CN104546725A - 一种载酶壳聚糖纳米颗粒的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开本一种载酶壳聚糖纳米颗粒的制备方法,包括如下步骤:(1)通过化学交联的方法制成壳聚糖与酶的交联复合体;(2)通过离子凝胶法制备纳米颗粒,将步骤(1)获得的交联复合体于磁力搅拌器上搅拌,再逐滴加入三聚磷酸钠,待反应后溶液呈均一的乳光悬液,再经多次离心洗涤后得到纯净的载酶壳聚糖纳米颗粒。本发明的优点在于:(1)载酶壳聚糖纳米颗粒用于酶-前药疗法的稳定性好、生物相容性好、载药量大以及酶包裹效率高;(2)制备方法工艺简单、反应条件温和、方便快捷、成分无毒害、药物包载率高以及对蛋白分子破坏小;(3)壳聚糖纳米颗粒将HRP包裹在其中,避免了HRP在体内的降解,并达到在一定程度的可控释放。
Description
技术领域
本发明涉及高分子材料科学领域制备复合生物医药材料的技术,更具体来说,涉及一种载酶壳聚糖纳米颗粒的制备及应用。
背景技术
近几十年来,化疗在肿瘤的治疗中取得了重大进展,并已成为目前恶性肿瘤治疗的一种基本手段,从而使得患者的生存时间明显延长。但是现有的一些化疗药物在给药的过程中,在杀伤肿瘤细胞的同时,也会极大地损伤人体正常细胞,因而在治疗中会出现明显的毒副作用而影响药物的疗效,并给患者带来极大的痛苦。因此,药物载体在肿瘤治疗中具有明显的优势,特别是纳米给药系统已成为国内外研究的热点,也是给药系统中发展较快的领域。
纳米给药系统具有增加药物溶解度、提高药物生物利用度、降低药物毒副作用和延缓释放的理化和生物优势,因而具有广阔的应用前景。生物相容性好、可降解以及对组织和细胞没有毒副作用的生物新材料一直是生物医学与材料科学研究的热点。伴随着纳米给药系统的发展,生物高分子材料也得到飞速发展,特别是基于壳聚糖(Chitosan)的新型生物载体得到长足发展和应用。
壳聚糖(Chitosan)是甲壳素脱乙酰化的衍生物,是自然界中含量仅次于纤维素的第二大有机高分子化合物,也是自然界中唯一的碱性多糖。它富含大量的可修饰基团,如氨基、羟基、乙酰胺基以及β(1→4)糖苷键,此外,它还具有良好的生物相容性、生物降解性、亲水性以及可再生性和抗菌性。因而,基于壳聚糖纳米颗粒药物载体系统的制备及其应用研究已成为材料科学、生物医学交叉学科研究的热点,也必将为药物载体的选择和研究提供新的机遇。
然而,壳聚糖纳米颗粒(CS-NPs)制备过程中多种实验变量又会影响到其制备的过程,且不同的应用领域对壳聚糖纳米颗粒的粒径、表面电势以及多分散性又有不同的要求,使得壳聚糖纳米颗粒的应用受到极大的限制。另外壳聚糖纳米颗粒(CS-NPs)的分散性也是阻碍其应用的一个极大障碍,以往报道的很多纳米颗粒的粒度分布较宽,并且颗粒呈现多分散性,这极大地不利于其作为药物及基因等的载体。
近年来,随着遗传学、免疫学及分子生物学等学科的飞速发展,针对肿瘤的治疗研究已由细胞毒性药物向新型抗肿瘤药物发展,特别是植物激素在肿瘤治疗中的作用。已有研究发现植物中提取的吲哚-3-乙酸(IAA)作为一种植物激素具有调节植物细胞分裂、分化和生长过程的作用。而辣根过氧化物酶(HRP)是一种含有激素的植物过氧化物酶,可氧化包括吲哚-3-乙酸(IAA)在内的一系列底物,产生具有肿瘤治疗作用的化学毒素,可作为一种新的肿瘤治疗药物。吲哚-3-乙酸(IAA)单独存在于人体内时具有很高的耐受性,不易被人体内的一系列过氧化物酶所氧化,而只有在辣根过氧化物酶(HRP)存在时才会使其氧化产生有毒的代谢物,对肿瘤具有毒性作用。但是,辣根过氧化物酶(HRP)在给药的过程中存在传递效率低、对细胞内蛋白酶抵抗力差和极易被降解的问题。
针对壳聚糖纳米颗粒(CS-NPs)应用中存在的粒度分布宽、分散性差的问题,我们根据研究和应用的需要,方便且有针对性的通过特定实验变量的考察,利用单因素和正交优化实验制备出了单分散性良好,并且载酶率高的壳聚糖纳米颗粒。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种用于酶-前药疗法的稳定性好、生物相容性好、载药量大以及酶包裹效率高的载酶壳聚糖纳米颗粒的制备方法。
本发明的第二个目的在于提供一种用于酶-前药疗法的稳定性好、生物相容性好、载药量大以及酶包裹效率高的载酶壳聚糖纳米颗粒。
本发明的第三个目的在于提供载酶壳聚糖纳米颗粒在制备酶-前药疗法药物中的应用。
本发明的第四个目的在于提供载酶壳聚糖纳米颗粒与前药吲哚-3-乙酸在制备治疗乳腺癌联合用药物中的应用。
为实现本发明第一个目的,本发明公开以下技术方案:一种载酶壳聚糖纳米颗粒的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)通过化学交联的方法制成壳聚糖与酶的交联复合体,所述酶是指等电点大于5的酶,所述等电点大于5的酶是指辣根过氧化物酶、溶菌酶、过氧化氢酶和脂肪酶;
