KR102198460B1 - 생물 발광 유도용 재조합 플라스미드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래의 루마진 단백질을 코딩하는 유전자; lux L 프로모터 또는 lux C 프로모터; 및 고초균(Bacillus subtilis) 유래의 돌연변이된 리보플라빈 오페론을 포함하는 생물 발광 유도용 재조합 플라스미드, 이를 형질 전환한 형질 전환체 및 이를 이용한 생물의 발광을 분석하는 방법에 관한 것이다.

Description

생물 발광 유도용 재조합 플라스미드 {Recombinant plasmids for induction of bioluminescence}
본 발명은 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래의 루마진 단백질을 코딩하는 유전자; lux L 프로모터 또는 lux C 프로모터를 발현하는 유전자; 및 고초균(Bacillus subtilis) 유래의 돌연변이된 리보플라빈 오페론을 포함하는 생물 발광 유도용 재조합 플라스미드, 이로부터 형질 전환된 형질 전환체 및 이를 이용한 생물의 발광을 분석하는 방법에 관한 것이다.
생물발광(Bioluminescence)은 일종의 광화학반응으로서, 특정 환경에서 외부의 빛 에너지 공급 없이 독자적으로 빛을 내는 것을 일컬으며 어떤 유기 화합물이 효소의 작용으로 산화되면서 방출되는 에너지가 빛 에너지 형태로 체외로 나오는 현상이다. 생체분자영상(in vivo molecular imaging)이란, 분자/세포생물학을 생체영상(non-invasive in vivo imaging)으로 응용하여 생체 내에서 일어나는 분자수준의 변화를 영상화하는 기법으로 분자/세포생물학과 첨단 영상기술이 융합된 분야이다. 분자영상은 생체조직을 손상시키지 않는 비침습적인 방법으로 반복 영상화할 수 있어 실험실에서 이루어지는 기초연구를 임상에 적용시킬 수 있게 하는 이행적 연구(translational research)에 있어서 중요한 위치를 차지하고 있다. 생체발광(in vivo bioluminescence) 영상 분석으로 관찰하고자 하는 생물학적 대상물(박테리아, 종양세포, 면역세포, 유전자 등)은 빛을 발생시키는 효소(luciferase) 혹은 형광 단백질을 암호화하는 보고유전자(reporter gene)로 표지 되어야 한다.
녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein, GFP)은 진핵세포에서의 유전자 발현 및 단백질 상호작용에 관한 연구에 있어 많이 활용되긴 하지만, 원핵세포에서만 발현되는 시스템을 찾을 필요가 있다. 따라서 해양 발광 미생물로부터 유래하며 형광을 내는 루마진 단백질에 대한 연구가 요구되어 왔다.
루마진 단백질(Lumazine protein)은 형광성 리간드인 6,7 다이메틸 8-리비틸루마진(6,7 dimethyl 8-ribityllumazine)과 1:1로 결합하는 21 kDa의 monomer이다. 효소 활성이 없는 이 형광 단백질은 해양 발광 박테리아인 Photobacterium의 발광반응에서 optical transponder의 기능을 한다. 루마진 단백질의 4차 구조는 단량체 단백질이지만 대장균과 Bacillus subtilis의 리보플라빈 합성효소 (Riboflavin synthase)는 삼량체이다. 리보플라빈 합성효소는 4-탄소 단위의 전달을 통해 6,7 다이메틸 8-리비틸루마진(6,7 dimethyl 8-ribityllumazine) 2분자로부터 리보플라빈의 형성을 촉진한다. 발광 미생물 유래의 리보플라빈 오페론의 ribE는 리보플라빈 합성효소, ribB는 DHBP 합성효소를, ribH는 루마진 합성효소를, ribA는 GTP 시클로가수분해효소 Ⅱ를 암호화한다. ribE로 부터 발현되는 아미노산 중에서 두 번째 잔기인 페닐알라닌을 알라닌으로 돌연변이 시키는 경우, 루마진 리간드가 리보플라빈으로 전환되는 과정이 봉쇄되어 루마진 리간드인 6,7 다이메틸 8-리비틸루마진(6,7 dimethyl 8-ribityllumazine)이 과다 생산된다. 상기의 기술을 이용하여, 루마진 및 오페론 등을 사용하여 미생물을 제조하는 연구가 진행 중에 있다. 예를 들어 한국특허공개번호 제 10-2014-0132634호에는 루마진 단백질 돌연변이체 및 이의 용도가 개시되어 있다.
