CN111172299B - Rna代谢标记探针、包含其的试剂盒及其应用 - Google Patents

Rna代谢标记探针、包含其的试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种RNA代谢标记探针、包含其的试剂盒及其应用。该RNA代谢标记探针为鸟嘌呤核苷酸类似物，鸟嘌呤核苷酸类似物是在鸟嘌呤核苷酸的核糖的第2位C上的‑OH被‑N3取代。本申请通过将原来在碱基上进行修饰的方式，转化为在核糖上进行修饰，并采用鸟嘌呤核苷酸进行代谢标记，在鸟嘌呤核苷酸的核糖的第2位的碳上以叠氮基团取代羟基。该探针不仅能够实现原核RNA的代谢标记及在显微成像、新生RNA的提取测序等诸多方面的应用，而且能够实现对真核RNA的代谢标记，因而也能进一步应用于对真核RNA代谢的相关研究中。

Description

RNA代谢标记探针、包含其的试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物标记领域，具体而言，涉及一种RNA代谢标记探针、包含其的试剂盒及其应用。
背景技术
中心法则是生命活动的黄金规则：遗传物质由DNA携带，通过转录传递到RNA，再通过翻译由RNA传递到蛋白质，维持生命活动的稳态。RNA作为连接DNA与蛋白质的信息传递物质，起重要的协调功能。RNA主要包括mRNA、tRNA、rRNA、长非编码RNA(longnon-codingRNA)、microRNA等。
目前，真核细胞中已经有成熟的探针实现对RNA的代谢标记，比如4SU、2008年报道的EU以及2012年发展的2’-Az-A等。这一系列探针成功实现了真核细胞中RNA的代谢标记、成像以及新生成RNA的测序与研究。2008年报道的EU可以一定程度上标记原核的RNA，仅在成像上可以检测到，并且对原核有较大的毒性。
然而，到目前为止，尚未有合适的探针能够实现对原核细胞中的RNA代谢进行标记。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种RNA代谢标记探针、包含其的试剂盒及其应用，以解决现有技术中尚未有合适的探针能够实现对原核细胞中的RNA代谢进行标记的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种RNA代谢标记探针，RNA代谢标记探针为鸟嘌呤核苷酸类似物，鸟嘌呤核苷酸类似物是在鸟嘌呤核苷酸的核糖的第2位C上的-OH被-N3取代。
根据本发明的第二个方面，提供了一种RNA代谢标记试剂盒，该试剂盒包括上述RNA代谢标记探针。
根据本发明的第二个方面，提供了上述RNA代谢标记探针或者上述试剂盒在对RNA进行代谢标记中的应用。
进一步地，RNA为原核RNA或真核RNA。
进一步地，原核RNA包括来源于如下任一种细胞的RNA：肺炎克雷伯菌(KlebsiellaPneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鲍曼不动杆菌(AcinetobacterBaumannil)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtills)、红球菌(Rhodococcus)、沙门氏菌(Salmonella)、大肠杆菌(E.coli)。
进一步地，真核RNA包括来源于如下任一种细胞的RNA：人纤维肉瘤细胞HT1080及小鼠神经瘤母细胞N2a。
进一步地，应用包括如下任意一项或多项：通过In-Gel成像的方式检测RNA代谢；通过荧光成像的方式对RNA进行荧光标记；通过RNA-Seq的方式对新生RNA转录本进行检测；通过荧光定量PCR的方式检测RNA的表达及变化；通过IP后的northern blot对RNA进行检测；通过点击反应及冷冻电镜对RNA的结构进行观察。
应用本发明的技术方案，本申请通过将原来在碱基上进行修饰的方式，转化为在核糖上进行修饰，并采用鸟嘌呤核苷酸进行代谢标记，在鸟嘌呤核苷酸的核糖的第2位的碳上以叠氮基团取代羟基。该探针不仅能够实现原核RNA的代谢标记及在显微成像、新生RNA的提取测序等诸多方面的应用，而且能够实现对真核RNA的代谢标记，因而也能进一步应用于对真核RNA代谢的相关研究中。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出的是本发明的实施例1中三种改进探针2’-Az-U、2’-Az-C和2’-Az-G对肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)RNA代谢标记结果；
