KR20140115626A - 적색 형광 단백질 변이체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 새로운 리포터와 탐침자로서 안정하면서도 빠르고 강한 형광이 유도되는 새로운 적색 형광 단백질 변이체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 야생형 DsRed2 유전자의 N-말단에 아미노산 Ser, Lys 또는 Pro-Ile-Val이 추가되어 이루어지는 적색 형광 단백질에 관한 것이다.
Description
본 발명은 새로운 리포터와 탐침자로서 안정하면서도 빠르고 강한 형광이 유도되는 새로운 적색 형광 단백질 변이체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 야생형 DsRed2 유전자의 N-말단에 아미노산 Ser, Lys 또는 Pro-Ile-Val이 추가되어 이루어지는 적색 형광 단백질에 관한 것이다.
손상되지 않은 세포기관, 살아있는 세포, 그리고 유기체들의 형광을 발현하는 생체 물질들은 생화학, 생물공학, 세포학, 발생생물학 등에서 광범위하게 이용되어왔다. 최초로 소개된 형광 단백질은 젤리피쉬 아쿠오레아 빅토리아(jellyfish Aequorea victoria)로부터 얻어진 녹색 형광 단백질 (Green Fluorescent Protein, GFP) 로서, 이것이 발견된 이후, 다양한 단백질들이 녹색형광단백질과 융합되어 살아있는 세포 내에서 트래킹 되었으며 이 경우 대부분의 경우 각 단백질의 고유 성격이 완전하게 유지되었다.
새로운 생물학적 연구를 통해 GFP의 클로닝이 시작됨으로써 형광표지의 응용이 가능하게 되었다. 최근에는 이렇게 발현된 관련 단백질들의 수가 빠르게 증가하여 대략 200여 형광단백질과 색소단백질을 화충강(Anthozoa)과 히드로충류(Hydrozoa)로부터 얻어내었다. 이들 형광단백질들은 발색단이 다른 보조적인 조효소나, 효소, 기질, 산소분자 등을 필요로 하며 살아있는 유기체, 조직, 그리고 세포에서 발색단의 구조를 형성한다. 반면, 발색단백질은 좀 더 광범위하게 정량이 가능한 유전적으로 암호화된 표지로 단백질-단백질 상호작용, 단백질, 세포의 추적이 가능하다.
녹색형광단백질의 유전자 돌연변이를 통해 형광파장의 변화가 만들어 졌다. 이렇게 클로닝된 유전자는 유전적 변형을 거쳐, 푸른색, 노란색, 붉은색, 그리고 색을 띄지 않는 색소 단백질 등을 만들기도 하였다.
녹색형광단백질로부터 유래한 녹색계통의 색(like-green fluorescent protein, GFP), 푸른색(blue fluorescent protein, BFP), 노란색(yellow fluorescent protein, YFP), 붉은색(red fluorescent protein, RFP), 그리고 색을 띄지 않는 색소 단백질(non-fluoresecent chromoprotein) 등이 색을 띄게 되는 원리는 특정 파장의 빛에 의해 전자가 여기된 후, 전자가 기저상태로 돌아오는 과정에서 방출되는 전자기파 에너지에 해당하는 파장의 형광색을 낸다. 각각의 형광단백질들이 발현되는 특정한 파장을 보게 되면 BFP는 ~370nm, GFP는 ~485-520 nm, YFP는 ~540nm, RFP는 ~ 570nm 이상의 파장이다.
GFP에서 유래한 형광단백질은 4분자의 복합체(tetramer)로 이루어져있다. 그리고 알파 나선(α-helix), 베타 병판(β-sheet), 베타 통(β-parrel)의 구조와 가운데는 발색단(chromophore)으로 이루어져 있다.
지난 십여 년 동안 가시광선(visible wavelength) 영역 전체에 걸쳐 형광을 발현하는, 다시 말하면 대기 중의 빛에너지만으로 직접 눈으로 선별이 가능한 색을 띄게 하는 특징을 나타내는 단백질은, 화충강(Anthozoa)으로부터 파생된 바다 말미잘과의 디스코소마 스트리아타(Discosoma striata)로부터 발견된 drFP583이 처음이었다. DsRed라고 알려진 이 단백질은 558nm 에서 최적으로 들뜬 상태가 되고, 최고 583nm를 방출한다.
근래에는 RFP 형광단백질이 세포내 영상 분석에 적합하여 많은 연구가 진행되고 있는데, 특히 DsRed2라는 최적화 되어있는 변이체(mutants)가 가장 널리 이용되고 있다. 하지만 이런 DsRed2 또한 몇 가지 단점을 가지고 있다. 첫째, 발현이 될 때 발색단계를 거치는데, DsRed2는 녹색단계(Green stage)라 불리우는 간섭crosstalk)이 야기된다. 또한 DsRed2는 4개의 동일한 분자로 구성되는 올리고머의 형태로, 4분자가 각각의 위치에 자리를 잡아야 단백질 4차 구조에 의해 형광 발색이 되는데, 단백질이 안정화되기까지의 시간이 오래 걸린다. 이는 세포발현 실험에 DsRed2를 표지자로 쓸 때 반응이 제대로 일어나지 못하게 한다.
이를 극복하기 위해 올리고머 형태의 RFP를 야생형의 붉은색 형광물질을 내는 mCherry 단량체 만으로도 발색이 이루어짐을 발견하기도 하였다. 하지만 이는 빠른 속도로 단백질이 숙성(maturation) 되었으나 발현의 불안정함을 가져와 올리고머 구조의 안정성이 중요함을 증명하였다.