(2)通过离子凝胶法制备纳米颗粒,将步骤(1)获得的交联复合体于磁力搅拌器上搅拌,再逐滴加入三聚磷酸钠,待反应后溶液呈均一的乳光悬液,再经多次离心洗涤后得到纯净的载酶壳聚糖纳米颗粒。
作为一个优选方案,所述酶是指辣根过氧化物酶。
作为一个优选方案,步骤(1)中所述壳聚糖分子量为5000-10000,脱乙酰度大于90%,壳聚糖先溶于1%的醋酸溶液,待完全溶解后调节pH在5.0左右,再进行后续化学交联反应。
作为一个优选方案,步骤(1)所使用的化学交联剂为1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。
作为一个优选方案,步骤(2)中所述交联复合体的浓度为1mg/mL,pH为5.0,磁力搅拌器转速为500rpm,三聚磷酸钠浓度为1mg/mL。
作为一个优选方案,步骤(2)中交联复合体与三聚磷酸钠的质量比为5:1。
为实现本发明第二个目的,本发明公开以下技术方案:利用上述制备方法制备获得的载酶壳聚糖纳米颗粒。
为实现本发明第三个目的,本发明公开以下技术方案:利用上述制备方法制备获得的载酶壳聚糖纳米颗粒在制备酶-前药疗法药物中的应用。
作为一个优选方案,所述纳米颗粒为一包裹有辣根过氧化物酶的壳聚糖纳米颗粒,所述前药是指吲哚-3-乙酸。
为实现本发明第四个目的,本发明公开以下技术方案:利用上述制备方法制备获得的载酶壳聚糖纳米颗粒与前药吲哚-3-乙酸在制备治疗乳腺癌联合用药物中的应用。
本发明的优点在于:(1)本发明制备获得的载酶壳聚糖纳米颗粒用于酶-前药疗法的稳定性好、生物相容性好、载药量大以及酶包裹效率高;(2)制备方法工艺简单、反应条件温和、方便快捷、成分无毒害、药物包载率高以及对蛋白分子破坏小;(3)基于壳聚糖良好的理化和生物性质,从而利用壳聚糖纳米颗粒将催化前药吲哚-3-乙酸(IAA)反应的辣根过氧化物酶(HRP)通过化学交联的方法固定在壳聚糖分子上,然后进一步利用离子凝胶法制备壳聚糖纳米颗粒(CS-NPs)将HRP包裹在其中,从而避免了HRP在体内的降解,并达到在一定程度的可控释放。
本发明的原理及方法:本发明以具有良好理化和生物学性质的壳聚糖分子(CS)为基体,选用具有良好偶联效率的化学交联剂EDC/NHS,通过EDC活化辣根过氧化物酶(HRP)表面所带羧基基团-COOH,在NHS的作用下与壳聚糖表面大量伯氨基-NH3反应形成稳定的酰胺共价键,从而实现辣根过氧化物酶(HRP)与壳聚糖分子(CS)的交联,组成壳聚糖分子与辣根过氧化物酶(HRP)的复合体(HRP-CS)。再基于离子间的相互作用利用离子凝胶法,在三聚磷酸钠(TPP)的作用下进一步凝胶化制备出载有辣根过氧化物酶(HRP)的壳聚糖纳米颗粒(HRP-CS-NPs)。
本发明以辣根过氧化物酶作为优选例子,是基于辣根过氧化物酶(HRP)与吲哚-3-乙酸(IAA)为典型的酶-前药组合,并且辣根过氧化物酶(HRP)的等电点大于5.0,在pH为5.0的壳聚糖溶液中带正电。采用本发明方法的酶需满足等电点大于5的条件,在此条件下酶在pH5.0附近带正电荷,不利于其与表面带正电的壳聚糖发生静电吸引,所以采用先进行化学交联再进行颗粒制备的方法,适合本条件的酶有过氧化氢酶、溶菌酶、脂肪酶等。
所述的基本原理如图14所示。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
(1)壳聚糖分子与辣根过氧化物酶(HRP)偶联复合体(HRP-CS)的制备
首先将0.5mg的辣根过氧化物酶(HRP)溶解于1mL的超纯水中,并添加50mg的化学交联剂1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]-碳化二亚胺(EDC)于上述混合液中,磁力搅拌30min来活化辣根过氧化物酶(HRP)表面所带的羧基。然后,将10mg的壳聚糖(CS)溶于1mL 1%的醋酸溶液中,于60℃磁力搅拌完全溶解后调节pH到5.0。最后,将10mg/mL的壳聚糖溶液于上述活化的辣根过氧化物酶(HRP)混合液混合,并添加40mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),于4℃下磁力搅拌48h来得到壳聚糖分子与辣根过氧化物酶(HRP)的偶联复合体(HRP-CS)。
(2)单分散壳聚糖纳米颗粒(CS-NPs)及载酶壳聚糖纳米颗粒(HRP-CS-NPs)的制备
通过正交实验设计和大量补充实验,确定制备单分散壳聚糖纳米颗粒较为优化的步骤如下:
将100mg的壳聚糖溶于100mL 1%的醋酸溶液中,配制成1mg/mL的壳聚糖溶液,磁力搅拌过夜溶解,并用20wt%氢氧化钠调节壳聚糖溶液pH到5.0,并用0.22μm的微孔滤膜除去溶液中的不溶杂质,制得壳聚糖储备液;配制1mg/mL的三聚磷酸钠(TPP)水溶液,经0.22μm的微孔滤膜除去溶液中的不溶杂质,制得TPP储备液。
