KR100950064B1 - 탐침자 및 리포터로 활용 가능한 메타게놈 유래의 청색 형광단백질 ｍＢＦＰ - Google Patents

Abstract

본 발명은 탐침자 및 리포터로 활용 가능한 메타게놈 유래의 청색 형광단백질 mBFP(metagenome-derived blue fluorescent protein)에 관한 것으로, 상기 본 발명에 따른 청색형광 단백질 mBFP를 이용한 새로운 리포터 및 탐침 시스템은 기존의 광범위하게 활용되고 있는 단백질 자체를 활용한 탐침 시스템들이 갖는 근본적인 문제를 해결한 것으로, 다양한 세포생리, 면역, 공학, 의학 분야에 적용함으로써 보다 높은 효율과 신뢰도를 빠른 시간 내에 얻을 수 있을 수 있어 생명공학-생명과학 연구에 기여할 것이다.

탐침자, 리포터, 메타게놈

Description

탐침자 및 리포터로 활용 가능한 메타게놈 유래의 청색 형광단백질 ｍＢＦＰ {Metagenome-derived blue fluorescent protein, mBFP, applicable as the probe and reporter}

본 발명은 탐침자 및 리포터로 활용 가능한 메타게놈 유래의 청색 형광단백질 mBFP(metagenome-derived blue fluorescent protein)에 관한 것으로, 보다 상세하게는 생체 외부에서 기질의 첨가가 필요 없으며, 형광 단백질과 같이 형광을 발생하는 특수한 구조를 형성하는 시간 없이 산소가 없는 조건에서도 짧은 시간 내에 형광을 발생시키고 대장균에서 높은 발현율과 가성성을 갖는 신규한 메타게놈 유래의 청색 형광단백질 mBFP 및 이를 이용한 새로운 리포터 및 탐침 시스템에 관한 것이다.

생명과학과 관련된 많은 분야에서 다양한 단백질들이 환경 시료에 존재하는 화합물질 혹은 생체 내 혹은 외에서 생체 물질을 분석하기 위한 탐침자 또는 리포터로 활용되고 있다. 이러한 탐침자 또는 리포터 시스템은 크게 특정 기질 자체 혹은 기질이 효소 반응에 의해 분해 혹은 변형되어 나타나는 착색, 발색, 발광을 측정하는 방법과 형광이나 착색능을 지닌 단백질 자체를 관찰하는 것으로 구분할 수 있다. 전자의 방법들은 목적하는 단백질의 N-또는 C-말단에 융합된 형태로 단백질의 발현량, 프로모터의 세기 측정, 재조합 균체의 선별 등의 세포 내 관찰뿐만 아니라 웨스턴/노던 블랏팅, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)등의 세포 외 관찰에도 활용되고 있으며, 대표적인 예로는 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase), 퍼옥시다아제(peroxidase), 크산틴 옥시다아제(xanthine oxidase) 등의 효소와 기질로서 루미놀(luminol), 루시게닌(lucigenin), 아크리디늄 에스테르(acridinium ester), 비오틴(biotin), 플루오레세인(fluorescein), 디옥시제닌(dioxigenin) 등의 화합물이 이용되고 있다.

그러나 이들이 세포 내에서 발현될 경우 생체 내 대사경로들을 교란시켜 성장을 저해하거나 세포사멸을 유도하는 등의 위험성이 존재하는 단점을 갖는다. 또한 상기 효소들의 촉매 특성에 기인하는 문제뿐만 아니라 사용되는 기질의 낮은 안정성은 실험오차의 주요한 원인이 되며, 이들 대부분이 생물소재가 아닌 화학 합성물이기 때문에 세포에 유해할 수 있는 가능성이 있어 생체 내에서 지속적인 관찰이 어렵다는 단점도 상존한다. 따라서 전술한 효소 리포터의 대부분은 생체 내 보다는 생체 외 탐침에 주로 이용되고 있다.

단백질 자체가 탐침자인 대표적인 예로는 특정 파장의 빛을 받아 흡수하여 활성화된 형광단이 낮은 에너지를 지닌 정상상태로 되돌아가는 과정에서 방출되는 에너지가 빛의 형태로 나타나는 특성을 갖는 형광 단백질이 있다. 대표적인 예로는 해파리(jellyfish)인 Aequorea victoria로부터 유래한 녹색형광을 나타내는 GFP(green fluorescent protein)와, Discocosoma 종에서 유래한 DsRed(Discosoma red fluorescent protein)가 존재한다.

상기 형광 단백질은 기질이나 보조인자 없이 단백질 자체가 형광을 나타내기 때문에 전자의 경우처럼 대사교란 및 세포생리학적 인자들에 대한 간섭이 적어, 전자의 효소들이 활용되는 여러 탐침 분야와 그 외의 분야 즉, 효소 및 기질이 지닌 단점으로 인해 적용하기 힘든 분야에서도 활용이 가능하다. 특히 단백질이 특정 파장의 빛에 의해 생성하는 고유한 파장을 갖는 형광을 통하여 세포나 생물체를 파괴하지 않고 정상생리를 유지하는 살아있는 상태에서 특정 단백질의 이동과 활성 경로, 세포분열 및 분화과정 등과 같이 세포 내부에서 일어나는 복잡한 변화들을 직접 모니터링 하는 것에 있어 현존하는 어떠한 방법보다도 우수한 요소로 인정받고 있다. 또한 형광 단백질들은 β-barrel 구조 내부에 형광단이 있는 견고한 3차 구조를 갖는다. 상기 구조로 인해 물리화학적으로 매우 안정적이며 우수한 빛 안정성을 지녀, 넓은 범위의 pH, 온도 구간, 변성제나 유기용매 등이 존재하는 환경에서도 적용이 가능하며 반복적인 실험에서도 재현성을 유지할 수 있어 효소 탐침자에 비해 안정적인 실험 결과를 얻을 수 있는 장점이 있다.