유전자 돌연변이를 통해 이런 단점들을 극복하기 위한 실험들이 많이 수행되었는데, 특히 점 돌연변이(Point mutation)와 무작위 돌연변이(Random mutation)를 통해 DsRed의 변형체인 DsRed2를 생산하였다. DsRed1 은 붉은 색을 띠기까지 11~15시간이 필요하지만, DsRed2는 보통 세포에 트랜스펙션(transfection) 하게 되면 8시간 정도면 형광을 나타내게 되었다. 하지만 DsRed2가 더욱 밝게 발현이 되어도 탐침자로 쓰이는 RFP는 여전히 안정하면서도 빠른 성숙이 요구되고 있다.
1. 이지웅, 분자진화기술을 이용한 광학진단용 적색형광단백질 Probe 개발, 2010
2. Sambrook, Joseph, Fritsch, Maniatis. Molecular Cloning 2nd Edition
본 발명은 이와 같은 기술적 배경 하에서 고안된 것으로, 본 발명의 목적은 안정하면서도 빠르고 강한 형광이 유도되는 새로운 적색 형광 단백질 및 이의 유전자를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 새로운 적색 형광 단백질 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환 미생물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 리포터(reporter) 또는 융합 태그(fusion tag)로서 상기 새로운 적색 형광 단백질 유전자를 포함하는 융합 단백질 및 바이오센서를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 리포터 또는 탐침자로서 상기 새로운 적색 형광 단백질을 사용하는 세포내 영상 분석 방법을 제공하는데 있다.
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 야생형 DsRed2 유전자의 N-말단에 아미노산 Ser, Lys 또는 Pro-Ile-Val이 추가되어 이루어지는 적색 형광 단백질을 제공한다.
본 발명에서, 상기의 아미노산은 바람직하게는 DsRed2 유전자의 N-말단의 시작코돈(Met) 뒤에 추가된다.
따라서 본 발명의 적색 형광 단백질은 N-말단이 Met-Ser, Met-Lys, Met-Pro-Ile-Val를 포함하여 이루어질 수 있으며, 이러한 본 발명의 적색 형광 단백질은 서열번호 1 내지 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열로 표시될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 아미노산 서열을 코딩하는 적색 형광 단백질 유전자를 제공하며, 상기 유전자는 서열번호 4 내지 서열번호 6 중 어느 하나에 기재된 염기서열로 이루어질 수 있다.
구체적으로 서열번호 1과 4는 Ser이 추가된 단백질의 아미노산 서열과 염기서열을, 서열번호 2와 5는 Lys이 추가된 단백질의 아미노산 서열과 염기서열을, 그리고 서열번호 3과 6은 Pro-Ile-Val이 추가된 단백질의 아미노산 서열과 염기서열을 나타낸다.
RFP는 인체에 위해한 자외선에 의해 여기되는 다른 형광단백질과 달리 가시광선에 의해 여기되며 방출하는 파장이 길어 조직의 투과성이 우수하므로 인체 질병의 진단에 가장 이상적인 형광단백질로 알려져 있다. DsRed2는 그 중 최적화되어 있는 RFP 변이체로서 가장 널리 이용되고 있으나, 형광이 늦게 발현되고 안정성이 낮은 단점이 있다.
본 발명자들은 이러한 단점을 개선하기 위하여 분자진화기법을 통하여 빠른 시간에 강한 형광을 나타내는 RFP 변이 단백질을 선별한 바 있다. 상기 RFP 변이체는 야생형의 DsRed2와 비교하여 N-말단에 Ile-Lys와 Ile-Val이 추가된 변이체임을 확인하고, 이를 BnRed1과 BnRed2로 각각 명명하였다.
본 발명에서는 상기 DsRed2와 BnRed2를 기반으로 신장 무작위 돌연변이(elongation random site mutation)을 통해 또 다른 강한 형광을 나타내는 세 개의 변이체를 선별하였다. 이들의 염기서열을 분석한 결과, 야생형의 DsRed2와 비교하여 N-말단에 Ser, Lys 또는 Pro-Ile-Val이 추가된 변이체임을 확인하였다.
이들 RFP 변이체는 DsRed2에 비하여 IPTG 유도(induction) 후 24시간에 정량적으로 1.2배 내지 1.6배 정도의 강한 형광세기를 보였다(N-말단에 Ser 또는 Lys이 추가된 경우 1.2배, N-말단에 Pro-Ile-Val이 추가된 경우 1.6배).
본 발명은 이러한 RFP 변이체의 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
상기 재조합 발현 벡터를 제조하기 위한 벡터로는 당 업계에서 통상적으로 사용되는 공지의 벡터 또는 플라스미드를 제한 없이 이용할 수 있으며, 예를 들면 pET21a 벡터를 사용할 수 있다. 참고로 도 1은 이러한 재조합 발현 벡터의 개략적인 모식도를 보여준다.
본 발명은 또한 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환 미생물을 제공한다.
이 때, 상기 미생물로는 당업계에서 통상적으로 사용되는 대장균, 효모, 바실러스 등을 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 대장균, 더욱 바람직하게는 E.coli BL21을 사용할 수 있다.
위에서 살펴보았듯이 본 발명이 제공하는 RFP 변이체는 DsRed2 보다 빠르고 강한 형광이 유도되면서도 안정한 단백질이므로, 리포터, 융합태그 또는 탐침자로서, 생체 내 이미지화 또는 다양한 질환 진단 등에 유용하게 활용할 수 있다.
따라서 본 발명은 리포터(reporter) 또는 융합 태그(fusion tag)로서 상기한 적색 형광 단백질 유전자를 포함하는 융합단백질을 제공한다.
또한 본 발명은 리포터 또는 융합 태그로서 상기한 적색 형광 단백질 유전자를 포함하는 바이오센서를 제공한다.