이에 본 발명자들은 발광하는 대장균을 연구하던 중, 유전공학적으로 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래 루마진 단백질의 N 말단 절반 부위를 암호화하는 유전자(N-Lump), 루마진 단백질 유전자의 과다 발현을 유도하기 위해 상기 균 유래 lux L 프로모터 또는 lux C 프로모터, 및 루마진 리간드인 6,7 다이메틸 8-리비틸루마진(6,7-dimethyl 8-ribityllumazine)이 과다 생산하는 고초균(Bbacillus subtilis) 유래의 돌연변이된 리보플라빈 오페론를 포함하는 재조합 플라스미드 (recombinant plasmid)를 제조한 뒤, 이를 대장균에 형질 전환하면, 대장균이 발광한다는 사실을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 상기의 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 이에 본 발명자들은 발광하는 대장균을 연구하던 중, 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래 루마진 단백질의 N 말단 절반 부위를 암호화하는 유전자(N-Lump), 루마진 단백질 유전자의 과다 발현을 유도하기 위해 상기 균 유래 lux L 프로모터 또는 lux C 프로모터, 및 루마진 리간드인 6,7 다이메틸 8-리비틸루마진(6,7-dimethyl 8-ribityllumazine)이 과다 생산하는 고초균(Bacillus subtilis) 유래의 돌연변이된 리보플라빈 오페론를 포함하는 재조합 플라스미드 (recombinant plasmid)를 제조한 뒤, 이를 대장균에 형질 전환하면, 대장균이 발광한다는 사실을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 a) 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래의 lux C 프로모터; b) 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래의 N-LumP 루마진 단백질을 코딩하는 유전자; 및 c) 고초균(Bacillus subtilis) 유래의 돌연변이된 리보플라빈 오페론을 포함하는 생물 발광 유도용 재조합 플라스미드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 a) 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래의 lux L 프로모터; b) 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래의 N-LumP 루마진 단백질을 코딩하는 유전자; 및 c) 고초균(Bacillus subtilis) 유래의 돌연변이된 리보플라빈 오페론을 포함하는 생물 발광 유도용 재조합 플라스미드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 플라스미드로 형질 전환된, 생물 발광용 형질 전환체를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 a) 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래의 lux C 프로모터; b) 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래의 N-LumP 루마진 단백질을 코딩하는 유전자; 및 c) 고초균(Bacillus subtilis) 유래의 돌연변이된 리보플라빈 오페론을 포함하는 생물 발광 유도용 재조합 플라스미드를 제공 할 수 있다.
본 발명은 또한 a) 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래의 lux L 프로모터; b) 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래의 N-LumP 루마진 단백질을 코딩하는 유전자; 및 c) 고초균(Bacillus subtilis) 유래의 돌연변이된 리보플라빈 오페론을 포함하는 생물 발광 유도용 재조합 플라스미드를 제공 할 수 있다.
상기 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래의 lux C 프로모터는 서열번호 1의 염기서열로 구성될 수 있다.
상기 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래의 lux L 프로모터는 서열번호 2의 염기서열로 구성될 수 있다.
상기 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래의 N-LumP 루마진 염기서열은 서열번호 3의 염기 서열로 코드될 수 있다.
상기 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래의 N-LumP 루마진 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
상기 리보플라빈 오페론 중 ribE는 서열번호 5의 염기 서열로 구성될 수 있다.
상기 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래의 N-LumP 루마진 단백질 유전자는 서열번호 6의 염기서열로 구성되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7의 염기서열로 구성되는 역방향 프라이머를 이용하여 증폭될 수 있다.
상기 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래의 lux C 프로모터는 서열번호 8의 염기서열로 구성되는 정방향 프라이머 및 서열번호 9의 염기서열로 구성되는 역방향 프라이머를 이용하여 증폭될 수 있다.
