TWI580691B

TWI580691B - 源自地毯海葵之藍色螢光蛋白

Info

Publication number: TWI580691B
Application number: TW105111741A
Authority: TW
Inventors: 蔡懷楨; 江政一; 陳彥廷; 林正勇
Original assignee: 蔡懷楨; 江政一; 陳彥廷; 林正勇
Priority date: 2016-04-15
Filing date: 2016-04-15
Publication date: 2017-05-01
Also published as: TW201736395A

Description

源自地毯海葵之藍色螢光蛋白

本發明是關於一種新穎的藍色螢光蛋白。更具體來說，本發明是關於一種源自地毯海葵之藍色螢光蛋白，其胺基酸序列與序列編號：1之胺基酸序列有至少96%的序列相似度。

螢光蛋白泛指一群帶有螢光團(fluorophore)的蛋白。螢光團通常為包含多個芳香基團的平面或環狀分子，在受到特定波長照射的光線或其他電磁輻射照射後，會發出另一種波長的光線。依照不同的吸收及發散特性，常見的螢光蛋白可分為藍色螢光蛋白、靛青色螢光蛋白、綠色螢光蛋白、黃色螢光蛋白、橘色螢光蛋白、紅色螢光蛋白、及遠紅光螢光蛋白等，習知技藝人士可因應不同的需求從中挑選適合的螢光蛋白來使用。

基於螢光易於觀察與偵測的特性，螢光蛋白常作為報導分子，應用於各式實驗研究中。舉例來說，螢光蛋白於生醫領域常見的用途包含： (1)基因表現：將用以編碼螢光蛋白之基因與特定基因連結，可藉由偵測螢光蛋白的表現來研究特定基因之表現位置及/或表現量； (2)標的特性：將螢光蛋白與標的分子(例如抗體或藥物)結合，可利用螢光蛋白來了解標的分子之標的特性； (3)分子檢測：將螢光蛋白與特定分子(例如抗體或核酸探針)結合，可使用流式細胞儀或螢光顯微鏡等技術進行定性或定量分析； (4)毒殺特性：將作用分子(例如藥物或免疫細胞)投予至會表現螢光蛋白之細胞後，觀察細胞培養液中的螢光含量，可快速且準確分析作用分子對細胞的毒殺特性及/或專一性；以及 (5)基因轉殖：利用不同的啟動子來驅動螢光蛋白於動物體(例如斑馬魚或小鼠)以全身或侷部方式進行表現，藉由觀察螢光表現量，研發人員可了解特定基因/分子於活體中的致病機制、治療藥物的作用路徑及功效。

一般來說，在目前巿售的螢光蛋白中，多數螢光蛋白仍具有穩定性不佳、螢光強度不足及/或半衰期過短等缺點。有鑑於此，相關領域亟需一種新穎的螢光蛋白，藉以更有效地進行各種活體內/外的分析應用。

發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。

本揭示內容的第一態樣是關於一種單離之螢光蛋白，其胺基酸序列與序列編號：1之胺基酸序列有至少96%的序列相似度。依據本揭示內容實施方式，該螢光蛋白第63及64個胺基酸殘基皆為白胺酸(leucine)。

依據本揭示內容一實施方式，該螢光蛋白第158個胺基酸殘基為絲胺酸(serine)或離胺酸(lysine)。依據本揭示內容另一實施方式，該螢光蛋白第173個胺基酸殘基為異白胺酸(isoleucine)。依據本揭示內容再另一實施方式，該螢光蛋白第158個胺基酸殘基為絲胺酸或離胺酸，且第173個胺基酸殘基為異白胺酸。在一特定實施例中，該螢光蛋白具有序列編號：5或6的胺基酸序列。

本揭示內容的第二態樣是關於一種用以編碼本發明螢光蛋白之單離核酸片段。依據本揭示內容實施方式，該單離之核酸片段的核苷酸序列與序列編號：7之核苷酸序列有至少96%的序列相似度。

本揭示內容的第三及第四態樣分別提供一種用以表現本發明螢光蛋白的重組載體及系統。

依據本揭示內容一實施方式，該重組載體包含本發明單離之核酸片段。

依據本揭示內容一實施方式，該系統包含本發明重組載體及一用以表現該重組載體的宿主細胞。

本揭示內容另一態樣提供了一種用以表現本發明螢光蛋白的套組。依據本揭示內容實施方式，該套組包含一試劑及一用以裝載該試劑的容器，其中該試劑可以是本發明上述態樣/實施方式所述之螢光蛋白、核酸片段、重組載體或系統。

在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一段點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。

除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。

「核酸序列」(nucleic acid sequence)、「多核苷酸」(polynucleotide)或「核酸」(nucleic acid)在本說明書中可交替使用，可指一雙股去氧核糖核酸(deoxyribonuclic acid, DNA)、一單股DNA或所述DNA之轉錄產物(例如核糖核酸分子，ribonucleic acid，RNA)。需知本揭示內容無關乎自然界或自然狀態下的基因多核苷酸序列。能用以分離或純化(或部分純化)本發明之核酸、多核苷酸或核苷酸序列的方法包含，但不限於離子交換色層分析(ion-exchange chromatography)、分子篩選色層分析(molecular size exclusion chromatography)或是可用於基因工程技術諸如擴增(amplification)、扣除雜交法(subtractive hybridization)、轉殖(cloning)、次轉殖(sub-cloning)、化學合成(chemical synthesis)或其組合等基因工程技術。

本發明亦包含所有簡併核苷酸序列(degenerate nucleotide sequence)，其係用以編碼於生物體中具有特定活性或功能的胜肽/多肽/蛋白(例如本發明螢光蛋白)。「簡併核苷酸序列」(degenerate nucleotide sequence)是指包含一或多個簡併密碼子(degenerate codon；與可編碼一多肽之參考多核苷酸分子相比)的核苷酸序列。簡併密碼子可包含不同的核苷酸三聯體(triplet)，卻可編碼出相同的胺基酸殘基(例如GAU及GAC三聯體皆係用以編碼天門冬胺酸(aspartic acid, Asp))。

在本說明書中，「蛋白」(protein)一詞係指由多個胺基酸殘基所組成的高分子。於本說明書中，除非另有說明，任何胺基酸序列係由N端開始記載，且胺基酸殘基於其中的位置係由該胺基酸列列的N端起算。本發明之範圍亦涵蓋了其他相較於所述螢光蛋白(如，序列編號：1)具有保守性置換的螢光蛋白。在此處，「保守性置換」(conservative substitution)一詞係指利用另一種在生物學上相似的殘基來取代某一殘基；一般來說，經保守性置換的蛋白質和原始蛋白質在二級、三級或四級結構或生理、生化功能上不會有顯著的改變。保守性置換的例示包括親水性殘基彼此間的置換，譬如異白胺酸(isoleucine, Ile, I)、纈胺酸(valine, Val, V)、白胺酸(leucine, Leu, L)與甲硫胺酸(methionine, Met, M)等之間的置換, 或相近極性的殘基彼此間的置換，例如精胺酸(arginine, Arg, R)與離胺酸(lysine, Lys, L)之間或是麩胺酸(glutamine, Gln, Q)與天冬胺酸(aspartic acid, Asp, D)之間, 也還包括其他適當的置換方式。「保守性置換」在此亦指利用一具有取代基的胺基酸來取代一不具有取代基的原始胺基酸。

於本說明書中，「單離的」(isolated)一詞是用以描述蛋白質及核酸等生物分子在自然界中的狀態經過了人為操作，而使其離開了其天然原生環境(native environment)。舉例來說，存在於生物體中的蛋白質就不是經單離的，但從此一蛋白質的天然狀態中將蛋白質與其他共同存在的物質分離，所得到的就是經單離的蛋白質。另一方面，一段核酸片段原本存在於自然界生物體的基因組(genome)中，而單離的核酸片段包括將該核酸片段和緊鄰在前(5’端)、後(3’端)的核苷酸殘基互相分離；此外，單離的核酸片段亦包括將一核酸片段插入於一載體(如質體或病毒載體)、或整合至一原核或真核生物的基因組內。再者，利用人為方法合成所得的蛋白質、核酸(包括DNA、RNA及cDNA)，也是經單離的蛋白質/核酸；上述人為合成方法包括但不限於：化學合成、重組遺傳技術以及聚合酶連鎖反應。