또한, 단백질 공학 기술을 활용하여 야생형 형광 단백질과 다른 파장의 빛을 방출하도록 개량된 적색의 RFP, 노란색의 YFP, 청록색의 CFP, 청색의 BFP 등을 조합하여 활용하는 경우에는 여러 현상들을 동시에 관찰할 수 있으며, 다른 파장의 빛을 방출하는 형광 단백질들이 인접하거나 융합된 형태로 발현되었을 때 일어나는 FRET(fluorescence resonance energy transfer) 현상을 활용하여 시료 내 특정 물질의 존재 여부 탐색, 단백질 간의 상호작용 관찰 등의 연구 목적에 다양하게 활용 될 수 있는 장점을 갖는다.

그러나 상기 GPF, YFP 및 CFP의 경우 조사하는 빛의 파장이 유사해 단일 파장의 빛을 이용하여 여러 파장의 형광을 동시에 측정할 수 있는 장점이 있으나, 방출되는 빛의 파장도가 GFP와 유사해 함께 사용하는 경우 각각의 형광을 측정하기 위해서는 고가의 장비가 필요한 단점이 있다. 또한, GFP 골격(scaffold)을 지닌 모든 단백질의 경우, 형광단을 구성하는 시간(maturation time)이 필요하여 발현 시점에서부터의 관찰이 어려운 단점과 구조 형성에 산소가 필요하기 때문에 무산소(anoxic) 환경에서 활용하기 어려운 단점, 산화과정에서 생산되는 활성산소(ROS)가 생체 물질(지방산, 아미노산, 단백질, 핵산)에 대한 잠재적인 독성을 지닌다는 문제점들로 인해 활용 범위가 크게 제한되고 있다.

이와 달리 청색형광을 갖는 BFP는 조사하는 빛의 파장과 방출하는 빛의 파장이 야생형인 GFP와 차이가 있어 위의 문제를 부분적으로 해결할 수 있으나, 빛 안정성 및 양자 수율(quantum yield)이 낮은 단점이 있어, 특성개량을 위한 많은 시도가 진행되어지고 있다.

이에 본 발명자들은 기존의 광범위하게 활용되고 있는 단백질 자체를 활용한 탐침 시스템들이 갖는 근본적인 문제를 해결하고자 지속적인 연구를 수행한 결과, 새로운 리포터와 탐침 시스템들의 개발하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 기존의 여러 리포터 및 탐침 시스템과 달리 생체 외부에서 기질을 첨가할 필요가 없고, 형광 단백질과 같이 형광을 발생하는 특수한 구조(fluoropore)를 형성하는 시간 없이 산소가 없는 조건에서도 짧은 시간 내에 형광을 발생시키고 대장균에서 높은 발현율과 가용성을 갖는 신규한 메타게놈 유래의 청색 형광단백질 mBFP(metagenome-derived blue fluorescent protein)을 제공하기 위한 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 리포터(reporter) 또는 친화성 태그(affinity tag)로서, 상기 청색 형광단백질 mBFP 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 사용하여 단백질 또는 유전자의 발현을 분석하거나 분리 정제하는 단계를 포함하는, 단백질 또는 유전자의 발현 분석 또는 분리 정제 방법을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명의 목적은 리포터(reporter) 또는 융합 태그(fusion tag)로서, 상기 청색 형광단백질 mBFP 유전자를 포함하는 융합단백질, 생리활성물질 측정용 바이오센서 및 NADPH 분석 키트를 제공하고자 한다.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 메타게놈 유래의 청색 형광단백질 mBFP(metagenome-derived blue fluorescent protein)을 제공한다.

본 발명은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하고, 서열번호 1에 기 재된 염기서열로 이루어지는 메타게놈 유래의 청색 형광단백질 mBFP 유전자를 제공한다.

본 발명은 상기 메타게놈 유래의 청색 형광단백질 mBFP 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된, 형질전환 미생물(수탁번호 KCTC 11593BP)을 제공한다.

본 발명에 따른 메타게놈 유래의 청색 형광단백질 mBFP는 생체 외부로부터 기질을 제공할 필요 없이, 생체 내 존재하는 대사물질을 이용하여 형광을 발생하는 점과 대사물질의 농도에 의존적으로 형광 세기를 갖는 특성이 있다.

또한, 본 발명에 따른 신규한 메타게놈 유래의 청색 형광단백질 mBFP는 형광 단백질이 형광을 발생하기 위한 특수한 구조(fluoropore) 형성 시, 소요되는 시간 없이 산소가 없는 조건에서도 짧은 시간 내에 형광을 발생시키며 대장균에서 높은 발현율과 가용성을 가지는 특성이 있다.

이하, 첨부된 도면을 참조하면서 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

최근에 염기서열 분석 기술의 발달로 많은 수의 원핵ㆍ진핵 생물의 전체 유전자 서열 및 지도가 보고되고 있으나, 소수의 비ㆍ난배양성 미생물의 전체 혹은 일부 유전체 지도를 제외하면 대부분이 배양 가능한 종에 제한된다. 따라서 환경 내에 존재하는 비ㆍ난배양성 미생물로부터 기존에 알려지지 않은 새로운 기능성 유전자의 탐색은 기존과 다른 특성을 갖는 단백질을 찾는데 있어 보다 효과적일 수 있다.

보다 상세하게는 토양으로부터 얻은 메타게놈을 본 연구실에서 개발한 양방 향성 탐침 시스템(pBGR1)을 활용하여 라이브러리를 제작한 후, 트랩된 프로모터의 빈도를 탐침자로 확인하는 방법으로 라이브러리의 가치를 평가하였고 새로운 리포터 또는 탐침자의 선별을 위해 UV 핸드 램프로 365 nm의 빛을 조사하여, 전형적인 탐침자의 형광(녹색과 적색)과 다른 특성을 지닌 청색형광을 나타내는 클론을 선별하였다.