상기 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래의 lux L 프로모터는 서열번호 10의 염기서열로 구성되는 정방향 프라이머 및 서열번호 11의 염기서열로 구성되는 역방향 프라이머를 이용하여 증폭될 수 있다.
본 발명은 상기 재조합 플라스미드로 형질 전환된 생물 발광용 형질 전환체를 제공할 수 있다.
본 발명의 포토박테리움 포스포리움(Photobactedium phosphoreum) 유래의 루마진 단백질 유전자; lux C 또는 lux L 프로모터; 및 고초균 (Bacillus subtilis) 유래의 돌연 변이된 리보플라빈 오페론을 포함하는 생물 발광 유도용 재조합 플라스미드를 대장균에 형질 전환하면, 야생형 대장균의 형광 강도의 약 2 내지 약 500배로 증가하는 효과가 있다. 이를 이용하여 세포내에서 동력학을 연구하는데 쓰일 표지 단백질을 발굴할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum)의 lux 오페론 구조를 나타낸다.
도 2는 pRFN4 벡터 원형 및 루마진 단백질과 luxC 또는 lux L의 프로모터가 삽입된 pRFN4 벡터를 나타낸다.
도 3은 재조합 플라스미드를 아가로즈 겔을 이용하여 확인한 결과이다.
도 4는 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) DNA를 포함하는 재조합 플라스미드로 형질 전환된 대장균 43R의 상대적인 형광을 410㎚ 및 450㎚파장에서 형광분광광도계로 측정한 결과이다.
도 5는 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) DNA를 포함하는 재조합 플라스미드로 형질 전환된 대장균 43R의 컨포칼 현미경 (confocal microscopy)를 수행한 결과이다.
이하에서 본 발명을 자세하게 설명한다.
상술한 바와 같이, 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래 루마진 단백질; 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래 lux C 프로모터 또는 lux L 프로모터와 및 리보플라빈 오페론을 포함하는 재조합 플라스미드를 제조하여 생물 발광 분석용으로 제공하는 것에 대하여는 현재까지 연구되거나 보고된 바가 없다.
이에 본 발명자들은 발광하는 대장균을 연구하던 중, 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래 루마진 단백질의 N 말단 절반 부위를 암호화하는 유전자(N-LumP), 루마진 단백질 유전자의 과다 발현을 유도하기 위해 상기 균 유래 lux L 프로모터 또는 lux C 프로모터, 및 루마진 리간드인 6,7 다이메틸 8-리비틸루마진(6,7dimethyl 8-ribityllumazine)이 과다 생산하는 고초균(Bacillus subtilis) 유래의 돌연변이된 리보플라빈 오페론를 포함하는 재조합 플라스미드 (recombinant plasmid)를 제조한 뒤, 이를 대장균에 형질 전환하면, 대장균이 발광한다는 사실을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 a) 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래의 lux C 프로모터; b) 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래의 N-LumP 루마진 단백질을 코딩하는 유전자; 및 c) 고초균(Bacillus subtilis) 유래의 돌연변이된 리보플라빈 오페론을 포함하는 생물 발광 유도용 재조합 플라스미드를 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 a) 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래의 lux L 프로모터; b) 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래의 N-LumP 루마진 단백질을 코딩하는 유전자; 및 c) 고초균(Bacillus subtilis) 유래의 돌연변이된 리보플라빈 오페론을 포함하는 생물 발광 유도용 재조합 플라스미드를 제공할 수 있다.
상기 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래의 lux C 프로모터는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 것이 바람직하나, 이에 한정 되지는 않는다. 상기 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum)은 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) NCBM 844일 수 있다.
상기 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래의 lux L 프로모터는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 것이 바람직하나 이에 한정 되지는 않는다.
본 발명의 루마진 염기서열은 서열번호 3의 염기서열로 구성되며, 상기 서열번호 3의 염기서열에 의하여 코드되는 아미노산 서열로 구성된 N-LumP 이나 이에 한정되지 않는다. 이때, N-LumP는 루마진 단백질의 N 말단 절반을 의미하며 서열번호 4에 나타난 바와 같이 아미노산 서열 117번까지 포함된 단백질을 의미한다.