또한 본 발명은 리포터 또는 탐침자로 상기한 적색 형광 단백질을 사용하는 세포내 영상 분석 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 적색 형광 단백질은 DsRed2의 단점을 보완한 것으로, 그보다 빠른 시간 내에 강한 형광을 나타내면서도 안정함으로써, 세포내 영상 분석, 다양한 질환 진단, 세포내 단백질 이동, 단백질 상호작용, 산소존재여부 측정은 물론 이스트 투 하이브리드(yeast two hybrid), 형광공명에너지전달 시스템을 포함한 다양한 바이오센싱 분야에 폭넓게 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 변이체 RFP 라이브러리를 갖는 재조합 플라스미드의 개략적인 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 DsRed2 변이체 유전자들의 증폭을 보여주는 것이다. 여기에서 A는 pET21a (1번: BamHI 절단, 2번: XhoI 절단, 3번 및 4번: BamHI, XhoI 절단, 크기: 5443kb), B는 PCR 산물 (1번: 그룹 1, 2번: 그룹 2, 3번: 그룹 3, 4번; 그룹 4, 크기: 684~690)의 결과를 나타낸다.
도 3은 DsRed2, BnRed1, BnRed2의 증폭을 보여주는 것이다. 여기에서 A는 pET21a (1번: 비절단(no digestion), 2번: BamHI 절단, 3번: XhoI 절단, 4번: BamHI, XhoI 절단, 크기: 5443kb), B는 PCR 산물 (1번: DsRed2, 2번: BnRed1, 3번: BnRed2)의 결과를 나타낸다.
도 4는 pET21a-DsRed2, pET21a-BnRed1 및 pET21a-BnRed2로 형질전환된 E.coli BL21(DE3)로부터 방출된 형광을 나타낸 것이다. 여기에서 A는 IPTG 유도 후 0시간; B는 IPTG 유도 후 6시간; C는 IPTG 유도 후 12시간의 결과를 보여준다.
도 5은 SDS-PAGE에 의한 mRFPs의 발현양을 분석한 결과이다. 여기에서 1번은 IPTG 비유도시의 DsRed2; 2번은 IPTG 비유도시의 BnRed1; 3번은 IPTG 비유도시의 BnRed2 ; 4번은 IPTG 유도 후 6시간의 DsRed2; 5번은 IPTG 유도 후 6시간의 BnRed1; 6번은 IPTG 유도 후 6시간의 BnRed2; 7번은 IPTG 유도 후 10시간의 DsRed2; 8번은 IPGF 유도 후 10시간의 BnRed1; 9번은 IPTG 유도 후 10시간의 BnRed2; 10번은 IPTG 유도 후 24시간의 DsRed2; 11번은 IPTG 유도 후 24시간의 BnRed1; 12번은 IPTG 유도 후 24시간의 BnRed2의 결과이다.
도 6은 변이체 RFPs의 1차 스크리닝 결과를 나타낸 것이다. 여기에서 A는 그룹 1, B는 그룹 2, C는 그룹 3, D는 그룹 4의 결과이다.
도 7은 DsRed 변이체들의 형광을 나타낸 것이다. 여기에서 RFPv1-1과 RFPv1-3은 그룹 1, RFPv3-3는 그룹 3, pET-21a는 공벡터, DsRed2는 대조군이다.
도 8은 pET-21a, DsRed2, RFPv1-1, RFPv1-3 및 RFPv3-3의 정량적인 형광값을 나타낸 것이다. 여기에서 A는 IPTG 유도 후 10시간, B는 IPTG 유도 후 24시간의 결과이다.
도 2는 DsRed2 변이체 유전자들의 증폭을 보여주는 것이다. 여기에서 A는 pET21a (1번: BamHI 절단, 2번: XhoI 절단, 3번 및 4번: BamHI, XhoI 절단, 크기: 5443kb), B는 PCR 산물 (1번: 그룹 1, 2번: 그룹 2, 3번: 그룹 3, 4번; 그룹 4, 크기: 684~690)의 결과를 나타낸다.
도 3은 DsRed2, BnRed1, BnRed2의 증폭을 보여주는 것이다. 여기에서 A는 pET21a (1번: 비절단(no digestion), 2번: BamHI 절단, 3번: XhoI 절단, 4번: BamHI, XhoI 절단, 크기: 5443kb), B는 PCR 산물 (1번: DsRed2, 2번: BnRed1, 3번: BnRed2)의 결과를 나타낸다.
도 4는 pET21a-DsRed2, pET21a-BnRed1 및 pET21a-BnRed2로 형질전환된 E.coli BL21(DE3)로부터 방출된 형광을 나타낸 것이다. 여기에서 A는 IPTG 유도 후 0시간; B는 IPTG 유도 후 6시간; C는 IPTG 유도 후 12시간의 결과를 보여준다.
도 5은 SDS-PAGE에 의한 mRFPs의 발현양을 분석한 결과이다. 여기에서 1번은 IPTG 비유도시의 DsRed2; 2번은 IPTG 비유도시의 BnRed1; 3번은 IPTG 비유도시의 BnRed2 ; 4번은 IPTG 유도 후 6시간의 DsRed2; 5번은 IPTG 유도 후 6시간의 BnRed1; 6번은 IPTG 유도 후 6시간의 BnRed2; 7번은 IPTG 유도 후 10시간의 DsRed2; 8번은 IPGF 유도 후 10시간의 BnRed1; 9번은 IPTG 유도 후 10시간의 BnRed2; 10번은 IPTG 유도 후 24시간의 DsRed2; 11번은 IPTG 유도 후 24시간의 BnRed1; 12번은 IPTG 유도 후 24시간의 BnRed2의 결과이다.
