KR101101986B1 - 새로운 리포터와 분자 탐침자로서 빠르고 강한 형광이 유도되는 적색 형광 단백질 ＦｍＲｅｄ - Google Patents

Abstract

본 발명은 야생형 DsRed(Red Fluorescence Protein) 유전자의 N-말단에 3개의 아미노산인 MGS 및 C-말단에 5개의 아미노산인 CGSPG이 연장되어 이루어지는 적색 형광 단백질 FmRed(fast maturating red fluorescent protein)에 관한 것으로, 본 발명에 따른 적색 형광 단백질 FmRed는 바이오센서, 이중 리포터(dual reporter) 시스템이나 형광공명에너지전달(fluorescence resonance energy transfer, FRET)과 같은 형광 단백질 연동 혹은 연속반응 시스템의 이용에 크게 기여할 것이다.

리포터, 탐침자, 형광 단백질

Description

새로운 리포터와 분자 탐침자로서 빠르고 강한 형광이 유도되는 적색 형광 단백질 ＦｍＲｅｄ{Fast maturating red fluorescent protein, FmRed, as a novel reporter and molecular probe}

본 발명은 새로운 리포터와 분자 탐침자로서 빠르고 강한 형광이 유도되는 적색 형광 단백질에 관한 것으로, 보다 상세하게는 야생형 DsRed(Red Fluorescence Protein) 유전자의 N-말단에 3개의 아미노산인 MGS 및 C-말단에 5개의 아미노산인 CGSPG이 연장되어 이루어지는 적색 형광 단백질 FmRed(fast maturating red fluorescent protein)에 관한 것이다.

형광단백질은 일정한 파장의 빛을 받을 경우 이를 흡수하여 활성화된 뒤 다시 정상상태로 되돌아가는 과정에서 특정 파장의 빛을 발산하여 형광을 띄는 단백질들을 말한다. 이러한 형광단백질은 특히 생명공학 연구에서 중요하게 이용되는데 특성분석이 필요한 단백질의 N- 혹은 C- 말단 부위에 결합시켜 목표로 하는 단백질의 발현과정이나 세포내 위치 등을 쉽게 파악할 수 있다. 뿐만 아니라 세포내에서의 안정성이나 발현 양을 결정하는 과정에서도 일반적으로 이용되어지며, 의학적인 관점에서는 암세포나 종양의 위치를 파악하는데 사용되기도 한다.

상기 형광단백질을 사용하는 경우처럼, 세포내-외의 생리-생태학적 변화를 쉽게 확인 할 수 있는 방법으로는 형광색소와 같은 화학물질이나 전구물질을 세포에 주입한 후 효소활성에 의존하는 방법도 있다. 상기 방법은 쉽고 정확하게 생리변화를 관찰할 수 있지만, 주입된 화학물질이나 전구체가 지닌 독성으로 인해 즉, 예를 들면 DNA가 복제되는 과정에서 돌연변이를 일으키거나 세포사멸을 유도하는, 많은 위험을 내포하고 있다.

그러나 형광 단백질은 기질이나 보조인자 없이 단백질 자체가 형광을 나타내기 때문에 대사체에 관한 영향이나 세포생리학적 인자들에 대한 간섭이 극히 드물다. 따라서 정상생리를 유지하는 살아있는 세포 상태에서도 특정 단백질의 이동과 활성 경로, 세포분열 및 분화과정 등을 관찰 할 수 있다. 이러한 특성으로 생체내의 생리현상을 시간차 없이 모니터링 하는 것에 있어 현존하는 어떤 방법보다도 우수한 리포터나 탐침자로 인정받고 있다. 다양한 탐침조건하에서 단백질 고유의 특정 파장의 빛에 의한 형광을 통해 세포나 생물체를 파괴하지 않고 내부에서 일어나는 복잡한 변화를 직접 관찰 할 수 있는 획기적인 기술이기 때문이다.

현재 일반적으로 사용되는 대표적인 형광단백질로는 녹색형광을 나타내는 GFP(green fluorescence protein)를 비롯해 적색의 RFP(red fluorescent protein), 청록색의 CFP(cyan fluorescent protein), 청색의 BFP(blue fluorescent protein), 황색의 YFP(yellow fluorescent protein) 등 많은 종류의 형광 단백질들이 개발되거나 개량되어져 연구목적에는 물론, 상업적인 용도로도 이용되고 있다.

현재 개발되어 사용되고 있는 형광단백질의 형광유도과정은 매우 다양해 자 외선에서부터 가시광선에 이르는 거의 모든 영역의 파장을 여기에 사용할 수 있다. 이들 중 특히 사용하는 광원이 맨눈으로 직접 관찰이 가능하고 세포독성이 적은 적외선 근처의 파장을 이용하는 적색 형광 단백질(DsRed)에 대한 관심이 점차로 증가되고 있다.

상기 적색 형광단백질(DsRed)은 산호에서 유래된 적색 형광을 나타내는 것으로 기존에 알려진 형광단백질들과 비슷한 구조를 갖는다. 일반적으로 형광단백질은 접힌 β-sheet의 원통형 구조 내부에 형광 발색단이 있는 견고한 3차 구조를 갖는다. 그러나 적색 형광단백질(DsRed)의 경우 이러한 원통형 구조 4개가 모여 하나의 단백질로 조립되어 적색 형광을 나타낸다. 상기와 같은 특성 때문에 매우 안정적이며 다른 형광단백질에 비해 높은 파장의 여기와 방출 값을 지니므로 육안으로 쉽게 확인할 수 있다. 따라서 다른 형광단백질의 여기 파장이 주로 낮은 영역대의 자외선에 의존해 발생되는 문제, 즉 생체 내 주요 분자인 핵산이나 지방산, 또는 아미노산 잔기의 손상을 최소화할 수 있는 장점을 갖는다.