상기 서열번호 5의 염기 서열은 야생형(Wild type)의 ribE에서 두 번째 아미노산 잔기인 페닐알라닌을 알라닌으로 돌연변이 시킨 서열이다. ribE로 부터 발현되는 아미노산 중에서 두 번째 잔기인 페닐알라닌을 알라닌으로 돌연변이 시키는 경우 루마진 리간드가 리보플라빈으로 전환되는 과정이 봉쇄되어 루마진 리간드인 6,7 다이메틸 8-리비틸루마진(6,7 dimethyl 8-ribityllumazine)이 과다 생산된다.
상기 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래의 N-LumP 루마진 단백질 유전자는 서열번호 6의 염기서열로 구성되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7의 염기서열로 구성되는 역방향 프라이머를 이용하여 증폭될 수 있다.
상기 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래의 lux C 프로모터는 서열번호 8의 염기서열로 구성되는 정방향 프라이머 및 서열번호 9의 염기서열로 구성되는 역방향 프라이머를 이용하여 증폭될 수 있다.
상기 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래의 lux L 프로모터는 서열번호 10의 염기서열로 구성되는 정방향 프라이머 및 서열번호 11의 염기서열로 구성되는 역방향 프라이머를 이용하여 증폭될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 본 발명자들은 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum)의 lux L 또는 lux C의 프로모터 구조 및 pRFN4의 구조를 확인하고, 루마진 단백질 및 lux L 또는 lux C의 프로모터를 도입한 pRFN4의 구조를 확인하였다 (도 1 내지 도 3).
N 말단 루마진 단백질을 코딩하는 유전자와 luxL 프로모터가 삽입된 pRFN4 플라스미드를 포함하는 형질전환체를 410nm 및 450nm의 파장에서 측정한 결과, 형광의 세기가 가장 강한 것으로 나타났으며, 야생형 대장균의 형광 세기에 비해 최대 500배까지 증가하였다 (도 4). 이에 비해 luxC 프로모터가 삽입된 재조합 플라스미드는 pRFN4 벡터가 포함된 형질전환체의 형광 세기보다 강했지만, luxL 프로모터가 삽입된 재조합 플라스미드를 포함하는 형질전환체의 형광세기에 비해 다소 낮은 형광세기로 나타났다 (도 4). 상기 재조합 플라스미드를 대장균 43R에 형질전환하여 공촛점 현미경(conforal microscope)로 형광 이미지를 측정한 결과, lux C 프로모터 또는 lux L 프로모터가 삽입된 재조합 플라스미드를 포함하는 형질 전환체의 단일 세포에서도 형광이 강하게 나타나는 것을 이미지로 확인하였다 (도 5).
본 발명은 또한 상기 재조합 플라스미드로 형질 전환된 생물 발광용 형질 전환체를 제공할 수 있다.
상기 형질 전환체의 숙주세포는 세균일 수 있고, 상기 세균은 대장균일 수 있다. 상기 대장균은 형질 전환체의 제조에 사용되는 통상의 대장균일 수 있으며, 바람직하게는 대장균 43R 일 수 있다.
또한, 본 발명은 a) 상기 형질 전환체를 배양하는 단계; 및
b) 상기 단계 a)에서 배양한 형질 전환체 배양 배지의 형광 세기를 측정하는 단계; 를 포함하는 생물 발광 분석 방법을 제공 할 수 있다.