도 6은 변이체 RFPs의 1차 스크리닝 결과를 나타낸 것이다. 여기에서 A는 그룹 1, B는 그룹 2, C는 그룹 3, D는 그룹 4의 결과이다.
도 7은 DsRed 변이체들의 형광을 나타낸 것이다. 여기에서 RFPv1-1과 RFPv1-3은 그룹 1, RFPv3-3는 그룹 3, pET-21a는 공벡터, DsRed2는 대조군이다.
도 8은 pET-21a, DsRed2, RFPv1-1, RFPv1-3 및 RFPv3-3의 정량적인 형광값을 나타낸 것이다. 여기에서 A는 IPTG 유도 후 10시간, B는 IPTG 유도 후 24시간의 결과이다.
이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 아이디어와 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에 종사하는 업자에게는 명백한 것이다.
이 때, 사용되는 기술용어 및 과학용어에 있어 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미를 지닌다.
재료 및 방법
1. 숙주 및 플라스미드
본 실험에서는 형질전환 및 발현숙주로 Escherichia coli BL21(DE3) (hsdS gal ; λcIts857 ind1 Sam7 nin5 lac UV5-T7 gene1)을 사용하였다.
새로운 변이 단백질의 제작을 위한 주형으로는 pDsRed -N1(Clontech) 유래의 DsRed2 유전자를 이용하였다. 또한 상기 DsRed2 유전자를 기초로 분자진화기법을 통하여 빠른 시간에 강한 형광을 나타내는 RFP 변이 단백질을 선별하고, 염기서열 분석결과 야생형의 DsRed2와 비교하여 N-말단에 시작코돈(Met) 뒤에 Ile-Lys와 Ile-Val이 추가된 변이체임을 확인한 후, 이를 각각 BnRed1과 BnRed2로 명명하였다(이지웅, 분자진화기술을 이용한 광학진단용 적색형광단백질 Probe 개발, 2010 참고).
변이체 라이브러리의 제작과 발현에는 pET-21a plasmid(BEAMS bio technology)를 이용하였다. 클로닝을 위한 숙주로는 E.coli DH5α(supE44 ΔlacU169 (φ80 lacZΔM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1)를 사용하였다.
2. 배지와 배양조건
E. coli 형질전환체는 50 ㎍/㎖ 암피실린(ampicillin)이 첨가된 고체배지인 Luria-Bertani(LB, 1% of Bacto-tryptone, 0.5% of Bacto-yeast extract, 1% of NaCl per liter, Agar 1.5%) 배지에서 37℃, 16시간 배양한 후 50 ㎍/㎖ 암피실린이 첨가된 액체 LB(10% of Bacto-tryptone, 5% of Bacto-yeast extract, 5% of NaCl) 배지에서 배양하였다. 배양은 37℃에서 vigorous shaking(300 rpm in a rotary shaker)으로 0, 10, 24 시간 배양시켰다. 배양액의 1.5㎖를 50㎖의 50 ㎍/㎖ 암피실린이 첨가된 LB 배지에 접종하여 37℃의 진탕 배양기(shaking incubator)에서 A550이 0.4-0.5에 달할 때까지 배양시켰다.
3. Competent cell의 제조 및 형질전환
E. coli BL-21(DE3)의 형질전환은 Sambrook 등[Sambrook, Joseph, Fritsch, Maniatis. Molecular Cloning 2nd Edition] 의 방법으로 실험하였다. E. coli BL-21(DE3)의 단일 콜로니는 LB 플레이트에서 37℃, 16시간 동안 자란 것을 멸균된 이쑤시개로 찍어 5㎖ 의 LB broth에 접종하였다. 배양은 37℃에서 진탕 배양기(300 rpm in a rotary shaker)로 16-18 시간 배양시켰다. 배양액의 1.5㎖를 50㎖ 의 LB 배지에 접종하여 37℃의 진탕 배양기에서 A550(OPTIZEN 2120UV, Mecasys.Co., Ltd)이 0.4-0.5에 달할 때까지 배양시켰다. 세포는 차가운 50㎖의 멸균된 폴리프로필렌 튜브(Falcon, 2070)에 옮긴 후 얼음에 10분간 꽂아두었다. 10분 후 4℃에서 5분간 4000 rpm으로 원심분리를 하여 상등액만 남도록 상등액을 버렸다. 상등액에 차가운 RF1 용액(표 1)을 16.6㎖로 재현탁(resuspension) 시킨 후 아이스에서 한 시간 동안 보관하였다. 1시간 경과 후 4℃에서 5분간 4000 rpm으로 원심분리를 하여 다시 상등액을 버렸다. 여기에 RF2 용액(표 1)을 4㎖ 넣고 다시 재현탁시킨 후 아이스에서 15분 동안 보관하고 원심분리 튜브(centrifuge tube)에 각각 100㎕씩 분주하여 -70℃에서 보관하여 사용하였다.
4. Plasmid DNA의 추출과 정제
Plasmid DNA의 추출과 정제는 Plasmid Mini Extraction Kit(BIONEER), Plasmid Midi Extraction Kit(BIONEER)를 이용하여 수행하였고, 상등액에 50 ㎕의 멸균된 증류수를 넣어 잘 녹도록 해주었다. 그 후에 1.0% 아가로스 젤 전기영동으로 추출된 plasmid DNA의 크기를 확인하였다.