상기 선별된 클론으로부터 분리한 메타게놈 단편은 약 10 kb의 크기로 약 5 kb의 줄어든 단편으로부터 청색 형광능을 확인한 후, 상기 단백질의 서열을 확인하기 위해 염기서열 분석, OFR 예측 및 발현된 단백질의 N-말단 서열 분석을 수행하였다. 그 결과 5 kb의 메타게놈 단편 내부에 존재하는 747 bp 크기의 유전자가 형광을 나타내는 단백질을 암호화하고 있음을 최종 확인하였고, 상기 단백질을 mBFP(metagenome-derived Blue fluorescent protein)로 명명하였다. 명명된 mBFP 유전자를 MBP(maltose binding protein)가 제거된 pDMAL-c2X에 클로닝해 준비된 플라스미드를 대장균 XL1-Blue에 도입한 형질전환 세균 대장균 XL1-Blue/pDMAL-mBFP를 대전광역시 유성구 어은동 52번지 생명공학연구원 유전자자원센터에 소재하는 국제기탁기관인 유전자은행에 2009년 11월 24일자로 수탁하여 수탁번호 KCTC 11593BP를 부여받았다.

상기 단백질 mBFP의 특성 및 기능을 예측하기 위해 염기 서열(서열번호 1)을 번역한 아미노산(서열번호 2)을 이용하여 모티브 검색을 수행한 결과, NADP Rossmann clan 내에 케토 그룹(keto group)을 히드록시기 그룹(hydroxy group)으로 환원시키기 위해 NADPH를 보조인자로 활용하는 단백질들이 갖는 KR doamin의 존재 가 가장 높은 점수로 예측 되었고, NADPH 및 단백질 mBFP와의 상호작용에 의해 짧은 시간 내에 형광이 나타나며, 첨가되는 NADPH 농도에 의존적으로 형광의 세기가 변하는 것을 확인하였다. 도 4 및 도 5를 참조한다.

본 발명은 리포터(reporter) 또는 친화성 태그(affinity tag)로서 상기 메타게놈 유래의 청색 형광단백질 mBFP 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 사용하여 단백질 또는 유전자의 발현을 분석하거나 분리 정제하는 단계를 포함하는, 단백질 또는 유전자의 발현 분석 또는 분리 정제 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 리포터(reporter) 또는 융합 태그(fusion tag)로서, 상기 메타게놈 유래의 청색 형광단백질 mBFP 유전자를 포함하는 융합단백질, 생리활성물질 측정용 바이오센서 및 NADPH 분석 키트를 제공한다.

보다 상세하게는 단백질 mBFP를 형광단백질의 중심 구조인 형광단을 형성하기 위해 요구되는 산소가 없는 절대 혐기 조건에서의 형광 여부를 확인하기 위하여 기존 일반적으로 활용되는 녹색 형광단백질(GFPuv) 및 붉은색 형광단백질(DsRed) 및 단백질 mBFP를 절대 혐기적인 조건에서 배양한 결과, 상기 녹색 형광단백질 및 붉은색 형광단백질에서는 형광이 검출되지 않은 반면, 단백질 mBFP는 청색 형광이 나타남을 확인하였으며, 목적하는 표적 단백질과 융합 후에도 본래의 형광을 유지하는 것을 확인할 수 있었다. 도 6 및 7을 참조한다.

상기 본 발명에 따른 메타게놈 유래의 청색 형광단백질 mBFP는 절대 혐기적인 조건에서, 형광단의 형성과 관계없이 생체내 NADPH 만으로 짧은 시간 내에 형광을 나타내는 특성 및 탐침자로서 목적하는 단백질과 융합한 형태로 발현을 시키는 경우, 녹색 형광단백질(GFPuv) 및 붉은색 형광단백질(DsRed)에 비해 형광을 나타내기 위해 필요한 성숙시간(maturation time)이 짧기 때문에 융합된 표적 단백질의 번역 및 접힘 과정, 세포내 위치나 기능 등의 추적이 보다 용이한 장점이 있다.

본 발명은 메타게놈 유래의 청색 형광단백질 mBFP 유전자를 포함하는 오페론 트랩 벡터(trap vector)를 제공한다.

보다 상세하게, 청색 형광단백질 mBFP 유전자를 프로모터의 세기를 측정하기 위해 루시퍼라아제를 사용하는 시스템과 유사한 방법으로 단백질 mBFP를 활용할 수 있는가를 평가하기 위하여 본 연구실에서 개발한 양방향 탐침 시스템의 역방향 탐침자인 붉은색 형광단백질(DsRed)을 mBFP로 치환하고, 녹색 형광단백질(GFPuv) 및 mBFP 유전자 사이에 다양한 프로모터를 동일한 방법으로 삽입하여 작동 유무 및 세기를 조사한 결과, 목적에 적합한 세기의 형광을 나타냄을 확인하였다. 도 8을 참조한다.

상기 본 발명은 메타게놈 유래의 청색 형광단백질 mBFP가 단백질 생산에 유리한 원핵생물, 즉 대장균에서의 높은 발현율과 가용성을 지니고 있어 알칼리성 포스파타제, 포스파타제 및 루시퍼라제와 달리 진핵세포를 발현숙주로 이용하지 않기 때문에 효율적이고 경제적인 생산이 가능한 장점이 있다.

본 발명에 따른 신규한 메타게놈 유래의 청색 형광단백질 mBFP는 기존의 여러 리포터 및 탐침 시스템과 달리 생체 외부에 기질을 첨가할 필요가 없으며, 형광 단백질이 형광을 발생하기 위한 특수한 구조(fluoropore) 형성시 소요되는 시간 없 이 산소가 없는 조건에서도 짧은 시간 내에 형광을 발생시킴으로써 유전자 클로닝, 프로모터 트랩, 융합단백질의 제작, 세포내 단백질의 이동 및 발현량 측정, two hybrid system 시스템 및 FRET 시스템을 활용한 단백질의 상호작용 관찰, 생리활성 진단 키트 및 바이오센서 등의 다양한 생체 내 혹은 생체 외 실험에 폭넓게 이용될 수 있는 장점이 있다.

또한, 본 발명에 따른 신규한 메타게놈 유래의 청색 형광단백질 mBFP는 대장균에서 높은 발현율과 가용성을 가짐으로써 융합 파트너 및 NADPH와의 결합능을 이용한 친화성 태그로서 단백질 분리 정제과정에도 활용할 수 있는 장점이 있다.