此處針對蛋白質或核酸片段之胺基酸序列或核苷酸序列所述的「序列相似度百分比」(Percent (%) sequence identity)係指一候選蛋白質或核酸片段的胺基酸/核苷酸殘基與一參考蛋白質或核酸片段的胺基酸/核苷酸殘基完全相同的百分比。於進行上述比對時，可將所述的候選蛋白質/核酸片段與所述的蛋白質或核酸片段並排，並於必要時引入間隙，以使二序列形成最高的序列相似度。在計算相似度時，保守性置換之胺基酸殘基視為不同的殘基；簡併密碼子的核苷酸殘基也視為不同的殘基，譬如同樣編碼天門冬醯胺酸(asparagine, Asn, N)的密碼子AAU和AAC之間，視為有一個不同的殘基。相關領域已有多種方法可供進行上述並排，譬如可公開取得的軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)等。本發明所屬技術領域中具有通常知識者在進行並排時，可選擇適當的參數與計算方式，以得到最佳的排列方式。在本說明書中，二胺基酸/核苷酸序列間的序列比較是採用美國國家生物科技資訊中心(Nation Center for Biotechnology Information，簡稱NCBI)所提供的蛋白質-蛋白質BLAST分析資料庫Blastp或核苷酸-核苷酸BLAST分析資料庫Blastn來進行。一候選序列A相較於一參考序列B的胺基酸/核苷酸序列相似度(在本說明書中亦稱之為序列A與序列B具有特定百分比(%)的胺基酸/核苷酸序列相似度)的計算方式如下: <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td width="233" height="5"></td></tr><tr><td></td><td><img wi="107" he="43" file="02_image001.jpg" img-format="jpg"></img></td></tr></TBODY></TABLE>其中X是利用Blastp或Blastn分析資料庫對序列A、B進行排列後所得到的相同胺基酸/核苷酸殘基數目(identical matches)，而Y是A、B二序列中較短者的胺基酸/核苷酸殘基總數。

(I) 螢光蛋白

色素蛋白(chromoprotein)是一種包含色素輔基(pigmented prosthetic group；或稱為色素輔因子，pigmented cofactor)的蛋白複合體。本發明部分是基於發明人首次發現，對源自地毯海葵( Stichodactyla haddoni)之色素蛋白(即shCP)的第63及64個胺基酸位置進行突變，可使該色素蛋白產生螢光表現特性。

因此，本發明的第一態樣是關於一種單離之螢光蛋白。依據本揭示內容實施方式，該螢光蛋白的胺基酸序列與序列編號：1之胺基酸序列有至少96%的序列相似度；意即，本發明螢光蛋白的胺基酸序列與序列編號：1之胺基酸序列具有96%、97%、98%、99%或100%的序列相似度。

依據本揭示內容某些實施方式，該螢光蛋白第63及64個胺基酸殘基皆為白胺酸。在一較佳實施例中，該螢光蛋白具有序列編號：1的胺基酸序列，且命名為shBFP；依據該實施例，shBFP可發散藍色螢光。

依據本揭示內容一實施方式，相較於色素蛋白shCP不具有螢光表現特性，本發明shBFP為一藍色螢光蛋白，其最大激發波長為401奈米，最大發散波長為458奈米，產生的量子量(quantum yield)為0.79。

為製備螢光強度更高的螢光蛋白，本發明進一步針對shBFP的數個胺基酸殘基位置進行突變，得到以下5種改良性螢光蛋白： (1) shBFP-N158S：將shBFP第158個胺基酸殘基由天門冬醯胺酸置換為絲胺酸，產生的螢光蛋白具有序列編號：2的胺基酸序列； (2) shBFP-N158K：將shBFP第158個胺基酸殘基由天門冬醯胺酸置換為離胺酸，產生的螢光蛋白具有序列編號：3的胺基酸序列； (3) shBFP-L173I：將shBFP第173個胺基酸殘基由白胺酸置換為異白胺酸，產生的螢光蛋白具有序列編號：4的胺基酸序列； (4) shBFP-N158S/L173I：將shBFP第158個胺基酸殘基由天門冬醯胺酸置換為絲胺酸，第173個胺基酸殘基由白胺酸置換為異白胺酸，產生的螢光蛋白具有序列編號：5的胺基酸序列；以及 (5) shBFP-N158K/L173I：將shBFP第158個胺基酸殘基由天門冬醯胺酸置換為離胺酸，第173個胺基酸殘基由白胺酸置換為異白胺酸，產生的螢光蛋白具有序列編號：6的胺基酸序列。

依據本揭示內容某些實施方式，相較於其他已知的藍色螢光蛋白，本發明螢光蛋白shBFP及改良性螢光蛋白(即shBFP-N158S、shBFP-N158K、shBFP-L173I、shBFP-N158S/L173I及shBFP-N158K/L173I)具有較低的消光係數(extinction coefficient)，且可產生較高的量子量。

依據本揭示內容其他實施方式，本發明5種改良性螢光蛋白(即shBFP-N158S、shBFP-N158K、shBFP-L173I、shBFP-N158S/L173I及shBFP-N158K/L173I)皆可發散較shBFP更高的螢光強度。

(II) 核酸片段

本發明的第二態樣是關於一種單離的核酸片段，其係用以編碼如上述態樣/實施方式所述之螢光蛋白。依據本揭示內容一實施方式，該單離之核酸片段的核苷酸序列與序列編號：7之核苷酸序列有至少96%的序列相似度；例如96%、97%、98%、99%或100%的序列相似度。

序列編號：7之核苷酸序列是用以編碼序列編號：1之shBFP的cDNA序列。當可想見，基於序列編號：7的各種簡併密碼子之序列變異，亦必然可編碼出本發明shBFP；因此，這些基於簡併密碼子所導致的序列變異，也落於本發明請求保護的範圍中。

此外，承上所述，本發明藍色螢光蛋白不限於序列編號：1之shBFP，而是涵蓋此一序列的合理變異範圍(例如，序列相似度至少96%的胺基酸序列)。由此可知，本發明所述之單離的核酸片段也涵蓋編碼這些變異蛋白質序列的各種核苷酸序列。

可利用任何本所屬領域習知技藝人士慣用技術來製備本發明核酸片段，例如亞磷醯胺法(phosphoramidite method)、聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)、定點突變(site-directed mutagenesis)或其組合。依據本揭示內容實施方式，是先利用PCR反應由地毯海葵擴增用以編碼shCP之核酸片段後，以定點突變方式置換核酸片段中特定位置的核苷酸，據以製備可分別編碼shBFP、shBFP-N158S、shBFP-N158K、shBFP-L173I、shBFP-N158S/L173I及shBFP-N158K/L173I的核酸片段。

依據本揭示內容某些實施方式，用以編碼shBFP-N158S的核酸片段具有序列編號：8的核苷酸序列；用以編碼shBFP-N158K的核酸片段具有序列編號：9的核苷酸序列；用以編碼shBFP-L173I的核酸片段具有序列編號：10的核苷酸序列；用以編碼shBFP-N158S/L173I的核酸片段具有序列編號：11的核苷酸序列；而用以編碼shBFP-N158K/L173I的核酸片段則具有序列編號：12的核苷酸序列。

(III) 重組載體

本揭示內容的第三態樣提供了一種包含本發明核酸片段的重組載體。結構上，除了本發明核酸片段，該重組載體更包含一啟動子，藉以驅動核酸片段的表現。因應不同應用需求，習知技藝人士可挑選適當的啟動子來驅動本發明核酸片段於特定細胞位置(例如細胞膜或細胞質)、特定生物體(例如原核生物或真核生物)及/或特定生物體組織(例如肝臟、胰臟或神經系統)進行表現。

舉例來說，適用於在原核生物中驅動基因表現的啟動子包含，但不限於，T3啟動子、T5啟動子、T7啟動子、 trp啟動子、 lac啟動子、 tac啟動子(為 trp和 lac啟動子的雜合體)、 lac衍生的啟動子、 araBAD啟動子、 recA啟動子、 proU啟動子、 cst-1啟動子、 tatA啟動子、 cadA啟動子、 nar啟動子、 cspA啟動子、SP6啟動子、Rhamnose啟動子和 phoA啟動子。

適用於在真核生物中驅動基因表現的啟動子可選擇自，但不限於，由SV40早期啟動子(SV40 early promoter)、勞斯肉瘤病毒啟動子(Rous sarcoma virus promoter)、腺病毒主要晚期啟動子(adenovirus major late promoter)、人類巨細胞病毒即時早期啟動子(human cytomegalovirus (CMV) immediate early promoter)、小鼠幹細胞病毒啟動子(murine stem cell virus (MSCV) promoter)、病毒內部啟動子(virus's internal promoter)、泛素啟動子(Ubiquitin C (UbC) promoter)、延長因子-1α啟動子(elongation factor-1α (EF-1α) promoter)、磷酸甘油酸激酶啟動子(phosphoglycerate kinase (PGK) promoter)或CMV早期啟動子(CMV early enhancer)/α-肌動蛋白啟動子(α-actin promoter)所組成的群組。

