CN109988771A

CN109988771A - 一个玉米抗盐qtl及其应用

Info

Publication number: CN109988771A
Application number: CN201910236051.7A
Authority: CN
Inventors: 蒋才富; 张鸣
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2019-03-27
Filing date: 2019-03-27
Publication date: 2019-07-09
Anticipated expiration: 2039-03-27
Also published as: CN109988771B

Abstract

本发明公开了一种玉米抗盐主效QTL及其应用。所述玉米抗盐QTL基因，其编码核苷酸序列选自：(a)SEQ ID No.1所示的序列；(b)SEQ ID No.1所示的序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。在此抗盐QTL基因内，鉴定了一个在抗感材料间存在差异的插入缺失标记。该标记与玉米抗盐性连锁，可作为玉米抗盐分子标记，本发明提供了检测该抗盐分子标记的引物和方法。由于玉米抗盐属数量性状遗传，表型分析耗时费力，本发明所述的QTL基因、分子标记和引物可以应用于玉米的抗盐育种。

Description

一个玉米抗盐QTL及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及本发明涉及一种玉米抗盐主效 QTL及其应用。

背景技术

盐碱胁迫在自然界中分布广泛，是对农业生产影响较大的非生物胁迫，已成为制约农业可持续发展的关键问题。近年来，全球盐碱化进程的加快进一步加重了盐碱对农业生产的威胁。我国是耕地受盐碱化危害较严重的国家之一，在北方耕地盐碱化较南方更为严重，而作为我国粮食生产的主产区，不断加剧的耕地盐碱化，势必威胁到粮食生产和粮食安全。因此如何开发利用大面积的盐碱地，合理应对盐碱胁迫对农业生产(尤其是主要作物生产)的负面影响，对维持我国农业生产的可持续发展有重要意义。

玉米对盐胁迫十分敏感(王丽燕，2005)。玉米中的研究表明，不同玉米自交系的抗盐能力存在显著差异。已有一些研究尝试通过各种技术手段进行相关基因的挖掘与分子克隆，但目前为止只有极少数玉米抗盐QTL被精细定位或克隆，这已然成为玉米抗盐分子标记开发和抗盐玉米培育的主要瓶颈。因此，克隆抗盐 QTL基因,研究其介导抗盐的分子机制，开发用于抗盐玉米培育的分子标记已成为抗盐玉米改良的首要关键任务。

植物在受到盐胁迫时，根系从土壤中吸收过量的Na⁺，同时K⁺吸收受阻，导致组织中K⁺/Na⁺比率失衡，最终导致离子毒害，因此维持Na⁺、K⁺浓度的稳态及 K⁺/Na⁺比率平衡在植物抗盐能力形成过程中发挥着重要的作用(Zhu et al.,2002； Munns and Tester,2008；Jiang et al.,2012)。已有的研究结果表明，玉米在盐胁迫条件下生长时，不同玉米自交系叶片中积累的Na⁺浓度以及K⁺/Na⁺比率存在显著差异(Zhao et al.,2010；Chen et al.,2016)，但相关QTL基因只有极少数被精细定位/克隆，因此克隆调控玉米Na⁺、K⁺浓度以及K⁺/Na⁺比率的QTL基因对抗盐玉米的改良具有重要意义。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种玉米抗盐QTL 基因，所述基因其编码核苷酸序列选自：

(a)SEQ ID No.1所示的序列；

(b)SEQ ID No.1所示的序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

同时，本发明还提供了上述玉米抗盐QTL基因所编码的蛋白质。

上述蛋白质，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

对于上述玉米抗盐QTL基因，本发明的发明人发现两个亲本自交系黄C 和X178的抗盐性存在显著差异，以黄C和X178的RIL群体为材料，本发明利用QTL分析及其它生物信息学手段，克隆了玉米抗盐QTL基因，命名为 ZmNC2，该基因编码区长度为2109bp(详细序列见SEQ ID No.1)，编码702 个氨基酸(详细序列见SEQ ID No.2)。

本发明的目的在于提供一种玉米抗盐主效QTL，其特征在于，该主效QTL 位于4号染色体55,074-55,085kb的位置。

为了筛选适合抗盐分子标记的DNA序列变异，发明人对抗盐自交系黄C 和盐敏感自交系X178基因组DNA进行了重测序，通过数据分析和基于PCR 产物的测序验证，鉴定到一个抗感材料间存在差异的12586bp(具体序列见SEQ ID No.3)插入片段，将该插入片段命名为ZmNC2-InDel。该插入仅存在于盐敏感材料X178中，导致ZmNC2的转录水平下降，进而影响其盐敏感性，适合用于分子标记。

本发明的目的也在于提供一种玉米抗盐相关的分子标记，所述分子标记表现为SEQ ID No.3所示核苷酸序列在上述抗盐QTL基因中插入或缺失。

上述分子标记，进一步地，表现为SEQ ID No.3所示核苷酸序列在所述抗盐QTL基因中的第一个内含子中插入或缺失。

上述分子标记，进一步地，在所述抗盐QTL基因中插入SEQ ID No.3所示核苷酸序列的个体为盐敏感型；所述抗盐QTL基因缺失SEQ ID No.3所示核苷酸序列的个体为抗盐型。