본 발명의 상기 단계 b)의 형광 세기 측정은, 400 ㎚ 내지 460 ㎚의 여기파장(excitation wavelength), 구체적으로는 410 ㎚ 내지 450 ㎚의 여기파장으로 빛을 조사하여 470 ㎚ 내지 570 ㎚의 발광파장(emission wavelength), 구체적으로는 480 ㎚ 내지 550 ㎚, 더욱 구체적으로는 500 ㎚ 내지 540 ㎚의 발광파장을 갖는 형광파장을 측정하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
따라서, 본 발명은 루마진 단백질과 루마진 리간드가 결합하는 경우 루마진 단백질에 비하여 강한 형광을 나타내므로, 상기 형질전환체를 포함하는 형질전환체는 표지(reporter) 미생물로 활용 가능하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 재조합 플라스미드의 제조
본 발명의 형질전환에 사용하기 위하여 루마진 단백질을 코딩하는 유전자, lux C 프로모터 또는 lux L 프로모터 및 리보플라빈 생합성 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 제작하였다. 오페론 주형 유전자를 제공하기 위한 플라스미드로서 고초균(Bacillus subtilis)의 리보플라빈 생합성 오페론이 삽입되어 있는 pRFN4 재조합 플라스미드를 사용하였다. 이때, 리보플라빈 오페론 내의 ribE 유전자로부터 발현되는 아미노산 중에서 두 번째 잔기인 페닐알라닌을 알라닌으로 돌연변이 시켰다. 다음으로, 루마진 단백질은 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum)로부터 유래한 서열번호 4의 N-말단 루마진 단백질(N-terminallumazine protien, N-LumP)를 사용하였다. 루마진 단백질을 암호화하는 유전자의 증폭을 위하여 PpEE in pT7 플라스미드 및 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 사용하였으며, 이때 사용된 프라이머는 아래 [표 1]과 같다. 또한 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래의 lux C 프로모터 또는 lux L 프로모터를 삽입한다. N 말단 루마진 단백질을 암호화하는 유전자, pRFN4를 EcoRI과 BamHI로 절단한 뒤 라이게이션(ligation)하였고, 이에 luxC 프로모터 또는 lux L 프로모터를 EcoRI으로 절단한 뒤 라이게이션(ligation) 하였다. 그 결과 도 2에 나타난 바와 같이 벡터를 제작하였다.
PCR에 사용된 프라이머 서열
유전자 프라이머 서열 서열번호
Pp-N-LumP 정방향 caaatgaaga agaattccat tttaaatatg 6
Pp-N-LumP 역방향 aaactttaag aggatcctct tcttc 7
Pp-luxC 프로모터 정방향 ctttatcata gaattccctt taaattcc 8
Pp-luxC 프로모터 역방향 cttgttattt ttattgaatt cttattcttt c 9
Pp-luxL 프로모터 정방향 gtttatcgaa ttccatttta aatcatc 10
Pp-luxL 프로모터 역방향 catatttaaa atggaattct tcatttgg 11
실시예 2. 재조합 플라즈미드의 확인
실시예1에서 N 말단 루마진 단백질을 암호화하는 유전자는 EcoRI과 BamHI로 절단하고, luxC 프로모터 또는 lux L 프로모터는 EcoRI로 절단한 후, 위와 동일한 제한효소로 절단한 pRFN4와 라이게이션(ligation)하여 제조된 플라스미드를 그 결과 도 3과 같이 PCR(Polymerase Chain Reaction)과정과 제한효소 EcoRI로 절단하고 아가로즈 젤을 이용하여 확인하였다.
실시예 3. 재조합 플라스미드를 포함하는 형질 전환체의 형광세기 측정
[실시예 1]에서 제조된 재조합 플라스미드를 포함하는 형질 전환체의 종류 및 파장 길이별로 형광세기를 측정하고자 하였다. [실시예 1]에서 제조한 재조합 플라스미드들을 E.coli 43R에 형질전환 시켰다. 버퍼 A(Buffer A; 트리스아미노메테인(TrisHCl) 50 mM, 디티오트레이톨(Dithiothreitol, DTT) 0.5 mM, 에틸렌다이아민테트라 아세트산(Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA) 0.5 mM, pH 7.2)를 사용하여 여기파장을 410 ㎚ 및 450 ㎚의 파장에서 형광분광광도계(fluorescence spectrometer; Perkin Elmer LS 45)로 측정하였다. 도 4와 같이 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래의 lux L 프로모터, 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래의 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되는 N-LumP 루마진 단백질을 코딩하는 유전자 및 lux C 프로모터를 라이게이션하여 pRFN4에 삽입하여 제조한 재조합 플라스미드로 형질 전환된 형질 전환체가 410 ㎚ 및 450 ㎚의 여기파장의 형광세기가 가장 강한 것으로 나타났다. 이 결과 도 4와 같이 여기파장(excitation spectrum)을 410nm 및 450nm의 파장에서 N 말단 루마진 단백질을 코딩하는 유전자와 luxL 프로모터가 삽입된 pRFN4 플라스미드를 포함하는 형질전환체의 형광의 세기가 가장 강한 것으로 나타났으며, 야생형 대장균의 형광 세기에 비해 최대 500배까지 증가하였다. 이에 비해 luxC 프로모터가 삽입된 재조합 플라스미드는 pRFN4 벡터가 포함된 형질전환체의 형광 세기보다 강했지만, luxL 프로모터가 삽입된 재조합 플라스미드를 포함하는 형질전환체의 형광세기에 비해 다소 낮은 형광세기로 나타났다.