또한 광표백(photobleaching) 현상에 비교적 강한 저항성을 지녀 발색시간이 길며 반복실험에서도 재현성이 있고, pH 조건에도 우수한 특성을 지녀 pH 5 내지 12 인 환경에서도 형광을 낼 수 있다. 따라서 물리 및 화학적으로 매우 안정적이고 변성제나 유기용매에도 강한 내성을 지닌 것으로 알려져 있다. 이러한 장점들로 인해 적색 형광단백질(DsRed)의 이용이 선호되지만, 4개의 단량체들이 모여 하나의 단백질을 형성하므로 다른 형광단백질보다 활성(4차)구조 형성에 오랜 시간(slow maturation time)이 걸리는 단점을 지닌다. 이러한 4차 구조 형성과 활성구조 형성 시간이 느린 단점을 보완하기 위해 하기 표 1에 예시 하는 것과 같이 많은 변이체들이 보고되었다.

특히, 적색 형광단백질(DsRed)의 빠른 발현을 위해 다른 형광단백질과 유사하게 단량체(monomer)로만으로 형광을 나타내는 변이체에 대한 결과가 보고되어 있으나 양자 수율(quantum yield)이 낮고, 야생형 DsRed의 장점이었던 광표백(photobleaching) 현상에 안정적인 특성이 소실된다는 문제점이 있는 것으로 분석되었다.

지금까지 알려진 야생형 DsRed를 주형으로 변형을 유도한 변이단백질의 대부분은 형광단(fluorophore) 형성에 관여하거나, 주변의 아미노산을 일부 치환하여 모든 형광단백질의 원형으로 추정되는 녹색 형광단백질(Green Fluorescent Protein, GFP)과의 차이를 이용한 방법, 즉 진화과정에서 짧아진 말단의 아미노산 결핍을 보완하는 임의 연장으로 신장(elongation)을 이용한 방법이다.

상기 방법으로 얻어진 변이단백질들은 빛을 받아들이는 형광단자의 구조가 미묘하게 달라져 다른 파장의 빛을 흡수하고 방출하여 다른 색의 형광능을 나타내기도 하나 근본적으로는 적색계열의 파장을 갖는다. 하지만 단량체로의 유도과정을 위해 녹색 형광단백질(Green Fluorescent Protein, GFP)과 같은 dimension(아미노산 길이와 유사한 서열)을 도입함으로써 4차 구조가 지닌 구조적 안정성 특히, 광표백(photobleaching) 현상에 대한 내성의 소실 및 양자 수율의 저하를 야기하는 문제점을 가지고 있다.

따라서 본 발명에서는 DsRed가 지닌 구조적 특성, 즉 4차 구조를 파괴하지 않고 빠르게 성숙되며 양자 수율 및 광표백 현상에 우수한 내성을 가지는 새로운 적색 형광 변이단백질을 제조하고 그 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 4차 구조가 지닌 구조적 안정성으로 양자 수율 및 광표백현상에 우수한 내성을 가진 새로운 적색 형광 변이단백질 및 상기 새로운 적색 형광 변이단백질의 유전자를 제공하고자 한다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 새로운 적색 형광 단백질 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환 미생물을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명의 목적은 리포터(reporter) 또는 융합 태그(fusion tag)로서 상기 새로운 적색 형광 변이단백질을 포함한 융합단백질을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명의 목적은 리포터(reporter) 또는 융합 태그(fusion tag)로서 상기 새로운 적색 형광 단백질 유전자를 포함하는 바이오센서 및 오페론 트랩 벡터(trap vector)를 제공하고자 한다.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 야생형 DsRed(Red Fluorescence Protein) 유전자의 N-말단에 3개의 아미노산인 MGS 및 C-말단에 5개의 아미노산인 CGSPG이 연장되어 이루어지는 적색 형광 단백질 FmRed(fast maturating red fluorescent protein)를 제공한다.

본 발명은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 적색 형광 단백질 FmRed(fast maturating red fluorescent protein)을 제공하며, 상기 서열번호 2 에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 서열번호 1에 기재된 염기서열로 이루어지는 적색 형광 단백질 FmRed(fast maturating red fluorescent protein) 유전자를 제공한다.

본 발명은

a) 야생형 DsRed의 결함 유전자에 대해, 결함 유전자 중 3 내지 10개의 아미노산이 추가된 무작위 조합 프라이머로 중합효소연쇄반응을 수행하여 변이 유전자 라이브러리를 구축하는 단계;

b) 구축된 라이브러리를 각각 세포 내로 도입하여 개별 변이단백질을 선별 후 발현하는 단계; 및

c) 상기 발현된 변이단백질에서 야생형 DsRed에 비해 빠른 형광 및 진한 적색을 보여주는 목적하는 변이단백질을 선발하는 단계; 를 포함하는, 신장 돌연변이(elongation mutagenesis) 중합효소연쇄반응을 이용한 적색 형광 단백질 FmRed(fast maturating red fluorescent protein)의 제조 방법을 제공한다.

이하, 첨부된 도면을 참조하면서 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명의 주형으로 이용한 DsRed는 적색 형광을 나타내는 해양생물 유래 단백질이며 약 28 KDa의 단량체 네 개가 모인 테트라머(tetramer) 구조를 이룬다. 상기 DsRed의 본질적인 문제점으로써 느린 발현시간을 개선하고, 상대적으로 빠른 형광을 보이나 양자 수율이 낮고 광표백 현상에 민감한 DsRed 변이체(주로 monomer)들이 지닌 단점을 보완하기 위하여, 기본적으로 4차 구조를 유지시키되 빠른 성숙과정과 높은 형광율을 유도하기 위해 양쪽 말단 부위를 무작위적으로 늘리는 과정 으로 제작된 돌연변이 라이브러리를 이용한다.

보다 구체적으로 상기 돌연변이 라이브러리는 야생형 DsRed 유전자의 양쪽 말단에 개시코돈(ATG) 및 종결코돈(TAG)이 제거되고, 상기 개시코돈 다음의 염기가 프래임 쉬프트(frame shift)가 된 야생형 DsRed 결함 유전자에 대해, 3 내지 10개의 아미노산이 추가된 프라이머로 중합효소연쇄반응을 수행하여 돌연변이 유전자 라이브러리를 제작한 것으로, 도 2를 참조한다.