壳聚糖纳米颗粒(CS-NPs)制备:将1mg/mL的pH为5.0的壳聚糖(CS)5mL加入到10mL烧杯中搅拌,控制搅拌转速为500rpm,搅拌的环境温度为10℃左右,再逐滴加入1mg/mL的三聚磷酸钠(TPP)溶液1mL,待反应15min后溶液呈均一的乳光悬液,再经多次12000rpm离心20min洗涤后得到纯净的壳聚糖纳米颗粒(CS-NPs)。
载酶壳聚糖纳米颗粒(HRP-CS-NPs)制备:将1mg/mL的pH为5.0的壳聚糖分子与辣根过氧化物酶(HRP)偶联复合体(HRP-CS)5mL加入到10mL烧杯中搅拌,控制搅拌转速为500rpm,搅拌的环境温度为10℃左右,再逐滴加入1mg/mL的三聚磷酸钠(TPP)溶液1mL,待反应15min后溶液呈均一的乳光悬液,再经多次再经多次12000rpm离心20min洗涤后得到纯净的载酶壳聚糖纳米颗粒(HRP-CS-NPs)。
(3)变量对壳聚糖纳米颗粒(CS-NPs)影响的考察
根据文献表明,多种实验变量都会影响到壳聚糖与TPP的交联过程,而单分散性又是限制壳聚糖纳米颗粒应用一个亟待解决的问题,以往报道中的壳聚糖纳米颗粒一般都有较宽的粒度分布,并且颗粒呈现多分散性的问题,我们通过正交优化和单因素实验考察了各个制备变量对壳聚糖纳米颗粒的影响,优化纳米颗粒制备工艺,并阐明反应条件对纳米颗粒形成及物化性质的影响。以颗粒粒径和多分散指数为指标,通过改变某一个实验变量而维持其它变量不变,进而来考察单一变量对制备壳聚糖纳米颗粒(CS-NPs)的影响。主要考察的变量包括:壳聚糖溶液浓度(0.5-2mg/mL)、三聚磷酸钠(TPP)溶液浓度(0.5-2mg/mL)、醋酸溶液浓度(0.5%-2%)、壳聚糖溶液的pH(3.5-6.0)、成颗粒时外界环境温度(5-25℃)、搅拌转速(300-1000rpm)、壳聚糖与三聚磷酸钠(TPP)质量比(8:1-2:1)。
通过以上变量的考察得到最优化的制备条件为:壳聚糖溶液浓度为1mg/mL、醋酸溶液浓度为1%,壳聚糖溶液pH为5.0、三聚磷酸钠(TPP)溶液浓度为1mg/mL、成颗粒时环境温度为10℃、搅拌转速为500rpm、壳聚糖与三聚磷酸钠(TPP)质量比为5:1。
(4)细胞毒性评价
于McCoy’s 5A(购自Gibco公司)培养基中将SK-BR-3乳腺癌细胞(取自中科院细胞库)培养至对数生长期,而后接种于96孔板上在37℃、5%CO2条件下孵育至对数生长期,然后在超净工作台中将以下治疗因子以及对照因子加入到96孔板中。
A.载酶纳米颗粒与前药组合(HRP-CS-NPs+IAA);
B.空白纳米颗粒与前药组合(CS-NPs+IAA);
C.辣根过氧化物酶与前药组合(HRP+IAA);
D.载酶壳聚糖纳米颗粒(HRP-CS-NPs);
E.空白壳聚糖纳米颗粒(CS-NPs);
F.空白对照(PBS)。
通过MTT法测定以上各因子细胞毒性,结果显示载酶纳米颗粒与前药组合(HRP-CS-NPs+IAA)对细胞的杀伤达80%以上,与单纯酶与前药组合基本一致,而其它对照因子对细胞损伤很小。
附图说明
图1为制备的载酶壳聚糖纳米颗粒(HRP-CS-NPs)的透射电镜图。制样方法为:取一定量已制备好的载酶壳聚糖颗粒用超声波超声分散3min,在红外灯照射下取10μl滴加到铜网上,用2%(w/v)的磷钨酸染色,红外灯下烘干,于投射电镜(JEOL1400)下观察纳米颗粒的形态。从TEM图可以看出,载酶壳聚糖纳米颗粒球形良好且圆整,表面光滑,均一分散,无明显的粘连现象,粒径分布在50nm左右。壳聚糖纳米颗粒在透射电镜下的粒径远小于马尔文激光粒度仪所测粒径,这是因为颗粒在干态时呈塌陷收缩状态,而在水环境中呈溶胀状态且颗粒表面存在一层水化层。这种水凝胶结构使得壳聚糖纳米颗粒内部具有较大的空间来包载药物。另外,部分颗粒间的凝聚是由于在干燥过程中颗粒间的静电斥力降低、氢键结合力增加而造成的。
图2为制备的载酶壳聚糖纳米颗粒(HRP-CS-NPs)的粒度分布图。制备好的载酶壳聚糖纳米颗粒(HRP-CS-NPs)的平均粒径通过马尔文激光粒度仪进行测量,将制备好的纳米溶液,加入到比色皿中,放置于粒度仪样品池中进行测量。从图中可以看出载酶壳聚糖纳米颗粒(HRP-CS-NPs)的粒径在160nm左右,多分散指数为0.134,说明颗粒具有良好单分散和粒度分布。
图3为制备的载酶壳聚糖纳米颗粒(HRP-CS-NPs)的zeta电位分布图。制备好的载酶壳聚糖纳米颗粒(HRP-CS-NPs)的zeta电位通过马尔文激光粒度仪进行测量,将制备好的纳米溶液加入到电极杯中,放置于粒度仪样品池中进行测量。从图中可以看出载酶壳聚糖纳米颗粒(HRP-CS-NPs)的zeta电位在+42.3mV右,说明该体系具有较好的稳定性,即溶解和分散可以抵抗聚集。
图4为醋酸溶液浓度对平均粒径的影响。从图中可以看出在醋酸浓度较低时,使得壳聚糖分子不能充分质子化,相对过量的三聚磷酸钠(TPP)导致部分颗粒发生聚集,使得粒径较大。当浓度为1%时颗粒具有较好的分散性,但随着醋酸浓度增加,颗粒的平均粒径变化不大,但粒径分布变宽,也就是单分散性降低。
