或融合蛋白在诊断疾病中的应用，所述疾病与cAMP水平有关。在一个实施方式中，本发明提供本发明荧光探针或融合蛋白在药物筛选中的应用，所述药物可用于调节检测对象cAMP的水平。

本发明提供的一种全新的基因编码的cAMP荧光探针，将Epac蛋白和荧光蛋白融合，该荧光探针利用Epac蛋白感受生理环境中cAMP水平的变化并将这一变化传递到荧光蛋白，通过荧光蛋白产生荧光与否及荧光强弱，对机体或者细胞生理状态进行实时描述。

本发明提供的基因编码的cAMP荧光探针，利用包含Epac蛋白的重组荧光融合蛋白能够在生理水平和亚细胞水平上检测cAMP，并具有较优异的特异性、直观性和灵敏性。

本发明提供的环核苷酸荧光探针对生理条件下核苷酸类似物的响应特性表现出良好的特异性。

本发明的荧光探针与cAMP的结合是一个迅速且很快达到饱和的过程，探针的结合能力与cAMP的浓度高低及反应时间无关。

本发明的环核苷酸荧光探针可作为靶标对该过程中内源的cAMP水平作实时监测，来标定葡萄糖、乳糖对大肠杆菌活细胞内cAMP的调节水平。

本发明荧光探针能作为一种遗传编码的生物工具有效应用于一些生理指标或病理状态的监测。

附图说明

图1：环腺苷酸荧光探针Epac2B-cpYFP的吸收光谱；

图2：环腺苷酸荧光探针Epac2B-cpYFP的激发/发射光谱归一化后特性；

图3：环腺苷酸荧光探针在双激发通道下荧光变化情况；

图4：环腺苷酸荧光探针与cAMP结合的响应时间曲线，其中图4-1(对照蛋白)，图4-2(探针蛋白)；

图5：不同形式下环腺苷酸荧光探针样品检测结果对照；

图6：环腺苷酸荧光探针E2B-cpY在体外模拟的生理条件下对核苷酸类似物的响应；

图7：环腺苷酸荧光探针实时测定外源葡萄糖、乳糖加入对E.coil细胞内cAMP水平变化的监测；

图8：经药物异丙肾上腺素处理后，HEK293FT细胞内环腺苷酸的变化。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件进行。

实验材料与试剂：

试剂：除特别标注，其他均来自上海国药集团化学试剂有限公司。

PCR扩增反应所用的酶、缓冲液、dNTP；分子生物实验中所使用的酶、缓冲液、T4DNA连接酶、T4DNA连接酶缓冲液、T4多聚核苷酸激酶及其缓冲液，均来自立陶宛维尔纽斯富酶泰斯公司。

实验方法：

除特别注明具体条件的实验方法，通常是按照制造厂商所建议的条件进行；或者按照常规条件(Sambrook等，《分子克隆：实验室指南》，美国纽约州：冷泉港实验室出版社，1989)进行。

实施例1pRSETb-Epac1和pRSETb-Epac2B的构建和表达

1、扩增Epac的核酸序列：

分别以pcDNA3.1/CFP-Epac-cp173venus及pBluescript-Epac质粒为模板，利用引物Epac1-F、Epac1-R以及引物Epac2B-F、Epac2B-R分别扩增交换蛋白Epac1(CNBD)及Epac2B(CNBD)的编码序列。

目的片段扩增：

Epac目的基因片段回收及纯化具体操作参考胶回收试剂盒(BBI公司)说明书。

2、目的片段与载体相连接

将回收后的Epac1、Epac2B片段及载体质粒pRSTb分别进行双酶切，体系如下：

于37℃电热恒温隔水式培养箱内孵育3～5h或过夜(根据所用内切酶的效率特性决定)，结束后可将样品暂存于-20℃待用。

将回收后的Epac1、Epac2B片段分别与载体质粒pRSTb-Epac双酶切片段连接，体系如下：

于16℃低温恒温金属浴中孵育3～5h或于22℃孵育1～2h，结束后可将样品暂存于-20℃待用。

筛选阳性克隆送取菌液测序，由北京华大基因公司上海部完成。测序结果用VectorNTI8.0进行比对分析。结果表明该质粒中确实插入了Epac的核苷酸序列(如SEQIDNO：25和SEQIDNO：26所示)，该序列编码SEQIDNO：23和SEQIDNO：24所示的Epac蛋白。转化