상기 3 내지 10개의 아미노산이 추가된 프라이머는 상기 야생형 DsRed의 결함 유전자의 양쪽 말단에 개시코돈(ATG)과 종결코돈(TAA)을 포함하고 각각 NNN으로 치환된 염기서열을 갖는 것으로 보다 구체적으로 랜덤 프라이머(N-말단 프라이머, 5'-ATG NNN (NNN)n A GCC TCC TCC G-3'; C-말단 프라이머, 5'-TAA (NNN)n CAG GAA CAG G-3')를 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하였다.

상기 구축된 라이브러리를 각각 세포 내로 도입하여 개별 변이단백질을 선별 하여 발현 시킨 후, 발현된 변이단백질에서 야생형 DsRed에 비해 형광 발현시간이 10 내지 12 시간으로 빠른 형광 및 진한 적색을 보여주는 목적하는 변이단백질을 선발하였다.

보다 구체적으로 상기 선별된 변이단백질과 야생형 DsRed과의 특성 차이를 비교하기 위해 LB 고체배지에서 연속작업으로 활성화 시킨 후 같은 조건에서 배양하며 맨눈과 핸드 UV 램프를 이용하여 발현 정도를 분석한 결과, 변이단백질이 대략 12시간 내외에서 형광을 띄는 반면에 야생형 DsRed는 불균일한 편차를 보이는 동시에 적어도 20 내지 24시간 이상의 시간이 경과한 후 형광이 나타나는 것으로 확인되었다. 도 3을 참조한다.

또한, 각각을 LB 액체 배지에서 배양하며 시간별로 시료를 취해 형광을 분석한 결과에서도 편차는 있지만 야생형 DsRed와 변이단백질이 동일한 발현 양은 동일 하였으나 선별된 변이단백질이 야생형 DsRed에 비해 월등이 향상된 형광능을 확인하였다. 즉, 동일 양을 로딩한 네이티브-겔에서 변이 단백질의 경우, 붉은 색 단백질 밴드가 뚜렷이 관찰되나 야생형 DsRed의 경우 육안은 물론 UV 램프를 이용하여도 불분명한 밴드 형태를 보여, 성숙과정이 촉진되었을 뿐만 아니라 양자 수율도 크게 향상되었음을 확인하였다. 이를 다시 시간대별로 배양하며, IPTG로 단백질 발현을 유도한 경우와 그렇지 않은 경우로 구분해 유세포 분석기로 성숙되는 시간을 측정한 결과 고체배지의 결과와 같이 본 발명에 따른 변이단백질의 향상된 성숙과정이 확인되었다.

따라서 본 발명에 따른 변이단백질의 경우, 돌연변이 효과가 발현율 증가가 아닌 성숙과정이 촉진되어 빠른 형광을 보이는 것으로, 야생형 DsRed로 측정할 수 없는 적은 양의 시료로도 빠른 시간 내에 단백질의 발현 여부를 확인할 수 있는 것이 검증되었다. 도 4를 참조한다.

상기 선별된 빠른 성숙과정을 보이는 클론에서 발현되는 단백질을 적색 형광 단백질 FmRed(fast maturating red fluorescence protein)로 명명한 후, 전체 염기서열 분석을 통해 N-말단과 C-말단에 각각 3개와 5개의 아미노산이 추가된 변이체임을 확인하였다. 보다 구체적으로 본 발명에 따른 선별된 변이단백질은 야생형 DsRed(Red Fluorescence Protein) 유전자의 N-말단에 3개의 아미노산인 MGS 및 C- 말단에 5개의 아미노산인 CGSPG이 연장되어 이루어지는 적색 형광 단백질 FmRed(fast maturating red fluorescent protein)인 것을 특징으로 한다. 도 1을 참조한다.

본 발명에 따른 적색 형광 단백질 FmRed 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된, 수탁번호 KCTC11464BP로 기탁된 것인 형질전환 미생물을 제공한다.

보다 구체적으로 본 발명에 따른 선별된 적색 형광 단백질 FmRed을 다시 pTrc99A 플라스미드에 재도입하는 과정을 반복하여 선별에 기준이 된 우수한 특성및 활성이 유지되는 재조합 플라스미드(pFmRed)를 E. coli XL1-Blue에 도입한 형질전환 된 균주(E. coli XL1-Blue[pFmRed])를 대전광역시 유성구 어은동 52번지 생명공학연구원 유전자 자원센터에 소재하는 국제기탁기관인 유전자은행에 2009년 2월 10일자로 수탁하여 수탁번호 KCTC11464BP를 부여받았다.

본 발명은 리포터(reporter) 또는 융합 태그(fusion tag)로서 본 발명에 따른 적색 형광 단백질 FmRed 유전자를 포함하는 융합단백질을 제공한다.

보다 구체적으로, 야생형 DsRed 및 본 발명에 따른 변이단백질 모두를 동일한 조건에서 융합 태그나 활성이 있는 프로모터 뒤에 리포터로 장착해 시험한 결과, DsRed의 융합 태그로서의 특성은 변이단백질 FmRed에서도 동일하게 관찰되었으며, 리포터로서도 야생형 DsRed에서 관찰이 불가능한 시간과 세포 양으로도 10 내지 12시간 내에 탐침이 가능한 것으로 확인되었다.

또한, 본 발명은 리포터(reporter) 또는 융합 태그(fusion tag)로서 본 발명 에 따른 적색 형광 단백질 FmRed 유전자를 포함하는 바이오센서 및 오페론 트랩 벡터(trap vector)를 제공한다.

보다 구체적으로 본 발명에 따른 오페론 트랩 벡터(trap vector)인 pBGR1 프로모터 트랩 벡터(pBGR1 promoter trap vector)의 경우, 서로 마주보도록 두 개의 형광단백질 리포터를 위치시키는데 녹색 형광단백질의 리포터 방향에 트랩 된 프로모터나 조절인자들에 의한 기능의 발현은 10시간 내외에서 모니터링이 가능할 뿐만 아니라, 반대편에 트랩 되어 기능을 가진 조절인자나 프로모터를 리포터인 FmRed를 장착해 확인한 결과 10시간 내외에서 녹색 형광단백질과 같은 시간대에 맨눈으로 확인이 가능한 정도의 형광을 확인하였다. 상기 결과, 이중 리포터(dual reporter) 시스템이나 형광공명에너지전달(fluorescence resonance energy transfer, FRET)과 같은 형광단백질 연동 혹은 연속반응 시스템에 실제 적용이 가능한 새로운 변이 단백질임을 최종 확인하였다.