同时，本发明还提供了用于检测权利上述分子标记的引物对，包括：引物对Ⅰ和引物对Ⅱ，所述引物对Ⅰ为引物ZmNC2-F1和引物ZmNC2-R1，所述引物对Ⅱ为引物ZmNC2-InDel-F1和引物ZmNC2-R1；

所述引物ZmNC2-F1、ZmNC2-InDel-F和ZmNC2-R1序列如下：

引物ZmNC2-F1：GAATCTTGGCCACGAACTTG；

引物ZmNC2-InDel-F：CTAGTAGCTGGCTCCCTTCC；

引物ZmNC2-R1：CCTTCCCCATCTCTGAGCTC。

利用上述引物对，以所述待测玉米基因组DNA为模板进行PCR扩增，如果用引物对Ⅰ扩增后得到318bp的片段，其序列SEQ ID No.4所示，如用引物对Ⅱ扩增后没有片段，则为抗盐型；如果用引物对Ⅰ扩增后没有片段，用引物对Ⅱ扩增后得到1206bp的片段，其序列SEQ ID No.5所示，则为盐敏感型。

同时，本发明还提供了一种用于检测上述分子标记的试剂盒，包括上述的引物对。

进一步地，所述试剂盒还包括用于PCR扩增的酶和试剂，用利用上述引物对进行PCR扩增。

本发明的目的还在于提供一种检测玉米是否抗盐的方法，包括：

对待测玉米进行上述分子标记的检测，根据检测结果判断其是否抗盐。

上述方法中，所述方法包括：

利用上述引物对，或者上述试剂盒，以所述待测玉米基因组DNA为模板进行PCR扩增；

根据扩增结果判断是否抗盐：如果用引物对Ⅰ扩增后得到318bp的片段，其序列SEQ ID No.4所示，用引物对Ⅱ扩增后没有片段，则为抗盐型；如果用引物对Ⅰ扩增后没有片段，用引物对Ⅱ扩增后得到1206bp的片段，其序列SEQ ID No.5所示，则为盐敏感型。

上述抗盐QTL基因、上述蛋白质、上述主效QTL、上述述的分子标记、上述引物对，上述试剂盒在玉米抗盐育种中的应用。

本发明的有益效果

(1)本发明提供了一种新的玉米抗盐主效QTL，及其相关的抗盐QTL基因的核苷酸序列和其对应的蛋白质氨基酸序列，并且在此抗盐QTL基因内，鉴定了一个位于其内含子中插入或缺失的，与玉米抗盐性连锁的大片段，该片段的插入或缺失，可作为玉米抗盐分子标记。本发明还提供了一种用于检测本发明的玉米抗盐分子标记的引物对和试剂盒，以及检测玉米是否抗盐的方法。

(2)由于玉米抗盐属数量性状遗传，表型分析耗时费力，上述的玉米抗盐主效QTL、抗盐QTL基因及其蛋白质、分子标记、引物对和试剂盒都可以应用于玉米抗盐育种中，在玉米种子期间或子叶长出的早期阶段就可鉴定，省时而且准确，可以加速玉米抗盐品种选育进程。

附图说明

图1为抗盐QTL基因ZmNC2的定位及遗传验证；其中(A)为基于黄C/X178 RIL群体的QTL分析确定的抗盐主效QTL，及其相关基因ZmNC2的位置；(B) 为转录组测序比较ZmNC2基因在黄C和X178中的表达水平；(C)为利用 CRSPR-Cas9敲除后的基因和原基因序列的比较；(D)为pBUE411-ZmNC2 载体结构示意图；(E)为在对照或盐处理条件下生长了2周的野生型和ZmNC2 基因敲除植株(ZmNC2^crispr-1，ZmNC2^crispr-2)的生长情况；其中标尺大小为10 cm。

图2为ZmNC2基因的结构示意图。

图3为ZmNC2基因全长编码序列PCR扩增的电泳图；其中1为以来自黄 C幼苗的cDNA为模板，用ZmNC2特异的引物(ZmNC2-gene-F和 ZmNC2-gene-R)进行扩增获得的PCR产物(预期产物大小2109bp)，M为天根公司分子量标准500bp marker。

图4为ZmNC2基因编码序列连接入T载体后的载体图谱。

图5为ZmNC2编码的蛋白定位在细胞膜并具有Na⁺转运活性；其中(A) 为pCAMBIAsuper1300-GFP-ZmNC2载体结构示意图；(B)为在烟草表皮细胞中分析ZmNC2-GFP亚细胞定位；(C)为p416GPD-ZmNC2载体结构示意图； (D)为在缺陷酵母菌株ant5中分析ZmNC2编码蛋白的Na⁺转运活性；(E) 为在缺陷酵母菌株trk1trk2中分析ZmNC2编码蛋白的K⁺转运活性。

图6为抗感材料间(黄C和X178间)存在差异的12586bp核苷酸序列的鉴定及其对ZmNC2转录水平的影响；图中箭头所示为X178中鉴定到的大片段插入 ZmNC2-InDel的插入位置及用于扩增插入片段的引物ZmNC2-F1，ZmNC2-R1， ZmNC2-InDel-F2，ZmNC2-InDel–R2的位置。