본 발명에 따른 신규한 메타게놈 유래의 청색 형광단백질 mBFP을 이용한 새로운 리포터 및 탐침 시스템은 기존의 광범위하게 활용되고 있는 단백질 자체를 활용한 탐침 시스템들이 갖는 근본적인 문제를 해결한 것으로, 다양한 세포생리, 면역, 공학, 의학 분야에 적용함으로써 보다 높은 효율과 신뢰도를 빠른 시간 내에 얻을 수 있을 수 있어 생명공학-생명과학 연구에 기여할 것이다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시 예에 의해 보다 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 아이디어와 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에 종사하는 업자에게는 명백한 것이다.

이 때, 사용되는 기술용어 및 과학용어에 있어 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미를 지 닌다.

또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.

[ 실시예 1] 토양 메타게놈 유래의 신규한 형광 단백질의 선별

토양으로부터 FastDNASPIN Kit(Bio101, USA)를 활용하여 메타게놈을 분리하고, 아가로스 겔에 전기 영동하여 토양에 포함되어 있는 불순물을 제거하였다. 상기 불순물이 제거된 메타게놈을 제한효소 Sau3AI(NEB, England)으로 절단한 후, 전기영동 하여 4 내지 10 kb에 해당하는 크기의 DNA 단편을 회수한 후 BamHI으로 절단한 벡터 시스템(pBGRI)에 클로닝하였다. 준비된 형질전환 균주를 항생제(50 ㎍/㎖의 암피실린)가 포함된 LB 고체 배지에 도말한 후 37℃에서 14 시간 배양해 라이브러리를 제작하였다. 프로모터와 같은 조절서열들이 트랩(trap)되는 빈도로 라이브러리를 평가한 후, 제작된 라이브러리에 핸드 램프로 UV(365 nm)를 조사하여 탐침 시스템으로 제작된 벡터에서 유래하지 않는 청색 형광을 갖는 클론을 선별하였다.

상기 선별된 청색 형광은 벡터의 양방향 탐침 시스템인 녹색 형광단백질(GFP)및 붉은색 형광단백질(DsRED)의 형광특성, 단백질의 크기 및 발현 양상 등과 뚜렷이 다른 것을 확인하였으며, 이는 새롭게 선별된 클론의 청색 형광이 탐침 단백질의 융합유도체이거나 변이체가 아님을 최종 확인한 결과인 것이다.

또한, 상기 선별된 클론을 37℃에서 14 시간 배양 후 365 nm의 UV를 조사한 결과, 눈으로 관찰할 수 있을 정도의 선명한 청색 형광을 보이는 것을 확인하였다.

[ 실시예 2] 선별된 클론의 염기서열 분석 및 ORF 의 추적

상기 실시예 1에서 선별된 클론으로부터 플라스미드를 분리하여 전기 영동한 결과, 약 10 kb의 메타게놈 단편이 삽입된 것을 확인할 수 있었다. 제한효소 지도를 근거로 서브 클로닝한 후, 형광을 지닌 단백질이 포함된 것으로 확인된 5 kb의 메타게놈 DNA 단편의 염기서열을 분석한 결과, 청색 형광을 보이는 단백질의 ORF(open reading frame)을 추정할 수 있었다.

상기 5 kb의 메타게놈 DNA 단편 내 존재하는 ORF 분석은 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 제공하는 ORF Finder를 이용하였으며, 그 결과 25.4 KDa 크기의 단백질의 크기 및 747 bp 길이의 ORF가 청색 형광을 갖는 단백질을 암호화 하고 있을 것으로 예측되었다. 상기 예측된 747 bp의 완전한 ORF를 얻기 위하여 NdeI 과 HindIII가 포함된 프라이머를 이용하여 중합 효소 연쇄 반응을 수행하였다.

상기 중합 효소 연쇄 반응으로 증폭된 747 bp의 ORF를 제한효소 NdeI과 HindIII로 절단하여 pMal-c2X 벡터 내 존재하는 MBP(maltose binding protein)를 제거한 플라스미드에 클로닝하여(pDMAL-mBFP) 대장균에 형질전환 하였다. 상기 형질전환 된 747 bp의 ORF를 포함한 재조합 형질전환 균주를 50 ㎍/㎖의 암피실린이 포함된 LB 고체 배지에 도말 후 37℃에서 14 시간동안 배양하였다. 상기 재조합 형질전환 균주가 1 내지 2 mm의 콜로니를 형성하였을 때 0.8% soft agar에 1 mM IPTG를 첨가해 도포한 후 37℃에서 1시간 동안 추가 배양하였다. 상기 배양된 콜로니들을 UV 핸드램프를 이용하여 365 nm의 UV를 조사하였을 때 각 콜로니들이 분명한 청 색 형광을 갖는 것을 확인할 수 있었고, 이는 예측된 747 bp 길이(서열번호 1)의 ORF가 청색 형광단백질을 암호화하고 있음을 확인한 결과이며, 선별된 신규한 청색 형광단백질을 mBFP(metagenome-derived blue Fluorescent protein)로 명명하였다.

[ 실시예 3] 신규한 청색 형광단백질 mBFP 의 크기 및 형광 특성의 확인

상기 실시예 2에서 이론적으로 예측한 단백질의 크기와 발현된 단백질 mBFP의 크기가 일치되는가를 확인하기 위하여, 단백질의 크기를 확인 할 수 있는 SDS-PAGE를 수행하였다.