图2示出的是本发明的实施例1中三种改进探针2’-Az-U、2’-Az-C和2’-Az-G对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)RNA代谢标记结果；
图3示出的是本发明的实施例1中三种改进探针2’-Az-U、2’-Az-C和2’-Az-G对鲍曼不动杆菌(Acinetobacter Baumannil)RNA代谢标记结果；
图4示出的是本发明的实施例1中三种改进探针2’-Az-U、2’-Az-C和2’-Az-G对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtills)RNA代谢标记结果；
图5示出的是本发明的实施例1中三种改进探针2’-Az-U、2’-Az-C和2’-Az-G对红球菌(Rhodococcus)RNA代谢标记结果；
图6示出的是本发明的实施例1中三种改进探针2’-Az-U、2’-Az-C和2’-Az-G对沙门氏菌(Salmonella)RNA代谢标记结果。
图7示出的是本发明的实施例2中三种改进探针2’-Az-U、2’-Az-C和2’-Az-G对人纤维肉瘤细胞HT1080的RNA代谢标记结果；
图8示出的是本发明的实施例2中三种改进探针2’-Az-U、2’-Az-C和2’-Az-G对小鼠神经瘤母细胞N2a的RNA代谢标记结果；
图9示出了根据本发明的实施例3中本申请的2’-Az-G探针对RNA和DNA进行代谢标记的检测结果图；
图10示出了根据本发明的实施例4中本申请的探针2’-Az-G与两种不同的配体正交反应后对RNA进行代谢标记的检测结果图；
图11示出了根据本发明的实施例5中利用本申请的探针2’-Az-G能够利用荧光成像的方式检测RNA代谢的结果图；
图12示出了根据本发明的实施例6中利用本申请的探针2’-Az-G能够利用共聚焦显微镜观察对RNA代谢的结果图；
图13示出了本发明的实施例7中本申请的探针2’-Az-G对大肠杆菌毒性的检测结果图；以及
图14出了本发明的实施例8中本申请的探针2’-Az-G对大肠杆菌新生RNA表达状态的影响。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
生物正交反应：指那些能够在活体细胞或组织中，能够在不干扰生物自身生化反应条件下，可以进行的化学反应。用于研究核酸、蛋白质或脂质等生物大分子。
如背景技术所提到的，现有的RNA标记探针均不能很好的实现原核RNA的代谢标记。本申请的发明人对现有的RNA标记探针进行实验，发现由于4SU在大肠杆菌特定tRNA位置天然存在，并且对大肠杆菌的生长存在一定的影响，导致不适合用于原核标记。而EU对大肠杆菌也具有明显的毒性，且标记强度并不强。因此到目前为止，原核中的RNA尚未有合适的探针实现代谢标记。
为了改进这一现状，发明人对现有的RNA代谢标记探针进行了改进，并发现通过改进探针的修饰位点，将原来在碱基上进行修饰的方式转化为在核糖上进行修饰，并且尝试了在A、T、C和G四种不同核糖核苷酸的核糖上进行修饰的探针对原核RNA代谢的标记效果，通过实验证明，新开发的在G核糖核苷酸的核糖上进行修饰的探针不仅能很好地实现对原核RNA的代谢标记，而且实现多种原核中RNA的标记，并可以成功实现原核RNA的荧光成型。借助改进的探针，能够实现对原核中新生成RNA的提取与研究从而可用于探究在某些外界刺激或者复杂体系中，微生物做出响应的RNA，或者某些特定微生物中的RNA动态变化情况。
具体地，本申请通过In-gel成像的方式，证明探针确实在原核的RNA上进行了代谢。通过荧光成像的方式实现了对原核RNA的荧光标记。通过RNA-seq的手段证明本申请改进的探针确实能够实现对原核新生RNA转录本的提取与研究。
在上述研究结果的基础上，申请人提出了本申请的技术方案。在一种典型的实施方式中，提供了一种RNA代谢标记探针，该探针为鸟嘌呤核苷酸类似物，该鸟嘌呤核苷酸类似物的结构式如下式I所示，是在鸟嘌呤核苷酸的核糖第2位的碳上的羟基替换为叠氮基团(简称2’-Az-G)。
Figure BDA0001864403780000041
本申请通过采用鸟嘌呤核苷酸的类似物进行代谢标记，在鸟嘌呤核苷酸的核糖的第2位的碳上以叠氮基团取代羟基，而此处的叠氮基团同时还可以作为进行生物正交反应的反应基团。