图5为壳聚糖溶液浓度对平均粒径的影响。从图中可以看出随着壳聚糖溶液浓度的增加,混合液中颗粒的平均粒径逐渐增大,这主要是由于随着壳聚糖溶液浓度增加,当三聚磷酸(TPP)溶液滴加到其中时,使得过量的壳聚糖分子与少量TPP发生交联,使得单个TPP分子可能交联多个壳聚糖而使粒径有所增大。从平均粒径、分散度方面考虑,本技术方案确定壳聚糖浓度在0.8-1.5mg/mL之间。
图6为三聚磷酸钠(TPP)浓度对平均粒径的影响。从图中可以看出,在TPP浓度较低时,根据壳聚糖与TPP的一定质量比,反应过程中需要加入的TPP质量就会增加,从而易造成TPP局部浓度过高,使得颗粒粒径增加。在浓度为1mg/mL时,由于与壳聚糖浓度比例搭配适中,不过造成其局部浓度过高,而使得平均粒径最小。但随着TPP浓度的增加,造成过量TPP与少量壳聚糖分子发生交联,造成粒径过大。从平均粒径、分散度方面考虑,本技术方案确定壳聚糖浓度1.0mg/mL。
图7为壳聚糖溶液pH对平均粒径的影响。从图中可以看出在pH较低时有较大的粒径分布,这主要是由于在低pH条件下,TPP表面所带负电荷数量较少,而壳聚糖分子表面氨基质子化程度极高,使得TPP与壳聚糖交联效率很低。同理,随着pH的增加使得TPP表面所带负电荷数量增加,而壳聚糖分子表面氨基质子化程度降低,使得TPP与壳聚糖交联效率同样很低。只有pH在5.0左右时,交联效率最高,并且颗粒表面未交联的质子化氨基仍保持正电性而维持体系的稳定性。
图8为壳聚糖与三聚磷酸钠质量比对平均粒径的影响。从图中可以看出,在质量比较低时,由于说成颗粒的密度过大,使得颗粒之间容易凝聚造成颗粒粒径过大。而当质量比较高时,由于TPP的量过少,而使得颗粒浓度极低,甚至趋于澄清状态,无法满足对制备量的要求。因此,结合本实验考虑最终选择质量比5:1。
图9为搅拌转速对平均粒径的影响。从图中可以看出,在搅拌转速较低时,由于转速不能使TPP充分分散造成局部浓度过高而使形成的颗粒粒径较大。随着搅拌转速的增加,使得两者的混合更加均匀,并在500rpm时达到一个最优值。但随着搅拌转速的增加,颗粒的粒径也逐渐增加,这可能是由于高转速所造成的高剪切力把壳聚糖和TPP的分子结构造成一定破坏,使得不能充分交联而使粒径增大。从平均粒径、分散度方面考虑,本技术方案确定搅拌转速为500rpm。
图10为环境温度对平均粒径的影响。从图中可以看出在较低的环境温度下,壳聚糖分子链上的极性基团与水分子间的氢键作用增加迅速,使得颗粒表面能及时形成水化层而减少搅拌过程中颗粒间碰撞几率,使得溶液基本不成颗粒;但随着温度升高,颗粒表面水化层形成缓慢,搅拌过程中颗粒间碰撞几率增大,但过高温度使得聚集成大颗粒的几率增加。因此,较低的环境温度有利于提高颗粒的单分散性,所以本技术方案选择10℃左右。
图11为固定化辣根过氧化物酶(HRP-CS-NPs)与游离辣根过氧化物酶(HRP)在37℃存储条件下相对酶活。从图中我们可以看出在存储50天时,固定化酶仍能保持50%以上的酶活力,而游离酶则降到了20%以下。通常酶在存放过程中,酶活的丧失主要是由于微生物的降解,而对于壳聚糖固定化后的酶,由于壳聚糖纳米颗粒的微孔结构能有效防止微生物进入孔内降解HRP,从而使其活力得到保持。
图12为固定化辣根过氧化物酶(HRP-CS-NPs)与游离辣根过氧化物酶(HRP)在尿素条件下抗降解稳定性结果。从图中可以看出在作用60min后,固定化酶仍能保持60%以上酶活,而游离酶则降到了30%左右。固定化HRP在包埋在壳聚糖纳米颗粒之中,一定的束缚使其分子构象更能抵抗尿素的降解,使其酶活仍能保持较高。
图13为在加入前药后各治疗因子和对照因子对细胞毒性考察结果。通过MTT法测定以上各因子细胞毒性,结果显示载酶纳米颗粒与前药组合(HRP-CS-NPs+IAA)对细胞的杀伤达80%以上,与单纯酶与前药组合基本一致,而其它对照因子对细胞损伤很小。
图14为本发明制备方法基本原理图。
图15为制备的载溶菌酶壳聚糖纳米颗粒(LYS-CS-NPs)的粒度分布图。制备好的载酶壳聚糖纳米颗粒(LYS-CS-NPs)的平均粒径通过马尔文激光粒度仪进行测量,将制备好的纳米溶液,加入到比色皿中,放置于粒度仪样品池中进行测量。从图中可以看出载酶壳聚糖纳米颗粒(LYS-CS-NPs)的粒径在313nm左右,多分散指数为0.162,说明颗粒具有良好单分散和粒度分布。
图16为制备的载溶菌酶壳聚糖纳米颗粒(LYS-CS-NPs)的zeta电位分布图。制备好的载酶壳聚糖纳米颗粒(LYS-CS-NPs)的zeta电位通过马尔文激光粒度仪进行测量,将制备好的纳米溶液加入到电极杯中,放置于粒度仪样品池中进行测量。从图中可以看出载酶壳聚糖纳米颗粒(LYS-CS-NPs)的zeta电位在+45mV右,说明该体系具有较好的稳定性,即溶解和分散可以抵抗聚集。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如J.萨姆布鲁克(Joseph Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件,或按照制造厂商所推荐的条件进行实验。