상기 실시예 2의 pDMAL-mBFP 재조합 형질전환 균주를 50 ㎍/㎖의 암피실린이 포함된 5 ㎖의 LB 액체 배지에 접종하여, OD₆₀₀ 에서 값이 2.0의 시점에서 세포를 회수 한 후 50 mM Tris-HCl 300 ㎕로 3회 반복 세척하였다. 상기 세척된 세포를 초음파 분쇄기를 이용하여 10 초간 초음파를 적용하고 50초간 정치하는 조건으로 세포를 파쇄한 후 13,200 rpm, 4℃에서 10분간 원심 분리하여 비가용성 물질을 침전시켜 상등액만을 수득하였다. 상기 수득한 상등액 14 ㎕와 5×SDS loading dye 4 ㎕, 1M DTT 2 ㎕를 혼합하여, 100℃에서 10분간 끓인 후 SDS-PAGE에 100 V 전압으로 2시간 동안 전기영동한 후 겔을 염색한 결과, 도 2의 A에서도 확인할 수 있듯이, 예측한 ORF로부터 번역된 아미노산 서열로부터 이론적으로 계산한 크기와 mBFP의 크기가 유사함을 확인하였다.(Lane 1: size marker, Lane 2: pMAL-c2X, Lane 3: pDMAL-mBFP)

또한, 발현된 단백질 mBFP를 코딩하고 있는 유전자를 지닌 클론들이 청색 형 광을 나타내는 것이 단백질 mBFP인가를 명확히 판단하기 위하여, 앞서 준비한 시료 16 ㎕와 5×native loading dye를 혼합한 후 SDS가 포함되어 있지 않은 비변성 겔에 100 V의 전압으로 2시간 전기영동한 후 유리판과 겔을 분리하여 50 mM Tris-HCl 로 세척 후 UV 핸드 램프로 345 nm의 UV를 조사하였다. 그 결과 도 2의 B에서도 확인할 수 있듯이, 녹색 형광단백질(pTrc-GFPuv)및 붉은색 형광단백질(pTrc-FmRed)과 마찬가지로 형광을 나타내는 mBFP를 관찰하였다.(Lane 1: pDMAL-mBFP, Lane 2: pMAL-c2X, Lane 3: pTrc-GFPuv, Lane 4: pTrc-FmRed)

[ 실시예 4] 신규한 청색 형광단백질 mBFP 의 순수분리

(1) 이온 교환 크로마토그래프를 이용한 단백질 mBFP 의 순수 분리

일반적으로 단백질의 정제는 단백질 표면의 전하, 3차 구조와 모양, 소수성 등의 특성을 이용하거나 친화성 태그를 융합하는 방법을 활용하여 정제할 수 있다. 그러나 메타게놈 유래의 단백질 mBFP는 염기서열 분석 후에 NCBI data base에 존재하는 단백질들과 비교 분석한 결과, 기존에 알려진 단백질들과의 유사성이 낮아, 단백질의 특성 및 융합 가능성을 예측하기 어려웠다.

따라서 특성을 모르는 단백질의 일반적인 정제 과정으로써 음이온 교환수지(anionic-exchange column), 양이온 교환수지(cation-exchange column) 및 분자크기별 분해능을 지닌 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 반복적으로 수행하여 다음과 같은 방법으로 단백질을 정제하였다.

50 ㎍/㎖의 암피실린이 포함된 LB 고체 배지에서 mBFP 단일 콜로니를 같은 조건의 5 ㎖ LB 액체 배지에 접종하여 37℃, 200 rpm의 조건으로 16시간 동안 진탕 배양하였다. 상기 진탕 배양된 배양액의 OD₆₀₀ 값이 2.0 에 도달하였을 때, 본 배양으로 1 ℓ의 LB 액체배지에 배양액 1 ㎖을 접종하여 동일한 조건에서 16시간 동안 배양 후 고속 원심분리기를 이용해 세포를 회수하였다. 상기 회수한 세포를 50 ㎖ binding buffer(20 mM Tris-HCl, pH 8.0)에 현탁한 후, 초음파 분쇄기를 이용하여 저온에서 10초 동안 초음파를 가하고 50초 동안 정치하는 과정을 10회 반복하여 세포를 파쇄하였다. 상기 파쇄된 세포를 고속 원심분리기를 이용하여 녹지 않는 세포의 찌꺼기 및 비 가용성 물질들을 제거한 후 가용성 단백질이 포함된 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액에 잔존하는 단백질 이외의 염색체와 다당류 등의 거대 분자들의 제거를 위하여 20 ㎖ 당 1 g의 CDR(cell debris remover)을 첨가하여 저온에서 10분간 혼합한 후, 고속 원심분리기 및 0.45 um의 실린지 필터(syringe filter)를 이용하여 CDR 및 고분자 불순물들을 제거하였다. 상기와 같이 전 처리된 세포 파쇄액에 10배 부피의 binding buffer를 첨가하여 희석하였다.

상기 희석된 세포 파쇄액으로부터 단백질 mBFP를 정제하기 위하여, 음이온 교환수지(HiTrap Q HP, GE Healthcare, 5 ㎖)가 평형에 도달하도록 50 ㎖의 binding buffer로 세척하였다. 음이온 교환 수지가 평형에 도달했을 때 준비한 세포 파쇄액을 2 ㎖/min 의 유속으로 흘려보내 단백질 부착을 유도한 후, 100 ㎖의 세척 버퍼(20 mM Tris-HCl, pH 8.0)를 4 ㎖/min의 유속으로 흘려보내 컬럼에 결합되지 않은 단백질과 비 특이적으로 약하게 결합된 불순물들을 제거하였다. 다음으로 같은 유속으로 elution buffer(20 mM Tris-HCl, 0.1 M NaCl, pH 8.0)를 흘려보 내 음이온 교환 수지에 흡착된 단백질들을 회수하였다. 이 때, 각각의 과정에서 흘러나온 용액을 모두 회수하여, 단백질 mBFP의 흡착 유무를 확인하였다. SDS-PAGE 분석을 통해 단백질 mBFP가 회수된 분획구간을 확인하고, 비 특이적인 단백질 상호작용을 줄이기 위해 첨가된 고농도의 염화나트륨을 제거할 목적으로 MWCO(molec㎕ar weight cut-off)가 10 KDa인 필터를 이용하여 버퍼를 교환하였다. 염화나트륨이 제거된 단백질 용액을 다시 50배의 binding buffer에 희석시키고 위의 방법과 동일하게 양이온 교환수지(cation-exchange column)에 적용하여, 분획별로 회수된 용액을 SDS-PAGE로 확인한 결과, 도 3에서도 확인할 수 있듯이 단백질 mBFP를 순수 분리할 수 있었다.(Lane 1: size marker, Lane 2: original clone screened, Lane 3: purified mBFP)

그러나 음이온 교환수지로 단백질을 회수하였을 때와 달리, 양이온 교환수지를 통해 순수 분리된 단백질의 형광이 급격히 감소하거나 사라지는 것을 관찰할 수 있었다.