本申请通过借助生物正交反应以及in-gel荧光成像证明，该探针确实可以进入原核RNA的代谢过程中。本申请的RNA代谢标记探针使用叠氮基团作为生物正交反应的基团，叠氮基团可以与八圆环炔类似物(DBCO)进行反应，从而避免如了之前EU的标记过程中，炔基只能借助铜离子催化的click反应而导致的RNA降解，从而最大程度保证了RNA的完整性(具体见实施例部分)。
EU的反应过程即EU作为一个包含有炔基的核酸类似物，其炔基可以与叠氮基团发生生物正交反应，但是这一反应必须在一价铜离子的催化下才能进行，但是铜离子的存在会导致RNA的降解，而我们的叠氮基团，除了与炔基在铜离子的催化下进行反应外，还可以与八圆环炔类似物(DBCO)进行反应，反应过程不需要金属离子的参与，从而保证了RNA的完整性。
由于DNA与RNA仅在核糖环2号位上有不同(DNA无羟基，RNA有羟基)，为进一步验证本申请所提供的探针是否会非特异地标记DNA，本申请通过实验验证，只有RNA能被标记而DNA不能被探针标记，因而证明本申请所的探针是特异性地针对RNA的(具体实验见实施例部分)。
此外，发明人还检测了该探针对细菌生长的影响，发现与现有的RNA代谢标记探针相比，本申请的RNA代谢标记探针对细菌的影响相对较低，因而，在应用上具有明显的低毒优势。尤其是当其浓度低于200μM时，细菌的存活率高于80％。而且，进一步，利用含本申请的探针标培养基和不含该探针的培养基，在相同状态下进行培养后提取RNA进行转录本的检测，发现两者的相似性更高，表明本申请的探针对原核的转录本无明显影响，因而可以用来进行原核的新生成RNA研究与测序。
因而，在本申请第二种典型的实施方式中，还提供了一种RNA代谢标记试剂或试剂盒，该试剂或试剂盒包括本申请所提供的RNA代谢标记探针。
在第三种典型的实施方式中，提供了RNA代谢标记探针在对RNA进行代谢标记中的应用。该应用包括但不限于通过In-Gel成像的方式检测RNA代谢、通过荧光成像的方式对RNA进行荧光标记、通过RNA-Seq的方式对新生RNA转录本进行检测与研究、通过荧光定量PCR的方式检测RNA的表达及变化、通过IP(免疫共沉淀)后的northern blot对RNA进行检测、通过点击反应结合冷冻电镜对RNA的结构进行探究。
发明人除了验证本申请的探针在对原核RNA代谢进行标记方面的性能外，还检测其对真核RNA代谢进行标记的性能，发现其同样适用于对真核RNA进行代谢标记。在本申请中，优选的原核RNA包括但不仅限于如下任一种细胞的RNA：肺炎克雷伯菌(KlebsiellaPneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鲍曼不动杆菌(AcinetobacterBaumannil)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtills)、红球菌(Rhodococcus)、沙门氏菌(Salmonella)及大肠杆菌(E.coli)。本申请中，优选的真核RNA包括但仅限于这些菌株真核RNA包括但不限于来源于如下任一种细胞的RNA：人纤维肉瘤细胞HT1080及小鼠神经瘤母细胞N2a。
下面结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。
实施例1：
本申请将叠氮修饰在核糖上的探针改进了三种，分别为探针2’-Az-U、2’-Az-C和2’-Az-G。为检测三种改进探针原核RNA代谢标记的效果，该实施例采用不同来源的原核RNA来对上述探针的性能进行检测。具体检测方法为：
取过夜培养的肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter Baumannil)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtills)、红球菌(Rhodococcus)、沙门氏菌(Salmonella)，按照1:200的比例转接到新的培养基中，养至OD600为0.3。每种菌分别分成四组，每组向培养基中加入终浓度为100μM的上述四种探针中的一种，并在37℃继续培养2小时。然后分别提取每种菌各组的RNA进行检测，检测结果分别见图1至图6。