将重组质粒pRSETb-wtEpac转入大肠杆菌E.coilMach1感受态细胞中，具体方法如下：

(1)在超净工作台内取适量连接产物或质粒加到已分装的感受态细胞内，冰浴30min；

(2)于42℃水浴热激90s后迅速冰浴3～5min；

(3)向上述各管中加500μLLB培养基进行复苏，于37℃振荡培养1h；

(4)取适量菌液均匀涂布至LB平板(相应抗性)，于37℃培养箱倒置过夜培养；

(5)次日可取出平板观察菌落生长情况，进行之后的阳性克隆筛选工作。

实施例2pRSETb-Epac2B-cpYFP和pRSETb-Epac1-cpYFP的构建和表达

探针构建原理：

通过对Epac2B-CNBD晶体结构及与cAMP结合的关键区域结构进行分析，初步设计4种cpYFP插入位点，分别为P/D(23/24)、H/L(58/59)、N/T(162/163)、Q/D(171/172)，其中23/24靠近本binding-domain的N端，58/59位于cAMP结合的疏水口袋区域，162/163位于cAMP结合性保守区域与Epac特征性VLVLE保守序列的柔性铰链处，而171/172则紧靠VLVLE保守序列，所选该几种位点均位于Epac2B在结合cAMP前后构象会发生显著变化的区域。

通过对Epac1的晶体结构以及Epac2B的4个插入位点分析后我们选择了K/T(162/163)这一个位点来进行cpYFP的插入。162/163位点是根据Epac2B-cpYFP四种基础模型的检测结果，选择其中响应较为理想的一种插入位点N/T(162/163)作为参照对象而设计的。

引物设计如下：

1.扩增cpYFP的核酸序列：

以MD9-cpYFP(Nagai，T.等，ProcNatlAcadSciUSA.2001，V.98(6)，pp.3197-3202)为模板，利用引物cpYFP-F及cpYFP-R扩增黄色荧光蛋白cpYFP的编码序列。

目的片段扩增：

cpYFP目的基因片段回收及纯化具体操作参考胶回收试剂盒(BBI公司)说明书。

2.目的片段与载体相连接

将回收后的cpYFP片段及不同位点的载体质粒pRSTb-Epac2B分别进行双酶切，体系如下：

于37℃电热恒温隔水式培养箱内孵育3～5h或过夜(根据所用内切酶的效率特性决定)，结束后可将样品暂存于-20℃待用。

将回收后的cpYFP片段及不同的载体质粒pRSTb-Epac双酶切片段分别连接，体系如下：

于16℃低温恒温金属浴中孵育3～5h或于22℃孵育1～2h，结束后可将样品暂存于-20℃待用。

筛选阳性克隆送取菌液测序，由北京华大基因公司上海部完成。测序结果用VectorNTI8.0进行比对分析。结果表明各质粒中确实插入了cpYFP的核苷酸序列(如SEQIDNO：22所示)，Epac2B-cpYFP4个探针为编码SEQIDNO：39、40、41、42所示的蛋白，Epac1-cpYFP探针为编码SEQIDNO：67所示的蛋白。