[ 실시예 5] 신규한 청색 형광단백질 mBFP 의 아미노산 서열 분석

(1) LC - MS / MS 을 이용한 분자량 측정과 N-말단 아미노산 서열분석

순수분리 과정을 통해 얻은 단백질 mBFP의 아미노산 서열이 상기 실시예 2에서 이론적으로 예측했던 크기와 서열이 일치하는지 확인하기 위해 LC-MS/MS 및 N-말단 아미노산 서열 분석을 수행하였다. LC-MS/MS 를 이용하여 mBFP의 전체 분자량을 측정하였을 때, 상기 실시예 2에서 예측한 ORF로부터 번역된 단백질의 크기인 25.4 KDa와 일치하였으며, N-말단 아미노산 서열분석에서도 역시 예측한 ORF로부터 번역된 아미노산(서열번호 2)과 동일한 서열을 확인하였다.

[ 실시예 6] 신규한 청색 형광단백질 mBFP 의 기능 유추

(1) in silico 예측을 통한 청색 형광단백질 mBFP 의 기능 유추

상기 실시예 2에서 예측했던 선행 결과를 통해 단백질 mBFP를 암호화하는 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열을 확인할 수 있었다. 하지만 양이온 교환수지에서 사라지는 형광능을 회복을 위해 시도된 다양한 물리화학적인 접근법(pH, 산화제와 환원제 처리 등)에서 만족할 만한 결과를 얻을 수 없었다. 따라서 진화유연관계의 추적과 모티브의 분석을 통해 기능과 관련된 구조적인 특성의 분석을 시도하였다. 일반적으로 구조/기능 유추를 위해 NCBI의 BlastP를 이용하지만, 앞서 언급한 것과 같이 단백질의 1차 구조인 아미노산 서열로 비교하였을 때 높은 유사성을 갖는 단백질이 검색되지 않았다. 단백질의 진화 과정은 크게 확산진화(divergent evolution)와 수렴진화(convergent evolution)로 구분할 수 있으며, 전자의 방법을 통하여 진화된 단백질의 경우 1차 구조인 아미노산 서열에 차이가 존재하더라도, 구조적인 유사성이 존재한다. 이러한 점에 착안하여 단백질 mBFP의 아미노산 서열이 아닌 구조적인 모티브의 검색을 시도하였다. 모티브의 검색은 ExPASy Proteomics Server의 'pattern and profile searches' 프로그램 중 ‘MotifScan'을 이용하였다.

도 4에서도 확인할 수 있듯이, 검색 결과 mBFP 내부에 NADP Rossmann clan 내에 케토 그룹(keto group)을 히드록시기 그룹(hydroxy group)으로 환원시키기 위해 NADPH 를 보조인자(cofactor)로 활용하는 단백질들이 지닌 KR domain의 존재가 가장 높은 점수로 예측되었다. 이 예측을 바탕으로 단백질 mBFP와 NADPH 및 형광특성과의 상관관계를 확인하였다.

(2) NADPH 의존적인 청색 형광단백질 mBFP 의 기능 규명

상기 in silico에서 예측한 단백질 mBFP와 NADPH 및 형광특성과의 상관관계를 시험관내 시험을 통해 확인하기 위하여, 형광이 사라진 순수 분리된 3 ㎕ mBFP solution 에 20 mM Tris-HCl(pH 7.8) 9 ㎕와 10 mM NADPH 1 ㎕를 혼합하여 37℃에서 30분 동안 반응시켰다.

그 결과 도 5의 A에서도 확인할 수 있듯이, 양이온 교환수지를 통과하며 사라졌던 형광능이 회복되는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 아미노산인 타이로신, 페닐알라닌 및 트립토판처럼 방향족 부분을 갖는 분자들이 낮은 형광을 보이듯이, 방향족 부분을 갖는 NADPH 역시 형광을 나타낼 수 있다는 점을 착안하여 위 실험 결과가 단순히 NADPH 첨가에 의한 결과인지 또는 단백질 mBFP와의 상호작용에 의한 것인가를 명확히 확인하기 위하여 형광 강도 측정기(Fluorometer)를 이용하여 235, 280, 350, 570 및 700 nm의 흡수 파장을 조사하였다.

그 결과 도 5의 B에서도 확인할 수 있듯이, NADPH와 단백질 mBFP 모두가 350 nm 파장에서 가장 높은 강도의 형광을 방출하는 것을 확인하였고, 방출 파장은 460 nm 및 450 nm로 차이가 있었으며, 방출하는 형광의 세기가 NADPH가 단독으로 존재할 때 보다 단백질 mBFP와 함께 존재할 때 4배 이상 강하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 형광이 사라진 순수 분리된 단백질 mBFP에 NADPH를 첨가하였을 때 나타나는 형광특성이 NADPH 분자자체에 의존적이지 않고 단백질 mBFP과의 상호작용 에 의한 것임을 확인한 결과이며, 또한 단백질 mBFP의 형광 세기가 NADPH의 첨가 농도에 의존적으로 변화하는 것을 관찰 할 수 있었다.

[ 실시예 7] 리포터로서의 신규한 청색 형광단백질 mBFP 의 가치 평가

(1) 절대 혐기적 조건에서의 단백질 mBFP 의 형광 여부 조사

상기 실시예 6의 결과에서 확인한 단백질 mBFP과 NADPH의 상호작용으로 인한 형광특성으로부터 단백질 mBFP가 녹색 형광단백질(GFPuv)및 붉은색 형광단백질(DsRed)과 같이 일반적으로 활용되는 형광 단백질들(대조군)과 다른 방법으로 형광을 나타내며, 형광 단백질의 중심 구조인 형광단을 형성하기 위해 요구되는 산소가 없는 절대 혐기 조건에서도 단백질 mBFP이 형광을 나타내는지 여부를 확인하였다.