图1至图6中，图1示出的是三种改进探针对肺炎克雷伯菌(KlebsiellaPneumoniae)RNA代谢标记结果；图2示出的是三种改进探针对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)RNA代谢标记结果；图3示出的是三种改进探针对鲍曼不动杆菌(Acinetobacter Baumannil)RNA代谢标记结果；图4示出的是三种改进探针对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtills)RNA代谢标记结果；图5示出的是三种改进探针对红球菌(Rhodococcus)RNA代谢标记结果；图6示出的是三种改进探针对沙门氏菌(Salmonella)RNA代谢标记结果。从图1至图6中可以看出，上述原核菌种均能在含2’-Az-G的培养基中生长后被标记上。可见，将修饰改进到核糖上后，唯有2’-Az-G探针能标记原核RNA代谢。
实施例2：
为进一步检测本申请改进的实施例1中的四种探针是否能够对真核RNA代谢进行标记，该实施例检测了上述四种探针对真核生物---人纤维肉瘤细胞HT1080及小鼠神经瘤母细胞N2a的RNA代谢的标记效果，检测结果见图7和图8。
其中，图7示出的是三种改进探针对人纤维肉瘤细胞HT1080的RNA代谢标记结果；图8示出的是三种改进探针对小鼠神经瘤母细胞N2a的RNA代谢标记结果。从图7和图8的结果可以看出，将修饰改进到核糖上后，同样唯有2’-Az-G探针能标记真核RNA代谢。
而且，该实施例还表明，本申请改进的2’-Az-G探针不仅能标记原核RNA代谢，而且能标记真核RNA代谢。
实施例3：
由于RNA与DNA的区别仅在核糖的2号位上，本申请叠氮修饰的改进也是发生在核糖的2号位上，为进一步检测该探针是否对DNA代谢也能标记，该实施例检测了2’-Az-G探针对DNA和RNA代谢的标记效果。具体方法如下：
取过夜培养的大肠杆菌，按照1:200的比例转接到新的培养基中，养至OD600约为0.3。将大肠杆菌分为两组，实验组向培养基中加入终浓度为100μm的2’-Az-G，并在37℃继续培养2小时。对照组的培养基中不含本申请式I的探针。然后分别提取两组大肠杆菌的RNA和DNA进行检测，检测结果见图9。
从图9中可以看出，在含2’-Az-G的培养基中生长后，DNA并没有被标记上，而RNA可以被标记上。可见，该探针是特异性标记RNA代谢。
实施例4
对未经过与经过本申请2’-Az-G标记(浓度分别为100μM和500μM)的大肠杆菌分别进行RNA提取，提取后，将RNA调至相同浓度，其中一份与终浓度为50μM的DBCO-cy5室温反应1h，另外一份加入终浓度为100μM的炔基cy5，0.5mM硫酸铜，2mM THPTA以及5mM抗坏血酸钠，室温反应2h，反应后的两份样品均再加入200μL trizol，重新提取一次RNA以去掉多余的染料，随后进行In-gel检测。
从图10可以看出：本申请通过使用叠氮基团作为生物正交基团能够与DBCO反应，所标记的RNA依旧可以看出三条明显的RNA条带，证明RNA是完整的，而借助于铜离子与THPTA反应的对照组，RNA均有显著降解。
可见，本申请的RNA探针含有的叠氮基团可以与DBCO进行反应，从而保证RNA的完整性。避免了之前如EU的方法中，炔基只能借助铜离子催化的点击(click)反应而导致的RNA降解，从而最大程度地保证了RNA的完整性。
实施例5
取过夜培养的大肠杆菌，按照1:200的比例转接到新的培养基中，养至OD600约为0.3，向培养基中加入100μM终浓度的2’-Az-G，37℃培养2h，离心去掉培养基，用4％多聚甲醛(PFA)室温固定15分钟，离心去掉PFA并用PBS洗三次以去掉PFA。接着用穿透液0.1％Triton-X100室温穿透15min，离心去掉穿透液，并用PBS洗三次。然后配置click反应体系进行click反应(click反应体系为：每个浓度梯度的菌液用500μL体系进行反应，其中包括444.5μL PBS，1μL 100mM硫酸铜，2μL 200mM THPTA 2.5μL 10mM炔基-cy5 50μL 25mM抗坏血酸钠)，室温反应1h，之后用PBS洗三次，去掉反应液以及吸附的背景，最后在共聚焦显微镜下进行显微成像。成像结果见图11。
从图11可以看出：本申请的探针能够通过共聚焦显微成像的方式检测到其能够参与到大肠杆菌的RNA代谢中，且被探针标记的大肠杆菌荧光信号显著高于未被标记的对照组。
实施例6：