본 발명에 따른 적색 형광 단백질 FmRed은 야생형 DsRed 보다 빠른 시간 내에 강한 형광을 지닌 것으로, 기존의 야생형 DsRed의 용도범위 뿐만 아니라 새로운 감도와 신속도를 지닌 특성으로 인해 유전자 클로닝, 프로모터 트랩, 융합단백질 제작, 세포내 단백질 이동, 단백질 상호작용, 산소존재 여부의 측정은 물론 이스트 투 하이브리드(yeast two hybrid), 형광공명에너지전달 시스템을 포함한 다양한 바이오센싱 분야에 폭넓게 이용할 수 있다.

본 발명에 따른 적색 형광 단백질 FmRed은 DsRed의 치명적인 단점을 보완했 을 뿐만 아니라 그동안 개량되어 보고된 변이체들의 단점까지 보완되어진 것으로, 다양한 세포생리, 면역, 공학, 의학 분야에 적용함으로써 보다 높은 효율과 신뢰도를 빠른 시간 내에 얻을 수 있을 수 있어 생명공학-생명과학 연구에 기여할 것이다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시 예에 의해 보다 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 아이디어와 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에 종사하는 업자에게는 명백한 것이다.

이 때, 사용되는 기술용어 및 과학용어에 있어 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미를 지닌다.

또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.

[ 실시예 1] 돌연변이 라이브러리 제작 및 빠른 형광을 보이는 클론 선별

빠르게 형광이 유도되고 감도가 높은 변이원의 선별을 위한 돌연변이 라이브러리의 제작은 주문 제작된 프라이머들을 이용한 신장 돌연변이(elongation mutagenesis) 중합효소연장반응 방법으로 수행하였다. 이를 위해 우선 야생형 DsRed(Red Fluorescence Protein) 유전자를 pDsRed-N1(Clontech)으로부터 중합효소연장반응으로 증폭한 후 pTrc99A(pharmacia) 플라스미드의 NcoI과 HindIII 사이트 에 클로닝하였다. 상기 클로닝된 완전한 유전자의 구조물과 발현되는 단백질의 형광을 확인한 후 신장 돌연변이의 유발여부를 쉽게 확인하기 위해 기능이 복원 된 효소의 변이주를 선별하는 방법(Protein Eng. 2001, 14: 647-654)에 기초한 기능적인 결함(defeat)을 말단 부위의 베이스(base) 제거과정으로 유도하였다. 이는 DsRed 유전자를 pTrc99A 벡터에 재클로닝하는 과정에서 양쪽말단의 개시코돈(ATG)과 종결코돈(TAG)을 제거하는 동시에, 추가적으로 개시코돈 다음의 염기를 누락시키는 방법으로 프래임 쉬프트(frame shift)를 유발시킴으로써 구현할 수 있었다. 제작된 결함유전자의 경우, 적색형광 단백질의 기능이 소실된 것을 확인한 후 염기서열을 분석해 검증하였다.

제작된 결함 유전자 주형에 신장이 유도됨과 동시에 정상적인 오픈 리딩 플래임(open reading frame, ORF)을 회복할 수 있도록 다음과 같은 합성 프라이머(N-말단 프라이머, 5'-ATG (NNN)n AGCCTCCTCCG-3'; C-말단 프라이머, 5'-TAA (NNN)n CAGGAACAGG-3')를 도입해 중합효소연장반응을 수행한 후 서브 클로닝하는 방법으로 라이브러리를 제작하였다(도 2).

상기 제조된 변이 라이브러리 단백질의 경우 양 말단에 3 내지 10개의 펩티드가 연장되며 인위적으로 유도된 프래임 쉬프트가 교정되는 효과를 보여 형광을 띄는 클론을 선별하는 방법으로 쉽게 신장 돌연변이를 유도할 수 있었다. 제조된 변이 유전자를 포함한 재조합 플라스미드를 대장균 XL1-Blue에 형질전환한 후 준비된 라이브러리를 LB 고체배지에서 24시간 동안 배양하며 기능이 회복된 변이 효소를 일차 선별(4000 여개)한 후, 야생형 DsRed에 비해 빠른 형광을 나타내며 진한 적색을 보여주는 클론들을 최종 후보군으로 선별하였다. 그 중 10 내지 12시간 내외의 가장 빠른 발현시간을 보이며 DsRed에 비해 밝은 형광을 나타내는 클론을 최종 선별하였다.

상기 선별된 클론이 지닌 플라스미드를 분리한 후 포함된 유전자를 분리해 다른 플라스미드에 재도입하는 과정을 반복하여도 같은 결과를 보여주는 것이 확인되었다.

최종 선별된 클론을 37℃ 배양기에서 암피실린 50 ul/ml이 포함된 LB 고체 배지와 액체배지에서 배양하며 형광을 나타내는 시간을 측정한 결과, 도 3의 결과에서 확인 할 수 있듯이. 야생형 DsRed가 24시간 정도 배양해야 형광을 나타내는 반면에 최종 선별된 변이 단백질의 경우, 최소 12시간 최대 15시간 정도면 배양하는 콜로니에서 선명한 적색 형광을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 상기 선별된 클론의 유전자 염기서열을 분석한 결과 도 1의 염기서열 및 아미노산 서열에서도 확인 할 수 있듯이, 주형인 DsRed 서열 양쪽말단, 즉 N-말단과 C-말단에 각각 3개와 5개의 아미노산이 연장된 변이체임을 확인하였다. 이를 FmRed(fast maturating red fluorescence protein) 으로 명명하고 특성분석 실험을 진행하였다.

[ 실시예 2] 간섭물질과 대사물이 존재하는 조효소액(crude extract)에서의 형광특성

상기 실시예 1에서 선별된 변이 단백질인 FmRed의 특성을 일반적으로 형광단백질을 탐침자로 작동시키는 조건, 즉 간섭물질과 대사물, 다양한 단백질 가수분해 효소가 존재하는 조효소액(crude extract)에서의 성능을 야생형인 DsRed와 비교하 였다. 동일한 조건에서 비교하기 위해 야생형 DsRed과 변이단백질 FmRed의 완전한 오픈 리딩 플래임(open reading frame, ORF)만을 pTrc-99A 플라스미드에 NcoI과 HindIII 제한효소를 이용하여 pTrc-DsRed, pTrc-FmRed를 제작하였다.

