CN104762249B - 一种基因工程大肠杆菌op50品系及其制备方法和应用 - Google Patents

一种基因工程大肠杆菌op50品系及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基因工程大肠杆菌OP50品系及其制备方法和应用，该品系的基因组中，敲除了rnc基因，且attB位点插入有IPTG诱导的T7RNA聚合酶基因序列，实现了同时在OP50品系中破坏rnc基因表达以及增加T7聚合酶表达。喂食该基因工程大肠杆菌OP50品系的线虫在发育、代谢、行为以及衰老上无法与喂食传统OP50的虫子区分开，表明其适合用来培养线虫。该品系作为基因工具的开发铺平了通过利用线虫的全基因组筛选来系统剖析饮食信号和肠道微生物相互作用背后的遗传道路。本发明的基因工程大肠杆菌OP50品系这种RNAi工具还可以在避开饮食差异的影响中得到其他研究中的广泛应用。

Description

一种基因工程大肠杆菌OP50品系及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种基因工程大肠杆菌OP50品系及其制备方法和应用。
背景技术
饮食是影响动物寿命的一个非常重要的环境因素。所有动物都必须通过食物摄入养料来维持生命和生育，饮食还直接或间接影响动物的发育、代谢、行为和衰老。根据动物遗传组成和生理状态，饮食量不同、饮食中营养成分不同会造成不同的反应。饮食变化和异常饮食信号日益和人类疾病如肥胖、糖尿病、癌症和心血管疾病联系起来。
除了提供营养，饮食还间接通过肠道微生物来影响动物，例如动物肠道中的微生物帮助动物消化食物中宿主动物本身不能消化的纤维来生产短链脂肪酸，这些微生物还能合成一些微量营养物质如维生素。这些间接的饮食影响也同从糖尿病、抑郁症到自闭症等许多人类疾病联系起来。尽管现在越来越认识到饮食的重要性以及饮食信号对健康的影响，这其中的复杂机制使得研究背后遗传基础的工作充满挑战。
线虫是在许多生物过程的研究中广泛应用的模式生物，线虫以细菌为食，摄入的细菌在肠道中消化后为线虫提供养料。细菌利用环境中的化学物质，合成一些必需微量营养物质例如线虫自身不能合成的维生素。就这一点而言喂养线虫的细菌直接为线虫提供大量营养物质以及必须微量营养物质，这和哺乳动物中的情况是一样的。此外，线虫和人需要相似的必需营养物质以及相似的基础代谢通路，这使得线虫代表了一个研究饮食的直接/间接影响包括宿主-微生物相互作用的非常易于遗传操作的模式生物系统。
OP50是Sydney Brenner在他第一次介绍线虫作为一种遗传模式生物时选择用来培养线虫的。自那以后OP50就成为实验室里标准的线虫食物。它是一种B系大肠杆菌，为尿嘧啶营养缺陷菌系，只能在培养板上形成较薄的菌苔，这样就方便于在显微镜下观察线虫的形态、发育及行为(Brenner,1974)。在过去40年里，几乎所有关于线虫基因表达、发育、代谢、行为和衰老等的实验数据都是用OP50收集的。RNAi是一种首先在线虫中建立起来的基因工具，从1990年开始，RNA干扰成为一种有力的遗传工具并使生物医学研究革命性发展(Fire et al.,1998)。现在已被广泛用来描绘几乎所有线虫中的生物过程，包括很多RNAi的研究，特别是大量的全基因组RNAi筛选。
但是关键资源的缺少阻碍了线虫模型在饮食信号研究中的应用，尤其是不能在喂食不同食物的虫子上进行RNAi。在OP50中不能进行RNAi操作，所有RNAi数据都来自于一种K-12系大肠杆菌HT115，这种方法是基于给线虫喂食表达针对特定基因的双链RNA(dsRNA)的HT115细菌来引起基因沉默。对线虫来说OP50和HT115是两种在营养物质和代谢产物的量和组成上不同的食物，前者是正常饮食而后者是富营养的，因此这两种饮食会对线虫的基因表达产生不同影响，导致对线虫整个生命周期各方面产生不同影响，包括而不仅限于发育、代谢、行为和衰老。因为技术上还不能在喂食OP50的线虫上进行RNAi，我们还不能通过RNAi系统性地研究饮食依赖对线虫生物特性分差调节背后的遗传基础。此外，因为OP50和HT115对线虫的影响不同，所以对比在HT115上的RNAi数据和文献中通过OP50得到的数据很困难，这些不仅对针对不同饮食反应的，还对旨在排除饮食差分影响的研究造成很大的挑战。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的基因工程菌，可作为线虫的标准食物等，用来进行多种生物学研究。