取过夜培养的大肠杆菌，按照1:200的比例转接到新的培养基中，养至OD600约为0.3，向培养基中加入10μM、25μM、50μM、100μM、200μM及500μM的不同终浓度的2’-Az-G，37℃培养2h，离心去掉培养基，用4％多聚甲醛(PFA)室温固定15分钟，离心去掉PFA并用PBS洗三次以去掉PFA，用0.1％Triton-X100室温穿透15min，离心去掉穿透液，并用PBS洗三次，配置click反应体系进行click(click反应体系为：每个浓度梯度的菌液用500μL体系进行反应，其中包括444.5μL PBS，1μL 100mM硫酸铜，2μL 200mM THPTA 2.5μL 10mM炔基-cy5 50μL25mM抗坏血酸钠)，室温反应1h，用PBS洗三次，去掉反应液以及吸附的背景，最后在共聚焦显微镜下进行显微成像。成像结果见图12。
从图12可以看出：本申请的探针不仅能借助于荧光成像的方式通过共聚焦显微观察到其的确能参与到原核RNA代谢中，而且，还能清楚地观察到在10μM到500μM的探针浓度内，随着探针浓度的增强，其对原核RNA的标记信号越强。
实施例7：
该毒性试验检测采用invitrogen L7007试剂盒进行，具体操作步骤为：
取过夜培养的大肠杆菌，按1:200的比例继代到新培养基中，待长到OD约为0.3，分别加入10μM、25μM、50μM、100μM、200μM及500μM的不同终浓度的探针，37℃继续标记2小时，离心去掉，用5ml 0.85％氯化钠溶液重选菌体，室温放置1h，10000g离心10min，再用5ml0.85％氯化钠溶液洗一次菌体，然后用0.85％氯化钠溶液重悬菌体，测OD670，调至于为0.06，取100μL菌液，加入100μL 2X染色液，暗室反应15min，酶标仪检测荧光并根据标准曲线判断细菌存活状态，最终的检测结果见图13。
从图13可以看出：当探针浓度低于200μM时，细菌的活率均高于80％。与之前报道的4SU及EU对细菌的生长曲线存在显著影响相比，本申请的探针具有明显的无毒优势。
实施例8：
取过夜培养的大肠杆菌，按照1:200的比例转接到新的培养基中，养至OD600约为0.3。将大肠杆菌分为两组，实验组向培养基中加入100μM的2’-Az-G，37℃培养2h，离心去掉培养基。对照组为不加入探针的组，将实验组和对照组分别进行RNA提取，并进行RNA转录本测序，对测序数据处理得到不同基因的表达值，其统计结果见图14，其中FPKM(fragmentsper kilobase of exon per million fragments mapped，百万外显子的碱基片段)。
从图14可以看出：实验组和对照组两种状态下差异表达的基因非常少，两种转录本的基因表达数据基本可以重叠。可见本申请的探针对转录本无明显影响，因而可用于进行原核的新生成RNA研究与测序等实验。
从以上的描述中，可以看出，本申请通过将原来在碱基上进行修饰的方式转化为在核糖上进行修饰，并采用鸟嘌呤核苷酸进行代谢标记，通过一系列实验证明，该探针不仅能够实现原核RNA的代谢标记及在显微成像、新生RNA的提取测序等诸多方面的应用，而且能够实现对真核RNA的代谢标记，因而也能进一步应用于对真核RNA代谢的相关研究中。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.RNA代谢标记探针在对RNA进行代谢标记中的应用，其中，所述RNA代谢标记探针为鸟嘌呤核苷酸类似物，所述鸟嘌呤核苷酸类似物是在鸟嘌呤核苷酸的核糖的第2位C上的-OH被-N3取代，且所述应用包括如下任意一项或多项：
通过In-Gel成像的方式检测RNA代谢；
通过荧光成像的方式对RNA进行荧光标记；
通过RNA-Seq的方式对新生RNA转录本进行检测；
通过荧光定量PCR的方式检测RNA的表达及变化；
通过IP后的northern blot对RNA进行检测；
通过点击反应及冷冻电镜对RNA的结构进行观察；
所述应用为非诊断或非治疗目的的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述RNA为原核RNA或真核RNA。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述原核RNA包括来源于如下任一种细胞的RNA：肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、 枯草芽孢杆菌、红球菌、沙门氏菌以及大肠杆菌。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述真核RNA包括来源于如下任一种细胞的RNA：人纤维肉瘤细胞HT1080及小鼠神经瘤母细胞N2a。
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