图7为利用两对引物(引物对Ⅰ和引物对Ⅱ)在黄C和X178中进行PCR扩增的结果；其中，M为聚合美公司分子量标准2000bp marker。

图8为抗盐基因型玉米自交系(没有ZmNC2-InDel插入)和盐敏感基因型玉米自交系(有ZmNC2-InDel插入)叶片中Na⁺含量比较结果。

具体实施方式

以下实施例便于更好地理解本发明，但不限于此，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

除特殊说明的之外，各实施例中所用的设备和试剂均常规市售可得。

实施例1玉米抗盐QTL基因的克隆及功能分析

以黄C和X178RIL群体为材料，本发明通过基于混合线性模型的QTL分析在4号染色体上定位了一个主效抗盐QTL区域，如图1A所示，在4号染色体上55,074-55,085kb的位置，位置根据玉米B73参考基因组V2确定。同时通过转录组测序比较对照及盐胁迫下黄C和X178的转录组，在此QTL候选区域鉴定到一个候选基因，命名为ZmNC2，其表达水平在X178中显著低于黄C，如图1B所示，结果表明，在对照和盐处理条件下，X178中该候选基因的表达水平都显著低于黄C。

为了获得ZmNC2的突变体，发明人(1)设计了CRSPR-Cas9敲除靶点，如图1C所示；(2)用BsaI对含有靶点序列的PCR片段和pBUE411载体进行酶切、连接，连接产物转入大肠杆菌，用通用引物FD3/RD进行菌落PCR扩增，电泳检测有目的大小条带的菌落为阳性克隆，将对应的菌液送至北京三博远志生物技术有限责任公司测序，获得正确的pBUE411-ZmNC2载体(图1D)，将 pBUE411-ZmNC2转入农杆菌EHA105；(3)通过幼胚侵染的方法获得转基因植株；(4)通过对包括靶点在内的基因片段进行PCR扩增、测序确定转基因阳性植株。最终获得了两个ZmNC2候选基因的敲除材料(命名为ZmNC2^crispr-1 和ZmNC2^crispr-2)，并证明这两个突变体跟X178一样表现出盐敏感的表型，如图1E所示，表明ZmNC2基因敲除植株对盐胁迫更敏感，表现为植株矮小叶片发黄，说明该基因的确是抗盐QTL基因ZmNC2。

通过Gramene网站对ZmNC2基因结构进行预测，基因全长(从起始密码子到终止密码子)11210bp，包含四个外显子，三个内含子，其中编码区序列全长2109bp，如图2所示。为了克隆ZmNC2全长编码序列，以生长7天的抗盐玉米自交系黄C幼苗为材料，使用天根生化科技(北京)有限公司的植物总 RNA提取试剂盒(Cat.#DP432)提取总RNA，并通过使用普洛麦格(北京)生物技术有限公司的M-MLV反转录酶进行反转录获得cDNA，用ZmNC2特异的引物(正向引物ZmNC2-gene-F ATGGCTGCTGCCTCCATGGAC；反向引物 ZmNC2-gene-RTCAGGCCTTGTAGAGCATGCC)进行PCR扩增，获得了与预期大小(2109bp)相符的产物，如图3所示。PCR扩增体系为50μl，包括：2×Super Multiplex PCR Mix 25μl；10μM Primer ZmNC2-gene-F 2μl；10μM Primer ZmNC2-gene-R 2μl；DNA 1μl,ddH2O 20μl)。PCR扩增条件为：预变性95℃ 2min,变性95℃30s,退火58℃30s,延伸72℃1min30s,由变性到延伸进行 34个循环，最后延伸72℃5min。

使用天根生化科技(北京)有限公司的凝胶回收试剂盒(Cat.#DP105-3) 对PCR产物进行回收和纯化，用北京全式金生物技术有限公司的pEASY-Blunt Cloning Kit试剂盒对纯化后的产物进行T载体的连接(载体图谱见图4)，然后转入大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆，使用通用引物T7/SP6进行菌落PCR 扩增，电泳检测有目的大小条带的菌落为阳性重组体，将对应的菌液送至北京三博远志生物技术有限责任公司测序，获得了2109bp的ZmNC2外显子序列，其核苷酸序列见SEQ ID No.1，对应的蛋白质的序列为SEQ ID No.2所示。

生物信息预测ZmNC2编码一个KUP家族离子转运蛋白，通过(1)用XbaI 和HindIII对含有XbaI和HindIII酶切位点的ZmNC2片段和 pCAMBIAsuper1300-GFP载体进行双酶切，酶切片段通过T4连接酶连接，转入大肠杆菌，通过菌落PCR扩增筛选有目的条带的阳性克隆；(2)将对应的菌液送至北京三博远志生物技术有限责任公司测序，最终获得正确的pCAMBIAsuper1300-GFP-ZmNC2(图谱如图5A所示)；(3)将 pCAMBIAsuper1300-GFP-ZmNC2转入农杆菌GV3101，挑单克隆接种到3 ml YEB液体培养基(含抗生素)在200rpm，28℃摇床培养过夜；(4)将上述过夜培养菌液在常温，4000rpm下离心2min，收集菌体；(5)用渗透培养液 (10mmol MgCl₂)重新悬浮沉淀的农杆菌细胞，调节浓度OD600至0.5～1.0； (6)用1mL的无针头的注射器吸取悬浮有农杆菌的渗透培养液从烟叶背面注入叶片内；(7)注射过的烟草继续生长2-3天；(8)使用激光共聚焦显微镜观察叶背面荧光表达情况。结果如图5B所示，ZmNC2-GFP定位在质膜上。