实施例1.制备载酶壳聚糖纳米颗粒(HRP-CS-NPs)
首先将0.5mg的辣根过氧化物酶(HRP)溶解于1mL的超纯水中,并添加50mg的化学交联剂1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]-碳化二亚胺(EDC)于上述混合液中,磁力搅拌30min来活化辣根过氧化物酶(HRP)表面所带的羧基。然后,将10mg的壳聚糖(Chitosan)溶于1mL 1%的醋酸溶液中,于60℃磁力搅拌完全溶解后调节pH到5.0。最后,将10mg/mL的壳聚糖溶液于上述活化的辣根过氧化物酶(HRP)混合液混合,并添加40mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),于4℃下磁力搅拌48h来得到壳聚糖分子与辣根过氧化物酶(HRP)的偶联复合体(HRP-CS)。
将1mg/mL的pH为5.0的壳聚糖分子与辣根过氧化物酶(HRP)偶联复合体(HRP-CS)5mL加入到10mL烧杯中搅拌,控制搅拌转速为500rpm,搅拌的环境温度为10℃左右,再逐滴加入1mg/mL的三聚磷酸钠(TPP)溶液1mL,待反应15min后溶液呈均一的乳光悬液,再经多次再经多次12000rpm离心20min洗涤后得到纯净的载酶壳聚糖纳米颗粒(HRP-CS-NPs)。所制得的载酶壳聚糖纳米颗粒的粒径在160nm左右,zeta电位在+42mV左右。
本实施例中,所制得的载酶壳聚糖纳米颗粒(HRP-CS-NPs)的透射电镜图如图1所示,粒度分布图如图2所示,zeta电位图如图3所示。
实施例2.不同醋酸浓度对制备壳聚糖纳米颗粒的影响
将100mg的壳聚糖分别溶于100mL(0.5%、0.8%、1%、1.2%、1.5%、2%)的醋酸溶液中,配制成1mg/mL的壳聚糖溶液,磁力搅拌过夜溶解,并用20wt%氢氧化钠调节壳聚糖溶液pH到5.0,并用0.22μm的微孔滤膜除去溶液中的不溶杂质,制得壳聚糖储备液;配制1mg/mL的三聚磷酸钠(TPP)水溶液,经0.22μm的微孔滤膜除去溶液中的不溶杂质,制得TPP储备液。
壳聚糖纳米颗粒(CS-NPs)制备:将1mg/mL的pH为5.0的壳聚糖(CS)5mL加入到10mL烧杯中搅拌,控制搅拌转速为500rpm,搅拌的环境温度为10℃左右,再逐滴加入1mg/mL的三聚磷酸钠(TPP)溶液1mL,待反应15min后停止搅拌,再经多次12000rpm离心20min洗涤后得到纯净的壳聚糖纳米颗粒(CS-NPs)。
本实施例考察了不同醋酸浓度对制备壳聚糖纳米颗粒的影响,结果如图4所示。
实施例3.不同壳聚糖浓度对制备壳聚糖纳米颗粒的影响
称取一定量的壳聚糖纳米颗粒溶于1%的醋酸溶液中,配制成浓度分别为(0.5mg/mL、0.8mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、1.8mg/mL、2mg/mL)的壳聚糖溶液,磁力搅拌过夜溶解,并用20wt%氢氧化钠调节壳聚糖溶液pH到5.0,并用0.22μm的微孔滤膜除去溶液中的不溶杂质,制得壳聚糖储备液;配制1mg/mL的三聚磷酸钠(TPP)水溶液,经0.22μm的微孔滤膜除去溶液中的不溶杂质,制得TPP储备液。
壳聚糖纳米颗粒(CS-NPs)制备:将浓度分别为(0.5mg/mL、0.8mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、1.8mg/mL、2mg/mL)pH为5.0的壳聚糖(CS)溶液5mL加入到10mL烧杯中搅拌,控制搅拌转速为500rpm,搅拌的环境温度为10℃左右,再逐滴加入1mg/mL的三聚磷酸钠(TPP)溶液1mL,待反应15min后停止搅拌,再经多次12000rpm离心20min洗涤后得到纯净的壳聚糖纳米颗粒(CS-NPs)。
本实施例考察了不同壳聚糖浓度对制备壳聚糖纳米颗粒的影响,结果如图5所示。
实施例4.不同浓度三聚磷酸钠(TPP)对制备壳聚糖纳米颗粒的影响
将100mg的壳聚糖溶于100mL质量分数为1%的醋酸溶液中,配制成1mg/mL的壳聚糖溶液,磁力搅拌过夜溶解,并用20wt%氢氧化钠调节壳聚糖溶液pH到5.0,并用0.22μm的微孔滤膜除去溶液中的不溶杂质,制得壳聚糖储备液;配制浓度分别为(0.5mg/mL、0.8mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、1.8mg/mL、2mg/mL)的三聚磷酸钠(TPP)水溶液,经0.22μm的微孔滤膜除去溶液中的不溶杂质,制得TPP储备液。