3.转化

将重组质粒pRSETb-Epac2B-cpYFP转入大肠杆菌E.coilBL21-plys感受态细胞中，具体方法如下：

(1)在超净工作台内取适量连接产物或质粒加到已分装的感受态细胞内，冰浴30min；

(2)于42℃水浴热激90s后迅速冰浴3～5min；

(3)向上述各管中加500μLLB培养基进行复苏，于37℃振荡培养1h；

(4)取适量菌液均匀涂布至LB平板(相应抗性)，于37℃培养箱倒置过夜培养；

(5)次日可取出平板观察菌落生长情况，进行之后的阳性克隆筛选工作。

挑取阳性克隆菌落至配有新鲜培养基(含相应抗生素)的试管内，37℃摇床培养过夜。培养至OD值为0.6时向已生长至最佳状态的菌液中加入0.1mMIPTG诱导剂，于18℃摇床培养20h，用镍离子亲和层析柱从裂解菌液中分离并纯化几种Epac2B-cpYFP蛋白。

实施例3Epac2B-N162/T163-cpYFP和Epac1-K162/T163-cpYFP衍生系列探针

探针构建原理：

由于不确定在Epac-cpYFP基本模型中cpYFP荧光蛋白与Epac蛋白连接处氨基酸在cAMP结合过程中具体的作用，因此本发明中利用截短突变原理进行探针的优化，通过对连接处氨基酸分别进行正交截短来寻找变化所能达到的较佳响应变化的相对平衡位置，这一设计对探针本身的cAMP结合常数并不会影响。

以Epac2B-N162/T163-cpYFP和Epac1-K162/T163-cpYFP原始探针质粒为模板，参照定点突变原理进行衍生系列探针的构建。

1.截短突变序列设计如下：

2.PCR扩增

利用定点突变PCR进行截短突变，突变扩增条件如下：

对于截短突变，首先进行单端截短体质粒的构建，然后用已单截短成功的Epac2B-cpYFP质粒为模板，选用Epac2BNT断开的上/下游引物和cpYFP不同截短的上/下游引物为来扩增其他正交截短片段。

3.DNA片段分离、纯化

(1)DpnI消化

于37℃孵育上述PCR片段2～3h，利用DpnI酶消化除去多余的模板质粒。后将反应体系置于85℃失活20min，反应结束后样品可用于后续分子生物学实验。

(2)加磷

于37℃孵育1～1.5h，利用T4多聚核苷酸激酶使DNA磷酸化，以便于之后片段环化自连，后将反应体系置于80℃失活10min，反应结束后样品可用于后续分子生物学实验。

(3)连接

于16℃孵育过夜，利用T4DNA连接酶使磷酸化处理的DNA片段环化自连。

(4)突变质粒鉴定：

筛选阳性克隆送取菌液测序，由北京华大基因公司上海部完成。测序结果用VectorNTI8.0进行比对分析。

(5)构建探针系列：

根据上述方法可获得下述探针系列。

实施例4Epac2B-N162/T163-cp3衍生系列探针

探针构建原理：

本发明中通过截短突变筛选首先得到一个较优探针cp3，但cp3探针在特异性方面仍存在一定缺陷可能会限制其在活细胞内的检测应用，因此本发明从Epac蛋白自身构象出发，根据其结合cAMP分子后结构发生的空间构象变化，采用本领域常用的突变手段对一系列特定序列进行定点突变修饰，通过基因序列的改变来改变所编码的蛋白，进而影响其结构及功能。

利用Epac2B-N162/T163-cpYFP原始探针质粒为模板，参照定点突变原理进行衍生系列突变体探针的构建。

随机突变体的构建思路与上述定点突变相似，只是在引物设计上有所差异，在设计时需要将待突变的氨基其碱基序列设为NNN，则最终可随机得到较多不同种类的突变体。

1.突变序列设计如下：

2.PCR扩增

利用定点突变PCR进行定点及随机突变，突变扩增条件如下：

3.DNA片段分离、纯化

(1)DpnI消化

于37℃孵育上述PCR片段2～3h，利用DpnI酶消化除去多余的模板质粒。后将反应体系置于85℃失活20min，反应结束后样品可用于后续分子生物学实验。

(2)加磷

于37℃孵育1～1.5h，利用T4多聚核苷酸激酶使DNA磷酸化，以便于之后片段环化自连，后将反应体系置于80℃失活10min，反应结束后样品可用于后续分子生物学实验。