与此同时，通过缺陷酵母表型互补实验系统确定ZmNC2具有内向转运Na⁺的活性。具体实验流程为：(1)用XbaI和HindIII对含有XbaI和HindIII酶切位点的ZmNC2回收片段和p416GPD载体进行双酶切，酶切片段通过T4连接酶连接，转入大肠杆菌，通过菌落PCR扩增筛选有目的条带的阳性克隆；(2) 将对应的菌液送至北京三博远志生物技术有限责任公司测序，最终获得正确的 p416GPD-ZmNC2(图谱如图6所示)；(3)p416GPD-ZmNC2质粒分别转入钠外排缺陷型酵母ant5和钾吸收缺陷型酵母trk1trk2；(4)挑取单克隆分别稀释成不同浓度梯度；(5)分别点在不同浓度Na⁺和K⁺的AP培养基上；(6)30℃培养三天后观察不同条件下酵母表型。如图5D所示，转入p416GPD-ZmNC2的钠外排缺陷型酵母ant5随着培养基中Na⁺浓度的改变，生长受到明显抑制，与对照相比对盐更为敏感；如图5E所示，转入p416GPD-ZmNC2的钾吸收缺陷型酵母trk1trk2在低钾条件下并不能回补表型至野生型。表明抗盐基因ZmNC2 编码一个内向Na⁺转运蛋白，而几乎不具有内向K⁺吸收能力。它可能通过调控盐胁迫下植物对Na⁺的吸收来调控植物抗盐。

实施例2玉米抗盐QTL基因ZmNC2内含子中插入的大片段(ZmNC2-InDel) 的获得

通过Illumina测序平台对黄C和X178的基因组DNA进行测序(测序在北京诺禾致源科技股份有限公司完成)，比对黄C和X178的全基因组测序数据，发现在盐敏感自交系X178中，ZmNC2基因的第一个内含子有一个大片段插入，命名为ZmNC2-InDel，如图6所示。根据全基因组测序数据，发明人设计了两对引物ZmNC2-F1/ZmNC2-InDel-R2和ZmNC2-InDel-F2/ZmNC2-R1(引物在基因上的具体位置如图6所示)。引物序列为：

ZmNC2-F1：GAATCTTGGCCACGAACTTG；

ZmNC2-InDel-R2：TAACTGGCATGGACGACTGA；

ZmNC2-InDel-F2：TCCCTTTCAGTCCTTGATCG；

ZmNC2-R1：CCTTCCCCATCTCTGAGCTC。

以ZmNC2-F1/ZmNC2-InDel-R2和ZmNC2-InDel-F2/ZmNC2-R1为引物，以X178的基因组DNA为模板，使用PCR扩增50μl体系，包括2×Super Multiplex PCR Mix 25μl,10μMPrimer ZmNC2-F1/ZmNC2-InDel-F2 2.5μl,10 μM Primer ZmNC2-R1/ZmNC2-InDel-R2 2.5μl,DNA2.0μl,ddH2O 18μl；PCR 程序：预变性95℃2min,变性95℃30s,退火58℃30s,延伸72℃3min30s, 由变性到延伸进行34个循环，最后延伸72℃3min30s)，将PCR产物送到北京三博远志生物技术有限责任公司测序，获得测序结果后，通过CodonCode Aligner软件拼接，获得了ZmNC2-InDel插入序列的长度为12586bp，该插入导致X178中ZmNC2的转录水平下降，如图1B所示，ZmNC2-InDel插入的具体序列如SEQ ID No.3所示。

实施例3玉米抗盐基因ZmNC2中的ZmNC2-InDel插入或缺失作为分子标记

因为ZmNC2-InDel插入仅存在于盐敏感玉米自交系X178中，它导致抗盐基因ZmNC2的转录水平显著下降，进而影响其盐敏感性，因此ZmNC2-InDel插入可以用于判断个体是否抗盐的分子标记。

利用基于ZmNC2-InDel插入的侧翼序列设计的引物ZmNC2-F1(正向)和 ZmNC2-R1(反向),以及基于ZmNC2-InDel插入序列设计的引物 ZmNC2-InDel-F1(正向)，以上述三条引物组成引物对Ⅰ(ZmNC2-F1/ZmNC2-R1) 和引物对Ⅱ(ZmNC2-InDel-F1/ZmNC2-R1)。以引物对Ⅰ和Ⅱ为引物，分别以抗盐玉米自交系黄C和盐敏感玉米自交系X178的基因组DNA为模板，进行PCR 扩增。PCR体系20μl：2×Super Multiplex PCR Mix 10μl,10μM PrimerZmNC2-F1 1μl,10μM Primer ZmNC2-R1/ZmNC2-InDel-R1 1μl,DNA 1μl,ddH2O 7μl。 PCR程序：预变性95℃2min,变性95℃30s,退火58℃30s,延伸72℃1min, 由变性到延伸进行34个循环，最后延伸72℃5min。结果发现以玉米抗盐自交系黄C总DNA为模板进行PCR扩增，引物对Ⅰ可获得318bp的条带(详细序列见SEQ ID No.4)，引物对Ⅱ没有条带；以玉米盐敏感自交系X178总DNA为模板进行PCR 扩增，引物对Ⅰ没有条带，引物对Ⅱ可获得1206bp的条带(详细序列见SEQ ID No. 5)，如图7所示。因此，以引物对Ⅰ和Ⅱ可以用于玉米抗盐分子辅助育种，把基于引物对Ⅰ和Ⅱ的抗盐分子标记命名为ZmSALT2。其中各引物的序列为：