壳聚糖纳米颗粒(CS-NPs)制备:将1mg/mL的pH为5.0的壳聚糖(CS)5mL加入到10mL烧杯中搅拌,控制搅拌转速为500rpm,搅拌的环境温度为10℃左右,再逐滴加入浓度分别为(0.5mg/mL、0.8mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、1.8mg/mL、2mg/mL)的三聚磷酸钠(TPP)溶液1mL,待反应15min后停止搅拌,再经多次12000rpm离心20min洗涤后得到纯净的壳聚糖纳米颗粒(CS-NPs)。
本实施例考察了不同浓度三聚磷酸钠(TPP)对制备壳聚糖纳米颗粒的影响,结果如图6所示。
实施例5.不同pH的壳聚糖溶液对制备壳聚糖纳米颗粒的影响
将100mg的壳聚糖溶于100mL质量分数为1%的醋酸溶液中,配制成1mg/mL的壳聚糖溶液,磁力搅拌过夜溶解,并用20wt%氢氧化钠调节壳聚糖溶液pH分别到(3.5、4、4.5、5.0、5.5、6.0),并用0.22μm的微孔滤膜除去溶液中的不溶杂质,制得壳聚糖储备液;配制浓度为1mg/mL的三聚磷酸钠(TPP)水溶液,经0.22μm的微孔滤膜除去溶液中的不溶杂质,制得TPP储备液。
壳聚糖纳米颗粒(CS-NPs)制备:将1mg/mL的pH分别为(3.5、4、4.5、5.0、5.5、6.0)的壳聚糖(CS)溶液5mL加入到10mL烧杯中搅拌,控制搅拌转速为500rpm,搅拌的环境温度为10℃左右,再逐滴加入浓度为1mg/mL的三聚磷酸钠(TPP)溶液1mL,待反应15min后停止搅拌,再经多次12000rpm离心20min洗涤后得到纯净的壳聚糖纳米颗粒(CS-NPs)。
本实施例考察了不同pH的壳聚糖溶液对制备壳聚糖纳米颗粒的影响,结果如图7所示。
实施例6.壳聚糖/三聚磷酸钠(TPP)不同质量比对制备壳聚糖纳米颗粒的影响
将100mg的壳聚糖溶于100mL质量分数为1%的醋酸溶液中,配制成1mg/mL的壳聚糖溶液,磁力搅拌过夜溶解,并用20wt%氢氧化钠调节壳聚糖溶液pH到5.0,并用0.22μm的微孔滤膜除去溶液中的不溶杂质,制得壳聚糖储备液;配制浓度为1mg/mL的三聚磷酸钠(TPP)水溶液,经0.22μm的微孔滤膜除去溶液中的不溶杂质,制得TPP储备液。
壳聚糖纳米颗粒(CS-NPs)制备:将1mg/mL的pH为5.0的壳聚糖(CS)溶液5mL加入到10mL烧杯中搅拌,控制搅拌转速为500rpm,搅拌的环境温度为10℃左右,再按照壳聚糖与三聚磷酸钠质量比分别为(8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1)逐滴加入浓度为1mg/mL的三聚磷酸钠(TPP)溶液,待反应15min后停止搅拌,再经多次12000rpm离心20min洗涤后得到纯净的壳聚糖纳米颗粒(CS-NPs)。
本实施例考察了壳聚糖/三聚磷酸钠(TPP)不同质量比对制备壳聚糖纳米颗粒的影响,结果如图8所示。
实施例7.不同搅拌转速对制备壳聚糖纳米颗粒的影响
将100mg的壳聚糖溶于100mL质量分数为1%的醋酸溶液中,配制成1mg/mL的壳聚糖溶液,磁力搅拌过夜溶解,并用20wt%氢氧化钠调节壳聚糖溶液pH到5.0,并用0.22μm的微孔滤膜除去溶液中的不溶杂质,制得壳聚糖储备液;配制浓度为1mg/mL的三聚磷酸钠(TPP)水溶液,经0.22μm的微孔滤膜除去溶液中的不溶杂质,制得TPP储备液。
壳聚糖纳米颗粒(CS-NPs)制备:将1mg/mL的pH为5.0的壳聚糖(CS)溶液5mL加入到10mL烧杯中搅拌,控制搅拌转速分别为(300rpm、400rpm、500rpm、600rpm、700rpm、800rpm、1000rpm),搅拌的环境温度为10℃左右,按照壳聚糖/TPP 5:1质量比逐滴加入浓度为1mg/mL的三聚磷酸钠(TPP)溶液,,待反应15min后停止搅拌,再经多次12000rpm离心20min洗涤后得到纯净的壳聚糖纳米颗粒(CS-NPs)。
本实施例考察了不同搅拌转速对制备壳聚糖纳米颗粒的影响,结果如图9所示。
实施例8.不同环境温度对制备壳聚糖纳米颗粒的影响
将100mg的壳聚糖溶于100mL质量分数为1%的醋酸溶液中,配制成1mg/mL的壳聚糖溶液,磁力搅拌过夜溶解,并用20wt%氢氧化钠调节壳聚糖溶液pH到5.0,并用0.22μm的微孔滤膜除去溶液中的不溶杂质,制得壳聚糖储备液;配制浓度为1mg/mL的三聚磷酸钠(TPP)水溶液,经0.22μm的微孔滤膜除去溶液中的不溶杂质,制得TPP储备液。
壳聚糖纳米颗粒(CS-NPs)制备:将1mg/mL的pH为5.0的壳聚糖(CS)溶液5mL加入到10mL烧杯中搅拌,搅拌转速500rpm,控制搅拌的环境温度分别为(5℃、10℃、15℃、20℃、25℃)左右,按照壳聚糖/TPP 5:1质量比逐滴加入浓度为1mg/mL的三聚磷酸钠(TPP)溶液,,待反应15min后停止搅拌,再经多次12000rpm离心20min洗涤后得到纯净的壳聚糖纳米颗粒(CS-NPs)。