本发明提供的基因工程大肠杆菌OP50品系，在其基因组中，敲除了rnc基因，且attB位点插入有T7RNA聚合酶部件。
大肠杆菌OP50DNA上的rnc基因编码产物为RNase III酶，RNase III酶能降解细菌中绝大多数dsRNA。基因敲除是通过一定的途径使有机体特定的基因失活或缺失的技术。rnc基因被敲除后，其不能再合成RNase III酶，有效增加了细菌中双链RNA的表达量。敲除rnc基因的目的是破坏其基因表达，只要起到破坏该基因表达的目的即可。
大肠杆菌OP50DNA上的att(attach)位点记为attB，长度为23bp，位于bio和gal基因之间，分B、O和B’三个序列组分。在attB位点插入T7RNA聚合酶基因序列后，使得相应RNA的表达具备可诱导性。虽然K-12系大肠杆菌HT115携带一个分离自DE3原噬菌体溶源化导入的IPTG诱导T7聚合酶部件，此部件可以起始质粒上dsRNA的合成。然而大肠杆菌OP50缺少这一结构，且该品系是抗λ噬菌体的，无法利用DE3溶源化来导入IPTG诱导T7聚合酶部件，大肠杆菌HT115的这种结构特征并不能在OP50上重现。
经过努力，发明人发现attB位点能够插入T7RNA聚合酶部件，T7RNA聚合酶部件特定插入到attb位点专一性重组需要的识别位点，没有插到promoter后面，重组DNA片段中自带启动子。
通过在大肠杆菌OP50基因组中联合进行这两处改进后，新的基因工程菌能够有效表达RNA，尤其是具有双链结构的RNA，如具有回文结构的RNA等，同时也保证了RNA表达的丰度和具备条件诱导表达特性。
作为优选方案，上述基因工程大肠杆菌OP50品系中，rnc基因序列部分插入有miniTn10转座子。通过miniTn10转座子，该品系还获得了四环素抗性。
所述miniTn10转座子的核苷酸序列如SEQIDNO.1～2所示。所述T7RNA聚合酶部件的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
miniTn10序列：
5’－NGCTNAGCN－3’(SEQ ID NO.1)
3’－NCGANTCGN－5’(SEQ ID NO.2)。其中N为任意碱基对。
SEQ ID NO.3：IPTG诱导的T7聚合酶序列参见序列表。
靶序列和共同顺序愈相似，则转位的频率愈高。很可能转位酶需要同时识别末端反向重复和靶序列二者方能发挥作用。
作为优选方案，上述基因工程大肠杆菌OP50品系，名称为大肠杆菌Escherichiacoli OP50(xu363)，于2015年3月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCM2015138。
本发明还提供了一种上述基因工程大肠杆菌OP50品系的制备方法，是将来自rnc－大肠杆菌K8024的miniTn10转座子引入rnc基因中；将IPTG诱导T7RNA聚合酶部件插入到attB位点，得到基因工程大肠杆菌OP50品系。上述两个操作顺序不分先后，可以调换。
Red同源重组技术的原理是将一段携带与靶基因两翼各有40～60bp同源序列的PCR片段导入宿主菌细胞，利用λ噬菌体Red重组酶的作用，使导入细胞的线性DNA片段与染色体(或载体)的特定靶序列进行同源重组，靶基因被标记基因置换下来。PCR引物由两部分组成，靠近5’端的区域为与靶基因同源的序列(约40bp)，靠近3’段的区域(约20bp)与模板DNA互补。
作为优选方案，上述基因工程大肠杆菌OP50品系的制备方法，具体步骤为：
敲除rnc基因：通过质粒转染的方法将来自rnc－大肠杆菌K8024的miniTn10转座子引入OP50的rnc基因中；