亦或是，習知技藝人士可選擇適當的啟動子來趨動本發明核酸片段於特定組織或器官進行表現；舉例來說，可使用白蛋白(albumin)啟動子或甲型胎兒蛋白(α-fetoprotein, AFP)啟動子來趨動本發明核酸片段於肝臟進行表現；可使用第II型胰島素(insulin II)啟動子或Pdx-1啟動子來趨動本發明核酸片段於胰臟進行表現；或是使用第I型突觸(synapsin I, SYN)啟動子來趨動本發明核酸片段於神經系統進行表現。

因應不同的使用需求，本發明重組載體可更包含其他控制/表現序列；例如若欲於原核生物進行表現，本發明重組載體可更包含複製起始序列(origin of replication)、操縱子(operon)、抗生素基因及/或篩選標記(selectable marker)；而若欲於真核生物進行表現，本發明重組載體則可更包含複製起始序列、轉譯起始序列、轉譯終止序列、促進子/緘默子(enhancer/silencer)、抗生素基因、分泌訊息序列(secretion signal sequence)及/或篩選標記(selectable marker)。

當可利用本所屬領域習知技藝人士熟知的方法來建構本發明重組載體，例如適當的限制酶、Gateway ^®轉殖系統或同源重組(homologous recombination)。

(IV) 表現系統

本發明第四態樣是關於一種用以表現本發明螢光蛋白的表現系統。依據本揭示內容某些實施方式，該表現系統包含一本發明第(II)部分所述之核酸片段及一宿主細胞。依據本揭示內容某些實施方式，該表現系統包含一本發明第(III)部分所述之重組載體及一宿主細胞。

適當的宿主細胞包括，但不限於，原核生物細胞、酵母細胞、真菌以及高等的真核生物細胞。習知技藝人士可利用適當的方法將本發明核酸片段及/或重組載體轉殖至一宿主細胞中。

舉例來說，可作為宿主細胞的原核生物細胞包括革蘭式陽性的細菌(如芽孢桿菌屬( Bacillus spp.)與鏈球菌屬( Streptomyces spp.)細菌)以及蘭式陰性的細菌(如大腸桿菌)。常用以將外源性DNA及/或載體轉殖至一原核生物細胞的方法包含化學處理(例如將原核生物細胞培養於包含二價陽離子的溶液中，再以熱進行處理)，以及電穿孔(electroporation，例如以電場刺激原核生物細胞，使其於細胞膜上產生孔洞)。

例示性的酵母細胞包括酵母菌屬( Saccharomyces spp.)或裂殖酵母屬 (Schizosaccharomyces spp.)的細胞，譬如啤酒酵母( Saccharomyces cerevisae)與克魯佛酵母( Saccharomyces kluyveri)。將核酸片段或重組載體轉殖至酵母細胞內的方法包括酵素處理(以酵素降解酵母菌的細胞壁)、化學處理(以鹼性陽離子處理酵母菌)、電穿孔及玻璃珠攪拌。

真菌類細胞則包括了來自麴黴屬( Aspergillus spp.)、麵包黴菌屬( Neurospora spp.)、鐮胞菌( Fusarium spp.)與木黴菌( Trichoderma spp.)的細胞。可利用以知的重組技術，譬如同源重組(homologous recombination)或異源重組(heterologous recombination)，將核酸片段嵌入宿主染色體中，以進行轉型。

例示性之高等真核生物細胞包括，但不限於，HEK293細胞、HeLa細胞、COS細胞、BHK細胞、CHL細胞與CHO細胞。用以將外源性DNA及/或載體轉殖至一高等真核生物細胞的方法包含以化學(例如磷酸鈣、高分支有機化合物/樹枝狀聚合物(dendrimer)、脂質體及陽離子聚合物)處理真核生物細胞、電穿孔、細胞擠壓(cell squeezing，輕壓細胞膜)、超音波穿孔(sonoporation，包含利用高強度超音波於細胞膜形成孔洞)、光轉染(optical transfection，利用高聚焦電射於細胞膜製造一微小孔洞)、基因交付(impalefection，將DNA連接至一可穿透細胞之奈米纖維的表面)、基因槍(gene gun，將DNA連接至一奈米粒子後，直接注入標的細胞核內)、磁轉染(magnetofection)/磁輔助轉染(magnet assisted transfection，利用磁力將DNA送至標的細胞內)，以及病毒法/病毒轉染(利用病毒作為轉體，將DNA送至標的細胞內)。

經轉殖後，本發明核酸片段及/或重組載體可暫時性地(transciently)或永久性地(permanently)於宿主細胞中進行表現。更具體來說，暫時性地表現是指在轉殖後，將宿主細胞培養於適當的培養條件下，使宿主細胞於特定時間內(不同宿主具有不同的表現時間)表現轉殖的核酸片段及/或重組載體。永久性地表現則是指在轉殖後，持續以抗生素進行篩選，以得到轉型株(transformant)；將轉型株培養於適當的培養條件下，可使宿主細胞持續性地表現本發明螢光蛋白。

習知技藝人士可例用慣用方法由宿主細胞分離及/或純化本發明螢光蛋白；舉例來說，可利用粒徑篩析層析法(size exclusion chromatography)、親和層析法(affinity chromatography)及高效液層析法(high performance liquid chromatography, HPLC)等方法來分離及/或純化本發明螢光蛋白。

(V) 表現套組

本揭示內容的第五態樣是關於一種用以表現本發明螢光蛋白的套組。依據本揭示內容實施方式，該套組包含一試劑及一用以裝載該試劑之容器；其中該試劑可以是本揭示內容第(I)部分之螢光蛋白、第(II)部分之核酸片段、第(III)部分之重組載體或第(IV)部分之表現系統。

可將所述試劑製備成易於保存的形式，並包裝於容器內。所述套組內的各種材料可分別包裝於適當的容器內，如小玻璃瓶(vial)、試管(tube)、微滴定孔盤(microtiter well plate)、瓶子(bottle)及與其相似者。套組內亦可包含獨立包裝的其他可任選試劑；如，陽性對照組(positive control)樣本、陰性對照組(negative control)樣本、緩衝液、細胞培養基等。

於可任選的實施方式中，上述套組包含所述試劑的使用說明。所述使用說明不限於紙本印刷形式，亦包含電子形式的使用說明(如，儲存於光碟片中)。或者是可將使用說明儲存於一網際網路網站，並於套組內提供可用以存取使用說明內容之連結(link)或網際網路地址(internet address)。上述的網際網路網站可以是公開的或具安全機制的網站。

下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。 實施例

材料及方法

建構重組載體

以shCP序列作為PCR模板，分別以包含限制酶 NdeI切位的正向引子5’15bSHCP NdeI F (序列編號：47)與包含突變點反向引子(序列編號：16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44或46)夾取含突變序列的5’端DNA片段。將含限制酶 BamHI切位的反向引子3’15bSHCP BamHI R (序列編號：48)與突變點正向引子(序列編號：15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或45)夾取含突變序列的3’端DNA片段。將PCR所取得之含突變序列5’端及3’端DNA片段進行PCR片段接合反應得完整shCP突變片段shCP-PM。將此片段進行TA轉殖(TA cloning)接合至pGEM-Te載體中，並轉形到大腸桿菌(DH5α)，回收質體DNA並以定序確定突變片段的DNA序列。之後含突變序列之質體與pET-15b分別與酵素BamHI與NdeI作用，取得二端皆為突出端(sticky end)之包含突變的DNA片段(大小為650 bp，5’端具有 NdeI限制酶切割位置，3’端具有 BamHI限制酶切割位置)及大小為7 kbp之5’ NdeI-pET-15b-3’ BamHI DNA片段。將兩片段混合均勻進行接合。轉形到大腸桿菌(DH5α)中，回收質體DNA並定序確定突變片段接合點的正確性防止蛋白質轉譯錯誤。表1　本實驗PCR所使用的引子 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="_0007"><TBODY><tr><td><b>建構體</b></td><td><b>引子名稱</b></td><td><b>序列編號</b></td></tr><tr><td> E63L/Y64L </td><td> sh_E63LY64L_F </td><td> 15 </td></tr><tr><td> sh_E63LY64L_R </td><td> 16 </td></tr><tr><td> E63L/Y64A </td><td> sh_E63LY64A_F </td><td> 17 </td></tr><tr><td> sh_E63LY64A_R </td><td> 18 </td></tr><tr><td> E63L/Y64I </td><td> sh_E63LY64I_F </td><td> 19 </td></tr><tr><td> sh_E63LY64I_R </td><td> 20 </td></tr><tr><td> E63L/Y64W </td><td> sh_E63LY64W_F </td><td> 21 </td></tr><tr><td> sh_E63LY64W_R </td><td> 22 </td></tr><tr><td> E63L/Y64H </td><td> sh_E63LY64H_F </td><td> 23 </td></tr><tr><td> sh_E63LY64H_R </td><td> 24 </td></tr><tr><td> E63L/Y64F </td><td> sh_E63LY64F_F </td><td> 25 </td></tr><tr><td> sh_E63LY64F_R </td><td> 26 </td></tr><tr><td> W90F </td><td> sh_W90F_F </td><td> 27 </td></tr><tr><td> sh_W90F_R </td><td> 28 </td></tr><tr><td> W90R </td><td> sh_W90R_F </td><td> 29 </td></tr><tr><td> sh_W90R_R </td><td> 30 </td></tr><tr><td> E145D </td><td> sh_ E145D_F </td><td> 31 </td></tr><tr><td> sh_ E145D_R </td><td> 32 </td></tr><tr><td> E145R </td><td> sh_ E145R_F </td><td> 33 </td></tr><tr><td> sh_ E145R_R </td><td> 34 </td></tr><tr><td> N158Q </td><td> sh_ N158Q_F </td><td> 35 </td></tr><tr><td> sh_ N158Q_R </td><td> 36 </td></tr><tr><td> N158I </td><td> sh_ N158I_F </td><td> 37 </td></tr><tr><td> sh_ N158I_R </td><td> 38 </td></tr><tr><td> N158S </td><td> sh_ N158S_F </td><td> 39 </td></tr><tr><td> sh_ N158S_R </td><td> 40 </td></tr><tr><td> N158K </td><td> sh_ N158K_F </td><td> 41 </td></tr><tr><td> sh_ N158K_R </td><td> 42 </td></tr><tr><td> L173I </td><td> sh_ L173I_F </td><td> 43 </td></tr><tr><td> sh_ L173I_R </td><td> 44 </td></tr><tr><td> L198I </td><td> sh_ L198I_F </td><td> 45 </td></tr><tr><td> sh_ L198I_R </td><td> 46 </td></tr><tr><td> pET-15b-X </td><td> 5' 15bSHCP Nde1 F </td><td> 47 </td></tr><tr><td> 3' 15bSHCP BamH1 R </td><td> 48 </td></tr></TBODY></TABLE>