그 결과 도 6에서도 확인할 수 있듯이, mBFP 및 mBFP를 포함하는 메타게놈 유전자 단편을 갖는 재조합 형질전환 균주를 글루코오즈와 소량의 염만 포함된 최소배지(M9 minimal media)에 도말하고 절대 혐기적인 조건에서 배양하였을 때 청색 형광이 나타남을 확인하였다. 상기와 동일한 조건에서 각각의 특정 파장을 조사하였을 때, 대조군으로 사용된 녹색 형광단백질(GFPuv)및 붉은색 형광단백질(DsRed)의 형광은 검출되지 않았다.

이는 절대 혐기적인 조건에서, 형광단의 형성과 관계없이 NADPH 첨가만으로 짧은 시간 내에 형광을 나타내는 특성이 있어, 리포터로서 기존의 형광 단백질 갖지 못한 놀라운 효과가 있는 신규한 리포트로서의 이용가능함을 보여주는 결과이다. 즉 단백질 mBFP를 탐침자로서 목적하는 단백질과 융합한 형태로 발현을 시키는 경우, 녹색 형광단백질(GFPuv) 및 붉은색 형광단백질(DsRed)에 비해 형광을 나타내기 위해 필요한 성숙시간(maturation time)이 짧기 때문에 융합된 표적 단백질의 번역 및 접힘 과정, 세포내 위치나 기능 등의 추적이 보다 용이한 장점이 있다. 이러한 리포팅 시스템 구축을 위하여 단백질 mBFP과의 융합 가능성을 확인한 결과, 도 7에서도 확인한 것과 같이 목적하는 표적 단백질과 융합 후에도 본래의 형광을 유지하는 것을 확인할 수 있었다.

(2) mBFP 단백질을 활용한 프로모터 세기의 측정

또한, 한 종의 탄소원과 소량의 염들만을 포함한 조건에서도 청색 형광을 나타내는 점은, 기존 세포의 활성 및 세포 내부에서 프로모터의 세기 등을 측정하기 위하여 활용되는 루시퍼라아제(luciferase)와 달리 형광을 나타내기 위하여 외부로부터 추가적인 기질의 첨가가 필요 없이 세포 내부에 존재하는 NADPH만으로 눈으로 관찰할 수 있는 정도의 형광이 생성 가능함을 보여주는 것이다.

상기와 같은 특성에 근거하여, 프로모터의 세기를 측정하기 위해 루시퍼라아제를 사용하는 시스템과 유사한 방법으로 단백질 mBFP를 활용할 수 있는가를 평가해 보았다. 이를 위하여 본 연구실에서 개발한 양방향 탐침 시스템의 역방향 탐침자인 붉은색 형광단백질(DsRed)을 mBFP로 치환하고, 녹색 형광단백질(GFPuv) 및 mBFP 유전자 각각의 앞에 동일한 프로모터를 삽입하여 작동 유무 및 세기를 조사한 결과, 도 8에서도 확인할 수 있듯이 목적에 적합한 세기의 형광을 나타냄을 확인하였다.

[ 실시예 8] 형광 현미경을 통한 단일 세포 수준에서의 형광능 평가

특정한 파장의 빛이나 발색 가능한 화합물을 생성할 수 있는 단백질을 리포터 혹은 인디케이터로 이용하기 위해서는 고체나 액체배지와 같은 벌키한 조건에서 동시에 많은 균주들이 생성하는 빛이나 색으로는 충분하지 않는 경우가 많다. 따라서 단일 세포 수준에서 보여주는 형광능의 세기 및 안정성이 중요한 지표가 되는 것으로 알려져 있다. 이를 확인하기 위하여 발현 유도체를 첨가하지 않고 고체 혹은 액체 배지에서 배양하거나, 배양한 세포를 특정 환경(다양한 구간의 pH, 온도, 계면활성제 및 유기용매의 첨가 등)에 일정 기간(10분 내지 2시간) 노출시킨 후, 형광현미경으로 개개의 세포가 보여주는 형광능을 측정하였다.

그 결과, 도 9에서도 확인할 수 있듯이, 배양조건이나 환경 인자에 큰 편차를 보이지 않고 안정적으로 청색 형광을 보이는 단백질의 발현 여부를 단일 세포 수준에서 확인할 수 있어, 이는 리포터 또는 인디케이터로서 이용 가능한 조건을 충분히 가지고 있는 것을 보여주는 결과이다.

도 1은 본 발명에 따른 청색 형광단백질 mBFP의 염기서열(A) 및 아미노산 서열(B)을 나타낸 것이고,

도 2는 본 발명에 따른 청색 형광단백질 mBFP의 크기(A) 및 형광특성(B)을 확인한 것이며,

도 3은 SDS-PAGE를 이용하여 순수 분리 정제된 본 발명의 청색 형광단백질 mBFP를 확인한 결과이고,

도 4는 본 발명에 따른 청색 형광단백질 mBFP에 대한 기능을 in silico 분석을 통한 예측한 검색 결과를 보여주는 것이며,

도 5는 본 발명의 청색 형광단백질 mBFP에 대한 기능으로 NADPH 첨가에 따른 mBFP의 회복 형광능(A) 및 mBFP의 고유한 특성파장(B)을 조사한 결과이고,

도 6은 절대 혐기적 조건의 배양에 따른 본 발명의 청색 형광단백질 mBFP에 대한 형광능을 조사한 결과이며,

도 7은 본 발명의 청색 형광단백질 mBFP 유전자를 포함하는 융합단백질에 대한 형광능을 조사한 결과이고,

도 8은 형광능에 있어서 본 발명에 따른 청색 형광단백질 mBFP과 기존의 일반적인 리포터 단백질의 형광능을 비교 조사한 결과이며,

도 9는 본 발명의 청색 형광단백질 mBFP에 대한 형광 현미경을 통한 단일 세포 수준에서의 형광능을 형광 현미경으로 확인한 결과이다.