다양한 배양조건에서 고체배지 상의 DsRed와 FmRed를 비교하였을 때 형광이 검출되기까지 DsRed가 발현의 편차를 보이며 FmRed에 비해 1.5 내지 2배 정도의 시간이 더 필요함을 확인하였다. 고체배지에 단백질 발현유도제로 IPTG를 첨가한 경우, 발현유도시간 차이는 줄어들었으나 3시간 정도의 차이는 여전히 존재함을 확인하였다.

상기 결과는 적색 형광단백질의 일반적인 검출방법, 즉 맨눈이나 UV 램프를 사용하는 경우에 모두 비슷하게 관찰되었다. 실제 용액에서의 단백질의 특성과 구조적 특성변화여부를 확인하기 위해 조효소액을 제조한 후 SDS-PAGE 와 네이티브 겔(Native-gel)로 분석한 후 겔 상에서의 형광특성을 비교하는 실험을 진행하였다.

실험에 이용한 세포는 IPTG로 단백질 발현을 유도하거나, 발현유도제를 첨가하지 않고 37℃에서 30시간 배양한 것을 각각 이용하였다. 세포를 파쇄하기 전에 전체 단백질내의 DsRed와 FmRed의 발현양을 전세포(whole cell) 상태에서 SDS-PAGE 로 비교하였을 때 뚜렷한 차이가 관찰되지 않았다. 따라서 형광증가나 빠른 성숙시간이 유도된 결과가 변이 단백질의 발현양의 차이에 의한 것이 아님을 검증할 수 있었다.

조효소액(crude extract)에서의 형광특성을 조사하기 위하여 조효소액을 다음 과정에 따라 준비하였다.

발현유도제를 첨가하지 않고 배양된 세포를 흡광도 값이 2.0이 되도록 희석하거나 농축하여 50 mM Tris-HCl 300 ul 로 3회 반복해 세척하였다. 10초 간격으로 펄스를 주고 50초 방치하는 과정으로 초음파를 처리해 세포를 파쇄한 후 13,000 rpm 4℃ 원심분리기를 이용하여 10분 동안 침전시켰다. 상기 원심 분리된 시료의 상층액만 회수하고 단백질의 총량을 측정하여 각 시료가 동일한 흡광도를 지니도록 보정한 후 50 mM Tris-HCl 용액으로 희석하였다. 각각의 샘플 14 ul 와 5X SDS 로딩 염료(loading dye) 4 ul, 1M DTT 2 ul를 섞고 100℃에서 10 분간 끓여 단백질의 변성을 유도한 후 SDS-PAGE에 100V 전압으로 2시간 동안 전기영동 하였다.

상기 로딩한 샘플시료를 겔 상에서 완전히 분리시킨 후 PAGE를 분리하여 4 시간동안 염색시키고 30% 메탄올, 10% 아세트산이 포함된 용액(destaining buffer) 에 담구어 탈색시켰다.

그 결과, 염기서열의 분석결과와 일치하게 야생형 DsRed의 크기인 28 KDa 근처에서 FmRed 의 뚜렷한 밴드를 확인 할 수 있었다.

안정적으로 발현된 FmRed의 형광세기를 동일한 조건의 DsRed 와 비교하기 위해 각각의 시료 16 ul 와 5X 네이티브 로딩 염료를 혼합한 후 SDS가 포함되어 있지 않은 비변성 겔에 100V의 전압으로 2시간 동안 전기 영동하였다. 전개정도를 확인하기 위해 로딩한 염료의 위치를 확인하여 전기영동 시간을 조절하여 전개 시킨 후 겔을 분리하여 3차 증류수에 세척하였다. 세척한 겔에 핸드 UV 램프를 조사하여 단백질 밴드의 위치를 확인하였다. 예상대로 4량체(tetramer)인 DsRed와 같은 위치에서 FmRed의 밴드를 확인 할 수 있었고, 같은 양의 단백질을 포함하고 있음에도 FmRed가 DsRed 보다 선명하고 밝은 형광을 보이는 것을 확인하였다. 따라서 변이 단백질 FmRed는 야생형과 같은 구조를 지니며 형광의 세기와 관련된 양자 수율이(quantum yield) 향상되었음을 확인하였다.

[ 실시예 3] FACS 를 이용한 DsRed 와 FmRed 의 생체 내 발현 시간 비교

보다 정확하게 클론내의 단백질 발현시간을 확인하기 위해 단일 콜로니를 암피실린 50 ul/ml가 포함된 LB 고체 배지에 접종하여 37℃에서 배양하며 DsRed와 FmRed의 시간에 따른 형광 발현정도를 확인하였다. 도 3의 결과에서 확인 할 수 있듯이, DsRed의 경우 21시간이 지나야 단일 콜로니에서 형광을 확인 할 수 있지만, FmRed는 15시간이 되기 전부터 단일 콜로니에서 형광을 확인 할 수 있었다. 따라서 FmRed의 발현시간이 DsRed에 비해 생체 내에서는 약 7시간 정도 빠른 것을 확인하였다.

고체 배지에서와 같은 조건으로 암피실린 50 ul/ml가 포함된 LB 액체 배지에 DsRed와 FmRed를 접종하여 37℃, 200 rpm 으로 진탕 배양하면서 2시간 간격으로 시료를 취해 네이티브 겔(Native-gel)에 로딩하여 형광이 나타나는 시간을 비교하였다. 회수된 각각의 시료의 세포 양을 같게 보정한 후 온화한 조건에서 파쇄하여 동일한 양의 단백질을 전기영동하였다.

그 결과, DsRed의 경우 배양 시작시간부터 8시간이 지나도록 형광 단백질을 확인 할 수 없었지만, FmRed의 경우는 미약하지만 2시간부터 형광을 확인 할 수 있고 시간이 지날수록 형광발현 정도가 급격히 증가하는 것을 확인하였다.