引物ZmNC2-F1：GAATCTTGGCCACGAACTTG；

引物ZmNC2-InDel-F1：CTAGTAGCTGGCTCCCTTCC；

引物ZmNC2-R1：CCTTCCCCATCTCTGAGCTC。

实施例4利用抗盐分子标记检测玉米是否抗盐

选取了24种玉米自交系材料(包括一些玉米骨干自交系)进行检测，检测方法如实施例3所述，利用实施例3中的检测本发明抗盐分子标记的引物对，以所述待测玉米基因组DNA为模板进行PCR扩增。其结果表明：其中243 份自交系引物对Ⅰ有PCR产物，产物长度为318bp，引物Ⅱ对无PCR产物，为抗盐基因型，另外51份自交系引物对Ⅰ无PCR产物，引物Ⅱ对有PCR产物，产物长度为1206bp，为盐敏感基因型基因型。所用自交系名称和鉴定结果如下表所示：

“√”表示PCR产物有条带；“×”表示PCR产物无条带。

在盐胁迫条件下，盐敏感基因型材料(有ZmNC2-InDel插入)叶片中的 Na⁺含量显著高于抗盐基因型材料(无ZmNC2-InDel插入)，相关检测结果如图8所示，与抗盐分子标记ZmSALT2的鉴定结果一致。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种玉米抗盐QTL及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2109