插入T7RNA聚合酶基因序列：通过Red/ET介导的同源重组一个两侧是两个FRT位点的卡那霉素抗性基因首先引入到大肠杆菌BL21(DE3)ybhC和lacI基因中间，然后携带整个编码T7聚合酶的基因片段和此卡那霉素抗性组件通过PCR扩增并通过第二步Red/ET介导的同源重组插入到经rnc基因敲除处理的OP50的attB位点，最后再通过FLP介导的重组将卡那霉素抗性组件去掉，最终得到的菌经PCR测序确认，获得所述基因工程大肠杆菌OP50品系
本发明还提供上述基因工程大肠杆菌OP50品系作为秀丽隐杆线虫的食物在研究饮食对动物生命活动影响研究中的应用。
本发明具有以下有益效果：
1.实现了同时在OP50品系中破坏rnc基因表达以及增加T7聚合酶表达
线虫以细菌为食，因此常规思路是把产生针对特定线虫基因的dsRNA的质粒转入作为食物的细菌中，这使得细菌成为产生和释放dsRNA最方便的载体。有两个理由使得HT115被选为宿主菌：其一，它携带一个插入可以编码RNA酶III的rnc基因的miniTn10转座子，这导致了rnc的缺失，由于RNA酶III剪切dsRNA，它的缺失使得dsRNA的得率大大提升；其二，HT115携带一个分离自DE3原噬菌体溶源化导入的IPTG诱导T7聚合酶部件，而此部件可以起始质粒上dsRNA的合成。
而OP50缺少这两点，它是rnc+，而且通过DE3溶源化转入IPTG诱导T7聚合酶部件也很困难。我们尝试通过DE3溶源化在经过rnc缺失改造的OP50中转入IPTG诱导T7聚合酶部件却未能成功，我们意识到OP50是抗λ噬菌体的，这可能是因为它表面缺乏有效的噬菌体受体。但是在转入携带编码λ噬菌体受体的K-12菌株源malB操纵子质粒后，OP50只获得了有限的λ噬菌体接受性，不足以诱导DE3溶源化，无法通过DE3溶源化转入IPTG诱导T7聚合酶部件。
因此尽管OP50是喂养线虫的标准食物而且我们也希望用OP50来进行RNAi实验，事实却不允许如此。
为了克服这个技术难题，我们求助于另一种重组方法：通过两步Red/ET介导的重组将IPTG诱导T7聚合酶部件插入OP50的attB位点(图1B)，通过这种方法，建立了一个dsRBA产量和HT115一样的新基因工程大肠杆菌OP50品系。
2.该基因工程大肠杆菌OP50品系可以通过质粒产生和HT115一样有效的dsRNA，最重要的是，喂食该基因工程大肠杆菌OP50品系的线虫在发育、代谢、行为以及衰老上无法与喂食传统OP50的虫子区分开，表明其适合用来培养线虫。
3.该基因工程大肠杆菌OP50品系作为基因工具的开发铺平了通过利用线虫的全基因组筛选来系统剖析饮食信号和肠道微生物相互作用背后的遗传道路。OP50是实验室中线虫的正常食物，本发明的基因工程大肠杆菌OP50品系这种RNAi工具还可以在避开饮食差异的影响中得到其他研究中的广泛应用。
保藏信息：
菌株名称：大肠杆菌Escherichia coli OP50(xu363)，保藏日期2015年3月19日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC M2015138，保藏地址：中国.武汉.武汉大学。
附图说明
图1是基因工程大肠杆菌OP50品系构建流程；
图2是OP50和OP50(xu363)的生长曲线；
图3是OP50、OP50(xu363)和HT115菌株经IPTG诱导表达的产物电泳结果图。
图4为实施例2的RNAi喂食试验结果。
图5为实施例2的红油O染色后显微镜成像结果。
图6为实施例2的ATP含量测定结果。
图7为实施例2的寿命试验测定结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
生物材料来源：
OP50：为现有常用菌，来自CGC数据库，可直接在http://www.cbs.umn.edu/research/resources/cgc申请获得。
以下菌株可从申请人处获得：
大肠杆菌K8024：大肠杆菌K8024是由K-12株K37(来自W3102，NIH保存菌株衍生出来的菌株，携带rnc14:miniTn10等位基因，是miniTn10转座子的来源菌。公开文献Takiff,H.E.,Chen,S.M.,and Court,D.L.(1989).Genetic analysis of the rnc operon ofEscherichia coli.J Bacteriol171,2581-2590.