보다 정확한 결과를 얻기 위해 유세포 분석기(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS)를 이용해 최소의 세포를 접종한 후 시간별로 회수된 세포의 형광을 측정하였다. 그 결과, 도 4의 A에서 확인할 수 있듯이, 단백질 발현을 유도하지 않은 FmRed는 배양시간 20시간이 되었을 때부터 형광이 나타나는 것을 확인 할 수 있었다. 반면 같은 조건에서 DsRed는 42시간 동안 배양하여도 분명한 형광을 지닌 클론이 나타나지 않는 것으로 확인되었다.

또한, IPTG 첨가 없이 기본 레벨로 발현을 유도하는 경우, 세포생리나 배양조건에 따라 편차가 거의 없는 FmRed와 다르게 야생형인 DsRed의 형광 단백질 발현을 확인하기 어려운 경우가 발생해 발현을 유도한 후 단백질의 특성을 비교하였다. 단백질의 발현유도는 암피실린 50 ul/ml가 포함된 LB 액체 배지에 배양하며 세포의 흡광도가 0.4가 되었을 때 IPTG 1 mM을 첨가해 유도하였다. 이 후에 37℃, 200rpm 으로 진탕 배양하며 1시간 간격으로 시료를 취해 FACS 를 이용해 형광 발현이 나타나는 시간을 비교하였다. 그 결과, 도 4의 B에서도 확인 할 수 있듯이, DsRed는 배양시간이 8시간이 되었을 때부터, FmRed는 배양시간이 7시간이 되었을 때부터 형광이 나타나는 것을 확인 할 수 있었다. 과도한 유도체의 사용으로 과발현 된 단백질로 인해 발현시간의 편차는 없어졌지만 FACS의 결과와 같이 FmRed의 형광 피크(peak)가 DsRed에 비해 급격히 뒤로 밀린 것으로 보아 DsRed 보다 강한 형광을 발하는 것을 확인 할 수 있었다. 상기된 결과에서 세포배양시의 형광발현 시간은 접종한 세포의 상태, 접종양, 단백질 발현 유도의 유무에 따라 편차는 있었으나 보편적인 결과로서 빠른 성숙시간과 우수한 형광능을 지닌 FmRed의 특성은 분명하게 유지되는 것으로 확인되었다.

[ 실시예 4] 친화성 크로마토그래프를 이용한 DsRed 와 FmRed 분리정제

상기 실시예 1의 FmRed의 도입된 임의의 아미노산 잔기에 의한 단백질의 특성과 기능의 변화 여부를 확인하고 정확한 구조와 형광의 세기, 빛 안정성 등을 확인하기 위해 순수분리 정제를 시도하였다. 알려진 가장 일반적인 DsRed 정제방법은 N- 또는 C-말단에 히스-태그(His-tag)을 붙여 발현시킨 단백질을 Ni-NTA 컬럼으로 분리하는 방법이 주로 이용된다. 하지만 DsRed에 히스-태그(His-tag)을 연결할 경우 단백질 본연의 구조에 영향을 주게 되어 기능상으로 온전한 단백질의 활성을 확인하기 어렵다. 더구나 변이 단백질 FmRed의 경우, 양 말단이 연장된 단백질로서 이들의 효과가 부수적으로 붙인 태그에 의해서 상쇄되거나 다른 영향을 나타날 수가 있다. 따라서 온전한 구조의 단백질만을 선택적으로 분리하는 것이 매우 중요하다.

또한, 변이 단백질 FmRed의 원형인 야생형 DsRed는 구리와 약한 이온결합을 할 수 있는 것으로 알려져 있어 생체 혹은 시료내의 구리측정이 가능한 구리-바이오마커(Cu-Biomarker)로 이용된다. 이러한 특성은 단백질 구조내의 8개의 히스티딘(histidine) 과 1개의 시스테인(cysteine)이 구리와 결합 할 수 있기 때문인 것으로 알려졌으며 대부분의 히스티딘(histidine)과 시스테인(cysteine)이 4개의 단량체가 결합하여 만들어지는 4차 구조표면에 노출되어 있어 가능한 것으로 알려져 있다.

본 발명의 FmRed의 경우 기본적인 아미노산 서열은 DsRed와 같고 새로이 연장된 아미노산 서열 중 N-말단에 1개의 시스테인(cysteine)이 추가적으로 삽입된 형태이므로 DsRed와 기본적인 구조적 특성은 유사할 것으로 예상되었다. 이를 근거로 DsRed의 경우와 같이 구리가 부착된 금속 친화성 컬럼(metal affinity column) 을 이용해 분리정제를 시도하였다.

우선 금속이온이 부착되어 있지 않은 베어 레진(bare resin)(chelating sepharose, GE Healthcare)을 멸균된 3차 증류수를 이용하여 세척한 후 0.1 mM 황산구리(CuSO₄) 0.5 ml을 흘려보내 레진에 구리이온을 부착하였다. 이 후 하기 표 2의 조성을 가지는 약산성의 버퍼 5 ml을 이용해 결합되지 않은 구리와 염 성분을 제거하였다. 준비된 컬럼을 바인딩 버퍼(binding buffer) 5 ml을 흘려보내 평형에 도달시키고 같은 완충용액에 혼합된 FmRed 조효소액을 로딩하여 단백질의 부착을 유도하여 37℃에서 30분간 정치시켜 단백질의 결합을 유도한 후에 세척 완충액I 10ml을 흘려보냈다. 다음으로 세척 완충액II 10 ml을 추가로 흘려보내 결합하지 않은 단백질과 비특이적으로 약하게 결합된 불순물과 단백질을 제거한 후, 4 mM 이미다졸(immidazole)이 포함된 일루션(elution) 버퍼를 첨가하여 선택적으로 결합된 단백질을 회수하였다. 모든 과정의 유속(flow rate)은 1 ml/min 으로 고정하였고, 비교대상으로 야생형인 DsRed 단백질도 같은 과정으로 정제하였다. 정제 후에 분석 결과 도 5에서도 확인 할 수 있듯이, 단일과정으로 90% 이상의 순도를 지닌 단백질을 분리할 수 있었다.