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 1

atggctgctg cctccatgga cgtggaagcc ggacagggga gaaacgataa gaagcgaatt 60

tacaaagatc tactccttgc ctacaagact ctgggcgtcg tattcggtgg tcttgtcacc 120

tcccctctct acgtctaccc ttccatgaac ctgacaaacc cgaccgaaga ggactatctg 180

ggaatctaca gcatcatgtt ctggaccctg acactgatcg gcgtcgtcaa gtacatctgc 240

atcgccctca acgccgacga ccacggcgaa ggtggcacat ttgccatgta ctccctgttg 300

tgccagcacg ccaacatcgg catcctcccg tccaagaaga tatacaccga ggaggagcag 360

ggcctggtcc cggctcggcc cgtcgcggcc cggaggccca gcaaggtgag gaggttcatc 420

gagcggagca ttacggcgag aaggttgctg cagctcacgg cgatcctggg catgtgcatg 480

ctcattggag acggcatcct cacgccggcc atctcaatcc tgtcagctgt tgatggacta 540

agagggcctt tcccgtcggt cagcaaaccg actgttgagg ctctgtccgc agggattctg 600

atcggtctgt tcctgctgca aaagtacggc acgtccaagg tgagcttcat gttctcgccg 660

atcatggcgg cgtggacgtt caccaccccg atcatcggca tctacagcat ctggcgctac 720

taccctggca tcttcaagag cgtgtcgccg tactacgtgg tacacttctt cgtgaccaac 780

cggaagaggg gctggcagct gctcggcggc accgtcctgt gcatcacggg cgccgaggcc 840

atgttcgccg acctcgggca cttcaacaag cggtccatcc agatcgcgtt cctctctagc 900

atctacccgt cgctggtgct cacgtacgcc ggccagacgg cctacctgat caaccacgtg 960

ggcgacttcg gcgacgggtt ctacaagttc gtgccgcgcc ccgtgtactg gccaatgttc 1020

gtcatcgcga cgctggcggc gatcgtggcg agccagtcgc tcatctccgc caccttctcc 1080

gtggtcaagc agtcggtggc gctggactac ttcccgcgcg tccgggtggt gcacacctcc 1140

aaggacaagg agggggaggt gtactccccg gagaccaact acctgctgat gctgctgtgc 1200

gtgggcgcca tcatcggctt cggcgacgga aaggacatcg gcaacgcgtt cggcgtggtg 1260

gtcatcctcg tcatgctcat cactaccatc ctgctctccc tggtgatgct catcgtctgg 1320

ggcacgcacg tggtgctggt ggcgctctac ctcgtgccct tcctcatcct ggagggcact 1380

tacgtgagcg cggtgtgcac caagatcatg aagggcggct ggttgccctt cgccatctcg 1440

ctcgttctgg cgctcgtcat gttcagctgg tactacggcc ggcagcgcaa ggcagagtac 1500

gagatggcca acaaggtgac cctggagcgg ctgagcgagc tgctggccgc gcccgacgtg 1560

cgccgcgccc cggggctctg cctcttctac agcaacatgc aggagtggcg gtggctcacc 1620

ccggtgctgg cgcactacat caagaacatg cggtcgctgc acggggttac catcttcgtc 1680

actctccggt accaactggt ggccaaggtg gacgccgaga gccgcatggc ggtccggcga 1740

ttcggtcccc gcggggtgta cggctgcacg atccagtacg ggtacgctgg cccactgtac 1800

gaggaggagg aggaggacct cgccgggcag gtggtgcggg cggtgcgcca gcatatcgag 1860

cgggaggcgg cggcgtcctc cacggcggag gtcgaggagg aggcggcgga gctggaggag 1920

gcgcgcgcgg ccggggtggt gcacgtcatg ggcaagacga ggttccacgt gggcaggaac 1980

acgggcctct tcgaccgcgt gctgctcggc ttctatgagt tcctgcatac cacctgccgc 2040

tccgcgctgc cggcgcttgg gatcccgctg cagcagcgcg tcgagatcgg catgctctac 2100

aaggcctga 2109

<210> 2

<211> 702

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 2

Met Ala Ala Ala Ser Met Asp Val Glu Ala Gly Gln Gly Arg Asn Asp

1 5 10 15

Lys Lys Arg Ile Tyr Lys Asp Leu Leu Leu Ala Tyr Lys Thr Leu Gly

20 25 30

Val Val Phe Gly Gly Leu Val Thr Ser Pro Leu Tyr Val Tyr Pro Ser

35 40 45

Met Asn Leu Thr Asn Pro Thr Glu Glu Asp Tyr Leu Gly Ile Tyr Ser

50 55 60

Ile Met Phe Trp Thr Leu Thr Leu Ile Gly Val Val Lys Tyr Ile Cys

65 70 75 80

Ile Ala Leu Asn Ala Asp Asp His Gly Glu Gly Gly Thr Phe Ala Met

85 90 95

Tyr Ser Leu Leu Cys Gln His Ala Asn Ile Gly Ile Leu Pro Ser Lys

100 105 110

Lys Ile Tyr Thr Glu Glu Glu Gln Gly Leu Val Pro Ala Arg Pro Val

115 120 125

Ala Ala Arg Arg Pro Ser Lys Val Arg Arg Phe Ile Glu Arg Ser Ile

130 135 140

Thr Ala Arg Arg Leu Leu Gln Leu Thr Ala Ile Leu Gly Met Cys Met

145 150 155 160

Leu Ile Gly Asp Gly Ile Leu Thr Pro Ala Ile Ser Ile Leu Ser Ala

165 170 175

Val Asp Gly Leu Arg Gly Pro Phe Pro Ser Val Ser Lys Pro Thr Val

180 185 190

Glu Ala Leu Ser Ala Gly Ile Leu Ile Gly Leu Phe Leu Leu Gln Lys

195 200 205

Tyr Gly Thr Ser Lys Val Ser Phe Met Phe Ser Pro Ile Met Ala Ala

210 215 220

Trp Thr Phe Thr Thr Pro Ile Ile Gly Ile Tyr Ser Ile Trp Arg Tyr

225 230 235 240

Tyr Pro Gly Ile Phe Lys Ser Val Ser Pro Tyr Tyr Val Val His Phe

245 250 255

Phe Val Thr Asn Arg Lys Arg Gly Trp Gln Leu Leu Gly Gly Thr Val

260 265 270

Leu Cys Ile Thr Gly Ala Glu Ala Met Phe Ala Asp Leu Gly His Phe

275 280 285

Asn Lys Arg Ser Ile Gln Ile Ala Phe Leu Ser Ser Ile Tyr Pro Ser

290 295 300

Leu Val Leu Thr Tyr Ala Gly Gln Thr Ala Tyr Leu Ile Asn His Val

305 310 315 320

Gly Asp Phe Gly Asp Gly Phe Tyr Lys Phe Val Pro Arg Pro Val Tyr

325 330 335

Trp Pro Met Phe Val Ile Ala Thr Leu Ala Ala Ile Val Ala Ser Gln

340 345 350

Ser Leu Ile Ser Ala Thr Phe Ser Val Val Lys Gln Ser Val Ala Leu

355 360 365

Asp Tyr Phe Pro Arg Val Arg Val Val His Thr Ser Lys Asp Lys Glu

370 375 380

Gly Glu Val Tyr Ser Pro Glu Thr Asn Tyr Leu Leu Met Leu Leu Cys

385 390 395 400

Val Gly Ala Ile Ile Gly Phe Gly Asp Gly Lys Asp Ile Gly Asn Ala

405 410 415

Phe Gly Val Val Val Ile Leu Val Met Leu Ile Thr Thr Ile Leu Leu

420 425 430

Ser Leu Val Met Leu Ile Val Trp Gly Thr His Val Val Leu Val Ala

435 440 445

Leu Tyr Leu Val Pro Phe Leu Ile Leu Glu Gly Thr Tyr Val Ser Ala

450 455 460

Val Cys Thr Lys Ile Met Lys Gly Gly Trp Leu Pro Phe Ala Ile Ser

465 470 475 480