5. DsRed2, BnRed1, BnRed2의 유전자 증폭과 vector pET21a에 클로닝
DsRed2와 BnRed1, BnRed2를 IPTG(isopropyl thio-beta-D-galactoside) 유도가 가능한 벡터 pET21a에 클로닝 하기 위해 각각의 프라이머를 제작하였다(표 2). 그리고 PCR 반응은 Taq DNA polymerase 20U, 2mM dNTPs 와 80㎍/㎕ 의 template DNA 를 첨가하여 전체 양이 20㎕가 되게 Super cycler Gradient cycler (Kyratec, Australia)를 사용하여 수행하였다. PCR 조건은 94℃에서 2분간 변성, 58℃에서 40초간 어닐링, 72℃에서 3분간 신장, 30 사이클로 하였다. 제한효소는 pET21-a 벡터의 BamH I과 XhoI을 이용하였다. 벡터의 BamHI은 삽입되는 유전자의 N-말단 부분이고, XhoI 은 C-말단 부분이다. 도 1은 본 발명의 RFP 변이체 라이브러리를 갖는 재조합 플라스미드의 개략적인 모식도를 나타낸다.
6. 돌연변이 도입을 위한 유전자 증폭과 클로닝
BnRed1의 Ile-Lys, BnRed2 의 Ile-Val이 RFP의 구조적 기능에 미치는 영향을 알기 위해 다른 아미노산들을 무작위적으로 넣어보는 변이체를 제작하였다. DsRed2 유전자의 N-말단에 1개의 아미노산만 무작위적으로 넣어보는 그룹 1(Met-X), BnRed1과 BnRed2에 공통으로 들어가는 Ile 뒤에 1개의 아미노산을 무작위적으로 넣어보는 그룹 2(Ile-X), BnRed2의 Ile-Val 앞뒤로 1개의 아미노산을 무작위적으로 넣어보는 그룹 3(X-Ile-Val)와 그룹 4(Ile-Val-X)의 각 프라이머 세트를 제작하였다(표 3). 그리고 PCR 반응은 Taq DNA polymerase 20U, 2mM dNTPs 와 80㎍/㎕의 template DNA를 첨가하여 전체 양이 20㎕ 가 되게 DNA Super cycler Gradient cycler (Kyratec, Australia)를 사용하여 수행하였다. PCR 조건은 94℃에서 2분간 변성, 58℃에서 40초간 어닐링, 72℃에서 3분간 신장, 30 사이클로 하였다. 제한효소는 pET21-a 벡터의 BamH I 과 XhoI을 이용하였다. 벡터의 BamHI은 삽입되는 유전자의 N-말단 부분이고 XhoI은 C-말단 부분이다(도 1 참조).
7. 변이체 라이브러리(Mutants library)
각 변이체 그룹의 PCR 산물을 BamHI과 XhoI로 절단한 후 1% 아가로스 겔에서 전기영동하여 680~700 bp의 DNA 절편을 회수하였다. 회수된 절편은 BamHI와 XhoI로 절단한 pET21a와 혼합한 후 4℃에서 12시간 동안 라이게이션(ligation) 과정을 수행하였다. 재조합된 DNA를 E.coli BL21(DE3)에 형질전환하고 50㎍/㎖ 암피실린과 0.1mM/㎖ IPTG가 포함된 LB(1% of Bacto-tryptone, 0.5% of Bacto-yeast extract, 1% of NaCl, 1.5% of Agar per liter) 고체배지에 도말하여 라이브러리를 구성하였다.
8. 변이체 선발
라이브러리를 구성한 후 2-3일 경과하여 유전자가 발현되어 DsRed2 보다 붉은색을 띠는 클론들을 1차 선별하였다. 50㎍/㎖ 암피실린과 0.1mM/㎖ IPTG가 포함된 LB 고체배지에 붉은색을 띄는 콜로니들을 선별하여 투스픽(toothpick)으로 플레이트에 찍은 후 다시 붉은 색을 띠는 것을 확인하여 2차 선별을 하였다. 2차 선별된 클론을 대상으로 50㎍/㎖ 암피실린이 포함된 5㎖ LB 액체배지에 접종하여 A550 가 0.3-0.6 까지 키워 0.1mM/㎖ IPTG를 넣은 후 빠른 시간에 붉은색을 띠는 클론들을 3차 선별하였다.
9. 형광 세기 측정
형질전환된 E.coli BL21(DE3)를 LB(1% of Bacto-tryptone, 0.5% of Bacto-yeast extract, 1% of NaCl , liquid) 배지에 단일 콜로니만 접종하였다. 형질전환 균주를 1-2시간 가량 키운 후 A550이 0.3-0.6을 확인한 후 IPTG를 0.1mM이 되게 넣어 주었다. 시간별로 배양액을 200㎕ 씩 96-웰 하프 에어리어 플레이트(half area plate)(black, Corstar)에 3 세트로 분주하여 공초점 레이저 스캐너(confocal laser scanner)(Magellan V6.5, Green Mate Biotech corp.)로 여기파장 558㎚, 발광파장 583㎚에서 형광 광량을 측정하였다.
10. 변이체 유전자 서열 분석
선별된 클론 내의 삽입된 유전자를 구조적 분석을 위해 plasmid DNA를 Plasmid Mini Extraction Kit(BIONEER)를 이용하여 추출한 후 T7 promoter 부위를 프라이머로 이용하여 PCR로 증폭한 후 Perkin-Elmer ABI 3100 sequencer 를 이용하여 염기서열을 분석하였다. 분석은 서열 분석 회사인 genotech에 의뢰하였다.