高频转化突变的P1噬菌体：公开文献Sternberg,N.L.,and Maurer,R.(1991).Bacteriophage-mediated generalized transduction in Escherichia coli andSalmonella typhimurium.Methods Enzymol204,18-43.)
大肠杆菌BL21(DE3)：公开文献Timmons,L.,Court,D.L.,and Fire,A.(2001).Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potentgenetic interference in Caenorhabditis elegans.Gene263,103-112.
实施例中未作说明的实验方法、步骤均为本领域常规实验手段。
实施例1基因工程大肠杆菌OP50品系构建
敲除rnc基因：
如图1A，转化使用一株高频转化突变的P1噬菌体(简称P1噬菌体)，P1噬菌体转染插入带有抗四环素特性的miniTn10转座子的大肠杆菌K8024，获得含有miniTn10转座子基因的噬菌体，该噬菌体继续转染OP50，miniTn10转座子基因会特异性插入到OP50内源的rnc基因内，进而破坏rnc基因功能，这一步得到的OP50改造产物称为具ura-,strR,rnc-基因型的OP50，命名为OP50(xu362)。
插入T7RNA聚合酶基因序列(如图1B)：
1.首先准备大肠杆菌OP50(xu362)用于Red/ET重组。
OP50(xu362)在LB固体培养基上划线在37℃培养得到单克隆。为了能使Red/ET进行重组，将pRed/ET质粒(gene bridges’公司产品)转化到OP50(xu362)。这种转化后的细菌在30℃液体LB培养基中培养到OD600为0.5，然后加入甘油保种。
2.在DNAcassette上构建出FRT-KanR-FRT-lacUV5p-gene1通过PCR的方式得到卡那霉素的DNA片段，然后将其整合到BL21(DE3)基因组中，正好在Red/ET介导的重组区DE3prophage上游(如图1B)，结果通过PCR验证。因为在卡那霉素的DNA片段扩增所用引物存在50bp的长同源序列(与大肠杆菌基因组上插入位点两侧序列同源)，因此用提取的大肠杆菌基因组作为模板PCR会出现重组得到拥有卡那霉素抗性的T7RNA聚合酶基因序列。
3.Red/ET介导T7RNA聚合酶基因序列整合到细菌基因组中。将已经转入pRed/ET质粒的OP50(xu362)菌株在12.5μg/mlLB中培养.因为OP50是大肠杆菌REL606衍生过来的，它在bio和gal基因节点间的自然λphophage结合位点有截断的λphophage。这个434类似的prophage被T7RNA聚合酶基因序列取代后就得到我们想要的菌株，命名为OP50(xu363)前体，通过卡那霉素抗性筛选得到阳性克隆。
4.从OP50(xu363)前体中删除卡那霉素抗性基因。步骤3中得到的OP50(xu363)前体菌株中转入FLP重组酶表达质粒(gene bridges’公司产品)，然后将其在LB培养到OD600为0.5。重组酶活性被温度转变诱导，进而置于37℃培养3小时，然后将菌在固体LB培养基上划线得到单克隆，挑选54个单克隆发现他们都是对卡那霉素敏感的，表明OP50(xu363)前体中的卡那霉素抗性基因已经去除。为验证序列的正确性，挑选4个单克隆，将修饰过的全序列通过PCR扩增得到，并用琼脂糖胶分离纯化后测序，结果显示序列是T7RNA聚合酶基因序列匹配的。获得OP50(xu363)，也就是大肠杆菌Escherichia coli OP50(xu363)。
实施例2RNAi试验
线虫品系
野生型：
N2.TQ2460：xuIs117[sur-5::gfp].