Leu Val Leu Ala Leu Val Met Phe Ser Trp Tyr Tyr Gly Arg Gln Arg

485 490 495

Lys Ala Glu Tyr Glu Met Ala Asn Lys Val Thr Leu Glu Arg Leu Ser

500 505 510

Glu Leu Leu Ala Ala Pro Asp Val Arg Arg Ala Pro Gly Leu Cys Leu

515 520 525

Phe Tyr Ser Asn Met Gln Glu Trp Arg Trp Leu Thr Pro Val Leu Ala

530 535 540

His Tyr Ile Lys Asn Met Arg Ser Leu His Gly Val Thr Ile Phe Val

545 550 555 560

Thr Leu Arg Tyr Gln Leu Val Ala Lys Val Asp Ala Glu Ser Arg Met

565 570 575

Ala Val Arg Arg Phe Gly Pro Arg Gly Val Tyr Gly Cys Thr Ile Gln

580 585 590

Tyr Gly Tyr Ala Gly Pro Leu Tyr Glu Glu Glu Glu Glu Asp Leu Ala

595 600 605

Gly Gln Val Val Arg Ala Val Arg Gln His Ile Glu Arg Glu Ala Ala

610 615 620

Ala Ser Ser Thr Ala Glu Val Glu Glu Glu Ala Ala Glu Leu Glu Glu

625 630 635 640

Ala Arg Ala Ala Gly Val Val His Val Met Gly Lys Thr Arg Phe His

645 650 655

Val Gly Arg Asn Thr Gly Leu Phe Asp Arg Val Leu Leu Gly Phe Tyr

660 665 670

Glu Phe Leu His Thr Thr Cys Arg Ser Ala Leu Pro Ala Leu Gly Ile

675 680 685

Pro Leu Gln Gln Arg Val Glu Ile Gly Met Leu Tyr Lys Ala

690 695 700

<210> 3

<211> 12586

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 3

actacaccat gacacaatat tgccaacgga ttgtctgatg gtaaaacacc taaatagcga 60

cgcacagtct gtcggtaaag agctttgccg acagataatg tgtgtcggca aaagtcctgt 120

cggcaataac ctttaccggc agacatagat ctaccaacag actatgtgtc ggcaatgttt 180

atgttattgc cgacagacat atctttgccg tcggacaaat ttttgccgac atattcttgt 240

gccaacggct tgtgtgtcgc taaaaatcta tataccgaca gattgtctga tgttattccc 300

tatgtgcagt ttaaaaaaaa tcatgtatac aaatatatgc taatgaaaca aataataaac 360

tgattatgat gcacattgca ggacaacttg aataatatgt agctcagaat atatgaaatt 420

tgattactaa aagaaagaga tcaatctttg actttgaatt ccaacatata ttgttttgga 480

acacaatttg tgtgatgaac atataaaaat aatagcatac atgttttcta aattctgaag 540

tgatctttca gttctattac atgcaaagtc taaagattca tctagcaaac taaaatctct 600

ccatcagctg ggtgttacgc caacggctag catgcatgcg agtaatcatt tttcacacac 660

ttcaagcact ctgatccttg cttccagcac ctcttcccta caacatattt tgataatttg 720

tcaattacta tatcaatagg tctataaact cccaacagaa aaaaaaacaa actgaaagtt 780

taataaaagt attaaattgc aaaaagttcg gtgatactgt agatgaaagt aaaccacaaa 840

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tgacgacggt gaactttgtt aagtttcttc aatattctgt gcaccaaaca gataatttcg 960

tattgtgtaa taaagtcagg tggatgtttc ccttcatttt gttttatatc taactactgt 1020

tatcattctt tgagataaga actaagtcta tattgttata gtgctgatta tgattatgac 1080

aggaaaatgg aagtcatgac aacagtaaac cagagatata cattaaaggc aacagttcaa 1140

atccattata aataatgaaa ttggcactgt catgaatgaa attggcaaca attcaaatct 1200

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gatgggtcaa aagatcaccg aataagttct gaagaggaca aaacagagac atgaatttgg 1320

acattaaaaa ttaagacaaa atagagacag catgcagaaa atatatgaag aaaatagttt 1380

gtgtctggtg ccatttcctc tacttatatg gaattactgt cagttaacaa taacatatat 1440

cttatcatct tttcactttt aatcaagcat atatctgatc tgtacagaag tatagcaatg 1500

ggacattggt tagtaagtag taactgtact tgcaagactg gaattaaaaa aactgggcca 1560

aattaaaaaa acagccgtct gtttgcgcct gcagttggat gacccgaacg aagatgcaga 1620

gatgatctat actatagcct gtgagcctca tttcttcccc agttccttta gaatacagca 1680

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agcttgttcc attaattaca taaataaaat acaaggttgt agtattacct tgtttgttgg 4200

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ctgcgagctt gcaatgccat ttgaagcttt gttgatattt tcatttgagt tccaggggtg 5040

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tactattttt ccctggtgat ggtagttcag ctcaagaatg tcttttataa caccataata 7680

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tttgtggtct aatgtgacac tatgcttacc aaccaatcct cgacctatgt tatggaagaa 8280

aggggtggta ttgattaaat caacatccaa gccatcgtca tttctttttt tccggttaaa 8340

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cattcaatac atgctacttc acctgatgta ctacatgctg caatgtaccc taggcctgga 9540

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tagtcgatga cgaacaacga cggcgcgcga tgattagcct gctccttggc gcgcggcggc 12180

ggatcgacag aggccacagg gccggggcgc aggacgacga cctcgatcac ttggtggcgg 12240

cggagtctag ggtaggctgg agcacgaaga tatttggatt tgcgtacggg tacccggtcg 12300

gccggctgat cgactgttgg tcttttttta attaagtccg aactcaattg ccgacaaatg 12360

atccgatgca atttgtttcc gacagacgtt gtgtcacgat taatcattta taccgacaaa 12420

tagtctatca caatagctcg acatttttgc cgacagtttg tttgacacca aaatactaag 12480

taccgacaga tactgtgatg gtaatatgtt gtgacagact agctgtcgcc aaaagcctat 12540

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<210> 4

<211> 318

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

gaatcttggc cacgaacttg ccccaggcca cttcctcacc cagatgaagg ccaccactcg 60

tgcatcgccg cctcccacca aggcggcggc cgctaccgcc tatgcttctt ccgcgtgctc 120

ggcggtggcg acgtcattat cgtcgccttg gtggaggaca agggcaagga agatagcaag 180

tcggagcagc tgcaatcgtc ggtggtggca acatcgtcgt ccatgccaag gagaatggcg 240

tcgagctact tgtagtagag gaagtggacg aactcttcgt gaactgggat ggctggaaga 300

gctcagagat ggggaagg 318

<210> 5

<211> 1206

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ctagtagctg gctcccttcc taaacgtgag taatgtaatc atgattttac ctacagattg 60