製備蛋白

將重組載體轉形至大腸桿菌細胞BL21中，培養至OD ₆₀₀讀值為0.4時，加入1 mM的異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1- thiogalactopyranoside, IPTG)，以誘發螢光蛋白表現。以200 rpm的轉速於20 ^°C培養24小時後，以5,000 rpm的轉速於4 ^°C離心10分鐘，收集經IPTG誘發表現的大腸桿菌，並使大腸桿菌懸浮於1毫升的脫鹽緩衝液(desalting buffer；包含50 mM之Tris-HCl 及100 mM之NaCl，pH 7.4)中。將懸浮液置於冰上進行音波振盪處理，再以13,000 rpm的轉速於4 ^°C離心10分鐘。將上清液注入以洗滌緩衝液(包含20 mM之咪唑(imidazole)、50 mM之Tris-HCl及100 mM之NaCl， pH 7.4)預先處理的His GraviTrap™管柱(GE Healthcare)中。接著，以10毫升的洗滌緩衝液洗滌管柱10次。以3毫升之沖提緩衝液(包含200 mM之咪唑、50 mM之Tris-HCl及100 mM之NaCl，pH 7.4)沖提與His標籤結合之蛋白後，利用脫鹽緩衝液及HiTrap脫鹽管柱(GE Healthcare)進行脫鹽及緩衝液置換。

於斑馬魚胚胎表現 shBFP

為了使重組載體於斑馬魚胚胎進行表現，以shBFP的cDNA作為模版，利用引子shBFP_5’AgeI (ACCGGTCGCCACCATGGCCGG TTTGTTGAAAG，序列編號：13)及引子shBFP_3’PmlI (CACGTGTCAATTTGCTTTTTCA GG，序列編號：14)進行PCR反應。以限制酶 XhoI切割包含斑馬魚α-肌動蛋白啟動子的質體(Lin et al., 2006)後，利用Klenow DNA聚合酶(Klenow DNA polymerase, NEB)進行填補反應(filled-in)，並以限制酶 AgeI進行切割。將得到的質體與shBFP片段進行接合，以製得質體pZα-shBFP。以限制酶 NotI (NEB)切割pZα-shBFP後，將線性化產物、注射染劑(Phenol Red)及無菌蒸餾水均勻混合，並使質體的最終濃度為每微升25奈克。將上述包含線性化產物的混合物微注射至單細胞斑馬魚胚胎。

測量光譜特性

利用1公分的光路徑石英比色管於25 ^°C 測量濃度為每毫升0.25毫克之TagBFP、shBFP及shBFP-突變衍生物的光譜。以Hitachi F-7000螢光光度計測量各蛋白於波長300-600奈米時的激發光譜及於波長400-700奈米的發散光譜。在計算量子量時，是以量子量為0.53的TGFP作為標準值。

半自然聚丙烯醯胺凝膠電泳 (Semi-native Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

利用12% SDS-PAGE於半自然的條件下分析重組shBFP蛋白，其中該shBFP未經熱處理(即未變性)，且注入緩衝液(loading buffer)不包含SDS。

實施例 1 對 shCP 進行突變

shCP原為一種在可見光下呈現紫紅色的色素蛋白，且不具有螢光表現特性。在實施例1中，利用定位點突變分別對shCP之數個位置的胺基酸殘基進行突變置換，據以製備數種可發出藍色螢光的螢光蛋白。

1.1 製備 shBFP

首先，利用定位點突變對shCP之發色團區域(chromophore region)進行突變置換，藉以改變突變色素蛋白的光譜特性。在將shCP色素蛋白之胺基酸殘基E63突變為白胺酸(即E63L)時，突變的shCP-E63L蛋白在可見光下會呈現皮膚色，在400奈米冷光照射下則會發出淡藍色的螢光(第1A及1B圖)。基於該些結果，進一步產生Y64L及Y64H突變來改變光學特性。結果顯示，相較於單一突變shCP-E63L，具有Y64L突變之shCP-E63L (雙突變，即shCP-E63L/Y64L，以下簡稱shBFP)會產生亮度更高的藍色螢光；而shCP-E63L/Y64H突變蛋白則不會顯著地增加螢光亮度(第1B圖)。

此外，利用傳統BFP (即TagBFP，作為比對shBFP的光學特性時的參照蛋白)可發現，shBFP與該已知藍色螢光蛋白具有相似的物理特性(第1D及1E圖)。值得注意的是，在相同濃度的情況下，利用肉眼於昏暗環境觀察可發現，shBFP發出的藍色螢光會較TagBFP發出的藍色螢光密集；另一方面，相較於shBFP，TagBFP則會發出的亮度較高的藍色螢光(第1C圖)。

該些結果指出，若對色素蛋白shCP進行E63L單點突變，產生的突變蛋白shCP-E63L會具備螢光表現特性；此時，若進一步對shCP-E63L進行Y64L突變(即產生突變蛋白shBFP)，則會增加藍色螢光的表現亮度。

1.2 製備 shBFP-N158K/L173I 及 shBFP-N158S/L173I

有鑑於shBFP可產生藍色螢光，進一步分析5Å發色團附近的胺基酸後，挑選shBFP蛋白中包含W90、E145、N158、L173及L198共5個位置的胺基酸殘基進行定位點突變，藉以增加或穩定shBFP的藍色螢光表現特性。表2總結了shBFP之特定位置突變後，各突變株的螢光特性。表2　源自shBFP之突變株及其螢光特性 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="_0010"><TBODY><tr><td> 位置 </td><td> 突變 </td><td> 光學特性 </td></tr><tr><td> W90 </td><td> W90F </td><td> 淡藍色螢光 </td></tr><tr><td> </td><td> W90R </td><td> 無螢光 </td></tr><tr><td> E145 </td><td> E145D </td><td> 淡藍色螢光 </td></tr><tr><td> </td><td> E145R </td><td> 無螢光 </td></tr><tr><td> N158 </td><td> N158I </td><td> 藍色螢光 </td></tr><tr><td> </td><td> N158Q </td><td> 藍色螢光 </td></tr><tr><td> </td><td> N158S </td><td> 增強的藍色螢光 </td></tr><tr><td> </td><td> N158K </td><td> 增強的藍色螢光 </td></tr><tr><td> L173 </td><td> L173I </td><td> 增強的藍色螢光 </td></tr><tr><td> L198 </td><td> L198I </td><td> 增強的藍色螢光 </td></tr></TBODY></TABLE>

依據表2及第2A圖可知，在所有突變蛋白中，shBFP-W90F及shBFP-E145D的螢光亮度會減弱，而shBFP-N158I、shBFP-L173I及shBFP-L198I則具有與shBFP相同或較shBFP更亮的螢光表現量。接著對N158及L173二個位置同時進行突變，以產生shBFP-N158K/L173I及shBFP-N158S/L173I；結果顯示， shBFP-N158K/L173I及shBFP-N158S/L173I皆會產生較shBFP更亮的藍色螢光(結果未顯示)。