[실시예 5] 순수분리 된 DsRed 와 FmRed 의 단백질 특성 비교

(1) DsRed와 FmRed의 양자수율 비교

일반적으로 밝혀진 야생형 DsRed는 558 nm 에서 최대 여기파장을 583 nm에서 방출파장을 갖는다. 야생형 DsRed에 비해 밝은 형광을 보이는 FmRed의 특성으로 다른 여기와 방출 파장을 갖는지 확인하기 위해 형광측정기(spectrofluorometer, LS55)를 이용하여 스캐닝을 하였다.

그 결과, 도 6에서 확인 할 수 있듯이, FmRed는 DsRed와 같은 패턴의 스팩트럼과 최대 형광 파장을 지님을 확인할 수 있었으며 동일한 단백질 농도에서 1.7-2배 정도의 형광 값을 보여 양자수율이 높게 향상되었음이 확인하였다. 따라서 상기 실시예 1에서 분리된 FmRed는 광표백(photobleaching)에 중요한 4차 구조는 유지되며 형광능과 성숙과정이 빨라진 변이 단백질임이 확인되었다.

(2) FmRed의 저장안정성

일반적으로 세포막이 파쇄 되어 용액이나 용매에 노출된 조효소액에서의 대부분의 단백질은 프로테아제(protease)에 의해 분해되고, 퀄리티 컨트롤에 의한 고유의 반감기를 갖기 때문에 단백질 본연의 기능을 잃는다. 본 실험을 진행하는 과정에서 형광이 유도된 전세포(whole cell enzyme)의 경우 고체배지 상에서 한 달 이상 본연의 색을 유지하고 있음이 확인되었고, 조효소액내의 단백질의 경우, 4℃ 에서 3 주가 지난 후에도 초기 형광능의 대부분이 유지되는 것으로 확인하였다.

(3) DsRed와 FmRed의 광표백 현상의 비교

리포터와 탐침자로서의 형광단백질은 반복된 실험에서나 특정한 파장의 일정한 빛을 장시간 조사하는 경우에 초기 형광능이 줄어드는 광표백 현상이 존재하며, 특히 단량체 혹은 이량체로 제작된 DsRed 변이체(표 1 참고)의 경우 야생형 DsRed가 지닌 우수한 광안전성이 대부분 소실되어 시간이 지남에 따라 급격히 형광이 감소되는 문제가 있는 것으로 알려져 있다. 상기 실시예 1에서 분리된 FmRed의 경우 야생형 단백질의 광안전성에 중요한 인자인 4차 구조가 유지되고 있어 광표백 현상은 나타나지 않았고, 같은 양의 단백질에 540 내지 560 nm의 빛을 조사하는 경우에, 환경에 따라 야생형 단백질에 비해 향상된 광안전성을 보여주는 것으로 최종 확인되었다.

[실시예 6] FmRed의 융합 태그와 리포터로서의 기능 평가

(1) 융합 태그로서의 기능성

형광 단백질은 주로 폴딩(folding), 위치(localization), 상호작 용(interaction) 리포터로 추적 혹은 특성을 알고자 하는 다른 단백질과 융합(fusion)된 상태에서 발현시키는 경우가 많다. 따라서 FmRed가 다른 단백질과 융합된 상태에서 발현되었을 경우 리포터로서 기능에 반드시 필요한 융합 능력과 안정성을 지녔는지를 확인하기 위해 여러 종류의 단백질과 융합을 시도하였다.

그 결과, 도 7의 A에서와 같이 플라스미드 pMAL-c2X에 EcoRI과 HindIII의 제한효소를 처리 후 클로닝을 하여 MBP 융합 단백질 형태로 발현시킨 경우, PAGE 결과에서 안정한 융합 단백질이 가용성으로 발현되고 있음을 확인하였고, 도 7의 B에서는 융합된 상태에서 동일한 양의 DsRed 융합 단백질과 유사하거나 약간 강한 형광세기를 보여주고 있어 대부분의 경우에서 야생형 DsRed와 같거나 우수한 융합능력을 지녔음이 확인되었다. 따라서 FmRed의 경우, 다른 단백질과 융합시킨 환경에서 필요한 리포터와 탐침자로의 기능에 전혀 문제가 없음을 확인하였다.

(2) 발현 인자 트랩 및 작동 리포터로의 이용

일반적으로 DsRed는 기능에 필요한 4차 구조를 만드는데 필요한 시간 때문에 다른 형광단백질(GFP나 YFP)들과 비교해 확연하게 차이나는 형광 발현시간을 지녀 같은 리포터 시스템에 함께 사용하기 어렵다는 단점을 갖는다. 즉, 녹색 형광단백질(Green Fluorescent Protein, GFP)이 생체조건에서 걸리는 숙성시간에 비해 상대적으로 긴 DsRed의 특성상 실시간으로 동시에 모니터링하려면 느린 DsRed의 발현시간이 전체모니터링시간을 결정하는 결과를 낳는다. 실제로 본 발명자들이 고안한 pBGR1 프로모터 트랩 벡터(pBGR1 promoter trap vector)의 경우 서로 마주보도록 두 개의 형광단백질 리포터를 위치시키는데 녹색형광단백질의 리포터 방향에 트랩 된 프로모터나 조절인자들에 의한 기능의 발현은 10시간 내외에서 모니터링이 가능하나, 반대편에 트랩 되어 기능을 가진 조절인자들이 경우 리포터인 DsRed가 발현되어 모니터링 되기까지는 24시간 이상을 필요로 한다. 즉, 라이브러리 내의 균주수가 많거나 콜로니가 작은 경우, 트랩 된 인자의 기능이 약한 경우에는 36 내지 48시간 이상이 지나서야 리포터로서의 동작여부를 확인할 수 있었다. 이들 트랩 벡터 시스템(trap vector system)에 새로이 제작된 FmRed를 장착해 동작여부를 확인한 결과 10시간 내외에서 녹색 형광단백질과 같은 시간대에 맨눈으로 확인이 가능한 정도의 형광을 냄으로써 이중 리포터(dual reporter) 시스템이나 형광공명에너지전달(fluorescence resonance energy transfer, FRET)과 같은 형광단백질 연동 혹은 연속반응 시스템에 실제 적용이 가능한 새로운 변이 단백질임을 최종 확인하였다.