실시예 1: N-말단 신장 돌연변이 기법을 통한 재조합 DsRed2 라이브러리 제조
DsRed2의 N-말단에 무작위적으로 1개의 아미노산이 첨가된 변이체 그룹 1, BnRed1과 BnRed2에 공통으로 들어가는 Ile 바로 뒤에 무작위적으로 1개의 아미노산을 첨가한 변이체 그룹 2, 그리고 BnRed2의 Ile-Val 앞뒤부분에 각각 무작위적으로 1개의 아미노산을 첨가한 변이체 그룹 3, 4로 RFP 유전자를 얻기 위하여 각각의 무작위적인 아미노산을 암호화하는 핵산염기를 NNN으로 제작한 프라이머를 사용하여 N-말단 신장 PCR을 수행하였다(도 2 참조). 그리고 대조군으로 이용하기 위한 DsRed2, BnRed1, BnRed2 PCR 산물을 pET21a에 라이게이션하여 E.coli BL21(DE3)에 형질전환 하였다(도 3 참조).
실시예 2: DsRed2, BnRed1, BnRed2의 특성 측정
1. pET21a에서의 발현 변화
pET21a에 클로닝한 DsRed2, BnRed1, BnRed2를 IPTG 유도 후 0, 6, 12 시간의 색변화를 관찰하였다. 그 결과 도 4에서 보는 바와 같이, DsRed2 는 12시간 이후부터 붉은색 발현이 관찰되었고, BnRed1은 12시간 이후 DsRed2와 비슷한 양상으로 붉은색이 띄는 것이 관찰되었다. BnRed2는 6시간 이후로 붉은 색이 관찰되었으며, 12시간 이후 DsRed2와 BnRed1 보다 더욱 강한 붉은빛이 관찰되었다.
2. 시간에 따른 발현량
가장 빠른 시간에 붉게 나타나는 BnRed2가 다른 재조합 균들과 비교하여 단백질이 어떻게 변하는지, 같은 양의 단백질이 만들어지는데 얼마나 빠르게 붉은색을 나타내는 것인지, 단백질 양 자체가 차이가 나는지를 알아보기 위하여 단백질을 추출하여 SDS-PAGE로 비교하였다. 그 결과 도 5에 나타낸 바와 같이 0, 6, 10, 24시간 별로 단백질 양을 비교 하였는데, 6시간 이후부터 BnRed2가 DsRed2와 BnRed1에 비하여 더욱 많은 양의 단백질이 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 신장 무작위 돌연변이에 의한 새로운 변이체 선별 및 특성 측정
1. 신장 무작위 돌연변이 스크리닝 및 서열분석
그룹 1-4의 변이체를 제작하고 1차 스크리닝을 하였다. 강하게 붉은 빛을 띠는 균들을 다시 LB (IPTG 0.1mM) 액체 배지에서 길러 빠른 시간에 붉게 변하는 경향성이 있는 균들 중 최종적으로 RFPv1-1, RFPv1-3, RFPv3-3을 선발하였다(도 6 및 도 7 참조). Ile 뒤에 무작위적으로 아미노산이 붙은 그룹 2는 액체 배지 상에서 붉게 나타나지 않았고, Ile-Val 뒤에 무작위적으로 아미노산이 붙은 그룹 4는 플레이트 상에서 붉게 나타나지 않아 스크리닝에서 제외되었다. 2차 선별된 균들은 T7 promoter sequence primer를 사용하여 시퀀싱을 하였다.
그 결과 표 4에 나타낸 바와 같이, RFPv1-1은 DsRed2의 N-말단의 시작코돈(Met) 뒤에 바로 TCT (serine), RFPv1-3은 AAA (lysine), RFPv3-3은 BnRed2의 isoleucine-valine 앞에 CCG (proline)으로 확인되었다.
2. 2차 선별된 변이체(그룹 1, 3)의 형광세기측정
2차 스크리닝 후 형질전환된 각각의 E.coli BL21(DE3)을 0.1mM 농도의 IPTG를 함유한 액체배지에서 배양한 후 0, 10, 24 시간별로 공초점 레이저 스캐너를 이용하여 형광의 세기를 측정하였다. 그 결과 도 8에 나타낸 바와 같이, RFPv1-1, RFPv1-3, RFPv3-3은 DsRed2보다 빠른 시간에 붉은 빛을 나타내었으며, 24시간 후에는 측정한 AU 값도 DsRed2보다 높은 수치를 보였다.