(3)连接

于16℃孵育过夜，利用T4DNA连接酶使磷酸化处理的DNA片段环化自连。

(4)突变质粒鉴定：

筛选阳性克隆送取菌液测序，由北京华大基因公司上海部完成。测序结果用VectorNTI8.0进行比对分析。

(5)构建探针系列：

根据上述方法获得下述探针系列。

实施例5环核苷酸荧光探针的光谱特性

首先对所制备的荧光探针进行吸收光谱性质的测定，扫描300～700nm波段发现它们在420nm和480nm处左右存在两个显著的吸收峰(如附图1所示)。然后分别以420nm激发及528nm发射为条件来进行激发、发射光谱的研究。对一系列数据进行归一化作图(附图2)，并结合本实验室研究条件，最终确定选择420nm和485nm为双激发波长、528nm为发射波长来进行不同环境下探针的荧光变化研究，同时以485nm和420nm下的荧光比值作为cAMP响应的衡量参数。

实施例6环核苷酸荧光探针对生理条件下核苷酸类似物的响应特性

滴定方法：对于本探针的体外检测主要采取滴定方式进行，配制100mM的cAMP储液并将其用NaOH调至pH7.4，以保证与待测样品所处环境一致避免因pH更变造成的干扰，然后依次稀释为0.1，1，10，100，1000，10000uM几种浓度梯度待用。

将待测蛋白样品用缓冲液统一稀释至终浓度1uM，同时以缓冲液为空白对照(pH7.4)，以cpYFP蛋白为阴性对照，各样品设两个重复，加样后于37℃孵育15～20min。正式开始检测后，首先读取一个荧光初始值，然后向各样品孔内从低到高依次滴加各浓度的cAMP底物，每次滴定后震荡5s并读取下一次的荧光值。

本发明荧光探针对生理条件下核苷酸类似物的响应特性，见下表：

结果表明(附图6)，本发明荧光探针对ATP、NAD及NADH后几种信号分子基本无响应，对cAMP的最高响应可达5倍左右，但对cGMP也有接近4倍的响应，但正常生理条件下哺乳细胞内cAMP的水平为0.1～1uM(应激情况下可升高100倍以上)，而cGMP在细胞内的水平极低，仅为cAMP的1/10～1/50，事实上从图6可看出，本发明荧光探针在0.1～10uM范围内对cGMP基本无响应，而对cAMP在5uM浓度下响应既已接近3倍，10uM浓度下接近4倍，故表现出良好的特异性。

实施例7环核苷酸荧光探针对生理条件下cAMP结合特性的检测

为掌握本发明中荧光探针具体的cAMP结合速率及反应饱和点等特性，我们通过以下两种滴定检测方法进行实验：

1)分别取cpYFP及待测探针样品，各样品设定5个平行重复孔，检测开始后首先读取初始荧光值，然后向5孔内分别同时加入0.1uM，1uM，10uM，100uM，1000uM五种浓度梯度的cAMP，读取5～10min的动力学。

2)分别取cpYFP及待测探针样品，各一孔即可，不必设众多重复，同方法一，先读取样品初始荧光值，然后仍采取滴定的方式由低至高依次滴加不同梯度的cAMP，每滴加一种浓度后读取5min的动力学。

结果表明(附图4，其中图4-1(对照蛋白)，图4-2(探针蛋白))，本发明中的荧光探针与cAMP的结合是一个较为迅速且很快达到饱和的过程，探针的结合能力与cAMP的浓度高低及反应时间无关。另外cpYFP作为阴性对照，在整个动力学过程中所有梯度浓度下其ratio值变化幅度均较小(在2％范围内)。