該些結果指出，若對shBFP進行N158K/L173I或N158S/L173I雙點突變，會進一步增加藍色螢光的表現亮度。

1.3 分析源自 shBFP 之螢光蛋白

相較於色素蛋白shCP，E63L突變會使蛋白發出螢光。因此，在本實施例將檢測源自shBFP之螢光蛋白的光學特性；表3總結了該些結果。表3　分析源自shBFP之螢光蛋白的光學特性 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="_0011"><TBODY><tr><td> 螢光蛋白 </td><td> Abs<sub>max</sub> (奈米) </td><td> 最大激發波長 (奈米) </td><td> 最大發散波長 (奈米) </td><td> 消光係數(M<sup>-1</sup>cm<sup>-1</sup>) </td><td> 量子量 </td><td> 相對於E63L/Y64L之亮度(%) </td></tr><tr><td> shBFP </td><td> 412 </td><td> 401 </td><td> 458 </td><td> 15407 </td><td> 0.79 </td><td> 100.00 </td></tr><tr><td> shCP-E63L/Y64H </td><td> 402 </td><td> 403 </td><td> 451 </td><td> 1276 </td><td> 0.17 </td><td> 1.78 </td></tr><tr><td> shBFP-N158S/L173I </td><td> 411 </td><td> 375 </td><td> 458 </td><td> 24100 </td><td> 0.84 </td><td> 166.32 </td></tr><tr><td> shBFP-N158K/L173I </td><td> 411 </td><td> 375 </td><td> 458 </td><td> 19500 </td><td> 0.78 </td><td> 124.96 </td></tr></TBODY></TABLE>

依據表3可知，shBFP (即shCP-E63L/Y64L)的激發及發散波峰分別為401奈米及458奈米；其消光係數為15,407 M ^-1•cm ^-1，產生的量子量則為0.79；該結果證實了第1D圖及第1E圖之結果，即相較於色素蛋白shCP，突變蛋白shBFP具有較強的螢光強度。

依據表3、第1D圖及第1E圖可知，shCP-E63L/Y64H蛋白的最大激發及發散波峰會分別平移至403奈米及451奈米；其消光係數為1,276 M ^-1•cm ^-1，產生的量子量為0.17 (該數值解釋了低螢光表現量)。相較於在發色團產生突變，於shBFP之發色團附近進行單一胺基酸置換不會改變最大激發或發散波長，卻會改變突變蛋白的總吸收或發散強度(第2B及2C圖)。

若同時將shBFP之N158及L173殘基進行突變，可發現shBFP-N158K/L173I及shBFP-N158S/L173I的螢光亮度皆會增加。如表3結果所示，shBFP-N158K/L173I蛋白的消光係數為19,500 M ^-1•cm ^-1，產生的量子量為0.78；shBFP-N158S/L173I蛋白的消光係數為24,100 M ^-1•cm ^-1，產生的量子量為0.84 (因此在所有shBFP突變蛋白中，shBFP-N158S/L173I的螢光表現亮度最高)。第3A圖為shBFP-N158S/L173I的激發光譜，右方為其於可見光下的照片；第3B圖則為shBFP-N158S/L173I的發散光譜。

1.4 比對本發明螢光蛋白及其他藍色螢光蛋白

實施例1.4進一步比對本發明螢光蛋白及其他螢光蛋白的光學特性；表4總結該些分析結果。表4　不同螢光蛋白之光學特性 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="_0012"><TBODY><tr><td> 螢光蛋白 </td><td> 激發波長 (奈米) </td><td> 發散波長 (奈米) </td><td> 消光係數(M<sup>-1</sup>cm<sup>-1</sup>) </td><td> 量子量 </td><td> 亮度<sup>a</sup></td></tr><tr><td> EBFP </td><td> 377 </td><td> 446 </td><td> 30000 </td><td> 0.15 </td><td> 4.5 </td></tr><tr><td> EBFP2 </td><td> 383 </td><td> 448 </td><td> 32000 </td><td> 0.45 </td><td> 14.4 </td></tr><tr><td> mBlueberry2 </td><td> 402 </td><td> 467 </td><td> 51000 </td><td> 0.48 </td><td> 24.5 </td></tr><tr><td> Azurite </td><td> 383 </td><td> 447 </td><td> 26200 </td><td> 0.55 </td><td> 14.4 </td></tr><tr><td> mTagBFP </td><td> 399 </td><td> 456 </td><td> 41400 </td><td> 0.63 </td><td> 26.1 </td></tr><tr><td> mTagBFP2 </td><td> 399 </td><td> 454 </td><td> 50600 </td><td> 0.64 </td><td> 32.4 </td></tr><tr><td> Cerulean </td><td> 433 </td><td> 475 </td><td> 43000 </td><td> 0.62 </td><td> 26.7 </td></tr><tr><td> shBFP </td><td> 401 </td><td> 458 </td><td> 15407 </td><td> 0.79 </td><td> 12.1 </td></tr><tr><td> shBFP-N158S/L173I </td><td> 375 </td><td> 458 </td><td> 24100 </td><td> 0.84 </td><td> 20.2 </td></tr></TBODY></TABLE>^a以消光係數(單位為mM ^-1cm ^-1)及量子量計算得到亮度。

依表4可知，相較於其他螢光蛋白，本發明螢光蛋白shBFP及shBFP-N158S/L173I具有較低的消光係數，且會產生較高的量子量。該結果指出，shBFP的吸光能力並未較其他螢光蛋白的吸光能力高；且可利用色素蛋白相關策略來製備具有高能量轉換率的新穎螢光蛋白。

實施例 2 表現 shBFP

為評估shBFP是否可作為用以標記特定器官或組織的生物標籤，分別將shBFP cDNA轉殖至細菌表現載體pET-15b、哺乳動物細胞表現載體pCS2 ⁺及斑馬魚表現載體pZα (該載體包含斑馬魚α-肌動蛋白啟動子)中。於20 ^°C培養2-3天後，可觀察到相較於未經誘發之對照組，經shBFP轉形之大腸桿菌在以400奈米之冷光照射下會發出藍色螢光(第4A及4B圖)。此外，於37 ^°C培養24小時後，可發現經包含TagBFP或shBFP之載體轉染後的人類胚胎腎臟細胞HEK-293T會發散藍色螢光(第4C及4D圖)。將會表現shBFP之質體以微注射方式轉殖至斑馬魚卵後，可在受精後48小時之斑馬魚胚胎的肌肉組織中暫時性地觀察到shBFP表現(第4E及4F圖)。基因轉殖斑馬魚中的藍色螢光確認了shBFP cDNA可於高等真核生物中進行表現。接著，挑選會表現shBFP的斑馬魚，並與野生型斑馬魚進行交配。觀察子代F1之胚胎可再次發現，shBFP會廣泛地表現於胚胎的肌肉組織中(第4G及4H圖)，該結果指出外源性shBFP cDNA可遺傳至子代。據此，shBFP cDNA於大腸桿菌、哺乳動物細胞及斑馬魚胚胎的表現證實了shBFP可作為一生物標籤或篩選性標籤。

值得注意的是，在shBFP未經熱處理而發生變性的情況下，利用半自然聚丙烯醯胺凝膠電泳分析由大腸桿菌製造的重組shBFP可發現一條位於48 kDa位置的蛋白帶(band)、一條位於25 kDa位置的蛋白帶及數條分子量較小的蛋白帶(結果未顯示)。比對未變性shFBP及變性shFBP的電泳分析結果可推測(1) shBFP蛋白會同時以單體(monomer)及同質二聚體(homodimer)的形式存在於細胞質中；以及(2) 在萃取過程中，shBFP容易被切割為小片段胜肽。

綜合上述，本發明提供了數種螢光蛋白、可表現該些螢光蛋白的核酸片段、重組載體、系統及套組。依據本揭示內容，色素蛋白shCP原本不具有螢光表現特性，本發明利用定位點突變將其中數個位置的胺基酸殘基進行突變置換，可製得6種能發散藍色螢光的螢光蛋白(即shBFP、shBFP-N158S、shBFP-N158K、shBFP-L173I、shBFP-N158S/L173I及shBFP-N158K/L173I)。相較於其他已知的螢光蛋白，本發明螢光蛋白具有較低的消光係數，且可產生較高的量子量；意即，本發明螢光蛋白較其他已知螢光蛋白具有更高的能量轉換率，因此能發散亮度更高的螢光。習知技藝人士可依據使用需求，由本揭示內容挑選/製備適合的螢光蛋白，進行各式生物醫學之基礎研究及相關應用。

雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。

為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1圖為依據本揭示內容實施例1所闡述之結果，其中第1A圖為帶有E63L突變之shCP的照片；第1B及1C圖分別為特定螢光蛋白之螢光照片；第1D及1E圖分別為特定螢光蛋白之激發及發散光譜；第2圖為依據本揭示內容實施例1所闡述之結果，其中第2A圖為特定螢光蛋白之螢光照片；第2B及2C圖為特定螢光蛋白之激發及發散光譜；第3圖為依據本揭示內容實施例1所闡述之結果，其中第3A圖為特定蛋白的照片及激發光譜，第3B圖則為特定蛋白的發散光譜；以及第4圖為依據本揭示內容實施例2所闡述之照片，其係關於特定質體於不同生物體之中的表現。

＜110＞蔡懷楨江政一陳彥廷林正勇＜120＞源自地毯海葵之藍色螢光蛋白＜130＞ P2923-TW ＜160＞ 48 ＜170＞ BiSSAP 1.3 ＜210＞ 1 ＜211＞ 227 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ shBFP ＜400＞ 1 Met Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ser Met Arg Ile Lys Met Asp Met Glu 1 5 10 15 Gly Thr Val Asn Gly His Tyr Phe Lys Cys Glu Gly Glu Gly Asp Gly 20 25 30 Asn Pro Phe Thr Gly Thr Gln Ser Met Arg Ile His Val Thr Glu Gly 35 40 45 Ala Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ala Pro Cys Cys Leu Leu 50 55 60 Gly Ser Arg Thr Phe Ile His His Thr Ala Gly Ile Pro Asp Phe Phe 65 70 75 80 Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg Thr Thr Thr Tyr 85 90 95 Glu Asp Gly Gly Ile Leu Thr Ala His Gln Asp Thr Ser Leu Glu Gly 100 105 110 Asn Cys Leu Ile Tyr Lys Val Lys Val Leu Gly Thr Asn Phe Pro Ala 115 120 125 Asp Gly Pro Val Met Lys Asn Lys Ser Glu Gly Trp Glu Pro Cys Thr 130 135 140 Glu Val Val Tyr Pro Asp Asn Gly Val Leu Cys Gly Arg Asn Val Met 145 150 155 160 Ala Leu Lys Val Gly Asp Arg Arg Leu Ile Cys His Leu Tyr Ser Ser 165 170 175 Tyr Lys Ser Lys Lys Ala Ile Arg Ala Leu Thr Met Pro Gly Phe His 180 185 190 Phe Thr Asp Ile Arg Leu Gln Met Pro Arg Lys Lys Lys Asp Glu Tyr 195 200 205 Phe Glu Leu Tyr Glu Ala Ser Val Ala Arg Tyr Ser Asp Leu Pro Glu 210 215 220 Lys Ala Asn 225 ＜210＞ 2 ＜211＞ 227 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ shBFP-N158S ＜400＞ 2 Met Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ser Met Arg Ile Lys Met Asp Met Glu 1 5 10 15 Gly Thr Val Asn Gly His Tyr Phe Lys Cys Glu Gly Glu Gly Asp Gly 20 25 30 Asn Pro Phe Thr Gly Thr Gln Ser Met Arg Ile His Val Thr Glu Gly 35 40 45 Ala Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ala Pro Cys Cys Leu Leu 50 55 60 Gly Ser Arg Thr Phe Ile His His Thr Ala Gly Ile Pro Asp Phe Phe 65 70 75 80 Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg Thr Thr Thr Tyr 85 90 95 Glu Asp Gly Gly Ile Leu Thr Ala His Gln Asp Thr Ser Leu Glu Gly 100 105 110 Asn Cys Leu Ile Tyr Lys Val Lys Val Leu Gly Thr Asn Phe Pro Ala 115 120 125 Asp Gly Pro Val Met Lys Asn Lys Ser Glu Gly Trp Glu Pro Cys Thr 130 135 140 Glu Val Val Tyr Pro Asp Asn Gly Val Leu Cys Gly Arg Ser Val Met 145 150 155 160 Ala Leu Lys Val Gly Asp Arg Arg Leu Ile Cys His Leu Tyr Ser Ser 165 170 175 Tyr Lys Ser Lys Lys Ala Ile Arg Ala Leu Thr Met Pro Gly Phe His 180 185 190 Phe Thr Asp Ile Arg Leu Gln Met Pro Arg Lys Lys Lys Asp Glu Tyr 195 200 205 Phe Glu Leu Tyr Glu Ala Ser Val Ala Arg Tyr Ser Asp Leu Pro Glu 210 215 220 Lys Ala Asn 225 ＜210＞ 3 ＜211＞ 227 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ shBFP-N158K ＜400＞ 3 Met Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ser Met Arg Ile Lys Met Asp Met Glu 1 5 10 15 Gly Thr Val Asn Gly His Tyr Phe Lys Cys Glu Gly Glu Gly Asp Gly 20 25 30 Asn Pro Phe Thr Gly Thr Gln Ser Met Arg Ile His Val Thr Glu Gly 35 40 45 Ala Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ala Pro Cys Cys Leu Leu 50 55 60 Gly Ser Arg Thr Phe Ile His His Thr Ala Gly Ile Pro Asp Phe Phe 65 70 75 80 Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg Thr Thr Thr Tyr 85 90 95 Glu Asp Gly Gly Ile Leu Thr Ala His Gln Asp Thr Ser Leu Glu Gly 100 105 110 Asn Cys Leu Ile Tyr Lys Val Lys Val Leu Gly Thr Asn Phe Pro Ala 115 120 125 Asp Gly Pro Val Met Lys Asn Lys Ser Glu Gly Trp Glu Pro Cys Thr 130 135 140 Glu Val Val Tyr Pro Asp Asn Gly Val Leu Cys Gly Arg Lys Val Met 145 150 155 160 Ala Leu Lys Val Gly Asp Arg Arg Leu Ile Cys His Leu Tyr Ser Ser 165 170 175 Tyr Lys Ser Lys Lys Ala Ile Arg Ala Leu Thr Met Pro Gly Phe His 180 185 190 Phe Thr Asp Ile Arg Leu Gln Met Pro Arg Lys Lys Lys Asp Glu Tyr 195 200 205 Phe Glu Leu Tyr Glu Ala Ser Val Ala Arg Tyr Ser Asp Leu Pro Glu 210 215 220 Lys Ala Asn 225 ＜210＞ 4 ＜211＞ 227 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ shBFP-L173I ＜400＞ 4 Met Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ser Met Arg Ile Lys Met Asp Met Glu 1 5 10 15 Gly Thr Val Asn Gly His Tyr Phe Lys Cys Glu Gly Glu Gly Asp Gly 20 25 30 Asn Pro Phe Thr Gly Thr Gln Ser Met Arg Ile His Val Thr Glu Gly 35 40 45 Ala Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ala Pro Cys Cys Leu Leu 50 55 60 Gly Ser Arg Thr Phe Ile His His Thr Ala Gly Ile Pro Asp Phe Phe 65 70 75 80 Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg Thr Thr Thr Tyr 85 90 95 Glu Asp Gly Gly Ile Leu Thr Ala His Gln Asp Thr Ser Leu Glu Gly 100 105 110 Asn Cys Leu Ile Tyr Lys Val Lys Val Leu Gly Thr Asn Phe Pro Ala 115 120 125 Asp Gly Pro Val Met Lys Asn Lys Ser Glu Gly Trp Glu Pro Cys Thr 130 135 140 Glu Val Val Tyr Pro Asp Asn Gly Val Leu Cys Gly Arg Asn Val Met 145 150 155 160 Ala Leu Lys Val Gly Asp Arg Arg Leu Ile Cys His Ile Tyr Ser Ser 165 170 175 Tyr Lys Ser Lys Lys Ala Ile Arg Ala Leu Thr Met Pro Gly Phe His 180 185 190 Phe Thr Asp Ile Arg Leu Gln Met Pro Arg Lys Lys Lys Asp Glu Tyr 195 200 205 Phe Glu Leu Tyr Glu Ala Ser Val Ala Arg Tyr Ser Asp Leu Pro Glu 210 215 220 Lys Ala Asn 225 ＜210＞ 5 ＜211＞ 227 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ shBFP-N158S/L173I ＜400＞ 5 Met Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ser Met Arg Ile Lys Met Asp Met Glu 1 5 10 15 Gly Thr Val Asn Gly His Tyr Phe Lys Cys Glu Gly Glu Gly Asp Gly 20 25 30 Asn Pro Phe Thr Gly Thr Gln Ser Met Arg Ile His Val Thr Glu Gly 35 40 45 Ala Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ala Pro Cys Cys Leu Leu 50 55 60 Gly Ser Arg Thr Phe Ile His His Thr Ala Gly Ile Pro Asp Phe Phe 65 70 75 80 Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg Thr Thr Thr Tyr 85 90 95 Glu Asp Gly Gly Ile Leu Thr Ala His Gln Asp Thr Ser Leu Glu Gly 100 105 110 Asn Cys Leu Ile Tyr Lys Val Lys Val Leu Gly