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY
<120> Red Fluorescence Protein Variants
<160> 14
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 227
<212> PRT
<213> RFPv1-1
<400> 1
Met Ser Ala Ser Ser Glu Asn Val Ile Thr Glu Phe Met Arg Phe Lys
1 5 10 15
Val Arg Met Glu Gly Thr Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly His Asn Thr Val Lys Leu Lys
35 40 45
Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro
50 55 60
Gln Phe Gln Tyr Gly Ser Lys Val Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile
65 70 75 80
Pro Asp Tyr Lys Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg
85 90 95
Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Ala Thr Val Thr Gln Asp Ser
100 105 110
Ser Leu Gln Asp Gly Cys Phe Ile Tyr Lys Val Lys Phe Ile Gly Val
115 120 125
Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp
130 135 140
Glu Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly
145 150 155 160
Glu Thr His Lys Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Leu Val
165 170 175
Glu Phe Lys Ser Ile Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly
180 185 190
Tyr Tyr Tyr Val Asp Ala Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp
195 200 205
Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Thr Glu Gly Arg His His Leu
210 215 220
Phe Leu ***
225
<210> 2
<211> 227
<212> PRT
<213> RFPv1-3
<400> 2
Met Lys Ala Ser Ser Glu Asn Val Ile Thr Glu Phe Met Arg Phe Lys
1 5 10 15
Val Arg Met Glu Gly Thr Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly His Asn Thr Val Lys Leu Lys
35 40 45
Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro
50 55 60
Gln Phe Gln Tyr Gly Ser Lys Val Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile
65 70 75 80
Pro Asp Tyr Lys Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg
85 90 95
Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Ala Thr Val Thr Gln Asp Ser
100 105 110
Ser Leu Gln Asp Gly Cys Phe Ile Tyr Lys Val Lys Phe Ile Gly Val
115 120 125
Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp
130 135 140
Glu Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly
145 150 155 160
Glu Thr His Lys Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Leu Val
165 170 175
Glu Phe Lys Ser Ile Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly
180 185 190
Tyr Tyr Tyr Val Asp Ala Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp
195 200 205
Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Thr Glu Gly Arg His His Leu
210 215 220
Phe Leu ***
225
<210> 3
<211> 229
<212> PRT
<213> RFPv3-3
<400> 3
Met Pro Ile Val Ala Ser Ser Glu Asn Val Ile Thr Glu Phe Met Arg
1 5 10 15
Phe Lys Val Arg Met Glu Gly Thr Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly His Asn Thr Val Lys
35 40 45
Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu
50 55 60
Ser Pro Gln Phe Gln Tyr Gly Ser Lys Val Tyr Val Lys His Pro Ala
65 70 75 80
Asp Ile Pro Asp Tyr Lys Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp
85 90 95
Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Ala Thr Val Thr Gln
100 105 110
Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Cys Phe Ile Tyr Lys Val Lys Phe Ile
115 120 125
Gly Val Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met
130 135 140
Gly Trp Glu Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu
145 150 155 160
Lys Gly Glu Thr His Lys Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr
165 170 175
Leu Val Glu Phe Lys Ser Ile Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu
180 185 190
Pro Gly Tyr Tyr Tyr Val Asp Ala Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn
195 200 205
Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Thr Glu Gly Arg His
210 215 220
His Leu Phe Leu ***
225
<210> 4
<211> 681
<212> DNA
<213> RFPv1-1
<400> 4
atgtctgcct cctccgagaa cgtcatcacc gagttcatgc gcttcaaggt gcgcatggag 60
ggcaccgtga acggccacga gttcgagatc gagggcgagg gcgagggccg cccctacgag 120
ggccacaaca ccgtgaagct gaaggtgacc aagggcggcc ccctgccctt cgcctgggac 180
atcctgtccc cccagttcca gtacggctcc aaggtgtacg tgaagcaccc cgccgacatc 240
cccgactaca agaagctgtc cttccccgag ggcttcaagt gggagcgcgt gatgaacttc 300
gaggacggcg gcgtggcgac cgtgacccag gactcctccc tgcaggacgg ctgcttcatc 360
tacaaggtga agttcatcgg cgtgaacttc ccctccgacg gccccgtgat gcagaagaag 420
accatgggct gggaggcctc caccgagcgc ctgtaccccc gcgacggcgt gctgaagggc 480
gagacccaca aggccctgaa gctgaaggac ggcggccact acctggtgga gttcaagtcc 540
atctacatgg ccaagaagcc cgtgcagctg cccggctact actacgtgga cgccaagctg 600
gacatcacct cccacaacga ggactacacc atcgtggagc agtacgagcg caccgagggc 660
cgccaccacc tgttcctgta g 681
<210> 5
<211> 681
<212> DNA
<213> RFPv1-3
<400> 5
atgaaagcct cctccgagaa cgtcatcacc gagttcatgc gcttcaaggt gcgcatggag 60
ggcaccgtga acggccacga gttcgagatc gagggcgagg gcgagggccg cccctacgag 120
ggccacaaca ccgtgaagct gaaggtgacc aagggcggcc ccctgccctt cgcctgggac 180
atcctgtccc cccagttcca gtacggctcc aaggtgtacg tgaagcaccc cgccgacatc 240
cccgactaca agaagctgtc cttccccgag ggcttcaagt gggagcgcgt gatgaacttc 300
gaggacggcg gcgtggcgac cgtgacccag gactcctccc tgcaggacgg ctgcttcatc 360
tacaaggtga agttcatcgg cgtgaacttc ccctccgacg gccccgtgat gcagaagaag 420