实施例8环核苷酸荧光探针在高通量筛选过程中的检测方法优化

在最初探针的检测实验中，需要对每次表达的样品探针蛋白进行纯化脱盐处理，其过程十分繁琐，而且由于cAMP本身不能直接透膜，无法进行活菌检测，而在对荧光探针的优化过程中需要对大批量的样品进行检测，本发明中我们创建了一种简便易行的检测途径，用破碎后的菌液上清代替纯化处理的蛋白直接进行检测。

首先选择之前所筛选出的cp3探针作为检测对象，以pRSETb空菌作为空白对照，cpYFP作为阴性对照进行小量表达，收菌后用适量体积的Hepes缓冲液重悬，稀释至相同OD，然后进行超声破碎，冷冻离心并将蛋白上清转移至新的离心管，置于冰上保存。取适量体积上清至96孔酶标检测板黑板内，读取荧光值，根据荧光高低来调整检测的灵敏度，注意保证信噪比。开始滴定检测实验，取之前脱盐后cp3蛋白样品作为对照，比较蛋白样品与破碎上清的响应情况。

检测结果表明，两种形式的探针样品初始ratio值相近，且上清样品响应情况与脱盐后蛋白保持一致，如附图5所示。由此可以证明，本发明的破碎上清检测方法可行，可免去蛋白纯化、脱盐等繁琐的处理步骤，用于高通量样品的检测，作为优化筛选过程中一种通俗简易的检测手段。

实施例9利用环核苷酸荧光探针监测大肠杆菌细胞内环核苷酸的变化

实验原理：鉴于大肠杆菌在不同培养条件下会出现二次生长现象，而cAMP的水平变化是调控的关键因素之一，本发明的环核苷酸荧光探针可作为靶标对该过程中内源的cAMP水平作实时监测，来标定葡萄糖、乳糖对大肠杆菌活细胞内cAMP的调节水平。

检测方法：

1.二次生长曲线的确定

(1)将已筛探针质粒转入表达菌株，挑数个克隆(尽量将克隆的大小维持在相似的水平上)至48或96深孔板进行培养，并在2-8h内测量OD变化曲线，原则上达到对数期后即可停止测量。

(2)根据已摸索的OD0.4左右的浓度诱导，确定这几个克隆达到该浓度的变化时间(差异最好限制在半个小时以内)。

(3)诱导18-22h后，离心收菌(无菌条件)更换成为乳糖培养基，该步需要对菌液进行一定的稀释(至OD0.4-0.6)，再次测量菌的生长曲线，测量时间3-4h左右，直到发现细菌再次进入对数期结束测量。

2.体外滴定曲线的绘制

检测方法已较为成熟，按本发明实施例5所述方法进行，对于所选探针有两个基本要求：

1)有适宜的浓度变化范围，最好在低浓度-高浓度都有相应

2)稳定性要好，选择性要高，响应性比较迅速

3.葡萄糖及乳糖对活菌细胞内cAMP水平的影响测定

1)根据之前所摸条件，对原始菌液测定初始ratio，后立即进行离心弃上清，沉淀用预热的新鲜M9(除糖类外其他盐类均含有)重悬，主要是用于排除之前诱导表达过程中cAMP及一些代谢物的积累，该操作过程不能超过5min。

2)在更换新鲜培养基后立即进行检测，首先读取30min的荧光动力学，然后分别加入待测物(缓冲液，葡萄糖，乳糖，糖类浓度为5mM)，继续读取1.5h动力学。

3)结合初始ratio值及动力学过程中变化情况进行数据分析，同时可用之前体外滴定曲线果进行cAMP水平的标定。

从附图7可看出，在滴定糖类之前的动力学过程中，本探针的荧光比值485/420处于持续升高状态，这是由于在更换新鲜培养基后细胞处于新的生长环境，cAMP会随生长而逐渐积累所致。而在加入葡萄糖后(35min时刻)探针的荧光比值485/420出现骤降，并在后面的15min内持续下降，在50min时达最低值后开始保持稳定，该变化过程是由PST(糖类磷酸转移酶)系统的调控作用所引起。在加入乳糖后探针的荧光比值485/420有稍微升高，但随后即保持稳定水平，是由于大肠杆菌在葡萄糖-乳糖环境的二次生长中,在利用完葡萄糖进入到乳糖利用阶段后配合乳糖操纵子的结合需要所发生。