도 1은 본 발명에 따른 적색 형광단백질 FmRed의 염기서열(A) 및 아미노산 서열(B)를 나타낸 것이고,

도 2는 본 발명에 따른 적색 형광단백질 FmRed의 클로닝을 위한 신장 돌연변이를 유도를 위한 무작위 말단 연장법을 모식화한 것이고,

(A: DsRed 유전자의 기능결함 유도, B: 기능이 회복된 라이브러리 제작)

도 3은 본 발명에 따른 적색 형광단백질 FmRed 클론의 형광발현 시간을 고체배지에서 확인한 결과이고,

도 4는 본 발명에 따른 적색 형광단백질 FmRed의 적색형광의 발현시간을 유세포 분석기를 이용하여 확인한 결과이고,

(A: 발현 유도제 없이 비교한 경우, B: IPTG 를 첨가한 후 비교한 경우)

도 5는 분리 후 정제된 본 발명에 따른 적색 형광단백질 FmRed를 SDS-PAGE(A) 및 네이티브-겔(B)에서 확인한 결과이고,

(1: pTrc-DsRed, 2: pTrc-FmRed)

도 6은 본 발명에 따른 적색 형광단백질 FmRed의 양자 수율을 확인한 결과이고,

(A: 여기 파장, B: 방출 파장)

도 7은 본 발명에 따른 적색 형광단백질 FmRed의 융합 안정성을 SDS-PAGE(A) 및 네이티브 겔(B)에서 발현을 확인한 결과이다.

(A; 1: size marker, 2: pMal-c2X, 3: MBP-FmRed, 4: MBP-DsRed, B; 1: pMal-c2X, 2: MBP-FmRed, 3:MBP-DsRed)

<110> Industry Foundation of Chonnam National University <120> Fast maturating red fluorescent protein, FmRed, as a novel reporter and molecular probe <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 702 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> FmRed <220> <221> gene <222> (1)..(702) <223> FmRed sequence <400> 1 atgggctcca cagcatcatc cgagaacgtc atcaccgagt tcatgcgctt caaggtgcgc 60 atggagggca ccgtgaacgg ccacgagttc gagatcgagg gcgagggcga gggccgcccc 120 tacgagggcc acaacaccgt gaagctgaag gtgaccaagg gcggccccct gcccttcgcc 180 tgggacatcc tgtcccccca gttccagtac ggctccaagg tgtacgtgaa gcaccccgcc 240 gacatccccg actacaagaa gctgtccttc cccgagggct tcaagtggga gcgcgtgatg 300 aacttcgagg acggcggcgt ggcgaccgtg acccaggact cctccctgca ggacggctgc 360 ttcatctaca aggtgaagtt catcggcgtg aacttcccct ccgacggccc cgtgatgcag 420 aagaagacca tgggctggga ggcctccacc gagcgcctgt acccccgcga cggcgtgctg 480 aagggcgaga cccacaaggc cctgaagctg aaggacggcg gccactacct ggtggagttc 540 aagtccatct acatggccaa gaagcccgtg cagctgcccg gctactacta cgtggacgcc 600 aagctggaca tcacctccca caacgaggac tacaccatcg tggagcagta cgagcgcacc 660 gagggccgcc accacctgtt cctgtgtgga tcccccgggt aa 702 <210> 2 <211> 233 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> FmRed <400> 2 Met Gly Ser Thr Ala Ser Ser Glu Asn Val Ile Thr Glu Phe Met Arg 1 5 10 15 Phe Lys Val Arg Met Glu Gly Thr Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly His Asn Thr Val Lys 35 40 45 Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu 50 55 60 Ser Pro Gln Phe Gln Tyr Gly Ser Lys Val Tyr Val Lys His Pro Ala 65 70 75 80 Asp Ile Pro Asp Tyr Lys Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp 85 90 95 Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Ala Thr Val Thr Gln 100 105 110 Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Cys Phe Ile Tyr Lys Val Lys Phe Ile 115 120 125 Gly Val Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met 130 135 140 Gly Trp Glu Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu 145 150 155 160 Lys Gly Glu Thr His Lys Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr 165 170 175 Leu Val Glu Phe Lys Ser Ile Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu 180 185 190 Pro Gly Tyr Tyr Tyr Val Asp Ala Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn 195 200 205 Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Thr Glu Gly Arg His 210 215 220 His Leu Phe Leu Cys Gly Ser Pro Gly 225 230

Claims (11)

1. 야생형 DsRed(Red Fluorescence Protein) 유전자의 N-말단에 3개의 아미노산인 MGS 및 C-말단에 5개의 아미노산인 CGSPG이 연장되어 이루어지는 적색 형광단백질 FmRed(fast maturating red fluorescent protein).
2. 제 1항에 있어서,

   상기 적색 형광단백질 FmRed은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 적색 형광 단백질 FmRed(fast maturating red fluorescent protein).
3. 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는, 적색 형광단백질 FmRed(fast maturating red fluorescent protein) 유전자.
4. 제 3항에 있어서,

   서열번호 1에 기재된 염기서열로 이루어지는 적색 형광단백질 FmRed(fast maturating red fluorescent protein) 유전자.
5. 제 3항 또는 제 4항에 따른 적색 형광단백질 FmRed 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
6. 제 5항에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환된, 형질전환 미생물.
7. 제 6항에 있어서,

   상기 형질전환 미생물은 수탁번호 KCTC11464BP로 기탁된 것인 형질전환 미생물.
8. 삭제
9. 리포터(reporter) 또는 융합 태그(fusion tag)로서 제 3항 또는 제 4항에 따른 적색 형광단백질 FmRed 유전자를 포함하는 융합단백질.
10. 리포터(reporter) 또는 융합 태그(fusion tag)로서 제 3항 또는 제 4항에 따 른 적색 형광단백질 FmRed 유전자를 포함하는 바이오센서.
11. 제 3항 또는 제 4항에 따른 적색 형광단백질 FmRed 유전자를 포함하는 오페론 트랩 벡터(trap vector).

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