本实施例考察了不同环境温度对制备壳聚糖纳米颗粒的影响,结果如图10所示。
实施例9.载酶颗粒包埋率和载酶率的测定
采用优化工艺制备出载酶壳聚糖纳米(HRP-CS-NPs)之后,高速离心20min(4℃,12000rpm)多次,收集每次离心后的上清液,通过紫外分光光度计测定在特定波长吸光度,带入蛋白浓度标准曲线得出上清液中未包埋的辣根过氧化物酶(HRP)量,根据以下公式得出包埋率和载酶率。
本实施例提供一种载酶颗粒包埋率和载酶率的测定方法,利用上述方法得出本技术方案对HRP的包埋效率为37.3%,载酶率为16.5%。
实施例10.测定辣根过氧化物酶(HRP)活力
采用经典的Sigma法来测定辣根过氧化物酶(HRP)活力。根据过氧化物酶催化过氧化氢发生还原反应。这时用焦棓酚(焦性没食子酸)作氢供体,它被氧化后产生红紫棓精。用分光光度计(420nm)跟踪测定逐渐增大的红紫棓精浓度。定义一个过氧化物酶单位相当于在20s内于20℃从焦棓酚催化产生1mg红紫棓精时所需的酶量。测定酶活所需溶液按照以下方法配制:
①磷酸盐缓冲液(pH6.0):取1.36g磷酸二氢钾(KH2PO4)溶于80mL超纯水中,用1M的氢氧化钠溶于将pH调至6.0,用超纯水定容至100mL。
②焦棓酚溶液:取500mg焦棓酚(C6H6O3)溶于超纯水,并定容至10mL。
③过氧化氢溶液:用超纯水稀释1.67mL过氧化氢(30%H2O2)至100mL。
④酶溶液:测定工作即将开始之前,用磷酸盐缓冲液溶解酶。1mL配制溶液需含有0.4-0.7U。
具体操作方法:用移液枪将0.32mL磷酸盐缓冲液、0.16mL过氧化氢溶液、0.32mL焦棓酚溶液和2.1mL超纯水滴入比色皿混合,调温至20℃。加0.10mL酶溶液,再次混合,并按动秒表。于420nm处以空白值为参比测定吸光度,每次隔20s,直至20s内的吸光度增大值达到稳定为止。
空白值的测定方法与主值相同,只是这里不加酶液,而是多加0.10mL磷酸盐缓冲液。
将以上溶液混合,调温至20℃,使用合适的分光光度计在A420nm直至稳定的一个常量。然后再加:
立即混合,于A420nm处以空白值为参比测定吸光度,每隔20s测一次,记录5min。使用最大线性率获得主值和空白值的DA420nm/20。
然后按照以下公式进行计算:
式中,s---------秒;
3---------反应混合液总体积;
Df--------稀释倍数;
12--------1mg/mL的红紫棓精在420nm处吸光度(由Sigma公司测定);
0.1-------添加酶液的mL数;
CE--------酶液浓度。
本实施例提供一个经典的Sigma法测定辣根过氧化物酶(HRP)活力,通过对游离辣根过氧化物酶(HRP)和固定化辣根过氧化物酶(HRP-CS-NPs)测定,得出固定化酶的酶活力为65.7U/mg,保留了42%的过氧化物酶活性。
实施例11.固定化酶与游离酶在37℃条件下存储稳定性的考察
取一定量优化步骤下制备好的载酶壳聚糖纳米颗粒(HRP-CS-NPs)分散于一定量的水溶液中,而后将其放置于37℃生化培养箱中,并定期取样测定其酶活。于此同时将适合浓度的游离辣根过氧化物酶(HRP)溶液放置于37℃生化培养箱中,定期取样测定其酶活。测定周期为50天,酶活测定按照实施例10中技术方案。
本实施例考察了固定化酶与游离酶在37℃条件下存储稳定性的考察,其结果如图11所示。
实施例12.固定化酶与游离酶在尿素中抗降解的稳定性
取一定量优化步骤下制备好的载酶壳聚糖纳米颗粒(HRP-CS-NPs)分散于浓度为6M的尿素溶液中,在37℃条件下分别测定其在(0min、10min、30min和60min)时的酶活。同时按照上述操作测定游离辣根过氧化物酶(HRP)在上述条件下的酶活。酶活测定按照实施例10中技术方案。
本实施例考察了固定化酶与游离酶在尿素中抗降解的稳定性,其结果如图12所示。
实施例13.载酶纳米颗粒与前药组合作用于细胞对细胞的杀伤作用
于McCoy’s 5A(购自Gibco公司)培养基中将SK-BR-3乳腺癌细胞(取自中科院细胞库)培养至对数生长期,而后接种于96孔板上在37℃、5%CO2条件下孵育至对数生长期,然后在超净工作台中将以下治疗因子以及对照因子加入到96孔板中。
A.载酶纳米颗粒与前药组合(HRP-CS-NPs+IAA);
B.空白纳米颗粒与前药组合(CS-NPs+IAA);
C.辣根过氧化物酶与前药组合(HRP+IAA);
D.载酶壳聚糖纳米颗粒(HRP-CS-NPs);
E.空白壳聚糖纳米颗粒(CS-NPs);
F.空白对照(PBS)。
通过MTT法测定以上各因子细胞毒性,游离HRP终浓度为1.2μg/mL,需要添加吲哚-3-乙酸(IAA)的孔的浓度为100μM,HRP-CS-NPs的添加量以与游离酶的酶活一致为标准,CS-NPs的量与HRP-CS-NPs用量相同,空白对照中PBS量与载酶纳米颗粒与前药组合用量一致。而后在37℃、5%CO2条件下孵育36h,通过MTT法测定各因子细胞毒性。