另外，我们可根据本发明的cAMP荧光探针的体外滴定曲线大致计算出该生理变化过程中cAMP的水平约为1～2uM。

实施例10利用环核苷酸荧光探针监测哺乳动物细胞内环核苷酸的变化

实验原理：为验证本发明荧光探针是否能作为一种遗传编码的生物工具有效应用于一些生理指标或病理状态的监测，我们选择一些能够介导cAMP生成或降解的激动剂或抑制剂来进行实验，其中肾上腺素便可作为一种激动剂用来刺激胞浆内cAMP的产生，通过荧光成像技术或是酶标仪读取荧光动力学来观察该过程的荧光变化情况。

检测方法：

1)配制肾上腺素储液100mM，待用。

2)细胞处理：将细胞消化后低速离心，弃上清，用含有一定浓度Glucose(20mM)的buffer重悬，以维持细胞正常的营养需求及生理状态。

3)荧光检测：设置缓冲液为空白对照，空细胞为阴性对照，根据485/528,420/528荧光值调整灵敏度。

4)应激变化检测：对于肾上腺素设计10uM及100uM两种检测浓度，检测温度为37度(细胞样品提前孵育15～20min)，读取5min荧光动力学后，分别迅速加入两种浓度的异丙肾上腺素，然后读取10～20min荧光动力学(变化趋于平稳即可)，需要注意的是：

a)尽量采取新鲜的细胞处理液进行检测，避免由于放置过久引起细胞本身cAMP的积累从而对之后的应激反应造成干扰

b)在加入肾上腺素之前读取荧光动力学，观察已消化处理后的细胞内cAMP水平是否稳定

附图8表明，在加入激动剂后本荧光探针表现为瞬间剧烈的荧光变化，其中485通道荧光升高，420通道荧光下降，但在瞬间应激变化后485在较长时间范围内荧光保持下降趋势约25min后达平稳，而420在瞬间降低后即达稳定状态，这与现有大量文献报道结果保持一致。另外比较关注的是不同激动剂浓度下的应激变化存在一定差异。

其他实施方式

本说明书描述了一些实施方式，然而应理解，本领域技术人员通过阅读本说明书可获知不背离本发明的构思和范围的各种改进。因此，这些其他实施方式也应当包括在所附权利要求书范围内。

Claims (17)

1.一种基因编码的cAMP荧光探针，其特征在于，其内含有荧光蛋白序列或其衍生物和对cAMP敏感的多肽，其中所述对cAMP敏感的多肽，

(1)具有cAMP结合特性的CNBD结构域；和/或

(2)来源于对cAMP敏感的被cAMP直接活化调节的鸟嘌呤核苷酸交换因子Epac家族蛋白。

2.根据权利要求1所述基因编码的cAMP荧光探针，其特征在于，所述对cAMP敏感的多肽为来自于真核生物的交换因子Epac蛋白基因的多肽，该多肽的序列选自SEQIDNO：1、2、3和4。

3.根据权利要求1所述基因编码的cAMP荧光探针，其特征在于，所述荧光蛋白序列为环状排列的黄色荧光蛋白cpYFP如SEQIDNO：21所示。

4.根据权利要求1-3任一项所述基因编码的cAMP荧光探针，其特征在于，所述荧光探针所包含的荧光蛋白序列B和对cAMP敏感的多肽中具有cAMP结合特性的CNBD结构域A，所述B为序列表所示B1和/或B2氨基酸序列，所述A为序列表所示A1和/或A2氨基酸序列；所述荧光探针的组合形式是：