Thr Asn Phe Pro Ala 115 120 125 Asp Gly Pro Val Met Lys Asn Lys Ser Glu Gly Trp Glu Pro Cys Thr 130 135 140 Glu Val Val Tyr Pro Asp Asn Gly Val Leu Cys Gly Arg Ser Val Met 145 150 155 160 Ala Leu Lys Val Gly Asp Arg Arg Leu Ile Cys His Ile Tyr Ser Ser 165 170 175 Tyr Lys Ser Lys Lys Ala Ile Arg Ala Leu Thr Met Pro Gly Phe His 180 185 190 Phe Thr Asp Ile Arg Leu Gln Met Pro Arg Lys Lys Lys Asp Glu Tyr 195 200 205 Phe Glu Leu Tyr Glu Ala Ser Val Ala Arg Tyr Ser Asp Leu Pro Glu 210 215 220 Lys Ala Asn 225 ＜210＞ 6 ＜211＞ 227 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ shBFP-N158K/L173I ＜400＞ 6 Met Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ser Met Arg Ile Lys Met Asp Met Glu 1 5 10 15 Gly Thr Val Asn Gly His Tyr Phe Lys Cys Glu Gly Glu Gly Asp Gly 20 25 30 Asn Pro Phe Thr Gly Thr Gln Ser Met Arg Ile His Val Thr Glu Gly 35 40 45 Ala Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ala Pro Cys Cys Leu Leu 50 55 60 Gly Ser Arg Thr Phe Ile His His Thr Ala Gly Ile Pro Asp Phe Phe 65 70 75 80 Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg Thr Thr Thr Tyr 85 90 95 Glu Asp Gly Gly Ile Leu Thr Ala His Gln Asp Thr Ser Leu Glu Gly 100 105 110 Asn Cys Leu Ile Tyr Lys Val Lys Val Leu Gly Thr Asn Phe Pro Ala 115 120 125 Asp Gly Pro Val Met Lys Asn Lys Ser Glu Gly Trp Glu Pro Cys Thr 130 135 140 Glu Val Val Tyr Pro Asp Asn Gly Val Leu Cys Gly Arg Lys Val Met 145 150 155 160 Ala Leu Lys Val Gly Asp Arg Arg Leu Ile Cys His Ile Tyr Ser Ser 165 170 175 Tyr Lys Ser Lys Lys Ala Ile Arg Ala Leu Thr Met Pro Gly Phe His 180 185 190 Phe Thr Asp Ile Arg Leu Gln Met Pro Arg Lys Lys Lys Asp Glu Tyr 195 200 205 Phe Glu Leu Tyr Glu Ala Ser Val Ala Arg Tyr Ser Asp Leu Pro Glu 210 215 220 Lys Ala Asn 225 ＜210＞ 7 ＜211＞ 684 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ cDNA_shBFP ＜400＞ 7 atggccggtt tgttgaaaga aagtatgcgc atcaaaatgg acatggaagg caccgttaat 60 ggccattatt tcaagtgtga aggagaagga gacggcaatc catttacagg tacgcagagc 120 atgaggattc atgtcaccga aggggctcca ttaccatttg ccttcgacat tttggcaccg 180 tgttgtcttc ttggcagcag aacctttatc caccatacgg cagggattcc cgatttcttc 240 aagcagtctt tccctgaagg ctttacttgg gaaagaacca caacctatga agatggaggc 300 attcttactg ctcatcaaga cacaagcctc gaggggaact gccttatata caaggtgaaa 360 gtccttggta ccaactttcc tgcggatggc cccgtgatga agaacaaatc agaaggatgg 420 gagccatgca ctgaggtggt ttatccagat aatggtgtcc tgtgtggacg taatgtgatg 480 gcccttaaag tcggtgatcg tcgtttgatc tgccatctct attcttctta caagtccaag 540 aaagcaatcc gtgccttgac aatgccagga tttcacttta cagacatccg ccttcagatg 600 ccgaggaaaa agaaagacga gtactttgaa ctgtacgaag catctgtggc taggtacagt 660 gatcttcctg aaaaagcaaa ttga 684 ＜210＞ 8 ＜211＞ 684 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ cDNA_shBFP-N158S ＜400＞ 8 atggccggtt tgttgaaaga aagtatgcgc atcaaaatgg acatggaagg caccgttaat 60 ggccattatt tcaagtgtga aggagaagga gacggcaatc catttacagg tacgcagagc 120 atgaggattc atgtcaccga aggggctcca ttaccatttg ccttcgacat tttggcaccg 180 tgttgtcttc ttggcagcag aacctttatc caccatacgg cagggattcc cgatttcttc 240 aagcagtctt tccctgaagg ctttacttgg gaaagaacca caacctatga agatggaggc 300 attcttactg ctcatcaaga cacaagcctc gaggggaact gccttatata caaggtgaaa 360 gtccttggta ccaactttcc tgcggatggc cccgtgatga agaacaaatc agaaggatgg 420 gagccatgca ctgaggtggt ttatccagat aatggtgtcc tgtgtggacg ttctgtgatg 480 gcccttaaag tcggtgatcg tcgtttgatc tgccatatct attcttctta caagtccaag 540 aaagcaatcc gtgccttgac aatgccagga tttcacttta cagacatccg ccttcagatg 600 ccgaggaaaa agaaagacga gtactttgaa ctgtacgaag catctgtggc taggtacagt 660 gatcttcctg aaaaagcaaa ttga 684 ＜210＞ 9 ＜211＞ 684 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ cDNA_shBFP-N158K ＜400＞ 9 atggccggtt tgttgaaaga aagtatgcgc atcaaaatgg acatggaagg caccgttaat 60 ggccattatt tcaagtgtga aggagaagga gacggcaatc catttacagg tacgcagagc 120 atgaggattc atgtcaccga aggggctcca ttaccatttg ccttcgacat tttggcaccg 180 tgttgtcttc ttggcagcag aacctttatc caccatacgg cagggattcc cgatttcttc 240 aagcagtctt tccctgaagg ctttacttgg gaaagaacca caacctatga agatggaggc 300 attcttactg ctcatcaaga cacaagcctc gaggggaact gccttatata caaggtgaaa 360 gtccttggta ccaactttcc tgcggatggc cccgtgatga agaacaaatc agaaggatgg 420 gagccatgca ctgaggtggt ttatccagat aatggtgtcc tgtgtggacg taaagtgatg 480 gcccttaaag tcggtgatcg tcgtttgatc tgccatatct attcttctta caagtccaag 540 aaagcaatcc gtgccttgac aatgccagga tttcacttta cagacatccg ccttcagatg 600 ccgaggaaaa agaaagacga gtactttgaa ctgtacgaag catctgtggc taggtacagt 660 gatcttcctg aaaaagcaaa ttga 684 ＜210＞ 10 ＜211＞ 684 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ cDNA_shBFP-L173I ＜400＞ 10 atggccggtt tgttgaaaga aagtatgcgc atcaaaatgg acatggaagg caccgttaat 60 ggccattatt tcaagtgtga aggagaagga gacggcaatc catttacagg tacgcagagc 120 atgaggattc atgtcaccga aggggctcca ttaccatttg ccttcgacat tttggcaccg 180 tgttgtcttc ttggcagcag aacctttatc caccatacgg cagggattcc cgatttcttc 240 aagcagtctt tccctgaagg ctttacttgg gaaagaacca caacctatga agatggaggc 300 attcttactg ctcatcaaga cacaagcctc gaggggaact gccttatata caaggtgaaa 360 gtccttggta ccaactttcc tgcggatggc cccgtgatga agaacaaatc agaaggatgg 420 gagccatgca ctgaggtggt ttatccagat aatggtgtcc tgtgtggacg taatgtgatg 480 gcccttaaag tcggtgatcg tcgtttgatc tgccatatct attcttctta caagtccaag 540 aaagcaatcc gtgccttgac aatgccagga tttcacttta cagacatccg ccttcagatg 600 ccgaggaaaa agaaagacga gtactttgaa ctgtacgaag catctgtggc taggtacagt 660 gatcttcctg aaaaagcaaa ttga 684 ＜210＞ 11 ＜211＞ 684 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ cDNA_shBFP-N158S/L173I ＜400＞ 11 atggccggtt tgttgaaaga aagtatgcgc atcaaaatgg acatggaagg caccgttaat 60 ggccattatt tcaagtgtga aggagaagga gacggcaatc catttacagg tacgcagagc 120 atgaggattc atgtcaccga aggggctcca ttaccatttg ccttcgacat tttggcaccg 180 tgttgtcttc ttggcagcag aacctttatc caccatacgg cagggattcc cgatttcttc 240 aagcagtctt tccctgaagg ctttacttgg gaaagaacca caacctatga agatggaggc 300 attcttactg ctcatcaaga cacaagcctc gaggggaact gccttatata caaggtgaaa 360 gtccttggta ccaactttcc tgcggatggc cccgtgatga agaacaaatc agaaggatgg 420 gagccatgca ctgaggtggt ttatccagat aatggtgtcc tgtgtggacg ttctgtgatg 480 gcccttaaag tcggtgatcg tcgtttgatc