실시예 4. conforcal microscope의 이미지 확인
[실시예 1]에서 제조된 재조합플라스미드를 포함하는 형질전환체의 종류 및 파장별로 공초점 현미경(confocal microscope)을 통해 단일 세포 (single cell) 상태에서 형광이 나타나는 것을 이미지화하였다. 구체적으로, poly-L-lysine으로 코팅된 슬라이드 글라스(slide glass)에 LB 배지(Luria Bertani media)에 배양된 야생형 대장균 및 재조합플라스미드를 포함하는 형질전환체를 올린 후 커버글라스(cover glass)로 덮어 공초점 현미경(confocal microscopy)로 관찰하였다. 도 5에서 보는 바와 같이 lux C 프로모터 또는 lux L 프로모터가 삽입된 재조합 플라스미드를 포함하는 형질전환체의 단일 세포에서도 형광이 강하게 나타나는 것을 이미지로 확인하였다.
<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> Recombinant plasmids for induction of bioluminescence <130> 1064888 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 258 <212> DNA <213> Photobacterium phosphoreum <400> 1 gaattccctt taaattccgc attgcacata ctcaatcagc atacaacctt gctgcatagg 60 tatggctaga gactaactaa atttcattag gtatgtaagg gaaatttgta tgatatggat 120 gcattgttaa atttattggg ttaatgtcac atttttaata tagaactttg ttatttatta 180 attcaggtct attttaaaac acctttaaat ataaaataag agcatttaac tacatattaa 240 ttgaaagaat aagaattc 258 <210> 2 <211> 205 <212> DNA <213> Photobacterium phosphoreum <400> 2 gaattccatt ttaaatcatc tacttactag ctttaatttc aactaaaaac acctatctaa 60 agaaaatcac atcttaaaca ccttgtctaa aatagaaatt aaaataaaaa gttaattatt 120 aaaaacggat taaatatcaa aaaaatatta tttagtattg aattttattt ttttatcatt 180 agactaattt ccaaatgaag aattc 205 <210> 3 <211> 392 <212> DNA <213> Photobacterium phosphoreum <400> 3 gaattccatt ttaaatatgt ttatcgacaa aaggagatta ttatgttcaa aggtatagtt 60 cagggcgctg gaataattaa aaaaatatca aaaaatgatg acacccaaag acatggcatt 120 acttttccaa aagatatatt ggaatcaatt gaaaaaggta ctgtcatgct cgtaaatggc 180 tgctcattaa ctgttgttcg aattagtggt gatgtagttt atttcgatat agatcaagca 240 attaacacta caacctttag agaattagaa gtcggtaaca aggtgaactt agaggtgcgt 300 ccagaatttg gatcactcct tgggaaaggt gctttaactg gaaatataaa gggtgtcgct 360 actgttgata atattactga agaagaggat cc 392 <210> 4 <211> 117 <212> PRT <213> Photobacterium phosphoreum <400> 4 Met Phe Lys Gly Ile Val Gln Gly Ala Gly Ile Ile Lys Lys Ile Ser 1 5 10 15 Lys Asn Asp Asp Thr Gln Arg His Gly Ile Thr Phe Pro Lys Asp Ile 20 25 30 Leu Glu Ser Ile Glu Lys Gly Thr Val Met Leu Val Asn Gly Cys Ser 35 40 45 Leu Thr Val Val Arg Ile Ser Gly Asp Val Val Tyr Phe Asp Ile Asp 50 55 60 Gln Ala Ile Asn Thr Thr Thr Phe Arg Glu Leu Glu Val Gly Asn Lys 65 70 75 80 Val Asn Leu Glu Val Arg Pro Glu Phe Gly Ser Leu Leu Gly Lys Gly 85 90 95 Ala Leu Thr Gly Asn Ile Lys Gly Val Ala Thr Val Asp Asn Ile Thr 100 105 110 Glu Glu Glu Asp Arg 115 <210> 5 <211> 648 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 5 atggctacag gaattatcga agaaacaggc acaatcgaat ccatgaaaaa agcagggcat 60 gcaatggcct