TQ3572:xuEx1266[Pges-1::sgk-1::SL2::mCherry].
TQ4776:xuEx1478[Pges-1::rict-1::SL2::mCherry].。
以下突变株由线虫基因中心(CGC)获得并用于本项研究中：
rict-1(mg360)，sgk-1(ok538)，pept-1(lg1601)，unc-31(e169)，
tyra-3(ok325)以及
uIs57[unc-119p::YFP+unc-119p::sid-1+mec-6p::mec-6]；lin-15B(n744)。
除了unc-31RNAi克隆是单独设计的，其余所有RNAi质粒均从Ahringer库中提取并经过测序后转入OP50(xu363)中。
所有RNAi喂食试验均从线虫卵开始延及整个寿命周期。RNAi实验中，含有空载L4440或者RNAi质粒的HT115，和含有空载L4440或者RNAi质粒的OP50(xu363)单克隆，在含有羧苄(100μg/mL)的LB培养基中37℃培养过夜，并在实验两天前将新鲜的RNAi菌接到线虫生长培养基(NGM，含有25μg/mL羧苄和1mM IPTG)。
线虫在HT115上发育得比在OP50和OP50(xu363)上快(图4中A)，通过在HT115或者OP50(xu363)上的RNAi都足以诱导和突变体一样的表型，消除了两种细菌食物造成的影响(图4中B，C，D)，这表明RNAi是一种研究饮食对发育的差分调节背后遗传基础的有效工具。
发育速率试验
通过让100只产卵期的线虫成虫产30分钟卵来同步化。在L4时期时，每种食物来源的20只虫子被转入有相应细菌的单独的NGM中，并每30分钟连续观测直到其第一次产卵。数据表示为平均卵-卵时间±平均数标准误如图4。
油红O染色
每株系大约500只同步化的1日龄成虫用1×磷酸盐缓冲液(PBS)洗下来，洗下来的虫子洗两次再用375μLPBS重悬，然后加入500μL现配的2×MRWB(160mM KCl,40mM NaCl,14mM Na2EGTA,1mM Spermidine HCl,0.4mM Spermine,30mM NaPIPES,pH7.4,0.2％beta-ME)和125μL16％多聚甲醛，室温放置30分钟后用Tris-HCl缓冲液(100mM,pH7.4)洗两次，加入还原缓冲液(100mM Tris-Cl pH7.4,10mM DTT)室温放置30分钟。接着离心后用1×PBS洗两次，用60％异丙醇重悬脱水(15分钟，室温)。待异丙醇去完后用1ml油红O溶液室温孵育过夜(油红O，以下简称ORO溶液如下准备：0.5g ORO溶入100ml无水异丙醇并通过震荡平衡两天得到ORO贮液；ORO染色溶液需要现配现用，混合60％ORO贮液和40％蒸馏水并用0.2μm注射式滤器过滤)。ORO染色的虫子直接固定到有琼脂糖垫(2％琼脂糖溶于1×PBS)的载玻片上，并通过连有数字彩色CCD摄像头的立式复合显微镜(Olympus BX51)成像。为了定量测定脂含量，得到的图像通过ImageJ软件去掉背景并转换为灰度图，然后比较不同条件处理虫子的信号强度。每组实验至少分析了30只虫子如图5。
耗氧量和ATP含量
耗氧率(OCR)通过Seahorse XF24分析仪实时测量。通过重力分选用M9缓冲液(3gKH2PO4,6g Na2HPO4,5g NaCl,and1mL1M MgSO4溶于1L蒸馏水)将同步化的1日龄虫子从NGM板子上冲洗下来并洗三次。Seahorse联板每个孔转入50～300只虫子，使用厂商建议的标准步骤测量耗氧量(OCR)。用测量得到的OCR值除以分析虫子数得到最终耗氧量ATP含量分析时，用M9收集约1000只1日龄同步化的成虫并洗三次，三次冻融循环后，将虫子置于M9中煮沸15分钟，离心之后分析上清中ATP含量(ATP Determination Kit,Life Technologies)和蛋白浓度(Bradford Protein Assay Kit,Thermo Fisher Scientific)。得到的数据通过蛋白总量标准化后得到ATP含量如图6。
寿命试验
所有寿命实验均在20℃条件下进行，方法参照文献Hsu et al.,2009；Xiao etal.,2013。所有实验中，将成虫第一天算为第一天，每次寿命试验中使用了100只虫子，每2～3天将其转到新的60mm NGM板子上，每板10只虫子；如果虫子爬出板子、爆裂或者变得松弛，将会被除开；所有RNAi上的寿命试验均从卵开始并始终在RNAi板子上进行。所有统计分析均用raphPad Prism5(GraphPad Software,Inc.)和IBM SPSS Statistics19(IBM,Inc.)软件完成，P值用对数秩法(Kaplan-Meier)得到。可以看出过去在HT115上得到的影响寿命基因，同时能在OP50(xu363)重现出来，如图7。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 密歇根大学，华中科技大学