<110> Industry Foundation of Chonnam National University <120> Metagenome-derived blue fluorescent protein, mBFP, applicable as the probe and reporter <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 747 <212> DNA <213> metagenome <220> <221> gene <222> (1)..(747) <223> metagenome derived blue fluorescent protein gene <400> 1 atgcagaatc tgaacggcaa agtggctttc gtgaccggcg gcagccgcgg catcggcgcg 60 gcgatcgtcc gccgcttggc ggcggacggc gccgacatcg cgttcaccta tgtcagcgcc 120 tcgtcgaaaa acgtggccac cgccctggtg caagaactcg aggccaaggg ccgccgcgct 180 cgcgccatcc aggcggactc ggcggatccg gcccaggtgc ggcaggcggt cgagcaggcc 240 atcgtgcaac tggggccggt ggacgtgctg gtgaacaacg ccggcatctt cctggccggc 300 cccttgggcg aggtgacgct ggacgactac gaacgcacga tgaacatcaa tgtgcgcgcg 360 cctttcgtgg ccatccaggc cgcgcaggcc tcgatgccgg acggcggccg catcatcaac 420 atcggcagct gcctggcgga acgcgccggc cgagccgggg taacgctgta tgccgccagc 480 aagtcggcgc tgctgggcat gacgcgcggc ctggcgcgcg acctgggcgc gcgcggcatc 540 accgccaacg tcgtgcaccc gggcccgatc gacaccgaca tgaatcccgc agatggcgaa 600 cgctcgggcg aactggtggc cgtgctgtcc ttgcctcatt acggcgaggt gcgcgacatc 660 gccggcatgg tggctttcct ggccgggccg gatgggcgct acgtgaccgg tgcgagtctg 720 gcggtggacg gcggcttcgc cgcttga 747 <210> 2 <211> 248 <212> PRT <213> metagenome <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(248) <223> metagenome derived blue fluorescent protein <400> 2 Met Gln Asn Leu Asn Gly Lys Val Ala Phe Val Thr Gly Gly Ser Arg 1 5 10 15 Gly Ile Gly Ala Ala Ile Val Arg Arg Leu Ala Ala Asp Gly Ala Asp 20 25 30 Ile Ala Phe Thr Tyr Val Ser Ala Ser Ser Lys Asn Val Ala Thr Ala 35 40 45 Leu Val Gln Glu Leu Glu Ala Lys Gly Arg Arg Ala Arg Ala Ile Gln 50 55 60 Ala Asp Ser Ala Asp Pro Ala Gln Val Arg Gln Ala Val Glu Gln Ala 65 70 75 80 Ile Val Gln Leu Gly Pro Val Asp Val Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile 85 90 95 Phe Leu Ala Gly Pro Leu Gly Glu Val Thr Leu Asp Asp Tyr Glu Arg 100 105 110 Thr Met Asn Ile Asn Val Arg Ala Pro Phe Val Ala Ile Gln Ala Ala 115 120 125 Gln Ala Ser Met Pro Asp Gly Gly Arg Ile Ile Asn Ile Gly Ser Cys 130 135 140 Leu Ala Glu Arg Ala Gly Arg Ala Gly Val Thr Leu Tyr Ala Ala Ser 145 150 155 160 Lys Ser Ala Leu Leu Gly Met Thr Arg Gly Leu Ala Arg Asp Leu Gly 165 170 175 Ala Arg Gly Ile Thr Ala Asn Val Val His Pro Gly Pro Ile Asp Thr 180 185 190 Asp Met Asn Pro Ala Asp Gly Glu Arg Ser Gly Glu Leu Val Ala Val 195 200 205 Leu Ser Leu Pro His Tyr Gly Glu Val Arg Asp Ile Ala Gly Met Val 210 215 220 Ala Phe Leu Ala Gly Pro Asp Gly Arg Tyr Val Thr Gly Ala Ser Leu 225 230 235 240 Ala Val Asp Gly Gly Phe Ala Ala 245

Claims (12)

1. 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 메타게놈 유래의 청색 형광단백질 mBFP(metagenome-derived blue fluorescent protein).
2. 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는, 청색 형광단백질 mBFP(metagenome-derived blue fluorescent protein) 유전자.
3. 제 2항에 있어서,

   상기 아미노산은 서열번호 1에 기재된 염기서열로 이루어지는 청색 형광단백질 mBFP(metagenome-derived blue fluorescent protein) 유전자.
4. 제 2항 또는 제 3항에 따른 청색 형광단백질 mBFP 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
5. 제 4항에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환된, 형질전환 미생물.
6. 제 5항에 있어서,

   상기 형질전환 미생물은 수탁번호 KCTC 11593BP로 기탁된 것인 형질전환 미생물.
7. 리포터(reporter) 또는 친화성 태그(affinity tag)로서 제 4항에 따른 재조합 발현 벡터를 사용하여 단백질 또는 유전자의 발현을 분석하거나 분리 정제하는 단계를 포함하는, 단백질 또는 유전자의 발현 분석 또는 분리 정제 방법.
8. 리포터(reporter) 또는 융합 태그(fusion tag)로서 제 2항 또는 제 3항에 따른 청색 형광단백질 mBFP 유전자를 포함하는 융합단백질.
9. 리포터(reporter) 또는 융합 태그(fusion tag)로서 제 2항 또는 제 3항에 따른 청색 형광단백질 mBFP 유전자를 포함하는 생리활성물질 측정용 바이오센서.
10. 리포터(reporter) 또는 융합 태그(fusion tag)로서 제 2항 또는 제 3항에 따른 청색 형광단백질 mBFP 유전자를 포함하는 NADPH 분석 키트.
11. 제 2항 또는 제 3항에 따른 청색 형광단백질 mBFP 유전자를 포함하는 오페론 트랩 벡터(trap vector).
12. 제 2항 또는 제 3항에 따른 청색 형광단백질 mBFP 유전자를 포함하는 혐기조건에서의 생리 탐침 시스템.

Images