taactattaa atgctcaaag attttagagg atgttcatct tggcgacagc 120 attgcagtga acggcatttg tctgactgtc actgatttta caaaaaatca attcacagtg 180 gatgttatgc ctgaaacagt caaagctacg tcactgaatg atttaacaaa aggaagcaaa 240 gtaaatctgg aaagagcgat ggcggcaaac ggccgtttcg gaggccattt cgtctcaggc 300 catgtcgacg gaactgcgga aatcacacga attgaagaga aaagcaacgc agtttactat 360 gatttaaaaa tggacccgtc attaacaaaa acattggttt taaagggatc aattactgtg 420 gatggcgtga gcttaaccat attcggcctg acagaagaca cagtgacgat ctccttaata 480 ccgcatacga tcagcgaaac gatcttttca gaaaaaacga tcggctctaa agtgaatatc 540 gaatgcgata tgatcggaaa atatatgtat cgatttttgc ataaagccaa tgaaaataag 600 acccaacaaa ccattacaaa agccttctta agcgaaaacg gcttttag 648 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pp N-LumP_F <400> 6 caaatgaaga agaattccat tttaaatatg 30 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pp N-LumP_R <400> 7 aaactttaag aggatcctct tcttc 25 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pp luxC promoter_F <400> 8 ctttatcata gaattccctt taaattcc 28 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pp luxC promoter_R <400> 9 cttgttattt ttattgaatt cttattcttt c 31 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pp luxL promoter_F <400> 10 gtttatcgaa ttccatttta aatcatc 27 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pp luxL promoter_R <400> 11 catatttaaa atggaattct tcatttgg 28

Claims (10)

  1. 삭제
  2. a) 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래의 lux L 프로모터;
    b) 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래의 N-LumP 루마진 단백질을 코딩하는 유전자; 및
    c) 고초균(Bacillus subtilis) 유래의 돌연변이된 리보플라빈 오페론을 포함하고,
    상기 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래의 N-LumP 루마진 염기서열은 서열번호 3의 염기 서열로 코드되는, 생물 발광 유도용 재조합 플라스미드.
  3. 삭제
  4. 제 2항에 있어서, 상기 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래의 lux L 프로모터는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는, 재조합 플라스미드.
  5. 삭제
  6. 제 2항에 있어서, 상기 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래의 N-LumP 루마진 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되는, 재조합 플라스미드.
  7. 제 2항에 있어서, 상기 리보플라빈 오페론 중 ribE는 서열번호 5의 염기 서열로 구성되는, 재조합 플라스미드.
  8. 제 2항에 있어서, 상기 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum) 유래의 N-LumP 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 6의 염기서열로 구성되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7의 염기서열로 구성되는 역방향 프라이머를 이용하여 증폭될 수 있는, 재조합 플라스미드.
  9. 제 2항에 있어서, 상기 luxL 프로모터는 서열번호 10의 염기서열로 구성되는 정방향 프라이머 및 서열번호 11의 염기서열로 구성되는 역방향 프라이머를 이용하여 증폭될 수 있는, 재조합 플라스미드.
  10. 제 2항의 재조합 플라스미드로 형질 전환된, 생물 발광용 형질 전환체.
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