<120> 一种基因工程大肠杆菌OP50品系及其制备方法和应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> n is a, c, g, or t
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tcgcgctgca ctggcgtaat gctgaccgga tggctatcgc taatggtctt acgctcaaca 60
ttgataagca acttgacgca atgttaatgg gctgatagtc ttatcttaca ggtcatctgc 120
gggtggcctg aataggtacg atttactaac tggaagaggc actaaatgaa cacgattaac 180
atcgctaaga acgacttctc tgacatcgaa ctggctgcta tcccgttcaa cactctggct 240
gaccattacg gtgagcgttt agctcgcgaa cagttggccc ttgagcatga gtcttacgag 300
atgggtgaag cacgcttccg caagatgttt gagcgtcaac ttaaagctgg tgaggttgcg 360
gataacgctg ccgccaagcc tctcatcact accctactcc ctaagatgat tgcacgcatc 420
aacgactggt ttgaggaagt gaaagctaag cgcggcaagc gcccgacagc cttccagttc 480
ctgcaagaaa tcaagccgga agccgtagcg tacatcacca ttaagaccac tctggcttgc 540
ctaaccagtg ctgacaatac aaccgttcag gctgtagcaa gcgcaatcgg tcgggccatt 600
gaggacgagg ctcgcttcgg tcgtatccgt gaccttgaag ctaagcactt caagaaaaac 660
gttgaggaac aactcaacaa gcgcgtaggg cacgtctaca agaaagcatt tatgcaagtt 720
gtcgaggctg acatgctctc taagggtcta ctcggtggcg aggcgtggtc ttcgtggcat 780
aaggaagact ctattcatgt aggagtacgc tgcatcgaga tgctcattga gtcaaccgga 840
atggttagct tacaccgcca aaatgctggc gtagtaggtc aagactctga gactatcgaa 900
ctcgcacctg aatacgctga ggctatcgca acccgtgcag gtgcgctggc tggcatctct 960
ccgatgttcc aaccttgcgt agttcctcct aagccgtgga ctggcattac tggtggtggc 1020
tattgggcta acggtcgtcg tcctctggcg ctggtgcgta ctcacagtaa gaaagcactg 1080
atgcgctacg aagacgttta catgcctgag gtgtacaaag cgattaacat tgcgcaaaac 1140
accgcatgga aaatcaacaa gaaagtccta gcggtcgcca acgtaatcac caagtggaag 1200
cattgtccgg tcgaggacat ccctgcgatt gagcgtgaag aactcccgat gaaaccggaa 1260
gacatcgaca tgaatcctga ggctctcacc gcgtggaaac gtgctgccgc tgctgtgtac 1320
cgcaaggaca gggctcgcaa gtctcgccgt atcagccttg agttcatgct tgagcaagcc 1380
aataagtttg ctaaccataa ggccatctgg ttcccttaca acatggactg gcgcggtcgt 1440
gtttacgccg tgtcaatgtt caacccgcaa ggtaacgata tgaccaaagg actgcttacg 1500
ctggcgaaag gtaaaccaat cggtaaggaa ggttactact ggctgaaaat ccacggtgca 1560