tgccatatct attcttctta caagtccaag 540 aaagcaatcc gtgccttgac aatgccagga tttcacttta cagacatccg ccttcagatg 600 ccgaggaaaa agaaagacga gtactttgaa ctgtacgaag catctgtggc taggtacagt 660 gatcttcctg aaaaagcaaa ttga 684 ＜210＞ 12 ＜211＞ 684 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ cDNA_shBFP-N158K/L173I ＜400＞ 12 atggccggtt tgttgaaaga aagtatgcgc atcaaaatgg acatggaagg caccgttaat 60 ggccattatt tcaagtgtga aggagaagga gacggcaatc catttacagg tacgcagagc 120 atgaggattc atgtcaccga aggggctcca ttaccatttg ccttcgacat tttggcaccg 180 tgttgtcttc ttggcagcag aacctttatc caccatacgg cagggattcc cgatttcttc 240 aagcagtctt tccctgaagg ctttacttgg gaaagaacca caacctatga agatggaggc 300 attcttactg ctcatcaaga cacaagcctc gaggggaact gccttatata caaggtgaaa 360 gtccttggta ccaactttcc tgcggatggc cccgtgatga agaacaaatc agaaggatgg 420 gagccatgca ctgaggtggt ttatccagat aatggtgtcc tgtgtggacg taaagtgatg 480 gcccttaaag tcggtgatcg tcgtttgatc tgccatatct attcttctta caagtccaag 540 aaagcaatcc gtgccttgac aatgccagga tttcacttta cagacatccg ccttcagatg 600 ccgaggaaaa agaaagacga gtactttgaa ctgtacgaag catctgtggc taggtacagt 660 gatcttcctg aaaaagcaaa ttga 684 ＜210＞ 13 ＜211＞ 32 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞引子-shBFP_5' AgeI ＜400＞ 13 accggtcgcc accatggccg gtttgttgaa ag 32 ＜210＞ 14 ＜211＞ 24 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞引子-shBFP_3' PmlI ＜400＞ 14 cacgtgtcaa tttgcttttt cagg 24 ＜210＞ 15 ＜211＞ 26 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ sh_E63LY64L_F ＜400＞ 15 accgtgttgt cttcttggca gcagaa 26 ＜210＞ 16 ＜211＞ 26 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ sh_E63LY64L_R ＜400＞ 16 ttctgctgcc aagaagacaa cacggt 26 ＜210＞ 17 ＜211＞ 26 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ sh_E63LY64A_F ＜400＞ 17 accgtgttgt cttgccggca gcagaa 26 ＜210＞ 18 ＜211＞ 26 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ sh_E63LY64A_R ＜400＞ 18 ttctgctgcc ggcaagacaa cacggt 26 ＜210＞ 19 ＜211＞ 26 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ sh_E63LY64I_F ＜400＞ 19 accgtgttgt cttatcggca gcagaa 26 ＜210＞ 20 ＜211＞ 26 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ sh_E63LY64I_R ＜400＞ 20 ttctgctgcc gataagacaa cacggt 26 ＜210＞ 21 ＜211＞ 26 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ sh_E63LY64W_F ＜400＞ 21 accgtgttgt ctttggggca gcagaa 26 ＜210＞ 22 ＜211＞ 26 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ sh_E63LY64W_R ＜400＞ 22 ttctgctgcc ccaaagacaa cacggt 26 ＜210＞ 23 ＜211＞ 26 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ sh_E63LY64H_F ＜400＞ 23 accgtgttgt cttcacggca gcagaa 26 ＜210＞ 24 ＜211＞ 26 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ sh_E63LY64H_R ＜400＞ 24 ttctgctgcc gtgaagacaa cacggt 26 ＜210＞ 25 ＜211＞ 26 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ sh_E63LY64F_F ＜400＞ 25 accgtgttgt cttttcggca gcagaa 26 ＜210＞ 26 ＜211＞ 26 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ sh_E63LY64F_R ＜400＞ 26 ttctgctgcc gaaaagacaa cacggt 26 ＜210＞ 27 ＜211＞ 29 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ sh_ W90F_F ＜400＞ 27 gaaggcttta cttttgaaag aaccacaac 29 ＜210＞ 28 ＜211＞ 29 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ sh_ W90F_R ＜400＞ 28 gttgtggttc tttcaaaagt aaagccttc 29 ＜210＞ 29 ＜211＞ 29 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ sh_ W90R_F ＜400＞ 29 gaaggcttta ctcgggaaag aaccacaac 29 ＜210＞ 30 ＜211＞ 29 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ sh_ W90R_R ＜400＞ 30 gttgtggttc tttcccgagt aaagccttc 29 ＜210＞ 31 ＜211＞ 23 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ sh_ E145D_F ＜400＞ 31 gccatgcact gacgtggttt atc 23 ＜210＞ 32 ＜211＞ 23 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ sh_ E145D_R ＜400＞ 32 gataaaccac gtcagtgcat ggc 23 ＜210＞ 33 ＜211＞ 23 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ sh_ E145R_F ＜400＞ 33 gccatgcact cgggtggttt atc 23 ＜210＞ 34 ＜211＞ 23 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ sh_ E145R_R ＜400＞ 34 gataaaccac ccgagtgcat ggc 23 ＜210＞ 35 ＜211＞ 23 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ sh_ N158Q_F ＜400＞ 35 gtgtggacgt caggtgatgg ccc 23 ＜210＞ 36 ＜211＞ 23 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ sh_ N158Q_R ＜400＞ 36 gggccatcac ctgacgtcca cac 23 ＜210＞ 37 ＜211＞ 23 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ sh_ N158I_F ＜400＞ 37 gtgtggacgt attgtgatgg ccc 23 ＜210＞ 38 ＜211＞ 23 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ sh_ N158I_R ＜400＞ 38 gggccatcac aatacgtcca cac 23 ＜210＞ 39 ＜211＞ 23 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ sh_ N158S_F ＜400＞ 39 gtgtggacgt tctgtgatgg ccc 23 ＜210＞ 40 ＜211＞ 23 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ sh_ N158S_R ＜400＞ 40 gggccatcac agaacgtcca cac 23 ＜210＞ 41 ＜211＞ 23 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ sh_ N158K_F ＜400＞ 41 gtgtggacgt aaagtgatgg ccc 23 ＜210＞ 42 ＜211＞ 23 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ sh_ N158K_R ＜400＞ 42 gggccatcac tttacgtcca cac 23 ＜210＞ 43 ＜211＞ 32 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ sh_ L173I_F ＜400＞ 43 gtttgatctg ccatatctat tcttcttaca ag 32 ＜210＞ 44 ＜211＞ 32 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ sh_ L173I_R ＜400＞ 44 cttgtaagaa gaatagatat ggcagatcaa ac 32 ＜210＞ 45 ＜211＞ 21 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ sh_ L198I_F ＜400＞ 45 gacatccgca ttcagatgcc g 21 ＜210＞ 46 ＜211＞ 21 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ sh_ L198I_R ＜400＞ 46 cggcatctga atgcggatgt c 21 ＜210＞ 47 ＜211＞ 24 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ 5' 15bSHCP Nde1 F ＜400＞ 47 cggcagccat atggccggtt tgtt 24 ＜210＞ 48 ＜211＞ 25 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ 3' 15bSHCP BamH1 R ＜400＞ 48 gttagcagcc ggatcctcaa tttgc 25

Claims

一種單離之螢光蛋白，其係具有序列編號：1、2、3、4、5或6的胺基酸序列。
一種單離之核酸片段，其係用以編碼如請求項1所述之螢光蛋白，其中該單離之核酸片段的序列與序列編號：7、8、9、10、11或12之核苷酸序列有至少96%的序列相似度。
如請求項2所述之核酸片段，其中該核酸片段具有序列編號：7、8、9、10、11或12的核苷酸序列。
一種用以編碼一螢光蛋白之重組載體，其係包含如請求項2所述之單離的核酸片段。
一種用以表現螢光蛋白之系統，包含一如請求項4所述之重組載體；以及一宿主細胞。
一種用以表現螢光之套組，包含一試劑，其係選自由請求項1所述之單離的螢光蛋白、用以編碼該單離之螢光蛋白的核酸片段、用以表現該單離之螢光蛋白的重組載體及用以表現該單離之螢光蛋白的系統所組成的群組；以及一容器，其係用以裝載該試劑。