gtagggtaat cttaatctgg ccttttgttt ggtcacgcct atgctatttt gtgtgccttc 120

attgaaatag caataagaaa tagtgtgacg accagatcgg agtggttgga cggctgcaac 180

agtaacctta agactcaata ctcaatccag taactacaaa aaaatggagc acgctttgtt 240

cacgaatcaa agacagccgt agattcgtgg attcttacca gatttatttt tttcgcacag 300

acaaagactg gtgacacctc gtgttccgtg tggatggagt tggggacgaa cattggcgct 360

tgggggaaga cggggctgta gtcgatgacg aacaacgacg gcgcgcgatg attagcctgc 420

tccttggcgc gcggcggcgg atcgacagag gccacagggc cggggcgcag gacgacgacc 480

tcgatcactt ggtggccgct tgggggaaga cggggctgta gtcgatgacg aacaacgacg 540

gcgcgcgatg attagcctgc tccttggcgc gcggcggcgg atcgacagag gccacagggc 600

cggggcgcag gacgacgacc tcgatcactt ggtggcggcg gagtctaggg taggctggag 660

cacgaagata tttggatttg cgtacgggta cccggtcggc cggctgatcg actgttggtc 720

tttttttaat taagtccgaa ctcaattgcc gacaaatgat ccgatgcaat ttgtttccga 780

cagacgttgt gtcacgatta atcatttata ccgacaaata gtctatcaca atagctcgac 840

atttttgccg acagtttgtt tgacaccaaa atactaagta ccgacagata ctgtgatggt 900

aatatgttgt gacagactag ctgtcgccaa aagcctattt ttaccgacag atgtttgccg 960

ctaattttgt gacatggtat agtgcgccta tgcttcttcc gcgtgctcgg cggtggcgac 1020

gtcattatcg tcgccttggt ggaggacaag ggcaaggaag atagcaagtc ggagcagctg 1080

caatcgtcgg tggtggcaac atcgtcgtcc atgccaagga gaatggcgtc gagctacttg 1140

tagtagagga agtggacgaa ctcttcgtga actgggatgg ctggaagagc tcagagatgg 1200

ggaagg 1206

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

gaatcttggc cacgaacttg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

ctagtagctg gctcccttcc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

ccttccccat ctctgagctc 20

Claims

1.一种玉米抗盐QTL基因，其特征在于，其编码核苷酸序列选自：

(a)SEQ ID No.1所示的序列；

2.权利要求1所述玉米抗盐QTL基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如序列表中SEQ IDNo.2所示。

3.一种玉米抗盐主效QTL，其特征在于，该主效QTL基因位于4号染色体上55074-55085kb的位置。

4.一种玉米抗盐相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记表现为SEQ ID No.3所示核苷酸序列在权利要求1所述抗盐QTL基因中插入或缺失。

5.根据权利要求4所述的分子标记，其特征在于，在权利要求1所述抗盐QTL基因中插入SEQ ID No.3所示核苷酸序列的个体为盐敏感型；权利要求1所述抗盐QTL基因缺失SEQ IDNo.3所示核苷酸序列的个体为抗盐型。

6.用于检测权利要求4-5任一项所述分子标记的引物对，其特征在于，包括：引物对Ⅰ和引物对Ⅱ，所述引物对Ⅰ为引物ZmNC2-F1和引物ZmNC2-R1，所述引物对Ⅱ为引物ZmNC2-InDel-F1和引物ZmNC2-R1；

所述引物ZmNC2-F1、ZmNC2-InDel-F1和ZmNC2-R1序列如下：

引物ZmNC2-F1：GAATCTTGGCCACGAACTTG；

引物ZmNC2-InDel-F：CTAGTAGCTGGCTCCCTTCC；

引物ZmNC2-R1：CCTTCCCCATCTCTGAGCTC。

7.一种用于检测权利要求4-5任一项所述分子标记的试剂盒，其特征在于，包括权利要求6所述的引物对。

8.一种检测玉米是否抗盐的方法，其特征在于，包括：

对待测玉米进行权利要求4-5所述的分子标记的检测，根据检测结果判断其是否抗盐。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

利用权利要求6所述的引物对，或者权利要求7所述的试剂盒，以所述待测玉米基因组DNA为模板进行PCR扩增；

根据扩增结果判断是否抗盐：如果用引物对Ⅰ扩增后得到318bp的片段，用引物对Ⅱ扩增后没有片段，则为抗盐型；如果用引物对Ⅰ扩增后没有片段，用引物对Ⅱ扩增后得到1206bp的片段，则为盐敏感型。

10.权利要求1所述抗盐QTL基因、权利要求2所述蛋白质、权利要求3所述主效QTL、权利要求4-5任一项所述的分子标记、权利要6所述的引物对在玉米抗盐育种中的应用。