aactgtgcgg gtgtcgataa ggttccgttc cctgagcgca tcaagttcat tgaggaaaac 1620
cacgagaaca tcatggcttg cgctaagtct ccactggaga acacttggtg ggctgagcaa 1680
gattctccgt tctgcttcct tgcgttctgc tttgagtacg ctggggtaca gcaccacggc 1740
ctgagctata actgctccct tccgctggcg tttgacgggt cttgctctgg catccagcac 1800
ttctccgcga tgctccgaga tgaggtaggt ggtcgcgcgg ttaacttgct tcctagtgag 1860
accgttcagg acatctacgg gattgttgct aagaaagtca acgagattct acaagcagac 1920
gcaatcaatg ggaccgataa cgaagtagtt accgtgaccg atgagaacac tggtgaaatc 1980
tctgagaaag tcaagctggg cactaaggca ctggctggtc aatggctggc tcacggtgtt 2040
actcgcagtg tgactaagcg ttcagtcatg acgctggctt acgggtccaa agagttcggc 2100
ttccgtcaac aagtgctgga agataccatt cagccagcta ttgattccgg caagggtccg 2160
atgttcactc agccgaatca ggctgctgga tacatggcta agctgatttg ggaatctgtg 2220
agcgtgacgg tggtagctgc ggttgaagca atgaactggc ttaagtctgc tgctaagctg 2280
ctggctgctg aggtcaaaga taagaagact ggagagattc ttcgcaagcg ttgcgctgtg 2340
cattgggtaa ctcctgatgg tttccctgtg tggcaggaat acaagaagcc tattcagacg 2400
cgcttgaacc tgatgttcct cggtcagttc cgcttacagc ctaccattaa caccaacaaa 2460
gatagcgaga ttgatgcaca caaacaggag tctggtatcg ctcctaactt tgtacacagc 2520
caagacggta gccaccttcg taagactgta gtgtgggcac acgagaagta cggaatcgaa 2580
tcttttgcac tgattcacga ctccttcggt accattccgg ctgacgctgc gaacctgttc 2640
aaagcagtgc gcgaaactat ggttgacaca tatgagtctt gtgatgtact ggctgatttc 2700
tacgaccagt tcgctgacca gttgcacgag tctcaattgg acaaaatgcc agcacttccg 2760
gctaaaggta acttgaacct ccgtgacatc ttagagtcgg acttcgcgtt cgcgtaacgc 2820
caaatcaata cgactcacta tagagggaca aactcaaggt cattcgcaag agtggcc 2877

Claims (4)

1.一种基因工程大肠杆菌OP50品系，其特征在于，该大肠杆菌OP50品系的基因组中，敲除了rnc基因，rnc基因序列部分插入有miniTn10转座子，且attB位点插入有IPTG诱导的T7RNA聚合酶基因序列；
该基因工程大肠杆菌OP50品系名称为大肠杆菌Escherichia coli OP50(xu363)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC M 2015138。
2.根据权利要求1所述的基因工程大肠杆菌OP50品系，其特征在于，所述miniTn10转座子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示。
3.根据权利要求1所述的基因工程大肠杆菌OP50品系，其特征在于，所述T7 RNA聚合酶基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.权利要求1～3任一所述的基因工程大肠杆菌OP50品系作为秀丽隐杆线虫的食物在研究饮食对动物生命活动影响研究中的应用。
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