accatgggct gggaggcctc caccgagcgc ctgtaccccc gcgacggcgt gctgaagggc 480
gagacccaca aggccctgaa gctgaaggac ggcggccact acctggtgga gttcaagtcc 540
atctacatgg ccaagaagcc cgtgcagctg cccggctact actacgtgga cgccaagctg 600
gacatcacct cccacaacga ggactacacc atcgtggagc agtacgagcg caccgagggc 660
cgccaccacc tgttcctgta g 681
<210> 6
<211> 687
<212> DNA
<213> RFPv3-3
<400> 6
atgccgattg ttgcctcctc cgagaacgtc atcaccgagt tcatgcgctt caaggtgcgc 60
atggagggca ccgtgaacgg ccacgagttc gagatcgagg gcgagggcga gggccgcccc 120
tacgagggcc acaacaccgt gaagctgaag gtgaccaagg gcggccccct gcccttcgcc 180
tgggacatcc tgtcccccca gttccagtac ggctccaagg tgtacgtgaa gcaccccgcc 240
gacatccccg actacaagaa gctgtccttc cccgagggct tcaagtggga gcgcgtgatg 300
aacttcgagg acggcggcgt ggcgaccgtg acccaggact cctccctgca ggacggctgc 360
ttcatctaca aggtgaagtt catcggcgtg aacttcccct ccgacggccc cgtgatgcag 420
aagaagacca tgggctggga ggcctccacc gagcgcctgt acccccgcga cggcgtgctg 480
aagggcgaga cccacaaggc cctgaagctg aaggacggcg gccactacct ggtggagttc 540
aagtccatct acatggccaa gaagcccgtg cagctgcccg gctactacta cgtggacgcc 600
aagctggaca tcacctccca caacgaggac tacaccatcg tggagcagta cgagcgcacc 660
gagggccgcc accacctgtt cctgtag 687
<210> 7
<211> 687
<212> DNA
<213> DsRed2 F primer
<400> 7
atgccgattg ttgcctcctc cgagaacgtc atcaccgagt tcatgcgctt caaggtgcgc 60
atggagggca ccgtgaacgg ccacgagttc gagatcgagg gcgagggcga gggccgcccc 120
tacgagggcc acaacaccgt gaagctgaag gtgaccaagg gcggccccct gcccttcgcc 180
tgggacatcc tgtcccccca gttccagtac ggctccaagg tgtacgtgaa gcaccccgcc 240
gacatccccg actacaagaa gctgtccttc cccgagggct tcaagtggga gcgcgtgatg 300
aacttcgagg acggcggcgt ggcgaccgtg acccaggact cctccctgca ggacggctgc 360
ttcatctaca aggtgaagtt catcggcgtg aacttcccct ccgacggccc cgtgatgcag 420
aagaagacca tgggctggga ggcctccacc gagcgcctgt acccccgcga cggcgtgctg 480
aagggcgaga cccacaaggc cctgaagctg aaggacggcg gccactacct ggtggagttc 540
aagtccatct acatggccaa gaagcccgtg cagctgcccg gctactacta cgtggacgcc 600
aagctggaca tcacctccca caacgaggac tacaccatcg tggagcagta cgagcgcacc 660
gagggccgcc accacctgtt cctgtag 687
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> BnRed1 F primer
<400> 8
gcggatccat gattaaggcc tcctccgaga acgtcatc 38
<210> 9
<211> 38
<212> DNA
<213> BnRed2 F primer
<400> 9
gcggatccat gattgttgcc tcctccgaga acgtcatc 38
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> DsRed2 R primer
<400> 10
gctctagact acaggaacag gtggtggc 28
<210> 11
<211> 33
<212> DNA
<213> DsRed2F 1 primer
<400> 11
gcggatccat gnnngcctcc tccgagaacg tca 33
<210> 12
<211> 32
<212> DNA
<213> BnRed2F 2 primer
<400> 12
gcggatccat gattnnngcc tcctccgaga ac 32
<210> 13
<211> 39
<212> DNA
<213> BnRed2F 3 primer
<400> 13
gcggatccat gnnnattaag gcctcctccg agaacgtct 39
<210> 14
<211> 39
<212> DNA
<213> BnRed2F 4 primer
<400> 14
gcggatccat gattaagnnn gcctcctccg agaacgtct 39
Claims (11)
- 야생형 DsRed2 유전자의 N-말단에 아미노산 Ser, Lys 또는 Pro-Ile-Val이 추가되어 이루어지는 적색 형광 단백질.
- 제1항에 있어서, 상기 아미노산은 N-말단의 시작코돈(Met) 뒤에 추가되는 것을 특징으로 하는 적색 형광 단백질.
- 제1항에 있어서, 상기 적색 형광 단백질은 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 적색 형광 단백질.
- 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는, 적색 형광 단백질 유전자.
- 제4항에 있어서, 서열번호 4 내지 서열번호 6 중 어느 하나에 기재된 염기서열로 이루어지는 적색 형광 단백질 유전자.
- 제4항 또는 제5항에 따른 적색 형광 단백질 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
- 제6항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환 미생물.
- 제7항에 있어서, 상기 미생물은 대장균인 것을 특징으로 하는 형질전환 미생물.
- 리포터(reporter) 또는 융합 태그(fusion tag)로서 제4항 또는 제5항에 따른 적색 형광 단백질 유전자를 포함하는 융합단백질.
- 리포터 또는 융합 태그로서 제4항 또는 제5항에 따른 적색 형광 단백질 유전자를 포함하는 바이오센서.
- 리포터 또는 탐침자로 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 적색 형광 단백질을 사용하는 것을 특징으로 하는 세포내 영상 분석 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020130030414A KR101523834B1 (ko) | 2013-03-21 | 2013-03-21 | 적색 형광 단백질 변이체 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020130030414A KR101523834B1 (ko) | 2013-03-21 | 2013-03-21 | 적색 형광 단백질 변이체 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20140115626A true KR20140115626A (ko) | 2014-10-01 |
| KR101523834B1 KR101523834B1 (ko) | 2015-05-28 |
Family
ID=51989905
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020130030414A KR101523834B1 (ko) | 2013-03-21 | 2013-03-21 | 적색 형광 단백질 변이체 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101523834B1 (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200075975A (ko) * | 2018-12-18 | 2020-06-29 | 전북대학교산학협력단 | 형광세기가 증진된 적색형광단백질 변이체 |
| CN116478264A (zh) * | 2023-06-20 | 2023-07-25 | 苏州左旋星生物科技有限公司 | 重组色蛋白、其制备方法及应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101101986B1 (ko) * | 2009-04-30 | 2012-01-02 | 전남대학교산학협력단 | 새로운 리포터와 분자 탐침자로서 빠르고 강한 형광이 유도되는 적색 형광 단백질 ＦｍＲｅｄ |
-
2013
- 2013-03-21 KR KR1020130030414A patent/KR101523834B1/ko active IP Right Grant
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200075975A (ko) * | 2018-12-18 | 2020-06-29 | 전북대학교산학협력단 | 형광세기가 증진된 적색형광단백질 변이체 |
| CN116478264A (zh) * | 2023-06-20 | 2023-07-25 | 苏州左旋星生物科技有限公司 | 重组色蛋白、其制备方法及应用 |
| CN116478264B (zh) * | 2023-06-20 | 2023-08-29 | 苏州左旋星生物科技有限公司 | 重组色蛋白、其制备方法及应用 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR101523834B1 (ko) | 2015-05-28 |
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