本实施例测定了载酶纳米颗粒与前药组合作用于细胞对细胞的杀伤作用,其结果如图13所示。
实施例14.制备载溶菌酶(LYS)壳聚糖纳米颗粒(LYS-CS-NPs)
首先将0.5mg的溶菌酶(LYS)溶解于1mL的超纯水中,并添加50mg的化学交联剂1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]-碳化二亚胺(EDC)于上述混合液中,磁力搅拌30min来活化溶菌酶(LYS)表面所带的羧基。然后,将10mg的壳聚糖(Chitosan)溶于1mL 1%的醋酸溶液中,于60℃磁力搅拌完全溶解后调节pH到5.0。最后,将10mg/mL的壳聚糖溶液于上述活化的溶菌酶(LYS)混合液混合,并添加40mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),于4℃下磁力搅拌48h来得到壳聚糖分子与溶菌酶(LYS)的偶联复合体(LYS-CS)。
将1mg/mL的pH为5.0的壳聚糖分子与溶菌酶(LYS)偶联复合体(LYS-CS)5mL加入到10mL烧杯中搅拌,控制搅拌转速为500rpm,搅拌的环境温度为10℃左右,再逐滴加入1mg/mL的三聚磷酸钠(TPP)溶液1mL,待反应15min后溶液呈均一的乳光悬液,再经多次12000rpm离心20min洗涤后得到纯净的载酶壳聚糖纳米颗粒(LYS-CS-NPs)。所制得的载酶壳聚糖纳米颗粒的粒径在313nm左右,zeta电位在+45mV左右。
本实施例中,所制得的载酶壳聚糖纳米颗粒(LYS-CS-NPs)的粒度分布图如图15所示,zeta电位图如图16所示。
综上所述,本发明的载酶壳聚糖纳米颗粒经透射电子显微镜(TEM)观察发现得到的颗粒为球形且大小均一,颗粒的平均直径为150±20nm,zeta电位为+43mV。HRP的包埋效率为37.3%,载酶率为16.5%,酶活性检测发现包埋HRP的壳聚糖纳米颗粒保留了42%的过氧化物酶活性。本发明制备方法条件温和,工艺简单,制备得到的复合纳米颗粒具有生物相容性好、稳定性好、载酶效率高的特点,并在与前药吲哚-3-乙酸(IAA)联合给药作用于乳腺癌SK-BR-3细胞时达到80%以上致死效果,因而在作为药物载体肿瘤治疗领域具有广阔应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种载酶壳聚糖纳米颗粒的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)通过化学交联的方法制成壳聚糖与酶的交联复合体,所述酶是指等电点大于5的酶,所述等电点大于5的酶是指辣根过氧化物酶、溶菌酶、过氧化氢酶和脂肪酶;
(2)通过离子凝胶法制备纳米颗粒,将步骤(1)获得的交联复合体于磁力搅拌器上搅拌,再逐滴加入三聚磷酸钠,待反应后溶液呈均一的乳光悬液,再经多次离心洗涤后得到纯净的载酶壳聚糖纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的一种载酶壳聚糖纳米颗粒的制备方法,其特征在于,所述酶是指辣根过氧化物酶。
3.根据权利要求1或2所述的一种载酶壳聚糖纳米颗粒的制备方法,其特征在于,步骤(1)中所述壳聚糖分子量为5000-10000,脱乙酰度大于90%,壳聚糖先溶于1%的醋酸溶液,待完全溶解后调节pH在5.0左右,再进行后续化学交联反应。
4.根据权利要求1或2所述的一种载酶壳聚糖纳米颗粒的制备方法,其特征在于,步骤(1)所使用的化学交联剂为1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。
5.根据权利要求1或2所述的一种载酶壳聚糖纳米颗粒的制备方法,其特征在于,步骤(2)中所述交联复合体的浓度为1mg/mL,pH为5.0,磁力搅拌器转速为500rpm,三聚磷酸钠浓度为1mg/mL。
6.根据权利要求1或2所述的一种载酶壳聚糖纳米颗粒的制备方法,其特征在于,步骤(2)中交联复合体与三聚磷酸钠的质量比为5:1。
7.利用权利要求1或2的制备方法制备获得的载酶壳聚糖纳米颗粒。
8.利用权利要求1或2的制备方法制备获得的载酶壳聚糖纳米颗粒在制备酶-前药疗法药物中的应用。
9.利用权利要求2的制备方法制备获得的载酶壳聚糖纳米颗粒在制备酶-前药疗法药物中的应用,其特征在于,所述纳米颗粒为一包裹有辣根过氧化物酶的壳聚糖纳米颗粒,所述前药是指吲哚-3-乙酸。
10.利用权利要求2的制备方法制备获得的载酶壳聚糖纳米颗粒与前药吲哚-3-乙酸在制备治疗乳腺癌联合用药物中的应用。
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