(1)A-B-A，其中B插入A的柔性区域内，将A分割成A的第一部分和A的第二部分，A的第一部分和A的第二部分共同构成完整的A结构域；

(2)A1-B-A2，其中A1和A2分别串联在B两端，A1和A2前后顺序可变换；A1是来自于人体或小鼠组织器官的交换蛋白或其衍生物的氨基酸序列，A2是来自于人体或小鼠组织器官的另一交换蛋白或其衍生物的氨基酸序列；

所述的cAMP荧光探针优选SEQIDNO：5、6、7、8、39、40、41、42、67所示的蛋白序列。

5.根据权利要求1所述基因编码的cAMP荧光探针，其特征在于，所述荧光探针为具有以下结构：

A₁-A₂-LK₁-FP-LK₂-A₃-A₄，

其中，A₁是Epac蛋白的第一结构域，为SEQIDNO:13或SEQIDNO:14；

A₂是Epac蛋白的第二结构域，为SEQIDNO:15或SEQIDNO:16；

A₃是Epac蛋白的第三结构域，为SEQIDNO:17或SEQIDNO:18；

A₄是Epac蛋白的第四结构域，为SEQIDNO:19或SEQIDNO:20；

FP是荧光蛋白，选自GFP，YFP，CFP以及基于这些蛋白的变异体，优选YFP，更优选cpYFP如SEQIDNO:21所示；

LK₁可以存在或不存在，存在时，LK₁为T、A、S、G中一种或一种以上氨基酸；

LK₂可以存在或不存在，存在时，LK₂为G、S、T中一种或一种以上氨基酸。

6.根据权利要求1所述基因编码的cAMP荧光探针，其特征在于，所述cAMP荧光探针为对荧光蛋白序列和对cAMP敏感的多肽的连接处氨基酸肽段YNSD和LEYN进行截短的突变体，优选的是SEQIDNO:51-66和SEQIDNO:68-83所示的氨基酸序列。

7.根据权利要求1所述基因编码的cAMP荧光探针，其特征在于，所述cAMP荧光探针为对cAMP荧光探针进行定点突变的突变体，所述突变为在Epac2B-CNBD氨基酸序列的93位、105位、122位、123位、132位、133位、152位、156位、160位、412位上突变；优选的是SEQIDNO:110-126所示的氨基酸序列。

8.一种编码权利要求1所述荧光探针的核苷酸序列，包括编码对cAMP敏感的蛋白质的核苷酸序列和编码荧光蛋白的核苷酸序列。

9.根据权利要求8所述的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列选自核苷酸序列SEQIDNO：9、10、11或12。

10.一种制备权利要求1-7中任一项所述荧光探针的方法，包括以下步骤：

(1)将含有权利要求8所述的核苷酸序列的表达载体转移至宿主细胞中，

(2)在所述宿主细胞表达的条件下培养所述宿主细胞，和

(3)由所述宿主细胞分离所述荧光探针。

11.一种融合蛋白，其特征在于，其包含权利要求1-7中任一项所述的荧光探针；所述融合蛋白是所述荧光探针与特异性亚细胞定位信号融合而成的，所述定位信号可将目标蛋白定位于指定的亚细胞器内。

12.一种编码权利要求11所述融合蛋白的核苷酸序列。

13.一种表达载体，所述的表达载体由载体质粒pRSETb与权利要求8所述的核酸序列操作性连接得到的。

14.权利要求1-7中任一项所述的荧光探针在检测cAMP中的应用。

15.一种权利要求1-7中任一项所述的荧光探针在监测活细胞内环核苷酸的变化的应用。

16.一种权利要求1-7中任一项所述的荧光探针在高通量筛选过程中的检测方法：

以pRSETb空菌为空白对照，cpYFP为阴性对照，cAMP荧光探针进行小量表达收菌后用Hepes缓冲液重悬并稀释至相同浓度，超声破碎取适量体积上清稀释至指定浓度后进行滴定检测实验。

17.一种试剂盒，所述的试剂盒包含说明书和权利要求1-7中任一项所述的荧光探针。